JP2024516320A - Ｆｃ受容体への結合が改変されたＦｃ変異体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＦｃγＲまたはＣ１ｑへの結合を低減した、修飾された免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）変異分子に関し、当該分子は、生体内で望ましくないＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣエフェクター機能を顕著に低減させることができる。また、本発明は、さらに前記Ｆｃ変異分子の使用、前記変異分子を含む融合タンパク質およびその使用に関する。
Description
本発明は、一般に、免疫学および抗体工学の分野に関し、具体的には、ＩｇＧ免疫グロブリンの変異体、その調製方法およびその使用に関する。
近年の治療用抗体の開発に伴い、研究者は、一方では新たな標的の探索と発見を継続し、他方では、その有益な効果を高めるかまたは増強するために、創薬可能な抗体に対してアップグレード改造を継続して行い、ここで、研究の焦点の１つは、抗体Ｆｃ領域に対する改造に集中している。
周知のように、抗体のＦｃ領域は抗原結合活性がないが、抗体が細胞表面のＦｃ受容体と相互作用する部位であるため、抗体のエフェクター機能に対して重要な役割を果たし、Ｆｃ領域は異なＦｃ受容体との相互作用により、抗体が多様なエフェクター機能、例えば、抗体は抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を発揮することができる。ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣエフェクター機能に関して、腫瘍細胞または病原体上に発現する抗原を認識して悪性細胞を除去することを標的とする抗体に対しては、効果的に、さらには強化されたＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣエフェクター機能は、抗体の治療効果に寄与するが、例えば、Ｔ細胞上に発現する抗原に対して細胞表面受容体／サイトカインまたは免疫調節を遮断することを標的とする抗体に対しては、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣエフェクター機能を低減さらには除去することはしばしば必要とされ、これは、標的細胞表面抗原の抗体が、免疫細胞に不要な免疫刺激および関連するエフェクター機能ならびに補体活性化を誘発して不利な結果をもたらすからであり、この点は、特に、標的細胞の低損失が必要とされる免疫チェックポイント阻害剤抗体に対しては、特に重要である。
ヒトＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）は異なる免疫機能を有し、例えば、異なるサブクラスのＩｇＧ抗体は異なるＡＤＣＣ活性を有し、他のサブクラスと比較して、ＩｇＧ１とＩｇＧ３は比較的強いＡＤＣＣ活性を有し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４は、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）を有する。治療用抗体およびＦｃ融合構築物は、多くの場合、所望の局所細胞または組織を破壊または損傷することができなく、標的リガンド機能領域を標的および活性化または中和する必要があるため、実際の生産用途では、Ｆｃエフェクター機能を低減または除去する（例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を低減または除去すること、ＣＤＣ活性を低減または除去すること）Ｆｃ変異体を求める実際の要求が常に存在しており、本出願はこの要求を満たす。
既存の文献報告によると、Ｆｃ領域の一部のアミノ酸変異は、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を低減または除去する効果、ＣＤＣ活性を低減または除去する効果が奏する可能性があり、例えばＸＥＮＣＯＲのパテントファミリーＵＳ８７３４７９１Ｂ２、ＵＳ１０１８３９９９Ｂ２、ＵＳ８８８３１４７Ｂ２、ＲｏｃｈｅのパテントファミリーＣＮ１０３４７６７９５Ｂなど、多数はＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を低減させる効果を有するが、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ効果を完全に除去する変異は比較的まれであり、本出願は野生型Ｆｃアミノ酸配列を標的化改造することにより、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ効果を完全に除去するＦｃ変異分子を取得する。
本発明は、操作改造された抗体または抗体ベースの治療薬に使用可能な、修飾された免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ領域）の変異分子を提供する。
本出願に開示された変異および／またはそれらの組み合わせをＦｃ領域に含めることにより、野生型Ｆｃ領域を含む分子と比較して、本出願の変異Ｆｃ領域を含む抗体、抗体ベースの治療薬、および変異Ｆｃ領域を含む他の分子は、ＦｃγＲまたはＣ１ｑへの結合作用が極めて低減され、これにより、望ましくないＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣエフェクター機能は、生体内で顕著に低減される。さらに、本出願に開示されたＦｃ変異は、本出願の変異Ｆｃ領域を含む抗体、抗体ベースの治療薬、および変異Ｆｃ領域を含む他の分子がＦｃＲｎに結合する能力に影響を与えず、したがって、対応する分子の半減期に影響を与えない。したがって、本出願は、特定の変異を有するＦｃ領域ポリペプチド分子、低減または除去されたＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣエフェクター機能を有するが、依然としてＦｃＲｎに結合する能力を保持している前記の変異Ｆｃ領域を含む抗体分子または類似の構造分子を提供する。
第１の態様では、本出願は、異なる修飾を有するＦｃ変異体を提供し、野生型Ｆｃ領域と比較して、当該Ｆｃ変異体はＦｃ受容体および／またはＣ１ｑに対する親和性の低下を示し、ひいては当該Ｆｃ変異体によって誘導されるＡＤＣＣ、ＣＤＣおよびＡＤＣＰエフェクター機能を低減または除去する。一実施形態では、Ｆｃ変異体によって誘導されるＡＤＣＣ、ＣＤＣおよびＡＤＣＰエフェクター機能は、対応する野生型によって誘導されるＡＤＣＣ、ＣＤＣおよびＡＤＣＰエフェクター機能の少なくとも８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％もしくは完全に除去されるまで低減される。
一実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体は、１つまたは複数のアミノ酸欠失を含む。一具体的な実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位のアミノ酸の欠失（Δ３２９）を含む。一具体的な実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体と対応する野生型Ｆｃとの相違は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位の欠失（Δ３２９）にある。別の具体的な実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位および３３０位のアミノ酸の欠失（Δ３２９およびΔ３３０）を含む。一具体的な実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体と対応する野生型Ｆｃとの相違は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位および３３０位の欠失（Δ３２９およびΔ３３０）にある。
一実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体は、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一具体的な実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた２３４位および／または２３５位のアミノ酸の置換を含み、ここで、２３４位のＬ、Ｖ、Ｆおよび／または２３５位のＬは、それぞれＡ、Ｖ、Ｌ、およびＩで置換されている。一好ましい実施形態では、前記Ｆｃ変異体は、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ、Ｖ２３４Ａ、またはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａを含む。一具体的な実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体と対応する野生型Ｆｃとの相違は、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ、Ｖ２３４ＡまたはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａにある。
一実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体は、１つまたは複数のアミノ酸欠失および１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一具体的な実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位のアミノ酸の欠失および３３０位の置換を含み、ここで、３３０位は、Ｇ、ＤまたはＱで置換されている。一好ましい実施形態では、前記Ｆｃ変異体は、Δ３２９＋Ａ３３０ＧまたはΔ３２９＋Ｓ３３０Ｇを含む。一具体的な実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体と対応する野生型Ｆｃとの相違は、Δ３２９＋Ａ３３０ＧまたはΔ３２９＋Ｓ３３０Ｇにある。
一具体的な実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位のアミノ酸の欠失および２３４位と２３５位のアミノ酸の置換を含み、ここで、２３４位のＬ、Ｖ、Ｆおよび／または２３５位のＬは、それぞれＡ、Ｖ、Ｌ、およびＩで置換されている。一好ましい実施形態では、前記Ｆｃ変異体は、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９、Ｖ２３４Ａ＋Δ３２９、またはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９を含む。一具体的な実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体と対応する野生型Ｆｃとの相違は、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９、Ｖ２３４Ａ＋Δ３２９、またはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９にある。
別の具体的な実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位と３３０位のアミノ酸の欠失および２３４位と２３５位のアミノ酸の置換を含み、ここで、２３４位のＬ、Ｖ、Ｆおよび／または２３５位のＬは、それぞれＡ、Ｖ、Ｌ、およびＩで置換されている。一好ましい実施形態では、前記Ｆｃ変異体は、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９＋Δ３３０、Ｖ２３４Ａ＋Δ３２９＋Δ３３０、またはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９＋Δ３３０を含む。一具体的な実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体と対応する野生型Ｆｃとの相違は、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９＋Δ３３０、Ｖ２３４Ａ＋Δ３２９＋Δ３３０、またはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９＋Δ３３０にある。
別の具体的な実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位のアミノ酸の欠失および２３４位、２３５位、３３０位のアミノ酸の置換を含み、ここで、２３４位のＬ、Ｖ、Ｆおよび／または２３５位のＬは、それぞれＡ、Ｖ、Ｌ、およびＩで置換されており、３３０位は、Ｇ、Ｄ、またはＱで置換されている。一好ましい実施形態では、前記Ｆｃ変異体は、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ａ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｓ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｖ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ａ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｖ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｓ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｆ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｓ３３０Ｇ＋Δ３２９、またはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ａ３３０Ｇ＋Δ３２９を含む。一具体的な実施形態では、本出願で提供されるＦｃ変異体と対応する野生型Ｆｃとの相違は、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ａ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｓ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｖ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ａ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｖ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｓ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｆ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｓ３３０Ｇ＋Δ３２９、またはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ａ３３０Ｇ＋Δ３２９にある。
いくつかの実施形態では、本発明で提供されるＦｃ変異体は、ＩｇＧ１型Ｆｃ変異体であり、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して、前記変異体は、低減、さらには除去されたＦｃγＲに結合する能力を有する。別のいくつかの実施形態では、本発明で提供されるＦｃ変異体はＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、およびＩｇＧ４型Ｆｃ変異体であり、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して、前記変異体は、低減、さらには除去されたＦｃγＲに結合する能力を有する。好ましくは、本発明で提供されるＦｃ変異体は、ＦｃＲｎに結合する能力を保持する。
本出願で開示されるＦｃ変異体は、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣエフェクター機能を低減さらには除去する必要がある任意の場面、例えば、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣエフェクター機能の低減さらには除去が望まれる任意の種類の抗体分子、類似の抗体構造を有する分子において、プラットフォーム構成要素として適用することができる。
一実施形態では、前記Ｆｃ変異体は実質的にＩｇＧ配列に基づき、一好ましい実施形態では、前記Ｆｃ変異体は実質的にヒトＩｇＧ配列に基づき、別の実施形態では、前記Ｆｃ変異体は実質的にヒトＩｇＧ１配列に基づく。
別の実施形態では、前記Ｆｃ変異体は、他の修飾、例えば、免疫原性を低下させ、安定性、溶解性、機能および臨床的利益を向上させるための従来技術で知られている他の修飾をさらに含み得る。
一具体的な実施形態では、Ｆｃ変異体は以下の配列を含む：
１）配列番号２のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２）配列番号３のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
３）配列番号４のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
４）配列番号５のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
５）配列番号６のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
６）配列番号７のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
７）配列番号８のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
８）配列番号１１のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
９）配列番号１２のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１０）配列番号１３のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１１）配列番号１４のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１２）配列番号１５のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１３）配列番号１６のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１４）配列番号１７のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１５）配列番号１９のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１６）配列番号２０のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１７）配列番号２１のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１８）配列番号２２のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１９）配列番号２３のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２０）配列番号２４のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２１）配列番号２５のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２２）配列番号２７のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２３）配列番号２８のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２４）配列番号２９のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２５）配列番号３０のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２６）配列番号３１のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２７）配列番号３２のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２８）配列番号３３のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの。
１）配列番号２のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２）配列番号３のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
３）配列番号４のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
４）配列番号５のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
５）配列番号６のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
６）配列番号７のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
７）配列番号８のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
８）配列番号１１のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
９）配列番号１２のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１０）配列番号１３のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１１）配列番号１４のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１２）配列番号１５のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１３）配列番号１６のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１４）配列番号１７のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１５）配列番号１９のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１６）配列番号２０のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１７）配列番号２１のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１８）配列番号２２のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１９）配列番号２３のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２０）配列番号２４のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２１）配列番号２５のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２２）配列番号２７のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２３）配列番号２８のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２４）配列番号２９のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２５）配列番号３０のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２６）配列番号３１のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２７）配列番号３２のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２８）配列番号３３のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの。
第２の態様では、本発明は、第１の態様に記載のＦｃ変異体を含むポリペプチドを提供し、野生型Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して、前記ポリペプチドは、低減または除去されたＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣエフェクター機能を有し、好ましくは、前記ポリペプチドは、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣ効果を引き起こさない。一具体的な実施形態では、前記ポリペプチドは、延長された半減期を同時に有する。一実施形態では、第１の態様に記載のＦｃ変異体を含むポリペプチドによって誘導されるＡＤＣＣ、ＣＤＣおよびＡＤＣＰエフェクター機能は、対応する野生型を含むポリペプチドによって誘導されるＡＤＣＣ、ＣＤＣおよびＡＤＣＰエフェクター機能の少なくとも８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％もしくは完全に除去されるまで低減される。
いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは抗体分子であり、好ましくは、前記抗体分子はＩｇＧクラスの抗体分子である。別の実施形態では、前記抗体分子は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体融合体である。対応する野生型抗体分子と比較して、本出願で得られた前記Ｆｃ変異体を含む抗体分子は、ＦｃγＲとの結合能力が低減、さらには除去されており、したがって、低減または除去されたＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣエフェクター機能を有する。
いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、Ｆｃ変異体に有効に連結された１つまたは複数の融合パートナーを含む融合タンパク質であり、前記融合パートナーは通常、任意のタンパク質または小分子、例えば、任意の抗体の可変領域、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、もしくはいくつかの他のタンパク質またはタンパク質ドメインであってもよい。一実施形態では、前記融合タンパク質は、例えばイムノアドヘシンである。
一実施形態では、本出願は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位のアミノ酸の欠失（Δ３２９）を含む、Ｆｃ変異体を含むＩｇＧ抗体を提供する。別の具体的な実施形態では、本出願は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位および３３０位のアミノ酸の欠失（Δ３２９およびΔ３３０）を含む、Ｆｃ変異体を含むＩｇＧ抗体を提供する。
一実施形態では、本出願は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた２３４位および／または２３５位のアミノ酸の置換を含み、ここで、２３４位のＬ、Ｖ、Ｆおよび／または２３５位のＬは、それぞれＡ、Ｖ、Ｌ、およびＩで置換されている、Ｆｃ変異体を含むＩｇＧ抗体を提供する。一好ましい実施形態では、前記ＩｇＧ抗体は、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ、Ｖ２３４Ａ、またはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａを含む。
一実施形態では、本出願は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位のアミノ酸の欠失および３３０位の置換を含み、ここで、３３０位は、Ｇ、ＤまたはＱで置換されている、Ｆｃ変異体を含むＩｇＧ抗体を提供する。一好ましい実施形態では、前記ＩｇＧ抗体はΔ３２９＋Ａ３３０ＧまたはΔ３２９＋Ｓ３３０Ｇを含む。
一実施形態では、本出願は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位のアミノ酸の欠失および２３４位と２３５位のアミノ酸の置換を含み、ここで、２３４位のＬ、Ｖ、Ｆおよび／または２３５位のＬは、それぞれＡ、Ｖ、Ｌ、およびＩで置換されている、Ｆｃ変異体を含むＩｇＧ抗体を提供する。一好ましい実施形態では、前記ＩｇＧ抗体は、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９、Ｖ２３４Ａ＋Δ３２９、またはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９を含む。
一実施形態では、本出願は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位と３３０位のアミノ酸の欠失および２３４位と２３５位のアミノ酸の置換を含み、ここで、２３４位のＬ、Ｖ、Ｆおよび／または２３５位のＬは、それぞれＡ、Ｖ、Ｌ、およびＩで置換されている、Ｆｃ変異体を含むＩｇＧ抗体を提供する。一好ましい実施形態では、前記ＩｇＧ抗体は、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９＋Δ３３０、Ｖ２３４Ａ＋Δ３２９＋Δ３３０、またはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９＋Δ３３０を含む。
一実施形態では、本出願は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位のアミノ酸の欠失および２３４位、２３５位、３３０位のアミノ酸の置換を含み、ここで、２３４位のＬ、Ｖ、Ｆおよび／または２３５位のＬは、それぞれＡ、Ｖ、Ｌ、およびＩで置換されており、３３０位は、Ｇ、Ｄ、またはＱで置換されている、Ｆｃ変異体を含むＩｇＧ抗体を提供する。一好ましい実施形態では、前記ＩｇＧ抗体は、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ａ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｓ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｖ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ａ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｖ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｓ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｆ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｓ３３０Ｇ＋Δ３２９、またはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ａ３３０Ｇ＋Δ３２９を含む。
いくつかの実施形態では、本発明で提供されるＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１型抗体であり、対応する野生型抗体と比較して、前記抗体は、低減、さらには除去されたＦｃγＲに結合する能力を有する。別のいくつかの実施形態では、本発明で提供されるＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、ＩｇＧ４型抗体であり、対応する野生型抗体と比較して、前記抗体は、低減、さらには除去されたＦｃγＲに結合する能力を有する。好ましくは、本発明で提供される抗体は、ＦｃＲｎに結合する能力を保持する。
いくつかの実施態様において、前記抗体分子は、抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２のＩｇＧ抗体である。
一具体的な実施形態では、本発明で提供されるＦｃ変異体を含むＩｇＧ抗体は、以下のような重鎖および軽鎖を含む：
１）配列番号２に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２）配列番号３に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
３）配列番号４に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
４）配列番号５に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
５）配列番号６に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
６）配列番号７に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
７）配列番号８に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
８）配列番号１１に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
９）配列番号１２に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１０）配列番号１３に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１１）配列番号１４に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１２）配列番号１５に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１３）配列番号１６に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１４）配列番号１７に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１５）配列番号１９に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１６）配列番号２０に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１７）配列番号２１に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１８）配列番号２２に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１９）配列番号２３に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２０）配列番号２４に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２１）配列番号２５に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２２）配列番号２７に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２３）配列番号２８に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２４）配列番号２９に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２５）配列番号３０に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２６）配列番号３１に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２７）配列番号３２に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２８）配列番号３３に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの。
１）配列番号２に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２）配列番号３に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
３）配列番号４に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
４）配列番号５に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
５）配列番号６に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
６）配列番号７に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
７）配列番号８に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
８）配列番号１１に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
９）配列番号１２に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１０）配列番号１３に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１１）配列番号１４に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１２）配列番号１５に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１３）配列番号１６に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１４）配列番号１７に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１５）配列番号１９に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１６）配列番号２０に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１７）配列番号２１に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１８）配列番号２２に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１９）配列番号２３に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２０）配列番号２４に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２１）配列番号２５に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２２）配列番号２７に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２３）配列番号２８に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２４）配列番号２９に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２５）配列番号３０に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２６）配列番号３１に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２７）配列番号３２に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２８）配列番号３３に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの。
別の実施形態では、本出願で提供される前記Ｆｃ変異体を含むポリペプチドド（例えば、抗体）は、Ｆｃ領域に、他の修飾、例えば、ポリペプチド（例えば、抗体）の免疫原性を低下させ、半減期を増加させ、安定性、溶解性、機能および臨床的利益を向上させるための従来技術で知られている他の修飾をさらに含み得る。
別の実施形態では、本出願で提供される前記Ｆｃ変異体を含む抗体は、従来技術で知られている異なる標的抗原に対する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する。当業者は、従来技術で知られている重鎖可変領域および軽鎖可変領域を本出願に開示されたＦｃ変異体上に容易にグラフトして、所望の特性（例えば、低減または除去されたＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣエフェクター機能）を有する抗体の変異体を得ることができる。
第３の態様では、本発明は、第２の態様に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、前記医薬組成物は、本発明に記載のＦｃ変異体を有する抗体分子を含む。一実施形態では、前記医薬組成物は、本発明に記載のＦｃ変異体を有するＩｇＧ抗体を含む。別の実施形態では、前記医薬組成物は、本発明に記載のＦｃ変異体を有するＩｇＧ１型抗体、ＩｇＧ２型抗体、ＩｇＧ３型抗体、またはＩｇＧ４型抗体を含む。
第４の態様では、本発明は、本出願に記載のＦｃ領域修飾により、抗体のＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣエフェクター機能を低減または除去し、かつ半減期を保持、さらには増加させる方法を提供する。一実施形態では、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣエフェクター機能を低減または除去するために必要な抗体Ｆｃ領域に対して本出願に開示された１つまたは複数の修飾を行うことにより、抗体のＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣエフェクター機能を低減または除去する。
第５の態様では、本発明は、Ｆｃ変異体の医薬の調製における使用を提供する。一実施形態では、前記医薬は免疫療法、免疫補助療法に使用される。一実施形態では、前記医薬は、低減または除去されたＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣエフェクター機能の作用を有する。一具体的な実施形態では、例えば、前記医薬は、本出願のＦｃ変異体を含む融合タンパク質、例えば、ＩＬ－２Ｆｃ融合タンパク質である。別の具体的な実施形態では、例えば、前記医薬は、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣエフェクター機能を低減または除去する作用を有する、本出願のＦｃ変異体を含む免疫細胞表面分子を標的とする抗体である。別の実施形態では、前記医薬は、対象の腫瘍を治療するために使用され、例えば、一実施形態では、前記医薬は、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣ作用を活性化することなく、半減期を延長して患者の免疫細胞を活性化し、これにより、抗腫瘍効果を達成する。
第６の態様では、本発明は、対象の疾患を治療する方法であって、本出願に記載のＦｃ変異体を含む、対応する疾患に対する有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、前記疾患は、免疫療法または免疫補助療法を必要とする疾患である。エフェクター機能の除去は、細胞表面分子を標的とする抗体、特に免疫細胞上の抗体にとって有利である。一実施形態では、本発明は、対象の疾患を治療する方法であって、本出願に記載のＦｃ変異体を含む、対応する免疫細胞上の抗原に対する有効量の抗体を対象に投与することを含む方法を提供する。
第７の態様では、本発明は、本出願に開示されるＦｃ変異体、前記Ｆｃ変異体を含むポリペプチド、または前記Ｆｃ変異体を含む免疫グロブリン分子を含むキットを提供する。一実施形態では、本発明は、機能性分子（例えば、酵素、抗原、受容体、リガンド、サイトカインなど）とＦｃとを融合させることによって融合タンパク質の安定性を向上させることができるだけでなく、フローサイトメトリー、免疫組織化、インビトロ活性検出、およびタンパク質マイクロアレイ検出などの非臨床分野で使用可能な検出キットを提供する。
本出願で提供される具体的なＦｃ変異を有する抗体分子は、低減または除去されたＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣエフェクター機能を有するが、ＦｃＲｎに結合する能力は依然として保持しているため、改良型抗体変異体として使用でき、抗体の治療効果を高めるだけでなく、抗体の安全性、安定性および低免疫原性も確保する。驚くべきことに、Ｆｃ領域の３２９位のプロリン残基を欠失させることにより、Ｆｃ領域の受容体ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩ、およびＣ１ｑへの結合が顕著に低減し、これにより、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣ活性が顕著に低減または除去されることが判明した。さらに、Ｆｃ領域のＰｒｏ３２９と、例えばＡ３３０欠失、Ａ３３０Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａからなる群から選択される１つまたは複数との組み合わせ変異は、受容体ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩ、Ｃ１ｑへの結合の顕著な低減をもたらし、これにより、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣ活性が顕著に低減または除去される。
発明の詳細な説明
明確に反対すると指定しない限り、本発明における実施は、本分野の技術的な日常化学、生物化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学と細胞生物学の方法を用いる。これらの方法の説明は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙとＳｏｎｓ、２００８年７月に更新）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓとＷｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５）；Ａｎａｎｄ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｅｄｓ．、１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．ＳｈｅｖａｃｈとＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ、ｅｄｓ．、１９９１）；Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；およびＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙのような定期刊行物専門書を参照する。
明確に反対すると指定しない限り、本発明における実施は、本分野の技術的な日常化学、生物化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学と細胞生物学の方法を用いる。これらの方法の説明は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙとＳｏｎｓ、２００８年７月に更新）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓとＷｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５）；Ａｎａｎｄ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｅｄｓ．、１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．ＳｈｅｖａｃｈとＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ、ｅｄｓ．、１９９１）；Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；およびＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙのような定期刊行物専門書を参照する。
定義
以下、本発明を詳細に説明するに先立ち、本明細書に記載される特定の方法学、形態または試薬が変更され得るため、本発明はそれらに限定されるものではないことが理解すべきである。また、本発明に使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定しようとは意図せず、本発明の範囲は、特許請求の範囲のみによって限定されると理解すべきである。特に定義のない限り、本明細書に使用される技術・科学用語は、当業者による通常の理解と同じ意味を有する。
以下、本発明を詳細に説明するに先立ち、本明細書に記載される特定の方法学、形態または試薬が変更され得るため、本発明はそれらに限定されるものではないことが理解すべきである。また、本発明に使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定しようとは意図せず、本発明の範囲は、特許請求の範囲のみによって限定されると理解すべきである。特に定義のない限り、本明細書に使用される技術・科学用語は、当業者による通常の理解と同じ意味を有する。
本明細書を解釈するために次の定義が使用され、また、適切であるならば、単数形で使用される用語には複数形が含まれてもよく、その逆も同様である。本明細書に使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定するためのものではないと理解しなければならない。
用語「約」は、数字または数値とともに使用される場合、下限として指定された数字または数値より５％小さく、上限として指定された数字または数値より５％大きい範囲内の数字または数値をカバーすることを意味する。
用語「かつ／または」は、２つまたは複数のオプションの接続に使用される場合、オプションのうちのいずれか１項またはオプションのうちのいずれか２項もしくは複数項を指すと理解すべきである。
用語「含有する」または「含む」は、前記要素、整数またはステップを含むが、任意の他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本明細書において、用語「含有する」または「含む」が使用される場合、特に断りのない限り、前記他の要素、整数またはステップの組合せの場合も包含する。例えば、ある具体的な配列を「含む」抗体可変領域が言及される場合、この具体的な配列からなる抗体可変領域を包含することも意図する。
用語「抗体」は、本明細書で最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、単鎖抗体、完全な抗体または所望の抗原結合活性を示す抗体断片を含むが、これらに限定されない、多種の抗体構造物を包含する。完全な抗体は通常、少なくとも２つの完全長重鎖および２つの完全長軽鎖を含むが、いくつかの場合では、比較的少ない鎖を含み、例えばラクダに天然に存在する抗体は重鎖のみを含む場合がある。
本明細書に使用されるように、用語「結合」および「特異的結合」は、抗体の結合作用が抗原に対して選択的であり、かつ望ましくない相互作用または非特異的相互作用と区別できることを意味する。特定の抗原に対する抗体の結合能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、またはバイオフィルム層光学干渉技術（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）、もしくは当分野で知られている他の通常結合測定法により測定することができる。例えば、ＳＰＲにおいて、抗体は、約１×１０－７以下のＫＤ、約１×１０－８以下のＫＤ、約１×１０－９以下のＫＤ、約１×１０－１０以下のＫＤ、約１×１０－１１以下のＫＤで、ＢＣＭＡまたはＣＤ３に結合すると、当該抗体は、「ＢＣＭＡまたはＣＤ３に特異的に結合する」抗体である。しかし、ヒトＢＣＭＡまたはＣＤ３に特異的に結合する抗体は、他の種由来のＢＣＭＡまたはＣＤ３タンパク質と交差反応性を有し得る。例えば、ヒトＢＣＭＡまたはＣＤ３に特異的な抗体は、いくつかの実施形態では、カニクイザルＢＣＭＡまたはＣＤ３と交差反応し得る。交差反応性を測定する方法は、実施例に記載される方法、および本分野で知られている標準的な測定法、例えば、光干渉による生体測定法、またはフローサイトメトリー技術を含む。
用語「Ｋａｂａｔの可変ドメイン残基の番号付け方式」、「Ｋａｂａｔの番号付けシステム」または「Ｋａｂａｔによるアミノ酸位置の番号付け方式」およびそれらのバリエーションとは、Ｋａｂａｔらによる抗体重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメイン編集のための番号付けシステムを指す（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）を参照）。Ｋａｂａｔの番号付けシステムは通常、抗体の可変ドメイン中の残基（およそ１位～１０７位の軽鎖残基および１位～１１３位の重鎖残基）に適用される。
用語「ＥＵ番号付けシステム」、「ＫａｂａｔのＥＵインデックスのように」または「ＥＵインデックス」は、一般に、免疫グロブリン重鎖の定常領域内の残基に適用される（例えば、Ｋａｂａｔら、前記記載を参照）。本明細書において特に断りのない限り、本明細書の抗体可変ドメイン中の残基番号付けはＫａｂａｔ番号付けシステムの残基番号付けにしたがって、抗体定常ドメイン中の残基番号付けはＥＵ番号付けシステムの残基番号付け方式にしたがう。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因して抗体アイソタイプによって変化する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレート、Ｂ細胞活性化などを含む。
用語「エフェクター細胞」とは、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を発揮する細胞、例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を発揮する細胞を指し、一実施形態では、ＡＤＣＣ機能を媒介する細胞は、例えば、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、好中球細胞である。エフェクター細胞は、血液などの天然環境に由来し得る。
用語「抗体依存性細胞介在性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」とは、細胞媒介性免疫応答を指し、ここで、一部の細胞傷害性細胞の表面に存在するＦｃ受容体が標的細胞上に結合する抗体を認識し、これにより、細胞傷害性細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、免疫系のエフェクター細胞を活性化して標的細胞を溶解する。典型的なＡＤＣＣ作用はナチュラルキラー細胞（ＮＫ）によって媒介され、マクロファージ、好中球、および好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｃｅｌｌｓ）もＡＤＣＣ作用を媒介できる。例えば、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｃｅｌｌｓ）は、ＡＤＣＣ作用により一部の特定の寄生虫を殺すことができる。
用語「抗体依存性細胞貪食」または「ＡＤＣＰ」とは、標的細胞に結合する抗体がマクロファージ表面上のＦｃγＲＩＩＩａに結合することによってマクロファージの活性化が誘導され、これにより標的細胞が内在化し、ファゴソームによって酸性化分解される、細胞応答を指す。ＡＤＣＰは、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩによっても媒介され得るが、その割合は比較的小さい。
補体系は、一連のタンパク質からなる先天性免疫系の一部である。補体系のタンパク質は「補体」と呼ばれ、略語記号Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３などで表され、ヒトや脊椎動物の血清、組織液中に存在する、熱に弱い活性化された酵素活性を有するタンパク質のグループである。Ｃ１ｑは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路の第１の成分であり、６つの抗体に結合できるが、補体カスケードを活性化するには２つのＩｇＧに結合するだけで十分である。
用語「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」とは、補体が関与する細胞傷害作用を指し、ここで、標的に結合する抗体のＦｃエフェクタードメインが一連の補体カスケード反応を活性化し、標的細胞膜に穴を形成し、これにより、標的細胞を死滅させる。
用語「Ｆｃ領域」とは、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、そのＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からカルボキシル末端までのセグメントとして定義され、Ｆｃ領域のＣ末端４４７位のリジン残基（ＥＵ番号付けシステムによる）は存在または欠失してもよい。したがって、完全な抗体組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去される抗体の集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体の集団、またはＫ４４７残基を有する抗体とＫ４４７残基を有さない抗体が混在する抗体の集団を含み得る。
一部の実施形態では、免疫グロブリンのＦｃ領域は、２つの定常ドメイン、すなわちＣＨ２およびＣＨ３を含み、別のいくつかの実施形態では、免疫グロブリンのＦｃ領域は、３つの定常ドメイン、すなわちＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む。
ＩｇＧのＦｃγ受容体またはＣ１ｑへの結合は、ヒンジ領域およびＣＨ２ドメインに位置する残基に依存する。ＣＨ２ドメインの２つの領域は、ＦｃγＲと補体Ｃ１ｑの結合に対して重要であり、ＩｇＧ２とＩｇＧ４において唯一の配列を有する。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２における２３３位～２３６位の残基の置換、ならびにヒトＩｇＧ４における３２７位、３３０位、および３３１位の残基の置換は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を大幅に低減させることがすでに示された（Ａｒｍｏｕｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）、１９９９、２６１３－２６２４；Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）、２００１、６５９１－６６０４）。さらに、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらは、Ｋ３２２を含む異なる位置でのアラニン置換が補体活性化を顕著に低減させることが判明した（ＩｄｕｓｏｇｉｅＥＥら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１６４（８）、２０００、４１７８－８４）。
「機能性Ｆｃ領域」および「機能的Ｆｃ領域」などの類似の用語は、互換的に使用されてもよく、野生型Ｆｃ領域のエフェクター機能を有するＦｃ領域を指す。
「変異Ｆｃ領域」、「Ｆｃ突然変異体」、「変異を有するＦｃ領域」、「突然変異Ｆｃ領域」、「Ｆｃ領域変異体」、「Ｆｃ変異体」、「変異体Ｆｃ領域」および「突然変異のＦｃ領域」などの類似の用語は、互換的に使用されてもよく、天然配列Ｆｃ領域／野生型Ｆｃ領域と区別する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むＦｃ領域を指す。
いくつかの実施形態では、変異Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列と、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、または付加が異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異Ｆｃ領域は、野生型ＩｇＧのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する。いくつかの実施形態では、変異Ｆｃ領域は、野生型ＩｇＧのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、変異Ｆｃ領域は、野生型抗体のＦｃ領域において１つまたは複数のアミノ酸置換および１つまたは複数のアミノ酸欠失を有する。いくつかの実施形態では、変異Ｆｃ領域は、少なくとも１つまたは２つの本明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸欠失を有する。いくつかの実施形態では、変異Ｆｃ領域は、少なくとも１つ、２つ、３つもしくはそれ以上の本明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、変異Ｆｃ領域は、少なくとも１つ、２つ、３つもしくはそれ以上の本明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸置換、および少なくとも１つ、２つの本明細書に記載のＦｃ領域欠失を有する。いくつかの実施形態では、変異体Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域および／または親Ｆｃ領域と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の相同性を有する。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」とは、抗体Ｆｃ領域に結合する分子を指す。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは天然のヒトＦｃＲである。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合する受容体、すなわちＦｃγＲであり、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の３つの受容体を含み、ならびにこれらの受容体の対立遺伝子変異体および可変スプライシング形式を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体はＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢを含み、ＦｃγＲＩＩＩ受容体はＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢを含む。
受容体機能に応じて、ＦｃγＲは活性化型受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢであって、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｃ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂとも呼ばれる）と抑制型受容体（ＦｃγＲＩＩＢ、ＣＤ３２Ｂとも呼ばれる）に分類することができる。活性化型受容体は、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔγｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｔｉｆ、またはＩＴＡＭ）を含み、当該モチーフは活性化シグナルを伝達し、細胞活性化の作用を促進し、抑制型受容体は、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔγｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒγ Ｍｏｔｉｆ、またはＩＴＩＭ））を含み、当該モチーフは細胞活性化の作用を阻害する。活性化性ＦｃγＲのエフェクター機能は主にＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、および抗原提示を含み、これに対して、抑制性ＦｃγＲのエフェクター機能は主に抑制、清掃などの機能を有する。ＦｃγＲＩＩＢは、ヒトおよびマウスで発現される唯一の阻害性ＦｃγＲであり、腫瘍を直接標的とする抗体において、ＦｃγＲＩＩＢの発現は抗体の治療効果の低下と関連する。
異なるＦｃγＲは、異なる細胞発現プロファイルを有し、例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）はマクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの細胞ですべて発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体は、ＮＫ細胞上に発現する唯一の受容体であり、ＡＤＣＣ機能を媒介することができる。
用語「ＦｃＲ」は、細胞膜の表面に位置するＩｇＧ抗体受容体である新生児受容体（ＦｃＲｎ）をさらに含む。ＦｃＲｎは、母体ＩｇＧを胎児に移し、インビボでの免疫グロブリンの定常状態の調節を担う。ＦｃＲｎはＩｇＧのＦｃ部分に結合して、ＩｇＧ分子がリソソームによって溶解されるのを阻止することができ、ＩｇＧのインビボ半減期を延長する効果を奏し、ＩｇＧのインビボ輸送、維持、および分布代謝に関与することができる。
ＩｇＧ１～ＩｇＧ４サブクラスは、Ｆｃ受容体に結合する能力が異なり、異なるＦｃγＲに対して、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は普遍的なリガンドであり、すべてのＦｃγＲに結合し、強力なＡＤＣＣ作用を有する。ＩｇＧ２またはＩｇＧ４は通常、「不活性」ＩｇＧサブクラスとも呼ばれ、両方のサブクラスを使用することで免疫活性化効果を回避することができる。実際、多くのモノクローナル抗体は、ＡＤＣＣ効果を回避するために、抗体のバックボーンとしてＩｇＧ４を選択する。しかし、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は完全に「不活性」ではなく、それぞれ活性化型ＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１およびＦｃγＲＩに結合し、これにより好中球の活性化を開始することができる。
さらに、実際の状況では、ＩｇＧ１サブクラスによるＡＤＣＣ効果を低減する必要があり、従来技術では、ＩｇＧ１の「ＬＡＬＡ」（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ）変異が広く使用されており、当該変異は、ＦｃγＲに対する抗体Ｆｃ領域の結合親和性を１００倍低減させることができる。本出願で得られたＦｃ変異体は、「ＬＡＬＡ」変異と比較してＦｃγＲに対する結合親和性が低いため、ＡＤＣＣの作用がより強く低減された。
ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣが関与する文脈において、「低減されたＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣエフェクター機能」または「低減されたＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣエフェクター機能」および類似の表現とは、対応する野生型によって引き起こされるＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣエフェクター機能の数値と比較して、本出願に記載のＦｃ変異体、Ｆｃ変異体を含むポリペプチドなどによって引き起こされるＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣエフェクター機能の数値は、当業者であれば、対応する生物学的状況において統計的に有意であると考えるほど十分に高い低減を有することを指す。例えば、一部の実施形態では、前記２つの数値の低減は、例えば、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０超、もしくは約１００％超、さらにはそれ以上である。
「アミノ酸置換」とは、所定のアミノ酸配列中に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を、別の異なる「置換」アミノ酸残基に置換することを指す。
用語「保存的置換」とは、１つのアミノ酸が同じクラス内の別のアミノ酸によって置換され、例えば、１つの酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸によって置換され、１つの塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸によって置換され、または１つの中性アミノ酸が別の中性アミノ酸によって置換されたことを指す。例示的な置換は下記の表に示す通りである：
共通の側鎖特性に従って、（１）疎水性：Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性度：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅにグループ化する。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換する必要がある。
「アミノ酸欠失」とは、所定のアミノ酸配列から少なくとも１つのアミノ酸残基を除去することを指す。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」と「宿主細胞培養物」は、交換して使用されてもよく、外因性核酸が導入された細胞を指し、この細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」と「形質転換細胞」を含み、初代形質転換細胞および継代数に関係なくそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸の内容において親細胞とは全く同じではない可能性があり、変異を含んでもよい。本明細書では、初代形質転換細胞からスクリーニングまたは選択された同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫を含む。
以下のように、配列間の配列同一性を算出する。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセンテージを決定するために、前記配列を最適比較のためにアラインメントを行う（例えば、最適アラインメントのために第１と第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方もしくは両方にギャップを導入してもよく、あるいは比較のために、非相同配列を捨ててもよい）。一好ましい実施形態では、比較のために、アラインメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応の位置での同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、前記分子はこの位置において同一である。
数学アルゴリズムにより、２つの配列間の配列比較および同一性パーセンテージの計算を実現することができる。一好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに統合されたＮｅｅｄｌｅｍａおよびＷｕｎｓｃｈ （（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３）アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて取得可能）により、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２行列若しくはＰＡＭ２５０行列、およびギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４と長さ重み１、２、３、４、５もしくは６を用いて決定される。別の好ましい実施形態では、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて取得可能）により、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、およびギャップ重み４０、５０、６０、７０もしくは８０と長さ重み１、２、３、４、５もしくは６を用いて、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセンテージを決定する。特に好ましいパラメータセット（および特に断りのない限り使用すべき１つのパラメータセット）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５のＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリング行列を採用する。
また、ＰＡＭ１２０加重余り表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を利用して、ＡＬＩＧＮプログラム（２．０版）に統合されたＥ．ＭｅｙｅｒｓとＷ．Ｍｉｌｌｅｒアルゴリズム（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ、４：１１－１７）により、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間の同一性パーセンテージを決定してもよい。
抗体の標的抗原
本発明によって提供されるＦｃ変異体を含む抗体は、例えば、サイトカイン、膜結合因子、酵素、受容体、リガンド、病原体およびその毒素、ウイルス粒子、腫瘍関連因子、シグナル伝達経路メンバー分子などの標的抗原に属するタンパク質、サブユニット、ドメイン、モチーフおよび／またはエピトープを含むがこれらに限定されない任意の抗原を標的とすることができる。適切な抗原は、目的の用途によって異る。抗癌治療に対しては、癌細胞内で発現が制限されている標的を有することが望ましい。抗体治療に特に適していることが証明されている一部の標的は、シグナル伝達機能を有するものである。他の治療抗体は、受容体とその共役リガンドとの間の結合を阻害することにより、受容体のシグナル伝達を遮断することによってその作用を発揮する。
本発明によって提供されるＦｃ変異体を含む抗体は、例えば、サイトカイン、膜結合因子、酵素、受容体、リガンド、病原体およびその毒素、ウイルス粒子、腫瘍関連因子、シグナル伝達経路メンバー分子などの標的抗原に属するタンパク質、サブユニット、ドメイン、モチーフおよび／またはエピトープを含むがこれらに限定されない任意の抗原を標的とすることができる。適切な抗原は、目的の用途によって異る。抗癌治療に対しては、癌細胞内で発現が制限されている標的を有することが望ましい。抗体治療に特に適していることが証明されている一部の標的は、シグナル伝達機能を有するものである。他の治療抗体は、受容体とその共役リガンドとの間の結合を阻害することにより、受容体のシグナル伝達を遮断することによってその作用を発揮する。
臨床試験のために承認されている、または開発中の多くの抗体は、本発明のＦｃ変異体から恩恵を受ける可能性がある。したがって、これらの抗体の可変領域は、本出願に開示されるＦｃ変異体と統合して、改良された優れた特性を有する製品を形成することができる。一実施形態では、本出願に開示されたＦｃ変異体は、例えば、それらの重鎖可変領域に融合されて、ヒト化抗体、親和性成熟抗体、操作された抗体に組み込むことができる。
Ｆｃ領域の他の修飾
従来技術においてすでに開示された様々な方法を使用して、本出願で提供されるＦｃ変異体、Ｆｃ変異体を含む融合タンパク質（例えば抗体）などに対して、さらなる修飾、例えば免疫原性を低減させ、安定性、溶解性、機能および臨床的利益を向上させるための他の修飾を行うことができる。このような修飾は、例えば、血清半減期を延長する可能性がある位置２５２、位置２５４および位置２５６における修飾を含むが、これらに限定されない。
従来技術においてすでに開示された様々な方法を使用して、本出願で提供されるＦｃ変異体、Ｆｃ変異体を含む融合タンパク質（例えば抗体）などに対して、さらなる修飾、例えば免疫原性を低減させ、安定性、溶解性、機能および臨床的利益を向上させるための他の修飾を行うことができる。このような修飾は、例えば、血清半減期を延長する可能性がある位置２５２、位置２５４および位置２５６における修飾を含むが、これらに限定されない。
実施例
以下の実施例を用いて本発明をさらに説明するが、実施例は、限定ではなく、説明することで記載され、当業者は、様々な変更を行うことができると理解すべきである。
以下の実施例を用いて本発明をさらに説明するが、実施例は、限定ではなく、説明することで記載され、当業者は、様々な変更を行うことができると理解すべきである。
明確に反対すると指定しない限り、本発明における実施は、本分野の技術的な日常化学、生物化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学と細胞生物学の方法を用いる。
実施例１．Ｆｃ変異体の設計
抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体との相互作用が悪影響を生じ得ることを考慮して、モノクローナル抗体の使用においてＦｃ領域のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ）を除去する必要がある場合がある。例えば、ＩｇＧ１サブクラス抗体の場合、主にＦｃ領域を介してＦｃγＲＩＩＩＡに結合することによってＡＤＣＣ機能を実現する。ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能を低減させる必要があるＩｇＧ１サブクラス抗体の場合、そのＦｃ領域を改造してＦｃγ受容体への結合を低減させる必要がある。したがって、本実施例は、ヒトＩｇＧ１ＦｃとＦｃγＲの共結晶構造に基づいて、ヒトＩｇＧ１ＦｃとＦｃγＲとの相互作用の重要な部位を検討し、それがＦｃγＲとの相互作用を低減するために対応するＦｃ変異体を設計した。
抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体との相互作用が悪影響を生じ得ることを考慮して、モノクローナル抗体の使用においてＦｃ領域のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ）を除去する必要がある場合がある。例えば、ＩｇＧ１サブクラス抗体の場合、主にＦｃ領域を介してＦｃγＲＩＩＩＡに結合することによってＡＤＣＣ機能を実現する。ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能を低減させる必要があるＩｇＧ１サブクラス抗体の場合、そのＦｃ領域を改造してＦｃγ受容体への結合を低減させる必要がある。したがって、本実施例は、ヒトＩｇＧ１ＦｃとＦｃγＲの共結晶構造に基づいて、ヒトＩｇＧ１ＦｃとＦｃγＲとの相互作用の重要な部位を検討し、それがＦｃγＲとの相互作用を低減するために対応するＦｃ変異体を設計した。
ヒトＩｇＧ１ＦｃおよびヒトＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩ）の結晶構造（ＰＤＢ：３ＳＧＪ）を図１に示し、ここで、Ｆｃの２つのセグメント、Ｐ２３２－Ｖ２４０およびＮ３２５－Ｅ３３３がＣＤ１６Ａエピトープの結合部位を構成し、Ｆｃのアミノ酸Ｐ３２９は、ＣＤ１６Ａのアミノ酸Ｗ９０およびＷ１１３との間で形成されるπ結合が相互作用し、それらの相互結合界面における重要なアミノ酸である。この重要なセグメントとアミノ酸に基づいて、発明者らは、分子間の作用界面に基づいて表１に示すようなＦｃ変異体を設計した。
本実施例では、信達製薬（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）の内部スクリーニングを通じて取得されたヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２タンパク質に対するＩｇＧ１モノクローナル抗体（Ｆｃｍｕｔ－０１）を例示として、関連する設計と研究を実施した。すなわち、親および対照としてのＦｃｍｕｔ－０１に基づいて、表１に示す一連のＦｃの異なる変異を有する変異体（Ｆｃｍｕｔ－０２～Ｆｃｍｕｔ－０２４）が得られた。Ｆｃｍｕｔ－２５はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）であり、Ｆｃｍｕｔ－２６～Ｆｃｍｕｔ３２はＨｅｒｃｅｐｔｉｎのＦｃに対して行う異なる改造である。
実施例２：Ｆｃ変異を有する抗体の発現と精製
プラスミド構築：通常の実験方法に従って、前記重鎖Ｆｃ変異および軽鎖のヌクレオチド配列を取得し、それぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングして各プラスミドを得た。
プラスミド構築：通常の実験方法に従って、前記重鎖Ｆｃ変異および軽鎖のヌクレオチド配列を取得し、それぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングして各プラスミドを得た。
タンパク質の発現と精製
一過性トランスフェクションプラスミドの調製：１／１０（トランスフェクション容量で計算する）の血清低減培地Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ（Ｇｉｂｃｏ、製品番号３１９８５－０７０）を取り、プラスミド混合物（５０ｕｇ／５０ｍＬ、重鎖と軽鎖の質量比は１：１である）を加え、プラスミド含有Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ培地を新しい５０ｍＬ遠沈管に濾過して、濾過したＰＥＩ（１ｇ／Ｌ、Ｐｏｌγｓｃｉｅｎｃｅｓ）を当該遠沈管に加え（質量比（プラスミド：ＰＥＩ）＝１：３）、均一にを混合し、２０分間静置した。
一過性トランスフェクションプラスミドの調製：１／１０（トランスフェクション容量で計算する）の血清低減培地Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ（Ｇｉｂｃｏ、製品番号３１９８５－０７０）を取り、プラスミド混合物（５０ｕｇ／５０ｍＬ、重鎖と軽鎖の質量比は１：１である）を加え、プラスミド含有Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ培地を新しい５０ｍＬ遠沈管に濾過して、濾過したＰＥＩ（１ｇ／Ｌ、Ｐｏｌγｓｃｉｅｎｃｅｓ）を当該遠沈管に加え（質量比（プラスミド：ＰＥＩ）＝１：３）、均一にを混合し、２０分間静置した。
細胞トランスフェクション：前記で得られたＤＮＡ／ＰＥＩ混合物をＥｘｐｉ２９３細胞（Ｇｉｂｃｏ）に軽くてしなやかに注ぎ、均一に混合し、３７℃、８％ＣＯ２の条件で１４時間トランスフェクトし、その後、トランスフェクトされた細胞の体積でそれぞれ、０．１％のバルプロ酸ナトリウム塩（ＶＰＡ）（２．２Ｍ、Ｓｉｇｍａ）を追加し、２．５％のグルコース（２００ｇ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ）および２．５％Ｆｅｅｄ溶液（１ｇ／ＬのＰｈγｔｏｎｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ＋１ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ ＳｅｌｅｃｔＰｈγｔｏｎｅ）を追加し、細胞を再び３７℃、８％ＣＯ２で７日間培養した。
精製産物：培養後の細胞培養液を４０００ｒｐｍで５０分間遠心分離し、上清を収集し、プレパックカラムＨｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ、１１－００３４－９５）を使用して上清を精製した。具体的な操作は以下の通りである：精製前に５倍カラム体積の平衡液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で充填カラムを平衡化し、収集した上清をカラムに通し、さらに１０倍カラム体積の平衡液で充填カラムを洗浄し、非特異的に結合するタンパク質を除去し、５倍カラム体積の溶出緩衝液（１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５）で充填物を洗い流し、溶出液を収集した。２ＭのＴｒｉｓで溶離液のｐＨを６．０に調整し、濃度を測定して精製の抗体産物を得た。
収集した抗体産物を限外濾過によって濃縮してＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、７００１１－０４４）に交換した後、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥ、１０／３００ＧＬ、１０２４５６０５）でさらに単離して精製し、モノマーの溶出ピークを収集し、カラムの平衡化および溶出緩衝液はＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、７００１１－０４４）であった。
実施例３．Ｆｃ変異体とＦｃ受容体の親和性測定
一、ＳＰＲ法によるＦｃ変異体を有する抗体の親和性の測定
本発明で得られたＦｃ変異体を有する抗体とヒトＦｃγＲとの結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定する場合、各抗体変異体とＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂおよびＦｃＲｎとの平衡解離定数（ＫＤ）を具体的に検出した。ＳＰＲの原理により、偏光ビームがプリズムの端面に一定の角度で入射すると、プリズムと金膜の界面で表面プラズモン波が発生し、金属膜内の自由電子の共鳴、すなわち表面プラズモン共鳴を引き起こす。分析する時、まずセンシングチップの表面に一層の生体分子認識フィルムを固定し、次に測定対象の試料がチップ表面を流れ、チップ表面の生体分子認識膜と相互作用可能な分子が試料中に存在すると、金膜表面の屈折率変化を引き起こし、最終的にＳＰＲ角度の変化につながり、ＳＰＲ角度の変化を検出することにより、被分析物の親和力、動力学定数などの情報を得た。
一、ＳＰＲ法によるＦｃ変異体を有する抗体の親和性の測定
本発明で得られたＦｃ変異体を有する抗体とヒトＦｃγＲとの結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定する場合、各抗体変異体とＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂおよびＦｃＲｎとの平衡解離定数（ＫＤ）を具体的に検出した。ＳＰＲの原理により、偏光ビームがプリズムの端面に一定の角度で入射すると、プリズムと金膜の界面で表面プラズモン波が発生し、金属膜内の自由電子の共鳴、すなわち表面プラズモン共鳴を引き起こす。分析する時、まずセンシングチップの表面に一層の生体分子認識フィルムを固定し、次に測定対象の試料がチップ表面を流れ、チップ表面の生体分子認識膜と相互作用可能な分子が試料中に存在すると、金膜表面の屈折率変化を引き起こし、最終的にＳＰＲ角度の変化につながり、ＳＰＲ角度の変化を検出することにより、被分析物の親和力、動力学定数などの情報を得た。
本実施例は、実施例２で得られたＦｃ領域変異を有する抗体とヒトＦｃγＲのＫＤをＢｉａｃｏｒｅ（Ｃγｔｉｖａ、Ｔ２００）で測定し、具体的な方法は以下の通りである：抗ヒスチジン抗体がカップリングしたチップ表面に、ヒスチジンタグ含有ＦｃγＲおよびＦｃＲｎタンパク質（各Ｆｃ受容体についての情報は下記の表２を参照）を捕獲し、次いで、チップ表面タンパク質と移動相中の抗体との間の結合および解離を検出することにより、親和性および動力学定数を得た。この方法は、チップの調製および親和性の検出を含む。測定プロセスは、１０倍に希釈した１０×ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＢＲ－１００６－６９、Ｃγｔｉｖａ）を実験緩衝液として使用した。
メーカーの仕様に基づいて、具体的な方法は次の通りである：
チップ調製：アミノカップリングキット（ＢＲ－１００６－３３、Ｃγｔｉｖａ）およびヒスチジン捕獲キット（２８９９５０５６、Ｃγｔｉｖａ）を使用して、ヒスチジン捕獲キット内の抗ヒスチジン抗体をＣＭ５チップ（２９－１４９６－０３、Ｃγｔｉｖａ）の表面にカップリングし、カップリング後、１Ｍのエタノールアミンを注入して残りの活性化部位をブロッキングした。
チップ調製：アミノカップリングキット（ＢＲ－１００６－３３、Ｃγｔｉｖａ）およびヒスチジン捕獲キット（２８９９５０５６、Ｃγｔｉｖａ）を使用して、ヒスチジン捕獲キット内の抗ヒスチジン抗体をＣＭ５チップ（２９－１４９６－０３、Ｃγｔｉｖａ）の表面にカップリングし、カップリング後、１Ｍのエタノールアミンを注入して残りの活性化部位をブロッキングした。
親和性検出：各サイクルは、受容体の捕獲、本出願のＦｃ領域変異を有する一定濃度の抗体への結合、およびチップの再生を含む。勾配希釈した各抗体変異体溶液（ＦｃγＲｓに結合する時、希釈勾配は０ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭであり、ＦｃＲｎに結合する時、希釈勾配は０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ、１６００ｎＭである）は、低濃度から高濃度の順で、それぞれ各親和性検出サイクルを完了した。各サイクルにおいて、抗体変異体溶液を３０μＬ／分の流速でチップ表面に流し、結合時間が６０秒、解離時間が６０秒であった。最後に、１０ｍＭのＧｌγｃｉｎｅ ｐＨ１．５（ＢＲ－１００３－５４、Ｃγｔｉｖａ）を使用してチップを再生した。得られたデータは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００分析ソフトウェア（バージョン番号３．１）を使用して、分析１：１結合または定常状態分析モデルを使用して分析し、対応する結果を得た。
以下の表３は、本研究における各抗体変異体の各Ｆｃ受容体に対する親和性データを示し、図２は、対応する分子のフィッティング曲線を示す。
この結果から、本研究の対照抗体として、ＩｇＧ１野生型Ｆｃｍｕｔ－０１抗体はＣＤ６４に対して高い親和性を有し、ＫＤ値は１．０７Ｅ－０９であり、ＣＤ３２Ａの２つのサブタイプであるＨ１６７およびＲ１６７にいずれも結合し、ＫＤ値はそれぞれ２．０１Ｅ－０７および４．６０Ｅ－０８であり、ＣＤ１６Ａの２つのサブタイプであるＦ１７６およびＶ１７６に対する親和性はそれぞれ１．５７Ｅ－０７および２．４４Ｅ－０８であり、これに対して、ＣＤ１６Ｂ（ＮＡ１）、ＣＤ１６Ｂ（ＮＡ２）、およびＣＤ３２Ｂに対しは弱い結合であることがわかった。
変異体Ｆｃｍｕｔ－０５がＣＤ１６Ａ（Ｖ１７６）に対して比較的弱い親和性（３．０６Ｅ－０７）を有すること以外、他のＦｃ変異を有する抗体分子は、いずれもＣＤ１６Ａ（Ｆ１７６）、ＣＤ１６Ａ（Ｖ１７６）、ＣＤ１６Ｂ（ＮＡ１）、ＣＤ１６Ｂ（ＮＡ２）、ＣＤ３２Ａ（Ｈ１６７）、ＣＤ３２Ａ（Ｒ１６７）、およびＣＤ３２Ｂに結合しなかった。野生型ＩｇＧ１と強い結合を有するＣＤ６４については、変異型Ｆｃｍｕｔ－０６／０７／０８は、すべてＣＤ６４に結合しなかったが、Ｆｃｍｕｔ－０２／０３／０４／０５のＣＤ６４への結合も大幅に低減し、対照Ｆｃｍｕｔ－０１と比較して、それぞれ８．７倍、１２．９倍、１４．０２倍、５０．７５倍弱化された。また、Ｆｃｍｕｔ－２６～Ｆｃｍｕｔ－３２でも類似の結果を示し、Ｆｃｍｕｔ－２５と比較して、Ｆｃｍｕｔ－２９以外の他のＦｃ変異を有する抗体分子は、いずれもＣＤ１６Ａ（Ｆ１７６）、ＣＤ１６Ａ（Ｖ１７６）、ＣＤ１６Ｂ（ＮＡ１）、ＣＤ１６Ｂ（ＮＡ２）、ＣＤ３２Ａ（Ｈ１６７）、ＣＤ３２Ａ（Ｒ１６７）、およびＣＤ３２Ｂに結合しなかった。
Ｆ１７６およびＶ１７６はＣＤ１６Ａの主要な遺伝子型であり、結晶構造により、ＣＤ１６Ａの１７６位のアミノ酸はＦｃとの結合領域に位置するため、ＣＤ１６ＡとＦｃの親和性に重要な影響があることがわかった。本出願で得られたＦｃ変異体は、実質的にＣＤ１６Ａの遺伝子型Ｆ１７６およびＶ１７６と相互作用しないため、本出願で得られたＦｃ変異体は、実質的にすべての機能性ＣＤ１６Ａと相互作用せず、これによりＡＤＣＣ効果を誘発しないことが示された。したがって、本出願のＦｃ変異体を含むタンパク質分子（例えば、抗体）分子は、実質的にＡＤＣＣエフェクター機能を有さない。
抗体のＦｃ領域は、ｐＨ中性条件下ではＦｃＲｎに結合せず、酸性条件下でのみ結合することが知られており、これは、抗体分子が比較的長い半減期を有する主要なメカニズムであった。検出でわかるように、対照抗体Ｆｃｍｕｔ－０１は、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに対する親和性が３．８６Ｅ－０７であるが、ｐＨ７．０の条件でＦｃＲｎに結合せず、本研究で得られたＦｃ変異を有する抗体分子は、同じ条件下で対照抗体Ｆｃｍｕｔ－０１と一致しており（図２ｉ、図２ｊ）、本研究で得られたＦｃ変異体がＦｃＲｎへの結合に影響を与えないことが示された。
ＦｃＲｎはインビボの様々な細胞で発現され、ＦｃＲｎのＦｃ領域への結合はｐＨ依存性であり、ｐＨ６．０付近の弱酸性でのみ結合し、中性ｐＨでは結合しないため、対応する抗体の半減期を延長することができる。本出願の実験データは、抗体が有するＦｃ領域変異が抗体分子のＦｃＲｎへの結合に影響を及ぼさないことを示し、したがって、ＦｃＲｎは依然として本出願の抗体変異体のインビボ半減期を延長することができる。
本出願で得られた抗体変異体はＣＤ３２Ｂに結合せず、抗体のＦｃ領域を変異させることで抗体の治療効果を高めることができることが示された。
従来技術で広く使用されている「ＬＡＬＡ」変異（Ｆｃｍｕｔ－０５）は、抗体Ｆｃ領域のＦｃγＲに対する結合親和性を１００倍低減させた。本出願で得られたＦｃ変異体は、「ＬＡＬＡ」変異と比較してＦｃγＲに対する結合親和性が低いため、ＡＤＣＣの作用がより強く低減された。
野生型ＩｇＧ２およびＩｇＧ４はＡＤＣＣ効果が弱いか、またはＡＤＣＣ効果がないため、ＡＤＣＣ効果を回避することが望まれる多くの抗体分子は、生産中にＩｇＧ２サブタイプまたはＩｇＧ４サブタイプのＦｃ領域を選択した。しかし、場合によっては、ＩｇＧ２サブタイプまたはＩｇＧ４サブタイプのＡＤＣＣエフェクター機能をさらに低減させることが依然として望ましい。このため、出願人は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４サブタイプのＦｃ領域の対応する部位（表１を参照）に対して対応する変異を行った後、それが様々なＦｃＲに結合する状況をさらに検討した。データは、本出願の対応する変異を含むＩｇＧ２サブタイプまたはＩｇＧ４サブタイプのＦｃ変異体は、野生型Ｆｃと比較してＦｃγＲへの結合を弱めることを示した。
二、バイオレイヤー干渉技術による本発明のＦｃ変異体のＦｃ受容体への結合の測定
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して、ヒトＦｃ受容体に対する本発明のＦｃ変異体の結合親和性（ＫＤ）を測定した。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して、ヒトＦｃ受容体に対する本発明のＦｃ変異体の結合親和性（ＫＤ）を測定した。
実験開始の半時間前に、試料数に応じて、適切な数のＨＩＳ１Ｋセンサー（１８－５１２０、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）をＳＤ緩衝液（１ｘＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）に浸漬し、ＦｃＲｎに結合する時、実験で使用した緩衝液を、１０ｍＭのＨＥＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＰ２０、ｐＨ６．０に変更した。抗体を２００ｎＭに希釈し、Ｆｃ受容体（試料情報については表２を参照）を１００ｎＭに希釈した。
２００μＬのＳＤ緩衝液、２００μＬの標識抗体溶液、および２００μＬのＦｃ受容体を９６ウェル黒色ポリスチレンマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６５５２０９）に加えた。Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６ｅを使用して検出を行い、試料の位置に応じてプレートをレイアウトし、センサーの位置を選択した。機器設定パラメータは次の通りである：実行ステップ：平衡ベースライン１２０秒、固定化Ｆｃ受容体１００秒、平衡ベースライン１２０秒、抗体結合６０秒、および解離６０秒を実行し、回転速度は１０００ｒｐｍ、温度は３０℃であった。実験が完了した後、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ分析ソフトウェアを使用してＫＤ値を分析した。
結果を下記の表４および図３に示す。Ｆｃｍｕｔ－２５と比較して、Ｆｃｍｕｔ－２９以外の他のＦｃ変異を有する抗体分子は、いずれもＣＤ１６Ａ（Ｆ１７６）、ＣＤ１６Ａ（Ｖ１７６）、ＣＤ１６Ｂ（ＮＡ１）、ＣＤ１６Ｂ（ＮＡ２）に結合しなかった。変異体Ｆｃｍｕｔ－２６／２７／２８／２９／３０／３１／３２変異体は、ＣＤ３２Ａ Ｈ１６７、ＣＤ３２Ａ Ｒ１６７、ＣＤ３２Ｂに結合しなかった。変異体Ｆｃｍｕｔ－３０／３１／３２は、いずれもＣＤ６４に結合しかったが、Ｆｃｍｕｔ－／２６／２７／２８／２９のＣＤ６４への結合も大幅に低減した。
Ｆｃ－２５はＨＥＲ２に結合する抗体であり、その抗体の定常領域は野生型のＩｇＧ１配列であり、結果から、Ｐ３２９の削除はＦｃ ｇａｍｍａ受容体への分子の結合を低減することができるが、ＦｃＲｎ（ｐＨ６．０）への結合は影響を受けないことがわかった。
実験例４．バイオレイヤー干渉技術による本発明のＦｃ変異体のＣ１ｑに対する親和性の測定
抗体のＦｃとＣ１ｑとの親和性の強弱は、抗体がＣＤＣエフェクター機能を有するか否かを直接決定するため、本実施例では、各Ｆｃ変異体のＣ１ｑに対する親和性を測定することにより、当該Ｆｃ変異体がＣＤＣエフェクター機能を有するか否かを判断した。
抗体のＦｃとＣ１ｑとの親和性の強弱は、抗体がＣＤＣエフェクター機能を有するか否かを直接決定するため、本実施例では、各Ｆｃ変異体のＣ１ｑに対する親和性を測定することにより、当該Ｆｃ変異体がＣＤＣエフェクター機能を有するか否かを判断した。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して、ヒトＣ１ｑに対する本発明の抗体の結合親和性（ＫＤ）を測定した。ＢＬＩ法による親和性の測定は、従来の方法（Ｅｓｔｅｐ、Ｐら、Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ、２０１３．５（２）：ｐ２７０－８）で行われた。
まず、ＥＺ－ＬｉｎｋＴＭＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（２１３２７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してビオチンと抗体をモル比３：１で混合した後、静置してビオチン標識を行い、遠心分離して標識されていないビオチンを除去し、抗体をＰＢＳ溶液に等体積置換した。
実験開始の半時間前に、試料数に応じて、適切な数のＳＡセンサー（Ｆｏｒｅｔｂｉｏ、１８－５０１９）をＳＤ緩衝液（１ｘＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）に浸漬した。抗体を約１００ｎＭに希釈し、Ｃ１ｑ（Ａ０９９、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を４０ｎＭに希釈した。
２００μＬのＳＤ緩衝液、２００μＬの標識抗体溶液、および２００μＬのＣ１ｑ抗原を９６ウェル黒色ポリスチレンマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６５５２０９）に加えた。Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６ｅを使用して検出を行い、試料の位置に応じてプレートをレイアウトし、センサーの位置を選択した。機器設定パラメータは次の通りである：実行ステップ：ベースライン、試料添加～３ｎｍ、ベースライン、会合（Ｋｏｎ）および解離（Ｋｄｉｓ）を実行し、各ステップの実行時間は試料の結合および解離速度に依存し、回転速度は１０００ｒｐｍ、温度は３０℃であった。実験が完了した後、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ分析ソフトウェアを使用してＫＤ値を分析し、座標軸データをエクスポートして、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェアを使用してプロットした。
結果は表５および図２ｋに示しように、Ｆｃｍｕｔ－０１のみがＣ１ｑに結合可能であり、親和性は２．０２Ｅ－０８であり、Ｆｃｍｕｔ－２～Ｆｃｍｕｔ－８はすべてＣ１ｑに結合しなかった。本研究のＦｃ変異体は、ＦｃとＣ１ｑの結合を弱めるか、または阻止することができ、したがって、抗体のＣＤＣエフェクター機能を低減また除去できることが示された。対応する野生型対照と比較して、Ｆｃｍｕｔ－１０～Ｆｃｍｕｔ－１６、Ｆｃｍｕｔ－１８～Ｆｃｍｕｔ－２４も同様に、Ｃ１ｑに結合しなかった。また、Ｆｃｍｕｔ－２５と比較して、Ｆｃｍｕｔ－２６～Ｆｃｍｕｔ－３２も同様に、Ｃ１ｑに結合しなかった。
実験例５．バイオレイヤー干渉技術による本発明の抗体と抗原との親和性の測定
以下の内容を除き、実施例４に記載の方法と同じＢＬＩ法を用いて親和性の検出を行った。
以下の内容を除き、実施例４に記載の方法と同じＢＬＩ法を用いて親和性の検出を行った。
実験開始の半時間前に、試料数に応じて、適切な数のＡＨＣ（Ｆｏｒｅｔｂｉｏ、１８－５０６０）センサーをＳＤ緩衝液（１ｘＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）に浸漬した。抗体およびＣｌａｕｄｉｎ１８．２（ｃｐ０００７、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）をそれぞれ１００ｎＭに希釈した。
２００μＬのＳＤ緩衝液、２００μＬの抗体、および２００μＬのＣｌａｕｄｉｎ１８．２抗原をそれぞれ９６ウェル黒色ポリスチレンマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６５５２０９）に加えた。Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６ｅを使用して検出を行い、試料の位置に応じてプレートをレイアウトし、センサーの位置を選択した。機器設定パラメータは次の通りである：実行ステップ：ベースライン、試料添加、ベースライン、会合（Ｋｏｎ）および解離（Ｋｄｉｓ）を実行し、各ステップの実行時間は試料の結合および解離速度に依存し、回転速度は１０００ｒｐｍ、温度は３０℃であった。実験が完了した後、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ分析ソフトウェアを使用してＫＤ値を分析した。
結果を表６に示し、Ｆｃｍｕｔ－０２～０８および抗原のＫＤ値は、Ｆｃｍｕｔ－０１および抗原のＫＤ値と同程度であるため、本発明に開示されたＦｃ領域における具体的な変異は、対応する抗体とその抗原の親和性に影響を及ぼさず、ひいては本発明のＦｃ変異体を含む抗体は、それ自体の抗原親和性を保持することが示された。
実施例６．抗体媒介によるＡＤＣＣ効果
ＦｃγＲによって媒介される主要なエフェクター機能の１つは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）であり、ＮＫ細胞およびマクロファージ上のＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）によって媒介された。前記実施例において本出願で得られたＦｃ変異を有する抗体のＦｃ受容体に対する親和性を研究した後、本実施例では、前記抗体変異体のＡＤＣＣエフェクター機能を引き続き検討した。
ＦｃγＲによって媒介される主要なエフェクター機能の１つは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）であり、ＮＫ細胞およびマクロファージ上のＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）によって媒介された。前記実施例において本出願で得られたＦｃ変異を有する抗体のＦｃ受容体に対する親和性を研究した後、本実施例では、前記抗体変異体のＡＤＣＣエフェクター機能を引き続き検討した。
本実施例では、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＪｕｒｋａｔ－ＡＤＣＣＮＦ－ＡＴ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅエフェクター細胞株（以下、ＡＤＣＣエフェクター細胞と略称する）を使用して、ＮＦ－ＡＴシグナルの活性化状況を検出することにより、抗体のＡＤＣＣ活性を検出した。実験手順は具体的に以下の通りである。
１）細胞の準備
ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２を表面過剰発現する細胞ＤＡＮＧ－１８．２（ＣＬＳ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ）およびＡＤＣＣエフェクター細胞に対して細胞計数を行った：遠心分離して細胞ＤＡＮＧ－１８．２およびＡＤＣＣエフェクター細胞の上清を除去し、細胞をＰＢＳ溶液で２回洗浄し、そして細胞を検出培地（５％の低ＩｇＧ血清を含む１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ））で再懸濁し、ＡＤＣＣエフェクター細胞の濃度を６×１０６個／ｍＬに調整し、ＤＡＮＧ－１８．２細胞の濃度を１×１０６個／ｍＬに調整した。
ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２を表面過剰発現する細胞ＤＡＮＧ－１８．２（ＣＬＳ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ）およびＡＤＣＣエフェクター細胞に対して細胞計数を行った：遠心分離して細胞ＤＡＮＧ－１８．２およびＡＤＣＣエフェクター細胞の上清を除去し、細胞をＰＢＳ溶液で２回洗浄し、そして細胞を検出培地（５％の低ＩｇＧ血清を含む１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ））で再懸濁し、ＡＤＣＣエフェクター細胞の濃度を６×１０６個／ｍＬに調整し、ＤＡＮＧ－１８．２細胞の濃度を１×１０６個／ｍＬに調整した。
２）プレーティング：標的細胞ＤＡＮＧ－１８．２を９６ウェルプレートにウェル当たり２５μＬでプレーティングした。
３）段階希釈した本発明の抗体を添加した：Ｆｃ領域変異を有する各抗体試料および対照試料の開始濃度は表７に示すようであり、そして３倍希釈を行って合計１０個の希釈勾配を得、それぞれウェルプレートに順次にウェル当たり２５μＬ添加した。
４）ＡＤＣＣエフェクター細胞を各ウェルプレートに、ウェル当たり２５μＬずつ添加した。
５）３７℃のインキュベーター中で１２時間インキュベートした。
６）９６ウェルプレートを取り出し、室温で１０分間置き、各ウェルに解凍したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ試験試薬（Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａγ ｒｅａｇｅｎｔ）を７５μＬ加えた。マイクロプレートリーダーで検出し、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアで濃度依存性曲線をフィッティングした。
試験結果を図４に示すように、対照抗体Ｆｃｍｕｔ－０１は野生型ＩｇＧ１モノクローナル抗体のＦｃ領域を有し、標的細胞（ＤＡＮＧ－１８．２）上の抗原に結合することでＡＤＣＣエフェクター細胞のＮＦ－ＡＴシグナルを効果的に活性化でき、これによりＡＤＣＣの下流シグナル伝達経路を活性化し、当該抗体が優れたＡＤＣＣ殺傷能力を有することが示された。しかし、本出願で得られたＦｃ領域変異を有する他の抗体は、非常に弱い又はほとんどないＡＤＣＣ効果を示し、具体的には、変異体Ｆｃｍｕｔ－０５（Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ変異を有する）は、対照Ｆｃｍｕｔ－０１より１０倍高い濃度で非常に弱いＡＤＣＣ活性を示したが、他の変異体は、Ｆｃｍｕｔ－０１より１０倍高い濃度でもＡＤＣＣ活性を有さず、本出願で得られたＦｃ領域変異を有する抗体分子のＡＤＣＣエフェクター機能が実質的に除去され、この結果も、実施例３の各抗体分子のＣＤ１６Ａに対する親和性データと一致することが示された。
従来技術によれば、Ｆｃ領域に対してＬＡＬＡ変異を行うことにより抗体のＡＤＣＣ効果が顕著に低減されることが知られているが、本実施例の結果から、ＬＡＬＡ変異と比較して、本出願で得られたＦｃ変異体はＡＤＣＣ効果に対する低減効果がより大きいことが示された。
本出願が抗体Ｆｃ領域の３２９位、３３０位、２３４位、もしくは２３５位の１つまたは複数のアミノ酸に対して変異修飾（例えば、欠失、置換）を行うことによって得られた抗体変異体は、ＡＤＣＣエフェクター機能を実質的に除去させ、これにより、前記アミノ酸の位置は、抗体のＡＤＣＣ／ＡＤＣＰエフェクター機能にとって重要であることが示された。標的抗体が実際の要求においてＡＤＣＣ／ＡＤＣＰエフェクター機能を回避する必要がある場合、当業者は、本出願に開示された内容にしたがって、Ｆｃ領域の３２９位、３３０位、２３４位、もしくは２３５位の１つまたは複数のアミノ酸に対して対応する修飾を行うことを選択でき、これにより実際の技術的効果を奏した。具体的には、抗体Ｆｃ領域の３２９位のアミノ酸の欠失、３２９位～３３０位のアミノ酸の欠失、３２９位のアミノ酸の欠失、および３２０位のアミノ酸の置換、ならびに前記修飾とＬＡＬＡ修飾（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ）との組み合わせ適用を考慮することができ、これにより、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰエフェクター機能を除去する抗体分子を得た。
Claims (15)
- ヒト野生型Ｆｃ領域と比較して、１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＦｃ変異体であって、前記修飾は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位、２３４位、２３５位、もしくは３３０位から選択される、Ｆｃ変異体。
- 以下のような修飾を含む、請求項１に記載のＦｃ変異体：
１）ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位のアミノ酸の欠失（Δ３２９）、あるいは
２）ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされた３２９位および３３０位のアミノ酸の欠失（Δ３２９およびΔ３３０）を含む、あるいは
４）ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされたΔ３２９＋Ａ３３０ＧまたはΔ３２９＋Ｓ３３０Ｇの修飾、あるいは
５）ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされたＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９、Ｖ２３４Ａ＋Δ３２９またはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９の修飾、あるいは
６）ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされたＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９＋Δ３３０、Ｖ２３４Ａ＋Δ３２９＋Δ３３０またはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Δ３２９＋Δ３３０の修飾、あるいは
７）ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって番号付けされたＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ａ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｓ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｖ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ａ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｖ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｓ３３０Ｇ＋Δ３２９、Ｆ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｓ３３０Ｇ＋Δ３２９またはＦ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ａ３３０Ｇ＋Δ３２９の修飾。 - ヒトＩｇＧ型Ｆｃ変異体であり、好ましくはＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、またはＩｇＧ４型Ｆｃ変異体である、請求項１または２に記載のＦｃ変異体。
- 以下のような配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＦｃ変異体：
１）配列番号２のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２）配列番号３のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
３）配列番号４のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
４）配列番号５のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
５）配列番号６のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
６）配列番号７のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
７）配列番号８のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
８）配列番号１１のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
９）配列番号１２のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１０）配列番号１３のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１１）配列番号１４のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１２）配列番号１５のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１３）配列番号１６のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１４）配列番号１７のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１５）配列番号１９のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１６）配列番号２０のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１７）配列番号２１のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１８）配列番号２２のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
１９）配列番号２３のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２０）配列番号２４のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２１）配列番号２５のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２２）配列番号２７のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２３）配列番号２８のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２４）配列番号２９のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２５）配列番号３０のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２６）配列番号３１のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２７）配列番号３２のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの、あるいは
２８）配列番号３３のＥＵインデックスによる２２１位～４４７位のアミノ酸の配列、または当該配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらにはより高い同一性を有するアミノ酸配列、または当該配列からなるもの。 - 請求項１～４のいずれか一項に記載のＦｃ変異体を含む、ポリペプチド。
- 抗体分子であり、好ましくは、前記抗体分子はＩｇＧクラス抗体分子である、請求項５に記載のポリペプチド。
- 以下のような重鎖および軽鎖を含む、請求項６に記載のＦｃ変異体を含む抗体分子：
１）配列番号２に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２）配列番号３に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
３）配列番号４に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
４）配列番号５に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
５）配列番号６に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
６）配列番号７に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
７）配列番号８に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
８）配列番号１１に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
９）配列番号１２に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１０）配列番号１３に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１１）配列番号１４に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１２）配列番号１５に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１３）配列番号１６に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１４）配列番号１７に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１５）配列番号１９に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１６）配列番号２０に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１７）配列番号２１に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１８）配列番号２２に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
１９）配列番号２３に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２０）配列番号２４に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２１）配列番号２５に示される重鎖および配列番号９に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２２）配列番号２７に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２３）配列番号２８に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２４）配列番号２９に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２５）配列番号３０に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２６）配列番号３１に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２７）配列番号３２に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの、あるいは
２８）配列番号３３に示される重鎖および配列番号３４に示される軽鎖を含むもの。 - 請求項１～４のいずれか一項に記載のＦｃ変異体、または請求項５～７のいずれか一項に記載のポリペプチド、および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載のＦｃ変異体の、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰまたはＣＤＣエフェクター機能を低減または除去することにおける、使用。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載のＦｃ変異体、または請求項５～７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
- 請求項１０に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項１０に記載の核酸分子または請求項１１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 対象の腫瘍を治療する方法であって、有効量の請求項８に記載の医薬組成物または請求項１～４のいずれか一項に記載のＦｃ変異体、もしくは請求項５～７のいずれか一項に記載のポリペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載のＦｃ変異体、請求項５～７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、キット。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載のＦｃ変異体、または請求項５～７のいずれか一項に記載のポリペプチドを調製する方法であって、適切な条件下で、請求項１２に記載の宿主細胞において、請求項１０に記載の核酸分子または請求項１１に記載のベクターを発現させることを含み、場合により、前記方法は、発現されたＦｃ変異体またはポリペプチドを回収することをさらに含む、方法。
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