CN103290140A - H5n1亚型禽流感病毒反转录环介导的体外等温扩增检测方法和试剂盒 - Google Patents
H5n1亚型禽流感病毒反转录环介导的体外等温扩增检测方法和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103290140A CN103290140A CN2012102986980A CN201210298698A CN103290140A CN 103290140 A CN103290140 A CN 103290140A CN 2012102986980 A CN2012102986980 A CN 2012102986980A CN 201210298698 A CN201210298698 A CN 201210298698A CN 103290140 A CN103290140 A CN 103290140A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- primer
- inner primer
- pair
- ring
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims abstract description 37
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 18
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 8
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 5
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 abstract 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 17
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 13
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 4
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- NNBFNNNWANBMTI-UHFFFAOYSA-M brilliant green Chemical compound OS([O-])(=O)=O.C1=CC(N(CC)CC)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 NNBFNNNWANBMTI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J dimagnesium;phosphonato phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000003555 cloaca Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- MTBZIGHNGSTDJV-UHFFFAOYSA-N Ditalimfos Chemical compound C1=CC=C2C(=O)N(P(=S)(OCC)OCC)C(=O)C2=C1 MTBZIGHNGSTDJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100532034 Drosophila melanogaster RTase gene Proteins 0.000 description 1
- -1 EZ1 nucleic acid Chemical class 0.000 description 1
- 206010019133 Hangover Diseases 0.000 description 1
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 238000009361 aviculture Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了H5N1亚型禽流感病毒的反转录环介导的体外等温扩增检测技术（RT-LAMP）检测方法和试剂盒，通过对H5N1亚型禽流感病毒HA基因序列的分析，选出高度保守且特异的核苷酸区域，设计了三对特异性引物，其中所用的外引物分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列；内引物分别含有Seq ID No.3和Seq ID No.4及Seq ID No.5和Seq ID No.6所示的序列；环引物分别含有Seq ID No.7和Seq ID No.8所示的序列。本发明的方法和试剂盒能够特异性地检测出鼻咽拭子、细胞培养液、组织悬液等多种样品中的H5N1亚型禽流感病毒；灵敏度高，操作方便快捷。本发明所述的H5N1亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂包含三对特异性引物。
Description
技术领域
本发明涉及病毒的检测方法和检测试剂盒，特别是涉及H5N1亚型禽流感病毒环介导的体外等温扩增检测方法和试剂盒。
背景技术
禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型之间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的一大毁灭性疫病。尤其是高致病力禽流感H5N1亚型可导致高达100%的发病率和死亡率，并可直接感染人并致人死亡，其生态学和公共卫生学意义已引起全世界人们的高度重视。H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是流感防控的重要一环。目前，有关H5N1亚型禽流感病毒的检测方法较多，快速、灵敏、特异的分子生物学检测技术已经在禽流感的病毒检测中发挥了重要的作用，但均需要复杂的仪器(如PCR仪)，在一些基层的实验室很难进行操作。如何能够在最先接触疫情的基层实验室，不需要昂贵的仪器即可对H5N1亚型禽流感病毒实现快速分子生物学检测，是目前需要解决的迫切问题。
环介导的体外等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年报导的一种新颖核酸扩增技术（Notomi et al.,2000）。该技术针对DNA靶序列的6个区域设计4条特异引物，包含1对内引物和1对外引物，内引物包括前内引物FIP（Forward inner primer）和后内引物BIP（Backward inner primer），外引物包括F3和B3，如图1A所示。FIP由2条引物组成，分别是F1C（靶基因F1序列的互补序列）和F2（与靶序列序列相同），TTTT链接F1C和F2，同理BIP由B1C-TTTTB2构成，TTTT作为连接核苷酸可有可无，当形成的环不够30个核苷酸时，增加4个核苷酸可增加环的长度。外引物B3和F3识别区域位于内引物外侧，分别与靶序列B3C、F3C互补。设计引物时还注意一个原则，扩增区段F2－R2最好控制在200个核苷酸以内。LAMP法扩增的机制（如图1B所示）：1、引物BIP中的B2（B2c的互补序列）与模板DNA中B2c结合，起始互补链的合成；2、B3（B3c的互补序列）与B3c结合，启动链置换反应；3、链置换反应产生1对双链和1条单链，单链两端有互补核苷酸，形成哑铃状；4、引物BIP中的B2与双链茎环结构DNA的环上的B2c合成一种有缺口的过渡性茎环结构DNA；5、在过渡性茎环结构的茎上含有1对反向互补序列，在对面的末端，通过FIP形成1个环状结构;6、在其中加入环引物FLOOP和BLOOP可以大大增加反应效率.在随后的自我引物置换延伸合成过程中，在内引物作用下，开始循环反应，茎的长度和环的个数都逐渐增加，最后的产物为不同长度的茎环DNA组成的混合物。
扩增产物可以通过3种方法来判断：1、琼脂糖凝胶电泳；2、扩增产物中加双链DNA染料PicoGreen；3、肉眼观察扩增负产物焦磷酸镁白色沉淀。LAMP法具有许多其他PCR方法无法比拟的优点。1、只需要保持60℃－65℃的恒定温度就能进行扩增反应，因此无需昂贵的设备，一般的恒温装置如水浴锅或恒温箱就能满足扩增要求；2、针对靶序列的6个区段设计4条引物，扩增的特异性比其他的PCR方法进一步提高；3、整个扩增在1h左右即可完成，且产率可达到0.15mg/mL，扩增效率大大提高。4、进行RT-LAMP时，在增加反转录酶和RNA酶抑制剂后，不需要专门设计反转录的时间，整个反应的时间也不需要增加，进一步提高检测的效率；5、在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物――焦磷酸镁沉淀，由于扩增效率高，产生的焦磷酸镁沉淀多，用肉眼观察或浊度仪检测浊度就能够判断是否扩增。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种H5N1亚型禽流感病毒的反转录环介导的体外等温扩增（RT-LAMP）检测方法。
本发明的另一目的在于提供一种H5N1亚型禽流感病毒的检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
H5N1亚型禽流感病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括一对外引物、一对内引物及一对环引物，
所述一对外引物为分别具有Seq ID No.1所示序列的前外引物F3和具有Seq IDNo.2所示序列的后外引物B3，
所述一对内引物包括前内引物FIP和后内引物BIP，所述前内引物FIP含有Seq IDNo.3和Seq ID No.4所示的序列，Seq ID No.3和Seq ID No.4之间通过0～4个碱基相连；所述后内引物BIP含有Seq ID No.5和Seq ID No.6所示的序列，Seq ID No.5和Seq ID No.6之间通过0～4个碱基相连,
所述一对环引物为分别具有Seq ID No.7所示序列的环引物FLOOP和具有Seq IDNo.8所示序列的环引物BLOOP，
Seq ID No.1：5’---TGGKTGTTTYGARTTCTAYCACAA---3’
Seq ID No.2：5’---AGAAACAAGGGTGTTTTTAAYTAYAATCTG---3’
Seq ID No.3：5’---TATTTCCTCYCTGTTTAGYCTTGMTTCT---3’
Seq ID No.4：5’---GTGACAATGAATGYATGGAAAGTGT---3’
Seq ID No.5：5’---GTGGCGAGTTCCCTAGCACTGG---3’
Seq ID No.6：5’---CTCACAAWTYTAGATGCAAATTCTGC---3’
Seq ID No.7：5’---TCTGARTAYTGYGGATAGTCATACGTTCC---3’
Seq ID No.8：5’---GGTAGCTGGTCTRTCTTTTTGGATGTG---3’。
作为一种优选方式，所述前内引物FIP的Seq ID No.3和Seq ID No.4之间直接相连，序列为：
TATTTCCTCYCTGTTTAGYCTTGMTTCT-GTGACAATGAATGYATGGAAAGTGT
所述后内引物BIP的Seq ID No.5和Seq ID No.6之间直接相连，序列为：
GTGGCGAGTTCCCTAGCACTGG-CTCACAAWTYTAGATGCAAATTCTGC。
作为另一种优选方式，所述前内引物FIP的Seq ID No.3和Seq ID No.4之间通过TTTT这4个碱基相连。上述0～4个碱基作为连接核苷酸可有可无，当形成的环不够30个核苷酸时，所增加的0～4个核苷酸可增加环的长度，所述0～4个碱基优选为TTTT。
作为另一种优选方式，所述后内引物BIP的Seq ID No.5和Seq ID No.6之间通过TTTT这4个碱基相连。同理，上述0～4个碱基作为连接核苷酸可有可无，当形成的环不够30个核苷酸时，所增加的0～4个核苷酸可增加环的长度，所述0～4个碱基优选为TTTT。
具体地来说，所述试剂盒的反应体系总体积为25μL，含有
H5N1亚型禽流感病毒的反转录环介导的体外等温扩增检测方法，所述方法包括利用特异性引物，以病毒基因组RNA为模板进行反转录环介导的体外等温扩增反应，其特征在于：所述特异性引物至少包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，
所述一对外引物为分别具有Seq ID No.1所示序列的前外引物F3和具有Seq IDNo.2所示序列的后外引物B3，
所述一对内引物包括前内引物FIP和后内引物BIP，所述前内引物FIP含有Seq IDNo.3和Seq ID No.4所示的序列，Seq ID No.3和Seq ID No.4之间通过0～4个碱基相连；所述后内引物BIP含有Seq ID No.5和Seq ID No.6所示的序列，Seq ID No.5和Seq ID No.6之间通过0～4个碱基相连；
所述一对环引物为分别具有Seq ID No.7所示序列的环引物FLOOP和具有Seq IDNo.8所示序列的环引物BLOOP，
Seq ID No.1：5’---TGGKTGTTTYGARTTCTAYCACAA---3’
Seq ID No.2：5’---AGAAACAAGGGTGTTTTTAAYTAYAATCTG---3’
Seq ID No.3：5’---TATTTCCTCYCTGTTTAGYCTTGMTTCT---3’
Seq ID No.4：5’---GTGACAATGAATGYATGGAAAGTGT---3’
Seq ID No.5：5’---GTGGCGAGTTCCCTAGCACTGG---3’
Seq ID No.6：5’---CTCACAAWTYTAGATGCAAATTCTGC---3’
Seq ID No.7：5’---TCTGARTAYTGYGGATAGTCATACGTTCC---3’
Seq ID No.8：5’---GGTAGCTGGTCTRTCTTTTTGGATGTG---3’。
作为一种优选实施方式，所述前内引物FIP的Seq ID No.3和Seq ID No.4之间直接相连，序列为：
TATTTCCTCYCTGTTTAGYCTTGMTTCT-GTGACAATGAATGYATG GAAAGTGT
所述后内引物BIP的Seq ID No.5和Seq ID No.6之间直接相连，序列为：
GTGGCGAGTTCCCTAGCACTGG–CTCACAAWTYTAGATGCAAAT TCTGC。
作为另一种优选实施方式，所述前内引物FIP的Seq ID No.3和Seq ID No.4之间通过TTTT这4个碱基相连。
作为另一种优选实施方式，所述后内引物BIP的Seq ID No.5和Seq ID No.6之间通过TTTT这4个碱基相连。
所述反转录环介导的体外等温扩增反应的恒温温度为59℃~65℃。更优选65℃，反应的时间优选为30min-120min，更优选60min。
由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：
本发明的反转录环介导的体外等温扩增（RT-LAMP）检测方法和试剂盒用于检测H5N1亚型禽流感病毒时，由于独特的引物设计使得检测方法拥有很好的特异性，用于检测H1、H3、H7、H9、ND，仅H5检测结果为阳性，其余均为阴性。本发明的方法和试剂盒灵敏度高，用PCR扩增H5亚型的HA全基因，克隆至PGEM-4z载体中，将HA全基因体外转录后进行纯化，按说明书用核酸蛋白分析仪测定各个亚型体外转录产物的含量。将体外转录的含目的片段的RNA稀释成约为1*107拷贝数，并10倍***稀释成1.0*10-1～10-10等10个稀释度，进行禽流感病毒RT-LAMP检测，与禽流感通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒同时检测，比较两种检测方法的灵敏度，RT-LAMP方法检测限为1000个模板拷贝与RT-PCR的灵敏度相当。本发明的方法和试剂盒检测时间短，RT-LAMP反应时间只需要1h，比实时荧光（1.5h－2h）和RT-PCR（2h－3h）耗时更短。应用LAMP技术需要的仪器要求也不高，一般的PCR仪或恒温设备如水浴锅或恒温箱就可以进行反应。
附图说明
图1为LAMP反应过程原理图，其中图A为LAMP引物位置示意图，图B为LAMP反应过程示意图。
图2A为LAMP的扩增原理示意图，图2B为本发明的一种RT-LAMP引物在H5N1亚型禽流感病毒HA基因中的位置示意图。
图3为本发明的RT-LAMP的结果判定图，其中，
图3A是在25μL反应体系中，于PCR反应管中分别加入禽流感H5亚型的模板，同时用无RNA酶的水作为阴性对照，于恒温水浴锅上进行RT-LAMP扩增。在加入H5亚型模板的管底肉眼可见微量的白色沉淀，阴性对照无沉淀；
图3B是在图3A的试管中加入染料，加入H5亚型模板的反应液呈现明显的翠绿色，而阴性对照则为淡橙色；
图3C是将图3B中加入染料后的各反应管置紫外灯下照射，加入H5亚型模板的反应液发射出强烈地绿色荧光。
图4A和4B为本发明RT-LAMP的灵敏性比对试验结果图，其中图4A是直接目测结果图；图4B是电泳检测结果图。
图5为本发明特异性试验的结果图。
具体实施方式
实施例1
1材料和方法
1.1病毒及细胞
禽流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亚型及新城疫病毒标准抗原，均购自哈尔滨兽医研究所。H1、H3、H5、H7和H9亚型及新城疫分离毒株RNA，均由深圳出入境检验检疫局实验室保存。
1.2设备与试剂
设备：ABI7500荧光定量PCR，EZ1核酸抽提仪，恒温水浴锅，核酸蛋白分析仪凝胶成像仪。
试剂：MgSO4、甜菜碱Betaine、荧光染料PicoGreen购于Sigma Chemical公司；Bst DNA聚合酶大片段及10×ThermoPol反应缓冲液（100mmol/L KCl，200mmol/LTris-HCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，1%Triton X-100，pH8.8,25℃）购于纽英伦生物技术有限公司（NEB）；反转录酶、核酸抑制剂购自大连宝生物公司；病毒RNA抽提试剂盒购于Qiagen公司;禽流感通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒购于深圳太太基因工程有限公司;实验所用水均为DEPC处理水；实验器皿均经过高温灭菌2次。
1.3RT-LAMP引物的设计
根据Genbank数据库中已有的H5N1亚型禽流感病毒HA基因核苷酸序列，用DNASTAR生物软件进行序列分析比较，选出高度保守且特异的核苷酸区域，人工设计8个位点的6个特异性LAMP简并引物。
引物进行合成，其中引物F3、B3、Floop和Bloop进行PAGE纯化，引物FIP和BIP进行HPLC纯化。
引物序列见表1。引物在HA基因中的位置及扩增原理示意图见图2。
表1H5N1亚型禽流感病毒RT-LAMP检测引物
内引物FIP和BIP分别含有2条不同的序列，分别为F1c+F2和B1c＋B2。
1.4病毒核酸的提取
采用病毒RNA抽提试剂盒对待检测样品的病毒核酸进行提取，具体操作参照试剂盒说明书进行。
1.5模板拷贝数的测定
用PCR扩增H5亚型的HA全基因，克隆至PGEM-4z载体中，将HA全基因体外转录后进行纯化，按说明书用核酸蛋白分析仪测定各个亚型体外转录产物的含量。
1.6RT-LAMP反应条件的优化
RT-LAMP采用25μL反应体系，加入的组分剂量如下表2：
表2
| 10×Bst Buffer | 2.5μL |
| dNTP(10mM/L each) | 3.5μL |
| MgSO4(25μmol/μL) | 0.6μL |
| H5F3(5pmol/μL) | 1μL |
| H5B3(5pmol/μL) | 1μL |
| H5FIP(40pmol/μL) | 1μL |
| H5BIP(40pmol/μL) | 1μL |
| H5FLOOP(25pmol/μL) | 1μL |
| H5BLOOP(25pmol/μL) | 1μL |
| Betaine(5M) | 5μL |
| RNasin(40U/μL) | 1μL |
| AMV RTase XL(5U/μL) | 1μL |
| Bst DNA polymerase(8U/μL) | 1μL |
| RNA | 1μL |
| DEPC dH2O | 3.4μL |
| Total | 25μL |
对RT-LAMP的扩增条件进行优化，采用相同模板、相同的组份配置，分别在不同的温度下（59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、63.5℃、64℃和65℃）恒温反应1h，以确定最佳反应温度；采用相同模板、相同的组份配置，在优化的温度下分别恒温反应30min、45min、60min、90min和120min，以确定最佳反应时间。
在温度优化和时间优化试验的RT-LAMP产物中加入PicoGreen后放到ABI7500实时荧光PCR仪上作溶解曲线，以帮助判断扩增产物的相对量。
结果表明，30～120min的反应时间条件下，反应均可进行，最佳的反应时间为60min，最佳反应温度为63.5℃。
1.7RT-LAMP结果观察
扩增结果使用3种方法进行观察。
方法1：取扩增产物8μL进行凝胶电泳，然后溴化乙锭染色，紫外投射灯下观察，靠近点样孔出现拖尾，远离点样孔出现梯度条带的样品判为阳性；
方法2：在反应管中加入双链DNA（dsDNA）染料PicoGreen，出现翠绿颜色的样品判为阳性；
方法3：将PicoGreen染色的样品放到ABI7500上作溶解曲线，呈现平直线的样品为阴性，出现单峰的样品为阳性，本文引入此方法显示扩增产物的相对量。
1.8RT-LAMP的特异性试验
提取H1、H3、H5、H7和H9亚型及新城疫病毒核酸检测，观察结果确定引物的特异性，结果见图5。
其结果是：除H5亚型禽流感病毒核酸之外均无扩增。
1.9RT-LAMP的灵敏度试验及与RT-PCR、实时荧光RT-PCR灵敏度的比较
用PCR扩增H5亚型的HA全基因，克隆至PGEM-4z载体中，将HA全基因体外转录后进行纯化，按说明书用核酸蛋白分析仪测定各个亚型体外转录产物的含量。将体外转录的含目的片段的RNA稀释成约为1X107拷贝数，并10倍***稀释成1.0*10-1～10-10等10个稀释度，进行禽流感病毒RT-LAMP检测，与H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒同时检测，比较两种检测方法的灵敏度。
2结果
2.1H5亚型禽流感病毒RT-LAMP扩增检测结果
在25μL反应体系中，于PCR反应管中分别加入禽流感H1、H3、H5、H7、H9亚型的模板，同时用无RNA酶的水作为阴性对照，于恒温水浴锅上进行RT-LAMP扩增。在加入H5亚型模板的管底肉眼可见微量的白色沉淀，阴性对照无沉淀（见图3A）；加入染料后，加入H5亚型模板的反应液呈现明显的翠绿色，而阴性对照则为淡橙色（见图3B）；将加入染料后的各反应管置紫外灯下照射，加入H5、亚型模板的反应液发射出强烈地绿色荧光（见图3C）。琼脂糖凝胶电泳检测后，亚型模板的反应液有特异性的梯状条带，阴性对照则无条带出现。
2.2H5亚型禽流感病毒RT-LAMP敏感性与禽流感病毒通用型实时荧光敏感性试验比
对结果
将测定的体外转录的H5亚型的RNA作10倍连续稀释，在建立的禽流感RT-LAMP反应体系中，只加入不同稀释度的H5模板，同时进行H5亚型的禽流感RT-LAMP和H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR敏感性检测比对，结果证实禽流感RT-LAMP检测的敏感性约为1000个模板拷贝，与实时荧光RT-PCR敏感性相同。结果见图4。
2.3H5亚型禽流感病毒RT-LAMP的特异性试验结果
在反应体系中，只加入载体的核酸并不出现非特异性扩增，检测结果全部阴性。通过对多种感染鸡的病毒或细菌的检测，结果证实，该方法特异性强，与其他检测对象无交叉反应。
2.4H5亚型禽流感病毒RT-LAMP多个检测样品的对比试验
取18份实验室保存经实时荧光RT-PCR确证的H5亚型禽流感病毒RNA，运用H5亚型禽流感病毒RT-LAMP进行盲检，结果全部为阳性。
2.5H5亚型禽流感RT-LAMP田间试验
在多个供港注册鸡场随机采集301份泄殖腔拭子和喉拭子，用灭菌磷酸盐缓冲液洗涤，同时采集发病鸡场的病料20份，其中全血10份，拭子10份。分别提取病毒核酸后将每份样品分成两份，一份用于H5亚型禽流感实时荧光RT-PCR的检测，另一份用所建立的H5亚型禽流感病毒RT-LAMP进行检测。
利用H5亚型禽流感病毒RT-LAMP和H5亚型实时荧光RT-PCR对临床采集的301份喉腔和泄殖腔棉拭子及临床采样的样品进行检测，结果H5亚型禽流感病毒RT-LAMP检测到棉拭子阳性8份、全血10份；H5亚型禽流感实时荧光RT-PCR检测到棉拭子阳性8份、全血7份。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.H5N1亚型禽流感病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括一对外引物、一对内引物及一对环引物，
所述一对外引物为分别具有Seq ID No.1所示序列的前外引物F3和具有Seq ID No.2所示序列的后外引物B3，
所述一对内引物包括前内引物FIP和后内引物BIP，所述前内引物FIP含有Seq ID No.3和Seq ID No.4所示的序列，Seq ID No.3和Seq ID No.4之间通过0～4个碱基相连；所述后内引物BIP含有Seq ID No.5和Seq ID No.6所示的序列，Seq ID No.5和Seq ID No.6之间通过0～4个碱基相连,
所述一对环引物为分别具有Seq ID No.7所示序列的环引物FLOOP和具有Seq ID No.8所示序列的环引物BLOOP，
Seq ID No.1：5’---TGGKTGTTTYGARTTCTAYCACAA---3’
Seq ID No.2：5’---AGAAACAAGGGTGTTTTTAAYTAYAATCTG---3’
Seq ID No.3：5’---TATTTCCTCYCTGTTTAGYCTTGMTTCT---3’
Seq ID No.4：5’---GTGACAATGAATGYATGGAAAGTGT---3’
Seq ID No.5：5’---GTGGCGAGTTCCCTAGCACTGG---3’
Seq ID No.6：5’---CTCACAAWTYTAGATGCAAATTCTGC---3’
Seq ID No.7：5’---TCTGARTAYTGYGGATAGTCATACGTTCC---3’
Seq ID No.8：5’---GGTAGCTGGTCTRTCTTTTTGGATGTG---3’。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述前内引物FIP的Seq ID No.3和Seq ID No.4之间直接相连，序列为：
TATTTCCTCYCTGTTTAGYCTTGMTTCT-GTGACAATGAATGYATG GAAAGTGT
所述后内引物BIP的Seq ID No.5和Seq ID No.6之间直接相连，序列为：
GTGGCGAGTTCCCTAGCACTGG-CTCACAAWTYTAGATGCAAATTCTGC。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述前内引物FIP的Seq ID No.3和Seq ID No.4之间通过TTTT这4个碱基相连。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述后内引物BIP的Seq ID No.5和Seq ID No.6之间通过TTTT这4个碱基相连。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的反应体系总体积为25μL，含有
6.H5N1亚型禽流感病毒的反转录环介导的体外等温扩增检测方法，所述方法包括利用特异性引物，以病毒基因组RNA为模板进行反转录环介导的体外等温扩增反应，其特征在于：所述特异性引物至少包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，
所述一对外引物为分别具有Seq ID No.1所示序列的前外引物F3和具有Seq ID No.2所示序列的后外引物B3，
所述一对内引物包括前内引物FIP和后内引物BIP，所述前内引物FIP含有Seq ID No.3和Seq ID No.4所示的序列，Seq ID No.3和Seq ID No.4之间通过0～4个碱基相连；所述后内引物BIP含有Seq ID No.5和Seq ID No.6所示的序列，Seq ID No.5和Seq ID No.6之间通过0～4个碱基相连，
所述一对环引物为分别具有Seq ID No.7所示序列的环引物FLOOP和具有Seq ID No.8所示序列的环引物BLOOP，
Seq ID No.1：5’---TGGKTGTTTYGARTTCTAYCACAA---3’
Seq ID No.2：5’---AGAAACAAGGGTGTTTTTAAYTAYAATCTG---3’
Seq ID No.3：5’---TATTTCCTCYCTGTTTAGYCTTGMTTCT---3’
Seq ID No.4：5’---GTGACAATGAATGYATGGAAAGTGT---3’
Seq ID No.5：5’---GTGGCGAGTTCCCTAGCACTGG---3’
Seq ID No.6：5’---CTCACAAWTYTAGATGCAAATTCTGC---3’
Seq ID No.7：5’---TCTGARTAYTGYGGATAGTCATACGTTCC---3’
Seq ID No.8：5’---GGTAGCTGGTCTRTCTTTTTGGATGTG---3’。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：
所述前内引物FIP的Seq ID No.3和Seq ID No.4之间直接相连，序列为：TATTTCCTCYCTGTTTAGYCTTGMTTCT-GTGACAATGAATGYATG GAAAGTGT
所述后内引物BIP的Seq ID No.5和Seq ID No.6之间直接相连，序列为：GTGGCGAGTTCCCTAGCACTGG–CTCACAAWTYTAGATGCAAATTCTGC。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述前内引物FIP的Seq ID No.3和Seq ID No.4之间通过TTTT这4个碱基相连；
所述后内引物BIP的Seq ID No.5和Seq ID No.6之间通过TTTT这4个碱基相连。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述反转录环介导的体外等温扩增反应的恒温温度为59℃~65℃,优选63.5℃。
10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述反转录环介导的体外等温扩增反应的时间为30min-120min,优选60min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210298698.0A CN103290140B (zh) | 2012-08-21 | 2012-08-21 | H5n1亚型禽流感病毒反转录环介导的体外等温扩增检测方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210298698.0A CN103290140B (zh) | 2012-08-21 | 2012-08-21 | H5n1亚型禽流感病毒反转录环介导的体外等温扩增检测方法和试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103290140A true CN103290140A (zh) | 2013-09-11 |
| CN103290140B CN103290140B (zh) | 2015-06-17 |
Family
ID=49091666
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210298698.0A Expired - Fee Related CN103290140B (zh) | 2012-08-21 | 2012-08-21 | H5n1亚型禽流感病毒反转录环介导的体外等温扩增检测方法和试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103290140B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101070554A (zh) * | 2006-05-08 | 2007-11-14 | 北京金迪克生物技术研究所 | 环介导逆转录等温扩增技术(rt－lamp)检测hcv和h5n1等rna病毒基因 |
-
2012
- 2012-08-21 CN CN201210298698.0A patent/CN103290140B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101070554A (zh) * | 2006-05-08 | 2007-11-14 | 北京金迪克生物技术研究所 | 环介导逆转录等温扩增技术(rt－lamp)检测hcv和h5n1等rna病毒基因 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103290140B (zh) | 2015-06-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105821138B (zh) | 一种基于连接反应构建双茎环结构dna模板检测核酸的方法 | |
| CN110616272B (zh) | 检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒 | |
| CN111394431B (zh) | 一种使用双重实时荧光等温扩增技术检测核酸的方法 | |
| CN101608242A (zh) | 一种基于rt-lamp技术的h3亚型流感快速检测分型方法 | |
| CN111118211A (zh) | 基于环介导等温扩增技术的牛结节性皮肤病检测试剂盒及方法 | |
| CN109554507B (zh) | 一种h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒的检测方法 | |
| CN101899521A (zh) | 一种广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法 | |
| CN112094946A (zh) | 牛结节性皮肤病病毒的lamp检测引物、试剂盒及其应用 | |
| CN101724714B (zh) | 一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒 | |
| CN102071263B (zh) | 禽流感病毒h5亚型套式荧光rt-pcr检测试剂及检测试剂盒 | |
| CN103320532A (zh) | H7n9亚型禽流感病毒快速检测引物组及其用途 | |
| CN102876813B (zh) | 一种检测禽流感病毒的实时荧光rt-hda试剂盒及引物 | |
| CN102649985B (zh) | H1n2亚型禽流感病毒rt-lamp可视化检测试剂盒 | |
| CN102952892B (zh) | 一种检测西尼罗病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用 | |
| CN101245395B (zh) | 大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增检测方法 | |
| CN108060271B (zh) | 基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法 | |
| CN105331746A (zh) | 一种鸭黄病毒rt-lamp检测试剂盒 | |
| CN103290139A (zh) | 反转录环介导等温扩增检测禽流感病毒的试剂盒及方法 | |
| CN103290140B (zh) | H5n1亚型禽流感病毒反转录环介导的体外等温扩增检测方法和试剂盒 | |
| CN113278736B (zh) | 用于定性检测牛疱疹病毒i型的试剂和方法 | |
| Guo et al. | Rapid detection of mud crab dicistrovirus-1 using loop-mediated isothermal amplification | |
| CN102108415B (zh) | 狗鱼幼鱼弹状病毒反转录环酶恒温扩增检测方法和试剂盒 | |
| CN103667521A (zh) | 一组用于检测虹彩病毒的引物及检测方法 | |
| CN109628643B (zh) | 一种h5亚型禽流感病毒的快速检测方法 | |
| CN103045763A (zh) | 一种新发鸭坦布苏病毒rt-lamp检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150617 |