TW202400659A - 經腫瘤活化之靶向ｃｄ２８及ｐｄ－ｌ１之多特異性抗體及其使用方法 - Google Patents
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-
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-
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-
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-
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-
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- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
Abstract
本文提供選擇性地結合於CD28及PD-L1之抗體、其醫藥組合物以及核酸，及其使用方法，及其製造及發現方法。
Description
本文揭示根據下式之經分離多特異性抗體：P
1-L
1-A
1-L-B (式I)，其中A
1包含CD28結合域；B包含PD-L1結合域；L包含連接A
1與B之連接子；P
1包含與A
1結合之肽，且L
1包含連接A
1與P
1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，多特異性抗體係根據下式：
P
1-L
1-A
1-L-B-L
2-P
2(
式 Ia)，其中P
2包含與B結合之肽，且L
2包含連接B與P
2之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 42-53中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 42-53中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 42-53中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 128-147中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 128-147中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 128-147中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據X
1-X
2-X
3-C-X
4-X
5-X
6-X
7-X
8-X
9-X
10-C-X
11-X
12之胺基酸序列，其中X
1係選自M、I、L及V；X
2係選自D、H、N、A、F、S、T、Y及V；X
3係選自W、L及F；X
4係選自P、A及L；X
5係選自R、T、I、M、S、K、L、V、W、F、A、P及D；X
6係選自E、D、Y、H、S、F、A、N、T、I、P及V；X
7係選自L、M、R、S、Q及H；X
8係選自W及Q；X
9係選自H、N、D、A、S、Y、T、F、V、L及I；X
10係選自E、V、L、D、Y、R、Q、H、F、K、A、M及N；X
11係選自F、Y、L、W及V；且X
12係選自N、A、F、S、Y、H、D、T及L。在一些實施例中，X
1係選自M、I及L；X
2係選自D、H、N及A；X
3為W；X
4為P；X
5係選自R、T、I、M、S及K；X
6係選自E、D、Y、H、S及F；X
7係選自L、M及R；X
8為W；X
9係選自H、N、D、A、S及V；X
10係選自E、V、L、D及H；X
11係選自F、Y及L；且X
12係選自N、A、F、S及Y。在一些實施例中，X
1為M；X
2係選自D及H；X
3為W；X
4為P；X
5係選自R、T及I；X
6係選自E、D及Y；X
7係選自L、M及R；X
8為W；X
9係選自H、N、D及V；X
10係選自E、V、L、D及H；X
11為F；且X
12係選自N、A及F。在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 32具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 138之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 138具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1削弱A
1與CD28之結合。在一些實施例中，P
1經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與A
1結合。在一些實施例中，P
1在抗原結合位點處或附近與A
1結合。在一些實施例中，當L
1由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
1變得與A
1不再結合，從而使A
1暴露於CD28。在一些實施例中，P
1與CD28之序列一致性小於75%。在一些實施例中，P
1與CD28之序列一致性小於80%。在一些實施例中，P
1與CD28之序列一致性小於85%。在一些實施例中，P
1與CD28之序列一致性小於90%。在一些實施例中，P
1與CD28之序列一致性小於95%。在一些實施例中，P
1包含與CD28共有小於10%之序列一致性的新的(de novo)胺基酸序列。在一些實施例中，P
2削弱B與PD-L1之結合。在一些實施例中，P
2經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與B結合。在一些實施例中，P
2在抗原結合位點處或附近與B結合。在一些實施例中，當L
2由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
2變得與B不再結合，從而使B暴露於PD-L1。在一些實施例中，P
2與PD-L1之序列一致性小於70%。在一些實施例中，P
2與PD-L1之序列一致性小於75%。在一些實施例中，P
2與PD-L1之序列一致性小於80%。在一些實施例中，P
2與PD-L1之序列一致性小於85%。在一些實施例中，P
2與PD-L1之序列一致性小於90%。在一些實施例中，P
2與PD-L1之序列一致性小於95%。在一些實施例中，P
2包含與PD-L1共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。在一些實施例中，P
2包含長度為至少5個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
2包含長度為至少6個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
2包含長度為至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
2包含長度為至少10個胺基酸且長度不超過20個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
2包含長度為至少16個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
2包含長度不超過40個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
1或P
2包含至少兩個半胱胺酸胺基酸殘基。在一些實施例中，P
1或P
2包含環狀肽或線性肽。在一些實施例中，P
1或P
2包含環狀肽。在一些實施例中，P
1或P
2包含線性肽。在一些實施例中，P
1或P
2包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。在一些實施例中，P
1或P
2不包含白蛋白或白蛋白片段。在一些實施例中，P
1或P
2不包含白蛋白結合域。在一些實施例中，L
1或L
2為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1或L
2為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1或L
2為具有至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1或L
2為具有至少18個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1或L
2為具有至少26個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1或L
2包含含有(G2S)n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。在一些實施例中，L
1或L
2包含含有(G2S)n之式，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，L
1或L
2包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，腫瘤特異性蛋白酶係選自由以下組成之群：金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶及天冬胺酸蛋白酶。在一些實施例中，L
1或L
2包含尿激酶可裂解胺基酸序列、間質蛋白酶可裂解胺基酸序列或基質金屬蛋白酶可裂解胺基酸序列。在一些實施例中，L
1或L
2包含根據SEQ ID NO: 18-19、62-88之序列。在一些實施例中，L
1與A
1之N端結合。在一些實施例中，L
1與A
1之C端結合。在一些實施例中，L
2與B之N端結合。在一些實施例中，L
2與B之C端結合。在一些實施例中，CD28結合域包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab或Fab'。在一些實施例中，CD28結合域包含單鏈可變片段。在一些實施例中，CD28結合域包含單域抗體。在一些實施例中，CD28結合域包含Fab或Fab'。在一些實施例中，PD-L1結合域包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab或Fab'。在一些實施例中，PD-L1結合域包含Fab或Fab'。在一些實施例中，PD-L1結合域包含Fab或Fab'且CD28結合域包含單鏈可變片段。在一些實施例中，包含Fab或Fab'之PD-L1結合域包含含有Fab重鏈可變域之Fab重鏈多肽及含有Fab輕鏈可變域之Fab輕鏈多肽。在一些實施例中，包含單鏈可變片段之CD28結合域包含scFv重鏈可變域及scFv輕鏈可變域。在一些實施例中，連接子將A
1之C端連接至B之N端。在一些實施例中，連接子將A
1之N端連接至B之C端。在一些實施例中，連接子將A
1之C端連接至Fab重鏈多肽之N端。在一些實施例中，連接子將A
1之N端連接至Fab重鏈多肽之C端。在一些實施例中，連接子將A
1之C端連接至Fab輕鏈多肽之N端。在一些實施例中，連接子將A
1之N端連接至Fab輕鏈多肽之C端。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv重鏈可變域。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv重鏈可變域。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之N端。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之C端。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv重鏈可變域之N端。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv重鏈可變域之C端。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之N端。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之C端。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv重鏈可變域之N端。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv重鏈可變域之C端。在一些實施例中，連接子之長度為至少5個胺基酸。在一些實施例中，連接子之長度不超過30個胺基酸。在一些實施例中，連接子之長度為至少5個胺基酸且不超過30個胺基酸。在一些實施例中，連接子之長度為5個胺基酸。在一些實施例中，連接子之長度為15個胺基酸。在一些實施例中，連接子包含(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 58)、(GGGS)n (SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)n (SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，L包含含有(G2S)n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 18 (GGGGSGGGGSGGGGS)或SEQ ID NO: 19 (GGGGS)之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該scFv重鏈可變域之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 1；HC-CDR2：SEQ ID NO: 2；HC-CDR3：SEQ ID NO: 3，且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該scFv輕鏈可變域之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 4；LC-CDR2：SEQ ID NO: 5 (KA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 6，且其中該等CDR包含該等LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，A
1包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中A
1之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 4；LC-CDR2：SEQ ID NO: 5 (KA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 6；其中A
1包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中A
1之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 1；HC-CDR2：SEQ ID NO: 2；HC-CDR3：SEQ ID NO: 3。在一些實施例中，Fab重鏈可變域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該Fab重鏈可變域之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 10；HC-CDR2：SEQ ID NO: 11；HC-CDR3：SEQ ID NO: 12；且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，Fab輕鏈可變域包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該Fab輕鏈可變域之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 13；LC-CDR2：SEQ ID NO: 14 (DA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 15；且其中該等CDR包含該等LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，B包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中B之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 10；HC-CDR2：SEQ ID NO: 11；HC-CDR3：SEQ ID NO: 12；且其中B包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中B之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 13；LC-CDR2：SEQ ID NO: 14 (DA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含與根據SEQ ID NO: 7之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少75個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含根據SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含與根據SEQ ID NO: 8之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少75個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含根據SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含與根據SEQ ID NO: 9之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含SEQ ID NO: 9之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，scFv包含根據SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab重鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 17之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab重鏈多肽包含SEQ ID NO: 17之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab重鏈多肽包含SEQ ID NO: 17之至少215個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab重鏈多肽包含SEQ ID NO: 17之至少215個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 17之至少215個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，Fab重鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 17之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab輕鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 16之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab輕鏈多肽包含SEQ ID NO: 16之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab輕鏈多肽包含SEQ ID NO: 16之至少200個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab輕鏈多肽包含SEQ ID NO: 16之至少200個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 16之至少200個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，Fab輕鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之C端，且其中Fab輕鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列，且連接至scFv輕鏈可變域之C端的Fab重鏈多肽之胺基酸序列包含與根據SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之C端，且其中Fab輕鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 20之胺基酸序列，且連接至scFv輕鏈可變域之C端的Fab重鏈多肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之C端，且其中Fab重鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列，且連接至scFv輕鏈可變域之C端的Fab輕鏈多肽之胺基酸序列包含與根據SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之C端，且其中Fab重鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 23之胺基酸序列，且連接至scFv輕鏈可變域之C端的Fab輕鏈多肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。在一些實施例中，多特異性抗體進一步包含半衰期延長分子(H
1)。在一些實施例中，H
1連接至P
1。在一些實施例中，H
1連接至P
2。在一些實施例中，H
1不阻斷A
1與CD28結合。在一些實施例中，H
1不阻斷B與PD-L1結合。在一些實施例中，H
1包含連接H
1與P
1或H
1與P
2之連接部分(L
5)。在一些實施例中，半衰期延長分子(H
1)對PD-L1不具有結合親和力。在一些實施例中，半衰期延長分子(H
1)對CD28不具有結合親和力。在一些實施例中，半衰期延長分子(H
1)不會使多特異性抗體隔離CD28。在一些實施例中，H
1包含根據SEQ ID NO: 54-57之序列。在一些實施例中，H
1包含具有重複序列模體之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含具有高度有序二級結構之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含聚合物。如技術方案148之經分離多特異性抗體，其中該聚合物為聚乙二醇(PEG)。在一些實施例中，H
1包含白蛋白。在一些實施例中，H
1包含Fc域。在一些實施例中，白蛋白為血清白蛋白。在一些實施例中，白蛋白為人類血清白蛋白。在一些實施例中，H
1包含多肽、配體或小分子。在一些實施例中，多肽、配體或小分子結合血清蛋白或其片段、循環免疫球蛋白或其片段、或CD35/CR1。在一些實施例中，血清蛋白包含甲狀腺素結合蛋白、甲狀腺素運載蛋白、1-酸性醣蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體或其運鐵蛋白結合部分、纖維蛋白原或白蛋白。在一些實施例中，循環免疫球蛋白分子包含IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。在一些實施例中，血清蛋白為白蛋白。在一些實施例中，多肽為抗體。在一些實施例中，抗體包含單域抗體、單鏈可變片段、Fab或Fab'。在一些實施例中，單域抗體包含與白蛋白結合之單域抗體。在一些實施例中，單域抗體為人類或人源化抗體。在一些實施例中，單域抗體係選自由以下組成之群：645gH1gL1、645dsgH5gL4、23-13-A01 -sc02、A10m3或其片段、DOM7r-31、DOM7h-11-15、Alb-1、Alb-8、Alb-23、10G、10E及SA21。在一些實施例中，單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 54，HC-CDR2：SEQ ID NO: 55，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 56；且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，H
1包含根據SEQ ID NO: 57之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。在一些實施例中，經修飾之胺基酸或經修飾之非天然胺基酸包含轉譯後修飾。在一些實施例中，H
1包含連接H
1與P
1或P
2之連接部分(L
5)。在一些實施例中，L
5為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少18個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少26個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149及150具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149及150具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 151及152具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 151及152具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 153及154具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 153及154具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 155及156具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 155及156具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 157及158具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 157及158具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 159及160具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 159及160具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 161及162具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 161及162具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 163及164具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 163及164具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 165及166具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 165及166具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 167及168具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 167及168具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 169及170具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 169及170具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 208及209具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 208及209具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
本文揭示經分離重組核酸分子，其編碼以上實施例中之任一者之經分離多特異性抗體之多肽。
本文揭示醫藥組合物，其包含：(a)以上實施例中之任一者之經分離多特異性抗體；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
本文揭示醫藥組合物，其包含：(a)以上實施例中之任一者之經分離多特異性抗體，(b)抗癌療法，及(c)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，抗癌療法包含小分子、基於細胞之療法或基於抗體之療法。在一些實施例中，基於抗體之療法為T細胞接合子。在一些實施例中，T細胞接合子包含根據以下之式：D
1-L
0-E
1(式II)，其中D
1包含與效應細胞抗原結合之效應細胞結合域，E
1包含與腫瘤抗原結合之腫瘤抗原結合域，且L
0包含連接D
1與E
1之連接子。在一些實施例中，D
1包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab片段或Fab'。在一些實施例中，D
1包含單鏈可變片段。在一些實施例中，E
1包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab片段或Fab'。在一些實施例中，E
1包含Fab片段。在一些實施例中，效應細胞抗原包含CD3。在一些實施例中，效應細胞結合域包含選自由以下組成之群的互補決定區(CDR)：莫羅單抗-CD3 (OKT3)、奧昔組單抗(TRX4)、替利組單抗(MGA031)、維西珠單抗(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030 (BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、15865、15865v12、15865v16及15865v19。在一些實施例中，效應細胞結合域包含根據SEQ ID NO: 89-101之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含表皮生長因子受體(EGFR)、***特異性膜抗原(PSMA)或腫瘤相關鈣信號轉導子2 (下文稱為TROP2)。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR。在一些實施例中，腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 102-111之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 105；HC-CDR2：SEQ ID NO: 106；HC-CDR3：SEQ ID NO: 107；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 102；LC-CDR2：SEQ ID NO: 103 (YAS)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 104。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 181及182具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 181及182之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 181及182具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 214及215之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 112；HC-CDR2：SEQ ID NO: 113；HC-CDR3：SEQ ID NO: 114；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 115；LC-CDR2：SEQ ID NO: 116 (SAS)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 117。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 187-192具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 187-192中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 112-119之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA。在一些實施例中，腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 120-127之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 120；HC-CDR2：SEQ ID NO: 121；HC-CDR3：SEQ ID NO: 122；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 123；LC-CDR2：SEQ ID NO: 124 (EA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 125。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 173及174具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 173及174之胺基酸序列。在一些實施例中，T細胞接合分子在腫瘤微環境中選擇性活化。在一些實施例中，T細胞接合子係根據以下子式：P
3-L
3-D
1-L
0-E
1(式IIa)，其中D
1包含CD3結合域；E
1包含腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之連接子；P
3包含與D
1結合之肽，且L
3包含連接D
1與P
3之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。在一些實施例中，T細胞接合子係根據以下子式：D
1-L
0-E
1-L
4-P
4(式IIb)，其中D
1包含CD3結合域；E
1包含腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之連接子；P
4包含與E
1結合之肽，且L
4包含連接E
1與P
4之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。在一些實施例中，T細胞接合子係根據以下子式：P
3-L
3-D
1-L
0-E
1-L
4-P
4(式IIc)，其中D
1包含CD3結合域；E
1包含腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之連接子；P
3包含與D
1結合之肽，且L
3包含連接D
1與P
3之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質；P
4包含與E
1結合之肽，且L
4包含連接E
1與P
4之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。在一些實施例中，T細胞接合子包含H
1。在一些實施例中，H
1包含根據SEQ ID NO: 54-57之序列。在一些實施例中，H
1包含單域抗體。在一些實施例中，單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 54，HC-CDR2：SEQ ID NO: 55，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 56。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少18個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少26個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4包含含有(G2S)n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。在一些實施例中，L
3或L
4包含含有(G2S)n之式，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，L
3或L
4包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，腫瘤特異性蛋白酶係選自由以下組成之群：金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶及天冬胺酸蛋白酶。在一些實施例中，L
3或L
4包含尿激酶可裂解胺基酸序列、間質蛋白酶可裂解胺基酸序列或基質金屬蛋白酶可裂解胺基酸序列。在一些實施例中，L
3或L
4包含根據SEQ ID NO: 18-19、62-88之序列。在一些實施例中，L
3與D
1之N端結合。在一些實施例中，L
3與D
1之C端結合。在一些實施例中，L
4與E
1之N端結合。在一些實施例中，L
4與E
1之C端結合。在一些實施例中，當L
3由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
3變得與D
1不再結合，從而使D
1暴露於CD3。在一些實施例中，當L
4由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
4變得與E
1不再結合，從而使E
1暴露於腫瘤抗原。在一些實施例中，P
3削弱D
1與CD3之結合。在一些實施例中，P
3經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與D
1結合。在一些實施例中，P
3在抗原結合位點處或附近與D
1結合。在一些實施例中，當L
3由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
3變得與D
1不再結合，從而使D
1暴露於CD3。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於70%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於85%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於90%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於95%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於98%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於99%。在一些實施例中，P
3包含根據SEQ ID NO: 177-180之胺基酸序列。在一些實施例中，P
3包含與CD3共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。在一些實施例中，P
4削弱E
1與腫瘤抗原之結合。在一些實施例中，P
4經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與E
1結合。在一些實施例中，P
4在抗原結合位點處或附近與E
1結合。在一些實施例中，當L
4由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
4變得與E
1不再結合，從而使E
1暴露於腫瘤抗原。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於70%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於80%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於85%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於90%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於95%。在一些實施例中，P
4包含與腫瘤抗原共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少5個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少6個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少10個胺基酸且長度不超過20個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少16個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度不超過40個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含至少兩個半胱胺酸胺基酸殘基。在一些實施例中，P
3或P
4包含環狀肽或線性肽。在一些實施例中，P
3或P
4包含環狀肽。在一些實施例中，P
3或P
4包含線性肽。在一些實施例中，P
4包含根據SEQ ID NO: 185或186之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含SEQ ID NO: 183及184之胺基酸序列。在一些實施例中，P
4包含根據SEQ ID NO: 199-201之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且T細胞接合子包含SEQ ID NO: 193-198之胺基酸序列中之任一者。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且T細胞接合子包含SEQ ID NO: 175及176之胺基酸序列。
本文揭示經分離多肽或多肽複合物，其包含CD28結合域，該結合域連接至削弱CD28結合域與CD28之結合的肽，其中該肽包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 42-53中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 42-53中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 42-53中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 128-147中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 128-147中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 128-147中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據X
1-X
2-X
3-C-X
4-X
5-X
6-X
7-X
8-X
9-X
10-C-X
11-X
12之胺基酸序列，其中X
1係選自M、I、L及V；X
2係選自D、H、N、A、F、S、T、Y及V；X
3係選自W、L及F；X
4係選自P、A及L；X
5係選自R、T、I、M、S、K、L、V、W、F、A、P及D；X
6係選自E、D、Y、H、S、F、A、N、T、I、P及V；X
7係選自L、M、R、S、Q及H；X
8係選自W及Q；X
9係選自H、N、D、A、S、Y、T、F、V、L及I；X
10係選自E、V、L、D、Y、R、Q、H、F、K、A、M及N；X
11係選自F、Y、L、W及V；且X
12係選自N、A、F、S、Y、H、D、T及L。在一些實施例中，X
1係選自M、I及L；X
2係選自D、H、N及A；X
3為W；X
4為P；X
5係選自R、T、I、M、S及K；X
6係選自E、D、Y、H、S及F；X
7係選自L、M及R；X
8為W；X
9係選自H、N、D、A、S及V；X
10係選自E、V、L、D及H；X
11係選自F、Y及L；且X
12係選自N、A、F、S及Y。在一些實施例中，X
1為M；X
2係選自D及H；X
3為W；X
4為P；X
5係選自R、T及I；X
6係選自E、D及Y；X
7係選自L、M及R；X
8為W；X
9係選自H、N、D及V；X
10係選自E、V、L、D及H；X
11為F；且X
12係選自N、A及F。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 32具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 138之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 138具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。在一些實施例中，CD28結合域包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab或Fab'。在一些實施例中，CD28結合域包含單鏈可變片段，且單鏈可變片段包含scFv重鏈可變域及scFv輕鏈可變域。在一些實施例中，CD28結合域包含單域抗體。如技術方案313之經分離多肽或多肽複合物，其中CD28結合域包含Fab或Fab'。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該scFv重鏈可變域之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 1；HC-CDR2：SEQ ID NO: 2；HC-CDR3：SEQ ID NO: 3，且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該scFv輕鏈可變域之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 4；LC-CDR2：SEQ ID NO: 5 (KA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 6，且其中該等CDR包含該等LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含與根據SEQ ID NO: 7之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少75個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含根據SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含與根據SEQ ID NO: 8之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少75個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含根據SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含與根據SEQ ID NO: 9之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含SEQ ID NO: 9之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，scFv包含根據SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。在一些實施例中，CD28結合域經由連接部分(L
1)連接至肽。在一些實施例中，L
1為腫瘤特異性蛋白酶之受質。在一些實施例中，L
1為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1為具有至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1為具有至少18個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1為具有至少26個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1包含含有(G
2S)
n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。在一些實施例中，L
1包含含有(G
2S)
n之式，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，L
1包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，腫瘤特異性蛋白酶係選自由以下組成之群：金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶及天冬胺酸蛋白酶。在一些實施例中，L
1包含尿激酶可裂解胺基酸序列、間質蛋白酶可裂解胺基酸序列或基質金屬蛋白酶可裂解胺基酸序列。在一些實施例中，L
1包含根據SEQ ID NO: 18-19、62-88之序列。在一些實施例中，L
1與A
1之N端結合。在一些實施例中，L
1與A
1之C端結合。在一些實施例中，當L
1由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
1變得與A
1不再結合，從而使A
1暴露於CD28。在一些實施例中，L
1包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。在一些實施例中，經修飾之胺基酸或經修飾之非天然胺基酸包含轉譯後修飾。在一些實施例中，經分離多肽或多肽複合物進一步包含半衰期延長分子(H
1)。在一些實施例中，H1連接至肽。在一些實施例中，H
1不阻斷CD28結合域與CD28結合。在一些實施例中，H
1包含連接H
1與肽之連接部分(L
5)。在一些實施例中，半衰期延長分子(H
1)對CD28不具有結合親和力。在一些實施例中，半衰期延長分子(H
1)不會使經分離多肽或多肽複合物隔離CD28。在一些實施例中，H
1包含根據SEQ ID NO: 54-57之序列。在一些實施例中，H
1包含具有重複序列模體之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含具有高度有序二級結構之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含聚合物。在一些實施例中，聚合物為聚乙二醇(PEG)。在一些實施例中，H
1包含白蛋白。在一些實施例中，H
1包含Fc域。在一些實施例中，白蛋白為血清白蛋白。在一些實施例中，白蛋白為人類血清白蛋白。在一些實施例中，H
1包含多肽、配體或小分子。在一些實施例中，多肽、配體或小分子結合血清蛋白或其片段、循環免疫球蛋白或其片段、或CD35/CR1。在一些實施例中，血清蛋白包含甲狀腺素結合蛋白、甲狀腺素運載蛋白、1-酸性醣蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體或其運鐵蛋白結合部分、纖維蛋白原或白蛋白。在一些實施例中，循環免疫球蛋白分子包含IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。在一些實施例中，血清蛋白為白蛋白。在一些實施例中，多肽為抗體。在一些實施例中，抗體包含單域抗體、單鏈可變片段、Fab或Fab'。在一些實施例中，單域抗體包含與白蛋白結合之單域抗體。在一些實施例中，單域抗體為人類或人源化抗體。在一些實施例中，單域抗體係選自由以下組成之群：645gH1gL1、645dsgH5gL4、23-13-A01 -sc02、A10m3或其片段、DOM7r-31、DOM7h-11-15、Alb-1、Alb-8、Alb-23、10G、10E及SA21。在一些實施例中，單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 54，HC-CDR2：SEQ ID NO: 55，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 56；且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，H
1包含根據SEQ ID NO: 57之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。在一些實施例中，經修飾之胺基酸或經修飾之非天然胺基酸包含轉譯後修飾。在一些實施例中，H
1包含連接H
1與P
1或P
2之連接部分(L
5)。在一些實施例中，L
5為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少18個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少26個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。
本文揭示治療有需要之個體之癌症的方法，其包含向該個體投與以上實施例中之任一者之多特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體誘導T細胞介導之腫瘤細胞的細胞毒性。在一些實施例中，癌症為惡性血液病。在一些實施例中，癌症為白血病或淋巴瘤。在一些實施例中，癌症為淋巴瘤，且其中該淋巴瘤為B細胞淋巴瘤。在一些實施例中，癌症為實體腫瘤。在一些實施例中，實體腫瘤表現PD-L1。在一些實施例中，實體腫瘤為肉瘤、乳癌、肺癌或癌瘤。在一些實施例中，實體腫瘤為肺癌，且其中該肺癌為非小細胞肺癌。在一些實施例中，多特異性抗體與抗癌療法組合投與。在一些實施例中，多特異性抗體及抗癌療法在同一醫藥組合物中投與。在一些實施例中，多特異性抗體及抗癌療法作為單獨的醫藥組合物投與。在一些實施例中，個體難以用檢查點抑制劑療法治療。在一些實施例中，個體已自檢查點抑制劑療法復發。在一些實施例中，抗癌療法包含小分子、基於細胞之療法或基於抗體之療法。在一些實施例中，基於抗體之療法為T細胞接合子。在一些實施例中，T細胞接合子包含根據以下之式：D
1-L
0-E
1(式II)，其中D
1包含與效應細胞抗原結合之效應細胞結合域，E
1包含與腫瘤抗原結合之腫瘤抗原結合域，且L
0包含連接D
1與E
1之連接子。在一些實施例中，D
1包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab片段或Fab'。在一些實施例中，D
1包含單鏈可變片段。在一些實施例中，E
1包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab片段或Fab'。在一些實施例中，E
1包含Fab片段。在一些實施例中，效應細胞結合域包含選自由以下組成之群的互補決定區(CDR)：莫羅單抗-CD3 (OKT3)、奧昔組單抗(TRX4)、替利組單抗(MGA031)、維西珠單抗(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030 (BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、15865、15865v12、15865v16及15865v19。在一些實施例中，效應細胞結合域包含根據SEQ ID NO: 89-101之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含表皮生長因子受體(EGFR)、***特異性膜抗原(PSMA)或腫瘤相關鈣信號轉導子2 (下文稱為TROP2)。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR。在一些實施例中，腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 102-111之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 105；HC-CDR2：SEQ ID NO: 106；HC-CDR3：SEQ ID NO: 107；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 102；LC-CDR2：SEQ ID NO: 103 (YAS)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 104。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 181及182具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 181及182之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 181及182具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 214及215之胺基酸序列。在一些實施例中，癌症為結腸直腸癌(CRC)、頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、非小細胞肺癌(NSCLC)、***癌、乳癌、結腸/直腸癌、頭頸癌、食道胃癌、肝癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌、腎癌或胰臟癌。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 112；HC-CDR2：SEQ ID NO: 113；HC-CDR3：SEQ ID NO: 114；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 115；LC-CDR2：SEQ ID NO: 116 (SAS)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 117。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 187-192具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 187-192中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 112-119之胺基酸序列。如請求項416之方法，其中該癌症為肺癌、乳癌(例如HER2+；ER/PR+；TNBC)、子宮頸癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胰臟癌、胃癌、三陰性乳癌(TNBC)、尿道上皮癌(UC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、胃癌、食道癌、頭頸癌、***癌或子宮內膜癌。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA。在一些實施例中，腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 120-127之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 120；HC-CDR2：SEQ ID NO: 121；HC-CDR3：SEQ ID NO: 122；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 123；LC-CDR2：SEQ ID NO: 124 (EA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 125。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 173及174具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 173及174之胺基酸序列。在一些實施例中，癌症為肺癌、乳癌(例如HER2+；ER/PR+；TNBC)、子宮頸癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胰臟癌或胃癌。在一些實施例中，T細胞接合分子在腫瘤微環境中選擇性活化。
在一些實施例中，T細胞接合子係根據以下子式：P
3-L
3-D
1-L
0-E
1(式IIa)，其中D
1包含CD3結合域；E
1包含腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之連接子；P
3包含與D
1結合之肽，且L
3包含連接D
1與P
3之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
在一些實施例中，T細胞接合子係根據以下子式：D
1-L
0-E
1-L
4-P
4(式IIb)，其中D
1包含CD3結合域；E
1包含腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之連接子；P
4包含與E
1結合之肽，且L
4包含連接E
1與P
4之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。在一些實施例中，T細胞接合子係根據以下子式：P
3-L
3-D
1-L
0-E
1-L
4-P
4(式IIc)，其中D
1包含CD3結合域；E
1包含腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之連接子；P
3包含與D
1結合之肽，且L
3包含連接D
1與P
3之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質；P
4包含與E
1結合之肽，且L
4包含連接E
1與P
4之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。在一些實施例中，T細胞接合子包含H
1。在一些實施例中，H
1包含根據SEQ ID NO: 54-57之序列。在一些實施例中，H
1包含單域抗體。在一些實施例中，單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 54，HC-CDR2：SEQ ID NO: 55，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 56。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少18個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少26個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4包含含有(G
2S)
n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。在一些實施例中，L
3或L
4包含含有(G
2S)
n之式，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，L
3或L
4包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，腫瘤特異性蛋白酶係選自由以下組成之群：金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶及天冬胺酸蛋白酶。在一些實施例中，L
3或L
4包含尿激酶可裂解胺基酸序列、間質蛋白酶可裂解胺基酸序列或基質金屬蛋白酶可裂解胺基酸序列。在一些實施例中，L
3或L
4包含根據SEQ ID NO: 18-19、62-88之序列。在一些實施例中，L
3與D
1之N端結合。在一些實施例中，L
3與D
1之C端結合。在一些實施例中，L
4與E
1之N端結合。在一些實施例中，L
4與E
1之C端結合。在一些實施例中，當L
3由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
3變得與D
1不再結合，從而使D
1暴露於CD3。在一些實施例中，當L
4由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
4變得與E
1不再結合，從而使E
1暴露於腫瘤抗原。在一些實施例中，P
3削弱D
1與CD3之結合。在一些實施例中，P
3經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與D
1結合。在一些實施例中，P
3在抗原結合位點處或附近與D
1結合。在一些實施例中，當L
3由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
3變得與D
1不再結合，從而使D
1暴露於CD3。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於70%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於85%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於90%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於95%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於98%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於99%。在一些實施例中，P
3包含根據SEQ ID NO: 177-180之胺基酸序列。在一些實施例中，P
3包含與CD3共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。在一些實施例中，P
4削弱E
1與腫瘤抗原之結合。在一些實施例中，P
4經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與E
1結合。在一些實施例中，P
4在抗原結合位點處或附近與E
1結合。在一些實施例中，當L
4由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
4變得與E
1不再結合，從而使E
1暴露於腫瘤抗原。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於70%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於80%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於85%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於90%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於95%。在一些實施例中，P
4包含與腫瘤抗原共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少5個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少6個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少10個胺基酸且長度不超過20個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少16個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度不超過40個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含至少兩個半胱胺酸胺基酸殘基。在一些實施例中，P
3或P
4包含環狀肽或線性肽。在一些實施例中，P
3或P
4包含環狀肽。在一些實施例中，P
3或P
4包含線性肽。在一些實施例中，P
4包含根據SEQ ID NO: 185或186之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含SEQ ID NO: 183及184之胺基酸序列。在一些實施例中，P
4包含根據SEQ ID NO: 199-201之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且T細胞接合子包含SEQ ID NO: 193-198之胺基酸序列中之任一者。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且T細胞接合子包含SEQ ID NO: 175及176之胺基酸序列。
交叉引用
本申請案主張2022年5月4日申請之美國臨時申請案第63/338,115號的權益，該臨時申請案以全文引用的方式併入本文中。
序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以XML格式以電子方式提交且特此以全文引用的方式併入。該XML複本創建於2023年4月13日，命名為52426-741_851_SL.xml且大小為578,045位元組。
用於再引導T細胞以介導癌細胞殺傷之雙特異性抗體在臨床前及臨床研究中均顯示出前景。已用單鏈可變片段(scFv)獲得有效的T細胞活化，特別是雙特異性T細胞接合子(BiTE)型式，其中一個scFv靶向腫瘤細胞抗原，且另一個scFv靶向參與T細胞活化之抗原決定基，諸如CD3。BiTE之一個此類實例為靶向CD19及CD3之博納吐單抗(blinatumomab)，其已在歐洲及美國經批准用於治療化學療法抵抗性CD19+ B細胞急性淋巴母細胞白血病。儘管諸如博納吐單抗之T細胞接合子取得進展，但一些患者對治療反應不良，即使患者表現腫瘤抗原，其原因尚不完全清楚。
已經由與靶向共抑制免疫檢查點計劃性死亡配體1(PD-L1)及/或CD28之第二抗體共投與來探索增加T細胞接合子之T細胞細胞毒性的策略。CD28為表現於T細胞上之蛋白質，提供T細胞活化及存活所需之共刺激信號。眾所周知，經由CD28之刺激性信號傳導與BiTE之組合增加T細胞誘導之腫瘤細胞的細胞毒性。然而，在先前的研究中，獲得T細胞介導之腫瘤細胞的細胞毒性的核心需要存在具有腫瘤結合域(諸如抗CD19抗體)及CD3結合域之BiTE，而發現以scFv-scFv型式之抗CD28及抗PD-L1的單藥劑投與不會誘導T細胞介導之針對腫瘤細胞的細胞毒性。
T細胞之活化為一個高度調控的過程，通常需要兩個信號傳導事件來實現全部功能：第一信號在MHC-抗原複合物結合時啟動，其有助於區分「自身」與「非自身」T細胞受體(TCR)，及經由活化共刺激受體之第二信號。雖然第一識別信號活化T細胞且觸發T細胞介導之對經識別細胞之毒性，但若T細胞未接受第二共刺激信號，則其可導致T細胞耐受性，由此T細胞繼續識別腫瘤抗原但不產生針對腫瘤細胞之免疫反應。第二共刺激信號防止T細胞耐受性，且進一步活化T細胞以增強T細胞對靶向細胞之細胞毒性。
如本文所述之包含CD28結合域及PD-L1結合域之多特異性抗體經設計以充當PD-L1之拮抗劑及C28之條件性促效劑。雖然CD28促效作用已顯示出一些臨床前景，但由於CD28之全身活化導致的劑量限制性毒性，此方法可見之功效受到限制。本文所述之包含CD28結合域及PD-L1結合域之多特異性抗體經設計以僅在PD-L1存在下條件性地促效CD28，PD-L1通常由腫瘤過度表現以避免T細胞介導之殺傷。此外，PD-L1之參與經設計以阻斷PD-1結合且提供檢查點抑制。此組合提供一種增強抗腫瘤反應且限制CD28促效作用之全身毒性的作用機制。本文所述之多特異性抗體的研究表明缺乏全身免疫系統活化，此係藉由缺乏細胞介素釋放所證明。儘管有空前的臨床反應率，但大多數患者未能對靶向PD-1及PD-L1之療法有反應，此部分歸因於T細胞需要共刺激才能發揮全部功能。因此，僅檢查點抑制可能不足以完全使免疫系統攻擊腫瘤。藉由添加如本文所述之多特異性抗體可得到進一步的益處。
本文揭示與PD-L1及CD28特異性結合之抗體，其能夠作為單藥劑或與T細胞接合子組合誘導T細胞介導之腫瘤細胞的細胞毒性。值得注意的是，此類靶向PD-L1及CD28之抗體能夠作為單藥劑誘導T細胞介導之腫瘤細胞的細胞毒性，即使不與特異性靶向腫瘤細胞抗原之第二藥劑一起投與。此類與PD-L1及CD28特異性結合之抗體不呈scFv-scFv型式。
本文揭示根據下式之經分離多特異性抗體：
P
1-L
1-A
1-L-B (
式 I)，其中A
1包含CD28結合域；B包含PD-L1結合域；L包含連接A
1與B之連接子；P
1包含與A
1結合之肽，且L
1包含連接A
1與P
1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
本文揭示包含下式之經分離多特異性抗體：
P
1-L
1-A
1-L-B (
式 I)，其中A
1包含CD28結合域；B包含PD-L1結合域；L包含連接A
1與B之連接子；P
1包含與A
1結合之肽，且L
1包含連接A
1與P
1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
本文揭示包含下式之經分離多特異性抗體：
P
1-L
1-A
1-L-B
( 式 I)，其中A
1為CD28結合域；B為PD-L1結合域；L為連接A
1與B之連接子；P
1為與A
1結合之肽，且L
1為連接A
1與P
1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
本文揭示根據下式之經分離多特異性抗體：
P
1-L
1-A
1-L-B
( 式 I)，其中A
1為CD28結合域；B為PD-L1結合域；L為連接A
1與B之連接子；P
1為與A
1結合之肽，且L
1為連接A
1與P
1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
在一些實施例中，多特異性抗體係根據下式：
P
1-L
1-A
1-L-B-L
2-P
2(
式 Ia)，其中P
2包含與B結合之肽，且L
2包含連接B與P
2之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
在一些實施例中，多特異性抗體包含下式：
P
1-L
1-A
1 -L-B-L
2-P
2 ( 式 Ia)，其中P
2包含與B結合之肽，且L
2包含連接B與P
2之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
在一些實施例中，多特異性抗體包含下式：
P
1-L
1-A
1 -L-B-L
2-P
2 ( 式 Ia)，其中P
2為與B結合之肽，且L
2為連接B與P
2之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
在一些實施例中，多特異性抗體係根據下式：
P
1-L
1-A
1-L-B-L
2-P
2(
式 Ia)，其中P
2為與B結合之肽，且L
2為連接B與P
2之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
雖然本文已顯示及描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者應顯而易見，此類實施例僅藉助於實例提供。熟習此項技術者現將在不背離本發明之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文所述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明。預期以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且因此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。
定義
本文中所用之術語僅用於描述特定情況之目的且並不意欲為限制性的。如本文所用，除非上下文另外明確指出，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」意欲亦包括複數形式。此外，在實施方式及/或申請專利範圍中使用術語「包括(including)」、「包括(includes)」、「具有(having)」、「具有(has)」、「具有(with)」或其變化形式的情況下，此類術語意欲以類似於術語「包含」之方式為包括性的。
術語「抗體」以最廣泛意義使用且涵蓋完全組裝之抗體、可結合抗原之抗體片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、單鏈抗體(scFv)、雙功能抗體、抗體嵌合體、雜合抗體、雙特異性抗體及其類似物。
術語「互補決定區」或「CDR」係抗體可變區之片段，其在結構上與抗體所結合之抗原決定基互補且比可變區之其餘部分更可變。因此，CDR有時稱為高變區。可變區包含三個CDR。CDR肽可藉由構築編碼所關注抗體之CDR的基因來獲得。此類基因例如藉由使用聚合酶鏈反應自產抗體細胞之RNA合成可變區來製備。參見例如Larrick等人,
Methods: A Companion to Methods in Enzymology2: 106 (1991)；Courtenay-Luck, 「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies」,
Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter等人(編), 第166-179頁(Cambridge University Press 1995)；及Ward等人, 「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」,
Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch等人(編), 第137-185頁(Wiley-Liss, Inc. 1995)。
在一些情況下，抗體之CDR係根據(i) Kabat編號系統(Kabat等人 (197 ) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391及Kabat等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)；或(ii) Chothia編號方案，其本文中將稱為「Chothia CDR」(參見例如Chothia及Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917；Al-Lazikani等人, 1997, J. Mol. Biol., 273 :927-948；Chothia等人, 1992, J. Mol. Biol., 227:799-817；Tramontano A等人, 1990, J. Mol. Biol. 215(1): 175-82；及美國專利第7,709,226號)；或(iii) ImMunoGeneTics (IMGT)編號系統，例如Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7: 132-136及Lefranc, M.-P.等人, 1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212中所述(「IMGT CDR」)；或(iv) MacCallum等人, 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745來確定。亦參見例如Martin, A., Antibody Engineering中之「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains」, Kontermann及Diibel編, 第31章, 第422-439頁, Springer- Verlag, Berlin (2001)。
關於Kabat編號系統，抗體重鏈分子內之CDR通常存在於胺基酸位置31至35，其視情況可包括35後的一或兩個額外胺基酸(在Kabat編號方案中稱為35A及35B) (CDRl)、胺基酸位置50至65 (CDR2)及胺基酸位置95至102 (CDR3)。使用Kabat編號系統，抗體輕鏈分子內之CDR通常存在於胺基酸位置24至34 (CDRl)、胺基酸位置50至56 (CDR2)及胺基酸位置89至97 (CDR3)。如熟習此項技術者所熟知，使用Kabat編號系統，由於FR及/或CDR之縮短或延長，抗體可變域之實際線性胺基酸序列可含有更少或額外胺基酸，因此，胺基酸之Kabat編號不一定與其線性胺基酸數目相同。
術語「Fab」係指含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)的蛋白質。Fab片段與Fab'片段的不同之處在於在重鏈CH1域之羧基末端添加若干殘基，包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。Fab'-SH係本文中對Fab'之名稱，其中恆定域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基。Fab'片段係藉由還原F(ab')2片段重鏈二硫橋鍵產生。抗體片段之其他化學偶合亦為已知的。
「單鏈可變片段(scFv)」係用具有十至約25個胺基酸之短連接肽連接的抗體之重鏈(VH)及輕鏈(VL)之可變區的融合蛋白。連接子通常富含甘胺酸以具有可撓性，以及絲胺酸或蘇胺酸以具有可溶性，且可連接VH之N端與VL之C端，或反之亦然。儘管移除恆定區且引入連接子，但此蛋白質保留原始抗體之特異性。scFv抗體例如描述於Houston, J. S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)中。另外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有VH域(亦即能夠與VL域一起組裝成功能性抗原結合位點)或VL域(亦即能夠與VH域一起組裝成功能性抗原結合位點)之特徵，且因此提供全長抗體之抗原結合特性。
術語「多特異性」意謂抗體能夠特異性結合兩個或更多個不同的抗原決定子，例如兩個或更多個結合位點，各結合位點由一對抗體重鏈可變域(VH)及抗體輕鏈可變域(VL)形成，或在單域抗體之情況下，單個可變域與不同抗原結合。
如本文所用，關於序列之術語「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且必要時引入空位以實現最大序列一致性百分比之後且在不考慮任何保守取代作為序列一致性之一部分的情況下，與特定序列中之胺基酸殘基一致的候選序列中之胺基酸殘基的百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術之技能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可用之電腦軟體，諸如EMBOSS MATCHER、EMBOSS WATER、EMBOSS STRETCHER、EMBOSS NEEDLE、EMBOSS LALIGN、BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括在所比較序列之全長上實現最大比對所需的任何演算法。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形中，給定胺基酸序列A對、與或針對給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (其可替代地表述為給定胺基酸序列A對、與或針對給定胺基酸序列B具有或包含某一胺基酸序列一致性%)計算如下：100乘以分數X/Y，其中X為在序列比對程式ALIGN-2對A及B進行比對時該程式評分為一致匹配的胺基酸殘基數，且其中Y為B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，在胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度的情況下，A對B之胺基酸序列一致性%將不等於B對A之胺基酸序列一致性%。除非另外特定陳述，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%值係如前一段落中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「個體(individual)」、「個體(subject)」及「患者」在本文中可互換使用且係指任何哺乳動物。在一些實施例中，哺乳動物為人類。在一些實施例中，哺乳動物為非人類。該等術語均不要求或限於以健康照護工作者(例如醫生、註冊護士、從業護士、醫師助理、護理員或臨終關懷工作者)之監督(例如持續或間歇)為特徵的情形。
肽 (P
1)
或 (P
2)
在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 42-53中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 42-53中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 42-53中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，P
1包含根據表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 128-147中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 128-147中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 128-147中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，P
1包含根據X
1-X
2-X
3-C-X
4-X
5-X
6-X
7-X
8-X
9-X
10-C-X
11-X
12之胺基酸序列，其中X
1係選自M、I、L及V；X
2係選自D、H、N、A、F、S、T、Y及V；X
3係選自W、L及F；X
4係選自P、A及L；X
5係選自R、T、I、M、S、K、L、V、W、F、A、P及D；X
6係選自E、D、Y、H、S、F、A、N、T、I、P及V；X
7係選自L、M、R、S、Q及H；X
8係選自W及Q；X
9係選自H、N、D、A、S、Y、T、F、V、L及I；X
10係選自E、V、L、D、Y、R、Q、H、F、K、A、M及N；X
11係選自F、Y、L、W及V；且X
12係選自N、A、F、S、Y、H、D、T及L。在一些實施例中，X
1係選自M、I及L；X
2係選自D、H、N及A；X
3為W；X
4為P；X
5係選自R、T、I、M、S及K；X
6係選自E、D、Y、H、S及F；X
7係選自L、M及R；X
8為W；X
9係選自H、N、D、A、S及V；X
10係選自E、V、L、D及H；X
11係選自F、Y及L；且X
12係選自N、A、F、S及Y。在一些實施例中，X
1為M；X
2係選自D及H；X
3為W；X
4為P；X
5係選自R、T及I；X
6係選自E、D及Y；X
7係選自L、M及R；X
8為W；X
9係選自H、N、D及V；X
10係選自E、V、L、D及H；X
11為F；且X
12係選自N、A及F。
在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 32具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。
在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 138之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 138具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，P
1包含根據SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
在一些實施例中，P
1削弱A
1與CD28之結合。在一些實施例中，P
1經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與A
1結合。在一些實施例中，P
1在抗原結合位點處或附近與A
1結合。在一些實施例中，當L
1由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
1變得與A
1不再結合，從而使A
1暴露於CD28。在一些實施例中，P
1與CD28之序列一致性小於75%。在一些實施例中，P
1與CD28之序列一致性小於80%。在一些實施例中，P
1與CD28之序列一致性小於85%。在一些實施例中，P
1與CD28之序列一致性小於90%。在一些實施例中，P
1與CD28之序列一致性小於95%。在一些實施例中，P
1包含與CD28共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。
在一些實施例中，P
2削弱B與PD-L1之結合。在一些實施例中，P
2經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與B結合。
在一些實施例中，P
2在抗原結合位點處或附近與B結合。在一些實施例中，當L
2由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
2變得與B不再結合，從而使B暴露於PD-L1。在一些實施例中，P
2與PD-L1之序列一致性小於70%。在一些實施例中，P
2與PD-L1之序列一致性小於75%。在一些實施例中，P
2與PD-L1之序列一致性小於80%。在一些實施例中，P
2與PD-L1之序列一致性小於85%。在一些實施例中，P
2與PD-L1之序列一致性小於90%。在一些實施例中，P
2與PD-L1之序列一致性小於95%。在一些實施例中，P
2包含與PD-L1共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。在一些實施例中，P
2包含長度為至少5個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
2包含長度為至少6個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
2包含長度為至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
2包含長度為至少10個胺基酸且長度不超過20個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
2包含長度為至少16個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
2包含長度不超過40個胺基酸之肽序列。
在一些實施例中，P
1或P
2包含至少兩個半胱胺酸胺基酸殘基。在一些實施例中，P
1或P
2包含環狀肽或線性肽。在一些實施例中，P
1或P
2包含環狀肽。在一些實施例中，P
1或P
2包含線性肽。在一些實施例中，P
1或P
2包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。在一些實施例中，P
1或P
2不包含白蛋白或白蛋白片段。在一些實施例中，P
1或P
2不包含白蛋白結合域。
表 1. P
1 序列
連接部分 ( L
1 或 L
2)
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至C) | SEQ ID NO: |
| 肽-1 | YWYCSPSIVRCVLV | 24 |
| 肽-2 | LICKSGSILILCAQ | 25 |
| 肽-3 | SPCGLFQWMEICEF | 26 |
| 肽-4 | SFCGLFLDLWICEF | 27 |
| 肽-5 | DNCYVIWGFEWQCR | 28 |
| 肽-6 | VNCMRVHRTLTWCV | 29 |
| 肽-7 | FCTPREWSFLNFVC | 30 |
| 肽-8 | CFAYLWIDSWIRVC | 31 |
| 肽-9 | MDWCPRERWVDCFF | 32 |
| 肽-10 | GQHCATSMWRYCMF | 33 |
| 肽-11 | WICDKSGSIMLCRA | 34 |
| 肽-12 | GYCHYWGDMVMWCG | 35 |
| 肽-13 | DNCHYIWGFEWQCG | 36 |
| 肽-14 | IDCIMVHMVKPWCF | 37 |
| 肽-15 | NCQPWYWNMFAFGC | 38 |
| 肽-16 | NCQPWYWNMIAFGC | 39 |
| 肽-17 | GCFTWSQRTFPFTC | 40 |
| 肽-18 | CFYAEYYDQVYSFC | 41 |
| 肽-19 | ADWCPRERWVDCFF | 42 |
| 肽-20 | MAWCPRERWVDCFF | 43 |
| 肽-21 | MDACPRERWVDCFF | 44 |
| 肽-22 | MDWCARERWVDCFF | 45 |
| 肽-23 | MDWCPAERWVDCFF | 46 |
| 肽-24 | MDWCPRARWVDCFF | 47 |
| 肽-25 | MDWCPREAWVDCFF | 48 |
| 肽-26 | MDWCPRERAVDCFF | 49 |
| 肽-27 | MDWCPRERWADCFF | 50 |
| 肽-28 | MDWCPRERWVACFF | 51 |
| 肽-29 | MDWCPRERWVDCAF | 52 |
| 肽-30 | MDWCPRERWVDCFA | 53 |
| 肽-31 | MDWCPIDLWNECFF | 128 |
| 肽-32 | MDWCPIHLWHVCFN | 129 |
| 肽-33 | MDWCPIYLWSECFN | 130 |
| 肽-34 | MNWCPKDIWYLCFN | 131 |
| 肽-35 | MDWCPLHMWHECFS | 132 |
| 肽-36 | MDWCPLYLWNECFN | 133 |
| 肽-37 | MDWCPRDLWDLCFA | 134 |
| 肽-38 | MDWCPRDLWHECFA | 135 |
| 肽-39 | MDWCPRDLWHLCFS | 136 |
| 肽-40 | MDWCPRDLWSECFF | 137 |
| 肽-41 | MDWCPRDLWVHCFA | 138 |
| 肽-42 | MDWCPRDMWDECFA | 139 |
| 肽-43 | MDWCPRDMWSECFA | 140 |
| 肽-44 | MDWCPRDMWSVCFS | 141 |
| 肽-45 | MDWCPRFMWDECFN | 142 |
| 肽-46 | MDWCPRHMWNYCFA | 143 |
| 肽-47 | MDWCPRSLWHECFA | 144 |
| 肽-48 | MDWCPRYLWHVCFA | 145 |
| 肽-49 | MHWCPVDLWYLCYN | 146 |
| 肽-50 | MDWCPVHLWSVCFA | 147 |
| 肽-51 | MDWCPRERWVDCFF | 148 |
在一些實施例中，L
1或L
2為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1或L
2為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1或L
2為具有至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1或L
2為具有至少18個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1或L
2為具有至少26個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1或L
2包含含有(G
2S)
n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。在一些實施例中，L
1或L
2包含含有(G
2S)
n之式，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，L
1或L
2包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，腫瘤特異性蛋白酶係選自由以下組成之群：金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶及天冬胺酸蛋白酶。在一些實施例中，L
1或L
2包含尿激酶可裂解胺基酸序列、間質蛋白酶可裂解胺基酸序列或基質金屬蛋白酶可裂解胺基酸序列。在一些實施例中，L
1或L
2包含根據SEQ ID NO: 18-19、62-88之序列。在一些實施例中，L
1與A
1之N端結合。在一些實施例中，L
1與A
1之C端結合。在一些實施例中，L
2與B之N端結合。在一些實施例中，L
2與B之C端結合。
表 2. L
1 或 L
2
CD28 結合域 (A
1)
、 PD-L1 結合域 (B) 及連接子 (L)
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至C) | SEQ ID NO: |
| 連接子1 | GGGGSGGGGSGGGGS | 18 |
| 連接子2 | GGGGS | 19 |
| 連接子3 | GGGGSGGGS | 62 |
| 可裂解連接子 | GGGGSGGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGS | 63 |
| 連接子4 | GGGGSLSGRSDNHGSSGT | 64 |
| 連接子5 | GGGGSSGGSGGSGLSGRSDNHGSSGT | 65 |
| 連接子6 | ASGRSDNH | 66 |
| 連接子7 | LAGRSDNH | 67 |
| 連接子8 | ISSGLASGRSDNH | 68 |
| 連接子9 | ISSGLLAGRSDNH | 69 |
| 連接子10 | LSGRSDNH | 70 |
| 連接子11 | ISSGLLSGRSDNP | 71 |
| 連接子12 | ISSGLLSGRSDNH | 72 |
| 連接子13 | LSGRSDNHSPLGLAGS | 73 |
| 連接子14 | SPLGLAGSLSGRSDNH | 74 |
| 連接子15 | SPLGLSGRSDNH | 75 |
| 連接子16 | LAGRSDNHSPLGLAGS | 76 |
| 連接子17 | LSGRSDNHVPLSLKMG | 77 |
| 連接子18 | LSGRSDNHVPLSLSMG | 78 |
| 連接子19 | GSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSDNHGSSGT | 79 |
| 連接子20 | GSSGGSGGSGGISSGLLSGRSDNHGGGS | 80 |
| 連接子21 | ASGRSDNH | 81 |
| 連接子22 | LAGRSDNH | 82 |
| 連接子23 | ISSGLASGRSDNH | 83 |
| 連接子24 | LSGRSDAG | 84 |
| 連接子25 | ISSGLLSGRSDAG | 85 |
| 連接子26 | AAGLLAPPGGLSGRSDAG | 86 |
| 連接子27 | SPLGLSGRSDAG | 87 |
| 連接子28 | LSGRSDAGSPLGLAG | 88 |
在一些實施例中，CD28結合域包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab或Fab'。在一些實施例中，CD28結合域包含單鏈可變片段。在一些實施例中，CD28結合域包含單域抗體。在一些實施例中，CD28結合域包含Fab或Fab'。在一些實施例中，PD-L1結合域包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab或Fab'。在一些實施例中，PD-L1結合域包含Fab或Fab'。在一些實施例中，PD-L1結合域包含Fab或Fab'且CD28結合域包含單鏈可變片段。在一些實施例中，包含Fab或Fab'之PD-L1結合域包含含有Fab重鏈可變域之Fab重鏈多肽及含有Fab輕鏈可變域之Fab輕鏈多肽。在一些實施例中，包含單鏈可變片段之CD28結合域包含scFv重鏈可變域及scFv輕鏈可變域。在一些實施例中，連接子將A
1之C端連接至B之N端。在一些實施例中，連接子將A
1之N端連接至B之C端。在一些實施例中，連接子將A
1之C端連接至Fab重鏈多肽之N端。在一些實施例中，連接子將A
1之N端連接至Fab重鏈多肽之C端。在一些實施例中，連接子將A
1之C端連接至Fab輕鏈多肽之N端。在一些實施例中，連接子將A
1之N端連接至Fab輕鏈多肽之C端。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv重鏈可變域。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv重鏈可變域。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之N端。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之C端。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv重鏈可變域之N端。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv重鏈可變域之C端。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之N端。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之C端。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv重鏈可變域之N端。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv重鏈可變域之C端。
在一些實施例中，連接子之長度為至少5個胺基酸。在一些實施例中，連接子之長度不超過30個胺基酸。在一些實施例中，連接子之長度為至少5個胺基酸且不超過30個胺基酸。在一些實施例中，連接子之長度為5個胺基酸。在一些實施例中，連接子之長度為15個胺基酸。在一些實施例中，連接子包含(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，L包含含有(G
2S)
n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 18 (GGGGSGGGGSGGGGS)或SEQ ID NO: 19 (GGGGS)之胺基酸序列。
表 3. 連接子序列
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至C) | SEQ ID NO: |
| 連接子1 | GGGGSGGGGSGGGGS | 18 |
| 連接子2 | GGGGS | 19 |
在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該scFv重鏈可變域之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 1；HC-CDR2：SEQ ID NO: 2；HC-CDR3：SEQ ID NO: 3，且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該scFv輕鏈可變域之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 4；LC-CDR2：SEQ ID NO: 5 (KA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 6，且其中該等CDR包含該等LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，A
1包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中A
1之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 4；LC-CDR2：SEQ ID NO: 5 (KA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 6；其中A
1包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中A
1之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 1；HC-CDR2：SEQ ID NO: 2；HC-CDR3：SEQ ID NO: 3。
表 4. 藉由 IMGT 定義確定的 抗 CD28 重鏈多肽互補決定區 (CDR)
表 5. 藉由 IMGT 定義確定的 抗 CD28 輕鏈多肽互補決定區 (CDR)
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至C) | SEQ ID NO: |
| 抗CD28：HC：CDR1 | GYTFTSYY | 1 |
| 抗CD28：HC：CDR2 | IYPGNVNT | 2 |
| 抗CD28：HC：CDR3 | TRSHYGLDWNFDV | 3 |
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至C) | SEQ ID NO: |
| 抗CD28：LC：CDR1 | QNIYVW | 4 |
| 抗CD28：LC：CDR2 | KA | 5 |
| 抗CD28：LC：CDR3 | QQGQTYPYT | 6 |
在一些實施例中，Fab重鏈可變域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該Fab重鏈可變域之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 10；HC-CDR2：SEQ ID NO: 11；HC-CDR3：SEQ ID NO: 12；且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，Fab輕鏈可變域包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該Fab輕鏈可變域之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 13；LC-CDR2：SEQ ID NO: 14 (DA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 15；且其中該等CDR包含該等LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，B包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中B之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 10；HC-CDR2：SEQ ID NO: 11；HC-CDR3：SEQ ID NO: 12；且其中B包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中B之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 13；LC-CDR2：SEQ ID NO: 14 (DA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 15。
表 6. 藉由 IMGT 定義確定的 抗 PD-L1 重鏈多肽互補決定區 (CDR)
表 7. 藉由 IMGT 定義確定的 抗 PD-L1 輕鏈多肽互補決定區 (CDR)
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至C) | SEQ ID NO: |
| 抗PD-L1 Fab 1：HC：CDR1 | GDTFSTYA | 10 |
| 抗PD-L1 Fab 1：HC：CDR2 | IIPIFGKA | 11 |
| 抗PD-L1 Fab 1：HC：CDR3 | ARKFHFVSGSPFGMDV | 12 |
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至C) | SEQ ID NO: |
| 抗PD-L1 Fab 1：LC：CDR1 | QSVSSY | 13 |
| 抗PD-L1 Fab 1：LC：CDR2 | DA | 14 |
| 抗PD-L1 Fab 1：LC：CDR3 | QQRSNWPT | 15 |
在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含與根據SEQ ID NO: 7之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少75個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含根據SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。
在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含與根據SEQ ID NO: 8之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少75個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含根據SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
在一些實施例中，scFv包含與根據SEQ ID NO: 9之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含SEQ ID NO: 9之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，scFv包含根據SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
表 8. 抗 CD28 輕鏈可變域、重鏈可變域序列及全長序列。 CDR 序列 帶下劃線且使用 IMGT 定義確定 。
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至 C) | SEQ ID NO: |
| 抗CD28：HC | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYY IHWVRQAPGQGLEWIGS IYPGNVNT NYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFC TRSHYGLDWNFDV WGQGTTVTVSS | 7 |
| 抗CD28：LC | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHAS QNIYVW LNWYQQKPGKAPKLLIY KA SNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQGQTYPYT FGGGTKVEIK | 8 |
| 抗CD28 scFv (VH - 連接子1 - VL) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYY IHWVRQAPGQGLEWIGS IYPGNVNT NYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFC TRSHYGLDWNFDV WGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHAS QNIYVW LNWYQQKPGKAPKLLIY KA SNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQGQTYPYT FGGGTKVEIK | 9 |
在一些實施例中，Fab重鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 17之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab重鏈多肽包含SEQ ID NO: 17之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab重鏈多肽包含SEQ ID NO: 17之至少215個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab重鏈多肽包含SEQ ID NO: 17之至少215個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 17之至少215個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，Fab重鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 17之胺基酸序列。
在一些實施例中，Fab輕鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 16之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab輕鏈多肽包含SEQ ID NO: 16之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab輕鏈多肽包含SEQ ID NO: 16之至少200個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab輕鏈多肽包含SEQ ID NO: 16之至少200個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 16之至少200個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，Fab輕鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。
表 9. 抗 PD-L1 Fab 輕鏈 多肽及 Fab 重鏈 多肽序列。 CDR 序列 帶下劃線且使用 IMGT 定義確定
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至 C) | SEQ ID NO: |
| 抗PD-L1 Fab 1：LC | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 16 |
| 抗PD-L1 Fab 1：HC | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 17 |
在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之C端，且其中Fab輕鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列，且連接至scFv輕鏈可變域之C端的Fab重鏈多肽之胺基酸序列包含與根據SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，連接子將Fab重鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之C端，且其中Fab輕鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 20之胺基酸序列，且連接至scFv輕鏈可變域之C端的Fab重鏈多肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之C端，且其中Fab重鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列，且連接至scFv輕鏈可變域之C端的Fab輕鏈多肽之胺基酸序列包含與根據SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，連接子將Fab輕鏈多肽連接至scFv輕鏈可變域之C端，且其中Fab重鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 23之胺基酸序列，且連接至scFv輕鏈可變域之C端的Fab輕鏈多肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。
表 10. 與 CD28 及 PD-L1 結合之抗體
半衰期延長分子 (H
1)
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至 C) | SEQ ID NO: |
| Ab-12 LC PDL1×CD28未掩蔽(Vh) | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 20 |
| Ab-12 HC PDL1×CD28未掩蔽(Vh) 抗CD28 scFv - 連接子2 - 抗PDL1 Fab HC | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 21 |
| Ab-13 LC PDL1×CD28未掩蔽(VL) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 22 |
| Ab-13 HC PDL1×CD28未掩蔽(VL) | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 23 |
| JXA2618 LC PDL1×CD28經掩蔽；不可裂解(Vh) | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 210 |
| JXA2618 HC PDL1×CD28經掩蔽；不可裂解(Vh) | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGMDWCPRDLWVHCFAGGGGSGGGSGGGGSGGASSGAGGSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 211 |
| JXA3777 LC PDL1×CD28經掩蔽；不可裂解(Vh) | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 212 |
| JXA3777 HC PDL1×CD28經掩蔽；不可裂解(Vh) | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFYTAVMGWVRQAPGKGLEWVAAIRWTALTTSYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAARGTLGLFTTADSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGMDWCPRDLWVHCFAGGGGSGGGSGGGGSGGASSGAGGSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 213 |
在一些實施例中，多特異性抗體進一步包含半衰期延長分子(H
1)。在一些實施例中，H
1連接至P
1。在一些實施例中，H
1連接至P
2。在一些實施例中，H
1不阻斷A
1與CD28結合。在一些實施例中，H
1不阻斷B與PD-L1結合。H
1包含連接H
1與P
1或H
1與P
2之連接部分(L
5)。在一些實施例中，半衰期延長分子(H
1)對PD-L1不具有結合親和力。在一些實施例中，半衰期延長分子(H
1)對CD28不具有結合親和力。在一些實施例中，半衰期延長分子(H
1)不會使多特異性抗體隔離CD28。在一些實施例中，H
1包含根據SEQ ID NO: 54-57之序列。在一些實施例中，H
1包含具有重複序列模體之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含具有高度有序二級結構之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含聚合物。在一些實施例中，聚合物為聚乙二醇(PEG)。在一些實施例中，H
1包含白蛋白。在一些實施例中，H
1包含Fc域。在一些實施例中，白蛋白為血清白蛋白。在一些實施例中，白蛋白為人類血清白蛋白。在一些實施例中，H
1包含多肽、配體或小分子。在一些實施例中，多肽、配體或小分子結合血清蛋白或其片段、循環免疫球蛋白或其片段、或CD35/CR1。在一些實施例中，血清蛋白包含甲狀腺素結合蛋白、甲狀腺素運載蛋白、1-酸性醣蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體或其運鐵蛋白結合部分、纖維蛋白原或白蛋白。在一些實施例中，循環免疫球蛋白分子包含IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。在一些實施例中，血清蛋白為白蛋白。在一些實施例中，多肽為抗體。在一些實施例中，抗體包含單域抗體、單鏈可變片段、Fab或Fab'。在一些實施例中，單域抗體包含與白蛋白結合之單域抗體。在一些實施例中，單域抗體為人類或人源化抗體。在一些實施例中，單域抗體係選自由以下組成之群：645gH1gL1、645dsgH5gL4、23-13-A01 -sc02、A10m3或其片段、DOM7r-31、DOM7h-11-15、Alb-1、Alb-8、Alb-23、10G、10E及SA21。在一些實施例中，單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 54，HC-CDR2：SEQ ID NO: 55，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 56；且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，H
1包含根據SEQ ID NO: 57之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。在一些實施例中，經修飾之胺基酸或經修飾之非天然胺基酸包含轉譯後修飾。在一些實施例中，H
1包含連接H
1與P
1或P
2之連接部分(L
5)。在一些實施例中，L
5為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少18個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少26個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。
在一些實施例中，單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 204，HC-CDR2：SEQ ID NO: 205，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 206；且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，H
1包含根據SEQ ID NO: 207之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 207具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 207具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 207具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 207具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 207具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。在一些實施例中，經修飾之胺基酸或經修飾之非天然胺基酸包含轉譯後修飾。在一些實施例中，H
1包含連接H
1與P
1或P
2之連接部分(L
5)。在一些實施例中，L
5為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少18個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少26個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。
表 11. H
1 序列
經腫瘤活化之與 CD28 及 PD-L1 結合之多特異性抗體
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至 C) | SEQ ID NO: |
| 抗白蛋白：CDR-H1 | GSTFYTAV | 54 |
| 抗白蛋白：CDR-H2 | IRWTALTT | 55 |
| 抗白蛋白：CDR-H3 | AARGTLGLFTTADSYDY | 56 |
| 抗白蛋白(HE-1) | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GSTFYTAV MGWVRQAPGKGLEWVAA IRWTALTT SYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYC AARGTLGLFTTADSYDY WGQGTLVTVSS | 57 |
| 抗白蛋白：CDR-H1 | GFTFSKFG | 204 |
| 抗白蛋白：CDR-H2 | ISGSGRDT | 205 |
| 抗白蛋白：CDR-H3 | TIGGSLSV | 206 |
| 抗白蛋白(HE-3) | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAAS GFTFSKFG MSWVRQAPGKGLEWVSS ISGSGRDT LYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYC TIGGSLSV SSQGTLVTVSS | 207 |
在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含SEQ ID NO: 149-170中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149及150具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149及150具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 151及152具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 151及152具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 153及154具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 153及154具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 155及156具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 155及156具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 157及158具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 157及158具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 159及160具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 159及160具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 161及162具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 161及162具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 163及164具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 163及164具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 165及166具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 165及166具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 167及168具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 167及168具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 169及170具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 169及170具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 208及209具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 208及209具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
表 12. 經腫瘤活化之與 CD28 及 PD-L1 結合之多特異性抗體序列。
編碼經腫瘤活化之與 CD28 及 PD-L1 結合之多特異性抗體的多核苷酸
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至 C) | SEQ ID NO: |
| Ab-1 LC | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 149 |
| Ab-1 HC | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGMDWCPRERWVDCFFGGGGSGGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 150 |
| Ab-2 LC | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 151 |
| Ab-2 HC | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGMDWCPRERWVDCFFGSSGGSAAGLLAPPGGLSGRSDAGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 152 |
| Ab-3 LC | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 153 |
| Ab-3 HC | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGMDWCPRERWVDCFFGGGGSGGGSGGGGSGGASSGAGGSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 154 |
| Ab-4 LC | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 155 |
| Ab-4 HC | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGGGSGSSGGASSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGASSGAGGSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 156 |
| Ab-5 LC | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 157 |
| Ab-5 HC | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFYTAVMGWVRQAPGKGLEWVAAIRWTALTTSYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAARGTLGLFTTADSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGMDWCPRERWVDCFFGGGGSGGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 158 |
| Ab-6 LC | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 159 |
| Ab-6 HC | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFYTAVMGWVRQAPGKGLEWVAAIRWTALTTSYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAARGTLGLFTTADSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGMDWCPRERWVDCFFGSSGGSAAGLLAPPGGLSGRSDAGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 160 |
| Ab-7 LC | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 161 |
| Ab-7 HC | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFYTAVMGWVRQAPGKGLEWVAAIRWTALTTSYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAARGTLGLFTTADSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGMDWCPRERWVDCFFGGGGSGGGSGGGGSGGASSGAGGSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 162 |
| Ab-8 LC | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 163 |
| Ab-8 HC | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFYTAVMGWVRQAPGKGLEWVAAIRWTALTTSYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAARGTLGLFTTADSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGMDWCPIYLWSECFNGSSGGSGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 164 |
| Ab-9 LC | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 165 |
| Ab-9 HC | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFYTAVMGWVRQAPGKGLEWVAAIRWTALTTSYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAARGTLGLFTTADSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGMDWCPRDLWVHCFAGSSGGSGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 166 |
| Ab-10 LC | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFYTAVMGWVRQAPGKGLEWVAAIRWTALTTSYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAARGTLGLFTTADSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGMDWCPIYLWSECFNGSSGGSGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 167 |
| Ab-10 HC | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 168 |
| Ab-11 LC | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFYTAVMGWVRQAPGKGLEWVAAIRWTALTTSYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAARGTLGLFTTADSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGMDWCPRDLWVHCFAGSSGGSGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 169 |
| Ab-11 HC | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 170 |
| JXA 2616 LC | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 208 |
| JXA 2616 HC | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGMDWCPRDLWVHCFAGSSGGSGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 209 |
在一些實施例中，本文揭示編碼本文所揭示之多特異性抗體的經分離重組核酸分子。
在一些實施例中，本文揭示編碼根據下式之經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子：
P
1-L
1-A
1-L-B
( 式 I)，其中A
1包含CD28結合域；B包含PD-L1結合域；L包含連接A
1與B之連接子；P
1包含與A
1結合之肽，且L
1包含連接A
1與P
1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文揭示編碼包含下式之經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子：
P
1-L
1-A
1-L-B (
式 I)，其中A
1包含CD28結合域；B包含PD-L1結合域；L包含連接A
1與B之連接子；P
1包含與A
1結合之肽，且L
1包含連接A
1與P
1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文揭示編碼包含下式之經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子：
P
1-L
1-A
1-L-B
( 式 I)，其中A
1為CD28結合域；B為PD-L1結合域；L為連接A
1與B之連接子；P
1為與A
1結合之肽，且L
1為連接A
1與P
1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文揭示編碼根據下式之經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子：
P
1-L
1-A
1-L-B
( 式 I)，其中A
1為CD28結合域；B為PD-L1結合域；L為連接A
1與B之連接子；P
1為與A
1結合之肽，且L
1為連接A
1與P
1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
在一些實施例中，為編碼根據下式之經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子：
P
1-L
1-A
1-L-B-L
2-P
2 ( 式 Ia)，其中P
2包含與B結合之肽，且L
2包含連接B與P
2之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
在一些實施例中，為編碼包含下式之經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子：
P
1-L
1-A
1-L-B-L
2-P
2 ( 式 Ia)，其中P
2包含與B結合之肽，且L
2包含連接B與P
2之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
在一些實施例中，為編碼包含下式之經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子：
P
1-L
1-A
1-L-B-L
2-P
2 ( 式 Ia)，其中P
2為與B結合之肽，且L
2為連接B與P
2之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
在一些實施例中，為編碼根據下式之經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子：
P
1-L
1-A
1-L-B-L
2-P
2 ( 式 Ia)，其中P
2為與B結合之肽，且L
2為連接B與P
2之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
在一些實施例中，本文揭示編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含SEQ ID NO: 149-170中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149及150具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 149及150具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 151及152具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 151及152具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 153及154具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 153及154具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 155及156具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 155及156具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 157及158具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 157及158具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 159及160具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 159及160具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 161及162具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 161及162具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 163及164具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 163及164具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 165及166具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 165及166具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 167及168具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 167及168具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 169及170具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 169及170具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 208及209具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，為編碼經分離多特異性抗體的經分離重組核酸分子，該抗體包含與SEQ ID NO: 208及209具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
醫藥組合物
在一些實施例中，本文揭示醫藥組合物，其包含：(a)如本文所揭示之多特異性抗體；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)根據下式之經分離多特異性抗體：
P
1-L
1-A
1-L-B
( 式 I)，其中A
1包含CD28結合域；B包含PD-L1結合域；L包含連接A
1與B之連接子；P
1包含與A
1結合之肽，且L
1包含連接A
1與P
1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)包含下式之經分離多特異性抗體：
P
1-L
1-A
1-L-B
( 式 I)，其中A
1包含CD28結合域；B包含PD-L1結合域；L包含連接A
1與B之連接子；P
1包含與A
1結合之肽，且L
1包含連接A
1與P
1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)包含下式之經分離多特異性抗體：
P
1-L
1-A
1-L-B
( 式 I)，其中A
1為CD28結合域；B為PD-L1結合域；L為連接A
1與B之連接子；P
1為與A
1結合之肽，且L
1為連接A
1與P
1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)根據下式之經分離多特異性抗體：
P
1-L
1-A
1-L-B
( 式 I)，其中A
1為CD28結合域；B為PD-L1結合域；L為連接A
1與B之連接子；P
1為與A
1結合之肽，且L
1為連接A
1與P
1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)根據下式之經分離多特異性抗體：
P
1-L
1-A
1-L-B-L
2-P
2 ( 式 Ia)，其中P
2包含與B結合之肽，且L
2包含連接B與P
2之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)包含下式之經分離多特異性抗體：
P
1-L
1-A
1-L-B-L
2-P
2 ( 式 Ia)，其中P
2包含與B結合之肽，且L
2包含連接B與P
2之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)包含下式之經分離多特異性抗體：
P
1-L
1-A
1-L-B-L
2-P
2 ( 式 Ia)，其中P
2為與B結合之肽，且L
2為連接B與P
2之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)根據下式之經分離多特異性抗體：
P
1-L
1-A
1-L-B-L
2-P
2 ( 式 Ia)，其中P
2為與B結合之肽，且L
2為連接B與P
2之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少80%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少85%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少90%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 149-170中之任一者具有至少99%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含SEQ ID NO: 149-170中之任一者之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 149及150具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 149及150具有至少99%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 151及152具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 151及152具有至少99%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 153及154具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 153及154具有至少99%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 155及156具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 155及156具有至少99%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 157及158具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 157及158具有至少99%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 159及160具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 159及160具有至少99%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 161及162具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 161及162具有至少99%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 163及164具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 163及164具有至少99%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 165及166具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 165及166具有至少99%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 167及168具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 167及168具有至少99%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 169及170具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 169及170具有至少99%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 208及209具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)經分離多特異性抗體，其包含與SEQ ID NO: 208及209具有至少99%序列一致性之胺基酸序列；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
本文揭示醫藥組合物，其包含：(a)本文所述之經分離多特異性抗體，(b)抗癌療法，及(c)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，抗癌療法包含小分子、基於細胞之療法或基於抗體之療法。
在一些實施例中，基於抗體之療法為T細胞接合子。在一些實施例中，T細胞接合子包含根據以下之式：D
1-L
0-E
1(式II)，其中D
1包含與效應細胞抗原結合之效應細胞結合域，E
1包含與腫瘤抗原結合之腫瘤抗原結合域，且L
0包含連接D
1與E
1之連接子。在一些實施例中，D
1包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab片段或Fab'。在一些實施例中，D
1包含單鏈可變片段。在一些實施例中，E
1包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab片段或Fab'。在一些實施例中，E
1包含Fab片段。在一些實施例中，效應細胞抗原包含CD3。在一些實施例中，效應細胞結合域包含選自由以下組成之群的互補決定區(CDR)：莫羅單抗-CD3 (OKT3)、奧昔組單抗(TRX4)、替利組單抗(MGA031)、維西珠單抗(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030 (BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、15865、15865v12、15865v16及15865v19。在一些實施例中，效應細胞結合域包含根據SEQ ID NO: 89-101之胺基酸序列。
表 13. 效應細胞結合域胺基酸序列
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至 C) | SEQ ID NO: |
| SP34.185 CD3：HC：CDR1 | GFTFNKYA | 89 |
| SP34.185 CD3：HC：CDR2 | IRSKYNNYAT | 90 |
| SP34.185 CD3：HC：CDR3 | VRHGNFGNSYISYWAY | 91 |
| SP34.185 CD3：LC：CDR1 | TGAVTSGNY | 92 |
| SP34.185 CD3：LC：CDR2 | GTK | 93 |
| SP34.185 CD3：LC：CDR3 | VLWYSNRWV | 94 |
| SP34.194 CD3：HC：CDR1 | GFTFNTYA | 95 |
| SP34.194 CD3：HC：CDR2 | IRSKYNNYAT | 90 |
| SP34.194 CD3：HC：CDR3 | VRHGNFGNSYVSWFAY | 96 |
| SP34.194 CD3：LC：CDR1 | TGAVTTSNY | 97 |
| SP34.194 CD3：LC：CDR2 | GT | 98 |
| SP34.194 CD3：LC：CDR3 | ALWYSNLWV | 99 |
| SP34.185 scFv (VH - 連接子1 - VL) | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAAS GFTFNKYA MNWVRQAPGKGLEWVAR IRSKYNNYAT YYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYC VRHGNFGNSYISYWAY WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSS TGAVTSGNY PNWVQQKPGQAPRGLIG GTK FLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYC VLWYSNRWV FGGGTKLTVL | 100 |
| SP34.194 scFv (VL - 連接子1 - VH) | QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSS TGAVTTSNY ANWVQQKPGQAPRGLIG GT NKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYC ALWYSNLWV FGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAAS GFTFNTYA MNWVRQAPGKGLEWVAR IRSKYNNYAT YYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYC VRHGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS | 101 |
| SP34.185肽掩蔽物(P 3) | GSQCLGPEWEVCPY | 177 |
| SP34.185肽掩蔽物(P 3) | VYCGPEFDESVGCM | 178 |
| SP34.185肽掩蔽物(P 3) | VYCGPEFDESVGCA | 179 |
| SP34.185肽掩蔽物(P 3) | YLCGPDGDETLACY | 180 |
在一些實施例中，腫瘤抗原包含表皮生長因子受體(EGFR)、***特異性膜抗原(PSMA)或腫瘤相關鈣信號轉導子2 (下文稱為TROP2)。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR。在一些實施例中，腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 102-111之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 105；HC-CDR2：SEQ ID NO: 106；HC-CDR3：SEQ ID NO: 107；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 102；LC-CDR2：SEQ ID NO: 103 (YAS)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 104。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 181及182具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 181及182之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 214及215具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 214及215之胺基酸序列。
表
14.
腫瘤抗原結合域胺基酸序列
-
抗
EGFR
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至 C) | SEQ ID NO: |
| EGFR：LC：CDR1 | QSIGTN | 102 |
| EGFR：LC：CDR2 | YAS | 103 |
| EGFR：LC：CDR3 | QQNNNWPTT | 104 |
| EGFR：HC：CDR1 | GFSLTNYG | 105 |
| EGFR：HC：CDR2 | IWSGGNT | 106 |
| EGFR：HC：CDR3 | ARALTYYDYEFAY | 107 |
| EGFR Fab LC v1 | QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRAS QSIGTN IHWYQQRTNGSPRLLIK YAS ESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC QQNNNWPTT FGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 108 |
| EGFR Fab LC v2 | DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRAS QSIGTN IHWYQQRTNGSPRLLIK YAS ESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC QQNNNWPTT FGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 109 |
| EGFR Fab HC | QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVS GFSLTNYG VHWVRQSPGKGLEWLGV IWSGGNT DYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYC ARALTYYDYEFAY WGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 110 |
| EGFR Fab HC (N88Q) | QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVS GFSLTNYG VHWVRQSPGKGLEWLGV IWSGGNT DYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYC ARALTYYDYEFAY WGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 111 |
| EGFR TCE-1 LC, | QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 181 |
| EGFR TCE-1 HC | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 182 |
| EGFR TCE-2 LC JXA2212 | QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 214 |
| EGFR TCE-2 HC JXA2212 | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 215 |
| EGFR TRACTr-1 LC, | GGPCRSHIDVAKPICVGGGGSGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGSDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 183 |
| EGFR TRACTr-1 HC, | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFYTAVMGWVRQAPGKGLEWVAAIRWTALTTSYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAARGTLGLFTTADSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGVYCGPEFDESVGCMGGGGSGGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 184 |
| EGFR TRACTr-1肽掩蔽物(P 4) | PCRSHIDVAKPICV | 185 |
| EGFR TRACTr-2肽掩蔽物(P 4), | PCLFHFDPAKPICS | 186 |
在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 112；HC-CDR2：SEQ ID NO: 113；HC-CDR3：SEQ ID NO: 114；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 115；LC-CDR2：SEQ ID NO: 116 (SAS)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 117。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 187-192具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 187-192中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 112-119之胺基酸序列。
表 15. 腫瘤抗原結合域胺基酸序列 - 抗 TROP2
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至 C) | SEQ ID NO: |
| TROP2：HC：CDR1 | GYTFTNYG | 112 |
| TROP2：HC：CDR2 | INTYTGEP | 113 |
| TROP2：HC：CDR3 | ARGGFGSSYWYFDV | 114 |
| TROP2：LC：CDR1 | QDVSIA | 115 |
| TROP2：LC：CDR2 | SAS | 116 |
| TROP2：LC：CDR3 | QQHYITPLT | 117 |
| TROP2 Fab LC | DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKAS QDVSIA VAWYQQKPGKAPKLLIY SAS YRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYC QQHYITPLT FGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 118 |
| TROP2 Fab HC | QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYG MNWVKQAPGQGLKWMGW INTYTGEP TYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFC ARGGFGSSYWYFDV WGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 119 |
| TROP2 TCE-1 LC | DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 187 |
| TROP2 TCE-1 HC | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSQVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 188 |
| TROP2 TCE-2 LC | DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 189 |
| TROP2 TCE-2 HC | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSQVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYADVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 190 |
| TROP2 TCE-3 LC | DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 191 |
| TROP2 TCE-3 HC | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSQVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFAVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 192 |
| TROP2 TRACTr-1 LC | GGIDFCMLYNWPICAGGGGGSGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 193 |
| TROP2 TRACTr-1 HC | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFYTAVMGWVRQAPGKGLEWVAAIRWTALTTSYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAARGTLGLFTTADSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGVYCGPEFDESVGCMGGGGSGGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSQVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 194 |
| TROP2 TRACTr-2 LC | GGVDFCGLYHWPICYQGGGGSGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 195 |
| TROP2 TRACTr-2 HC | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFYTAVMGWVRQAPGKGLEWVAAIRWTALTTSYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAARGTLGLFTTADSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGVYCGPEFDESVGCMGGGGSGGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSQVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFAVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 196 |
| TROP2 TRACTr-3 LC | GGVDFCALYHWPICYQGGGGSGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 197 |
| TROP2 TRACTr-3 HC | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFYTAVMGWVRQAPGKGLEWVAAIRWTALTTSYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAARGTLGLFTTADSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGVYCGPEFDESVGCMGGGGSGGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSQVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYADVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 198 |
| TROP2 TRACTr-4 LC JXA2388 | GGIDFCMLYNWPICAGGGGGSGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 216 |
| TROP2 TRACTr-4 HC JXA2388 | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGVYCGPEFDESVGCMGGGGSGGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSQVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 217 |
| TROP2 TRACTr-5 LC JXA2389 | GGIDFCMLYNWPICAGGGGGSGGGGGSGGGGSGGASSGAGGSGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 218 |
| TROP2 TRACTr-5 HC JXA2389 | EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGVYCGPEFDESVGCMGGGGSGGGSGGGGSGGASSGAGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSQVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 219 |
| TROP2 TRACTr-1肽掩蔽物(P 4) | IDFCMLYNWPICA | 199 |
| TROP2 TRACTr-2肽掩蔽物(P 4) | VDFCGLYHWPICYQ | 200 |
| TROP2 TRACTr-2肽掩蔽物(P 4) | VDFCALYHWPICYQ | 201 |
在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA。在一些實施例中，腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 120-127之胺基酸序列。
在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 120；HC-CDR2：SEQ ID NO: 121；HC-CDR3：SEQ ID NO: 122；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 123；LC-CDR2：SEQ ID NO: 124 (EA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 125。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 173及174具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 173及174之胺基酸序列。
表 16. 腫瘤抗原結合域胺基酸序列 - 抗 PSMA
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至 C) | SEQ ID NO: |
| PSMA：HC：CDR1 | GFAFSRYG | 120 |
| PSMA：HC：CDR2 | IWYDGSNK | 121 |
| PSMA：HC：CDR3 | ARGGDFLYYYYYGMDV | 122 |
| PSMA：LC：CDR1 | QGISNY | 123 |
| PSMA：LC：CDR2 | EA | 124 |
| PSMA：LC：CDR3 | QNYNSAPFT | 125 |
| 006 PSMA Fab LC | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QGISNY LAWYQQKTGKVPKFLIY EA STLQSGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC QNYNSAPFT FGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 126 |
| 006 PSMA Fab HC | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFAFSRYG MHWVRQAPGKGLEWVAV IWYDGSNK YYADSVKGRFTISRDNSKNTQYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGGDFLYYYYYGMDV WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 127 |
| PSMA TCE-1 LC | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKTGKVPKFLIYEASTLQSGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQNYNSAPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 173 |
| PSMA TCE-1 HC | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTQYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDFLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 174 |
| PSMA TRACTr-1 LC | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFYTAVMGWVRQAPGKGLEWVAAIRWTALTTSYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAARGTLGLFTTADSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGVYCGPEFDESVGCMGGGGSGGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKTGKVPKFLIYEASTLQSGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQNYNSAPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 175 |
| PSMA TRACTr-1 HC | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTQYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDFLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 176 |
在一些實施例中，T細胞接合分子在腫瘤微環境中選擇性活化。在一些實施例中，T細胞接合子係根據以下子式：P
3-L
3-D
1-L
0-E
1(式IIa)，其中D
1包含CD3結合域；E
1包含腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之連接子；P
3包含與D
1結合之肽，且L
3包含連接D
1與P
3之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
在一些實施例中，T細胞接合子係根據以下子式：D
1-L
0-E
1-L
4-P
4(式IIb)，其中D
1包含CD3結合域；E
1包含腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之連接子；P
4包含與E
1結合之肽，且L
4包含連接E
1與P
4之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
在一些實施例中，T細胞接合子係根據以下子式：P
3-L
3-D
1-L
0-E
1-L
4-P
4(式IIc)，其中D
1包含CD3結合域；E
1包含腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之連接子；P
3包含與D
1結合之肽，且L
3包含連接D
1與P
3之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質；P
4包含與E
1結合之肽，且L
4包含連接E
1與P
4之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
在一些實施例中，T細胞接合子包含H
1。在一些實施例中，H
1包含根據SEQ ID NO: 54-57之序列。在一些實施例中，H
1包含單域抗體。
在一些實施例中，單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 54，HC-CDR2：SEQ ID NO: 55，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 56。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少18個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少26個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4包含含有(G
2S)
n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。在一些實施例中，L
3或L
4包含含有(G
2S)
n之式，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，L
3或L
4包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，腫瘤特異性蛋白酶係選自由以下組成之群：金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶及天冬胺酸蛋白酶。
在一些實施例中，L
3或L
4包含尿激酶可裂解胺基酸序列、間質蛋白酶可裂解胺基酸序列或基質金屬蛋白酶可裂解胺基酸序列。在一些實施例中，L
3或L
4包含根據SEQ ID NO: 18-19、62-88之序列。在一些實施例中，L
3與D
1之N端結合。在一些實施例中，L
3與D
1之C端結合。在一些實施例中，L
4與E
1之N端結合。在一些實施例中，L
4與E
1之C端結合。
在一些實施例中，當L
3由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
3變得與D
1不再結合，從而使D
1暴露於CD3。在一些實施例中，當L
4由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
4變得與E
1不再結合，從而使E
1暴露於腫瘤抗原。在一些實施例中，P
3削弱D
1與CD3之結合。在一些實施例中，P
3經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與D
1結合。在一些實施例中，P
3在抗原結合位點處或附近與D
1結合。在一些實施例中，當L
3由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
3變得與D
1不再結合，從而使D
1暴露於CD3。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於70%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於85%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於90%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於95%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於98%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於99%。在一些實施例中，P
3包含根據SEQ ID NO: 177-180之胺基酸序列。在一些實施例中，P
3包含與CD3共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。在一些實施例中，P
4削弱E
1與腫瘤抗原之結合。在一些實施例中，P
4經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與E
1結合。在一些實施例中，P
4在抗原結合位點處或附近與E
1結合。在一些實施例中，當L
4由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
4變得與E
1不再結合，從而使E
1暴露於腫瘤抗原。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於70%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於80%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於85%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於90%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於95%。在一些實施例中，P
4包含與腫瘤抗原共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少5個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少6個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少10個胺基酸且長度不超過20個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少16個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度不超過40個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含至少兩個半胱胺酸胺基酸殘基。在一些實施例中，P
3或P
4包含環狀肽或線性肽。在一些實施例中，P
3或P
4包含環狀肽。在一些實施例中，P
3或P
4包含線性肽。在一些實施例中，P
4包含根據SEQ ID NO: 185或186之胺基酸序列。
在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含SEQ ID NO: 183及184之胺基酸序列。在一些實施例中，P
4包含根據SEQ ID NO: 199-201之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且T細胞接合子包含SEQ ID NO: 193-198之胺基酸序列中之任一者。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且T細胞接合子包含SEQ ID NO: 175及176之胺基酸序列。
在一些實施例中，多特異性抗體進一步包含可偵測標記、治療劑或藥物動力學修飾部分。在一些實施例中，可偵測標記包含螢光標記、放射性標記、酶、核酸探針或對比劑。
為了向個體投與，如本文所揭示之多特異性抗體可與一或多種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑一起以醫藥組合物形式提供。術語「醫藥學上可接受之載劑」包括但不限於不干擾成分之生物活性的有效性且對其所投與之患者無毒性的任何載劑。適合的醫藥載劑之實例為此項技術中眾所周知的，且包括磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)、各種類型之潤濕劑、無菌溶液等。此類載劑可藉由習知方法調配且可以適合之劑量向個體投與。較佳地，組合物為無菌的。此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、乳化劑及分散劑。可藉由包括各種抗細菌劑及抗真菌劑來確保防止微生物之作用。
醫藥組合物可呈任何適合形式(取決於所需投與方法)。其可以單位劑型提供，可提供於密封容器中且可作為套組之一部分提供。此類套組可包括使用說明書。其可包括複數個該等單位劑型。
醫藥組合物可經調適以藉由任何適當途徑，包括非經腸(例如皮下、肌肉內或靜脈內)途徑投與。此類組合物可藉由藥學技術中已知之任何方法製備，例如藉由在無菌條件下混合活性成分與載劑或賦形劑。
本發明之物質之劑量可在寬限度之間變化，視待治療之疾病或病症、待治療之個體之年齡及病況等而定，且醫師將最終確定待使用之適當劑量。
連接至削弱與 CD28 之 結合的肽的 CD28 結合域
本文揭示經分離多肽或多肽複合物，其包含CD28結合域，該結合域連接至削弱CD28結合域與CD28之結合的肽，其中該肽包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 42-53中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 42-53中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 42-53中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 128-147中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 128-147中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 128-147中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，肽包含根據X
1-X
2-X
3-C-X
4-X
5-X
6-X
7-X
8-X
9-X
10-C-X
11-X
12之胺基酸序列，其中X
1係選自M、I、L及V；X
2係選自D、H、N、A、F、S、T、Y及V；X
3係選自W、L及F；X
4係選自P、A及L；X
5係選自R、T、I、M、S、K、L、V、W、F、A、P及D；X
6係選自E、D、Y、H、S、F、A、N、T、I、P及V；X
7係選自L、M、R、S、Q及H；X
8係選自W及Q；X
9係選自H、N、D、A、S、Y、T、F、V、L及I；X
10係選自E、V、L、D、Y、R、Q、H、F、K、A、M及N；X
11係選自F、Y、L、W及V；且X
12係選自N、A、F、S、Y、H、D、T及L。在一些實施例中，X
1係選自M、I及L；X
2係選自D、H、N及A；X
3為W；X
4為P；X
5係選自R、T、I、M、S及K；X
6係選自E、D、Y、H、S及F；X
7係選自L、M及R；X
8為W；X
9係選自H、N、D、A、S及V；X
10係選自E、V、L、D及H；X
11係選自F、Y及L；且X
12係選自N、A、F、S及Y。在一些實施例中，X
1為M；X
2係選自D及H；X
3為W；X
4為P；X
5係選自R、T及I；X
6係選自E、D及Y；X
7係選自L、M及R；X
8為W；X
9係選自H、N、D及V；X
10係選自E、V、L、D及H；X
11為F；且X
12係選自N、A及F。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 32具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 138之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 138具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含根據SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
在一些實施例中，CD28結合域包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab或Fab'。在一些實施例中，CD28結合域包含單鏈可變片段。在一些實施例中，CD28結合域包含單域抗體。在一些實施例中，CD28結合域包含Fab或Fab'。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該scFv重鏈可變域之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 1；HC-CDR2：SEQ ID NO: 2；HC-CDR3：SEQ ID NO: 3，且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該scFv輕鏈可變域之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 4；LC-CDR2：SEQ ID NO: 5 (KA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 6，且其中該等CDR包含該等LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含與根據SEQ ID NO: 7之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少75個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，scFv重鏈可變域包含根據SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含與根據SEQ ID NO: 8之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少75個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，scFv輕鏈可變域包含根據SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含與根據SEQ ID NO: 9之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含SEQ ID NO: 9之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv包含SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，scFv包含根據SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
在一些實施例中，CD28結合域經由連接部分(L
1)連接至肽。在一些實施例中，L
1為腫瘤特異性蛋白酶之受質。在一些實施例中，L
1為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1為具有至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1為具有至少18個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1為具有至少26個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
1包含含有(G
2S)
n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。在一些實施例中，L
1包含含有(G
2S)
n之式，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，L
1包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，腫瘤特異性蛋白酶係選自由以下組成之群：金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶及天冬胺酸蛋白酶。在一些實施例中，L
1包含尿激酶可裂解胺基酸序列、間質蛋白酶可裂解胺基酸序列或基質金屬蛋白酶可裂解胺基酸序列。在一些實施例中，L
1包含根據SEQ ID NO: 18-19、62-88之序列。在一些實施例中，L
1與A
1之N端結合。在一些實施例中，L
1與A
1之C端結合。在一些實施例中，當L
1由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
1變得與A
1不再結合，從而使A
1暴露於CD28。在一些實施例中，L
1包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。在一些實施例中，經修飾之胺基酸或經修飾之非天然胺基酸包含轉譯後修飾。
在一些實施例中，經分離多肽或多肽複合物進一步包含半衰期延長分子(H
1)。在一些實施例中，H
1連接至肽。在一些實施例中，H
1不阻斷CD28結合域與CD28結合。在一些實施例中，H
1包含連接H
1與肽之連接部分(L
5)。在一些實施例中，半衰期延長分子(H
1)對CD28不具有結合親和力。在一些實施例中，半衰期延長分子(H
1)不會使經分離多肽或多肽複合物隔離CD28。在一些實施例中，H
1包含根據SEQ ID NO: 54-57之序列。在一些實施例中，H
1包含具有重複序列模體之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含具有高度有序二級結構之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含聚合物。在一些實施例中，聚合物為聚乙二醇(PEG)。在一些實施例中，H
1包含白蛋白。在一些實施例中，H
1包含Fc域。在一些實施例中，白蛋白為血清白蛋白。在一些實施例中，白蛋白為人類血清白蛋白。在一些實施例中，H
1包含多肽、配體或小分子。在一些實施例中，多肽、配體或小分子結合血清蛋白或其片段、循環免疫球蛋白或其片段、或CD35/CR1。在一些實施例中，血清蛋白包含甲狀腺素結合蛋白、甲狀腺素運載蛋白、1-酸性醣蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體或其運鐵蛋白結合部分、纖維蛋白原或白蛋白。在一些實施例中，循環免疫球蛋白分子包含IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。在一些實施例中，血清蛋白為白蛋白。在一些實施例中，多肽為抗體。在一些實施例中，抗體包含單域抗體、單鏈可變片段、Fab或Fab'。在一些實施例中，單域抗體包含與白蛋白結合之單域抗體。在一些實施例中，單域抗體為人類或人源化抗體。在一些實施例中，單域抗體係選自由以下組成之群：645gH1gL1、645dsgH5gL4、23-13-A01 -sc02、A10m3或其片段、DOM7r-31、DOM7h-11-15、Alb-1、Alb-8、Alb-23、10G、10E及SA21。在一些實施例中，單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 54，HC-CDR2：SEQ ID NO: 55，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 56；且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。在一些實施例中，H
1包含根據SEQ ID NO: 57之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，H
1包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。在一些實施例中，經修飾之胺基酸或經修飾之非天然胺基酸包含轉譯後修飾。在一些實施例中，H
1包含連接H
1與P
1或P
2之連接部分(L
5)。在一些實施例中，L
5為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少18個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5為具有至少26個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
5包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。
治療方法
本文揭示治療有需要之個體之癌症的方法，其包含向該個體投與本文所述之實施例中之任一者的多特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體誘導T細胞介導之腫瘤細胞的細胞毒性。在一些實施例中，癌症為惡性血液病。在一些實施例中，癌症為白血病或淋巴瘤。在一些實施例中，癌症為淋巴瘤，且其中該淋巴瘤為B細胞淋巴瘤。在一些實施例中，癌症為實體腫瘤。在一些實施例中，實體腫瘤表現PD-L1。在一些實施例中，實體腫瘤為肉瘤、乳癌、肺癌或癌瘤。在一些實施例中，實體腫瘤為肺癌，且其中該肺癌為非小細胞肺癌。在一些實施例中，多特異性抗體與抗癌療法組合投與。在一些實施例中，多特異性抗體及抗癌療法在同一醫藥組合物中投與。在一些實施例中，多特異性抗體及抗癌療法作為單獨的醫藥組合物投與。在一些實施例中，個體難以用檢查點抑制劑療法治療。在一些實施例中，個體已自檢查點抑制劑療法復發。在一些實施例中，抗癌療法包含小分子、基於細胞之療法或基於抗體之療法。
在一些實施例中，與在投與多特異性抗體之前自個體獲取之癌症基線量測結果相比，向個體投與多特異性抗體足以減少或消除癌症。在一些實施例中，減少至少約1倍、5倍、10倍、20倍、40倍、60倍、80倍，或高達約100倍。
在一些實施例中，基於抗體之療法為T細胞接合子。在一些實施例中，T細胞接合子包含根據以下之式：D
1-L
0-E
1(式II)，其中D
1包含與效應細胞抗原結合之效應細胞結合域，E
1包含與腫瘤抗原結合之腫瘤抗原結合域，且L
0包含連接D
1與E
1之連接子。在一些實施例中，D
1包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab片段或Fab'。在一些實施例中，D
1包含單鏈可變片段。在一些實施例中，E
1包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab片段或Fab'。在一些實施例中，E
1包含Fab片段。在一些實施例中，效應細胞結合域包含選自由以下組成之群的互補決定區(CDR)：莫羅單抗-CD3 (OKT3)、奧昔組單抗(TRX4)、替利組單抗(MGA031)、維西珠單抗(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030 (BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、15865、15865v12、15865v16及15865v19。在一些實施例中，效應細胞結合域包含根據SEQ ID NO: 89-101之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含表皮生長因子受體(EGFR)、***特異性膜抗原(PSMA)或腫瘤相關鈣信號轉導子2 (下文稱為TROP2)。
在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR。在一些實施例中，腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 102-111之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 105；HC-CDR2：SEQ ID NO: 106；HC-CDR3：SEQ ID NO: 107；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 102；LC-CDR2：SEQ ID NO: 103 (YAS)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 104。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 181及182具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 181及182之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 214及215具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 214及215之胺基酸序列。在一些實施例中，癌症為結腸直腸癌(CRC)、頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、非小細胞肺癌(NSCLC)、***癌、乳癌、結腸/直腸癌、頭頸癌、食道胃癌、肝癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌、腎癌或胰臟癌。
在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 112；HC-CDR2：SEQ ID NO: 113；HC-CDR3：SEQ ID NO: 114；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 115；LC-CDR2：SEQ ID NO: 116 (SAS)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 117。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 187-192具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 187-192中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 112-119之胺基酸序列。在一些實施例中，癌症為肺癌、乳癌(例如HER2+；ER/PR+；TNBC)、子宮頸癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胰臟癌、胃癌、三陰性乳癌(TNBC)、尿道上皮癌(UC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、胃癌、食道癌、頭頸癌、***癌或子宮內膜癌。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA。在一些實施例中，腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 120-127之胺基酸序列。
在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 120；HC-CDR2：SEQ ID NO: 121；HC-CDR3：SEQ ID NO: 122；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 123；LC-CDR2：SEQ ID NO: 124 (EA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 125。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 173及174具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 173及174之胺基酸序列。在一些實施例中，癌症為肺癌、乳癌(例如HER2+；ER/PR+；TNBC)、子宮頸癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胰臟癌或胃癌。
在一些實施例中，T細胞接合分子在腫瘤微環境中選擇性活化。在一些實施例中，T細胞接合子係根據以下子式：P
3-L
3-D
1-L
0-E
1(式IIa)，其中D
1包含CD3結合域；E
1包含腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之連接子；P
3包含與D
1結合之肽，且L
3包含連接D
1與P
3之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。在一些實施例中，T細胞接合子係根據以下子式：D
1-L
0-E
1-L
4-P
4(式IIb)，其中D
1包含CD3結合域；E
1包含腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之連接子；P
4包含與E
1結合之肽，且L
4包含連接E
1與P
4之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。在一些實施例中，T細胞接合子係根據以下子式：P
3-L
3-D
1-L
0-E
1-L
4-P
4(式IIc)，其中D
1包含CD3結合域；E
1包含腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之連接子；P
3包含與D
1結合之肽，且L
3包含連接D
1與P
3之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質；P
4包含與E
1結合之肽，且L
4包含連接E
1與P
4之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
在一些實施例中，T細胞接合子包含H
1。在一些實施例中，H
1包含根據SEQ ID NO: 54-57之序列。在一些實施例中，H
1包含單域抗體。在一些實施例中，單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 54，HC-CDR2：SEQ ID NO: 55，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 56。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少18個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4為具有至少26個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，L
3或L
4包含含有(G
2S)
n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。在一些實施例中，L
3或L
4包含含有(G
2S)
n之式，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，L
3或L
4包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。在一些實施例中，腫瘤特異性蛋白酶係選自由以下組成之群：金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶及天冬胺酸蛋白酶。在一些實施例中，L
3或L
4包含尿激酶可裂解胺基酸序列、間質蛋白酶可裂解胺基酸序列或基質金屬蛋白酶可裂解胺基酸序列。在一些實施例中，L
3或L
4包含根據SEQ ID NO: 18-19、62-88之序列。在一些實施例中，L
3與D
1之N端結合。在一些實施例中，L
3與D
1之C端結合。在一些實施例中，L
4與E
1之N端結合。在一些實施例中，L
4與E
1之C端結合。在一些實施例中，當L
3由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
3變得與D
1不再結合，從而使D
1暴露於CD3。在一些實施例中，當L
4由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
4變得與E
1不再結合，從而使E
1暴露於腫瘤抗原。在一些實施例中，P
3削弱D
1與CD3之結合。在一些實施例中，P
3經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與D
1結合。在一些實施例中，P
3在抗原結合位點處或附近與D
1結合。在一些實施例中，當L
3由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
3變得與D
1不再結合，從而使D
1暴露於CD3。
在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於70%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於85%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於90%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於95%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於98%。在一些實施例中，P
3與CD3之序列一致性小於99%。在一些實施例中，P
3包含根據SEQ ID NO: 177-180之胺基酸序列。在一些實施例中，P
3包含與CD3共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。
在一些實施例中，P
4削弱E
1與腫瘤抗原之結合。在一些實施例中，P
4經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與E
1結合。在一些實施例中，P
4在抗原結合位點處或附近與E
1結合。在一些實施例中，當L
4由腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
4變得與E
1不再結合，從而使E
1暴露於腫瘤抗原。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於70%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於80%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於85%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於90%。在一些實施例中，P
4與腫瘤抗原之序列一致性小於95%。在一些實施例中，P
4包含與腫瘤抗原共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少5個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少6個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少10個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少10個胺基酸且長度不超過20個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度為至少16個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含長度不超過40個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，P
3或P
4包含至少兩個半胱胺酸胺基酸殘基。在一些實施例中，P
3或P
4包含環狀肽或線性肽。在一些實施例中，P
3或P
4包含環狀肽。在一些實施例中，P
3或P
4包含線性肽。在一些實施例中，P
4包含根據SEQ ID NO: 185或186之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR，且T細胞接合子包含SEQ ID NO: 183及184之胺基酸序列。在一些實施例中，P
4包含根據SEQ ID NO: 199-201之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2，且T細胞接合子包含SEQ ID NO: 193-198之胺基酸序列中之任一者。在一些實施例中，腫瘤抗原包含PSMA，且T細胞接合子包含SEQ ID NO: 175及176之胺基酸序列。
抗體之產生
在一些實施例中，本文所述之多肽(例如抗體及其結合片段)係使用此項技術中已知可用於合成多肽(例如抗體)之任何方法產生，特別是藉由化學合成或藉由重組表現，且較佳藉由重組表現技術產生。
在一些情況下，抗體或其結合片段以重組方式表現，且編碼抗體或其結合片段之核酸係由化學合成之寡核苷酸組裝而成(例如，如Kutmeier等人, 1994, BioTechniques 17:242中所述)，其涉及合成含有編碼抗體之序列部分的重疊寡核苷酸，黏接且連接彼等寡核苷酸，且隨後藉由PCR擴增連接的寡核苷酸。
或者，編碼抗體之核酸分子視情況由適合的來源(例如抗體cDNA庫，或由表現免疫球蛋白之任何組織或細胞產生之cDNA庫)，藉由使用可與序列之3'端及5'端雜合之合成引子進行PCR擴增，或藉由使用對特定基因序列具有特異性之寡核苷酸探針進行選殖而產生。
在一些情況下，抗體或其結合視情況藉由使動物諸如小鼠免疫以產生多株抗體，或更佳地藉由產生單株抗體，例如，如Kohler及Milstein (1975, Nature 256:495-497)所述或如Kozbor等人(1983, Immunology Today 4:72)或Cole等人(1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 第77-96頁)所述產生。或者，至少編碼抗體之Fab部分的純系視情況藉由篩選Fab表現庫(例如，如Huse等人, 1989, Science 246:1275-1281中所述)中結合特定抗原之Fab片段的純系或藉由篩選抗體庫(參見例如Clackson等人, 1991, Nature 352:624；Hane等人, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937)來獲得。
在一些實施例中，使用開發用於產生「嵌合抗體」之技術(Morrison等人, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855；Neuberger等人, 1984, Nature 312:604-608；Takeda等人, 1985, Nature 314:452-454)，其係藉由將具有適當抗原特異性之小鼠抗體分子的基因與具有適當生物活性之人類抗體分子的基因剪接一起。嵌合抗體為不同部分來源於不同動物物種之分子，諸如具有來源於鼠類單株抗體之可變區及人類免疫球蛋白恆定區之分子。
在一些實施例中，針對產生單鏈抗體所述之技術(美國專利第4,694,778號；Bird, 1988, Science 242:423-42；Huston等人, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；及Ward等人, 1989, Nature 334:544-54)適於產生單鏈抗體。單鏈抗體係藉由將Fv區之重鏈及輕鏈片段經由胺基酸橋連接產生單鏈多肽而形成。亦視情況使用在大腸桿菌中組裝功能性Fv片段之技術(Skerra等人, 1988, Science 242:1038-1041)。
在一些實施例中，藉由習知技術(例如電穿孔、脂質體轉染及磷酸鈣沈澱)將包含抗體之核苷酸序列的表現載體或抗體之核苷酸序列轉移至宿主細胞，且接著藉由習知技術培養經轉染細胞以產生抗體。在特定實施例中，抗體之表現藉由組成型、誘導型或組織特異性啟動子調節。
在一些實施例中，利用各種宿主表現載體系統來表現本文所述之抗體或其結合片段。此類宿主表現系統代表產生抗體之編碼序列且隨後純化之載體，且亦代表當經適當核苷酸編碼序列轉型或轉染時原位表現抗體或其結合片段的細胞。此等宿主表現系統包括但不限於微生物體，諸如經含有編碼抗體或其結合片段之序列之重組噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉型的細菌(例如大腸桿菌及枯草桿菌(B. subtilis))；經含有編碼抗體或其結合片段之序列之重組酵母表現載體轉型的酵母(例如畢赤酵母(Saccharomyces Pichia))；經含有編碼抗體或其結合片段之序列之重組病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；經含有編碼抗體或其結合片段之序列之重組病毒表現載體(例如花椰菜嵌紋病毒(CaMV)及菸草嵌紋病毒(TMV))感染或經含有編碼抗體或其結合片段之序列之重組質體表現載體(例如Ti質體)轉型的植物細胞系統；或具有含有來源於哺乳動物細胞基因體之啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或來源於哺乳動物病毒之啟動子(例如腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)之重組表現構築體的哺乳動物細胞系統(例如COS、CHO、BH、293、293T、3T3細胞)。
為了長期、高產率地產生重組蛋白，穩定表現為較佳的。在一些情況下，穩定表現抗體之細胞株視情況經工程改造。宿主細胞可經受適當表現控制元件(例如啟動子、強化子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)控制之DNA及可選標記轉型，而非使用含有病毒複製起點之表現載體。在引入外來DNA後，接著使經工程改造之細胞在富集培養基中生長1-2天，且隨後切換成選擇性培養基。重組質體中之可選標記賦予選擇抗性，且允許細胞將質體穩定地整合至其染色體中且生長以形成變異區(foci)，該變異區繼而選殖且擴增至細胞株中。此方法可有利地用於工程改造表現抗體或其結合片段之細胞株。
在一些情況下，使用多個選擇系統，包括但不限於單純疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人, 1977, Cell 11:223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska及Szybalski, 192, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202)及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等人, 1980, Cell 22:817)基因分別用於tk-、hgprt-或aprt-細胞中。此外，抗代謝物抗性用作選擇以下基因之基礎：dhfr，其賦予對甲胺喋呤之抗性(Wigler等人, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357；O'Hare等人, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527)；gpt，其賦予對黴酚酸之抗性(Mulligan及Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072)；neo，其賦予對胺基醣苷G-418之抗性(Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu及Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；以及Morgan及Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；1993年5月, TIB TECH 11(5):155-215)；及hygro，其賦予對潮黴素之抗性(Santerre等人, 1984, Gene 30:147)。可使用之重組DNA技術中通常已知之方法描述於Ausubel等人(編, 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY；Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY；及第12及13章, Dracopoli等人(編), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.；Colberre-Garapin等人, 1981, J. Mol. Biol. 150:1)中。
在一些情況下，抗體之表現量係藉由載體擴增而增加(關於綜述，參見Bebbington及Hentschel, the use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, 第3卷. (Academic Press, New York, 1987))。當表現抗體之載體系統中的標記物可擴增時，存在於宿主細胞培養物中之抑制劑的含量增加將使標記基因複本之數目增加。由於擴增區與抗體之核苷酸序列相關，故抗體之產生亦將增加(Crouse等人, 1983, Mol. Cell Biol. 3:257)。
在一些情況下，使用此項技術中已知用於純化抗體之任何方法，例如藉由層析法(例如離子交換、親和力(特別是藉由在蛋白A之後對特定抗原之親和力)及篩分管柱層析法)、離心、差異溶解度或藉由任何其他用於純化蛋白質之標準技術。
表現載體
在一些實施例中，載體包括來源於真核或原核來源之任何適合載體。在一些情況下，載體自細菌(例如大腸桿菌)、昆蟲、酵母(例如甲醇酵母(Pichia pastoris))、藻類或哺乳動物來源獲得。例示性細菌載體包括pACYC177、pASK75、pBAD載體系列、pBADM載體系列、pET載體系列、pETM載體系列、pGEX載體系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE載體系列、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAG CTS、pFLAG MAC、pFLAG Shift-12c、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC或pTAC-MAT-2。
例示性昆蟲載體包括pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBact M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393、pVL1393 M10、pVL1393 M11、pVL1393 M12、FLAG載體(諸如pPolh-FLAG1或pPolh-MAT 2)或MAT載體(諸如pPolh-MAT1或pPolh-MAT2)。
在一些情況下，酵母載體包括Gateway® pDEST™ 14載體、Gateway® pDEST™ 15載體、Gateway®
pDEST™ 17載體、Gateway®
pDEST™ 24載體、Gateway®
pYES-DEST52載體、pBAD-DEST49 Gateway®目的地載體、pAO815畢赤酵母(Pichia)載體、pFLD1甲醇酵母載體、pGAPZA、B及C甲醇酵母載體、pPIC3.5K畢赤酵母載體、pPIC6 A、B及C畢赤酵母載體、pPIC9K畢赤酵母載體、pTEF1/Zeo、pYES2酵母載體、pYES2/CT酵母載體、pYES2/NT A、B及C酵母載體或pYES3/CT酵母載體。
例示性藻類載體包括pChlamy-4載體或MCS載體。
哺乳動物載體之實例包括短暫表現載體或穩定表現載體。哺乳動物短暫表現載體可包括pRK5、p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV 19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV 6a,b,c、pFLAG-CMV 5.1、pFLAG-CMV 5a,b,c、p3xFLAG-CMV 7.1、pFLAG-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV 24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3或pBICEP-CMV 4。哺乳動物穩定表現載體可包括pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV 21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV 14、pFLAG-Myc-CMV 22、p3xFLAG-Myc-CMV 26、pBICEP-CMV 1或pBICEP-CMV 2。
在一些情況下，游離系統係來自細胞之細胞質及/或細胞核組分之混合物，且用於活體外核酸合成。在一些情況下，游離系統利用原核細胞組分或真核細胞組分。有時，在游離系統中基於例如果蠅細胞、爪蟾卵或希拉細胞獲得核酸合成。例示性游離系統包括但不限於大腸桿菌S30提取物系統、大腸桿菌T7 S30系統或PURExpress®。
宿主細胞
在一些實施例中，宿主細胞包括任何適合之細胞，諸如天然來源之細胞或經基因修飾之細胞。在一些情況下，宿主細胞係生產宿主細胞。在一些情況下，宿主細胞係真核細胞。在其他情況下，宿主細胞係原核細胞。在一些情況下，真核細胞包括真菌(例如酵母細胞)、動物細胞或植物細胞。在一些情況下，原核細胞係細菌細胞。細菌細胞之實例包括革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陰性細菌有時係厭氧的、桿狀的或兩者兼而有之。
在一些情況下，革蘭氏陽性細菌包括放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)或無壁菌門(Tenericutes)。在一些情況下，革蘭氏陰性細菌包括產水菌門(Aquificae)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、纖維桿菌門-綠菌門/擬桿菌綱(Fibrobacteres-Chlorobi/Bacteroidetes)(FCB族)、梭桿菌門(Fusobacteria)、芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、浮黴菌門-疣微菌門/衣原體門(Planctomycetes-Verrucomicrobia/Chlamydiae) (PVC族)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體綱(Spirochaetes)或互養菌綱(Synergistetes)。其他細菌可為酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、產金菌綱(Chrysiogenetes)、藍細菌門(Cyanobacteria)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、網團菌門(Dictyoglomi)、熱脫硫桿菌門(Thermodesulfobacteria)或熱袍菌門(Thermotogae)。細菌細胞可為大腸桿菌、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)或大腸芽孢桿菌(Coli bacilli)。
例示性原核宿主細胞包括但不限於BL21、Mach1™、DH10B™、TOP10、DH5α、DH10Bac™、OmniMax™、MegaX™、DH12S™、INV110、TOP10F'、INVαF、TOP10/P3、ccdB Survival、PIR1、PIR2、Stbl2™、Stbl3™或Stbl4™。
在一些情況下，動物細胞包括來自脊椎動物或無脊椎動物之細胞。在一些情況下，動物細胞包括來自海洋無脊椎動物、魚類、昆蟲、兩棲動物、爬行動物或哺乳動物之細胞。在一些情況下，真菌細胞包括酵母細胞，諸如啤酒酵母、焙用酵母或紅酒酵母。
真菌包括子囊菌綱(ascomycetes)諸如酵母、黴菌、絲狀真菌、擔子菌綱(basidiomycetes)或接合菌綱(zygomycetes)。在一些情況下，酵母包括子囊菌門(Ascomycota)或擔子菌門(Basidiomycota)。在一些情況下，子囊菌門包括酵母亞門(Saccharomycotina)(真酵母，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(焙用酵母))或外囊菌亞門(Taphrinomycotina)(例如裂殖酵母綱(Schizosaccharomycetes)(***酵母))。在一些情況下，擔子菌門包括傘菌亞門(Agaricomycotina)(例如銀耳綱(Tremellomycetes))或柄鏽菌亞門(Pucciniomycotina)(例如微球黑粉菌綱(Microbotryomycetes))。
例示性酵母菌或絲狀真菌包括例如以下屬：酵母菌屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、念珠菌屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢森酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidi)、曲黴菌屬(Aspergillus)、鐮孢菌屬(Fusarium)或木黴菌屬(Trichoderma)。例示性酵母或絲狀真菌包括例如以下種：釀酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、產朊假絲酵母(Candida utilis)、博伊丁假絲酵母(Candida boidini)、白色念珠菌(Candida albicans)、熱帶念珠菌(Candida tropicalis)、類星形念珠菌(Candida stellatoidea)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、克魯斯念珠菌(Candida krusei)、***滑念珠菌(Candida parapsilosis)、季也蒙畢念珠菌屬(Candida guilliermondii)、維斯念珠菌(Candida viswanathii)、葡萄牙念珠菌(Candida lusitaniae)、膠紅酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)、蒙塔利亞畢赤酵母(Pichia metanolica)、安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)、甲醇酵母(Pichia pastoris)、異常畢赤酵母(Pichia anomala)、多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)、魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、出芽絲孢酵母菌(Trichosporon pullulans)、湯魯紅冬孢酵母-黑麴黴(Rhodosporidium toru-Aspergillus niger)、構巢麴黴(Aspergillus nidulans)、泡盛麴菌(Aspergillus awamori)、米麴黴(Aspergillus oryzae)、里氏木黴(Trichoderma reesei)、解脂耶氏酵母、佈雷特酒香酵母布魯氏菌(Brettanomyces bruxellensis)、星形假絲酵母(Candida stellata)、粟酒裂殖酵母、戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隱球菌(Cryptococcus gattii)或鮑氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)。
例示性酵母宿主細胞包括但不限於甲醇酵母菌株，諸如GS115、KM71H、SMD1168、SMD1168H及X-33；及釀酒酵母菌株，諸如INVSc1。
在一些情況下，其他動物細胞包括獲自軟體動物、節肢動物、環節動物或海綿動物之細胞。在一些情況下，其他動物細胞為哺乳動物細胞，例如來自靈長類動物、猿、馬、牛、豬、犬、貓或嚙齒動物。在一些情況下，嚙齒動物包括小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠、倉鼠、絨鼠、褐家鼠或天竺鼠。
例示性哺乳動物宿主細胞包括但不限於293A細胞株、293FT細胞株、293F細胞、293 H細胞、CHO DG44細胞、CHO-S細胞、CHO-K1細胞、FUT8 KO CHOK1、Expi293F™細胞、Flp-In™ T-REx™ 293細胞株、Flp-In™-293細胞株、Flp-In™-3T3細胞株、Flp-In™-BHK細胞株、Flp-In™-CHO細胞株、Flp-In™-CV-1細胞株、Flp-In™-Jurkat細胞株、FreeStyle™ 293-F細胞、FreeStyle™ CHO-S細胞、GripTite™ 293 MSR細胞株、GS-CHO細胞株、HepaRG™細胞、T-REx™ Jurkat細胞株、Per.C6細胞、T-REx™-293細胞株、T-REx™-CHO細胞株及T-REx™-HeLa細胞株。
在一些情況下，哺乳動物宿主細胞係穩定細胞株，或已將所關注遺傳物質併入至其自身基因體中且在許多代細胞***之後具有表現遺傳物質產物之能力的細胞株。在一些情況下，哺乳動物宿主細胞係短暫細胞株，或尚未將所關注遺傳物質併入至其自身基因體中且在許多代細胞***之後不具有表現遺傳物質產物之能力的細胞株。
例示性昆蟲宿主細胞包括但不限於果蠅屬S2細胞、Sf9細胞、Sf21細胞、High Five™細胞及expresSF+®細胞。
在一些情況下，植物細胞包括來自藻類之細胞。例示性昆蟲細胞株包括但不限於來自萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) 137c或細長聚球藻(Synechococcus elongatus) PPC 7942之菌株。
製品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有可用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料的製品。製品包含容器及容器上或容器隨附之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多種材料形成，諸如玻璃或塑膠。
標籤或藥品說明書指示組合物用於治療所選病況。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病況之藥品說明書。
替代地或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭及注射器。
實施例
實施例1. 一種根據下式之經分離多特異性抗體：
P
1-L
1-A
1-L-B (
式 I)，其中A
1包含CD28結合域；B包含PD-L1結合域；L包含連接A
1與B之連接子；P
1包含與A
1結合之肽，且L
1包含連接A
1與P
1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
實施例2. 如實施例1之經分離多特異性抗體，其中該多特異性抗體係根據下式：
P
1-L
1-A
1-L-B-L
2-P
2(
式 Ia)，其中P
2包含與B結合之肽，且L
2包含連接B與P
2之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
實施例3. 如實施例1或2之經分離多特異性抗體，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列。
實施例4. 如實施例1或2之經分離多特異性抗體，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 42-53中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 42-53中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
實施例5. 如實施例1或2之經分離多特異性抗體，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 42-53中之任一者之胺基酸序列。
實施例6. 如實施例1或2之經分離多特異性抗體，其中P
1包含根據表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
實施例7. 如實施例1或2之經分離多特異性抗體，其中P
1包含根據表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列。
實施例8. 如實施例1或2之經分離多特異性抗體，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 128-147中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 128-147中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
實施例9. 如實施例1或2之經分離多特異性抗體，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 128-147中之任一者之胺基酸序列。
實施例10. 如實施例1或2之經分離多特異性抗體，其中P
1包含根據X
1-X
2-X
3-C-X
4-X
5-X
6-X
7-X
8-X
9-X
10-C-X
11-X
12之胺基酸序列，其中X
1係選自M、I、L及V；X
2係選自D、H、N、A、F、S、T、Y及V；X
3係選自W、L及F；X
4係選自P、A及L；X
5係選自R、T、I、M、S、K、L、V、W、F、A、P及D；X
6係選自E、D、Y、H、S、F、A、N、T、I、P及V；X
7係選自L、M、R、S、Q及H；X
8係選自W及Q；X
9係選自H、N、D、A、S、Y、T、F、V、L及I；X
10係選自E、V、L、D、Y、R、Q、H、F、K、A、M及N；X
11係選自F、Y、L、W及V；且X
12係選自N、A、F、S、Y、H、D、T及L。
實施例11. 如實施例10之經分離多特異性抗體，其中X
1係選自M、I及L；X
2係選自D、H、N及A；X
3為W；X
4為P；X
5係選自R、T、I、M、S及K；X
6係選自E、D、Y、H、S及F；X
7係選自L、M及R；X
8為W；X
9係選自H、N、D、A、S及V；X
10係選自E、V、L、D及H；X
11係選自F、Y及L；且X
12係選自N、A、F、S及Y。
實施例12. 如實施例11之經分離多特異性抗體，其中X
1為M；X
2係選自D及H；X
3為W；X
4為P；X
5係選自R、T及I；X
6係選自E、D及Y；X
7係選自L、M及R；X
8為W；X
9係選自H、N、D及V；X
10係選自E、V、L、D及H；X
11為F；且X
12係選自N、A及F。
實施例13. 如實施例1至3、10至12中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 32具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
實施例14. 如實施例1至3、10至12中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。
實施例15. 如實施例1至3、10至12中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 138之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 138具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
實施例16. 如實施例1至3、10至12中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1包含根據SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
實施例17. 如實施例1至16中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1削弱A
1與CD28之結合。
實施例18. 如實施例1至17中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與A
1結合。
實施例19. 如實施例1至18中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1在抗原結合位點處或附近與A
1結合。
實施例20. 如實施例1至18中任一項之經分離多特異性抗體，其中當L
1由該腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
1變得與A
1不再結合，從而使A
1暴露於CD28。
實施例21. 如實施例1至20中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1與CD28之序列一致性小於75%。
實施例22. 如實施例1至21中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1與CD28之序列一致性小於80%。
實施例23. 如實施例1至22中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1與CD28之序列一致性小於85%。
實施例24. 如實施例1至23中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1與CD28之序列一致性小於90%。
實施例25. 如實施例1至24中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1與CD28之序列一致性小於95%。
實施例26. 如實施例1至25中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1包含與CD28共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。
實施例27. 如實施例2至26中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2削弱B與PD-L1之結合。
實施例28. 如實施例2至27中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與B結合。
實施例29. 如實施例2至28中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2在抗原結合位點處或附近與B結合。
實施例30. 如實施例2至29中任一項之經分離多特異性抗體，其中當L
2由該腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
2變得與B不再結合，從而使B暴露於該PD-L1。
實施例31. 如實施例2至30中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2與該PD-L1之序列一致性小於70%。
實施例32. 如實施例2至31中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2與該PD-L1之序列一致性小於75%。
實施例33. 如實施例2至32中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2與該PD-L1之序列一致性小於80%。
實施例34. 如實施例2至33中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2與該PD-L1之序列一致性小於85%。
實施例35. 如實施例2至34中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2與該PD-L1之序列一致性小於90%。
實施例36. 如實施例2至35中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2與該PD-L1之序列一致性小於95%。
實施例37. 如實施例2至36中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2包含與該PD-L1共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。
實施例38. 如實施例2至37中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2包含長度為至少5個胺基酸之肽序列。
實施例39. 如實施例2至38中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2包含長度為至少6個胺基酸之肽序列。
實施例40. 如實施例2至39中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2包含長度為至少10個胺基酸之肽序列。
實施例41. 如實施例2至40中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2包含長度為至少10個胺基酸且長度不超過20個胺基酸之肽序列。
實施例42. 如實施例2至41中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2包含長度為至少16個胺基酸之肽序列。
實施例43. 如實施例2至42中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
2包含長度不超過40個胺基酸之肽序列。
實施例44. 如實施例1至43中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1或P
2包含至少兩個半胱胺酸胺基酸殘基。
實施例45. 如實施例1至44中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1或P
2包含環狀肽或線性肽。
實施例46. 如實施例1至45中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1或P
2包含環狀肽。
實施例47. 如實施例1至46中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1或P
2包含線性肽。
實施例48. 如實施例1至47中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1或P
2包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。
實施例49. 如實施例1至48中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1或P
2不包含白蛋白或白蛋白片段。
實施例50. 如實施例1至49中任一項之經分離多特異性抗體，其中P
1或P
2不包含白蛋白結合域。
實施例51. 如實施例1至50中任一項之經分離多特異性抗體，其中L
1或L
2為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。
實施例52. 如實施例1至51中任一項之經分離多特異性抗體，其中L
1或L
2為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。
實施例53. 如實施例1至52中任一項之經分離多特異性抗體，其中L
1或L
2為具有至少10個胺基酸之肽序列。
實施例54. 如實施例1至53中任一項之經分離多特異性抗體，其中L
1或L
2為具有至少18個胺基酸之肽序列。
實施例55. 如實施例1至54中任一項之經分離多特異性抗體，其中L
1或L
2為具有至少26個胺基酸之肽序列。
實施例56. 如實施例1至55中任一項之經分離多特異性抗體，其中L
1或L
2包含含有(G2S)n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。
實施例57. 如實施例1至56中任一項之經分離多特異性抗體，其中L
1或L
2包含含有(G2S)n之式，其中n為至少1之整數。
實施例58. 如實施例1至57中任一項之經分離多特異性抗體，其中L
1或L
2包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。
實施例59. 如實施例1至58中任一項之經分離多特異性抗體，其中該腫瘤特異性蛋白酶係選自由以下組成之群：金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶及天冬胺酸蛋白酶。
實施例60. 如實施例1至58中任一項之經分離多特異性抗體，其中L
1或L
2包含尿激酶可裂解胺基酸序列、間質蛋白酶可裂解胺基酸序列或基質金屬蛋白酶可裂解胺基酸序列。
實施例61. 如實施例1至60中任一項之經分離多特異性抗體，其中L
1或L
2包含根據SEQ ID NO: 18-19、62-88之序列。
實施例62. 如實施例1至61中任一項之經分離多特異性抗體，其中L
1與A
1之N端結合。
實施例63. 如實施例1至61中任一項之經分離多特異性抗體，其中L
1與A
1之C端結合。
實施例64. 如實施例1至61中任一項之經分離多特異性抗體，其中L
2與B之N端結合。
實施例65. 如實施例1至61中任一項之經分離多特異性抗體，其中L
2與B之C端結合。
實施例66. 如實施例1至65中任一項之經分離多特異性抗體，其中該CD28結合域包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab或Fab'。
實施例67. 如實施例66之經分離多特異性抗體，其中該CD28結合域包含該單鏈可變片段。
實施例68. 如實施例66之經分離多特異性抗體，其中該CD28結合域包含該單域抗體。
實施例69. 如實施例66之經分離多特異性抗體，其中該CD28結合域包含該Fab或該Fab'。
實施例70. 如實施例1至69中任一項之經分離多特異性抗體，其中該PD-L1結合域包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab或Fab'。
實施例71. 如實施例70之經分離多特異性抗體，其中該PD-L1結合域包含該Fab或該Fab'。
實施例72. 如實施例70之經分離多特異性抗體，其中該PD-L1結合域包含該Fab或該Fab'且該CD28結合域包含該單鏈可變片段。
實施例73. 如實施例70之經分離多特異性抗體，其中包含該Fab或該Fab'之該PD-L1結合域包含含有Fab重鏈可變域之Fab重鏈多肽及含有Fab輕鏈可變域之Fab輕鏈多肽。
實施例74. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中包含該單鏈可變片段之該CD28結合域包含scFv重鏈可變域及scFv輕鏈可變域。
實施例75. 如實施例1至74中任一項之經分離多特異性抗體，其中該連接子將A
1之C端連接至B之N端。
實施例76. 如實施例1至74中任一項之經分離多特異性抗體，其中該連接子將A
1之N端連接至B之C端。
實施例77. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將A
1之C端連接至該Fab重鏈多肽之N端。
實施例78. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將A
1之N端連接至該Fab重鏈多肽之C端。
實施例79. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將A
1之C端連接至該Fab輕鏈多肽之N端。
實施例80. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將A
1之N端連接至該Fab輕鏈多肽之C端。
實施例81. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域。
實施例82. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv重鏈可變域。
實施例83. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域。
實施例84. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv重鏈可變域。
實施例85. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之N端。
實施例86. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之C端。
實施例87. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv重鏈可變域之N端。
實施例88. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv重鏈可變域之C端。
實施例89. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之N端。
實施例90. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之C端。
實施例91. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv重鏈可變域之N端。
實施例92. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv重鏈可變域之C端。
實施例93. 如實施例1至92中任一項之經分離多特異性抗體，其中該連接子之長度為至少5個胺基酸。
實施例94. 如實施例1至93中任一項之經分離多特異性抗體，其中該連接子之長度不超過30個胺基酸。
實施例95. 如實施例1至94中任一項之經分離多特異性抗體，其中該連接子之長度為至少5個胺基酸且不超過30個胺基酸。
實施例96. 如實施例1至95中任一項之經分離多特異性抗體，其中該連接子之長度為5個胺基酸。
實施例97. 如實施例1至96中任一項之經分離多特異性抗體，其中該連接子之長度為15個胺基酸。
實施例98. 如實施例1至97中任一項之經分離多特異性抗體，其中該連接子包含(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 58)、(GGGS)n (SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)n (SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。
實施例99. 如實施例1至98中任一項之經分離多特異性抗體，其中L包含含有(G2S)n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。
實施例100. 如實施例1至97中任一項之經分離多特異性抗體，其中該L包含SEQ ID NO: 18 (GGGGSGGGGSGGGGS)或SEQ ID NO: 19 (GGGGS)之胺基酸序列。
實施例101. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv重鏈可變域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該scFv重鏈可變域之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 1；HC-CDR2：SEQ ID NO: 2；HC-CDR3：SEQ ID NO: 3，且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。
實施例102. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv輕鏈可變域包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該scFv輕鏈可變域之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 4；LC-CDR2：SEQ ID NO: 5 (KA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 6，且其中該等CDR包含該等LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。
實施例103. 如實施例1至100中任一項之經分離多特異性抗體，其中A
1包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中A
1之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 4；LC-CDR2：SEQ ID NO: 5 (KA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 6；其中A
1包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中A
1之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 1；HC-CDR2：SEQ ID NO: 2；HC-CDR3：SEQ ID NO: 3。
實施例104. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該Fab重鏈可變域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該Fab重鏈可變域之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 10；HC-CDR2：SEQ ID NO: 11；HC-CDR3：SEQ ID NO: 12；且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。
實施例105. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該Fab輕鏈可變域包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該Fab輕鏈可變域之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 13；LC-CDR2：SEQ ID NO: 14 (DA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 15；且其中該等CDR包含該等LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。
實施例106. 如實施例1至100中任一項之經分離多特異性抗體，其中B包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中B之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 10；HC-CDR2：SEQ ID NO: 11；HC-CDR3：SEQ ID NO: 12；且其中B包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中B之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 13；LC-CDR2：SEQ ID NO: 14 (DA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 15。
實施例107. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv重鏈可變域包含與根據SEQ ID NO: 7之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
實施例108. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少75個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例109. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例110. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。
實施例111. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv重鏈可變域包含根據SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。
實施例112. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv輕鏈可變域包含與根據SEQ ID NO: 8之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
實施例113. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少75個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例114. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例115. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。
實施例116. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv輕鏈可變域包含根據SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
實施例117. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv包含與根據SEQ ID NO: 9之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
實施例118. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv包含SEQ ID NO: 9之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例119. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv包含SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例120. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv包含SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。
實施例121. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該scFv包含根據SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
實施例122. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該Fab重鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 17之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
實施例123. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該Fab重鏈多肽包含SEQ ID NO: 17之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例124. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該Fab重鏈多肽包含SEQ ID NO: 17之至少215個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例125. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該Fab重鏈多肽包含SEQ ID NO: 17之至少215個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 17之至少215個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。
實施例126. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該Fab重鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 17之胺基酸序列。
實施例127. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該Fab輕鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 16之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
實施例128. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該Fab輕鏈多肽包含SEQ ID NO: 16之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例129. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該Fab輕鏈多肽包含SEQ ID NO: 16之至少200個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例130. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該Fab輕鏈多肽包含SEQ ID NO: 16之至少200個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 16之至少200個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。
實施例131. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該Fab輕鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。
實施例132. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之C端，且其中該Fab輕鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列，且連接至該scFv輕鏈可變域之C端的該Fab重鏈多肽之胺基酸序列包含與根據SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
實施例133. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之C端，且其中該Fab輕鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 20之胺基酸序列，且連接至該scFv輕鏈可變域之C端的該Fab重鏈多肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。
實施例134. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之C端，且其中該Fab重鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列，且連接至該scFv輕鏈可變域之C端的該Fab輕鏈多肽之胺基酸序列包含與根據SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
實施例135. 如實施例73之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之C端，且其中該Fab重鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 23之胺基酸序列，且連接至該scFv輕鏈可變域之C端的該Fab輕鏈多肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。
實施例136. 如實施例1至135中任一項之經分離多特異性抗體，其中該多特異性抗體進一步包含半衰期延長分子(H
1)。
實施例137. 如實施例136之經分離多特異性抗體，其中H
1連接至P
1。
實施例138. 如實施例136之經分離多特異性抗體，其中H
1連接至P
2。
實施例139. 如實施例136至138中任一項之經分離多特異性抗體，其中H
1不阻斷A
1與CD28結合。
實施例140. 如實施例136至139中任一項之經分離多特異性抗體，其中H
1不阻斷B與PD-L1結合。
實施例141. 如實施例136至140中任一項之經分離多特異性抗體，H
1包含連接H
1與P
1或H
1與P
2之連接部分(L
5)。
實施例142. 如實施例136至141中任一項之經分離多特異性抗體，其中該半衰期延長分子(H
1)對PD-L1不具有結合親和力。
實施例143. 如實施例136至142中任一項之經分離多特異性抗體，其中該半衰期延長分子(H
1)對CD28不具有結合親和力。
實施例144. 如實施例136至143中任一項之經分離多特異性抗體，其中該半衰期延長分子(H
1)不會使該多特異性抗體隔離CD28。
實施例145. 如實施例136至144中任一項之經分離多特異性抗體，其中H
1包含根據SEQ ID NO: 54-57之序列。
實施例146. 如實施例136至144中任一項之經分離多特異性抗體，其中H
1包含具有重複序列模體之胺基酸序列。
實施例147. 如實施例136至144中任一項之經分離多特異性抗體，其中H
1包含具有高度有序二級結構之胺基酸序列。
實施例148. 如實施例136至144中任一項之經分離多特異性抗體，其中H
1包含聚合物。
實施例149. 如實施例148之經分離多特異性抗體，其中該聚合物為聚乙二醇(PEG)。
實施例150. 如實施例136至149中任一項之經分離多特異性抗體，其中H
1包含白蛋白。
實施例151. 如實施例136至150中任一項之經分離多特異性抗體，其中H
1包含Fc域。
實施例152. 如實施例150之經分離多特異性抗體，其中該白蛋白為血清白蛋白。
實施例153. 如實施例152之經分離多特異性抗體，其中該白蛋白為人類血清白蛋白。
實施例154. 如實施例136至153中任一項之經分離多特異性抗體，其中H
1包含多肽、配體或小分子。
實施例155. 如實施例153之經分離多特異性抗體，其中該多肽、該配體或該小分子結合血清蛋白或其片段、循環免疫球蛋白或其片段、或CD35/CR1。
實施例156. 如實施例155之經分離多特異性抗體，其中該血清蛋白包含甲狀腺素結合蛋白、甲狀腺素運載蛋白、1-酸性醣蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體或其運鐵蛋白結合部分、纖維蛋白原或白蛋白。
實施例157. 如實施例155之經分離多特異性抗體，其中該循環免疫球蛋白分子包含IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。
實施例158. 如實施例155之經分離多特異性抗體，其中該血清蛋白為白蛋白。
實施例159. 如實施例154之經分離多特異性抗體，其中該多肽為抗體。
實施例160. 如實施例159之經分離多特異性抗體，其中該抗體包含單域抗體、單鏈可變片段、Fab或Fab'。
實施例161. 如實施例160之經分離多特異性抗體，其中該單域抗體包含與白蛋白結合之單域抗體。
實施例162. 如實施例160之經分離多特異性抗體，其中該單域抗體為人類或人源化抗體。
實施例163. 如實施例160之經分離多特異性抗體，其中該單域抗體係選自由以下組成之群：645gH1gL1、645dsgH5gL4、23-13-A01 -sc02、A10m3或其片段、DOM7r-31、DOM7h-11-15、Alb-1、Alb-8、Alb-23、10G、10E及SA21。
實施例164. 如實施例160之經分離多特異性抗體，其中該單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 54，HC-CDR2：SEQ ID NO: 55，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 56；且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾，或其中該單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 204，HC-CDR2：SEQ ID NO: 205，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 206；且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。
實施例165. 如實施例164之經分離多特異性抗體，其中H
1包含根據SEQ ID NO: 57或SEQ ID NO: 207之胺基酸序列。
實施例166. 如實施例165之經分離多特異性抗體，其中H
1包含與SEQ ID NO: 57或SEQ ID NO: 207具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
實施例167. 如實施例165之經分離多特異性抗體，其中H
1包含與SEQ ID NO: 57或SEQ ID NO: 207具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。
實施例168. 如實施例165之經分離多特異性抗體，其中H
1包含與SEQ ID NO: 57或SEQ ID NO: 207具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
實施例169. 如實施例165之經分離多特異性抗體，其中H
1包含與SEQ ID NO: 57或SEQ ID NO: 207具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例170. 如實施例165之經分離多特異性抗體，其中H
1包含與SEQ ID NO: 57或SEQ ID NO: 207具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例171. 如實施例136至170中任一項之經分離多特異性抗體，其中H
1包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。
實施例172. 如實施例171之經分離多特異性抗體，其中該經修飾之胺基酸或經修飾之非天然胺基酸包含轉譯後修飾。
實施例173. 如實施例136至172中任一項之經分離多特異性抗體，其中H
1包含連接H
1與P
1或P
2之連接部分(L
5)。
實施例174. 如實施例173之經分離多特異性抗體，其中L
5為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。
實施例175. 如實施例173之經分離多特異性抗體，其中L
5為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。
實施例176. 如實施例173之經分離多特異性抗體，其中L
5為具有至少10個胺基酸之肽序列。
實施例177. 如實施例173之經分離多特異性抗體，其中L
5為具有至少18個胺基酸之肽序列。
實施例178. 如實施例173之經分離多特異性抗體，其中L
5為具有至少26個胺基酸之肽序列。
實施例179. 如實施例173之經分離多特異性抗體，其中L
5包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。
實施例180. 如實施例1至179中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
實施例181. 如實施例1至180中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。
實施例182. 如實施例1至181中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
實施例183. 如實施例1至182中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例184. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例185. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149及150具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例186. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149及150具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例187. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 151及152具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例188. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 151及152具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例189. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 153及154具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例190. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 153及154具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例191. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 155及156具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例192. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 155及156具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例193. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 157及158具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例194. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 157及158具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例195. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 159及160具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例196. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 159及160具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例197. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 161及162具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例198. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 161及162具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例199. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 163及164具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例200. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 163及164具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例201. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 165及166具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例202. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 165及166具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例203. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 167及168具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例204. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 167及168具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例205. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 169及170具有至少95%序列一致性或與SEQ ID NO: 208及209具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例206. 如實施例1至183中任一項之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 169及170具有至少99%序列一致性或與SEQ ID NO: 208及209具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例207. 一種經分離重組核酸分子，其編碼如實施例1至206中任一項之經分離多特異性抗體之多肽。
實施例208. 一種醫藥組合物，其包含：
(a)如實施例1至206中任一項之經分離多特異性抗體；及
(b)醫藥學上可接受之賦形劑。
實施例209. 一種醫藥組合物，其包含：(a)如實施例1至206中任一項之經分離多特異性抗體，(b)抗癌療法，及(c)醫藥學上可接受之賦形劑。
實施例210. 如實施例209之醫藥組合物，其中該抗癌療法包含小分子、基於細胞之療法或基於抗體之療法。
實施例211. 如實施例210之醫藥組合物，其中該基於抗體之療法為T細胞接合子。
實施例212. 如實施例211之醫藥組合物，其中該T細胞接合子包含根據以下之式：D
1-L
0-E
1(式II)，其中D
1包含與效應細胞抗原結合之效應細胞結合域，E
1包含與腫瘤抗原結合之腫瘤抗原結合域，且L
0包含連接D
1與E
1之連接子。
實施例213. 如實施例212之醫藥組合物，其中D
1包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab片段或Fab'。
實施例214. 如實施例213之醫藥組合物，其中D
1包含該單鏈可變片段。
實施例215. 如實施例212之醫藥組合物，其中E
1包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab片段或Fab'。
實施例216. 如實施例215之醫藥組合物，其中E
1包含該Fab片段。
實施例217. 如實施例215之醫藥組合物，其中該效應細胞抗原包含CD3。
實施例218. 如實施例217之醫藥組合物，其中該效應細胞結合域包含選自由以下組成之群的互補決定區(CDR)：莫羅單抗-CD3 (OKT3)、奧昔組單抗(TRX4)、替利組單抗(MGA031)、維西珠單抗(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030 (BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、15865、15865v12、15865v16及15865v19。
實施例219. 如實施例217之醫藥組合物，其中該效應細胞結合域包含根據SEQ ID NO: 89-101之胺基酸序列。
實施例220. 如實施例212至219中任一項之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含表皮生長因子受體(EGFR)、***特異性膜抗原(PSMA)或腫瘤相關鈣信號轉導子2 (下文稱為TROP2)。
實施例221. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含EGFR。
實施例222. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 102-111之胺基酸序列。
實施例223. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含EGFR，且該腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 105；HC-CDR2：SEQ ID NO: 106；HC-CDR3：SEQ ID NO: 107；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 102；LC-CDR2：SEQ ID NO: 103 (YAS)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 104。
實施例224. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含EGFR，且該T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 181及182具有至少95%序列一致性或根據SEQ ID NO: 214及215具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例225. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含EGFR，且該T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 181及182或根據SEQ ID NO: 214及215之胺基酸序列。
實施例226. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含TROP2。
實施例227. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含TROP2，且該腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 112；HC-CDR2：SEQ ID NO: 113；HC-CDR3：SEQ ID NO: 114；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 115；LC-CDR2：SEQ ID NO: 116 (SAS)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 117。
實施例228. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含TROP2，且該T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 187-192具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例229. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含TROP2，且該T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 187-192中之任一者之胺基酸序列。
實施例230. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 112-119之胺基酸序列。
實施例231. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含PSMA。
實施例232. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 120-127之胺基酸序列。
實施例233. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含PSMA，且該腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 120；HC-CDR2：SEQ ID NO: 121；HC-CDR3：SEQ ID NO: 122；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 123；LC-CDR2：SEQ ID NO: 124 (EA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 125。
實施例234. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含PSMA，且該T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 173及174具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例235. 如實施例220之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含PSMA，且該T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 173及174之胺基酸序列。
實施例236. 如實施例211至235中任一項之醫藥組合物，其中該T細胞接合分子在腫瘤微環境中選擇性活化。
實施例237. 如實施例236之醫藥組合物，其中該T細胞接合子係根據以下子式：P
3-L
3-D
1-L
0-E
1(式IIa)，其中D
1包含該CD3結合域；E
1包含該腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之該連接子；P
3包含與D
1結合之肽，且L
3包含連接D
1與P
3之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
實施例238. 如實施例236之醫藥組合物，其中該T細胞接合子係根據以下子式：D
1-L
0-E
1-L
4-P
4(式IIb)，其中D
1包含該CD3結合域；E
1包含該腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之該連接子；P
4包含與E
1結合之肽，且L
4包含連接E
1與P
4之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
實施例239. 如實施例236之醫藥組合物，其中該T細胞接合子係根據以下子式：P
3-L
3-D
1-L
0-E
1-L
4-P
4(式IIc)，其中D
1包含該CD3結合域；E
1包含該腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之該連接子；P
3包含與D
1結合之肽，且L
3包含連接D
1與P
3之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質；P
4包含與E
1結合之肽，且L
4包含連接E
1與P
4之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
實施例240. 如實施例211至239中任一項之醫藥組合物，其中該T細胞接合子包含H
1。
實施例241. 如實施例240之醫藥組合物，其中H
1包含根據SEQ ID NO: 54-57之序列。
實施例242. 如實施例240之醫藥組合物，其中H
1包含單域抗體。
實施例243. 如實施例240之醫藥組合物，其中該單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 54，HC-CDR2：SEQ ID NO: 55，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 56。
實施例244. 如實施例237至243中任一項之醫藥組合物，其中L
3或L
4為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。
實施例245. 如實施例237至244中任一項之醫藥組合物，其中L
3或L
4為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。
實施例246. 如實施例237至245中任一項之醫藥組合物，其中L
3或L
4為具有至少10個胺基酸之肽序列。
實施例247. 如實施例237至246中任一項之醫藥組合物，其中L
3或L
4為具有至少18個胺基酸之肽序列。
實施例248. 如實施例237至247中任一項之醫藥組合物，其中L
3或L
4為具有至少26個胺基酸之肽序列。
實施例249. 如實施例237至243中任一項之醫藥組合物，其中L
3或L
4包含含有(G
2S)
n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。
實施例250. 如實施例237至243中任一項之醫藥組合物，其中L
3或L
4包含含有(G
2S)
n之式，其中n為至少1之整數。
實施例251. 如實施例237至243中任一項之醫藥組合物，其中L
3或L
4包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。
實施例252. 如實施例237至243中任一項之醫藥組合物，其中該腫瘤特異性蛋白酶係選自由以下組成之群：金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶及天冬胺酸蛋白酶。
實施例253. 如實施例237至243中任一項之醫藥組合物，其中L
3或L
4包含尿激酶可裂解胺基酸序列、間質蛋白酶可裂解胺基酸序列或基質金屬蛋白酶可裂解胺基酸序列。
實施例254. 如實施例237至243中任一項之醫藥組合物，其中L
3或L
4包含根據SEQ ID NO: 18-19、62-88之序列。
實施例255. 如實施例237至254中任一項之醫藥組合物，其中L
3與D
1之N端結合。
實施例256. 如實施例237至254中任一項之醫藥組合物，其中L
3與D
1之C端結合。
實施例257. 如實施例238至254中任一項之醫藥組合物，其中L
4與E
1之N端結合。
實施例258. 如實施例238至254中任一項之醫藥組合物，其中L
4與E
1之C端結合。
實施例259. 如實施例237至254中任一項之醫藥組合物，其中當L
3由該腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
3變得與D
1不再結合，從而使D
1暴露於CD3。
實施例260. 如實施例238至254中任一項之醫藥組合物，其中當L
4由該腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
4變得與E
1不再結合，從而使E
1暴露於該腫瘤抗原。
實施例261. 如實施例237至260中任一項之醫藥組合物，其中P
3削弱D
1與CD3之結合。
實施例262. 如實施例237至261中任一項之醫藥組合物，其中P
3經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與D
1結合。
實施例263. 如實施例237至262中任一項之醫藥組合物，其中P
3在抗原結合位點處或附近與D
1結合。
實施例264. 如實施例237至263中任一項之醫藥組合物，其中當L
3由該腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
3變得與D
1不再結合，從而使D
1暴露於CD3。
實施例265. 如實施例237至264中任一項之醫藥組合物，其中P
3與CD3之序列一致性小於70%。
實施例266. 如實施例237至265中任一項之醫藥組合物，其中P
3與CD3之序列一致性小於85%。
實施例267. 如實施例237至266中任一項之醫藥組合物，其中P
3與CD3之序列一致性小於90%。
實施例268. 如實施例237至267中任一項之醫藥組合物，其中P
3與CD3之序列一致性小於95%。
實施例269. 如實施例237至268中任一項之醫藥組合物，其中P
3與CD3之序列一致性小於98%。
實施例270. 如實施例237至269中任一項之醫藥組合物，其中P
3與CD3之序列一致性小於99%。
實施例271. 如實施例237至270中任一項之醫藥組合物，其中P
3包含根據SEQ ID NO: 177-180之胺基酸序列。
實施例272. 如實施例237至271中任一項之醫藥組合物，其中P
3包含與CD3共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。
實施例273. 如實施例238至272中任一項之醫藥組合物，其中P
4削弱E
1與該腫瘤抗原之結合。
實施例274. 如實施例238至273中任一項之醫藥組合物，其中P
4經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與E
1結合。
實施例275. 如實施例238至274中任一項之醫藥組合物，其中P
4在抗原結合位點處或附近與E
1結合。
實施例276. 如實施例238至275中任一項之醫藥組合物，其中當L
4由該腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
4變得與E
1不再結合，從而使E
1暴露於該腫瘤抗原。
實施例277. 如實施例238至276中任一項之醫藥組合物，其中P
4與該腫瘤抗原之序列一致性小於70%。
實施例278. 如實施例238至277中任一項之醫藥組合物，其中P
4與該腫瘤抗原之序列一致性小於80%。
實施例279. 如實施例238至278中任一項之醫藥組合物，其中P
4與該腫瘤抗原之序列一致性小於85%。
實施例280. 如實施例238至279中任一項之醫藥組合物，其中P
4與該腫瘤抗原之序列一致性小於90%。
實施例281. 如實施例238至280中任一項之醫藥組合物，其中P
4與該腫瘤抗原之序列一致性小於95%。
實施例282. 如實施例238至281中任一項之醫藥組合物，其中P
4包含與該腫瘤抗原共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。
實施例283. 如實施例237至282中任一項之醫藥組合物，其中P
3或P
4包含長度為至少5個胺基酸之肽序列。
實施例284. 如實施例237至283中任一項之醫藥組合物，其中P
3或P
4包含長度為至少6個胺基酸之肽序列。
實施例285. 如實施例237至284中任一項之醫藥組合物，其中P
3或P
4包含長度為至少10個胺基酸之肽序列。
實施例286. 如實施例237至285中任一項之醫藥組合物，其中P
3或P
4包含長度為至少10個胺基酸且長度不超過20個胺基酸之肽序列。
實施例287. 如實施例237至286中任一項之醫藥組合物，其中P
3或P
4包含長度為至少16個胺基酸之肽序列。
實施例288. 如實施例237至287中任一項之醫藥組合物，其中P
3或P
4包含長度不超過40個胺基酸之肽序列。
實施例289. 如實施例237至288中任一項之醫藥組合物，其中P
3或P
4包含至少兩個半胱胺酸胺基酸殘基。
實施例290. 如實施例237至289中任一項之醫藥組合物，其中P
3或P
4包含環狀肽或線性肽。
實施例291. 如實施例237至290中任一項之醫藥組合物，其中P
3或P
4包含環狀肽。
實施例292. 如實施例237至291中任一項之醫藥組合物，其中P
3或P
4包含線性肽。
實施例293. 如實施例238至292中任一項之醫藥組合物，其中P
4包含根據SEQ ID NO: 185或186之胺基酸序列。
實施例294. 如實施例237至293中任一項之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含EGFR，且該T細胞接合子包含SEQ ID NO: 183及184之胺基酸序列。
實施例295. 如實施例238至292中任一項之醫藥組合物，其中P
4包含根據SEQ ID NO: 199-201之胺基酸序列。
實施例296. 如實施例237至292中任一項之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含TROP2，且該T細胞接合子包含SEQ ID NO: 193-198之胺基酸序列中之任一者。
實施例297. 如實施例237至292中任一項之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原包含PSMA，且該T細胞接合子包含SEQ ID NO: 175及176之胺基酸序列。
實施例298. 一種經分離多肽或多肽複合物，其包含CD28結合域，該結合域連接至削弱該CD28結合域與CD28之結合的肽，其中該肽包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 24-53、128-148中之任一者及表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
實施例299. 如實施例298之經分離多肽或多肽複合物，其中該肽包含根據SEQ ID NO: 24-53、128-148及表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列。
實施例300. 如實施例298之經分離多肽或多肽複合物，其中該肽包含根據SEQ ID NO: 42-53中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 42-53中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
實施例301. 如實施例298之經分離多肽或多肽複合物，其中該肽包含根據SEQ ID NO: 42-53中之任一者之胺基酸序列。
實施例302. 如實施例298之經分離多肽或多肽複合物，其中該肽包含根據表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列，或相對於表20之胺基酸序列中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
實施例303. 如實施例298之經分離多肽或多肽複合物，其中該肽包含根據表20之胺基酸序列中之任一者之胺基酸序列。
實施例304. 如實施例298之經分離多肽或多肽複合物，其中該肽包含根據SEQ ID NO: 128-147中之任一者之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 128-147中之任一者具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
實施例305. 如實施例298之經分離多肽或多肽複合物，其中該肽包含根據SEQ ID NO: 128-147中之任一者之胺基酸序列。
實施例306. 如實施例298之經分離多肽或多肽複合物，其中該肽包含根據X
1-X
2-X
3-C-X
4-X
5-X
6-X
7-X
8-X
9-X
10-C-X
11-X
12之胺基酸序列，其中X
1係選自M、I、L及V；X
2係選自D、H、N、A、F、S、T、Y及V；X
3係選自W、L及F；X
4係選自P、A及L；X
5係選自R、T、I、M、S、K、L、V、W、F、A、P及D；X
6係選自E、D、Y、H、S、F、A、N、T、I、P及V；X
7係選自L、M、R、S、Q及H；X
8係選自W及Q；X
9係選自H、N、D、A、S、Y、T、F、V、L及I；X
10係選自E、V、L、D、Y、R、Q、H、F、K、A、M及N；X
11係選自F、Y、L、W及V；且X
12係選自N、A、F、S、Y、H、D、T及L。
實施例307. 如實施例306之經分離多肽或多肽複合物，其中X
1係選自M、I及L；X
2係選自D、H、N及A；X
3為W；X
4為P；X
5係選自R、T、I、M、S及K；X
6係選自E、D、Y、H、S及F；X
7係選自L、M及R；X
8為W；X
9係選自H、N、D、A、S及V；X
10係選自E、V、L、D及H；X
11係選自F、Y及L；且X
12係選自N、A、F、S及Y。
實施例308. 如實施例307之經分離多肽或多肽複合物，其中X
1為M；X
2係選自D及H；X
3為W；X
4為P；X
5係選自R、T及I；X
6係選自E、D及Y；X
7係選自L、M及R；X
8為W；X
9係選自H、N、D及V；X
10係選自E、V、L、D及H；X
11為F；且X
12係選自N、A及F。
實施例309. 如實施例298至302或306至308中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中該肽包含根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 32具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
實施例310. 如實施例298至302或306至308中任一項之經分離多肽或多肽複合物。
實施例311. 如實施例298之經分離多肽或多肽複合物，其中該肽包含根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。
實施例312. 如實施例298至302或306至308中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中該肽包含根據SEQ ID NO: 138之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 138具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
實施例313. 如實施例298至302或306至308中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中該肽包含根據SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
實施例314. 如實施例298至312中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中該CD28結合域包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab或Fab'。
實施例315. 如實施例314之經分離多肽或多肽複合物，其中該CD28結合域包含該單鏈可變片段，且該單鏈可變片段包含scFv重鏈可變域及scFv輕鏈可變域。
實施例316. 如實施例314之經分離多肽或多肽複合物，其中該CD28結合域包含該單域抗體。
實施例317. 如實施例314之經分離多肽或多肽複合物，其中該CD28結合域包含該Fab或該Fab'。
實施例318. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv重鏈可變域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該scFv重鏈可變域之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 1；HC-CDR2：SEQ ID NO: 2；HC-CDR3：SEQ ID NO: 3，且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。
實施例319. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv輕鏈可變域包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該scFv輕鏈可變域之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 4；LC-CDR2：SEQ ID NO: 5 (KA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 6，且其中該等CDR包含該等LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。
實施例320. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv重鏈可變域包含與根據SEQ ID NO: 7之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
實施例321. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少75個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例322. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例323. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。
實施例324. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv重鏈可變域包含根據SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。
實施例325. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv輕鏈可變域包含與根據SEQ ID NO: 8之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
實施例326. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少75個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例327. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例328. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。
實施例329. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv輕鏈可變域包含根據SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
實施例330. 如實施例314之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv包含與根據SEQ ID NO: 9之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
實施例331. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv包含SEQ ID NO: 9之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例332. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv包含SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
實施例333. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv包含SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。
實施例334. 如實施例315之經分離多肽或多肽複合物，其中該scFv包含根據SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
實施例335. 如實施例298至334中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中該CD28結合域經由連接部分(L
1)連接至該肽。
實施例336. 如實施例335之經分離多肽或多肽複合物，其中L
1為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
實施例337. 如實施例335至336中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
1為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。
實施例338. 如實施例335至337中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
1為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。
實施例339. 如實施例335至338中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
1為具有至少10個胺基酸之肽序列。
實施例340. 如實施例335至339中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
1為具有至少18個胺基酸之肽序列。
實施例341. 如實施例335至341中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
1為具有至少26個胺基酸之肽序列。
實施例342. 如實施例335至341中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
1包含含有(G
2S)
n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。
實施例343. 如實施例335至341中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
1包含含有(G
2S)
n之式，其中n為至少1之整數。
實施例344. 如實施例335至341中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
1包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。
實施例345. 如實施例335至344中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中該腫瘤特異性蛋白酶係選自由以下組成之群：金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶及天冬胺酸蛋白酶。
實施例346. 如實施例335至344中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
1包含尿激酶可裂解胺基酸序列、間質蛋白酶可裂解胺基酸序列或基質金屬蛋白酶可裂解胺基酸序列。
實施例347. 如實施例335至346中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
1包含根據SEQ ID NO: 18-19、62-88之序列。
實施例348. 如實施例335至347中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
1與A
1之N端結合。
實施例349. 如實施例335至347中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
1與A
1之C端結合。
實施例350. 如實施例335至349中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中當L
1由該腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
1變得與A
1不再結合，從而使A
1暴露於CD28。
實施例351. 如實施例335至350中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
1包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。
實施例352. 如實施例351之經分離多肽或多肽複合物，其中該經修飾之胺基酸或經修飾之非天然胺基酸包含轉譯後修飾。
實施例353. 如實施例298至352中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中該經分離多肽或多肽複合物進一步包含半衰期延長分子(H
1)。
實施例354. 如實施例353之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1連接至該肽。
實施例355. 如實施例353或354之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1不阻斷該CD28結合域與CD28結合。
實施例356. 如實施例354至355中任一項之經分離多肽或多肽複合物，H
1包含連接H
1與該肽之連接部分(L
5)。
實施例357. 如實施例353至356中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中該半衰期延長分子(H
1)對CD28不具有結合親和力。
實施例358. 如實施例353至357中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中該半衰期延長分子(H
1)不會使該經分離多肽或多肽複合物隔離CD28。
實施例359. 如實施例353至358中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含根據SEQ ID NO: 54-57之序列。
實施例360. 如實施例353至359中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含具有重複序列模體之胺基酸序列。
實施例361. 如實施例353至360中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含具有高度有序二級結構之胺基酸序列。
實施例362. 如實施例353至361中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含聚合物。
實施例363. 如實施例362之經分離多肽或多肽複合物，其中該聚合物為聚乙二醇(PEG)。
實施例364. 如實施例353至361中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含白蛋白。
實施例365. 如實施例353至361中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含Fc域。
實施例366. 如實施例364之經分離多肽或多肽複合物，其中該白蛋白為血清白蛋白。
實施例367. 如實施例364之經分離多肽或多肽複合物，其中該白蛋白為人類血清白蛋白。
實施例368. 如實施例353至361中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含多肽、配體或小分子。
實施例369. 如實施例368之經分離多肽或多肽複合物，其中該多肽、該配體或該小分子結合血清蛋白或其片段、循環免疫球蛋白或其片段、或CD35/CR1。
實施例370. 如實施例369之經分離多肽或多肽複合物，其中該血清蛋白包含甲狀腺素結合蛋白、甲狀腺素運載蛋白、1-酸性醣蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體或其運鐵蛋白結合部分、纖維蛋白原或白蛋白。
實施例371. 如實施例369之經分離多肽或多肽複合物，其中該循環免疫球蛋白分子包含IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。
實施例372. 如實施例369之經分離多肽或多肽複合物，其中該血清蛋白為白蛋白。
實施例373. 如實施例368之經分離多肽或多肽複合物，其中該多肽為抗體。
實施例374. 如實施例373之經分離多肽或多肽複合物，其中該抗體包含單域抗體、單鏈可變片段、Fab或Fab'。
實施例375. 如實施例374之經分離多肽或多肽複合物，其中該單域抗體包含與白蛋白結合之單域抗體。
實施例376. 如實施例374之經分離多肽或多肽複合物，其中該單域抗體為人類或人源化抗體。
實施例377. 如實施例374之經分離多肽或多肽複合物，其中該單域抗體係選自由以下組成之群：645gH1gL1、645dsgH5gL4、23-13-A01 -sc02、A10m3或其片段、DOM7r-31、DOM7h-11-15、Alb-1、Alb-8、Alb-23、10G、10E及SA21。
實施例378. 如實施例374之經分離多肽或多肽複合物，其中該單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 54，HC-CDR2：SEQ ID NO: 55，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 56；且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。
實施例379. 如實施例353至361中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含根據SEQ ID NO: 57之胺基酸序列。
實施例380. 如實施例353至361中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
實施例381. 如實施例353至361中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。
實施例382. 如實施例353至361中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
實施例383. 如實施例353至361中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例384. 如實施例353至361中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含與SEQ ID NO: 57具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例385. 如實施例353至361中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。
實施例386. 如實施例385之經分離多肽或多肽複合物，其中該經修飾之胺基酸或經修飾之非天然胺基酸包含轉譯後修飾。
實施例387. 如實施例353至387中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中H
1包含連接H
1與P
1或P
2之連接部分(L
5)。
實施例388. 如實施例387之經分離多肽或多肽複合物，其中L
5為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。
實施例389. 如實施例387至388中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
5為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。
實施例390. 如實施例387至389中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
5為具有至少10個胺基酸之肽序列。
實施例391. 如實施例387至390中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
5為具有至少18個胺基酸之肽序列。
實施例392. 如實施例387至391中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
5為具有至少26個胺基酸之肽序列。
實施例393. 如實施例387至392中任一項之經分離多肽或多肽複合物，其中L
5包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。
實施例394. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，包含向該個體投與如實施例1至180中任一項之多特異性抗體。
實施例395. 如實施例394之方法，其中該多特異性抗體誘導T細胞介導之腫瘤細胞的細胞毒性。
實施例396. 如實施例394或395之方法，其中該癌症為惡性血液病。
實施例397. 如實施例394或395之方法，其中該癌症為白血病或淋巴瘤。
實施例398. 如實施例394或395之方法，其中該癌症為淋巴瘤，且其中該淋巴瘤為B細胞淋巴瘤。
實施例399. 如實施例394或395之方法，其中該癌症為實體腫瘤。
實施例400. 如實施例399之方法，其中該實體腫瘤表現PD-L1。
實施例401. 如實施例399之方法，其中該實體腫瘤為肉瘤、乳癌、肺癌或癌瘤。
實施例402. 如實施例399之方法，其中該實體腫瘤為肺癌，且其中該肺癌為非小細胞肺癌。
實施例403. 如實施例394至402中任一項之方法，其中該多特異性抗體與抗癌療法組合投與。
實施例404. 如實施例403之方法，其中該多特異性抗體及該抗癌療法在同一醫藥組合物中投與。
實施例405. 如實施例403之方法，其中該多特異性抗體及該抗癌療法作為單獨的醫藥組合物投與。
實施例406. 如實施例403至405中任一項之方法，其中該個體難以用檢查點抑制劑療法治療。
實施例407. 如實施例403至405中任一項之方法，其中該個體已自檢查點抑制劑療法復發。
實施例408. 如實施例403至407中任一項之方法，其中該抗癌療法包含小分子、基於細胞之療法或基於抗體之療法。
實施例409. 如實施例408之方法，其中該基於抗體之療法為T細胞接合子。
實施例410. 如實施例409之方法，其中該T細胞接合子包含根據以下之式：D
1-L
0-E
1(式II)，其中D
1包含與效應細胞抗原結合之效應細胞結合域，E
1包含與腫瘤抗原結合之腫瘤抗原結合域，且L
0包含連接D
1與E
1之連接子。
實施例411. 如實施例410之方法，其中D
1包含單鏈可變片段、單域抗體或Fab片段。
實施例412. 如實施例411之方法，其中D
1包含該單鏈可變片段。
實施例413. 如實施例409至411中任一項之方法，其中E
1包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab片段或Fab'。
實施例414. 如實施例413之方法，其中E
1包含該Fab片段。
實施例415. 如實施例410至414中任一項之方法，其中該效應細胞結合域包含選自由以下組成之群的互補決定區(CDR)：莫羅單抗-CD3 (OKT3)、奧昔組單抗(TRX4)、替利組單抗(MGA031)、維西珠單抗(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030 (BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、15865、15865v12、15865v16及15865v19。
實施例416. 如實施例410至415中任一項之方法，其中該效應細胞結合域包含根據SEQ ID NO: 89-101之胺基酸序列。
實施例417. 如實施例410至416中任一項之方法，其中該腫瘤抗原包含表皮生長因子受體(EGFR)、***特異性膜抗原(PSMA)或腫瘤相關鈣信號轉導子2 (下文稱為TROP2)。
實施例418. 如實施例417之方法，其中該腫瘤抗原包含EGFR。
實施例419. 如實施例418之方法，其中該腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 102-111之胺基酸序列。
實施例420. 如實施例417之方法，其中該腫瘤抗原包含EGFR，且該腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 105；HC-CDR2：SEQ ID NO: 106；HC-CDR3：SEQ ID NO: 107；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 102；LC-CDR2：SEQ ID NO: 103 (YAS)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 104。
實施例421. 如實施例417之方法，其中該腫瘤抗原包含EGFR，且該T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 181及182具有至少95%序列一致性或根據SEQ ID NO: 214及215具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例422. 如實施例417之方法，其中該腫瘤抗原包含EGFR，且該T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 181及182或根據SEQ ID NO: 214及215之胺基酸序列。
實施例423. 如實施例417之方法，其中該癌症為結腸直腸癌(CRC)、頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、非小細胞肺癌(NSCLC)、***癌、乳癌、結腸/直腸癌、頭頸癌、食道胃癌、肝癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌、腎癌或胰臟癌。
實施例424. 如實施例417之方法，其中該腫瘤抗原包含TROP2。
實施例425. 如實施例416之方法，其中該腫瘤抗原包含TROP2，且該腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 112；HC-CDR2：SEQ ID NO: 113；HC-CDR3：SEQ ID NO: 114；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 115；LC-CDR2：SEQ ID NO: 116 (SAS)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 117。
實施例426. 如實施例417之方法，其中該腫瘤抗原包含TROP2，且該T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 187-192具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例427. 如實施例417之方法，其中該腫瘤抗原包含TROP2，且該T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 187-192中之任一者之胺基酸序列。
實施例428. 如實施例417之方法，其中該腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 112-119之胺基酸序列。
實施例429. 如實施例417之方法，其中該癌症為肺癌、乳癌(例如HER2+；ER/PR+；TNBC)、子宮頸癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胰臟癌、胃癌、三陰性乳癌(TNBC)、尿道上皮癌(UC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、胃癌、食道癌、頭頸癌、***癌或子宮內膜癌。
實施例430. 如實施例417之方法，其中該腫瘤抗原包含PSMA。
實施例431. 如實施例417之方法，其中該腫瘤抗原結合域包含根據SEQ ID NO: 120-127之胺基酸序列。
實施例432. 如實施例417之方法，其中該腫瘤抗原包含PSMA，且該腫瘤結合域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含HC-CDR1：SEQ ID NO: 120；HC-CDR2：SEQ ID NO: 121；HC-CDR3：SEQ ID NO: 122；且其中該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 123；LC-CDR2：SEQ ID NO: 124 (EA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 125。
實施例433. 如實施例417之方法，其中該腫瘤抗原包含PSMA，且該T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 173及174具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例434. 如實施例417之方法，其中該腫瘤抗原包含PSMA，且該T細胞接合子包含根據SEQ ID NO: 173及174之胺基酸序列。
實施例435. 如實施例417之方法，其中該癌症為肺癌、乳癌(例如HER2+；ER/PR+；TNBC)、子宮頸癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胰臟癌或胃癌。
實施例436. 如實施例408至435中任一項之方法，其中該T細胞接合分子在腫瘤微環境中選擇性活化。
實施例437. 如實施例436之方法，其中該T細胞接合子係根據以下子式：P
3-L
3-D
1-L
0-E
1(式IIa)，其中D
1包含該CD3結合域；E
1包含該腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之該連接子；P
3包含與D
1結合之肽，且L
3包含連接D
1與P
3之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
實施例438. 如實施例436之方法，其中該T細胞接合子係根據以下子式：D
1-L
0-E
1-L
4-P
4(式IIb)，其中D
1包含該CD3結合域；E
1包含該腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之該連接子；P
4包含與E
1結合之肽，且L
4包含連接E
1與P
4之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
實施例439. 如實施例436之方法，其中該T細胞接合子係根據以下子式：P
3-L
3-D
1-L
0-E
1-L
4-P
4(式IIc)，其中D
1包含該CD3結合域；E
1包含該腫瘤抗原結合域；L
0包含連接D
1與E
1之該連接子；P
3包含與D
1結合之肽，且L
3包含連接D
1與P
3之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質；P
4包含與E
1結合之肽，且L
4包含連接E
1與P
4之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質。
實施例440. 如實施例437至439中任一項之方法，其中該T細胞接合子包含H
1。
實施例441. 如實施例440之方法，其中H
1包含根據SEQ ID NO: 54-57之序列。
實施例442. 如實施例440之方法，其中H
1包含單域抗體。
實施例443. 如實施例440之方法，其中該單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 54，HC-CDR2：SEQ ID NO: 55，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 56。
實施例444. 如實施例437至443中任一項之方法，其中L
3或L
4為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。
實施例445. 如實施例437至444中任一項之方法，其中L
3或L
4為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。
實施例446. 如實施例437至445中任一項之方法，其中L
3或L
4為具有至少10個胺基酸之肽序列。
實施例447. 如實施例437至446中任一項之方法，其中L
3或L
4為具有至少18個胺基酸之肽序列。
實施例448. 如實施例437至447中任一項之方法，其中L
3或L
4為具有至少26個胺基酸之肽序列。
實施例449. 如實施例437至448中任一項之方法，其中L
3或L
4包含含有(G
2S)
n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。
實施例450. 如實施例437至449中任一項之方法，其中L
3或L
4包含含有(G
2S)
n之式，其中n為至少1之整數。
實施例451. 如實施例437至443中任一項之方法，其中L
3或L
4包含選自由以下組成之群的式：(G
2S)
n、(GS)
n、(GSGGS)
n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS)
n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)
n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。
實施例452. 如實施例437至451中任一項之方法，其中該腫瘤特異性蛋白酶係選自由以下組成之群：金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶及天冬胺酸蛋白酶。
實施例453. 如實施例437至452中任一項之方法，其中L
3或L
4包含尿激酶可裂解胺基酸序列、間質蛋白酶可裂解胺基酸序列或基質金屬蛋白酶可裂解胺基酸序列。
實施例454. 如實施例437至453中任一項之方法，其中L
3或L
4包含根據SEQ ID NO: 18-19、62-88之序列。
實施例455. 如實施例437至454中任一項之方法，其中L
3與D
1之N端結合。
實施例456. 如實施例437至454中任一項之方法，其中L
3與D
1之C端結合。
實施例457. 如實施例438至454中任一項之方法，其中L
4與E
1之N端結合。
實施例458. 如實施例438至454中任一項之方法，其中L
4與E
1之C端結合。
實施例459. 如實施例437至458中任一項之方法，其中當L
3由該腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
3變得與D
1不再結合，從而使D
1暴露於CD3。
實施例460. 如實施例438至459中任一項之方法，其中當L
4由該腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
4變得與E
1不再結合，從而使E
1暴露於該腫瘤抗原。
實施例461. 如實施例437至460中任一項之方法，其中P
3削弱D
1與CD3之結合。
實施例462. 如實施例437至461中任一項之方法，其中P
3經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與D
1結合。
實施例463. 如實施例437至462中任一項之方法，其中P
3在抗原結合位點處或附近與D
1結合。
實施例464. 如實施例437至463中任一項之方法，其中當L
3由該腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
3變得與D
1不再結合，從而使D
1暴露於CD3。
實施例465. 如實施例437至464中任一項之方法，其中P
3與CD3之序列一致性小於70%。
實施例466. 如實施例437至465中任一項之方法，其中P
3與CD3之序列一致性小於85%。
實施例467. 如實施例437至465中任一項之方法，其中P
3與CD3之序列一致性小於90%。
實施例468. 如實施例437至467中任一項之方法，其中P
3與CD3之序列一致性小於95%。
實施例469. 如實施例437至468中任一項之方法，其中P
3與CD3之序列一致性小於98%。
實施例470. 如實施例437至469中任一項之方法，其中P
3與CD3之序列一致性小於99%。
實施例471. 如實施例437至470中任一項之方法，其中P
3包含根據SEQ ID NO: 177-180之胺基酸序列。
實施例472. 如實施例437至470中任一項之方法，其中P
3包含與CD3共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。
實施例473. 如實施例437至471中任一項之方法，其中P
4削弱E
1與該腫瘤抗原之結合。
實施例474. 如實施例437至473中任一項之方法，其中P
4經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與E
1結合。
實施例475. 如實施例437至474中任一項之方法，其中P
4在抗原結合位點處或附近與E
1結合。
實施例476. 如實施例437至475中任一項之方法，其中當L
4由該腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P
4變得與E
1不再結合，從而使E
1暴露於該腫瘤抗原。
實施例477. 如實施例437至476中任一項之方法，其中P
4與該腫瘤抗原之序列一致性小於70%。
實施例478. 如實施例437至477中任一項之方法，其中P
4與該腫瘤抗原之序列一致性小於80%。
實施例479. 如實施例437至478中任一項之方法，其中P
4與該腫瘤抗原之序列一致性小於85%。
實施例480. 如實施例437至479中任一項之方法，其中P
4與該腫瘤抗原之序列一致性小於90%。
實施例481. 如實施例437至480中任一項之方法，其中P
4與該腫瘤抗原之序列一致性小於95%。
實施例482. 如實施例437至481中任一項之方法，其中P
4包含與該腫瘤抗原共有小於10%之序列一致性的新的胺基酸序列。
實施例483. 如實施例436至482中任一項之方法，其中P
3或P
4包含長度為至少5個胺基酸之肽序列。
實施例484. 如實施例436至483中任一項之方法，其中P
3或P
4包含長度為至少6個胺基酸之肽序列。
實施例485. 如實施例436至484中任一項之方法，其中P
3或P
4包含長度為至少10個胺基酸之肽序列。
實施例486. 如實施例436至485中任一項之方法，其中P
3或P
4包含長度為至少10個胺基酸且長度不超過20個胺基酸之肽序列。
實施例487. 如實施例436至486中任一項之方法，其中P
3或P
4包含長度為至少16個胺基酸之肽序列。
實施例488. 如實施例436至487中任一項之方法，其中P
3或P
4包含長度不超過40個胺基酸之肽序列。
實施例489. 如實施例436至488中任一項之方法，其中P
3或P
4包含至少兩個半胱胺酸胺基酸殘基。
實施例490. 如實施例436至489中任一項之方法，其中P
3或P
4包含環狀肽或線性肽。
實施例491. 如實施例436至490中任一項之方法，其中P
3或P
4包含環狀肽。
實施例492. 如實施例436至490中任一項之方法，其中P
3或P
4包含線性肽。
實施例493. 如實施例437至492中任一項之方法，其中P
4包含根據SEQ ID NO: 185或186之胺基酸序列。
實施例494. 如實施例437至492中任一項之方法，其中該腫瘤抗原包含EGFR，且該T細胞接合子包含SEQ ID NO: 183及184之胺基酸序列。
實施例495. 如實施例437至492中任一項之方法，其中P
4包含根據SEQ ID NO: 199-201之胺基酸序列。
實施例496. 如實施例437至492中任一項之方法，其中該腫瘤抗原包含TROP2，且該T細胞接合子包含SEQ ID NO: 193-198之胺基酸序列中之任一者。
實施例497. 如實施例437至492中任一項之方法，其中該腫瘤抗原包含PSMA，且該T細胞接合子包含SEQ ID NO: 175及176之胺基酸序列。
實施例498. 如實施例210之醫藥組合物，其中該基於抗體之療法包含抗PD-1抗體療法。
實施例499. 如實施例498之醫藥組合物，其中該抗PD-1抗體療法包含派姆單抗或納武單抗之互補決定區(CDR)。
實施例500. 如實施例498之醫藥組合物，其中該抗PD-1抗體療法包含SEQ ID NO: 222及223之胺基酸序列。
實施例501. 如實施例498之醫藥組合物，其中該抗PD-1抗體療法包含SEQ ID NO: 226及227之胺基酸序列。
實施例502. 如實施例403之方法，其中該基於抗體之療法包含抗PD-1抗體療法。
實施例503. 如實施例502之方法，其中該抗PD-1抗體療法包含派姆單抗或納武單抗之互補決定區(CDR)。
實施例504. 如實施例502之方法，其中該抗PD-1抗體療法包含SEQ ID NO: 222及223之胺基酸序列。
實施例505. 如實施例502之方法，其中該抗PD-1抗體療法包含SEQ ID NO: 226及227之胺基酸序列。
實例 實例 1. 與抗 CD28 scFv 結合之肽的發現
掩蔽根據SEQ ID NO: 9之抗CD28 scFv的前導肽係根據
圖 2之方法藉由噬菌體呈現來鑑別。隨後將前導命中物合成為肽且如下文所述進行評估。以標準酶聯免疫吸附分析(ELISA)型式評估合成肽結合人類抗CD28 scFv之能力。簡言之，在經中性抗生物素蛋白塗佈之盤上捕捉經生物素標記之肽。隨後將稀釋於緩衝液中之抗CD28 scFv或Ab-12添加至肽捕捉盤中。使用標準辣根過氧化酶結合物二級抗體偵測結合的抗CD28 scFv。使用Graphpad Prism軟體計算達成50%最大信號所需之抗CD28 scFv或Ab-12濃度(EC50)。亦評估肽抑制抗CD28 scFv或Ab-12結合其同源抗原CD28之能力。簡言之，在經中性抗生物素蛋白塗佈之盤上捕捉經生物素標記之CD28抗原。將2 nM之抗CD28 scFv或5 nM之Ab-12與0-100 uM滴定肽一起預培育。在短暫的預培育期後，將滴定肽與固定的抗CD28 scFv (2 nM)或Ab-12 (5 nM)之混合物添加至CD28抗原捕捉盤中。在盤上短暫培育後，用標準辣根過氧化酶結合的二級抗體偵測結合的抗CD28 scFv或Ab-12。在Graphpad Prism軟體中計算使最大信號減少50%所需之肽濃度(IC50)。
圖 3A繪示藉由ELISA量測之抗CD28 scFv (SEQ ID NO: 9)與肽的結合。
圖 3B繪示藉由ELISA量測之Ab-12與肽的結合。Ab-12為一種Vh型式之抗PD-L1×CD28 (未掩蔽)抗體。
圖 3C繪示藉由ELISA量測之抗CD28 scFv與肽的結合。
圖 3D繪示藉由ELISA量測之Ab-12與肽的結合。
圖 3E-3F繪示藉由ELISA量測之抑制抗CD28 scFv與CD28抗原結合的肽。
圖 3G繪示藉由ELISA量測之抑制Ab-12結合CD28的肽。
實例 2. 抗 CD28 scFv (SEQ ID NO: 9) 或 Ab-12 (Vh 型式之抗 PD-L1 ×CD28 未掩蔽抗體 ) 與肽 -9 及肽 -12 之動力學結合分析 .
此實例在活體外動力學結合分析中評定抗CD28 scFv或Ab-12與肽-9及肽-12之結合。使用Octet RED96儀器藉由生物層干涉術評估抗CD28 scFv或Ab-12與肽-9及肽-12之動力學結合。簡言之，卵白素生物感測器裝載有經生物素標記之肽且在緩衝液中基線化。抗CD28 scFv或Ab-12以100 nM、50 nM、25 nM及12.5 nM之溶液進行滴定，隨後締合至裝載肽之感測器上。在短暫的締合期後，將感測器轉移至緩衝液中且量測結合的抗CD28 scFv或Ab-12之解離。實驗之時序及步驟展示於隨附表中。即時記錄締合及解離信號，且使用儀器軟體內之1:1結合模型進行分析。使用1:1結合模型之分析能夠計算締合及解離速率常數以及親和力KD。肽-9及肽-12動力學結合感測器圖譜展示於
圖 4A-4D中且彙總於
表17-19中。
表 17. 分析之時序及步驟
表 18. 抗 CD28 scFv 與 肽 -9 及肽 -12 之結合動力學概述
表 19. Ab-12 與 肽 -9 及肽 -12 之結合動力學概述
實例 3 ： 經最佳化之噬菌體庫構築 - 抗 CD28 scFv(SEQ ID NO: 9) 肽 -9
| 步驟 | 時間 |
| 基線：緩衝液 | 60秒 |
| 裝載： ● 200 nM肽-9 ● 200 nM肽-12 | 300秒 |
| 基線：緩衝液 | 300秒 |
| 在octet緩衝液中締合 ● 100 nM Ab-12或CD28 scFv ● 50 nM Ab-12或CD28 scFv ● 25 nM Ab-12或CD28 scFv ● 12.5 nM Ab-12或CD28 scFv | 300秒 |
| 解離：緩衝液 | 900秒 |
| 結合域 | 肽 | KD (M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
| CD28 scFv | 肽-9 | 3.77E-07 | 3.25E+04 | 1.23E-02 |
| CD28 scFv | 肽-12 | 1.70E-08 | 9.87E+04 | 1.67E-03 |
| 結合域 | 肽 | KD (M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
| Ab-12 | 肽-9 | 1.88E-08 | 1.68E+05 | 3.17E-03 |
| Ab-12 | 肽-12_200nM | 1.31E-08 | 9.66E+04 | 1.27E-03 |
藉由將肽內之各個別殘基突變為丙胺酸且量測針對抗CD28 scFv之結合及抑制，建立肽-9之序列活性關係。丙胺酸突變顯著減弱結合及抑制之肽殘基視為不容許突變之關鍵殘基。丙胺酸突變與非突變序列表現類似的肽殘基視為確實容許突變之非關鍵位點。使用肽序列活性關係(SAR)，構築DNA寡核苷酸庫，其中編碼各肽序列內之關鍵殘基的密碼子突變程度最低且編碼非關鍵殘基之密碼子經大量突變。所得寡核苷酸選殖至噬菌體載體中，用於經由融合至噬菌體之pIII長絲來呈現SAR引導肽。相關載體隨後用於使用本領域之標準技術經由在細菌中擴增而產生噬菌體最佳化庫。
圖 5A及
圖 5B展現根據實例1之ELISA方案的抗CD28 scFv與肽-9之丙胺酸掃描肽的結合。
圖 6A及
圖 6B展現根據實例1之ELISA方案的肽-9之丙胺酸掃描肽的抗CD28 scFv抑制。
實例 4 ：淘選 ELISA- 抗 CD28 scFv 肽
單株噬菌體以粗製上清液形式收穫且經由標準酶聯免疫吸附分析(ELISA)進行篩選。簡言之，在經中性抗生物素蛋白塗佈之盤上捕捉經生物素標記之抗CD28 scFv。在添加單株噬菌體之前，將孔用阻斷緩衝液及CD28可溶性蛋白或單獨的阻斷緩衝液培育。在不洗滌或抽吸的情況下，隨後將單株噬菌體上清液添加至孔中且培育短時間。隨後洗滌各孔，接著使用辣根過氧化酶結合的抗M13抗體偵測結合的噬菌體。隨後將所關注之單株噬菌體送去進行序列分析。
抗CD28 scFv肽-9庫序列之噬菌體淘選結果展示於
表 20中。鑑別出453個單株噬菌體序列。自
表 20之所有序列計算出的共同序列展示於
圖 7中，且係使用WebLogo 3.7.4生成。
表 20. 抗 CD28 scFv 肽 -9 庫序列之噬菌體淘選結果。(-)指示與抗CD28 scFv肽-9相應位置(例如噬菌體-1位置)相同的胺基酸。
實例 5. 藉由 ELISA 量測之 肽抑制抗 CD28 scFv 及 Ab-12 結合 CD28 抗原
| ID | 單株噬菌體肽序列 | SEQ ID NO: | 胺基酸位置序列 | 噬菌體結合 ELISA | SEQ ID NO: | |||||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | # | # | # | # | # | 背景信號 | CD28 scFv 信號 | 在 CD28 存在下之 CD28 scFv 信號 | ||||
| 噬菌體-9 | MDWCPRERWVDCFF | 32 | M | D | W | C | P | R | E | R | W | V | D | C | F | F | 0.084 | 2.042 | 0.489 | 32 |
| 噬菌體-19 | MDWCPIDLWNECFF | 128 | - | - | - | - | - | I | D | L | - | N | E | - | - | - | 0.066 | 2.515 | 0.187 | 128 |
| 噬菌體-20 | MDWCPIHLWHVCFN | 129 | - | - | - | - | - | I | H | L | - | H | V | - | - | N | 0.082 | 2.526 | 0.167 | 129 |
| 噬菌體-21 | MDWCPIYLWSECFN | 130 | - | - | - | - | - | I | Y | L | - | S | E | - | - | N | 0.075 | 2.635 | 0.513 | 130 |
| 噬菌體-22 | MNWCPKDIWYLCFN | 131 | - | N | - | - | - | K | D | I | - | Y | L | - | - | N | 0.073 | 2.625 | 0.168 | 131 |
| 噬菌體-23 | MDWCPLHMWHECFS | 132 | - | - | - | - | - | L | H | M | - | H | E | - | - | S | 0.086 | 2.511 | 0.151 | 132 |
| 噬菌體-24 | MDWCPLYLWNECFN | 133 | - | - | - | - | - | L | Y | L | - | N | E | - | - | N | 0.065 | 2.612 | 0.247 | 133 |
| 噬菌體-25 | MDWCPRDLWDLCFA | 134 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | D | L | - | - | A | 0.078 | 2.696 | 0.219 | 134 |
| 噬菌體-26 | MDWCPRDLWHECFA | 135 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | H | E | - | - | A | 0.063 | 2.710 | 0.277 | 135 |
| 噬菌體-27 | MDWCPRDLWHLCFS | 136 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | H | L | - | - | S | 0.059 | 2.592 | 0.290 | 136 |
| 噬菌體-28 | MDWCPRDLWSECFF | 137 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | S | E | - | - | - | 0.068 | 2.574 | 0.218 | 137 |
| 噬菌體-29 | MDWCPRDLWVHCFA | 138 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | - | H | - | - | A | 0.062 | 2.554 | 0.179 | 138 |
| 噬菌體-30 | MDWCPRDMWDECFA | 139 | - | - | - | - | - | - | D | M | - | D | E | - | - | A | 0.116 | 2.593 | 0.250 | 139 |
| 噬菌體-31 | MDWCPRDMWSECFA | 140 | - | - | - | - | - | - | D | M | - | S | E | - | - | A | 0.069 | 2.701 | 0.293 | 140 |
| 噬菌體-32 | MDWCPRDMWSVCFS | 141 | - | - | - | - | - | - | D | M | - | S | V | - | - | S | 0.062 | 2.619 | 0.207 | 141 |
| 噬菌體-33 | MDWCPRFMWDECFN | 142 | - | - | - | - | - | - | F | M | - | D | E | - | - | N | 0.079 | 2.680 | 0.256 | 142 |
| 噬菌體-34 | MDWCPRHMWNYCFA | 143 | - | - | - | - | - | - | H | M | - | N | Y | - | - | A | 0.089 | 2.712 | 0.242 | 143 |
| 噬菌體-35 | MDWCPRSLWHECFA | 144 | - | - | - | - | - | - | S | L | - | H | E | - | - | A | 0.064 | 2.544 | 0.255 | 144 |
| 噬菌體-36 | MDWCPRYLWHVCFA | 145 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | H | V | - | - | A | 0.072 | 2.475 | 0.226 | 145 |
| 噬菌體-37 | MHWCPVDLWYLCYN | 146 | - | H | - | - | - | V | D | L | - | Y | L | - | Y | N | 0.079 | 2.659 | 0.417 | 146 |
| 噬菌體-38 | MDWCPVHLWSVCFA | 147 | - | - | - | - | - | V | H | L | - | S | V | - | - | A | 0.072 | 2.650 | 0.302 | 147 |
| 噬菌體-39 | MDWCPMHLWHQCFN | 229 | - | - | - | - | - | M | H | L | - | H | Q | - | - | N | 0.073 | 2.555 | 0.299 | 229 |
| 噬菌體-40 | MDWCPIDMWDQCFN | 230 | - | - | - | - | - | I | D | M | - | D | Q | - | - | N | 0.061 | 2.661 | 0.297 | 230 |
| 噬菌體-41 | MAWCPRDKWSECFS | 231 | - | A | - | - | - | - | D | K | - | S | E | - | - | S | 0.062 | 0.853 | 0.147 | 231 |
| 噬菌體-42 | MDWCPRHLWVHCFN | 232 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | - | H | - | - | N | 0.071 | 2.505 | 0.254 | 232 |
| 噬菌體-43 | MDWCPRALWHECFY | 233 | - | - | - | - | - | - | A | L | - | H | E | - | - | Y | 0.115 | 2.499 | 0.252 | 233 |
| 噬菌體-44 | MDWCPIALWAECFN | 234 | - | - | - | - | - | I | A | L | - | A | E | - | - | N | 0.111 | 2.458 | 0.224 | 234 |
| 噬菌體-45 | MDWCPRPLWHECFS | 235 | - | - | - | - | - | - | P | L | - | H | E | - | - | S | 0.078 | 2.346 | 0.121 | 235 |
| 噬菌體-46 | MHWCPIDLWAECYA | 236 | - | H | - | - | - | I | D | L | - | A | E | - | Y | A | 0.082 | 2.278 | 0.225 | 236 |
| 噬菌體-47 | MAWCPVYLWHECFN | 237 | - | A | - | - | - | V | Y | L | - | H | E | - | - | N | 0.094 | 2.273 | 0.351 | 237 |
| 噬菌體-48 | IDWCPRYLWDECYN | 238 | I | - | - | - | - | - | Y | L | - | D | E | - | Y | N | 0.061 | 2.243 | 0.153 | 238 |
| 噬菌體-49 | MSWCPIHLWNECFN | 239 | - | S | - | - | - | I | H | L | - | N | E | - | - | N | 0.083 | 2.057 | 0.284 | 239 |
| 噬菌體-50 | MDWCPPYLWNVCFS | 240 | - | - | - | - | - | P | Y | L | - | N | V | - | - | S | 0.063 | 1.639 | 0.100 | 240 |
| 噬菌體-51 | MDWCPMDLWDYCFN | 241 | - | - | - | - | - | M | D | L | - | D | Y | - | - | N | 0.071 | 1.635 | 0.107 | 241 |
| 噬菌體-52 | MDWCPINLWDECFS | 242 | - | - | - | - | - | I | N | L | - | D | E | - | - | S | 0.062 | 1.498 | 0.096 | 242 |
| 噬菌體-53 | MDWCPMHLWNKCFN | 243 | - | - | - | - | - | M | H | L | - | N | K | - | - | N | 0.071 | 1.043 | 0.122 | 243 |
| 噬菌體-54 | MNWCPRDMWYQCFN | 244 | - | N | - | - | - | - | D | M | - | Y | Q | - | - | N | 0.068 | 1.948 | 0.177 | 244 |
| 噬菌體-55 | QDWCPRHMWSFCFH | 245 | Q | - | - | - | - | - | H | M | - | S | F | - | - | H | 0.138 | 0.074 | 0.081 | 245 |
| 噬菌體-56 | MHWCPMDQWSNCFN | 246 | - | H | - | - | - | M | D | Q | - | S | N | - | - | N | 0.062 | 0.515 | 0.084 | 246 |
| 噬菌體-57 | MDWCPRHRWVDCFY | 247 | - | - | - | - | - | - | H | - | - | - | - | - | - | Y | 0.073 | 0.478 | 0.110 | 247 |
| 噬菌體-58 | MHWCPIDRWADCFN | 248 | - | H | - | - | - | I | D | - | - | A | - | - | - | N | 0.074 | 0.287 | 0.077 | 248 |
| 噬菌體-59 | MDWCPRDSWHLCFA | 249 | - | - | - | - | - | - | D | S | - | H | L | - | - | A | 0.073 | 2.446 | 0.147 | 249 |
| 噬菌體-60 | MDWCPRTLWYLCFN | 250 | - | - | - | - | - | - | T | L | - | Y | L | - | - | N | 0.508 | 2.593 | 1.198 | 250 |
| 噬菌體-61 | MVSCPTTMWNRCFN | 251 | - | V | S | - | - | T | T | M | - | N | R | - | - | N | 0.079 | 1.329 | 0.072 | 251 |
| 噬菌體-62 | MDWCPSYLWNECFF | 252 | - | - | - | - | - | S | Y | L | - | N | E | - | - | - | 0.065 | 1.995 | 0.133 | 252 |
| 噬菌體-64 | MDWCPRALWAECFN | 253 | - | - | - | - | - | - | A | L | - | A | E | - | - | N | 0.068 | 2.676 | 0.339 | 253 |
| 噬菌體-65 | MDWCPMYLWNECFN | 254 | - | - | - | - | - | M | Y | L | - | N | E | - | - | N | 0.064 | 2.609 | 0.471 | 254 |
| 噬菌體-66 | MDWCPRYLWNECFY | 255 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | N | E | - | - | Y | 0.079 | 2.537 | 0.358 | 255 |
| 噬菌體-67 | MNWCPTALWHVCFN | 256 | - | N | - | - | - | T | A | L | - | H | V | - | - | N | 0.067 | 1.644 | 0.169 | 256 |
| 噬菌體-68 | MDWCPMYMWYECFA | 257 | - | - | - | - | - | M | Y | M | - | Y | E | - | - | A | 0.080 | 2.479 | 0.358 | 257 |
| 噬菌體-69 | MDWCPIHMWADCFA | 258 | - | - | - | - | - | I | H | M | - | A | - | - | - | A | 0.065 | 2.457 | 0.143 | 258 |
| 噬菌體-70 | ITWCPSSMWNRCFI | 259 | I | T | - | - | - | S | S | M | - | N | R | - | - | I | 0.065 | 0.379 | 0.110 | 259 |
| 噬菌體-71 | MDWCPRYLWHECFA | 260 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | H | E | - | - | A | 0.071 | 2.628 | 0.429 | 260 |
| 噬菌體-72 | MFWCPTTMWNRCFT | 261 | - | F | - | - | - | T | T | M | - | N | R | - | - | T | 0.111 | 0.662 | 0.338 | 261 |
| 噬菌體-73 | MDWCPRALWHECFN | 262 | - | - | - | - | - | - | A | L | - | H | E | - | - | N | 0.071 | 2.686 | 0.401 | 262 |
| 噬菌體-74 | MDWCPRDMWLFCYN | 263 | - | - | - | - | - | - | D | M | - | L | F | - | Y | N | 0.097 | 2.707 | 1.023 | 263 |
| 噬菌體-75 | MDWCPRSHWHVCYN | 264 | - | - | - | - | - | - | S | H | - | H | V | - | Y | N | 0.072 | 1.951 | 0.281 | 264 |
| 噬菌體-76 | MDWCPRYLWSDCFA | 265 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | S | - | - | - | A | 0.084 | 2.727 | 1.530 | 265 |
| 噬菌體-77 | MDWCPFYLWDECFN | 266 | - | - | - | - | - | F | Y | L | - | D | E | - | - | N | 0.092 | 2.672 | 0.291 | 266 |
| 噬菌體-78 | MDWCPRHLWHECFN | 267 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | H | E | - | - | N | 0.070 | 2.654 | 0.704 | 267 |
| 噬菌體-79 | MDWCPRDLWHECFS | 268 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | H | E | - | - | S | 0.066 | 2.649 | 0.382 | 268 |
| 噬菌體-80 | MDWCPMYLWNECFS | 269 | - | - | - | - | - | M | Y | L | - | N | E | - | - | S | 0.071 | 2.641 | 0.411 | 269 |
| 噬菌體-81 | MDWCPRFLWSVCFN | 270 | - | - | - | - | - | - | F | L | - | S | V | - | - | N | 0.515 | 2.637 | 1.151 | 270 |
| 噬菌體-82 | MDWCPRDLWTECFA | 271 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | T | E | - | - | A | 0.060 | 2.634 | 0.151 | 271 |
| 噬菌體-83 | MDWCPRFLWDECFN | 272 | - | - | - | - | - | - | F | L | - | D | E | - | - | N | 0.065 | 2.629 | 0.483 | 272 |
| 噬菌體-84 | MDWCPKYLWSVCFF | 273 | - | - | - | - | - | K | Y | L | - | S | V | - | - | - | 0.184 | 2.622 | 0.826 | 273 |
| 噬菌體-85 | MDWCPMDLWYQCFN | 274 | - | - | - | - | - | M | D | L | - | Y | Q | - | - | N | 0.063 | 2.617 | 0.187 | 274 |
| 噬菌體-86 | MDWCPRHLWAECFF | 275 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | A | E | - | - | - | 0.066 | 2.611 | 0.292 | 275 |
| 噬菌體-87 | MDWCPKDLWYLCFA | 276 | - | - | - | - | - | K | D | L | - | Y | L | - | - | A | 0.200 | 2.608 | 0.213 | 276 |
| 噬菌體-88 | MDWCPIHLWHYCFN | 277 | - | - | - | - | - | I | H | L | - | H | Y | - | - | N | 0.078 | 2.602 | 0.453 | 277 |
| 噬菌體-89 | MDWCPRALWNVCFN | 278 | - | - | - | - | - | - | A | L | - | N | V | - | - | N | 0.065 | 2.598 | 0.472 | 278 |
| 噬菌體-90 | MDWCPIDLWHLCFY | 279 | - | - | - | - | - | I | D | L | - | H | L | - | - | Y | 0.062 | 2.590 | 0.488 | 279 |
| 噬菌體-91 | MDWCPRDLWFLCYN | 280 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | F | L | - | Y | N | 0.060 | 2.587 | 0.424 | 280 |
| 噬菌體-92 | MDWCPRHLWHECFF | 281 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | H | E | - | - | - | 0.364 | 2.583 | 0.373 | 281 |
| 噬菌體-93 | MDWCPRYLWTVCFS | 282 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | T | V | - | - | S | 0.115 | 2.582 | 0.372 | 282 |
| 噬菌體-94 | MDWCPRDLWSLCFY | 283 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | S | L | - | - | Y | 0.065 | 2.573 | 0.246 | 283 |
| 噬菌體-95 | MDWCPRFLWSECFN | 284 | - | - | - | - | - | - | F | L | - | S | E | - | - | N | 0.062 | 2.571 | 0.227 | 284 |
| 噬菌體-96 | MDWCPRTLWAYCFN | 285 | - | - | - | - | - | - | T | L | - | A | Y | - | - | N | 0.070 | 2.571 | 0.584 | 285 |
| 噬菌體-97 | MDWCPKDLWDYCFA | 286 | - | - | - | - | - | K | D | L | - | D | Y | - | - | A | 0.078 | 2.568 | 0.165 | 286 |
| 噬菌體-98 | MDWCPKYLWDVCFN | 287 | - | - | - | - | - | K | Y | L | - | D | V | - | - | N | 0.096 | 2.566 | 0.422 | 287 |
| 噬菌體-99 | MDWCPRYLWNMCFH | 288 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | N | M | - | - | H | 0.114 | 2.564 | 0.404 | 288 |
| 噬菌體-100 | MDWCPRYLWTECFN | 289 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | T | E | - | - | N | 0.062 | 2.560 | 0.549 | 289 |
| 噬菌體-101 | MDWCPRSLWHYCFA | 290 | - | - | - | - | - | - | S | L | - | H | Y | - | - | A | 0.140 | 2.552 | 0.338 | 290 |
| 噬菌體-102 | MDWCPRYLWAECFY | 291 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | A | E | - | - | Y | 0.063 | 2.552 | 0.354 | 291 |
| 噬菌體-103 | MDWCPRDLWHECFN | 292 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | H | E | - | - | N | 0.074 | 2.552 | 0.218 | 292 |
| 噬菌體-104 | MDWCPRDLWDLCFF | 293 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | D | L | - | - | - | 0.076 | 2.549 | 0.156 | 293 |
| 噬菌體-105 | MDWCPRYLWNVCFN | 294 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | N | V | - | - | N | 0.087 | 2.546 | 0.570 | 294 |
| 噬菌體-106 | MDWCPIYLWDECFN | 295 | - | - | - | - | - | I | Y | L | - | D | E | - | - | N | 0.061 | 2.546 | 0.215 | 295 |
| 噬菌體-107 | MDWCPRDLWAECFN | 296 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | A | E | - | - | N | 0.061 | 2.537 | 0.207 | 296 |
| 噬菌體-108 | MDWCPRALWHECFT | 297 | - | - | - | - | - | - | A | L | - | H | E | - | - | T | 0.075 | 2.536 | 0.191 | 297 |
| 噬菌體-109 | MDWCPKNLWHVCFN | 298 | - | - | - | - | - | K | N | L | - | H | V | - | - | N | 0.081 | 2.530 | 0.248 | 298 |
| 噬菌體-110 | MDWCPRYLWDECFN | 299 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | D | E | - | - | N | 0.069 | 2.529 | 0.283 | 299 |
| 噬菌體-111 | MDWCPFYLWNECFY | 300 | - | - | - | - | - | F | Y | L | - | N | E | - | - | Y | 0.099 | 2.528 | 0.594 | 300 |
| 噬菌體-112 | MHWCPRALWDVCYN | 301 | - | H | - | - | - | - | A | L | - | D | V | - | Y | N | 0.077 | 2.528 | 0.240 | 301 |
| 噬菌體-113 | MDWCPRDLWNVCFF | 302 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | N | V | - | - | - | 0.164 | 2.520 | 0.137 | 302 |
| 噬菌體-114 | MDWCPRYLWFECFA | 303 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | F | E | - | - | A | 0.066 | 2.504 | 0.210 | 303 |
| 噬菌體-115 | MDWCPRYLWHECFN | 304 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | H | E | - | - | N | 0.105 | 2.490 | 0.421 | 304 |
| 噬菌體-116 | MDWCPRDLWYACFA | 305 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | Y | A | - | - | A | 0.072 | 2.474 | 0.242 | 305 |
| 噬菌體-117 | MDWCPRYLWFECFS | 306 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | F | E | - | - | S | 0.079 | 2.462 | 0.235 | 306 |
| 噬菌體-118 | MDWCPRHLWDECFF | 307 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | D | E | - | - | - | 0.074 | 2.459 | 0.663 | 307 |
| 噬菌體-119 | MDWCPRYLWHMCYS | 308 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | H | M | - | Y | S | 0.129 | 2.419 | 1.166 | 308 |
| 噬菌體-120 | MDWCPRDLWHACFS | 309 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | H | A | - | - | S | 0.074 | 2.414 | 0.173 | 309 |
| 噬菌體-121 | MDWCPRDLWHVCFF | 310 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | H | V | - | - | - | 0.068 | 2.412 | 0.268 | 310 |
| 噬菌體-122 | MDWCPRDLWDQCYA | 311 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | D | Q | - | Y | A | 0.059 | 2.406 | 0.201 | 311 |
| 噬菌體-123 | MDWCPIHLWNECFA | 312 | - | - | - | - | - | I | H | L | - | N | E | - | - | A | 0.104 | 2.405 | 0.203 | 312 |
| 噬菌體-124 | MDWCPRPLWDMCFF | 313 | - | - | - | - | - | - | P | L | - | D | M | - | - | - | 0.063 | 2.403 | 0.138 | 313 |
| 噬菌體-125 | MDWCPVSLWHVCFY | 314 | - | - | - | - | - | V | S | L | - | H | V | - | - | Y | 0.107 | 2.401 | 0.409 | 314 |
| 噬菌體-126 | MDWCPRFLWNECFN | 315 | - | - | - | - | - | - | F | L | - | N | E | - | - | N | 0.072 | 2.400 | 0.503 | 315 |
| 噬菌體-127 | MDWCPRALWNECFA | 316 | - | - | - | - | - | - | A | L | - | N | E | - | - | A | 0.080 | 2.385 | 0.375 | 316 |
| 噬菌體-128 | MDWCPRDLWIECFF | 317 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | I | E | - | - | - | 0.084 | 2.372 | 0.137 | 317 |
| 噬菌體-129 | MDWCPSYLWTVCFA | 318 | - | - | - | - | - | S | Y | L | - | T | V | - | - | A | 0.062 | 2.340 | 0.096 | 318 |
| 噬菌體-130 | MDWCPRYLWDACFF | 319 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | D | A | - | - | - | 0.066 | 2.337 | 0.168 | 319 |
| 噬菌體-131 | MDWCPRSLWIYCFN | 320 | - | - | - | - | - | - | S | L | - | I | Y | - | - | N | 0.113 | 2.336 | 0.401 | 320 |
| 噬菌體-132 | MDWCPTYLWFECFN | 321 | - | - | - | - | - | T | Y | L | - | F | E | - | - | N | 0.205 | 2.329 | 0.224 | 321 |
| 噬菌體-133 | MDWCPRFLWDECFF | 322 | - | - | - | - | - | - | F | L | - | D | E | - | - | - | 0.064 | 2.284 | 0.246 | 322 |
| 噬菌體-134 | MDWCPSYLWHECFA | 323 | - | - | - | - | - | S | Y | L | - | H | E | - | - | A | 0.096 | 2.284 | 0.198 | 323 |
| 噬菌體-135 | MDWCPKFLWHECFS | 324 | - | - | - | - | - | K | F | L | - | H | E | - | - | S | 0.065 | 2.279 | 0.142 | 324 |
| 噬菌體-136 | MHWCPIYLWDECFN | 325 | - | H | - | - | - | I | Y | L | - | D | E | - | - | N | 0.071 | 2.234 | 0.193 | 325 |
| 噬菌體-137 | MDWCPRYLWHECFH | 326 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | H | E | - | - | H | 0.101 | 2.193 | 0.308 | 326 |
| 噬菌體-138 | MDWCPTNLWHECFA | 327 | - | - | - | - | - | T | N | L | - | H | E | - | - | A | 0.061 | 2.163 | 0.096 | 327 |
| 噬菌體-139 | MDWCPRDLWDVCFA | 328 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | D | V | - | - | A | 0.096 | 2.158 | 0.280 | 328 |
| 噬菌體-140 | MDWCPMDLWDVCFN | 329 | - | - | - | - | - | M | D | L | - | D | V | - | - | N | 0.090 | 2.149 | 0.263 | 329 |
| 噬菌體-141 | MDWCPRSLWNVCFF | 330 | - | - | - | - | - | - | S | L | - | N | V | - | - | - | 0.106 | 2.131 | 0.356 | 330 |
| 噬菌體-142 | MDWCPVILWDFCFN | 331 | - | - | - | - | - | V | I | L | - | D | F | - | - | N | 0.066 | 2.030 | 0.173 | 331 |
| 噬菌體-143 | LDWCPLNLWDLCYF | 332 | L | - | - | - | - | L | N | L | - | D | L | - | Y | - | 0.062 | 2.028 | 0.095 | 332 |
| 噬菌體-144 | MDWCPRHLWYACFN | 333 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | Y | A | - | - | N | 0.061 | 2.012 | 0.159 | 333 |
| 噬菌體-145 | MDWCPKHLWIECFA | 334 | - | - | - | - | - | K | H | L | - | I | E | - | - | A | 0.065 | 1.977 | 0.132 | 334 |
| 噬菌體-146 | MDWCPRHLWSECFY | 335 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | S | E | - | - | Y | 0.136 | 1.918 | 0.199 | 335 |
| 噬菌體-147 | MHWCPRDLWVVCFN | 336 | - | H | - | - | - | - | D | L | - | - | V | - | - | N | 0.070 | 1.834 | 0.112 | 336 |
| 噬菌體-148 | MHWCPEYLWNECFA | 337 | - | H | - | - | - | E | Y | L | - | N | E | - | - | A | 0.074 | 1.687 | 0.092 | 337 |
| 噬菌體-149 | MDWCPRDLWAVCFA | 338 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | A | V | - | - | A | 0.070 | 1.669 | 0.089 | 338 |
| 噬菌體-150 | MDWCPRHLWNVCFS | 339 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | N | V | - | - | S | 0.058 | 1.613 | 0.176 | 339 |
| 噬菌體-151 | MDFCPISLWHECFF | 340 | - | - | F | - | - | I | S | L | - | H | E | - | - | - | 0.081 | 1.585 | 0.129 | 340 |
| 噬菌體-152 | MDWCPKYLWDKCFH | 341 | - | - | - | - | - | K | Y | L | - | D | K | - | - | H | 0.073 | 1.540 | 0.109 | 341 |
| 噬菌體-153 | MDWCPRHLWDLCFF | 342 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | D | L | - | - | - | 0.093 | 1.395 | 0.182 | 342 |
| 噬菌體-154 | MDWCPRDLWNVCFA | 343 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | N | V | - | - | A | 0.114 | 1.382 | 0.145 | 343 |
| 噬菌體-155 | MHWCPLHLWNECYH | 344 | - | H | - | - | - | L | H | L | - | N | E | - | Y | H | 0.063 | 1.370 | 0.113 | 344 |
| 噬菌體-156 | MDWCPKHLWHQCFH | 345 | - | - | - | - | - | K | H | L | - | H | Q | - | - | H | 0.058 | 1.351 | 0.108 | 345 |
| 噬菌體-157 | MDWCPRSLWSYCFH | 346 | - | - | - | - | - | - | S | L | - | S | Y | - | - | H | 0.066 | 1.335 | 0.152 | 346 |
| 噬菌體-158 | MDWCPRYLWTECFF | 347 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | T | E | - | - | - | 0.110 | 1.265 | 0.244 | 347 |
| 噬菌體-159 | MAWCPMNLWDQCFF | 348 | - | A | - | - | - | M | N | L | - | D | Q | - | - | - | 0.070 | 1.202 | 0.145 | 348 |
| 噬菌體-160 | MHWCPRALWHECFN | 349 | - | H | - | - | - | - | A | L | - | H | E | - | - | N | 0.070 | 1.178 | 0.144 | 349 |
| 噬菌體-161 | MDWCPRHLWDQCFA | 350 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | D | Q | - | - | A | 0.150 | 1.122 | 0.144 | 350 |
| 噬菌體-162 | MNWCPTDLWHECFN | 351 | - | N | - | - | - | T | D | L | - | H | E | - | - | N | 0.087 | 1.093 | 0.095 | 351 |
| 噬菌體-163 | MFWCPRYLWHECFN | 352 | - | F | - | - | - | - | Y | L | - | H | E | - | - | N | 0.086 | 1.078 | 0.175 | 352 |
| 噬菌體-164 | MDWCPKFLWDLCFA | 353 | - | - | - | - | - | K | F | L | - | D | L | - | - | A | 0.100 | 1.075 | 0.139 | 353 |
| 噬菌體-165 | MDWCPFYLWDECFL | 354 | - | - | - | - | - | F | Y | L | - | D | E | - | - | L | 0.070 | 1.024 | 0.141 | 354 |
| 噬菌體-166 | MDWCPRHLWDLCFA | 355 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | D | L | - | - | A | 0.061 | 0.925 | 0.096 | 355 |
| 噬菌體-167 | MSWCPQDLWHVCFN | 356 | - | S | - | - | - | Q | D | L | - | H | V | - | - | N | 0.095 | 0.860 | 0.112 | 356 |
| 噬菌體-168 | MDWCPKDLWHECFN | 357 | - | - | - | - | - | K | D | L | - | H | E | - | - | N | 0.073 | 0.762 | 0.100 | 357 |
| 噬菌體-169 | MDWCPRDLWNVCFN | 358 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | N | V | - | - | N | 0.100 | 0.740 | 0.108 | 358 |
| 噬菌體-170 | MNWCPSDLWHLCFN | 359 | - | N | - | - | - | S | D | L | - | H | L | - | - | N | 0.071 | 0.739 | 0.131 | 359 |
| 噬菌體-171 | MNWCPSHLWHMCYF | 360 | - | N | - | - | - | S | H | L | - | H | M | - | Y | - | 0.195 | 0.702 | 0.192 | 360 |
| 噬菌體-172 | MDWCPPYLWYECFA | 361 | - | - | - | - | - | P | Y | L | - | Y | E | - | - | A | 0.068 | 0.692 | 0.094 | 361 |
| 噬菌體-173 | MDWCPMNLWSECFN | 362 | - | - | - | - | - | M | N | L | - | S | E | - | - | N | 0.168 | 0.670 | 0.124 | 362 |
| 噬菌體-174 | MDWCPKHLWNECFN | 363 | - | - | - | - | - | K | H | L | - | N | E | - | - | N | 0.063 | 0.663 | 0.105 | 363 |
| 噬菌體-175 | MDWCPAYLWAECFS | 364 | - | - | - | - | - | A | Y | L | - | A | E | - | - | S | 0.082 | 0.640 | 0.120 | 364 |
| 噬菌體-176 | MDWCPSDLWHECFH | 365 | - | - | - | - | - | S | D | L | - | H | E | - | - | H | 0.075 | 0.629 | 0.164 | 365 |
| 噬菌體-177 | MDWCPVSLWDHCFN | 366 | - | - | - | - | - | V | S | L | - | D | H | - | - | N | 0.075 | 0.616 | 0.100 | 366 |
| 噬菌體-178 | LDWCPRDLWHVCFF | 367 | L | - | - | - | - | - | D | L | - | H | V | - | - | - | 0.176 | 0.610 | 0.105 | 367 |
| 噬菌體-179 | MDWCPWILWNECFN | 368 | - | - | - | - | - | W | I | L | - | N | E | - | - | N | 0.141 | 0.581 | 0.137 | 368 |
| 噬菌體-180 | MHWCPRYLWDECFN | 369 | - | H | - | - | - | - | Y | L | - | D | E | - | - | N | 0.132 | 0.550 | 0.127 | 369 |
| 噬菌體-181 | MYWCPRDLWDVCFN | 370 | - | Y | - | - | - | - | D | L | - | D | V | - | - | N | 0.145 | 0.512 | 0.102 | 370 |
| 噬菌體-182 | MHWCPRSLWNECYF | 371 | - | H | - | - | - | - | S | L | - | N | E | - | Y | - | 0.168 | 0.456 | 0.115 | 371 |
| 噬菌體-183 | IDWCPRDLWALCFN | 372 | I | - | - | - | - | - | D | L | - | A | L | - | - | N | 0.127 | 0.370 | 0.129 | 372 |
| 噬菌體-184 | MHWCPINLWNECFS | 373 | - | H | - | - | - | I | N | L | - | N | E | - | - | S | 0.081 | 0.316 | 0.098 | 373 |
| 噬菌體-185 | MERCPRFLWNECFN | 374 | - | E | R | - | - | - | F | L | - | N | E | - | - | N | 0.132 | 0.216 | 0.093 | 374 |
| 噬菌體-186 | QDWCPTYLWHHCFN | 375 | Q | - | - | - | - | T | Y | L | - | H | H | - | - | N | 0.101 | 0.123 | 0.122 | 375 |
| 噬菌體-187 | IGKLTLCLNADLVI | 376 | I | G | K | L | T | L | C | L | N | A | - | L | V | I | 0.274 | 0.116 | 0.100 | 376 |
| 噬菌體-188 | MDWCPSYLWDQCFF | 377 | - | - | - | - | - | S | Y | L | - | D | Q | - | - | - | 0.100 | 0.083 | 0.079 | 377 |
| 噬菌體-189 | VDWCPRYLWHVCYN | 378 | V | - | - | - | - | - | Y | L | - | H | V | - | Y | N | 0.064 | 0.065 | 0.061 | 378 |
| 噬菌體-190 | MDWCPRDMWAECFF | 379 | - | - | - | - | - | - | D | M | - | A | E | - | - | - | 0.099 | 2.687 | 2.259 | 379 |
| 噬菌體-191 | MDWCPRDMWYECFN | 380 | - | - | - | - | - | - | D | M | - | Y | E | - | - | N | 0.099 | 2.564 | 0.235 | 380 |
| 噬菌體-192 | DVWCPKYMWSLCFN | 381 | D | V | - | - | - | K | Y | M | - | S | L | - | - | N | 0.101 | 2.529 | 0.418 | 381 |
| 噬菌體-193 | MDWCPMDMWVNCFN | 382 | - | - | - | - | - | M | D | M | - | - | N | - | - | N | 0.059 | 2.516 | 0.277 | 382 |
| 噬菌體-194 | MDWCPSDMWHECYA | 383 | - | - | - | - | - | S | D | M | - | H | E | - | Y | A | 0.062 | 2.474 | 0.200 | 383 |
| 噬菌體-195 | MDWCPKHMWFMCFN | 384 | - | - | - | - | - | K | H | M | - | F | M | - | - | N | 0.101 | 2.395 | 0.372 | 384 |
| 噬菌體-196 | MDWCPRYMWYQCFS | 385 | - | - | - | - | - | - | Y | M | - | Y | Q | - | - | S | 0.079 | 2.364 | 0.357 | 385 |
| 噬菌體-197 | MDWCPRHMWYECFF | 386 | - | - | - | - | - | - | H | M | - | Y | E | - | - | - | 0.129 | 2.342 | 0.298 | 386 |
| 噬菌體-198 | MDWCPRAMWNHCFN | 387 | - | - | - | - | - | - | A | M | - | N | H | - | - | N | 0.321 | 2.326 | 0.426 | 387 |
| 噬菌體-199 | MDWCPRNMWAQCFA | 388 | - | - | - | - | - | - | N | M | - | A | Q | - | - | A | 0.102 | 2.315 | 0.209 | 388 |
| 噬菌體-200 | MFWCPFDMWHFCFN | 389 | - | F | - | - | - | F | D | M | - | H | F | - | - | N | 0.150 | 2.292 | 0.469 | 389 |
| 噬菌體-201 | MDWCPRDMWDQCFD | 390 | - | - | - | - | - | - | D | M | - | D | Q | - | - | D | 0.072 | 2.292 | 0.119 | 390 |
| 噬菌體-202 | MFWCPMDMWDQCFN | 391 | - | F | - | - | - | M | D | M | - | D | Q | - | - | N | 0.091 | 2.260 | 0.207 | 391 |
| 噬菌體-203 | MSWCPRDMWFYCYA | 392 | - | S | - | - | - | - | D | M | - | F | Y | - | Y | A | 0.065 | 2.248 | 0.174 | 392 |
| 噬菌體-204 | MDWCPRHMWNVCFS | 393 | - | - | - | - | - | - | H | M | - | N | V | - | - | S | 0.067 | 2.245 | 0.130 | 393 |
| 噬菌體-205 | MDWCPTDMWHHCFL | 394 | - | - | - | - | - | T | D | M | - | H | H | - | - | L | 0.061 | 2.201 | 0.126 | 394 |
| 噬菌體-206 | IHWCPINMWDKCYN | 395 | I | H | - | - | - | I | N | M | - | D | K | - | Y | N | 0.060 | 2.080 | 0.203 | 395 |
| 噬菌體-207 | MDWCPRAMWHECFY | 396 | - | - | - | - | - | - | A | M | - | H | E | - | - | Y | 0.069 | 1.915 | 0.129 | 396 |
| 噬菌體-208 | MDWCPTDMWIVCFA | 397 | - | - | - | - | - | T | D | M | - | I | V | - | - | A | 0.363 | 1.495 | 0.172 | 397 |
| 噬菌體-209 | IDWCPQDMWFYCFN | 398 | I | - | - | - | - | Q | D | M | - | F | Y | - | - | N | 0.069 | 1.416 | 0.160 | 398 |
| 噬菌體-210 | MDWCPRDMWFECFA | 399 | - | - | - | - | - | - | D | M | - | F | E | - | - | A | 0.076 | 1.310 | 0.143 | 399 |
| 噬菌體-211 | MDWCPRNMWTVCFL | 400 | - | - | - | - | - | - | N | M | - | T | V | - | - | L | 0.060 | 1.116 | 0.093 | 400 |
| 噬菌體-212 | MDWCPRAMWDKCFF | 401 | - | - | - | - | - | - | A | M | - | D | K | - | - | - | 0.073 | 0.985 | 0.094 | 401 |
| 噬菌體-213 | MNWCPSYMWDQCFA | 402 | - | N | - | - | - | S | Y | M | - | D | Q | - | - | A | 0.125 | 0.854 | 0.105 | 402 |
| 噬菌體-214 | MDWCPTYMWSECFN | 403 | - | - | - | - | - | T | Y | M | - | S | E | - | - | N | 0.086 | 0.754 | 0.107 | 403 |
| 噬菌體-215 | MDWCPRYMWNECFN | 404 | - | - | - | - | - | - | Y | M | - | N | E | - | - | N | 0.064 | 0.687 | 0.128 | 404 |
| 噬菌體-216 | MDWCPMNMWYQCFN | 405 | - | - | - | - | - | M | N | M | - | Y | Q | - | - | N | 0.110 | 0.639 | 0.137 | 405 |
| 噬菌體-217 | MDWCPWDMWDKCFN | 406 | - | - | - | - | - | W | D | M | - | D | K | - | - | N | 0.101 | 0.586 | 0.108 | 406 |
| 噬菌體-218 | TFGCPTTMWNRCFA | 407 | T | F | G | - | - | T | T | M | - | N | R | - | - | A | 0.117 | 0.181 | 0.068 | 407 |
| 噬菌體-219 | NYWCPSSMWNRCLH | 408 | N | Y | - | - | - | S | S | M | - | N | R | - | L | H | 0.295 | 0.158 | 0.088 | 408 |
| 噬菌體-220 | FDFCPTTMWTYCQH | 409 | F | - | F | - | - | T | T | M | - | T | Y | - | Q | H | 0.084 | 0.086 | 0.081 | 409 |
| 噬菌體-221 | TTWCPTSMWLHCFD | 410 | T | T | - | - | - | T | S | M | - | L | H | - | - | D | 0.096 | 0.074 | 0.072 | 410 |
| 噬菌體-222 | MDWCPRDQWHNCFN | 411 | - | - | - | - | - | - | D | Q | - | H | N | - | - | N | 0.075 | 0.200 | 0.078 | 411 |
| 噬菌體-223 | MDWCPRDRWVDCFF | 412 | - | - | - | - | - | - | D | - | - | - | - | - | - | - | 0.066 | 1.577 | 0.140 | 412 |
| 噬菌體-224 | MDWCPKDRWNDCYF | 413 | - | - | - | - | - | K | D | - | - | N | - | - | Y | - | 0.078 | 1.091 | 0.093 | 413 |
| 噬菌體-225 | MDWCPRDRWADCFF | 414 | - | - | - | - | - | - | D | - | - | A | - | - | - | - | 0.069 | 0.392 | 0.089 | 414 |
| 噬菌體-226 | MDWCPRDRWIDCFN | 415 | - | - | - | - | - | - | D | - | - | I | - | - | - | N | 0.218 | 0.339 | 0.131 | 415 |
| 噬菌體-227 | MDWCPRDRWSDCFN | 416 | - | - | - | - | - | - | D | - | - | S | - | - | - | N | 0.074 | 0.102 | 0.074 | 416 |
| 噬菌體-228 | ITWCHVISGLECWN | 417 | I | T | - | - | H | V | I | S | G | L | E | - | W | N | 0.076 | 0.193 | 0.100 | 417 |
| 噬菌體-229 | VPWCQIISGLECLT | 418 | V | P | - | - | Q | I | I | S | G | L | E | - | L | T | 0.076 | 0.174 | 0.077 | 418 |
| 噬菌體-230 | APWCQIISGLECLT | 419 | A | P | - | - | Q | I | I | S | G | L | E | - | L | T | 0.080 | 0.169 | 0.078 | 419 |
| 噬菌體-231 | VPWCLIISGLDCLN | 420 | V | P | - | - | L | I | I | S | G | L | - | - | L | N | 0.455 | 0.107 | 0.090 | 420 |
| 噬菌體-232 | MDWCARFVGYGCLD | 421 | - | - | - | - | A | - | F | V | G | Y | G | - | L | D | 0.948 | 0.065 | 0.074 | 421 |
| 噬菌體-233 | MTWCPTSFWNRCLD | 422 | - | T | - | - | - | T | S | F | - | N | R | - | L | D | 0.142 | 0.392 | 0.405 | 422 |
| 噬菌體-234 | MDWCPRALWFECFF | 423 | - | - | - | - | - | - | A | L | - | F | E | - | - | - | 0.111 | 2.668 | 0.331 | 423 |
| 噬菌體-235 | MDWCPRYLWHECFS | 424 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | H | E | - | - | S | 0.063 | 2.654 | 0.303 | 424 |
| 噬菌體-236 | MDWCPRDLWNLCFF | 425 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | N | L | - | - | - | 0.084 | 2.639 | 0.436 | 425 |
| 噬菌體-237 | MDWCPSYLWHECFF | 426 | - | - | - | - | - | S | Y | L | - | H | E | - | - | - | 0.067 | 2.606 | 0.447 | 426 |
| 噬菌體-238 | MDWCPPYLWSECFA | 427 | - | - | - | - | - | P | Y | L | - | S | E | - | - | A | 0.539 | 2.604 | 0.234 | 427 |
| 噬菌體-239 | MDWCPRYLWHVCFN | 428 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | H | V | - | - | N | 0.187 | 2.603 | 0.409 | 428 |
| 噬菌體-240 | MDWCPRTLWHVCFN | 429 | - | - | - | - | - | - | T | L | - | H | V | - | - | N | 0.317 | 2.601 | 0.551 | 429 |
| 噬菌體-241 | MDWCPRHLWHECYS | 430 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | H | E | - | Y | S | 0.066 | 2.584 | 0.374 | 430 |
| 噬菌體-242 | MDWCPKHLWTECFA | 431 | - | - | - | - | - | K | H | L | - | T | E | - | - | A | 0.098 | 2.491 | 0.145 | 431 |
| 噬菌體-243 | MDWCPRHLWYECFN | 432 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | Y | E | - | - | N | 0.063 | 2.414 | 0.167 | 432 |
| 噬菌體-244 | MDWCPRYLWHECFD | 433 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | H | E | - | - | D | 0.071 | 2.066 | 0.177 | 433 |
| 噬菌體-245 | MDWCPRNLWHLCFA | 434 | - | - | - | - | - | - | N | L | - | H | L | - | - | A | 0.082 | 1.397 | 0.164 | 434 |
| 噬菌體-246 | MDWCPKHLWNKCFN | 435 | - | - | - | - | - | K | H | L | - | N | K | - | - | N | 0.075 | 1.161 | 0.092 | 435 |
| 噬菌體-247 | MDWCPRFMWAECFN | 436 | - | - | - | - | - | - | F | M | - | A | E | - | - | N | 0.073 | 2.603 | 0.341 | 436 |
| 噬菌體-248 | MDWCPRNMWHHCFD | 437 | - | - | - | - | - | - | N | M | - | H | H | - | - | D | 0.205 | 1.597 | 0.524 | 437 |
| 噬菌體-249 | MDWCPSDMWAHCYN | 438 | - | - | - | - | - | S | D | M | - | A | H | - | Y | N | 0.191 | 1.209 | 0.109 | 438 |
| 噬菌體-250 | MDWCPKVMWHYCFA | 439 | - | - | - | - | - | K | V | M | - | H | Y | - | - | A | 0.136 | 1.138 | 0.252 | 439 |
| 噬菌體-251 | MDWCPRFMWSECFS | 440 | - | - | - | - | - | - | F | M | - | S | E | - | - | S | 0.092 | 1.008 | 0.137 | 440 |
| 噬菌體-252 | MDWCPRHMWINCFA | 441 | - | - | - | - | - | - | H | M | - | I | N | - | - | A | 0.091 | 0.920 | 0.165 | 441 |
| 噬菌體-253 | MVGCATSMWNRCLT | 442 | - | V | G | - | A | T | S | M | - | N | R | - | L | T | 0.256 | 0.770 | 0.746 | 442 |
| 噬菌體-254 | MDWCPRYLWSECFA | 443 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | S | E | - | - | A | 0.078 | 2.705 | 0.513 | 443 |
| 噬菌體-255 | MDWCPRHLWSVCFN | 444 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | S | V | - | - | N | 0.064 | 2.649 | 0.825 | 444 |
| 噬菌體-256 | MDWCPFDLWHVCYN | 445 | - | - | - | - | - | F | D | L | - | H | V | - | Y | N | 0.089 | 2.602 | 0.651 | 445 |
| 噬菌體-257 | MDWCPRFLWHECFN | 446 | - | - | - | - | - | - | F | L | - | H | E | - | - | N | 0.079 | 2.586 | 0.351 | 446 |
| 噬菌體-258 | MDWCPRSLWHVCFN | 447 | - | - | - | - | - | - | S | L | - | H | V | - | - | N | 0.098 | 2.412 | 0.238 | 447 |
| 噬菌體-259 | MDWCPRNLWHACFN | 448 | - | - | - | - | - | - | N | L | - | H | A | - | - | N | 0.071 | 1.571 | 0.112 | 448 |
| 噬菌體-260 | MDWCPVFMWNECFN | 449 | - | - | - | - | - | V | F | M | - | N | E | - | - | N | 0.079 | 2.661 | 0.356 | 449 |
| 噬菌體-261 | MDWCPMFMWHECFN | 450 | - | - | - | - | - | M | F | M | - | H | E | - | - | N | 0.102 | 2.235 | 1.045 | 450 |
| 噬菌體-262 | MYWCATSMWNRCFV | 451 | - | Y | - | - | A | T | S | M | - | N | R | - | - | V | 0.248 | 0.398 | 0.415 | 451 |
| 噬菌體-263 | MDWCPRHMWHECFA | 452 | - | - | - | - | - | - | H | M | - | H | E | - | - | A | 0.074 | 2.518 | 0.298 | 452 |
| 噬菌體-264 | MDWCPRHLWHVCFN | 453 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | H | V | - | - | N | 0.070 | 2.667 | 0.636 | 453 |
| 噬菌體-265 | MDWCPRFMWDLCFA | 454 | - | - | - | - | - | - | F | M | - | D | L | - | - | A | 0.270 | 2.638 | 0.725 | 454 |
| 噬菌體-266 | VTSCPTTMWNRCFS | 455 | V | T | S | - | - | T | T | M | - | N | R | - | - | S | 0.396 | 1.220 | 0.546 | 455 |
| 噬菌體-267 | MTLCLSVDLVHCWY | 456 | - | T | L | - | L | S | V | D | L | - | H | - | W | Y | 0.114 | 0.632 | 0.093 | 456 |
| 噬菌體-269 | DSFCTWSAWQECGR | 457 | D | S | F | - | T | W | S | A | - | Q | E | - | G | R | 0.072 | 0.130 | 0.101 | 457 |
| 噬菌體-270 | MDWCPRDFWAFCFF | 458 | - | - | - | - | - | - | D | F | - | A | F | - | - | - | 0.118 | 2.365 | 0.655 | 458 |
| 噬菌體-271 | MDWCPTSFWNRCFH | 459 | - | - | - | - | - | T | S | F | - | N | R | - | - | H | 0.102 | 0.087 | 0.092 | 459 |
| 噬菌體-272 | MVWCMSVGWAVCLN | 460 | - | V | - | - | M | S | V | G | - | A | V | - | L | N | 0.289 | 0.271 | 0.284 | 460 |
| 噬菌體-273 | IDWCPTAGWTYCWF | 461 | I | - | - | - | - | T | A | G | - | T | Y | - | W | - | 0.071 | 0.136 | 0.075 | 461 |
| 噬菌體-274 | WVSCLRHHWLECFH | 462 | W | V | S | - | L | - | H | H | - | L | E | - | - | H | 0.781 | 0.723 | 0.858 | 462 |
| 噬菌體-275 | MDWCPRDHWVDCYS | 463 | - | - | - | - | - | - | D | H | - | - | - | - | Y | S | 0.172 | 0.671 | 0.092 | 463 |
| 噬菌體-276 | IDWCPKIHWDLCYF | 464 | I | - | - | - | - | K | I | H | - | D | L | - | Y | - | 0.072 | 0.295 | 0.082 | 464 |
| 噬菌體-277 | MDWCPRSHWSECFS | 465 | - | - | - | - | - | - | S | H | - | S | E | - | - | S | 0.080 | 0.253 | 0.087 | 465 |
| 噬菌體-278 | MDWCPRSIWYLCFN | 466 | - | - | - | - | - | - | S | I | - | Y | L | - | - | N | 0.383 | 2.548 | 1.337 | 466 |
| 噬菌體-279 | MDWCPRYLWAECFN | 467 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | A | E | - | - | N | 0.068 | 2.742 | 1.141 | 467 |
| 噬菌體-280 | MDWCPRYLWDYCFA | 468 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | D | Y | - | - | A | 0.073 | 2.709 | 0.382 | 468 |
| 噬菌體-281 | MDWCPRSLWFLCFN | 469 | - | - | - | - | - | - | S | L | - | F | L | - | - | N | 1.110 | 2.709 | 1.774 | 469 |
| 噬菌體-282 | MDWCPRDLWFACFA | 470 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | F | A | - | - | A | 0.060 | 2.658 | 0.794 | 470 |
| 噬菌體-283 | MDWCPRHLWNECFN | 471 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | N | E | - | - | N | 0.079 | 2.650 | 0.393 | 471 |
| 噬菌體-284 | MDWCPRFLWHVCFS | 472 | - | - | - | - | - | - | F | L | - | H | V | - | - | S | 2.091 | 2.643 | 2.480 | 472 |
| 噬菌體-285 | MDWCPRDLWAMCFA | 473 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | A | M | - | - | A | 0.071 | 2.627 | 0.889 | 473 |
| 噬菌體-286 | MERCPRYLWHMCYS | 474 | - | E | R | - | - | - | Y | L | - | H | M | - | Y | S | 0.164 | 2.589 | 0.840 | 474 |
| 噬菌體-288 | MDWCPIALWDFCFA | 475 | - | - | - | - | - | I | A | L | - | D | F | - | - | A | 0.073 | 2.522 | 0.492 | 475 |
| 噬菌體-289 | MDWCPRYLWNVCFA | 476 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | N | V | - | - | A | 0.070 | 2.513 | 0.280 | 476 |
| 噬菌體-290 | MDWCPRDLWSVCFS | 477 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | S | V | - | - | S | 0.090 | 2.505 | 0.116 | 477 |
| 噬菌體-291 | MDWCPRYLWHVCFY | 478 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | H | V | - | - | Y | 0.227 | 2.498 | 1.137 | 478 |
| 噬菌體-292 | MDWCPRALWDHCFF | 479 | - | - | - | - | - | - | A | L | - | D | H | - | - | - | 0.081 | 2.492 | 0.394 | 479 |
| 噬菌體-293 | MDWCPRHLWFECFN | 480 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | F | E | - | - | N | 0.064 | 2.489 | 0.171 | 480 |
| 噬菌體-294 | MDWCPRSLWDYCFA | 481 | - | - | - | - | - | - | S | L | - | D | Y | - | - | A | 0.115 | 2.488 | 0.235 | 481 |
| 噬菌體-297 | MDWCPRHLWTECFS | 482 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | T | E | - | - | S | 0.074 | 2.482 | 0.243 | 482 |
| 噬菌體-298 | MDWCPLYLWAECFN | 483 | - | - | - | - | - | L | Y | L | - | A | E | - | - | N | 0.094 | 2.476 | 0.193 | 483 |
| 噬菌體-299 | MDWCPIYLWAECFN | 484 | - | - | - | - | - | I | Y | L | - | A | E | - | - | N | 0.078 | 2.453 | 0.307 | 484 |
| 噬菌體-300 | MDWCPRHLWFECFF | 485 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | F | E | - | - | - | 0.178 | 2.451 | 0.479 | 485 |
| 噬菌體-301 | MDWCPRYLWHECFF | 486 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | H | E | - | - | - | 0.082 | 2.450 | 0.682 | 486 |
| 噬菌體-302 | MDWCPRYLWHVCFD | 487 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | H | V | - | - | D | 0.068 | 2.445 | 0.310 | 487 |
| 噬菌體-303 | MDWCPRYLWTECFS | 488 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | T | E | - | - | S | 0.074 | 2.421 | 0.329 | 488 |
| 噬菌體-304 | MDWCPKFLWDECFA | 489 | - | - | - | - | - | K | F | L | - | D | E | - | - | A | 0.311 | 2.406 | 0.376 | 489 |
| 噬菌體-305 | MDWCPRDLWTECFS | 490 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | T | E | - | - | S | 0.080 | 2.401 | 0.174 | 490 |
| 噬菌體-306 | MDWCPRHLWNECFA | 491 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | N | E | - | - | A | 0.068 | 2.394 | 0.170 | 491 |
| 噬菌體-307 | MDWCPRYLWPVCFH | 492 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | P | V | - | - | H | 0.179 | 2.392 | 0.602 | 492 |
| 噬菌體-308 | MDWCPKSLWAECFN | 493 | - | - | - | - | - | K | S | L | - | A | E | - | - | N | 0.395 | 2.377 | 0.162 | 493 |
| 噬菌體-309 | MDWCPMFLWHECFN | 494 | - | - | - | - | - | M | F | L | - | H | E | - | - | N | 0.170 | 2.375 | 0.591 | 494 |
| 噬菌體-310 | MDWCPRDLWDECFN | 495 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | D | E | - | - | N | 0.066 | 2.374 | 0.248 | 495 |
| 噬菌體-311 | MDWCPRDLWYQCFN | 496 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | Y | Q | - | - | N | 0.069 | 2.353 | 0.609 | 496 |
| 噬菌體-313 | MDWCPRSLWNYCFN | 497 | - | - | - | - | - | - | S | L | - | N | Y | - | - | N | 0.076 | 2.350 | 0.209 | 497 |
| 噬菌體-314 | MDWCPIHLWNECFN | 498 | - | - | - | - | - | I | H | L | - | N | E | - | - | N | 0.074 | 2.347 | 0.157 | 498 |
| 噬菌體-315 | MDWCPTYLWHVCFS | 499 | - | - | - | - | - | T | Y | L | - | H | V | - | - | S | 0.089 | 2.324 | 0.160 | 499 |
| 噬菌體-316 | MDWCPRSLWNYCFA | 500 | - | - | - | - | - | - | S | L | - | N | Y | - | - | A | 0.067 | 2.316 | 0.198 | 500 |
| 噬菌體-317 | MDWCPRHLWHECFT | 501 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | H | E | - | - | T | 0.103 | 2.297 | 0.320 | 501 |
| 噬菌體-318 | MDWCPMFLWDECFN | 502 | - | - | - | - | - | M | F | L | - | D | E | - | - | N | 0.132 | 2.287 | 0.203 | 502 |
| 噬菌體-319 | MSWCPRDLWHLCFF | 503 | - | S | - | - | - | - | D | L | - | H | L | - | - | - | 0.077 | 2.265 | 0.319 | 503 |
| 噬菌體-320 | MDWCPTYLWNECFN | 504 | - | - | - | - | - | T | Y | L | - | N | E | - | - | N | 0.120 | 2.244 | 0.606 | 504 |
| 噬菌體-321 | MDWCPRDLWYVCFA | 505 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | Y | V | - | - | A | 0.095 | 2.221 | 0.138 | 505 |
| 噬菌體-322 | MDWCPRHLWIECFN | 506 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | I | E | - | - | N | 0.339 | 2.214 | 0.376 | 506 |
| 噬菌體-323 | MDWCPTYLWNVCFA | 507 | - | - | - | - | - | T | Y | L | - | N | V | - | - | A | 0.085 | 2.211 | 0.132 | 507 |
| 噬菌體-324 | MDWCPRHLWYECFS | 508 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | Y | E | - | - | S | 0.216 | 2.167 | 0.163 | 508 |
| 噬菌體-325 | MDWCPAYLWDECFA | 509 | - | - | - | - | - | A | Y | L | - | D | E | - | - | A | 0.096 | 2.166 | 0.163 | 509 |
| 噬菌體-326 | MFWCPITLWNECFN | 510 | - | F | - | - | - | I | T | L | - | N | E | - | - | N | 0.075 | 2.153 | 0.143 | 510 |
| 噬菌體-327 | MHWCPRDLWHVCFN | 511 | - | H | - | - | - | - | D | L | - | H | V | - | - | N | 0.071 | 2.149 | 0.150 | 511 |
| 噬菌體-328 | MDWCPRALWDHCFN | 512 | - | - | - | - | - | - | A | L | - | D | H | - | - | N | 0.323 | 2.145 | 0.293 | 512 |
| 噬菌體-329 | MDWCPRALWNVCFA | 513 | - | - | - | - | - | - | A | L | - | N | V | - | - | A | 0.071 | 2.140 | 0.249 | 513 |
| 噬菌體-330 | MDWCPRFLWDVCFN | 514 | - | - | - | - | - | - | F | L | - | D | V | - | - | N | 0.100 | 2.139 | 0.309 | 514 |
| 噬菌體-331 | MDWCPRHLWDECFY | 515 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | D | E | - | - | Y | 0.098 | 2.127 | 0.146 | 515 |
| 噬菌體-332 | IDWCPRALWDACLA | 516 | I | - | - | - | - | - | A | L | - | D | A | - | L | A | 0.269 | 2.103 | 0.164 | 516 |
| 噬菌體-333 | MDWCPTDLWHECFA | 517 | - | - | - | - | - | T | D | L | - | H | E | - | - | A | 0.078 | 2.071 | 0.154 | 517 |
| 噬菌體-334 | MDWCPRYLWDECFS | 518 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | D | E | - | - | S | 0.069 | 2.064 | 0.164 | 518 |
| 噬菌體-335 | MDWCPRFLWDYCFA | 519 | - | - | - | - | - | - | F | L | - | D | Y | - | - | A | 0.146 | 2.034 | 0.207 | 519 |
| 噬菌體-336 | MDWCPRDLWNWCFN | 520 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | N | W | - | - | N | 0.139 | 2.026 | 0.390 | 520 |
| 噬菌體-337 | MDWCPKPLWHVCFA | 521 | - | - | - | - | - | K | P | L | - | H | V | - | - | A | 0.069 | 2.022 | 0.152 | 521 |
| 噬菌體-338 | MDWCPRFLWNECFY | 522 | - | - | - | - | - | - | F | L | - | N | E | - | - | Y | 0.143 | 1.996 | 0.287 | 522 |
| 噬菌體-339 | MDWCPRTLWDQCFF | 523 | - | - | - | - | - | - | T | L | - | D | Q | - | - | - | 0.088 | 1.992 | 0.314 | 523 |
| 噬菌體-340 | MSWCPIDLWSECFA | 524 | - | S | - | - | - | I | D | L | - | S | E | - | - | A | 0.072 | 1.986 | 0.148 | 524 |
| 噬菌體-341 | MDWCPRHLWDECFN | 525 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | D | E | - | - | N | 0.084 | 1.978 | 0.268 | 525 |
| 噬菌體-342 | MDWCPRNLWHECFA | 526 | - | - | - | - | - | - | N | L | - | H | E | - | - | A | 0.067 | 1.965 | 0.175 | 526 |
| 噬菌體-343 | MDWCPRDLWTQCFF | 527 | - | - | - | - | - | - | D | L | - | T | Q | - | - | - | 0.065 | 1.932 | 0.119 | 527 |
| 噬菌體-344 | MDWCPRHLWVHCFS | 528 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | - | H | - | - | S | 0.096 | 1.914 | 0.173 | 528 |
| 噬菌體-345 | MDFCPRFLWHECFN | 529 | - | - | F | - | - | - | F | L | - | H | E | - | - | N | 0.063 | 1.908 | 0.225 | 529 |
| 噬菌體-346 | MDWCPRHLWHACFS | 530 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | H | A | - | - | S | 0.073 | 1.826 | 0.167 | 530 |
| 噬菌體-347 | MDWCPLFLWDQCFN | 531 | - | - | - | - | - | L | F | L | - | D | Q | - | - | N | 0.116 | 1.819 | 0.264 | 531 |
| 噬菌體-348 | MAWCPWYLWDECFN | 532 | - | A | - | - | - | W | Y | L | - | D | E | - | - | N | 0.200 | 1.810 | 0.267 | 532 |
| 噬菌體-349 | LDWCPRHLWALCFN | 533 | L | - | - | - | - | - | H | L | - | A | L | - | - | N | 0.073 | 1.780 | 0.240 | 533 |
| 噬菌體-350 | MDWCPWFLWNECFN | 534 | - | - | - | - | - | W | F | L | - | N | E | - | - | N | 0.158 | 1.774 | 0.279 | 534 |
| 噬菌體-351 | MDWCPMNLWHECFA | 535 | - | - | - | - | - | M | N | L | - | H | E | - | - | A | 0.080 | 1.742 | 0.160 | 535 |
| 噬菌體-352 | MDWCPIHLWYECFN | 536 | - | - | - | - | - | I | H | L | - | Y | E | - | - | N | 0.080 | 1.734 | 0.203 | 536 |
| 噬菌體-353 | IDWCPLHLWHECYH | 537 | I | - | - | - | - | L | H | L | - | H | E | - | Y | H | 0.067 | 1.693 | 0.182 | 537 |
| 噬菌體-354 | MDWCPRYLWLECFN | 538 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | L | E | - | - | N | 0.083 | 1.685 | 0.368 | 538 |
| 噬菌體-356 | MDWCPMYLWDECFF | 539 | - | - | - | - | - | M | Y | L | - | D | E | - | - | - | 0.082 | 1.652 | 0.178 | 539 |
| 噬菌體-357 | MDWCPRLLWHECFN | 540 | - | - | - | - | - | - | L | L | - | H | E | - | - | N | 0.071 | 1.601 | 0.109 | 540 |
| 噬菌體-358 | MDWCPPHLWHECFF | 541 | - | - | - | - | - | P | H | L | - | H | E | - | - | - | 0.069 | 1.449 | 0.136 | 541 |
| 噬菌體-359 | MDWCPRPLWHECFA | 542 | - | - | - | - | - | - | P | L | - | H | E | - | - | A | 0.063 | 1.439 | 0.138 | 542 |
| 噬菌體-360 | MDWCPMFLWHECFS | 543 | - | - | - | - | - | M | F | L | - | H | E | - | - | S | 0.092 | 1.435 | 0.193 | 543 |
| 噬菌體-361 | MHWCPRHLWSECFN | 544 | - | H | - | - | - | - | H | L | - | S | E | - | - | N | 0.165 | 1.430 | 0.478 | 544 |
| 噬菌體-362 | MDWCPRILWHECFS | 545 | - | - | - | - | - | - | I | L | - | H | E | - | - | S | 0.064 | 1.391 | 0.174 | 545 |
| 噬菌體-363 | MNWCPMHLWAECFN | 546 | - | N | - | - | - | M | H | L | - | A | E | - | - | N | 0.087 | 1.390 | 0.140 | 546 |
| 噬菌體-364 | MDWCPRSLWAQCFY | 547 | - | - | - | - | - | - | S | L | - | A | Q | - | - | Y | 0.067 | 1.387 | 0.140 | 547 |
| 噬菌體-365 | MDWCPSYLWPVCFN | 548 | - | - | - | - | - | S | Y | L | - | P | V | - | - | N | 0.079 | 1.178 | 0.131 | 548 |
| 噬菌體-366 | MHWCPLYLWDECFY | 549 | - | H | - | - | - | L | Y | L | - | D | E | - | - | Y | 0.153 | 1.159 | 0.376 | 549 |
| 噬菌體-367 | MDWCPSFLWYECFN | 550 | - | - | - | - | - | S | F | L | - | Y | E | - | - | N | 0.063 | 1.130 | 0.104 | 550 |
| 噬菌體-368 | MSWCPPYLWTVCYN | 551 | - | S | - | - | - | P | Y | L | - | T | V | - | Y | N | 0.176 | 1.104 | 0.326 | 551 |
| 噬菌體-369 | MHWCPRDLWYECFA | 552 | - | H | - | - | - | - | D | L | - | Y | E | - | - | A | 0.072 | 0.995 | 0.108 | 552 |
| 噬菌體-370 | MTWCPAYLWHECFN | 553 | - | T | - | - | - | A | Y | L | - | H | E | - | - | N | 0.086 | 0.985 | 0.139 | 553 |
| 噬菌體-371 | MAWCPRYLWAECFF | 554 | - | A | - | - | - | - | Y | L | - | A | E | - | - | - | 0.510 | 0.918 | 0.216 | 554 |
| 噬菌體-372 | MDWCPRYLWVDCFA | 555 | - | - | - | - | - | - | Y | L | - | - | - | - | - | A | 0.095 | 0.917 | 0.218 | 555 |
| 噬菌體-373 | MDWCPRILWSDCFN | 556 | - | - | - | - | - | - | I | L | - | S | - | - | - | N | 0.082 | 0.847 | 0.113 | 556 |
| 噬菌體-374 | MAWCPLDLWDKCFY | 557 | - | A | - | - | - | L | D | L | - | D | K | - | - | Y | 0.079 | 0.770 | 0.141 | 557 |
| 噬菌體-375 | MNWCPRALWHECFL | 558 | - | N | - | - | - | - | A | L | - | H | E | - | - | L | 0.085 | 0.759 | 0.107 | 558 |
| 噬菌體-376 | MDWCPRHLWTYCFH | 559 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | T | Y | - | - | H | 0.109 | 0.757 | 0.207 | 559 |
| 噬菌體-377 | MDWCPFDLWLECFN | 560 | - | - | - | - | - | F | D | L | - | L | E | - | - | N | 0.087 | 0.650 | 0.120 | 560 |
| 噬菌體-378 | MHWCPLHLWNECFA | 561 | - | H | - | - | - | L | H | L | - | N | E | - | - | A | 0.065 | 0.575 | 0.083 | 561 |
| 噬菌體-379 | MDWCPRNLWAECFS | 562 | - | - | - | - | - | - | N | L | - | A | E | - | - | S | 0.061 | 0.538 | 0.080 | 562 |
| 噬菌體-380 | MDYCPSYLWHECFA | 563 | - | - | Y | - | - | S | Y | L | - | H | E | - | - | A | 0.065 | 0.470 | 0.090 | 563 |
| 噬菌體-381 | MAWCPRILWHQCFN | 564 | - | A | - | - | - | - | I | L | - | H | Q | - | - | N | 0.113 | 0.322 | 0.129 | 564 |
| 噬菌體-382 | ITWCPTSLWNRCLV | 565 | I | T | - | - | - | T | S | L | - | N | R | - | L | V | 0.077 | 0.242 | 0.089 | 565 |
| 噬菌體-383 | LAGCQRDLATVCVI | 566 | L | A | G | - | Q | - | D | L | A | T | V | - | V | I | 0.068 | 0.229 | 0.116 | 566 |
| 噬菌體-384 | IMWCPTSLWNRCVT | 567 | I | M | - | - | - | T | S | L | - | N | R | - | V | T | 0.104 | 0.161 | 0.129 | 567 |
| 噬菌體-385 | ILRCQMNLQDECLN | 568 | I | L | R | - | Q | M | N | L | Q | D | E | - | L | N | 0.083 | 0.083 | 0.077 | 568 |
| 噬菌體-386 | NHWCPTTLWNRCVA | 569 | N | H | - | - | - | T | T | L | - | N | R | - | V | A | 0.293 | 0.078 | 0.093 | 569 |
| 噬菌體-387 | MDWCPRHLWLECFN | 570 | - | - | - | - | - | - | H | L | - | L | E | - | - | N | 0.064 | 0.066 | 0.074 | 570 |
| 噬菌體-388 | MDWCPRFMWNFCFF | 571 | - | - | - | - | - | - | F | M | - | N | F | - | - | - | 2.200 | 2.621 | 2.539 | 571 |
| 噬菌體-389 | MDWCPSDMWANCFF | 572 | - | - | - | - | - | S | D | M | - | A | N | - | - | - | 0.110 | 2.621 | 0.316 | 572 |
| 噬菌體-390 | IDWCPMHMWDFCYN | 573 | I | - | - | - | - | M | H | M | - | D | F | - | Y | N | 0.078 | 2.544 | 0.232 | 573 |
| 噬菌體-391 | MDWCPFDMWADCFF | 574 | - | - | - | - | - | F | D | M | - | A | - | - | - | - | 0.063 | 2.532 | 0.215 | 574 |
| 噬菌體-392 | LHWCPTSMWTYCYY | 575 | L | H | - | - | - | T | S | M | - | T | Y | - | Y | Y | 0.688 | 2.475 | 2.456 | 575 |
| 噬菌體-393 | MDWCPRDMWFECFN | 576 | - | - | - | - | - | - | D | M | - | F | E | - | - | N | 0.069 | 2.422 | 0.778 | 576 |
| 噬菌體-394 | MDWCPRYMWSDCFF | 577 | - | - | - | - | - | - | Y | M | - | S | - | - | - | - | 0.082 | 2.280 | 0.377 | 577 |
| 噬菌體-395 | MDWCPKDMWAECFN | 578 | - | - | - | - | - | K | D | M | - | A | E | - | - | N | 0.083 | 2.106 | 0.457 | 578 |
| 噬菌體-396 | TDWCPRDMWYLCFN | 579 | T | - | - | - | - | - | D | M | - | Y | L | - | - | N | 0.082 | 2.106 | 0.301 | 579 |
| 噬菌體-397 | MDWCPRAMWDYCFY | 580 | - | - | - | - | - | - | A | M | - | D | Y | - | - | Y | 0.123 | 2.106 | 0.339 | 580 |
| 噬菌體-398 | MDWCPRNMWNECFF | 581 | - | - | - | - | - | - | N | M | - | N | E | - | - | - | 0.095 | 2.099 | 0.430 | 581 |
| 噬菌體-399 | MDWCPRSMWDSCFN | 582 | - | - | - | - | - | - | S | M | - | D | S | - | - | N | 0.332 | 2.019 | 0.142 | 582 |
| 噬菌體-400 | MHWCPTYMWSECFA | 583 | - | H | - | - | - | T | Y | M | - | S | E | - | - | A | 0.070 | 1.839 | 0.161 | 583 |
| 噬菌體-401 | MDWCPLDMWVLCFA | 584 | - | - | - | - | - | L | D | M | - | - | L | - | - | A | 0.085 | 1.837 | 0.169 | 584 |
| 噬菌體-402 | MDWCPRHMWHECFH | 585 | - | - | - | - | - | - | H | M | - | H | E | - | - | H | 0.067 | 1.815 | 0.171 | 585 |
| 噬菌體-403 | MSWCPWDMWNECFA | 586 | - | S | - | - | - | W | D | M | - | N | E | - | - | A | 0.069 | 1.521 | 0.108 | 586 |
| 噬菌體-404 | MDWCPRDMWTSCFN | 587 | - | - | - | - | - | - | D | M | - | T | S | - | - | N | 0.100 | 1.414 | 0.179 | 587 |
| 噬菌體-405 | MDWCPMSMWAFCFD | 588 | - | - | - | - | - | M | S | M | - | A | F | - | - | D | 0.102 | 1.412 | 0.160 | 588 |
| 噬菌體-406 | MNWCPIDMWTECFN | 589 | - | N | - | - | - | I | D | M | - | T | E | - | - | N | 0.245 | 1.403 | 0.175 | 589 |
| 噬菌體-407 | MNWCPIHMWNQCFA | 590 | - | N | - | - | - | I | H | M | - | N | Q | - | - | A | 0.085 | 1.373 | 0.133 | 590 |
| 噬菌體-408 | MFWCPKDMWAECFA | 591 | - | F | - | - | - | K | D | M | - | A | E | - | - | A | 0.099 | 1.258 | 0.113 | 591 |
| 噬菌體-409 | LHWCPITMWTYCYY | 592 | L | H | - | - | - | I | T | M | - | T | Y | - | Y | Y | 0.229 | 1.212 | 0.516 | 592 |
| 噬菌體-410 | IDWCPRYMWHECFF | 593 | I | - | - | - | - | - | Y | M | - | H | E | - | - | - | 0.098 | 1.178 | 0.164 | 593 |
| 噬菌體-411 | MSWCPRFMWHECFN | 594 | - | S | - | - | - | - | F | M | - | H | E | - | - | N | 0.081 | 1.111 | 0.246 | 594 |
| 噬菌體-412 | QHWCPRDMWNDCYA | 595 | Q | H | - | - | - | - | D | M | - | N | - | - | Y | A | 0.066 | 1.076 | 0.149 | 595 |
| 噬菌體-413 | MDWCPSDMWSNCFN | 596 | - | - | - | - | - | S | D | M | - | S | N | - | - | N | 0.070 | 1.075 | 0.121 | 596 |
| 噬菌體-414 | LYWCPRDMWAYCYS | 597 | L | Y | - | - | - | - | D | M | - | A | Y | - | Y | S | 0.068 | 1.019 | 0.157 | 597 |
| 噬菌體-415 | MDWCPMYMWHKCFH | 598 | - | - | - | - | - | M | Y | M | - | H | K | - | - | H | 0.099 | 0.987 | 0.168 | 598 |
| 噬菌體-416 | MDWCPSNMWNECFF | 599 | - | - | - | - | - | S | N | M | - | N | E | - | - | - | 0.072 | 0.983 | 0.136 | 599 |
| 噬菌體-417 | IYWCPTAMWNRCSA | 600 | I | Y | - | - | - | T | A | M | - | N | R | - | S | A | 0.086 | 0.817 | 0.073 | 600 |
| 噬菌體-418 | MYWCPKYMWSECFA | 601 | - | Y | - | - | - | K | Y | M | - | S | E | - | - | A | 0.072 | 0.741 | 0.099 | 601 |
| 噬菌體-419 | VDWCPAHMWNECYN | 602 | V | - | - | - | - | A | H | M | - | N | E | - | Y | N | 0.208 | 0.664 | 0.085 | 602 |
| 噬菌體-420 | MFWCPSTMWNRCFD | 603 | - | F | - | - | - | S | T | M | - | N | R | - | - | D | 0.063 | 0.464 | 0.138 | 603 |
| 噬菌體-421 | TIFCPSTMWNRCWT | 604 | T | I | F | - | - | S | T | M | - | N | R | - | W | T | 0.138 | 0.262 | 0.085 | 604 |
| 噬菌體-422 | MYWCPINMWDYCYA | 605 | - | Y | - | - | - | I | N | M | - | D | Y | - | Y | A | 0.122 | 0.109 | 0.088 | 605 |
| 噬菌體-423 | INLCPTPMWNRCWL | 606 | I | N | L | - | - | T | P | M | - | N | R | - | W | L | 0.119 | 0.103 | 0.101 | 606 |
| 噬菌體-424 | ITQCPSTMWNRCSV | 607 | I | T | Q | - | - | S | T | M | - | N | R | - | S | V | 0.067 | 0.098 | 0.108 | 607 |
| 噬菌體-425 | MDLCPTAMWNRCFY | 608 | - | - | L | - | - | T | A | M | - | N | R | - | - | Y | 0.063 | 0.097 | 0.084 | 608 |
| 噬菌體-426 | MFLCPSAMWNRCFY | 609 | - | F | L | - | - | S | A | M | - | N | R | - | - | Y | 0.069 | 0.094 | 0.114 | 609 |
| 噬菌體-427 | VILCPTTMWNRCFH | 610 | V | I | L | - | - | T | T | M | - | N | R | - | - | H | 0.100 | 0.072 | 0.084 | 610 |
| 噬菌體-428 | MNWCPSTMWNRCLT | 611 | - | N | - | - | - | S | T | M | - | N | R | - | L | T | 0.067 | 0.065 | 0.070 | 611 |
| 噬菌體-430 | IHLCHWVPWIKCSH | 612 | I | H | L | - | H | W | V | P | - | I | K | - | S | H | 2.516 | 2.550 | 2.508 | 612 |
| 噬菌體-431 | MAWCPADQWHECFN | 613 | - | A | - | - | - | A | D | Q | - | H | E | - | - | N | 0.076 | 1.845 | 0.456 | 613 |
| 噬菌體-432 | IDWCPIIQGLPCFA | 614 | I | - | - | - | - | I | I | Q | G | L | P | - | - | A | 0.058 | 0.368 | 0.065 | 614 |
| 噬菌體-433 | MAWCPWAQFDECLA | 615 | - | A | - | - | - | W | A | Q | F | D | E | - | L | A | 0.073 | 0.071 | 0.078 | 615 |
| 噬菌體-434 | IVWCPTTQWNRCAT | 616 | I | V | - | - | - | T | T | Q | - | N | R | - | A | T | 0.113 | 0.067 | 0.083 | 616 |
| 噬菌體-435 | MDWCPRDRWVDCYA | 617 | - | - | - | - | - | - | D | - | - | - | - | - | Y | A | 0.157 | 1.484 | 0.403 | 617 |
| 噬菌體-436 | MDWCPRDRWADCFN | 618 | - | - | - | - | - | - | D | - | - | A | - | - | - | N | 0.063 | 1.351 | 0.080 | 618 |
| 噬菌體-437 | MDWCPVDRWADCFN | 619 | - | - | - | - | - | V | D | - | - | A | - | - | - | N | 0.071 | 1.156 | 0.315 | 619 |
| 噬菌體-438 | MDWCPMSRWAFCFD | 620 | - | - | - | - | - | M | S | - | - | A | F | - | - | D | 0.071 | 1.000 | 0.115 | 620 |
| 噬菌體-439 | MDWCPRDRWDVCFA | 621 | - | - | - | - | - | - | D | - | - | D | V | - | - | A | 0.073 | 0.924 | 0.096 | 621 |
| 噬菌體-440 | MDWCPRDRWVDCFN | 622 | - | - | - | - | - | - | D | - | - | - | - | - | - | N | 0.106 | 0.911 | 0.132 | 622 |
| 噬菌體-441 | MDWCPRDRWDDCFF | 623 | - | - | - | - | - | - | D | - | - | D | - | - | - | - | 0.114 | 0.899 | 0.183 | 623 |
| 噬菌體-442 | IYWCPIDRWNDCYN | 624 | I | Y | - | - | - | I | D | - | - | N | - | - | Y | N | 0.177 | 0.867 | 0.164 | 624 |
| 噬菌體-443 | MDWCPMTRWNDCYF | 625 | - | - | - | - | - | M | T | - | - | N | - | - | Y | - | 0.081 | 0.671 | 0.078 | 625 |
| 噬菌體-444 | VNQCTRYRWAECLN | 626 | V | N | Q | - | T | - | Y | - | - | A | E | - | L | N | 0.465 | 0.566 | 0.135 | 626 |
| 噬菌體-445 | MDWCPRARWHDCFF | 627 | - | - | - | - | - | - | A | - | - | H | - | - | - | - | 0.097 | 0.497 | 0.138 | 627 |
| 噬菌體-446 | MDWCPRDRWDDCFN | 628 | - | - | - | - | - | - | D | - | - | D | - | - | - | N | 0.069 | 0.450 | 0.077 | 628 |
| 噬菌體-447 | MDWCPRDRWDVCYY | 629 | - | - | - | - | - | - | D | - | - | D | V | - | Y | Y | 0.073 | 0.074 | 0.073 | 629 |
| 噬菌體-448 | MAWCPWASFDECLA | 630 | - | A | - | - | - | W | A | S | F | D | E | - | L | A | 0.104 | 0.089 | 0.109 | 630 |
| 噬菌體-449 | MVDCPLISFDECLA | 631 | - | V | D | - | - | L | I | S | F | D | E | - | L | A | 0.246 | 0.070 | 0.076 | 631 |
| 噬菌體-450 | EDWCPTDVWPYCFS | 632 | E | - | - | - | - | T | D | V | - | P | Y | - | - | S | 0.100 | 0.711 | 0.157 | 632 |
| 噬菌體-451 | MDWCPRFWWHECYA | 633 | - | - | - | - | - | - | F | W | - | H | E | - | Y | A | 0.246 | 2.397 | 0.503 | 633 |
| 噬菌體-452 | MDWCPRDWWHMCFN | 634 | - | - | - | - | - | - | D | W | - | H | M | - | - | N | 0.100 | 2.115 | 0.243 | 634 |
| 噬菌體-453 | MDWCPSDYWYVCFA | 635 | - | - | - | - | - | S | D | Y | - | Y | V | - | - | A | 0.065 | 0.707 | 0.080 | 635 |
以標準酶聯免疫吸附分析(ELISA)型式評估肽抑制抗CD28 scFv或Ab-12與CD28抗原結合之能力。簡言之，在經中性抗生物素蛋白塗佈之盤上捕捉經生物素標記之CD28抗原。將2 nM之抗CD28 scFv或5 nM之Ab-12與0-100 uM滴定肽一起預培育。在短暫的預培育期後，將滴定肽與固定的抗CD28 scFv (2 nM)或Ab-12 (5 nM)之混合物添加至CD28抗原捕捉盤中。在盤上短暫培育後，用標準辣根過氧化酶結合的二級抗體偵測結合的抗CD28 scFv或Ab-12。在Graphpad Prism軟體中計算使最大信號減少50%所需之肽濃度(IC50)。
圖 8A-8C繪示藉由ELISA量測之抑制抗CD28 scFv結合CD28抗原的肽。
圖 9A-9C繪示藉由ELISA量測之抑制Ab-12結合CD28抗原的肽。
實例 6. 藉由 Octet 量測之 抗 CD28 scFv 與肽之動力學結合
使用Octet RED96儀器藉由生物層干涉術評估抗CD28 scFv與肽之動力學結合。簡言之，卵白素生物感測器裝載有經生物素標記之肽且在緩衝液中基線化。抗CD28 scFv或Ab-12以100 nM、50 nM、25 nM及12.5 nM之溶液進行滴定，隨後締合至裝載肽之感測器上。在短暫的締合期後，將感測器轉移至緩衝液中且量測結合的抗CD28 scFv之解離。實驗之時序及步驟展示於隨附表中。即時記錄締合及解離信號，且使用儀器軟體內之1:1結合模型進行分析。使用1:1結合模型之分析能夠計算締合及解離速率常數以及親和力KD。
圖 10A-10F繪示藉由Octet量測之抗CD28 scFv與肽結合之動力學結合。
圖 10G-10U繪示藉由Octet量測之肽與抗CD28 scFv之動力學結合。
表 21. 分析之時序及步驟
表 22. 動力學資料之概述
實例 7. 標準 ELISA 分析中 PD-L1 及 / 或 CD28 之結合
| 步驟 | 時間 |
| 基線：緩衝液 | 60秒 |
| 裝載： ● 200 nM肽 | 300秒 |
| 基線：緩衝液 | 300秒 |
| 在octet緩衝液中締合 ● 100nM CD28 scFv ● 50nM CD28 scFv ● 25nM CD28 scFv ● 12.5nM CD28 scFv | 300秒 |
| 解離：緩衝液 | 900秒 |
| 樣品ID | 裝載樣品ID | KD (M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
| 抗CD28 scFv | 肽-31 | 7.18E-08 | 5.14E+04 | 3.69E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-32 | 4.99E-08 | 5.91E+04 | 2.95E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-33 | 5.28E-08 | 2.90E+04 | 1.53E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-34 | 8.88E-08 | 7.70E+04 | 6.84E-03 |
| 肽-35 | 肽-35 | 1.27E-07 | 3.90E+04 | 4.97E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-36 | 6.87E-08 | 3.67E+04 | 2.52E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-37 | 9.78E-08 | 3.59E+04 | 3.51E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-38 | 9.23E-08 | 3.00E+04 | 2.77E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-39 | 5.19E-08 | 5.11E+04 | 2.65E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-40 | 7.99E-08 | 3.88E+04 | 3.10E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-41 | 4.23E-08 | 3.64E+04 | 1.54E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-42 | 1.52E-07 | 2.84E+04 | 4.33E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-43 | 1.92E-07 | 1.67E+04 | 3.20E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-44 | 3.74E-07 | 2.17E+04 | 8.12E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-45 | 1.34E-07 | 2.71E+04 | 3.64E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-46 | 3.52E-08 | 6.19E+04 | 2.18E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-47 | 5.18E-08 | 3.89E+04 | 2.01E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-48 | 2.11E-08 | 8.89E+04 | 1.87E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-49 | 2.11E-08 | 8.82E+04 | 1.86E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-50 | 4.80E-08 | 9.23E+04 | 4.43E-03 |
| 抗CD28 scFv | 肽-9 | 2.78E-07 | 4.15E+04 | 1.15E-02 |
以標準酶聯免疫吸附分析(ELISA)型式評估抗體結合人類PD-L1或CD28之能力。簡言之，在經中性抗生物素蛋白塗佈之盤上捕捉經生物素標記之抗原。隨後將稀釋於緩衝液中之抗體添加至經抗原塗佈之盤中。使用標準辣根過氧化酶結合物二級抗體偵測結合的抗體。使用Graphpad Prism軟體計算達成50%最大信號所需之濃度濃度(EC50)。
圖 11A繪示Ab-12及抗PD-L1 Fab 1 (SEQ ID NO: 16及17)與PD-L1之結合。
圖 11B繪示Ab-12及抗CD28 scFv (SEQ ID NO: 9)與CD28之結合。
圖 11C繪示Ab-12及Ab-13與PD-L1之結合。
圖 11D繪示Ab-12及Ab-13與CD28之結合。
圖 11E繪示Ab-1、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6及Ab-12與PD-L1之結合。在一些情況下，抗體與蛋白酶MTSP1一起培育。
圖 11F繪示Ab-12、Ab-1、抗PD-L1 Fab 1、抗CD28 scFv、Ab-5、Ab-6及Ab-7與CD28之結合。在一些情況下，抗體與MTSP1一起培育。
圖 11G繪示Ab-12、Ab-2、Ab-1、Ab-5及Ab-6與PD-L1之結合。在一些情況下，抗體與MMP9一起培育。
圖 11H繪示Ab-12、Ab-1、Ab-2、Ab-5及Ab-6與CD28之結合。在一些情況下，抗體與MMP9一起培育。
圖 11I繪示Ab-12、Ab-8、Ab-9、Ab-10及Ab-11與CD28之結合。在一些情況下，抗體與MTSP1一起培育。
圖 11J繪示Ab-12、Ab-5、Ab-1及Ab-9與CD28之結合。
圖 11K繪示Ab-12、Ab-5、Ab-1及Ab-9與PD-L1之結合。
圖 11L繪示Ab-12、Ab-9及Ab-9+MTSP1與PD-L1之結合。
圖 11M繪示Ab-12、Ab-9及Ab-9+MTSP1與CD28之結合。
實例 8. 免疫細胞活化分析
此實例展示使用經目標塗佈之珠粒及滴定的測試化合物活化人類PBMC。分析之例示性示意圖見於
圖 12E。
簡言之，經由經目標塗佈之珠粒及PBMC共培養後的IL-2釋放來量測免疫細胞活化。用可溶的經生物素標記之PD-L1及可溶的經生物素標記之TROP2處理M280磁性卵白素珠粒。洗滌M280珠粒且以每孔200,000個珠粒接種於96孔盤中。隨後將化合物以單藥劑及組合形式進行滴定，且接著添加至孔中，隨後添加100,000個PBMC。在不存在化合物之情況下，使用人類T細胞活化劑CD3/CD28珠粒(Invitrogen)作為陽性對照。共培養48小時後，使用來自BD Biosciences之細胞計數珠粒陣列(CBA)套組量測上清液中之細胞介素。根據製造商說明書使用標準曲線計算細胞介素之濃度。
圖 12A-12C展示化合物Ab-12，一種Vh型式之抗PD-L1×CD28未掩蔽抗體(序列提供於下文)；Ab-5，一種經肽-9掩蔽之抗PD-L1×CD28抗體；Ab-5與蛋白酶MTSP1一起培育、Ab-12與Ab-14 (一種抗TROP2 T細胞接合子(序列提供於下文))組合；Ab-5與Ab-14組合、Ab-5與Ab-14組合且與蛋白酶MTSP1一起培育、及單獨的Ab-14之資料。
圖 12A展示IL-2之資料。
圖 12B展示IFNy之資料。
圖 12C展示TNFα之資料。
圖 12D展示化合物Ab-12、Ab-13 (Vl型式之抗PD-L1×CD28未掩蔽抗體(序列提供於下文))及經掩蔽之抗PD-L1×CD28抗體Ab-8、Ab-10、Ab-9及Ab-11在與或不與蛋白酶MTSP1一起培育之情況下與Ab-14組合之資料。
表 23. Ab-12 、 Ab-13 及 Ab-14 之胺基酸序列
實例 9. 藉由 IL-2 釋放量測之免疫細胞活化
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至 C) | SEQ ID NO: |
| Ab-12 LC PDL1×CD28未掩蔽(Vh) | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 20 |
| Ab-12 HC PDL1×CD28未掩蔽(Vh) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 21 |
| Ab-13 LC PDL1×CD28未掩蔽(VL) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 22 |
| Ab-13 HC PDL1×CD28未掩蔽(VL) | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 23 |
| Ab-14 LC TROP2 T細胞接合子 | QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 202 |
| Ab-14 HC TROP2 T細胞接合子 | QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 203 |
經由經目標塗佈之珠粒及PBMC共培養後的IL-2釋放來量測免疫細胞活化。簡言之，用可溶的經生物素標記之PD-L1及可溶的經生物素標記之TROP2處理M280磁性卵白素珠粒。洗滌M280珠粒且以每孔200,000個珠粒接種於96孔盤中。隨後將化合物以單藥劑及組合形式進行滴定，接著添加至孔中，隨後添加100,000個人類或食蟹獼猴PBMC。共培養48小時後，使用來自BD Biosciences之細胞計數珠粒陣列(CBA)套組量測上清液中之細胞介素。根據製造商說明書使用標準曲線計算細胞介素之濃度。
圖 13A展示測試化合物Ab-14與Ab-9組合及Ab-14與Ab-12組合之資料。
圖 13B展示Ab-14與Ab-12組合及Ab-14與Ab-9組合以及單獨的Ab-14之資料。
實例 10. 在與 LNCaP 細胞之共培養分析中 hPBMC 之活化
使用PD-L1陽性腫瘤細胞株LNCaP，在功能性活體外腫瘤細胞殺傷及細胞介素釋放分析中評估化合物。使用來自Agilent之xCelligence即時細胞分析儀來量測腫瘤細胞殺傷，該分析儀依賴於感測器阻抗量測(細胞指數)，隨著腫瘤細胞在感測器表面上的黏附、擴散及擴增而增加。同樣，隨著腫瘤細胞被殺滅，阻抗降低。添加腫瘤細胞且使其在96孔E-Plate上黏附隔夜。第二天，將化合物作為單藥劑或與T細胞接合子、經肽掩蔽之T細胞接合子或經肽掩蔽之預裂解T細胞接合子組合連同PBMC一起滴定於補充人類血清之培養基中且添加至孔中。每10分鐘進行一次細胞指數量測，再持續120小時。隨後將細胞指數乘以小時數(腫瘤細胞生長動力學)相對於多肽複合物之濃度作圖，其中使用Graphpad Prism軟體計算減少腫瘤生長50%所需之濃度(IC50)。在研究端點使用來自BD Biosciences之Th1/Th2/Th17細胞計數珠粒陣列量測細胞介素。
圖 14A展示不同濃度之Ab-12相對於Ab-15 (一種抗PSMA T細胞接合子，其序列提供於下文)繪製之資料。
圖 14B展示不同濃度之Ab-5相對於Ab-15繪製之資料。
圖 14C展示不同濃度之Ab-5與MTSP1相對於Ab-15繪製之資料。
圖 14D展示不同濃度之Ab-5相對於Ab-16 (一種經肽掩蔽之抗PSMA T細胞接合子，其序列提供於下文中)繪製之資料。
圖 14E展示不同濃度之經MTSP1處理之Ab-5相對於經MTSP1處理之Ab-16繪製之資料。
圖 14F展示不同濃度之Ab-12相對於Ab-15繪製之資料。資料表明，在人類PBMC存在下，測試化合物與T細胞接合子協同作用，增強腫瘤細胞殺傷。
表 24. Ab-15 及 Ab-16 之胺基酸序列
實例 11. 抗 PD-L1×CD28 抗體與 T 細胞接合子組合增強 T 細胞活化之概念驗證研究
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至 C) | SEQ ID NO: |
| Ab-15 LC 抗PSMA T細胞接合子 | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKTGKVPKFLIYEASTLQSGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQNYNSAPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 173 |
| Ab-15 HC 抗PSMA T細胞接合子 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTQYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDFLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 174 |
| Ab-16 LC 抗PSMA經掩蔽T細胞接合子 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFYTAVMGWVRQAPGKGLEWVAAIRWTALTTSYADSVKGRFTISRDGAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAARGTLGLFTTADSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSGGVYCGPEFDESVGCMGGGGSGGGLSGRSDAGSPLGLAGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKTGKVPKFLIYEASTLQSGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQNYNSAPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 175 |
| Ab-16 HC 抗PSMA經掩蔽T細胞接合子 | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTQYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDFLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 176 |
在PBMC與MDAMB231腫瘤細胞共培養後，經由IL-2誘導量測免疫細胞活化。簡言之，在96孔盤中共培養30,000個MDAMB231細胞及90,000個PBMC。隨後將化合物以單藥劑及組合形式進行滴定，接著添加至孔中。共培養72小時後，使用來自BD Biosciences之細胞計數珠粒陣列(CBA)細胞介素套組量測上清液中之細胞介素。
圖 15A繪示靶向CD28及PD-L1之多特異性抗體的草圖組態，該多特異性抗體與靶向腫瘤相關抗原(TAA)諸如TROP2及T細胞之CD3的T細胞接合子(TCE)組合投與。
圖 15B繪示在PBMC與MDAMB231腫瘤細胞共培養後，經由IL-2誘導量測之免疫細胞活化。展示Ab-14、抗PD-L1 Fab 1、Ab-9及Ab-12之各種組合的圖。
實例 12. 在與 MDAMB231 腫瘤細胞之共培養分析中 hPBMC 之活化
在PBMC與MDAMB231腫瘤細胞共培養後，經由IL-2誘導量測免疫細胞活化。簡言之，在96孔盤中共培養30,000個MDAMB231細胞及90,000個PBMC。隨後將化合物以單藥劑及組合形式進行滴定，接著添加至孔中。共培養72小時後，使用來自BD Biosciences之細胞計數珠粒陣列(CBA)細胞介素套組量測上清液中之細胞介素。
圖 16A展示Ab-9與Ab-14組合及Ab-12與Ab-14組合以及單獨的Ab-14。
圖 16B展示分析之示意圖。
圖 16C展示Ab-11與Ab-14組合及Ab-13與Ab-14組合以及單獨的Ab-14。
實例 13. Ab-12 及 Ab-9 在食蟹獼猴中之藥物動力學
在食蟹獼猴中評估Ab-12及Ab-9之藥物動力學及探索安全性。簡言之，以IV大劑量推注形式向約3 kg體重之食蟹獼猴投與測試劑，且每天觀察不良事件之跡象。未觀察到生活中的不良事件。給藥後，在特定時間點將血液收集於K2 EDTA管中且處理成血漿。冷凍儲存血漿直至分析。血漿中測試劑之濃度係經由標準ELISA技術相對於在對照食蟹獼猴血漿中稀釋之參考標準品來量測。將血漿濃度曲線擬合為代表分佈相及消除相之標準兩相指數方程式。藥物動力學之擬合使得能夠計算
表 20中所示之Cmax、半衰期、分佈體積、清除率及7天曲線下面積(AUC)。
圖 17繪示在單次IV大劑量推注注射後Ab-12及Ab-9在食蟹獼猴中之藥物動力學。
表 25. Ab-12 及 Ab-9 之圖 17 藥物動力學概述
實例 14. 單次 IV 大劑量推注注射 Ab-12 及 Ab-9 後 食蟹獼猴之細胞介素釋放
| Ab-12 | Ab-9 | |
| 劑量(ug/kg) | 30 | 100 |
| C MAX(nM) | 10.7 | 60 |
| t 1/2(hr) | 2.15 | 40 |
| Vd (L) | 0.11 | 0.05 |
| CL (ml/hr/kg) | 12.1 | 0.3 |
在食蟹獼猴中評估藉由IV大劑量推注投與Ab-12或Ab-9後的細胞介素釋放。簡言之，以IV大劑量推注形式向約3 kg體重之食蟹獼猴投與測試劑，且每天觀察不良事件之跡象。未觀察到生活中的不良事件。給藥後，在特定時間點將血液收集於K2 EDTA管中且處理成血漿。冷凍儲存血漿直至分析。使用來自BD biosciences之非人類靈長類動物細胞計數Th1/Th2珠粒陣列套組，按照製造商的說明書分析血漿樣本之細胞介素。血漿中之干擾素γ、腫瘤壞死因子α、介白素6及介白素2含量係相對於珠粒陣列套組提供之參考標準品進行計算。
圖 18A-18C繪示在單次IV大劑量推注注射Ab-12及Ab-9後食蟹獼猴之細胞介素釋放。
實例 15. 單次 IV 大劑量推注注射 Ab-12 及 Ab-9 後 食蟹獼猴之肝酶分析
在食蟹獼猴中評估藉由IV大劑量推注投與測試劑後之全身性肝酶。簡言之，以IV大劑量推注形式向約3 kg體重之食蟹獼猴投與測試劑，且每天觀察不良事件之跡象。未觀察到生活中的不良事件。給藥後，在特定時間點將血液收集於K2 EDTA管中且處理成血漿。冷凍儲存血漿直至分析。分析血漿樣本中是否存在肝酶天冬胺酸轉胺酶(AST)及丙胺酸胺基轉移酶(ALT)作為潛在肝毒性跡象。AST及ALT按照Millipore市售套組中提供之說明書進行定量。根據製造商說明書，相對於陽性對照參考標準品，計算AST及ALT含量。
圖 19A-19D繪示在單次IV大劑量推注注射Ab-12或Ab-9後食蟹獼猴之血清肝酶。
實例 16. Ab-12 、 Ab-9 及 Ab-19 與 人類及猴 T 細胞 之結合
將來源於食蟹獼猴或健康人類供體血液之PBMC以1×10
6/ml之濃度接種於平底96孔盤中，總共100 μL。將細胞集結且在室溫下於暗處用活/死排除染料染色15分鐘。用PBS洗滌兩輪後，細胞用針對以下表面標誌物之抗體染色：CD3、CD4、CD8及PD-1。在+4℃下進行表面標誌物染色20分鐘，之後用PBS洗滌細胞。將所製備之測試化合物於PBS中之稀釋液添加至細胞中，最終體積為100 μL，且在CO2、37℃培育箱中培育1小時。為了偵測細胞表面結合的測試化合物，細胞用PBS洗滌3次且與已結合Alexa fluor 647的二級山羊抗人類IgG (H + L)抗體一起在+4℃下培育30分鐘。用PBS洗滌後，固定細胞且使用BD FACSymphony流式細胞儀進行分析。使用FlowJo軟體處理數據，及分析。使用Alexa fluor-647之幾何平均螢光強度(GMFI)計算CD28結合百分比且繪製結合曲線。
圖 20A-20D繪示Ab-12 (以Vh型式與PD-L1及CD28結合之未掩蔽抗體)、Ab-9及Ab-19 (以不可裂解之經掩蔽Vh型式與PD-L1及CD28結合之抗體)的結合結果。結果顯示，對CD28結合域之掩蔽降低與T細胞之濃度依賴性結合。
實例 17. 使用 Ab-12 、 Ab-9 、派姆單抗、阿特珠單抗及納武單抗之 PD-1 報導子分析
使用市售的基於生物發光細胞報導子之系統(Promega J1250)評估化合物拮抗PD-1/PD-L1途徑之效力。
PD-1報導子系統依賴於表現T細胞受體(TCR)、人類PD-1及由NFAT反應元件(NFAT-RE)驅動之螢光素酶報導子的重組Jurkat T細胞株。此細胞株與人工抗原呈現細胞(aAPC) (PD-L1 aAPC/CHO-Ki細胞)組合，表現人類PD-L1及經設計以活化Jurkat報導子細胞上所表現同源TCR的經工程改造之細胞表面蛋白質。當共同培養兩種類型之細胞時，PD-1/PD-L1相互作用會抑制TCR信號傳導及NFAT-RE介導之發光。與抗PD-(L)1阻斷抗體一起培育會釋放抑制信號且引起TCR活化及NFAT-RE介導之發光。
所有分析均根據製造商說明書進行。簡言之，將40,000個PD-L1 aAPC細胞接種於96孔盤之每孔中，且在37℃、5% CO2的含濕氣培育箱中培育隔夜。第二天，在細胞培養基中製備測試物品之適當連續稀釋液，且添加至含有PD-L1 aAPC之孔中。將90,000個Jurkat報導子細胞再懸浮於細胞培養基中且添加至適當的孔中。各測試條件設置為一式四份。將Jurkat PD-1報導子細胞與PD-L1 aAPC及測試物品一起在37℃、5% CO2的含濕氣培育箱中培育72小時。培育5小時後，將Bio-Glo試劑添加至孔中且在室溫下培育10分鐘。使用Tecan Spark微量盤讀取器量測發光。將測試化合物之對數濃度相對於標準化發光信號作圖。
圖 21繪示Ab-12、Ab-9、派姆單抗、阿特珠單抗及納武單抗之PD-1報導子分析的結果。派姆單抗、阿特珠單抗及納武單抗之序列提供於
表 26中。結果表明，在PD-1報導子分析中觀察到的活性在CD28掩蔽或未掩蔽分子中為相似的。
表 26. 額外序列
實例 18. 使用 Ab-12 、 Ab-9 、 Ab-19 及 TGN1412 之 CD28 報導子分析
| 構築體描述 | 胺基酸序列 (N 至 C) | SEQ ID NO: |
| TGN1412 LC | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 220 |
| TGN1412 HC | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 221 |
| 派姆單抗LC | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 222 |
| 派姆單抗HC | QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK | 223 |
| 阿特珠單抗LC | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 224 |
| 阿特珠單抗HC | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 225 |
| 納武單抗LC | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 226 |
| 納武單抗HC | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK | 227 |
為了評估化合物促效CD28共刺激途徑之效力，使用市售的基於生物發光細胞報導子之系統(Promega JA6701)。
CD28報導子系統依賴於表現T細胞受體(TCR)、CD3及CD28受體以及由CD28途徑依賴性啟動子驅動之螢光素酶報導子的重組Jurkat T細胞株。CD28報導子Jurkat細胞與來自PD-1報導子套組(Promega J1250)之人工APC (PD-L1 aAPC/CHO-Ki細胞)共培養，後者表現人類PD-L1及經設計以活化Jurkat報導子細胞上表現之同源TCR的經工程改造之細胞表面蛋白。在不存在CD28促效劑抗體之情況下，CD28未活化且發光低。與CD28促效劑抗體一起培育誘導CD28途徑且增加發光。
所有分析均根據製造商說明書進行。簡言之，將40,000個PD-L1 aAPC細胞接種於96孔盤之每孔中，且在37℃、5% CO2的含濕氣培育箱中培育隔夜。第二天，在細胞培養基中製備測試物品之適當連續稀釋液，且添加至含有PD-L1 aAPC之孔中。將90,000個Jurkat CD28報導子細胞再懸浮於細胞培養基中且添加至適當的孔中。各測試條件設置為一式四份。將Jurkat CD28報導子細胞與PD-L1 aAPC及測試物品一起在37℃、5% CO2的含濕氣培育箱中培育72小時。培育5小時後，將Bio-Glo試劑添加至孔中且在室溫下培育10分鐘。使用Tecan Spark微量盤讀取器量測發光。將測試化合物之對數濃度相對於標準化發光信號作圖。
圖 22繪示Ab-12、Ab-9、Ab-19及TGN1412之CD28報導子分析的結果。TGN1412之序列提供於
表 26中。結果表明，與未掩蔽型式相比，經掩蔽分子在CD28報導子分析中表現出活性降低。
實例 19. 藉由 混合淋巴細胞反應 (MLR) 系統中腫瘤細胞之 IL-2 誘導量測之作為單藥劑或與派姆單抗組合的功能活性分析
為了評估測試化合物作為單藥劑或與派姆單抗組合之功能活性，基於健康人類供體PBMC與三陰性***腫瘤細胞株MDA-MB231之共培養建立混合淋巴細胞反應(MLR)系統。其中指示測試化合物用蛋白酶MMP9或MTSP1預處理。為了確保活性抗原呈現之存在，MDA-MB231細胞負載有HLA-A*0201限制性CMV肽(NLVPMVATV)。為了確保T細胞識別此肽，在MLR反應中使用來源於HLA-A*0201+ CMV+供體之PBMC。簡言之，在存在1 ug/mL CMV肽之情況下，將50,000個MDA-MB231細胞接種於96孔盤之每孔中，且在37℃、5% CO2的含濕氣培育箱中培育隔夜。第二天，在完全細胞培養基中製備測試物品之適當連續稀釋液，且添加至含有經肽包覆之MDA-MB231腫瘤細胞的孔中。將健康供體PBMC (150,000個細胞)再懸浮於細胞培養基中且添加至適當的孔中。各測試條件設置為一式四份。將PBMC與測試物品及MDA-MB231細胞一起在37℃、5% CO2的含濕氣培育箱中培育72小時。收穫細胞培養上清液且儲存於-20℃下，直至細胞介素分析。使用MSD平台量測細胞培養上清液中之可溶性IL-2。將IL-2誘導相對於測試化合物之對數濃度作圖。
圖 23A繪示Ab-12、Ab-9及Ab-19之IL-2誘導結果。亦展示Ab-9與MMP9或MTSP1之組合。
圖 23B繪示Ab-12與派姆單抗組合、Ab-9與派姆單抗組合、Ab-9與MMP9及派姆單抗組合以及Ab-9與MTSP1及派姆單抗組合的結果。
實例 20. Ab-12 、 Ab-9 及 Ab-19 與 腫瘤細胞上之 PD-L1 的 結合
使用表現PD-L1之MDA-MB231腫瘤細胞株評估測試化合物與腫瘤細胞上表現之PD-L1的結合。簡言之，將100,000個MDA-MB231細胞接種於96孔盤之每孔中，且在37℃、5% CO
2的含濕氣培育箱中與測試化合物之適當連續稀釋液培育1小時。為了偵測細胞表面結合的測試化合物，細胞用PBS洗滌3次且與Alexa fluor 647結合的二級抗人類IgG抗體一起在+4℃下培育30分鐘。用PBS洗滌後，固定細胞且使用BD FACSymphony進行分析。使用FlowJo軟體對資料進行處理及分析。使用Alexa fluor-647之幾何平均值螢光強度(GMFI)計算PD-L1結合百分比且繪製結合曲線。
圖 24繪示Ab-12、Ab-9及Ab-19與表現PD-L1之MDA MB231腫瘤細胞株上之PD-L1結合的結果。結果表明，與MDA-MB231腫瘤細胞上之PD-L1結合在CD28經掩蔽及未掩蔽分子中為相似的。
實例 21. 經 腫瘤活化之與 CD28 及 PD-L1 結合之多特異性抗體與 T 細胞 接合子組合增強 T 細胞 功能活化
使用PDL1陽性腫瘤細胞株CAL27，在功能性活體外腫瘤細胞殺傷及細胞介素釋放分析中評估多肽複合物。使用來自Agilent之xCelligence即時細胞分析儀來量測腫瘤細胞殺傷，該分析儀依賴於感測器阻抗量測(細胞指數)，隨著腫瘤細胞在感測器表面上的黏附、擴散及擴增而增加。同樣，隨著腫瘤細胞被殺滅，阻抗降低。添加腫瘤細胞且使其在96孔E-Plate上黏附隔夜。第二天，將可裂解或不可裂解的多肽複合物作為單藥劑或與TCE組合連同人類PBMC一起滴定於補充人類血清之培養基中且添加至孔中。每10分鐘進行一次細胞指數量測，再持續120小時。隨後將細胞指數乘以小時數(腫瘤細胞生長動力學)相對於多肽複合物之濃度作圖，其中使用Graphpad Prism軟體計算減少腫瘤生長50%所需之濃度(IC50)。在研究端點使用來自BD Biosciences之Th1/Th2/Th17細胞計數珠粒陣列量測細胞介素。
圖 25A繪示靶向CD28及PD-L1之多特異性抗體的草圖組態，該多特異性抗體與靶向腫瘤相關抗原(TAA)諸如EGFR及T細胞之CD3的T細胞接合子組合投與。
圖 25B-25C繪示Ab-12、Ab-9、Ab-18單獨或與1 pM之Ab-20 (一種EGFR T細胞接合子)組合對CAL27腫瘤細胞之腫瘤細胞殺傷。圖之結果亦彙總於
表 28中。
表 27彙總CAL27細胞上之PD-L1及EGFR密度。
圖 25D-25F繪示Ab-12或Ab-12與1 pM之Ab-20的組合連同人類PBMC一起滴定於補充人類血清之培養基中時的細胞介素誘導(IFNγ、TNF及IL-2)。
圖 25G-25I繪示Ab-9或Ab-9與1 pM之Ab-20的組合以及Ab-18或Ab-18與1 pM之Ab-20的組合連同人類PBMC一起滴定於補充人類血清之培養基中時的細胞介素誘導(IFNγ、TNF及IL-2)。
結果表明，PD-L1及CD28靶向分子與靶向EGFR及CD3之T細胞接合子組合的活體外功能活性為掩蔽及裂解依賴性的。未掩蔽之PD-L1×CD28雙特異性表現出比經掩蔽型式更強的效力，且經掩蔽之不可裂解型式與經掩蔽之可裂解型式相比表現出更弱的活性。經掩蔽之可裂解分子及經掩蔽之不可裂解分子之間的活性差異暗示分析中來自腫瘤細胞或PBMC或兩者之蛋白水解裂解。
表 27. CAL27 密度
表 28.
實例 22. 經 腫瘤活化之與 CD28 及 PD-L1 結合之多特異性抗體與結合 TROP2 及 CD3 之抗體組合的抗腫瘤功效
| 細胞株 | PD-L1 密度( 複本/ 細胞) | EGFR 密度( 複本/ 細胞) |
| CAL27 | 22,000 | 170,000 |
| 化合物 | 存在Ab-20 (EGFR TCE) | 不存在Ab-20 (EGFR TCE) |
| Ab-12(未掩蔽) | 70 pM | ＞ 100,000 pM |
| Ab-9(可裂解) | 2,226 pM | ＞100,000 pM |
| Ab-18(不可裂解) | 64,463 pM | ＞100,000 pM |
在三陰性乳癌小鼠模型中對測試化合物之抗腫瘤活性進行測試。雌性NCG小鼠在後側腹皮下接種5×10
6個MDAMB231腫瘤細胞。當腫瘤變得可觸知(50-80 mm
3)時，將小鼠隨機分組(每組N = 10)且藉由腹膜內注射投與15×10
6個人類PBMC。當腫瘤達到200-300 mm
3時，每天經由尾靜脈的靜脈內注射向動物投與測試物品，持續10天。使用測徑規隨時間推移量測腫瘤體積。當腫瘤體積達到2000 mm
3或有明顯的移植物抗宿主病跡象時，對動物實施安樂死。藉由將平均腫瘤體積相對於時間作圖來評估腫瘤生長動力學。
圖 26繪示在用Ab-22與Ab-18組合處理、或用Ab-21及Ab-17組合處理、或僅用Ab-17處理、或僅用Ab-21處理後的平均腫瘤體積。
結果表明，PD-L1及CD28靶向分子與TROP2及CD3靶向分子組合之活體內抗腫瘤活性為裂解依賴性的。雖然經掩蔽之可裂解PD-L1及CD28靶向分子與TROP2及CD3靶向分子組合抑制腫瘤生長，但經掩蔽之不可裂解型式在相同組合中不抑制腫瘤生長。由於移植的PBMC缺乏對腫瘤的免疫識別，因此單藥劑PD-L1及CD28靶向分子不抑制腫瘤生長。所利用之PBMC因其缺乏活體內針對MDAMB231腫瘤之內源活性而經特別選擇。
實例 23. 在 1 mg/kg 、 5 mg/kg 及 15 mg/kg Ab-9 之 IV 給藥後的非人類靈長類動物研究
根據實例13之程序評定Ab-9之藥物動力學及安全性，不同之處在於處理劑量為1 mg/kg、5 mg/kg及15 mg/kg。使用標準Luminex細胞介素板來量測投與後的細胞介素釋放，包括IL-2、IL-10、TNFa、IL-6及IFNg。使用標準板及方法量測NHP血清中之臨床化學參數。臨床化學板包括肝酶、AST及ALT，以及總膽紅素(TBIL)、肌酐(CRE)及血尿素(UREA)，作為肝臟及腎臟功能之間接量度。
圖 27繪示以15 mg/kg、5 mg/kg及1 mg/kg之Ab-9給藥的非人類靈長類動物藥物動力學。
圖 28A-28E繪示在投與15 mg/kg、5 mg/kg及1 mg/kg之Ab-9後非人類靈長類動物之細胞介素釋放(IFNγ、TNF、IL-2、IL-6及IL-10)。
圖 29A-29E繪示以15 mg/kg、5 mg/kg及1 mg/kg之Ab-9給藥的非人類靈長類動物臨床化學結果(AST、ALT、TBIL、CRE、尿素)。
結果表明，在劑量高達15 mg/kg後，所測量之細胞介素或臨床化學沒有引起有意義的變化。在此研究中未達到最大耐受劑量(MTD)。
本發明之新穎特徵在隨附申請專利範圍中細緻闡述。將參考闡述利用本發明原理之說明性實施例及其隨附圖式的以下詳細描述來獲得對本發明之特徵及優點的較佳理解：
圖 1A-1B繪示抗PDL1×CD28多特異性抗體之例示性示意圖。
圖 1A繪示抗體Fab-scFv型式之「Vh」型式。
圖 1B繪示Fab-scFv抗體型式之「Vl」型式。
圖 2繪示鑑別可連接至抗PD-L1及抗CD28多特異性抗體以在腫瘤微環境中選擇性活化之肽的示意圖。該示意圖繪示定向進化及噬菌體呈現技術，以鑑別阻斷抗原結合域識別抗原之肽。
圖 3A繪示藉由ELISA量測之抗CD28 scFv與肽的結合。
圖 3B繪示藉由ELISA量測之Ab-12與肽的結合。
圖 3C繪示藉由ELISA量測之抗CD28 scFv與肽的結合。
圖 3D繪示藉由ELISA量測之Ab-12與肽的結合。
圖 3E-3F繪示藉由ELISA量測之抑制抗CD28 scFv與CD28抗原結合的肽。
圖 3G繪示藉由ELISA量測之抑制Ab-12結合CD28抗原的肽。
圖 4A-4D繪示藉由Octet量測之抗CD28 scFv或Ab-12與肽-9及肽-12之動力學結合。
圖 5A-5B繪示抗CD28 scFv與肽-9之Ala掃描肽之結合。
圖 6A-
6B繪示肽-9之Ala掃描肽對抗CD28 scFv之抑制。
圖 7繪示使用WebLogo 3.7.4生成之經最佳化抗CD28 scFv肽-9序列的核心序列模體。
圖 8A-8C繪示藉由ELISA量測之抑制抗CD28 scFv結合CD28抗原的肽。
圖 9A-9C繪示藉由ELISA量測之抑制Ab-12結合CD28抗原的肽。
圖 10A-10U繪示藉由Octet量測之抗CD28 scFv與肽結合之動力學結合。
圖 11A繪示藉由ELISA量測之Ab-12及抗PD-L1 Fab 1 (SEQ ID NO: 16及17)與PD-L1之結合。
圖 11B繪示藉由ELISA量測之Ab-12及抗CD28 scFv (SEQ ID NO: 9)與CD28之結合。
圖 11C繪示藉由ELISA量測之Ab-12及Ab-13與PD-L1之結合。
圖 11D繪示藉由ELISA量測之Ab-12及Ab-13與CD28之結合。
圖 11E繪示藉由ELISA量測之Ab-1、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6及Ab-12與PD-L1之結合。在一些情況下，抗體與MTSP1一起培育。
圖 11F繪示藉由ELISA量測之Ab-12、Ab-1、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6及Ab-7與CD28之結合。在一些情況下，抗體與MTSP1一起培育。
圖 11G繪示藉由ELISA量測之Ab-12、Ab-1、Ab-2、Ab-5及Ab-6與PD-L1之結合。在一些情況下，抗體與MMP9一起培育。
圖 11H繪示藉由ELISA量測之Ab-12、Ab-1、Ab-2、Ab-5及Ab-6與CD28之結合。在一些情況下，抗體與MMP9一起培育。
圖 11I繪示藉由ELISA量測之Ab-12、Ab-8、Ab-9、Ab-10及Ab-11與CD28之結合。在一些情況下，抗體與MTSP1一起培育。
圖 11J繪示藉由ELISA量測之Ab-12、Ab-5、Ab-1及Ab-9與CD28之結合。
圖 11K繪示藉由ELISA量測之Ab-12、Ab-5、Ab-1及Ab-9與PD-L1之結合。
圖 11L繪示藉由ELISA量測之Ab-12、Ab-9及Ab-9+MTSP1與PD-L1之結合。
圖 11M繪示藉由ELISA量測之Ab-12、Ab-9及Ab-9+MTSP1與CD28之結合。
圖 12A-12D繪示在塗佈有TROP2及PD-L1之經目標塗佈之珠粒與PBMC共培養且投與靶向CD28及PD-L1之抗體構築體及抗TROP2×CD3T細胞接合子(Ab-14)後，藉由細胞介素釋放量測之免疫細胞活化。
圖 12E繪示靶向CD28及PD-L1之抗體構築體的草圖組態，該抗體構築體與靶向腫瘤相關抗原(TAA)諸如TROP2及T細胞之CD3的T細胞接合子(TCE)組合投與。
圖 13A-13B繪示在經靶向塗佈之珠粒與人類PBMC (
圖 13A)或食蟹獼猴PSMC (
圖 13B)共培養後，經由IL-2釋放所量測之免疫細胞活化。珠粒用經生物素標記之PD-L1及可溶的經生物素標記之TROP2處理，且靶向CD28及PD-L1之抗體構築體作為單藥劑或組合投與。
圖 14A-14C繪示使用LNCaP PD-L1陽性腫瘤細胞株之活體外PBMC活化分析的結果，其中在人類PBMC存在下，將靶向CD28及PD-L1之各種抗體構築體與Ab-15共投與。當靶向CD28及PD-L1之各種抗體構築體與抗PSMA×CD3 T細胞接合子(Ab-15)組合時，藉由細胞介素釋放量測之活體外PBMC活化發生協同作用。
圖 14D-14F繪示在人類PBMC存在下使用LNCaP PDL1陽性腫瘤細胞株之活體外腫瘤細胞殺傷分析的結果。當靶向CD28及PD-L1之各種抗體構築體與抗PSMA×CD3 T細胞接合子(Ab-15)或經掩蔽之PSMA×CD3 T細胞接合子(Ab-16)組合時，活體外腫瘤細胞殺傷增強。腫瘤細胞殺傷依賴於掩蔽，其中藉由MTSP1移除掩蔽之裂解導致腫瘤細胞殺傷增強。
圖 15A繪示靶向CD28及PD-L1之多特異性抗體的草圖組態，該多特異性抗體與靶向腫瘤相關抗原(TAA)諸如TROP2及T細胞之CD3的T細胞接合子組合投與。
圖 15B繪示在PBMC與MDAMB231腫瘤細胞及指定抗體共培養後，經由IL-2誘導量測之免疫細胞活化。
圖 16A及
圖 16C繪示在PBMC與MDAMB231腫瘤細胞及指定抗體共培養後，經由IL-2誘導量測之免疫細胞活化。
圖 16B繪示靶向CD28及PD-L1之多特異性抗體的草圖組態，該多特異性抗體與靶向腫瘤相關抗原(TAA)諸如TROP2及T細胞之CD3的T細胞接合子組合投與。
圖 17繪示在單次IV大劑量推注注射後Ab-12及Ab-9在食蟹獼猴中之藥物動力學。
圖 18A-18C繪示在單次IV大劑量推注注射Ab-12及Ab-9後食蟹獼猴之細胞介素釋放。
圖 19A-19D繪示在單次IV大劑量推注注射Ab-12及Ab-9後食蟹獼猴之血清肝酶。
圖 20A-20D繪示藉由流動式細胞測量術量測的Ab-12 (以Vh型式與PD-L1及CD28結合的未掩蔽之抗體)、Ab-9 (以可裂解的經掩蔽Vh型式與PD-L1及CD28結合之抗體)及Ab-19 (以不可裂解的經掩蔽Vh型式與PD-L1及CD28結合之抗體)與人類或食蟹獼猴PBMC的結合結果。
圖 21繪示Ab-12、Ab-9、派姆單抗、阿特珠單抗及納武單抗之PD-1報導子分析的結果。
圖 22繪示Ab-12、Ab-9、Ab-19及TGN1412之CD28報導子分析的結果。
圖 23A繪示由人類PBMC及腫瘤細胞混合淋巴細胞反應活體外IL-2誘導Ab-12、Ab-9及Ab-19之結果。亦展示使用MTSP1及MMP9裂解之Ab-9。
圖 23B繪示Ab-12與派姆單抗組合、Ab-9與派姆單抗組合、MMP9裂解之Ab-9與派姆單抗組合及MTSP1裂解之Ab-9與派姆單抗組合的結果。
圖 24繪示Ab-12、Ab-9及Ab-19與表現PD-L1之MDA MB231腫瘤細胞株上之PD-L1結合的結果。
圖 25A繪示靶向CD28及PD-L1之多特異性抗體的草圖組態，該多特異性抗體與靶向腫瘤相關抗原(TAA)諸如EGFR及T細胞之CD3的T細胞接合子組合投與。
圖 25B-25C繪示Ab-12、Ab-9、Ab-18單獨或與1 pM之Ab-20 (一種EGFR T細胞接合子)組合對CAL27腫瘤細胞之腫瘤細胞殺傷。圖之結果亦彙總於
表 28中。
圖 25D-25F繪示在補充人類血清之培養基中在滴定的Ab-12或滴定的Ab-12與1pM之Ab-20的組合存在下，人類PBMC與Cal27腫瘤細胞共培養物之細胞介素誘導(IFNγ、TNF及IL-2)。
圖 25G-25I繪示在補充人類血清之培養基中在滴定的Ab-9或滴定的Ab-9與1pM之Ab-20的組合以及滴定的Ab-18或滴定的Ab-18與1 pM之Ab-20的組合存在下，人類PBMC與Cal27腫瘤細胞共培養物之細胞介素誘導(IFNγ、TNF及IL-2)。
圖 26繪示在用Ab-22與Ab-18組合處理、或用Ab-21及Ab-17組合處理、或僅用Ab-17處理、或僅用Ab-21處理後，MDAMB231在免疫功能不全小鼠中之活體內腫瘤生長動力學(平均腫瘤體積)。
圖 27繪示以15 mg/kg、5 mg/kg及1 mg/kg之Ab-9給藥的非人類靈長類動物藥物動力學。
圖 28A-28E繪示在投與15 mg/kg、5 mg/kg及1 mg/kg之Ab-9後非人類靈長類動物之細胞介素釋放(IFNγ、TNF、IL-2、IL-6及IL-10)。
圖 29A-29E繪示以15 mg/kg、5 mg/kg及1 mg/kg之Ab-9給藥的非人類靈長類動物臨床化學結果(AST、ALT、TBIL、CRE、尿素)。
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Claims (160)
- 一種根據下式之經分離多特異性抗體： P 1-L 1-A 1-L-B ( 式 I)，其中A 1包含CD28結合域；B包含PD-L1結合域；L包含連接A 1與B之連接子；P 1包含與A 1結合之肽，且L 1包含連接A 1與P 1之連接部分且為腫瘤特異性蛋白酶之受質，其中P 1包含根據X 1-X 2-X 3-C-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8-X 9-X 10-C-X 11-X 12之胺基酸序列，其中X 1係選自M、I、L及V；X 2係選自D、H、N、A、F、S、T、Y及V；X 3係選自W、L及F；X 4係選自P、A及L；X 5係選自R、T、I、M、S、K、L、V、W、F、A、P及D；X 6係選自E、D、Y、H、S、F、A、N、T、I、P及V；X 7係選自L、M、R、S、Q及H；X 8係選自W及Q；X 9係選自H、N、D、A、S、Y、T、F、V、L及I；X 10係選自E、V、L、D、Y、R、Q、H、F、K、A、M及N；X 11係選自F、Y、L、W及V；且X 12係選自N、A、F、S、Y、H、D、T及L。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中X 1係選自M、I及L；X 2係選自D、H、N及A；X 3為W；X 4為P；X 5係選自R、T、I、M、S及K；X 6係選自E、D、Y、H、S及F；X 7係選自L、M及R；X 8為W；X 9係選自H、N、D、A、S及V；X 10係選自E、V、L、D及H；X 11係選自F、Y及L；且X 12係選自N、A、F、S及Y。
- 如請求項2之經分離多特異性抗體，其中X 1為M；X 2係選自D及H；X 3為W；X 4為P；X 5係選自R、T及I；X 6係選自E、D及Y；X 7係選自L、M及R；X 8為W；X 9係選自H、N、D及V；X 10係選自E、V、L、D及H；X 11為F；且X 12係選自N、A及F。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中P 1包含根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 32具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中P 1包含根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中P 1包含根據SEQ ID NO: 138之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO: 138具有1、2或3個胺基酸突變、取代或缺失之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中P 1包含根據SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中P 1削弱A 1與CD28之結合。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中P 1經由離子相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用、π堆疊相互作用及H鍵結相互作用或其組合與A 1結合。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中P 1在抗原結合位點處或附近與A 1結合。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中當L 1由該腫瘤特異性蛋白酶裂解時，P 1變得與A 1不再結合，從而使A 1暴露於CD28。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中P 1與CD28之序列一致性小於75%。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中P 1包含與CD28共有小於10%之序列一致性的新的(de novo)胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中P 1包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中P 1不包含白蛋白或白蛋白片段。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中P 1不包含白蛋白結合域。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中L 1為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中L 1為具有至少10個至不超過30個胺基酸之肽序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中L 1為具有至少10個胺基酸之肽序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中L 1為具有至少18個胺基酸之肽序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中L 1為具有至少26個胺基酸之肽序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中L 1包含含有(G 2S) n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中L 1包含含有(G 2S) n之式，其中n為至少1之整數。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中L 1包含選自由以下組成之群的式：(G 2S) n、(GS) n、(GSGGS) n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS) n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS) n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS) n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該腫瘤特異性蛋白酶係選自由以下組成之群：金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶及天冬胺酸蛋白酶。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中L 1包含尿激酶可裂解胺基酸序列、間質蛋白酶可裂解胺基酸序列或基質金屬蛋白酶可裂解胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中L 1包含根據SEQ ID NO: 18-19、62-88之序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中L 1與A 1之N端結合。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中L 1與A 1之C端結合。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該CD28結合域包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab或Fab'。
- 如請求項30之經分離多特異性抗體，其中該CD28結合域包含該單鏈可變片段。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該PD-L1結合域包含單鏈可變片段、單域抗體、Fab或Fab'。
- 如請求項32之經分離多特異性抗體，其中該PD-L1結合域包含該Fab或該Fab'。
- 如請求項32之經分離多特異性抗體，其中該PD-L1結合域包含該Fab或該Fab'且該CD28結合域包含該單鏈可變片段。
- 如請求項32之經分離多特異性抗體，其中包含該Fab或該Fab'之該PD-L1結合域包含含有Fab重鏈可變域之Fab重鏈多肽及含有Fab輕鏈可變域之Fab輕鏈多肽。
- 如請求項35之經分離多特異性抗體，其中包含該單鏈可變片段之該CD28結合域包含scFv重鏈可變域及scFv輕鏈可變域。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該連接子將A 1之C端連接至B之N端。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該連接子將A 1之N端連接至B之C端。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將A 1之C端連接至該Fab重鏈多肽之N端。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將A 1之N端連接至該Fab重鏈多肽之C端。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將A 1之C端連接至該Fab輕鏈多肽之N端。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將A 1之N端連接至該Fab輕鏈多肽之C端。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv重鏈可變域。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv重鏈可變域。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之N端。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之C端。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv重鏈可變域之N端。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv重鏈可變域之C端。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之N端。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之C端。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv重鏈可變域之N端。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv重鏈可變域之C端。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該連接子之長度為至少5個胺基酸。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該連接子包含(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 58)、(GGGS)n (SEQ ID NO: 59)、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS)n (SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中L包含含有(G2S)n之式，其中n為1至3之整數(SEQ ID NO: 228)。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該L包含SEQ ID NO: 18 (GGGGSGGGGSGGGGS)或SEQ ID NO: 19 (GGGGS)之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv重鏈可變域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該scFv重鏈可變域之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 1；HC-CDR2：SEQ ID NO: 2；HC-CDR3：SEQ ID NO: 3，且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv輕鏈可變域包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該scFv輕鏈可變域之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 4；LC-CDR2：SEQ ID NO: 5 (KA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 6，且其中該等CDR包含該等LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中A 1包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中A 1之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 4；LC-CDR2：SEQ ID NO: 5 (KA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 6；其中A 1包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中A 1之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 1；HC-CDR2：SEQ ID NO: 2；HC-CDR3：SEQ ID NO: 3。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該Fab重鏈可變域包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該Fab重鏈可變域之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 10；HC-CDR2：SEQ ID NO: 11；HC-CDR3：SEQ ID NO: 12；且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該Fab輕鏈可變域包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中該Fab輕鏈可變域之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 13；LC-CDR2：SEQ ID NO: 14 (DA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 15；且其中該等CDR包含該等LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中B包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中B之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 10；HC-CDR2：SEQ ID NO: 11；HC-CDR3：SEQ ID NO: 12；且其中B包含互補決定區(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，其中B之該LC-CDR1、該LC-CDR2及該LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO: 13；LC-CDR2：SEQ ID NO: 14 (DA)；及LC-CDR3：SEQ ID NO: 15。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv重鏈可變域包含與根據SEQ ID NO: 7之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少75個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv重鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之至少110個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 7之該等至少110個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv重鏈可變域包含根據SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv輕鏈可變域包含與根據SEQ ID NO: 8之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少75個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之至少100個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 8之該等至少100個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv輕鏈可變域包含根據SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv包含與根據SEQ ID NO: 9之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv包含SEQ ID NO: 9之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv包含SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv包含SEQ ID NO: 9之至少210個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 9之該等至少210個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該scFv包含根據SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該Fab重鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 17之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該Fab重鏈多肽包含SEQ ID NO: 17之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該Fab重鏈多肽包含SEQ ID NO: 17之至少215個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該Fab重鏈多肽包含SEQ ID NO: 17之至少215個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 17之該等至少215個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該Fab重鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 17之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該Fab輕鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 16之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該Fab輕鏈多肽包含SEQ ID NO: 16之至少175個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該Fab輕鏈多肽包含SEQ ID NO: 16之至少200個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該Fab輕鏈多肽包含SEQ ID NO: 16之至少200個連續胺基酸殘基之胺基酸序列，且與SEQ ID NO: 16之該等至少200個連續胺基酸殘基具有至少80%序列一致性。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該Fab輕鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之C端，且其中該Fab輕鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列，且連接至該scFv輕鏈可變域之C端的該Fab重鏈多肽之胺基酸序列包含與根據SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab重鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之C端，且其中該Fab輕鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 20之胺基酸序列，且連接至該scFv輕鏈可變域之C端的該Fab重鏈多肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之C端，且其中該Fab重鏈多肽包含與根據SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列，且連接至該scFv輕鏈可變域之C端的該Fab輕鏈多肽之胺基酸序列包含與根據SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項36之經分離多特異性抗體，其中該連接子將該Fab輕鏈多肽連接至該scFv輕鏈可變域之C端，且其中該Fab重鏈多肽包含根據SEQ ID NO: 23之胺基酸序列，且連接至該scFv輕鏈可變域之C端的該Fab輕鏈多肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該多特異性抗體進一步包含半衰期延長分子(H 1)。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1連接至P 1。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1不阻斷A 1與CD28結合。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1不阻斷B與PD-L1結合。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，H 1包含連接H 1與P 1之連接部分(L 5)。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中該半衰期延長分子(H 1)對PD-L1不具有結合親和力。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中該半衰期延長分子(H 1)對CD28不具有結合親和力。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中該半衰期延長分子(H 1)不會使該多特異性抗體隔離CD28。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1包含根據SEQ ID NO: 54-57之序列。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1包含具有重複序列模體之胺基酸序列。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1包含具有高度有序二級結構之胺基酸序列。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1包含聚合物。
- 如請求項105之經分離多特異性抗體，其中該聚合物為聚乙二醇(PEG)。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1包含白蛋白。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1包含Fc域。
- 如請求項107之經分離多特異性抗體，其中該白蛋白為血清白蛋白。
- 如請求項107之經分離多特異性抗體，其中該白蛋白為人類血清白蛋白。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1包含多肽、配體或小分子。
- 如請求項111之經分離多特異性抗體，其中該多肽、該配體或該小分子結合血清蛋白或其片段、循環免疫球蛋白或其片段、或CD35/CR1。
- 如請求項112之經分離多特異性抗體，其中該血清蛋白包含甲狀腺素結合蛋白、甲狀腺素運載蛋白、1-酸性醣蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體或其運鐵蛋白結合部分、纖維蛋白原或白蛋白。
- 如請求項112之經分離多特異性抗體，其中該循環免疫球蛋白分子包含IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。
- 如請求項112之經分離多特異性抗體，其中該血清蛋白為白蛋白。
- 如請求項112之經分離多特異性抗體，其中該多肽為抗體。
- 如請求項112之經分離多特異性抗體，其中該抗體包含單域抗體、單鏈可變片段、Fab或Fab'。
- 如請求項117之經分離多特異性抗體，其中該單域抗體包含與白蛋白結合之單域抗體。
- 如請求項118之經分離多特異性抗體，其中該單域抗體為人類或人源化抗體。
- 如請求項117之經分離多特異性抗體，其中該單域抗體係選自由以下組成之群：645gH1gL1、645dsgH5gL4、23-13-A01 -sc02、A10m3或其片段、DOM7r-31、DOM7h-11-15、Alb-1、Alb-8、Alb-23、10G、10E及SA21。
- 如請求項117之經分離多特異性抗體，其中該單域抗體包含互補決定區(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其中該單域抗體之該HC-CDR1、該HC-CDR2及該HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO: 54，HC-CDR2：SEQ ID NO: 55，及HC-CDR3：SEQ ID NO: 56；且其中該等CDR包含該等HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之至少一者之0-2個胺基酸修飾。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1包含根據SEQ ID NO: 57之胺基酸序列。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1包含與SEQ ID NO: 57具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1包含與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1包含與SEQ ID NO: 57具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1包含經修飾之胺基酸或非天然胺基酸，或經修飾之非天然胺基酸，或其組合。
- 如請求項126之經分離多特異性抗體，其中該經修飾之胺基酸或經修飾之非天然胺基酸包含轉譯後修飾。
- 如請求項94之經分離多特異性抗體，其中H 1包含連接H 1與P 1之連接部分(L 5)。
- 如請求項128之經分離多特異性抗體，其中L 5為具有至少5個至不超過50個胺基酸之肽序列。
- 如請求項128之經分離多特異性抗體，其中L 5為具有至少26個胺基酸之肽序列。
- 如請求項128之經分離多特異性抗體，其中L 5包含選自由以下組成之群的式：(G 2S) n、(GS) n、(GSGGS) n(SEQ ID NO: 58)、(GGGS) n(SEQ ID NO: 59)、(GGGGS) n(SEQ ID NO: 60)及(GSSGGS) n(SEQ ID NO: 61)，其中n為至少1之整數。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149-170具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149及150具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 149及150具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 151及152具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 151及152具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 153及154具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 153及154具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 155及156具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 155及156具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 157及158具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 157及158具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 159及160具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 159及160具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 161及162具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 161及162具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 163及164具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 163及164具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 165及166具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 165及166具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 167及168具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 167及168具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 169及170具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 169及170具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 208及209具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1之經分離多特異性抗體，其中該經分離多特異性抗體包含與SEQ ID NO: 208及209具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 一種經分離重組核酸分子，其編碼如請求項1之經分離多特異性抗體之多肽。
- 一種醫藥組合物，其包含： (a)如請求項1之經分離多特異性抗體；及 (b)醫藥學上可接受之賦形劑。
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