TW201039850A - Trivalent, bispecific antibodies - Google Patents

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201039850 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於三價雙特異性抗體、其產生方法、含有該 等抗體之醫藥組合物、及其用途。 【先前技術】 最近幾年已研發出眾多種多特異性重組抗體形式，例如 融合（例如）IgG抗體形式及單鏈結構域之四價雙特異性抗 體（例如，參見 Coloma，M.J.等人，Nature Biotech 15 Ο (1997) 159-163 ; WO 2001/077342 ;及 Morrison，S.L.，

Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234)。 亦已研發出若干種不再保留抗體核心結構（IgA、IgD、 IgE、IgG或IgM)之其他新形式，例如雙鏈抗體、三鏈抗體 或四鏈抗體、微小抗體、若干種單鏈形式（scFv、雙 scFv)，其能結合兩種或更多種抗原（Holliger, P.等人， Nature Biotech 23 (2005) 1 126-1 136 ; Fischer, N.及 L6ger, 0_，Pathobiology 74 (2007) 3-14 ; Shen, J.等人，Journal of ❹ Immunological Methods 318 (2007) 65-74 ； Wu, C.等人， Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297)。 所有該等形式皆使用連接體來融合抗體核心（IgA、 IgD、IgE、IgG或IgM)與另一結合蛋白（例如scFv)或融合 (例如）兩個 Fab 片段或 scFv(Fischer，N.及 L0ger，Ο·, Pathobiology 74 (2007) 3-14)。必須牢記，可藉由維持與 天然抗體之高度相似性來保留經由Fc受體結合介導之效應 子功能（例如補體依賴性細胞毒性（CDC)或抗體依賴性細胞 146805.doc 201039850 毒性（ADCC))。 在WO 2007/024715中報導雙可變結構域免疫球蛋白，其 為經改造多價多特異性結合蛋白。製備生物活性抗體二聚 體之方法報導於US 6,897,044中。具有至少四個經由肽連 接體彼此連接之可變結構域的多價Fv抗體構成物報導於US 7,129,330中。二聚及多聚抗原結合結構報導於US 2005/0079170中。包含三個或四個藉由連接結構彼此共價 結合之Fab片段的三價或四價單特異性抗原結合蛋白報導 於US 6,51 1,663中，該蛋白並非天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中報導四價雙特異性抗體，其可在原核及真 核細胞中有效表現且可用於治療性及診斷性方法。一種自 包含經由至少一個鏈間二硫鍵連接之二聚體與並非經由至 少一個鏈間二硫鍵連接之二聚體的混合物分離該兩種類型 之多肽二聚體或優先合成該經由至少一個鏈間二硫鍵連接 之二聚體的方法報導於US 2005/0163782中。雙特異性四 價受體報導於US 5,959,083中。具有三個或更多個功能性 抗原結合位點之經改造抗體報導於WO 2001/077342中。 多特異性及多價抗原結合多肽報導於WO 1997/001580 中。WO 1992/004053報導通常自結合相同抗原決定簇之 IgG類單株抗體製備之均偶合物，其係藉由合成***聯共 價連接。對抗原具有高親合力之募聚單株抗體報導於WO 1991/06305中，其中分泌具有兩個或更多個免疫球蛋白單 體之寡聚物（通常為IgG類），該等單體結合在一起形成四 價或六價IgG分子。綿羊源抗體及經改造抗體構成物報導 146805.doc 201039850 於US 6,350,860中，其可用於治療具有致病性干擾素γ活性 之疾病。在US 2005/0100543中報導可靶向構成物，其係 雙特異性抗體之多價載體，即可靶向構成物之每個分子皆 可用作兩個或更多個雙特異性抗體之載體。遺傳改造雙特 異性四價抗體報導於WO 1995/009917中。在WO 2007/ 109254中報導經穩定結合分子，其由經穩定scFv組成或包 含該經穩定scFv。 【發明内容】 本發明第一態樣係三價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合第一抗原且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕 鏈組成之全長抗體； b) 由以下組成之多肽： ba) 抗體重鏈可變結構域;或 bb) 抗體重鏈可變結構域（VH)及抗體恆定結構域 1(CH1)， 其中該多肽以該VH結構域之N端經由肽連接物與該全 長抗體兩條重鏈中一條之C端融合； c) 由以下組成之多肽： ca) 抗體輕鏈可變結構域（VL)，或 cb) 抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體輕鏈恆定結構域 (CL); 其中該多肽以該VL結構域之N端經由肽連接物與該全 長抗體兩條重鏈中另一條之C端融合； 且其中該b)中之多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及該c) 146805.doc 201039850 中之多肽之抗體輕鏈可變結構域（VL)一起形成特異性結 合第二抗原之抗原結合位點。 本發明另一態樣係編碼本發明三價雙特異性抗體之核酸 分子。 本發明又—態樣係包含該三價雙特異性抗體之醫藥組合 物。 本發明三價雙特異性抗體一方面由於其與不同抗原結合 而顯不新特性，且另一方面由於其穩定性、低凝集性及藥 代動力學與生物學特性而適於產生及醫藥調配。由於其具 有Ig核心’故其仍保留天然抗體之特性，例如Adcc及 CDC。 【實施方式】 本發明之一態樣係三價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合第一抗原且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕 鏈組成之全長抗體； b) 由以下組成之多肽： ba) 抗體重鏈可變結構域（Vh);或 bb) 抗體重鏈可變結構域（VH)及抗體恆定結構域 1(CH1)， 其中該多肽以該VH結構域之N端經由肽連接物與該全 長抗體兩條重鏈中一條之C端融合； c) 由以下組成之多肽： ca) 抗體輕鏈可變結構域（VL)，或 cb) 抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體輕鏈恆定結構域 146805.doc .6- 201039850 (CL)； 其中該多肽以該VL結構域之N端經由肽連接物與該全 長抗體兩條重鏈中另一條之C端融合； 且其中該b)中之多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及該c) 中之多肽之抗體輕鏈可變結構域（VL)一起形成特異性結 合第二抗原之抗原結合位點。 視需要藉由在以下位置之間引入二硫鍵經由鏈間二硫橋 來連接及穩定該b)中之多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及 該c)中之多肽之抗體輕鏈可變結構域（VL) ·· i) 重鏈可變結構域44位與輕鏈可變結構域1 〇〇位， ii) 重鏈可變結構域105位與輕鏈可變結構域43位，或 iii) 重鏈可變結構域101位與輕鏈可變結構域100位（始終根 據Kabat之EU索引來編號）。 引入非天然二硫橋來進行穩定之技術闡述於（例如）以下 文獻中：WO 94/029350、Rajagopal 等人，pr〇t. Engin. (1997) 1453-59 ; Kobayashi，Η·等人，Nuclear Medicine & Biology，第 25卷，（1998) 387-393 ;或 Schmidt，M.等人， Oncogene (1999) 18 171 1-1721。在一實施例中，b)及 c)中 之多肽之可變結構域之間的可選二硫鍵介於重鏈可變結構 域44位與輕鏈可變結構域1 〇〇位之間。在一實施例中，b) 及c)中之多肽之可變結構域之間的可選二硫鍵介於重鏈可 變結構域105位與輕鏈可變結構域43位之間（始終根據 Kabat之EU索引來編號）。在一實施例中，在單鏈Fab片段 之可變結構域VH與VL之間未經該可選二硫鍵穩定之三價 146805.doc 201039850 雙特異性抗體較佳。 術語「全長抗體」表示由兩個「全長抗體重鏈」及兩個 「全長抗體輕鏈」組成之抗體（參見圖1)。「全長抗體重 鏈」係在N端至C端方向上由以下組成之多肽：抗體重鏈 可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定結構域1(CH1)、抗體鉸鏈 區（HR)、抗體重鏈恆定結構域2(CH2)及抗體重鏈恆定結構 域 3(CH3)，縮寫為 VH-CH1-HR-CH2-CH3 ;且在抗體為 IgE 亞類之情形下視需要包括抗體重鏈恆定結構域4(CH4)。 「全長抗體重鏈」較佳為在N端至C端方向上由VH、 CHI、HR、CH2及CH3組成之多肽。「全長抗體輕鏈」係 在N端至C端方向上由以下組成之多肽··抗體輕鏈可變結 構域（VL)、及抗體輕鏈恆定結構域（CL)，縮寫為VL-CL。 抗體輕鏈恒定結構域（CL)可為K(kappa)或X(lambda)。兩個 全長抗體鏈經由CL結構域與CH1結構域之間及全長抗體重 鏈鉸鏈區之間之多肽内二硫鍵連接在一起。典型全長抗體 之實例係天然抗體，例如IgG(例如IgGl及IgG2)、IgM、 IgA、IgD、及IgE。本發明全長抗體可來自單一物種（例如 人類），或其可為嵌合抗體或人類化抗體。本發明全長抗 體包含兩個各自由VH及VL對形成之抗原結合位點，二者 可特異性結合相同抗原。該全長抗體重鏈或輕鏈之C端表 示該重鏈或輕鏈C端之最後一個胺基酸。 b)中多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及c)中多肽之抗體 輕鏈可變結構域（VL)之N端表示VH或VL結構域中N端之最 後一個胺基酸。 146805.doc 201039850 可藉由「隆凸-孔洞結合」技術來改變本發明該全長抗 體之CH3結構域，該技術以若干個實例詳細闡述於（例如） 以下文獻中：WO 96/02701 1 ; Ridgway，J.B.等人，Protein Eng 9 (1996) 617-621 ;及 Merchant, A.M.等人，Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681。在此方法中，兩個CH3結 構域之交互作用表面經改變以增強含有該兩個CH3結構域 之兩條重鏈之異二聚化作用。兩個CH3結構域（兩條重鏈 中）之每一者皆可為「隆凸」，而另一者為「孔洞」。引 入一硫橋可進一步穩定異二聚體（Merchant，A.M.等人，

Nature Biotech 16 (1998) 677-681 ; Atwell，S.等人，厂 Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)並提高產率。 因此在本發明一態樣中，該三價雙特異性抗體之特徵另 外在於 全長抗體中一條重鏈之CH3結構域及全長抗體中另一條 重鏈之CH3結構域各自在包含抗體CH3結構域之間之初始 介面的介面處會合；其中該介面經改變以促進二價雙特異 性抗體之形成，其中該改變之特徵在於： a)—條重鏈之CH3結構域經改變， 從而使仔在一價雙特異性抗體内，在遇到一條重鍵之CH3 結構域之初始介面的另一條重鏈之CH3結構域的初始介面 内， 胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基替代，從而 在一條重鏈之CH3結構域之介面内生成突出物，其可定位 於另一條重鏈之CH3結構域之介面内的腔中， 146805.doc 201039850 及 b)另一條重鏈之CH3結構域經改變， 從而使得在三價雙特異性抗體内，在遇到第一 CH3結構域 之初始介面的第二CH3結構域之初始介面内， 胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基替代，由此 在第二CH3結構域之介面内生成腔，其中可定位第一 CH3 結構域之介面内之突出物。 該具有較大側鏈體積之胺基酸殘基較佳選自由以下組成之 群：精胺酸（R)、***酸（F)、酪胺酸（Y)、色胺酸（W)。 該具有較小側鏈體積之胺基酸殘基較佳選自由以下組成之 群：丙胺酸（A)、絲胺酸（S)、蘇胺酸（T)、纈胺酸（V)。 在本發明一態樣中，兩個CH3結構域進一步發生以下改 變：在各CH3結構域之相應位置引入半胱胺酸（C)作為胺基 酸，從而可在兩個CH3結構域之間形成二硫橋。 在一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體在「隆凸鏈」 之CH3結構域中包含T366W突變且在「孔洞鏈」之CH3結 構域中包含T366S、L368A、Y407V突變。亦可藉由（例如） 在「隆凸鏈」之CH3結構域中引入Y349C突變且在「孔洞 鏈」之CH3結構域中引入E356C突變或S354C突變來使用 CH3結構域之間之另一鏈間二硫橋（Merchant, A.M·等人， Nature Biotech 16 (1998) 677-681)。因此在另一較佳實施 例中，該三價雙特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者中 包含Y349C、T3 66W突變且在兩個CH3結構域中之另一者 中包含E356C、T366S、L368A、Y407V突變；或該三價雙 146805.doc -10- 201039850 特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者中包含Y349C、 T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包含 S354C、T366S、L368A、Y407V 突變（一個 CH3 結構域中之 額外Y349C突變與另一 CH3結構域中之額外E356C或S354C 突變形成鏈間二硫橋）（始終根據Kabat之EU索引來編號）。 但或者或另外，亦可使用其他隆凸-孔洞結合技術，如EP 1 870 459A1所述。該三價雙特異性抗體之較佳實例係： 在「隆凸鏈」之CH3結構域中具有R409D ; K370E突變且 〇 在「孔洞鏈」之CH3結構域中具有D399K ; E357K突變（始 終根據Kabat之EU索引來編號）。 在另一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體在「隆凸 鏈」之CH3結構域中包含T366W突變且在「孔洞鏈」之 CH3結構域中包含T366S、L368A、Y407V突變，且另外在 「隆凸鏈」之CH3結構域中包含R409D ; K370E突變並在 「孔洞鏈」之CH3結構域中包含D399K ; E357K突變。 在另一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體在兩個CH3 〇 結構域中之一者中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3 結構域中之另一者中包含S354C、T366S、L368A、Y407V 突變；或該三價雙特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者 中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一 者中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突變，且另外在 「隆凸鏈」之CH3結構域中包含R409D ; K370E突變並在 「孔洞鏈」之CH3結構域中包含D399K ; E357K突變。 本發明雙特異性抗體包含三個抗原結合位點（A)本發明 I46805.doc 201039850 全長抗體包含兩個特異性結合第一抗原之相同抗原結合位 點；及B)b)中多肽之抗體重鏈可變結構域（vh)與中多肽 之抗體輕鏈可變結構域（VL)—起形成—個特異性結合第二 抗原之抗原結合位點）。本文所用術語「結合位點」或 「抗原結合位點」表示本發明該雙特異性抗體中實際上特 異性結合各抗原之區域。全長抗體中之抗原結合位點或由 b)中多肽之抗體重鏈可變結構域（VHme)中多肽之抗體輕 鏈可變結構域（VL)形成之抗原結合位點各自係由由抗體輕 鏈可變結構域（VL)及抗體重鏈可變結構域（VH)組成之對來 形成。 特異I1 生，&期望抗原之抗原結合位點可源自：&)針對該 抗原之已知抗體’或b)藉由尤其使用抗原蛋白或其核酸或 片段實施之重新免疫方法或藉由噬菌體展示法獲得之新抗 體或抗體片段。 本發明抗體之抗原結合位點含有六個互補決定區 (CDR)，其不同程度地促進結合位點對抗原之親和力。存 在二個重鏈可變結構域CDR(CDRH1、CDRH2及CDRH3)及 三個輕鏈可變結構域CDR(CDRL1、Cdrl2及CDRL3)。 CDR及框架區（FR)之範圍取決於與胺基酸序列之經編譯數 據庫的比對’其中該等區域已根據各序列間之差異加以界 定。 抗體特異性係指抗體對抗原特定表位之選擇性識別。例 如，天然抗體具有單特異性。本發明「雙特異性抗體」係 具有兩種不同抗原結合特異性之抗體。倘若抗體具有不止 146805.doc 12 201039850 一種特異性，則所埸SI主 片相關。am 與單-抗H不止一種抗 原相關。本文所用術語「單特異性」抗體表 個結合位點之抗體，該等妹人 5 荨、·、σ σ位點各自結合相同抗原上之 相同表位。本申請案所用 「 ^〇〇價」表不抗體分子中存在 特疋數量之結合位胃丨。加1 ’天然抗體或本發明全長抗體 具有兩個結合位點且為二價抗體。因此，術語「三價」表 不在抗體刀子中存在三個結合位點。本發明雙特異性抗體 Ο 係「三價」抗體。本文所用術語「三價雙特異性」抗體表 不具有三個抗原結合位點之抗體，該等位點中兩個結合相 同抗原（或抗原之相同表位）且第三個位點結合不同抗原或 相同抗原之不同表位。本發明抗體具有三個結合位點且為 雙特異性。 本發明之另一實施例係三價雙特異性抗體，其包含： a) 特異性結合第一抗原且由以下組成之全長抗體： aa) 兩個抗體重鏈’其在n端至C端方向上由以下組成： 抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定結構域i (CH1)、抗體鉸鏈區（HR)、抗體重鏈恆定結構域2(CH2) 及抗體重鏈恆定結構域3(CH3);及 ab) 兩個抗體輕鏈，其在N端至C端方向上由以下组成： 抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕鏈恆定結構域 (CL);及 b) 由以下組成之多肽： ba) 抗體重鍵可變結構域（VH);或 bb) 抗體重鏈可變結構域（VH)及抗體恆定結構域1 146805.doc •13· 201039850 (CHI)， 其中該多肽以該VH結構域之N端經由肽連接物與該全長 抗體兩條重鏈中一條之C端融合，其中該肽連接物係具 有至少5個胺基酸、較佳具有介於25與50個之間之胺基 酸之肽； c)由以下組成之多肽： ca) 抗體輕鏈可變結構域（VL)，或 cb) 抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體輕鏈恆定結構域 (CL); 其中該多肽以該VL結構域之N端經由肽連接物與該全長 抗體兩條重鍵中另一條之C端融合； 其中該肽連接物與b)中之肽連接物相同； 且其中該b)中之多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)與該c)中 之多肽之抗體輕鏈可變結構域（VL)—起形成特異性結合 第二抗原之抗原結合位點。 在此實施例中，三價雙特異性抗體較佳在兩個CH3結構 域中之一者中包含T366W突變且在兩個CH3結構域中之另 一者中包含T366S、L368A、Y407V突變，且該三價雙特 異性抗體更佳在兩個CH3結構域中之一者中包含Y349C、 T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包含 D3 56C、T3 66S、L3 68A、Y407V 突變（一個 CH3 結構域中 之額外Y3 49C突變與另一個CH3結構域中之額外D356C突 變形成鏈間二硫橋）。 在本發明一實施例中，本發明三價雙特異性抗體之特徵 146805.doc -14- 201039850 在於 a)該特異性結合ErbB-3之全長抗體包含序列SEQ ID ΝΟ:1 作為重鏈可變結構域，且包含序列SEQ ID NO:2作為輕鏈 可變結構域； . b)該b)中之多肽包含序列SEQ ID NO:3作為重鏈可變結構 ^ 域；及 c)該c)中之多肽包含序列SEQ ID NO:4作為輕鏈可變結構 域。 〇 在本發明另一態樣中，本發明三價雙特異性抗體包含 a) 結合第一抗原且由兩個抗體重鏈VH-CH1-HR-CH2-CH3及兩個抗體輕鏈VL-CL組成之全長抗體； (其中兩個CH3結構域中之一者較佳包含Y349C、 T3 66W突變且兩個CH3結構域中之另一者包含 S354C、T366S、L368A、Y407V突變）； b) 由以下組成之多肽： ba)抗體重鏈可變結構域（VH);或 w bb)抗體重鏈可變結構域（VH)及抗體恆定結構域1 (CH1)， 其中該多肽以該VH結構域之N端經由肽連接物與該全 長抗體兩條重鏈中一條之C端融合； * c)由以下組成之多肽： ca) 抗體輕鏈可變結構域（VL)，或 cb) 抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體輕鏈恆定結構域 (CL); 146805.doc •15- 201039850 其中該多肽以該VL結構域之N端經由肽連接物與該全 長抗體兩條重鏈中另一條之C端融合； 且其中該b)中之多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)與該 c)中之多肽之抗體輕鏈可變結構域（VL)—起形成特 異性結合第二抗原之抗原結合位點。 本發明之另一實施例係三價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類ErbB-3且由以下組成之全長抗體： aa) 兩個抗體重鏈，其在N端至C端方向上由以下組 成：抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定結構域 1(CH1)、抗體鉸鏈區（HR)、抗體重鏈恆定結構域 2(CH2)及抗體重鏈恆定結構域3(CH3);及 ab) 兩個抗體輕鏈，其在N端至C端方向上由以下組 成：抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕鏈恆定結構 域（CL)(VL-CL);及 b) —個特異性結合人類c-Met之單鏈Fv片段， 其中該b)中之單鏈Fv片段經由該a)中之全長抗體的重鏈 或輕鏈C或N端（較佳位於重鏈C端）之肽連接物與該全 長抗體融合； 其中該肽連接物係具有至少5個胺基酸、較佳具有介於 25與50個之間之胺基酸之肽。 較佳地，該三價雙特異性抗體在全長抗體之兩個CH3結 構域中之一者中另外包含Y349C、T366W突變，且在全長 抗體之兩個CH3結構與中之另一者中另外包含S354C(或 E356C)、T366S、L368A、Y407V突變。 146805.doc -16- 201039850 本發明之另一實施例係三價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類ErbB-3且由以下組成之全長抗體： aa) 兩個抗體重鏈’其在N端至C端方向上由以下組 成：抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定結構域 1(CH1)、抗體鉸鏈區（HR)、抗體重鏈恆定結構域 ' 2(CH2)及抗體重鏈恆定結構域3(CH3);及 ab) 兩個抗體輕鏈，其在N端至C端方向上由以下組 成：抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕鏈恆定結構 〇 域（CL);及 b) 由以下組成之多肽： ba) 抗體重鏈可變結構域（VH；);或 bb) 抗體重鏈可變結構域（VH)及抗體恆定結構域工 (CH1)， 其中該多肽以該VH結構域之N端經由肽連接物與該全 長抗體兩條重鏈中一條之C端融合，其中該肽連接物 係具有至少5個胺基酸、較佳具有介於25與5〇個之間 ^ 之胺基酸之肽； c) 由以下組成之多肽： ca) 抗體輕鏈可變結構域（VL)，或 cb) 抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體輕鏈恆定結構域 ' (CL)； 其中該多肽以該VL結構域之N端經由肽連接物與該全 長抗體兩條重鏈中另一條之C端融合； 其中該肽連接物與b)中之肽連接物相同； 146805.doc •17- 201039850 且其中該b)中之多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及該c) 中之多肽之抗體輕鏈可變結構域（VL) —起形成特異性結 合人類c-Met之抗原結合位點。 本發明全長抗體包含一或多個免疫球蛋白種類之免疫球 蛋白值定區。免疫球蛋白種類包括IgG、IgM、IgA、 IgD、及IgE同種型，且在IgG及IgA情形下包括其亞型。在 一較佳實施例中，本發明全長抗體具有IgG型抗體之恆定 結構域結構。 本文所用術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指 具有單一胺基酸組成之抗體分子製劑。 術語「嵌合抗體」係指包含來自一種來源或物種之可變 區（即結合區）及源自不同來源或物種之恆定區之至少一部 分的抗體，其通常係藉由重組DNA技術來製備。包含鼠類 可變區及人類恆定區之嵌合抗體較佳。本發明所涵蓋之其 他較佳形式之「嵌合抗體」係彼等恆定區已相對於原始抗 體進行修飾或改變從而尤其在Clq結合及/或以受體（FcR) 結合方面獲得本發明特性者。該等嵌合抗體亦稱作「種類 轉換抗體」。嵌合抗體係免疫球蛋白基因之表現產物，該 等免疫球蛋白基因包含編碼免疫球蛋白可變區之DNa片段 及編碼免疫球蛋白恆定區之DNA片段。製備嵌合抗體之方 法涉及業内熟知之習用重組DNA及基因轉染技術。例如， 參見 M〇rriS0n，s.l.等人，pr〇c 刪 Α(^ ^ usa η (1984) 6851-6855 ; US 5,202,238及 US 5,204,244。 術語「人類化抗體」係指框架區或「互補決定區 146805.doc 201039850 (CDR)已經修飾而包含與親代免疫球蛋白cdr相比具有不 同特異性之免疫球蛋白CDR的抗體。在一較佳實施例中， 將鼠類CDR移植入人類抗體之框架區中以製備「人類化抗 體」。例如，參見Riechmann，L.等人，Nature 332 (1988) 323-327 ;及Neuberger，M_S.等人，Nature 314 (1985) 268- 270。尤佳CDR對應於嵌合抗體中彼等代表可識別上述抗 原之序列者。本發明所涵蓋之其他形式之「人類化抗體」 係彼等恆定區已相對於原始抗體進行額外修飾或改變從而 〇 尤其在Clq結合及/或FC受體（FcR)結合方面獲得本發明特 性者。 本文所用術語「人類抗體」意欲包括具有源自人類種系 免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。人類抗體已為 當前業内所熟知（van Dijk，M.A.及 van de Winkel, J.G.， Curr’ 〇pin. Chem Bi〇1 5 (2〇〇1) 368 37句。亦可在轉基因 動物（例如小鼠）中產生人類抗體，該等轉基因動物在免疫 Q 後能在不產生内源免疫球蛋白之情況下產生全譜系之人類 抗體或所選人類抗體。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉 移至該等種系之突變小鼠中使得可在抗原激發後產生人類 抗體（例如’參見Jakobovits，A.等人，Proc. Natl. Acad.

Sci· USA 90 (1993) 2551-2555 ; Jakobovits，A.等人， Nature 362 (1993) 255-258 ; Brtiggemann，M.等人，Year

Immunol. 7 (1993) 33-40)。人類抗體亦可在噬菌體展示文 庫中產生（Hoogenboom，H.R.及Winter, G.J· Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ; Marks, J.D.等人，J. Mol. Bi〇l. 222 146805.doc -19- 201039850 (1991) 581-597)。亦可使用 Cole，S.P.C·等 人及 Boerner，P. 等人之技術來製備人類單株抗體（C〇le, S.p.c.等人， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss > 第 77-96 頁（1985);及 Boerner，P.等人，J. Immunol. 147 (1991) 86-95)。如已提及之本發明嵌合及人類化抗體，本 文所用術語「人類抗體」亦包含該等恆定區中經修飾從而 尤其在Clq結合及/或FcR結合方面獲得本發明特性之抗 體’例如藉由「種類轉換」來修飾，即，使Fc部分發生改 變或突變（例如自IgG1變為IgG4及/或igGl/IgG4突變）。 本文所用術語「重組人類抗體」意欲包括所有藉由重組 方式製備、表現、產生或分離之人類抗體，例如自諸如 NS0或CHO細胞等宿主細胞或自人類免疫球蛋白基因之轉 基因動物（例如小鼠）分離之抗體，或使用轉染至宿主細胞 中之重組表現載體表現之抗體。該等重組人類抗體具有重 排形式之可變及恆定區。本發明之重組人類抗體已經活體 内體細胞超突變。因此，重組抗體之VH& VL區之胺基酸 序列雖然源自且相關於人類種系VH& VL序列，但可能天 然不存在於活體内人類抗體種系譜中。 本文所用「可變結構域」（輕鏈可變結構域（VL)、重鏈 可變區（VH))表示直接參與抗體與抗原結合之輕鏈及重鏈 對中之每一者。人類輕鏈及重鏈可變結構域具有相同—般 結構，且每一結構域包含四個序列高度保守之框架區 (FR)，經由三個「超變區」（或互補決定區，cdr)連接。 框架區採用β-片構形，CDRs可形成連接p_片結構之環。各 146805.doc -20- 201039850 鍵中之C D R s精由框架區保持二維結構，並與另一鍵中之 CDRs —起形成抗原結合位點。抗體重鏈及輕鏈之CDR3區 在本發明抗體之結合特異性/親和性方面具有特別重要之 作用，由此提供本發明之另一目的。 ' 本文所用術語「超變區」或「抗體之抗原結合部分」係 • 指抗體中負責與抗原結合之胺基酸殘基。超變區包含「互 補決定區」或「CDRs」之胺基酸殘基。「框架」或 「FR」區係本文所定義超變區殘基以外的可變結構域區。 〇 因此，抗體之輕鏈及重鏈自N端至C端包含結構域FR1、 CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4。各鏈上之 CDRs 係藉由該等框架胺基酸間隔。重鏈之CDR3尤其為對抗原 結合貢獻最大之區域。CDR及FR區係根據Kabat, E.A.等人 (Sequences of Proteins of Immunological Interest > 第 5版， Public Health Service, National Institutes of Health， 6611^3(13，1^0(1991))之標準定義確定。 本文所用術語「結合」或「特異性結合」係指在體外分 〇 ^ 析中抗體與抗原表位之結合，較佳係在電漿共振分析 (BI Ac or e, GE-Healthcare Uppsala，Sweden)中與純化野生型 抗原之結合。結合親和力定義為術語ka(抗體/抗原複合物 中抗體結合之速率常數）、kD(解離常數）及KD(kD/ka)。結合 • 或特異性結合意指結合親和力（KD)為1(T8 mold或更低，較 佳為ΙΟ·9 Μ至10_13 mol/1。因此，本發明三價雙特異性抗體 以10_8 mol/1或更低、較佳ΙΟ·9 Μ至ΙΟ·13 mol/1之結合親和 力（KD)與各特異性抗原特異性結合。 146805.doc -21 - 201039850 可藉由 BIAcore分析（GE-HealthCare Uppsala, Sweden)來 研究抗體與FcYRin之結合。結合親和力定義為術語ka(抗 體/抗原複合物中抗體結合之速率常數）、kD(解離常數）及 KD(k〇/ka)。 術語「表位」包括能特異性結合抗體之任何多肽決定 簇。在某些實施例中，表位決定簇包括分子之化學活性表 面基團，例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基、或磺醯基，且在 某些實施例中可具有特定的三維結構特徵及/或比電荷特 徵。表位係抗原中結合抗體之區域。 在某些實施例中，當抗體在蛋白質及/或高分子複合混 合物中優先識別其靶抗原時，認為該抗體可特異性結合該 抗原。 本發明所用術語「肽連接物」表示胺基酸序列較佳具有 合成來源之肽。使用本發明該等肽連接物來融合b)&c)中 之多肽與全長抗體重鏈之C端以形成本發明三價雙特異性 抗體。較佳地’該等肽連接物係胺基酸序列長度為至少5 個胺基酸、較佳長10至100個胺基酸、更佳長25至50個胺 基酸之肽。較佳地，該b)及C)中之肽連接物係長度為至少 25個胺基酸、較佳長25至5 0個胺基酸之相同肽，且該肽連 接物更佳為（GxS)n或（GxS)nGm，其中G=甘胺酸，絲胺 酸，其（χ=3，η=6、7 或 8，且 m = 0、1、2 或 3)或（χ=4， η=3、4、5、6或 7且 m=0、1、2或 3)，較佳地χ=4 且 η=5、ό 或7。 在另一實施例中，本發明三價雙特異性抗體之特徵在 146805.doc -22- 201039850 於’該全長抗體屬於人類IgG 1亞類或屬於人類igG 1亞類且 具有突變L234A及L235A。 在另一實施例中’本發明三價雙特異性抗體之特徵在 於，該全長抗體屬於人類IgG2亞類。 在另一實施例中’本發明三價雙特異性抗體之特徵在 於’該全長抗體屬於人類IgG3亞類。 在另一實施例中，本發明三價雙特異性抗體之特徵在 於’該全長抗體屬於人類IgG4亞類或屬於人類igG4亞類且 具有額外突變S228P。 較佳地，本發明三價雙特異性抗體之特徵在於，該全長 抗體屬於人類IgGl亞類或屬於人類igG4亞類且具有額外突 變 S228P。 現已發現，本發明三價雙特異性抗體具有經改良特徵， 例如生物學或藥理學活性、藥代動力學特性或毒性。其可 用於（例如）治療諸如癌症等疾病。 在另一實施例令，本發明三價雙特異性抗體之特徵在於 可特異性結合ErbB3及c-Met。本申請案所用術語「恆定 區」表示抗體中除可變區以外之結構域的總和。恆定區並 非直接參與抗原結合，而是表現出各種效應子功能。端視 抗體重鏈恆定區之胺基酸序列，可將抗體分為以下幾類： IgA、IgD、IgE、IgG及IgM ’且其中若干種類可進一步分 為多個亞類，例如IgGl、IgG2、IgG3及IgG4、igAl及 IgA2。對應於不同抗體種類之重鏈恆定區分別稱作α、δ、 ε及γ。在所有五種抗體種類中可發現之輕鏈恆定區（CL)稱 146805.doc -23- 201039850 作 K(kappa)及 X(lambda)。 本申請案中所用術語「得自人類來源之恆定區」表示 IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞類人類抗體之重鏈恆定區及/ 或輕鏈κ或λ恆定區。該等恆定區為當前業内所熟知且由 (例如）Kabat，Ε.Α.所闡述（例如，參見Johnson, G.及Wu， T.T. > Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 ； Kabat, E.A. 等人，Proc· Natl. Acad. Sci. USA 72(1975) 2785-2788)。

IgG4亞類之抗體顯示降低之Fc受體（FcyRIIIa)結合，同 時其他IgG亞類之抗體顯示較強結合。然而，Pro238、 Asp265、Asp270、Asn297(喪失 Fc碳水化合物）' Pro329、 Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、 Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、及 His435係在改變後 亦可提供降低之Fc受體結合之殘基（Shields, R.L.等人，夂 Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ; Lund, J.等人，FASEB J. 9 (1995) 115-1 19 ; Morgan, A.等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ; EP 0 307 434)。 在一實施例中，本發明抗體相對於IgGl抗體及全長親代 抗體具有降低之FcR結合，其在FcR結合方面屬於IgG4亞 類或IgGl或IgG2亞類且在S228、L234、L235及/或D265處 具有突變，及/或含有PVA236突變。在一實施例中，全長 親代抗體中之突變係S228P、L234A、L235A、L235E及/或 PVA236。在另一實施例中，全長親代抗體中之突變係 IgG4 S228P及 IgGl L234A及 L235A。 抗體恆定區直接參與ADCC(抗體依賴性細胞介導細胞毒 146805.doc •24- 201039850 性）及CDC(補體依賴性細胞毒性）。補體活化（CDC)係藉由 使補體因子Clq與大多數IgG抗體亞類之恆定區結合來起 始。Clq與抗體之結合係藉由在所謂的結合位點實施所定 義之蛋白質間交互作用來引發。該等恆定區結合位點為當 前業内所知且闡述於（例如）以下文獻中：Lukas，T., J_等 人，J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560 ; Brunhouse, R.及 Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16(1979) 907-917 ； Burton, D.R. 等人，Nature 288 (1980) 338-344 ; Thommesen, J.E.等 〇 人，Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004 ; Idusogie, E.E.等 人，J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184 ; Hezareh，M.等 人，J. Virol. 75 (2001) 12161-12168 ; Morgan，A.等人， Immunology 86 (1995) 319-324 ;及EP 0 307 434 ° 該等恆 定區結合位點之特徵在於（例如）胺基酸L234、L235、 D270、N297、E318、K320、K322、P331 及 P329(根據 Kabat之EU索引來編號）。 術語「抗體依賴性細胞毒性（ADCC)」係指人類靶細胞 〇 i w 在效應子細胞存在下由本發明抗體溶解。較佳在效應子細 胞存在下藉由用本發明抗體處理抗原表現細胞之製劑來量 測ADCC，該等效應子細胞例如剛分離之PBMC或自血沉 標黃層純化之效應子細胞，例如單核細胞或天然殺傷（NK) 細胞或持久生長NK細胞系。 術語「補體依賴性細胞毒性（CDC)」表示藉由使補體因 子Clq與大多數IgG抗體亞類之Fc部分結合來起始之過程。 Clq與抗體之結合係藉由在所謂的結合位點實施所定義之 146805.doc •25- 201039850 蛋白質間交互作用來引發。該等Fc部分結合位點為當前業 内已知（參見上文）。該等Fc部分結合位點之特徵在於（例 如）胺基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、 K322、P33 1、及P329(根據Kabat之EU索引來編號）。 IgGl、IgG2及IgG3亞類抗體通常顯示包括Clq及C3結合在 内之補體活化，而IgG4不活化補體系統且不結合Clq及/或 C3。 單株抗體之細胞介導效應子功能可藉由改造其募糖組份 來增強，如Umana，P.等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 ;及US 6,602,684所述。IgGl型抗體係最常用治療 性抗體，其為在各CH2結構域中之Asn297處具有保守N-連 接糖基化位點之糖蛋白。與Asn297附接之兩種複雜二天線 (biantennary)寡糖包埋於CH2結構域之間，與多肽骨架形 成廣泛接觸，且其存在為抗體介導諸如抗體依賴性細胞毒 性（ADCC)等效應子功能所必需（Lifely, M. R.等人， Glycobiology 5 (1995) 813-822 ; Jefferis，R.等人，

Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76 ； Wright, A.及 Morrison, S. L.，Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32)。Umana, P.等 人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及 WO 99/54342 顯示，中國倉鼠卵巢（CHO)細胞中β(1，4)-Ν-乙醯葡糖胺基 轉移酶ΙΙΙ(「GnTIII」）（一種催化形成二等分型（bisected)寡 糖之糖基轉移酶）之過表現可顯著提高抗體之活體外ADCC 活性。Asn297碳水化合物組成中之改變或其消除亦影響與 FcyR 及 Clq 之結合（Umana, P_等人，Nature Biotechnol. 17 -26- 146805.doc 201039850 (1999) 176-180 ; Davies, J.等人，Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294 ; Mimura，Y.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547 ; Radaev，S.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483 ; Shields，R.L·等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ; Shields, R.L.#A，J.Biol.Chem. 277 (2002) 26733-26740 ; Simmons，L.C.等人，*!·

Immunol. Methods 263 (2002) 133-147) °

增強單株抗體之細胞介導效應子功能之方法報導於（例 〇 如）以下文獻中：WO 2005/018572、WO 2006/1 16260、WO 2006/1 14700 ' WO 2004/065540、WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835、WO 2000/061739 〇 令人驚訝的是，作為本發明一實施例之雙特異性 <ErbB3-c-Met>抗體與其親代<ErbB3>& /或<c-Met>抗體相 比顯示靶抗原下調及内化降低。因此，在本發明一較佳實 施例中，雙特異性抗體在Asn297處經糖鏈糠基化（若其包 含IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞類、較佳IgGl或IgG3亞類 之Fc部分），其中岩藻糖在該糖鏈内之量為65。/。或更低（根 據Kabat編號）。在另一實施例中，該糖鏈肉岩藻糖之量介 於5%與65%之間，較佳介於20%與40%之間。本發明 「Asn297」意指大致位於Fc區中297位之胺基酸天冬醯 胺。基於抗體間之較小序列差異，Asn297亦可位於297位 上游或下游之數個胺基酸（通常不超過±3個胺基酸）處’即 146805.doc -27- 201039850 介於294位與3 00位之間。在一實施例中，本發明IgG亞類 之糖基化抗體屬於人類IgGl亞類且具有突變L234A及 L235A，或屬於IgG3亞類。在另一實施例中，該糖鏈内N-羥乙醯神經氨酸（NGNA)之量為1%或更低及/或N端α-1,3-半乳糖之量為1%或更低。該糖鏈較佳顯示附接至抗體 Asn297之Ν-連接聚糖之特徵，該抗體係以重組方式於CHO 細胞中表現。 術語「該糖鏈顯示附接至抗體Asn297之N-連接聚糖之特 徵，該抗體以重組方式於CHO細胞中表現」表示在本發明 全長親代抗體之Asn297處之糖鏈與在未經修飾CHO細胞中 表現之相同抗體中之糖鏈具有相同結構及相同糖殘基序列 (除岩藻糖殘基外），例如如彼等WO 2006/103100中所報導 者。 本申請案中所用術語「NGNA」表示糖殘基N-羥乙醯神 經氨酸。 人類IgGl或IgG3之糖基化發生在Asn297處，其為核心岩 藻糖化二天線複雜寡糖糖基化形式，末端為最多2個Gal殘 基。人類IgGl或IgG3亞類之重鏈恆定區詳細報導於以下文 獻中：Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest > 第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD. (1991);及 Briiggemann，M.等人，J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 ； Love, T.W.等人，Methods Enzymol· 178 (1989) 5 1 5-527。該等結構端視末端Gal殘基之量命名為GO、 146805.doc -28- 201039850

Gl(cc-1，6-或 α-ΐ，3·)或 G2 聚糖殘基（Raju，T.S , Bi〇pr〇cess Int_l (2003) 44-53)。抗體Fc部分之CHO類糖基化闡述於 (例如）Routier，F.H.，Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207 中。以重組方式在未經糖基修飾之Ch〇宿主細胞中表現之 抗體通常在ASn297處以至少85%之比例經岩藻糖化。全長 親代抗體之經修飾募糖可為雜合募糖或複雜寡糖。二等分 型、經還原/未岩藻糖化寡糖較佳為雜合寡糖。在另一實 施例中，二等分型、經還原/未岩藻糖化募糖為複雜寡 〇 糖。 本發明「岩藻糖之量」意指在Asn297處之糖鏈内，該糖 相對於附接至Asn297之所有糖結構（例如複雜結構、雜合 體結構及高甘露糖結構）之總和之量，其係藉由MALDI_ T〇F質譜法來量測且計算為平均值。岩藻糖之相對量係含 岩藻糖結構相對於N-糖苷酶F處理樣品中所有確定糖結構 (分別例如複雜結構、雜合體結構及寡_及高_甘露糖結構） 之百分比。 ❹ 本發明抗體係藉由重組方式產生。因此，本發明之一態 樣係編碼本發明抗體之核酸，另一態樣係包含該編碼本發 明抗體之核酸之細胞。用於重組製造之方法廣泛為當前業 内所知’且包含在原核及真核細胞中表現蛋白質及隨後分 離抗體以及通常純化至醫藥上可接受之純度。對於上述抗 體在锢主細胞中之表現，編碼各經修飾之輕鏈及重鏈的核 酸藉由標準方法***表現載體中。在適宜原核或真核宿主 細胞（例如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細 146805.doc •29- 201039850 胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母或大腸桿菌（Ec〇liyw 胞）中進行表現，且自該等細胞（上清液或溶解後細胞）回收 抗體。重組產生抗體之通用方法為當前業内所熟知且闡述 於例如綜述文獻Makrides，S.C·，Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202，Geisse，S.等人，protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ； Kaufman, R.J., M〇l. Biotechnol. 16 (2000) 151-160 ； Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880 ° 本發明三價雙特異性抗體適合藉由習用免疫球蛋白純化 程序自培養基分離，§亥專程序為例如蛋白質A _境脂糖凝膠 (Sepharose)法、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親 和層析法。編碼單株抗體之DNA及RNA可使用習用程序輕 易地分離及測序。雜交瘤細胞可用作該DNA及RNA之來 源。分離後，DNA可***表現載體中，隨後轉染至原本不 產生免疫球蛋白之宿主細胞（例如HEK 293細胞、CHO細 胞、或骨髓瘤細胞）中’以在宿主細胞中獲得重組單株抗 體之合成。 一仏雙特異性抗體之胺基酸序列變體（或突變體）係拜由 適當核苷酸變化引入該抗體DNA或藉由核苷酸合成製備。 然而，該等修飾僅能在極有限範圍内（例如上文所述）實 施。舉例而言，該等修飾不改變上述抗體特徵，諸如_ 同型及抗原結合等，但可提高重組產生之產率、增強蛋白 質穩定性，或有利於純化。 本案中所用術語「宿主細胞」表示任何種類可經改造以 146805.doc -30· 201039850 生成本發明抗體之細胞系統。在一個實施例中，使用 HEK293細胞及CHO細胞作為宿主細胞。本文所用表述 「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用且所 有該等名稱皆包括子代。因此，詞語「轉化體」及「轉化 細胞」包括原代個體細胞及源自其之培養物而不考慮轉移 次數。亦應瞭解，所有子代之DNA含量可能因特意或無意 的突變而不完全相同。本發明包括最初轉化細胞中經篩選 具有相同功能或生物活性之變體的子代。 〇 在NS0細胞中之表現闡述於（例如）Barnes，L.M.等人，

Cytotechnology 32 (2000) 109-123 ; Barnes, L.M.等人， Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 中。瞬時表現闡述於 (例如）Durocher, Y·等人，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 中。可變結構域之選殖闡述於以下文獻中：Orlandi，R.等 人，Proc. Natl. Acad· Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ; Carter，P.等人，Proc· Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289 ;及 Norderhaug，L·等人，J. Immunol. Methods O 204 (1997) 77-87。較佳瞬時表現系統（HEK 293)闡述於 Schlaeger, E.-J.及 Christensen, K. ，Cytotechnology 30 (1999) 71-83 ;及 Schlaeger, E_-J.，J_ Immunol. Methods 194 (1996) 191-199 中。 舉例而言，適用於原核生物之控制序列包括啟動子、 (視需要）操縱子序列、及核糖體結合位點。已知真核細胞 可利用啟動子、增強子及多聚腺苷酸化信號。 當一核酸與另一核酸序列具有功能性關係時，該核酸係 146805.doc -31 - 201039850 「可操作連接的」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列 之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該前序列或分泌 月導序列之DNA可操作連接至該多肽之DNA ;若啟動子哎 增強子可影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子可操 作連接至該編碼序列；或若核糖體結合位點之定位有助於 轉澤’則該核糖體結合位點可操作連接至該編碼序列。一 般而5 ’「可操作連接」意指所連接DNa序列係鄰接序列 且在分泌前導序列情況下係鄰接序列且處於閱讀框内。然 而，增強子無需鄰接。藉由在便利的限制位點處接合可完 成，接。若不存在該等位點，則根據習用慣例可使用合成 I*生暴核音酸銜接子或連接體。 藉由標準技術實施抗體純化以消除細胞組份或其他污染 物（例如其他細胞核酸或蛋白質），該等技術包括驗⑽處 理、CsCl區帶法、管柱層析法、境脂糖凝膠電泳法、及其 他業内熟知方法。參見Ausubel, F等人編輯，㈤加 Protocols in Molecular Bi〇l〇gy, Greene Publishing and WUey im⑽ience，New Y〇rk (1987)。已有多種不同方法 被人們所接受且廣泛用於蛋白質純化，例如使用微生物蛋 白質實施之親和層析(例如蛋白質A或蛋白質⑽和層析)、 離子交換層析（例如陽離子交換⑽甲基樹脂）、陰離子交換 (胺基乙基樹脂）及混合型交換）、嗜硫菌吸附（例如使用卜 疏基乙醇及其他SH配體）、疏水作用或芳香族吸附層析（例 如使用苯基-填脂糖、氮雜_親芳煙（aren〇phnic)樹脂、或 間胺基苯基侧酸）、金屬螯合親和層析（例如使用犯⑴)_及 146805.doc •32· 201039850

Cu(n)·親和性材料）' 尺寸排除層析及電泳方法（例如凝膠 電泳、毛細管電泳）(Vijayalakshmi，M.A.，Appl. Biochem.

Biotech. 75 (1998) 93-102)。 本發明之一態樣係包含本發明抗體之醫藥組合物。本發 明另一態樣係本發明抗體用於製造醫藥組合物之用途。本 發明另一態樣係製造包含本發明抗體之醫藥組合物之方 法。在另一態樣中，本發明提供組合物（例如醫藥組合 物）’其含有與醫藥載劑調配在一起之本發明抗體。 本發明一實施例係本發明三價雙特異性抗體，其用於治 療癌症。 本發明另一態樣係該醫藥組合物，其用於治療癌症。 本發明另一態樣係本發明抗體之用途，其用於製造治療 癌症之藥物。 本發明另一態樣係藉由將本發明抗體投與需要治療之患 者來治療癌症患者之方法。

所本文所用「醫藥載劑」包括任何及所有溶劑、分散介 質 '包衣、抗細®及抗真菌試劑、等滲劑及吸收延遲劑、 及生理上相容之類似試劑。較佳地’載劑適合於靜脈内、 肌内、皮下、非經腸、經脊柱或經表皮投與（例如 射或輸注）。 本發明組合物可藉由多錄董 田夕種業内已知方法來投與。熟習此 項技術者應瞭解，投與途徑及/或模式可隨期望效果而變 化。為藉由某些投與途徑投與本發明化合物 材料塗佈該化合物或將該化合物與該材料共投與以： 146805.doc -33- 201039850 化合物失活。舉例而言，投與個體之化合物可存於適宜載 劑中，例如脂質體或稀釋劑。醫藥上可接受之稀釋劑包括 鹽水及水性緩衝溶液。醫藥載劑包括無菌水性溶液或分散 液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉劑。 該等介質及試劑於醫藥活性物質中之應用為業内已知。 本文所用片語「非經腸投與」及「以非經腸方式投與」 意指除經腸及局部投與以外的投與模式，通常係藉由注射 來投與且包括（但不限於）靜脈内、肌内、動脈内、鞘内、 莢膜内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜腔内、經氣管、皮 下、表皮下、關節内、囊下、蛛網膜下、脊柱内、硬膜外 及胸骨内注射及輸注。 本文所用術語「癌症」係指增殖性疾病，例如淋巴瘤、 淋巴細胞性白血病、肺癌、非小細胞肺（NSCL)癌、細支氣 管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮 膚或眼内黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、 月癌（stomach cancer)、胃癌（gastric cancer)、結腸癌、乳 癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、*** 癌***癌、霍奇金病（Hodgkin's Disease)、食道癌、小 腸癌、内分泌系統癌症、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺 癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、***癌、膀胱癌、 腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞 癌、膽管癌、中樞神經系統贅瘤、脊椎腫瘤、腦幹 膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、許旺細胞瘤 (sehwarmoma)、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦膜瘤、扁平細 146805.doc -34· 201039850 胞癌垂體腺瘤及尤文肉瘤（Ewings sarcoma)，包括任一 上述癌症之難治性形式，或一或多種上述癌症之組合。 Ο Ο 該等組合物亦可含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化 劑及分散劑。可藉由上述消毒程序及藉由引入各種抗細菌 及抗真菌劑來確保防止存在微生物，該等抗細菌及抗真菌 劑為(例如)對羥基苯甲酸酯' 氣丁醇、苯酚、山梨酸及諸 此類亦可期望該等組合物包括等渗劑，例如糖、氣化 鈉及諸如此類。另外，可藉由引入延遲吸收之試劑(例如 單硬脂酸1呂及明膠）來實現可注射醫藥形式之長效吸收。 不管選擇何種投與路徑，可藉由熟習此項技術者已知之 習用方法將可以適宜水合形式使用之本發明化合物及蜮 本發明醫藥組合物調配為醫藥上可接受之劑型。 、本發明醫藥組合物中活性成份之實際劑量程度可改變， 、、又得活丨生成伤可有效地使特定患者、組合物及投與模式 =成期望，口療反應且對患者無毒性之量。所選劑量程度取 、於各種藥代動力學因素’包括本發明所用特定組合物之 '杈與路徑、投與時間 '所用特定化合物之***速 罕、治療持續時間、盘所田+ 1 /、所用特疋化合物組合使用之其他藥 =、、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體 去」體狀况、一般健康狀況及先前病史、及醫學領域熟 知的類似因素。 送組：物之無菌及流動性程度應使其可藉由注射器來遞 、矛欠以外’載劑較佳為等滲緩衝鹽水溶液。 例如’可藉由使用諸如印磷脂等包衣、藉由在分散物情 146805.doc -35- 201039850 形下維持所需粒徑及 性。在許多情形下，“：用表面活性劑來維持適當流動 多元醇（例如甘露醇或山梨醇卜及氣化納 例糖、 本文所用表述「細胞 可互換使用且所有該等 化體」及「轉化細胞」 物而不考慮轉移次數。 能因特意或無意的突變 化細胞中經篩選具有相 倘若意欲使用獨特名稱 」、細胞系」及「細胞培養物」 名稱皆包括子代。因此，詞語「轉 包括原代個體細胞及源自其之培養 亦應瞭解，所有子代之DNA含量可 而不疋全相同。本發明包括最初轉 同功能或生物活性之變體的子代。 ，則可根據上下文來確定。 本文所用術語「轉化」係指將载體/核酸轉移至宿主細 胞中之k帛；^使用不具有牢固細胞壁障壁之細胞作為宿 主細胞’則可藉由例如磷酸鈣沉澱法來實施轉染，如 Graham, F.L.^van der Eb, A.J., Virology 52(1973) 456-467 中所述。然、而，亦可使用將DNA引人細胞中之其他方法， 例如細胞核注射或原生質體融合。若使用原核細胞或含有 牢固細胞壁構造之細胞，則—種轉染方法係（例如）使用氣 化鈣進行鈣處理，如Cohen，S.，N.等人，pNAS. 69 (1972) 2110-2114 所述。 本文所用「表現」係指將核酸轉錄為mRNA之過程及/或 隨後將經轉錄mRNA(亦稱作轉錄物）轉譯為肽、多肽或蛋 白質之過程。轉錄物及所編碼多肽共稱為基因產物。若多 核苷酸源自基因組DNA，則在真核細胞中之表現可包括 mRNA之剪接。 146805.doc -36 - 201039850 「載體」係核酸分子，具體而言為自主複製的核酸分 子，其將***核酸分子轉移至宿主細胞中及/或宿主細胞 之間。該術語包括主要用於將DNA或RNA***細胞（例如 染色體整合）之載體、主要用於複製DNA或RNA之複製載 體、及用於DNA或RNA轉錄及/或轉譯之表現載體。該術 語亦包括可提供不止一種上述功能之載體。 「表現載體」係在引入適宜宿主細胞時可轉錄並轉譯為 多肽之多核苷酸。「表現系統」通常係指包括可用於產生 〇 期望表現產物之表現載體的適宜宿主細胞。 胺基酸序列說明

SEQ ID ΝΟ:1 重鏈可變結構域<ErbB3>HER3純系29 SEQ ID NO:2 輕鏈可變結構域<ErbB3>HER3純系29 SEQ ID NO:3 重鏈可變結構域<c-Met>Mab 5D5 SEQ ID NO:4 輕鍵可變結構域<c-Met>Mab 5D5 SEQ ID NO:5 重鏈 <ErbB3>HER3 純系 29 SEQ ID NO:6 輕鏈 <ErbB3>HER3 純系 29 ^ SEQ ID NO:7 重鏈 <c-Met>Mab 5D5 SEQ ID NO:8 輕鏈 <c-Met>Mab 5D5 SEQ ID NO:9 重鏈 <c-Met>Fab 5D5 SEQ ID NO:10 輕鏈 <c-Met>Fab 5D5 SEQ ID NO:ll 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS SEQ ID NO:12 重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS SEQ ID NO:13 輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS SEQ ID NO:14 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH 146805.doc -37- 201039850 SEQ ID NO:15 重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH SEQ ID NO:16 輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH SEQ ID NO:17 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS SEQ ID NO:18 重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS SEQ ID NO:19 輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS SEQ ID NO:20 重鏈 1 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_lC SEQ ID NO:21 重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_lC SEQ ID NO:22 輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_l C SEQ ID NO:23 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C SEQ ID NO:24 重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C SEQ ID NO:25 輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C SEQ ID NO:26 人類IgGl之重鏈恆定區 SEQ ID NO:27人類IgGl之重鏈恆定區 SEQ ID NO:28 人類輕鏈κ恆定區 SEQ ID NO:29 人類輕鏈λ恆定區 提供以下實例、序列表及圖來幫助理解本發明，本發明 之實際範圍陳述於隨附申請專利範圍中。應瞭解，可對各 程序實施修改而不偏離本發明之精神。 實驗程序 實例 材料及方法 重組DNA技術 使用標準方法來處理DNA，如以下文獻中所述： Sambrook, J.等人，Molecular cloning:A laboratory 146805.doc -38- 201039850 manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989。根據製造商說明書來使用分子生 物學試劑。 DNA及蛋白質序列分析及序列資料管理 關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈核苷酸序列之一般資訊 闡述於以下文獻中：Kabat，Ε·, A.等人，（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，NIH出版號 91-3242。根據EU編號法對抗體鏈之胺基酸進行編號 〇 (Edelman, G.M.等人，PNAS 63 (1969) 78-85 ; Kabat，E.A. 等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，NIH 出版號 91-3242)。使用 GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)之軟體包（10.2 版） 及 Infomax之 Vector NTI Advance suite(8.0版）來對序列實 施創建、製圖、分析、注釋及說明。 DNA測序 藉由用 SequiServe(Vaterstetten， Germany)及 Geneart ^ AG(Regensburg, Germany)實施雙鏈測序法來測定DNA之序 列。 基因合成 藉由 Geneart AG(Regensburg, Germany)自藉由自動化基 因合成產生之合成性募核苷酸及PCR產物來製備期望基因 片段。將兩側具有單數個限制性内切核酸酶裂解位點之基 因片段選殖至pGA18(ampR)質粒中。質粒DNA係自經轉化 細菌純化且藉由UV光譜法來測定濃度。藉由DNA測序來 146805.doc -39- 201039850 確認亞選殖基因片段之DNA序列。使用5'-BamHI及3'-XbaI 限制性位點來合成基因片段，該基因片段編碼「隆凸-孔 洞結合」Her3(純系29)抗體重鏈，該抗體重鏈在CH3結構 域中具有T366W突變且具有藉由⑴^:^肽連接物連接之C 端5D5 VH區；以及「隆凸-孔洞結合」Her3(純系29)抗體 重鏈，該抗體重鏈具有T366S、L368A及Y407V突變且具 有藉由（048)„肽連接物連接之C端5D5 VL區。以類似方式 藉由使用兩側BamHI及Xbal限制性位點之基因合成來製備 DNA序列，該DNA序列編碼「隆凸-孔洞結合」Her3(純系 29)抗體重鏈，該抗體重鏈在CH3結構域中具有S354C及 T366W突變且具有藉由（043)„肽連接物連接之C端5D5 VH 區；以及「隆凸-孔洞結合」Her3(純系29)抗體重鏈，該抗 體重鏈具有Y3 49C、T3 66S、L368A及Y407V突變且具有藉 由…^:^肽連接物連接之C端5D5 VL區。最後，使用兩側 BamHI及Xbal限制性位點來合成編碼Her3(純系29)及5D5 抗體之未經修飾重鏈及輕鏈的DNA序列。所有構成物皆經 設計而具有編碼前導肽（MGWSCIILFLVATATGVHS)之5, 端DNA序列，該前導肽靶向真核細胞中之分泌蛋白。 表現質粒之構建 使用Roche表現載體來構建編碼所有重鏈VH或VL融合蛋 白及輕鏈蛋白之表現質粒。該載體係由以下元件組成： -作為選擇標記之抗潮黴素基因， -愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr virus)(EBV)之複製 起點oriP， 146805.doc •40- 201039850 •來自載體pUC18之複製起點，其容許此質粒在大腸桿 菌中複製， -在大腸桿菌中賦予氨苄西林抗性之β-内醯胺酶基因， -來自人類巨細胞病毒（HCMV)之立即早期增強子及啟 動子， -人類1-免疫球蛋白多聚腺苷酸化（「多聚A」）信號序 列，及 -獨特的BamHI及Xbal限制性位點。 Ο 包含重鏈或輕鏈構成物以及具有C端VH及VL結構域之 「隆凸-孔洞結合」構成物的免疫球蛋白融合基因係藉由 基因合成來製備且將其選殖至所述pGA18(ampR)質粒中。 用 BamHI及 Xbal 限制性酶（Roche Molecular Biochemicals) 來消化具有合成DNA片段及Roche表現載體之pG18(ampR) 質粒且實施瓊脂糖凝膠電泳。然後將編碼重鏈及輕鏈之經 純化DNA片段接合至經分離Roche表現載體BamHI/Xbal片 段，從而產生最終表現載體。將最終表現載體轉化至大腸 〇 v 桿菌細胞中，分離表現質粒DNA(Miniprep)且對其實施限 制性酶分析及DNA測序。使正確純系在150 ml LB-Amp培 養基中生長，再次分離質粒DNA(Maxiprep)並藉由DNA測 序來確認序列完整性。 免疫球蛋白變體在HEK293細胞中之瞬時表現 根據製造商說明書藉由使用Freestyle™ 293表現系統 (Invitrogen, USA)瞬時轉染人類胚腎293-F細胞來表現重組 免疫球蛋白變體。簡言之，在FreeStyle™ 293表現培養基 146805.doc •41 · 201039850 中在37°C/8% C02下培養懸浮FreeStyle™ 293-F細胞，且在 轉染當天將細胞以1-2χ 106活細胞/ml之密度接種於新鮮培 養基中。在Opti-MEM® I培養基（Invitrogen, USA)中使用 325 μΐ 293fectin™(Invitrogen，Germany)及 250 pg 重鏈及輕 鏈質粒DNA以1:1莫耳比及250 ml之最終轉染體積來製備 DNA-293fectinTM 複合物。在 Opti-MEM® I 培養基 (Invitrogen, USA)中使用 325 μΐ 293fectin™(Invitrogen, Germany)及250 pg「隆凸-孔洞結合」重鏈1及2及輕鏈質 粒DNA以1:1:2之莫耳比及250 ml之最終轉染體積來製備 「隆凸-孔洞結合」DNA-293fectin複合物。在轉染後7天藉 由以14000 g離心30分鐘來收穫含有抗體之細胞培養上清 液且經由無菌濾器（0.22 μιη)過濾。在純化前將上清液儲存 在-20°C下。 三價雙特異性抗體及對照抗體之純化 藉由使用 Protein A-SepharoseTM(GE Healthcare, Sweden) 之親和層析及Superdex200尺寸排除層析自細胞培養上清 液純化三價雙特異性抗體及對照抗體。簡言之，將無菌過 濾細胞培養上清液施加至經PBS緩衝液（10 mM Na2HP04、 lmMKH2P04、137mMNaCl及2·7mMKCl，pH7.4)平衡 之HiTrap ProteinA HP(5 ml)管柱上。用平衡緩衝液洗去未 結合蛋白。用0.1 Μ擰檬酸鹽緩衝液（PH 2.8)洗脫抗體及抗 體變體，且用0.1 ml 1 M Tris(pH 8.5)來中和含有蛋白質之 流份。然後，彙集所洗脫蛋白質流份，用Amicon Ultra離 心過濾裝置（MWCO:30 K，Millipore)濃縮至3 ml體積並裝 146805.doc -42· 201039850 載至經20 mM Histidin、140 mM NaCl(pH 6.0)平衡之 Superdex200 HiLoad 120 ml 16/60 凝膠過濾管柱（GE Healthcare，Sweden)上。彙集含有經純化雙特異性抗體及 對照抗體以及低於5%之高分子量凝集體之流份且以1.0 mg/ml之等份儲存於-80°C下。藉由用木瓜蛋白酶消化經純 化5D5單株抗體且隨後藉由蛋白A層析移除摻雜的Fc結構 域來產生 Fab 片段。在經 20 mM Histidin、140 mM NaCl (pH 6_0)平衡之 Superdex200 HiLoad 120 ml 16/60 凝膠過渡 〇 管柱（GE Healthcare，Sweden)上進一步純化未結合Fab片 段，將其彙集且以l.o mg/ml等份儲存於-80°c下。 純化蛋白質之分析 藉由在280 nm下量測光密度（OD)使用基於胺基酸序列計 算出之莫耳消光係數來確定經純化蛋白質樣品之蛋白質濃 度。藉由在存在及不存在還原劑（5 mM 1,4-二硫蘇糖醇）時 使用考馬斯亮藍（Coomassie brilliant blue)染色實施SDS-PAGE來分析雙特異性抗體及對照抗體之純度及分子量。 〇 ^ 根據製造商說明書來使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統 (Invitrogen，USA)(4-20% Tris-甘胺酸凝膠）。在 200 mM KH2P〇4、250 mM KCl(pH 7.0)運行緩衝液中於25°C下使用 Superdex 200分析型尺寸排除管柱（GE Healthcare, Sweden) 藉由高效SEC來分析雙特異性抗體及對照抗體樣品之凝集 體含量。以0.5 ml/min之流速將25 pg蛋白質注入管柱上且 經50分鐘實施等度洗脫。對於穩定性分析，將1 mg/ml濃 度之純化蛋白質在4°C及40°C下培育7天且隨後藉由高效 146805.doc -43- 201039850 SEC來評估。在藉由用肽-N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)實施酶處理移除N-聚糖後，藉由奈升電噴霧 Q-TOF質譜來驗證經還原雙特異性抗體輕鏈及重鏈之胺基 酸骨架之完整性。 c-Met墙睃化分析 在實施HGF刺激前一天以5xl0e5/孔將A549細胞接種於6 孔板中之含有0.5% FCS(胎牛血清）之RPMI中。第二天，經 一小時用含有0.2% BSA(牛血清白蛋白）之RPMI替代生長 培養基。然後將5 pg/mL雙特異性抗體添加至培養基中且 將細胞培育10分鐘，之後再經10分鐘以50 ng/mL之終濃度 添加HGF。用含有1 mM釩酸鈉之冰冷PBS將細胞洗滌一 次，之後將其置於冰上並在細胞培養板中用1 〇〇 μί溶解緩 衝液（50 mM Tris-Cl ρΗ7.5、150 mM NaCn、1% ΝΡ40、 0.5% DOC、抑肽酶、0.5 mM PMSF、1 mM釩酸鈉）進行溶 解。將細胞溶解產物轉移至埃彭道夫（eppendorf)管中並在 冰上使溶解繼續進行30分鐘。使用BCA方法（Pierce)來測 定蛋白質濃度。在4-12% Bis-Tris NuPage 凝勝（Invitrogen) 上分離30-50 pg溶解產物且將凝膠上之蛋白質轉移至硝酸 纖維素膜上。用含有5% BSA之TBS-T將膜封閉1小時且根 據製造商說明書用針對Y1230、1234、1235之磷酸化特異 性c-Met抗體（44-888, Biosource)進行顯影。用結合未填酸 化c-Met之抗體（AF276, R&D)再次探測免疫印跡。 Her3(ErbB3)磷酸化分析 以2x1 0e5/孔將MCF7細胞接種於12孔板中之完全生長培 146805.doc -44- 201039850 養基（RPMI 164〇, 10% FCS)中。使細胞在兩天内生長至 90%融合。然後將培養基更換為含有0.5% FCS之饑餓培養 基。第二天以所示濃度補加各抗體，在1小時後添加500 ng/mL神經生長因子（R&D)。在添加神經生長因子後，將 細胞再培養10分鐘，之後收穫並溶解細胞。使用BCA方法 (Pierce)來測定蛋白質濃度。在4-12% Bis-Tris NuPage凝膠 (Invitrogen)上分離30-50 pg溶解產物且將凝膠上之蛋白質 轉移至硝酸纖維素膜上。用含有5% BSA之TBS-T將膜封閉 〇 一小時且用特異性識別Tyrl289(4791，Cell Signaling)之碟 酸化特異性Her3/ErbB3抗體進行顯影。 擴散分析 在化合物處理前一天以200 μί總體積將A549(4000細胞/ 孔）或A43 1(8000細胞/孔）接種於96孔E-板（Roche, 05232368001)中之含有〇·5% FCS之RPMI中。用實時細胞 分析機過夜監測細胞黏附及細胞生長，每15 min掃描一次 以監測阻抗。第二天，將細胞與5 μι之各抗體稀釋液在 ◎ PBS中一起預培育，且每5分鐘掃描一次。在30分鐘後，添 加2.5 pL具有20 ng/mL終濃度之HGF溶液並使實驗繼續再 進行72小時。經1 80分鐘每分鐘掃描一次來監測即時變 化，之後在剩餘時間内每15分鐘掃描一次。 FACS a)結合分析 分離並計數A431。以1.5><10e5/孔將細胞接種於96孔錐 形板中。使細胞旋轉沉降（15〇〇 rPm, 4°C，5 min)且在冰上 146805.doc -45- 201039850 及50 μί各雙特異性抗體存於含有2% FCS(胎牛血清）之PBS 中之系列稀釋液中培育30 min。再次使細胞旋轉沉降並用 200 pL含有2% FCS之PBS洗滌一次，之後再次與在含有2°/〇 FCS的PBS中稀釋之針對人類Fc且偶合藻紅蛋白之抗體 (Jackson Immunoresearch, 1091 16098) — 起培育 30 min。使 細胞旋轉沉降且用200 μι含有2% FCS之PBS洗滌兩次，使 其再懸浮於BD細胞固定溶液（BD Bio sciences)中且在冰上 培育至少10 min。藉由流式細胞術（FACS Canto，BD)測定 細胞之平均螢光強度（mfi)。藉由至少兩次一式兩份的獨立 染色來測定mfi。使用FlowJo軟體（TreeStar)進一步處理流 式細胞術譜圖。使用XLFit 4.0(IDBS)及劑量反應一點式模 型205來測定半最大結合。 b) 内化分析 分離並計數細胞。將5xl0e5個細胞置於埃彭道夫管中之 50 μί完全培養基中且與5 pg/mL之各雙特異性抗體在37°C 下一起培育。在指定時間點後將細胞儲存在冰上，直至時 程結束。此後，將細胞轉移至FACS管中，旋轉沉降（1500 rpm, 4°C , 5min)，用 PBS+2% FCS洗滌且與在含有 2% FCS 之PBS中稀釋之5〇 pL針對人類Fc且偶合藻紅蛋白之第二抗 禮（Jackson Immunoresearch, 1091 16098) —起培育30 分鐘。 再次使細胞旋轉沉降，用PBS + 2% FCS洗滌並藉由流式細 胞術（FACS Canto, BD)測定螢光強度。 c) 交聯實驗 分離並計數HT29細胞且將其分為兩個細胞群，根據製 146805.doc -46- 201039850 造商說明書用PKH26及PKH67(Sigma)分別對該等細胞群進 行染色。自各經染色細胞群中取5x1 0e5個細胞，將其合併 並在完全培養基中與10 pg/mL之各雙特異性抗體一起培育 30及60分鐘。在所示時間點後，將細胞儲存在冰上直至時 程結束。使細胞旋轉沉降（1500 rpm, 4°C , 5min)，用 • PBS+2% FCS洗滌並藉由流式細胞術（FACS Canto, BD)測 定螢光強度。

Cell Titer Glow分析 〇 使用cell titer glow分析（Promega)來量化細胞活力及增 殖。根據製造商說明書來實施分析。簡言之，在96孔板中 以100 μΐ^之總體積將細胞培養期望時間段。對於增殖分 析，自培育器中移出細胞且將其於室溫下置放30 min。添 加100 pL cell titer glow試劑且將多孔板置於定軌振盈器上 並保持2 min。在15 min後於微量板讀數器（Tecan)上量化 發光。

Wst-Ι分析 Ο 根據終點法分析來實施Wst-1活力及細胞增殖分析，從 而檢測代謝活性細胞數。簡言之，將20 μΕ Wst-Ι試劑 (Roche，1 1644807001)添加至200 pL培養基中。將96孔板 ' 再培育30 min至1 h直至染料顯著顯影。在微量板讀數器 • (Tecan)上於45 0 nm波長下量化染色強度。 經表現及純化之三價雙特異性<£化83-(；-]\16丨>抗體之設計 在表1中：根據上述通用方法來表現並純化三價雙特異 抗體，其係基於全長ErbB-3抗體（HER3純 146805.doc -47· 201039850 系29)及來自c-Met抗體（c-Met 5D5)之VH及VL結構域且具 有表1中所示各特徵。HER3純系29及c-Met 5D5之相應VH 及VL展示於序列表中。 表1 :表現並純化表1中具有VHVL-Ab-命名之三價雙特異 性抗體<ErbB3-c-Met>(亦可參見以下實例及圖3c) 分子名稱 雙特異性抗體 之 VHVL-Ab-命名 Her3/Met_ KHSS Her3/Met_ SSKH Her3/Met_ SSKHSS Her3/Met_ 1C Her3/Met_6C 特徵： 陵ΰ>·孔洞結合 突夔 S354C:T366W/ Y349'C:T366'S: L368'A:Y407'V T366W/ T366'S:L368'A: Y407V S354C:T366W/ Y349fC:T366'S:L 368A:Y407V S354C:T366W/ Y349'C:T366'S: L368'A:Y407'V S354C:T366W/ Y349'C:T366IS: L368'AY407'V 全長抗艎骨 架，源自： Her3 純系29 (嵌合） Her3 純系29 (嵌合） Her3 純系29 (嵌合） Her3 純系29 (拔合） Her3 純系29 (敌合） VHVL片段， 澈自 cMet 5D5 (人類化） __ ---— . cMet 5D5 (人類化） cMet 5D5 (人類化） --------— 一 cMet 5D5 (人類化） cMet 5D5 (人類化） 附接至抗後之 VH之位置 隆凸重鍵C端 隆凸重鏈C端 — 隆凸重鍵(¾¾ 隆凸重鏈C端 隆凸重鍵c端 附接至抗體之 VL之位置 —*—— 孔洞重鏈eg ---- 孔洞重鏈C端 孔洞重鏈C端 孔洞重鏈C端 — 孔洞重鏈c端 狀連接物 (G4s>, (g4s), (g4s)3 VHVL二疏鍵 VH44/ VL100 穩定 a-以----... (g4s), (G4S)fi ~~~ 〜 - + --- - -—^ —- --—— 贯例1(圖5): 雙特異性抗體與癌細胞之細胞表面之結合 在基於流式細胞術之分析中在Α43ι癌細胞上分析雙⑸ 性抗體與其位於細胞表面上之相應受體之結合特性。將$ 胞與單-或雙特異性一級抗體一起培育且用偶合勞光團: 可特異性結合-級抗體之Fc之二級抗體來檢測該等一級‘ 體與其同源受體之結合。相對於一級抗體之濃度來物 146805.doc •48- 201039850 抗體之系列稀釋液之平均螢光強度，從而獲得s形結合曲 線。藉由僅與二價5D5及Her3純系29抗體一起培育來驗證 c-Met及Her3之細胞表面表現。Her3/c-Met_KHSS抗體可容 易地結合A43 1之細胞表面。在該等實驗設定下，抗體僅能 經由其Her3部分來結合，因此平均螢光強度不會超過單獨 針對Her3純系29之染色。 實例2(圖6): 雙特異性Her3/c-Met抗體形式對HGF誘導c-Met受體磷酸 Q 化之抑制 為確認雙特異性抗體中c-Met部分之功能性，實施c-Met 磷酸化分析。在此實驗中，用雙特異性抗體或對照抗體處 理A549肺癌細胞或HT29結直腸癌細胞，之後暴露於HGF 中。然後溶解細胞並檢驗c-Met受體之磷酸化。兩種細胞 系皆可經HGF刺激，此可藉由免疫印跡中磷酸化-c-Met特 異性區帶之出現來觀察。 實例3(圖7): 〇 雙特異性Her3/c-Met抗體形式對HGF誘導Her3受體磷酸化 之抑制 為確認雙特異性抗體中Her3部分之功能性，實施Her3磷 酸化分析。在此實驗中，用雙特異性抗體或對照抗體處理 MCF7細胞，之後暴露於HRG(神經生長因子）中。然後溶解 細胞並檢驗Her3受體之磷酸化。Her3/c-Met_KHSS抑制 Her3受體磷酸化之程度與親代Her3純系29相同，表明抗體 之Her3結合及功能性未受三價抗體形式影響。 146805.doc -49· 201039850 實例4(圖8): 雙特異性Her3/c-Met抗體形式對HGF誘導HUVEC增殖之 抑制 實施HUVEC增殖分析來證實HGF之促有絲***效應。將 HGF添加至HUVEC可使增殖增強兩倍。以與雙特異性抗體 相同之濃度範圍添加人類IgG對照抗體對細胞增殖無影 響，而5D5 Fab片段可抑制HGF誘導增殖。對Her3/c-Met_KHSS之滴定證實抗體具有弱抑制效應（圖8)。 Her3/Met-6C抗體之抑制效應更顯著，表明較長連接物可 改良抗體之效能。此證實了三價抗體形式中c-Met組份之 功能性。 實例5(圖9): 雙特異性Her3/c-Met抗體形式對癌細胞系A431增殖之抑制 若將A43 1接種於低血清培養基中，添加HGF除擴散外可 誘導較弱促有絲***效應。利用此作用來分析Her3/c-Met_KHSS對經HGF處理之A431之增殖的影響。實際上， 雙特異性抗體可顯著抑制HGF誘導之增殖增強（15%)。對 照人類IgGl抗體對經HGF促進之A43 1細胞生長無影響。 實例6(圖10): 分析在癌細胞系A431中雙特異性Her3/c-Met抗體形式對 HGF誘導細胞-細胞擴散（擴散）之抑制 HGF誘導擴散包括細胞之形態改變，從而導致細胞變 圓、細胞產生偽足樣突出、紡錘體樣結構及獲得一定運動 性。實時細胞分析儀（Roche)量測給定細胞培養孔之阻抗 146805.doc -50- 201039850 且由此可間接監測細胞形態及增殖之改變。將HGF添加至 A43 1及A549細胞導致阻抗改變，監測該阻抗且其隨時間 而變化。Her3/c-Met_KHSS 及 Her3/Met-6C 抑制 HGF誘導擴 散，且Her3/Met-6C更有效（20.7°/。及43.7°/〇擴散抑制）（圖 10)。 【圖式簡單說明】 圖1不含CH4結構域之全長抗體的示意性結構，其可以兩 對重鏈及輕鏈特異性結合第一抗原1，該等重鏈及輕 〇 鏈以典型順序包含可變結構域及恆定結構域。 圖2本發明三價雙特異性抗體之示意圖，其包含特異性結 合第一抗原1之全長抗體，該全長抗體上融合有 a) 圖2a兩個多肽VH及VL(VH及VL結構域二者一起形 成特異性結合第二抗原2之抗原結合位點）； b) 圖2b兩個多肽VH-CH1及VL-CL(二者中之VH及VL 結構域一起形成特異性結合第二抗原2之抗原結合位 點）。 ^ 圖3本發明三價雙特異性抗體之示意圖，其包含特異性結 合第一抗原1之全長抗體，該全長抗體上融合有兩個 多肽VH及VL(VH及VL結構域二者一起形成特異性結 合第二抗原2之抗原結合位點）且具有「隆凸及孔 洞」。 圖4本發明三價雙特異性抗體之示意圖，其包含特異性結 合第一抗原1之全長抗體，該全長抗體融合有兩個多 肽VH及VL(VH及VL結構域二者一起形成特異性結合 146805.doc •51 - 201039850 第二抗原2之抗原結合位點，其中該等VH及VL結構域 在VH44位與VL100位之間包含鏈間二硫橋）且具有 「隆凸及孔洞」。 圖5雙特異性抗體與癌細胞之細胞表面之結合。 圖6雙特異性Her3/c-Met抗體形式對HGF誘導c-Met受體磷 酸化之抑制；圖6a : A549細胞；圖6b及6c ·· HT29細 胞。 圖7雙特異性Her3/c-Met抗體形式對HRG誘導Her3受體磷 酸化之抑制；圖7a及7b : MCF7細胞。 圖8雙特異性Her3/c-Met抗體形式對HGF誘導HUVEC增殖 之抑制。 圖9雙特異性Her3/c-Met抗體形式對癌細胞系A43 1增殖之 抑制。 圖10分析在癌細胞系A43 1中雙特異性Her3/c-Met抗體形式 對HGF誘導細胞-細胞擴散（擴散）之抑制。 146805.doc 52- 201039850 序列表 <110>瑞士商羅齊克雷雅公司 <120>三價雙特異性抗體

<130> 26063 FT <140> 099110642 <141> 2010-04-06 <150> EP 09005108.7 <151> 2009-04-07 <160> 29 <170> Patentln version 3.2

<210> <211〉 <212> <213> 1 118 PRT 人工的 <220> <223> 重鏈可變結構域<£^33>!^3純系29 <400> 1

Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Ala 20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45

Met Gly Tyr lie Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60

Lys Asn Arg Phe Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe 65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 146805-序列表.doc 201039850 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223> 輕鏈可變結構域<£咖3>服113純系29 <400> 2

Asp lie Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr 工le Ser Cys Arg Ala Arg Gin Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Arg Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Glu Gin 65 70 75 80

Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Asn Thr Phe Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213〉 人工的 <220〉 <223> 重鍵可變結構域<c-Met> Mab 5D5 <400> 3

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 146805·序列表.doc 201039850

Trp Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Met lie Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe 50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 o

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223〉輕鏈可變結構域<c-Met> Mab 5D5 <400> 4

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30

Ser Ser Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95 146805-序列表.doc 201039850

Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 100 105 HO

Lys <210> 5 <211> 448 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223> 重鏈HER3-純系29 <400> 5

Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Ala 20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45

Met Gly Tyr lie Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60

Lys Asn Arg Phe Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe 65 IQ 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn -4- 146805-序列表.doc 201039850 145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300

Ser Val Leu Thr Val· Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 325 330 335 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 146805-序列表.doc 201039850

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <21〇> 6 <211〉 214 <212> PRT <213〉 人工如 <220>

<223〉輕鏈 HER3-純系 29_K01_LC <400> 6

Asp lie Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Arg Gin Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Arg Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Glu Gin 65 70 75 80

Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Asn Thr Phe Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly -6 - 146805-序列表.doc 201039850 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

o

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 7 <211> 449 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223〉重鏈 cMet Mab 5D5 <400> 7

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Met lie Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe 50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 146805-序列表.doc 201039850 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg 85

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95 Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 105 110 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 125 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 140 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 155 160 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 170 175 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 185 190 lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 205 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 220 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 235 240 Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 250 255 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 265 270 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 285 Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 300

Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val 100

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 130 135

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 145 150

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 165

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 180

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 195

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 210 215

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295

Val Ser Val Leu Thr Val Leu

Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 146805-序列表.doc 201039850 305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 325 330 335

Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 OSer Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445

Lys

<210〉 <211> <212> <213> 8 220 PRT 人工的 <220> <223〉輕鏈 cMet Mab 5D5 <400> 8

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30 -9 146805-序列表.doc 201039850

Ser Ser Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95

Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125

Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160

Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 1B5 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 9 <211> 226 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223> 重鏈 cMetFab5D5 <400> 9 10- 146805-序列表.doc 201039850

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Met lie Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe 50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Ma Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ❹

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp ◎ 145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 -11 - 146805·序列表.doc 201039850

Thr His 225 <210> 10 <211> 220 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223〉輕鏈 cMet Fab 5D5 <400> 10

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30

Ser Ser Gin Lys Asa Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95

Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 100 105 110

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O

Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140

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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190

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o

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Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 450 455 460 lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 465 470 475 480

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Lys Cys Lys Val

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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 o

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430

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Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

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Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205

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Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 〇 290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 325 330 335 工le Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 340 345 350

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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380

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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 146805-序列表.doc -41 - 201039850

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 450 455 460

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 465 470 475 480

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Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140

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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser ' 180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205

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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 工le Ser Arg 245 250 255 •43 146805-序列表.doc 201039850

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Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 325 330 335 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Cys Thr Leu 340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Ser Cys 355 360 365

Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 450 455 460

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie 465 470 475 480 44- 146805-序列表.doc 201039850

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Lys Leu Leu He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser 530 535 540

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 545 550 555 560

O

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr 565 570 575

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Leu Asn Trp Tyr Gin Arg Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu lie 35 40 45

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Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 26 <211> 330 <212> PRT <213〉 智人 <400> 26

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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 -46· 146805-序列表.doc 201039850

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 o Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 〇

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe •47· 146805-序列表.doc 201039850 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 27 <211> 327 <212> PRT <213〉智人 <400> 27

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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 -48- 146805-序列表.doc 201039850

Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205

Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220 o

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 工le Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 o

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 28 <211> 107 <212> PRT <213〉智人 <400> 28

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu -49· 146805-序列表.doc 201039850 i 5 10 15

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ma Leu Gin 35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 29 <211〉 104 <212> PRT <213〉 智人 <400> 29

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 1 5 10 15

Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr 20 25 30

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 35 40 45

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr 50 55 60

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His 65 70 Ί5 80

Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 85 90 95 -50 146805-序列表.doc 201039850

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100

146805-序列表.doc -51 -

Claims (1)

1. 201039850 七、申請專利範圍： 1. 一種三價雙特異性抗體，其包含 a) 全長抗體，特異性結合第一抗原且由兩個抗體重鏈及 兩個抗體輕鏈組成； b) 由以下組成之多肽： . ba)抗體重鏈可變結構域（VH);或 bb)抗體重鏈可變結構域（VH)及抗體恆定結構域1 (CH1)， 0 其中該多肽以該VH結構域之N端經由肽連接物與該全 長抗體兩條重鏈中一條之C端融合； c) 由以下組成之多肽： ea) 抗體輕鏈可變結構域（VL)，或 eb) 抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體輕鏈恆定結構域 (CL)； 其中該多肽以該VL結構域之N端經由肽連接物與該全 長抗體兩條重鏈中另一條之C端融合； 〇 且其中b)中該多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及C)中該 多肽之抗體輕鏈可變結構域（VL)—起形成特異性結合 第二抗原之抗原結合位點。 2. 如凊求項1之三價雙特異性抗體，其特徵在於 ' 條重鏈之CH3結構域及另一條重鏈之CH3結構域各 在個包含該專抗體CH3結構域間之原始介面之介面會 合（meet); 二價雙特異性抗體之形 其中該介面經改變以促進該 146805.doc 201039850 成，其中該改變之特徵在於： i) 一條重鏈之CH3結構域改變， 使得在該二價雙特異性抗體内與另一條重鏈之CH3結 構域之原始介面會合的一條重鍵之CH3結構域的原始介 面内， 一個胺基酸殘基經一個具有較大側鏈體積之胺基酸殘 基替代，從而在一條重鍵之CH3結構域之介面内生成一 個突出物，其可位於另一條重鏈之CH3結構域之介面内 的一個腔中， 及 ii)另一條重鏈之CH3結構域改變， 使得在該三價雙特異性抗體内與第一 CH3結構域之原 始介面會合的第二CH3結構域之原始介面内， 一個胺基酸殘基經一個具有較小側鏈體積之胺基酸殘 基替代，由此在第二CH3結構域之介面内生成一個腔， 其中可定位該第一 CH3結構域之介面内之突出物。 3. 如請求項2之三價雙特異性抗體，其特徵在於 0該具有較大側鏈體積之胺基酸殘基選自由以下組成 之群：精胺酸（R)、***酸（F)、酪胺酸（Y)、色胺酸 (W);及 ii)該具有較小側鏈體積之胺基酸殘基選自由以下組成 之群：丙胺酸（A)、絲胺酸（S)、蘇胺酸（T)、纈胺酸（V)。 4. 如請求項2或3之三價雙特異性抗體，其特徵在於 兩個CH3結構域進一步改變：在各CH3結構域之相應 146805.doc 201039850 位置引入半胱胺酸（C)胺基酸，從而在兩個CH3結構域之 間可形成二硫橋。 5.如請求項2或3之三價雙特異性抗體，其特徵在於 i) 中該CH3結構域包含T366W突變；及 ii) 中該CH3結構域包含T366S、L368A、Y407V突變。 6·如請求項4之三價雙特異性抗體，其特徵在於 i)中該CH3結構域包含Y349C、T366W突變；及 i〇 中該 CH3 結構域包含 S354C、T366S、L368A、 〇 Y407V突變。 7·如請求項2或3之三價雙特異性抗體，其特徵在於 b)中該多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及c)中該多肽 之抗體輕鏈可變結構域（VL)藉由在以下位置之間引入二 硫鍵經由鏈間二硫橋連接及穩定： Ο重鏈可變結構域44位與輕鏈可變結構域1〇〇位， η)重鏈可變結構域1〇5位與輕鏈可變結構域43位，或 lu)重鏈可變結構域101位與輕鏈可變結構域100位。 #J 8_如請求項7之三價雙特異性抗體，其特徵在於 b)中該多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及c)中該多肽 之抗體輕鏈可變結構域（v L)藉由在以下位置之間引入二 硫鍵經由鏈間二硫橋連接及穩定： 〇重鏈可變結構域44位與輕鏈可變結構域100位。 9·如叫求項6之三價雙特異性抗體，其特徵在於及幻中該 等狀連接物係長度介於25與50個胺基酸間之相同肽 (identical peptides) ° 146805.doc 201039850 1 0. —種醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一項之三價 雙特異性抗體。 11. 一種核酸，其編碼如請求項1至9中任一項之三價雙特異 性抗體。 12. 如請求項2或3之三價雙特異性抗體，其用於治療癌症。 13. —種如請求項1至9中任一項之三價雙特異性抗體之用 途，其用於製造治療癌症之藥物。 146805.doc 4-