CN112218877A - 拉曼光谱在下游纯化中的应用 - Google Patents

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Abstract

提供了用于在制备或制造期间表征或定量蛋白质纯化中间品和/或最终浓缩池的原位拉曼光谱方法和***。在一个实施方案中，将原位拉曼光谱用于在下游处理期间(即，在收获所述蛋白质纯化中间品之后)表征或定量蛋白质纯化中间品的关键质量属性。例如，在对蛋白质纯化中间品进行纯化、浓缩或以别的方式配制成待出售或施用的最终药物产品时可将所公开的原位拉曼光谱方法和***用于表征和定量所述蛋白质纯化中间品。

Description

拉曼光谱在下游纯化中的应用
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年8月27日提交的美国临时专利申请No.62/723,188的权益和优先权，并在允许的情况下将其以引用的方式全文并入。
技术领域
本发明整体涉及用于监测和控制下游蛋白质纯化过程中的一个或多个关键质量属性(CQA)或参数的***和方法。
背景技术
在过去的十年中，已批准用于治疗用途的单克隆抗体(mAb)的数量已大大增加。这在一定程度上是由于大规模制造工艺的改进，其有利于大量mAb的制备。此外，诸如美国食品和药物管理局(FDA)的过程分析技术(PAT)框架之类的举措已为过程开发、过程分析和过程控制提供了创新的解决方案，以更好地理解过程并控制产品质量。从细胞培养基中有效回收和纯化单克隆抗体是制备过程的关键部分。纯化过程应可靠地制备可安全用于人的单克隆抗体。这包括监测关键质量属性(CQA)，CQA包括蛋白质属性和杂质诸如宿主细胞蛋白质、DNA、病毒、内毒素、聚集体、浓聚物、赋形剂和可能影响患者安全性、功效或效价的其他物质。蛋白质浓度通常也是经纯化物质中的CQA，并且过程中间品中适当的蛋白质浓度可能是单元操作性能的关键过程参数。需要在整个制备过程以及整个程序生命周期中监测这些CQA。
为确保mAb的最终制剂不合超过确定水平的杂质，在下游处理的各个阶段对mAb产品进行测试。生物产品(诸如mAb)制造中的质量控制通常是通过对每批次制备使用离线方法分析纯化中间品和经配制原料药样品来完成。将样品从处理设备(例如UF/DF橇)中移出，并使其经受离线测试以测量产品CQA，诸如蛋白质浓度(g/L)、缓冲赋形剂和大小变体。无法在制造过程中进行实时监测和分析，从而导致处理时间增加以及更高的由于无法满足CQA而导致的批次不合格风险。因此，需要用于mAb的实时质量控制监测的快速线内(in-line)方法。
因而，本发明的目的是提供用于在下游纯化过程期间实时监测关键质量属性的***和方法。
发明内容
提供了用于在制备或制造期间表征或定量蛋白质纯化中间品的原位拉曼光谱方法和***。在一个实施方案中，将原位拉曼光谱用于在下游处理期间(即，从细胞培养流体中收获蛋白质纯化中间品之后)表征或量化蛋白质药物的关键质量属性。例如，可将所公开的原位拉曼光谱方法和***用于在纯化蛋白质纯化中间品(在配制成待出售或施用的最终药物产品之前)时表征和定量蛋白质纯化中间品的关键质量属性。关键质量属性包括但不限于蛋白质浓度、赋形剂、高分子量(HMW)物质、抗体滴度和药物/抗体比。
一个实施方案提供了一种制备浓缩蛋白质纯化中间品的方法，所述方法通过如下进行：在浓缩/渗滤蛋白质纯化中间品的同时使用原位拉曼光谱实时测定所述蛋白质纯化中间品的浓度并实时调整所述浓缩步骤的参数来获得原料药配制所需的预定的浓度目标和赋形剂水平。蛋白质纯化中间品可具有5mg/mL至300mg/mL、优选50mg/mL至300mg/mL的浓度以供后续的配制步骤。在一个实施方案中，在初级(primary)或最终浓缩期间使用超滤将蛋白质纯化中间品浓缩至所需浓度目标。在初级浓缩后的处理期间将渗滤用作缓冲液交换的手段以实现所需的最终制剂组分。可以从生物反应器、补料分批培养物或连续培养物收获蛋白质纯化中间品。在另一个实施方案中，测定蛋白质纯化中间品的浓度可以实时连续地或间歇地进行。可以以大约5秒至10分钟的间隔、每小时一次或每天一次进行蛋白质浓度的定量。蛋白质纯化中间品可以是抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白。可以在选自977-1027cm-1、1408-1485cm-1、1621-1711cm-1、2823-3046cm-1以及它们的组合的一个或多个波数范围内收集光谱数据。
另一个实施方案提供了一种制备蛋白质纯化中间品的方法，所述方法通过如下进行：对多种蛋白质纯化中间品独立地进行拉曼光谱分析以产生能够对所述多种蛋白质纯化中间品中的任一者进行定量的通用模型。可以在蛋白质纯化中间品的浓缩期间从浓缩所述蛋白质纯化中间品的开始到结束使用原位拉曼光谱采用所述通用模型测定所述蛋白质纯化中间品的浓度。另一个实施方案提供了一种制备蛋白质纯化中间品的方法，该方法用以产生能够定量蛋白质浓度的蛋白质特异性模型，该模型将用于商业上可行的蛋白质制备。
可以使用原始光谱数据的偏最小二乘回归分析以及将正交方法用于离线蛋白质浓度数据来产生该模型。诸如标准正态变量(SNV)和/或点平滑技术之类的预处理技术可以是一阶导数，其中可以对拉曼光谱数据进行21cm-1平滑以减轻模型变异性和预测误差。可以进行进一步的模型精化以分离与CQA预测(诸如蛋白质浓度)相关的光谱区。在一个实施方案中，该模型具有≤5％的误差容限，优选≤3％的误差容限。
另一个实施方案提供了一种用于在下游纯化期间监测和控制收获的细胞培养物流体和/或蛋白质纯化中间品中的赋形剂水平的方法，所述方法通过如下进行：在纯化所述细胞培养物流体或蛋白质纯化中间品的同时使用原位拉曼光谱实时测定所述赋形剂的浓度，并实时调整所述纯化步骤的参数以在所述收获的细胞培养物流体和/或蛋白质纯化中间品中获得或维持预定量的赋形剂。赋形剂可以是乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐、羟甲基氨基甲烷(Tris)、脯氨酸、精氨酸、蔗糖或它们的组合。赋形剂可以是表面赋形剂诸如聚山梨酯80、聚山梨酯20和泊洛沙姆188。
附图说明
图1是示出了示例性蛋白质纯化过程的流程图。
图2是代表性光谱图，示出了线内拉曼光谱的初始模型开发。X轴表示拉曼位移。Y轴表示强度。右边的图例表示蛋白质浓度。初始模型开发过程中使用的光谱区域从左到右包括977-1027cm-1(环结构)、1408-1485cm-1(精氨酸)、1621-1711cm-1(二级结构)和2823-3046cm-1(C-H伸缩)。
图3是柱状图，示出了在标准超滤/渗滤单元操作期间mAb1的蛋白质浓度(g/L)。空白条柱是使用SoloVPE***(C技术公司(C-technologies))采用基于UV-Vis的离线方法测定的浓度，其中误差棒为±5％，±5％为线内拉曼预测的目标。带有宽阴影线的条柱表示在本文中称为拉曼预测中不包含mAb1的通用模型，带有窄阴影线的条柱表示具有mAb1的通用模型。带交叉阴影线的条柱对应于来自范围为0-120g/L的初始通用模型的预测结果。带阴影线条柱对应于来自＞120g/L的初始通用模型的预测结果。
图4是柱状图，示出了来自初始通用模型开发的各种mAb的绝对拉曼模型误差。带阴影线的条柱表示初始通用模型0-120g/L(初级浓缩和渗滤)，空白条柱表示来自初始通用模型＞120g/L。(最终浓缩)。水平线表示误差≤5％的拉曼模型目标。
图5是柱状图，示出了各种mAb的绝对拉曼模型误差。带宽阴影线的条柱表示0-120g/L(初级浓缩和渗滤)，带窄阴影线的条柱表示＞120g/L(最终浓缩)。水平线表示误差≤5％的拉曼模型目标。示出了通用拉曼模型的两种形式。带阴影线的条柱表示初始通用模型，带交叉阴影线的条柱表示更新的通用模型。
图6是超滤/渗滤***的示意图，包括用于线内拉曼探针放置的位置。
图7是柱状图，示出了将通用模型或mAb10特异性模型用于最终浓缩池(FCP)测量时mAb10的蛋白质浓度。示出了线内实时拉曼预测(带宽阴影线的条柱)、更新的模型(带窄阴影线的条柱)和SoloVPE(空白条柱)的蛋白质浓度。X轴表示实验组，Y轴表示蛋白质浓度。
图8A至图8B是柱状图，示出了蛋白质浓度的实验室规模DoE建模的拉曼模型误差。图8A示出了UF/DF处理的各个阶段(初级浓缩、渗滤和最终浓缩池)中实时预测的拉曼模型误差。图8B示出了在UF/DF处理的各个阶段(初级浓缩、渗滤和最终浓缩池)的最终DoE模型的拉曼模型误差。
图9A是柱状图，示出了针对mAb11，模型放大至中试处理设备时的模型预测能力百分误差。将实验室规模模型数据与并入了中试规模数据的实验室规模数据进行比较。X轴表示实验组，Y轴表示模型预测能力百分误差(％)。图9B是柱状图，示出了各种单克隆抗体的中试规模处理的模型预测能力。X轴表示实验组，Y轴表示模型预测能力百分误差(％)。
图10A是具有拉曼反馈的示例性自动批处理UF/DF的示意图。图10B是具有拉曼反馈的示例性自动单程TFF的示意图。
图11是示出了UF/DF处理过程中mAb14浓度的图。X轴表示通过量(L/m2)，Y轴表示mAb 14浓度(g/L)。
图12A是柱状图，示出了通过SE-UPLC或拉曼建模测定的各个处理步骤(初级浓缩、渗滤、最终浓缩)期间mAb2中的高分子量(HMW)物质的百分比。X轴表示实验组，Y轴表示mAb2HMW百分比(％)。图12B是柱状图，示出了使用各种扫描时间(10秒、20秒、30秒)对mAb 15预测的高分子量(HMW)物质的百分比。X轴表示实验组，Y轴表示HMW百分比(％)。
图13是点阵图，示出了来自mAb 14的单克隆抗体样品的实际滴度(g/L)对拉曼预测滴度。X轴表示拉曼预测滴度，Y轴表示实际滴度(g/L)。
图14A是散点图，示出了各种单克隆抗体中的拉曼组氨酸预测。X轴表示通过拉曼建模预测的组氨酸浓度，Y轴表示通过氨基酸分析测定的实际组氨酸浓度。图14B是点阵图，示出了单克隆抗体样品的实际组氨酸浓度对拉曼预测的组氨酸浓度。图14C是点阵图，示出了单克隆抗体样品的实际精氨酸浓度对拉曼预测的精氨酸浓度。
图15A是散点图，示出了来自mAb 3的单克隆抗体样品的实际药物/抗体比(DAR)对拉曼预测的DAR。X轴表示拉曼预测的DAR，Y轴表示通过紫外光谱测定的实际DAR。图15B是散点图，示出了来自mAb 1的单克隆抗体样品的实际药物/抗体比(DAR)对拉曼预测的DAR。X轴表示拉曼预测的DAR，Y轴表示实际DAR。
具体实施方式
I.定义
应当理解，本公开不限于本文描述的组合物和方法以及描述的实验条件，因为它们可能会有所不同。还应当理解本文所用的术语仅用于描述某些实施方案的目的，并且并非旨在进行限制，因为本公开的范围将仅由随附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文使用的所有科技术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的一致。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何组合物、方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中。所提及的所有出版物均以引用的方式全文并入本文。
在描述当前要求权利保护的本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用术语“一个”、“一种”、“该(所述)”和类似指代应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾。
除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的缩略方法，并且将每个单独的值并入本说明书中，就如同其在本文中单独引用一样。
术语“约”的使用旨在描述在大约±10％的范围内高于或低于所述值的值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约±5％的范围内高于或低于所述值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约±2％的范围内高于或低于所述值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约±1％的范围内高于或低于所述值。前面的范围旨在通过上下文解释清楚，并且不暗示进一步的限制。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求权利保护的要素对于本发明的实施是必不可少的。
如本文所用，“蛋白质”是指包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。蛋白质包括多肽和肽，并且可还包括修饰，诸如糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ羧化、烷基化、羟基化和ADP-核糖基化。蛋白质可以具有科学价值或商业价值，包括基于蛋白质的药物，并且蛋白质尤其包括酶、配体、受体、抗体和嵌合蛋白或融合蛋白。蛋白质是使用众所周知的细胞培养方法由各种类型的重组细胞产生的，并且通常通过转染基因工程核苷酸载体(例如，诸如编码嵌合蛋白的序列，或者密码子优化的序列、无内含子序列等)而引入细胞中，其中载体可以作为附加体存在或整合到细胞基因组中。
“抗体”是指由通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重链(H)和两条轻链(L))组成的免疫球蛋白分子。每条重链具有重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区含有三个结构域即CH1、CH2和CH3。每条轻链具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH区和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包括指任何同种型或亚型的糖基化和非糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体分子，诸如从经转染以表达抗体的宿主细胞分离的抗体。术语抗体也包括双特异性抗体，其包括可结合至不止一个不同表位的异四聚免疫球蛋白。双特异性抗体在美国专利申请公开No.2010/0331527中进行了一般性描述，该专利申请以引用方式并入本申请中。
“二级结构”是指由于主链原子之间的相互作用而在多肽内形成的局部折叠结构。二级结构最常见的类型是α螺旋和β折叠片层。两种结构都通过氢键保持形状，氢键形成在一个氨基酸的羰基O与另一个氨基酸的氨基H之间。
如本文所用，“赋形剂”是指药理学上无活性的物质，其用作稳定剂以供经配制原料药的长期储存。通常，将额外的赋形剂添加至最终浓缩池中以制备经配制原料药。但是，在UF/DF处理过程中，对赋形剂的水平进行监测以确保赋形剂水平将不会影响所需的配制策略。赋形剂为药物制剂提供堆积体积，促进药物吸收或溶解，以及提供稳定性和防止变性。常见的药物赋形剂包括但不限于氨基酸、填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、润滑剂、助流剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、甜味剂、着色剂、溶剂和助溶剂以及增粘剂。在一个实施方案中，赋形剂是聚乙二醇，包括但不限于PEG-3550。
“聚乙二醇”或“PEG”是通常用于食品、药品和化妆品中的环氧乙烷的聚醚聚合物。其为非离子大分子，可用作降低生物分子溶解度的分子。PEG可以以300g/mol至10,000,000g/mol的不同分子量商购获得。PEG的示例性类型包括但不限于PEG 20000、PEG 8000和PEG 3350。PEG有不同的几何形状，包括线性的、支化的(附接至中心核的3至10条链)、星形的(附接至中心核的10至100条链)和梳形的(附接至聚合物主链的多条链)。
“拉曼光谱”是用于测量来自分子的非弹性散射光的波长和强度的一种光谱技术。其基于以下原理：材料上的单色入射辐射将以特定的方式被反射、吸收或散射，这取决于接收所述辐射的具体分子或蛋白质。大部分能量以相同的波长散射，称为弹性散射或瑞利散射。少量(＜0.001％)以不同的波长散射，称为非弹性散射或拉曼散射。拉曼散射与转动、振动和电子能级跃迁相关。拉曼光谱可以揭示样品的化学和结构组成。
如本文所用，“超滤”是指广泛用于重组蛋白纯化期间蛋白质治疗剂下游处理中的蛋白质浓缩的薄膜法。超滤是基于大小的分离，其中大于膜孔的物质被保留而较小的物质则可以自由通过。在处理过程中，将蛋白质溶液切向泵送通过半透性平行平板膜的表面。膜可渗透缓冲液和缓冲盐，但通常不渗透单克隆抗体。渗透的驱动力是由膜流动通道出口处的流量限制引起的跨膜压力(TMP)施加的(TMP＝((P进料+P渗余物)/2-P渗透物..)。
如本文所用，“初级浓缩”是指初始步骤，其中跨膜压力驱动水和盐穿过可渗透膜，这可减少液体体积并因而增加蛋白质浓度。初级浓缩中的浓缩程度可以被优化以平衡通过量、蛋白质稳定性、处理时间和缓冲液消耗。
如本文所用，“渗滤”是指使用半透膜将所关注产品从一种液体介质交换为另一种液体介质的技术。通常使用渗滤模式进行缓冲液交换和脱盐，其中通过连续添加缓冲液有效地从产品中洗掉少量杂质和缓冲液组分，所述缓冲液旨在将蛋白质调理至稳定的pH和允许高产品浓度的赋形剂浓度。这可以基于处理技术以连续或不连续模式执行。
渗滤通常与超滤结合使用，以实现所需的体积减少，同时还去除杂质和盐。UF/DF是下游纯化中的最后一个单元操作，其对mAb进行调理以实现有利于长期存储和添加稳定化赋形剂来生成经配制原料药(FDS)的pH、赋形剂含量和蛋白质浓度。
如本文所用，“最终浓缩”是指最终的步骤，其中跨膜压力驱动水和盐穿过可渗透膜，这可减少液体体积并因而将蛋白质浓度增加至用于存储和/或配制的所需目标。来自最终浓缩步骤的所得的池(pool)为最终浓缩池(FCP)。该最终浓缩步骤可以以连续或不连续的处理模式进行。
术语“生物产品”和“蛋白质纯化中间品”可以互换使用，是指从生物反应器过程中纯化出的任何抗体、抗体片段、经修饰的抗体、蛋白质、糖蛋白或融合蛋白以及最终原料药。
术语“控制”和“进行控制”是指将所收获细胞培养流体中的关键质量属性的量或浓度水平调整至预定的设定点。
如本文所用，术语“上游处理”是指第一步，在该步骤中通常通过细菌或哺乳动物细胞系，在生物反应器中产生抗体或治疗性蛋白质。上游处理包括培养基制备、细胞培养以及细胞分离和收获。当细胞达到所需密度时，收获细胞并移至生物过程的下游段。术语“下游处理”是指从生物反应器收获抗体或治疗性蛋白质后发生的分离和纯化。通常，这意味着经由几种不同的形式从水溶液回收产品。对所收获的产品进行处理，以满足下游处理期间的纯度和关键质量属性要求。
如本文所用，术语“蛋白质纯化中间品”指已经从生物反应器收获的蛋白质，以及指下游处理期间的任何中间品。
术语“浓缩蛋白质纯化中间品”是指浓度大于5mg/mL的蛋白质纯化中间品。更优选地，浓度介于50mg/mL至300mg/mL之间。
术语“监测”和“进行监测”是指定期检查细胞培养物或收获的细胞培养流体中关键质量属性的量或浓度水平。
术语“收获的细胞培养流体”是指从容纳有经工程改造以分泌所关注蛋白质的细胞的生物反应器中移出的流体。“收获的细胞培养流体”最佳的是含有所分泌的所关注蛋白质，例如单克隆抗体。
如本文所用，“关键质量属性(CQA)”是指物理、化学、生物学或微生物学性质或特征，其应处于适当的限值、范围或分布内以确保生物治疗性药物产品的所需产品质量。这些属性可能会影响安全性、功效和/或效价。关键质量属性包括但不限于蛋白质浓度、高分子量物质、缓冲赋形剂和pH。
如本文所用，“经配制原料药”是指旨在提供药理活性的活性成分，但不包括用于合成这种成分的中间体。
如本文所用，“通用模型”是指用于预测关键质量属性的不同重组蛋白的光谱特性的数学相关性。
如本文所用，“mAb特异性模型”是指用于预测关键质量属性的一种特定蛋白质的光谱特性的数学相关性。
如本文所用，“滴度”是指溶液中抗体或蛋白质分子的量。
II.用于表征下游蛋白质纯化产品的***和方法
提供了用于在蛋白质制造期间监测和控制蛋白质浓度的***和方法。由于高的相关溶液粘度(＞10cP)，浓缩蛋白溶液难以准确测量。准确的定量需要专用的离线设备，并且通常需要稀释溶液。在高浓度UF/DF中，由于吉布斯-唐南效应，最终的赋形剂水平是蛋白质浓度的函数。无法在制造过程中进行实时监测和分析，这会增加处理时间，以及由于不符合CQA而可能导致批次不合格。本文所公开的***和方法可用于线内监测蛋白质浓度和其他关键质量属性。
在一个实施方案中，拉曼光谱***是在最终浓缩池(其可以是高度浓缩的(≥150g/L))的制备期间使用的线内或原位拉曼光谱***。通常，在蛋白质纯化中间品制备的下游，例如在从生物反应器或补料分批培养***收获后处理蛋白质纯化中间品以及后续的纯化期间，采用拉曼光谱***。图1示出了示例性的蛋白质纯化过程。通常，从细胞培养物(100)收获蛋白质纯化中间品，并通过多个纯化步骤诸如亲和捕集(110)、病毒灭活(120)、精制色谱(130和140)、病毒截留过滤(150)和超滤/渗滤(160)进行处理，以产生最终浓缩池，然后将其配制成原料药。在一个实施方案中，监测收获的细胞培养流体中的蛋白质浓度通过原位拉曼光谱来进行。
A.拉曼光谱
在一个实施方案中，监测和控制收获的细胞培养流体中的蛋白质浓度通过拉曼光谱来进行。拉曼光谱是振动光谱的一种形式，其提供有关分子振动的信息，所述信息可用于样品鉴定和关键质量属性定量。原位拉曼分析是一种在样品的原始位置分析样品而无需提取一部分样品以在拉曼光谱仪中进行分析的方法。原位拉曼分析的优势在于拉曼光谱分析仪是非侵入性的和非破坏性的，这可降低污染和蛋白质品质损失的风险。可以实施线内拉曼分析，以在监测收获的细胞培养流体、蛋白质纯化中间品和/或最终浓缩池的蛋白质浓度的同时实现连续处理。
原位拉曼分析可提供蛋白质纯化中间品中蛋白质浓度的实时评估。例如，原位拉曼光谱提供的原始光谱数据可用于获取和监测蛋白质纯化中间品中的当前蛋白质浓度。在这方面，为了确保原始光谱数据是连续更新的，应大约每5秒至10小时从拉曼光谱获取光谱数据。在另一个实施方案中，应大约每15分钟至1小时获取光谱数据。在另一个实施方案中，应大约每20分钟至30分钟获取光谱数据。
蛋白质纯化中间品中蛋白质浓度的监测可通过任何可进行原位拉曼分析的市售拉曼光谱分析仪进行分析。原位拉曼分析仪应能够获得蛋白质纯化中间品内的原始光谱数据。例如，拉曼分析仪应配备可***流体回路的线内的探针。合适的拉曼分析仪包括但不限于RamanRXN2和RamanRXN4分析仪(美国密歇根州安娜堡市(Ann Arbor，MI)的恺撒光学***有限公司(Kaiser Optical Systems，Inc.))。
可将通过原位拉曼光谱获得的原始光谱数据与离线蛋白质浓度测量结果进行比较，以便将光谱数据中的峰与蛋白质浓度相关联。离线蛋白质浓度测量结果可用于确定哪些光谱区展现蛋白质信号。可通过任何适当的分析方法收集离线测量数据。例如，就蛋白质浓缩而言，可使用SoloVPE(C技术公司)收集离线测量结果。另外，任何类型的多元软件包，例如SIMCA 13(瑞典于默奥市(Umea，Sweden)的MKS Data Analytic Solutions公司)可用于将原始光谱数据内的峰与蛋白质浓度的离线测量结果相关联。然而，在一些实施方案中，可能有必要用光谱滤波器对原始光谱数据进行预处理以移除任何变化的基线。例如，可用任何类型的点平滑技术或归一化技术对原始光谱数据进行预处理。可能需要归一化以校正拉曼分析仪的任何探针、光学器件、激光功率变化和曝光时间。在一个实施方案中，可以用点平滑(诸如结合21cm-1点平滑的一阶导数)和归一化(诸如标准正态变量(SNV)归一化)处理原始光谱数据。对于某些光谱区域可以组合这些预处理技术以改善模型预测。
也可以在获得的光谱数据上执行化学计量学建模。在这方面，可在光谱数据上应用一种或多种多元方法，包括但不限于偏最小二乘(PLS)、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘(OPLS)、多元回归、典型相关、因子分析、聚类分析、图解程序等等。在一个实施方案中，将所获得的光谱数据用于创建PLS回归模型。可以通过将预测的变量和观察到的变量投影到新空间来创建PLS回归模型。在这个方面，可以使用从拉曼分析获得的测量值和离线测量值来创建PLS回归模型。PLS回归模型提供了预测的过程值，例如预测的蛋白质浓度值。在一个实施方案中，与离线蛋白质浓度值相比，该模型提供具有≤5％的误差的预测蛋白质浓度值。在一个优选的实施方案中，与离线蛋白质浓度值相比，该模型提供具有≤3％的误差的预测蛋白质浓度值。
化学计量学建模后，可以将信号处理技术应用于预测的蛋白质浓度值。在一个实施方案中，信号处理技术将减轻模型变异性和预测误差。在这个方面，可以将一种或多种预处理技术应用于预测的蛋白质浓度值。可以利用本领域技术人员已知的任何预处理技术。例如，降噪技术可以包括数据平滑和/或信号剔除。平滑处理通过一系列平滑算法和滤波器来实现，而信号剔除则使用信号特征来识别不应包含在所分析光谱数据中的数据。在一个实施方案中，通过降噪滤波器将预测的蛋白质浓度值减低噪音。降噪滤波器提供最终的预测蛋白质浓度值。在这方面，降噪技术将原始测量结果与基于模型的估计相结合，以得出根据该模型该测量结果应得到什么。在一个实施方案中，降噪技术将当前的预测蛋白质浓度值与其不确定性相结合。不确定性可以通过预测的蛋白质浓度值和当前蛋白质浓度值的可重复性来确定。一旦观察到下一个预测的蛋白质浓度值，就使用加权平均值更新预测的蛋白质浓度值的估计值，其中具有较高确定性的估计值给予更多的权重。使用迭代方法，可以基于先前的测量结果和当前的测量结果来更新最终的蛋白质浓度值。在这方面，该算法应该是递归的并且能够实时运行，以便利用当前的预测蛋白质浓度值、先前的值以及实验测定的常数。降噪技术通过减少自动反馈控制器将要作用于其上的噪声，可提高从拉曼分析和PLS预测接收的测量结果的鲁棒性。
B.使用方法
所公开的方法可用于在下游蛋白质纯化过程中监测和控制收获的细胞培养物和/或蛋白质纯化中间品流体中的蛋白质浓度。常见的下游纯化过程包括但不限于离心、直接深层过滤、蛋白A亲和纯化、病毒灭活步骤、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、超滤/渗滤、病毒截留过滤以及它们的组合。这些单元操作以限定的顺序组合使用，以分离所关注的蛋白质并且确保在制备经配制原料药之前监测杂质和/或关键质量属性。在一个实施方案中，所公开的方法包括流体回路线内的拉曼探针。在另一个实施方案中，所公开的方法可以用于制备浓缩蛋白质纯化中间品或最终浓缩池。
1.抗体滴度和蛋白质浓度
抗体滴度和蛋白质浓度都是生物产品纯化中的重要因素。在最初收获细胞培养流体后测得的抗体滴度对于确定色谱柱上样量和确保用于移除杂质的可靠纯化过程非常重要。在整个纯化步骤中监测蛋白质浓度对于确保最终产品的适当浓度和所执行的纯化单元操作的适当性能非常重要。不当的蛋白质浓度会导致无效的药物产品或经配制原料药制备。
在一个实施方案中，在收获后但在任何其他纯化开始之前使收获的细胞培养流体立刻经受拉曼光谱分析。收获后可使用拉曼光谱数据来定量收获的细胞培养流体中的抗体滴度。可以在蛋白质纯化过程期间，例如在亲和捕集期间、在精制色谱期间、在病毒截留过滤期间或在超滤/渗滤期间的多个步骤使用所公开的方法来测量蛋白质浓度。线内拉曼探针可检测收获的细胞培养流体和/或流体回路内的蛋白质纯化中间品中的拉曼散射，而无需从***移出样品，从而提供通常以离线方式测定的分析表征。
在一个实施方案中，如果在超滤/渗滤过程中蛋白质浓度不在预定浓度之内，则通知***，并相应地变更蛋白质纯化中间品。例如，如果蛋白质纯化中间品中的蛋白质浓度低于预定的蛋白质浓度，则可通过进行超滤/渗滤进一步浓缩蛋白质纯化中间品。
在一个实施方案中，通过蛋白A亲和色谱进行浓缩步骤。
2.药物/抗体比
在另一个实施方案中，所公开的方法可用于监测和控制药物/抗体比(DAR)。DAR是一种质量属性，在开发抗体-药物缀合物(ADC)、抗体-放射性核素缀合物(ARC)和普通蛋白质缀合物(有效的类固醇、非细胞毒性有效载荷等)期间监测该质量属性以确保一致的产品质量以及便于后续使用有效载荷进行标记。DAR是与抗体缀合的药物或其他治疗性分子的平均数目，并且是治疗性缀合物制备中的重要质量属性。DAR值会影响缀合的药物的功效，因为低载药量会降低药物效力，而高载药量会负面影响药代动力学和安全性。
在一个实施方案中，在缀合之后但在任何其他纯化进行之前使抗体-放射性核素缀合物立即经受拉曼光谱分析。可在缀合后用拉曼光谱数据测定DAR。
在一个实施方案中，如果在处理期间DAR不在预定浓度之内，则通知***，并相应地变更ADC中间品。例如，如果ADC中间品中的DAR低于预定的DAR，则可以变更缀合反应组分，例如可以优化反应物浓度、可以变更接头的类型、可以优化温度或其他制造变量。
3.缓冲赋形剂
所公开的方法可用于在下游纯化期间监测和控制收获的细胞培养流体和/或蛋白质纯化中间品中缓冲赋形剂的水平。单克隆抗体制备中通常使用的缓冲赋形剂包括但不限于乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐和羟甲基氨基甲烷(Tris)、脯氨酸和精氨酸。表面活性赋形剂包括但不限于聚山梨酯80(吐温80)、聚山梨酯20(吐温20)和泊洛沙姆188。多元醇/二糖/多糖赋形剂包括但不限于甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡聚糖40。抗氧化赋形剂包括但不限于抗坏血酸、甲硫氨酸和乙二胺四乙酸(EDTA)。两种常用的氨基酸赋形剂是组氨酸和精氨酸。在一个优选的实施方案中，监测和控制的赋形剂是组氨酸和精氨酸。
由于排除的体积和道南效应的组合，最终浓缩池赋形剂浓度不同于渗滤缓冲液的组成。道南效应是由于在UF/DF期间膜将带净正电荷的蛋白质保留下来，再加上渗余物和渗透物二者中均要求电中性而引起的现象。为了平衡带正电荷的蛋白质，相对于渗滤缓冲液，带负电荷的缓冲液组分富集在渗余物中，而带正电荷的缓冲液组分则被排出。该效应可导致FCP pH和缓冲赋形剂浓度与渗滤缓冲液组成显著不同(Stoner等人，JPharm Sci，93：2332-2342(2004))。
体积排阻描述了高浓度样品(其中蛋白质占溶液体积的很大一部分)的行为。缓冲液从蛋白质占据的体积中被排出，从而导致缓冲液溶质浓度随蛋白质浓度增加而降低，表示为每溶液体积中溶质的摩尔数(或质量)。缓冲液从蛋白质占据的体积中被排出，从而导致当表示为每溶液体积中溶质的摩尔数(或质量)时缓冲液溶质浓度随蛋白质浓度增加而降低。
基于这些原理以及缓冲赋形剂水平是关键质量属性，线内拉曼探针将最大限度地减少离线分析表征，并且提供进一步的过程理解，以确保配制前赋形剂水平足够。
4.高分子量杂质
在单克隆抗体的制备中，即使在大量纯化步骤之后，仍存在低水平的产品相关杂质。高分子量(HMW)物质(如抗体二聚体物质)是促成mAb产品的大小异质性的产品相关杂质。治疗性mAb药物产品中因蛋白质聚集导致的HMW物质的形成可能会潜在地损害药物功效和安全性。HMW物质被认为是在药物开发期间进行常规监测的CQ A，并且视为制造期间纯化蛋白药物产品的发布测试的一部分。
在一个实施方案中，所公开的方法可用于鉴定含有HMW物质的蛋白质药物产品。可以在纯化过程期间(包括但不限于在亲和捕集期间、在病毒灭火期间、在精制色谱期间、在病毒截留过滤期间、在超滤/渗滤期间或它们的组合)的多个步骤通过拉曼光谱检测HMW物质。
在一个实施方案中，所公开的方法检测收获的细胞培养流体中的HMW物质，并且进一步处理该流体以移除HMW物质。移除细胞培养流体中的HMW物质的方法包括附加的精制步骤，包括但不限于阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。
C.UF/DF***
图6示出了超滤/渗滤处理***，包括用于线内拉曼探针的多个位置(带圈的数字1至4)。蛋白质纯化中间品通过渗滤泵200泵入渗余物容器205，该渗滤泵可以是蠕动泵、旋转叶泵、压力传递泵或隔膜泵。来自渗余物容器205的流体流至进料泵210(其可以是旋转叶片泵、蠕动泵或隔膜泵)，经过进料压力阀215并进入切向流过滤模块(TFFM)220。在TFFM 220中，蛋白质纯化中间品经受跨膜超滤。所关注的生物产品保留在流体(渗余物)中，而水和低分子量溶质(包括缓冲赋形剂)穿过渗透液(滤液)中的膜，渗透液通过穿越渗透液压力阀225而进入废物罐230而离开***。渗余物离开TFFM 220并穿越渗余物压力阀235、跨膜压力控制阀240以及渗余物回流通道245，在该回流通道中渗余物流回至渗余物容器205中。可以根据需要重复此过程以浓缩生物产品、移除杂质以及确保CQA在可接受的限值内。在渗滤期间中，遵循上述相同的流动路径，其中当新的缓冲液被洗涤到产品料流中时，可渗透的溶质被替换。当以与从***中移除渗透液相同的速率添加新缓冲液时，渗余物罐和橇滞留体积的总和将限定***体积。一周转量(TOV)定义为等于***体积的添加到UF/DF过程的渗滤缓冲液的量。通常，更换8倍***体积(8TOV)可确保＞99.9％的缓冲液交换(Schwarts，L.，Scientific and Technical Report，PN 33289)
此外，在UF/DF过程期间，有必要在渗余物容器205中混合蛋白质溶液。渗滤期间渗滤缓冲液、回流渗余物(retentate return)和本体渗余物(bulk retentate)之间的密度差异要求罐中的搅拌应足以确保充分的缓冲液交换，但又要足够适度以避免剪切，因为已观察到这会导致某些产品中的蛋白质聚集和亚可见粒子(SVP)生成。另外，重要的是要确保浓缩阶段期间回流渗余物的充分混合，以防止渗余物罐中的蛋白质浓差极化，从而导致较高的蛋白质浓度被递送至UF/DF膜。
在一个实施方案中，将拉曼探针设置于渗滤泵200下游渗余物容器205中的位置1处。作为另一种选择也可以将拉曼探针设置于进料泵210之前渗余物容器205下游线内的位置2。在另一个实施方案中，在进料压力泵215和切向流过滤模块220之间的位置3处线内设置拉曼探针。在另一个实施方案中，在渗余物回流通道245中线内设置拉曼探针。拉曼探针的位置对于确保在具有工程和处理约束的复杂***中进行精确线内测量至关重要。
D.细胞培养
收获的细胞培养流体可以从容纳有经工程改造以产生单克隆抗体的细胞的生物反应器中收获。术语“细胞”包括适合于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核生物和真核生物的细胞，诸如细菌细胞、哺乳动物细胞、人细胞、非人动物细胞、禽细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细胞融合物，诸如例如杂交瘤或四重杂交瘤。在某些实施方案中，细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在其他实施方案中，细胞选自以下细胞：中国仓鼠卵巢(CHO)(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾细胞(例如HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB8065、HL-60、淋巴细胞例如Jurkat(T淋巴细胞)或Daudi(B淋巴细胞)、A431(表皮细胞)、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT细胞、干细胞、肿瘤细胞和源自上述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.
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细胞)。在一些实施方案中，细胞是CHO细胞。在其他实施方案中，细胞是CHOK1细胞。
在蛋白质制备中，“补料分批细胞培养”或“补料分批培养”是指分批培养，其中在最初将细胞和培养基供应至培养容器，并且在培养期间将另外的培养营养物以不连续的增量缓慢地供料至培养物，在终止培养之前进行或不进行定期的细胞和/或产物收获。补料分批培养包括“半连续补料分批培养”，其中定期移出整个培养物(可能包括细胞和培养基)并用新鲜培养基代替。补料分批培养不同于简单的“分批培养”，而在分批培养中用于细胞培养的所有组分(包括动物细胞和所有培养营养物)都在培养过程的开始就提供至培养容器。补料分批培养在以下方面可与“灌流培养”不同：在标准补料分批过程中未从培养容器中移出上清液，而在灌流培养中，通过例如过滤将细胞限制在培养物中，并连续或间歇地将培养基引入培养容器并从培养容器移出。但是，设想了在补料分批细胞培养过程中移出样品以用于测试目的。补料分批过程持续进行直至确定达到最大工作体积和/或蛋白质产量，随后收获蛋白质。
短语“连续细胞培养”涉及一种用于连续培养细胞(通常是处于特定生长期)的技术。例如，如果需要持续供应细胞，或者需要制备所关注的特定蛋白质，则细胞培养物可能需要维持在特定的生长期。因此，必须连续地监测并相应地调整条件，以将细胞维持在该特定生长期。
术语“细胞培养基”和“培养基”是指用于培养哺乳动物细胞的营养液，其通常提供必要的营养以增强细胞的生长，诸如碳水化合物能源、必需氨基酸(如苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和组氨酸)和非必需氨基酸(如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)、痕量元素、能源、脂质、维生素等。细胞培养基可含有提取物，例如血清或蛋白胨(水解产物)，其可提供支持细胞生长的原料。培养基可含有源自酵母的提取物或大豆提取物，而不是源自动物的提取物。化学限定培养基是指其中所有化学组分均已知(即具有已知化学结构)的细胞培养基。化学限定培养基完全不合源于动物的组分，诸如源于血清或源于动物的蛋白胨。在一个实施方案中，培养基是化学限定培养基。
该溶液还可以含有增强生长和/或存活率高于最低速率的组分，包括激素和生长因子。可以将溶液配制成对于所培养的特定细胞的存活和增殖而言最佳的pH和盐浓度。
E.所关注的蛋白质
可以使用所公开的方法监测适合在原核细胞或真核细胞中表达的任何所关注的蛋白质。例如，所关注的蛋白质包括(但不限于)抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、ScFv或其片段、Fc融合蛋白或其片段、生长因子或其片段、细胞因子或其片段、或细胞表面受体的胞外结构域或其片段。所关注的蛋白质可为由单个亚基组成的简单多肽或为由两个或更多个亚基组成的复杂多亚基蛋白质。所关注的蛋白质可是生物医药产品、食品添加剂或防腐剂或任何受纯化和质量标准约束的蛋白质产品。
在一些实施方案中，该抗体选自抗程序化细胞死亡1抗体(例如，如美国专利No.9,987,500中所述的抗PD1抗体)、抗程序化细胞死亡配体1(例如，如美国专利No.9,938,345中所述的抗PD-L1抗体)、抗D114抗体、抗血管生成素2抗体(例如，如美国专利No.9,402,898中所述的抗ANG2抗体)、抗血管生成素样3抗体(例如，如美国专利No.9,018,356中所述的抗AngPt13抗体)、抗血小板衍生生长因子受体抗体(例如，如美国专利No.9,265,827中所述的抗PDGFR抗体)、抗Erb3抗体、抗催乳素受体抗体(例如，如美国专利No.9,302,015中所述的抗PRLR抗体)、抗补体5抗体(例如，如美国专利No9,795,121中所述的抗C5抗体)、抗TNF抗体、抗表皮生长因子受体抗体(例如，如美国专利No.9,132,192中所述的抗EGFR抗体或如美国专利No.9,475,875中所述的抗EGFRvIII抗体)、抗前蛋白转化酶枯草溶菌素Kexin-9抗体(例如，如美国专利No.8,062,640或美国专利No.9,540,449中所述的抗PCSK9抗体)、抗生长和分化因子8抗体(例如，抗GDF8抗体，也称为抗肌生长抑制素抗体，如美国专利No.8,871,209或No.9,260,515中所述)、抗胰高血糖素受体(例如，如美国专利No.9,587,029或No.9,657,099中所述的抗GCGR抗体)、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、白介素4受体抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2014/0271681A1或美国专利No.8,735,095或No.8,945,559中所述的抗IL4R抗体)、抗白介素6受体抗体(例如，如美国专利No.7,582,298、No.8,043,617或No.9,173,880中所述的抗IL6R抗体)、抗IL1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗白介素33(例如，如美国专利No.9,453,072或No.9,637,535中所述的抗IL33抗体)、抗呼吸道合胞病毒抗体(例如，如美国专利申请公开No.No.9,447,173中所述的抗RSV抗体)、抗分化簇3(例如，如在美国专利No.9,447,173和No.9,447,173以及在美国申请No.62/222,605中所述的抗CD3抗体)、抗分化簇20(例如，如美国专利No.9,657,102和No.US20150266966A1以及在美国专利No.7,879,984中所述的抗CD20)、抗CD19抗体、抗CD28抗体、抗分化簇48(例如，如美国专利No.9,228,014中所述的抗CD48抗体)、抗Fel d1抗体(例如，如美国专利No.9,079,948中所述的)、抗中东呼吸综合征病毒(例如，如美国专利No.9,718,872中所述抗MERS抗体)、抗埃博拉病毒抗体(例如，如美国专利No.9,771,414中所述的)、抗塞卡病毒抗体、抗淋巴细胞活化基因3抗体(例如，抗LAG3抗体或抗CD223抗体)、抗神经生长因子抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2016/0017029以及美国专利No.8,309,088和No.9,353,176中所述的抗NGF抗体)和抗激活素A抗体。
在一些实施方案中，双特异性抗体选自抗CD3×抗CD20双特异性抗体(如美国专利No.9,657,102和美国专利申请公开No.US20150266966A1中所述的)、抗CD3×抗粘蛋白16双特异性抗体(例如，抗CD3×抗Muc16双特异性抗体)和抗CD3×抗***特异性膜抗原双特异性抗体(例如，抗CD3×抗PSMA双特异性抗体)。在一些实施方案中，所关注的蛋白质选自阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达木单抗-atto(adalimumab-atto)、ado-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利库单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、贝洛托单抗(bezlotoxumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、康纳单抗(canakinumab)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendefide)、PEG化塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、西米普利单抗(cemiplimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、地诺单抗(denosumab)、地努妥昔单抗(dinutuximab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、得瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾米希组单抗(emicizumab-kxwh)、厄塔毒素-阿利珠单抗偶联物(emtansinealirocumab)、依维库人单抗(evinacumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、fasinumab、戈利木单抗(golimumab)、塞库单抗(guselkumab)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、依达赛珠单抗(idarucizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、英夫利昔单抗-abda(infliximab-abda)、英夫利昔单抗-dyyb(infliximab-dyyb)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊西贝单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、雷珠单抗(nesvacumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥必托昔单抗(obiltoxaximab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞西巴库单抗(raxibacumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利努单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、塞库单抗(secukinumab)、西妥昔单抗(siltuximab)、塔西单抗(tocilizumab)、塔西单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、特伐单抗(trevogrumab)、乌司他单抗(ustekinumab)和维多珠单抗(vedolizumab)。
实施例
实施例1：用于UF/DF应用的通用线内蛋白质浓度模型
材料和方法
该模型的数据收集包括利用MR-Probe-785和RamanRxn Probehead-758(美国密歇根州安娜堡市的凯撒光学***有限公司)从Raman Rxn2和Rxn 4分析仪(美国密歇根州安娜堡市的凯撒光学***有限公司)得到的光谱数据。此外，根据可用性，在整个开发过程中使用了几种不同的光学元件。拉曼分析仪的操作参数设置为10秒扫描时间，进行6次累加，重复5次。将SIMCA 13(瑞典于默奥市的MKS Data Analytic Solutions公司)用于将光谱数据内的峰与离线蛋白质浓度测量值相关联。在UF/DF单元操作的所有不同点(包括初级浓缩、渗滤和最终浓缩)进行线内测量。使用SoloVPE(C技术有限公司)测定离线蛋白质浓度。SoloVPE测量以一式三份进行。
图2示出了用于建立化学计量学模型的光谱区域。这些区域包括区域1-977-1027cm-1(环结构)、区域2-1408-1485cm-1(精氨酸)、区域3-1621-1711cm-1(二级结构)和区域4-2823-3046cm-1(C-H伸缩)。对原始光谱数据执行以下光谱滤波：结合21cm-1点平滑的一阶导数以除去变动的基线
结果
为了确定通用线内蛋白质浓度模型用于超滤/渗滤(UF/DF)应用的可行性，使用拉曼光谱分析了mAb1。在渗滤之前(初级浓缩)、渗滤期间(渗滤)和渗滤之后(最终浓缩)测量了蛋白质浓度。将模型计算出的浓度与SoloVPE测定的蛋白质浓度进行比较(图3)。当包含训练集数据(mAb 1光谱并入PLS模型中)时，0-120g/L(初级浓缩和渗滤)的模型误差为3.1％，＞120g/L(最终浓缩)的模型误差为1.8％。
可通过拉曼光谱检测处理误差。图3显示通过拉曼光谱数据检测到最终再循环通过UF/DF***期间***中的空气夹带。矩形所包围的条柱显示，SoloVPE预测的mAb1浓度＞200g/L，而拉曼预测值约为65g/L。
图4示出了十种代表性mAb的绝对拉曼模型误差。该数据显示成功开发了用于所示mAb的模型，这些mAb包括不同的mAb同种型(IgG1和IgG4)以及双特异性分子。17个模型预测中有14个满足误差≤5％。然而，为每个探针创建了特定的模型(0-120g/L和＞120g/L)，所述探针在开发期间用作探针来探测增大PLS模型所预测的误差的变异性。
为了优化模型，用多种mAb测试了不同的探针和激光。进行了模型精化，其中仅一个光谱区域是更新的通用模型的焦点：2823-3046cm-1(C-H伸缩)，使用标准正态变量(SNV)进行光谱滤波以校正激光功率变化和探针变异性作为基线校正。表1中汇总了所开发的两个模型组件的比较。使用相应的离线SoloVPE测量(一式三份进行)，创建了偏最小二乘(PLS)回归模型。表2中示出了偏最小二乘回归模型的详细信息。用优化的激光/探针通用模型预测的更新数据集显示，在17个模型预测中有15个满足≤5％的误差，相比之下此前在17个模型预测中只有14个满足(图5)。
表1.通用模型组件比较
Figure BDA0002809696360000261
表2.蛋白质浓度偏最小二乘回归通用模型(第2版)详细信息
最终模型 0-120g/L ＞120g/L
样本量 1412 879
R<sup>2</sup>X 0.993 0.987
Q<sup>2</sup> 0.984 0.958
RMSECV 3.34 7.77
R2X-模型解释的变差百分比，目标：R2＞0.9
Q2-交叉验证期间模型预测的变差百分比，目标：Q2＞0.8
RMSECV：交叉验证的均方根误差
实施例2：蛋白质浓度模型的放大性能
材料和方法
采用一放大的1/2英寸单次使用切向流过滤***(Single Use Tangential FlowFiltration System)(颇尔公司(Pall Corporation))实验用mAb10测试了优化的通用模型(第2版)(参见表1)。mAb10上样材料是经配制原料药，而不是典型的处理上样材料。将FDS材料稀释为代表性的UF/DF上样源(包括蛋白质浓度和缓冲赋形剂)。然而，由于上样源中存在未在通用模型开发期间测试的额外赋形剂，因此创建了mAb 10特异性模型。有关拉曼数据收集和扫描长度信息的方法，请参见实施例1。＞120g/L的mAb特异性模型使用与通用模型(第2版)相同的光谱区域和预处理技术。然而，0-120g/L mAb特异性模型使用了如图2所示的四个光谱区域，采用标准正态变量预处理。0-120g/L模型中的差异可归因于上样源中的额外赋形剂。
结果
当训练集包括在模型预测中时，4个更新的模型中2个满足了误差≤5％的模型目标，如表3中所示。基于在IOPS的初步实验期间的显著差异诸如上样源、激光和规模(实验室规模对放大规模)，进行了第二次运行。在第二个实验之前，对0-120g/L mAb 10特异性模型进行了更改。使用SNV预处理将所有四个区域都包括在内，但三个区域：977-1027cm-1、1408-1485cm-1和1621-1711cm-1还额外使用结合21cm-1点平滑的一阶导数。表3中总结了汇总的实验结果。在第二个实验中，当训练集包括在模型预测中时，4个更新的模型中3个满足了误差≤5％的模型目标，如表3中所示。数据分析期间的另一观察结果是上样源是增加误差的主要贡献因素。如果移除了上样样本，则通用模型误差将从8.6％降低到5.7％。在图7中，示出了最终浓缩池的线内预测结果(实时，带宽阴影线的条柱)和更新的模型的结果(带窄阴影线的条柱)，将蛋白质浓度与SoloVPE的离线测量结果(空白条柱)进行了比较。对于最终浓缩池，通用模型线内和更新的模型具有2.7％的误差，而mAb 10模型线内和更新的模型分别为12.0％和4.2％。在mAb 10模型中观察到的误差增加可归因于约250g/L范围内的有限数据，而通用模型具有更大的数据集。导致误差增加的另一个因素是模型无法在表征范围之外(即在mAb 10模型中＞250g/L)外推。
表3.放大实验中蛋白质浓度预测的平均模型误差
Figure BDA0002809696360000291
实施例3：蛋白质浓度模型放大至中试处理设备.
材料和方法
在商业化过程的过程开发期间，UF/DF的特征是单元操作遵循“质量源于设计”原则以了解关键过程参数以及关键质量属性。在mAb11开发期间将拉曼和模型开发包括在内以增强过程理解并给模型开发提出流线型方法。关于拉曼数据收集的方法信息请参见实施例1，但扫描时长从10秒调整为5秒。开发的mAb 11模型对全部四个光谱区域均使用SNV预处理，但三个区域：977-1027cm-1、1408-1485cm-1和1621-1711cm-1，额外使用了结合21cm-1点平滑的一阶导数。
结果：
使用四个DoE实验和4个光谱区域生成了实验室规模模型。图8A示出了来自四个DoE实验的实时预测的拉曼模型误差。图8B示出了使用实验室规模模型的另外15个实验的拉曼模型误差。生成了0-120g/L和＞120g/L的mAb特异性蛋白质浓度模型，误差≤5％。
使用实验室规模模型(n＝15)，对于mAb11，中试规模运行(n＝3)的预测误差为0.6％-10.6％(图9A)。当将中试规模的数据并入实验室规模模型(n＝18)时，中试规模的预测误差降至0.6-2.2％。增加的实验室规模模型误差可能是由于与放大的设备相关的散热而导致的温度对拉曼光谱位移的影响。在未来的拉曼开发和模型验证主张中，温度将成为考虑因素。
在使用三种不同单克隆抗体(mAb J、mAb K和mAb L)的七个中试规模实验中，最终模型预测误差为0.6-2.2％；很好地处于5％的目标内(图9B)。
实施例4：使用拉曼模型进行实时浓度测定，从而使得能进行处理决策.
材料和方法：
有关进一步的信息请参见实施例3，因为将拉曼光谱收集和建模的相同规程用于拉曼自动化。开发了一种自动化控制策略，以使用拉曼光谱数据来实现最终的蛋白质浓度目标。使用所生成的预测模型，对数据进行过滤，并用于为UF/DF上的仪器提供输入，以在实现蛋白质浓度目标时终止单元操作。SoloVPE测量以一式三份进行。
结果：
图10A和10B示出了用于自动监测批次UF/DF和单程TFF蛋白浓缩的示例性屏幕设置。图11显示预测模型可用于监测各个处理步骤中mAb14的实时浓度，并在达到所需的浓度目标时触发浓缩单元操作停止。拉曼预测最终浓缩池为260g/L，相比之下离线SoloVPE测量结果为262g/L，从而得到0.8％的误差，满足≤5％的误差目标。拉曼是一种适合的应用，可用于做出自动处理决策，以验证是否满足所需的蛋白质浓度目标。
实施例5：UF/DF中高分子量(HMW)物质建模的概念验证.
材料和方法：
HMW物质模型的数据收集包括来自Raman Rxn2分析仪(美国密歇根州安娜堡市的凯撒光学***有限公司)和RamanRxn Probehead-758(美国密歇根州安娜堡市的凯撒光学***有限公司)的光谱数据。此外，根据可用性，在整个开发过程中使用了几种不同的光学元件。拉曼分析仪的操作参数设置为72秒扫描时间，进行1次累加，重复25次。在UF/DF单元操作的所有不同点(包括初级浓缩、渗滤和最终浓缩)进行线内测量。光谱范围是110-3415cm-1。使用SNV对原始光谱数据进行预处理，并使用结合21cm-1平滑的一阶导数进行额外的滤波。使用尺寸排阻超高效液相色谱来确定离线HMW物质测量值。
结果：
HMW物质是被认为是蛋白质纯化中的初步关键质量属性的另一属性。当前的技术无法在处理期间中实时监测HMW物质。图12A显示，所公开的拉曼建模方法可用于在蛋白质纯化期间监测HMW物质。在整个纯化过程中(初级浓缩、渗滤和最终浓缩)，将通过拉曼建模得到的HMW物质预测结果与使用SE-UPLC收集的测量结果进行比较。拉曼建模在蛋白质处理期间有效地实时预测了高分子物质的百分比。生成了平均误差为3.4％的模型。
实施例6.精制色谱中高分子量(HMW)物质建模的概念验证.
材料和方法：
HMW物质模型的数据采集包括利用MR-Probe-785从Raman Rxn2分析仪(美国密歇根州安娜堡市的凯撒光学***有限公司)获得的光谱数据。将拉曼分析仪的操作参数设置为10秒、30秒或60秒的扫描时间，进行1次累加，重复测量5次。用总HMW为6.2％-76.2％的阴离子交换色谱(AEX)池进行离线测量。表4中描述了用于建模的光谱范围和所用的预处理技术。使用尺寸排阻超高效液相色谱来确定离线HMW物质测量值。
结果：
所公开的拉曼建模方法可用于在精制色谱蛋白质纯化期间监测HMW物质。将通过拉曼建模得到的HMW物质预测结果与使用SE-UPLC从生成的AEX池中采集的测量结果进行比较。如表4中汇总的，所评价的方法的RMSEP为3.2-7.6％。在图12B中，将6.2％-19.7％HMW的压缩数据集用于评价用350-3100cm-1的光谱区域和SNV预处理技术生成的模型。通过减小HMW范围，对于10秒、30秒和60秒，RMSEP分别减少至1.2％、1.4％和2.1％。基于这些结果，可以使用拉曼在AEX池中确定HMW含量。
表4.HMW含量为6.2％-76.2％时HMW模型预测的误差(RMSEP).
Figure BDA0002809696360000321
Figure BDA0002809696360000331
实施例7.滴度建模的概念验证.
材料和方法：
训练集模型为35种蛋白质A流过样品，样品掺杂有FCP(265g/L)以实现0.36-9.8g/L的滴度。用滴度为1.3-8.8g/L的稀释的深层过滤滤液样品评价模型。滴度模型的数据采集包括利用MR-Probe-785从Raman Rxn2(美国密歇根州安娜堡市的凯撒光学***有限公司)获得的光谱数据。以离线方式使用浸入式探针来生成光谱数据，操作参数设置为20秒扫描时间，进行1次累加，重复5次。光谱范围为977-1027、1408-1485、1621-1711和2823-3046cm-1。使用SNV对原始光谱数据进行预处理，并使用结合21cm-1平滑的一阶导数进行额外的滤波。表5中描述了模型特征。
表5.抗体滴度模型特征.
Figure BDA0002809696360000332
结果：
抗体滴度是蛋白质纯化中的一个过程属性，需要该属性以通知后续的下游纯化单元操作，包括亲和柱上样量、生产一致性以及过程中的中间品体积限制。不准确的色谱柱上样量会影响后续的初步关键质量属性，因此需要监测技术如拉曼光谱。图13示出了单克隆抗体的实际抗体滴度对拉曼预测的抗体滴度。在该实验中，模型误差为26％，高于≤5％的期望目标。增加扫描时长以及使用稀释的和非稀释的深度过滤滤液开发模型将会减少模型误差。
实施例8：满足约10％的当前正交测定法误差的用于缓冲赋形剂测量的拉曼模型.
材料和方法：
从先前针对各种抗体的浓度模型开发运行中收集数据。有关拉曼数据收集的方法信息，请参见实施例1。表6示出了用于检测样品中的组氨酸和精氨酸的模型组件。光谱区域是基于已知的组氨酸/精氨酸峰(Zhu等人，Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc，78(3)：1187-1195(2011))。在组氨酸和精氨酸的初始模型开发后，用mAb 14进行了进一步的模型表征。使用非接触式光学探针，将拉曼分析仪的操作参数设置为20秒扫描时间，进行5次累加。组氨酸的光谱范围为1200-1480cm-1，精氨酸的为860-1470cm-1。对于两种缓冲液赋形剂，使用SNV对原始光谱数据进行预处理，并使用结合21cm-1平滑的一阶导数进行额外的滤波。使用基于超高效液相色谱(UPLC)氨基酸定量的方法确定离线组氨酸和精氨酸物质测量值。
结果：
为了确定所公开的拉曼建模方法和***是否可用于测量经过处理的抗体样品中的缓冲赋形剂，针对组氨酸和精氨酸分析了从先前的浓度模型开发运行中收集的数据。将使用拉曼建模预测的值与根据基于UPLC的氨基酸方法计算的值进行比较，如图14A所示。该初级组氨酸/精氨酸拉曼建模的预测值和平均模型误差在表6中给出。在图14B中，示出了mAb 14的预测组氨酸对实际组氨酸模型的点阵图，其平均模型误差为8.2％，满足缓冲赋形剂的目标≤10％。≤10％的目标是基于当前UPLC正交方法的测定法变异性。在图14C中，示出了mAb 14的预测精氨酸对实际精氨酸模型的点阵图，其平均模型误差为2.9％，满足≤10％的目标。
该数据表明，拉曼建模可用于预测过程中的UF/DF和FCP材料中的缓冲赋形剂水平。这些赋形剂的成功定量可确保UF/DF提供将能进行后续配制的最终浓缩池。
表6.模型组件和从通用浓度模型(实施例1)处理收集的组氨酸/精氨酸的数据.
组氨酸 精氨酸
光谱区域(cm<sup>-1</sup>) 1200-1480 970-1100，1300-1500
预处理技术 一阶导数和SNV 一阶导数和SNV
R<sup>2</sup>Y 0.940 0.964
Q<sup>2</sup> 0.938 0.963
RMSEP 1.20mM 6.19mM
平均模型误差 10.4％ 7.39％
组氨酸范围：0-25mM；精氨酸范围：0-81mM
SNV-标准正态变量-均值居中并归一化
R2-模型解释的训练集中的变差百分比，R2＞0.9
Q2-交叉验证期间模型预测的训练集中的变差百分比，
Q2＞0.8
(RMSEP)均方根误差预测
实施例9：用于药物/抗体比测量的拉曼模型.
材料和方法：
DAR是一种质量属性，在开发抗体-药物缀合物(ADC)、抗体-放射性核素缀合物(ARC)和普通蛋白质缀合物(有效的类固醇、非细胞毒性有效载荷等)期间监测该质量属性以确保一致的产品质量以及便于后续使用有效载荷进行标记。将拉曼作为监测DAR水平的技术进行评价，DAR水平然后可用作反应的控制策略。使用拉曼评估了两种正在开发的不同mAb(mAb 1和mAb 3)的DAR测定可行性。使用非接触式光学探针，将拉曼分析仪的操作参数设置为10秒扫描时间，进行10次累加。使用350-3100cm-1的光谱范围，用SNV预处理原始光谱数据，并且另外使用结合21cm-1平滑的二阶导数进行滤波。表7示出了用于确定样品中DAR的模型组件。使用基于UV光谱的方法确定离线DAR测量值。
表7.用于药物/抗体比测量的模型组件.
Figure BDA0002809696360000361
结果：
图15A至15B显示拉曼建模可用于测量mAb 1和mAb 3的iPET药物缀合物的药物/抗体比。对于这两个模型，交叉验证的均方根误差为0.6DAR。当前基于UV的正交测定法具有与0.3DAR相关的变异性(一个标准偏差)。该初始拉曼预测值在两个标准偏差之内，并表明通过进一步的某些精化，可以用拉曼成功预测DAR。
尽管在前面的说明书中已关于本发明的某些实施方案描述了本发明，并且出于说明的目的已经提出了许多细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可容许有额外实施方案，并且在不脱离本发明的基本原理的情况下，本文所述的某些细节可以进行相当大的改变。
本文引用的所有参考文献均以引用的方式全文并入。在不脱离本发明的精神或本质属性的情况下，本发明可以以其他特定形式来体现，并且因此，应参考所附权利要求，而不是前述说明书，来指示本发明的范围。

Claims (35)

1.一种制备浓缩蛋白质纯化中间品的方法，包括：
在浓缩蛋白质纯化中间品的同时使用原位拉曼光谱实时测定所述蛋白质纯化中间品的浓度；以及
实时调整所述浓缩步骤的参数以获得所述浓缩蛋白质纯化中间品和/或最终浓缩池。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述浓缩蛋白质产品具有5mg/mL至300mg/mL的浓度。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述蛋白质纯化中间品的浓度是至少50mg/mL。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述蛋白质纯化中间品的浓度是至少150mg/mL。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中使用超滤、缓冲液交换或这两者浓缩所述蛋白质纯化中间品。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中从生物反应器、补料分批培养物或连续培养物中收获所述蛋白质纯化中间品。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中测定所述蛋白质纯化中间品的浓度实时连续或间歇地进行。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述蛋白质浓度定量以30秒至10分钟的间隔、每小时一次或每天一次进行。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述蛋白质纯化中间品是抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在选自977-1027cm-1、1408-1485cm-1、1621-1711cm-1、2823-3046cm-1以及它们的组合的一个或多个波数范围内收集光谱数据。
11.一种制备蛋白质纯化中间品的方法，包括：
对多种蛋白质纯化中间品独立地进行拉曼光谱分析以产生能够对所述多种蛋白质纯化中间品中的任一者进行定量的通用模型；
在浓缩所述蛋白质纯化中间品期间使用原位拉曼光谱采用所述通用模型测定所述蛋白质纯化中间品的浓度；以及
当所述浓缩蛋白质纯化中间品达到预定浓度或最终浓缩池目标时，制备所述浓缩蛋白质纯化中间品。
12.根据权利要求11所述的方法，其中使用原始光谱数据和离线蛋白质浓度数据的偏最小二乘回归分析来产生所述模型。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括对所述拉曼光谱数据执行归一化技术或点平滑。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述归一化技术包括标准正态变量。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述点平滑包含结合21cm-1平滑的一阶导数。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其中与离线蛋白质浓度值相比，所述模型提供具有≤5％误差的预测蛋白质浓度值。
17.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其中与离线蛋白质浓度值相比，所述模型提供具有≤3％误差的预测蛋白质浓度值。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述浓缩蛋白质纯化中间品具有5mg/mL至300mg/mL的浓度。
19.根据权利要求11所述的方法，其中，所述浓缩蛋白质纯化中间品的浓度为至少100mg/mL。
20.根据权利要求11所述的方法，其中所述浓缩蛋白质纯化中间品的浓度为至少150mg/mL。
21.根据权利要求11所述的方法，其中使用超滤、渗滤或这两者浓缩所述浓缩蛋白质纯化中间品。
22.根据权利要求11所述的方法，其中从生物反应器、补料分批培养物或连续培养物中收获所述浓缩蛋白质纯化中间品。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中测定所述蛋白质纯化中间品的浓度实时连续或间歇地进行。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述蛋白质浓度定量以30秒至10分钟的间隔、每小时一次或每天一次进行。
25.根据权利要求11至24中任一项所述的方法，其中所述蛋白质纯化中间品是抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白。
26.一种蛋白质纯化中间品，所述蛋白质纯化中间品是根据权利要求1至25中任一项制备。
27.一种在下游蛋白质纯化处理期间监测和控制蛋白质纯化中间品中的关键质量属性的方法，包括：
使用原位拉曼光谱定量所述蛋白质纯化中间品中的一个或多个关键质量属性；以及
调整所述蛋白质纯化中间品中的所述一个或多个关键质量属性以匹配预定的关键质量属性水平。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述关键质量属性选自抗体滴度、蛋白质浓度、高分子量物质、药物/抗体比和缓冲赋形剂。
29.根据权利要求27或28中任一项所述的方法，其中所述下游蛋白质纯化处理是超滤/渗滤。
30.一种在下游纯化期间监测和控制收获的细胞培养流体和/或蛋白质纯化中间品中的赋形剂水平的方法，包括：
在纯化所述细胞培养流体或蛋白质纯化中间品的同时使用原位拉曼光谱实时测定所述赋形剂的浓度；以及
实时调整所述纯化步骤的参数，以在所述收获的细胞培养流体和/或蛋白质纯化中间品中获得或维持预定量的所述赋形剂。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述赋形剂包含缓冲赋形剂。
32.根据权利要求30或31中任一项所述的方法，其中所述赋形剂选自乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐、羟甲基氨基甲烷(Tris)、脯氨酸、精氨酸、蔗糖或它们的组合。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述赋形剂包含表面活性赋形剂。
34.权利要求30或33中任一项所述的方法，其中所述表面活性赋形剂选自聚山梨酯80、聚山梨酯20和泊洛沙姆188。
35.根据权利要求11所述的方法，其中所述赋形剂包含聚乙二醇。
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