PT1615955E - Alteração das afinidades de ligação ao fcrn ou semi-vidas séricas de anticorpos por mutagénese - Google Patents

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DESCRIÇÃO "ALTERAÇÃO DAS AFINIDADES DE LIGAÇÃO AO FcRn OU SEMI-VIDAS SÉRICAS DE ANTICORPOS POR MUTAGÉNESE"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se aos campos da imunologia e manipulação de proteínas. Em particular, a invenção refere-se a anticorpos modificados de classe IgG que possuem afinidades de ligação ao FcRn alteradas ou semi-vidas séricas alteradas como consequência de uma ou mais modificações nos aminoácidos na região Fc desses mesmos anticorpos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os anticorpos são proteínas que exibem uma especificidade de ligação a um determinado antigénio. Os anticorpos nativos (isto é, que ocorrem naturalmente ou do tipo selvagem) são normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compostos por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Tal como apresentado na Figura 1, cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por meio de uma ligação dissulfureto covalente, enquanto o número de ligações dissulfureto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada contém numa extremidade um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes. Cada 2 cadeia leve contém um domínio variável (VL) numa extremidade e um domínio constante na outra extremidade. 0 domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada.

Certas porções dos domínios variáveis diferem grandemente na sequência entre anticorpos e são responsáveis pela especificidade de ligação de cada anticorpo particular para o seu antigénio particular. Os domínios constantes não se encontram directamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções efectoras. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante das cadeias pesadas, podem ser atribuídas classes diferentes aos anticorpos ou imunoglobulinas. Existem cinco classes principais (isotipos) de imunoglobulinas em seres humanos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e muitas destas podem ainda ser divididas em subclasses (subtipos), tais como IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4 assim como IgAl e IgA2.

Uma representação esquemática da estrutura da IgG nativa é apresentada na Figura 1, onde são indicadas as várias porções da molécula de anticorpo nativa. A região constante da cadeia pesada inclui CH1, a região charneira Ch2, e CH3. A digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos Fab e Fc. 0 fragmento Fc consiste em CH2, Ch3 e parte da região charneira. A estrutura do fragmento Fc da IgGl humana foi já determinada (Deisenhofer, Biochemistry 20:2361-2370 (1981)). Nas moléculas da IgG humana, o fragmento Fc é gerado por clivagem pela papaína do N-terminal da região charneira para Cys 226. Por conseguinte, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana é normalmente definida como compreendendo desde o resíduo de 3 aminoácido na posição 226 até o terminal-C (numerada de acordo com o índice UE de Kabat, et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991); sendo que doravante o esquema de numeração da UE será aqui utilizado). A região Fc é essencial para as funções efectoras dos anticorpos. As funções efectoras incluem a iniciação de citoxicidade dependente do complemento (CDC), iniciação de fagocitose e citoxicidade mediada por células e dependente de anticorpos (ADCC) e transferência de anticorpos através de barreiras celulares por transcitose. Para além disso, a região Fc é essencial para a manutenção da semi-vida sérica de um anticorpo de classe IgG (Ward and Ghetie, Ther. Immunol. 2:77-94 (1995)).

Estudos descobriram que a semi-vida sérica de um anticorpo IgG é mediada pela ligação de Fc ao receptor Fc neonatal (FcRn). FcRn é um heterodímero que consiste em uma cadeia α transmembranar e uma cadeia β solúvel (β 2 — microglobulina). FcRn partilha uma identidade sequencial de 22-29% com moléculas MHC de Classe I e possui uma versão não funcional da ranhura MHC que faz a ligação ao peptídeo (Simister e Mostov, Nature 337:184-187 (1989)). Os domínios al e a2 da FcRn interagem com os domínios CH2 e CH3 da região Fc (Raghavan et al., Immunity 1:303-315 (1994)).

Foi proposto um modelo da forma como a FcRn poderia regular a semi-vida sérica de um anticorpo. Tal como mostrado na Figura 2, as IgGs são captadas por células endoteliais através de pinocitose não específica e depois penetram nos endossomas ácidos. O FcRn liga-se a IgG a um 4 pH ácido (<β,5) em endossomas e liberta IgG a um pH básico (>7,4) na corrente sanguínea. Consequentemente, FcRn evita que a IgG entre na via de degradação lisossomal. Quando os níveis de IgG no soro diminuem, existem mais moléculas de FcRn disponíveis para ligação da IgG pelo que uma quantidade aumentada de IgG é reaproveitada. Reciprocamente, se os níveis de IgG no soro aumentam, o FcRn fica saturado, deste modo aumentando a proporção de IgG que sofreu pinocitose que é degradada (Ghetie and Ward, Annu. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000)).

Consistentes com o modelo acima descrito, encontram-se os resultados de inúmeros estudos que suportam a correlação entre afinidade para a ligação a FcRn e a semi-vida no soro de um anticorpo (Ghetie and Ward, ibid.). Significativamente, esta correlação foi alargada a anticorpos manipulados com afinidade mais elevada para FcRn comparativamente às suas moléculas progenitoras de tipo selvagem.

Ghetie et al. provocaram mutações aleatórias na posição 252, na posição 254 e na posição 256 num fragmento charneira Fc da IgG 1 de um ratinho. Um mutante apresentou uma afinidade três vezes e meia superior para uma FcRn do ratinho e uma semi-vida de aproximadamente 23% ou 65% mais longa em duas estirpes de ratinhos, respectivamente, comparativamente ao do tipo selvagem (Ghetie et al. , Nat. Biotechnol. 15:637-640 (1997)).

Shields et al. utilizou mutagénese de detecção de alanina para alterar resíduos na região Fc de um anticorpo IgG 1 humano e depois avaliou a ligação à FcRn humana. Descobriram inúmeros mutantes com uma afinidade de ligação 5 mais elevada para a FcRn humana do que para o tipo selvagem, mas não identificaram mutações nas posições 250, 314, ou 428 (Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)).

Martin et al. propuseram a mutagénese para um número de posições na Fc IgG humana para aumentar a ligação à FcRn incluindo, entre muitas outras, as posições 250, 314 e 428. No entanto, nenhum dos mutantes propostos por Martin et al. foi construído ou testado quanto á ligação a FcRn (Martin et al., Mol. Cell 7:867-877 (2001))

Dall'Acqua et al. descreveram a mutagénese aleatória e rastreio de bibliotecas de fagos do fragmento charneira Fc de IgG 1 humana contra FcRn de ratinhos. Divulgaram uma mutagénese aleatória das posições 428-436 mas não identificaram a mutagénese na posição 428 como possuindo um efeito na afinidade de ligação da FcRn do ratinho e afirmaram que o aminoácido metionina de tipo selvagem, nesta posição, é favorável para uma ligação eficaz (Dall'Acqua et al., J. Immunol. 169:5171-5180 (2002)).

Kim et al. realizaram mutagénese aleatória da IgGl humana por meio de substituições de aminoácidos na posição 253, posição 310 ou posição 435 da região Fc. Descobriram que os fragmentos charneira de Fc-mutante diminuíram a semi-vida no soro dos ratinhos comparativamente ao fragmento charneira Fc da IgGl do tipo selvagem e concluíram que Ile253, His310 e His435 desempenham um papel muito importante na regulação da semi-vida no soro da IgG (Kim et al., Eur. J. Immunol. 29:2819-2825 (1999)).

Hornick et al. mostraram que uma simples substituição de aminoácido na posição 253 na região Fc de um anticorpo 6 quimérico IgGl humano acelera a depuração nos ratinhos e optimiza a imunocintigrafia de tumores sólidos (Hornick et al., J. Nucl. Med. 41:355-362 (2000)) A patente norte-americana N° 6,165,745 divulga um método de produção de um anticorpo com uma semi-vida biológica reduzida ao introduzir uma mutação no segmento de ADN que codifica o anticorpo. A mutação inclui uma substituição de aminoácido nas posições 253, 310, 311, 433, ou 434 do dominio charneira Fc.

As patentes norte-americanas Nos. 5 530 101; 5 585 089; 5 693 761; 5 693 762; e 6 180 370 divulgam a humanização de imunoglobulinas. A patente norte-americana N° 6 277 375 BI divulga uma composição que inclui uma molécula IgG mutante que possui uma semi-vida no soro elevada relativamente ao IgG de tipo selvagem, em que a molécula IgG mutante inclui substituições de aminoácidos: treonina por leucina na posição 252, treonina por serina na posição 254 ou treonina por fenilalanina na posição 256. É igualmente divulgada uma IgG mutante com uma substituição de aminoácido nas posições 433, 435 ou 436. A Publicação do Pedido de Patente norte-americana US 20020098193 Al e Publicação PCT No. WO 97/34621 divulgam moléculas IgG mutantes que possuem semi-vidas no soro elevadas relativamente às IgG em que a molécula IgG mutante possui, pelo menos, uma substituição de aminoácido na região charneira Fc. No entanto, não é facultado qualquer evidência experimental para mutações nas posições 250, 314 ou 428. 7 A Patente norte-americana N° 6,528,624 divulga uma variante de um anticorpo que inclui uma região Fc de IgG humana, cuja variante inclui uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições de aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 331, 333 e 334 da região Fc da IgG humana. A Publicação PCT N° WO 98/05787 divulga a deleção ou substituição de aminoácidos nas posições 310-331 do anticorpo BR96 de modo a diminuir a sua toxicidade induzida, mas não divulga as modificações de aminoácidos que resultam na ligação alterada para FcRn. A Publicação PCT N° WO 00/42072 divulga um peptideo que inclui uma região Fc variante com afinidade de ligação FcRn alterada, cujo polipeptideo inclui uma modificação de aminoácido em qualquer uma ou mais posições de aminoácidos 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 386, 388, 400, 413, 415, r 424 , 433 , 43 4 , 435, 436, 43 9, e 447 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é a do índice da UE (Kabat et al., op. cit.). A Publicação PCT N° WO 02/060919 A2 divulga uma IgG modificada que inclui um domínio constante da IgG que, por sua vez, inclui um ou mais modificações de aminoácidos relativamente a um domínio constante da IgG do tipo selvagem, em que a IgG modificada possui uma semi-vida elevada comparativamente à semi-vida de uma IgG que possui o domínio constante da IgG do tipo selvagem, e em que aquela ou mais modificações de aminoácidos se encontram em uma ou mais das posições 251, 253, 255, 285-290, 308-314, 385-389 e 428-435. No entanto, não são divulgados exemplos 8 de mutações nas posições 314 ou 428 com ligações alteradas para FcRn.

Martin, W.L. (Tese de Doutoramento intitulada, "Protein-Protein Recognition: The Neonatal Fc Receptor and Immunoglobulin G, " Califórnia Institute of Technology (2001)) propõe mutações teóricas em diversas posições de Fc da região gamma-2a constante do rato, incluindo posições 250 e 428 que podem aumentar a afinidade de ligação FcRn. Martin sugere a possibilidade de substituir, entre outras, a isoleucina por valina na posição 250, ou substituir a fenilalanina por leucina na posição 428. Martin não sugere qualquer substituição para a posição 314. Martin não demonstra afinidade de ligação aumentada para FcRn para qualquer destas mutações propostas.

As publicações acima referidas não demonstram que a semi-vida no soro ou afinidade de ligação de FcRn de um anticorpo da classe IgG possa ser alterado por modificações de aminoácidos na posição 250, posição 314 ou posição 428 da região Fc. A presente invenção utilizou modulação molecular para seleccionar resíduos FC próximos do local de contacto FcRn que poderiam ter um efeito na ligação, mas que podem não ser necessários para a ligação dependente do pH. As modificações de aminoácidos foram realizadas na posição 250, 314 ou 428 da região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina de classe IgG. As semi-vidas no soro ou afinidades de ligação FcRn de anticorpos que incluem tais modificações foram alteradas e, por conseguinte, apresentaram-se como diferentes das dos anticorpos não modificados. 9

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um anticorpo que é modificado a partir de daclizumab, compreendendo ácido glutâmico ou glutamina no residuo do aminoácido 250 e leucina ou fenilalanina no residuo do aminoácido 428 e em que os resíduos de aminoácidos são numerados pelo sistema de numeração UE, para utilização em profilaxia ou terapia, em que (a) o resíduo de aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é ácido glutâmico e o resíduo de aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é fenilalanina; (b) o resíduo de aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é glutamina e o resíduo de aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é fenilalanina ou (c) o resíduo de aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é glutamina e o resíduo aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é leucina. A presente invenção baseia-se na identificação pelos inventores de várias mutações no domínio constante de uma molécula IgG humana que alteram (isto é, aumentam ou diminuem) a afinidade da molécula IgG para FcRn. A presente invenção apresenta anticorpos modificados com afinidade de ligação FcRn e/ou semi-vida no soro modificadas relativamente ao correspondente anticorpo não modificado. A semi-viva in vivo (isto é, persistência no soro ou outros tecidos de um sujeito) de anticorpos e outras moléculas bioactivas, é um parâmetro clínico importante que determina a quantidade e frequência de administração do anticorpo (ou qualquer outra molécula farmacêutica). Deste modo, estas moléculas, incluindo os anticorpos, com semi-vida elevada 10 (ou reduzida) possuem uma importância significativa em termos farmacêuticos. A presente invenção refere-se a uma molécula modificada (de preferência um anticorpo) que possui uma semi-vida in vivo elevada (ou reduzida) por virtude da presença de um domínio constante de IgG humana modificado (de preferência proveniente de uma IgG humana) ou porção de ligação FcRn da mesma (preferencialmente o domínio Fc ou charneira Fc), em que o domínio constante da IgG, ou fragmento do mesmo, é modificado (preferencialmente por meio de uma substituição de aminoácido) para aumentar (ou diminuir) a afinidade para o FcRn.

Em particular, a presente invenção refere-se a anticorpos de classe IgG modificados, cujas semi-vidas in vivo são expandidas (ou reduzidas) pelas mudanças nos resíduos de aminoácidos em posições, identificadas por estudos estruturais que estão implicadas, directa ou indirectamente, na interacção do domínio Fc charneira com o receptor FcRn. De preferência o anticorpo de classe IgG modificado é selecionado entre o conjunto constituído por daclizumab, fontolizumab, visilizumab e M200.

Em realizações preferidas, o domínio constante (ou fragmento do mesmo) possui uma afinidade mais elevada de FcRn a um pH de 6,0 do que a um pH de 7,4. Isto significa que a dependência de pH da afinidade de ligação FcRn é mimética da dependência de pH do tipo selvagem. Em realizações alternativas, os anticorpos modificados da presente invenção podem exibir perfis de dependência de pH alterados relativamente ao do anticorpo não modificado. 11

Estes perfis de dependência de pH alterados podem ser úteis em algumas aplicações terapêuticas ou de diagnóstico.

Em algumas realizações, as modificações do anticorpo da presente invenção irão alterar a ligação FcRn e/ou a semi-vida no soro sem alterar outras funções efectoras do anticorpo tais como ADCC ou CDC. Em realizações particularmente preferidas, os anticorpos modificados da invenção não exibem alterações na ligação aos receptores Fc-gama ou Clq. Em realizações alternativas, as modificações do anticorpo da presente invenção podem resultar no aumento (ou diminuição) das funções efectoras assim como no aumento da semi-vida no soro. Em realizações particularmente preferidas, os anticorpos modificados da invenção podem ter aumentado (ou diminuído) actividades ADCC assim como aumentado a semi-vida no soro.

Deverá considerar-se que as modificações da presente invenção podem igualmente alterar (isto é, aumentar ou diminuir) a bio-disponibilidade (por exemplo, transporte para superfícies da mucosa ou outros tecidos alvo) dos anticorpos (ou outras moléculas) modificados. A presente divulgação apresenta um anticorpo modificado de classe IgG, no qual, pelo menos, um aminoácido da região constante da cadeia pesada seleccionado a partir do grupo que consiste em resíduos dos aminoácidos 250, 314 e 428 é substituído por um resíduo de aminoácido diferente do que se encontra presente no anticorpo não modificado. Preferencialmente, esta substituição altera a afinidade de ligação para FcRn e/ou semi-vida no soro dos referidos anticorpos modificados relativamente ao anticorpo tipo selvagem não modificado. A presente invenção apresenta 12 ainda um anticorpo modificado que possui uma afinidade de ligação a FcRn elevada e uma semi-vida no soro elevada comparativamente ao anticorpo não modificado, em que o resíduo do aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é substituído por ácido glutâmico ou glutamina; e o resíduo do aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é substituído por fenilalanina ou leucina. A presente invenção apresenta ainda um anticorpo modificado que possui uma afinidade de ligação elevada para FcRn e/ou uma semi-vida no soro elevada comparativamente ao anticorpo não modificado, em que (a) o resíduo do aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é substituído por ácido glutâmico e o resíduo do aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é substituído por fenilalanina; (b) o resíduo do aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é substituído por glutamina e o resíduo do aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é substituído por fenilalanina; ou (c) o resíduo do aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é substituído por glutamina e o resíduo do aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é substituído por leucina. A presente divulgação apresenta ainda um anticorpo modificado que possui uma afinidade de ligação reduzida para FcRn e/ou uma semi-vida no soro reduzida comparativamente ao anticorpo não modificado, em que o resíduo do aminoácido 314 da região constante da cadeia pesada é substituído por outro aminoácido, o qual é diferente do que se encontra presente num anticorpo não modificado. 13 A presente divulgação apresenta ainda um anticorpo modificado que possui uma afinidade de ligação reduzida para FcRn e/ou uma semi-vida no soro reduzida comparativamente ao anticorpo não modificado, em que o resíduo do aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é substituído por arginina, asparagina, ácido aspártico, lisina, fenilalanina, prolina, triptofano ou tirosina; ou o resíduo do aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é substituído por alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glicina, histidina, lisina, prolina, serina, treonina, tirosina ou valina. A presente divulgação apresenta igualmente um anticorpo que possui uma região constante substancialmente idêntica a uma região constante de classe IgG que ocorre naturalmente, em que, pelo menos, um resíduo do aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste dos resíduos 250, 314 e 428 é diferente do que se encontra presente no anticorpo de classe IgG que ocorre naturalmente, deste modo alterando a afinidade de ligação FcRn e/ou semi-vida no soro do referido anticorpo relativamente ao anticorpo que ocorre naturalmente. De preferência, o anticorpo de classe IgG que ocorre naturalmente inclui uma região constante de cadeia pesada de uma molécula IgGl, IgG2, IgG2M3, IgG3 ou IgG4 humana. Também preferencialmente, o resíduo do aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada do anticorpo que possui uma região constante substancialmente idêntica ao anticorpo de classe IgG que ocorre naturalmente é ácido glutâmico ou glutamina; ou o resíduo do aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é fenilalanina ou leucina. Ainda preferencialmente, o anticorpo que possui 14 uma região constante substancialmente idêntica a uma região constante de classe IgG que ocorre naturalmente possui um ácido glutâmico na posição 250 e o residuo de fenilalanina na posição 428; ou o residuo de aminoácido 250 é uma glutamina e o residuo do aminoácido 428 é uma fenilalanina; ou o residuo do aminoácido 250 é uma glutamina e o residuo do aminoácido 428 é uma leucina.

Por vezes, o anticorpo que possui uma região constante substancialmente idêntica à região constante do anticorpo de classe IgG que ocorre naturalmente inclui um residuo de aminoácido na posição 314 diferente do que se encontra presente no anticorpo que ocorre naturalmente, deste modo reduzindo a afinidade de ligação FcRn e/ou semi-vida no soro relativamente ao anticorpo que ocorre naturalmente. São incluídos anticorpos em que o resíduo 314 do aminoácido é alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, cisteína, ácido glutâmico, glicina, histidina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina ou valina. Numa realização preferida, o resíduo 314 do aminoácido é arginina.

Noutros casos, o anticorpo que possui uma região constante substancialmente idêntica à região constante do anticorpo de classe IgG que ocorre naturalmente inclui um resíduo de aminoácido na posição 250 seleccionado a partir do grupo que consiste de arginina, asparagina, ácido aspártico, lisina, fenilalanina, prolina, triptofano ou tirosina, deste modo reduzindo a afinidade de ligação de FcRn e/ou reduzindo a semi-vida relativamente ao anticorpo que ocorre naturalmente. De modo semelhante, o resíduo do aminoácido na posição 428 pode ser substituído por um resíduo do aminoácido seleccionado a partir do grupo que 15 consiste de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, prolina, serina, treonina, tirosina ou valina, deste modo reduzindo a afinidade de ligação de FcRn e/ou reduzindo a semi-vida relativamente ao anticorpo que ocorre naturalmente. A presente invenção apresenta ainda um método para modificar um anticorpo de classe IgG, em que o referido método compreende a substituição de pelo menos um aminoácido da região constante da cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste dos resíduos aminoácidos 250, 314 e 428 com um aminoácido que é diferente do que está presente num anticorpo não modificado, deste modo provocando uma alteração da afinidade de ligação de FcRn e/ou da semi-vida sérica do referido anticorpo não modificado. A presente invenção proporciona ainda moléculas polinucleotídicas que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo de acordo com a reivindicação 1.

De preferência, o vector de expressão é um vector de expressão replicável.

Opcionalmente, este método inclui ainda: a preparação de um segundo vector de expressão (preferencialmente um vector de expressão replicável) que inclui um promotor operacionalmente ligado ao ADN que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina complementar e ainda a transformação da referida linhagem celular com o referido segundo vector. A presente invenção inclui ainda composições e métodos farmacêuticos de profilaxia e terapia utilizando imunoglobulinas modificadas (incluindo imunoglobulinas 16 conjugadas com toxinas e radionuclídos), proteínas e outras moléculas bioactivas da invenção com semi-vidas alteradas. Encontram-se também presentemente incluídos métodos de diagnóstico que utilizam imunoglobulinas modificadas, proteínas e outras moléculas bioactivas que possuem semi-vidas alteradas. Em realizações preferidas, as modificações de aminoácidos da presente invenção podem ser utilizadas para prolongar a semi-vida no soro de um anticorpo terapêutico ou diagnóstico. Por exemplo, a presente invenção apresenta um anticorpo terapêutico ou de diagnóstico modificado de classe IgG com uma semi-vida in vivo de eliminação pelo menos aproximadamente 1,3 vezes maior do que a do anticorpo correspondente não modificado. 0 anticorpo terapêutico ou de diagnóstico modificado da divulgação em que, pelo menos, um resíduo de aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos resíduos 250, 314 e 428, é diferente do que se encontra presente no anticorpo não modificado. Em realizações preferidas, o anticorpo terapêutico ou de diagnóstico modificado possui uma semi-vida in vivo de eliminação de, pelo menos, aproximadamente 1,3 vezes, 1,5 vezes, 1,8 vezes, 1,9 vezes ou mais do que 2,0 vezes maior do que a do anticorpo correspondente não modificado. A presente invenção apresenta igualmente um anticorpo terapêutico ou de diagnóstico modificado de classe IgG com uma semi-vida in vivo de eliminação de, pelo menos, aproximadamente 1,3 vezes menor do que a do correspondente anticorpo não modificado. O anticorpo terapêutico ou de diagnóstico modificado em que, pelo menos, um resíduo de aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste dos resíduos 250, 314 e 428, é diferente do que se encontra 17 presente no anticorpo não modificado. De preferência, o anticorpo terapêutico ou de diagnóstico modificado possui uma semi-vida in vivo de eliminação de, pelo menos, aproximadamente 1,3 vezes, 1,5 vezes, 1,8 vezes, 2,0 vezes, 2,3 vezes, 2,5 vezes, 2,8 vezes ou mais do que 3,0 vezes menor do que a do anticorpo correspondente não modificado. De preferência, o anticorpo terapêutico é selecionado entre o conjunto constituído por daclizumab, fontolizumab, visilizumab e M200. A presente invenção apresenta ainda um anticorpo terapêutico ou de diagnóstico modificado de classe IgG com uma área in vivo sob a curva concentração-tempo de, pelo menos, aproximadamente 1,3 vezes maior do que a do correspondente anticorpo não modificado. O anticorpo terapêutico ou de diagnóstico modificado em que, pelo menos, um resíduo de aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste dos resíduos 250, 314 e 428, é diferente do que se encontra presente no anticorpo não modificado. Em realizações preferidas, o anticorpo terapêutico ou de diagnóstico modificado possui uma semi-vida in vivo de eliminação de, pelo menos, aproximadamente 1,3 vezes, 1,5 vezes, 1,8 vezes, 2,0 vezes, 2,3 vezes, 2,6 vezes, 2,8 vezes ou mais do que 3,0 vezes maior do que a do anticorpo correspondente não modificado.

Em realizações alternativas preferidas, as modificações de aminoácidos da presente invenção podem também ser utilizadas para reduzir a semi-vida no soro de um anticorpo terapêutico ou diagnóstico. Estes anticorpos terapêuticos ou diagnósticos são bem conhecidos na técnica e encontram-se indicados na seguinte descrição da invenção. 18 A invenção também proporciona um anticorpo terapêutico modificado que compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia leve da SEQ ID NO: 118 e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada selecionada entre as SEQ ID NOs: 122, 123, 127 e 128. A invenção também proporciona um vector que compreende um polinucleótido que codifica uma ou várias destas sequências de aminoácido de cadeia leve ou pesada. A presente invenção proporciona ainda uma célula hospedeira que compreende este vector.

Além disso a invenção proporciona: um anticorpo terapêutico modificado que compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia leve da SEQ ID NO: 129 e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada selecionada entre as SEQ ID NOs: 130-134; um anticorpo terapêutico modificado que compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia leve da SEQ ID NO: 135 e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada selecionada entre as SEQ ID NOs: 136-140; e um anticorpo terapêutico modificado que compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia leve da SEQ ID NO: 141 e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada selecionada entre as SEQ ID NOs: 142-146. A invenção proporciona ainda vectores que compreendem uma ou várias das sequências de aminoácidos de cadeias pesada e/ou leve dos anticorpos terapêuticos modificados referidos antes e a invenção proporciona uma célula hospedeira que compreende qualquer um dos vectores referidos antes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Ilustração da Estrutura da Molécula IgG

Figura 2. Via de Reaproveitamento de Moléculas IgG. 19

Figura 3A. Sequências de Aminoácidos de OST577-IgG2M3 e OST577-IgGl com Posições 250, 314 e 428 da Cadeia Pesada em Relevo "OST577-VH" (SEQ ID NO: 1) representa a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de OST577-IgG2M3 ou OST577-IgGl. "IgG2M3-CH" (SEQ ID No: 2) representa a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de OST577-IgG2M3. "IgGl-CH" (SEQ ID NO: 3) representa a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de OST577-IgGl. "OST577-VL" (SEQ ID NO: 4) representa a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de OST577-IgG2M3 ou OST577-IgGl. "LAMBDA2-CL" (SEQ ID NO: 5) representa a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve de OST577-IgG2M3 ou OST577-IgGl.

Figura 3B. Sequências de Aminoácidos das Regiões Constantes da OST577-IgG2M3 Modificada em Comparação com a OST577-IgG2M3 Não Modificada (Vide Tabela 1 para a SEQ ID NO de cada sequência de aminoácidos divulgada).

Figura 3C. Sequências de Aminoácidos das regiões Constantes da OST577-IgGI Modificada em Comparação com a OST577-IgGl Não Modificada.

Figura 3D. Sequências de Aminoácidos de HulD10-IgG2M3 e HulDIO-IgGl com Posições 250, 314 e 428 da Cadeia Pesada em Relevo "HulDIO-VH" (SEQ ID NO: 6) representa a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de HulDlO-IgG2M3 ou HulDIO-IgGl. "IgG2M3-CH" (SEQ ID No: 2) representa a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de HulD10-IgG2M3. "IgGl-CH" (SEQ ID NO: 7) representa a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de HulDIO-IgGl. "HulDIO-VL" (SEQ ID NO: 8) 20 representa a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de HulDl0-IgG2M3 ou HulDIO-IgGl. "KAPPA-CL" (SEQ ID NO: 9) representa a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve de HulDl0-IgG2M3 ou HulDlO-IgGl.

Figura 3E. Sequências de Aminoácidos das regiões Constantes da HulDl0-IgG2M3 Modificada em Comparação com a HulDl0-IgG2M3 Não Modificada.

Figura 3F. Sequências de Aminoácidos das regiões Constantes da HulDIO-IgGl Modificada em Comparação com a HulDIO-IgGl Não Modificada.

Figura 3G. Sequências de Aminoácidos de HulD10-IgG3 e HulD10-IgG4 com Posições 250 e 428 da Cadeia Pesada em Relevo "HulDIO-VH" (SEQ ID NO: 6) representa a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de HulDlO-IgG3 ou HulDlO-IgG4. "IgG3-CH" (SEQ ID No: 113) representa a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de HulD10-IgG3. "IgG4-CH" (SEQ ID NO: 114) representa a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de HulD10-IgG4. "HulDIO-VL" (SEQ ID NO: 8) representa a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de HulD10-IgG3 ou HulD10-IgG4. "KAPPA-CL" (SEQ ID NO: 9) representa a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve de HulD10-IgG3 ou HulD10-IgG4.

Figura 3H. Sequências de Aminoácidos das regiões Constantes do mutante HulDl0-IgG3 M428L (SEQ ID NO: 115) em Comparação com a HulD10-IgG3 Não Modificada.

Figura 31. Sequências de Aminoácidos das regiões Constantes dos mutantes HulD10-IgG4 M428L (SEQ ID NO: 116) 21 e HulD10-IgG4 T250Q/M428L (SEQ ID NO: 117) em Comparação com a HulD10-IgG4 Não Modificada.

Figura 4. Ilustração do Método PCR Overlap-Extension

Figura 5A. Mapa de Restrição do Vector de Cadeia Pesada pVAg2M3-OST577

Figura 5B. Mapa de Restrição do Vector de Cadeia Pesada pVAgl.N-0ST5 7 7

Figura 6. Mapa de Restrição do Vector de Cadeia Leve pVAX2-OST577

Figura 7A. Mapa de Restrição do Vector de Cadeia Pesada pVAg2M3-HulD10

Figura 7B. Mapa de Restrição do Vector de Cadeia Pesada pVAgl.N-HulD10

Figura 7C. Mapa de Restrição do Vector de Cadeia Pesada

pHuHCg3.Tt.D-HulDIO

Figura 7D. Mapa de Restrição do Vector de Cadeia Pesada pHuHCg4.Tt.D-HulDIO

Figura 8. Mapa de Restrição do Vector de Cadeia Leve pVk-HulDl0

Figura 9A. Mapa de Restrição do Vector FcRn Humano pDL2 0 8

Figura 9B. Mapa de Restrição do Vector FcRn de Rhesus pDL410

Figura 10A. Análise SDS-PAGE de Anticorpos OST577-IgG2M3 Tipo Selvagem e Mutantes 22

Anticorpos OST577-IgG2M3 purificados do tipo selvagem e mutantes foram analisados por meio de SDS-PAGE mediante condições redutoras tal como descrito no Exemplo 5.

Figura 10B. Análise SDS-PAGE de Anticorpos OST577-IgGl do Tipo Selvagem e Anticorpos OST577-IgGl Purificados do Tipo selvagem e anticorpos mutantes foram analisados por meio de SDS-PAGE mediante condições redutoras, tal como descrito no Exemplo 5.

Figura 11A. Ensaio de Ligação Competitiva de Ponto Simples de Vários Mutantes de Posição 250 de OST577-IgG2M3 para a FcRn Humano A ligação do anticorpo OST577-IgG2M3 biotinilado para FcRn humano em células NSO transfectadas na presença de anticorpos competitivos OST577-IgG2M3 mutantes de tipo selvagem ou na posição 250 em FBB, com pH 6,0, foi detectada com RPE conjugada com estreptavidina e analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 6.

Figura 11B. Ensaio de Ligação Competitiva de Ponto Simples de Vários Mutantes de Posição 314 de OST577-IgG2M3 para a FcRn Humano A ligação do anticorpo OST577-IgG2M3 biotinilado para FcRn humano em células NSO transfectadas na presença de anticorpos competitivos OST577-IgG2M3 mutantes de tipo selvagem ou na posição 314 em FBB, com pH 6,0, foi detectada com RPE conjugada com estreptavidina e analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 6. 23

Figura 11C. Ensaio de Ligação Competitiva de Ponto Simples de Vários Mutantes de Posição 428 de OST577-IgG2M3 para a FcRn Humana A ligação do anticorpo OST577-IgG2M3 biotinilado para FcRn humano em células NSO transfectadas na presença de anticorpos competitivos OST577-IgG2M3 mutantes de tipo selvagem ou na posição 428 em FBB, com pH 6.0, foi detectada com RPE conjugada com estreptavidina e analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 6.

Figura 12A. Ensaio de Ligação Competitiva de Anticorpos OST577-IgG2M3 do Tipo Selvagem e Mutantes para a FcRn Humana A ligação do anticorpo HuEP5C7-IgG2M3 biotinilado para FcRn humana em células NSO transfectadas na presença de concentrações elevadas de anticorpos competitivos OST577-IgG2M3 do tipo selvagem ou mutantes em FBB, com pH 6,0, foi detectada com conjugado RPE com estreptavidina e analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 6.

Figura 12B. Ensaio de Ligação Competitiva de Anticorpos OST577-IgG2M3 do Tipo Selvagem e Mutantes para a FcRn Humana A ligação do anticorpo OST577-IgG2M3 biotinilado para FcRn humana em células NSO transfectadas na presença de concentrações crescentes de anticorpos competitivos OST577-IgG2M3 do tipo selvagem ou mutantes em FBB, com pH 6,0, foi detectada com RPE conjugada com estreptavidina e analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 6. 24

Figura 13. Ligação de Anticorpos a Células Transfectadas com FcRn Humana versus Células Não Transfectadas A ligação dos anticorpos 0ST577-IgG2M3 de tipo selvagem ou mutantes para FcRn humana em células NSO transfectadas ou células NSO não transf ectadas em FBB, com pH 6,0, foi analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 7.

Figura 14. Ensaio de Ligação Competitiva de Anticorpos OST577-IgG2M3 do Tipo Selvagem e Mutantes para a FcRn Humana a 37°C A ligação do anticorpo OST577-IgG2M3 biotinilado para FcRn humana em células NSO transfectadas na presença de concentrações elevadas de anticorpos competitivos OST577-IgG2M3 do tipo selvagem ou mutantes em FBB, com pH 6,0, foi detectada com RPE conjugada com estreptavidina e analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 7. Todas as incubações foram realizadas a 37°C.

Figura 15A. Ligação dependente de pH e Libertação de Anticorpos OST577-IgG2M3 de Tipo Selvagem e Mutantes para a FcRn Humana A ligação e libertação dos anticorpos OST577-IgG2M3 de tipo selvagem ou mutantes para FcRn humana em células NSO transfectadas em FBB, com pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0 foi analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 7.

Figura 15B. Ligação dependente de pH e Libertação de Anticorpos OST577-IgGl de Tipo Selvagem e Mutantes para a FcRn Humana 25 A ligação e libertação dos anticorpos OST577-IgGl de tipo selvagem ou mutantes para FcRn humana em células NSO transfectadas em FBB, com pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0 foi analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 7.

Figura 15C. Ligação dependente de pH e Libertação de Anticorpos OST577-IgGl de Tipo Selvagem e Mutantes para a FcRn Humana A ligação e libertação dos anticorpos OST577-IgGl de tipo selvagem ou mutantes para FcRn humana em células NSO transfectadas em FBB, com pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0 foi analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 7.

Figura 15D. Ligação dependente de pH e Libertação de Anticorpos OST577-IgG2M3 de Tipo Selvagem e Mutantes para a FcRn de Rhesus A ligação e libertação dos anticorpos OST577-IgG2M3 de tipo selvagem ou mutantes para FcRn de rhesus em células NSO transfectadas em FBB, com pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0 foi analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 7.

Figura 15E. Ligação dependente de pH e Libertação de Anticorpos OST577-IgGl de Tipo Selvagem e Mutantes para a FcRn de Rhesus A ligação e libertação dos anticorpos OST577-IgGl de tipo selvagem ou mutantes para FcRn de rhesus em células NSO transfectadas em FBB, com pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0 foi analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 7. 26

Figura 16A. Ensaio de Ligaçao Competitiva de Anticorpos OST577-IgG2M3 do Tipo Selvagem e Mutantes para HBsAg A ligação de anticorpos 0ST577-IgG2M3 do tipo selvagem ou mutantes para HBsAg foi analisada com base numa técnica ELISA de competição, tal como descrito no Exemplo 8.

Figura 16B. Ensaio de Ligação Competitiva de Anticorpos OST577-IgGl do Tipo Selvagem e Mutantes para HBsAg A ligação de anticorpos OST577-IgGl do tipo selvagem ou mutantes a HBsAg foi analisada com base numa técnica ELISA de competição, tal como descrito no Exemplo 8.

Figura 17A. Ensaio de Ligação de Anticorpos HulDlO-IgG2M3 de Tipo Selvagem e Mutantes para Alelo HLA-DR Cadeia β A ligação de anticorpos HulDl0-IgG2M3 do tipo selvagem ou mutantes para células Raji foi analisada com base num ensaio de ligação FACS, tal como descrito no Exemplo 8.

Figura 17B. Ensaio de Ligação de Anticorpos HulDIO-IgGl de Tipo Selvagem e Mutantes para Alelo HLA-DR Cadeia β A ligação de anticorpos HulDIO-IgGl do tipo selvagem ou mutantes para células Raji foi analisada com base num ensaio de ligação FACS, tal como descrito no Exemplo 8.

Figura 18A. Ensaio ADCC de Anticorpos HulDIO-IgGl e HulDl0-IgG2M3 do Tipo Selvagem e Mutantes Utilizando PBMC a Partir de um Dador 158V/V A actividade ADCC dos anticorpos HulDIO-IgGl e HulDlO-IgG2M3 do tipo selvagem e mutantes em células Raji foi determinada utilizando PBMC isolado de um dador que 27 transportava alelos 158V/V FcyRIII homozigotos, tal como descrito no Exemplo 8.

Figura 18B. Ensaio ADCC de Anticorpos HulDIO-IgGl e HulD10-IgG2M3 do Tipo Selvagem e Mutantes Utilizando PBMC a Partir de um Dador 158F/F A actividade ADCC dos anticorpos HulDIO-IgGl e HulDlO-IgG2M3 do tipo selvagem e mutantes em células Raji foi determinada utilizando PBMC isolado de um dador que transportava alelos 158F/F FcyRIII homozigotos, tal como descrito no Exemplo 8.

Figura 19. Farmacocinéticas dos Anticorpos OST577-IgG2M3 de tipo selvagem e anticorpos variantes do rhesus macaque

As concentrações médias no soro e observadas e modelo ((pg/ml) e desvios padrão dos anticorpos OST577-IgG2M3 do tipo selvagem e variantes administrados por perfusão a uma dose de 1 mg/kg a grupos de quatro rhesus macaques foi registada em função de tempo (dias após perfusão), tal como descrito no Exemplo 9.

Figura 20. Farmacocinéticas dos Anticorpos OST577-IgGl de tipo selvagem e anticorpos variantes do rhesus macaque

As concentrações médias no soro e observadas e modelo ((pg/ml) e desvios padrão dos anticorpos OST577-IgGl do tipo selvagem e variantes administrados por perfusão a uma dose de 1 mg/kg a grupos de quatro rhesus macaques foi registada em função de tempo (dias após perfusão), tal como descrito no Exemplo 10. 28

Figura 21A. Ligação dependente de pH e Libertação de Anticorpos HulD10-IgG3 de Tipo Selvagem e Mutantes para a FcRn Humana A ligação e libertação dos anticorpos HulD10-IgG3 de tipo selvagem ou mutantes para FcRn humana em células NSO transfectadas em FBB, com pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0 foi analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 11.

Figura 21B. Ligação dependente de pH e Libertação de Anticorpos HulD10-IgG4 de Tipo Selvagem e Mutantes para a FcRn Humana A ligação e libertação dos anticorpos HulD10-IgG4 de tipo selvagem ou mutantes para FcRn humana em células NSO transfectadas em FBB, com pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0 foi analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 11.

Figura 21C. Ligação dependente de pH e Libertação de Anticorpos HulD10-IgG3 de Tipo Selvagem e Mutantes para a FcRn de Rhesus A ligação e libertação dos anticorpos HulD10-IgG3 de tipo selvagem ou mutantes para FcRn de rhesus em células NSO transfectadas em FBB, com pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0 foi analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 11.

Figura 21D. Ligação dependente de pH e Libertação de Anticorpos HulD10-IgG4 de Tipo Selvagem e Mutantes para a FcRn de Rhesus A ligação e libertação dos anticorpos HulD10-IgG4 de tipo selvagem ou mutantes para FcRn de rhesus em células 29 NSO transfectadas em FBB, com pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0 foi analisada por meio de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 11.

Figura 22. Sequências de aminoácidos de Daclizumab com diversas mutações de ligação a FcRn.

Figura 23. Sequências de aminoácidos de Fontolizumab com diversas mutações de ligação a FcRn.

Figura 24. Sequências de aminoácidos de Visilizumab com diversas mutações de ligação a FcRn.

Figura 25. Sequências de aminoácidos de M200 com diversas mutações de ligação a FcRn.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS I. Anticorpos modificados com afinidade de ligação FcRn alterada e/ou semi-vidas no soro A fim de proporcionar uma melhor compreensão desta invenção são apresentadas inúmeras definições.

Tal como presentemente utilizado, os termos "imunoglobulina" e "anticorpo" designam proteínas que consistem num ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por genes da imunoglobulina. Os genes da imunoglobulina reconhecidos incluem o capa, lambda, alfa, gama (γΐ, γ2, γ3, γ4), delta, épsilon e genes de regiões constantes mu, assim como os genes de regiões variáveis assim como a miríade de genes de região variável da imunoglobulina. As "cadeias leves" de imunoglobulina de comprimento total (cerca de 25 Kd ou 214 aminoácidos) são codificadas por um gene de região variável capa ou lambda 30 no terminal NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) e um gene de região constante capa ou lambda no terminal COOH. As "cadeias pesadas" de imunoglobulina de comprimento total (cerca de 50 Kd ou 446 aminoácidos) são semelhantemente codificadas por um gene de região variável de cadeia pesada (aproximadamente 116 aminoácidos) e por um dos outros genes de região constante acima mencionados, por exemplo, gama (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos).

Uma forma de imunoglobulina constitui a unidade estrutural básica de um anticorpo. Esta forma é um tetrâmero e consiste de dois pares idênticos de cadeias de imunoglobulina, sendo que cada par possui uma cadeia leve e uma cadeia pesada. Em cada par, as regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada são, conjuntamente responsáveis pela ligação a um antigénio e as regiões constantes são responsáveis pelas funções efectoras do anticorpo. Para além de anticorpos tetraméticos, as imunoglobulinas podem existir numa variedade de outras formas incluindo, por exemplo, Fv, Fab, e (Fab')2f assim como anticorpos híbridos bifuncionais (por exemplo, Lanzavecchia and Scheidegger, Eur. J. Immunol. 17:105-111 (1987)) e em cadeias simples (e.g., Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:5879-5883 (1988), e Bird et al., Science, 242:423-426 (1988). (Vide, normalmente, Hood et al., "Immunology", 2 a ed., Benjamin, New York (1984), e Hunkapiller and Hood, Nature, 323:15-16 (1986)). O termo "anticorpos geneticamente alterados" refere-se a anticorpos em que a sequência de resíduos de aminoácidos foi alterada da de um anticorpo nativo ou do tipo selvagem. Devido à importância de técnicas do ADN recombinante, a presente invenção não se limita à modificação de sequências 31 de aminoácidos encontradas em anticorpos naturais. Tal como abaixo descrito, os anticorpos anteriormente manipulados podem ser redesenhados de acordo com a presente invenção de modo a se obter as caracteristicas desejadas da afinidade de ligação de FcRn e/ou semi-vida no soro. As variantes possíveis de anticorpos modificados úteis com a presente invenção são inúmeros e variam em mudar apenas um ou alguns aminoácidos para o re-concepção completa da, por exemplo, variável ou região constante. As mudanças na região constante irão, de modo geral, ser realizadas de modo a optimizar ou alterar características, tais como, complementar a fixação, interacção com vários receptores Fc-gama e outras funções efectoras. As mudanças na região variável irão ser realizadas de modo a optimizar as características de ligação ao antigénio.

Um anticorpo que possua uma região constante substancialmente idêntica a uma região constante de anticorpo de classe IgG que ocorre naturalmente refere-se a um anticorpo, no qual qualquer região constante presente é substancialmente idêntica, isto é, pelo menos, aproximadamente 85-90%, e preferencialmente, pelo menos, 95% idêntica à sequência de aminoácidos da região constante do anticorpo de classe IgG que ocorre naturalmente.

Em muitas utilizações preferidas da presente invenção, incluindo utilização in vivo de anticorpos modificados em humanos para e em ensaios de detecção in vitro, pode ser preferível utilizar anticorpos quiméricos, primatizados, humanizados ou humanos que tenham sido modificados (isto é, mudados) de acordo com a presente invenção. 32 0 termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo, no qual a região constante deriva de um anticorpo de uma espécie (tipicamente humana) e a região variável deriva de um anticorpo de outra espécie (tipicamente roedora). Métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Morrison, Science 229:1202-1207 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214-221 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); Patente Norte-americana Nos. 5,807,715; 4,816,567; e 4,816,397. O termo "anticorpo primatizado" refere-se a um anticorpo que inclui regiões variáveis de macaco e regiões constantes humanas. Métodos para produzir anticorpos primatizados são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patente Norte-americana Nos. 5,658,570; 5,681,722; and 5,693,780. 0 termo "anticorpo humanizado" ou "imunoglobulina humanizada" refere-se a uma imunoglobulina que inclui uma estrutura humana, pelo menos uma e preferencialmente todas as regiões que determinam a complementaridade (CDRs) a partir de um anticorpo não humano e na qual qualquer região constante presente é substancialmente idêntica à região constante de imunoglobulina humana, isto é, pelo menos aproximadamente 85-90% e preferencialmente, pelo menos, 95% idêntica. Deste modo, todas as partes de uma imunoglobulina humana, excepto possivelmente as CDRs, são substancialmente idênticas às partes correspondentes de uma ou mais sequências de imunoglobulina humana nativa. Frequentemente, os resíduos da estrutura nas regiões da estrutura humana serão substituídas pelo resíduo correspondente a partir de um anticorpo CDR dador para alterar, preferencialmente 33 optimizar, a ligação do antigénio. Estas substituições de estrutura são identificadas por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, ao se modelar as interacções da CDR e dos resíduos da estrutura para identificar resíduos da estrutura importantes para a ligação de antigénio e comparação de sequências para identificar resíduos de estrutura incomuns em determinadas posições. Vide, por exemplo, Queen et al., patente Norte-americana Nos: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 6,180,370.

Os anticorpos podem ser humanizados utilizando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, enxertos de CDR (EP 239,400; Publicação PCT WO 91/09967; Patente Norte-americana Nos. 5,225,539; 5,530,101 e 5,585,089), estratificação ou resurfacing (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Mol. Immunol., 28:489-498 (1991); Studnicka et aL, Prot. Eng. 7:805-814 (1994); Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 91:969-973 (1994), e shuffling da cadeia (Patente Norte-americana No. 5,565,332).

Os anticorpos completamente humanos podem ser desejáveis para tratamento terapêutico de doentes humanos. Os anticorpos humanos podem ser produzidos através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo métodos de visualização do fago acima descritos utilizando bibliotecas de anticorpos derivadas de sequências de imunoglobulina humana. Vide Patente Norte-americana Nos. 4,444,887 e 4,716,111; e Publicações PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; e WO 91/10741.

Os anticorpos humanos podem igualmente ser produzidos utilizando ratinhos transgénicos, os quais são incapazes de 34 expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana. Para se ter uma visão desta tecnologia para produzir anticorpos humanos, vide Lonberg and Huszar, Int Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Para uma discussão detalhada sobre esta tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produzir estes anticorpos, vide, por exemplo, Publicações PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patente Europeia No. 0 598 877; Patente Norte-americana Nos. 5 413 923; 5 625 126; 5 633 425; 5 569 825; 5 661 016; 5 545 806; 5 814 318; 5 885 793; 5 916 771; e 5 939 598.

Para além disso, companhias como Abgenix, Inc. (Fremont, CA) e Medarex (Princeton, NJ) podem ser responsáveis por facultar anticorpos humanos direccionados contra um antigénio seleccionado utilizando tecnologia semelhante à acima descrita.

Os anticorpos completamente humanos que reconhecem um epítopo seleccionado podem ser gerados utilizando uma técnica referida como "selecção guiada" Nesta abordagem é utilizado um anticorpo monoclonal não humano, por exemplo, um anticorpo de um rato, para conduzir a selecção de um anticorpo completamente humano reconhecendo o mesmo epítopo (Jespers et al., Biotechnology 12: 899-903 (1988).

Tal como presentemente utilizado, o termo "alterar" pode designar "aumentar" ou "reduzir". A invenção é definida nas reivindicações em anexo. A presente divulgação apresenta um anticorpo modificado de classe IgG, no qual, pelo menos, um aminoácido da região constante da cadeia pesada seleccionada a partir do grupo 35 que consiste em resíduos de aminoácidos 250, 314, 314 e 428 é substituída por um resíduo de aminoácido diferente do que se encontra presente no anticorpo não modificado.

Os anticorpos de classe IgG incluem anticorpos de IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. A região constante da cadeia pesada de uma molécula IgG é indicada na Figura 1. A enumeração dos resíduos na cadeia pesada é a numeração do índice da UE (Kabat et al., op. cit.). A substituição pode ser efectuada na posição 250, 314 ou 428 isoladamente ou em qualquer combinação das mesmas, tais como posições 250 e 428, ou nas posições 250 e 314, ou nas posições 314 e 428, ou nas posições 250, 314, e 428, sendo as posições 250 e 428 a combinação preferida.

Para cada posição, o aminoácido substituinte pode ser qualquer resíduo de aminoácido do que se encontra presente nessa posição do anticorpo não modificado.

Para a posição 250, o resíduo de aminoácido substituinte pode ser qualquer resíduo de aminoácido que não a treonina, incluindo, mas não se limitando a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, valina, triptofano ou tirosina.

Para a posição 314, o resíduo de aminoácido substituinte pode ser qualquer resíduo de aminoácido que não a leucina, incluindo, mas não se limitando a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptofano ou tirosina. Para a posição 428, o resíduo de 36 aminoácido substituinte pode ser qualquer resíduo de aminoácido que não a metionina, incluindo, mas não se limitando a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido qlutâmico, fenilalanina, qlicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, asparaqina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptofano ou tirosina. A presente divulgação apresenta anticorpos de classe IgG que incluem pelo menos uma das substituições dos aminoácidos acima mencionados. Por exemplo, a presente invenção apresenta as regiões constantes IgG2M3 modificadas que incluem as substituições acima mencionadas na posição 250, 314 e/ou 428. As sequências de aminoácidos de algumas substituições específicas (isto é, mutações) da região constante apresentadas pela presente invenção são

divulgadas no Quadro Quadro 1 1 (SEQ ID NOs: 10 -66 ) e Figura 3B . Aminoácido substituinte 250 314 428 Alanina T250A; 10 SEQ ID NO: L314A; NO: 29 SEQ ID M428A; NO: 48 SEQ ID Cisteína (C) T250C; 11 SEQ ID NO: L314C; NO: 30 SEQ ID M428C; NO: 49 SEQ ID Ácido Aspártico T 2 5 0 D; 12 SEQ ID NO: L314D; NO: 31 SEQ ID M428D; NO: 50 SEQ ID Ácido Glutâmico (E) T250E; SEQ ID NO 13 L314E; NO: 32 SEQ ID M428E; NO: 51 SEQ ID Fenilalanina(F) T250F; 14 SEQ ID NO: L314F; NO: 33 SEQ ID M428F; NO: 52 SEQ ID 37

Aminoácido substituinte 250 314 428 Glicina (G) T250G; SEQ ID NO: L314G; SEQ ID M428G; SEQ ID 15 NO: 3 4 NO: 53 Histidina (H) T250H; SEQ ID NO: L314H; SEQ ID M428H; SEQ ID 16 NO: 35 NO: 5 4 Isoleucina (I) T 2 5 01; SEQ ID NO: L314I; SEQ ID M428H; SEQ ID 17 NO: 36 NO: 55 Lisina (K) T250K; SEQ ID NO: L314H; SEQ ID M428K; SEQ ID 18 NO: 3 7 NO: 56 Leucina (L) T 2 5 0 L; SEQ ID NO: Tipo Selvagem M428H; SEQ ID 19 NO: 5 7 Metionina (M) T250M; SEQ ID NO: L314M; SEQ ID Tipo Selvagem 20 NO: 3 8 Asparagina (N) T250N; SEQ ID NO: L314N; SEQ ID M428N; SEQ ID 21 NO: 39 NO: 58 Prolina (P) T250P; SEQ ID NO: L314P; SEQ ID M428P; SEQ ID 22 NO: 4 0 NO: 59 Glutamina (Q) T250Q; SEQ ID NO: L314Q; SEQ ID M428Q; SEQ ID 23 NO: 41 NO: 6 0 Arginina (R) T250R; SEQ ID NO: L314R; SEQ ID M428R; SEQ ID 24 NO: 42 NO: 61 Serina (S) T250S; SEQ ID NO: L314S; SEQ ID M428S; SEQ ID 25 NO: 43 NO: 62 Treonina (T) Tipo Selvagem L314T; SEQ ID M428T; SEQ ID NO: 4 4 NO: 63 38

Aminoácido 250 314 428 substituinte Valina (V) T250V; SEQ ID NO: L314V; SEQ ID M428V; SEQ ID 26 NO: 45 NO: 6 4 Triptofano (W) T250W; SEQ ID NO: L314W; SEQ ID M428W; SEQ ID 27 NO: 46 NO: 65 Tirosina (Y) T250Y; SEQ ID NO: L314Y; SEQ ID M428Y; SEQ ID 28 NO: 4 7 NO: 6 6

Numa realização preferida, a presente invenção apresenta um anticorpo modificado com uma semi-vida alterada ou afinidade de ligação FcRn relativamente a um anticorpo não modificado. A presente divulgação apresenta ainda um anticorpo modificado de classe IgG, no qual, pelo menos, um aminoácido da região constante de cadeia pesada seleccionado do grupo que consiste de resíduos de aminoácidos 250, 314, e 428 é substituído com um outro aminoácido, o qual é diferente do que se encontra presente no anticorpo não modificado, deste modo alterando a afinidade de ligaçao ao F cRN e/ou semi-vida no soro do anticorpo modificado comparativamente à afinidade de ligaçao e/ou semi-vida no soro do referido anticorpo não modificado.

Os anticorpos não modificados da presente invenção incluem anticorpos naturais de todas as espécies. 0 termo "anticorpos naturais" designa todos os anticorpos produzidos por um animal hospedeiro. Os anticorpos naturais exemplarmente não limitativos da presente invenção incluem anticorpos derivados de humanos, galinhas, cabras e 39 roedores (por exemplo, ratos, ratinhos, hamsters e coelhos), incluindo roedores transgénicos geneticamente manipulados para produzir anticorpos humanos (vide, e.g., Lonberg et al., W093/12227; Patente Norte-americana No. 5,545,806; e Kucherlapati, et al., WO91/10741; Patente Norte-americana No. 6,150,584).

Os anticorpos não modificados da presente invenção incluem igualmente anticorpos recombinantes que possuem as mesmas sequências de aminoácidos de um anticorpo natural, ou anticorpos geneticamente alterados que mudaram as sequências de aminoácidos comparativamente aos anticorpos naturais. Estes podem ser produzidos em qualquer sistema de expressão, incluindo sistemas de expressão procariótica e eucariótica ou utilizando métodos de visualização do fago (vide, e.g., Dower et aL, W091/17271 e McCafferty et al., WP92/01047; Patente Norte-americana No. 5,969,108).

Os anticorpos não modificados da presente invenção incluem igualmente anticorpos quiméricos, primatizados, humanizados e humanos (vide discussão acima). Consequentemente, um anticorpo modificado da presente invenção pode ser produzido ao se substituir um resíduo de aminoácido na posição 250, 314 ou 428 num anticorpo humanizado, primatizado ou quimérico, em que o anticorpo humanizado, primatizado ou quimérico anterior teve origem num anticorpo nativo.

Preferencialmente, os anticorpos quiméricos incluem regiões variáveis derivadas de roedores de regiões constantes derivadas de humanos de modo a que os anticorpos quiméricos tenham semi-vidas mais longas e sejam menos imunogénicos quando administrados para um sujeito humano. 40

Os anticorpos primatizados incluem regiões variáveis derivadas de primatas e regiões constantes derivadas de humanos. Os anticorpos humanizados incluem tipicamente, pelo menos, um CDR dos anticorpos dadores (por exemplo, murina ou anticorpos de galinhas) e estruturas humanas de cadeias pesadas e/ou leves. Por vezes, alguns resíduos de aminoácidos nas estruturas humanas serão substituídos pelos resíduos nas posições equivalentes dos anticorpos dadores de modo a assegurar a ligação adequada dos anticorpos humanizados aos seus antigénios. As linhas detalhadas da humanização do anticorpo são divulgadas na Patente Norte-americana Nos: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; and 6,180,370.

Os anticorpos não modificados da presente invenção podem incluir anticorpos geneticamente alterados que são funcionalmente equivalentes para os anticorpos naturais correspondentes. Os anticorpos não modificados que são alterados geneticamente para proporcionar uma eficácia terapêutica e/ou terapêutica são os preferidos. Exemplos de anticorpos alterados incluem aqueles com substituições conservadoras de resíduos de aminoácidos e uma ou mais eliminações ou adições de aminoácidos que não alteram significativamente a utilidade de ligação ao antigénio. As substituições podem variar de alterar ou modificar um ou mais resíduos de aminoácidos para completar a reconcepção de uma região desde que a ligação ou utilidade funcional seja mantida. Os anticorpos desta invenção podem ser alterados pós-translacionalmente (por exemplo, por meio de acetilação e fosforilação) ou podem ser alterados sinteticamente (por exemplo, a adição de um grupo marcador). 41

Os anticorpos não modificados da presente invenção podem incluir anticorpos que possuam afinidades de ligação intensificadoras para os seus antigénios através de alterações genéticas das regiões variáveis (vide, por exemplo, Patente Norte-americana No. 6,350,861).

Numa realização alternativa, as IgGs modificadas da presente invenção que possuem semi-vida mais longa do que as IgGs do tipo selvagem (ou não modificadas) incluem igualmente IgGs cujos locais bioactivos, ou locais de ligação ao antigénio, locais de ligação aos receptores Fc ou locais de ligação complementar para aumentar ou reduzir tais actividades comparativamente às do tipo selvagem.

Os anticorpos modificados da presente invenção podem ser um dos isotipos reconhecidos, mas os quatro isotipos IgG são preferidos, sendo os IgGl e IgG2 principalmente preferidos. São incluídos os anticorpos com regiões constantes mudadas para possuírem funções efectoras reduzidas, por exemplo, as IgG2M3 e outras mutantes IgG2 descritas na Patente Norte-americana No. 5,834,597. Numa realização preferida, os anticorpos não modificados e modificados na presente invenção incluem regiões constantes de cadeia pesada das IgGs humanas. A presente invenção pode ser aplicada a qualquer anticorpo que inclua regiões constantes de cadeia pesada de classe IgG, preferencialmente IgGl, IgG2, IgG2M3, IgG3 e Egg4. As regiões variáveis da cadeia pesada destes anticorpos podem derivar de quaisquer anticorpos seleccionados. Os anticorpos, a título de exemplo, presentemente divulgados incluem OST577-IgGl e OST577-IgG2M3, os quais incluem as regiões variáveis de cadeia 42 pesada e de cadeia leve do anticorpo OST577 do vírus da anti-hepatite B (Ehrlich et aL, Hum. Antibodies Hybridomas 3:2-7 (1992)), a região constante de cadeia leve da lambda-2 humana e a região constante de cadeia pesada da lgGl e lgG2M3 humana, respectivamente. São igualmente aqui divulgadas as HulDIO-IgGl e HulDIO- IgG2M3, as quais incluem as regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo HulDIO alelo da cadeia β anti-HLA-DR humanizada (Kostelny et al., Int. J. Câncer 93:556-565 (2001)), a região constante de cadeia leve capa e as regiões constantes de cadeia pesada acima mencionadas de IgGl e IgG2M3 humanas, respectivamente.

Outras exemplificações da presente invenção aqui divulgadas incluem mutantes dos anticorpos das IgGl, IgG2M3 humana (uma variante geneticamente alterada de IgG2), IgG3 e IgG4, demonstrando a alteração da semi-vida no soro de um anticorpo de classe IgQ. A região constante da cadeia pesada de IgG2M3 deriva da região da IgG2 ao substituir os resíduos 234 e 237 da região constante de cadeia pesada da IgG2 com alanina. A geração a região constante de cadeia pesada da IgG2m# é divulgada na Patente Norte-americana No 5,834,597.

Normalmente, os anticorpos modificados da presente invenção incluem qualquer molécula de imunoglobulina que liga (preferencialmente, imunoespecificamente, isto é, compete na ligação não específica, tal como determinado por imunoensaios bem conhecidos na técnica para testar ligações específicas do anticorpo ao antigénio) um antigénio e contém um fragmento de ligação FcRn. Estes anticorpos incluem, mas não se limitam a, anticorpos policlonais, monoclonais, bi-específicos, multi-específicos, humanos, 43 humanizados, quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos, F(ab')2f Fvs ligado a dissulfureto e fragmentos que contêm tanto um domínio VL como um domínio VH ou ainda uma região determinante complementar (CDR), a qual liga especificamente um antigénio, em determinados casos, manipulado para conter ou fundir-se com um domínio de ligação FcRn.

As moléculas IgG modificadas da invenção podem incluir subclasses IgG de qualquer animal. Por exemplo, em humanos, a classe IgG inclui IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4; e a classe IgG dos ratinhos inclui IgGl, IgG2a, IgG2b, e IgG3; e a classe IgG dos ratos inclui IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG2c e IgG3. Sabe-se que determinadas subclasses IgG, por exemplo, a IgG2b e IgG2c dos ratos possuem taxas depuração superior relativamente à, por exemplo, IgGl (Medesan et al., Eur. J. Immunol., 28:2092-2100 (1998)). Deste modo, quando se utilizam subclasses IgG que não as IgGl, pode ser vantajoso substituir um ou mais dos resíduos, particularmente nos domínios Cr2 e Cr3, os quais diferem da sequência IgG 1 com os da IgG 1, aumentando assim a semi-vida in vivo dos outros tipos de IgG.

As imunoglobulinas da presente invenção podem ser de qualquer origem animal incluindo pássaros e mamíferos. Preferencialmente, os anticorpos são humanos, de roedores, de burros, ovelhas, coelhos, cabras, porquinho-da-índia, camelos, cavalos ou galinhas. Tal como presentemente utilizado, os anticorpos "humanos" incluem anticorpos que possuem uma sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulinas humanas ou de animais transgénicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas, tal como abaixo descrito 44 e, por exemplo, na Patente Norte-americana No. 5,939,598 por Kucherlapati et al.

Para além disso, os anticorpos modificados da presente invenção podem ser anticorpos mono-especificos, bi- especificos, tri-especificos ou de multi-especificidade maior. Os anticorpos multi-específicos podem ser específicos para epítopos diferentes de um polipeptídeo ou podem ser específicos para epítopos heterólogos, tais como um polipeptídeo heterólogo ou material de suporte sólido. Vide, por exemplo, Publicações PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991); Patente Norte-americana Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819;

Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).

Os anticorpos modificados da invenção incluem derivados que são de outro modo modificados, isto é, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo de modo a que a ligação covalente não evita que o anticorpo se ligue ao antigénio e/ou gere uma resposta anti-idiotípica. Por exemplo, mas não como forma de limitação, os derivados do anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, por meio de glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos protectores/bloqueadores conhecidos, por clivagem proteolítica, por ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc. Qualquer das inúmeras modificações químicas pode ser conduzida por técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a, clivagem química especifica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos. 45

Os anticorpos monoclonais úteis com a presente invenção podem ser preparados utilizando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo a utilização de tecnologias de visualização de hibridomas, recombinantes e fagos, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando técnicas de hibridoma incluindo aquelas conhecidas na técnica e explicadas, por exemplo, em Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1988); Hammerling et al., em: "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas," Elsevier, New Yolk (1981), pp. 563-681. 0 termo "anticorpo monoclonal", tal como presentemente utilizado, não se limita a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. 0 termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que deriva de um clone simples, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou fago e não ao método pelo qual é produzido.

Os métodos de produção e rastreio para anticorpos específicos utilizando tecnologia de hibridoma são rotineiros e bem conhecidos na técnica. Num exemplo não limitativo, os ratinhos podem ser imunizados com um antigénio de interesse ou uma célula expressora deste antigénio. Uma vez detectada a resposta imune, por exemplo, os anticorpos específicos para um antigénio são detectados no soro do ratinho, o baço do ratinho é colhido e os esplenócitos são isolados. Os esplenócitos são depois fundidos por técnicas bem conhecidas para qualquer célula de mieloma adequada. Os hibridomas são seleccionados e clonados ao se limitar a diluição. Os clones do hibridoma são depois testados por meio de métodos bem conhecidos na 46 técnica para células que segregam anticorpos capazes de ligar o antigénio. 0 fluido das ascites, o qual contém normalmente níveis altos de anticorpos, pode ser gerado ao se inocular intra-peritonealmente o ratinho com clones de hibridoma positivos.

Os fragmentos do anticorpo que reconhecem epítopos específicos podem igualmente ser úteis com a presente invenção e podem ser gerados por meio de técnicas bem conhecidas. Por exemplo, os fragmentos Fab e F(ab')2 podem ser produzidos por meio de clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, utilizando enzimas tais como a papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2 )· Os fragmentos F(ab')2 contêm a cadeia leve completa e a região variável, a região CHI e a região charneira da cadeia pesada.

Por exemplo, os anticorpos podem igualmente ser gerados utilizando vários métodos de visualização conhecidos na técnica, incluindo a visualização do fago. Nos métodos de visualização do fago, os domínios de anticorpos funcionais são apresentados na superfície de partículas do fago que transportam sequências polinucleótidas que codificam as mesmas. Numa realização particular, este fago pode ser utilizado para apresentar domínios de ligação ao antigénio, tais como Fab e Fv ou Fv estabilizado de ligação ao dissulfureto, expresso a partir de um repertório ou de uma biblioteca de anticorpos combinatoriais (por exemplo, humanos ou murinos) . 0 fago que expressa um domínio de ligação ao antigénio que liga o antigénio de interesse pode ser seleccionado ou identificado com antigénio, por exemplo, utilizando um antigénio marcado ou antigénio ligado ou capturado para uma superfície sólida ou 47 microesfera. Os fagos utilizados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos, incluindo fd e Ml 3. Os domínios de ligação ao antigénio são expressos como uma proteína recombinantemente fundida com o gene do fago III ou proteína do fago VIII. Alternativamente, a porção de ligação FcRn modificada de imunoglobulinas da presente invenção pode ser igualmente expressas num sistema de visualização de fago. Exemplos de métodos de visualização de fagos que podem ser utilizados para produzir imunoglobulinas ou fragmentos dos mesmos da presente invenção incluem aqueles divulgados em Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettieborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187:9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); Publicação PCT No. PCT/GB91/01134; Publicações PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e Patente Norte-americana Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403, 484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5, 780,225; 5,658,727; 5,733,743 e 5,969,108.

Tal como descrito nas referências acima, após a selecção do fago, as regiões codificadoras do anticorpo do fago podem ser isoladas e utilizadas para gerar anticorpos completos, incluindo anticorpos humanos ou qualquer outro fragmento desejado e expresso em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células mamíferas, células de insectos, células vegetais, fermento e bactérias, por exemplo, tal como abaixo descrito em detalhe. Por exemplo, as técnicas para produzir recombinantemente fragmentos Fab, Fab', e F(ab'>2 podem igualmente ser empregues utilizando métodos 48 conhecidos na técnica tais como aqueles divulgados na Publicação PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12:864-869 (1992); Sawai et al., Amer. J. Reprod. Immunol. 34:26-34 (1995); e Better et al., Science 240:1041 -1043 (1988). Exemplos de técnicas, as quais podem ser utilizadas para produzir cadeias Fvs simples e anticorpos incluem aquelas descritas nas Patentes Norte-americanas Nos. 4,946,778 e 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 90:7995-7999 (1993); e Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988) .

Em realizações particulares, os anticorpos modificados possuem in vivo utilizações terapêuticas e/ou profiláticas. Exemplos de anticorpos terapêuticos e profiláticos, os quais podem ser modificados incluem, mas não se limitam a, SYNAGIS® (Medimmune, MD) que é um vírus sincicial anti-respiratório humanizado (RSV) anticorpo monoclonal para o tratamento de doentes com infecção RSV; HERCEPTIN® (Trastuzumab) (Genentech, CA) que é um anticorpo monoclonal HER2 humanizado para o tratamento de doentes com cancro da mama metastático; RBMICADE® (infliximab) (Centocor, PA) que é um anticorpo monoclonal anti-TNF-α quimérico para o tratamento de doentes com a doença de Crohn; REPRO® (abeiximab) (Centocor) que é um receptor Ilb/IIIa anti-glicoproteína nas plaquetas para prevenção da formação do coágulo ZBNAPAX® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Suíça) que é um anticorpo monoclonal anti-CD25 humanizado imunossupressivo, para a prevenção de rejeição alográfica renal aguda. Outros exemplos são, um anti-CD18 F(ab')2 humanizado (Genentech); CDP860, o qual é um anti-CD18 F (ab')2 humanizado (Celltech, UK); PR0542, o qual é um 49 anticorpo anti-HIV gpl20 fundido com CD4 (Progénies/Genzyme Transgenics) ; OSTAVIR™, o qual é um anticorpo do virus anti-hepatite B humanizado (Protein Design Labs/Novartis); PROTOVIR™, o qual é um anticorpo anti-CMV IgGl humanizado (Protein Design Labs/Novartis); IC14, o qual é um anticorpo anti-CDl4 (ICOS); AVASTIN™ (bevacizumab), o qual é um anticorpo anti-VEGF IgGl humanizado (Genentech); ERBITUX™ (cetuximab), o qual é um anticorpo anti-EGFR IgG quimérico (ImClone Systems); VITAXIN™, o qual é um anticorpo anti-ανβ3 de integrina humanizado (Applied Molecular Evolution/Medimmune); Campath-lH/LDP-03, o qual é um anticorpo anti CD52 IgGl humanizado (Leukosite); ZAMYL™, o qual é um anticorpo anti-CD33 IgG humanizado (Protein Design Labs/Kanebo); RITUXAN™ o qual é um anticorpo anti-CD20 IgGl quimérico (IDEC Pharmaceuticals/Genentech, Roche/Zenyaku); LYMPHOCIDE™ o qual é um anticorpo anti-CD22 IgG humanizado (Immunomedics); REMITOGEN™, o qual é um anticorpo ant i-HLA-DR humanizado (Protein Design Labs); ABX-IL8, o qual é um anticorpo anti-IL8 humano (Abgenix); RAPTIVA™ o qual é um anticorpo IgGl humanizado (Genetech/Xoma); ICM3 o qual é um anticorpo anti-ICAM3 humanizado (ICOS); IDEC-114 o qual é um anticorpo anti-CD80 primatizado (IDEC Pharmaceuticals/Mitsubishi) ; IDEC-131 o qual é um anticorpo anti-CD40L humanizado (IDEC/Eisai); IDEC-151 o qual é um anticorpo anti-CD4 primatizado (IDEC); IDEC-152 o qual é um anticorpo anti-CD23 primatizado (IDEC/Seika-gaku); NUIVON™ o qual é um anticorpo anti-CD3 da IgG humanizada (Protein Design Labs); SG1.1, o qual é um anticorpo do factor 5 (c5) complementar e humanizado (Alexion Pharmaceuticals) ; HUMIRA™ o qual é um anticorpo anti-TNF-α humano (CAT/BASF); CDP870 o qual é um fragmento 50 anti-TNF-α Fab humanizado (Celltech); IDEC-151 o qual é um anticorpo anti-CD4 IgGl primatizado (IDEC Pharmaceuticals/Smith-Kline Beecham); MDX-CD4 o qual é um anticorpo anti-CD4 IgG humano (Medarex/Eisai/Genmab); CDP571 o qual é um anticorpo anti-TNF-α IgG4 humanizado (Celltech) ; LDP-02 o qual é um anticorpo anti-cx4p7 humanizado (LoukoSite/Genentech); OrthoClone 0KT4A o qual é um anticorpo anti-CD4 IgG humanizado (Ortho Biotech); ANTOVA™ o qual é um anticorpo anti-CD40L IgG humanizado (Biogen); ANTBGREN™ o qual é um anticorpo anti-VLA-4 IgG humanizado (Elan); MDX-33 o qual é um anticorpo anti-CD64 (FcyR) humano (Medarex/Centeon); SCH55700 o qual é um anticorpo anti-IL-5 IgG4 humano (Celltech/Schering); SB-240563 e SB-240683 que são anticorpos anti-IL-5 e IL-4 humanizados, respectivamente (SmithKline Beecham); rhuMab-E25 o qual é um anticorpo anti-IgE IgG I humanizado (Genentech/Novards/Tanox Biosystems); IDEC-152 o qual é um anticorpo anti-CD23 primatizado (IDEC Phatmaceuticals); SIMULECT™ o qual é um anticorpo anti-CD25 IgGI quimérico (Novartis Pharmaceuticals); LDP-01 o qual é um anticorpo anti-p2-IgG de integrina humanizado (Leukosite); CAT-152 o qual é um anticorpo anti-TGF-p2 humano (Cambridge Antibody Technology) ; e Corsevin Μ, o qual é um anticorpo do anti-Factor VII quimérico (Centocor). A presente invenção permite a modificação destes e outros anticorpos terapêuticos para aumentar a semi-vida in vivo, permitindo a administração de dosagens eficazes mais baixas e/ou menos doses frequentes de anticorpos terapêuticos. Esta modificação para aumentar a semi-vida in vivo pode ser igualmente útil para também optimizar as imunoglobulinas de diagnóstico. Por exemplo, a semi-vida no 51 soro elevada de um anticorpo de diagnóstico pode permitir a administração de doses mais baixas para se obter uma sensibilidade de diagnóstico suficiente. Alternativamente, a semi-vida no soro reduzida pode ser vantajosa nas aplicações em que se pretende a eliminação rápida de um anticorpo de diagnóstico.

Aqui divulgada, encontra-se a sequência de aminoácidos de OST577-IgG2M3, incluindo a sequência de aminoácidos da sua região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 1) (OST577-VH) e região constante (SEQ ID NO: 2) (IgG2M3-CH) com as posições 250, 314 e 428 realçadas e a sequência de aminoácidos da sua região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 4) (OST577-VL) e região constante (SEQ ID NO: 5) (LAMBDA2-CL) (Figura 3A).

Divulga-se aqui a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de OST577-IgGl (SEQ ID NO: 3), com as posições 250, 314 e 428 realçadas (Figura 3C). A presente invenção apresenta um anticorpo modificado que possui uma afinidade de ligação elevada para FcRn e/ou uma semi-vida no soro elevada comparativamente ao anticorpo não modificado, em que o resíduo do aminoácido 250 ou 428 da região constante da cadeia pesada é substituído com outro resíduo aminoácido que é diferente do que está presente no anticorpo não modificado. De preferência o resíduo do aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é substituído por ácido glutâmico ou glutamina. Em alternativa o resíduo do aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é substituído por fenilalanina ou leucina.

Em um exemplo, o anticorpo não modificado referido inclui a região constante de cadeia pesada de uma molécula 52

IgG2, ou IgG2M3, incluindo, mas não se limitando a OST577-IgG2M3 ou OST577-IgGl. IgGI, IgG2, e IgG2M3 possuem um residuo de treonina na posição 250 e um resíduo de metionina na posição 428. De preferência o resíduo de treonina na posição 250 é substituído por ácido glutâmico (T250E) ou glutamina (T250Q), e o resíduo de metionina na posição 428 é substituído por fenilalanina (M428F) ou leucina (M428L). A Figura 3B apresenta a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada da IgG2M3 modificada, sendo o aminoácido substituído por T250E (SEQ ID NO: 13), T250Q (SEQ ID NO: 23), M428F (SEQ ID NO: 52), ou M428L (SEQ ID NO: 57). A Figura 3C apresenta a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada da IgGI modificada, sendo o aminoácido substituído por T250D (SEQ ID NO: 67), T250E (SEQ ID NO: 68), T250Q (SEQ ID NO: 69), M428F (SEQ ID NO: 70), ou M428L (SEQ ID NO. 71). A presente invenção apresenta um anticorpo daclizumab modificado que possui uma afinidade de ligação elevada para FcRn e/ou semi-vida no soro elevada comparativamente ao anticorpo não modificado. A modificação de aminoácidos pode ser uma das seguintes substituições: 1) O resíduo do aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é substituído por ácido glutâmico e o resíduo do aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é substituído por fenilalanina. 2) O resíduo do aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é substituído por glutamina e o resíduo do aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é substituído por fenilalanina. 53 3) 0 resíduo do aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é substituído por glutamina e o resíduo do aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é substituído por leucina. A sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada da IgG2M3 modificada que possui as substituições duplas de aminoácidos de T250E/M428F (SEQ ID NO: 72), T250Q/M428F (SEQ ID NO: 73), ou T250Q/M428L (SEQ ID NO: 74) é apresentada na Figura 3B. A sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada da IgGI modificada que possui as substituições duplas de aminoácidos de T250E/M428F (SEQ ID NO: 75) ou T250Q/M428F (SEQ ID NO: 76) é apresentada na Figura 3C.

Os anticorpos modificados com as substituições duplas de aminoácidos nas posições 250 e 428 exibem de modo excessivo afinidades de ligação altas para FcRn comparativamente às dos anticorpos não modificados.

Numa realização preferida da presente invenção, a afinidade de ligação para FcRn e/ou semi-vida no soro do anticorpo modificado é aumentada em, pelo menos, aproximadamente 30%, 50%, 80%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, ou 100 vezes. A presente divulgação apresenta um anticorpo modificado que possui uma afinidade de ligação reduzida para FcRn e/ou uma semi-vida no soro reduzida comparativamente ao anticorpo não modificado, em que o resíduo do aminoácido 314 da região constante da cadeia pesada é substituído por 54 outro aminoácido, o qual é diferente do que se encontra presente num anticorpo não modificado. Demonstrou-se que os anticorpos modificados que possuem uma substituição dos aminoácidos na posição 314 apresentam uma afinidade de ligação reduzida, sugerindo que a posição 314 deveria ser modificada se se pretender uma semi-vida no soro reduzida num anticorpo. Preferencialmente, o resíduo do aminoácido 314 da região constante da cadeia pesada é substituído por alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, cisterna, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina ou valina. Mais preferencialmente, a substituição de aminoácidos é de leucina para alanina ou arginina na posição 314. Tal como mostrado nos Exemplos, a afinidade de ligação para FcRn das OST577-IgG2M3 modificadas que incluem uma substituição de leucina para arginina é reduzida para 11% comparativamente à das OST577-IgG2M3 não modificadas.

Tal como demonstrado na Figura 3B, L314A descreve a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada da IgG2M3 modificada, sendo a substituição do aminoácido de leucina para alanina na posição 314 (SEQ ID NO: 29) . L314R descreve a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada da IgG2M3 modificada, sendo a substituição de aminoácidos de leucina para arginina na posição 314 (SEQ ID NO: 42). A presente divulgação apresenta um anticorpo modificado que possui uma afinidade de ligação reduzida para FcRn e/ou uma semi-vida no soro reduzida comparativamente ao anticorpo não modificado, em que (1) o resíduo do aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é 55 substituído por arginina, asparagina, ácido aspártico, lisina, fenilalanina, prolina, triptofano ou tirosina; ou (2) o resíduo do aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é substituído por alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glicina, histidina, lisina, prolina, serina, treonina, tirosina ou valina. Preferencialmente, o resíduo do aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é substituído por ácido aspártico ou o resíduo do aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é substituído por glicina. Esta substituição de aminoácidos pode reduzir dramaticamente a semi-vida no soro de um anticorpo. Tal como mostrado nos Exemplos, a afinidade de ligação para FcRn da OST577-IgG2M3 modificada que possui essas substituições de aminoácidos é reduzida para aproximadamente 5-7% comparativamente à da OST577-IgG2M3 não modificada.

Tal como mostrado na Figura 3B, T250D descreve a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada da IgG2M3 modificada, sendo a substituição de aminoácidos de treonina para ácido aspártico na posição 250 (SEQ ID NO: 12). M428G descreve a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada da IgG2M3 modificada, sendo a substituição de aminoácidos de metionina para glicina na posição 428 (SEQ ID NO: 53).

Num aspecto particular da presente divulgação, a afinidade de ligação para FcRn e/ou semi-vida no soro do referido anticorpo modificado é reduzida em, pelo menos, aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99%. 56 A presente invenção inclui as regiões constantes da cadeia pesada, regiões Fc ou regiões CH2-CH3 de anticorpos IgG modificados aqui descritos, preferencialmente dos anticorpos IgG 1, IgG2 ou IgG2M3 modificados que possuem as substituições de aminoácidos aqui descritas. A presente divulgação inclui igualmente um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos de qualquer das SEQ ID Nos: 10-76. Numa realização preferida, estes polipeptideos são regiões constantes de IgG 1, IgG2, ou IgG2M3 mutantes. As regiões constantes de cadeia pesada dos anticorpos modificados da presente invenção podem ser ligadas à região variável de cadeia pesada de qualquer anticorpo seleccionado para gerar a cadeia pesada híbrida desejada. Exemplos dos anticorpos seleccionados incluem, mas não se limitam a, anticorpos contra IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, HSV, CD3, CD33, CMV, e IFN-γ. Para além disso, as regiões variáveis podem ser aquelas de anticorpos naturais de qualquer espécie tais como um humano, um primata ou um roedor. Alternativamente, estas regiões variáveis podem ser as de anticorpos geneticamente alterados, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos humanizados, anticorpos que possuem afinidades de ligação elevadas para os seus antigénios através de modificações genéticas ou anticorpos completamente humanos. Esta cadeia pesada híbrida pode ser ligada a uma variedade de cadeias leves para produzir o anticorpo desejado. As cadeias leves podem ser cadeias leve lambda ou kapa. Uma vez determinada primeiramente a semi-vida no soro de um anticorpo pela sua região constante de cadeia pesada, pode obter-se uma semi-vida no soro desejada de um anticorpo produzido através de substituições de 57 aminoácidos na região constante de cadeia pesada tal como presentemente descrito. II. Produção de anticorpos modificados com afinidade de ligação FcRn alterada e/ou semi-vidas no soro A presente invenção apresenta métodos de produzir anticorpos com afinidade de ligação FcRn alterada e/ou semi-vidas no soro. Preferencialmente, a presente invenção apresenta métodos para modificar um determinado anticorpo de classe IgG em uma ou mais posições aqui divulgadas. Estas modificações podem ser quimicamente obtidas ou por mutagénese aleatória ou direccionada para o local e por produção recombinante utilizando quaisquer métodos de produção conhecidos. A presente divulgação apresenta um método para modificar um anticorpo de classe IgG, que inclui a substituição de, pelo menos, um aminoácido da região constante de cadeia pesada seleccionado do grupo que consiste de resíduos de aminoácidos 250, 314 e 428 com um aminoácido, o qual é diferente do que se encontra presente num anticorpo não modificado, causando assim a alteração da afinidade de ligação para FcRN e/ou semi-vida no soro do referido anticorpo não modificado. A substituição pode ser realizada na posição 250, 314 ou 428 isolada ou em qualquer combinação das mesmas, tais como nas posições 250 e 428.

Para aumentar a afinidade de ligação para FcRn e/ou aumentar a semi-vida no soro de um anticorpo, o resíduo do aminoácido 250 da região constante de cadeia pesada é substituído por ácido glutâmico ou glutamina e o resíduo do aminoácido 428 da região constante de cadeia pesada é 58 substituído por fenilalanina ou leucina. Alternativamente, o resíduo do aminoácido 250 da região constante de cadeia pesada é substituído por ácido glutâmico e o resíduo do aminoácido 428 da região constante de cadeia pesada é substituído por fenilalanina; ou o resíduo do aminoácido 250 da região constante de cadeia pesada é substituído por glutamina e o resíduo do aminoácido 428 da região constante de cadeia pesada é substituído por leucina. É preferível a modificação de ambos os resíduos em 250 e 428, uma vez que os anticorpos ao terem estas mutações duplas, apresentam afinidades de ligação excepcionalmente elevadas para FcRn.

Para se produzir um anticorpo modificado que possui uma afinidade de ligação reduzida para FcRn e/ou uma semi-vida no soro reduzida comparativamente ao anticorpo não modificado, o resíduo do aminoácido 314 da região constante da cadeia pesada é substituído por outro aminoácido, o qual é diferente do que se encontra presente num anticorpo não modificado. Preferencialmente, o resíduo do aminoácido 314 da região constante da cadeia pesada é substituído por alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina ou valina. Mais preferencialmente, o resíduo do aminoácido 314 da região constante de cadeia pesada é substituído por alanina ou arginina.

Para produzir um anticorpo modificado que possui uma afinidade de ligação reduzida para FcRn e uma semi-vida no soro reduzida comparativamente ao anticorpo não modificado, em que o resíduo do aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é substituído por arginina, asparagina, ácido aspártico, lisina, fenilalanina, prolina, triptofano ou 59 tirosina; ou o resíduo do aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é substituído por alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glicina, histidina, lisina, prolina, serina, treonina, tirosina ou valina. Mais preferencialmente, o resíduo do aminoácido 250 é substituído por ácido aspártico ou o aminoácido 428 é substituído ou glicina.

As substituições de aminoácidos presentemente descritas são obtidas por meio de tecnologias modelo de ADN recombinante. Numa realização, a mutagénese direccionada para o local pode ser utilizada para introduzir as substituições de aminoácidos no ADN que codifica um anticorpo não modificado. Os ADNs resultantes dos anticorpos modificados são depois transportados para as células hospedeiras e os anticorpos modificados são assim produzidos. A alteração desejada de afinidade de ligação para FcRn dos anticorpos modificados pode ser seleccionada ao se utilizar uma tecnologia de visualização do fago ou qualquer outro método adequado conhecido na técnica e confirmado ao se avaliar a afinidade de ligação.

Preferencialmente, um método para produzir anticorpos modificados de classe IgG com uma afinidade de ligação alterada para FcRn e uma semi-vida no soro alterada comparativamente a um anticorpo não modificado inclui: (a) A preparação de um vector de expressão replicável que inclua um promotor adequado operacionalmente ligado a um ADN, o qual codifica, pelo menos, uma região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina e na qual, é substituído, pelo menos, um aminoácido da região constante de cadeia pesada seleccionado a partir do grupo que 60 consiste de resíduos de aminoácidos 250, 314 3 428 por um aminoácido o qual é diferente daquele que se encontra presente num anticorpo não modificado, causando assim uma alteração na semi-vida no soro. (b) a transformação de células hospedeiras com o vector mencionado; e (c) produzir uma cultura das referidas células hospedeiras transformadas para produzir o referido anticorpo modificado.

Este método inclui ainda opcionalmente após Fase (a): A preparação de um segundo vector de expressão replicável que inclua um promotor operacionalmente ligado a um ADN o qual codifica uma cadeia leve de imunoglobulina complementar e em que a referida linha celular é ainda transformada com o referido vector.

Para gerar o ADN na Fase (a) , as substituições de aminoácidos podem ser introduzidas por mutagénese, incluindo, mas não se limitando a, mutagénese direccionada para o local (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492 (1985)), mutagénese PCR (Higuchi, in "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego (1990) pp. 177-183), e mutagénese de cassete (Wells et al., Gene 34:315-323 (1985)). Preferencialmente, a mutagénese direccionada para o local é realizada pelo método PCR overlap-extension, o qual é divulgado nos Exemplos Higuchi, in "PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification", Stockton Press, New York (1989), pp. 61 -70). A técnica de PCR overlap-extension (Higuchi, ibid.) pode ser utilizada para introduzir qualquer mutação 61 desejada ou mutações numa sequência alvo (o ADN de partida). Por exemplo, tal como demonstrado na Figura 4, o primeiro ciclo de PCR no método overlap-extension envolve a amplificação da sequência alvo com um iniciador exterior (iniciador 1) e um iniciador de mutagénese interno (iniciador 3) e separadamente com um segundo iniciador exterior (iniciador 4) e um iniciador interno (iniciador 2) rendendo dois segmentos de PCR (segmentos A e B). 0 iniciador de mutagénese interno (iniciador 3) é desenhado para conter desemparelhamentos para a sequência alvo especificando a(s) mutação(ões) desejadas. Na segunda fase de PCR, os produtos da primeira fase de PCR (segmentos A e B) são amplificados por PCR utilizando os dois iniciadores exteriores (iniciadores 1 e 4) . 0 segmento PCR de comprimento completo dai resultante (segmento C) é digerido com enzimas de restrição e o fragmento de restrição dai resultante é clonado para um vector apropriado.

No primeiro passo da mutagénese, o ADN de partida é operacionalmente clonado para um vector de mutagenese. Os iniciadores são desenhados para reflectir a substituição de aminoácidos desejada (vide mais detalhes nos Exemplos). Num exemplo, os vectores utilizados para mutagénese in vitro podem ser utilizados para direccionar a expressão da proteína. Deste modo, o ADN resultante do PCR overlap-extension pode ser clonado de volta num vector de mutagénese de modo a que o vector de expressão que inclui o ADN com a mutação desejada seja criado. Um exemplo do vector de mutagénese que inclui o ADN de partida inclui, mas não se limita a, pVAg2M3-OST577.

Por exemplo, as mutações na posição 250 foram realizadas por meio de amplificação da região que envolve o 62 fragmento PinAI-BamHI de pVAg2M3-OST577 (vide o mapa de restrição na Figura5A) num processo de duas fases utilizando o método overlap-extension acima descrito, depois digerindo o segmento PCR dai resultante com PinAI e BamHI, e clonando o fragmento de restrição em VAg2M3-OST577. Semelhantemente, as mutações nas posições 314 ou 428 foram realizadas por amplificação da região que envolve o fragmento PmlI-BamHI por meio de PCR overlap-extension, digerindo depois os segmentos PCR com Pmll e BamHI, clonando os fragmentos de restrição dai resultantes em pVAg2M3-OST577. 0 ADN de partida pode ser um ADN codificador de um anticorpo inteiro não modificado, uma cadeia pesada inteira de imunoglobulina e um anticorpo não modificado, a região constante de uma cadeia pesada, ou parte da região constante de cadeia pesada de um anticorpo não modificado desde que seja incluído o resíduo de aminoácido a ser modificado.

Se o ADN que codifica um anticorpo inteiro não modificado for utilizado como o ADN de partida para mutagénese , o anticorpo inteiro modificado pode ser produzido ao se realizarem as Fases (a), (b) e (c) do método presentemente descrito. 0 passo entre a Fase (a) e a

Fase (b) deste método para gerar a cadeia leve complementar não seria necessário.

Se o ADN de partida para mutagénese for um ADN que codifica a cadeia pesada inteira de um anticorpo não modificado, a mutagénese dará lugar a um vector que inclui o ADN que codifica a cadeia pesada inteira modificada. De modo a produzir um anticorpo inteiro modificado, é 63 realizado o passo entre as Fases (a) e (b) do método presentemente divulgado. Isto é, outro vector de expressão replicável que inclui um promotor adequado operacionalmente ligado a um ADN que codifica a cadeia leve de imunoglobulina complementar é co-transferido para as mesmas células hospedeiras. Consequentemente, tanto a cadeia leve modificada como a cadeia pesada modificada são expressas nas mesmas células hospedeiras e devidamente agrupadas para dar lugar ao anticorpo inteiro modificado. Um exemplo do vector de expressão mencionado que inclui um ADN que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina inclui, mas não se limita a, pVAÀ2-OST577.

Se o ADN de partida para mutagénese for um ADN que codifica parte da região constante de cadeia pesada, tal como um segmento Ce2- Ch3 ou um domínio Fc, o ADN resultante que codifica uma cadeia pesada parcial modificada é primeiro ligado numa estrutura com o restante da cadeia pesada não modificada de modo a que seja possível geral o ADN que codifica uma cadeia pesada inteira com a modificação presentemente descrita na Fase (a) . Um anticorpo inteiro modificado é então produzido por meio de co-transferência de células hospedeiras com o vector que inclui o ADN que codifica uma cadeia leve complementar e o vector que inclui o ADN que codifica esta cadeia pesada modificada. A ligação do ADN que codifica a cadeia pesada

parcial modificada e a restante cadeia pesada nao modificada pode ser obtida ao se utilizar as técnicas modelo de clonagem molecular conhecidas na técnica da biologia molecular, tais como digestões e ligações de restrição (Sambrook e Russell , "Molecular Cloning: A 64

Laboratory, Manual", 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)).

As cadeias leve e pesada podem ser clonadas nos mesmos ou diferentes vectores de expressão. Os segmentos de ADN que codificam as cadeias de imunoglobulina são operacionalmente ligadas para controlar sequências no(s) vector(es) de expressão que asseguram a expressão de polipeptideos de imunoglobulinas. Estas sequências de controlo incluem uma sequência de sinal, um promotor, um intensificador e uma sequência de terminação de transcrição (vide Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-10033 (1989); W090/07861; Co et al., J. Immunol. 148:1149-1154 (1992); "Antibody Engineering: A Practical Guide", Borrebaeck, Ed., Freeman, New York (1997)).

As células hospedeiras são transformadas utilizando as técnicas conhecidas na técnica, tais como lipossoma, fosfato de cálcio, electroporação, etc. (Sambrook and Russell, op. Cit). Preferencialmente, as células hospedeiras são transitoriamente transfectadas utilizando o método lipossoma.

As células hospedeiras para produzir o anticorpo modificado da presente invenção podem ser cultivadas numa variedade de meios conhecidos nas técnicas.

Os anticorpos modificados presentemente descritos podem ser produzidos intracelularmente, no espaço periplásmico ou directamente segregadas no meio. Preferencialmente, os anticorpos modificados na presente invenção são segregados num meio de cultura. 0 meio da cultura da célula hospedeira que produz anticorpos modificados é colhido e os restos celulares são rodados por meio de centrifugação. Os 65 sobrenadantes sao colhidos e sujeitos a ensaios de expressão de proteínas (vide mais detalhes nos Exemplos). A expressão de um anticorpo modificado é confirmada por electroforese em gel utilizando SDS-PAGE reduzindo ou não reduzindo a análise em gela da proteína ou outras técnicas quaisquer conhecidas na técnica. ELISA pode ser igualmente utilizado para detectar tanto a expressão de um anticorpo modificado como a quantidade de tal anticorpo.

Os anticorpos modificados deveriam reter uma ligação adequada para antigénios comparativamente aos anticorpos não modificados. Consequentemente, a ligação anticorpo-antigénio apropriada é testada por meio de procedimentos conhecidos na técnica da imunologia, tal como o ELISA. Podem ser realizadas experiências adicionais para confirmar que os anticorpos modificados possuem características estruturais semelhantes às dos anticorpos não modificados. Estas experiências incluem, mas não se limitam a, SDS-PAGE, SEC, ELISA e ensaios de ligação à proteína A. 0 ensaio de ligação à proteína A é preferido considerando que a proteína A se liga à mesma região da junção CH2-CH3 como FcRn embora a ligação envolva resíduos diferentes.

Os anticorpos modificados preparados a partir de células hospedeiras podem ser purificados utilizando técnicas conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a, filtração em gel e cromatografia em coluna (por exemplo, cromatografia de afinidade por proteína A, cromatografia de troca de catiões, cromatografia de troca de aniões e filtração em gel). A pureza mínima aceitável do anticorpo para utilização em formulação farmacêutica será 66 de 90%, preferencialmente 95%, mais preferivelmente 98% e ainda mais preferivelmente 99% ou acima da mais preferida.

As afinidades de ligação dos anticorpos produzidos para FcRn podem ser detectadas ao se realizar um ensaio de ligação competitivo a pH 6,0, sendo esta a condição ideal para ligação ao FcRn. As afinidades de ligação podem ser testadas ao se imobilizar a FcRn num substrato sólido tal como uma conta de Sepharose®. Alternativamente, as afinidades de ligação podem ser avaliadas utilizando o ELISA. Preferencialmente, a presente invenção testa as afinidades de ligação ao desenvolver um ensaio de ligação competitiva num sistema com base celular. Uma série de processos de diluição de um anticorpo modificado produzido e de um anticorpo não modificado é comparada para se ligar a FcRn expresso numa linha celular, preferencialmente uma linha celular NSO. Os procedimentos experimentais para desenvolver um ensaio de ligação competitivo são descritos em detalhe nos Exemplos.

As experiências na presente invenção mostram que resultados semelhantes de afinidade de ligação podem ser obtidos com anticorpos purificados ou sobrenadantes de cultura das células que produzem anticorpos. Consequentemente, os sobrenadantes podem ser directamente utilizados para testar afinidades de ligação para FcRn dos anticorpos produzidos para confirmar que a alteração desejada das afinidades de ligação foram obtidas. Após esta confirmação, o anticorpo produzido é sujeito a procedimentos de purificação mais complexos.

Ensaios de ligação directos deveriam ser igualmente desenvolvidos para confirmar que os anticorpos modificados 67 se ligam a FcRn de uma forma dependente do pH. Em particular, a afinidade de ligação dos anticorpos modificados para FcRn é testada tanto a um pH 6,0 como a um pH 8,0 (vide mais detalhes nos Exemplos). De modo geral, a afinidade de ligação a pH 6,0 deveria exceder a afinidade de ligação a pH 8,0. A estabilidade biológica (ou semi-vida no soro) pode ser avaliada por uma variedade de meios in vivo ou in vitro, por exemplo, utilizando uma proteína marcada radioactivamente e medindo os níveis de radioactividade no soro como uma função de tempo, ou testando os níveis de anticorpos intactos (de especificidade conhecida) presentes no soro utilizando o ELISA como uma função de tempo, com uma medida particularmente preferida de estabilidade biológica elevada, sendo evidenciada pela semi-vida no soro elevada e taxas de eliminação reduzidas. A presente divulgação apresenta moléculas de polionucleótidos que codificam os anticorpos modificados da invenção com as mutações presentemente descritas. A presente divulgação apresenta os vectores que incluem as moléculas de polionucleótidos que codificam os anticorpos com as mutações (substituições) presentemente descritas. A presente divulgação inclui uma célula hospedeira que contém os referidos vectores que incluem as referidas moléculas de ácido nucleico tal como presentemente descrito. As células hospedeiras adequadas para a expressão dos anticorpos modificados aqui descritos derivam de organismos procarióticos tais como Escherichia coli, ou 68 organismos multicelulares eucarióticos, incluindo fermentos, plantas, insectos e mamíferos. E coli é um hospedeiro procariótico particularmente útil para clonagem e/ou expressão das sequências de ADN da presente invenção. Outros hospedeiros microbiais adequados para utilização incluem bacilos, tais como Bacillus subtilis e outros enterobacteriaceae, tal como Salmonela, Serratia e várias espécies de Pseudomonas. Nestes hospedeiros procarióticos, pode igualmente produzir-se vectores de expressão, os quais contêm normalmente sequências de controlo de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Para além disso, qualquer número de uma variedade de promotores bem conhecidos pode encontrar-se presente, tal como o sistema de promoção da lactose, um promotor de triptofano (trp), um sistema de promoção de beta-lactamase ou um sistema de promoção a partir do fago lambda. Os promotores controlam tipicamente a expressão, opcionalmente com uma sequência operadora, e possuem sequências de local de ligação ao ribosoma e semelhantes para iniciar e completar a transcrição e translação.

Outros micróbios, tais como, fermento, podem igualmente ser utilizados em termos de expressão. Saccharomyces é um hospedeiro preferido, com vectores adequados que possuem sequências de controlo de vectores adequadas, tais como promotores, incluindo 3-fosfoglicerato-cinase ou outra enzima glicolítica e uma origem de replicação, sequências de terminação e semelhantes se desejado.

As plantas e as culturas de células vegetais podem ser utilizadas para a expressão de sequência de ADN da invenção 69 (Larrick e Fry, Hum. Antibodies Hybridomas 2:172-189 (1991); Benvenuto et al., Plant Mol. Biol. 17:865-874 (1991); During et al., Plant Mol. Biol. 15:281-293 (1990); Hiatt et al., Nature 342:76-78 (1989)). As células vegetais preferidas incluem, por exemplo: Arabidopsis, Nicotiana tabacum, Nicotiana rústica e Solanum tuberosum. Uma cassete de expressão preferida para expressar sequências de polinucleótidos que codificam os anticorpos modificados da invenção é o plasmideo pMOG18, no qual a sequência de polinucleótido inserida que codifica o anticorpo modificado é operacionalmente ligada a um promotor CaMV 35S com um intensificador duplicado; pMOG18 é utilizado de acordo com o método de Sijmons et al., Bio/Technology 8:217-221 (1990). Alternativamente, uma realização preferida para a expressão de anticorpos modificados nas plantas segue os métodos de Hiatt et al., supra, com a substituição de sequências de polinucleótidos que codificam os anticorpos modificado da invenção para sequências de imunoglobulina utilizadas por Hiatt et al., supra. Os vectores agrobacterium tumifaciens baseados no T-ADN podem igualmente ser utilizados para expressar as sequências de ASDN da invenção, preferencialmente estes vectores incluem um gene marcador que codifica a resistência à espectinomicina ou outro marcador seleccionável. A cultura de células de insectos pode igualmente ser utilizada para produzir os anticorpos modificados da invenção, normalmente utilizando um sistema de expressão com base no baculovirus. Os anticorpos modificados podem ser produzidos por meio de expressão de sequências de polinucleótidos que codificam os anticorpos modificados de 70 acordo com os métodos de Putlitz et al., Bio/Technology 8:651-654 (1990) .

Para além dos micro-organismos e plantas, a cultura de células de mamíferos pode igualmente ser utilizada para expressar e produzir polipeptídeos da presente invenção (vide, Winnacker, "From Genes to Clones", VCH Publishers, New York (1987)). As células mamíferas são actualmente preferidas, porque foi desenvolvido, na técnica, um número de linhagens celulares hospedeiras adequadas e capazes de segregar imunoglobulinas intactas e que inclui as linhagens celulares de CHO, várias linhagens celulares COS, células HeLa, preferencialmente linhagens celulares de mieloma, etc. ou células B transformadas ou hibridomas. Os vectores de expressão para estas células podem incluir sequências de controlo de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor, um intensificador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68 (1986)), e locais de processamento de informação necessários, tais como locais de ligação a ribosomas, locais de splicing de ARN, locais de poliadenilação e sequências terminadoras da transcrição. As sequências de controlo de expressão preferidas são promotores derivados de genes de imunoglobulina, SV40, adenovírus, vírus do papiloma bovino, citomegalovírus e semelhantes. Normalmente, um marcador seleccionável, tal como uma cassete de expressão, é incluído no vector de expressão.

A presente divulgação apresenta um método de produzir um agente com afinidade de ligação FcRn alterada e/ou semi-vida no soro ao conjugar ou até a ligar esse agente a uma fracção identificada como possuindo uma semi-vida no soro elevada ou reduzida através da sua interacção com FcRn. Esta fracção inclui, mas não se limita a, uma IgG 71 modificada ou a uma cadeia pesada parcial ou total modificada incluindo as substituições de aminoácidos presentemente descritas. Estes agentes incluiriam, mas não se limitando a, anticorpos, fragmentos de anticorpos, hormonas, ligantes de receptores, imunotoxinas, fármacos terapêuticos de qualquer tipo, antigénio de ligação ao receptor celular B e quaisquer outros agentes que possam ser ligados às fracções de semi-vida no soro elevada da presente invenção. Para se criar uma proteína de fusão com uma estabilidade alterada in vivo, os segmentos de ADN que codificam tais proteínas podem ser operativamente incorporados num vector recombinante, numa estrutura com a região constante de um anticorpo modificado, em ambos os sentidos, numa posição de modo a tornar o vector capaz de expressar uma proteína de fusão que inclua essa proteína operacionalmente ligada à região constante. As técnicas para manipulação de segmentos de ADN nesta maneira, por exemplo, por manipulação genética utilizando endonucleases de restrição, serão bem conhecidas pelos especialistas na técnica considerando não só a presente divulgação como também as referências de Sambrook e Russel, supra. 0 método acima é proposto para utilização na geração de uma série de compostos terapêuticos com estabilidade biológica melhorada. Estes compostos incluem, por exemplo, interleucina-2, insulina, interleucina-4 e interferão gama, ou ainda os receptores de células T. Os domínios Fc recombinantes desta invenção são igualmente contemplados para ser utilizados na estabilização de uma série ampla de fármacos, os quais poderiam possivelmente aliviar a necessidade de administração repetida. No entanto, os métodos presentes não se limitam apenas à produção de 72 proteínas para administração humana e podem ser empregues para produzir grandes quantidades de qualquer proteína com estabilidade elevada, tal como podem ser utilizados, por exemplo, em protocolos de imunização, tratamento animal por veterinários ou em modelos de terapia de roedores in vivo. III. Utilização de anticorpos modificados com afinidade de ligação FcRn alterada e/ou semi-vidas no soro A presente divulgação apresenta uma composição que inclui anticorpos modificados descritos presentemente e um veiculo farmaceuticamente aceitável. As composições para administração parentérica incluem comummente uma solução de um anticorpo ou um cocktail do mesmo dissolvido num veículo aceitável, preferencialmente um veiculo aquoso. Pode ser utilizada uma variedade de veículos aquosos, por exemplo, água, água tamponada, 0,4% salina, 0,3% glicina e semelhante. Estas soluções são estéreis e normalmente livres de partículas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como requerido, para condições fisiológicas aproximadas tais como agentes tampão e agentes ajustadores de pH, agentes ajustadores de toxicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e lactato de sódio. A concentração dos anticorpos nesta formulações podem variar grandemente, ou seja, de menos de cerca de 0,01%, normalmente, pelo menos, cerca de 0,1% para algo como 5%, em peso, e são seleccionadas principalmente com base no volume de fluido e viscosidade de acordo com o modo particular de administração seleccionado. 73

Pode ser produzida uma composição típica para infusão intravenosa para conter 250 ml de solução Ringer estéril e 10 mg a 10 mg do anticorpo (vide "Remington's Pharmaceutical Science", 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1980)).

Os anticorpos modificados na presente invenção podem ser utilizados para vários fins não terapêuticos. Estes podem ser utilizados como um agente de purificação de afinidade. Estes podem ser igualmente utilizados em ensaios de diagnóstico, tal como detectar a expressão de uma antigénio de interesse em células específicas, tecidos ou soro. Para efeitos de aplicações de diagnóstico, os anticorpos serão tipicamente marcados com uma fracção detectável, incluindo radioisótopos, marcadores fluorescentes e vários marcadores de substrato de enzimas. Os anticorpos podem igualmente ser empregues em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ensaios de ligação competitiva, ensaios tipo sandwich directos e indirectos e ensaios de imunoprecipitação. Os anticorpos podem igualmente ser utilizados para testes de diagnóstico in vivo. Normalmente, os anticorpos são marcados com um radionucleótido de modo a que o antigénio ou célula que o expressa possam ser localizados utilizando a imunocintigrafia.

Podem ser igualmente fornecidos kits para utilização com os anticorpos modificados na protecção contra ou detecção de uma actividade celular ou para a presença de um receptor de superfície celular seleccionado ou diagnóstico da doença. Deste modo, a composição do sujeito da presente invenção pode ser facultada, normalmente numa forma liofilizada num recipiente, ou isoladamente ou em conjunto 74 com anticorpos adicionais específicos para o tipo de célula desejada. Os anticorpos modificados, os quais podem ser conjugados com um marcador ou toxina, ou não conjugados, são incluídos nos kits com tampões, tais como Tris, fosfato, carboneto, etc., estabilizadores, biocidas, proteínas inertes, por exemplo, albumina sérica e semelhante, e um conjunto de instruções de utilização. Normalmente, estes materiais serão apresentados em menos do que cerca de 5% por peso com base na quantidade do anticorpo activo e normalmente presente na quantidade total de, pelo menos, cerca de 0,001% em peso, uma vez mais com base na concentração do anticorpo. Frequentemente, será desejável incluir um diluente inerte ou excipiente para diluir os ingredientes activos, onde o excipiente se pode encontrar presente em aproximadamente 1 a 99% em peso da composição total Quando, no ensaio, se emprega um segundo anticorpo capaz de se ligar a um anticorpo, então este encontra-se normalmente presente num frasco separado. O segundo anticorpo é normalmente conjugado para um marcador e formulado numa forma análoga com as formulações do anticorpo acima descritas.

Os anticorpos modificados possuem várias aplicações terapêuticas. Os anticorpos modificados podem ser utilizados para tratar um doente que sofra de, ou que tenha predisposição para, uma doença ou distúrbio, e que poderá beneficiar da administração dos anticorpos modificados. As condições que podem ser tratadas com os anticorpos incluem o cancro, condições inflamatórias tais como asma, doenças auto-imunes e infecções virais, etc.

Os cancros que podem ser tratados pelos anticorpos presentemente descritos incluem, mas não se limitam a, 75 cancro da mama, cancro de células escamosas, cancro de pulmão de pequenas células, cancro de pulmão de não-pequenas células, cancro gastrointestinal, cancro pancreático, qlioblastoma, cancro do colo do útero, cancro de ovário, cancro de bexiga, hepatoma, cancro de cólon, cancro colorretal, carcinoma de endométrio, carcinoma de glândulas salivares, cancro renal, cancro do fígado, cancro da próstata, cancro vulvar, cancro da tiróide, carcinoma hepático, e vários tipos de cancro de cabeça e pescoço.

As doenças auto-imunes incluem, mas não se limitam a, doença de Addison, doenças auto-imunes do ouvido, doenças auto-imunes dos olhos tal como uveite, hepatite auto-imune, doença de Chron, diabetes (tipo I), epididimite, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré, doença de Hashimoto, anemia hemolítica, lúpus eritematoso sistémico, esclerose múltipla, miastenia gravis, pênfigo vulgar, psoríase, artrite reumatóide, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatias, tiróidite, colite ulcerativa e vasculite.

Os anticorpos modificados com semi-vida no soro reduzida da presente invenção podem ser utilizados no tratamento de doenças ou perturbações em que se pretende a destruição ou a eliminação de tecido ou micro-organismos estranhos. Por exemplo, o anticorpo pode ser utilizado para tratar o cancro, doenças inflamatórias, infecções e outras condições em que se pretende a remoção do tecido. 0 anticorpo pode ser normalmente útil na medida em que os tempos de depuração biológica mais rápida resultariam em redução da imunogenicidade de qualquer anticorpo administrado. Outras aplicações incluiriam regimes de 76 imagens baseadas em anticorpos, a remoção de drogas baseadas em anticorpos ou criação de imunotoxinas com uma vida mais curta.

Os anticorpos modificados com semi-vida no soro elevada podem ser um anticorpo de factor anti-tecido (TF), anticorpo anti-lGE e o anticorpo anti-integrina. 0 mecanismo desejado de acção pode ser bloquear pares de ligação de receptores ligantes. Os anticorpos modificados com semi-vida no soro elevada podem igualmente ser anticorpos agonistas. Os anticorpos podem igualmente ser utilizados como agentes terapêuticos tais como vacinas. A dosagem e frequência de imunização de tais vacinas serão reduzidas devido à semi-vida no soro alargada dos anticorpos.

As composições que incluem os presentes anticorpos são administradas por qualquer meio adequado, incluindo administração parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento imunosupressivo local, administração intralesional As infusões parentéricas incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Para além disso, os anticorpos são administrados por infusão de pulso, particularmente com doses a diminuir de anticorpos.

As composições que contêm os anticorpos presentes ou um cocktail dos mesmos podem ser administradas para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em termos de aplicação terapêutica, as composições são administradas a um doente já afectado por uma determinada doença, numa quantidade suficiente para curar ou, pelo menos, parar 77 parcialmente a condição e suas complicações. Uma quantidade adequada para se obter tais efeitos é definida como "dose terapeuticamente eficaz". As quantidades eficazes para esta utilização irão depender da severidade da condição e estado geral do sistema imune do próprio doente, mas normalmente variam entre 0,01 e cerca de 100 mg do anticorpo modificado por dose, sendo mais comummente utilizadas com dosagens de 1 a 10 mg por doente.

Em termos de aplicações profiláticas, as composições que contêm os anticorpos modificados ou um cocktail dos mesmos são administradas a um doente que não se encontra ainda em estado doente para intensificar a resistência do doente. Esta quantidade é definida como sendo uma "dose profilática eficaz". Nesta utilização, mais uma vez, as quantidades precisas dependem do estado de saúde do doente e nivel geral de imunidade, mas normalmente variam entre 0,1 e 100 mg por dose, principalmente dosagens de 1 a 10 mg por doente.

Podem ser conduzidas administrações únicas ou múltiplas das composições, sendo que os níveis de dose e níveis padrão são seleccionados pelo médico responsável pelo tratamento do doente em causa. Em qualquer dos casos, as formulações farmacêuticas deverão facultar uma quantidade dos anticorpos mutantes desta invenção em quantidade suficiente para tratar o doente de modo eficaz.

Os exemplos que se seguem são apresentados como uma forma de demonstração e não como forma limitativa. 78

EXEMPLOS

Exemplo 1

Este exemplo descreve os vectores de expressão do anticorpo utilizados na presente invenção.

Os componentes do plasmídeo pVAg2M3-OST577 de expressão de cadeia pesada, um derivado da variante M3 de pVg2.D.Tt (Cole et al., J. Immunol. 159:3613-3621 (1997)), são como segue. Tal como apresentado na Figura 5A, considerando o processo no sentido do relógio a partir do sitio de EcoRI, a unidade de cadeia pesada começa com o citomegalovirus humano (hCMV) maior imediatamente antes (IE) do promotor e intensificador (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)) como um fragmento EcoRI-Xbal. A região hCMV é seguida pela região OST577 VH como um fragmento Xbal, incluindo sequência de sinal, segmento J e sequência de dadora de splicing. A região VH é seguida por um fragmento de ADN genómico modificado que contém a região constante de cadeia pesada gama-2M3 humana (Cole et al., op. cit.) como um fragmento Xbal-BamHI, incluindo CH1, a charneira (H) , CH2, e exões CH3 com os intrões intervenientes, parte do intrão que precede CH1, e um sinal de poliadenilação (poliA) para o processamento de mARN a seguir a CH3, seguido pelo terminador transcripcional do gene C2 complementar humano (Ashfield et al., EMBO J. 10 : 4197-4207 (1991)) como um fragmento BamHI-EcoRI. A unidade de cadeia pesada é seguida por um gene codificador de uma forma mutante de dihidrofolato reductase (dhfr), conjuntamente com elementos reguladores (intensificador, promotor, sinais de união, e sinal poliA) do Vírus 40 Siamian (SV40) necessário para efeitos de transcrição. Esta região, que foi considerada 79 como um fragmento BamHI-EcoRI do plasmídeo pVgl (Co et al., op. Cit.) foi modificada ao se converter o local BamHI num local EcoRI. No movimento do sentido do relógio dentro desta unidade a partir do local original EcoRI, primeiro existe uma parte do plasmídeo pBR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:77-90 (1979)) que inclui a origem de replicação bacteriana e o gene de resistência à ampicilina para selecção em E. coli, sendo que apenas a origem de replicação bacteriana foi substituída pelo segmento correspondente de pUC 18 (Yanisch-Perron et al. Gene 33:103-119 (1985)) para aumentar o número de cópias do vector nos hospedeiros bacterianos. A seguir, existe um segmento de SV40 (Reddy et al., Science 200:494-502 (1978)) que contém o intensificador SV40 e promotor anterior para assegurar a iniciação de uma transcrição forte. Este segmento é seguido por uma sequência codificadora do gene dhfr de E. coli (Simonsen and Levinson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:2495-2499 (1983)). O gene dhfr é seguido por um segmento SV40 que contém o pequeno intrão t antigénio, o qual se acredita que aumente os níveis de mARN e depois o plasmídeo que contém outro segmento SV40 que contém um sinal poliA para terminar a transcrição mARN.

Os componentes do plasmídeo de expressão de cadeia pesada pVAgl .N-OST577, um derivado de pVgl (Co et al., op. Cit.) são como segue. Tal como demonstrado na Figura 5B, considerando o processo no sentido do relógio a partir do sítio de EcoRI, a unidade de cadeia pesada começa com o mesmo fragmento EcoRI-Xbal contendo o promotor HCMV IE e intensificador que foi utilizado no vector pVAg2M3-OST577 seguido pela região OST577 VH como um fragmento Xbal. A 80 região VH é seguida por um fragmento de ADN genómico que contém uma região constante de cadeia pesada gama-1 humana (Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10:4071-4079 ( 1982)) como um fragmento Xbal-BamHI, incluindo CH1, a charneira (H) , Ch2, e exões CH3 com os intrões intervenientes, parte do intrão que precede CH1, e um sinal de poliA para o processamento de mARN a seguir a CH3. Para facilitar manipulações subsequentes das regiões codificadoras, a mutagénese PCR overlap-extension (Higuchi, op. cit.) foi utilizada para criar um local Nhel no intrão entre a charneira e exões CH2. A unidade de cadeia pesada é seguida pelo mesmo fragmento de restrição BamHI-EcoRI codificador de dhfr, conjuntamente com elementos regulatórios e uma porção de plasmídeo pBR322, que é utilizado no vector pVAg2M3-OST577 .

Os componentes do plasmídeo de expressão de cadeia leve pVAX2-OST577, um derivado de pVK (Co et al., op. Cit.) são como segue. Tal como demonstrado na Figura 6, considerando o processo no sentido do relógio a partir do sítio de EcoRI, a unidade de cadeia leve começa com o mesmo fragmento EcoRI-Xbal contendo o promotor HCMV IE e intensificador que foi utilizado nos vectores de cadeia pesada, seguido pela região OST577 VL como um fragmento Xbal, incluindo sequência de sinal, segmento J d sequência de dador de splicing. A região VL é seguido pelo fragmento de ADN genómico que contém a região constante de cadeia leve lambda-1 humana (Hieter et al., Nature 294:536-540 (1981)) como um fragmento Xbal-Sau3AI que foi modificado por PCR para codificar a região constante de cadeia leve lambda-2 humana (Hieter et al., ibid.), incluindo o intrão de cadeia leve lambda-1 humana, o exão da região constante 81 de cadeia leve lambda-2 humana (Οχ2) e uma porção da região 3' não traduzida da cadeia leve lambda-2 humana e um sinal poliA para processamento de mARN a partir da cadeia leve lambda-1 humana. 0 gene da cadeia leve é seguido por um gene codificador de xantina guanina fosforibolsilo transferase (gpt), conjuntamente com elementos regulatórios do SV40 necessários para efeitos de transcrição. A função desta região, a qual foi considerada como um fragmento BamHI-EcoRI a partir do plasmideo pSV2-gpt (Mulligan and Berg, op. cit.), serve para facultar um marcador fármaco-resistente seleccionável após transfecção do plasmideo em células mamíferas. Prosseguindo no sentido do relógio a partir do sítio de EcoRI, primeiro existe uma parte do plasmideo pBR322 (Sutcliffe, op. cit.) que inclui a origem bacteriana de replicação e gene de resistência à ampicilina para selecção em E. coli, sendo que apenas a origem de replicação bacteriana foi substituída pelo segmento correspondente de pUC18 (Yanisch-Perron et al., op. cit.) para aumentar o número de cópias do vector em hospedeiros bacterianos. A seguir, existe um segmento de SV40 (Reddy et al., op. cit.) que contém o intensificador SV40 e promotor anterior para assegurar a iniciação de uma transcrição forte. Este segmento é seguido pela sequência codificadora do gene E. coli gpt (Richardson et al., Nucleic Acids Res. 11:8809-8816 (1983)). O gene gpt é seguido por um segmento SV40 que contém o pequeno intrão t antigénio, o qual se acredita que aumente os níveis de mARN e depois o plasmideo que contém outro segmento SV40 que contém um sinal poliA para terminar a transcrição mARN.

Os componentes do plasmideo de expressão de cadeia pesada pVAg2M3-HulD10 (vide Figura 7A) são idênticos aos de 82 pVAg2M3-OST577 a partir do qual derivam, excepto da região OST577 VH que foi substituída pela região HulDIO VH do plasmídeo pHulDl0.IgGl.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001), op . cit.) Os componentes do plasmídeo de expressão de cadeia pesada pVAgl.N-HulD10 (vide Figura 7B) são idênticos aos de pVAgl.N-OST577 a partir do qual derivam, excepto da região OST577 VH que foi substituída pela região HulDIO VH do plasmídeo pHulDIO.IgGl.rgpt.dE (Kostelny et al., ibid).

Os componentes do plasmídeo de expressão de cadeia pesada pHuHCg3.Tt.D-HulDl0 (vide Figura 7C) são idênticos aos de pVg2.D.Tt (Col et al., op. cit.), excepto o fragmento Xbal-BamHI que contém a região constante da cadeia pesada 2M3 gama humana ter sido substituído pela região VH de HulDIO do plasmídeo pHulDIO.IgGl.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001), op. cit.) como um fragmento Xbal, seguido por um fragment de AND genómico que contém a região constante da cadeia pesada 3 gama (Huck et al., Nucleic Acids Res. 14:1779-1789 (1986)) como um fragment Xba-BamHI, incluindo os exões CH1, quatro charneiras (H) , Cr2, e Cr3 com os intrões intervenientes, parte do intrão que precede CH1 e um sinal de poliadenilação (poliA) para processamento de mARN após CH3. Os components do plasmídeo de expressão de cadeia pesada pHuHCg4.Tt.D-HulDIO (vide Figura 7D) são idênticos aos de pHuHCg3.Tt.D-HulDl0, com excepção da região constante da cadeia pesada de 3 gama humana ter sido substituída por um fragmento de AND genómico que contém a região constante da cadeia pesada 4 gama humana (Ellison et al., op. cit.) como um fragmento Xbal-BamHI, incluindo os exões CH1, charneira (H), CH2, e CH3 com os intrões intervenientes, parte do intrão que precede CH1 e um sinal 83 de poliadenilação (poliA) para processamento de mARN após

Ch3 .

Os componentes do plasmídeo de expressão de cadeia leve pVk-HulDIO, um derivado de pVK (Co et al., op. Cit. ) são como segue. Tal como demonstrado na Figura 8, considerando o processo no sentido do relógio a partir do sitio de

EcoRI, a unidade de cadeia leve começa com o mesmo fragmento EcoRI-Xbal contendo o promotor HCMV IE e intensificador que foi utilizado nos vectores de cadeia pesada, seguido pela região HulDIO VL (Kostelny et al. (2001), op. cit.) como um fragmento Xbal, incluindo sequência de sinal, segmento J d sequência de dador de splicing. A região VL é seguida por um fragmento de ADN genómico que contém a região constante de cadeia leve capa humana (Hieter et al., Cell 22:197-207 (1980)) como um fragmento Xbal-BamHI, incluindo o exão da região constante de cadeia leve kapa (Ck) , parte do intrão que precede Ck, e um sinal poliA para processamento de mARN a seguir a Ck. A unidade de cadeia leve é seguida pelo mesmo fragmento BamHI-EcoRI codificador de gpt, conjuntamente com elementos regulatórios necessários para efeitos de transcrição e uma porção do plasmídeo pBR322, que foi utilizado no vector pVk.

Exemplo 2

Este exemplo descreve os plasmídeos utilizados na presente invenção.

Os cADNs de cadeia pesada e leve OST577 foram integralmente clonados por PCR a partir de uma linhagem celular de trioma expressoras do anticorpo anti/HBV monoclonal humano OST577 (Ehrlich et al., op. cit.) . As 84 regiões variáveis de cadeia pesada e leve foram convertidas por PCR em mini-exões, flanqueados por sitios Xbal em ambas as extremidades, compreendendo as sequências de sinal, segmentos V, (D) e J, sequências dadoras de splicing e uma porção dos intrões correspondentes, como descrito por Co et al., supra. 0 vector de expressão pVAg2M3-OST577 (ver fig. 5A), um derivado da variante M3 de pVg2.D.Tt (Cole et al., op. cit. ) , foi construído por meio de substituição do fragmento Xbal contendo o mini-exão 0KT3-VH com o mini-exão OST577-Vh. Depois, o fragmento Pcil-Fspl contendo a origem da replicação bacteriana foi substituído pelo fragmento Pcil-Fspl correspondente de pUC18 (Yanisch-Perron et al., op. cit.) para aumentar o número de cópias do vector em hospedeiros bacterianos. 0 vector de expressão pVAgl-N-OST577 (ver figura 5B), um derivado de pVgl (Co et al., op. cit.), foi construído por meio de inserção de um fragmento Xbal contendo o mini-exão OST577-VH no sítio único Xbal de pVgl, modificando o intrão charneira CH2 por overlap-extension PCR (Higuchi, op. cit.) para criar um sítio Nhel único e substituindo o fragmento HindIII-Xhol contendo a origem da replicação bacteriana com o fragmento HindlII-Xhol correspondente de pVAg2M3-OST577 para aumentar o número de cópias do vector em hospedeiros bacterianos. 0 vector de expressão pVÀ2-OST577, um derivado de pVk (Co et al., op. cit.), foi construído substituindo primeiro o fragmento Xbal-BamHI de pVk contendo a região constante capa genómica humana com um produto de PCR Xbal-BglII, contendo a região constante lambda-1 genómica humana. A região codificadora e uma porção da região 3' não-traduzida foram substituídas eplo fragmento correspondente do cADN de cadeia leve OST577 por PCR, produzindo essencialmente um 85 exão da região constante lambda-2 humana genómica. Finalmente, o mini-exão OST577-VL foi inserido no sitio Xbal do vector. 0 vector de expressão pVAX2-OST577 (ver figura 6), um derivado de pVX2-OST577, foi construído substituindo o fragmento Sapl-Fspl contendo a origem de replicação bacteriana pelo fragmento Sapl-Fspl correspondente de pVAg2M3- OST577, para aumentar o número de cópias do vector em hospedeiros bacterianos. 0 vector de expressão pVAg2M3-HulDl0 (ver figura 7A) foi construído substituindo o fragmento Xhol-Xbal do plasmideo pVAg2M3-OST577, contendo o promotor hCMN e intensificador (Boshart et al., op. cit.) e a região OST577 VH pelo fragmento Xhol-Xbal correspondente do plasmideo pHulDl0.IgGI.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001), op . cit.) contendo o promotor hCMV e intensificador e a região HulDIO VH. O vector de expressão pVAgl.N-HulD10 (ver figura 7B) foi construído substituindo o fragmento Xhol-Xbal do plasmideo pVAgl.N-OST577, contendo o promotor hCMV e intensificador (Boshart et al., op. cit.) e a região OST577 VH pelo fragmento Xhol-Xbal correspondente do plasmideo pHulDIO.IgGI.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001), op. cit.) contendo o promotor hCMV e intensificador e a região HulDIO VH. O vector de expressão pHuHC.g3.Tt.D-HulDIO (vide Figura 7C) foi construído por substituição do fragmento Xhol-BamHI da variante M3 de pVg2.D.Tt (Cole et al., op. cit.), que contém o promotor e potenciador hCMV e a região constante da cadeia pesada 2M3 gama humana, por um fragmento Xhol-Xbal do plasmideo pHulDl0.IgGI.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001), op. cit.) que contém o promotor e potenciador hCMV e a região VH de HulDIO e um fragmento Xbal-BamHI que 86 contém a região constante de cadeia pesada 3 gama humana (Huck et al. , op. cit. ) , respectivamente. 0 vector de expressão pHuHC.g4.Tt.D-HulDl0 (vide Figura 7D) foi construído por substituição do fragmento Xhol-BamHI da variante M3 de pVg2.D.Tt (Cole et al., op. cit.)/· que contém o promotor e potenciador hCMV e a região constante da cadeia pesada 2M3 gama humana, por um fragmento Xhol-Xbal do plasmídeo pHulDIO.IgGl.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001), op. cit.) que contém o promotor e potenciador hCMV e a região VH de HulDIO e um fragmento Xbal-BamHI que contém a região constante de cadeia pesada 4 gama humana (Ellison et al., op. cit.), respectivamente. O vector de expressão pVk-HulDIO (ver figura 8) foi construído substituindo o fragmento Xhol-Xbal do plasmídeo pVk, (Co et al., op. cit.) contendo o promotor hCMV e intesificador (Boshart et al., op. cit.) pelo fragmento Xhol-Xbal do plasmídeo pHulDIO.IgGI.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001), op. cit.) contendo o promotor hCMV e intensificador e a região HulDIO VL. O vector de expressão base pDL172, um derivado de pVk.rg (Cole et al., op. cit.), foi construído substituindo o fragmento Xbal-Sphl contendo a região constante capa humana por um fragmento Xbal-Sphl constituído por um fragmento Xbal-Nhel contendo a porção N-terminal da sequência de sinal de cadeia pesada M195 (Co et al., op. cit.), um fragmento Nhel-Agel, um fragmento Agel-EagI sintético codificador de um decapeptídeo c-myuc humano, flanqueado por peptídeos ligantes, que é reconhecido pelo anticorpo monoclonar de ratinho 9E10 (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5:3610-3616 (1985)), seguido do sinal de ligação GPI do factor de aceleração da decomposição humano 87 (Caras et al., Nature 325:545-549 (1987)) e o fragmento

Eagl-Sphl contendo o sinal poly A do gene gamma-1 da imunoglobulina humana (Ellison et al., op. cit.). A microglobulina beta-2 humana (β2ιη) e os domínios extracelulares da cadeia alfa do receptor Fc neonatal humano (FcRn) foram clonados por PCR a partir da biblioteca de cADN, preparada a partir de células mononucleares de sangue periférico humano. 0 gene da cadeia alfa FcRn humano foi modificado por PCR para acrescentar um sítio Nhel de flanco e a porção C-terminal da sequência de sinal da cadeia pesada M195 (Co et al., op. cit.) na extremidade 5' e um sítio Agel de flanco na extremidade 3' e foi utilizado para substituir o fragmento Nhel-Agel de pDL172, resultando no vector de expressão pDLl72 + HuFcRn. 0 gene humano β2ιη foi modificado por PCR para acrescentar sítios Xbal e Sall de flanco nas extremidades 5' e 3' respectivamente e remover um sítio EcoRI interno. 0 fragmento Xbal-Sall resultante foi subclonado para um vector intermediário, flanqueado na respectiva extremidade 5' e por um fragmento EcoRI-Xbal contendo o promotor IE hCMV e intensificador (Boshart et al., op. cit.) e na respectiva extremidade 3' por um fragmento SalI-BamHI contendo o sinal de poliadenilação do gene gamma-2a da imunoglobulina de murino (Kostelny et al. (1992), op. cit.), seguido de um fragmento BamHI-EcoRI contendo o terminador da transcrição do gene C2 complementar humano (Ashfield et al., op. cit.). 0 fragmento EcoRI-EcoRI resultante, contendo uma unidade de transcrição β2ιη humana funcional foi clonado no sítio EcoRI único de pDL172 + HuFcRn, resultando no vector de expressão pDL172 + HuFcRn + Hup2m, doravante designado pDL208 (ver figura 9A). β2ιη Rhesus e os domínios extracelulares da cadeia alfa FcRn de Rhesus foram clonados por PCR a partir da biblioteca de cADN, preparada a partir de células mononucleares de sangue periférico de rhesus. 0 gene rhesus β2ιη foi modificado por PCR para acrescentar sítios Xbal e Sall de flanco nas extremidades 5' e 3' respectivamente e remover um sítio EcoRI interno. 0 fragmento Xbal-Sall resultante foi subclonado para um vector intermediário, flanqueado na respectiva extremidade 5' e por um fragmento EcoRI-Xbal contendo o promotor IE hCMV e intensificador (Boshart et al., op. cit.) e na respectiva extremidade 3' por um fragmento SalI-BanHI contendo o sinal de poliadenilação do gene gamma-2a da imunoglobulina de murino (Kostelny et al. (1992), op. cit.), seguido de um fragmento BamHI-EcoRI contendo o terminador da transcrição do gene C2 complementar humano (Ashfield et al., op. cit.). 0 fragmento EcoRI-EcoRI resultante, contendo uma unidade de transcrição β2ιη rhesus foi utilizado para substituir o fragmento EcoRI-EcoRI (contendo a unidade transcricional β2ιη humana) de pDL172 + HuFcRn + Ηυβ2ιη, resultando em pDL172 + HuFcRn + R]^2m. 0 gene da cadeia alfa FcRn de rhesus foi modificado por PCR para acrescentar um sítio Nhel de flanco e a porção C-terminal da sequência de sinal da cadeia pesada M195 (Co et al., op. cit.) na extremidade 5' e um sítio Agel de flanco na extremidade 3' e foi utilizado para substituir o fragmento Nhel-Agel de pDL172 (contendo o gene da cadeia alfa FcRn humano) de pDL172 + HuFcRn + Rh32m, resultando no vector de expressão pDL172 + RhFcRn + Rhp2m,doravante designado pDL410 (ver figura 9B). 89

Exemplo 3

Este exemplo descreve a mutagénese da região Fc do gene de cadeia pesada γ2Μ3 humano.

Modelação Molecular:

Um modelo inicial do complexo Fc/FcRn humano foi gerado com base numa estrutura cristalina de baixa resolução do complexo Fc/FcRn de rato (Burmeister et al., Nature 372:379-383 (1994); código 1FRT da base de dados de proteínas RCSB) . Em primeiro lugar, ο β2ιη de rato do complexo é substituído por superimposição de β2ιη humano, recolhido de uma estrutura cristalina de alta-resolução do antigénio histocompatibilidade humana HLA-A2 (Saper et al. J. Mol. Biol. 219:277-319 (1991); RCSB, código 3HLA) com a mesma orientação que β2ιη de rato no complexo. Em primeiro lugar, ο β2ιη de rato do complexo é substituído por superimposição de β2ιη humano, recolhido de uma estrutura cristalina de alta-resolução do antigénio histocompatibilidade humana HLA-A2 (Saper et al. J. Mol. Biol. 29:9698-9708 (2000); RCSB, código 3HLA) com a mesma orientação que β2ιη de rato no complexo. Em seguida, os resíduos de rato da Fc do complexo foram substituídos pelos resíduos correspondentes do IgGl Fc humano (Kabat et al., op. cit.) e foram realizados cálculos de minimização da energia utilizando ou programas SEGMOD e ENCAD (Levitt, J. Mol. Biol. 226:507-533 (1992); Levitt, J. Mol. Biol. 168:595-620 (1983)) para produzir um modelo do complexo Fc/ FcRn de IgGl humano. Finalmente os resíduos de Fc de IgGl humanos do modelo foram substituídos pelos resíduos correspondentes do IgG2M3 Fc (Cole et al., op. cit.), e os cálculos de minimização da energia foram repetidos para 90 produzir um modelo do complexo IgG2M3 Fc/FcRn humano, doravante designado modelo 1.

Um segundo modelo do complexo Fc/FcRn IgG2M3 humano foi gerado com anteriormente descrito com base no modelo do complexo Fc/FcRn de rato (Weng et al., J. Mol. Biol. 282:217-225 (1998); RCSB code 2FRT), doravante designado por modelo 2.

Foi gerado um terceiro modelo com anteriormente descrito com base na estrutura cristalina de alta-resolução de um complexo heterodimérico Fc/FcRn de rato (Martin et al., Mol. Cell 7: 867-877 (2001); código 1 | 1 A de RCSB), doravante designado por modelo 3.

Mutagénese: IN), segundo as 0 método de reacção em cadeia de polimerase (PCR) overlap-extension (Higuchi, op. cit.) foi utilizado para gerar substituições aleatórias de aminoácido nas posições 250, 314 e 428 da cadeia pesada OST577-IgG2M3 (numerada de acordo com o índice UE de Kabat et al., op. cit.) . Para gerar mutantes aleatóreos na posição 250, foram utilizaods os iniciadores da mutagénese JY24 (5' - GAC CTC AGG GGT CCG GGA GAT CAT GAG MNN GTC CTT GG - 3') (SEQ ID NO: 77) e JY25 (5' - CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC - 3') (SEQ ID NO: 78) em que M = A ou C e N = A, C, G ou T. O primeiro ciclo de PCR overlap-extension utilizou o iniciador externo msc g2-l (5' - CCA GCT CTG TCC CAC ACC G - 3') (SEQ ID NO: 79) e JY24 para o fragmento esquerdo e o iniciador externo kco8 (5'- GCC AGG ATC CGA CCC ACT - 3') (SEQ ID NO: 80) e JY25 para o fragmento direito. A reacção PCR foi realizada utilizando o sistema PCR Expand™ High Fidelity (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, 91 recomendações do fabricante, incubando a 94°C durante 5 minutos, seguido de 25 ciclos a 94°C durante 5 segundos, 55°C durante 5 segundos e 72°C durante 60 segundos seguido de incubação a 72°C durante 7 minutos num sistema GeneAmp® PCR 9600 (Applied Biosystems®, Foster City, CA) . Os produtos de PCR foram passados por um gel de agarose de baixo ponto de fusão, excisados do gel e fundidos a 70°C. O segundo ciclo de PCR para combinar os fragmentos esquerdo e direito foi realizado como anteriormente descrito, utilizando os iniciadores externos msc g2-l e kco8 durante 35 ciclos. Os produtos de PCR finais foram passados por gel de agarose de baixo ponto de fusão e foram excisados os fragmentos de ADN com o tamanho previsto e purificados utilizando o QIAEX™II Gel Extraction Kit (QIAGEN®, Valência, CA) . Os fragmentos purificados foram digeridos com PinAI e BamHI, purificados em gel como anteriormente descrito e clonados entre os sítios correspondentes em pVAg2M3-OST577.

Para gerar os mutantes T250I e T250L, foram utilizaods os iniciadores da mutagénese KH4 (5'-GAC CTC AGG GGT CCG GGA GAT CAT GAG AAK GTC CTT GG - 3') (SEQ ID NO: 81) e KH3 (5' - CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC - 3') (SEQ ID NO: 82) em que K = G ou T. Para gerar os mutantes T250C e T250G, foram utilizados os iniciadores da mutagénese KH5 (5'- GAC CTC AGG GGT CCG GGA GAT CAT GAG GCM GTC CTT GG -3') (SEQ ID NO: 83) e KH3 em que M = A ou C. Para gerar os mutantes T250N e T250Q, foram utilizados os iniciadores da mutagénese KH6 (5'- GAC CTC AGG GGT CCG GGA GAT CAT GAG NTK GTC CTT GG - 3') (SEQ ID NO: 84) e KH3 em que K = G ou T e N = A, C, G ou T. O primeiro ciclo de PCR utilizou o iniciador externo msc g2-l e KH4, KH5 ou KH6 para o 92

fragmento esquerdo e o iniciador externo MGD-1 (5'- GCC AGG ATC CGA CCC ACT - 3' ) (SEQ ID NO: 85) e KH3 para o fragmento direito. As reacções PCR foram realizadas utilizando o sistema PCR Expand™ High Fidelity (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) , incubando a 94°C durante 5 minutos, seguido de 25 ciclos a 94°C durante 5 segundos, 60 °C durante 5 segundos e 72°C durante 60 segundos seguido de incubação a 72°C durante 7 minutos. Os produtos de PCR foram passados por um gel de agarose de baixo ponto de fusão, excisados do gel e fundidos a 70°C. O segundo ciclo de PCR para combinar os fragmentos esquerdo e direito foi realizado como anteriormente descrito, utilizando iniciadores externos msc g2-l e MGD-1, incubando a 94°C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 94°C durante 5 segundos, 60°C durante 5 segundos e 72°C durante 105 segundos, seguido de incubação a 72°C durante 7 minutos. Os produtos de PCR finais foram passados por gel de agarose de baixo ponto de fusão e foram excisados os fragmentos de ADN com o tamanho previsto e purificados utilizando o QIAquick™ Gel Extraction Kit (QIAGEN®). Os fragmentos purificados foram digeridos com PinAI e BamHI, purificados em gel como anteriormente descrito e clonados entre os sitios correspondentes em pVAg2M3-OST577.

Para gerar mutantes aleatórios na posição 314, foram utilizados os iniciadores da mutagénese kco78 (5' - ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG NNK AAC GGC AAG GAG - 3') (SEQ ID NO: 86) e kco79 (5'- CCA GTC CTG GTG CAC AAC GG - 3') (SEQ ID NO: 87) em que K = G ou T e N = A, C, G ou T. O primeiro ciclo de PCR utilizou o iniciador externo ks g2-5 (5' - CTC CCG GAC CCC TGA GGT C - 3') (SEQ ID NO: 88) e kco79 para o fragmento esquerdo e o iniciador externo kco8 e kco78 para 93 o fragmento direito. Todas as etapas seguintes foram efectuadas como anteriormente descrito para a mutagénese aleatória da posição 250, com excepção do segundo ciclo de PCR que utilizou iniciadores externos ks g2-5 e kco8 e os fragmentos de PCR finais foram digeridos com Pmll e BamHI e clonados nos sitios correspondentes em pVAg2M3-OST577.

Para gerar o mutante L314I foram utilizados os iniciadores de mutagénese MGD-10 (5'- ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG ATC AAC GGC AAG GA - 3') (SEQ ID NO: 89) e kco79. Para gerar o mutante L314Y foram utilizados os iniciadores de mutagénese MGD-11 (5'- ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG TAT AAC GGC AAG GA - 3') (SEQ ID NO: 90) e kco79. Para gerar o mutante L314H foram utilizados os iniciadores de mutagénese MGD-12 (5'- ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG CAC AAC GGC AAG GA - 3') (SEQ ID NO: 91) e kco79. Para gerar o mutante L314M foram utilizados os iniciadores de mutagénese MGD-13 (5'-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG ATG AAC GGC AAG GA - 3') (SEQ ID NO: 92) e kco79. Para gerar o mutante L314N foram utilizados os iniciadores de mutagénese MGD-14 (5'- ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG AAT AAC GGC AAG GA - 3') (SEQ ID NO: 93) e kco79. O primeiro ciclo de PCR utilizou o iniciador externo jt240 (5'- GGA CAC CTT CTC TCC TCC C - 3') (SEQ ID NO: 94) e kco79 para o fragmento esquerdo e o iniciador externo kco41 (5'- ATT CTA GTT GTG GTT TGT CC - 3') (SEQ ID NO: 95) e MGD-10, MGD-11, MGD-12, MGD-13 ou MGD-14 para o fragmento direito. As reacções PCR foram realizadas utilizando o sistema PCR Expand™ High Fidelity (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN), incubando a 94°C durante 5 minutos, seguido de 25 ciclos a 94°C durante 5 segundos, 60°C durante 5 segundos e 72°C durante 60 segundos seguido de incubação a 72°C durante 7 minutos. Os 94 produtos de PCR foram passados por um gel de agarose de baixo ponto de fusão, excisados do gel e fundidos a 70°C. 0 segundo ciclo de PCR para combinar os fragmentos esquerdo e direito foi realizado como anteriormente descrito, utilizando iniciadores externos jt240 e kco41, incubando a 94°C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 94°C durante 5 segundos, 60°C durante 5 segundos e 72°C durante 90 segundos, seguido de incubação a 72°C durante 7 minutos. Os produtos de PCR finais foram passados por gel de agarose de baixo ponto de fusão e foram excisados os fragmentos de ADN com o tamanho previsto e purificados utilizando o QIAquick™ Gel Extraction Kit (QIAGEN®). Os fragmentos purificados foram subclonados em pCR®4Blunt-TOPO® (Invitrogen™, Carlsbad, CA) , depois foram digeridos com Pmll e BamHI, purificados em gel como anteriormente descrito e clonados entre os sítios correspondentes em pVAg2M3-OST577.

Para gerar mutantes aleatórios na posição 428, foram utilizados os iniciadores da mutagéneseJY22 (5'- GAA CGT CTT CTC ATG CTC CGT GNN KCA TGA GGC TCT G - 3') (SEQ ID NO: 96) e JY23 (5' - CAC GGA GCA TGA GAA GAC GTT C - 3') (SEQ ID NO: 97) em que K = G ou T e N = A, C, G ou T. O primeiro ciclo de PCR utilizou o iniciador externo ks g2-5 e JY23 para o fragmento esquerdo e o iniciador externo kco8 e JY22 para o fragmento direito. Todas as etapas seguintes foram efectuadas como anteriormente descrito para a mutagénese aleatória da posição 314.

Para gerar mutantes aleatórios adicionais na posição 428, foram utilizaods os iniciadores da mutagénese JMGD-2 (5'- GTG TAG TGG TTG TGC AGA GCC TCA TGM NNC ACG GAG CAT GAG AAG - 3') (SEQ ID NO: 98) e KH1 (5'- CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC AC - 3') (SEQ ID NO: 99) em que M = A ou C 95 e Ν = A, C, G ou T. 0 primeiro ciclo de PCR utilizou o iniciador externo msc g2-l e MGD-2 para o fragmento esquerdo e o iniciador externo MGD-1 e KH1 para o fragmento direito. A reacção PCR foi realizada utilizando o sistema PCR Expand™ High Fidelity (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) , incubando a 94°C durante 5 minutos, seguido de 25 ciclos a 94°C durante 5 segundos, 60°C durante 5 segundos e 72°C durante 90 segundos seguido de incubação a 72 °C durante 7 minutos. Os produtos de PCR foram passados por um gel de agarose de baixo ponto de fusão, excisados do gel e fundidos a 70°C. O segundo ciclo de PCR para combinar os fragmentos esquerdo e direito foi realizado como anteriormente descrito, utilizando iniciadores externos msc g2-l e MGD-1, incubando a 94°C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 94°C durante 5 segundos, 60°C durante 5 segundos e 72°C durante 75 segundos, seguido de incubação a 72°C durante 7 minutos. Os produtos de PCR finais foram passados por gel de agarose de baixo ponto de fusão e foram excisados os fragmentos de ADN com o tamanho previsto e purificados utilizando o QIAquick™ Gel Extraction Kit (QIAGEN®). Os fragmentos purificados foram digeridos com PinAI e BamHI, purificados em gel como anteriormente descrito e clonados entre os sítios correspondentes em pVAg2M3-OST577.

Para gerar o mutante M428E foram utilizados os iniciadores de mutagénese MGD-8 (5'- GTG TAG TGG TTG TGC AGA GCC TCA TGT TCC ACG GAG CAT GAG AAG - 3') (SEQ ID NO: 100) e KH1. O primeiro ciclo de PCR utilizou o iniciador externo msc g2-l e MGD-8 para o fragmento esquerdo e o iniciador externo MGD-1 e KH1 para o fragmento direito. Todas as etapas seguintes foram efectuadas como 96 anteriormente descrito para a mutagénese aleatória da posição 428. 0 mutante duplo T250E/M428F foi gerado por meio de substituição do fragmento PmlI-BamHI no plasmídeo pVAg2M3-OST577 contendo a mutação T250E pelo fragmento PmlI-BamHI do plasmídeo pVAg2M3-OST577 contendo a mutação M428F. Os mutantes duplos T250Q/M428F e T250Q/M428L foram gerados por meio de substituição do fragmento PmlI-BamHI no plasmídeo pVAg2M3-OST577 contendo a mutação T250Q pelo fragmento PmlI-BamHI dos plasmídeos pVAg2M3-OST577 contendo as mutações M428F e M428L respectivamente.

Foram também criadas várias substituições de aminoácidos nas posições 250 e 428 da cadeia pesada HulDlO-IgG2M3. Para gerar o mutante M428L, o fragmento Xhol-Xbal do plasmídeo pVAg2M3-OST577 (M428L), contendo o promotor hCMN e intensificador (Boshart et al., op. cit.) e a região OST577 VH foi substituído pelo fragmento Xhol-Xbal correspondente do plasmídeo pHulDIO.IgGI.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001), op. cit.) contendo o promotor hCMV e intensificador e a região HulDIO VH. Para gerar o mutante T250Q/M428L, o fragmento Xhol-Xbal do plasmídeo pVAg2M3-OST577 (T250Q/M428L), contendo o promotor hCMN e intensificador (Boshart et al., op. cit.) e a região OST577 VH foi substituído pelo fragmento Xhol-Xbal correspondente do plasmídeo pHulDIO.IgGI.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001), op. cit.) contendo o promotor hCMV e intensificador e a região HulDIO VH. O ADN plasmídico foi preparado utilizando o QIAprep™ Spin Miniprep Kit (QIAGEN®) e as substituições de nucleótidos foram identificadas por sequenciação Foram 97 efectuadas preparações de ADN plasmídico em grande escala utilizando EndoFree® Plasmid Maxi Kit (QIAGEN®). As regiões codificadoras dos plasmídeos de expressão OST577-IgG2M3 foram verificadas por sequenciação de nucleótidos.

Resultados:

Para isolar os mutantes IgG humanos com maior ou menor afinidade para o receptor Fc nenonatal (FcRn), que se esperaria ter alterado as semi-vidas no soro, foram geradas substituições de aminoácidos aleatórias nas posições 250, 314 e 428 da cadeia pesada γ2Μ3 humana (numerada segundo o índice UE de Kabat et al., op. cit.) · Estas três posições foram escolhidas com base em modelação por computador de um complexo de IgG2M3 Fc humano e FcRn humano (ver modelos 1, 2 e 3 que foram anteriormente descritas no exemplo), que foi deduzida da estrutura cristalina em raios-x do complexo Fc/FcRn de rato (Burmeister et al., op. cit.). Embora os aminoácidos de tipo selvagem nas posições 250, 314 e 428 estejam localizados próximo da interface Fc/FcRn, aparentemente estes resíduos não contribuem directamente para interacção entre Fc e FcRn dependente do pH. - Por conseguinte, as substituições de aminoácidos nestas posições podem aumentar (ou diminuir) a afinidade de Fc para FcRn, mantendo sempre a ligação dependente do pH. Entre os mutantes singulares gerados por mutagénese baseada em PCR existiam 19 mutantes que converteram o T de tipo selvagem na posição 250 em A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W ou Y; 19 mutantes que convertera, o tipo selvagem L na posição 314 em A, C, D, E, F, G, Η, I, K, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y; e 19 mutantes que converteram o M de tipo selvagem na posição 428 em A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y (ver 98 quadro 1). Alguns dos mutantes singulares com ligação intensificada a FcRN foram combinados para gerar vários mutantes duplos, incluindo T250E/M428F, T250Q/M428F, e 1750Q/M428L.

Exemplo 4

Este exemplo descreve a mutagénese da região Fc do gene de cadeia pesada γΐ humano.

Mutagénese:

0 método de PCR overlap-extension (Higuchi, op. cit.) foi utilizado para gerar substituições aleatórias de aminoácido nas posições 250 e 428 da cadeia pesada OST577-IgGl (numerada de acordo com o índice UE de Kabat et al., op. cit.). Para gerar o mutante T250E, foram utilizados os iniciadores da mutagénese XO76 (5' - AAC CCA AGG ACG AAC TCA TGA TCT CCC G - 3') (SEQ ID NO: 101) e JX0 7 7 (5'- GGA GAT CAT GAG TTC GTC CTT GGG TTT TG - 3') (SEQ ID NO: 102). O primeiro ciclo de PCR overlap-extension utilizou o iniciador externo JX080 (5' - CCT CAG CTC GGA CAC CTT CTC -3') (SEQ ID NO: 103) e JX077 para o fragmento esquerdo e o iniciador externo NT244 (5' - GCC TCC CTC ATG CCA CTC A -

3') (SEQ ID NO: 104) e JX076 para o fragmento direito. A reacção PCR foi realizada utilizando o sistema PCR Expand™ High Fidelity (Roche Diagnostics Corporation), segundo as recomendações do fabricante, incubando a 94°C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 94°C durante 20 segundos, 55°C durante 20 segundos e 72°C durante 90 segundos seguido de incubação a 72°C durante 7 minutos num sistema GeneAmp® PCR 9600 (Applied Biosystems®) . Os produtos de PCR foram passados por um gel de agarose de baixo ponto de fusão, excisados do gel e fundidos a 70°C. O segundo ciclo de PCR 99 para combinar os fragmentos esquerdo e direito foi realizado como anteriormente descrito, utilizando os iniciadores externos JX080 e NT244 e kco8 durante 35 ciclos. Os produtos de PCR finais foram passados por gel de agarose de baixo ponto de fusão e foram excisados os fragmentos de ADN com o tamanho previsto e purificados utilizando o QIAquick™II Gel Extraction Kit (QIAGEN®). Os fragmentos purificados foram digeridos com Nhel e Eagl, purificados em gel como anteriormente descrito e clonados entre os sítios correspondentes em pVAgl.N-0ST577.

Para gerar o mutante T250D, foram utilizados os iniciadores da mutagénese JX087 (5' - AAC CCA AGG ACG ACC TCA TGA TCT CCC G - 3') (SEQ ID NO: 105) e JX088 (5' - GGA GAT CAT GAG GTC GTC CTT GGG TTT TG - 3') (SEQ ID NO: 106). O primeiro ciclo de PCR utilizou os iniciadores externos JX080 e JX088 para o fragmento esquerdo e os iniciadores externos NT244 e JX087 para o fragmento direito. Todas as etapas seguintes foram efectuadas como anteriormente descrito.

Para gerar o mutante M428F, foram utilizados os iniciadores da mutagénese JX078 (5'- CTC ATG CTC CGT GTT CCA TGA GGC TCT GC - 3') (SEQ ID NO: 107) e JX079 (5' - AGA GCC TCA TGG AAC ACG GAG CAT GAG - 3') (SEQ ID NO: 108). O primeiro ciclo de PCR utilizou o iniciador externo JX080 e JX079 para o fragmento esquerdo e os iniciadores externos NT244 e JX078 para o fragmento direito. Todas as etapas seguintes foram efectuadas como anteriormente descrito.

Para gerar o mutante M428L, foram utilizados os iniciadores da mutagénese JXM428L1 (5' - CTC ATG CTC CGT GTT GCA TGA GGC TCT GC - 3') (SEQ ID NO: 109) e JXM428L2 100 (5' - AGA GCC TCA TGC AAC ACG GAG CAT GAG - 3') (SEQ ID NO: 110). O primeiro ciclo de PCR utilizou o iniciador externo JX080 e JXM428L2 para o fragmento esquerdo e os iniciadores externos NT244 e JXM428L1 para o fragmento direito. Todas as etapas seguintes foram efectuadas como anteriormente descrito.

Para gerar o mutante T250Q, foram utilizados os iniciadores da mutagénese JXT250Q1 (5' - AAC CCA AGG ACC AAC TCA TGA TCT CCC G - 3') (SEQ ID NO: 111) e JXT250Q2 (5' - GGA GAT CAT GAG TTG GTC CTT GGG TTT TG - 3') (SEQ ID NO: 112). O primeiro ciclo de PCR utilizou o iniciador externo JX080 e JXT250Q2 para o fragmento esquerdo e os iniciadores externos NT244 e JXT250Q1 para o fragmento direito. Todas as etapas seguintes foram efectuadas como anteriormente descrito.

Para gerar o mutante duplo T250E/M428F, os iniciadores de mutagénese JX076 e JX077 foram utilizados para criar a mutação T250E num modelo contendo a mutação M428F. O primeiro ciclo de PCR utilizou o iniciador externo JX080 e JX077 para o fragmento esquerdo e os iniciadores externos NT244 e JX076 para o fragmento direito. Todas as etapas seguintes foram efectuadas como anteriormente descrito.

Para gerar o mutante duplo T250Q/M428L, os iniciadores de mutagénese JXT250Q1 e JXT250Q2 foram utilizados para criar a mutação T250Q e os iniciadores de mutagénese JXM428L1 e JXM428L2 foram utilizados para criar a mutação M428L. 0 primeiro ciclo de PCR utilizou o iniciador externo JX080 e JXT250Q2 para o fragmento esquerdo, JXT250Q1 e JXM428L2 para criar o fragmento intermédio e os iniciadores externos NT244 e JXM428L1 para o fragmento direito. Todas 101 as etapas seguintes foram efectuadas como anteriormente descrito.

Foram também criadas várias substituições de aminoácidos nas posições 250 e 428 da cadeia pesada HulDlO-IgGl. Para gerar o mutante M428L, o fragmento Xhol-Xbal do plasmideo pVAgl.N-OST577 (M428L), contendo o promotor hCMN e intensificador (Boshart et al., op. cit.) e a região OST577 VH foi substituído pelo fragmento Xhol-Xbal correspondente do plasmideo pHulDIO.IgGI.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001), op. cit.) contendo o promotor hCMV e intensificador e a região HulDIO VH. Para gerar o mutante T250Q/M428L, o fragmento Xhol-Xbal do plasmideo pVAgl.N-OST577 (T250Q/M428L), contendo o promotor hCMN e intensificador (Boshart et al., op. cit.) e a região OST577 VH foi substituído pelo fragmento Xhol-Xbal correspondente do plasmideo pHulDIO.IgGI.rgpt.dE (Kostelny et al. (2001), op. cit.) contendo o promotor hCMV e intensificador e a região HulDIO VH. 0 ADN plasmídico foi preparado utilizando o QIAprep™ Spin Miniprep Kit (QIAGEN®) e as usbst ituições de nucleótidos foram confirmadas por sequenciação Foram efectuadas preparações de ADN plasmídico em grande escala utilizando EndoFree™ Plasmid Maxi Kit (QIAGEN®). As regiões codificadoras dos plasmídeos de expressão OST577-IgGl foram verificadas por sequenciação de nucleótidos.

Resultados:

Para identificar mutantes IgG humanos com afinidade modificada para o receptor Fc nenonatal (FcRn), que se esperaria ter as semi-vidas no soro alteradas, foram geradas substituições de aminoácidos aleatórias nas 102 posições 250 e 428 da cadeia pesada γΐ humana (numerada segundo o índice UE de Kabat et al., op. cit.). Estas duas posições foram escolhidas com base na identificação das mutações nestas posições na cadeia pesada γ2Μ3 humana, que teve como resultado uma ligação maior ou menor a FcRn. Embora os aminoácidos de tipo selvagem nas posições 250 e 428 estejam localizados próximo da interface Fc/FcRn, aparentemente estes resíduos não contribuem directamente para interacção entre Fc e FcRn dependente do pH. Por conseguinte, as substituições de aminoácidos nestas posições podem aumentar (ou diminuir) a afinidade de Fc para FcRn, mantendo sempre a ligação dependente do pH. Os mutantes tanto singulares como duplos que apresentavam uma mair ligação no contexto da cadeia pesada γ2Μ3 humana foram avaliados na cadeia pesada γΐ humana, incluindo os mutantes singulares T250E, T250Q, M428F e M428L e os mutantes duplos T250E/M428F e T250Q/M428L. Um mutante singular que exibiu uma ligação menor no contexto da cadeia pesada γ2Μ3 humana (T250D) foi também avaliado na cadeia pesada γΐ humana.

Exemplo 5

Este exemplo descreve a caracterização dos anticorpos

mutantes IgG2M3 e IgGl. Cultura de células: A linha celular 293-H do rim humano (Life Technologies®, Rockville, MD) foi mantida em DMEM

(BioWhittaker™, Walkersville, MD) contendo soro fetal de bovino 10% (FBS) (HyClone®, Logan, UT), 0,1 mM MEM

Para a expressão e aminoácidos não-essenciais (Invitrogen™) e 2 mM de L-glutamina (Invitrogen™), doravante designado meio 293, a 37°C, em incubadora a 7,5% de C02. 103 purificação de anticorpos monoclonais após transfecção transitória, células 293-H foram incubadas em DMEM contendo 10% FBS de IgG baixo (HyClone®), 0,1 mM MEM aminoácidos não essenciais e 2 mM de L-glutamina, doravante designado meio 293 de baixo teor de IgG. A linhagem celular de mieloma do ratinho Sp2/0 (American Type Culture Collection, Manassus, VA) foi mantida em DMEM contendo FBS 10% e 2 mM de L-glutmaina. Para a purificação de anticorpos monoclonais depois de transfecções estáveis, as células Sp2/0 foram adaptadas ao crescimento em hibridoma-SFM (HSFM) (Life Technologies®) .

Transfecções transitórias. Células 293-H foram co-transfectadas de modo transitório com o plasmídeo de cadeia leve apropriado e o tipo selvagem apropriado ou os plasmídeos de cadeia pesada mutados que contêm uma substituição simples ou dupla de aminoácido na posição 250, 314 ou 428. Para transfecções transitórias em pequena escala, cultivou-se aproximadamente 1 x 106 células por transfecção numa placa de 6 poços em 3 ml de meio 293 e foram cultivadas de um dia para o outro até à confluência. No dia seguinte, combinaram-se 2 pg de plasmídeo de cadeia leve e 2 pg de plasmídeo de cadeia pesada de tipo selvagem ou mutado com 0,25 ml de HSFM. Num tubo de ensaio em separado, foram combinados 10 p de reagente Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen™) e 0,25 ml de HSFM e foram incubados durante 5 minutos à temperatura ambiente. A mistura de 0,25 ml de Lipofectamine™ 2000-HSFM foi misturada suavemente com a mistura de 0,25 ml de ADN-HSFM e foi incubada à temperatura ambiente durante 20 minutos. O meio que cobria as células 293-H foi aspirado e substituído por meio 293 de baixo teor de IgG, depois foram 104 adicionados gota a gota os complexos lipofectamina-ADN às células, foram misturados suavemente utilizando um sistema de vórtice, e as células foram incubadas durante 5 a 7 dias a 37°C numa incubadora a 7,5% de CO2, antes da colheita dos sobrenadantes.

Para transfecções transitórias em pequena escala, cultivou-se aproximadamente 7 x 106 células por transfecção num balão T-75 em 25 ml de meio 293 e foram cultivadas de um dia para o outro até à confluência. No dia seguinte, combinaram-se 12 pg de plasmideo de cadeia leve e 12 pg de plasmideo de cadeia pesada de tipo selvagem ou mutado com 1,5 ml de HSFM. Num tubo de ensaio em separado, foram combinados 60 p de reagente Lipofectamine™ 2000 e 1,5 ml de HSFM e foram incubados durante 5 minutos à temperatura ambiente. A mistura de 1,5 ml de Lipofectamine™ 2000-HSFM foi misturada suavemente com a mistura de 1,5 ml de ADN-HSFM e foi incubada à temperatura ambiente durante 20 minutos. O meio que cobria as células 293-H foi aspirado e substituído por meio 293 de baixo teor de IgG, depois foram adicionados gota a gota os complexos lipofectamina-ADN às células, foram misturados suavemente utilizando um sistema de vórtice, e as células foram incubadas durante 5 a 7 dias a 37°C numa incubadora a 7,5% de CO2, antes da colheita dos sobrenadantes.

Concentração de anticorpos:

Os sobrenadantes das transfecções transitórias em pequena escala foram colhidos por centrifugação a -1,200 rpm durante 5 minutos e esterilizados por filtração com microfiltros de 0,22 pm Millex®-GV (Millipore® Corporation, Bedford, MA). As amostras foram concentradas 105 aproximadamente 6 vezes até 0,5 ml, utilizando 6 ml de concentradores Vivaspin® (50,000 MWCO) (Vivascience® AG, Hannover, Alemanha) por centrifugação a 3.000 rpm. As amostras de proteína concentradas foram ressuspensas em 5 ml de PBS, pH 6,0 e concentradas até um volume de 0,5 ml como anteriormente descrito. O método ELISA descrito seguidamente foi empregue para medir a concentração de anticorpos em cada amostra.

Transfecções estáveis: Células Sp2/0 foram transfectadas de modo estável com o plasmideo de cadeia leve apropriado e o tipo selvagem apropriado ou os plasmídeos de cadeia pesada mutados gue contêm uma substituição simples ou dupla aminoácido na posição 250 ou 428. Lavaram-se aproximadamente 1 x 107 células com 10 ml de PBS e ressuspenderam-se em 1 ml de PBS. Aproximadamente 25 a 30 pg de plasmideo de cadeia leve e 50 a 60 pg de plasmideo de cadeia pesada foram linearizados com Fspl e adicionados às células. Células e ADN foram misturados suavemente e transferidos para uma cuvete Gene Pulser (Bio-Rad® Laboratories, Hercules, CA) em gelo. As células foram electroporadas utilizando um Gene Pulser II (Bio-Rad® Laboratories) regulado para 0,360 kV, 25 pF e foram repostas em gelo durante 10 a 20 minutos. As células foram diluídas em 40 ml de DMEM, 10% FBS, 2 mM de L-glutamina e foram cultivadas em guatro placas de 96 poços a 100 pl/poço. Passadas 48 horas adicionou-se 100 pl/poço de meio de selecção 2x ácido micofenólico (MPA) (DMEM, 10% FBS, lx suplemento de meio HT Hybri-Max® (Sigma®, St. Louis, MO), 300 pg/ml de xantina (Sigma®), 2 pg/mlácido micofenólico (Life Technologies®) e 2 mM de L-glutamina). Os sobrenadantes dos poços contendo aparentemente colónias 106 únicas foram analisados por ELISA passados 10 a 14 dias. Os clones maiores produtores de anticorpos foram escolhidos para expansão e adaptação de HSFM (Life Technologies®). Os clones adaptados foram expandidos em frascos cilíndricos em 450 ml de HSFM, gaseados com 5% de C02 em ar, suplementados durante 2 dias com 50 ml de meio nutriente isento de proteínas-2 (Protein Free Feed Medium-2 PFFM-2) (Sauer et al., Biotechnol. Bioeng. 67:585-597 (2000)) e deixados desenvolver até à exaustão.

Alguns dos clones com maior índice de produção de anticorpos foram também adaptados a um meio basal isento de proteínas (Protein-Free Basal Medium-1 - PFBM-1) (Protein Design Labs™, Inc.) expandem frascos de cultura cilíndricos de 10 L, suplementados passados 2 dias com 1/10 de volume de PFFM-1 e deixados desenvolver-se até à exaustão. ELISA:

Para quantificar a quantidade de anticorpo OST577 ou HulDIO presente nos sobrenadantes da cultura foi realizado um teste ELISA. Placas Immulon™ 4 (DYNEX®Technologies, Inc., Chantilly, VA) fora revestidas de um dia para o outro a 4°C com 1,0 pg/ml de anticorpo de cabra F(ab')2 anti-cadeia gama da IgG humana (BioSource International, Camarillo, CA) ou anticorpo de cabra específico anti-fragmento IgG Fey humano da AffiniPure™ (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) em 100 μΐ/poço de tampão carbonato-bicarbonato 0,2 M, pH 9,4. No dia seguinte as placas foram lavadas com tampão de lavagem para ELISA (ELISA Wash Buffer - EWB) (PBS, 0,1% Tween 20) e bloqueadas com 300 μΐ/poço de tampão de bloqueio SuperBlock® em TBS (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) 107 durante 20 a 30 minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com EWB e foram adicionadas a cada poço amostras de ensaio diluídas apropriadamente. Anticorpos OST577 ou HulDIO purificados, conforme apropriado, foram diluídos em série duas vezes em 100 μΐ/poço de tampão ELISA (ELISA Buffer - EB) (PBS, 1% albumina de soro de bovino, 0,1% Tween 20), com início em 0,2 pg/ml e utilizados como padrão. Os sobrenadantes foram inicialmente diluídos 1:10 em 100 μΐ/poço de EB, depois foram duplamente diluídos em série em 100 μΐ/poço de EB. As placas foram incubadas durante 1 a 2 horas à temperatura ambiente, depois lavadas com EWB e adicionou-se 100 μΐ/poço de anticorpo de cabra anti-cadeia leve lambda humana conjugado com peroxidades de rábano (HRF) (BioSource International, ou Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) ou anticorpo de cabra anti-cadeia leve kapa humana conjugado com HRP (Southern Biotechnology Associates, Inc.), conforme apropriado, a 1,0 pg/ml em EB. Após incubação durante 1 hora à temperatura ambiente, as placas foram lavadas com EWB, seguido de adição de 100 μΐ/poço de substrato da peroxidase ABTS/solução de peroxidase B (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). A reacção foi parada com 100 μΐ/poço de ácido oxálico 2% e foi medida a absorbância a 415 nm com um leitor de placa de microtitulação VERSAmax™ (Molecular Devices Corporation®, Sunnyvale, CA).

Purificação de anticorpos:

Sobrenadantes da cultura de transfecções transientes foram colhidos por centrifugação e esterilizados por filtração. O pH dos sobrenadantes filtrados foi ajustado por adição de 1/50 do volume de citrato de sódio 1M, pH 7,0. Os sobrenadantes foram passados por uma coluna HiTrap® 108

Protein A HP (Amersham Biosciences™ Corporation, Piscataway, NJ) pré-equilibrada com 20 mM de citrato de sódio, 150 mM de NaCl, pH 7,0. A coluna foi lavada com o mesmo tampão e o anticorpo ligado foi eluido com 2 0 mM de citrato de sódio, pH 3,5. Após neutralização por meio de adição de 1/50 do volume de citrato de sódio 1,5 M, pH 6,5, as fracções de anticorpo reunidas foram passadas por uma coluna HiTrap® Desalting de 5 ml (Amersham Biosciences™ Corporation) pré-equilibrada com 20 mM de citrato de sódio, 120 mM de NaCl, pH 6,0. O flow-through foi recolhido e as fracções com OD28o > 0,1 foram reunidas e concentradas a -0,5-1,0 mg/ml utilizando concentradores Vivaspin® de 2 ml (50.000 dalton MWCO) (Vivascience® AG). As amostras foram então esterilizadas por filtração, utilizando microfiltros Millex® de 0,2 μιη (Millipore® Corporation). As concentrações dos anticorpos purificados foram determinadas por espectroscopia UV, mediante medição da absorbância a 280 nm (1 mg/ml = 1,4 A280).

Para purificação de anticorpos de transfecções estáveis em pequena escala foram colhidos os sobrenadantes da cultura por meio de centrifugação e foram esterilizados por filtração. Os sobrenadantes foram passados por uma coluna POROS®50A Protein A de 5 ml (Applied Biosystems®), +ré-equilibrada com PBS, pH 7,4. A coluna foi lavada com o mesmo tampão e o anticorpo ligado foi eluido com 0,1 M de glicina, 0,1 M de NaCl, pH 3,0. Após neutralização mediante adição de 1/20 volume de 1M de base Tris, trocou-se o tampão das fracções reunidas por PBS, pH 7,4, utilizando uma coluna de dessalinização PD-10 (Amersham Biosciences™ Corporation) ou diálise. As amostras foram então esterilizadas por filtração, utilizando microfiltros 109

Millex® de 0,2 μιη (Millipore® Corporation) . As concentrações dos anticorpos purificados foram determinadas por espectroscopia UV, mediante medição da absorbância a 280 nm (1 mg/ml = 1,4 A280 ) ·

No caso de purificação de anticorpos de transfectantes estáveis em grande escala, a colheita da cultura celular foi clarificada por meio de filtração convencional utilizando cápsulas de filtração Sartorius® (Sartorius® AG, Goettingen, Alemanha). A colheita clarificada foi concentrada a partir de aproximadamente 10 L a 750 ml utilizando uma cassete Pellicon®2 (30,000 dalton MWCO) (Millipore® Corporation), depois purificada por cromatografia de afinidade em proteína A ou uma coluna Sepharose FF em proteína A (Amersham Biosciences™ Corporation), utilizando o sistema tampão de citrato descrito anteriormente. O eluído da proteína A foi concentrado num aparelho de agitação de células Amicon®, utilizando uma membrana YM30 (Millipore® Corporation), depois trocou-se o tampão da amostra PARA 20 Mm de citrato de sódio, 120 mM de NaCl, pH 6,0, utilizando uma coluna Superdex™ 200 (Amersham Biosciences™ Corporation). Foram medidos o pH e a osmolaridade e as concentrações dos anticorpos purificados foram determinadas por espectroscopia UV, mediante medição da absorbância a 280 nm (1 mg/ml = 1,4 A28o) . SDS-PAGE:

Amostras de cinco pg de anticorpos purificados foram passadas sob condições redutoras ou não-redutoras em géis Bis-Tris 4-12% NuPAGE® Novex (Invitrogen™) e sujeitas a 110 coloração utilizando SimplyBlue™ SafeStain Kit (Invitrogen™) segundo as recomendações do fabricante.

Resultados:

Os mutantes IgG2M3 Fc e IgG 1 Fc foram expressos como anticorpos anti-HBV, compreendendo as regiões variáveis da cadeia leve e pesada de OST577 (Ehrlich et al., op. cit.), a região constante da cadeia leve de tipo lambda-2 humano (Hieter et al. (1981), op. cit.), e as regiões constantes de cadeia pesada do tipo gama-2 humano do mutante 3 (IgG2M3) (Cole et al, op. cit.) e IgGl (Ellison et al., op. cit.), respectivamente. A variante IgG2M3 contém duas substituições de aminoácidos na região CH2 (V234A e G237A) e revela ligação residual aos receptores Fey humanos extremamente baixa (Cole et al., op. cit.). Os mutantes IgG2M3 Fc e IgG 1 Fc foram também expressos como anticorpo do alelo da cadeia β anti-HLA-DR, compreendendo as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de HulDIO (Kostelny et al. (2001), op. cit.), a região constante de cadeia leve do tipo kapa humano (Hieter et al. (1981), op. cit.), e as regiões constantes de cadeia pesada de IgG2M3 (Cole et al, op. cit.) e IgGl (Ellison et al., op. cit.), respectivamente. Como anteriormente descrito, o vector de expressão de cadeia pesada de tipo selvagem ou mutante apropriado foi co-transfectado de modo transiente com o vector de expressão de cadeia leve apropriado em células 293-H para expressão de anticorpos monoclonais OST577 ou HulDIO. A análise ELISA de sobrenadantes de cultura colhidos 5 a 7 dias depois da transfecção transiente revelou que os niveis de expressão de anticorpos situavam-se tipicamente entre 5 e 50 pg/ml em 25 ml de sobrenadante. Os anticorpos OST577 ou HulDIO foram purificados por 111 cromatografia de afinidade em proteína A para um rendimento final de aproximadamente 100-1000 pg. Uma expressão estável de anticorpos OST577 ou HulDIO em células Sp2/0 resultou tipicamente em níveis de expressão de 5 a 50 pg/ml como determinado por ELISA. Os rendimentos de aproximadamente 50 a 80% do anticorpo presente nos sobrenadantes da cultura foram obtidos por cromatografia de afinidade em proteína A em pequena escala.

Os anticorpos purificados foram caracterizados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) sob condições não redutoras e redutoras. A análise SDS-PAGE sob condições não redutoras indicou que os anticorpos purificados possuíam um peso molecular de cerca de 150 a 160 kD (dados não apresentados); a análise sob condições redutoras indicou que os anticorpos purificados eram constituídos por uma cadeia pesada com um peso molecular de cerca de 50 kD e uma cadeia leve com um peso molecular de cerca de 25 kD (ver figuras 10A e 10B). A análise SDS-PAGE de anticorpos purificados a partir de transfectantes estáveis Sp2/0 produziu resultados similares aos observados com anticorpos purificados a partir de transfecções de 293-H transientes.

Exemplo 6

Este exemplo descreve a análise de ligação competitiva dos anticorpos mutantes IgG2M3 e IgGl.

Cultura de células:

A linhagem celular de mieloma de ratinho NSO (European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK) foi mantida em DMEM contendo 10% de FBS. Transfectantes NSO que expressam FcRn humano ou de rhesus ligado a GPI 112 recombinante na superfície foram mantidos em meio de selecção (DMEM, 10% FBS, lx suplemento de meio HT Hybri-Max® (Sigma®), de ácido micofenólico (MPA), 250 pg/ml de xantina (Sigma®), 1 pg/ml ácido micofenólico (Life Technologies®) e 2 mM de L-glutamina) ou 2x meio de selecção MPA.

Linha celular de FcRn humano:

As células NSO foram transfectadas de forma estável com pDL208. Aproximadamente 1 x 107 células foram lavadas uma vez e ressuspensas em 1 ml de DMEM simples, transferidas para uma cuvete Gene Pulser™ (Bio-Rad® Laboratories) e incubadas em gelo durante 10 minutos. Quarenta pg de plasmídeo pDL208 foram linearizados com Fspl e suavemente misturados com as células em gelo, então estas células foram sujeitas a electroporação pulsando duas vezes com um Gene Pulser™ II (Bio-Rad® Laboratories) regulado para 1,5 kV, 3 pF e devolvidos a gelo durante 10 minutos. As células foram diluídas em 20 ml de DMEM, 10% FBS, e foram cultivadas em duas placas de 96 poços a 100 pl/poço. O meio foi substituído passadas 48 horas com meio de selecção de MPA. Células NSO transfectadas resistentes ao ácido micofenólico de poços contendo aparentemente colónias individuais foram expandidas em meio de selecção MPA e rastreadas passadas cerca de 3 semanas por FACS™. Aproximadamente 1,5 x 105 células/teste foram incubadas em 100 pl de tampão de coloração FACS (FACS Staining Buffer -FSB) (PBS, 1% FBS, 0,1% NaN3) contendo 10 pg/ml de anticorpo de ratinho anti-microglobulina β2 humana biotinilado (Chromaprobe, Inc., Aptos, CA) durante 1 hora em gelo. As células foram lavadas uma vez com 4 ml de FSB, depois incubadas em 25 pl de FSB contendo 20 pg/ml de 113 conjugado estreptavidina-FITC (Southern Biotechnology Associates, Inc.) durante 30 minutos em gelo sob escuridão. As células foram lavadas uma vez com 4 ml de FSB e ressuspensas em 1% de formaldeido. As amostras foram analisadas para detectar anticorpos ligados a β2ιη humana, utilizando um citómetro de fluxo FACScan (BD® Biosciences, San Jose, CA). Vários clones com a maior coloração aparente foram subclonados utilizando um separador celular FACStar (BD® Biosciences), expandidos em DMEM, 10% FBS, 2mM L-glutamina e repetiram-se as análises por FACS™ como anteriormente descrito. Foi utilizado um subclone, designado NSO HuFcRn (memb), clone 7-3, nos ensaios de ligação subsequentes.

Linha celular de FcRn de Rhesus:

As células NSO foram transfectadas de forma estável com pDL410. Aproximadamente 6 x 105 células foram transfectadas por electroporação como anteriormente descrito. As células transfectadas foram identificadas por FACS™ como anteriormente descrito, por meio de coloração com 100 ng/teste de um anticorpo de ratinho anti-cadeia alfa do FcRn humano e (Protein Design Labs™, Inc.) que apresenta reacção cruzada com a cadeia alfa do FcRn de rhesus e detecção com anticorpo de cabra conjugado com FITC anti-cadeia kapa de ratinho (Southern Biotechnology Associates, Inc.). Foi utilizada uma linha celular, designada NSO RhFcRn, clone R-3, nos ensaios de ligação subsequentes.

Ensaio de ligação competitivo de ponto único:

Sobrenadantes OST577-IgG2M3 concentrados foram testados em ensaio de ligação competitivo de ponto único para ligação a FcRn humano na linha celular NSO HuFcRn (memb), 114 clone 7-3. Aproximadamente 2 x 105 células/teste foram lavadas uma vez em tampão de ligação FACS (FACS Binding Buffer - FBB) PBS contendo 0,5% BSA, 0,1% NaN3) , pH 8,0, uma vez em FBB, pH 6,0 e ressuspensas em 120 μΐ de anticorpo OST577-IgG2M3 biotinilado pré-misturado (8,3 pg/ml) e sobrenadante concentrado (contendo 8,3 μ/ml de anticorpo competitivo) em FBB, pH 6,0. As células foram incubadas durante 1 hora em gelo, lavadas por duas vezes em FBB, pH 6,0 e ressuspensas em 25 μΐ de conjugado de estreptavidina-RPE (BioSource International) diluído até 2,5 μ/ml em FBB, pH 6,0. Após incubação durante 30 minutos em gelo, sob escuridão, as células foram lavadas por duas vezes em FBB, pH 6,0 e ressuspensas em formaldeído 1 %. As amostras foram analisadas para detectar anticorpos ligados a FcRn por FACS™, utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD® Biosciences). A fuorescência média do canal (Mean channel fluorescence - MCF) de cada mutante foi comparada com a do anticorpo de tipo selvagem e convertida num gráfico com Excel (Microsoft® Corporation, Redmond, WA) .

Ensaios de ligação competitivos:

Uma série de diluições de cada anticorpo OST577-IgG2M3 purificado foi posta em competição com anticorpo HuEP5C7-IgG2M3 biotinilado (He et al., J. Immunol. 160 : 1029-1035 (1998)) para ligação a FcRn humano em linha celular NSO HuFcRn (memb) , clone 7-3. Para experiências de rastreio iniciais, foram lavadas aproximadamente 2 x 105 células/teste uma vez em FSB pH 6,0, e ressuspensas em 100 μΐ de anticorpo HuEP5C7-IgG2M3 biotinilado pré-misturado (10 μ/ml) e anticorpo competidor OST577-IgG2M3 (diluições em série duplas de 208 μ/ml para 0,102 pg/ml) em FSB, pH 115 6,0. As células foram incubadas com a mistura de anticorpos durante 1 hora em gelo, lavadas por duas vezes em FsB, pH 6,0 e ressuspensas em 25 μΐ de conjugado de estreptavidina-RPE (BioSource International) diluido até 2,5 μ/ml em FBB, pH 6,0. Após incubação durante 30 minutos em gelo, sob escuridão, as células foram lavadas por duas vezes em FSB, pH 6,0 e ressuspensas em formaldeído 1%. As amostras foram analisadas para detectar anticorpos ligados a FcRn por FACS™, utilizando um citómetro de fluxo FACScan (BD® Biosciences). Registou-se a fluorescência média de canal (MCF) em gráfico em comparação com uma concentração de competidor e foram calculados os valores IC50 utilizando rism® (Graph- Pad™ Software, Inc., San Diego, CA) . Para consistência, os valores de IC50 apresentados nos quadros baseiam-se nas concentrações do competidor finais.

Foram efectuadas experiências de ligação competitiva como anteriormente descrito excepto que as células foram lavadas uma vez em FBB, pH 8,0 e uma vez em FBB pH 6,0, depois ressuspensas em 100 μΐ de anticorpo HuEP5C7-IgG2M3 biotinilado pré-misturado (10 pg/ml) e anticorpo competidor OST577-IgG2M3 (diluições em série duplas de 208 μ/ml para 0,102 pg/ml) em FSB, pH 6,0. Todas as incubações seguintes e lavagens foram efectuadas utilizando FBB, pH 6,0 como anteriormente descrito. Um grupo de experiências foi realizado em 120 μΐ de anticorpo OST577-IgG2M3 biotinilado pré-misturado (8,3 pg/ml) e anticorpo competidor OST577-IgG2M3 (diluições em série duplas de 208 μ/ml para 0,102 pg/ml) em FSB, pH 6,0 como anteriormente descrito. Outro grupo de experiências foi realizado em 200 μΐ de anticorpo OST577-IgGl biotinilado pré-misturado (5,0 pg/ml) e anticorpo competidor OST577-IgGl (diluições em série duplas 116 a partir de 125 pg/ml ou diluições em série triplas a partir de 250 pg/ml) em FBB, pH 6,0 como anteriormente descrito. Um outro grupo de experiências foi realizado em 200 μΐ de anticorpo OST577-IgGl biotinilado pré-misturado (5,0 pg/ml) e anticorpo competidor OST577-IgGl diluições em série triplas de 750 μ§/ιη1) em FBB, pH 6,0 como anteriormente descrito.

Foi posta em competição uma série de diluição de cada anticorpo HuEP5C7-IgG2M3 purificado contra anticorpo OST577-IgG2M3 biotinilado para ligação a FcRn em linha celular NSO RhFcRn, clone R-3. Num grupo de experiências, lavaram-se uma vez aproximadamente 2 x 105 células/teste em FBB, pH 8,0 e uma vez em FBB pH 6,0, depois ressuspensas em 120 μΐ de anticorpo HuEP5C7-IgG2M3 biotinilado pré-misturado (8,3 μg/ml) e anticorpo competidor OST577-IgG2M3 (diluições em série duplas de 208 pg/ml para 0,102 pg/ml) em FSB, pH 6,0. As células foram incubadas com a mistura de anticorpos durante 1 hora em gelo, lavadas por duas vezes em FsB, pH 6,0 e ressuspensas em 25 μΐ de conjugado de estreptavidina-RPE (BioSource International) diluído até 2,5 pg/ml em FBB, pH 6,0. Após incubação durante 30 minutos em gelo, sob escuridão, as células foram lavadas por duas vezes em FBB, pH 6,0 e ressuspensas em formaldeído 1%. As amostras foram analisadas para detectar anticorpos ligados a FcRn por FACS™, utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD® Biosciences) . Outro grupo de experiências foi realizado em 200 μΐ de anticorpo OST577-IgGl biotinilado pré-misturado (5,0 pg/ml) e anticorpo competidor OST577-IgGl diluições em série triplas de 500 μ§/ιη1) em FBB, pH 6,0 como anteriormente descrito. 117

Resultados : A ligação relativa de anticorpos OST577-IgG2M3 de tipo selvagem ou OST577-IgGl e respectivos mutantes a FcRn foi determinada utilizando uma linha celular de NSO transfectada que expressa de forma estável FcRn humano na superfície. Como anteriormente descrito, os sobrenadantes concentrados foram analisados para detectar a ligaçao a FcRn humano segundo o ensaio de ligação competitiva de ponto único e os anticorpos purificados foram analisados para detectar ligação a FcRn nos ensaios de ligação competitiva. Concentrações crescentes de anticorpos de competição sem marcação foram incubadas com células na presença de uma concentração sub-saturada de anticorpo gG2M3 ou IgGl marcado em FSB ou FBB, pH 6,0.

Os resultados de experiências típicas com sobrenadantes OST577-IgG2M3 concentradas são apresentados nas figuras 11A, 11B e 11C. Como se mostra na fig. 11A. alguns dos mutantes na posição 250 (por exemplo T250E, T250Q) constituíram competidores mais fortes do que os do tipo selvagem, sugerindo que estes mutantes possuem uma capacidade de ligação maior ao FcRn humano em comparação com o anticorpo de tipo selvagem. Outros mutantes nesta posição (por exemplo T250D, T250F, T250K, T250N, T250P, T250R, T250W, T250Y) constituíram competidores mais fracos do que os do tipo selvagem, sugerindo que estes mutantes possuem uma capacidade de ligação menor ao FcRn humano em comparação com o anticorpo de tipo selvagem. Como se mostra na fig. 11B, alguns dos mutantes na posição 314 constituíram competidores mais fortes do que os do tipo selvagem, sugerindo que nenhum destes mutantes possuem uma capacidade de ligação ao FcRn humano aumentada em 118 comparaçao com o anticorpo de tipo selvagem. A maioria dos mutantes nesta posição (por exemplo L314A, L314C, L314D, L314E, L314F, L314G, L314H, L314K, L314M, L314N, L314P, L314Q, L314R, L314S, L314T, L314V, L314W, L314Y) revelaram-se competidores mais fracos do que os do tipo selvagem, sugerindo que estes mutantes possuem uma capacidade de ligação menor ao FcRn humano em comparação com o anticorpo de tipo selvagem. Como se mostra na fig. 11C, alguns dos mutantes na posição 428 (por exemplo M428F, M428L) constituíram competidores mais fortes do que os do tipo selvagem, sugerindo que estes mutantes possuem uma capacidade de ligação aumentada ao FcRn humano em comparação com o anticorpo de tipo selvagem. Outros mutantes nesta posição (por exemplo, M428A, M428C, M428D, M428E, M428G, M428H, M428K, M428N, M428P, M428Q, M428R, M428S, M428T, M428V, M428Y) constituíram competidores mais fracos do que os do tipo selvagem, sugerindo que estes mutantes possuem uma capacidade de ligação menor ao FcRn humano em comparação com o anticorpo de tipo selvagem. 0 quadro 2 resume os valores IC50 (a quantidade de anticorpo competitivo necessário para inibir a ligação do anticorpo marcado a FcRn em 50%) do anticorpo OST577-IgG2M3 de tipo selvagem purificado e alguns dos respectivos mutantes para ligação a FcRn humano. Os valores de ligação relativos foram calculados como a proporção do valor IC50 do anticorpo OST577-IgG2M3 de tipo selvagem para o de cada um dos mutantes. Na posição 314 do aminoácido, nenhum dos mutantes purificados revelou um aumento da ligação a FcRn humano relativamente ao anticorpo de tipo selvagem. Na realidade, todos os quatro mutantes purificados na posição 314 revelaram capacidade de ligação reduzida relativamente 119 ao anticorpo de tipo selvagem. N entanto, na posição 250 do aminoácido, um dos mutantes (T250E) revelou uma capacidade de ligação 3 vezes melhor a FcRn humano do que o anticorpo de tipo selvagem. Vários mutantes na posição 250 revelaram uma capacidade de ligação ligeiramente reduzida em relação ao anticorpo de tipo selvagem e um mutante (T250D) revelou uma capacidade de ligação substancialmente reduzida ao FcRn humano relativamente ao anticorpo de tipo selvagem. Na posição 428 do aminoácido, um dos mutantes (M428F) revelou também uma capacidade de ligação aproximadamente 3 vezes mehor ao FcRn humano do que o anticorpo de tipo selvagem, enquanto outro mutante (M428G) revelou uma capacidade de ligação substancialmente reduzida com o FcRn humano relativamente ao anticorpo de tipo selvagem.

Uma vez que foram identificadas duas substituições de aminoácidos em duas posições diferentes, nomeadamente T250E, T250Q, M428F e M428L, revelando cada uma um aumento da capacidade de ligação ao FcRn humano, os mutantes duplos T250E/M428F, T250Q/M428F e T250Q/M428L foram construídos, transfectados de forma transiente em células 293-H, purificados e testados quanto à ligação ao FcRn humano. Como anteriormente descrito, concentrações crescentes de anticorpos de competição sem marcação foram incubadas com células que expressam FcRn humano na presença de uma concentração sub-saturada de anticorpo HuEP5C7-IgG2M3 ou IgGl marcado em FBB, pH 6,0.

Como se mostra na figura 12A, o mutante duplo (T250E/M428F) revelou uma melhor capacidade de ligação a FcRn humano do que qualquer um dos mutantes individuais (T250E ou M428F) e revelou uma ligação aproximadamente 15 vezes melhor ao FcRn humano do que o anticorpo de tipo 120 selvagem. Como se mostra na figura 12B, o mutante duplo (T250Q/M428L) revelou uma melhor capacidade de ligação a FcRn humano do que qualquer um dos mutantes individuais (T250Q ou M428L) e revelou uma ligação aproximadamente 28 vezes melhor ao FcRn humano do que o anticorpo de tipo selvagem. Conforme resumido no quadro 3, num grupo de experiências, o IC50 para o anticorpo de tipo selvagem 0ST577-IgG2M3 é -9 pg/ml, enquanto o IC50 para cada um dos mutantes individuais (T250E e M428F) é ~3 pg/ml e o IC50 para o mutante duplo (T250E/M428F) é inferior a 1 pg/ml. Conforme resumido no quadro 4, noutro grupo de experiências, o IC50 para o anticorpo de tipo selvagem 0ST577-IgG2M3 é ~12 pg/ml, enquanto o IC50 para cada um dos mutantes individuais (T250Q e M428L) e o mutante duplo T250Q/M428F) é ~2-4 pg/ml e o IC50 para o mutante duplo (T250Q/M428L) é inferior a 1 pg/ml. OST577-IgGl de tipo selvagem, os mutantes individuais T250E, T250Q, M428F, M428L, e os mutantes duplos T250E/M428F e T250Q/M428L foram também criados. Conforme resumido no quadro 5, num grupo de experiências, o IC50 para o anticorpo de tipo selvagem OST577-IgGl é ~14 pg/ml, enquanto o IC50 para cada um dos mutantes individuais (T250E e M428F) é ~3-5 pg/ml e o IC50 para o mutante duplo (T250E/M428F) é inferior a 1 pg/ml. Conforme resumido no quadro 6, noutro grupo de experiências, o IC50 para o anticorpo de tipo selvagem OST577-IgGl é ~10 pg/ml, enquanto o IC50 para o mutante individual (T250Q) é ~3pg/ml e o IC50 para o mutante individual (M428L) e o mutante duplo (T250Q/M428L) é inferior a 1 pg/ml. A ligação de OST577-IgG2M3 e alguns dos respectivos mutantes ao FcRn de rhesus foram testados em experiências 121 de ligação competitiva. Conforme resumido no quadro 7, o IC50 para o anticorpo de tipo selvagem OST577-IgG2M3 é ~15 pg/ml, enquanto o IC50 para cada um dos mutantes individuais (T250Q e M428L) e o mutante duplo (T250Q/M428F) é ~2-4 pg/ml e o IC50 para o mutante duplo (T250Q/M428L) é inferior a 1 pg/ml. A ligação de OST577-IgGl e alguns dos respectivos mutantes ao FcRn de rhesus foram também testados em experiências de ligação competitiva. Conforme resumido no quadro 8, o IC50 para o anticorpo de tipo selvagem OST577-IgGl é ~9 pg/ml, enquanto o IC50 para o mutante individual (T250Q) é ~3pg/ml e o IC50 para o mutante singular (M428L) e o mutante duplo (T250Q/M428L) é inferior a 1 pg/ml. QUADRO 2

Nome3 (IgG2M3) nb IC50 pg/ml)c Ligaçao relativad Tipo selvagem 6 10, 7 ± 4,6 1,0 L314W 2 20,2 ±2,0 0, 53 L314Q 2 32,0 ± 2,3 0,33 L314A 2 68, 7 ± 2,1 0, 16 L314R 2 102 ± 4 0, 11 T250E 1 3, 82 2, 8 T250S 2 12, 0 ± 0,9 0, 89 T250A 2 13,3 ± 0,5 0, 80 T250V 3 19, 0 ± 1,8 0, 56 122 T250D 1 >210 <0,050 M428F 2 3,40 ± 0,53 3,1 M428G 1 147 0, 072 a para cada mutante, a primeira letra indica o aminoácido de tipo selvagem, o número indica a posição de acordo com o índice UE (Kabat et al., op. cit.) e a segunda letra indica o aminoácido mutante. b n indica o número de análises independentes. c valores de IC50 (± D.P.) são expressos em pg/ml (com base nas concentrações de competição finais) e foram calculados a partir de ensaios de ligação competitivos em comparação com HuEP5C7-IgG2M3 biotinilado em FSB, pH 6,0, como descrito no exemplo 6. d a ligação relativa a FcRn humano foi calculada como a proporção do valor IC50 do OST577-IgG2M3 de tipo selvagem para o de cada um dos mutantes. QUADRO 3

Nomea IC50 (pg/ml)c Ligação relativad (IgG2M3) b

Tipo selvagem 3 9,40 ±2,87 1,0

T250E 2,71 ±1,16 3, 5 3

M428F 2,97 ± 0,30 3,2 3 123 Τ250Ε/Μ 0,639 ± 0,094 15 428F 2 a para cada mutante, a primeira letra indica o aminoácido de tipo selvagem, o número indica a posição de acordo com o índice UE (Kabat et al., op. cit.) e a segunda letra indica o aminoácido mutante. b n indica o número de análises independentes. c valores de IC50 (± D.P.) são expressos em pg/ml (com base nas concentrações de competição finais) e foram calculados a partir de ensaios de ligação competitivos em comparação com HuEP5C7-IgG2M3 biotinilado em FBB, pH 6,0, como descrito no exemplo 6. d a ligação relativa a FcRn humano foi calculada como a proporção do valor IC50 do OST577-IgG2M3 de tipo selvagem para o de cada um dos mutantes. QUADRO 4

Nomea nb IC50 pg/ml)c Ligação (IgG2M3) Tipo 3 11,9 ± 2,5 1,0 selvagem T250Q 3 4,20 ± 1,02 2,8 M428L 3 1,79 ± 0,69 6,7 T250Q/M428F 3 1,50 ±0,31 8,0 T250Q/M428L 3 0,430 ± 0,084 28 124 para cada mutante, a primeira letra indica o aminoácido de tipo selvagem, o número indica a posição de acordo com o indice UE (Kabat et ai., op. cit. ) e a segunda letra indica o aminoácido mutante. b n indica o número de análises independentes. c valores de IC50 (± S.D.) são expressos em pg/ml (com base nas concentrações de competidor finais) e foram calculados a partir de ensaios de ligação competitivos em comparação com 0ST577-IgG2M3 biotinilado em FBB, pH 6,0, como descrito no exemplo 6. d a ligação relativa a FcRn humano foi calculada como a proporção do valor IC50 do OST577-IgG2M3 de tipo selvagem para o de cada um dos mutantes. QUADRO 5

Nomea (IgGl) nb IC50 pg/ml)c Ligaçao relativad Tipo selvagem 6 13, 9 + 4,2 O i—1 T250E 3 5,26 ± 0,87 2,6 M428F 5 3,44 ± 1,22 4,0 T250E/M428F 4 0, 990 ± 0,786 14 a para cada mutante, a primeira letra indica o aminoácido de tipo selvagem, o número indica a posição de acordo com o índice UE (Kabat et al., op. cit.) e a segunda letra indica o aminoácido mutante. 125 n indica ο número de análises independentes. c valores de IC50 (± D.P.) são expressos em pg/ml (com base nas concentrações de competidor finais) e foram calculados a partir de ensaios de ligação competitivos em comparação com OST577-IgGl biotinilado em FBB, pH 6,0, como descrito no exemplo 6. d a ligação relativa a FcRn humano foi calculada como a proporção do valor IC50 do OST577-IgGl de tipo selvagem para o de cada um dos mutantes. QUADRO 6

Nomea (IgGl) nb IC50 pg/ml)c Ligaçao relativad Tipo selvagem 5 10,3 ± 2,8 O i—1 T250Q 5 3,14 ± 0,86 3,3 M428L 5 0,896 ± 0,304 11 T250Q/M428L 5 0,351 ± 0,144 29 a para cada mutante, a primeira letra indica o aminoácido de tipo selvagem, o número indica a posição de acordo com o índice UE (Kabat et al., op. cit.) e a segunda letra indica o aminoácido mutante. b n indica o número de análises independentes. c valores de IC50 (± D.P.) são expressos em pg/ml (com base nas concentrações de competidor finais) e foram calculados a partir de ensaios de ligação competitivos em comparação 126 com OST577-IgGl biotinilado em FBB, pH 6,0, como descrito no exemplo 6. d a ligação relativa a FcRn humano foi calculada como a proporção do valor IC50 do OST577-IgGl de tipo selvagem para o de cada um dos mutantes. QUADRO 7

Nomea nb IC50 pg/ml)c Ligaçao (IgG2M3) relativad Tipo selvagem 3 14,8 ±2,7 1,0 T250Q 3 4, 05 ± 0,24 3,6 M428L 3 1,92 ± 0,46 7, 7 T750Q/M428F 3 1,77 ± 0,60 8,4 T250Q/M428L 3 0,554 ± 0,052 27 a para cada mutante, a primeira letra indica o aminoácido de tipo selvagem, o número indica a posição de acordo com o índice UE (Kabat et al., op. cit.) e a segunda letra indica o aminoácido mutante. b n indica o número de análises independentes. c valores de IC50 (± D.P.) são expressos em pg/ml (com base nas concentrações de competidor finais) e foram calculados a partir de ensaios de ligação competitivos em comparação com OST577-IgG2M3 biotinilado em FBB, pH 6,0, como descrito no exemplo 6. 127 a ligação relativa a FcRn de rhesus foi calculada como a proporção do valor IC50 do OST577-IgG2M3 de tipo selvagem para o de cada um dos mutantes. QUADRO 8

Nomea (IgGl) nb IC50 pg/ml)c Ligaçao relativad Tipo selvagem 3 8, 86 ± 0,52 0 1 ^ T250Q 3 2, 97 ± 0,59 3, 0 M428L 3 0,629 ± 0,060 14 T250Q/M428L 3 0,236 ± 0,013 37 a para cada mutante, a primeira letra indica o aminoácido de tipo selvagem, o número indica a posição de acordo com o índice UE (Kabat et ai., op. cit.) e a segunda letra indica o aminoácido mutante. b n indica o número de análises independentes. c valores de IC50 (± D.P.) são expressos em pg/ml (com base nas concentrações de competidor finais) e foram calculados a partir de ensaios de ligação competitivos em comparação com OST577-IgGl biotinilado em FBB, pH 6,0, como descrito no exemplo 6. d a ligação relativa a FcRn de rhesus foi calculada como a proporção do valor IC50 do OST577-IgGl de tipo selvagem para o de cada um dos mutantes. 128

Exemplo 7

Este exemplo descreve a confirmação das propriedades dos mutantes IgG2M3 and IgGl na ligação a FcRn.

Ensaio de ligação directa:

Foi testada a ligação de anticorpos OST577-IgG2M3 purificados a FcRn humano expresso na linha celular NSO HuFcRn (memb), clone 7-3 ou a células NSO não transfectadas em FBB a pH 6,0. Aproximadamente 2 x 105 células/teste foram lavadas uma vez em Fbb, pH 8,0 e uma vez em FBB, pH 6,0, depois foram ressuspensas em 100 μΐ de anticorpo a uma concentração de 11 pg/ml em FBB, pH 6,0. As células foram incubadas com anticorpo durante 1 hora em gelo, lavadas por duas vezes em FBB, pH 6,0 e ressuspensas em 25 μΐ de anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado com RPE (Southern Biotechnology Associates, Inc.) diluído até 5 μ/ml em FBB, pH 6,0. Após incubação durante 30 minutos em gelo, sob escuridão, as células foram lavadas por duas vezes em FBB, pH 6,0 e ressuspensas em formaldeído 1%. As amostras foram analisadas para detectar anticorpos ligados a FcRn por FACS™, utilizando um citómetro de fluxo FACScan (BD® Biosciences). Registou-se a fluorescência média de canal (MCF) de cada mutante utilizando Excel (Microsoft® Corporation).

Ensaios de ligação competitivos a 37°C:

Foi posta em competição uma série de diluição de cada anticorpo HuEP5C7-IgG2M3 purificado contra anticorpo OST577-IgG2M3 biotinilado para ligação a FcRn humano expresso na linha celular NSO HuFcRn (memb), clone 7-3 a 37°C. Lavaram-se uma vez aproximadamente 2 x 105 células/teste em FBB, pH 8,0 e uma vez em FBB, pH 6,0, 129 depois ressuspensas em 100 μΐ de anticorpo OST577-IgG2M3 biotinilado pré-misturado (10 pg/ml) e anticorpo competitivo OST577-IgG2M3 (diluições em série duplas de 208 pg/ml para 0,102 pg/ml) em FBB, pH 6,0. As células foram incubadas com a mistura de anticorpos durante 1 hora a 37°C, lavadas por duas vezes em FBB, pH 6,0 e ressuspensas em 25 μΐ de conjugado de estreptavidina-RPE (BioSource International) diluido até 2,5 μ/ml em FBB, pH 6,0. Após incubação durante 30 minutos, sob escuridão, as células foram lavadas por duas vezes em FBB, pH 6,0 e ressuspensas em formaldeído 1%. As amostras foram analisadas para detectar anticorpos ligados a FcRn por FACS™, utilizando um citómetro de fluxo FACScan (BD® Biosciences). Registou-se a fluorescência média de canal (MCF) em gráfico em comparação com uma concentração competitivoa e foram calculados os valores IC50 utilizando GraphPad Prism® (GraphPad™ Software).

Ensaio de ligação e libertação dependente do pH: A ligação a FcRn humano de anticorpos mutantes OST577-IgG2M3 e OST577-IgGI foi comparada com a dos anticorpos de tipo selvagem respectivos e depois estes foram libertados a vários valores de pH em ensaios de ligação e libertação de ponto único utilizando a linha de células NSO HuFcRn (memb), clone 7-3. Aproximadamente 2 x 105 células/teste foram lavadas uma vez em FBB, pH 8,0 e uma vez em FBB, pH 6,0, depois foram ressuspensas em 100 μΐ de anticorpo purificado (10 pg/ml) em FBB, pH 6,0. As células foram incubadas com anticorpo durante 1 hora em gelo, lavadas por duas vezes em FBB, pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0 e ressuspensas em 25 μΐ de anticorpo de cabra F(ab')2 anti-IgG humana conjugado com FITC (Southern Biotechnology 130

Associates, Inc.) diluído até 1,25 μ/ml em FBB do pH apropriado. Após incubação durante 30 minutos em gelo, sob escuridão, as células foram lavadas por duas vezes em FBB ao pH apropriado e ressuspensas em formaldeído 1%. As amostras foram analisadas para detectar anticorpos ligados a FcRn por FACS™, utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD® Biosciences) . Registou-se a fluorescência média de canal (MCF) de cada mutante utilizando Excel (Microsoft® Corporation). A ligação a FcRn de rhesus de anticorpos mutantes 0ST577-IgG2M3 e OST577-IgGl foi comparada com a dos anticorpos de tipo selvagem respectivos e depois estes foram libertados a vários valores de pH em ensaios de ligação e libertação de ponto único utilizando a linhagem de células NSO RhFcRn (memb), clone R-3 descrito anteriormente.

Resultados:

As propriedades de ligação de anticorpos OST577-IgG2M3 de tipo selvagem ou OST577-IgGl e respectivos mutantes a FcRn foram confirmadas utilizando uma linha celular de NSO transfectada que expressa de forma estável FcRn humano na superfície. Para confirmar que a ligação dos anticorpos mutantes era específica para FcRn humano na linha celular NSO transfectada, e não decorrente de algum outro receptor ou um mecanismo desconhecido, os anticorpos foram testados quanto à ligação a células NSO não transfectadas em comparação com uma linha celular transfectada que expressa de forma estável FcRn humano. Como anteriormente descrito, as células fõram incubadas com uma concentração sub-saturada de anticorpo em FBBm pH 6,0 e a ligação foi 131 analisada por FACS®. Como se mostra na figura 13, os resultados indicam que não houve ligação aparente à linhagem celular NSO progenitora, sugerindo que os anticorpos ligam especificamente às células transfectadas pelo FcRn humano.

Para confirmar que cada um dos mutantes gerados na presente invenção se comportou de um modo fisiologicamente relevante, os efeitos da temperatura e pH na ligação ao FcRn humano foram examinados mais detalhadamente. Porque os ensaios de ligação competitiva foram realizados a 4°C, as experiências foram repetidas a uma temperatura mais relevante do ponto de vista fisiológico, 37°C, para demonstrar que os mutantes ainda estava activos a esta temperatura. Como anteriormente descrito, concentrações crescentes de anticorpos de competição sem marcação foram incubadas com células expressoras de FcRn humano na presença de uma concentração sub-saturada de anticorpo OST577-IgG2M3 marcado a 37°C, em FBB, pH 6,0. Como se mostra na figura 14, os resultados indicaram que so anticorpos mantiveram o seu padrão relativo de ligação a FcRn humano a 37°C. A ligação de IgG a FcRn é conhecida por ser dependente do pH: 0 IgG liga-se fortemente a FcRn a pH 6,0 mas liga-se fracamente a pH 8,0. Para modificar anticorpos mutantes com semi-vidas mais prolongadas no soro é desejável aumentar a ligação a FcRn a pH 6,0, mantendo a libertação dependente do pH de FcRn a pH 8,0. Para confirmar que a ligação é dependente do pH, os anticorpos foram testados quanto à ligação a uma linhagem celular de NSO transfectada a expressar de modo estável FcRn humano e depois libertação a valors de pH entre 6,0 e 8,0. Como anteriormente descrito, 132 as células foram incubadas com uma concentração sub-saturada de anticorpo em FBBm pH 6,0, foram lavadas com FBB, pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0 e a ligação foi analisada por FACS™. Como se mostra na figura 15A, os resultados indicam que os anticorpos 0ST577-IgG2M3 modificados, com as mutações T250E, T250Q, M428F, M428L, T250E/M428F, T250Q/M428F ou T250Q/M428L revelaram todos forte ligação ao FcRn humano a pH 6,0, diminuindo a ligação à medida que os valores de pH aumentam para pH 8,0. Como se mostra na figura 15B, os resultados indicam que os anticorpo OST577-IgGl modificados, com as mutações T250E, M428F ou T250E/M428F revelaram todos forte ligação ao FcRn humano a pH 6,0, diminuindo a ligação à medida que os valores de pH aumentam para pH 8,0. 0 anticorpo OST577-IgGl com a mutação T250D revelou uma ligação mais fraca (em comparação com o tipo selvagem) ao FcRn humano a pH 6,0, diminuindo a ligação à medida que os valores de pH aumentam até pH 8,0. Como se mostra na figura 15C, os resultados indicam que os anticorpos OST577-IgGl modificados, com as mutações T250Q, M428L ou T250Q/M428L revelaram todos forte ligação ao FcRn humano a pH 6,0, diminuindo a ligação à medida que os valores de pH aumentam para pH 8,0. Estes resultados indicam que aligação dos anticorpos ao FcRn humano eram, de facto, dependentes do pH.

De modo similar, os anticorpos foram testados quanto à ligação a uma linha celular de NSO transfectada a expressar de modo estável FcRn de rhesus e depois libertação a valors de pH entre 6,0 e 8,0. Como se mostra na figura 15D, os resultados indicam que os anticorpo OST577-IgG2M3 modificados, com as mutações T250E, T250Q, M428F, M428L, T250E/M428F, T250Q/M428F ou T250Q/M428L revelaram todos 133 forte ligação ao FcRn de rhesus a pH 6,0, diminuindo a ligação à medida que os valores de pH aumentam para pH 8,0. Como se mostra na figura 15E, os resultados indicam que os anticorpos OST577-IgGl modificados, com as mutações T250Q, M428L ou T250Q/M428L revelaram todos forte ligação ao FcRn de rhesus a pH 6,0, diminuindo a ligação à medida que os valores de pH aumentam para pH 8,0. Estes resultados indicam que aligação dos anticorpos ao FcRn de rhesus eram também dependentes do pH.

Exemplo 8

Este exemplo descreve a confirmação das propriedades adicionais dos mutantes IgG2M3 and IgGl.

Cultura de células:

Linha celular do linfoma de Burkitt humano Raji (American Type Culture Collection) foi mantido em RPMI 1640 com L-glutamina (BioWhittaker™) contendo 10% de FBS (HyClone®) e 1 % penicilina-estreptomicina (Life

Technologies®).

Ensaios de ligação de antigénios: A actividade de ligação antigénica ed OST577 de tipo selvagem e anticorpos mutantes foi confirmada em ELISA de ligação competitiva. Placas de Immulon™ (DYNEX®Technologies) foram revestidas de um dia para o outro a 4°C com 1,0 pg/ml de antigénio de superfície da hepatite B recombinante(HBsAg) (Advanced Immunochemical, Inc., Long Beach, CA). No dia seguinte as placas foram lavadas com EWB e bloqueadas com 300 μΐ/poço de tampão de bloqueio SuperBlock® em TBS (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) durante 30 minutos à temperatura ambiente. As 134 placas foram lavadas com EWB e adicionou-se a cada poço anticorpo 0ST577-IgG2M3 biotinilado pré-misturado (0,25 pg/ml) e anticorpo competitivo OST577-IgG2M3 (diluições em série duplas de 33 pg/ml a 0,033 pg/ml) ou anticorpo OST577-IgGl biotinilado pré-misturado (0,25 pg/ml) e anticorpo competitivo OST577-IgGl (diluições em série duplas de 6 7 pg/ml a 0,06 7 pg/ml) em 100 μΐ de EB. As palcas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente, depois foram lavadas com EWB e adicionou-se 100 μΐ/poço de conjugado de estreptavidina-HRP (Pierce Chemical Company) a 1 pg/ml em EB. Após incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente, as placas foram lavadas com EWB, seguido de adição de 100 μΐ/poço de substrato da peroxidase ABTS/solução de peroxidase B (Kirkegaard & Perry). A reacção foi parada com 100 μΐ/poço de ácido oxálico 2% e foi medida a absorbância a 415 nm com um leitor de placa de microtitulação VERSAmax™ (Molecular Devices Corporation®). A actividade de ligação ao antigénio de HulDl0-IgG2M3 de tipo selvagem e anticorpos mutantes foi confirmada num ensaio de ligação FACS™ com células Raji, que expressam um alelo da cadeia HLA-DR β que é reconhecido por HulDIO (Kostelny et al. (2001), op. cit.) . Aproximadamente 2,5 x 105 células/teste foram lavadas uma vez em FBB, pH 7,4 e foram ressuspensas em 140 μΐ de anticorpo HulDl0-IgG2M3 (diluições em série triplas de 60 pg/ml a 0,027 pg/ml) em FBB, pH 7,4. As células foram incubadas com anticorpo durante 1 hora em gelo, lavadas por duas vezes em FBB, pH 7,4 e ressuspensas em 25 μΐ de anticorpo de cabra F(ab')2 anti kapa da IgG-humana conjugado com RPE (Southern Biotechnology Associates, Inc.) diluído até 10 μ/ml em FBB, pH 7,4. Após incubação durante 30 minutos em gelo, sob 135 escuridão, as células foram lavadas por duas vezes em FBB, pH 7,4 e ressuspensas em formaldeído 1 %. As amostras foram analisadas para detectar anticorpos ligados ao alelo da cadeia β HLA-DR por FACS™, utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD® Biosciences).

De modo similar, a actividade de ligação do antigénio de HulDIO-IgGl de tipo selvagem e anticorpos mutantes foi confirmada em ensaio de ligação FACS™, utilizando células Raji. Aproximadamente 2,0 x 105 células/teste foram lavadas uma vez em FBB, pH 7,4 e foram ressuspensas em 100 μΐ de anticorpo HulDIO-IgGl (diluições em série duplas de 25 pg/ml a 12,5 pg/ml, depois diluições em série triplas de 12,5 pg/ml a 0, 0020 pg/ml) em FBB, pH 7,4. Foi preparada uma série de diluições de anticorpo HuFd79-IgGl Co et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 88:2869-2873 (1991)) como anteriormente descrito e utilizada como controlo negativo. As células foram incubadas com anticorpo durante 1 hora em gelo, lavadas por duas vezes em FBB, pH 7,4 e ressuspensas em 25 μΐ de anticorpo de cabra F(ab')2 anti-IgG humana conjugado com FITC (Southern Biotechnology Associates, Inc.) diluído até 20 μ/ml em FBB, pH 7,4. Após incubação durante 30 minutos em gelo, sob escuridão, as células foram lavadas por duas vezes em FBB, pH 7,4 e ressuspensas em formaldeído 1%. As amostras foram analisadas para detectar anticorpos ligados ao alelo da cadeia β HLA-DR por FACS™, utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD®

Biosciences) .

Ensaio ADCC: A citotoxicidade mediada por células dependente do anticorpo (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - 136 ADCC) foi confirmada mediante medição da libertação de lactato desidrogenase (LDH) , utilizando células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) como efectores e células Raji como alvos, segundo um método publicado (Shields et al., op. cit.)· As PBMC foram preparadas a partir de sangue total fresco, utilizando gradiente Ficoll-Paque® Plus (Amersham Biosciences™ Corporation) e ressuspensas a uma densidade de 8 x 106/ml em meio de ensaio (RPMI 1640, 1% BSA) . As células Raji foram lavadas três vezes em meio de ensaio e ressuspensas a uma densidade de 0,4 x 106 células/ml em meio de ensaio. HulDIO de tipo selvagem e anticorpos mutantes foram diluídos até 4 pg/ml, 0,25 pg/ml e 0,016 pg/ml em meio de ensaio. Células Raji (50 μΐ/poço) e anticorpo HulDIO (50 μΐ/poço), isto é 200 ng/ensaio, 12,5 ng/ensaio ou 0,8 ng/ensaio) foram combinados nos poços de uma placa de análise de fundo em U de 96 po;os (BD® Biosciences) e incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente. Adicionou-se PBMC (100 μΐ/poço), isto é proporção efector/alvo 40:1) às células opsonizadas e incubou-se durante 4 horas a 3 7°C numa incubadora de CO2. A citotoxicidade mediada por células independente do anticorpo (Antibody independent cell-mediated cytotoxicity - AICC) foi medida incubando as células efectoras e alvo na ausência de anticorpos. A libertação espontânea foi medida incubando células alvo (SRaivo) ou células efectoras ( SRefector ) na ausência de anticorpos. A libertação máxima (MR) foi medida adicionando 2% Triton X-100 À células alvo. As placas foram centrifugadas suavemente e os sobrenadantes (100 μΐ/poço) foram transferidos para uma placa de fundo plano de 96 poços Falcon. A actividade LDH foi medida por 137 meio de incubação dos sobrenadantes com 100 μΐ/poço de mistura reacional LDH do conjunto de detecção de citotoxicidade (Roche Diagnostics Corporation) durante 30 minutos à temperatura ambiente. A reacção foi parada com 50 μΐ/poço de HC1 1 N e foi medida a absorbância a 490 nm com um leitor de placa de microtitulação VERSAmax™ (Molecular Devices Corporation®). A citotoxicidade em percentagem foi calculada como (Libertação de LDHamostra - SRefector - SRaivo) / (MRalvo - SRalvo) x 100.

Resultados:

As propriedades de ligação do antigénio de anticorpos OST577 e HulDIO de tipo selvagem e mutantes com os respectivos antigénios foram confirmadas recorrendo a ensaios de ligação apropriados. Como anteriormente descrito, a ligação de anticorpos OST577 a HBsAg foi determinada em ELISA competitivo. Como se mostra na figura 16A, a ligação de anticorpos OST577- IgG2M3 de tipo selvagem e mutantes a HBsAg foi essencialmente idêntica. Como se mostra na figura 16B, a ligação de anticorpos OST577- IgGl de tipo selvagem e mutantes a HBsAg foi essencialmente idêntica.

Como anteriormente descrito, a ligação de anticorpos HulDIO a um alelo HLA-DR da cadeia β foi determinada num ensaio de ligação FACS. Como se mostra na figura 17A, a ligação de anticorpos HulDIO - IgG2M3 de tipo selvagem e mutantes a alelo HLA-DR da cadeia β foi essencialmente idêntica Similarmente, como se mostra na figura 17B, a ligação de anticorpos HulDl0-IgGl de tipo selvagem e mutantes a alelo HLA-DR da cadeia β foi essencialmente idêntica. Estes resultados indicam que, como previsto, as 138 mutações descritas nas posições 250 e 428 não afectam a ligação dos antigénios. A actividade ADCC de anticorpos HulDIO de tipo selvagem e mutantes foi confirmada com um ensaio de libertação LDH, utilizando PBMC humano como efector e células Raji como alvos. Como se mostra na figura 18A, utilizando alelos 158 V/V FcyRIII homozigóticos com dador, a actividade ADCC do anticorpo HulDIO-IgGl com duplo mutante (T250Q/M428L) foi muito semelhante à do anticorpo de tipo selvagem enquanto a actividade ADCC do anticorpo HulDIO-IgGl com mutante singular (M428L) sofreu uma ligeir diminuição em comparação com o anticorpo de tipo selvagem. Como previsto, os anticorpos HulD10-IgG2M3 de tipo selvagem e mutantes não tinham actividade ADCC. De modo similar, como se mostra na figura 18B, utilizando alelos 158 F/F FcyRIII homozigóticos com dador, a actividade ADCC do anticorpo HulDIO-IgGl com duplo mutante (T250Q/M428L) foi muito semelhante à do anticorpo de tipo selvagem enquanto a actividade ADCC do anticorpo HulDIO-IgGl com mutante singular (M428L) sofreu uma ligeira diminuição em comparação com o anticorpo de tipo selvagem. Os anticorpos HulDl0-IgG2M3 de tipo selvagem e mutantes não tinham actividade ADCC. Estes resultados indicam que a mutação T250Q/M428L descrita não afecta a actividade ADCC da forma IgGl do anticorpo, enquanto a mutação M428L reduz ligeiramente a actividade ADCC da forma IgGl. As mutações descritas nas posições 250 e 428 não afectam a actividade ADCC da forma IgG2M3 do anticorpo.

Exemplo 9

Este exemplo descreve ensaios de semi-vida no soro in vitro e in vivo. 139

Espera-se que os anticorpos humanos IgC com uma maior (ou menor) afinidade ao FcRn in vitro tenham uma semi-vida no soro in vivo mais longa (ou mais curta) respectivamente. A afinidade dos IgC mutantes humanos para FcRn pode ser medida in vitro através de métodos, como, por exemplo, a ressonância de plasmão de superfície (RPS) usando FcRn solúvel, conjugado com um chip biosensor adequado, ou através de um teste de ligação competitiva usando FcRn expressado na superfície de células transfectadas. 0 FcRn utilizado nos testes de afinidade in vitro pode ser de origem murina, de rhesus ou humana. A semi-vida sérica dos IgG mutantes humanos com as propriedades desejadas pode ser medida in vivo injectando cobaias animais (por exemplo, ratos ou macacos) ou humanos com uma dose de anticorpos entre 0,1 a 10 mg de anticorpo por kg de peso, e depois retirando amostras de soro a intervalos de tempo diferentes que cubram a antecipada semi-vida sérica do anticorpo, e analisando as amostras para detectar a presença de IgG intacto através de uma técnica apropriada para o efeito, como a ELISA.

Estudo farmacocinético em Rhesus:

Um estudo farmacocinético preparado não em conformidade com os princípios BPL intitulado "Comparação Farmacocinética de Tres Variantes de OST577" foi realizado no Califórnia National Primate Research Center (CNCPP) na Universidade da Califórnia, em Davis. Doze rhesus macaques machos foram divididos aleatoriamente por peso e postos num dos três grupos de estudo. Cada um dos quatro animais designados para cada grupo recebeu uma dose intravenosa de tipo selvagem ou uma ou duas das variantes de OST577 a 1 mg/kg administrado durante quinze minutos. Os anticorpos 140 OST577 eram do tipo selvagem OST577-IgG2M3, uma variante do OST577- IgG2M3 contendo a mutação singular M428L, e uma variante de OST577-IgG2M3 contendo a mutação dupla T250Q/M428L. Cada um dos três anticorpos foram expressados pela transfecção de células Sp2/0 e purificados como está descrito no Exemplo 5.

Foram recolhidas amostras de sangue antes de ser administrada a dose no dia 0, na primeira e quarta hora depois de a dose ser administrada, e nos dias 1, 7, 14, 21, 28, 42, e 56. Em cada ponto temporal 4 ml de sangue eram retirados através da veia safena, foi preparado soro e 2 aliquotas foram congeladas e mantidas a -20° C até serem usadas. Para testes quimicos e hematológicos foram recolhidas amostras de sangue 16 dias antes de começar o estudo, antes da primeira dosagem no dia 0, e na conclusão do estudo no dia 56. ELISA:

As concentrações dos anticorpos OST577-IgG2M3 nas amostras de soro dos rhesus macaques foram determinadas por ELISA, usando uma dosagem apropriada. Soro recolhido de rhesus normais (ASRN) foi obtido do CNCPP. O mesmo lote de AS RN foi utilizado par preparar calibradores, controlos de soro positivo, e para pré-diluição de amostras de soro de rhesus macaques. Os calibradores foram preparados através de uma diluição padrão de OST577-IgG2M3 em ASRN a 3000, 1500, 750, 375, 187.5, 93, 75, 46, 88, 23,44, e 0 ng/ml, deixados repousar durante 2 horas para atingirem a temperatura ambiente e congelados em aliquotas a -20° C. Controlos de soro positivo foram preparados através de um enriquecimento de ASRN com OST577-IgG2M3 a 0,2 pg/m para o 141 controlo de soro fracamente positivo, 0,4 pg/ml para o controlo de soro positivo médio, e O co pg/ml para o controlo de soro altamente positivo, deixados repousar durante 2 horas para atingirem a temperatura ambiente e congelados em alíquotas a -20° C. Amostras pré-dosagem recolhidas de cada animal foram usadas como controlo do soro negativo.

Placas Immulon™ 2 (DYNEX® Technologies, Inc.) foram revestidas de um dia para o outro a 2-8°C com 100 μΐ/poço com um anticorpo idiotipo monoclal ratinho anti-OST577-IgGl (OST577-y1 anti-id, Protein Design Labs™, Inc.) a 1,0 pg/ml em PBS. No dia seguinte as placas foram lavadas três vezes com 300 μΐ/poço com PBS/Tween (Tampão Fosfato Salino, 0,1% Tween 20), secas com uma toalha de papel, e bloqueadas com 300 μΐ/poço de tampão de bloqueio SuperBlock® em PBS (Pierce Chemical Company) durante 60 ± 5 minutos à temperatura ambiente. Calibradores e controlos de soro positivo e negativo, assim como amostras de soro, foram descongelados a trazidos à temperatura ambiente antes de serem usados. Os calibradores e controlos de soro positivo e negativo foram diluídos a 1:10 in tampão de bloqueio SuperBlock® em PBS. Amostras de soro foram previamente diluídas de modo adequado (1:10 a 1:80) em ASRN, e depois diluídas 1:10 em Tampão de bloqueio SuperBlock® em PBS. As placas foram lavadas três vezes com 300 μΐ/poço de PBS/Tween e secas com uma toalha de papel. Calibradores diluídos, controlos de soro positivo e negativo, e amostras de soro foram então adicionadas a 100 μΐ/poço em poços duplicados e incubados durante durante 60+5 minutos a temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com 300 μΐ/ poço de PBS/Tween e secas com uma toalha de 142 papel. Preparou-se um anticorpo de cabra anti-cadeia leve lambda humana conjugado com HRP (Southern Biotechnology Associates, Inc.) através de uma dissolução de 1:1000 em PBSBSA/Tween (solução-tampão fosfato salino, 0,5% de albumina do soro de bovino, 0,1% Tween 20), adicionada a 100 μΐ/poço e incubada durante 60 ± 5 minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com 300 μΐ/poço de PBS/Tween e secas com uma toalha de papel. Foi adicionado Substrato de Peroxidase ABTS/Solução Peroxidase B (Kirkegaard & Perry Laboratories) a 100 μΐ/poço e incubado durante 7 ± 1 minutos. O processo foi interrompido com a adição de solução de paragem substrato (ácido oxálico 2%) a 100 μΐ/poço. Foram medidos os valores de absorvância a 415 nm antes de 30 minutos decorridos depois da adição da solução de paragem substrato usando um leitor de micro placas VERSAmax™ (Molecular Devices Corporation®).

Foi preparada uma curva de calibração utilizando os valores médios de absorvância obtidos pelos calibradores e ajustando os dados a uma curva de regressão logística com quatro parâmetros utilizando SOFTmax® PRO, versão 4.0 (Molecular Devices Corporation®). 0 valor médio de absorvância para o controlo de soro negativo (ou seja, amostra média pré-dosagem para cada animal) foi subtraído de cada valor de absorvância obtida para os calibradores. As concentrações de controlo de soro positivo foram determinadas depois de subtrair o valor médio de absorvância obtido para o controlo de soro negativo de cada valor de absorvância obtido para os controlos de soro positivos. As concentrações correspondentes aos valores médios de absorvância resultantes foram derivadas por interpolação da curva de calibragem. As concentrações das 143 amostras de soro foram determinadas através da subtração do valor médio de absorvância do controlo de soro negativo do valor de absorvância de cada amostra, obtendo a média dos valores de absorvância resultantes, derivando a concentração correspondente ao valor médio de absorvância por interpolação da curva de calibragem, e multiplicando a concentração resultante pelo fator de pré-diluição, se existir, para chegar à concentração final para cada amostra. A ordem de grandeza quantitativa prevista para o teste era de 0,0 - 0,90 pg/ml. O teste foi considerado adequado quando as seguintes duas condições foram conseguidas: (1) a concentração média retro-calculada de cada um dos três calibradores no intervalo quantitativo tinha um valor igual ou inferior a 20% dos seus valores nominais; e (2) os valores médios calculados de quatro dos seis valores de controlos de soro positivos eram iguais ou inferiores ao seu valor nominal, e pelo menos um resultado médio de cada nivel de concentração era igual ou inferior a 30% do seu valor nominal. Dados obtidos de placas que não cumpriam os critérios acima descritos foram descartados. Dados obtidos de amostras únicas de soro foram rejeitadas sempre que uma das três condições seguintes não foi respeitada: (1) os valores de absorvância em poços repetidos divergiam um do outro em mais de 40%; (2) a concentração média calculada estava abaixo do limite inferior de quantificação (LIQ) do ensaio (0,10 pg/ml); (3) a concentração média calculada estava acima do limite superior de quantificação (LSQ) do ensaio (0,90 pg/ml). 144

Resultados :

Os dados da concentração do anticorpo sérico foram introduzidos num modelo com dois compartimentos utilizando WinNonlin® Enterprise Edition, versão 3.2 (Pharsighl® Corporation, Mountain View, CA). 0 modelo assume uma distribuição de primeira ordem e uma eliminação de primeira ordem e está bem adaptado aos dados. Os dados modelados (simulados com base na média geométrica de cada grupo dos parâmetros farmacocinéticos primários), assim como a média observada de concentração de anticorpo sérico (pg/ml) e o desvio-padrão para cada grupo de quatro animais, foram inseridos em função do tempo (dias depois da perfusão) utilizando GraphPad Prism®, versão 3.02 (GraphPad™ Software, Inc.) . Como mostra a Figura 19, os dados indicam que a média das concentrações de anticorpo sérico de M428L e das variantes T250Q/M428L de OST577-IgG2M3 foram mantidas a níveis mais elevados que o OST577-IgG2M3 de tipo selvagem em qualquer ponto temporal. Vários parâmetros farmacocinéticos foram calculados dos dados obtidos usando WinNonlin® Enterprise Edition, versão 3.2 (Pharsighl® Corporation). A análise estatística dos parâmetros farmacocinéticos foi calculada usando Graph- Pad Prism®, versão 3.02 (GraphPad™ Software, Inc.). Como mostra o quadro 9, a concentração mais elevada da média de anticorpo sérico (Cmax) foi muito semelhante entre os três grupos de teste, o que indica que os anticorpos administrados distribuíram-se pela circulação de uma maneira semelhante. Desta forma, as concentrações mais elevadas de anticorpos, dos anticorpos mutantes IgG2m3 depois da fase de distribuição são devidas ao seu aumento de persistência no soro. Uma análise da depuração média 145 (clearance - CL) indicou que era este o caso. A CL média, o volume de anticorpo sérico eliminado por unidade de tempo era aproximadamente 1,8 vezes inferior para a variante M428L (0,0811 ± 0,03 84 ml/hr/kg; p = 0, 057), e aproximadamente 2,8 vezes inferior para a variante T250Q/M428L (0,0514 ± 0,0075 ml/hr/kg; p = 0,029) comparado com o tipo selvagem OST577-IgG2M3 (0,144 + 0,047 ml/h/kg) (quadro 9), indicando uma redução significativa na eliminação das variantes OST577-IgG2M3 M428L e T250Q/M428L da circulação dos rhesus macaques comparada com o tipo selvagem.

Os perfis PK das variantes OST577-IgG2M3 foram adicionalmente analisados calculando outros parâmetros (Tabela 9). Uma vez que a AUC (Area Under Curve) é inversamente proporcional à CL, conclui-se que a AUC média, a área sob a curva de concentração-tempo extrapolada de tempo zero ao infinito, era aproximadamente 2 vezes superior para a variante M428L (15,200 ± 8,700 h*pg/ml; P = 0,057), e aproximadamente 2,6 vezes superior para a variante T250Q/M428L (19,800 ± 2,900 hr*g/ml; p = 0.029) comparado com o tipo selvagem OST577-IgG2M3 (7,710 ± 3,110 hr*g/ml) (quadro 9), indicando um aumento significativo na exposição total das variantes OST577-IgG2M3 M428L e T250Q/M428L comparado com o tipo selvagem.

Finalmente, a semi-vida de eliminação média (fase β) foi 1,8 vezes mais longa para a variante M428L (642 ± 205 hr), e aproximadamente 1,9 vezes mais longa para a variante T250Q/M428L (652 ± 28 hr, p = 0, 029) comparado com o tipo selvagem OST577-IgG2M3 (351 ± 121 hr) (quadro 9). A semi-vida de eliminação para o tipo selvagem OST577-IgG2M3 neste 146 estudo é similar a do OST577-lgGl (324 ± 85 h) no estúdio PK prévio em macacos rhesus (Ehrlich et al., op. cit.). QUADRO 9

Nomea (IgG2M3) Cmaxb (pg/ml) CLc (ml/hr/kg) AUCd (hr*pg/ml) semi-vida eliminação e (h) Tipo 36,7 ±12,8 0,144 ± 7710 ±3110 351 ± 121 Selvagem 0,047 M428L 36,5 ±20,1 0,0811* ± 15200* ± 642 ± 205 0,0384 8700 T250Q/M428L 39,9 ± 6,8 0,0514* ± 19800* ± 652* ± 28 0,0075 2900 aPara cada mutante a primeira letra indica o aminoácido de tipo selvagem, o número indica a posição em relação ao índex EU(,Kabat et al., op. cit.) e a segunda letra incida o aminoácido mutante. bValores Cmax (± D.P) são expressos em pg/ml e foram calculados através dos dados PK utilizando WinNonlin como descrito no Exemplo 9. cValores SM (± D.P) são expressos em ml/hr/kg e foram calculados através dos dados PK utilizando WinNonlin como descrito no Exemplo 9. dValores AUC (± D.P) são expressos em hr*pg/ml e foram calculados através dos dados PK utilizando WinNonlin como descrito no Exemplo 9. 147 eValores de semi-vida de depuração (± D.P.) são expressados em hr e foram calculados através dos dados PK utilizando WinNonlin como descrito no Exemplo 9. *Indica uma diferença significativa (p < 0,060) entre o grupo de tipo selvagem e cada um dos grupos mutantes. Foram feitos testes Mann-Whitney usando GraphPad Prism como está descrito no Exemplo 9.

Exemplo 10

Este exemplo descreve a aplicação dos ensaios de semi-vida sérica in vitro e in vivo descritos no exemplo 9 em mutantes de anticorpos de IgGl.

Estudo farmacocinético em Rhesus:

Um estudo farmacocinético preparado não em conformidade com os princípios BPL intitulado "Comparação Farmacocinética de Tres Variantes de OST577" foi realizado no Califórnia National Primate Research Center (CNCPP) na Universidade da Califórnia, em Davis. Oito rhesus macaques machos foram divididos aleatoriamente por peso e postos num dos dois grupos de estudo. Cada um dos quatro animais designados para cada grupo recebeu uma dose intravenosa de tipo selvagem ou de uma variante de OST577 a 1 mg/kg administrado durante quinze minutos. Os anticorpos OST577 eram do tipo selvagem OST577-IgG2M3, uma variante do OST577-IgG2M3 contendo a mutação dupla T250Q/M428L. Ambos os anticorpos foram expressados pela transfecção de células Sp2/0 e purificados como está descrito no Exemplo 5. 148

Foram recolhidas amostras de sangue antes de ser administrada a dose no dia 0, na primeira e quarta hora depois da dose ser administrada, e nos dias 1, 7, 14, 21, 28, 42, e 56. Em cada ponto temporal 4 ml de sangue eram retirados através da veia safena, foi preparado soro e 2 aliquotas foram congeladas e mantidas a -20° C até serem usadas. Para testes químicos e hematológicos foram recolhidas amostras de sangue antes da primeira dosagem no dia 0, e na conclusão do estudo no dia 56. ELISA:

As concentrações dos anticorpos OST577-IgGl nas amostras de soro dos rhesus macaques foram determinadas por ELISA, usando uma dosagem apropriada. Soro recolhido de rhesus normais (ASRN) foi obtido do CNCPP. O mesmo lote de AS RN foi utilizado para preparar calibradores, controlos de soro positivo e negativo, e para pré-diluição de amostras de soro de rhesus macaques. Os calibradores foram preparados através de uma diluição padrão de OST577-IgGl em ASRN a 3200, 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25 e 0 ng/ml, deixados repousar durante 2 horas para atingirem a temperatura ambiente e congelados em aliquotas a -80° C. Controlos de soro positivo foram preparados através de um enriquecimento de ASRN com OST577-IgGl a 0,2 pg/m para o controlo de soro fracamente positivo, 0,4 pg/ml para o controlo de soro positivo médio, e O co pg/ml para o controlo de soro altamente positivo, deixados repousar durante 2 horas para atingirem a temperatura ambiente e congelados em aliquotas a -80° C. ASRN foi utilizado como controlo do soro negativo. 149

Placas Immulon™ 2 (DYNEX® Technologies, Inc.) foram revestidas de um dia para o outro a 2-8°C com 100 μΐ/poço com um anticorpo idiotipo monoclal ratinho anti-OST577-IgGl (OST577-yl anti-id, Protein Design Labs™, Inc.) a 1,0 pg/ml em PBS. No dia seguinte as placas foram lavadas três vezes com 300 μΐ/poço com PBS/Tween (Tampão Fosfato Salino, 0,1% Tween 20), secas com uma toalha de papel, e bloqueadas com 300 μΐ/poço de tampão de bloqueio SuperBlock® em PBS (Pierce Chemical Company) durante 60 ± 5 minutos à temperatura ambiente. Calibradores e controlos de soro positivo e negativo, assim como amostras de soro, foram descongelados a trazidos à temperatura ambiente antes de serem usados. Os calibradores e controlos de soro positivo e negativo foram diluidos a 1:10 in tampão de bloqueio SuperBlock® em PBS. Amostras de soro foram previamente diluídas de modo adequado (1:5 a 1:80) em ASRN, e depois diluídas 1:10 em Tampão de bloqueio SuperBlock® em PBS. As placas foram lavadas três vezes com 300 μΐ/poço de PBS/Tween e secas com uma toalha de papel. Calibradores diluídos, controlos de soro positivo e negativo, e amostras de soro foram então adicionadas a 100 μΐ/poço em poços duplicados e incubados durante durante 60 ± 5 minutos a temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com 300 μΐ/ poço de PBS/Tween e secas com uma toalha de papel. Preparou-se um anticorpo de cabra anti-cadeia leve lambda humana conjugado com HRP (Southern Biotechnology Associates, Inc.) através de uma dissolução de 1:1000 em PBSBSA/Tween (solução-tampão fosfato salino, 0,5% de albumina do soro de bovino, 0,1% Tween 20), adicionada a 100 μΐ/poço e incubada durante 60 ± 5 minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com 300 150 μΐ/poço de PBS/Tween e secas com uma toalha de papel. Foi adicionado Substrato de Peroxidase ABTS/Solução Peroxidase B (Kirkegaard & Perry Laboratories) a 100 μΐ/poço e incubado durante 7 ± 1 minutos. O processo foi interrompido com a adição de solução de paragem substrato (ácido oxálico 2%) a 100 μΐ/poço. Foram medidos os valores de absorvância a 415 nm antes de 30 minutos decorridos depois da adição da solução de paragem substrato usando um leitor de micro placas VERSAmax™ (Molecular Devices Corporation®).

Foi preparada uma curva de calibração utilizando os valores médios de absorvância obtidos pelos calibradores e ajustando os dados a uma curva de regressão logística com quatro parâmetros utilizando SOFTmax® PRO, versão 4.0 (Molecular Devices Corporation®). O valor médio de absorvância para o calibrador a 0,0 ng/mL foi subtraído de cada valor de absorvância obtido para os restantes calibradores. As concentrações de controlo de soro positivo foram determinadas depois de subtrair o valor médio de absorvância obtido para o controlo de soro negativo de cada valor de absorvância obtido para os controlos de soro positivos. As concentrações correspondentes aos valores médios de absorvância resultantes foram derivadas por interpolação da curva de calibragem. As concentrações das amostras de soro foram determinadas através da subtração do valor médio de absorvância da amostra pré-doseada adequada do valor de absorvância de cada amostra do estudo, obtendo a média dos valores de absorvância resultantes, derivando a concentração correspondente ao valor médio de absorvância por interpolação da curva de calibragem, e multiplicando a concentração resultante pelo factor de pré-diluição, se 151 existir, para chegar à concentração final para cada amostra. A ordem de grandeza quantitativa prevista para o teste era de 0,0 - 0,9 0 pg/ml. O teste foi considerado adequado quando as seguintes duas condições foram conseguidas: (1) a concentração média retro-calculada de cada um dos quatro calibradores no intervalo quantitativo tinha um valor igual ou inferior a 20% dos seus valores nominais; e (2) os valores médios calculados de quatro dos seis valores de controlos de soro positivos eram iguais ou inferiores ao seu valor nominal, e pelo menos um resultado médio de cada nível de concentração era igual ou inferior a 30% do seu valor nominal. Dados obtidos de placas que não cumpriam os critérios acima descritos foram descartados. Dados obtidos de amostras únicas de soro foram rejeitadas sempre que uma das condições seguintes não foi respeitada: (1) a concentração média calculada estava abaixo do limite inferior de quantificação (LIQ) do ensaio (0,10 pg/ml); ou (2) a concentração média calculada estava acima do limite superior de quantificação (LSQ) do ensaio (0,90 pg/ml). No caso do resultado calculado entre amostras em duplicado ser diferente em mais de 40% entre si, então testou-se novamente a amostra num segundo ensaio independente. Se a média calculada a partir do segundo ensaio estivesse num intervalo de 15% da média calculada a partir do primeiro ensaio para a amostra em questão, então utilizou-se a média calculada proveniente do primeiro ensaio. Caso contrário testou-se novamente a amostra num terceiro ensaio independente e calculou-se a média dos resultados para os três ensaios, salvo quando um valor pudesse ser removido 152 por se encontrar para lá de um valor aceitável. Neste caso, utilizou-se a média dos dois valores restantes.

Resultados:

Os dados da concentração do anticorpo sérico foram introduzidos num modelo com dois compartimentos utilizando WinNonlin® Enterprise Edition, versão 3.2 (Pharsighl® Corporation, Mountain View, CA). 0 modelo assume uma distribuição de primeira ordem e uma eliminação de primeira ordem e está bem adaptado aos dados. Os dados modelados (simulados com base na média geométrica de cada grupo dos parâmetros farmacocinéticos primários), assim como a média observada de concentração de anticorpo sérico (pg/ml) e o desvio-padrão para cada grupo de quatro animais, foram inseridos em função do tempo (dias depois da perfusão) utilizando GraphPad Prism®, versão 3.02 (GraphPad™ Software, Inc.). Como mostra a Figura 20, os dados indicam que a média das concentrações de anticorpo sérico da variante T250Q/M428L de OST577-IgGl foram mantidas a níveis mais elevados que o OST577-IgGl de tipo selvagem em qualquer ponto temporal. Vários parâmetros farmacocinéticos foram calculados dos dados obtidos usando WinNonlin® Enterprise Edition, versão 3.2 (Pharsighl® Corporation). A análise estatística dos parâmetros farmacocinéticos foi calculada usando Graph- Pad Prism®, versão 3.02 (GraphPad™ Software, Inc.). Como mostra o quadro 10, a Cmax foi muito semelhante em ambos os grupos de teste, o que indica que os anticorpos administrados distribuíram-se pela circulação de uma maneira semelhante. Desta forma, as concentrações mais elevadas de anticorpos, dos anticorpos mutantes IgGl depois da fase de distribuição 153 são devidas ao seu aumento de persistência no soro. Uma análise da CL média indicou que era este o caso. A CL média era aproximadamente 2,3 vezes inferior para a variante T250Q (0,0811 ± 0,0191 ml/hr/kg; p = 0,029), comparado com o tipo selvagem OST577-IgGl (0,190 ± 0,022 ml/hr/kg) (quadro 10), indicando uma redução significativa na eliminação da variante OST577-IgGl T250Q/M428L da circulação dos rhesus macaques comparada com o tipo selvagem. O perfil PK da variante OST577-IgGl foi adicionalmente analisado calculando outros parâmetros (Tabela 10) . A AUC média era aproximadamente 2,4 vezes superior para a variante T250Q/M428L (12,900 ± 3,000 hr*ug/ml; p = 0,029) comparado com o tipo selvagem OST577-IgGl (5,320 ± 590 hr*ug/ml) (quadro 10), indicando um aumento significativo na exposição total da variante OST577-IgGl T250Q/M428L comparado com o tipo selvagem.

Finalmente, a semi-vida de eliminação média (fase β) foi 2,5 vezes mais longa para a variante T250Q/M428L (838 ± 187 hr, p = 0, 029) comparado com o tipo selvagem OST577-IgGl (336 ± 34 hr) (quadro 10) . A semi-vida de eliminação para o tipo selvagem OST577-IgGl neste estudo é similar à do OST577-IgGl (324 ± 85 h) no estúdio PK prévio em macacos rhesus (Ehrlich et al., op. cit.). QUADRO 10

Nomea Cmaxb CLc AUCd semi-vida (igGi) (pg/ml) (ml/hr/kg) (hr*pg/ml) eliminação e (h) 154

Tipo 26,0 ± 4,1 0,190 ± 5320 ± 590 336 ± 34 Selvagem 0, 022 T250Q/M428L 29,1 ±3,7 0,0811* ± 0, 0191 12900* ± 3000 838* ± 187 aPara cada mutante a primeira letra indica o aminoácido de tipo selvagem, o número indica a posição em relação ao índex EU(,Kabat et al., op. cit.) e a segunda letra incida o aminoácido mutante. bValores Cmax (+ D.P) são expressos em pg/ml e foram calculados através dos dados PK utilizando WinNonlin como descrito no Exemplo 10. cValores SM (± D.P) são expressos em ml/hr/kg e foram calculados através dos dados PK utilizando WinNonlin como descrito no Exemplo 10. dValores AUC (± D.P) são expressos em hr*pg/ml e foram calculados através dos dados PK utilizando WinNonlin como descrito no Exemplo 10. eValores de semi-vida de depuração (± D.P.) são expressados em hr e foram calculados através dos dados PK utilizando WinNonlin como descrito no Exemplo 10. *Indica uma diferença significativa (p < 0,060) entre o grupo de tipo selvagem e cada um dos grupos mutantes. Foram feitos testes Mann-Whitney usando GraphPad Prism como está descrito no Exemplo 10.

Exemplo 11 155

Este exemplo descreve a aplicação dos diversos ensaios de ligação descritos nos exemplos 6 e 7 aos mutantes dos anticorpos IgG3 e IgG4.

Mutagénese 0 método de PCR overlap-extension (Higuchi, op. cit.) foi utilizado para gerar substituições dirigidas ao local de aminoácido na posição 428 da cadeia pesada HulD10-IgG3 ou nas posições 250 e 428 da cadeia pesada HulD10-IgG4 (numerada de acordo com o índice UE de Kabat et al., op. cit.). Um mutante M428L foi gerado na cadeia pesada HulDlO-IgG3. Na cadeia pesada HulD10-IgG4 foram gerados os mutantes M428L e T250Q/M428L.

Transfecções

Os vectores de expressão da cadeia pesada HulDlO-IgG3 oo HulDl0-IgG4 de tipo selvagem ou mutante, descritos mais minuciosamente nos exemplos 1 e 2, foram co-transfectados de um modo transiente com o vector de expressão de cadeia leve pVk-HulDIO numa linhagem celular de rim humano 293-H (Life Technologies®). Os vectores de expressão de HulDlO-IgG3 ou HulD10-IgG4 também foram co-transfectados de um modo estável com o vector de expressão pVk-HulDIO em células Sp2/0, conforme descrito no exemplo 5. Para as transfecções estáveis em Sp2/0, os vectores de expressão de IgG3 foram linearizados com FspI; no entanto, os vectores de expressão de IgG4 foram linearizados com BstZ171, uma vez que existem dois locais FspI em pHuHC.g4.Tt.D-HulDIO. 156

Purificação de anticorpos

Os sobrenadantes da cultura que contêm anticorpos IgG4 humanos foram quantificados por ELISA, sendo colhidos por centrifugação, filtrados em ambiente estéril e purificados por cromatografia de afinidade de proteína A, conforme descrito no exemplo 5.

Os sobrenadantes da cultura que contêm anticorpos IgG3 humanos foram quantificados por ELISA, sendo colhidos por centrifugação e filtrados em ambiente estéril, conforme descrito no exemplo 5. 0 pH dos sobrenadantes filtrados foi ajustado por meio da adição de 1/75 volume de Tris-HCl 1 M, pH 8,0. Os sobrenadantes foram submetidos a uma coluna HiTrap® Protein G HP, 1 mL (Amersham Biosciences™ Corporation), em pré-equilíbrio com fosfato de sódio 20 mM, pH 7,0. A coluna foi lavada com o mesmo tampão e o anticorpo ligado foi eluído com glicina-HCl 100 mM, pH 2,7. Após neutralização por adição de -1/50 volume de Tris-HCl 1 M, pH 8,0, submeteu-se as fracções de proteínas reunidas a diálise de um dia para o outro em citrato de sódio 20 mM, NaCl 120 mM, pH 6,0, ou a uma coluna de des-salinização HiTrap® de 5 mL (Amersham Biosciences™ Corporation), em pré-equilíbrio com citrato de sódio 20 mM, NaCl 120 mM, pH 6,0. 0 fluxo proveniente da coluna de des-salinização foi recolhido e as fracções com OD280 > 0,1 foram reunidas e concentradas até -0,5-1,0 mg/mL, utilizando 2 mL de concentradores Vivaspin® (50,000 dalton MWCO) (Vivascience® AG) . O material submetido a diálise foi concentrado de um modo semelhante. As amostras foram então filtradas em ambiente estéril utilizando microfiltros Millex®-GV de 0,2 μιη (Millipore® Corporation). A concentração dos anticorpos 157 pirificados foi determinada por espectroscopia UV medindo a absorvância a 280 nm (1 mg/mL = 1,4 A2so) ·

SDS-PAGE

Cinco pg de amostras de anticorpos purificados foram submetidos a condições redutoras ou não redutoras, conforme descrito no exemplo 5.

Ensaios de ligação competitivos:

Conforme descrito no exemplo 6, transfectantes NSO que expressam FcRn humano ou de resus ligado a GPI recombinante sobre a superfície foram mantidos em meio de selecção com ácido micofenólico (MPA) (DMEM, 10% de FBS, lx suplemento de meio HT Hybri-Max® (Sigma®), xantina 250 a pg/mL (Sigma®), ácido micofenólico 1 pg/mL (Life Technologies®) e L-glutamina 2 mM) ou 2 x meio de seleccção MPA.

Uma série de diluições de cada anticorpo HulDlO-IgG3 purificado foi posta em competição com IgG humana (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) marcada com biotina (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL). Testou-se os anticorpos quanto à ligação a FcRn humana numa linhagem celular NSO HuFcRn (memb), clone 7-3, e a FcRn de rhesus numa linhagem celular NSO RhFcRn, clone R-3. Aproximadamente 2 x 105 células/teste foram lavadas uma vez em pH 8,0, e uma vez em FBB, pH 6,0, e depois colocadas novamente em suspensão em 120 pL de uma pré-mistura de anticorpo IgG humano biotinilado (8,3 pg/ml) e anticorpo competidor HulD10-IgG3 (diluições em séries de duas vezes desde 625 pg/mL até 0,305 pg/mL) em FBB, pH 6,0. As células foram mantidas a incubar com a mistura de anticorpo durante 1 hora sobre gelo, lavadas 2 vezes em FBB, pH 6,0, e colocadas novamente em suspensão em 25 pL de conjugado estreptavidina-RPE 158 (BioSource International), diluído até 2,5 μg/mL in FBB, pH 6,0. Após incubação durante 30 minutos em gelo e no escuro, as células foram lavadas 2 vezes em FBB, pH 6,0, e colocadas novamente em suspensão em 1% de formaldeído. As amostras foram analisadas quabto à ligação do anticorpo a FcRn por FACS, utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD® Biosciences).

Uma série de diluições de cada anticorpo HulD10-IgG4 purificado foi posta em competição com IgG humana (Sigma-Aldrich) marcada com biotina (Pierce Biotechnology, Inc) . Testou-se os anticorpos quanto à ligação a FcRn humana numa linhagem celular NSO HuFcRn (memb), clone 7-3, e a FcRn de rhesus numa linhagem celular NSO RhFcRn, clone R-3, conforme descrito antes para os anticorpos IgG3.

Ensaio de ligação e libertação dependente do pH: A ligação a FcRn humano ou de rhesus de anticorpos mutantes HulD10-IgG3 e HulD10-IgG4 foi comparada com a dos anticorpos de tipo selvagem respectivos e depois estes foram libertados a vários valores de pH em ensaios de ligação e libertação de ponto único utilizando a linha de células NSO HuFcRn (memb), clone 7-3, e NSO RhFcRn, clone R-3, respectivamente, conforme descrito no exemplo 7. Para garantir que ambos os subtipos, IgG3 e IgG4 eram marcados de um modo equivalente utilizou-se 25 μΐ de anticorpo de cabra F(ab')2 anti-IgG humana conjugado com FITC kapa (Southern Biotechnology Associates, Inc.) diluído até 1,25 μ/ml em FBB do pH apropriado, como reagente de detecção.

Resultados

As substituições de aminoácidos foram geradas na posição 428 da cadeia pesada γ3 humana e nas posições 250 e 159 428 da cadeia pesada γ4 humana (numerada de acordo com o índice UE de Kabat et al., op. cit.) · Estas duas posições foram selecionadas com base na identificação de mutações nestas posições na cadeia pesada γ2Μ3 humana que proporcionaram um aumento na ligação a FcRn. 0 mutante M428L foi avaliado na cadeia pesada γ3 humana. Os mutantes M428L e T250Q/M428L foram avaliados na cadeia pesada γ4 humana.

Os mutantes IgG3 e IgG4 Fc foram expressos como anticorpos alélicos de cadeia β anti-HLA-DR, compreendendo as regiões variáveis da cadeia leve e pesada de HulDIO (Kostelny et al., (2001), op. cit.), a região constante da cadeia leve kapa humana (Hieter et al. (1980), op. cit.), e as regiões constantes de cadeia pesada IgG3 humana (Huck et al, op. cit.) e IgG4 (Ellison et al., op. cit.), respectivamente. Como anteriormente descrito, o vector de expressão de cadeia pesada de tipo selvagem ou mutante apropriado foi co-transfectado de modo transiente com o vector de expressão de cadeia leve apropriado em células 293-H para expressão de anticorpos monoclonais HulDIO. A análise ELISA de sobrenadantes de cultura colhidos 5 a 7 dias depois da transfecção transiente revelou que os níveis de expressão de anticorpos situavam-se tipicamente entre 5 e 25 pg/ml em 25 ml de sobrenadante. Os anticorpos HulDlO-IgG3 e HulD10-IgG4 foram purificados por cromatografia de afinidade em proteína G e proteína A, respectivamente, para um rendimento final de aproximadamente 100-500 pg. Uma expressão estável de anticorpos HulDIO em células Sp2/0 resultou tipicamente em níveis de expressão de 30 a 100 pg/ml como determinado por ELISA. Os rendimentos de aproximadamente 50% a 80% do anticorpo presente nos 160 sobrenadantes da cultura foram obtidos por cromatografia de afinidade em proteína G ou proteína A em pequena escala.

Os anticorpos purificados foram caracterizados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) sob condições não redutoras e redutoras. A análise SDS-PAGE sob condições não redutoras indicou que os anticorpos purificados possuíam um peso molecular de cerca de 150 a 170 kD (dados não apresentados); a análise sob condições redutoras indicou que os anticorpos purificados eram constituídos por uma cadeia pesada com um peso molecular de cerca de 50-60 kD e uma cadeia leve com um peso molecular de cerca de 25 kD (dados não apresentados). A análise SDS-PAGE de anticorpos purificados a partir de transfectantes estáveis Sp2/0 produziu resultados similares aos observados com anticorpos purificados a partir de transfecções de 293-H transientes. A ligação relativa de anticorpos HulD10-IgG3 e HulDlO-IgG4 de tipo selvagem e seus diversos mutantes a FcRn foi determinada utilizando uma linha celular de NSO transfectada que expressa de forma estável FcRn humano na superfície. Como anteriormente descrito, os anticorpos purificados foram analisados para detectar ligação a FcRn nos ensaios de ligação competitiva. Concentrações crescentes de anticorpos de competição sem marcação foram incubadas com células na presença de uma concentração sub-saturada de anticorpo IgG humano biotinilado (Sigma-Aldrich) em FBB, pH 6,0. A ligação de HulD10-IgG3 de tipo selvagem e do mutante M428L ao FcRn humano foi testada em experiências de ligação competitiva. Conforme resumido no quadro 11, o IC50 para o 161 anticorpo de tipo selvagem HulD10-IgG3 é ~15 pg/ml, enquanto o IC50 para o mutante individual M428L é ~2 pg/ml. A ligação de HulD10-IgG4 e dos seus mutantes ao FcRn humano foi testada em experiências de ligação competitiva. Conforme resumido no quadro 12, o IC50 para o anticorpo de tipo selvagem HulD10-IgG4 é ~76 pg/ml, enquanto o IC50 para o mutante individual M428L é ~5 pg/ml e o IC50 para o mutante duplo T250Q/M428L é ~1 pg/ml. A ligação de HulD10-IgG3 de tipo selvagem e do mutante M428L ao FcRn de rhesus foi testada em experiências de ligação competitiva. Conforme resumido no quadro 13, o IC50 para o anticorpo de tipo selvagem HulD10-IgG3 é ~14 pg/ml, enquanto o IC50 para o mutante individual M428L é ~3 pg/ml. A ligação de HulD10-IgG4 e dos seus mutantes ao FcRn de rhesus foi também testada em experiências de ligação competitiva. Conforme resumido no quadro 14, o IC50 para o anticorpo de tipo selvagem HulD10-IgG4 é ~98 pg/ml, enquanto o IC50 para o mutante individual M428L é ~7 pg/ml e o IC50 para o mutante duplo T250Q/M428L é ~1 pg/ml. A ligação de IgG a FcRn é conhecida por ser dependente do pH: 0 IgG liga-se fortemente a FcRn a pH 6,0 mas liga-se fracamente a pH 8,0. Para modificar anticorpos mutantes com semi-vidas mais prolongadas no soro é desejável aumentar a ligação a FcRn a pH 6,0, mantendo a libertação dependente do pH de FcRn a pH 8,0. Para confirmar que a ligação é dependente do pH, os anticorpos foram testados quanto à ligação a uma linha celular de NSO transfectada a expressar de modo estável FcRn humano e depois libertação a valores de pH entre 6,0 e 8,0. Como anteriormente descrito, as células foram incubadas com uma concentração sub-saturada de anticorpo em FBBm pH 6,0, foram lavadas com FBB, pH 6,0, 162 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0 e a ligação foi analisada por FACS™. Como se mostra na figura 21A, os resultados indicam que o anticorpo HulD10-IgG3 modificado, com a mutação M428L revelou forte ligação ao FcRn humano a pH 6,0, diminuindo a ligação à medida que os valores de pH aumentam para pH 8,0. Como se mostra na figura 21B, os resultados indicam que o anticorpo HulD10-IgG4 modificado, com as mutações M428L ou T250Q/M428L revelaram todos forte ligação ao FcRn humano a pH 6,0, diminuindo a ligação à medida que os valores de pH aumentam para pH 8,0. Estes resultados indicam que a ligação dos anticorpos IgG3 e IgG4 ao FcRn humano eram, de facto, dependentes do pH.

De modo similar, os anticorpos foram testados quanto à ligação a uma linha celular de NSO transfectada a expressar de modo estável FcRn de rhesus e depois libertação a valores de pH entre 6,0 e 8,0. Como se mostra na figura 21C, os resultados indicam que o anticorpo HulD10-IgG3 modificado, com a mutação M428L revela forte ligação ao FcRn de rhesus a pH 6,0, diminuindo a ligação à medida que os valores de pH aumentam para pH 8,0. Como se mostra na figura 21D, que os anticorpos HulD10-IgG4 modificados, com as mutações M428L ou T250Q/M428L revelaram forte ligação ao FcRn de rhesus a pH 6,0, diminuindo a ligação à medida que os valores de pH aumentam para pH 8,0. Estes resultados indicam que a ligação dos anticorpos ao FcRn de rhesus era também dependente do pH. 163

Quadro 11

Nomea (lgG3) nb IC50 (pg/ml)c Ligação relativad Tipo selvagem 3 14, 5 ± 3,6 1,0 M428L 3 2, 29 ± 0,39 6,3 a para cada mutante, a primeira letra indica o aminoácido de tipo selvagem, o número indica a posição de acordo com o índice UE (Kabat et al., op. cit.) e a segunda letra indica o aminoácido mutante. b n indica o número de análises independentes. c valores de IC50 (± D.P.) são expressos em pg/ml (com base nas concentrações de competição finais) e foram calculados a partir de ensaios de ligação competitivos em comparação com IgG humana biotinilada (Sigma-Aldrich) em FBB, pH 6,0, como descrito no exemplo 11. d a ligação relativa a FcRn humano foi calculada como a proporção do valor IC50 do HulD10-IgG3 de tipo selvagem para o do mutante.

Quadro 12

Nomea (IgG4) nb IC5 0 (pg/ml)c Ligação relativad Tipo selvagem 3 76,1 CM \—1 +1 0 1 1 M428L 3 5, 03 ± 0,45 15 T250Q/M428L 3 1,07 \—1 o +1 71 164 a para cada mutante, a primeira letra indica o aminoácido de tipo selvagem, o número indica a posição de acordo com o índice UE (Kabat et al., op. cit.) e a segunda letra indica o aminoácido mutante. b n indica o número de análises independentes. c valores de IC50 (± D.P.) são expressos em pg/ml (com base nas concentrações de competição finais) e foram calculados a partir de ensaios de ligação competitivos em comparação com IgG humana biotinilada (Sigma-Aldrich) em FBB, pH 6,0, como descrito no exemplo 11. d a ligação relativa a FcRn humano foi calculada como a proporção do valor IC50 do HulDl0-IgG4 de tipo selvagem para o de cada um dos mutantes.

Quadro 13

Nome3 (IgG3) nb IC50 (pg/ml)c Ligaçao relativad Tipo selvagem 3 13,8 0 1 1 +1 0 1 1 M428L 3 3, 03 ± 0,44 4,6 a para cada mutante, a primeira letra indica o aminoácido de tipo selvagem, o número indica a posição de acordo com o índice UE (Kabat et al., op. cit.) e a segunda letra indica o aminoácido mutante. b n indica o número de análises independentes. c valores de IC50 (± D.P.) são expressos em pg/ml (com base nas concentrações de competição finais) e foram calculados a partir de ensaios de ligação competitivos em comparação 165 com igG humana biotinilada (Sigma-Aldrich) em FBB, pH 6,0, como descrito no exemplo 11. d a ligação relativa a FcRn humano foi calculada como a proporção do valor IC50 do HulD10-IgG3 de tipo selvagem para o do mutante.

Quadro 14

Nomea (IgG4) nb IC5 0 (pg/ml)c Ligaçao relativad Tipo selvagem 3 98,4 ±5,8 1,0 M428L 3 6,64 ± 1,05 15 T250Q/M428L 3 1,27 ± 0,13 77 a para cada mutante, a primeira letra indica o aminoácido de tipo selvagem, o número indica a posição de acordo com o indice UE (Kabat et al., op. cit.) e a segunda letra indica o aminoácido mutante. b n indica o número de análises independentes. c valores de IC50 (± D.P.) são expressos em pg/ml (com base nas concentrações de competição finais) e foram calculados a partir de ensaios de ligação competitivos em comparação com IgG humana biotinilada (Sigma-Aldrich) em FBB, pH 6,0, como descrito no exemplo 11. d a ligação relativa a FcRn humano foi calculada como a 166 proporção do valor IC50 do HulD10-IgG4 de tipo selvagem para o de cada um dos mutantes.

Exemplo 12

Este exemplo descreve a aplicação dos ensaios de semi-vida séricos in vitro e in vivo descritos nos exemplos 9 e 10 aos mutantes dos anticorpos IgG3 e IgG4.

Os protocolos do "Estudo Farmacocinético em Rhesus", descritos nos Exemplos 9 e 10 são efectuados em mutantes de IgG3 e IgG4 para confirmar o efeito das mutações sobre a semi-vida in vivo no soro e nos vários parâmetros farmacocinéticos.

Exemplo 13

Este exemplo descreve a concepção e a produção de mutantes de ligação a FcRn de anticorpos terapêuticos bem conhecidos, aumentando (ou diminuindo) a semi-vida no soro de cada um destes para permitir a obtenção de regimes de tratamentos melhorados para os pacientes.

Daclizumab O daclizumab é um anticorpo monoclonal anti-CD25 humanizado que está a ser submetido a desenvolvimento clínico para diversas indicações para enfermidades auto-imunes e inflamatórias, incluindo asma, diabetes, uveite, esclerose múltipla, artrite reumatóide e colite ulcerativa. O daclizumab é presentemente comercializado sob a designação comercial Zenapax®, apenas para propósitos de transplante. 167

As sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve e pesada para o daclizumab foram descritas na patente de invenção norte-americana n° 5 530 101. 0 daclizumab, na sua variante clinica presente, é um anticorpo de isotipo IgGl; no entanto é possível produzir uma versão de isotipo IgG2M3 de daclizumab que exibe caracteristicas terapêuticas idênticas.

Para aumentar a semi-vida sérica de daclizumab a sua sequência de aminoácidos de região constante pode ser modificada com qualquer uma das mutações de ligação a FcRn descritas antes. Por exemplo, a mutação T250Q/M428L pode ser produzida em daclizumab utilizando os métodos para a concepção de vectores e mutagénese descritas nos exemplos 1-4 anteriores. A sequência de T250Q/M428L de daclizumab é apresentada na figura 22 (SEQ ID NO: 122). A semi-vida sérica aumentada de T250Q/M428L de daclizumab pode ser determinada utilizando os métodos de ensaio de ligação in vitro descritos nos exemplos 5-7 ou utilizando os métodos de ensaio in vivo descritos nos exemplos 9-10. É esperado que o T250Q/M428L de daclizumab proporciona os benefícios terapêuticos de daclizumab inalterado com a vantagem de uma diminuição na frequência e na quantidade de dosagem.

As outras mutações de ligação FcRn nas sequências da região constante (isotipo IgGl) de daclizumab, conforme apresentadas na figura 22 (SEQ ID NOs: 119-123), também podem ser produzidas de acordo com os métodos dos exemplos 1-3 anteriores. É esperado que tais mutantes também afectem a semi-vida sérica de daclizumab consoante desejado com 168 base nos efeitos de tais mutações nos exemplos de anticorpos OST577 e HulDIO anteriores.

De igual modo, a mutação de ligação a FcRn numa versão IgG2M3 das sequências da região constante daclizumab, conforme ilustrado na figura 22 (SEQ ID NOs: 124-128), também pode ser produzida de acordo com os métodos dos exemplos 1-4 anteriores.

Fontolizumab: 0 fontolizumab é um anticorpo monoclonal anti-interferão gama humanizado (IFN-γ) do isotipo IgGl, também conhecido como HuZAF™. 0 fontolizumab encontra-se presentemente em desenvolvimento clínico enquanto terapêutico para o tratamento da doença de Crohn. As sequências da região variável de fontolizumab encontram-se descritas na patente de invenção norte-americana n° 6 329 511.

Conforme descrito antes para daclizumab, a semi-vida sérica de fontolizumab pode ser alterada por mutação das suas sequências de região constante, conforme ilustrado na figura 23 (SEQ ID NOs: 130-134), utilizando os métodos descritos antes nos exemplos 1-4. (Racémico) O Visilizumab é um anticorpo monoclonal anti-CD3 humanizado do isotipo IgG2, também conhecido como Nuvion®. O visilizumab é dirigido a moléculas CD3, que formam o complexo antigénio-receptor em todas as células T maduras. O visilizumab encontra-se presentemente em desenvolvimento clinico enquanto tratamento de colite ulcerativa refractária a esteróides. Tal como descrito antes para 169 daclizumab e fontolizumab, a semi-vida sérica de visilizumab também pode ser alterada por mutação das sequências de região constante, conforme ilustrado na figura 24 (SEQ ID NOs: 136-140), utilizando os métodos descritos antes no exemplo 1-4. M200 : Ο M200 é um anticorpor de IgG4 quimérico que é dirigido à integrina α5β1, e que se encontra presentemente em desenvolvimento como terapêutica de inibição da angiogénese dirigida a diversas enfermidades proliferativas. Tal como descrito antes para daclizumab, fontolizumab e visilizumab, a semi-vida sérica de M200 também pode ser alterada por mutação das sequências da região constante, conforme ilustrado na figura 25 (SEQ ID NOs: 142-146), utilizando os métodos descritos antes no exemplo 1-3. 170

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas para conveniência do leitor. Esta lista não faz parte do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o IEP rejeita toda a responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição:

us 6165745 A us 5530101 A us 5585089 A us 5693761 A us 5693762 A us 6180370 A us 6277375 BI us 2002009 8193 AI wo 9734621 A us 6528624 B wo 9805787 A wo 0042072 A wo 0206091 9A2 A us 5807715 A us 4816567 A us 4816397 A 171

US 5658570 A US 5681722 A US 5693780 A US 6180370 B EP 239400 , A wo 9109967 A US 5225539 A EP 592106 , A EP 519596 , A US 5565332 A US 4444887 A US 4716111 A WO 9846645 A WO 9850433 A wo 9824893 A wo 9816654 A wo 9634096 A wo 9633735 A wo 9110741 A wo 9201047 A EP 0598877 A US 5413923 A US 5625126 A

US 5633425 A 172 172 , Lonberg , Dower

US 5569825 A US 5661016 A US 5545806 A US 5814318 A US 5885793 A US 5916771 A US 5939598 A WO 9312227 A US 6150584 A WO 9117271 A US 5969108 A US 6350861 B US 5834597 A WO 9317715 A WO 9208802 A WO 9100360 A WO 9205793 A US 4474893 A US 4714681 A US 4925648 A US 5573920 A US 5601819 A WO 9002809 A

WO 9110737 A 173 173 wo wo wo wo us us us us us us us us us us us us wo us us wo

9218619 A 9311236 A 9515982 A 9520401 A 5698426 A 5223409 A 5403484 A 5580717 A 5427908 A 5750753 A 5821047 A 5571698 A 5516637 A 5780225 A 5658727 A 5733743 A 9222324 A 4946778 A 5258498 A 9007861 A na

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Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo que é modificado a partir de daclizumab, compreendendo ácido glutâmico ou glutamina no resíduo do aminoácido 250 e leucina ou fenilalanina no resíduo do aminoácido 428 e em que os resíduos de aminoácidos são numerados pelo sistema de numeração UE, para utilização em profilaxia ou terapêutica, em que (a) o resíduo de aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é ácido glutâmico e o resíduo de aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é fenilalanina; (b) o resíduo de aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é glutamina e o resíduo de aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é fenilalanina ou (c) o resíduo de aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é glutamina e o resíduo de aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é leucina.

2. Moléculas polinucleotídicas que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo de acordo com a reivindicação 1.

3. Vector que compreende as moléculas polinucleotídicas de acordo com a reivindicação 2.

4. Célula hospedeira que compreende o vector de acordo com a reivindicação 3

5. Método de produção de um anticorpo modificado a partir de daclizumab de classe IgG que possui uma afinidade de 2 ligação alterada para FcRn e/ou uma semi-vida sérica alterada em comparação com um anticorpo de daclizumab não modificado, em que o método compreende: (a) a preparação de um vector de expressão que inclui um promotor adequado ligado de forma funcional a um ADN que codifica, pelo menos, uma cadeia pesada de imunoglobulina do anticorpo modificado, em que o resíduo de aminoácido 250 de daclizumab é substituído por um ácido glutâmico ou glutamina e o resíduo de aminoácido 428 de daclizumab é substituído por leucina ou fenilalanina, em que os resíduos de aminoácidos são numerados pelo sistema de numeração UE, provocando assim uma alteração na afinidade de ligação a FcRn e/ou na semi-vida sérica em relação a daclizumab não modificado; (b) a transformação de células hospedeiras com o vector mencionado; e (c) cultura das referidas células hospedeiras transformadas para produzir o referido anticorpo modificado, em que (i) o resíduo de aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é ácido glutâmico e o resíduo de aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é fenilalanina; (ii) o resíduo de aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é glutamina e o resíduo de aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é fenilalanina ou (iii) o resíduo de aminoácido 250 da região constante da cadeia pesada é glutamina e o resíduo aminoácido 428 da região constante da cadeia pesada é leucina. 3

6. Método de acordo com a reivindicação 5, que compreende ainda a preparação de um segundo vector de expressão que compreende um promotor ligado de forma funcional a ADN que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina complementar do anticorpo modificado, e ainda a transformação da referida linha celular com o referido segundo vector.