BR112016016207B1

BR112016016207B1 - Anticorpo anti-pd-l1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, seu método de produção e seus usos, composição farmacêutica e seus usos, molécula de polinucleotídeo isolada, e vetor isolado

Info

Publication number: BR112016016207B1
Application number: BR112016016207-2A
Authority: BR
Inventors: Nicholas J. Papadopoulos; Andrew J. Murphy; Gavin Thurston; Ella Ioffe; Elena Burova
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc
Priority date: 2014-01-23
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2023-10-24
Also published as: EA034695B1; PT3473648T; CY1124437T1; JP7106594B2; CY1122005T1; PL3473648T3; UY35965A; EA201691487A1; KR20160128309A; PH12016501384A1; MX2016009444A; IL246661B; JP2017507650A; MY188355A; AU2015209238B2; HUE055465T2; US9938345B2; AU2015209238A1; PT3097120T; DK3473648T3

Abstract

anticorpos humanos para pd-l1. a presente invenção provê anticorpos que se ligam à proteína de ligante de morte programada 1 (pd-l1) de co-inibidor de célula t, e métodos de uso. em várias concretizações da invenção, os anticorpos são anticorpos totalmente humanos que se ligam a pd-l1. em certas concretizações, a presente invenção provê moléculas de ligação de antígeno multi-específicas compreendendo uma primeira especificidade de ligação que se liga a pd-l1 e uma segunda especificidade de ligação que se liga a um antígeno de célula de tumor, um antígeno específico de célula infectada, ou um co-inibidor de célula t. em algumas concretizações, os anticorpos da invenção são úteis para a inibição ou a neutralização de atividade de pd-l1, provendo, assim, um meio de tratar uma doença ou uma desordem tal como câncer ou infecção viral.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a anticorpos humanos e fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos humanos que especificamente se ligam a ligante de morte programada por ligante receptor imunomodulador 1 (PD-L1), e a métodos terapêuticos e de diagnósticos de uso daqueles anticorpos.

Afirmação da Técnica Relacionada

[002] Ligante de morte programada 1 (PD-L1) (também chamado B7-H1 ou CD274) é um ligante de receptor de proteína de 290 aminoácidos expresso amplamente tanto em tecidos linfóides quanto não linfóides tais como células de CD4 e de CD8T, células de linhagem de macrófago, tecidos periféricos bem como on células de tumor, e células viralmente infectadas (Dong e outros 1999, Nature Med.). PD- L1 se liga a receptores PD-1 e B7-1 que pertence à família de CD28/CTLA-4 (antígeno de linfócito T citotóxico)/ ICOS (co-estimulador induzível) de receptores co-inibidores de célula T (Chen e outros 2013, Nature Rev. Immunol. 13: 227-242) e atenua a resposta imune por inibição de célula T. Ligação de PD-L1 a PD-1 ou B7-1 resulta em proliferação de célula T diminuída e secreção de citocina, comprometendo respostas imunes celulares e humorais nas doenças tais como câncer e infecção viral.

[003] A expressão de PD-L1 em células de tumor e células viralmente infectadas é explorada por tumores e infecções virais crônicas para evadir resposta imune. PD-L1 é expresso em uma ampla variedade de tumores e estudos nos modelos de animais mostravam que PD-L1 nos tumores inibe ativação de célula T e lise de células de tumor e podem levar a morte aumentada de células T específicas de tumor. Nas infecções virais crônicas, PD-L1 expresso em células viralmente infectadas se liga a PD-1 em células T específicas de vírus e estas células T se tornam células T se “esgotadas” com perda de funções efetoras e capacidade proliferativa (Freeman 2008, PNAS 105: 10275-10276). O PD-1: Sistema de PD-L1 também desempenha um papel importante no desenvolvimento de célula de regulador T induzido (Treg) e na função de Treg sustentada (Francisco e outros 2010, Immunol. Rev. 236: 219-242).

[004] Uma vez que PD-L1 desempenha um papel importante em imunidade de tumor e imunidade infecciosa, é um alvo ideal para imunoterapia. Bloqueamento de PD-L1 com antagonistas, incluindo anticorpos monoclonais, foi estudo nos tratamentos de câncer e infecções virais crônicas (Ribas 2012, NEJM 366: 2517-2519; Freeman 2008, PNAS 105: 10275-10276; Sheridan 2012, Nature Biotechnology 30: 729-730).

[005] Anticorpos monoclonais para PD-L1 são conhecidos na técnica e foram descritos, por exemplo, nas publicações de patentes US Nos. 7943742, 8383796, 8217149, 20090055944, 20120003056, 20130034559, 20130045200, 20130045201, 20130045202, e na WO 2007005874, WO 2011066389, WO 2010077634, EP1907424, e EP1899379.

Breve Sumário da Invenção

[006] A presente invenção provê anticorpos e seus fragmentos de ligação de antígeno que ligam PD-L1. Os anticorpos da presente invenção são úteis, inter alia, para o direcionamento de células que expressam PD-L1 tais como células de câncer ou células viralmente infectadas, e para a modulação de atividade de PD-L1. In certas concretizações, the anticorpos da invenção são úteis para a inibição ou a neutralização de atividade de PD-L1 e para estimulação de ativação de célula T, por exemplo, sob circunstâncias onde morte mediada por célula T é benéfica ou desejável. Os anticorpos de anti-PD-L1 da invenção, ou suas porções de ligação de antígeno, podem ser incluídos como parte de uma molécula de ligação de antígeno multi-específica, por exemplo, para modular a resposta imune e/ou direcionar os anticorpos para um tipo de célula específica, tal como célula de tumor ou uma célula viralmente infectada. Os anticorpos são úteis no tratamento de uma doença ou uma desordem tais como câncer ou infecção viral.

[007] Os anticorpos da invenção podem ser de comprimento total (por exemplo, um anticorpo de IgG1 ou IgG4) ou podem compreender apenas uma porção de ligação de antígeno (por exemplo, um fragmento de Fab, F(ab’)2 ou scFv), e pode ser modificado para afetar funcionalmente, por exemplo, para eliminar funções efetoras residuais (Reddy e outros, 2000, J. Immunol. 164:1925-1933). Em certas concretizações, os anticorpos podem ser biespecíficos.

[008] Em um primeiro aspecto, a presente invenção prove anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação de antígeno que se ligam especificamente a PD-L1. Anticorpos de anti-PD- L1 exemplares do presente invenção são listados nas tabelas 1 e 2 aqui. A tabela 1 indica os identificadores de sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada (HCVRs), regiões variáveis de cadeia leve (LCVRs), regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), e regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 and LCDR3) dos anticorpos de anti-PD-L1 exemplares. Tabela 2 indica os identificadores de sequência de ácidos nucléicos das HCVRs, LCVRs, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 dos anticorpos de anti-PD-L1 exemplares.

[009] A presente invenção provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo uma HCVR compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na tabela 1, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aos mesmos.

[010] A presente invenção também provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo uma LCVR compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer das sequências de aminoácidos de LCVR listadas na tabela 1, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aos mesmos.

[011] A presente invenção também provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo um par de sequências de aminoácidos de HCVR e LCVR (HCVR/LCVR) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listada na tabela 1 emparelhada com qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listada na tabela 1. De acordo com certas concretizações, a presente invenção provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo um par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR contido dentro do qualquer um dos anticorpos de anti-PD-L1 exemplares listado na tabela 1. Em certas concretizações, o par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR é selecionado do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/170, 186/194, 202/210, 218/226, 234/242, 250/258, 266/274, 282/274, 290/274, 298/274, 306/274, 314/274, 322/274, 330/274, and 338/274. Em certas concretizações, o par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR é selecionado de uma de SEQ ID NOs: 82/90 (por exemplo, H2M8314N), 162/170 (por exemplo, H2M8718N), 306/274 (por exemplo, H1H9364P2), e 314/274 (por exemplo, H1H9373P2). Em certas outras concretizações, o par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR é selecionada de um de SEQ ID NOs: 98/106 (por exemplo, H2M8316N), 146/154 (por exemplo, H2M8323N), 290/274 (por exemplo, H1H9351P2), e 330/274 (por exemplo, H1H9387P2).

[012] A presente invenção também provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR1 listada na tabela 1 ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[013] A presente invenção também provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer das sequências de aminoácidos de HCDR2 listada na tabela 1 ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[014] A presente invenção também provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR3 listada na tabela 1 ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[015] A presente invenção também provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR1 listada na tabela 1 ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[016] A presente invenção também provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo uma cadeia leve CDR2 (LCDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer das sequências de aminoácidos de LCDR2 listada na tabela 1 ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[017] A presente invenção também provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR3 listrada na tabela 1 ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[018] A presente invenção também provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo um par de sequências de aminoácidos de HCDR3 e de LCDR3 (HCDR3/LCDR3) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR3 listada na tabela 1 emparelhada com qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR3 listada na tabela 1. De acordo com certas concretizações, a presente invenção provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo um par de sequências de aminoácidos de HCDR3/ LCDR3 contidos dentro de qualquer um dos anticorpos de anti-PD-L1 exemplares listado na tabela 1. Em certas concretizações, o par de sequências de aminoácidos de HCDR3/ LCDR3 é selecionado do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 88/96 (por exemplo, H2M8314N), 168/176 (por exemplo, H2M8718N), 312/280 (por exemplo, H1H9364P2), e 320/280 (por exemplo, H1H9373P2). Em certas outras concretizações, o par de sequências de aminoácidos de HCDR3/ LCDR3 é selecionado do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 104/112 (por exemplo, H2M8316N), 152/160 (por exemplo, H2M8323N), 296/280 (por exemplo, H1H9351P2), e 336/280 (por exemplo, H1H9387P2).

[019] A presente invenção também provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo um conjunto de seis de CDRs (isto é, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contidas dentro de qualquer um dos anticorpos de anti-PD-L1 exemplares listado na tabela 1. In certas concretizações, o conjunto de sequência de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1- LCDR2-LCDR3 é selecionado do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 84-86-88-92-94-96 (por exemplo, H2M8314N); 164-166-168-172-174176 (por exemplo, H2M8718N); 308-310-312-276-278-280 (por exemplo, H1H9364P2); e 316-318-320-276-278-280 (por exemplo, H1H9373P2). Em certas outras concretizações, o conjunto de sequência de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1- LCDR2-LCDR3 é selecionado do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 100-102-104-108-110-112 (por exemplo, H2M8316N); 148-150-152156-158-160 (por exemplo, H2M8323N); 292-294-296-276-278-280 (por exemplo, H1H9351P2); e 332-334-336-276-278-280 (por exemplo, H1H9387P2).

[020] Em uma concretização relacionada, a presente invenção provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo um conjunto de seis CDRs (isto é, HCDR1-HCDR2- HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contidas dentro de um par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR como definido por qualquer um dos anticorpos de anti-PD-L1 exemplares listado na tabela 1. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo o conjunto de sequências de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1- LCDR2-LCDR3 contidas dentro de um par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR selecionado do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 82/90 (por exemplo, H2M8314N), 98/106 (por exemplo, H2M8316N), 146/154 (por exemplo, H2M8323N), 162/170 (por exemplo, H2M8718N), 290/274 (por exemplo, H1H9351P2), 306/274 (por exemplo, H1H9364P2), 314/274 (por exemplo, H1H9373P2) e 330/274 (por exemplo, H1H9387P2). Métodos e técnicas para identificação de CDRs dentro de sequências de aminoácidos de HCVR e LCVR são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para identificar CDRs dentro das sequências de aminoácidos de HCVR e/ou de LCVR especificadas reveladas aqui. Convenções exemplares que podem ser usados para identificar os limites de CDRs incluem, por exemplo, a definição de Kabat, a definição de Chothia, e a definição de AbM. Em termos gerais, a definição de Kabat é com base na variabilidade de sequência, a definição de Chothia é com base na localização das regiões de laço estruturais, e a definição de AbM é um compromisso entre as abordagens de Kabat e de Chothia. Vide, por exemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani e outros, J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); and Martin e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Base de dados estão também disponíveis para identificação de sequências de CDR dentro de um anticorpo.

[021] A presente invenção inclui anticorpos de anti-PD-L1 tendo um padrão de glicosilação modificado. Em algumas concretizações, modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil ou um anticorpo que carece de uma porção de fucose presente na cadeia de oligossacarídeo, por exemplo, para aumentar função de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (vide Shield e outros (2002) JBC 277:26733). Em outras aplicações, modificação de galactosilação pode ser feita a fim de modificar citotoxicidade de dependente complemento (CDC).

[022] A presente invenção também provê anticorpos e seus fragmentos de ligação de antígeno que compete para ligação específica a PD-L1 com um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo as CDRs de uma HCVR e as CDRs de uma LCVR, em que a HCVR e LCVR cada uma tem uma sequência de aminoácidos selecionada de as sequências de HCVR e LCVR listadas na tabela 1.

[023] A presente invenção também provê anticorpos isolados e seus fragmentos de ligação de antígeno que bloqueiam ligação de PD- L1 a PD-1 ou a B7-1. Em algumas concretizações, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno que bloqueia ligação de PD-L1 a PD- 1 ou a B7-1 pode se ligar ao mesmo epítopo em PD-L1 como PD-1/B7- 1 ou pode se ligar a um diferente epítopo PD-L1 como PD-1/B7-1. In certas concretizações, os anticorpos da invenção que bloqueiam ligação de PD-L1 a PD-1 ou a B7-1 compreendem as CDRs de uma HCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de sequências de HCVR listadas na tabela 1; e as CDRs de uma LCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de sequências de LCVR listadas na tabela 1.

[024] Em concretizações substitutas, a presente invenção prove anticorpos e seus fragmentos de ligação de antígeno que não bloqueiam ligação de PD-L1 a PD-1 ou a B7-1. Em certas concretizações, a presente invenção provê anticorpos isolados ou seus fragmentos de ligação de antígeno que ligam PD-L1, em que os anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno melhoram ligação de PD-L1 a PD-1 ou a B7-1. Em algumas concretizações, the anticorpos isolados ou seus fragmentos de ligação de antígeno que melhoram ligação de PD-L1 a PD-1/B7-1 compreendem as CDRs de um HCVR em que a HCVR tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 18, 66, 114, 130, 202, 218, 266, 282, 298, 322 and 338; e as CDRs de uma LCVR, em que a LCVR tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 26, 74, 122, 138, 210, 226, e 274. Em algumas concretizações, os anticorpos isolados ou seus fragmentos de ligação de antígeno compreendem um par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR selecionadas do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 18/26 (por exemplo, H2M8307N), 66/74 (por exemplo, H2M8312N), 114/122 (por exemplo, H2M8317N), 130/138 (por exemplo, H2M8321N), 202/210 (por exemplo, H1H9323P), 218/226 (por exemplo, H1H9327P), 266/274 (por exemplo, H1H9344P2), 282/274 (por exemplo, H1H9345P2), 298/274 (por exemplo, H1H9354P2), 322/274 (por exemplo, H1H9382P2), e 338/274 (por exemplo, H1H9396P2).

[025] A presente invenção também provê anticorpos e seus fragmentos de ligação de antígeno que ligam especificamente a PD-L1 da espécie humano ou outras espécies. Em certas concretizações, os anticorpos podem se ligar a human PD-L1 e/ou a PD-L1 de cynomolgus.

[026] A presente invenção também provê anticorpos e seus fragmentos de ligação de antígeno que compete cruzadamente para a ligação a PD-L1 com um anticorpo de referência ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo as CDRs de um HCVR e os CDRs de uma LCVR, em que a HCVR e LCVR cada uma tem uma sequência de aminoácidos selecionada das sequências de HCVR e LCVR listadas na tabela 1.

[027] Em uma concretização, a invenção provê um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação de antígeno que tem uma ou mais das seguintes características: (a) bloqueia a ligação de PD-L1 a PD-1 ou a B7-1; (b) liga especificamente a PD-L1 humano e/ou PD-L1 de cynomolgus; (c) inibe Proliferação de célula T em um ensaio de reação de linfócito misto (MLR); e (d) aumenta secreção de IL-2 e/ou interferon- gama em um ensaio de MLR.

[028] Em algumas concretizações, o anticorpo ou seu fragment de ligação de antígeno pode se ligar especificamente a PD-L1 de um modo agonista, isto é, pode melhorar ou estimular ligação e/ou atividade de PD-L1; em outras concretizações, o anticorpo pode se ligar especificamente a PD-L1 de um modo antagonista, isto é, pode bloquear PD-L1 da ligação a seu receptor.

[029] Em certas concretizações, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção são biespecíficos compreendendo uma primeira especificidade de ligação para PD-L1 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. O segundo epítopo alvo pode ser um outro epítopo no PD-L1 ou em uma proteína diferente tal como co-inibidor de célula T. Em certas concretizações, o epítopo alvo pode estar em uma célula diferente incluindo por exemplo, uma célula T diferente, uma célula B, uma célula de tumor, uma célula de tecido autoimune ou uma célula viralmente infectada.

[030] Em um segundo aspecto, a presente invenção prove moléculas de ácidos nucléicos que codificam anticorpos de anti-PD-L1 ou suas porções. Por exemplo, a presente invenção provê moléculas de ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listada na tabela 1; em certas concretizações a moléculas de ácido nucléico compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada de qualquer uma das sequências de ácidos nucléicos de HCVR listada na tabela 2, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aos mesmos.

[031] A presente invenção também provê moléculas de ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listada na tabela 1; em certas concretizações a molécula de ácido nucléico compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada de qualquer uma das sequências de ácidos nucléicos de LCVR listada na tabela 2, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aos mesmos.

[032] A presente invenção também provê moléculas de ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR1 listada na tabela 1; em certas concretizações a molécula de ácido nucléico compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada de qualquer uma das sequências de ácidos nucléicos de HCDR1 listada na tabela 2, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aos mesmos.

[033] A presente invenção também provê moléculas de ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR2 listada na tabela 1; em certas concretizações a molécula de ácido nucléico compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada de qualquer uma das sequências de ácidos nucléicos de HCDR2 listada na tabela 2, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aos mesmos.

[034] A presente invenção também provê moléculas de ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das HCDR3 sequências de aminoácidos listada na tabela 1; em certas concretizações a molécula de ácido nucléico compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada de qualquer uma das sequências de ácidos nucléicos de HCDR3 listada na tabela 2, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aos mesmos.

[035] A presente invenção também provê moléculas de ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR1 listadas na tabela 1; em certas concretizações a molécula de ácido nucléico compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada de qualquer uma das sequências de ácidos nucléicos de LCDR1 listadas na tabela 2, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aos mesmos.

[036] A presente invenção também provê moléculas de ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR2 listada na tabela 1; em certas concretizações a molécula de ácido nucléico compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada de qualquer uma das sequências de ácidos nucléicos de LCDR2 listada na tabela 2, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aos mesmos.

[037] A presente invenção também provê moléculas de ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR3 listada na tabela 1; em certas concretizações a molécula de ácido nucléico compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada de qualquer uma das sequências de ácidos nucléicos de LCDR3 listada na tabela 2, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aos mesmos.

[038] A presente invenção também provê moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma HCVR, em que a HCVR compreende um conjunto de três CDRs (isto é, HCDR1-HCDR2-HCDR3), em que o conjunto de sequência de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3 é como definido por qualquer um dos anticorpos de anti-PD-L1 exemplares listado na tabela 1.

[039] A presente invenção também provê moléculas de ácidos nucléicos que codifica uma LCVR, em que a LCVR compreende um conjunto de três CDRs (isto é, LCDR1-LCDR2-LCDR3), em que o conjunto de sequência de aminoácidos de LCDR1-LCDR2-LCDR3 é como definido por qualquer um dos anticorpos de anti-PD-L1 exemplares listado na tabela 1.

[040] A presente invenção também provê moléculas de ácidos nucléicos que codifica tanto uma HCVR quanto uma LCVR, em que the HCVR compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listada na tabela 1, e em que a LCVR compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listada na tabela 1. Em certas concretizações, a molécula de ácido nucléico compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada de qualquer uma das sequências de ácidos nucléicos de HCVR listada na tabela 2, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aos mesmos, e uma sequência de polinucleotídeos selecionada de qualquer uma das sequências de ácidos nucléicos de LCVR listada na tabela 2, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência aos mesmos. Em certas concretizações de acordo com este aspecto da invenção, a molécula de ácido nucléico codifica uma HCVR e uma LCVR, em que a HCVR e a LCVR são ambas derivadas do mesmo anticorpo de anti-PD-L1 listado na tabela 1.

[041] Em um aspecto relacionado, a presente invenção prove vetores de expressão recombinantes capazes de expressar um polipeptídeo compreendendo uma região variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo de anti-PD-L1. Por exemplo, a presente invenção inclui vetores de expressão recombinantes compreendendo qualquer uma das moléculas de ácidos nucléicos mencionada acima, isto é, moléculas de ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das sequências de HCVR, LCVR, e/ou CDR como indicada na tabela 1. Também incluído dentro do escopo da presente invenção são células hospedeiras para dentro das quais tais vetores foram introduzidos, bem como métodos de produção dos anticorpos ou suas porções por cultivo das células hospedeiras sob condições de permissão de produção dos anticorpos ou fragmentos de anticorpo, e recuperação dos anticorpos e fragmentos de anticorpo assim produzidos.

[042] Em um terceiro aspecto, a presente invenção prove moléculas de ligação de antígeno multi-específicas e seus fragmentos de ligação de antígeno compreendendo uma primeira ligação de especificidade de antígeno que se liga especificamente a PD-L1 e uma segunda ligação de especificidade de antígeno que se liga especificamente a um antígeno selecionado do grupo que consiste de PD-L1, um antígeno específico de célula, um antígeno específico de célula infectado, e um co-inibidor de célula T. Em certas concretizações, a primeira especificidade de ligação de antígeno pode compreender três CDRs derivadas de uma HCVR com uma sequência de aminoácidos selecionada das sequências de HCVR na tabela 1 e três CDRs derivadas de uma LCVR com uma sequência de aminoácidos selecionada das sequências de LCVR na tabela 1. Em uma concretização, a primeira especificidade de ligação de antígeno pode compreender um domínio extracelular de PD-1 ou de B7-1, ou um seu fragmento. A segunda especificidade de ligação de antígeno pode direcionar um antígeno na mesma célula que PD-L1 ou em uma célula diferente do mesmo tipo de tecido ou de um tipo diferente de tecido. Por exemplo, a molécula de ligação de antígeno multi-específica pode se ligar a uma célula T em que a primeira especificidade de ligação de antígeno pode se ligar especificamente a PD-L1 e a segunda especificidade de ligação de antígeno pode se ligar a um co-inibidor de célula T na célula T. Alternativamente, em uma outra concretização, a primeira especificidade de ligação de antígeno se liga especificamente a PD-L1 em uma célula T e a segunda especificidade de ligação de antígeno é direcionada a um antígeno/receptor em uma célula B ou um macrófago ou célula de apresentação de antígeno. Em certas concretizações, a segunda especificidade de ligação de antígeno é dirigida a um antígeno em uma célula de tumor ou em uma célula infectada com um vírus. Em uma concretização, a primeira especificidade de ligação de antígeno compreende um domínio extracelular de PD-1 and a segunda especificidade de ligação de antígeno se liga a um epítopo diferente em PD-L1. Em certas concretizações, a primeira especificidade de ligação de antígeno se liga a PD-L1 com uma afinidade mais baixa, por exemplo, com uma KD mais do que 10-8 M, mais do que 10-7 M, mais do que 10-6 M, ou mais do que 10-5 M.

[043] Em um quarto aspecto, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humano recombinante ou seu fragmento de ligação de antígeno que especialmente liga PD-L1 e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto relacionado, a invenção caracteriza uma composição que é uma combinação de um anticorpo de anti-PD-L1 e um segundo agente terapêutico. Em uma concretização, o segundo agente terapêutico é qualquer agente que é vantajosamente combinado com um anticorpo de anti-PD-L1. Agentes exemplares que podem ser vantajosamente combinados com um anticorpo de anti-PD-L1 incluem, sem limitação, outros agentes que ligam e/ou modulam sinalização de PD-L1 (incluindo outros anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno, etc.) e/ou agentes que não diretamente ligam PD-L1 mas no entanto modulam ativação de célula imune. Terapias de combinação adicionais e co-formulações que envolvem os anticorpos de anti-PD-L1 e moléculas de ligação de antígeno multi-específicas da presente invenção são revelados outro lugar aqui.

[044] Em um quinto aspecto, a invenção provê métodos para modular a resposta imune em um indivíduo, o método compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de anti-PD-L1 ou seu fragmento de ligação de antígeno da invenção ao indivíduo que necessita do mesmo. Em certas concretizações, a invenção provê métodos para melhorar a resposta imune em um indivíduo, os métodos compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz um anticorpo ou seu fragmento da invenção que se liga PD-L1 e bloqueia ligação de PD-L1 a PD-1 ou a B7-1. Em uma concretização, a invenção provê um método para estimular ou melhorar ativação de célula T em um indivíduo, o método compreendendo administração de anticorpo de bloqueio ou seu fragmento de ligação de antígeno da invenção ao indivíduo que necessita do mesmo. Em uma concretização, a invenção provê métodos para inibir uma célula reguladora T (Treg) um indivíduo, os métodos compreendendo administração de anticorpo de bloqueio ou seu fragmento de ligação de antígeno da invenção ao indivíduo que necessita do mesmo. Em certas concretizações, o indivíduo que necessita do mesmo pode sofrer de uma doença ou uma desordem tal como câncer ou infecção viral. Em concretizações substitutas, a presente invenção provê métodos para inibir ativação de célula T, os métodos compreendendo administração de um anticorpo de ativação ou seu fragmento de ligação de antígeno da invenção a um indivíduo que necessita do mesmo. Em certas concretizações, o indivíduo que necessita do mesmo pode sofrer de uma doença autoimune.

[045] Em um sexto aspecto, a invenção provê métodos terapêuticos para o tratamento de uma doença ou uma desordem, por exemplo, câncer ou infecção viral, em um indivíduo usando-se um anticorpo de anti-PD-L1 ou uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo da invenção, em que os métodos terapêuticos compreendem administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de um anticorpo da invenção ao indivíduo que necessita do mesmo. A desordem tratada é qualquer doença ou condição que é aperfeiçoada, melhorada, inibida ou prevenida por estimulação ou inibição de atividade ou ligação de PD-L1. Em certas concretizações, o anticorpo ou um seu fragmento de ligação de antígeno da invenção é administrado em combinação com um segundo agente terapêutico ao indivíduo que necessita do mesmo. O segundo agente terapêutico pode ser selecionado do grupo que consiste de um anticorpo para um co-inibidor de célula T, um anticorpo para um antígeno de célula de tumor, um anticorpo para um receptor de célula T, um anticorpo para um receptor de Fc, um anticorpo para um epítopo em uma célula viralmente infectada, um anticorpo para PD-1, um agente citotóxico, um fármaco anti-câncer, um fármaco anti-viral, um fármaco anti-inflamatório (por exemplo, corticoesteróides), um antagonista de VEGF, e qualquer outro fármaco ou terapia conhecido na técnica. Em certas concretizações, o segundo agente terapêutico pode ser um agente que auxilia a neutralizar ou a reduzir qualquer(quaisquer) efeito(s) colateral(ais) possível(eis) associado(s) a um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno da invenção, se tais efeito(s) colateral(ais) ocorreria(m).

[046] Em certas concretizações, a presente invenção prove métodos para a supressão de crescimento de tumor. Em certas concretizações, a presente invenção provê métodos para melhorar a sobrevivência de pacientes de câncer. Exemplos de câncer incluem, mas não são limitados a, câncer primário e/ou recorrente, incluindo câncer no cérebro (por exemplo, glioblastoma multiforme), câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de célula não pequena), carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço, carcinoma de célula renal, melanoma, mieloma múltiplo, câncer de próstata, e câncer de cólon. Os métodos compreendem administração de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de anti-PD-L1 da presente invenção em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado do grupo que consiste de um antagonista de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (por exemplo, aflibercept, bevacizumab), um inibidor de angiopoietina-2 (Ang2) (por exemplo, um anticorpo de anti-Ang2 tal como nesvacumab), um inibidor de gene de ativação de linfócito 3 (LAG-3), um inibidor de antígeno linfócito T citotóxico 4 (CTLA-4) (por exemplo, ipilimumab), um inibidor de CCR4 (por exemplo, mogamulizumab), um agente quimioterapêutico, e terapia de radiação. Exemplos adicionais de terapias adicionais /agentes terapêuticos que podem ser usados em combinação com um anticorpo de anti-PD-L1 da invenção para o uso no tratamento de câncer são descritos em outro lugar aqui.

[047] O anticorpo ou seu fragmento pode ser administrado subcutaneamente, intravenosamente, intradermicamente,intraperitonealmente, oralmente, intramuscularmente, ou intracranialmente. O anticorpo ou seu fragmento pode ser administrado em uma dose de cerca de 0,1 mg/kg de peso de corpo a cerca de 100 mg/kg de peso de corpo do indivíduo.

[048] A presente invenção também inclui uso de um anticorpo de anti-PD-L1 ou seu fragmento de ligação de antígeno da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou uma desordem (por exemplo, câncer, e infecção viral crônica) que se beneficiaria do bloqueio ou melhoramento da ligação de sinalização e/ou melhoramento de PD-L1.

[049] Outras concretizações se tornarão evidentes a partir de uma revisão seguindo a descrição detalhada.

Breve Descrição das Figuras

[050] A figura 1 é uma vista esquemática do bioensaio de PD-L1 com base em luciferase descrito no Exemplo 8 aqui. Painel A: células de Jurkat inativas; Painel B: células de Jurkat são ativadas por agrupamento de receptor de célula T (TCR) através do anticorpo biespecífico de CD3xCD20; Painel C: ativação PD-1 atenua resposta em células de Jurkat ativadas; Painel D: bloqueio de PD-L1 resgata a resposta em células de Jurkat ativadas.

[051] A figura 2 ilustra resultados de sobrevivência e crescimento de tumor para camundongos implantados com células de tumor de Colon-26 no dia 0 e tratadas com as combinações indicadas de moléculas por injeção no dias 3, 6, 10, 13 e 19 ("modelo de tumor tratamento precoce"). O gráfico mostra volume de tumor (em mm3) para os grupos experimentais diferentes em vários pontos de tempo depois da implantação. Setas para cima ao longo do eixo de X indicam o timing das injeções de tratamento. "mIgG2a" é controle de isótipo de IgG2; "Fc" é controle de Fc de ser humano; "armadilha para VEGF" é aflibercept; "anti-PD-1" é clone de PD-1 de anti-camundongo RPMI-14; “anti-PD-L1” é um anticorpo monoclonal de anti-PD-L1 como descrito em outro lugar aqui.

[052] A figura 3 ilustra resultados de sobrevivência e crescimento de tumor para camundongos implantados com células de Colon-26 de tumor no dia 0 e tratados com as combinações indicadas de moléculas por injeção nos dias 3, 6, 10, 13 e 19 ("modelo de tumor tratamento precoce"). O gráfico mostra o volume de tumor (em mm3) de camundongos individuais em cada grupo experimental no dia 28 depois da implantação. "mIgG2a" é o controle de isótipo de IgG2; "Fc" é um controle de Fc de ser humano; "armadilha para VEGF" é aflibercept; "anti-PD-1" é clone de PD-1 de anti-camundongo RPMI-14; “anti-PD-L1” é um anticorpo monoclonal de anti-PD-L1 como descrito em outro lugar aqui.

Descrição Detalhada

[053] Antes dos presentes métodos são descritos. Deve ser entendido que esta invenção não é limitada a métodos particulares, e condições experimentais descritos, como tais métodos e condições podem variar. Deve também ser entendido que a terminologia usada aqui e apenas para a finalidade de descrever concretizações particulares, e não destina-se a ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será apenas limitado pelas reivindicações anexa.

[054] A não ser que de outra maneira definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por um de habilidade comum na técnica ao qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui podem ser usados na prática ou na testagem da presente invenção, métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

[055] O termo “PD-L1” refere-se a ligante de morte programada 1, também conhecido como CD274 e B7H1. A sequência de aminoácidos de PD-L1 de comprimento total é provida no número de acesso no GenBank número NP_054862.1 e é também chamada aqui de SEQ ID NO: 351. O termo “PD-L1” também inclui variantes de proteína de PD- L1 tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 345, 346, 347 ou 348. O termo “PD-L1” inclui PD-L1 recombinante ou um seu fragmento. O termo também inclui PD-L1 ou um seu fragmento acoplado a, por exemplo, etiqueta de histidina, Fc de ser humano ou de camundongo, ou uma sequência de sinal tal como ROR1. Por exemplo, o termo inclui sequências exemplificadas pela SEQ ID NOs: 347 ou 348, compreendendo um fragmento de Fc de camundongo(mIgG2a) ou human Fc (hIgG1) no C-terminal, acoplado a resíduos de aminoácidos 19 - 239 PD-L1 de comprimento total (SEQ ID NO: 351; NP_054862.1). Variantes de proteína como exemplificadas pela SEQ ID NO: 345 compreendem a etiqueta de histidina no C-terminal, acoplada a resíduos de aminoácidos 19 - 239 de NP_054862.1. A não ser que de outra maneira especificado como sendo de uma espécie não humana, o termo “PD-L1” significa PD-L1 de ser humano.

[056] PD-L1 é uma proteína de 290 aminoácidos com domínios de tipo IgC e de tipo IgV extracelulares (aminoácidos 19 - 239 de PD-L1 de comprimento total), um domínio de transmembrana e um domínio intracelular de cerca de 30 aminoácidos. PD-L1 é constitutivamente expresso em muitas células tais como células de apresentação de antígeno (por exemplo, células dendítricas, macrófagos, e células B) e em células hematopoiéticas e não hematopoiéticas (por exemplo, células endoteliais vasculares, ilhotas pancreáticas, e sítios de privilégio imune). PD-L1 é também expresso em uma ampla variedade de tumores, e células viralmente infectadas e é um componente do meio imunossupressivo (Ribas 2012, NEJM 366: 2517-2519). PD-L1 se liga a um dos dois co-inibidores de PD-1 e B7-1 de célula T.

[057] O termo “PD-1” refere-se à proteína de morte 1 programada, um co-inibidor de célula T, também conhecida como CD279. É provida a sequência de aminoácidos de PD-1 de comprimento total no GenBan como número de acesso NP_005009.2 e é também chamada aqui de SEQ ID NO: 352. O termo também inclui PD-1 ou um seu fragmento acoplado a, por exemplo, etiqueta de histidina, Fc de ser humano ou de camundongo, ou uma sequência de sinal tal como ROR1. Por exemplo, o termo inclui sequências exemplificadas pelas SEQ ID NOs: 349 ou 350, compreendendo um fragmento de Fc de camundongo (mIgG2a) ou um Fc de ser humano (hIgG1) no C-terminal, acoplado a resíduos de aminoácidos 25 - 170 de NP_005009.2 com uma mudança de C93S.

[058] PD-1 é um membro da família de CD28/ CTLA-4/ICOS de co-inibidores de célula T. PD-1 é uma proteína de 288 aminoácidos com um domínio N-terminal extracelular que é de tipo IgV, um domínio de transmembrana e um domínio intracelular contatando um pedaço inibidor com base em tirosina de imunorreceptor (ITIM) e um pedaço de mudança com base em tirosina de imunorreceptor (ITSM) (Chattopadhyay e outros 2009, Immunol. Rev.). O receptor de PD-1 tem dois ligantes PD-L1 e PD-L2.

[059] O termo “B7-1” refere-se ao antígeno de ativação de linfócito T, também conhecido como fator co-estimulador CD80. B7-1 é um receptor de membrana de 288 de aminoácidos com um domínio N- terminal extracelular que compreende regiões de tipo IgV (aa 37 - 138) e de tipo IgC (aa 154 - 232), um domínio de transmembrana (aa 243 - 263) e uma região intracelular C-terminal (aa 263 - 288). A sequência de aminoácidos de B7-1 de comprimento total é provida no GenBank como número de acesso NP_005182.1.

[060] Como usado aqui, o termo “co-inibidor de célula T” refere-se a um ligante e/ou receptor que modula a resposta imune via ativação ou supressão de célula T. O termo “co-inibidor de célula T”, também conhecido como molécula de co-sinalização de célula T, inclui, mas não é limitada a, PD-1, proteína de gene 3 de ativação de linfócito (LAG-3, também conhecido como CD223), antígeno de linfócito T citotóxico-4 (CTLA-4), atenuador de linfócito B e T (BTLA), CD-28, 2B4, LY108, imunoglobulina de célula T e mucina-3 (TIM3), imunorreceptor de célula T com imunoglobulina e ITIM (TIGIT; também conhecido como VSIG9), receptor de tipo imunoglobulina associada a leucócito 1 (LAIR1; também conhecido como CD305), co-estimulador de célula T co-induzível (ICOS; também conhecido como CD278), B7-1 (CD80), e CD160.

[061] O termo "anticorpo", como usado aqui, é destinado a referir- se a moléculas de imunoglobulina constituídas de quatro cadeias de polipeptídeos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas com ligações de dissulfeto (isto é, " moléculas de anticorpo totais"), bem como seus multímeros (por exemplo IgM) ou seus fragmentos de ligação de antígeno. Cada cadeia pesada é constituída de uma região variável de cadeia pesada (“HCVR” ou “VH”) e uma região constante de cadeia pesada (constituídas de domínios CH1, CH2 e CH3). Cada cadeia leve é constituídas de uma região variável de cadeia leve (“LCVR ou “VL”) e uma região constante de cadeia leve (CL). As regiões de VH e VL podem ser ulteriormente subdivididos em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, chamadas de regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é constituída de três CDRs e quatro FRs, é disposta de amino-terminal até carbóxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em certas concretizações da invenção, as FRs do anticorpo (ou seu fragmento de ligação de antígeno) podem ser idênticas às sequências de linhas de germes de ser humano, ou podem ser naturalmente ou artificialmente modificadas. Uma sequência de consenso de aminoácidos pode ser definida com base em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs.

[062] Substituição de um ou mais resíduos de CDR ou omissão de um ou mais CDRs é também possível. Anticorpos foram descritos na literatura científica em que uma ou duas CDRs podem ser distribuídas com para a ligação. Padlan e outros (1995 FASEB J. 9:133-139) analisadas as regiões de contato entre anticorpos e seus antígenos, com base nas estruturas publicadas, e concluídas que apenas cerca de um quinto a um terço de resíduos de CDR realmente contatam o antígeno. Padlan também encontrou muitos anticorpos em que uma ou duas CDRs não tinham nenhum amino ácido em contato com um antígeno (vide também, Vajdos e outros 2002 J Mol Biol 320:415-428).

[063] Resíduos de CDR que não contatam antígeno podem ser identificados com base nos estudos anteriores (por exemplo, resíduos H60-H65 em CDRH2 são frequentemente não exigidos), a partir das regiões de Kabat CDRs lying outside Chothia CDRs, por modelagem e/ou empiricamente molecular. Se uma CDR ou seu(s) resíduo (s) for omitido. É usualmente substituído com um amino ácido que ocupa a posição correspondente em uma outra sequência de anticorpos de ser humano ou um consenso de tais sequências. Posições para substituição dentro das CDRs e aminoácidos para substituir podem também be ser selecionados empiricamente. Substituições empíricas podem ser substituições conservadoras ou substituições não conservadoras.

[064] Os anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 totalmente de ser humano revelados aqui podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos nas regiões de CDR e/ou estrutura dos domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada quando comparados com as sequências de linhas de germes correspondentes. Tais mutações podem ser prontamente determinadas por comparação das sequências de aminoácidos reveladas aqui com sequências de linhas de germes disponíveis de, por exemplo, base de dados de sequência de anticorpos de base públicas. A presente invenção inclui anticorpos, e seus fragmentos de ligação de antígeno, que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos revelada aqui, em que uma ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de CDR e/ou estrutura são transformadas no(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequência de linhas de germes a partir da qual o anticorpo foi derivado ou no(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma outra sequência de linhas de germes de ser humano, ou em uma substituição de amino ácido conservadora do(s) resíduo(s) de linha(s) de germe(s) (tais mudanças de sequência são chamadas aqui coletivamente de “mutações de linha de germe”). Uma pessoa de habilidade comum na técnica, partindo com as sequências de região variável de cadeia leve e pesada reveladas aqui, podem facilmente produzir anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno que compreendem uma ou mais mutações de linha de germe individuais ou suas combinações. Em certas concretizações, todos os resíduos de CDR e/ou estrutura dentro dos domínios de VH e/ou VL são transformados de volta nos resíduos encontrados na sequência de linhas de germes original a partir da qual o anticorpo foi derivado. Em outras concretizações, apenas certos resíduos são transformados de volta à sequência de linhas de germes origina, por exemplo, apenas os resíduos transformados encontrados dentro dos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou dentro dos últimos 8 aminoácidos of FR4, ou apenas os resíduos transformados encontrados dentro de CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras concretizações, uma ou mais do(s) resíduo(s) de CDR e/ou estrutura são transformados em o resíduo correspondente(s) de uma sequência de linhas de germes diferente (isto é, uma sequência de linhas de germes que é diferente da sequência de linhas de germes a partir da qual o anticorpo foi originalmente derivado). Além do mais, os anticorpos da presente invenção pode conter qualquer combinação de duas ou mais mutações de linhas de germes dentro de the regiões de CDR e/ou estrutura, por exemplo, em que certos resíduos individuais são transformados em o resíduo correspondente de uma sequência de linhas de germes particular embora certos outros resíduos que diferem da sequência de linhas de germes original sejam mantidos ou sejam transformados no resíduo correspondente de uma sequência de linhas de germes diferente. Uma vez obtidos, anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno que contêm uma ou mais mutações de linhas de germes podem ser facilmente testadas quanto uma ou mais propriedades desejadas tal como, especificidade de ligação aperfeiçoada, afinidade de ligação aumentada, propriedades biológicas agonísticas e antagonísticas melhoradas ou aperfeiçoadas (como o caso pode ser), imunogenicidade reduzida, etc. Anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno obtidos deste modo geral estão incluídos dentro da presente invenção.

[065] A presente invenção também inclui anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 totalmente de ser humano compreendendo variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR, e/ou CDR reveladas aqui tendo uma ou mais substituições conservadoras. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos de anti-PD-L1 tendo sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR, e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições de aminoácidos conservadoras em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR, e/ou CDR reveladas aqui.

[066] O termo "anticorpo humano", como usado aqui, destina-se a incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas de linhas de germes de ser humano. Os mAbs de ser humano da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulinas de linhas de germes de ser humano (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese específica de sítio ou aleatória in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e em particular CDR3. No entanto, o termo "human anticorpo", como usado aqui, não destina-se a incluir mAbs em que sequências de CDR derivadas da linha de germe de uma outra espécie de mamífero (por exemplo, camundongo), foram enxertadas sobre sequências de FR humanas. O termo inclui anticorpos recombinantemente produzidos em um mamífero não humano, ou em células de um mamífero não humano. O termo não destina-se a incluir anticorpos isolados de ou gerados em um indivíduo humano.

[067] O termo “moléculas de ligação de antígeno multi- específicas”, como usado aqui refere-se a moléculas de ligação de antígeno biespecíficas, tri-específicas ou multi-específicas, e seus fragmentos de ligação de antígeno. Moléculas de ligação de antígeno multi-específicas podem ser específicas para diferentes epítopos de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios de ligação de antígeno específicos para epítopos de mais do que um polipeptídeo alvo. Uma molécula de ligação de antígeno multi-específica pode ser um polipeptídeo multifuncional simples, ou pode ser um complexo multimérico de dois ou mais polipeptídeos que estão covalentemente ou não covalentemente associados a um outros. O termo “moléculas de ligação de antígeno multi-específicas” inclui anticorpos da presente invenção que podem ser ligados a o co-expressos com uma outra molécula funcional, por exemplo, um outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como uma proteína ou seu fragmento para produzir uma molécula de ligação de antígeno biespecífica ou multi- específica com uma segunda especificidade de ligação. De acordo com a presente invenção, o termo “moléculas de ligação de antígeno multi- específicas” também inclui anticorpos bi-específicos, tri-específicos ou multi-específicos ou seus fragmentos de ligação de antígeno. Em certas concretizações, um anticorpo da presente invenção é funcionalmente ligado a um outro anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno para produzir um anticorpo biespecífico com uma segunda especificidade de ligação. Anticorpos biespecíficos e multi-específicos da presente invenção são descritos em outro lugar aqui.

[068] O termo "ligações específicas," ou “ligações especificamente a”, ou semelhantes, significa que um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno foram um complexo com um antígeno que é relativamente estável sob condições fisiológicas. Ligação específica pode ser caracterizada por uma constante dissociação de equilíbrio de pelo menos cerca de 1x10-8 M ou menos (por exemplo, uma KD menor significa uma ligação mais comprimida). Métodos para a determinação se duas moléculas especificamente ligam são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, dialise de equilíbrio, ressonância de plasmônio de superfície, and semelhantes. Como descrito aqui, anticorpos foram identificados por ressonância de plasmônio de superfície, por exemplo, BIACORE™, que se ligam especificamente a PD-L1. Além do mais, anticorpos multi-específicos que ligam a um domínio em PD-L1 e um ou mais antígenos adicionais ou um bi- específico que se liga a duas diferentes regiões de PD-L1 são no entanto consideradas anticorpos que “especificamente se ligam”, como usado aqui.

[069] O termo anticorpo de “alta afinidade” refere-se àqueles mAbs tendo uma afinidade de ligação a PD-L1, expresso como KD, de pelo menos 10-8 M; de preferência 10-9 M; mais de preferência 10-10 M, ainda mais preferência 10-11 M, ainda mais com preferência 10-12 M, quando medido por ressonância de plasmônio de superfície, BIACORE™ ou ELISA por afinidade de solução.

[070] Pelo termo “taxa de dissociação lenta” (slow off rate”), “Koff” ou “kd” quer se dizer um anticorpo que se dissocia de PD-L1, com uma constante de taxa de 1 x 10-3 s-1 ou menos, de preferência 1 x 10-4 s-1 ou menos, como determinada por uma ressonância de plasmônio de superfície, por exemplo, BIACORE™.

[071] Os termos "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo, e semelhantes, como usado aqui, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzimaticamente obtenível, sintético ou geneticamente engenheirado que especificamente liga um antígeno para formar um complexo. Os termos "fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo, ou "fragmento de anticorpo”, como usado aqui, refere-se a uma ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de ser ligar a PD-L1.

[072] Em concretizações específicas, anticorpo ou fragmentos de anticorpo da invenção podem ser conjugados com uma porção tal ligante ou uma porção terapêutica (“imunoconjugado”), tal como antibiótico, um segundo anticorpo de anti-PD-L1, ou um anticorpo to um outro antígeno tal como antígeno específico de tumor, um antígeno de célula viralmente infectada, ou um co-inibidor de célula T, ou uma imunotoxina, ou qualquer outra porção terapêutica útil para o tratamento de a disease or condition incluindo por exemplo, câncer, infecção viral crônica ou doença autoimune.

[073] Um "anticorpo isolado", como usado aqui, é destinado a referir-se a um anticorpo que está substancialmente livre de outros anticorpos (Abs) tendo diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que especificamente liga PD-L1, ou um seu fragmento, está substancialmente livre de Abs que especificamente ligam antígenos outros que não PD-L1.

[074] Um “anticorpo de bloqueio” ou um "anticorpo de neutralização", como usado aqui (ou um "anticorpo que neutraliza atividade de PD-L1" ou um “anticorpo de antagonista”), é destinado a referir-se a um anticorpo cuja ligação a PD-L1 resulta na inibição de pelo menos uma atividade biológica de PD-L1. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode prevenir ou bloquear ligação de PD-L1 a PD-1 ou a B7-1.

[075] Um “anticorpo de ativação” ou um “anticorpo de melhoramento”, como usado aqui (ou um “anticorpo de agonista”), é destinado a referir-se a um anticorpo cuja ligação a PD-L1 resulta no aumento ou estimulação de pelo menos uma atividade biológica de PD- L1. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode aumentar ou melhorar ligação de PD-L1 a PD-1 ou a B7-1.

[076] O termo "ressonância de plasmônio de superfície", como usado aqui, refere-se a um fenômeno ótico que permite a análise de interações biomoleculares de tempo real por detecção de alterações nas concentrações de proteína dentro de uma matriz de biossensor, por exemplo, usando-se o sistema de BIACORE™ (Pharmacia Biossensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.).

[077] O termo "KD ", como usado aqui, é destinado a referir-se à constante de dissociação de equilíbrio de uma interação de um anticorpo-antígeno particular.

[078] O termo “epítopo” refere-se a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação de antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como um paratopo. Um antígeno simples pode ter mais do que um epítopo. Assim, diferentes anticorpos podem se ligar a diferentes áreas em um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. O termo “epítopo” também refere-se a um sítio em um antígeno ao qual células B e/ou T respondem. Também refere-se a uma região de um antígeno que está ligado por um anticorpo. Epítopos podem ser definidos como estruturais ou funcionais. Epítopos funcionais são em geral um sub-conjunto dos epítopos estruturais e têm aqueles resíduos que diretamente contribuem para a afinidade da interação. Epítopos podem também ser conformacionais, isto é, constituídos de aminoácidos não lineares. Em certas concretizações, epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos de fosforila, ou grupos de sulfonila e, em certas concretizações, podem ter características estruturais tridimensionais específicas, e/ou características de carga específicas.

[079] O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntica," quando se referindo a um ácido nucléico ou seu fragmento, indica que, quando otimamente alinhado com inserções ou deleções de nucleotídeo com um outro ácido nucléico (ou seu fio complementar), há identidade de sequência de nucleotídeos em pelo menos cerca de 90%, e mais de preferência pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeos, como medido por qualquer algorítmo bem conhecido de identidade de sequência tal como FASTA, BLAST ou GAP, como discutido abaixo. Uma molécula de ácido nucléico tendo identidade com uma molécula de ácido nucléico de referência pode, em certos casos, codificar um polipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácidos ou substancialmente similar que o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucléico de referência.

[080] Como aplicados a polipeptídeos, o termo "similaridade substancial" ou “substancialmente similar” significa que duas sequências de peptídeos, quando otimamente alinhados, tais como pelos programas GAP ou BESTFIT usando-se pesos da lacuna padrão, partilham pelo menos 90% de identidade de sequência, ainda mais preferência pelo menos 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência. De preferência, posições de resíduo, que não são idênticos, diferem pelas substituições de aminoácidos conservadores. Uma "substituição de amino ácido conservadora" é uma em que um resíduo de amino ácido está substituído por um outro resíduo de amino ácido tendo uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral general, a substituição de amino ácido conservadora substancialmente mudará as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos onde duas ou mais sequências de aminoácidos diferem entre si por substituições conservadoras, a percentagem ou o grau de similaridade pode ser ajustada para cima para corrigir para a natureza conservadora da substituição. Meios para fazer este ajuste são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. Vide, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307331, que é aqui incorporado por referência. Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais de hidroxila alifática: serina e treonina; 3) cadeias laterais contanto amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina, e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato, e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos conservadores preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservadora é qualquer mudança tendo um valor positivo na matriz de probabilidade de log de PAM250 log em Gonnet e outros (1992) Science 256: 1443 45, aqui incorporado por referência. Uma substituição "moderadamente conservadora" é qualquer mudança tendo um valor não negativo na matriz de probabilidade de log de PAM250.

[081] Similaridade de sequência para polipeptídeos é tipicamente medida usando-se software de análise de sequência. Software de análise de proteína emparelha sequências similares usando-se medições de similaridade atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácidos conservadoras. Por exemplo, software de GCG contém programas tais como GAP e BESTFIT que pode ser usado como parâmetros padrão para determinar homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos proximamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e sua muteína. Vide, por exemplo, GCG versão 6.1. Sequências de polipeptídeos também podem ser comparadas usando-se FASTA com parâmetros padrão ou recomendados em GCG versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) provê alinhamentos e percentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre a sequências em questão e de busca (Pearson (2000) supra). Um outro algorítmo preferido quando comparando uma sequência da invenção com uma base de dados contatando um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando-se parâmetros padrão. Vide, por exemplo, Altschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 and (1997) Ácido nucléicos Res. 25:3389-3402, cada um dos quais é incorporado por referência.

[082] Pela frase “quantidade terapeuticamente eficaz” quer se dizer uma quantidade que produz o efeito desejado para o qual é administrado. A quantidade exata dependerá da finalidade do tratamento, será determinável por aquele versado na técnica usando-se técnicas conhecidas (vide, por exemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).

[083] Como usado aqui, o termo “indivíduo” refere-se a um animal, de preferência um mamífero, que necessita de melhoramento, prevenção e/ou tratamento de uma doença ou uma desordem tal como infecção viral crônica, câncer ou doença autoimune.

[084] Como usado aqui, “fármaco anti-câncer” significa qualquer agente útil para tratar câncer incluindo, mas não limitado a, citotoxinas e agentes tais como antimetabólitos, agentes de alquilação, antraciclinas, antibióticos, agentes antimitóticos, procarbazina, hidroxiuréia, asparaginase, corticosteróides, mitotano (O,P‘-(DDD)), interferons e agentes radioativos. Como usado aqui, “um agente de citotoxina ou citotóxico” significa qualquer agente que é nocivo a células. Exemplos incluem Taxol® (paclitaxel), citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinbiastina, coiquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- desidroteestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e seus análogos ou homólogos.

[085] Como usado aqui, o termo “fármaco anti-viral” refere-se a qualquer fármaco ou terapia usada para trarar, prevenir, ou melhorar infecção viral em um indivíduo hospedeiro. O termo “fármaco anti-viral” inclui, mas não é limitada a zidovudina, lamivudina, abacavir, ribavirina, lopinavir, efavirenz, cobicistat, tenofovir, rilpivirina, analgésicos e corticosteróides. No contexto da presente invenção, as infecções virais incluem infecções crônicas ou de longo prazo causadas por vírus incluindo, mas não limitados a, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus de hepatite B (HBV), vírus de hepatite C (HCV), papiloma vírus de ser humano (HPV), vírus de coriomeningite linfocítica (LCMV), e vírus da imunodeficiência de símio (SIV).

[086] Os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção especificamente se ligam a PD-L1 e modulam a interação de PD-L1 com PD-1 ou com B7-1. Os anticorpos de anti-PD- L1 podem se ligar a PD-L1 com alta afinidade ou com baixa afinidade. Em certas concretizações, os anticorpos da presente invenção são anticorpo de bloqueios em que os anticorpos se ligam a PD-L1 e bloqueiam a interação de PD-L1 com PD-1 ou com B7-1. Em algumas concretizações, os anticorpos de bloqueio da invenção bloqueiam a ligação de PD-L1 a PD-1 ou a B7-1 e/ou estimular ou melhorar ativação de célula T. Em algumas concretizações, os anticorpos de bloqueio são úteis para estimulação ou melhoramento a resposta imune e/ou para o tratamento de um indivíduo que sofre de câncer, ou uma infecção viral crônica. Os anticorpos quando administrados a um indivíduo que necessita do mesmo podem reduzir a infecção crônica por um vírus tal como HIV, LCMV ou HBV no indivíduo. Eles podem ser usados para inibir o crescimento de células de tumor em um indivíduo. Elcs podem usados sozinhos ou como terapia auxiliar com outras modalidades ou porções terapêuticas conhecidas na técncia para o tratamento de câncer, ou infecção viral. Em certas concretizações, os anticorpos de anti-PD-L1 que ligam to PD-L1 com uma baixa afinidade são usados como moléculas de ligação de antígeno multi-específicas em que a primeira especificidade de ligação se liga a PD-L1 com uma baixa afinidade e a segunda especificidade de ligação se ligam a um antígeno selecionado do grupo que consiste de um diferente epítopo de PD-L1, um co-inibidor de célula T tal como PD-1, um antígeno específico de tumor e um antígeno específico de célula infectado.

[087] Em certas concretizações, os anticorpos de a presente invenção são anticorpos de agonista, em que os anticorpos se ligam a PD-L1 e melhoram a interação de PD-L1 e PD-1/B7-1. Em algumas concretizações, os anticorpo de ativação melhoram ligação de PD-L1 a PD-1 ou a B7-1 e/ou inibem ou suprimem ativação de célula T. Os anticorpos de ativação da presente invenção podem ser úteis para a inibição da resposta imune em um indivíduo e/ou para o tratamento de doença autoimune.

[088] Em certas concretizações, os anticorpos de anti-PD-L1 são moléculas de ligação de antígeno multi-específicas, em que eles compreendem uma primeira especificidade de ligação a PD-L1 e uma segunda especificidade de ligação a um antígeno selecionado do grupo que consiste de um diferente epítopo de PD-L1, um co-inibidor de célula T tal como PD-1, um antígeno específico de tumor e um antígeno específico de célula infectado. Em certas concretizações, a primeira especificidade de ligação se liga a PD-L1 com baixa afinidade, por exemplo, com uma KD de 10-8 M, 10-7 M ou mais.

[089] Certos anticorpos de anti-PD-L1 da presente invenção são capazes de se ligar a e neutralizar a atividade de PD-L1, como determinados por ensaios in vitro ou in vivo. A capacidade dos anticorpos da invenção de se ligar a e neutralizar a atividade de PD-L1 pode ser medida usando-se qualquer método padrão conhecido por aqueles versados na técnica, incluindo ensaios de ligação, ou ensaios de atividade, como descritos aqui.

[090] Ensaios in vitro exemplares, não limitantes para a medição de atividade de ligação são ilustrados no exemplo 3, aqui. No exemplo 3, as afinidades de ligação e constantes cinéticas de anticorpos de anti- PD-L1 humanos para PD-L1 de ser humano e PD-L1 de cynomolgus foram determinadas por ressonância de plasmônio de superfície e as medições foram conduzidas em um instrumento T200 Biacore. Nos exemplos 4 e 5, ensaios de bloqueio foram usados para determinar a capacidade dos anticorpos de anti-PD-L1 para bloquear capacidade de ligação de PD-L1 de PD-1 ou a B7-1 in vitro. No exemplo 6, ensaios de bloqueio foram usados para determinar competição cruzada entre diferentes anticorpos de anti-PD-L1. Exemplo 7 descreve a ligação dos anticorpos a células que ultra-expressam PD-L1. No exemplo 8, um ensaio de luciferase foi usado para determinar a capacidade de anticorpos de anti-PD-L1 a antagonizar PD-1/sinalização de PD-L1 em células T.

[091] Em certas concretizações, os anticorpos de a presente invenção são capazes de melhorar ou estimular ativação de célula T in vitro e em um indivíduo com câncer ou em um indivíduo infectado com um vírus tal como LCMV. Em certas concretizações, os anticorpos da presente invenção são usados em combinação com um segundo agente terapêutico, tal como um anticorpo com um antígeno específico de tumor ou um co-inibidor de célula T, para melhorar a resposta imune e inibir crescimento de tumor em um indivíduo. Em certas concretizações, os anticorpos de agonista da invenção capazes de melhorar ligação de PD-L1 a PD-1 ou a B7-1 e podem inibir ativação de célula T in vitro e/ou em um indivíduo com doença autoimune.

[092] Os anticorpos específicos para PD-L1 pode conter nenhum rótulo ou porção adicional, ou eles podem conter uma porção ou rótulo N-terminal ou C-terminal. Em uma concretização, o rótulo ou porção é biotina. Em um ensaio de ligação, a localização de um rótulo (se for o caso) pode determinar a orientação do peptídeo em relação à superfície em que o peptídeo está ligado. Por exemplo, se uma superfície for revestida com avidina, um peptídeo contatando uma biotina N-terminal será orientada tal que a porção C-terminal do peptídeo será distal em relação a superfície. Em uma concretização, o rótulo pode ser um radionuclídeo, um corante fluorescente ou um rótulo detectável por MRI. Em certas concretizações, tais anticorpos marcados podem ser usados em ensaios de diagnóstico incluindo ensaios de imagem.

Fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos

[093] A não ser que de outra maneira especificamente indicado, o termo "anticorpo," como usado aqui, será entendido como incluindo moléculas de anticorpo compreendendo duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina (isto é, "moléculas de anticorpo totais") bem como seus fragmentos de ligação de antígeno. Os termos "porção de ligação de antígeno " de um anticorpo, "fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo, e semelhantes, como usado aqui, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzimaticamente obtenível, sintético ou geneticamente engenheirado que especificamente liga um antígeno para formar um complexo. Os termos "fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo, ou "fragmento de anticorpo”, como usado aqui, refere-se a uma ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de especificamente se ligar a PD-L1. Um fragmento de anticorpo pode incluir um fragmento de Fab, um fragmento de F(ab')2, um fragmento de Fv, fragmento de dAb, fragmento de contatando a CDR, ou uma CDR isolada. Em certas concretizações, o termo “fragmento de ligação de antígeno” refere-se a um polipeptídeo ou seu fragmento de uma molécula de ligação de antígeno multi-específica. Em tais concretizações, o termo “fragmento de ligação de antígeno” inclui, por exemplo, um domínio extracelular de PD-1 que liga especificamente a PD-L1. Fragmentos de ligação de antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpo totais usando-se quaisquer técnicas padrão adequados tais como técnicas de digestão proteolítica ou técnicas de engenheiramento genético recombinante que envolve a manipulação e expressão de DNA que codifica anticorpo variável e domínios constantes (opcionalmente). Tal DNA é conhecido e/ou está prontamente disponível de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fagos- anticorpos), ou podem ser sintetizadas. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou por uso de técnicas de biologia molecular, por exemplo, para dispor um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar e deletar aminoácidos, etc.

[094] Exemplos de fragmentos de ligação de antígeno não limitantes incluem: (i) fragmentos de Fab; (ii) fragmentos de F(ab')2; (iii) fragmentos de Fd; (iv) fragmentos de Fv; (v) moléculas de Fv (scFv) de cadeia simples; (vi) fragmentos de dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimas que consiste dos resíduos de aminoácidos que imitam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR) tal como peptídeo de CDR3), ou um peptídeo de FR3-CDR3-FR4 confinado. Outras moléculas engenheiradas, tais como anticorpos específicos de domínio, anticorpos de domínio simples, anticorpos deletados por domínio, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados na CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc.), imunofarmacêuticas modulares pequenas (SMIPs), e domínios de IgNAR variáveis de tubarão, são também incluídos dentro da expressão de "fragmento de ligação de antígeno," como usado aqui.

[095] Um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo tipicamente compreenderá pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou de composição de amino ácido e em geral compreenderá pelo menos uma CDR, que é adjacente a ou em quadro com uma ou mais sequências de estrutura. Nos fragmentos de ligação de antígeno tendo um domínio de VH associado a um domínio de VL, os domínios de VH e VL podem ser situados em relação a uns dos outros em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros de VH - VH, VH - VL ou VL - VL. Alternativamente, o fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo pode conter um domínio de VH ou VL monomérico.

[096] Em certas concretizações, um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável covalentemente ligado a pelo menos um domínio constante. Configurações exemplares, não limitantes de domínios variáveis e constantes que podem ser encontrados dentro de um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH -CH1; (ii) VH -CH2; (iii) VH -CH3; (iv) VH -CH1-CH2; (v) VH -CH1-CH2- CH3; (vi) VH -CH2-CH3; (vii) VH -CL; (viii) VL -CH1; (ix) VL -CH2; (x) VL -CH3; (xi) VL -CH1-CH2; (xii) VL -CH1-CH2-CH3; (xiii) VL -CH2-CH3; e (xiv) VL -CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplares listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser ou diretamente ligados a uns dos outros ou podem ser ligados por uma região ligadora ou articulação total ou parcial. Uma região de articulação pode consistir de pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos, que resulta em uma ligação flexível ou semi-flexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma molécula de polipeptídeo simples. Além do mais, um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compreender um homo-dímero ou hetero-dímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínio constante e variável listadas acima em associação não covalente entre si e/ou com um ou mais domínio de VH ou VL monomérico (por exemplo, por ligação(ões) de dissulfeto).

[097] Uma vez que com moléculas anticorpo inteiras, fragmentos de ligação de antígeno podem ser mono-específica ou multi-específica (por exemplo, bi-específica). Um fragmento de ligação de antígeno multi-específico de um anticorpo tipicamente compreenderá pelo menos dois domínios variáveis diferentes, em que cada domínio variável é capaz de especificamente se ligar a um antígeno separado ou a um epítopo diferente no mesmo antígeno. Qualquer formato de anticorpo multi-específico, incluindo os formatos de anticorpo bi-específicos exemplares revelados aqui, podem ser adaptados para o uso no contexto de um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo da presente invenção usando-se técnicas rotineiras disponíveis na técnica.

Preparação de anticorpos humanos

[098] Métodos para geração de anticorpos humanos em camundongos transgênicos são conhecidos na técnica. Quaisquer tais métodos conhecidos podem ser usados no contexto da presente invenção para formar anticorpos humanos que especificamente se ligam a PD-L1.

[099] Um imunógeno compreendendo qualquer um do que se segue pode ser usado para gerar anticorpos to PD-L1. Em certas concretizações, os anticorpos da invenção são obtidos a partir de camundongos imunizados com um imunógeno primário, tal como PD- L1 de comprimento total [Vide GenBank número de acesso NP_054862.1 (SEQ ID NO: 351)] ou com uma forma recombinante de PD-L1 ou fragmentos de PD-L1 de ser humano modificados (SEQ ID NOs: 345, 347 ou 348) ou com fragmentos de PD-L1 de cynomolgus modificados(SEQ ID NO: 346), seguidos por imunização com um imunógeno secundário, ou com um fragmento imunologicamente ativo de PD-L1.

[0100] Em certas concretizações, o imunógeno pode ser um peptídeo da extremidade N terminal ou C terminal de PD-L1. Em uma concretização, the imunógeno é o domínio de tipo IgV e/ou de tipo IgC extracelular de PD-L1. Em certas concretizações da invenção, o imunógeno é um fragmento de PD-L1 que varia de cerca de resíduos de aminoácidos 19 - 239 da SEQ ID NO: 351 (NP_054862.1).

[0101] Em algumas concretizações, o imunógeno pode ser um peptídeo recombinante de PD-L1 expresso em E. coli ou em quaisquer outras células eucarióticas ou de mamífero tais como células de ovário de hamster Chinês (CHO).

[0102] Em certas concretizações, anticorpos que ligam especificamente a PD-L1 podem ser preparados usando-se fragmentos das regiões observadas acima, ou peptídeos que se prolongam além das regiões designadas por cerca de 5 a cerca de 20 resíduos de aminoácidos de qualquer dos ou ambos os, as extremidades N ou C terminal das regiões descritas aqui. Em certas concretizações, qualquer combinação das regiões observadas acima ou seus fragmentos podem ser usados na preparação de anticorpos específicos de PD-L1.

[0103] Usando-se tecnologia de VELOCIMMUNE® (vide, por exemplo, a patente US no. 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) ou qualquer outro método conhecido para a geração de anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos de alta afinidade para PD-L1 são inicialmente isolados tendo uma região variável humano e uma região constante de camundongo. A tecnologia de VELOCIMMUNE® envolve a geração de camundongos transgênicos tendo um genoma compreendendo regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada operavelmente ligadas a locais de região constante de camundongo endógena tal que o camundongo produz um anticorpo compreendendo uma região variável de ser humano e uma região constante de camundongo em resposta a estimulação antigênica. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias leve e pesada do anticorpo são isoladas e são operavelmente ligadas ao DNA que codifica as regiões constantes de cadeia leve e de cadeia pesada. O DNA é então expresso em uma célula capaz de expressar o anticorpo totalmente humano.

Bioequivalentes

[0104] Os anticorpos de anti-PD-L1 e fragmentos de anticorpo da presente invenção incluem proteínas tendo sequências de aminoácidos que podem variar daqueles anticorpos descritos, mas que retêm a capacidade se ligar PD-L1. Tais anticorpos variantes e fragmentos de anticorpo compreendem uma ou mais adições, deleções, ou substituições de aminoácidos quando comparadas com sequência de origem, mas exibem atividade biológica que é essencialmente equivalente àquela dos anticorpos descritos. Do mesmo modo, o anticorpo-que codifica sequências de DNA da presente invenção incluem sequências que compreendem uma ou mais adições, deleções, ou substituições de nucleotídeos quando comparadas com a sequência revelada, mas que codificam um anticorpo ou fragmento de anticorpo que é essencialmente bioequivalente a um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção.

[0105] Duas proteínas de ligação de antígeno, ou anticorpos, são considerados bioequivalentes se, por exemplo, eles são equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cujas taxas e extensão de absorção não mostram uma diferença significativa quando administradas na mesma dose molar sob condições experimentais similares, ou dose simples ou doses múltiplas. Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticas se eles forem equivalentes na extensão de sua absorção mas não em sua taxa de absorção e ainda podem ser considerados bioequivalentes porque tais diferenças na taxa de absorção são intencionais e são refletidos no rótulo, não são essenciais para a obtenção das concentrações de fármaco no corpo eficazes no, por exemplo, uso crônico, e são considerados mediamente insignificantes para o produto de fármaco particular estudado.

[0106] Em uma concretização, duas proteínas de ligação de antígeno são bioequivalentes se não houver diferenças clinicamente significativas em sua segurança, pureza ou potência.

[0107] Em uma concretização, duas proteínas de ligação de antígeno são bioequivalentes se um paciente puder ser mudado uma ou mais vezes entre o produto de referência e o produto biológico sem um aumento esperado no risco de efeitos adversos, incluindo uma mudança clinicamente significativa em imunogenicidade, ou eficácia diminuída, quando comparados com terapia continuada sem tal mudança.

[0108] Em uma concretização, duas proteínas de ligação de antígeno são bioequivalentes se elas tanto agirem por um mecanismo comum quanto mecanismos de ação para a condição ou condições de uso, na extensão de que tais mecanismos são conhecidos.

[0109] Bioequivalência pode ser demonstrada por métodos in vivo e/ou in vitro. Medidas de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos, em que a concentração do anticorpo ou seu metabólito é medido no sangue, plasma, soro, ou outro fluido biológico como uma função de tempo; (b) um teste in vitro que foi correlacionado com e é razoavelmente previsto de dados de biodisponibilidade in vivo de ser humano; (c) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos em que o efeito farmacológico agudo apropriado do anticorpo (ou seu alvo) é medido como uma função de tempo; e (d) em uma experiência clínica bem controlada que estabelece segurança, eficácia ou biodisponibilidade ou bioequivalência de um anticorpo.

[0110] Variantes bioequivalentes dos anticorpos da invenção podem ser construídos por, por exemplo, formar várias substituições de resíduos ou sequências ou deleção de sequências ou resíduos terminais ou internos não necessárias para a atividade biológica. Por exemplo, resíduos de cisteína não essenciais para a atividade biológica podem ser deletados ou substituídos com outros aminoácidos para prevenir a formação de pontos de dissulfeto intramoleculares desnecessárias ou incorretas na renaturação. Em outros contextos, anticorpos bioequivalentes podem incluir variantes de anticorpo compreendendo mudanças de amino ácido, que modificam as características de glicolisação dos anticorpos, por exemplo, mutações que eliminam ou removem glicosilação.

Anticorpos de anti-PD-L1 compreendendo variantes de Fc

[0111] De acordo com certas concretizações da presente invenção, anticorpos de anti-PD-L1 são providos compreendendo um domínio de Fc compreendendo uma ou mais mutações que aumentam ou melhorem ligação de anticorpo ao receptor de FcRn, por exemplo, em pH ácido quando comparado com pH neutro. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos de anti-PD-L1 compreendendo uma mutação na região de CH2 ou CH3 do domínio de Fc, em que a(s) mutação(ões) aumenta(m) a afinidade do domínio de Fc a FcRn em um ambiente ácido (por exemplo, em um endossoma onde pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Tais mutações podem resultar em um aumento na semivida de soro do anticorpo quando administrado a um animal. Exemplos não limitantes de tais modificações de Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T), e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428 e/ou 433 (por exemplo, H/L/R/S/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, A, W, H, F ou Y [N434A, N434W, N434H, N434F ou N434Y]); ou uma modificação na posição 250 e/ou 428; ou uma modificação na posição 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F), e 434. Em uma concretização, a modificação compreende uma modificação de 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, N434S); uma modificação de 428L, 259I (por exemplo, V259I), e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação de 433K (por exemplo, H433K) e uma modificação de 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação de 252, 254, e 256 (por exemplo, 252Y, 254T, e 256E); uma modificação de 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação de 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P). Em ainda uma outra concretização, a modificação compreende uma modificação de 265A (por exemplo, D265A) e/ou a uma modificação de 297A (por exemplo, N297A).

[0112] Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos de anti- PD-L1 compreendendo um domínio de Fc compreendendo uma ou mais pares ou grupos de mutações selecionados do grupo que consiste de: 250Q e 248L (por exemplo, T250Q e M248L); 252Y, 254T e 256E (por exemplo, M252Y, S254T e T256E); 428L e 434S (por exemplo, M428L and N434S); 257I e 311I (por exemplo, P257I e Q311I); 257I e 434H (por exemplo, P257I e N434H); 376V e 434H (por exemplo, D376V e N434H); 307A, 380A e 434A (por exemplo, T307A, E380A e N434A); e 433K e 434F (por exemplo, H433K e N434F). Em uma concretização, a presente invenção inclui anticorpos de anti-PD-L1 compreendendo um domínio de Fc compreendendo uma mutação de S108P na região de articulação de IgG4 para promover estabilização de dímero. Todas as combinações possíveis das mutações de domínio de Fc expostos acima, e outras mutações dentro dos domínios variáveis de anticorpo revelados aqui, são contemplados dentro do escopo da presente invenção.

[0113] A presente invenção também inclui anticorpos de anti-PD-L1 compreendendo uma região constante de cadeia pesada quimérica (CH), em que a região de CH quimérica compreende segmentos derivados das regiões de CH de mais do que um isótipo de imunoglobulina. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem compreender uma região de CH quimérica compreendendo parte ou a totalidade de um domínio de CH2 derivado de uma molécula de IgG1 de ser humano, IgG2 de ser humano ou IgG4 de ser humano, combinados com parte ou a totalidade de um domínio de CH3 derivado de uma molécula de IgG1 de ser humano, IgG2 de ser humano ou IgG4 de ser humano. De acordo com certas concretizações, os anticorpos da invenção compreendem uma região de CH quimérica tendo uma região de articulação quimérica. Por exemplo, uma articulação quimérica pode compreender uma sequência de aminoácidos de "articulação superior" (resíduos de aminoácidos das posições de 216 a 227 de acordo com numeração de EU) derivada de uma região de articulação de IgG1 de ser humano, IgG2 de ser humano ou IgG4 de ser humano, combinada com uma sequência de "articulação inferior" (resíduos de aminoácidos das posições de 228 a 236 de acordo com numeração de EU) derivadas de uma região de articulação de IgG1, a IgG2 de ser humano ou a IgG4 de ser humano. De acordo com certas concretizações, a região de articulação quimérica compreende resíduos de aminoácidos derivadas de uma articulação superior de IgG1 de ser humano ou IgG4 de ser humano e resíduos de aminoácidos derivados da IgG2 de ser humano articulação inferior. Um anticorpo compreendendo uma região de CH quimérica como descrita aqui pode, em certas concretizações, exibem funções efetoras de Fc modificadas sem adversamente afetar as propriedades terapêuticas ou farmacocinéticas do anticorpo. (Vide, por exemplo, USSN. 14/170.166, depositado em 31 de janeiro de 2014, cuja revelação é aqui incorporada pela referência em sua totalidade).

Características biológicas dos anticorpos

[0114] Em geral, os anticorpos da presente invenção funcionam por ligação a PD-L1. A presente invenção inclui anticorpos de anti-PD-L1 e seus fragmentos de ligação de antígeno que ligam moléculas de PD-L1 monoméricas ou diméricas solúveis com alta afinidade. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos que ligam PD-L1 monomérico (por exemplo, a 25oC ou a 37oC) com uma KD de menos do que cerca de 318 pM como medido por ressonância de plasmônio de superfície, por exemplo, usando-se o formato de ensaio como definido no exemplo 3 aqui. Em certas concretizações, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno ligam PD-L1 monomérico com uma KD de menos do que cerca de 300 pM, menos do que cerca de 250 pM, menos do que cerca de 150 pM, menos do que cerca de 100 pM, ou menos do que cerca de 50 pM, como medido por ressonância de plasmônio de superfície, por exemplo, usando-se o formato de ensaio como definido no exemplo 3 aqui, ou um ensaio substancialmente similar.

[0115] A presente invenção também inclui anticorpos e seus fragmentos de ligação de antígeno que ligam PD-L1 dimérico (por exemplo, a 25oC ou a 37oC) com uma KD de menos do que cerca de 15 pM como medido por ressonância de plasmônio de superfície, por exemplo, usando-se o formato de ensaio como definido no exemplo 3 aqui. Em certas concretizações, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno ligam PD-L1 dimérico com uma KD de menos do que cerca de 12 pM, menos do que cerca de 10 pM, menos do que cerca de 8 pM, ou menos do que cerca de 5 pM, como medido por ressonância de plasmônio de superfície, por exemplo, usando-se o formato de ensaio como definido no exemplo 3 aqui, ou um ensaio substancialmente similar.

[0116] A presente invenção também inclui anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno que ligam cynomolgus (Macaca fascicularis) PD-L1 (por exemplo, a 25oC ou a 37oC) com uma KD de menos do que cerca de 28 nM como medido por ressonância de plasmônio de superfície, por exemplo, usando-se o formato de ensaio como definido no exemplo 3 aqui. Em certas concretizações, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno ligam PD-L1 de cynomolgus com uma KD de menos do que cerca de 25 nM, menos do que cerca de 20 nM, menos do que cerca de 15 nM, menos do que cerca de 10 nM, ou menos do que cerca de 5 nM, como medido por ressonância de plasmônio de superfície, por exemplo, usando-se o formato de ensaio como definido no exemplo 3 aqui, ou um ensaio substancialmente similar.

[0117] A presente invenção também inclui anticorpos e seus fragmentos de ligação de antígeno que ligam PD-L1 com uma semi-vida dissociativa (t7) de mais do que cerca de 1 minuto como medido por ressonância de plasmônio de superfície a 25°C ou 37°C, por exemplo,usando-se um formato de ensaio como definido no exemplo 3 aqui, ou um ensaio substancialmente similar. Em certas concretizações, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção ligam PD-L1 com um t1^ de mais do que cerca de 5 minutos, mais do que cerca de 10 minutos, mais do que cerca de 30 minutos, mais do que cerca de 50 minutos, mais do que cerca de 60 minutos, mais do que cerca de 70 minutos, mais do que cerca de 80 minutos, mais do que cerca de 90 minutos, mais do que cerca de 100 minutos, mais do que cerca de 200 minutos, mais do que cerca de 300 minutos, mais do que cerca de 400 minutos, mais do que cerca de 500 minutos, mais do que cerca de 600 minutos, mais do que cerca de 700 minutos, ou mais do que cerca de 800 minutos, como medido por ressonância de plasmônio de superfície a 25°C ou 37°C, por exemplo, usando-se um formato de ensaio como definido no exemplo 3 aqui (por exemplo, formato de captura de mAb ou formato de captura de antígeno), ou um ensaio substancialmente similar.

[0118] A presente invenção também inclui anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno que bloqueiam ligação de PD-L1 a PD-1 com uma IC50 de menos do que cerca de 770 pM como determinados usando-se um ensaio de imunoensaio com base em ELISA, por exemplo, como mostrado no exemplo 4, ou um ensaio substancialmente similar. A presente invenção também inclui anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno que bloqueiam Ligação de PD-L1 a B7-1 com uma IC50 de menos do que cerca de 10 nM como determinados usando-se um ensaio de imunoensaio com base em ELISA, por exemplo, como mostrado no exemplo 4, ou um ensaio substancialmente similar. A presente invenção também inclui anticorpos e seus fragmentos de ligação de antígeno que se ligam a PD-L1 e melhoram a ligação de PD-L1 a PD-1 ou a B7-1.

[0119] Em algumas concretizações, os anticorpos de a presente invenção pode se ligar ao domínio extracelular de PD-L1 ou a um fragmento do domínio. Em algumas concretizações, os anticorpos de a presente invenção podem se ligar a mais do que um domínio (anticorpos de reação cruzada). Em certas concretizações, os anticorpos de a presente invenção pode se ligar a um epítopo localizado no domínio extracelular compreendendo resíduos de aminoácidos 19 - 239 of NP_054862.1 (SEQ ID NO: 351). Em algumas concretizações, os anticorpos podem se ligar a um epítopo compreendendo um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste de resíduos de aminoácidos 1 - 221 da SEQ ID NOs: 345 - 348, ou 353.

[0120] Em certas concretizações, os anticorpos da presente invenção podem funcionar pelo bloqueio ou inibição da ligação de PD-1 ou a atividade de ligação de B7-1 Associados a PD-L1 por ligação a qualquer outra região ou fragmento da proteína de comprimento total, a sequência de aminoácidos de que é mostrada na SEQ ID NO: 351. Em certas concretizações, os anticorpos podem atenuar ou modular a interação entre PD-L1 e PD-1/B7-1.

[0121] Em certas concretizações, os anticorpos de a presente invenção podem ser anticorpos bi-específicos. Os anticorpos bi- específicos da invenção podem se ligar um epítopo em um domínio e pode também ligar um segundo epítopo em um domínio diferente de PD-L1. Em certas concretizações, os anticorpos bi-específicos da invenção podem se ligar dois diferentes epítopos no mesmo domínio. Em uma concretização, a molécula de ligação de antígeno multi- específica compreende uma primeira ligação de especificidade de antígeno em que a primeira especificidade de ligação compreende o domínio extracelular ou seu fragmento of PD-1; e uma segunda ligação de especificidade de antígeno a um outro epítopo de PD-L1. Em uma outra concretização, a molécula de ligação de antígeno multi-específica compreende uma primeira ligação de especificidade de antígeno em que a primeira especificidade de ligação compreende o domínio extracelular ou seu fragmento de B7-1; e uma segunda ligação de especificidade de antígeno a um outro epítopo de PD-L1.

[0122] Em uma concretização, a invenção provê um anticorpo monoclonal totalmente humano ou seu fragmento de ligação de antígeno que se liga a PD-L1, em que o anticorpo ou seu fragmento exibe uma ou mais das seguintes características: (i) compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 186, 202, 218, 234, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 306, 314, 322, 330 e 338, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (ii) compreende uma LCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 194, 210, 226, 242, 258, e 274, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (iii) compreende um domínio de HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 280, 288, 296, 304, 312, 320, 328, 336 e 344, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 200, 216, 232, 248, 264, e 280, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (iv) compreende um domínio de HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 292, 300, 308, 316, 324, 332, and 340, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 294, 302, 310, 318, 326, 334, and 342, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 196, 212, 228, 244, 260, e 276, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 198, 214, 230, 246, 262, e 278, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (v) é uma molécula de ligação de antígeno multi- específica compreendendo uma primeira especificidade de ligação a PD-L1 e uma segunda especificidade de ligação a um antígeno selecionado do grupo que consiste de PD-L1, um antígeno específico de tumor, um antígeno de célula viralmente infectado, e um co-inibidor de célula T; (vi) se liga a PD-L1 de ser humano com uma KD de cerca de 4 pM a cerca de 645 nM; (vii) se liga a PD-L1 de cynomolgus com uma KD de cerca de 70 pM a cerca de 400 nM; (viii) bloqueia ou melhora a ligação de PD-L1 a PD-1 com uma IC50 < 770 pM; (ix) bloqueia ou melhora a ligação de PD-L1 a B7-1 com uma IC50 < 10 nM; (x) bloqueia regulação para baixo de célula T induzida por PD-1 e/ou resgata sinalização de célula T em ensaio de repórter de luciferase de APC/célula T; (xi) estimula atividade e proliferação de célula T em um ensaio de reação de linfócito misto (MLR); (xii) induz produção de IL-2 e/ou IFNY em um ensaio de MLR; e (xiii) suprime crescimento de tumor e aumenta sobrevivência em indivíduos com câncer.

[0123] Em uma concretização, a invenção provê um anticorpo monoclonal totalmente humano ou seu fragmento de ligação de antígeno que bloqueia ligação de PD-L1 a PD-1 ou a B7-1, em que o anticorpo ou seu fragmento exibe uma ou mais das seguintes características: (i) compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 82, 98, 146, 162, 290, 306, 314, e 330, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (ii) compreende uma LCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 90, 106, 154, 170, e 274, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (iii) compreende um domínio de HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 88, 104, 152, 168, 296, 312, 320, e 336, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 96, 112, 160, 176, e 280, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (iv) compreende um domínio de HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 84, 100, 148, 164, 292, 308, 316, e 332, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 86, 102, 150, 166, 294, 310, 318, e 334, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 92, 108, 156, 172, e 276, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; and um domínio de LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 94, 110, 158, 174, e 278, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (v) é uma molécula de ligação de antígeno multi-específica compreendendo uma primeira especificidade de ligação to PD-L1 e uma segunda especificidade de ligação a um antígeno selecionada do grupo que consiste de um diferente epítopo de PD-L1, um antígeno específico de tumor, um antígeno de célula viralmente infectado, e um co-inibidor de célula T; (vi) se liga a PD-L1 de ser humano com uma KD < 10-10M; (vii) se liga a PD-L1 de cynomolgus com uma KD < 10-7M; (viii) bloqueia a ligação de PD-L1 a PD-1 ou a B7-1; (ix) bloqueia regulação para baixo de célula T induzida por PD-1 e/ou resgata sinalização de célula T in ensaio de repórter de luciferase de APC/célula T; (xi) estimula atividade e proliferação de célula T em um ensaio de reação de linfócito misto (MLR); (xii) induz produção de IL-2 e/ou IFNY em um ensaio de MLR; e (xiii) suprime crescimento de tumor e aumenta sobrevivência em indivíduos com câncer.

[0124] Os anticorpos de a presente invenção podem possuir uma ou mais das características biológicas mencionadas acima, ou quaisquer suas combinações. Outras características biológicas dos anticorpos da presente invenção estarão evidentes por uma pessoa de habilidade comum na técnica a partir de uma revisão da presente revelação incluindo o trabalho dos exemplos aqui.

Seletividade de espécies e reatividade cruzada de espécies

[0125] De acordo com certas concretizações da invenção, os anticorpos de anti-PD-L1 se ligam a PD-L1 de ser humano mas não a PD-L1 a partir de outras espécies. Alternativamente, os anticorpos de anti-PD-L1 da invenção, em certas concretizações, se ligam a PD-L1 de ser humano e a PD-L1 a partir de uma ou mais espécies não humanas. Por exemplo, os anticorpos de anti-PD-L1 da invenção podem se ligar a PD-L1 de ser humano e podem se ligar ou não ligar, como o caso pode ser, a um ou mais de camundongo, rato, cobaia, hamster, gerbil, porco, gato, cachorro, coelho, cabra, ovelha, vaca, cavalo, camelo, cynomolgus, sagui, rhesus ou chimpanzé PD-L1. Em certas concretizações, os anticorpos de anti-PD-L1 da invenção podem se ligar a PD-L1 de cynomolgus e de ser humano com as mesmas afinidades ou com diferentes afinidades.

Mapeamento de epítopo e tecnologias relacionadas

[0126] A presente invenção inclui anticorpos de anti-PD-L1 que interagem com um ou mais aminoácidos encontrados dentro de um ou mais domínios da molécula de PD-L1 incluindo, por exemplo, domínio de (tipo IgV) extracelular, o domíno de tipo IgC extracelular, um domínio de transmembrana, e um domínio intracelular. O epítopo ao qual os anticorpos ligam pode consistir de uma sequência contígua simples de 3 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais) aminoácidos located dentro de qualquer um dos domínios acima mencioanados da molécula de PD-L1 (por exemplo, um epítopo linear em um domínio). Alternativamente, o epítopo pode consistir de uma pluralidade de aminoácidos não contíguos (ou sequências de aminoácidos) localizados dentro de qualquer dos ou ambos os domínios acima mencionados da molécula de PD-L1 (por exemplo, um epítopo conformacional).

[0127] Várias técnicas conhecidas por pessoas de habilidade comum na técnica podem ser usadas para determinar se um anticorpo "interagir” com um ou mais aminoácidos" dentro de um polipeptídeo ou proteína. Técnicas exemplares incluem, por exemplo, ensaios de bloqueio de rotina cruzada, tais como aquele descrito nos anticorpos, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Outros métodos incluem análise mutacional de varredura de alanina, análise de blot de peptídeo (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), análise de clivagem de peptídeo de estudos cristalográficos e análise de RMN. Além disso, métodos tais como excisão de epítopo, extração de epítopo e modificação química de antígenos podem ser empregados (Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). Um outro método que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual um anticorpo interage é troca de hidrogênios/deutérios detectada por espectrometria de massa. Em geral termos, o método de troca de hidrogênios/deutérios envolve marcação de deutério da proteína de interesse, seguido por ligação do anticorpo à proteína marcada com deutério. A seguir, o complexo de proteína/anticorpo é transferido para água e prótons permutáveis dentro de aminoácidos que são protegidos pelo complexo de anticorpo sofrem de retro-troca de deutério em hidrogênio em uma taxa mais baixa do que prótons permutáveis dentro de aminoácidos que não são partes da interface. Como um resultado, aminoácidos que fazem parte da interface de proteína/anticorpo podem reter deutério e, portanto exibem massa relativamente mais alta em comparação com aminoácidos não incluídos na interface. Depois da dissociação do anticorpo, a proteína alvo é submetida a clivagem de protease e análise de espectrometria de massa, desse modo revelando os resíduos marcados com deutério que correspondem aos aminoácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Vide, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A.

[0128] O termo "epítopo" refere-se a um sítio em um antígeno ao qual células B e/ou T respondem. Epítopos de célula B podem ser formados tanto a partir de aminoácidos quanto aminoácidos não contíguos justapostos por dobramento terciário de uma proteína. Epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na exposição a solventes de desnaturação, enquanto que epítopos formados por dobramento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes de desnaturação. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, e mais usualmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma única conformação espacial.

[0129] Representação de perfil auxiliado por modificação (MAP),também conhecida como Representação de perfil de anticorpo com base em estrutura de antígeno (ASAP) é um método que categoriza grandes números de anticorpos monoclonais (mAbs) dirigidos contra o mesmo antígeno de acordo com as similaridades do perfil de ligação de cada anticorpo às superfícies de antígeno quimicamente ou enzimaticamente modificadas (vide US 2004/0101920, aqui especialmente incorporada por referência em sua totalidade). Cada categoria pode refletir um único epítopo ou distintamente diferente de ou sobreposição parcial com epítopo representado por uma outra categoria. Esta tecnologia permite rápida filtração de anticorpos geneticamente idênticos, tal que caracterização pode ser foculizado em anticorpos geneticamente distintos. Quando aplicado a triagem de hibridoma, MAP pode facilitar identificação de clones de hibridoma raros que produzem mAbs tendo as características desejadas. MAP pode ser usado para classificar os anticorpos da invenção em grupos de anticorpos que se ligam diferentes epítopos.

[0130] Em certas concretizações, os anticorpos de anti-PD-L1 ou seus fragmentos de ligação de antígeno ligam um epítopo dentro de qualquer uma ou mais das regiões exemplificadas em PD-L1, ou em forma natural, ou exemplificadas na SEQ ID NO: 351, ou recombinantemente produzidas, como exemplificadas na SEQ ID NOS: 345 - 348, ou a um seu fragmento. Em algumas concretizações, os anticorpos da invenção se ligam a uma região extracelular compreendendo um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste de resíduos de aminoácidos 19 - 239 de PD-L1. Em algumas concretizações, os anticorpos da invenção se ligam a uma região compreendendo um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste de resíduos de aminoácidos 1 - 221 de PD-L1 de cynomolgus, como exemplificada pela SEQ ID NO: 346.

[0131] Em certas concretizações, os anticorpos da invenção, como mostrados na tabela 1, interagem com pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de resíduos de aminoácidos que variam de cerca da posição 19 a cerca da posição 130 da SEQ ID NO: 351; ou resíduos de aminoácidos que variam de cerca da posição 130 a cerca da posição 153 de SEQ ID NO: 351; ou resíduos de aminoácidos que variam de cerca da posição 153 a cerca da posição 210 da SEQ ID NO: 351; ou a resíduos de aminoácidos que variam de cerca da posição 210 a cerca da posição 239 da SEQ ID NO: 351. Estas regiões são parcialmente exemplificadas na SEQ ID NOs: 345 - 348.

[0132] A presente invenção inclui anticorpos de anti-PD-L1 que ligam ao mesmo epítopo, ou uma porção do epítopo, como qualquer um dos anticorpos exemplares específicos descritos aqui na tabela 1, ou um anticorpo tendo as sequências de CDR de qualquer um dos anticorpos exemplares descrito na tabela 1. Do mesmo modo, a presente invenção também inclui anticorpos de anti-PD-L1 que compete para a ligação um PD-L1 ou um fragmento de PD-L1 com qualquer um dos anticorpos exemplares específicos descrito aqui na tabela 1, ou um anticorpo tendo as sequências de CDR of qualquer um dos anticorpos exemplares descrito na tabela 1. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos de anti-PD-L1 que competem cruzadamente para a ligação a PD-L1 com um ou mais anticorpos como definido no exemplo 6 aqui (por exemplo, H2aM8309N, H1H9329P, H1H9336P, H2aM8314N, H2aM8316N, H2AM8718N, H1H9387P2, H1H9351P2, H1H9364P2, H1H9373P2, e H2aM8306N). A presente invenção também inclui anticorpos de anti-PD-L1 que competem cruzadamente para a ligação a PD-L1 com um ou mais anticorpos como definido no exemplo 6 aqui (por exemplo, H1H9396P2, H2aM8317N, H2aM8321N, H1H9323P, H1H9382P2, H1H9344P2, H1H9345P2 e H1H9354P2).

[0133] Pode-se facilmente determinar ser um anticorpo se liga ao mesmo epítopo como, ou compete para a ligação com, um anticorpo de anti-PD-L1 de referência por uso de métodos rotineiros conhecidos na técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se ligar ao mesmo epítopo como um anticorpo de anti-PD-L1 de referência da invenção, o anticorpo de referência é deixado se ligar a uma proteína ou um peptídeo de PD-L1 sob condições de saturação. A seguir, a capacidade de um anticorpo de teste de se liga à molécula de PD-L1 é avaliada. Se o anticorpo de teste é capaz de ser ligar a PD-L1 após ligação de saturação com o anticorpo de anti-PD-L1 de referência, pode ser concluída que o anticorpo de teste se liga a um diferente epítopo do que o anticorpo de anti-PD-L1 de referência. Por outro lado, se o anticorpo de teste não for capaz de se ligar à proteína de PD-L1 após a ligação de saturação com o anticorpo de anti-PD-L1 de referência, então o anticorpo de teste pode se ligar ao mesmo epítopo como o epítopo ligado pelo anticorpo de anti-PD-L1 de referência da invenção.

[0134] Para determinar se um anticorpo compete pela ligação com um anticorpo de anti-PD-L1 de referência, a metodologia de ligação descrita acima é realizadas em duas orientações: Em uma primeira orientação, o anticorpo de referência é deixado se ligar a uma proteína de PD-L1 sob condições de saturação seguido por avaliação de ligação do anticorpo de teste à molécula de PD-L1. Em uma segunda orientação, o anticorpo de teste é deixado se ligar a uma molécula de PD-L1 sob condições de saturação seguido por avaliação de ligação do anticorpo de referência à molécula de PD-L1. Se, em ambas as orientações, penas um primeiro anticorpo (saturação) é capaz de se ligar à molécula de PD-L1, então é concluído que o anticorpo de teste e o anticorpo de referência compete para a ligação a PD-L1. Uma vez que será apreciado por uma pessoa de habilidade comum na técnica, um anticorpo que compete para a ligação com um anticorpo de referência pode não necessariamente se ligar ao epítopo idêntico como o anticorpo de referência, mas pode estericamente bloquear ligação do anticorpo de referência por ligação de uma sobreposição ou epítopo adjacente.

[0135] Dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo ou sobreposição de epítopo se cada competitivamente inibir (bloquear) ligação do outro ao antígeno. Isto é, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibe ligação do outro por pelo menos 50% mas de preferência 75%, 90% ou ainda 99% como medido em um ensaio de ligação competitivo (vide, por exemplo, Junghans e outros, Cancer Res. 1990 50:1495-1502). Alternativamente, dois anticorpos têm o mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de amino ácido no antígeno que reduzem ou eliminam ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam ligação do outro. Dois anticorpos têm sobreposição de epítopos se algumas mutações de amino ácido que reduzem ou eliminam ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam ligação do outro.

[0136] Experimentação rotineira adicional (por exemplo, mutação de peptídeo e análise de ligação) pode ser realizada para confirmar se carência observada de ligação do anticorpo de teste é de fato devido a ligação ao mesmo epítopo como o anticorpo de referência ou se bloqueio estérico (ou um outro fenômeno) for responsável pela carência de ligação observada. Experiências desta espécie pode ser realizada usando-se ELISA, RIA, ressonância de plasmônio de superfície, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação de anticorpo quantitativo ou qualitativo disponível na técnica.

Imunoconjugados

[0137] A invenção inclui um anticorpo monoclonal de anti-PD-L1 humano conjugado a uma porção terapêutica (“imunoconjugado”), tal como uma citotoxina ou agente quimioterapêutico para tratar câncer. Como usado aqui, o termo “imunoconjugado” refere-se a um anticorpo que é quimicamente ou biologicamente ligado a uma citotoxina, um agente radioativo, uma citocina, um interferon, uma porção alvo ou repórter, uma enzima, uma toxina, um peptídeo ou uma proteína ou um agente terapêutico. O anticorpo pode ser ligado à citotoxina, agente radioativo, citocina, interferon, porção alvo ou repórter, enzima, toxina, peptídeo ou agente terapêutico em qualquer localização ao longo da molécula contanto que seja capaz de ligar seu alvo. Exemplos de imunoconjugados incluem conjugados de fármaco de anticorpo e proteínas de fusão de toxina de anticorpo. Em uma concretização, o agente pode ser um segundo anticorpo diferente para PD-L1. Em certas concretizações, o anticorpo pode ser conjugado a um agente específico para uma célula de tumor ou uma célula viralmente infectada. O tipo de porção terapêutica que pode se conjugada ao anticorpo de anti-PD-L1 e levará em consideração a condição a ser tratada e o efeito terapêutico desejado a ser conseguido. Exemplos de agentes adequados para a formação de imunoconjugados são conhecidos na técnica; vide por exemplo, WO 05/103081.

Anticorpos Multi-específicos

[0138] Os anticorpos de a presente invenção podem ser mono- específicos, bi-específicos, ou multi-específicos. Anticorpos multi- específicos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipeptídeo alvo ou pode conter domínios de ligação de antígeno específicos para mais do que um polipeptídeo alvo. Vide, por exemplo, Tutt e outros, 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer e outros, 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244.

[0139] Em um aspecto, a presente invenção inclui moléculas de ligação de antígeno multi-específicas ou seus fragmentos de ligação de antígeno em que uma especificidade de ligação de antígeno de uma imunoglobulina é específica para um epítopo dentro de o domínio extracelular of PD-L1 (por exemplo, na região de tipo IgV), ou um seu fragmento, e a outra especificidade de ligação de antígeno da imunoglobulina é específica para a ligação a um diferente epítopo no domínio extracelular de PD-L1 (por exemplo, na região de tipo IgC), ou um segundo alvo terapêutico, ou é conjugado a uma porção terapêutica. Em certas concretizações, a primeira especificidade de ligação de antígeno pode compreender PD-1 ou B7-1 ou um seu fragmento. Em uma concretização, a primeira especificidade de ligação de antígeno que se liga a PD-L1 compreende o domínio extracelular de PD-1. Em certas concretizações da invenção, uma especificidade de ligação de antígeno de uma imunoglobulina é específica para um epítopo dentro de resíduos de aminoácidos 19 - 239 de PD-L1 (SEQ ID NO: 351) ou um seu fragmento, e a outra especificidade da imunoglobulina é específica para um segundo antígeno alvo. O segundo antígeno alvo pode estar na mesma célula que PD-L1 ou em uma célula diferente. Em uma concretização, a segunda célula alvo está em uma célula imune outro que não uma célula T tal como célula B, célula de apresentação de antígeno, monócito, macrófago, ou célula dendrítica. Em algumas concretizações, o segundo antígeno alvo pode apresentar em uma célula de tumor em uma célula viralmente infectada.

[0140] Em um outro aspecto, a invenção provê moléculas de ligação de antígeno multi-específicas ou seus fragmentos de ligação de antígeno compreendendo uma primeira ligação de especificidade de antígeno que se liga a PD-L1 e uma segunda ligação de especificidade de antígeno que se liga especificamente a um antígeno alvo em uma célula de tumor. Em várias concretizações, o antígeno específico de tumor é um de CA9, CA125, antígeno associado a melanoma (MAGE), antígeno carcinoembriônico (CEA), vimentin, M2-PK de tumor, antígeno específico de próstata (PSA), MART-1, ou CA19-9. Exemplos não limitantes de outros antígenos associados a tumor específicos incluem, por exemplo, AFP, ALK, proteínas de BAGE, β-catenina, brc-abl, BRCA1, BORIS, anidrase carbônica IX, caspase-8, CCR5, CD19, CD20, CD30, CD40, CDK4, CTLA4, ciclina-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra- 1, FOLR1, proteínas de GAGE (por exemplo, GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipican-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, proteínas de MAGE (por exemplo, MAGE-1, -2, -3, -4, -6, e -12), HLA-A2, MART-1, mesotelina, ML-IAP, Muc1, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY- BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), proteínas de RAGE, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, survivin, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, Tn, TRP-1, TRP-2, tirosinase, e uroplaquina-3. Em outras concretizações, a segunda especificidade de ligação de antígeno se liga a um antígeno de tumor que está presente em células de tumor específica a, mas não limitadas a, carcinoma de célula renal, câncer de próstata, câncer de colorretal, melanoma, câncer de mama, câncer de rim, câncer ovariano, e câncer pancreático. Os anticorpos da invenção, neste aspecto, podem inibir a atividade de PD- L1.

[0141] Em um outro aspecto, a invenção provê moléculas de ligação de antígeno multi-específicas ou seus fragmentos de ligação de antígeno em que a segunda especificidade de ligação de antígeno se liga a um antígeno específica a uma célula viralmente infectada. Em certas concretizações, a segunda especificidade de ligação de antígeno se liga a um antígeno específica a uma célula infectada com um vírus selecionado do grupo que consiste de HIV, HBV, HCV, HPV, LCMV e SIV.

[0142] Em um outro aspecto, a invenção provê moléculas de ligação de antígeno multi-específicas ou seus fragmentos de ligação de antígeno compreendendo uma primeira ligação de especificidade de antígeno que se liga a PD-L1 e uma segunda ligação de especificidade de antígeno que se liga a um co-inibidor de célula T tais como PD-1, LAG-3, TIM3, B7-1, CTLA-4, BTLA, CD-28, 2B4, LY108, TIGIT, LAIR1, ICOS e CD160.

[0143] Qualquer uma das moléculas de ligação de antígeno multi- específicas, ou suas variantes, podem ser construídas usando-se técnicas biológicas moleculares padrão (por exemplo, tecnologia de DNA recombinante e tecnologia de expressão de proteína), como serão bem conhecidos por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

[0144] Em algumas concretizações, anticorpos específicos de PD-L1 são gerados em um formado bi-específico (um "bi-específico") em que regiões variáveis que se ligam a domínios distintos de PD-L1 são ligados entre si para conferir especificidade de domínio duplo dentro de uma molécula de ligação simples. Apropriadamente bi-specificos projetados podem melhorar a eficácia inibitória de PD-L1 total através de aumento tanto de especificidade quanto avidez de ligação. Regiões variáveis com especificidade para domínios individuais, (por exemplo, segmentos do domínio N-terminal), ou podem se ligar a diferentes regiões dentro de um domínio, são emparelhadas em uma armação estrutural que permite cada região se ligar simultaneamente aos epítopos separados, ou a regiões diferentes dentro de um domínio. Em um exemplo para regiões variáveis de cadeia pesada (VH) bi-específicas oriundas de um aglutinante com especificidade para um domínio são recombinadas com regiões variáveis de cadeia leve (VL) de uma série de aglutinantes com especificamente para um segundo domínio para identificar pares VL não cognatos que podem ser emparelhados com uma VH original sem romper a especificidade original para aquela VH. Deste modo, um segmento de VL simples (por exemplo, VL1) pode ser combinado com dois diferentes domínios de VH (por exemplo, VH1 e VH2) para gerar um bi-específico constituído de dois “braços” de ligação (VH1- VL1 e VH2- VL1). Uso de um segmento de VL simples reduz a complexidade do sistema e desse modo simplifica e aumenta eficácia no processo de clonagem, expressão e purificação usados para gerar o bi-específico (Vide, por exemplo, US SN13/022759 e US 2010/0331527).

[0145] Alternativamente, anticorpos que ligam mais do que um domínios e um segundo alvo, tais como, mas não limitados a, por exemplo, um segundo diferente anticorpo de anti-PD-L1, pode ser preparado em um formato bi-específico usando-se técnicas descritas aqui, ou outras técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica. Anticorpo regiões variáveis que se ligam a regiões distintas podem ser ligadas juntamente com regiões variáveis que ligam a sítios relevantes em, por exemplo, o domínio extracelular de PD-L1, para conferir especificidade de antígeno duplo dentro de uma molécula de ligação simples. Apropriadamente projetados bi-específicos desta natureza servem uma função dupla. Regiões variáveis com especificidade para o domínio extracelular são combinadas com uma região variável com especificidade para o lado de fora do domínio extracelular e são emparelhadas em uma armação estrutural que permite cada região variável para se ligar aos antígenos separados.

[0146] Um formato de anticorpo bi-específico exemplar que pode ser usado no contexto da presente invenção envolve o uso de um primeiro domínio de CH3 de imunoglobulina (Ig) e um segundo domínio de CH3 de Ig, em que um primeiro e um segundo domínios de CH3 de Ig diferem de uns dos outros por pelo menos um amino ácido, e em que pelo menos uma diferença de amino ácido reduz ligação do anticorpo bi-específico a proteína A quando comparados com um anticorpo bi- específico que carece a diferença de amino ácido. Em uma concretização, o primeiro domínio de CH3 de Ig liga Proteína A e o segundo domínio de CH3 de Ig contém uma mutação que reduz ou abole uma ligação de Proteína A tal como modificação de H95R (por numeração de éxon de IMGT; H435R por numeração de EU). A segunda CH3 pode ulteriormente compreender uma modificação de Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Outras modificações que podem ser encontrados dentro da segunda CH3 incluem: D16E, L18M, N44S,K52N, V57M, e V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N,V397M, e V422I por EU) no caso de anticorpos de IgG1; N44S, K52N, e V82I (IMGT; N384S, K392N, e V422I por EU) no caso de anticorpos de IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, e V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I por EU) no caso de anticorpos de IgG4. Variações no formato de anticorpo bi- específico descritas acima são contempladas dentro do escopo da presente invenção.

[0147] Outros formatos biespecíficos exemplares que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem, sem limitação, por exemplo, formatos biespecíficos de diacorpo ou a base de scFv, fusões de IgG-scFv, domínio variável duplo (DVD)-Ig, Quadroma, botões para dentro de ofirícios, cadeia leve comum (por exemplo, cadeia leve comum com botões para dentro de ofirícios, etc.), CrossMab, CrossFab, corpo de (SEED), leucina zipper, Duocorpo, IgG1/IgG2, Fab (DAF)-IgG de ação dupla, e formatos biespecíficos de Mab2 (vide, por exemplo, Klein e outros 2012, mAbs 4:6, 1-11, e referências citadas aqui, para uma revisão dos formatos expostos acima). Anticorpos biespecíficos podem também ser construídos usando-se conjugação de peptídeo/ácido nucléico, por exemplo, em que aminoácidos não naturais com reatividade química ortogonal são usados para gerar conjugados de anticorpo-oligonucleotídeo específicos de sítio que então auto- montam em complexos multiméricos com composição definida, valency and geometry. (Vide, por exemplo, Kazane e outros, J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]).

Formulações e Administração terapêutica

[0148] A invenção provê composições terapêuticas compreendendo os anticorpos de anti-PD-L1 ou seus fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção. Composições terapêutcas de acordo com a invenção serão administradas com veículos, excipientes, e outros agentes adequados que são incorporados nas formulações para prover transferência aperfeiçoada, fornecimento, tolerância, e semelhantes. Uma multidão de formulações apropriadas podem ser encontradas no formulário conhecido a todos químicos farmacêuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geléias, ceras, óleos, lipídios, vesículas de contato de lipídio (catiônico ou aniônico) (tal como LIPOFECTIN™), conjugados de DNA, pasta de absorção anidra, emulsões de óleo em água e água em óleo, emulsões carbowax (polietileno glicóis de vários pesos moleculares), géis semi-sólidos, e misturas semi-sólidas que contatam carbowax. Vide também Powell e outros "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[0149] A dose de anticorpo pode variar dependendo da idade e do tamanho do indivíduo a ser administrado da doença alvo, das condições, da rota de administração, e semelhantes. Quando um anticorpo da presente invenção é usado para o tratamento de uma doença ou uma desordem em um paciente adulto, ou para a prevenção de tal doença, é vantajoso administrar o anticorpo da presente invenção normalmente em uma dose única de cerca de 0,1 a cerca de 100 mg/kg de peso de corpo, mais de preferência cerca de 5 a cerca de 80, cerca de 10 a cerca de 60, cerca de 20 a cerca de 50 mg/kg de peso de corpo. Dependendo da severidade da condição, da frequência e da duração do tratamento pode ser ajustada. Em certas concretizações, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno da invenção pode ser administrado como uma dose inicial de pelo menos cerca de 0,1 mg a cerca de 800 mg, cerca de 1 a cerca de 500 mg, cerca de 5 a cerca de 300 mg, or cerca de 10 a cerca de 200 mg, a cerca de 100 mg, ou a cerca de 50 mg. Em certas concretizações, a dose inicial pode ser seguida por administração de um segundo ou uma pluralidade de doses subsequentes do anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno em uma quantidade que pode ser aproximadamente a mesma ou menos do que aquela da dose inicial, em que as doses subsequentes são separadas por pelo menos 1 dia a 3 dias; pelo menos uma semana, pelo menos 2 semanas; pelo menos 3 semanas; pelo menos 4 semanas; pelo menos 5 semanas; pelo menos 6 semanas; pelo menos 7 semanas; pelo menos 8 semanas; pelo menos 9 semanas; pelo menos 10 semanas; pelo menos 12 semanas; ou pelo menos 14 semanas.

[0150] Vários sistemas de fornecimento são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o vírus mutante, endocitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu e outros (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Métodos de introdução incluem, mas não são limitados a, rotas intradérmica, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. A composição pode ser administrada por qualquer rota conveniente, por exemplo, por injeção de infusão ou bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada juntamente com outros agentes biologicamente ativos. Administração pode ser sistêmica ou local. A composição farmacêutica pode ser também fornecida em uma vesícula, em particular um lipossoma (vide, por exemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533).

[0151] O uso de nanopartículas para fornecer os anticorpos da presente invenção é também contemplado aqui. Nanopartículas conjugadas a anticorpo podem ser usadas tanto para aplicações terapêuticas e de diagnóstico. Nanopartículas conjugadas a anticorpo e métodos de preparação e uso são descritos em detalhes por Arruebo, M., e outros 2009 (“Antibody-conjugated nanopartículas for biomedical applications” in J. Nanomat. Volume 2009, Article ID 439389, 24 pages, doi: 10.1155/2009/439389), incorporados aqui por referência.Nanopartículas podem ser desenvolvidas e conjugadas a anticorpos contidos nas composições farmacêuticas para direcionar células de tumor ou células de tecido autoimmune ou células viralmente infectadas. Nanopartículas para o forneicmento de fármco foram também descritas na, por exemplo, US 8257740, ou US 8246995, cada uma incorporada aqui em sua totalidade.

[0152] Em certas situações, a composição farmacêutica pode ser fornecida em um sistema de liberação controlado. Em uma concretização, uma bomba pode ser usada. Em uma outra concretização, materiais poliméricos podem ser usados. Em ainda uma outra concretização, um sistema de liberação controlado pode ser colocado na proximidade do alvo da composição, assim exigindo apenas uma fração da dose sistêmica.

[0153] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosage para injeções intravenosa, subcutânea, intracutânea, intracraniana, intraperitoneal e intramuscular, infusões de gotejamento, etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas por métodos publicamente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, por dissolução, suspensão ou emulsão do anticorpo ou seu sal descrito acima em um meio estéril ou um meio oleoso convencionalmente usado para injeções. Como o meio aquoso para injeções, há, por exemplo, solução salina fisiológica, uma solução isotônica contatando glicose e outros agentes auxiliares, etc., que pode ser usado em combinação com um agente de solubilização apropriada tal como álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propileno glicol, polietileno glicol), um tensoativo não iônico [por exemplo, polissorbato 80, um produto de adição de HCO-50 (polioxietileno (50 mol) de óleo de rícino hidrogenado)], etc. Como o meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de gergelim, óleo de soja, etc., que podem ser usados em combinação com um agente de solubilização tal como benzoato de benzila, álcool benzílico, etc. A injeção assim preparada é de preferência enchida em uma ampola apropriada.

[0154] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser fornecida subcutaneamente ou intravenosamente com uma seringa e agulha padrão. Além disso, com relação a fornecimento subcutâneo, um dispositivo de fornecimento de caneta prontamente tem aplicações no fornecimento de uma composição farmacêutica da presente invenção. Tal dispositivo de fornecimento de caneta pode ser reusável ou descartável. Um dispositivo de fornecimento de caneta reusávelem geral utiliza um cartucho substituível que contém uma composição farmacêutica. Uma vez que toda a composição farmacêutica dentro do cartucho foi administrada e o cartucho está vázio, o cartucho vazio pode prontamente ser descartado e trocado por um novo cartucho que contém a composição farmacêutica. O dispositivo de fornecimento de caneta pode então ser reusado. Em um dispositivo de fornecimento de caneta descartável, não há cartucho substituível. Pelo contrário, o dispositivo de fornecimento de caneta descartável vem pré-enchido com a composição farmacêutica mantida em um reservatório dentro do dispositivo. Uma vez que o reservatório é esvaziado da composição farmacêutica, o dispositivo total é descartado.

[0155] Numerosos dispositivos de fornecimento de caneta e auto- injetor reusáveis têm aplicações no fornecimento subcutâneo de uma composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos incluem, mas certamento não são limitados a AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), caneta DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suíça), caneta HUMALOG MIX 75/25™, caneta HUMALOG™, caneta HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II e III (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), BD™ pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, e OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemanha), para nomear apenas alguns. Exemplos de disposable dispositivos de fornecimento de caneta decartáveis tendo aplicações no fornecimento subcutâneo de uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, mas certamento são limitados à caneta SOLOSTARR (Sanofi-Aventis), o auto-injetor FLEXPENR (Novo Nordisk), e KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICKR (Amgen, Thousand Oaks, CA), a caneta PENLETR (Haselmeier, Stuttgart, Germany), a caneta EPIPEN (Dey, L.P.) e a caneta HUMIRAR (Abbott Labs, Abbott Park, IL), para nomear apenas alguns.

[0156] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para o uso oral or parenteral descrito acima são preparados para formar formas de dosagem em uma dose unitária adequada para ajustar uma dose dos ingredientes ativos. Tais formas de dosage em uma dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade do anticorpo contida é em geral cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma de dosagem em uma dose unitária; especialmente na forma de injeção, é preferido que o anticorpo está contido em cerca de 5 a cerca de 100 mg e em cerca de 10 a cerca de 250 mg para as outras formas de dosagem.

Usos terapêuticos dos anticorpos

[0157] Os anticorpos da presente invenção são úteis para o tratamento, prevenção, e/ou melhoramento de doença ou desordem ou condição tais como câncer, doença autoimune ou uma infecção viral e/ou para o melhoramento de pelo menos um sintoma associado a tal doença, desordem ou condição. Em algumas concretizações da invenção, os anticorpos described aqui são úteis para o tratamento de indivíduos que sofrem de câncer primário ou recorrente, incluindo, por exemplo, carcinoma de célula renal, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer de rim, câncer de colorretal, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer no cérebro, mieloma múltiplo, e melanoma. Os anticorpos podem ser usados para tartar sintomas de estágio precoce ou tardio de câncer. Em uma concretização, um anticorpo ou seu fragmento da invenção pode ser usado para tratar câncer metastático. Os anticorpos são úteis na redução ou inibição ou encolhimento de crescimento de tumor tanto de tumores sólidos quanto cânceres no sangue. Em certas concretizações, os anticorpos podem ser usados para prevenir recaída de um tumor. Em certas concretizações, tratamento com um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno da invenção pode levar a mais do que 50% de regressão, mais do que 60% de regressão, mais do que 70% de regressão, mais do que 80% de regressão ou mais do que 90% de regressão de um tumor em um indivíduo. Em certas concretizações, os anticorpos podem ser usados para aumentar a sobrevivência de um indivíduo que sofre de câncer.

[0158] Em certas concretizações, os anticorpos da invenção são úteis para tratar indivíduos que sofrem de uma infecção viral crônica. Em algumas concretizações, os anticorpos da invenção são úteis na diminuição de títulos virais nos hospedeiro e/ou regaste de células T esgotadas. Em uma concretização, um anticorpo ou um seu fragmento de ligação de antígeno da invenção pode ser administrado em uma dose terapêutico a um paciente com uma infecção por vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou papiloma vírus de ser humano (HPV) ou vírus da hepatite B/C (HBV/HCV). Em uma concretização relacionada, um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno da invenção pode ser usado para tratar uma infecção por vírus da imunodeficiência de símio (SIV) em um indivíduo símio tal como cynomolgus. Em uma outra concretização, um anticorpo ou seu fragmento da invenção pode ser usado para tratar infecção viral crônica por vírus de coriomeningite linfocítica (LCMV).

[0159] Em certas concretizações, um anticorpo de bloqueio da presente invenção pode ser administrado em uma quantidade terapeuticamente eficaz a um indivíduo que sofre de câncer ou uma infecção viral.

[0160] Em certas concretizações, os anticorpos da invenção sãoúteis para o tratamento de uma doença autoimune, incluindo mas não limitada a, alopecia areata, hepatite autoimune, doença celíaca, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barre, doença de Hashimoto, anemia hemolítica, doença de intestino inflamatório, miopatias inflamatórias, eclerose múltipla, cirrose biliar primária, psoríase, artrite reumatóide, escleroderma, síndrome de Sjogren, lúpus sistêmico ertiematoso, vitiligo, pancreatite autoimune, urticaria autoimune, púrpura tromobicitopênica autoimune, doença de Crohn, diabetes tipo I, fascite eosinofílica, enterogastrite eosinofílica, síndrome de Goodpasture, miasteina grave, artrite psoriática, febre reumática, colite ulcerativa, vasculite e granulomatose de Wegener. Em certas concretizações, um anticorpo de ativação da invenção pode ser usado para tratar um indivíduo que sofre de doença autoimune.

[0161] Um ou mais anticorpos da presente invenção pode ser administrado para aliviar or prevenir ou diminuir a severidade de um ou mais dos sintomas ou condições da doença ou da desordem.

[0162] É também contemplado aqui usar um ou mais anticorpos da presente invenção profilaticamente a pacientes em risco para o desenvolvimento de uma doença ou uma desordem tais como câncer, e infecção viral crônica.

[0163] Em uma outra concretização da invenção os presents anticorpos são usados para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de pacientes que sofrem de câncer, doença autoimune ou infecção viral. Em uma outra concretização da invenção, os presentes anticorpos são usados como terapia auxiliar com qualquer outro agente ou qualquer outra terpaia conhecida por aqueles versados na técnica useful para o tratamento de câncer, doença autoimune ou infecção viral.

Terapias de combinação

[0164] Terapias de combinação podem incluir um anticorpo de anti- PD-L1 da invenção e qualquer agente terapêutico adicional que podem ser vantajosamente combinadas com um anticorpo da invenção, ou com um fragmento biologicamente ativo de um anticorpo da invenção.

[0165] Os anticorpos da presente invenção podem ser combinados sinergicamente com uma ou mais fármacos anti-câncer ou terapia usada para tratar câncer, incluindo, por exemplo, carcinoma de célula renal, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer de colorretal, câncer de pulmão de célula não pequena, e melanoma. É contemplado aqui usar anticorpos de anti-PD-L1 da invenção em combinação com terapias imunoestimultória e/ou imunossuportativo para inibir crescimento de tumor, e/ou melhorar sobrevivência de pacientes com câncer. As terapias imunoestimulatórias incluem terapias imunoestimulatórias diretas para aumentar a atividade de células imunes por ou “soltar o freio” nas células imunes suprimidas ou “pisar no acelerador” para ativar uma resposta imune. Exemplos incluem direcionamento de outros receptors ponto de checabem, vacinação e auxiliaress. As modalidades imunossuportativas podem aumentar antigenicidade do tumor por promoção de morte de célula imunogênica, inflamação ou têm outros efeitos indiretos que promovem uma resposta imune anti-tumor. Exemplos incluem radiação, quimioterapia, agentes anti-angiogênicos e cirurgia.

[0166] Em várias concretizações, um ou mais anticorpos da presente invenção podem ser usados em combinação com um segundo anticorpo com PD-L1, um anticorpo com PD-1 (por exemplo, nivolumab), um inibidor de LAG-3, um inibidor de CTLA-4 (por exemplo, ipilimumab), um inibidor de TIM3, um inibidor de BTLA, um inibidor de TIGIT, um inibidor de CD47, um inibidor de antagonista de um outro co- inibidor de célula T ou ligante (por exemplo, um anticorpo para CD-28, 2B4, LY108, LAIR1, ICOS, CD160 ou VISTA), um inibidor de indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), um antagonista de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) [por exemplo, um “armadilha para VEGF” tal como aflibercept ou outra proteína de fusão de inibição de VEGF como indicado na patente US no. 7.087.411, ou um anticorpo de anti-VEGF ou seu fragmento de ligação de antígeno (por exemplo, bevacizumab, ou ranibizumab) ou um inibidor de cinase de molécula pequena de receptor de VEGF (por exemplo, sunitinib, sorafenib, ou pazopanib)], um inibidor de Ang2 (por exemplo, nesvacumab), um inibidor de fator de crescimento transformante beta (TGFβ), um inibidor de receptor de fato de crescimento epidérmico (EGFR) (por exemplo, erlotinib, cetuximab), um agonista a um receptor co-estimulatório (por exemplo, um agonista a proteína relacionada com TNFR induzida por glucocorticóide), um anticorpo para um antígeno específico de tumor (por exemplo, CA9, CA125, antígeno associado a melanoma 3 (MAGE3), antígeno carcinoembriônico (CEA), vimentina, tumor-M2-PK, antígeno específico de próstata (PSA), mucina-1, MART-1, e CA19-9), uma vacina (por exemplo, Bacillus Calmette-Guerin, uma vacina de câncer), um auxiliar para aumentar apresentação de antígeno (por exemplo, fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago), um anticorpo biespecífico (por exemplo, anticorpo biespecífico de CD3xCD20, anticorpo biespecífico PSMAxCD3), uma citotoxina, um agente quimioterapêutico (por exemplo, dacarbazina, temozolomida, ciclofosfamida, docetaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, cisplatina, carboplatina, gemcitabina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatina, paclitaxel, e vincristina), ciclofosfamida, radioterapia, um inibidor de IL- 6R (por exemplo, sarilumab), um inibidor de IL-4R (por exemplo, dupilumab), um inibidor de IL-10, uma citocina tais como IL-2, IL-7, IL- 21, e IL-15, um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) (por exemplo, anti-CD19-DM4 ADC, e anti-DS6-DM4 ADC), um fármaco anti- inflamatório (por exemplo, corticosteróides, e fármacos anti- inflamatórios não esteroidais), um suplemento de dieta tais como antioxidantes ou qualquer cuidado paliativo para tratar câncer. Em certas concretizações, os anticorpos de anti-PD-L1 da presente invenção podem ser usados em combinação com vacinas de câncer incluindo vacinas de célula dendríticas, vírus oncolíticos, vacinas de célula de tumor, etc. para aumentar a resposta anti-tumor. Exemplos de vacinas de câncer que podem ser usados em combinação com anticorpos de anti-PD-L1 da presente invenção incluem vacina deMAGE3 para melanoma e câncer de bexiga, vacina de MUC1 para câncer de mama, EGFRv3 (por exemplo, Rindopepimut) para câncer no cérebro (incluindo glioblastoma multiforme), ou ALVAC-CEA (para cânceres CEA+). Em certas concretizações, os anticorpos de anti-PD- L1 da presente invenção podem ser usados em combinação com um suplemento de dieta tais como antioxidantes ou qualquer cuidado paliativo para tratar câncer.

[0167] Em certas concretizações, os anticorpos de anti-PD-L1 da invenção podem ser administrados em combinação com terapia de radiação nos métodos para gerar respostas de anti-tumor duráveis de longo prazo e/ou melhoram sobrevivência de pacientes com câncer. Em algumas concretizações, os anticorpos de anti-PD-L1 da invenção podem ser administrados antes de, concomitantemente ou depois da administração de terapia de radiação a um paciente com câncer. Por exemplo, terapia de radiação pode ser administrada em uma ou mais doses a lesões de tumor seguido por administração de um ou mais doses de anticorpos de anti-PD-L1 da invenção. Em algumas concretizações, terapia de radiação pode ser administrada localmente a uma lesão de tumor para melhorar a imunogenicidade local de um tumor do paciente (radiação adjuvinante) e/ou a matar células de tumor (radiação ablativa) seguido por administração sistêmica de um anticorpo de anti-PD-L1 da invenção. Por exemplo, intracranial radiação pode ser administrado a um paciente com câncer no cérebro (por exemplo, glioblastoma multiforme) juntamente com administração sistêmica de um anticorpo de anti-PD-L1 da invenção. Em certas concretizações, os anticorpos de anti-PD-L1 da invenção podem ser administrados em combinação com terapia de radiação e um agente quimioterapêutico (por exemplo, temozolomida) ou um antagonista de VEGF (por exemplo, aflibercept).

[0168] Os anticorpos ou seus fragmentos da invenção podem ser administrados em combinação com um ou mais fármacos anti-virais conhecidos na técnica, incluindo mas não limitados a, zidovudina, lamivudina, abacavir, ribavirin, lopinavir, efavirenz, cobicistat, tenofovir, rilpivirina e corticosteróides. Em algumas concretizações, os anticorpos de anti-PD-L1 da invenção podem ser administrados em combinação com um inbidiro de LAG3, um inbidiro de CTLA-4, um inbidiro de PD-1 ou qualquer antagonista de um outro co-inibidor de célula T para tratar infecção viral crônica.

[0169] Os anticorpos de seus fragmentos da invenção podem ser usados em combinação com qualquer fármaco ou terapia conhecido na técnica (por exemplo, corticosteróides e outros imunosupressores) para tratar uma doença ou desordem autoimune incluindo, mas não limitada a, alopecia areata, hepatite autoimune, doença celíaca, doença de Grave, síndrome de Guillain-Barre, doença de Hashimoto, anemia hemolítica, doença de intestino inflamatório, miopatias inflamatórias, eclerose múltipla, cirrose biliar primária, psoríase, artrite reumatóide, scleroderma, síndrome de Sjogren, lúpus sistêmico ertiematoso, vitiligo, pancreatite autoimune, autoimmune urticaira, púrpura tromobicitopênica autoimune, doença de Crohn, diabetes tipo I, fascite eosinofílica, enterogastrite eosinofílica, síndrome de Goodpasture, miasteina grave, artrite psoriática, febre reumática, colite ulcerativa, vasculite e granulomatose de Wegener.

[0170] O(s) componente(s) terapeuticamente ativo(s) adicional(ais) pode(m) ser administrado(s) antes de, concorrente com, ou depois da administração do anticorpo de anti-PD-L1 da presente invenção. Para as finalidades da presente revelação, tais regimes de administração são considerados a administração de um anticorpo de anti-PD-L1 “em combinação com” um segundo componente terapeuticamente ativo.

[0171] O(s) componente(s) terapeuticamente ativo(s) adicional(ais) podem ser administrados a um indivíduo antes da administração de um anticorpo de anti-PD-L1 da presente invenção. Por exemplo, um primeiro componente pode ser julgado ser administrado "antes de" um segundo componente se um primeiro componente for administrado 1 semana antes, 72 horas antes, 60 horas antes, 48 horas antes, 36 horas antes, 24 horas antes, 12 horas antes, 6 horas antes, 5 horas antes, 4 horas antes, 3 horas antes, 2 horas antes, 1 hora antes, 30 minutos antes, 15 minutos antes, 10 minutos antes, 5 minutos antes, ou menos do que 1 minuto antes da administração do segundo componente. Em outras concretizações, o(s) additional componente(s) terapeuticamente ativo(s) adicional (ais) podem ser administrados a um indivíduo depois da administração de um anticorpo de anti-PD-L1 da presente invenção. Por exemplo, um primeiro componente pode ser julgado como sendo administrado "depois de" um segundo componente se um primeiro componente é administrado 1 minuto depois, 5 minutos depois, 10 minutos depois, 15 minutos depois, 30 minutos depois, 1 hora depois, 2 horas depois, 3 horas depois, 4 horas depois, 5 horas depois, 6 horas depois, 12 horas depois, 24 horas depois, 36 horas depois, 48 horas depois, 60 horas depois, 72 horas depois da administração do segundo componente. Em ainda outras concretizações, o(s) componente(s) terapeuticametne ativo(s) adicional(ais) podem ser administrados a um indivíduo concorrente com administração de um anticorpo de anti-PD- L1 da presente invenção. Administração "concorrente", para as finalidades da presente invenção, inclui, por exemplo, administração de um anticorpo de anti-PD-L1 e um componente terapeuticamente ativo adicional a um indivíduo em uma forma de dosagem simples (por exemplo, co-formulated), ou em formas de dosagem separadas administradas ao indivíduo dentro de cerca de 30 minutos ou menos entre si. Se administrado em formas de dosagem separadas, cada forma de dosagem pode ser administrada via a mesma rota (por exemplo, tanto o anticorpo de anti-PD-L1 quanto o componente terapeuticamente ativo adicional podem ser administrados intravenosamente, subcutaneamente, etc.); alternativamente, cada forma de dosagem pode ser administrada via uma rota diferente (por exemplo, o anticorpo de anti-PD-L1 pode ser administrado intravenosamente, e o componente terapeuticamente ativo adicional pode ser administrado subcutaneamente). Em qualquer evento, administração dos componentes emu ma dosage única, em formas de dosage separadas pela mesma rota ou em formas de dosage separadas por rotas diferentes são todas consideradas "administração concorrente," para as finalidades da presente revelação. Para as finalidades da presente revelação, administração de um anticorpo de anti-PD-L1 "antes de", "concorrente com," ou "depois" (como aqueles termos são definidos aqui acima) administração de um componente terapeuticamente ativo adicional é considerado administração de um anticorpo de anti-PD-L1 "em combinação com" um componente terapeuticamente ativo adicional).

[0172] A presente invenção inclui composições farmacêuticas em que um anticorpo de anti-PD-L1 da presente invenção é co-formulado com um ou mais do(s) componente(s) terapeuticametne ativo(s) adicional(ais) como descrito em outro lugar aqui usando-se uma variedade de combinações de dosagem.

[0173] Em concretizações exemplares em que um anticorpo de anti- PD-L1 da invenção é administrado em combinação com um antagonista de VEGF (por exemplo, uma armadilha para VEGF tal como aflibercept), incluindo administração de co-formulações compreendendo um anticorpo de anti-PD-L1 e um antagonista de VEGF, os componentes individuais podem ser administrados a um indivíduo e/ou co-formulados usando-se uma variedade de combinações de dosagem. Por exemplo, o anticorpo de anti-PD-L1 pode ser administrado a um indivíduo e/ou contido em uma co-formulação em uma quantidade selecionada do grupo que consiste de 0,01 mg, 0,02 mg, 0,03 mg, 0,04 mg, 0,05 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1,0 mg, 1,5 mg, 2,0 mg, 2,5 mg, 3,0 mg, 3,5 mg, 4,0 mg, 4,5 mg, 5,0 mg, 6,0 mg, 7,0 mg, 8,0 mg, 9,0 mg, e 10,0 mg; e o antagonista de VEGF (por exemplo, uma armadilha para VEGF tal como aflibercept) pode ser administrado ao indivíduo e/ou contained in a co-formulation in an amount selecionada do grupo que consiste de 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1,0 mg, 1,1 mg, 1,2 mg, 1,3 mg, 1,4 mg, 1,5 mg, 1,6 mg, 1,7 mg, 1,8 mg, 1,9 mg, 2,0 mg, 2,1 mg, 2,2 mg, 2,3 mg, 2,4 mg, 2,5 mg, 2,6 mg, 2,7 mg, 2,8 mg, 2,9 mg e 3,0 mg. As combinações/co-formulações podem ser administradas a um indivíduo de acordo com qualquer um dos regimes de administração revelado em outro lugar aqui, incluindo, por exemplo, duas vezes por semana, uma vez a cada semana, uma vez a cada 2 semanas, uma vez a cada 3 semanas, uma vez a cada month, uma vez a cada 2 meses, uma vez a cada 3 meses, uma vez a cada 4 meses, uma vez a cada 5 meses, uma vez a cada 6 meses, etc.

Regimes administrativos

[0174] De acordo com certas concretizações da presente invenção, multiplas doses de um anticorpo de anti-PD-L1 (ou uma composição farmacêutica compreendendo uma combinação de um anticorpo de anti-PD-L1 e qualquer um dos agentes terapeuticamente ativos adicionais mencionados aqui) podem ser administradas a um indivíduo no período de tempo definido. Os métodos de acordo com este aspecto da invenção compreendem administração sequencial de a um indivíduo múltiplas doses de um anticorpo de anti-PD-L1 da invenção. Como usado aqui, "administração sequencial" significa que cada dose de anticorpo de anti-PD-L1 é administrada ao indivíduo em um ponto de tempo diferente, por exemplo, nos dias diferentes separados por um intervalo predeterminado (por exemplo, horas, dias, semanas ou meses). A presente invenção inclui métodos que compreendem administração sequencial ao paciente de uma dose inicial única de um anticorpo de anti-PD-L1, seguido por uma ou mais doses secundárias do anticorpo de anti-PD-L1, e opcionalmente seguido por uma ou mais doses terciárias do anticorpo de anti-PD-L1. O anticorpo de anti-PD-L1 pode ser administrado a uma dose de entre 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg.

[0175] Os termos "dose inicial," "doses secundárias," e "doses terciárias," referem-se à sequência temporal de administração do anticorpo de anti-PD-L1 da invenção. Assim, a "dose inicial" é a dose que é administrada no início do regime de tratamento (também chamada da "dose de liha de base"); as "doses seecundárias" são as doses que são administradas depois de uma dose inicial; e as "doses terciárias" são as doses que são administradas depois das doses secundárias. As doses inicial, secundária e terciária podem todas conter a mesma quantidade de anticorpo de anti-PD-L1, mas em geral podem diferir de umas das outras em termos de frequência de administração. Em certas concretizações, no entanto, a quantidade de anticorpo de anti-PD-L1 continha doses inicial, secundária e/ou terciária varia umas das outras (por exemplo, ajutadas para cima ou para baixo quando apropriadas) durante o curso do tratamento. Em certas concretizações, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, ou 5) doses são administradas no início do regime de tratamento como "doses de carregamento" seguido por doses subsequentes que são administradas em uma base mais frequente (por exemplo, " doses de manutenção").

[0176] Em certas concretizações exemplares da presente invenção,cada dose secundária e/ou terciária é administrada de 1 a 26 (por exemplo, 1, 1%, 2, 2%, 3, 3%, 4, 4%, 5, 5%, 6, 6%, 7, 7%, 8, 8%, 9, 9%, 10, 10%, 11, 11%, 12, 12%, 13, 13%, 14, 14%, 15, 15%, 16, 16%, 17, 17%, 18, 18%, 19, 19%, 20, 20%, 21, 21%, 22, 22%, 23, 23%, 24, 24%, 25, 25%, 26, 26%, ou mais) semanas depois da dose imediatamente precedente. A frase "a dose imediatamente precedente," como usada aqui, significa, em uma sequência de múltiplas administrações, a dose do anticorpo de anti-PD-L1 que é administrada a um paciente antes da administração da dose muito próxima na sequência com nenhuma dose de intervenção.

[0177] Os métodos de acordo com este aspecto da invenção pode compreender administração a um paciente de qualquer número de doses secundária e/ou doses terciária de um anticorpo de anti-PD-L1. Por exemplo, em certas concretizações, apenas uma única dose secundária é administrada ao paciente. Em outras concretizações, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou mais) doses seecundárias são administradas ao paciente. Do mesmo modo, em certas concretizações, apenas uma única dose terciária é administrada ao paciente. Em outras concretizações, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou mais) doses terciárias são administradas ao paciente.

[0178] Em concretizações que envolvem múltiplas doses seecundárias, cada dose secundária pode ser administrada na mesma frequência que as outras doses seecundárias. Por exemplo, cada dose secundária pode ser administrada ao paciente de 1 a 2 semanas ou de 1 a 2 meses depois da dose imediatamente precedente. Similarmente, em concretizações que envolvem múltiplas doses terciárias, cada dose terciária pode ser administrada na mesma frequência que as outras doses terciárias. Por exemplo, cada dose terciária pode ser administrada ao paciente de 2 a 12 semanas depois da dose imediatamente precedente. Em certas concretizações da invenção, a frequência em que as doses secundária e/ou terciária são administradas a um paciente pode variar durante o curso do regime de tratamento. A frequência de administração pode também ser ajustada durante o curso do tratamento por um médico dependendo das necessidades do paciente individual após o exame clínico.

[0179] A presente invenção inclui regimes de administração em que de 2 a 6 doses de carregamento são administradas a um paciente em uma primeira frequência (por exemplo, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada mês, uma vez a cada dois meses, etc.), seguido por administração de duas ou mais doses de manutenção ao paciente em uma base menos frequente. Por exemplo, de acordo com este aspecto da invenção, se as doses de carregamento forem administradas em uma frequência de, por exemplo, uma vez por mês (por exemplo, duas, três, four, ou mais doses de carregamento administradas uma vez por mês), então doses de manutenção podem ser administradas ao paciente uma vez a cada cinco semanas, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada sete semanas, uma vez a cada oito semanas, uma vez a cada dez semanas, uma vez a cada doze semanas, etc.).

Usos de diagnóstico dos anticorpos

[0180] Os anticorpos de anti-PD-L1 da presente invenção podem ser usados para detectar e/ou para medir PD-L1 em uma amostra, por exemplo, para finalidades de diagnóstico. Algumas concretizações contemplam o uso de um ou mais anticorpos da presente invenção nos ensaios para detectar uma doença ou uma desordem tal como câncer, doença autoimune ou infecção viral crônica. Ensaios de diagnóstico exemplares para PD-L1 podem compreender, por exemplo, o contato de uma amostra, obtida a partir de um paciente, com um anticorpo de anti-PD-L1 da invenção, em que o anticorpo de anti-PD-L1 é marcado com um rótulo detectável ou uma molécula repórter ou usado como um ligante de captura para seletivamente isolar PD-L1 de amostras de paciente. Alternativamente, um anticorpo de anti-PD-L1 não marcado pode ser usado nas aplicações de diagnóstico em combinação com um anticorpo secundário que é ele próprio detectavelmente marcado. O rótulo detectável ou a molécula repórter pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, ou 125I; uma porção fluorescente ou quimioluminescente tal como um isotiocianato de fluoresceína ou rodamina; ou uma enzima tal como fosfatase alcalina, β-galactosidase, peroxidase de rábano picante, ou luciferase. Ensaios específicos exemplares que podem ser usados para detectar ou para medir PD-L1 em uma amostra incluem ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), e classificação de célula ativada por fluorescência (FACS).

[0181] Amostras que podem ser usadas nos ensaios de diagnostic de PD-L1 de acordo com a presente invenção incluem qualquer amostra de tecido ou de fluido obtenível de um paciente, que contém quantidades detectáveis ou de proteína de PD-L1, ou seus fragmentos, sob condições normais ou patológicas. Em geral, níveis de PD-L1 em uma amostra particular obtida a partir de um paciente saudável (por exemplo, um paciente não afligido com câncer ou uma doença autoimune) serão medidos para inicialmente estabelecer uma linha de base, ou padrão, nível de PD-L1. Este nível de linha de base de PD-L1 pode então ser comparado contra os níveis de PD-L1 medidos em amostras obtidas a partir de indivíduos suspeitos de ter condição relacionada com câncer, ou sintomas associados a tal condição.

[0182] Os anticorpos específicos para PD-L1 podem conter nenhuma porção ou rótulo adicional, ou eles podem conter uma porção ou rótulo N-terminal ou C-terminal. Em uma concretização, o rótulo ou a porção é biotina. Em um ensaio de ligação, a localização de um rótulo (se for o caso) pode determinar a orientação do peptídeo em relação à superfície na qual o peptídeo está ligado. Por exemplo, se uma superfície é revestida com avidina, um peptídeo que contata uma biotina N-terminal será orientado tal que a porção C-terminal do peptídeo será distal em relação à superfície.

[0183] Aspectos da invenção referem-se ao uso dos anticorpos revelados como marcadores para os prognósticos precedentes de câncer ou uma desordem autoimune em pacientes. Anticorpos da presente invenção podem ser usados em ensaios de diagnóstico para avaliar prognóstico de câncer em um paciente e prever sobrevivência.

EXEMPLOS

[0184] Os seguintes exemplos são publicados de modo a prover aqueles de habilidade comum na técnica com uma revelação e descrição complete de como fazer e usar os métodos e composições da invenção, e não destinam-se a limitar o escopo daquele os inventores consideravam como sua invenção. Esforços foram feitos para garantir precisão com relação a números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) mas alguns erros experimentais e desvios seriam explicados. A não ser que de outra maneira indicado, partes são partes em peso, peso molecular é o peso molécular médio, temperatura é em graus Centígrados, temperatura ambiente é cerca de 25oC, e pressão é a ou quase atmosférica.

Exemplo 1: Geração de anticorpos humanos para PD-L1

[0185] Anticorpos humanos para PD-L1 foram gerados usando-se um fragmento de PD-L1 que varia de cerca de aminoácidos 19 - 239 da SEQ ID NO: 351 (No. de acesso Genbank NP_054862.1). O imunógeno foi administrado diretamente, com um auxílio para estimular a resposta imune, a um camundongo VELOCIMMUNE® compreendendo DNA que codifica regiões variáveis de cadeia leve kappa e pesada de imunoglobulina de ser humano. O anticorpo resposta imune foi monitorado por um imunoensaio de específico de PD-L1. Quando uma resposta immune desejada foi conseguida esplenócitos foram coletados e foram fundidos com células de mieloma de camundongo para preservar sua viabilidade e formam linhas de células de hibridoma. As linhas de células de hibridoma foram triadas e foram selecionadas para identificar linhas de células que produzem anticorpos específicos de PD- L1. Usando-se esta técnica, e o imunógeno descritos acima, vários anticorpos de anti-PD-L1 quiméricos (isto é, anticorpos que possuem domínios variáveis humanos e domínios constantes de camundongo) foram obtidos; anticorpos exemplares gerados deste modo foram designados como H2M8306N, H2M8307N, H2M8309N, H2M8310N, H2M8312N, H2M8314N, H2M8316N, H2M8317N, H2M8321N,H2M8323N, H2M8718N, H2M8718N2, e H2M8719N.

[0186] Anticorpos de anti-PD-L1 foram também isloados diretamente das células B positivas a antígeno sem fusão a células de mieloma, como descrito na U.S. 2007/0280945A1, aqui especificamente incorporados por referência em sua totalidade. Usando-se este método, vários anticorpos de anti-PD-L1 totalmente humanos (isto é, anticorpos que possuem domínios variáveis humanos e domínios constantes humanos) foram obtidos; anticorpos exemplares gerados deste modo foram designados como se segue: H1H9323P, H1H9327P, H1H9329P, H1H9336P, H1H9344P2, H1H9345P2, H1H9351P2, H1H9354P2,H1H9364P2, H1H9373P2, H1H9382P2, H1H9387P2, e H1H9396P2.

[0187] As propriedades biológicas dos anticorpos exemplars geradas de acordo com os métodos deste Exemplo são descritos em detalhes nos exemplos indicados abaixo.

Exemplo 2: Sequências de nucleotídeos e de aminoácidos de região variável de cadeia leve e pesada

[0188] Tabela 1 indica os identificadores de sequência de aminoácidos regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada e CDRs de anticorpos de anti-PD-L1 selecionados da invenção. Os identificadores de sequência de ácidos nucléicos correspondentes são indicados na tabela 2.Tabela 1: Identificadores de sequência de aminoácidosTabela 2: Identificadores de sequência de ácidos nucléicos

[0189] Anticorpos são tipicamente mencionados aqui de acordo com a seguinte nomeclatura: prefixo Fc (por exemplo "H1H," "H2M," "H2aM," etc.), seguido por um identificador numéricor (por exemplo "8306," "9323," etc., como mostrado na tabela 1), seguido por um sufixo "P," "N," “P2,” ou "N2". Assim, de acordo com esta nomenclatura, um anticorpo pode ser chamado aqui de, por exemplo, "H2M8306N,""H1H9344P2," etc. Os prefixos H1H, H2M e H2aM na designação de anticorpos usados aqui indicam o isótipo de região de Fc particular do anticorpo. Por exemplo, um anticorpo de "H1H" tem um Fc de IgG1 de ser humano, um anticorpo de "H1M" tem tem um Fc de IgG1 de camundongo, e um anticorpo de "H2M" ou de “H2aM” tem um Fc de IgG2 de camundongo, (todas as regiões variáveis são totalmente humanas como designado pelo primeiro 'H' na designação de anticorpo). Como será apreciado por uma pesssoa de habilidade comum na técnica, um anticorpo tendo um isótipo de Fc particular pode ser convertido em um anticorpo com um isótipo de Fc diferente (por exemplo, um anticorpo with um Fc de IgG1 de camundongo pode ser converitdo em um anticorpo com uma IgG4 de ser humano, etc.), mas em qualquer evento, os domínios variáveis (incluindo as CDRs) - que são indicados pelos indentificadores numéricos mostrados na tabela 1 - permanecerão os mesmos, e as propriedades da ligação a antígeno são esperados como sendo idênticos ou substancialmente similares independentemente da natureza do domínio de Fc.

Exemplo 3: Anticorpo que se liga a PD-L1 como determinado pela ressonância de plasmônio de superfície

[0190] Constantes de taxa de associação e dissociação de ligação (ka e kd, respectivamente), contantes de dissociação em equlíbrio e semi-vidas de dissociação (KD e t/, respectivamente) de antígeno que se ligam a anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 purificados foram determinadas usando-se um ensio de biossensor de ressonância de plasmônio de superfície de tempo real em um instrumento Biacore 4000. A superfície de sensor de Biacore foi ou derivatizada com anticorpo de anti-camundongo de coelho policlonal (GE, # BR-1008-38) ou com anticorpo de Fc de de anti-humano de camundongo monoclonal (GE, # BR-1008-39) para capturar cerca de 200-300 RUs de anticorpos monoclonais de anti-PD-L1, expressos com ou um fragmento de Fc de camundongo ou um Fc de ser humano, respectivamente. Os reagentes de PD-L1 testados para a ligação aos anticorpos de anti-PD-L1 incluídos PD-L1 de ser humano recombinante (aminoácidos 19 - 239 de número de acesso NP_054862.1) expressos com uma etiqueta de myc-myc - hexaistidina C-terminal (hPD-L1-MMH; SEQ ID: 345), PD-L1 de macaco cynomolgus recombinante expresso com uma etiqueta de myc-myc - hexaistidina C-terminal (MfPD-L1-MMH; SEQ ID: 346), PD-L1 de ser humano recombinante (aminoácidos 19 - 239 de número de acesso NP_054862.1) expresso com ou uma etiqueta de Fc de IgG1 de ser humano C-terminal (hPD-L1-hFc; SEQ ID: 347) ou com uma etiqueta de Fc de IgG2a de camundongo C-terminal (hPD-L1-mFc; SEQ ID: 348), e PD-L1 de macaco cynomolgus recombinante expressa com uma etiqueta de Fc de IgG2a de camundongo C-terminal (MfPD-L1-mFc; SEQ ID: 353). Concentrações diferentes de reagentes de PD-L1 foram injetados sobre superfície capturada do anticorpo monoclonal de anti- PD-L1 em uma taxa de fluxo de 30 μL/min. A ligação dos reagentes de PD-L1 aos anticorpos monoclonais capturados foi monitorada por 3 a 4 minutos embora a dissociação de reagentes de PD-L1 ligados a anticorpo fosse monitorada por 10 minutos no tampão de experiência de HBST (HEPES a 0,01 M pH 7,4, NaCl a 0,15 M, EDTA a 3 mM, 0,05% v/v de tensoativo tween-20). Experiências foram realizadas ou a 25°C ou 37°C. Constantes de taxa de associação (ka) e dissociação (kd) cinética foram determinadas por processamento e ajuste de dasdos para um modelo de ligação de 1:1 usando-se software de ajuste de curva de Scrubber 2.0c.Constantes de equilíbrio de dissociação de ligação de (KD) e semi-vidas de dissociativa (t1/2) foram então calculadas a partir de constantes de taxa cinética como: KD (M) = kd / ka e t/ (min) = [ln2/(60*kd)]. Parâmetros de cinética de ligação para diferentes anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 que se ligam a reagentes de PD- L1 diferentes a 25°C e 37°C são tabulados nas tabelas 3 - 8.Tabela 3: Parâmetros de cinética de ligação de anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 que se liga a hPD-L1-MMH a 25°C Tabela 4: Parâmetros de cinética de ligação de anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 que se liga a hPD-L1-MMH a 37°C. Tabela 5: Parâmetros de cinética de ligação de anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 que se liga a PD-L1 de ser humano Dímero a 25°C. Tabela 6: Parâmetros de cinética de ligação de anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 que se ligam a dímero de PD-L1 de ser humano a 37°C. Tabela 7: Parâmel tros de cinética de ligação de anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 que se ligam a MfPD-L1-MMH a 25°C. Tabela 8: Parâmetros de cinética de ligação de anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 que se ligam a MfPD-L1-MMH a 37°C. Tabela 9: Parâmetros de cinética de ligação of anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 que se ligam a PD-L1-mFc de macaco a 25°C. Tabela 10: Parâmetros de cinética de ligação de anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 que se liga a PD-L1-mFc de macaco a 37°C

[0191] Como mostrado na tabela 3, a 25°C, todos os 25 anticorpos de anti-PD-L1 da invenção ligados a hPD-L1-MMH com valores de KD que variam de 55,8 pM a 421 nM. Como mostrado na tabela 4, a 37°C, todos os 25 anticorpos de anti-PD-L1 da invenção ligados a hPD-L1-MMH com valores de KD que variam de 140 pM a 647 nM. Como mostrado na tabela 5, a 25°C, todos os 25 anticorpos de anti-PD-L1 da invenção ligados a dímero de hPD-L1 com valores de KD que variam de 4,26 pM a 1,54 nM. Como mostrado na tabela 6, a 37°C, todos os 25 anticorpos de anti-PD-L1 da invenção ligados a dímero de hPD-L1 com valores de KD que variam de 5,32 pM to 5,0 nM. Como mostrado na tabela 7, a 25°C, todos os 25 anticorpos de anti-PD-L1 da invenção ligados a MfPD-L1-MMH com valores de KD que variam de 72 4 pM a 292 nM. Como mostrado na tabela 8, a 37°C, todos os 25 anticorpos de anti-PD-L1 da invenção ligados a MfPD-L1- MMH com valores de KD que variam de 133 pM a 398 nM. Como mostrado na tabela 9, a 25°C, todos os 20 anticorpos de anti-PD-L1 da invenção testados ligados a MfPD-L1-mFc com valores de KD que variam de 17,4 pM a 626 pM. Como mostrado na tabela 10, a 37°C, todos os 20 anticorpos de anti-PD-L1 da invenção testados ligados a MfPD-L1-mFc com valores de KD que variam de 20,8 pM a 825 pM.

Exemplo 4: Bloqueamento de ligação de PD-L1 a PD-1 como determinado por ELISA

[0192] A capacidade de anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 de bloquear PD-L1 de ser humano de ligação a seus pares de ligação, os receptores de BT-1 e PD-1 de ser humano, foi medida usando-se dois formatos ELISA de sanduícne de competição.

[0193] Uma proteína de PD-1 de ser humano dimérica constituída de uma porção do domínio extracelular (aminoácidos 25 - 170 de número de acesso NP_005009.2 com uma mudança C93S) que foi expressa com uma etiqueta de hFc C-terminal (hPD-1-hFc; SEQ ID: 350) e uma proteína de B7-1 de ser humano dimérica constituídas de uma porção do domínio extracelular expressa com uma etiqueta de hFc C-terminal e etiquetas de hexaistidina (hB7-1- hFc-6His; R&D Systems, #140-B1) foram separadamente revestidas a 2 μg/mL em uma placa de microtítulo de 96 cavidades em um tampão de PBS de um dia para o outro a 4°C. Sítios de ligação não específicos foram subsequentemente bloqueados usando-se uma solução de 0.,5% (w/v) de BSA em PBS. Uma quantidade constante de 0,5 nM ou 8,0 nM de uma proteína de hPD-L1 dimérica constituída de uma porção do domínio extracelular de PD-L1 de ser humano que foi expresso com uma etiqueta de mFc C-terminal (hPD-L1-mFc; SEQ ID: 348) foi separadamente titulada com concentrações de anticorpos de anti-PD-1 e anticorpos de controle de isótipo que variam entre 0-210 nM em diluição em série. Estes complexos de anticorpo-proteína complexes foram então incubados por 1 hora a temperatura ambiente (RT). Complexos com hPD-L1-mFc constant a 0,5 nM foram subsequentemente transferidos para placas de microtítulo revestidas com hPD-1-hFc, e complexos com hPD-L1- mFc contante a 8 nM foram transferidos para placas revestidas com hB7-1-hFc-6His. Os complexos foram deixados se ligar às placas revestidas por 1 hora a temperatura ambiente. Depois da incubação por 1 hora, as cavidades foram lavadas e hPD-L1-mFc ligado a placa foi detectado com um anticorpo poliblonal de anti-mFc conjugado com peroxidase de rábano picante (Jackson ImmunoResearch, # 115-035-164). Amostras foram desenvolvidas com uma solução de TMB (BD Biosciences, #51-2606KC and #51-2607KC) para produzir uma reação colorimétrica e foram neutralizadas com ácido sulfúrico a 1 M e antes da medição da absorbância a 450 nm em uma leitora de placa Victor X5. Análise de dados usada um modelo de dose- resposta sigmoide dentro de software PrisR. O valor calculado IC50, definido como a concentração do anticorpo exigida para bloquear 50% de ligação de hPD-L1-mFc a hPD-1-hFc ou hB7-1-hFc-6His, foi usado como um indicador de potência de bloqueamento. Valores de bloqueamento máximo representam a capacidade dos anticorpos para bloquear ligação de hPD-L1-mFc em relação a linha de base. A absorbância medida na quantidade constant de hPD-L1 na curva de dose é definida como 0% de bloqueamento e a absorbância com nenhum hPD-L1 dicionao é definido como 100% de bloqueamento. Os valores de absorbância das cavidades contatando a concentração mais alta para cada anticorpo foram usados para determinar a percentagem de bloqueamento na concentração máxima de anticorpo testada. Anticorpos com com uma percentagem de bloqueio máxima abaixo de 25% foram caracterizados como não bloqueadores, e seus valores de IC50 não foram relatados na tabela 11. Anticorpos com uma percentage de bloqueio máxima abaixo de -25% foram caracterizados como não bloqueadores/melhoradores. Tabela 11: Bloqueio de ELISA de ligação de hPD-L1-mFc a hPD-1-hFc e hB7-1-hFc-6His por anticorpos de anti-PD-L1 (*) - abaixo do fundo teórico no ensaio; Fundo teórico de ensaio é de 2,5E-10 M para o revestimento de hPD-1-hFc e 4,0E-09 M para o revestimento de hB7-1-hFc-6His; NBl - não bloqueador; IC - inconclusivo

[0194] Como mostrado na tabela 11, 19 dos 25 anticorpos de anti- PD-L1 da invenção bloqueavam 0,5 nM de hPD-L1-mFc a partir da ligação a hPD-1-hFc com valores de IC50 que variam de menos do que 250 pM a 770 pM com a percentagem de bloqueio máximo que variam de 26% a 100%. Quatro dos 25 anticorpos de anti-PD-L1 testados foram caracterizados como não bloqueadores de ligação de hPD-L1-mFc a hPD-1-hFc, enquanto um anticorpo testado (H1H9327P) fosse caracterizado como um não bloqueador/melhorador de ligação de hPD- L1-mFc a hPD-1-hFc. Um anticorpo (H2aM8307N) demonstrou fraco bloqueio da ligação de hPD-L1-mFc a hPD-1-hFc com uma percentagem de bloqueio máximo de 29%; no entanto o valor de IC50 não poderia ser determinado nesta amostra.

[0195] Além disso, 14 dos 25 anticorpos de anti-PD-L1 da invenção bloqueavam 8 nM de hPD-L1-mFc a partir da ligação a hB7-1-hFc-6His com valores de IC50 que variam de <4 nM a 10 nM com a percentagem de bloqueio máximo que varia de 57% a 101%. Dois dos 25 anticorpos de anti-PD-L1 testados foram caracterizados como não bloqueadores de ligação de hPD-L1-mFc a hB7-1-hFc-6His, enquanto 8 anticorpos testados fossem caracterizados como não bloqueadores/melhoradores da ligação de hPD-L1-mFc a hB7-1-hFc-6His. Um anticorpo (H1H9327P) demonstrou fraco bloqueio de ligação de hPD-L1-mFc a hB7-1-hFc-6His com uma percentagem de bloqueio máximo de 41%; no entanto o valor de IC50 não poderia ser determinado nesta amostra.

Exemplo 5: Bloqueio de ligação de PD-L1 a PD-1 como determinado por ensaio de biossensor e por ressonância de plasmônio de superfície

[0196] Inibição de PD-L1 de ser humano a partir da ligação a PD-1 de ser humano por diferentes anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 foi estudada ou por uso de ensaio de interferometria de bio-camada de tempo real em um instrumento de biossensor Octet Red96 (Fortebio Inc.) ou por uso de um ensaio de biossensor de ressonância de plasmônio de superfície de tempo real em um instrumento Biacore 3000.

[0197] Estudos de inibição para anticorpos monoclonais de anti-PD- L1 expressos com Fc de camundongo foram realizados em um instrumento Octet Red96. Em primeiro lugar, 100 nM de um PD-L1 de ser humano recombinante expresso com uma etiqueta de Fc de IgG2a de camundongo C-terminal (hPD-L1-mFc; SEQ ID: 348) foi incubada com 500 nM de cada anticorpo monoclonal de anti-PD-L1 por pelo menos 1 hora antes da experiência o ensaio de inibição. Cerca de 0,8 nm a 1,2 nm de PD-1 de ser humano recombinante expressos com uma etiqueta de Fc de IgG1 de ser humano C-terminal (hPD-1-hFc; SEQ ID: 350) foi capturada usando-se biossensores de captura de Fc de IgG de anti-humano. Os biossensores de Octet capturados com hPD-1-hFc foram subsequentemente submergidos para dentro de cavidades contatando a mistura de hPD-L1-mFc e diferentes anticorpos monoclonais de anti-PD-L1. A experiência total foi realizada a 25°C em tampão de Octet HBST (HEPES a 0,01 M pH 7,4, NaCl a 0,15 M, EDTA a 3 mM, 0,05% v/v de tensoativo de P20, 0,1 mg/mL BSA) com uma agitação de placa em uma velocidade de 1000 rpm. Os biossensores foram lavados em tampão de Octet HBST em entre cada etapa da experiência. A resposta de ligação de tempo real foi monitorada durante o curso da experiência e a resposta de ligação no fim de cada etapa foi registrada. Ligação de hPD-L1-mFc ao hPD-1-hFc capturado foi comparada na presença e na ausência de diferentes anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 e foi usada para determinar o comportamento de bloqueio dos anticorpos testados como mostrados na tabela 12. Tabela 12: Inibição de ligação de PD-1 de ser humano a PD-L1 de ser humano por diferentes anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 expressos com Fc de camundongo realizado em um instrumento Octet Red96.

[0198] Como mos trado na tabela 12, 8 dos 12 anticorpos de anti- PD-L1 testados no instrumento Octet Red96 demonstravam bloqueio de hPD-L1-mFc a partir da ligação a hPD-1-hFc que variam de 58% a 97%. Quatro anticorpos de anti-PD-L1 testados demonstravam a capacidade de melhorar a ligação de hPD-L1-mFc a hPD-1-hFc.

[0199] A seguir, estudos de inibição para anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 expressos com um Fc de ser humano foram realizados no instrumento Biacore 3000. Em primeiro lugar, 100 nM de PD-L1 de ser humano recombinante expressos com uma etiqueta de Fc de IgG1 de ser humano C-terminal (hPD-L1-hFc; SEQ ID: 350) foi incubada com 500 nM de cada anticorpo monoclonal de anti-PD-L1 por pelo menos 1 hora antes experiência o ensaio de inibição. Uma superfície de sensor CM5 Biacore foi primeiramente derivatizado com anticorpo policlonal específico de IgG2a de anti-camundongo (Southern Biotech, # 1080-01) usando-se a química EDC-NHS padrão. A cerca de 230 RUs de PD-1 de ser humano recombinante expressas com uma etiqueta de Fc de IgG2a de camundongo C-terminal (hPD-1-mFc; SEQ ID: 348) foi então capturada e foi seguido por uma injeção de 100 nM de hPD-L1-hFc na presença e na ausência de diferentes anticorpos monoclonais de anti- PD-L1 em uma taxa de fluxo de 25 μL/min por 2 minutos. A experiência total foi realizada a 25°C em tampão de experiência de HBST (HEPES a 0,01 M pH 7,4, NaCl a 0,15 M, EDTA a 3 mM, 0,05% v/v de Tensoativo P20). As respostas de ligação de tempo real foram monitoradas durante o curso total da experiência e a resposta de ligação no fim de cada etapa foi registrada. Ligação de hPD-L1-hFc ao hPD-1-mFc capturado foi comparada na presença e na ausência de diferentes anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 e foi usada para determinar o comportamento de bloqueio dos anticorpos testados como mostrados na tabela 13.Tabela 13: Inibição de ligação de PD-1 de ser humano a PD-L1 de ser humano por diferentes anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 expressos com um Fc de ser humano realizado em instrumento Biacore 3000.

[0200] Como mostrado na tabela 13, 6 de cada 12 anticorpos de anti-PD-L1 da invenção testados no instrumento Biacore 3000 demonstravam bloqueio de hPD-L1-hFc a partir da ligação a hPD-1-mFc que variam de 84% a 97%. Seis anticorpos de anti-PD-L1 testados demonstravam a capacidade de melhorar a ligação de hPD-L1-hFc a hPD-1-mFc.

Exemplo 6: Competição cruzada de octetos entre anticorpos de anti-PD-L1

[0201] Competição de ligação entre anticorpos monoclonais de anti- PD-L1 foi determinada usando-se um ensaio de interferometria livre de marca, de tempo real em um biossensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). A experiência total foi realizada a 25°C no tampão de HBST Octet (HEPES a 0,01 M pH 7,4, NaCl a 0,15 M, EDTA a 3 mM, 0,05% v/v de Tensoativo P20, 0,1 mg/mL de BSA) com a agitação de placa na velocidade de 1000 rpm. Para avaliar se 2 anticorpos eram capazes de competir entre si para a ligação a seus respectivos epítopos no PD-L1 de ser humano recombinante expressos com uma etiqueta de com uma myc-myc-hexaistidina C-terminal (hPD-L1-MMH; SEQ ID: 345), por volta de ~0,3 nm de hPD-L1-MMH foi primeiramente capturado sobre extremidades de biossensor Octet revestidas com anticorpo de anti- Penta-His (Fortebio Inc, # 18-5079) por submersão das extremidades por 5 minutos para dentro da cavidade que contata solução de 20 μg/mL de hPD-L1-MMH. As extremidades de biossensor capturadas por antígeno foram então saturadas com um primeiro anticorpo monoclonal de anti-PD-L1 (subsequentemente chamado de mAb-1) por mergulho para dentro das cavidades que contata solução de 50 μg/mL de mAb-1 por 5 minutos. As extremidades de biossensor foram então subsequentemente mergulhados para dentro de cavidades que contata solução de 50 μg/mL de um segundo anticorpo monoclonal de anti-PD- L1 (subsequentemente chamado de mAb-2). As extremidades de biossensor foram lavadas em tampão de HBST Octet em entre cada etapa da experiência. A resposta de ligação de tempo real foi monitorada durante o curso da experiência e a resposta de ligação no fim de cada etapa foi registrada como mostrada na figura 1. A resposta de mAb-2 que se liga a hPD-L1-MMH pré-complexada com mAb-1 foi comparado e comportamento competitivo/não competitivo de diferentes anticorpos monoclonais de anti-PD-L1 foi determinada.

[0202] Sob as condições experimentais usadas neste Exemplo, (a) H2aM8309N, H1H9329P, H1H9336P, H2aM8314N, H2aM8316N,H2aM8718N, H1H9387P2, H1H9351P2, H1H9364P2, H1H9373P2, e H2aM8306N competição cruzada entre si; (b) H2aM8310N, H2aM8321N e H2aM8312N competidos cruzadamente entre si; (c) H1H9396P2, H2aM8317N, H2aM8321N, H1H9323P, H1H9382P2, H1H9344P2, H1H9345P2e and H1H9354P2 competidos cruzadamente entre si; e (d) H1H9327P e H2aM8307N competidos cruzadamente entre si. Em um caso, competição foi observada em uma orientação mas não na orientação oposta: isto é, H2aM8307N quando aplicado primeiramente competido com H2aM8309N, H1H9329P, H1H9336P, H2aM8314N, H2aM8316N, H2aM8718N, H1H9387P2, H1H9351P2, H1H9364P2, H1H9373P2, e H2aM8306N; no entanto, na orientação oposta, H2aM8309N, H1H9329P, H1H9336P, H2aM8314N, H2aM8316N, H2aM8718N, H1H9387P2, H1H9351P2, H1H9364P2, H1H9373P2, e H2aM8306N quando aplicados em primeiro lugar não competiam com H2aM8307N.

Exemplo 7: Ligação de anticorpo a células que ultra-expressam PD- L1

[0203] A ligação de anticorpos de anti-PD-L1 a uma linha de células de rim embriônica de ser humano (HEK293; ATCC, #CRL-1573) estavelmente transfectada com PD-L1 de ser humano de comprimento total (aminoácidos de 1 a 290 de número de acesso NP_054862.1) (HEK293/hPD-L1) foi determinada por FACS.

[0204] Para o ensaio, células aderentes foram separadas usando- se tampão de dissociação livre de enzima e foram bloqueadas com meio completo. Células foram centrifugadas e foram ressuspensas em uma concentração de 2,8x10A6 células/mL em PBS frio que contata 2% de FBS. Células parentais de HEK293 células de HEK293/hPD-L1 foram então incubadas por 15 a 30 minutos sobre gelo com 100 nM de cada anticorpo de anti-PD-L1 ou um anticorpo de controle de isótipo. Anticorpos não ligados foram removidos por lavagem com D-PBS que contata 2% de FBS, e células foram subsequentemente incubadas com um fragmento de FCY segundário conjugado a ficoeritrina especificamente reconhecendo ou um Fc de ser humano (Jackson ImmunoResearch, # 109-116-170) um Fc de camundongo (Jackson ImmunoResearch, #115-115-164) por 15 a 30 minutos sobre gelo. Células foram lavadas com D-PBS que contata 2% de FBS para remover reagentes de detecção sedunária não ligados e medições de fluorescência foram adquiridos usando-se um citômetro de fluxo HyperCyte (IntelliCyt, Inc.). Dados foram analisados usando-se software HyperCyte. Tabela 14: ligação de FACS de anticorpos de anti-PD-L1 a células de HEK293/hPD-L1 e células HEK293 parentais

[0205] Como mostrado na tabela 14, todos os 25 anticorpos de anti- PD-L1 da invenção mostravam forte ligação às células de HEK293/ hPD-L1 comparadas com a ligação na linha de HEK293 parental.

Exemplo 8: Bloqueio de regulação para baixo de célula T induzida por PD-L1 em ensaio de repórter de luciferase de APC/célula T

[0206] Ativação de célula T é conseguida por estimulação de receptores de célula T (TcR) que reconhecem peptídeos específicos apresentados pelas principais proteínas de classe I ou II de complexo de histocompatibilidade nas células de apresentação de antítgeno (APC). TcRs ativadas por sua vez inciar uma cascata de eventos de sinalização que podem ser monitorados por genes repórteres dirigidos por fatores de transcrição such as activator-proteína 1 (AP-1), Fator nuclear de células T ativadas (NFAT) ou um melhorador de cadeia leve kappa de fator nuclear de células B ativadas (NFKb). Resposta de célula T é modulada via ligação de co-receptores expressos ou constitutivamente ou induzivelmente em células T. Um tal receptor é uma proteína de morte de célula programada 1 (PD-1), um regulador negativo de atividade de célula T. PD-1 interage com seu ligante, PD- L1, que é expresso em células alvos incluindo APCs ou células de câncer, e esta interação resulta no fornecimento de sinais inibitórios por recrutamento de fosfatases para o signalosome de TcR, resultando na supressão de sinalização positiva.

[0207] Um bioensaio foi desenvolvido para medir sinalização de célula T induzida por interação entre APC e células T por utilização de uma cultura mistura derivada de duas linhas de células de mamífero: células de Jurkat (uma linha de células T imortalizada) e células de Raji (uma linha de células B) (a figura 1). Para um primeiro componente do bioensaio, células de E6-1 de clone de Jurkat (ATCC, #TIB-152) foram transduzidas com o repórter Cignal Lenti AP-1 Luc (Qiagen - Sabiosciences, #CLS-011L) como pelas instruções do fabricante. O lentivírus codifica o gene de luciferase de vaga-lume sob o controle de um promotor de CMV mínimo, repetições tandem do elemento de resposta transcritiva induzível por TPA= (TRE) e um gene de resistência a puromicina. A linha de células de Jurkat engenheirada foi subsequentemente transduzida com uma quimera de PD-1 compreendendo o domínio extracelular de PD-1 humano (aminoácidos de 1 a 170 de PD1 humano; número de acesso NP_005009.2) e a trans- membrana e domínios citoplásmico de CD300a de ser humano (aminoácidos de 181 a 299 de CD300a de ser humano; número de acesso NP_009192.2). A linha de células estável resultante (Jurkat/AP1-Luc/ hPD1-hCD300a) foi selecionada e foi mantida em RPMI/10% de FBS/ penicilina/estreptomicina/glutamina suplementados com 500 ug/mL de G418+1 ug/mLde puromicina.

[0208] Para o segundo componente do bioensaio, células de Raji (ATCC, #CCL-86) foram transduzidas com gene de PD-L1 de ser humano (aminoácidos de 1-290 de número de acesso NP_054862.1) que foi clonado em um sistema de vetor lentiviral (pLEX) (Thermo Scientific Biosystems, #OHS4735). Células de Raji, positivas para PD- L1 (Raji/ hPD-L1) foram isoladas por FACS usando-se um anticorpo de PD-L1 e foram mantidos Iscove/10% de FBS/penicilina/estreptomicina/glutamina suplementadas com 1 ug/mL de puromicina.

[0209] Para estimular a interação de célula T/APC, um anticorpo biespecífico constituído de uma ligação de braço de Fab a CD3 em células T e a outra uma ligação de braço de Fab que se liga a CD20 em células de Raji (anticorpo biespecífico de CD3xCD20; por exemplo, como revelada na US 20140088295) foi utilizada. A presença da molécula biespecífica no ensaio resulta na ativação da célula T e APC por ligação por pontes das subunidades de CD3 em células T a CD20 endogenamente expressa em células de Raji. Ligação de CD3 com anticorpos de anti-CD3 foi demonstrado como levando a ativação de células T. Neste bioensaio, anticorpos que bloqueiam a atividade de célula T de resgate de interação de PD1/PD-L1 por incapacitação da sinalização inibitória e subsequentemente levando a ativação de AP1- Luc aumentada.

[0210] No bioensaio à base de luciferase, RPMI1640 suplementado com 10% de FBS e penicilina/estreptomicina/glutamina foi usado como meio de ensaio para preparar suspensões de células e diluições de anticorpos para realizar a triagem de anticorpos monoclonais de anti- PD-L1 (mAbs). No dia da triagem, os valores de EC50 de mAbs de anti- PD-L1, na presença de uma concentração fixa de anticorpo biespecífico de CD3xCD20 (30 pM), bem como a EC50 do anticorpo biespecífico sozinho, foram determinadas. Na seguinte ordem, células e reagentes foram adicionados a placas de fundo chato, brancas de 96 cavidades. Para as determinações de EC50 de mAb de anti-PD-L1, em primeiro lugar uma concentração fixa de anticorpo biespecífico de CD3xCD20 (final 30 pM) foi preparada e foi adicionada às cavidade de placa de microtítulo. Diluições em série de doze pontos de mAbs de anti-PD-L1 e controles foram então adicionados (concentrações finais que variam de 1,7 pM a 100 nM; mais cavidades com meio de ensaio sozinho). Para a determinação de EC50 de anticorpo biespecífico (sozinho), o anticorpo biespecífico, a concentrações finais que variam de 0,17 pM a 10 nM (mais cavidades com meio de ensaio sozinho), foi adicionada às cavidades de placa de microtítulo. subsequentemente, uma suspensão de 2,5x10A6/mL de célula de Raji/hPD-LI foi preparada e 20 uL por cavidade foram adicionados (número de célula final/cavidade 5x10A4 células). Placas foram deixadas a temperatura ambiente (de 15-20 minutos), enquanto uma suspensão de 2,5x10A6/mL de Jurkat/AP1- Luc/hPD1(ecto)-hCD300a(TM-Cito) foi preparada. 20 uL da suspensão de Jurkat (número de célula final/cavidade 5x10A4 células) foram adicionados por cavidade. Placas que contatam a co-cultura foram incubadas por 5 a 6 horas a 37°C em 5% de CO2. Atividade de luciferase foi então detectada depois da adição de reagente de ONE-Glo™ (Promega, # E6051) e unidades leves relativas (RLUs) foram medidas em um luminômetro Victor. Todas as amostras foram testadas em cópias.

[0211] Valores de RLU para cada anticorpo triado foram normalizados por ajuste da condição de ensaio com concentração fixa (30 pM) do anticorpo biespecífico de CD3/CD20, mas em anticorpo de anti-PD-L1 até 100%. Esta condição corresponde à resposta de AP1- Luc máxima eliciada pela molécula biespecífica na presença do sinal inibitório de PD-1/PD-L1. Na adição do anticorpo de anti-PD-L1, o sinal inibitório é suprimido, e o estímulo aumentado é mostrado aqui como Emax, a percentagem de aumento no sinal na presença da dose de anticorpo mais alta testada (100 nM). Para comparar potência dos anticorpos de anti-PD-L1 testados, a concentração de anticorpo em que o valor de RLU normalizado alcançou 125% de ativação foi determinado de uma equação logística de quatro parâmetros sobre uma curva de resposta de 12 pontos usando-se GraphPad Prism. Os resultados são sumarizados na tabela 15.Tabela 15: Anticorpo de Anti-PD-L1 que bloqueia PD-1/PD-L1 dependente de inibição de sinalização de AP1-Luc

[0212] Como mostrado na tabela 15, 14 de cada 27 anticorpos de anti-PD-L1 da invenção testados bloqueavam inibição de PD-1/PD-L1 com valores de Emax que variam de 234,9 a 138.1. Treze de cada 27 anticorpos de anti-PD-L1 da invenção não demontravam bloqueio substancial de interação de PD1/PD-L1 quando testados neste ensaio. Controles de isótopo não interferiam com a interação de PD1/PD-L1.

Exemplo 9: eficácia in vivo de anticorpos de anti-PD-L1

[0213] Para determinar o efeito de um número seleto de anticorpos de anti-PD-L1 da invenção em um modelo relevante in vivo, um estudo de crescimento de tumor de MC38.ova, envolvendo injeção subcutânea de células de tumor e iniciada em dias diferentes, foi conduzida em camundongos que eram homozigotos para a expressão do domínio extracelular de PD-L1 de ser humano no lugar do domínio extracelular de PD-L1 de camundongo (PD-L1 HumIn camundongos) em uma base de 75% de C57/Bl6 / 25% de 129 cepas. Células de MC38.Ova (adenocarcinoma de cólon de camundongo) foram engenheiradas para expressar ovalbumina de galinha a fim de aumentar imunogencidade de tumor, e para permitir monitoramento das respostas imunes de célula T a peptídeos de ovalbumina antigênicos bem definidos. Em uma segunda etapa, células de MC38.Ova foram transduzidas com um vetor lentiviral que expressa hPD-L1 sob o promotor de SFFV. Células de MC38.Ova positivas para hPD-L1 (MC38.Ova/hPD-L1) foram isoladas por FACS usando-se anticorpo específico de hPD-L1-. As células demonstraram expressar baixo nível de PD-L1 de camundongo endógeno.

[0214] Para um primeiro estudo (estudo #1), camundongos foram divididos uniformemente de acordo com o peso do corpo em 5 grupos de tratamento ou de controle (n=5 a 8 camudnongos por grupo). No dia 0, camundongos foram anestesiados por inalação de isoflurano e então foram injetados subcutaneamente para dentro do flanco direito com 1x106 células de MC38.ova/hPD-L1 em suspensão de 100 uL de DMEM. Grupos de tratamento foram intraperitonealmente injetados com 500 ug ou de um dos três anticorpos de anti-PD-L1 da invenção, ou um dos dois anticorpos de anticorpos de controle de isótopo com especificidade irrelevante nos dias 3, 7, 10, 14, e 17 da experiência, embora um grupo de camundongos fosse deixado não tratado.

[0215] Em um segundo estudo (estudo #2), camundongos humanizados de PD-L1 foram aleatoriamente escolhidos em 7 grupos de tratamento (n=5 a 6 camundongos). NO dia 0, camundongos foram subcutaneamente implantados com 1x10A6 células de MC38.Ova/hPD- L1. Camundongos foram intraperitonealmente administrados com REGN a-PD-L1 ab (H1H8314N ou H1H9364P2 ou H1H9373P2), ou controle de isótipo abs hIgG4 mut ou hIgG1 em doses de 10 mg/kg ou 5 mg/kg. A grupos de camundongos foram administrados anticorpo nos dias 3, 7, 10, 14, e 17. Volumes de tumor foram monitorados por medição de compasso de calibre duas vezes por semana pela duração da experiência (21 dias). Administração dosada experimental e protocol de tratamento para grupos de camundongos são mostrados na tabela 16. Tabela 16: Protocolo de tratamento e administração dosada experimental para grupos de camundongos

[0216] Para os estudos, volumes médio de tumor foram monitorados por medição de compasso de calibre duas vezes por semana pela duração da experiência (17 dias) e percentagem de sobrevivência foi registrada no fim da experiência. Além disso, o número de camundongos livres de tumor foi também avaliado no fim do estudo. Resultados, expressos como volume médio de tumor (mm3)(±SD), percentagem de sobrevivência, e número de camundongos livres de tumor são mostrados na tabelas 17 e 18.Tabela 17: Volume médio de tumor, percentagem de sobrevivência e números de camundongos livres de tumor em cada grupo de tratamento do estudo # 1

[0217] Como mostrado na tabela 17 para o estudo #1, todos os três anticorpos de anti-PD-L1 da invenção eram eficazes na promoção de regressão de tumor na dosagem de 500 ug/camundongo com todos os camundongos do grupo de tratamentos que recebiam dois dos anticorpos, H1H9364P2 e H1H9373P2, estando livre de tumor no dia 17. No grupo de tratamento que recebia um dos anticorpos de anti-PD- L1 da invenção, H1H8314N, 4 de cada 5 camundongos estavam livres de tumor pelo dia 17, enquanto que 0 de cada 5 animais estavam livres de tumor nos grupo de controle de isótipo. ANOVA de uma via com pós- teste de comparação múltiplo de Dunnett revelou uma diferença significativa nos volumes de tumor entre os tratamentos com anticorpos de anti-PD-L1 da invenção e o anticorpo de controle de isótipo com um valor de p <0,05.Tabela 18: volume de tumor médio, percentagem de sobrevivência e números de camundongos livres de tumor em cada grupo de tratamento do estudo # 2

[0218] Como mostrado na tabela 18, no estudo #2, administração dos anticorpos de anti-PD-L1 selecionados resultou na inibição de crescimento de tumor que promove regressão de tumor. Todos os três anticorpos de anti-PD-L1 eram eficazes na dose de 10 mg/kg e dose de 5 mg/kg e promoveram regressão de tumor nos camundongos tratados em um modo dependente de dose através de todo o curso da experiência, enquanto que 0 de cada 5 animais estavam livres de tumor no grupo de controle. ANOVA de uma via com pós-teste de múltipla comparação de Tukey revelou uma diferença significativa em volumes de tumor entre tratamentos com os anticorpos de anti-PD-L1 e anticorpo de controle de isótipo com valor de p <0,05 ou mais baixo.

Exemplo 10: Efeitos de anti-tumor de uma combinação de um anticorpo de anti-PD-L1 e um antagonista de VEGF em um modelo de tumor de tratamento precoce de camundongo

[0219] Um modelo de tumor tratamento precoce foi desenvolvido para tratar a eficácia de uma combinação de um anticorpo de anti-PD- L1 e um antagonista de VEGF. Neste modelo, a terapia de combinação é administrada logo depois da implantação do tumor. A experiência também usava um anticorpo de anti-PD-1 sozinho e em combinação com o antagonista de VEGF. O anticorpo de anti-PD-L1 usado nesta experiência era um anticorpo monoclonal de anti-PD-L1 com sequências de VH/VL de anticorpo “YW243.55S70” de acordo com US 20100203056A1 (Genentech, Inc.), com IgG2a de camundongo e que foi cruzadamente reativa com PD-L1 de camundongo. O antagonista de VEGF usado nesta experiência era aflibercept (uma molécula quimérica com base em receptor de VEGF, também conhecida como “armadilha para VEGF" ou "VEGFR1R2-FcΔC1(a)," cuja descrição total é provida em outro lugar aqui). O anticorpo de anti-PD-1 usado nesta experiência era um clone anti-camundongo de PD-1 "RPMI-14" com IgG2b de rato (Bio X Cell, West Lebanon, NH).

[0220] Para este modelo experimental, 1.0x106 Colon-26 células de tumor foram implantadas subcutaneamente em camundongos BALB/c no dia 0. Partindo no Dia 3, antes do estabelecimento de tumores mensuráveis, camundongos foram tratados com uma das mono- ou terapias de combinação, ou combinação de controle, como indicado na tabela 19.Tabela 19: Administração dosada experimental e Grupos de tratamento

[0221] As várias terapias foram administradas em cinco diferentes pontos de tempo durante um período de duas semanas (isto é, injeções nos dia 3, Dia 6, Dia 10, Dia 13 e Dia 19).

[0222] Animais em cada grupo de terapia foram avaliados em termos de incidência de tumor, volume de tumor, tempo médio de sobrevivência, e número de animais livres de tumor no dia 50. A extensão de crescimento de tumor é sumarizada na figura 2 (curvas de crescimento de tumor) e a figura 3 (volume de tumor no dia 28). Resultados são também sumarizados na tabela 20. Tabela 20: Camundongos livres de tumor no tratamento

[0223] Crescimento de tumor foi su bstancialmente reduzido em animais com a combinação de armadilha para VEGF + anticorpo de anti- PD-L1 quando comparada com regimes de tratamento que envolvem qualquer agente terapêutico sozinho (vide as figuras 2 e 3). Além do mais, sobrevivência foi substancialmente aumentada no grupo de armadilha para VEGF + anticorpo de anti-PD-L1, com 90% de animais que sobrevivem por pelo menos dia 50 depois da implantação do tumor. Por contraste com isso, para os grupos de monoterapia de anti-PD-L1 e armadilha para VEGF, sobrevivência para o Dia 50 era apenas 50% e 30% respectivamente (vide a figura 3 e Tabela 20).

[0224] A presente invenção não deve ser limitada no escopo pelas concretizações específicas descritas aqui. De fato, várias modificações da invenção além daquelas descritas se tornarão evidentes por aqueles versados na técnica a partir da descrição e as figuras expostas acima. Pretende-se que tais modificações caiam dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga à protepina do ligante de morte programada 1 humana (PD-L1), em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma região variável de cadeia pesada (HCVR) (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e três CDRs de uma região variável de cadeia leve (LCVR) (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84; HCDR2 consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 86; HCDR3 consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88; LCDR1 consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92; LCDR2 consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 94; e LCDR3 consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 96.

2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 e uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 90.

3. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um IgG1 ou IgG4.

4. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é uma molécula de ligação ao antígeno multi-específica.

5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a PD-L1, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

6. Molécula de polinucleotídeo isolada, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 81 ou suas sequências nucleotídicas degeneradas que codificam a sequência de aminoácidos da HCVR de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 89 ou suas sequências nucleotídicas degeneradas que codificam a sequência de aminoácidos da LCVR do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

7. Vetor isolado, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 6.

8. Método de produção de um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de uma célula hospedeira que expressa o vetor, como definido na reivindicação 7, sob condições que permitem a produção do anticorpo ou fragmento, e a recuperação do anticorpo ou fragmento então produzido.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a formulação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como uma composição farmacêutica compreendendo um veículo aceitável.

10. Uso do anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para aumentar uma resposta imune em um indivíduo.

11. Uso do anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para inibir uma célula T-reguladora (Treg) em um indivíduo.

12. Uso do anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para aumentar a ativação de célula T em um indivíduo.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um tumor.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma infecção viral.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a infecção viral compreende HIV, HBV, HCV, HPV, LCMV, SIV ou uma combinação dos mesmos.

16. Uso do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para inibir o crescimento de um tumor ou célula tumoral.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 13 ou 16, caracterizado pelo fato de que o tumor ou célula tumoral compreende carcinoma de células renais, câncer de cérebro, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer gástrico, câncer de rim, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão de não pequenas células, câncer colorretal, mieloma múltiplo ou melanoma.

18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é formulado para administração ao indivíduo em combinação com um segundo agente terapêutico ou terapia.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o segundo agente terapêutico ou terapia compreende um NSAID, um corticosteroide, um anticorpo para um co-inibidor de células T, um anticorpo para um antígeno específico de tumor, um anticorpo para PD-1, um inibidor de indoleamina-2,3-dioxigenase, um inibidor de Ang2, uma vacina contra o câncer, um inibidor de EGFR, um inibidor de TGFβ, um suplemento dietético como um antioxidante, um antagonista de VEGF como um anticorpo anti-VEGF, um inibidor de pequena molécula de quinase do receptor de VEGF ou uma proteína de fusão inibidora de VEGF, cirurgia, radiação, um agente quimioterápico, um agente citotóxico ou uma combinação dos mesmos.

20. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é formulado para administração subcutânea, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal, oral, intramuscular ou intracranial.

21. Uso da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para aumentar uma resposta imune em um indivíduo.

22. Uso da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para inibir uma célula T-reguladora (Treg) em um indivíduo.

23. Uso da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para aumentar a ativação de célula T em um indivíduo.

24. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma infecção viral.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a infecção compreende HIV, HCV, HBV, HPV, LCMV, SIV, ou uma combinação dos mesmos.

26. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um tumor.

27. Uso da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para inibir o crescimento de um tumor ou de uma célula de tumor em um indivíduo.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que o tumor compreende carcinoma de célula renal, câncer no cérebro, carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço, câncer gástrico, câncer de rim, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão de não pequenas células , câncer colorretal, mieloma múltiplo ou melanoma.

29. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 28, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é formulada para administração por via subcutânea, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal, oral, intramuscular ou intracraniana.