KR100230613B1

KR100230613B1 - 간균내 유전자 발현

Info

Publication number: KR100230613B1
Application number: KR1019930703241A
Authority: KR
Inventors: 유게니오 페라리
Original assignee: 마가렛 에이.혼; 제넨코 인터내셔널 아이엔씨
Priority date: 1991-04-26
Filing date: 1992-04-24
Publication date: 1999-12-01
Also published as: CA2108358C; EP0600893A4; AU663321B2; JP2654472B2; US5387521A; EP0600893B1; FI934717A0; WO1992019721A1; FI934717A; JPH06507075A; DE69230825D1; AU1911192A; EP0600893A1; DE69230825T2; NZ242507A; CA2108358A1; DK0600893T3

Abstract

본원은 신규의 유전자, 벡터 및 이들로 형질전환시킨, 효소의 대량생산에 유용한 간균(bacilli)에 관한다. 특히 본원은 돌연변이화된 또는 야생형인, 함께 협력하여 상승적으로 효소의 대량생산을 유발하는 비연쇄된 유전자들(unlinked genes)의 특정조합물에 관한다.

Description

[발명의 명칭]

간균내 유전자 발현

[본원분야]

본원은 신규의 유전자, 벡터 및 이들로 형질전환시킨, 효소의 대량생산에 유용한 간균(bacilli)에 관한다. 특히, 본원은 돌연변이화된 또는 야생형인, 함께 협력하여 상승적으로 효소의 대량생산을 유발하는 비연쇄된 유전자들(unlinked genes)의 특정조합물에 관한다.

[본원배경]

간균속(the genus Bacilli)은 산업적으로 중요한 많은 생성물들을 생산한다. 이들중 일부는 프로티아제, 아밀라제, 및 베타-글루카나제를 포함한다(priest, 1977, Bacteriological Review, 41 : 711-753). 간균은 이들 효소대부분을 포자형성개시후 또는 정지기에 이르렀을 때 생산한다.

Bacillus Subtilis I-168은 수년간의 학술연구결과로 잘 개발된 유전시스템을 지니게된, 가장 광범위하게 연구된 간균의 하나이다. 간균연구를 통해 우리는 세포의 효소발현에 관한 상당량의 정보와 함께 당해 효소발현 기작이 경질된 많은 B Subtilis I-168 돌연변이를 얻게 되었다. 세포외 효소들의 발현을 조절하는 단백질들은 여러개의 서로 상이한 공지된 유전자들에 암호화 되어 있다. 이같은 조절의 정확한 분자적 기작은 알 수 없지만, 이들 유전자들의 생성물이 표적효소의 전사 레벨에서 직·간접적으로 상호작용한다는 사실만은 분명한 듯 싶다.(Ferrari etal. 1988, J. Bacteriol. 170 : 289-295, Henner etal, 1988, J. Bacteriol. 170 : 296-300).

프로모터주위의 DNA 지역은 혹종의 전사제어 인자와 활발히 상호작용하므로써 당해 특정프로모터의 강도와 효율을 효과적으로 조절한다. 이같은 상호작용은 당해 특정표적 유전자의 전사를 촉진하거나 또는 억제케된다. 따라서, 이같은 전사 제어인자를 암호화하는 유전자 또는 당해 제어인자와 상호작용하는 염색체 지역을 돌연변이시키게 되면, 보다 많거나 적은양의 표적유전자 mRNA가 생산되게 되고, 결국, 세포가 보다많거나 적은양의 효소를 합성토록하는 결과를 낳게 된다.

유전공학기술의 출현으로 말미암아, 혹종의 종(species)에서 유래한 유전자를 B. Subtilis I-168 또는 다른 간균종(Bacillus species)에 클로닝시켜 발현시킬 수 있게 되었다. 대부분의 연구들은 클로닝벡터로서 멀티카피 플라스미드를 사용해 왔다. 클로닝된 단백질의 수율은 야생형 숙주의 생산수율보다는 현저히 증가하였으나, 돌연변이화를 통해 얻은 균주의 효소생산 수율에는 훨씬 못미치는 것이었다. 이것은 또한 효소가 B. Subtilis 유래의 강력한 전사 및 번역인자 제어하에 놓인 경우에도 마찬가지였다. 분명히, 혹종의 돌연변이들, 즉, 논문에 여러 가지 분비효소들의 대량생산을 유발할 수 있는 것으로 기재되어 있는 SacU(Hy), SacQ(Hy), 및 hpr은 멀티카피복제 플라스미드로 부터의 효소생산에 영향을 미치지 않는 것으로 여겨진다. (Dedoner 등, Microbiology 1976, D. Schlessinger (Ed), pp 58-69, American Society for Microbiology, washington, DC : Palva 등, 1983, FEMS Microbiology Cetters, 17 81-85 ; Ferrari, unpublished observation). 이들 조절 유전자들은 영향받는 효소의 구조유전자에 비연쇄된 것이기 때문에 당해 유전자가 멀티카피플라스미드에 존재할때도 또한 상당한 정도까지 자신들의 촉진활성을 발휘할 것으로 예견된다.

6개 이상의 서로 상이한 조절유전자(SacU, SacQ, PrtR, hpr, Sin 및 abrB)가 서브틸리신 유전자(Subtilisin gene)의 전사에 직·간접적인 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다.

상기 조절유전자 가운데 가장 다면적인 결과(pleiotropic effect)를 나타내는 SacU 유전자의 혹종의 돌연변이들은 개질된 폴리펩타이드를 암호화한다. 예컨데, SacU(Hy) 돌연변이를 지니는 균주는 고농도의 글루코즈존재에서 포자를 형성하고, 형질전환효율이 매우 낮으며, 편모가 존재하지 않고, 여러 가지 분비효소를 또한 대량생산한다.(Dedonder 등, Microbiology 1976, 상기논문)

3개의 서로 상이한 간균유래의 SacQ 유전자를 클론시킨뒤, 특성을 규명하였다.(Amory 등, 1987, J. Bacteriol, 169, 234 ; Yang 등, 1986, J. Bacteriol, 166, 133 ; 및 Tomioka 등, 1985, J. Biotechrnol 3, 85). B. Subtilis에서 분리된 유전자는 46개의 아미노산으로 이루어진 폴리텝티드를 암호화하였다. 자신의 프로모터를 돌연변이시키거나 또는 멀티카피 플라스미드내 조재로 대량발현된 SacQ 유전자는 알카리성인 프로티아제를 포함하는 혹종의 세포외효소를 대량생산한다(Yang 등, 1986, J. Bacteriol 166, 113-119).

PrtR 유전자는 60개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화한다. 이같은 유전자는 멀티카피 플라스미드에 함유되어 B subtilis 내에 도입케 되었을 때 단백질 생산을 증대시키게 된다. 하지만, SacQ와는 달리, 지금까지, 프로티아제 생산을 증대시킬 수 있는 이같은 유전자의 염색체 돌연변이에 대해서는 보고된바 없었다.(Yang 등, 1987, J. Bacteriol, 169. 434-437)

hpr 유전자는 203개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하며, 이 유전자에서의 혹종의 돌연변이들은 알칼리성 프로티아제 생산을 촉진시킨다. 이같은 유전자의 생성물 손실을 야기하는 돌연변이들은 서브틸리신 유전자의 전사를 촉진시키는 것으로 보고된바 있다(Perego and Hoch, 1988, J. Bacteriol. 170, 2560-2567). 그러므로 hpr 유전자의 생성물은 서브틸리신 유전자의 억제인자일 것으로 생각된다. ScoC 유전자와 CatA 유전자는 hpr 유전자와 동일한 것으로 확인되었다. 이후에 hpr이란 표기는 hpr, ScoC 또는 CatA라 불리는 3개의 대립유전자중 임의의 한 개를 가지게 된다.

Sin 유전자는 111개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화한다(Gaur 등, 1986, J. Bacteriol, 168 : 860-869). 당해 유전자의 삽입불활성화(insertional inactivation)는 알칼리성 프로티아제의 대량생산을 야기하는바, 이같은 유전자는 알칼리성 프로티아제의 발현억제인자인 것으로 사료된다.

끝으로, abrB 유전자는 97개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는데, 이 유전자는 알칼리성 프로티아제 전사의 억제인자이며, 당해 알칼리성 프로티아제 유전자의 일시적 조절에 있어 중요한 역할을 행할것이라는 증거가 존재한다.

[본원요약]

놀랍게도 우리는 상술한 유전자의 돌연변이 조합을 지니는 균주내에서 상승효과가 이루어질 수 있음을 발견하였다. 발현될 효소가 자신의 조절지역들 및 프로모터 제어하에 있는 삽입벡터 또는 플라스미드(integrative vector or plasmid)로 미생물을 형질전환시키게 되면, 당해 미생물은 복제멀티카피 플라스미드나 상술한 돌연변이된 조절유전자중 하나를 사용했을 때 예상할 수 있는 것보다 더 많은 효소를 발현케 된다.

따라서, 본원은 a) 효소유전자 서열 ; b) 효소유전자 서열에 작동적으로 연쇄된 효소 유전자 발현제어용 기능적 프로모터유전자 및 c) 각각이 프로모터의 전사조절에 관여하여 효소생산을 증가시키는, 바람직하기로 hpr, SacQ, SacU, sin, abrB, 또는 PrtR을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 두 개 이상의 돌연변이화된 유전자들 : 을 포함하는 효소를 대량생산할 수 있는 간균에 관한다.

본원은 또한 신규의 유전자를 포함하는 벡터와 이 벡터로 형질전환시킨 세포 및 이 세포를 사용해 효소를 생산하는 방법에 관한다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 pSAR 유전자의 축조를,

제2도는 pSAICM 유전자의 축조를,

제3도는 pSAIM 유전자의 B. Subtilis 염색체내 삽입을 보여준다.

[발명의 상세한 설명]

본원 출원인은 돌연변이화된 또는 야생형 유전자들의 신규조합물과 이들로 구성된 벡터 및 효소를 대량생산하는 독특한 능력을 갖는 당해 벡터로 형질전환된 간균을 개발하였다. 상술한 바와같은 2개의 돌연변이화된 유전자들은 적당한 프로모터와 유전자 서열을 지니는 균주에 도입된다. 당해 효소의 프로모터 서열과 유전자 서열은 삽입벡터(integrative vector)에 의해 그같은 숙주균주에 도입된다. 삽입시 증폭되거나 또는 그렇치 않을 수 있는 그같은 벡터는 숙주게놈의 일부로서 안정하게 유지되며, 염색체의 필수부분으로서 숙주세포내 복제된다. 삽입은 특정축조물에 사용되는 프로모터 지역과 상동관계에 있는 지역을 포함하는(그러나, 이에 한하지는 않는) 서로상이한 염색체 지역에서 일어나게 된다. 그같은 숙주는 자신의 고유한 효소서열, 또는 바람직한 효소생산에 해로운, 결실된 또는 다른표준기술에 의해 본래의 기능을 발휘할 수 없도록 만들어진 기타 다른 유전자 서열들을 지닐 수 있다.

본원에 기재된 “효소유전자 서열”(enzyme gene seguence)이란 일반적으로 간균에 대해 이형(heterologous) 또는 상동성인, 효소를 암호화하는 효소발현용 DNA 서열을 가리킨다. Bacillus lentus, Bacillus amyloliguefaciens(예컨데, Aicc 23844), Bacillus alcalophilus(예컨데, Aicc 21522), B subitilis(예컨데, Aice 6051) 및 Bacillus cereus(예컨데, △TCC 21768)에서 유래하는 바람직한 효소들을 포함한(그러나, 이에 한하지는 않는) 여러개의 공지효소가 본원 범주에 포함된다. 본원은 또한 프로티아제, 리파제, 큐티나제, 에스테라제, 엔도글리코시다제등을 암호화하는 유전자들과 같은 간균내에서 발현될 수 있는 모든 유전자들을 포함한다. 바람직한 효소는 서브틸리신이며, 기타의 바람직한 효소들은 스트렙토마이세스종(streptomyes species) 유래의 엔도글리코시다제 H와 pseudomonas mendocino △ATCC 53552(메릴랜드주 록크빌소재 American Type Culture collection에서 구입할 수 있는) 유래의 리파제를 포함한다. 바람직한 효소가운데는 비교적 높은 pH에서 최적활성을 지니는 서브틸리신과 같은 효소들도 포함된다. 본원에는 또한 각각의 전사 조절 유전자들이 독립적으로 영향을 미칠 수 있는(즉, 대량생산하게 할 수 있는) 프로모터들(예컨데, aprE 및 nprE)도 포함된다. 효소 유전자서열은 또한 수정되어, 하나이상의 아미노산에 대한 치환, 삽입 또는 결실 변이가 이루어진 돌연변이 DNA가 되게 되는, 천연효소 유전자 서열을 암호화하는 DNA 서열도 포함한다. 예컨데, 1985년 1월 9일자 공개된 EPO 공개공보 No. 0130756호에는 적합한 수정방법이 기재되어 있다.

서브틸리신은 박테리아 유래의 알칼리성 프로티아제로서 단백질 또는 펩티드의 펩티드 결합을 절단한다. 본원 기재된 “세브틸리신”(subtilisin)이란 세린 프로티아제의 일종인 천연 서브틸리신 또는 재조합 서브틸리신을 가리킨다. 다양한 박테리아종이 일련의 천연 서브틸리신을 생산 및 분비하는 것으로 알려져 있다. 이러한 일련의 서브틸리신은 그들의 아미노산 서열에 있어 완전한 상동성을 보여주지는 아니하나 동일한 또는 유사한 형태의 단백질 분해활성을 보여준다. 이같은 세린프로티아제류들은 키모트립신 관련 세린프로티아제류로 부터 자신들을 구분짓게 해주는, 촉매삼위체(catalytic triad) 규정요소인 공통의 아미노산 서열을 공유한다. 서브틸리신과 키모트립신 관련 세린프로티아제들은 양자모두 아스파테이트, 히스티딘 및 세린으로 구성되는 촉매 삼위체를 지니지만, 아미노 말단에서 카복시 말단쪽으로 읽었을 때, 당해 아미노산들의 상대적 순서가, 서브틸리신 관련 프로티아제의 경우 아스파테이트-히스티딘-세린순이 되고, 키모트립신 관련 프로티아제의 경우 히스티딘-아스파테이트-세린순이 되는 차이점이 있다.

“재조합 서브틸리신”(Recombinant subtilisin)이란 천연의 서브틸리신을 암호화하는 DNA 서열을 수정시켜 하나이상의 천연서브틸리신 아미노산에 치환, 삽입, 도는 결실 변이가 발생한 돌연변이 DNA 서열을 만든 뒤, 이 돌연변 DNA 서열을 사용해 얻은 서브틸리신을 가리킨다. 이같은 수정에 적합한 방법들은 본원 및 EPO 공개공보 제 0130756호에 기재된 방법들을 포함한다. 예컨데, 제 50, 124 및 222번의 아미노산 잔기인 메티오닌이 페닐알라닌 이소류신 및 글루타민으로 각기 치환된 서브틸리신 다중 돌연변이는 잔기 222번이 글루타민으로 치환된(Gln-222) 재조합 서브틸리신(EPO 공개공보 제 0130756호에 기재된)으로부터 유도될 수 있다. 즉, Gln-222 재조합 서브틸리신내에 존재하는 제 50 번의 페닐알라닌 잔기를 메티오닌으로, 제 124 번의 이소루신 잔기를 메티오닌으로 치환시켜 다중돌연변이(multiple mutant)를 얻을 수 있다.

본원 기재된 “효소 유전자 서열에 작동적으로 연쇄된 효소유전자 발현제어용 기능적 프로모터”(a functional promoter seguence Controlling the expression of the enzyne gere operably linked to the enzyme gene seguence)란 간균내 암호화 서열의 전사와 번역을 제어하는 프로모터 서열을 가리킨다. 프로모터 서열은 발현용으로 선정된 미생물내에서 기능적으로 작동할 수 있는것 가운데 선택해야 한다. 예컨데, 대장균(E. Coli)내 알카리성 프로티아제 발현용 암호화 서열에는 람다피(Lambda p)(Renaut, 등.,Gene 15, 81(1981) 및 trp[Russell, 등., Gene 20, 23(1982) 또는 tac(de Boer 등., PNAS. USA 80, 21(1983)]를 사용해 만든 프로모터 서열이 작동적으로 연쇄될 수 있을 것이다. B. subtilis I-168이 발현숙주로서 사용되는 경우에는, 발현이 상술된 엎스트림 조절 유전자들에 의해 영향을 받는, B. subtilis의 알카리성 프로티아제 프로모터[stahl 등, J. Bacteriol 158, 411-418 91984)], B. subtilis의 알파 아밀라제 프로모터(Yang 등, 1983, Nucleic Acids Res, 11, 237-249) 또는 B. anyloliguefaciens(Tarkinen 등, J. Biol, Chem, 258, 1007-1013(1983)], 또는 B. subtilis의 중성 프로티아제 프로모터[Yang 등, J. Bacteriol, 160, 15-21(1984)] 또는 B. subtilis나 기타 다른 관련간균의 임의의 프로모터가 사용될 수 있을 것이다. 본원의 바람직한 프로모터는 aprE 프로모터가 된다. nprE 프로모터 역시도 바람직하다. 본원기재의 “전사 조절 유전자”(transcriptional regulatory gene)”란 생성물이 효소 프로모터의 전사레벨에 영향을 미치는 임의의 유전자들을 가리킨다. 이들 유전자들은 프로모터(예컨데, AbrB)와 또는 당해 프로모터의 엎스트림 또는 다운스트림 지역(예컨데, Hpr, SacU, SacQ, PrtR, Sin)과 직·간접적으로 상호작용할 수 있다. 상기 정의는 특정 프로모터의 전사량을 증가(예컨데, 멀티플카피)시킬 수 있는 혹종의 가능한 돌연변이 및 유전자 생성물 또는 유전자 생성물의 결여를 포괄적으로 포함한다. 이같은 정의는 또한 전사기구(예컨데, RNA 플리머라제) 또는 조절유전자와의 보다나은 상호작용으로 또는 그같은 상호작용의 결여로 인하여 전사의 증가를 가져올 수 있는 표적유전자 프로모터 지역 또는 프로모터의 다운스트림 또는 엎스트림 지역에서의 돌연변이(예컨데, 전사에 간여하는 유전자 생성물의 생산을 감소시키는 돌연변이)를 포함(그러나, 이에 한하지는 않는) 한다. 이들 유전자들과 이들의 돌연변이들의 영향은 상술된바 있다. 출원인이 찾아낸 이들 특정조합물은 단일 돌연변이들만을 사용했을때는 찾아볼 수 없던 상승효과를 보여주었다.

대량으로 효소가 발현되고 그리고 상기 조절 돌연변이들의 제어하에서 발현이 좀더 효율적인 것이 되려면 프로모터가 숙주인 Bacillus 세포의 게놈에 삽입 또는 저카피수의 플라스미드(low copy number plasmid)에 의해 날라져야 한다. 효소 유전자를 나르는 고카피수의 복제 플라스미드들은 혹종의 조절 돌연변이들을 지니는 균주내에서 잘 적응치못해 매우 빈번히 소실되거나 또는 재배열된다.

대량 발현될 효소를 암호화는 유전자는 숙주인 Bacillus 세포의 게놈에 삽입되는 것이 바람직하다.

“발현벡터”란 적합한 숙주내에서 DNA의 발현을 실행시킬 수 있는 적합한 제어서열에 작동적으로 연쇄된 DNA 서열함유의 DNA 축조물을 가리킨다. 그같은 제어서열은 전사를 실행시킬 수 있는 프로모터 또는 그같은 전사를 제어할 수 있는 임의의 작동서열, 적합한 리보좀 결합부위(RBS)를 암호화하는 서열 및 전사와 번역의 종결을 제어할 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지입자, 또는 게놈삽입물이 될 수 있는 물질(potential genomic insert)이 될 수 있다. 적합한 숙주세포내로 들어간 벡터는 숙주 유전자와는 별개로 독립하여 복제 및 작용을 하거나 또는 숙주세포 유전자내에 삽입되게 된다. 바람직한 벡터는 pSAI이다.

본원 목적용 Bacillus 숙주세포들은 발현벡터를 기능적으로 받아들일 수 있는 것들이다. 이들은 EPO 공개공보 제 0130756호에 기재된 방법에 의해 목적하는 효소에 해로운 영향을 미치는 기타의 효소들을 분비할 수 없도록 조작된다. 서브틸리신 발현용 숙주세포는 효소적으로 활성을 지닌 중성 프로티아제 및 알카리성 프로티아제(천연 서브틸리신)가 결손된 B. subtilis BG 2036 주가 바람직하다. BG 2036 2주(strain BG 2036)의 축조방법은 EPO 공개공보 제 0130756호 및 Yang 등의 J. Bacteriol. 160 15-21(1984)에 상세히 기술되어 있다. 서브틸리신 발현용의 기타 다른 숙주세포들은 B. subtilis I-168의 혹종의 유도변이체 및 발현이 가능한 간균과(bacillus family)의 기타다른 간균들(즉, B. amyloliguefaciens 및 B. licheniformis)(EPO 공개공보 제 0130756호)을 포함한다.

본원기재된 “작동적으로 연쇄된”(operably linked)이란 2개의 DNA 지역사이의 관계를 말하는 것이고, 그들이 서로 기능적인 관계를 지니고 있음을 의미한다. 예컨데, 프로모터는 서열의 전사를 적절히 제어한다고 한다면 알카리성 프로티아제는 암호화하는 유전자 서열에 작동적으로 연쇄된다.

하기실시예는 본원의 구체예일뿐, 본원 범주의 한도를 나타내는 것이 아님에 유의해야 한다. 당업계 통상의 전문인은 기타다른 프로모터를 선택하거나, 기타다른 돌연변이를 발견 또는 사용하여 Bacillus 내 기타다른 효소를 발현시킬 수도 있을 것이다. 또한 당업계 통상의 전문인은 공증에 일반적으로 공표되어 있는 소재를 사용해 본원실시예를 반복실시해 볼 수도 있을 것이다. 본원 기재된 균주는 공중에 공표된 것으로 기탁의 필요성을 못느껴 기탁치 아니하였다.

[구체적 실시예]

[서브틸리신 유전자의 클로닝]

wells 등의 방법(1983, Nucleic Acid Res. 11 : 7911-7925에 기재된)을 사용해 B. amyloliguefaciens로부터 서브틸리신 유전자를 분리하였다. 간단히, 부분적 Sau3A 소화시킨, B. anyloliguefaciens 유래의 염색체 DNA를 BamHI 소화시킨 pBS42에 결합(ligation)시킨 뒤, 이를 사용해 E. Coli를 형질전화시켰다. pBS42는 B. subtilis가 인식하는 pUB110 유래의 복제기원, E. Coli so 플라스미드의 복제를 허용하는 pBR 322 유래의 복제기원, PC194 유래의 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제(CAT 또는 CmR,) E. Coli와 B. subtilis 모두에서 CmR을 발현할 수 있는 staphilococcus aureus 유래의 특징이 완전히 밝혀진 플라스미드(Horinouchi and weisblum, 1982)로 구성되는 플라스미드 벡터이다. 서브틸리신의 공지된 아미노산 서열을 사용해 설계한 합성 DNA 탐침을 사용해 당해 유전자를 암호화시키는 DNA를 운반하는 플라스미드(p54)를 분리하였다. 분리된 DNA 단편은 B. subtilis에 전달되었을 때 서브틸리신을 생산할 수 있는 것이있는바, 상기 DNA 서열을 번역시켰더니 공표된 알카리성 프로티아제의 아미노산 서열(wells 등, 1983, Nucleic Acid Res. 11 7911-7925)과 매치되었다.

B. amyloliguefaciens DNA 유래의, 시그날 서열의 8번째 코돈에서 3´말단 뒤 250bp까지의 서브틸리신 구조유전자를 포함하는 pS4-5(pS4의 유도체) 유래의 Sau3A BamH1 단편을 프로모터와 B. subtilis 서브틸리신 유전자의 번역서열중 첫 번째 8개의 코돈을 운반하는 750bp의 EcoR1-Sau3A 단편에 융합시켰다.(제1도) 상기와 같이 재구성되어 단지 Bacillus DNA만을 함유하는 EcoR1-BamH1 놓여진 당해 유전자를 BamH1-EcoR1 소화시킨 pBS 42에 삽입시켜 B. subtilis 내에서 서브틸리신을 생산할 수 있을 것으로 사료되는 플라스미드 pSAR을 얻었다.

B. anyloliguefaciens 서브틸리신 유전자에 융합된 B. subtilis aplE 프로모터를 운반하는 pSAR 유래의 EcoR1-BamH1 단편을 EcoR1-BamH1 소화시킨 pJH 101(Ferrari 등, Journal of Bacteriol). vol. 154, pp 1513-1515)에 결합시켰다. Escherichia Coli에서는 복제할 수 있으나 B. subtilis에서는 복제할 수 없는 결과의 플라스미드를 pSA1이라 명명하였다. 이 플라스미드는 혈질전환방법을 통해 B. subtilis 옮겨졌을 때, 염색체내 aprE 프로모터와 상동적인 부위에 삽입되었는바, 우리는 형질전환된 B. subtilis에 대한 클로람페니콜 선택(chloramphenicol selection)을 행하였다.

1.6킬로베이스(Kb)의 ClaI 단편에 함유된 pC194 유래의 CmR 유전자를 ClaI 소화시킨 pBR322에 클로닝시켰다. EcoR1와 HindⅢ를 사용해 소화시켰을 때, 당해 플라스미드는 pBR 322 기원의 몇몇 염기쌍으로 측면배열된 CmR 저항성 유전자를 방출하였다. (하기참조)

서브틸리신 유전자를 운반하는 pSAR 또는 pSAI 유래의 EcoR1-BamH1 단편을 pUC9의 합성 폴리링커지역인 EcoR1-BamH1 부위에 서브클로닝 시켰다. EcoR1 및 HindⅢ로 소화시켰을 때, 당해 플라스미드는 한쪽편이 17bp의 합성링커로 측면배열된 서브틸리신 유전자를 운반하는 2.2kb의 단편을 방출하였다. (제2도)

이들 2개의 EcoR1-HindⅢ 단편들을 함께 결합시킨 뒤, 이를 사용해 B. subtilis를 형질전환시키고, 형질전환 B. subtilis에 대한 CmR 선택을 행하였다. 형질전환시 당해 플라스미드는 PBS1의 형질도입시 볼 수 있었던 것처럼 염색체에 삽입되었다. (제3도) B. subtilis내 최종축조물은 PC194유래의 1.6kb와 짧은 링커지역으로 함께 연결된 서브틸리신 유전자로 구성된다. 링커하나는 pUC9 유래의 20pb로, 그리고 나머지 다른 하나는 EcoR1과 Clal 부위사이에 포함된 pBR322 유래의 17bp로 구성된다.

우리가 특별히 관심을 지닌, 프로티아제를 주로 생산하는 균주를 얻기위해, 우리는 거의 모든 간균에 존재하는 2가지 주요 프로티아제(알카리성 프로티아제와 중성 프로티아제)를 stahl과 Ferrar1의 (1984), J. Bacteriol., 158 : 411-418와 Yang 등의 ((1984), J. Bacteriol., 160 : 15-21에 기재된 방법을 사용해 결실시켰다. 다음엔, 상술한 플라스미드를 BG 2036에 형질전환 방법을 사용해 도입시킨 뒤, 형질전환된 BG 2036에 대한 CmR 선택을 행하였다. pSAI에 유사한 당해 플라스미드는 B. subtilis의 서브틸리신 프로모터에 의해 제공된 상동지역내 염색체에 삽입되었다. (우리는 결코 어떠한 복제하는 플라스미드도 검출할 수 없었다)(제3도) 적당한 제한효소로 소화시킨 염색체 DNA에 대한 서던블롯(Southernblot)과 PBSI 맵핑(mapping) 실험은 적당크기의 단편들이 삽입되어 존재함을 보여주었다.

대량생산을 위하여 우리는 B. subtilis의 유전연구에 일반적으로 사용되는 방법인 능력세포(competent cell)형질전환 방법 또는 PBS1 형질도입법을 사용하여 균주의 염색체에 분비효소의 분비량을 증가시키는 것으로 알려진 염색체 돌연변이를 일으켰다. 결과의 균주는 염색체로 삽입된 PC 194 유래의 CmR 유전자와 B. amyloliguefaciens의 서브틸리신 유전자를 운반하는, 원양성을 지니며(prototrophic) 포자형성이 가능한, B. subtilisI-168의 유도체(Catalog No. 1-A1, Bacillus Genetic Stock Center)였다.

Hpr 97, Scoc, CatA주(株)들의 축조 :

본 실시예의 모든 균주축조는 표준 B. subtilis 유전기술을 사용해 행하였다. 형질전환은 Anagnostopoulos와 Spizizen의 방법(J. Bacteriol., 81 : 741-746, 1961)을 사용하고, 형질도입은 Hoch 등의 방법(J. Bacteriol., 93 : 1925-1937, 1967) 및 박테리오파지 PBS1을 사용해 행하였다. 삽입 플라즈미드 pSAI(intergrative plasmid pSAI)를 BG 2097주(aprE와 nprE 유전자들이 결실된, 시중구입가능 균주)에 형질전환 방법으로 도입시켜 BG 3002주를 얻었다. BG 3002주로부터 제조된 DNA를 사용해, 각기 Scoc1, CatA 또는 hpr-97 클로람페니콜 저항성 돌연변이를 함유하는, IPCC 7698 2(프랑스 파리소재 Pasteur institute Culture Collection에서 구입), 1A151주(오하이오주 콜롬버스 소재 Bacillus Genetic stock center에서 구입) 및 Hpr 97주(캘리포니아주, La Jolla 소재 Dr J.A. Hoch, Research institute of Scripps clinic에서 구입)를 형질전환시켰다. 모균주(parent strain)에 특징적인 프로티아제 대량생산능(scoc, catA 및 hpr 돌연변이들의 존재에 기인하는)을 지니는가를 확인하기 위해 결과의 클로람페니콜 저항성주를 탈지유를 함유하는 고체배지(tryptose blood agar base agar, TBAB) 상에 배양하였다. 표준공개기술(Hoch 등 1967, 상기참조)을 사용해 pSAI 삽입플라스미드를 나르는 ScoC, CatA 및 Hpr균주의 PBS-1g 용균액(상기참조)을 만들었다. 이 용균액을 사용해 BG 2097주를 형질도입시켰다. 형질도입은 BG 2097에 pSAI과 함께 염색체 삽입된 서브틸리신 유전자를 도입시킴과 아울러 ScoC 또는 CatA 도는 hpr 돌연변이들이 연쇄에 의해 aprE 유전자(즉, pSAI)로 전달되도록 해준다.대략 10-20%의 클로람페니콜 저항성 형질도입체들이 대량으로 프로티아제를 생산, ScoC 또는 CatA 또는 hpr 대량생산 표현형(hyperproducing phenotype)을 획득했음을 보여주었다.

형질도입체중 일부를 1.6%의 탈지유를 함유하는 플레이트상에서 스크린한 뒤, BG 3002와 비교하였다. 플레이트상에 비교적 큰 할로(halo)를 생산한 형질도입체를 선정, BG 3008, BG 3005, 및 BG 3007 균주를 얻었다. 이같은 균주의 유전자형은 hpr 유전자가 Scoc1, CatA 또는 hpr 97 돌연변이로 각기 존재한 것을 제외하고는 동일 윤전자적(isogenic)(hisA, aprE, nprE, pSAI : CmR)이었다. 이들 형질도입체의 표본을 선정 진탕플라스크내 영양배지(nutrient broth medium)상에서 서브틸리신 생산시험을 했더니, 이들은 대량생산 돌연변이를 함유치아니한 균주보다 5-10배 많은양의 서브틸리신을, 즉, 1ℓ당 약 19-17mg의 서브틸리신을 생산하였다.

SacU(Hy) 주(株)들의 축조 :

SacU(Hy)의 특성가운데 하나는 편모생산능이 없어서 운동성이 없다는 것이다. PBS-1은 운동성 편모에 부착하기 때문에, SacU(Hy)주의 PBS-1 작업용균액(working lysafe)을 얻는 것이 불가능하다. 우리는 이같은 문제를 운동성과 프로티아제 대량생산 표현형을 지니는 자연돌연변이(speontaneous mutant)를 분리해 극복하였다. 운동성이된 돌연변이의 성질은 규명치 못하였다. 운동성 Sac(Hy)주의 용균액을 제조한뒤, 이 용액을 사용해 히스티딘 원영양성으로 pSAI 플라스미드를 함유하는 BG 3002(apr, npr, hisA)를 연쇄되기 때문에, 형질변화시켰다. SacU 유전자와 hisA 유전자는 형질도입에 의해 연쇄되기 때문에, 형질도입체들의 일부가 SacU(Hy) 32 유전자를 함유케될 것으로 예견되었다. 이같은 돌연변이의 존재는 탈지유 플레이트상에서 확인할 수 있는바, 대략 90%의 혈질도입체들이 대량생산 표현형을 보여주었다. SacU(Hy) 돌연변이를 함유하는 균주표본을 영양배지상에서 성장시켰더니 1ℓ당 35-45mg의 서브틸리신을 생산하였다. 동일방법을 SacU(Hy) 주의 PBS1 용균액으로 SCoC 또는 CatA 돌연변이를 함유하는 균주에 형질도입시켰을때도 사용하였다. SCoC(BG 3008)와 CatA(BG 3005) 돌연변이를 함유하는 균주들은 SacU(Hy)로 성공적으로 형질변환되었다. SacUCHy)32와 SCoC 또는 CatA 돌연변이를 함유하는 균주들은 탈지유 플레이트상에 개개돌연변이들을 함유한 균주가 보여주었던 것보다 더큰 투명지대를 보여주었다. 이들 균주들은 영양배지에 1ℓ당 약 55mg의 서브틸리신을 생산하였다.

SacQ(Hy) 주(株)의 축조 :

SacQ(Hy)주의 용균액을 제조하여 균주의 트레오닌 원영양성으로의 형질변환에 사용하였다. 여기서도 마찬가지로, thr 유전자와 SacQ(Hy) 유전자는 형질도입에 의해 연쇄되기 때문에, 형질도입체의 일부가 대량생산 SacQ(Hy) 유전자를 함유케될 것으로 예견되었다. 동일한 방법을 SacQ(Hy) 돌연변이만을 함유하는 또는 SacQ(Hy) 돌연변이와 SCoC 또는 CatA 돌연변이를 함께 함유하는 균주를 축조하는데 사용하였다.

3중 돌연변이의 축조 :

상술한 방법을 조합한 방법을 사용하여 SacU(Hy)32, SacQ(Hy) 및 SCoC 또는 CatA 돌연변이를 함유하는 균주를 축조하였다. 일반적으로, CAtA/scoC 돌연변이는 플라스미드 pSAI과 함께 균주내로 제일처음에 도입되고, 2번째로는 SacQ(Hy) 돌연변이가, 그리고 마지막 3번 째로는 SacU(Hy) 돌연변이가 도입된다.

[결과]

Claims

a) 효소구조 유전자 ; b) 효소구조 유전자에 작동적으로 연결된, Bacillus aprE와 nprE로 구성되는 그룹에서 선택된 기능적 프로모터 서열 ; 및 c) catA 돌연변이 및 sacQ(HY) 돌연변이, catA 돌연변이 및 sacU(HY) 돌연변이, scoC1 돌연변이 및 sacQ(HY) 돌연변이, scoC1 돌연변이 및 sacU(HY) 돌연변이 ; catA 돌연변이, sacQ 돌연변이 및 sacU 돌연변이 ; 및 scoC1 돌연변이, sacQ 돌연변이 및 sacU 돌연변이 ; 로 구성된 그룹에서 선택된, 프로모터의 전사조절에 관여하는 두 개이상의 전사조절 유전자들의 조합을 포함하는 효소대량 생산용 Bacillus(간균).
제1항에 있어서, 생산된 효소가 서브틸리신(subtilisin)인 Bacillus.
제1항에 있어서, 생산된 효소가 엔도글리코지다제 H(endoglycosidase H) 또는 리파제인 Bacillus.
제1항에 있어서, 효소의 증가된 생산이 전사조절 유전자의 대량발현에 의해 이루어진 Bacillus.
제1항에 있어서, SacU(HY) 돌연변이가 SacU(Hy) 32 돌연변이인 Bacillus.
제1항에 있어서, SacQ(HY) 대립유전자가 SacQ(Hy) 36 돌연변이인 Bacillus.
제1항에 있어서, 효소유전자가 숙주 Bacillus 세포의 게놈에 융합된 Bacillus.
제1항에 있어서, 효소의 증가된 생산이 전사 조절 유전자의 다수개 복제본으로써 Bacillus를 축조함으로써 이루어진 Bacillus.
제1항에 있어서, B. subtilis I-168로부터 유도된 Bacillus.
a) 효소구조 유전자 : 효소구조 유전자에 작동적으로 연결된, aprE와 nprE로 구성되는 그룹에서 선택된 기능적 프로모터 서열 ; 및 catA 돌연변이 및 sacQ(HY) 돌연변이, catA 돌연변이 및 sacU(HY) 돌연변이, scoC1 돌연변이 및 sacQ(HY) 돌연변이, scoC1 돌연변이 및 sacU(HY) 돌연변이 ; catA 돌연변이, sacQ 돌연변이 및 sacU 돌연변이 ; 및 scoC1 돌연변이, sacQ 돌연변이 및 sacU 돌연변이 ; 로 구성된 그룹에서 선택된, 프로모터의 전사조절에 관여하는 두 개이상의 전사조절 유전자들의 조합을 포함하는 Bacillus를 축조하는 단계 ; 및 b) 상기 Bacillus를 효소발현용으로 적합한 배지에서 성장시키는 단계를 포함하는 Bacillus내 효소를 대량생산하는 방법.
제10항에 있어서, 효소가 서브틸리신, 엔도글리코지다제 H 및 리파제로 구성되는 그룹에서 선택되는 방법.