JP2014533249A - 多重特異性を持つ多価結合タンパク質およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本開示は概して、2つのエピトープ(たとえば、第1および第2のエピトープ)に結合し、かつ第1および第2のエピトープのそれぞれへの結合に対して二価であるタンパク質を提供する。本開示はまた、そうしたタンパク質を含む組成物と、そうしたタンパク質をコードする核酸分子と、そうしたタンパク質を作製および使用する方法とを提供する。【選択図】図1
Description
多くの疾患が生体分子により引き起こされるかまたは生体分子に関連しており、生体分子を標的とし、任意にその活性を調節する疾患処置剤、治療薬、診断試薬および研究試薬を開発することは、有用である。2つ以上の部位に結合する、たとえば治療剤、診断剤および研究剤を含む作用物質は、単一の分子が同じ標的生体分子の複数の領域、あるいは複数の異なる標的に結合できるように、望ましい場合がある。本明細書に記載のアプローチは、追加のエピトープに結合する(すなわち、追加の特異性を有する)結合タンパク質、たとえば三重特異性結合タンパク質、四重特異性結合タンパク質、五重特異性結合タンパク質を作製するように適合することができる、独特のコア構造に基づく新規な二重特異性を持つ二価結合タンパク質を提供する。
本開示は概して、少なくとも2つのエピトープに結合するタンパク質(たとえば、少なくとも二重特異性であり、かつ第1のエピトープおよび第2のエピトープに結合するタンパク質)を提供する。一方、本開示はまた、単一特異性でありながら、エピトープへの結合に対して四価性を示す(たとえば、第1第2の結合ユニットが各々同じエピトープに結合する)タンパク質も提供する点に留意されたい。
一態様では、本開示は、第1のエピトープに結合するFabアーム(arm)と、第2のエピトープに結合する結合ドメイン(BD)と、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc領域とを含むタンパク質であって、BDは第1のポリペプチドリンカー(L1)を介してFabアームに、第2のポリペプチドリンカー(L2)を介してFc領域に相互に連結されており、かつタンパク質は第1および第2の各エピトープへの結合に対して二価であるタンパク質を提供する。
ある態様では、L1および/またはL2はヒンジ部分およびリンカー部分を含む。ある態様では、L1および/またはL2のリンカー部分はGly−Serペプチドを含む。ある態様では、L1もL2もヒンジ部分を含まない。
ある態様では、BDはscFv、単一ドメイン抗体、一本鎖ダイアボディ、抗体模倣体、抗体可変ドメインおよび受容体結合ドメインからなる群から選択される。
ある態様では、Fc領域はIgG1由来、IgG2由来、IgG3由来、IgG4由来、IgA由来、IgM由来、IgE由来およびIgD由来のFc領域からなる群から選択される。
ある態様では、Fc領域は変異配列のFc領域である。
ある態様では、タンパク質はN末端からC末端に以下のポリペプチドドメイン:VH1−CH1−L1−BD−L2−Fcを含むキメラ重鎖を含み、VH1はFabの重鎖可変ドメインを含むアミノ酸配列を含み、CH1はFabの重鎖定常ドメイン1を含むアミノ酸配列を含み、L1は第1のポリペプチドリンカーを含むアミノ酸配列を含み、BDは結合ユニット2をコードするアミノ酸配列を含み、L2は第2のポリペプチドリンカーを含むアミノ酸配列を含み、FcはCH2ドメインおよびCH3ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、BDはscFvを含む。
いくつかの態様では、scFvは、N末端からC末端にVH2−ポリペプチドリンカー−VL2またはVL2−ポリペプチドリンカー−VH2を含み、VH2はscFvの重鎖可変ドメインを含むアミノ酸配列を含み、VL2はscFvの軽鎖可変ドメインを含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、VH2とVL2との間のポリペプチドリンカーはプロテアーゼ切断部位を含む。
ある態様では、L1はN末端からC末端にヒンジ部分およびリンカー部分を含む。
ある態様では、L2はN末端からC末端にリンカー部分およびヒンジ部分を含む。
いくつかの態様では、FabアームはEGFR、IGFR1、VEGF、Ang2、PslまたはPcrVから選択される標的上に存在する第1のエピトープに結合する。
いくつかの態様では、BDはEGFR、IGFR1、VEGF、Ang2、PslまたはPcrVから選択される標的上に存在する第2のエピトープに結合する。
いくつかの態様では、第1および第2のエピトープは異なる。他の態様では、第1および第2のエピトープは同じである。ある態様では、第1および第2のエピトープは同じ標的分子上に位置する。他の態様では、第1および第2のエピトープは異なる標的分子上に位置する。
ある態様では、Fabアームおよび/またはFc領域は少なくとも1つの結合ユニットをさらに含み、少なくとも1つの結合ユニットはポリペプチドリンカーを介してFabアームおよび/またはFc領域に相互に連結される。
いくつかの態様では、少なくとも1つの結合ユニットはFabアーム、scFv、単一ドメイン抗体、一本鎖ダイアボディ、抗体模倣体、抗体可変ドメインおよび受容体結合ドメインからなる群から選択される。
いくつかの態様では、タンパク質は3つ以上の結合ユニット、たとえば少なくとも3つまたは少なくとも4つまたは少なくとも5つの結合ユニットを含む。
ある態様では、結合ユニット(少なくとも2つ、3つ、4つ、5つなど)は各々異なるエピトープに結合する。他の態様では、2つ以上の結合ユニット(少なくとも2つ、3つ、4つ、5つなどを有する分子の)は各々同じエピトープに結合する。いくつかの態様では、タンパク質は3つ以上の結合ユニットを含み、結合ユニット3、4、5などは第1および/または第2のエピトープに結合しない。
本開示はまた、第1のヌクレオチド配列を含む第1の核酸分子および第2のヌクレオチド配列を含む第2の核酸分子を含む核酸組成物であって、第1および第2の核酸分子は第1のエピトープに結合するFabアームと、第2のエピトープに結合する結合ドメイン(BD)と、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc領域とを含むタンパク質をコードし、BDは第1のポリペプチドリンカー(L1)を介してFabアームに、第2のポリペプチドリンカー(L2)を介してFc領域に相互に連結されており、かつタンパク質は第1および第2の各エピトープへの結合に対して二価である核酸組成物を提供する。
本開示は、前述の態様のいずれかのすべての組み合わせのほか、詳細な説明および例に記載された態様のいずれかとの組み合わせを考慮している。
本開示の説明において、本開示の特定の態様が図に示されている。しかしながら、本開示は、図に示した態様の正確な配置および手段に限定されるものではない。
引き続き本開示をさらに詳細に記載する前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されるものではなく、したがって異なってもよいことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「1つの(a、an)」および「前記(the)」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の意味を含むことに留意しなければならない。
他に記載がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が関連する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を持つ。たとえば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei−Show,2nd ed.,2002,CRC Press;The Dictionary of Cell and Molecular Biology,3rd ed.,1999,Academic Press;およびOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Pressは、当業者にとって本発明に使用される多くの用語の一般的な辞書となる。
本明細書においてアミノ酸は、その一般に知られる3文字記号またはIUPAC−IUB生化学命名委員会(Biochemical Nomenclature Commission)により推奨される1文字記号で示すことがある。ヌクレオチドも、同様に、その一般的に認められた1文字記号で示すことがある。
抗体の可変ドメイン、相補性決定領域(CDR)およびフレームワーク領域(FR)のアミノ酸の番号付けは、他に記載がない限り、Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)に記載されるKabatの定義に従う。この番号付け体系を使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのFRもしくはCDRの短縮またはFRもしくはCDRへの挿入に対応して、より少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含むことができる。たとえば、重鎖可変ドメインは、H2の残基52の後の1個のアミノ酸の挿入(Kabatによれば残基52a)、および重鎖FR残基82の後に挿入された残基(たとえば、Kabatによれば残基82a、82bおよび82cなど)を含むことができる。残基のKabatの番号付けは個々の抗体に対して、抗体の配列と「標準的な」Kabat番号が付けられた配列との相同性領域でアライメントを行うことにより決定することができる。フレームワーク残基の最大のアライメントには、Fv領域に使用される、この番号付け体系の「スペーサー」残基の挿入が必要とされることが多い。さらに、任意の特定のKabat部位番号における個々の特定の残基の種類は、種間の相違または対立遺伝子の相違のため抗体鎖によって異なることもある。
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリンとも呼ばれ、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの異なるエピトープ結合フラグメントから形成される多重特異性抗体(たとえば、多重特異性抗体、たとえば、その全体を本明細書に援用する国際公開第2009/018386号パンフレット、国際出願PCT/米国特許出願公開第2012/045229号明細書)、biMab、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、所望の生物活性を示す抗体フラグメント(たとえば抗原結合部分)、ジスルフィド結合Fv(dsFv)、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体(たとえば、本発明の抗体に対する抗Id抗体など)、イントラボディ、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを包含する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち、少なくとも1つの抗原結合部位を含む分子を含む。抗体はまた、抗体またはその一部とのペプチド融合体、たとえばFcドメインとの融合タンパク質を含む。免疫グロブリン分子は、どのようなアイソタイプ(たとえば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、サブアイソタイプ(たとえば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはアロタイプ(たとえば、Gm、たとえば、G1m(f、z、aまたはx)、G2m(n)、G3m(g、bまたはc)、Am、EmおよびKm(1、2または3))であってもよい。抗体は、任意の哺乳動物、以下に限定されるものではないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなど、または他の動物、たとえばトリ(たとえばニワトリ)に由来してもよい。
A.新規な二重特異性結合タンパク質
単一の結合分子に複数の結合部位を付加すると、分子の能力(たとえば治療能、診断能など)を大きく高めることができる。たとえば、二重特異性抗体は、同じ標的生体分子の2つ以上の領域に結合して、標的の1つのエピトープのみに結合する単特異性ポリペプチドより大きな特異性を与えることができる。あるいは、二重特異性抗体は、複数の標的生体分子、たとえば複合体に存在する標的、または封鎖および/またはクラスター形成が望ましい標的に結合することができる。第3のシナリオでは同じ二重特異性抗体が、その標的分子の局在および/または発現に応じて、いつでも異なる機能を発揮することができる。
単一の結合分子に複数の結合部位を付加すると、分子の能力(たとえば治療能、診断能など)を大きく高めることができる。たとえば、二重特異性抗体は、同じ標的生体分子の2つ以上の領域に結合して、標的の1つのエピトープのみに結合する単特異性ポリペプチドより大きな特異性を与えることができる。あるいは、二重特異性抗体は、複数の標的生体分子、たとえば複合体に存在する標的、または封鎖および/またはクラスター形成が望ましい標的に結合することができる。第3のシナリオでは同じ二重特異性抗体が、その標的分子の局在および/または発現に応じて、いつでも異なる機能を発揮することができる。
本明細書に記載されるのは、新規な結合タンパク質である。こうした新規な結合タンパク質の例示的構造を「biMab」という。例示的biMabを模式化したもの、および特定のbiMabの具体的な例を本明細書に提供する。より一般的には、biMabは、各々がエピトープに結合する2つの結合ユニットを含むポリペプチドである(たとえば、結合ユニット1は第1のエピトープに結合し、結合ユニット2は第2のエピトープに結合する)。基本的なbiMabは、2つのエピトープの各々の結合に対して二価である(たとえば、ポリペプチドは2つの結合ユニット1および2つの結合ユニット2を含む)。このため、結合ユニット1および2が異なるエピトープに結合する場合、biMabは、通常の二重特異性抗体の多重特異性と、通常の抗体分子の二価性とを有する。結合ユニット1および2が同じエピトープに結合する場合、biMabは、通常の抗体の単一特異性を有するが、四価である。biMabは、結合ユニットに加えて、リンカーポリペプチドおよびFc部分をさらに含む。本開示はまた、「コア」biMab構造に追加の結合ユニットを付加して、各エピトープに対して二価である三重特異性、四重特異性、五重特異性および六重特異性の結合タンパク質を得ることにより、3つ以上のエピトープに結合する結合タンパク質も提供する(たとえば図26、27および28を参照)。本開示は、biMabなどの結合タンパク質、およびbiMabコアを構成する結合タンパク質を提供する。本開示の結合タンパク質は、本明細書に記載するような結合ユニット、リンカーポリペプチドおよびFc部分を含む。本開示はまた、こうしたbiMabをコードする核酸分子、およびこうしたbiMabを作製して使用する方法も提供する。biMab、biMabコアを含む結合タンパク質、およびbiMabの様々な部分については、本明細書により詳細に記載する。
本明細書に記載するようなbiMabは2つの重鎖−軽鎖対を含み、一緒に第1の結合ユニットを形成する重鎖および軽鎖は各々可変領域(たとえばVLおよびVH)を含み、かつ重鎖は第2の結合ユニット(たとえばscFv)をさらに含む。第1および第2の結合ユニットが異なるエピトープに結合する場合、各重鎖−軽鎖対は二重特異性であり、2つの対は共に各エピトープに対して二価である。第1および第2の結合ユニットが同じエピトープに結合する場合、各重鎖−軽鎖対は単一特異性であり、2つの対は共にエピトープに対して四価である。いくつかの態様では、2つの重鎖−軽鎖対は同一である。いくつかの態様では、2つの重鎖−軽鎖対は同一でない。
biMabのドメインは、免疫グロブリンのドメインに基づいてもよい。モノクローナル抗体(mAb)などの免疫グロブリン分子は、診断薬および治療薬として広く使用されており、mAbの結合フラグメントを設計する方法は、当該技術分野において公知である。モノクローナル抗体は、すべての免疫グロブリン分子と同様に、ペプチドサブユニットで構成される。典型的または通常のmAbは、2つの重鎖サブユニットおよび2つの軽鎖サブユニットを含む。mAbの重鎖は各々、抗原結合に寄与する1つの可変ドメイン(VH)、および3または4つのサブ領域(CH1、CH2、CH3、CH4)で構成される定常ドメイン(CH)を含む。mAbの軽鎖は各々、1つの可変ドメイン(VL)および1つの定常ドメイン(CL)を含む。軽鎖定常ドメイン鎖には、哺乳動物に見られる2つのアイソタイプ、カッパ(κ)およびラムダ(λ)がある。ジスルフィド結合は、各CH1ドメインを1つのCLドメインに連結し、CH2ドメインを互いに連結する。異なるクラスの抗体(IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM)には、5種の重鎖(α、δ、ε、γおよびμ)が認められる。mAb重鎖は、構造の柔軟性および可動性を与えるヒンジ領域を有する。本開示のbiMabは、従来の抗体に類似した全体構造を有し得るが、第1の抗原結合部分とFc部分との間に位置する追加の結合ユニットの存在によって区別することができる。したがって、1つのエピトープへの結合に対して二価である従来の抗体と異なり、biMabは、2つのエピトープへの結合に対して二価である。一方で、本明細書に記載するように、biMabは、FcRnへの結合能ならびにC1q受容体およびFcγ受容体への結合能(たとえば、抗体依存性細胞傷害および補体依存性細胞傷害を媒介する能力を示唆する)など従来の抗体の多くの望ましい特性を依然として維持している。
Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab’フラグメント、scFvフラグメント、ジ−scFvフラグメント、sdAbフラグメントなどmAb分子の選択された部分のみを含むmAbフラグメントも、診断薬または治療薬として使用されてきた。さらに、抗体および抗体フラグメントの結合特異性を向上させるため、可変ドメインの特定の残基が変更されてきた。非ヒト抗体の領域「をヒト化して」mAbの免疫原性を低下させるため、抗原結合に直接関与しない他の残基も置き換えられてきた。
biMabは従来の抗体と異なり、たとえば、2つの異なるエピトープへの結合に対して二価(または1つのエピトープへの結合に対して四価)であるが、biMabの多くの部分は、従来の抗体部分に由来するまたは類似する。本明細書に記載のbiMabには、当該技術分野において公知のどのようなmAbドメインおよび/またはフラグメントを使用してもよい。特に、biMabは、Fabフラグメントおよび/もしくはscFvフラグメントまたはこれらの変異体を含んでもよい。例示的かつ非限定的なscFvの変異体として、タンデムジ−scFv、タンデムトリ−scFv、ダイアボディおよびトリボディまたはトリアボディがあるが、これに限定されるものではない。このため、ある態様では、本開示は、多重特異性を持つ二価ポリペプチドであって、第1のエピトープに結合するFab(結合ユニット1)、第2のエピトープに結合するscFvまたはscFvの変異体(結合ユニット2)、少なくともCH2およびCH3ドメインを含むFc、結合ユニット1と結合ユニット2とを相互に連結するポリペプチドリンカー(L1;上方ヒンジ/リンカー)、および結合ユニット2とFcとを相互に連結するポリペプチドリンカー(L2;リンカー/下方ヒンジ)を含むポリペプチドを提供する。
本開示は全般的に、本開示の新規な結合タンパク質に関し、biMabが実例である。別の例には、biMabコアのほか、1つまたは複数の追加の結合ユニットを含む結合タンパク質(たとえば、図27および28を参照)および/または伸長型biMabコアを含む結合タンパク質(たとえば、図29を参照)がある。biMabまたはbiMabの特徴を本明細書に記載するときは、そうした記載が本開示の新規な結合タンパク質に全般的に当てはまるものであり、そうした結合タンパク質が2つの結合ユニットまたは3つ以上の結合ユニットを含むかどうかに関係ないことを理解すべきである。したがって、biMabという用語は、本開示の結合タンパク質を例示するものであり、文脈上許容される場合、biMabに関する任意のそうした言及は、biMabコアを含む結合タンパク質を説明するために使用されることがある。
図1は、本開示の例示的biMabの模式図を示す。図1に示すように、本開示のbiMabの一態様は、2つの同一の重鎖−軽鎖対を含み、重鎖−軽鎖対は各々二重特異性であり、2つの同一の対が各エピトープに対して共に二価である。各重鎖−軽鎖対は、第1のエピトープに結合するFabドメイン(結合ユニット1)、第2のエピトープに結合する結合ドメイン(BD)(結合ユニット2;図1にscFvとして図示)およびFc領域を含む。さらに詳しくは、biMabは2つのキメラ重鎖を含み、各々重鎖可変領域(VH1)と、重鎖定常領域(CH1)と、第1のポリペプチドリンカー(図1に上方ヒンジ/リンカーと表記;本明細書ではL1ともいう)と、結合ドメイン(BD)と、第2のポリペプチドリンカー(図1にリンカー/下方ヒンジと表記;本明細書ではL2ともいう)と、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc領域とを含む。本開示のbiMabは、2つの通常の抗体軽鎖をさらに含み、各々軽鎖可変領域(VL1)および軽鎖定常領域(CL)を含む。図1に示す特定のbiMabの結合ドメイン(結合ユニット2)はscFvである。しかしながら、本開示の様々な態様によるbiMabの結合ドメインは、当該技術分野において公知のどのような結合ドメインであってもよい。
図1は、本明細書ではbiMab「コア」ともいうbiMabの有用な模式化したものを示す。図2および3は、代表的なbiMabの重鎖の追加の説明を示す。このポリペプチド鎖は、図1に示すように、VH1ドメイン、CH1ドメイン、上方ヒンジ/リンカー(本明細書ではL1または第1のポリペプチドリンカーともいう)、結合ユニット2(scFvのVL2およびVH2など)、リンカー/下方ヒンジ(本明細書ではL2または第2のポリペプチドリンカーともいう)、およびFc(CH2ドメインおよびCH3ドメイン)を含む。この重鎖は、従来の軽鎖領域を含んでもよいため、本明細書でキメラ重鎖という。biMabは2つのこうしたキメラ重鎖を含み、これらは同一でも、あるいは異なってもよい。結合ユニット1の可変重鎖ドメイン(VH)はVH1という点に留意されたい。ある態様では、これは、第1のエピトープに結合するFabの可変重鎖である。同様に、結合ユニット1の可変軽鎖ドメイン(VL)はVL1という。ある態様では、これは、第1のエピトープに結合するFabの可変軽鎖である。一方、結合ユニット2が第2のエピトープに結合するscFvである態様では、結合ユニット2のドメインは、VH2およびVL2など数字「2」で示す。
図2は、例示的biMabキメラ重鎖に使用されるいくつかのドメインのDNA配列およびアミノ酸配列の情報を提供する。キメラ重鎖の部分は図2A〜2Cに示す。図2Aの最上部に、VH1領域のDNA配列およびタンパク質配列を模式的に示す。任意の特定のbiMabの場合、この実際の配列は、特定の結合ユニット1のVH1、たとえば特定のFabのVH1に対応すると考えられる。次いで図2Aは、例示的CH1ドメインおよびヒトIgG1全ヒンジ領域のDNA配列およびタンパク質配列を示す。これに続いて、biMabのFabとBDとを相互に連結するポリペプチドリンカー1(L1)のいくつかの例示的な選択肢のDNA配列およびアミノ酸配列を示す。L1は、ヒンジ部分およびリンカー部分(上方ヒンジ/リンカー)を含んでもよく、これを図2Aに図示する。図2Aは、最初にL1のヒンジ部分(上方ヒンジ、この場合ヒトIg1上方ヒンジとして示す)の例を示す。図2Aは、ヒトIgG1上方ヒンジまたは修飾ヒトIgG1上方ヒンジとして示す、L1のヒンジ部分に考えられる3つの態様を図示していることに留意されたい。これらのヒンジ部分は、修飾ヒンジ部分がシステインの直後にDからGへの置換を含む、あるいはシステイン後の残基を欠いている点で異なる。次いで図2Aは、L1のリンカー部分、この場合G4Sリンカーを示す。上方ヒンジ部分およびリンカー部分は一緒にL1を形成する。しかしながら、ある態様では、L1はリンカー部分のみ、またはヒンジ部分のみを含む。
図2Bは、VH2−リンカー−VL2配向でも、あるいはVL2−リンカー−VH2配向でもよい結合ユニット2の、この場合scFvのDNA配列およびタンパク質配列を模式的に示す。任意の特定のbiMabでは、この配列は、たとえば、特定の結合ユニット2のVH2配列およびVL2配列、ならびにこれらのVH2ドメインおよびVL2ドメインに適切なリンカーに対応すると考えられる。L1のヒンジ部分およびリンカー部分は、たとえば、L1が2つのヒンジ部分および2つのリンカー部分を含むように繰り返されてもよいことが理解されよう。
例示的第2のポリペプチドリンカー(L2;リンカー/下方ヒンジともいう)のDNA配列およびアミノ酸配列を図2Aおよび2Bに示す。L2のリンカー部分は図2Bの下部に示す。図示したように、このリンカー部分はG4Sリンカーである。L2のヒンジ部分は図2Bの下部に示す(このヒンジ部分は下方ヒンジまたはヒンジ変異体として示している点に留意されたい)。図2Bは、L2のヒンジ部分、ヒトIgG1のヒンジ変異体およびヒトIgG1の下方ヒンジの3つの態様を示す。下方ヒンジ部分およびリンカー部分は一緒にL2(リンカー/下方ヒンジともいう)を形成する。しかしながら、ある態様では、L2はリンカー部分のみ、またはヒンジ部分のみを含む。
図2Cは、FcのCH2ドメインおよびCH3ドメインのDNA配列およびアミノ酸配列を示す。図2Bに示すCH2ドメインおよびCH3ドメインはIgG1由来であるが、biMabは、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEなど任意のIgクラス、ならびにIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4など任意のアイソタイプ由来のFcを使用して容易に作製することができる。L2のヒンジ部分およびリンカー部分は、たとえば、L2が2つのヒンジ部分および2つのリンカー部分を含むように繰り返されてもよいことが理解されよう。
最後に、図2Dは、野生型ヒンジ領域およびいくつかの代表的なL1およびL2の変更形態のタンパク質配列のアライメントを示す。望ましくない切断現象が起こる可能性があるアスパルテートを示す。ある態様では、このアスパルテートはL1および/またはL2に存在しない。ある態様では、アスパレートを別のアミノ酸残基(たとえば、グリシン)で置換する。他の態様では、アスパルテート残基を欠失させる。また、アミノ酸挿入(たとえば、セリン)を含むL2の変更形態も示す。このアミノ酸挿入は、リンカーをコードするDNA配列に制限部位(たとえば、XhoI)を導入するために行った。特に結合ドメインのクローニングを容易にするには、本発明の結合タンパク質に存在する任意のリンカーに所望の制限部位を組み込んでもよいことを意図している。
図3は、biMabの例示的模式図でキメラ重鎖のアミノ酸配列をもう1つ表示する。言うまでもなく、VH1(結合ユニット1の可変重鎖ドメイン1)の具体的な配列および結合ドメイン2(VH2−リンカー−VL2配向のsvFc)の具体的な配列は示していないことを理解すべきである。これらの配列は、特定のbiMabを構成する個々の結合ユニットによって異なる。一方、相互に関連するbiMabの各部分の相対位置は、維持されている(たとえば、個々の結合ユニットが異なっても、biMab型は同じである)。
図3では、L1およびL2を下線およびイタリック体で示し、L1およびL2のヒンジ部分を太字で示す。上のパネルでは、L1のヒンジ部分は、ヒトIgG1上方ヒンジに対応するのに対し、下のパネルではL1のヒンジ部分は修飾ヒトIgG1上方ヒンジに対応する。上のパネルでは、L2のヒンジ部分はヒトIgG1の下方ヒンジ変異体に対応するのに対し、下のパネルではL2のヒンジ部分はヒトIgG1の下方ヒンジに対応する。いずれの場合も、L1は、たとえば、結合ユニット1のVH1と結合ユニット2のVH2とを相互に連結することにより、結合ユニット1と結合ユニット2とを相互に連結する。L2は、たとえば、結合ユニット2のVL2とFcのCH2ドメインとを相互に連結することにより、結合ユニット2とFcと相互に連結する。
代表的なbiMabをさらに模式化したものを図4および5に示す。これらの図は、この分子におけるL1およびL2のヒンジ部分の相対位置を示す。たとえば、図4A〜4Cでは、L1のヒンジ部分の相対位置を示す。L1はリンカー部分をさらに含んでもよいが、その配列は、図4A、4Bまたは4Cに示していない。リンカー部分をさらに含むL1の例は配列番号62、63および64に示す)。一方、存在する場合には、L1のヒンジ部分は結合ユニット1と直接相互に連結し(たとえば、結合ユニット1の一部と隣接し)、リンカー部分は結合ユニット2と直接相互に連結する(たとえば、結合ユニット2の一部と隣接する)点に留意されたい。この構造のため、L1は上方ヒンジ/リンカーともいう。さらに例を挙げると、図5A〜5CはL2のヒンジ部分の相対位置を示す。L2はリンカー部分をさらに含んでもよいが、その配列は図5A、5Bまたは5Cに示していない。一方、存在する場合には、L2のヒンジ部分はFcドメインと直接相互に連結し(たとえば、Fcドメインの一部と隣接し)、リンカー部分は結合ユニット2と直接相互に連結する(たとえば、結合ユニット2の一部と隣接する)点に留意されたい。この構造のため、L2はリンカー/下方ヒンジともいう。
本明細書ではbiMab「コア」ともいうbiMab型全体について記載してきた。本開示のbiMabの様々な部分および例示的な機能特性について、下記により詳細に記載する。本開示は、分子の各部分または分子の機能的特徴を記載する態様など、上記または下記に開示される態様のいずれかの組み合わせを含むbiMab意図している。
1. 結合ユニット
本開示のbiMabは、少なくとも2つの結合ユニット(結合ユニット1および結合ユニット2)を含む。ある態様では各結合ユニットは、同じ標的分子上にある異なるエピトープあるいは異なる標的上のエピトープを問わず、異なるエピトープに結合する。biMabの結合ユニットは各々対として存在する(2つの結合ユニット1および2つの結合ユニット2が存在する)ため、biMabは各エピトープに対して二価の結合を示す。本明細書の教示から、各結合ユニットが同じエピトープに結合する場合、biMabはエピトープに対して四価の結合を示すことが理解されよう。
本開示のbiMabは、少なくとも2つの結合ユニット(結合ユニット1および結合ユニット2)を含む。ある態様では各結合ユニットは、同じ標的分子上にある異なるエピトープあるいは異なる標的上のエピトープを問わず、異なるエピトープに結合する。biMabの結合ユニットは各々対として存在する(2つの結合ユニット1および2つの結合ユニット2が存在する)ため、biMabは各エピトープに対して二価の結合を示す。本明細書の教示から、各結合ユニットが同じエピトープに結合する場合、biMabはエピトープに対して四価の結合を示すことが理解されよう。
ある態様では、第1の結合ユニットはFabフラグメント、たとえば、通常のモノクローナル抗体のFabフラグメント、または可変軽鎖(VL1)、定常軽鎖(CL1)、可変重鎖(VH1)および定常重鎖部分(CH1)を含む組換え技術によって作製された抗原結合フラグメントである。任意に、Fabの軽鎖および重鎖は、1つまたは複数のジスルフィド結合を介して相互に連結されていてもよい。Fabは、第1のエピトープに結合する。
ある態様では、Fabは、通常のモノクローナル抗体、たとえば通常のマウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の配列に由来するまたは基づく。ある態様では、通常のモノクローナル抗体の配列に由来するまたは基づくFabを含むbiMabは、通常の抗体の1つまたは複数の機能活性を保持する(たとえば、機能活性の少なくとも80%以上(80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%))を保持する。たとえば、ある態様では、こうしたFabを含むbiMabは、通常の抗体の抗原に対する親和性、阻害活性または細胞殺傷活性の1つまたは複数を保持する。
ある態様では、Fabは上皮増殖因子受容体(EGFR)に結合する。ある態様では、FabはIGFR1に結合する。ある態様では、FabはVEGFに結合する。ある態様では、FabはAng2に結合する。ある態様では、FabはEGFR、IGFR1、VEGF、Ang2、PslまたはPcrVのいずれかに結合する通常のモノクローナル抗体の配列に由来するまたは基づく。例示的な通常のモノクローナル抗体として、パニツムマブ、ダロツズマブ、ベバシズマブ、LC06、W4−RADまたはV2L2が挙げられる。たとえば、ある態様では、本開示のbiMabは結合ユニット1としてFabを含み、このFabは、パニツムマブ、ダロツズマブ、ベバシズマブまたはLC06の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは全6つのCDRを含む。
ある態様では、Fabは、配列番号20、29および42のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖部分(VL1およびCL)を含む。ある態様では、Fabは、配列番号23、32および45のいずれかに記載の、図6C、7Cまたは8Cに下線で示したアミノ酸配列を含む重鎖部分(VH1およびCH1)を含む。ある態様では、Fabは、配列番号21に記載のアミノ酸配列を含む可変軽鎖部分(VL1)、および配列番号24に記載のアミノ酸配列を含む可変重鎖部分(VH1)を含む。ある態様では、Fabは、配列番号30に記載のアミノ酸配列を含む可変軽鎖部分(VL1)、および配列番号33に記載のアミノ酸配列を含む可変重鎖部分(VH1)を含む。ある態様では、Fabは、配列番号43に記載のアミノ酸配列を含む可変軽鎖部分(VL1)、および配列番号46に記載のアミノ酸配列を含む可変重鎖部分(VH1)を含む。ある態様では、Fabは、軽鎖部分(VL1およびCL)をコードするヌクレオチド配列、および重鎖部分(VH1およびCH1)をコードするヌクレオチド配列、たとえば、配列番号19 28、41に記載の核酸配列を含むヌクレオチド配列、および配列番号22、29または44に記載の、図6A、7Aまたは8Aに下線で示した核酸配列を含むヌクレオチド配列によりコードされる。
ある態様では、本開示のbiMabは結合ユニット2を含み、結合ユニット2は第2のエピトープに結合する結合ドメインを含む。本開示による結合ドメイン(「BD」ともいう)として、たとえば、抗体可変領域、抗体フラグメント、scFv、一本鎖ダイアボディまたは当該技術分野において公知の他の結合ドメインがある。結合ドメインとしてさらに、二重特異性一本鎖ダイアボディ、または2つの異なるエピトープに結合するように設計された一本鎖ダイアボディが挙げられる。さらに、抗体様分子または抗体模倣体として、たとえば、以下に限定されるものではないが、エピトープに特異的に結合するミニボディ、マキシボディ(maxybody)、「A」ドメインオリゴマー(アビマーとも呼ばれる)(たとえば、各々援用する米国特許出願公開第2005/0164301号明細書、同第2005/0048512号明細書および同第2004/017576号明細書を参照)、Fn3を用いたタンパク質スキャフォールド(たとえば、援用する米国特許出願公開第2003/0170753号明細書を参照)、アンクリンリピート(DARpinとも呼ばれる)、VASPポリペプチド、トリ膵ポリペプチド(aPP)、テトラネクチン(CTLD3に基づく)、アフィリリン(γB−クリスタリン/ユビキチンに基づく)、ノッチン(Knottin)、SH3ドメイン、PDZドメイン、テンダミスタット、ネオカルチノスタチン、プロテインAドメイン、リポカリン、トランスフェリンおよびKunitzドメインが挙げられる。一態様では、本開示の多重特異性エピトープ結合ドメインの構築に有用なエピトープ結合ドメインは、あらゆる目的において本明細書に援用する国際公開第2009/058379号パンフレットおよび国際公開第2011/130324号パンフレットに例示される。
さらにある態様では、BDは、受容体のリガンド結合ドメインまたはリガンドの受容体結合ドメインを含む。たとえば、BDは、FGFRに結合するFGF部分、EGFRに結合するEGF部分、PDGFRに結合するPDGFおよび同種のものを含む。あるいは、BDは、FGFに結合するFGFR部分、EGFに結合するEGFR部分、PDGFに結合するPDGFRおよび同種のものを含んでもよい。多くのリガンド/受容体対のそれぞれの結合ドメインは当該技術分野において周知であり、したがって容易に選択してbiMab型の使用に適合させることができる。
ある態様では、結合ドメインはscFvである。したがって、ある態様では、結合ユニット2はscFvを含む。scFvは、フレキシブルなポリペプチドリンカーを介して可変軽鎖ドメイン(VL)に結合した可変重鎖ドメイン(VH)を含むポリペプチド鎖を包含することが理解されよう。図1は、BD(ここでは結合ユニット2と表示)がscFvであり、そのドメインをVL2およびVH2で示す例示的biMabの模式図を示す。いくつかの態様では、VH2とVL2との間のポリペプチドリンカーはプロテアーゼ切断部位を含む。図29は、scFv結合ドメインのポリペプチドリンカーのプロテアーゼ切断前および後の代表的なbiMab「コア」を含む模式図を示す。
scFvのVHドメインおよびVLドメインは同じ抗体に由来しても、あるいは異なる抗体に由来してもよい。いくつかの態様では、scFvのVHまたはVLは目的の標的に結合する1つまたは複数のCDRを含んでもよく、VHドメインまたはVLドメインの残りは、異なる抗体に由来するまたは合成ドメインである。いくつかの態様では、scFvは、抗体、たとえば、目的の標的に結合する当該技術分野において公知の抗体の少なくとも1つのCDRを含む。いくつかの態様では、scFvは、ある抗体の少なくとも2つのCDRを含む。いくつかの態様では、scFvは、ある抗体の少なくとも3つのCDRを含む。いくつかの態様では、scFvは、ある抗体の少なくとも4つのCDRを含む。いくつかの態様では、scFvは、ある抗体の少なくとも5つのCDRを含む。いくつかの態様では、scFvは、ある抗体の少なくとも6つのCDRを含む。
いくつかの方法を単独あるいは組み合わせて用いて、scFv分子を含むbiMabの安定性を高めてもよい。単独あるいは本明細書に記載の1つまたは複数の他の方法と組み合わせて使用できると考えられる1つの方法は、scFv部分を安定化させるようにscFvドメインを連結するリンカーの長さおよび/または組成を操作することによる。
単独あるいは本明細書に記載の他の方法1つまたは複数を組み合わせて使用できると考えられる別の方法は、ジスルフィド結合の形成を促進するようにscFvのVHドメインおよび/またはVLドメインに少なくとも2つのアミノ酸置換(修飾または突然変異ともいう)を導入することによる(たとえばBrinkmann et al.,1993,PNAS,90:7538−42;Zhu et al.,1997,Prot.Sci.6:781−8;Reiter et al.,1994,Biochem.33:5451−9;Reiter et al.,1996,Nature 14:1239−45;Luo et al.,1995,J.Biochem.118:825−31;Young et al.,1995,FEBS Let.377:135−9;Glockshuber et al.,1990,Biochem.29:1362−7を参照)。
ある態様では、scFvのVHドメインおよびVLドメインに1つの突然変異を導入して、scFvを含むbiMabの発現時にVHドメインとVLドメインとの間の鎖間ジスルフィド結合の形成を促進する。別の態様では、鎖の同じドメインに2つの突然変異を導入する。ある態様では、異なる鎖に2つの突然変異を導入する。ある態様では、2つの突然変異の複数対を導入して、複数のジスルフィド結合の形成を促進する。ある態様では、システインを導入してジスルフィド結合の形成を促進する。システインに変異させてもよい例示的アミノ酸として、VH2のアミノ酸43、44、45、46、47、103、104、105および106、ならびにVL2のアミノ酸42、43、44、45、46、98、99、100および101が挙げられる。前述の番号付けは、scFvのVH2およびVL2のみに対する(biMabの全長配列または本明細書に提供する配列番号のアミノ酸の位置に対するものではない)位置を特定するKabatの番号付けに基づく。システイン残基に変異させてもよいアミノ酸位置の例示的組み合わせとして、VH44−VL100、VH105−VL43、VH105−VL42、VH44−VL101、VH106−VL43、VH104−VL43、VH44−VL99、VH45−VL98、VH46−VL98、VH103−VL43、VH103−VL44およびVH103−VL45が挙げられる。いくつかの態様では、VHのアミノ酸44およびVLのアミノ酸100をシステインに変異させる。
単独あるいは本明細書に記載の1つまたは複数の他の方法と組み合わせて使用してもよいとさらに考えられる方法は、scFvの順序を選択することである。ある態様では、VLドメインに対するVHドメインの配向を安定性のために最適化する。ある態様では、scFvは、VH−リンカー−VLの配向である。ある態様では、scFvは、VL−リンカー−VHの配向である。また、scFvのドメインの配向は、scFvがbiMabのFab部分およびFc部分とどのように相互に結合するかを決定する。これは、ポリペプチドリンカーの文脈で以下により詳細に記載する。ただし、簡単に説明すると、BD、たとえばscFVがポリペプチドリンカー(L1)によりFabと相互に連結され、Fcとポリペプチドリンカー(L2)により相互に連結されることから、ドメインの順序は、scFvのどの部分がL1と相互に連結され、scFvのどの部分がL2と相互に連結されるかを決定する。
単独あるいは1つまたは複数の本明細書に記載の方法と組み合わせて使用してもよい別の方法は、scFvの1つまたは複数の表面残基を変異させて1つまたは複数の安定化突然変異を導入することによる。いくつかの態様では、scFvのVHドメインおよび/またはVLドメインの一方または両方の1、2、3、4、5、6または6を超える残基を変異させる。ある態様では、scFvのVHドメインのみの変更を行う。ある態様では、scFvのVLドメインのみの変更を行う。ある態様では、scFvのVHドメインおよびVLドメインの両方の変更を行う。各ドメインに同じ数の変更を行っても、あるいは各ドメインに異なる数の変更を行ってもよい。ある態様では、1つまたは複数の変更は、未修飾の親scFvに存在する残基の保存的アミノ酸置換である。他の態様では、1つまたは複数の変更は、未修飾の親scFvに存在する残基の非保存的アミノ酸置換である。scFvのVHドメインまたはVLドメインの一方あるいは両方に複数の置換を行う場合、置換は各々独立に保存的置換または非保存的置換である。ある態様では、置換はすべて保存的置換である。ある態様では、置換はすべて非保存的である。ある態様では、置換の少なくとも1つは保存的である。ある態様では、少なくとも1つまたは置換は非保存的である。
単独あるいは1つまたは複数の本明細書に記載の他の方法と組み合わせて使用してもよいさらに別の方法は、scFvのVHドメインおよび/またはVLドメインの1つまたは複数の残基を変異させて1つまたは複数の置換を導入して、既知の抗体のVHドメインおよび/またはVLドメインのコンセンサス配列の前記特定位置で最も頻度の高い残基にマッチさせることによる。ある態様では、scFvのVHドメインおよび/またはVLドメインの一方または両方に1、2、3、4、5、6または6を超える位置で置換を導入する。各ドメインに同じ数の変更を行ってもよいし、あるいは各ドメインに異なる数の変更を行ってもよい。ある態様では、あるコンセンサス配列にマッチさせる配列の1つまたは複数の変更は、未修飾のVH配列および/またはVL配列に存在する残基の保存的アミノ酸置換である。他の態様では、1つまたは複数の変更は、未修飾のVH配列および/またはVL配列に存在する残基の非保存的アミノ酸置換である。scFvのVHドメインまたはVLドメインの一方あるいは両方に複数の置換を行う場合、置換は各々独立に保存的置換または非保存的置換である。ある態様では、置換はすべて保存的置換である。ある態様では、置換はすべて非保存的置換である。ある態様では、置換の少なくとも1つは保存的である。ある態様では、少なくとも1つまたは置換は非保存的である。
scFv部分の修飾または安定化に有用であると記載された修飾のいずれも、Fab部分の修飾に適用できることに留意されたい。たとえば、biMabのFab部分の可変ドメインを修飾して、安定性、抗原結合および同種のものを向上させることができる。さらに、Fab部分あるいはscFv部分を修飾して免疫原性を低下させることもできる。
ある態様では、結合ユニット2(BD)は、scFv、たとえば、グリシン−セリンリンカーなどのフレキシブルリンカーにより相互に連結された可変軽鎖(VL2)および可変重鎖(VH2)を含む通常のモノクローナル抗体に由来するscFvである。任意に、scFvの可変軽鎖および可変重鎖は、1つもしくは複数のジスルフィド結合を介してさらに相互に連結されていてもよく、上記のように、1つもしくは複数の突然変異または変更を含んでいてもよい。scFvは、第2のエピトープに結合する。ある態様では、第2のエピトープは、結合ユニット1が結合する第1のエピトープと異なる。他の態様では、第2のエピトープは、結合ユニット1が結合する第1のエピトープと同じである。ある態様では、scFvは、通常のマウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体など通常のモノクローナル抗体の配列に由来するまたは基づく。ある態様では、通常のモノクローナル抗体の配列に由来するまたは基づくscFvを含むbiMabは、通常の抗体の1つまたは複数の機能活性を保持する(たとえば、機能活性の少なくとも80%以上(80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%)を保持する)。たとえば、ある態様では、こうしたscFvを含むbiMabは、通常の抗体の抗原に対する親和性、阻害活性または細胞殺傷活性の1つまたは複数を保持する。
ある態様では、scFvは上皮増殖因子受容体(EGFR)に結合する。ある態様では、scFvはIGFR1に結合する。ある態様では、scFvはVEGFに結合する。ある態様では、scFvはAng2に結合する。ある態様では、scFvは、EGFR、IGFR1、VEGF、Ang2、PslまたはPcrVのいずれかに結合する通常のモノクローナル抗体の配列に由来するまたは基づく。例示的な通常のモノクローナル抗体として、パニツムマブ、ダロツズマブ、ベバシズマブまたはLC06が挙げられる。たとえば、ある態様では、本開示のbiMabは結合ユニット2としてscFvを含み、このscFvは、パニツムマブ、ダロツズマブ、ベバシズマブまたはLC06の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは全6つのCDRを含む。
ある態様では、scFvは、配列番号26、35および48のいずれかに記載されたアミノ酸配列を含む可変軽鎖部分(VL2)を含む。ある態様では、scFvは、配列番号27、36、49のいずれかに記載されたアミノ酸配列を含む可変重鎖部分(VH2)を含む。ある態様では、scFvは、配列番号25、34および47のいずれかに記載されたアミノ酸配列を含む。図6B、6C、7B、7C、8Bおよび8Cを参照されたい。
本開示は、ある態様では、本開示のbiMabが、本明細書に記載の結合ユニット1および結合ユニット2の任意の組み合わせを含め、本明細書に記載の結合ユニット1および結合ユニット2のいずれかを含むことを意図している。たとえば、ある態様では、本開示は、特定の標的に結合する(たとえば、特定の標的上のエピトープに結合する)Fab、たとえば特定のアミノ酸配列を含むまたは特定のヌクレオチド配列によりコードされたFab、および/または、特定の標的に結合する(たとえば、特定の標的上のエピトープに結合する)scFv、たとえば特定のアミノ酸配列を含むまたは特定のヌクレオチド配列によりコードされたscFvを含むポリペプチドを提供する。
上記に詳述したように、結合ユニット1および結合ユニット2は、リンカーポリペプチド1(L1;上方ヒンジ/リンカーともいう)を介して相互に連結される。一般に、この結合は、相互の連結が結合ユニット1の重鎖CH1ドメイン(VH1、たとえばFabのVH1)および結合ユニット2部分を介する(たとえば、結合ユニット2がscFvである場合、相互の連結はscFvのVH2またはVL2を介する)ように、biMabのキメラ重鎖を介するものである。L1は長さおよび配列が異なってもよく、例示的なL1構造を本明細書に記載する。本開示は、所望の標的に結合する特異的結合ユニットと本明細書に記載の特定のL1およびL2ポリペプチドリンカーとの任意の組み合わせなど結合ユニットとリンカーポリペプチドとの任意の組み合わせを含むbiMabを意図している。
2. Fc領域
本明細書で使用する場合、「Fc領域」は定常領域のフラグメント、アナログ、変異体、ミュータントまたは誘導体を含む、免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリンの定常領域に由来するドメインを包含する。好適な免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4および他のクラス、たとえばIgA、IgD、IgEおよびIgMが挙げられる。Fc領域は、天然配列のFc領域でも、あるいは改変したFc領域でもよい。免疫グロブリンのFc領域は一般に2つの定常ドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、任意にCH4ドメインを含む。本開示のbiMabは、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc領域を含む。ある態様では、本開示のbiMabは、L1もしくはL2の一方または両方のヒンジ部分と同じクラスのFcドメインを含む。
本明細書で使用する場合、「Fc領域」は定常領域のフラグメント、アナログ、変異体、ミュータントまたは誘導体を含む、免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリンの定常領域に由来するドメインを包含する。好適な免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4および他のクラス、たとえばIgA、IgD、IgEおよびIgMが挙げられる。Fc領域は、天然配列のFc領域でも、あるいは改変したFc領域でもよい。免疫グロブリンのFc領域は一般に2つの定常ドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、任意にCH4ドメインを含む。本開示のbiMabは、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc領域を含む。ある態様では、本開示のbiMabは、L1もしくはL2の一方または両方のヒンジ部分と同じクラスのFcドメインを含む。
a. 改変Fc領域
本開示のbiMabのエフェクター機能および/または半減期を変化させるため、改変Fc領域(本明細書では「変異Fc領域」ともいう)を使用してもよい。Fc領域では、分子の機能特性および/または薬物動態特性を変化させるため、1つまたは複数の改変を行ってもよい。こうした改変の結果、IgGのC1q結合および補体依存性細胞傷害(CDC)、またはFcγR結合および抗体依存性細胞傷害(ADCC)、または抗体依存性貪食作用(ADCP)が低下または増強される。本開示は、機能を増強または減弱するあるいは所望のエフェクター機能を与えることによりエフェクター機能を微調整するための変更を行ったbiMabを包含する。したがって、本開示の一態様では、biMabは変異Fc領域(すなわち、下記で考察される改変を行ったFc領域)を含む。本明細書では変異Fc領域を含むbiMabを「Fc変異biMab」ともいう。本明細書で使用する場合、「天然の」とは未修飾の親配列をいい、本明細書では天然のFc領域を含むbiMabを「天然のFc biMab」という。Fc変異biMabは、当業者によく知られている多くの方法により作製することができる。非限定的な例として、抗体コード領域の単離(たとえば、ハイブリドーマから)およびFc領域における1つまたは複数の所望の置換の実施が挙げられる。あるいは、biMabの抗原結合部分(たとえば、可変領域)を、変異Fc領域をコードするベクターにサブクローニングしてもよい。一態様では、変異Fc領域は、天然のFc領域と比較してエフェクター機能を誘導するレベルが同等である。別の態様では、変異Fc領域は、天然のFcと比較してエフェクター機能の誘導が高くなる。別の態様では、変異Fc領域は、天然のFcと比較してエフェクター機能の誘導が低くなる。変異Fc領域のいくつかの具体的な態様を以下に詳述する。エフェクター機能を測定する方法は、当該技術分野において周知である。
本開示のbiMabのエフェクター機能および/または半減期を変化させるため、改変Fc領域(本明細書では「変異Fc領域」ともいう)を使用してもよい。Fc領域では、分子の機能特性および/または薬物動態特性を変化させるため、1つまたは複数の改変を行ってもよい。こうした改変の結果、IgGのC1q結合および補体依存性細胞傷害(CDC)、またはFcγR結合および抗体依存性細胞傷害(ADCC)、または抗体依存性貪食作用(ADCP)が低下または増強される。本開示は、機能を増強または減弱するあるいは所望のエフェクター機能を与えることによりエフェクター機能を微調整するための変更を行ったbiMabを包含する。したがって、本開示の一態様では、biMabは変異Fc領域(すなわち、下記で考察される改変を行ったFc領域)を含む。本明細書では変異Fc領域を含むbiMabを「Fc変異biMab」ともいう。本明細書で使用する場合、「天然の」とは未修飾の親配列をいい、本明細書では天然のFc領域を含むbiMabを「天然のFc biMab」という。Fc変異biMabは、当業者によく知られている多くの方法により作製することができる。非限定的な例として、抗体コード領域の単離(たとえば、ハイブリドーマから)およびFc領域における1つまたは複数の所望の置換の実施が挙げられる。あるいは、biMabの抗原結合部分(たとえば、可変領域)を、変異Fc領域をコードするベクターにサブクローニングしてもよい。一態様では、変異Fc領域は、天然のFc領域と比較してエフェクター機能を誘導するレベルが同等である。別の態様では、変異Fc領域は、天然のFcと比較してエフェクター機能の誘導が高くなる。別の態様では、変異Fc領域は、天然のFcと比較してエフェクター機能の誘導が低くなる。変異Fc領域のいくつかの具体的な態様を以下に詳述する。エフェクター機能を測定する方法は、当該技術分野において周知である。
一般に、エフェクター機能は、以下に限定されるものではないが、アミノ酸置換、アミノ酸付加、アミノ酸欠失、およびFcアミノ酸の翻訳後修飾(たとえばグリコシル化)における変更などFc領域の変更により修飾する。下記に記載される方法を用いて、本開示のbiMabのエフェクター機能、FcRに対するFc領域の結合性の割合(たとえば、親和性および特異性)を微調整して、所望の特性を持つbiMabを得てもよい。
本明細書で使用するFc領域は、第1の定常領域の免疫グロブリンドメインを除く、抗体分子の定常領域を含むポリペプチドを含むことが理解されよう。このためFcとは、IgA、IgDおよびIgGの最後の2つの定常領域の免疫グロブリンドメインと、IgEおよびIgMの最後の3つの定常領域の免疫グロブリンドメインと、任意に、これらのドメインのフレキシブルなヒンジのN末端の全部または一部とをいう。IgAおよびIgMの場合、FcはJ鎖を含んでいてもよい。IgGの場合、Fcは免疫グロブリンドメインCガンマ2およびCガンマ3(Cγ2およびCγ3)、および任意にCガンマ1(Cγ1)とCガンマ2(Cγ2)との間の下方ヒンジ部分を含む。Fc領域の境界は異なってもよいが、本明細書で使用する場合、ヒトIgG重鎖のFc領域は残基A231からそのカルボキシル末端までを含み、番号付けはKabatに記載されたEUインデックスに従う。Fcとは、単離されたこの領域をいっても、あるいは抗体、抗体フラグメントまたはFc融合タンパク質の文脈におけるこの領域をいってもよい。多くの異なるFc位置、以下に限定されるものではないが、EUインデックスにより番号付けされたIgG1の270位、272位、312位、315位、356位および358位で多型が観察されており、したがって本配列と従来技術の配列との間に若干の相違が存在してもよい。
一態様では、本開示は、天然のFc biMabと比較してFcリガンド(たとえば、Fc受容体、C1q)に対する結合性が改変されたFc変異biMabを包含する。結合性の例として、結合特異性、平衡解離定数(Kd)、解離速度および結合速度(それぞれkoffおよびkon)、結合親和性ならびに/またはアビディティーがあるが、これに限定されるものではない。平衡解離定数(Kd)がkoff/konと定義されることは、当該技術分野において公知である。ある態様では、低Kdを有するFc変異領域を含むbiMabが、高Kdを有するbiMabより望ましいことがある。しかしながら、場合によってはkonまたはkoffの値の方がKdの値より重要であることもある。当業者であれば、個々の用途にどの速度論的パラメーターが最も重要であるかを判定することができる。たとえば、1つまたは複数のポジティブレギュレーター(たとえば、FcγRIIIA)に対する結合を低下させる、および/または、抑制性Fc受容体(たとえば、FcγRIIB)に対する結合を増強する修飾は、ADCC活性を低下させるのに好適であると考えられる。したがって、様々な受容体に対する結合親和性の比率(たとえば、平衡解離定数(Kd)の比率)から、本開示のFc変異biMabのADCC活性が増強または低下されるかどうかが示され得る。加えて、C1qに対する結合を低下させる修飾も、CDC活性を低下または除去するに好適であると考えられる。
一態様では、1つまたは複数のFc受容体、以下に限定されるものではないが、FcRn、FcγRI(CD64)(アイソフォームFcγRIA、FcγRIBおよびFcγRICを含む);FcγRII(CD32、たとえばアイソフォームFcγRIIA、FcγRIIBおよびFcγRIIC);およびFcγRIII(CD16、たとえばアイソフォームFcγRIIIAおよびFcγRIIIB)に対する結合親和性が、Fc変異biMabは天然のFc biMabと比較して改変される。
ある態様では、Fc変異biMabはFcリガンドに対する親和性を高めてある。他の態様では、Fc変異biMabは、天然のFc biMabと比較してFcリガンドに対する親和性を低下させてある。
特定の態様では、Fc変異biMabはFc受容体FcγRIIIAに対する結合を増強させてある。別の特定の態様では、Fc変異biMabはFc受容体FcγRIIBに対する結合を増強させてある。さらなる特定の態様では、Fc変異biMabはFc受容体FcγRIIIAとFcγRIIBとの両方に対する結合を増強させてある。ある態様では、FcγRIIIAに対する結合を増強させたFc変異biMabは、天然のFc biMabと比較してFcγRIIB受容体に対する結合を同時に高めていない。特定の態様では、Fc変異biMabはFc受容体FcγRIIIAに対する結合を低下させてある。さらなる特定の態様では、Fc変異biMabはFc受容体FcγRIIBに対する結合を低下させてある。別の特定の態様では、Fc変異biMabはFc受容体FcRnに対する結合を増強させてある。なお別の特定の態様では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIBに対する親和性が改変されたFc変異biMabは、Fc受容体FcRnに対する結合を増強させてある。なお別の特定の態様では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIBに対する親和性が改変されたFc変異biMabは、天然のFc biMabと比較してC1qに対する結合を改変してある。
別の態様では、Fc変異biMabは、天然のFc biMabと比較してC1qに対する親和性を増加または低下させる。なお別の特定の態様では、C1qに対する親和性が改変されたFc変異biMabは、Fc受容体FcRnに対する結合を増強させてある。なお別の特定の態様では、C1qに対する親和性が改変されたFc変異biMabは、天然のFc biMabと比較してFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIBに対する結合を改変させてある。
抗体が当該技術分野において抗体エフェクター機能と総称される複数のプロセスにより標的抗原の攻撃および破壊を誘導することができることは、当該技術分野において周知である。これらのプロセスの1つは、「抗体依存性細胞性細胞傷害」または「ADCC」と呼ばれ、分泌型Igが特定の細胞傷害性細胞(たとえば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球およびマクロファージ)上に存在するFcγ受容体(FcγR)に結合すると、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を持つ標的細胞に特異的に結合し、その後細胞毒で標的細胞を殺傷することができるようになる細胞毒性の形態をいう。標的細胞の表面に対して特異的な高親和性IgG抗体は細胞傷害性細胞を「武装」させるものであり、こうした殺傷に必須である。標的細胞の溶解は細胞外で行われ、細胞間の直接的な接触を必要とするが、補体を必要としない。エフェクター機能という用語により包含されるもう1つのプロセスは、補体依存性細胞傷害(以下「CDC」という)であり、これは、抗体を介して補体系により標的細胞を破壊する生化学的現象をいう。補体系は、抗体と組み合わさって病原菌および他の外来細胞を破壊する、通常の血漿で見られる複雑なタンパク質の系である。エフェクター機能という用語に包含されるさらに別のプロセスは抗体依存性貪食作用(ADCP)であり、これは、1つまたは複数のエフェクターリガンドを発現する非特異的な細胞傷害性細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の貪食作用を引き起こす細胞性反応をいう。
Fc変異biMabは、1つまたは複数のFcγRを介したエフェクター細胞の機能に関するインビトロ機能アッセイにより特徴付けられることを意図している。ある態様では、Fc変異biMabは、インビボモデルにおいてインビトロ系アッセイと同様の結合性およびエフェクター細胞機能(本明細書に記載および開示されたものなど)を有する。しかしながら、本開示は、インビトロ系アッセイで所望の表現型を示さないが、インビボでは所望の表現型を示すFc変異biMabを除外するものではない。
Fc領域を含むタンパク質の血清中半減期は、FcRnに対するFc領域の結合親和性を高めることにより延長することができる。「抗体半減期」という用語は、本明細書で使用する場合、投与後の抗体分子の平均生存時間の指標である抗体の薬物動態特性を意味する。抗体半減期は、既知量の免疫グロブリンの50パーセントを患者の体内(または他の哺乳動物)またはその特定のコンパートメントから除去するのに要する時間を、たとえば血清中で見て(すなわち、血中半減期)または他の組織で見て表すことができる。半減期は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのクラスによって異なってもよい。一般に、抗体(またはbiMab)半減期を延長すると、投与されたbiMabの循環血中の平均滞留時間(MRT)が長くなる。
半減期を延長すると、患者に投与される薬剤量が減少するほか、投与頻度も低下し得る。biMabの血清半減期を延長するには、たとえば米国特許第5,739,277号明細書に記載されているようなサルベージ受容体結合エピトープをbiMab(特に抗体フラグメント)に組み込んでもよい。本明細書で使用する場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、IgG分子のインビボでの血清中半減期に関わる、IgG分子(たとえばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4)のFc領域のエピトープをいう。あるいは、半減期の延長された本開示のbiMabは、FcとFcRn受容体との間の相互作用に関与することが確認されたアミノ酸残基を修飾することにより作製してもよい(たとえば、米国特許第6,821,505号明細書および同第7,083,784号明細書;および国際公開第09/058492号パンフレットを参照されたい)。さらに、本開示のbiMabの半減期は、当該技術分野において広く利用される技術によりPEGまたはアルブミンへのコンジュゲーションによって延長してもよい。
一態様では、本開示は、Fc領域がKabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた221、225、228、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、250、251、252、254、255、256、257、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、308、313、316、318、320、322、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、428、433、434、435、436、440および443からなる群から選択される1つまたは複数の位置に修飾(たとえば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失)を含む、Fc変異体を提供する。任意に、Fc領域は、当業者に公知の追加および/または代わりの位置に修飾を含んでよい(たとえば、米国特許第5,624,821号明細書;同第6,277,375号明細書;同第6,737,056号明細書;同第7,083,784号明細書;同第7,317,091号明細書;同第7,217,797号明細書;同第7,276,585号明細書;同第7,355,008号明細書;米国特許出願公開第2002/0147311号明細書;同第2004/0002587号明細書;同第2005/0215768号明細書;同第2007/0135620号明細書;同第2007/0224188号明細書;同第2008/0089892号明細書;国際公開第94/29351号パンフレット;および国際公開第99/58572号パンフレットを参照されたい)。さらに、有用なアミノ酸位置および具体的な置換については、米国特許第6,737,056号明細書の表2および6〜10;米国特許出願公開第2006/024298号明細書の図41に示される表;米国特許出願公開第2006/235208号明細書の図5、12および15に示される表;米国特許出願公開第2006/0173170号明細書の図8、9および10に示される表および国際公開第09/058492号パンフレットの図8〜10、13および14に示される表に例示されている。
特定の態様では、本開示は、Fc領域がKabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた221K、221Y、225E、225K、225W、228P、234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235E、235F、236E、237L、237M、237P、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R。243W、243L 243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、250E、250Q、251F、252L、252Y、254S、254T、255L、256E、256F、256M、257C、257M、257N、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265A、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、296G、297S、297D、297E、298A、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、308F313F、316D、318A、318S、320A、320S、322A、322S、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、326A、326D、326E、326G、326M、326V、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、331I、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、333A、333D、333G、333Q、333S、333V、334A、334E、334H、334L、334M、334Q、334V、334Y、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、428L、428F、433K、433L、434A、424F、434W、434Y、436H、440Yおよび443Wからなる群から選択される少なくとも1つの置換を含む、Fc変異体を提供する。任意に、Fc領域は、当業者に公知の追加および/または代わりのアミノ酸置換、以下に限定されるものではないが、米国特許第6,737,056号明細書の表2および6〜10;米国特許出願公開第2006/024298号明細書の図41に示される表;米国特許出願公開第2006/235208号明細書の図5、12および15に示される表;米国特許出願公開第2006/0173170号明細書の図8、9および10に示される表および国際公開第09/058492号パンフレットの図8、9および10に示される表に例示されているものを含んでもよい。
特定の態様では、本開示は、Fc領域がKabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた228、234、235および331からなる群から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの修飾(たとえば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失)を含む、Fc変異biMabを提供する。228位を図2Aの配列番号10に下線で示し、234位、235位および331位を図2Cの配列番号16に下線で示す。一態様では、修飾は、Kabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた228P、234F、235E、235F、235Yおよび331Sからなる群から選択される少なくとも1つの置換である。
別の特定の態様では、本開示は、Fc領域がIgG4のFc領域であり、Kabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた228および235からなる群から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの修飾を含む、Fc変異biMabを提供する。なお別の特定の態様では、Fc領域はIgG4のFc領域であり、非天然のアミノ酸は、Kabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた228P、235Eおよび235Yからなる群から選択される。
別の特定の態様では、本開示は、Fc領域がKabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた239、330および332からなる群から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの非天然のアミノ酸を含む、Fc変異biMabを提供する。239位、330位および332位を図2Cの配列番号16に太字および二重下線で示す。一態様では、修飾は、Kabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた239D、330L、330Yおよび332Eからなる群から選択された少なくとも1つの置換である。本明細書にその全体を援用する米国特許第7,317,091号明細書を参照されたい。
特定の態様では、本開示は、Fc領域がKabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた252、254および256からなる群から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの非天然のアミノ酸を含む、Fc変異biMabを提供する。252位、254位、256位を拡大して波下線で図2Cの配列番号16に示す。一態様では、修飾は、Kabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた252Y、254Tおよび256Eからなる群から選択される少なくとも1つの置換である。その全体を本明細書に援用する米国特許第7,083,784号明細書を参照されたい。
ある態様では、本開示は、Fc領域がKabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた428位に非天然のアミノ酸を含む、Fc変異biMabを提供する。一態様では、428位の修飾は、Kabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた428T、428L、428Fおよび428Sからなる群から選択される。その全体を本明細書に援用する米国特許第7,670,600号明細書を参照されたい。別の態様では、Fc変異biMabは、Kabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた434位に非天然のアミノ酸をさらに含んでもよい。一態様では、434位の修飾は、Kabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた434A、434Sおよび434Fからなる群から選択される。他の態様では、本開示は、Fc領域がKabatに記載されたEUインデックスにより番号付けされた428位および434位に非天然のアミノ酸を含む、Fc変異biMabを提供する。特定の態様では、Fc領域は428L、434Sを含む。米国特許第8,088,376号明細書を参照されたい。428位および434位を図2Cの配列番号18に太字および下線で示す。
ある態様では、IgG抗体により誘発されるエフェクター機能は、タンパク質のFc領域に結合した糖部分に強く依存する(Claudia Ferrara et al.,2006,Biotechnology and Bioengineering 93:851−861)。したがって、Fc領域にグリコシル化修飾を行ってエフェクター機能を増強または低下させることができる(たとえば、Umana et al,1999,Nat.Biotechnol 17:176−180;Davies et al.,2001,Biotechnol Bioeng 74:288−294;Shields et al,2002,J Biol Chem 277:26733−26740;Shinkawa et al.,2003,J Biol Chem 278:3466−3473;米国特許第6,602,684号明細書;同第6,946,292号明細書;同第7,064,191号明細書;同第7,214,775号明細書;同第7,393,683号明細書;同第7,425,446号明細書;同第7,504,256号明細書;米国特許出願公開第2003/0157108号明細書;同第2003/0003097号明細書;同第2009/0010921号明細書;POTELLIGENT(商標)技術(Biowa,Inc.Princeton,N.J.);GLYCOMAB(商標)グリコシル化工学技術(GLYCART biotechnology AG,Zurich,Switzerland)を参照)。したがって、一態様では、本開示のbiMabのFc領域はアミノ酸残基の変化したグリコシル化を含む。別の態様では、アミノ酸残基のグリコシル化を変化させた結果、エフェクター機能が低下する。別の態様では、アミノ酸残基のグリコシル化を変化させた結果、エフェクター機能が増強される。特定の態様では、Fc領域はフコシル化を抑制する。別の態様では、Fc領域を非フコシル化する(たとえば、米国特許出願公開第2005/0226867号明細書を参照)。一態様では、エフェクター機能、特にADCCを増強したこうしたbiMabを、親細胞により産生されるポリペプチドと比較して100倍を超えるADCCを有する、高度にフコースを除去したポリペプチドを産生するように操作された宿主細胞(たとえば、CHO細胞、コウキクサ(Lemna minor))に発現させる(Mori et al.,2004,Biotechnol Bioeng 88:901−908;Cox et al.,2006,Nat Biotechnol.,24:1591−7)。
IgG分子上のオリゴ糖にシアル酸を付加すると、その抗炎症活性を増強し、その細胞毒性を変化させることができる(Keneko et al.,Science,2006,313:670−673;Scallon et al.,Mol.Immuno.2007 Mar;44(7):1524−34)。上記の研究から、シアリル化を増加させたIgG分子は抗炎症性を有する一方、シアリル化を低下させたIgG分子は免疫賦活性を増強する(たとえば、ADCC活性を増強する)ことが立証される。したがって、biMabは、特定の用途に適切なシアリル化プロファイルで修飾してもよい(米国特許出願公開第2009/0004179号明細書および国際公開第2007/005786号パンフレット)。
一態様では、本開示のbiMabのFc領域は、天然のFc領域と比較して改変されたシアリル化プロファイルを含む。一態様では、本開示のbiMabのFc領域は、天然のFc領域と比較して増加したシアリル化プロファイルを含む。別の態様では、本開示のbiMabのFc領域は、天然のFc領域と比較して減少したシアリル化プロファイルを含む。
一態様では、本開示のFc変異体は、他の既知のFc変異体、たとえばGhetie et al.,1997,Nat Biotech.15:637−40;Duncan et al,1988,Nature 332:563−564;Lund et al.,1991,J.Immunol 147:2657−2662;Lund et al,1992,Mol Immunol 29:53−59;Alegre et al,1994,Transplantation 57:1537−1543;Hutchins et al.,1995,Proc Natl.Acad Sci U S A 92:11980−11984;Jefferis et al,1995,Immunol Lett.44:111−117;Lund et al.,1995,Faseb J 9:115−119;Jefferis et al,1996,Immunol Lett 54:101−104;Lund et al,1996,J Immunol 157:4963−4969;Armour et al.,1999,Eur J Immunol 29:2613−2624;Idusogie et al,2000,J Immunol 164:4178−4184;Reddy et al,2000,J Immunol 164:1925−1933;Xu et al.,2000,Cell Immunol 200:16−26;Idusogie et al,2001,J Immunol 166:2571−2575;Shields et al.,2001,J Biol Chem 276:6591−6604;Jefferis et al,2002,Immunol Lett 82:57−65;Presta et al.,2002,Biochem Soc Trans 30:487−490);米国特許第5,624,821号明細書;同第5,885,573号明細書;同第5,677,425号明細書;同第6,165,745号明細書;同第6,277,375号明細書;同第5,869,046号明細書;同第6,121,022号明細書;同第5,624,821号明細書;同第5,648,260号明細書;同第6,528,624号明細書;同第6,194,551号明細書;同第6,737,056号明細書;同第7,122,637号明細書;同第7,183,387号明細書;同第7,332,581号明細書;同第7,335,742号明細書;同第7,371,826号明細書;同第6,821,505号明細書;同第6,180,377号明細書;同第7,317,091号明細書;同第7,355,008号明細書;米国特許出願公開第2004/0002587号明細書;および国際公開第99/58572号パンフレットに開示されたものと組み合わせてもよい。Fcドメインの他の修飾および/または置換および/または付加および/または欠失も当業者に容易に明らかになるであろう。
天然のFcを含むbiMab型に示されたポリペプチドは、例に示すように、FcRnおよびC1qに結合してADCCを媒介する能力を保持している点に留意されたい。このためある態様では、biMabは、FcRnおよび/またはC1qおよび/または1つまたは複数のFcγ受容体(FcγR)に結合する能力を保持している。たとえば、ある態様では、biMabはbiMabが結合するエピトープの1つに結合する通常の抗体と比較して、FcRnおよび/またはC1qおよび/または1つまたは複数のFcγRに結合する能力を少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%保持する。ある態様では、biMabは1つまたは2つの通常の抗体の結合ドメインから作製され、これらの通常の抗体の一方または両方と活性の比較が行われる。
また、改変されたFc領域を使用して重鎖ヘテロ2量体を作製し、2つの異なる重鎖−軽鎖対を含むbiMabを得てもよい。ヘテロ2量体を形成しやすくするには、一対のFc領域間の境界面を操作して、組換え細胞培養から回収されるヘテロ2量体の割合を最大にする。ある態様では、境界面はCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1の抗体分子の境界面の1つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(たとえばチロシンまたはトリプトファン)で置換することにより「突起」が生じる。大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖(たとえばアラニンまたはトレオニン)で置換することにより、大きな側鎖と同一または類似の大きさの「空洞」が代償として第2の抗体分子の境界面に形成される。これが、ヘテロ2量体の収率をホモ2量体など他の望ましくない最終産物より高めるメカニズムとなる。CH3の修飾としては、たとえば、一方の重鎖のY407V/T366S/L368Aおよび他方の重鎖のT366W;一方の重鎖のS354C/T366Wおよび他方の重鎖のY349C/Y407V/T366S/L368Aが挙げられる。一方の鎖に突起を、そして他方の鎖に空洞を与える別の修飾については、米国特許第7,183,076号明細書;およびMerchant et al.,1998,Nat.Biotech 16:677−681に記載されている。ヘテロ2量体を形成するのに使用することができる他の修飾には、静電気的に一致するFc領域が共発現するとヘテロ2量化が起こるように、Fc2量体の境界面両端の電荷極性を変化させる修飾があるが、これに限定されるものではない。電荷極性を変化させる修飾には、下記表1に示したものがあるが、これに限定されるものではない(さらに国際公開第2007/147901号パンフレット;Gunasekaran et al.,2010,JBC 285:19637−46も参照されたい)。さらに、Davis et al.(2010,Prot.Eng.Design & Selection 23:195−202)は、ヒトIgGドメインおよびIgA CH3ドメインの誘導体である鎖交換操作ドメイン(SEED:strand−exchanged engineered domain)CH3領域を用いたヘテロ2量体のFcプラットフォームについて記載している(さらに、国際公開第2007/110205号パンフレットも参照されたい)。
3.グリコシル化
グリコシル化によりポリペプチドのエフェクター機能を変化させられるだけでなく、可変領域のグリコシル化修飾により、標的抗原に対する抗体(またはbiMab)の親和性も変化させることができる。一態様では、本biMabの可変領域のグリコシル化パターンを修飾する。たとえば、非グリコスル化biMabを作製してもよい(すなわち、biMabはグリコシル化を欠損している)。グリコシル化は、たとえば、標的抗原に対するbiMabの親和性を高めるように改変することができる。こうした糖鎖修飾は、たとえば、biMab配列内の1つまたは複数のグリコシル化部位を変化させることにより達成することができる。たとえば、1つまたは複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を除去し、それによりその部位のグリコシル化を除去する1つまたは複数のアミノ酸置換を行ってもよい。こうした非グリコシル化は、抗原に対するbiMabの親和性を高めることができる。こうしたアプローチについては、米国特許第5,714,350号明細書および同第6,350,861号明細書にさらに詳細に記載されている。また、Fc領域に存在するグリコシル化部位(たとえば、IgGのアスパラギン297)を除去する1つまたは複数のアミノ酸置換を行ってもよい。さらに、非グリコシル化biMabは、必要なグリコシル化機構を欠損する細菌細胞を用いて作製してもよい。
グリコシル化によりポリペプチドのエフェクター機能を変化させられるだけでなく、可変領域のグリコシル化修飾により、標的抗原に対する抗体(またはbiMab)の親和性も変化させることができる。一態様では、本biMabの可変領域のグリコシル化パターンを修飾する。たとえば、非グリコスル化biMabを作製してもよい(すなわち、biMabはグリコシル化を欠損している)。グリコシル化は、たとえば、標的抗原に対するbiMabの親和性を高めるように改変することができる。こうした糖鎖修飾は、たとえば、biMab配列内の1つまたは複数のグリコシル化部位を変化させることにより達成することができる。たとえば、1つまたは複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を除去し、それによりその部位のグリコシル化を除去する1つまたは複数のアミノ酸置換を行ってもよい。こうした非グリコシル化は、抗原に対するbiMabの親和性を高めることができる。こうしたアプローチについては、米国特許第5,714,350号明細書および同第6,350,861号明細書にさらに詳細に記載されている。また、Fc領域に存在するグリコシル化部位(たとえば、IgGのアスパラギン297)を除去する1つまたは複数のアミノ酸置換を行ってもよい。さらに、非グリコシル化biMabは、必要なグリコシル化機構を欠損する細菌細胞を用いて作製してもよい。
4. ポリペプチドリンカー
リンカーは、biMabキメラ重鎖のドメイン/領域を近接する分子に連結するのに使用することができる。上記のようにbiMabは、少なくとも2つのリンカーポリペプチドL1およびL2を含む。加えてbiMabは、別のリンカー、たとえばscFvの可変重鎖および軽鎖を相互に連結するフレキシブルリンカーを含んでもよい。さらにbiMabは、別のリンカー、たとえばscFvの可変重鎖および軽鎖を相互に連結するフレキシブルリンカーと、他の結合ユニットをbiMabコア構造に連結する他のリンカーとを含んでもよい。biMabコア構造に連結される追加の結合ユニットの例を図26〜28に示す。
リンカーは、biMabキメラ重鎖のドメイン/領域を近接する分子に連結するのに使用することができる。上記のようにbiMabは、少なくとも2つのリンカーポリペプチドL1およびL2を含む。加えてbiMabは、別のリンカー、たとえばscFvの可変重鎖および軽鎖を相互に連結するフレキシブルリンカーを含んでもよい。さらにbiMabは、別のリンカー、たとえばscFvの可変重鎖および軽鎖を相互に連結するフレキシブルリンカーと、他の結合ユニットをbiMabコア構造に連結する他のリンカーとを含んでもよい。biMabコア構造に連結される追加の結合ユニットの例を図26〜28に示す。
リンカーの例示的かつ非限定的な例として、少なくとも4つの残基を含むポリペプチド鎖がある。こうしたリンカーの一部は、フレキシブルであり、親水性であり、さらにそれ自体の二次構造(リンカー部分またはフレキシブルリンカー部分)をほとんどあるいはまったく有さなくてもよい。少なくとも4つのアミノ酸のリンカーは、分子が集合した後、近傍に位置するドメインおよび/または領域を相互に連結するのに使用してもよい。また、より長いリンカーを使用してもよい。このため、リンカーは約1残基、2残基、3残基、4残基、5残基、6残基、7残基、8残基、9残基、10残基、11残基、12残基、13残基、14残基、15残基、16残基、17残基、18残基、19残基、20残基、25残基、30残基、35残基、40残基、45残基、50残基でもよい。またリンカーは、たとえば、約100〜175残基であってもよい。分子の一部を相互に連結するため複数のリンカーを使用する場合、リンカーは同一でも、あるいは異なっていてもよい(たとえば、長さおよび/またはアミノ酸配列が同一または異なる)。
リンカーは、切断試薬により選択的に切断される少なくとも1つの結合を含む切断可能なリンカーであってもよい。切断可能なリンカーを使用して、リンカー配列の全部または一部を除去しやすくしてもよい。リンカーは、リンカーの内部またはリンカーの少なくとも1つの末端で切断が起こるように、プロテアーゼ切断部位を含むように操作してもよい。たとえば、リンカーの両側の2つの末端各々にトロンビン部位を操作してもよい。また、使用するリンカーの種類に応じて、TCEP、TFAおよびDTTなど薬により切断を媒介してもよい。リンカーは、切断試薬が切断産物からリンカー由来の残基をすべて除去するように設計してもよい。他の例示的かつ非限定的なリンカーとして、インビボ条件下で、たとえば、内在性酵素もしくは他の内在性因子の存在下で、あるいは、単に体内に存在する水性液体内または体内の細胞内で結合が選択的に切断され得るプロドラッグリンカーが挙げられる。biMabが2つ以上のポリペプチドリンカーを含む場合、リンカーは各々異なっていてもよいし、あるいは、リンカーの少なくとも1つが他と異なっていてもよい。いくつかの態様では、biMabは切断可能なリンカーを含む。特定の態様では、biMabは、VH2とVL2との間に切断可能なリンカーを含むscFvを含む。
リンカーは所望の構造の形成を容易にする。リンカーは(Gly−Ser)n残基を含み、溶解性を高めるため、Glu残基またはLys残基がある程度全体に分散していてもよい。その代わりにまたはそれに加えて、リンカーはセリン残基をまったく含んでおらず、こうしたリンカーは、リンカーがO−結合型グリコシ化を受ける場合に好ましいことがある。いくつかの態様では、たとえば、リンカーの2量体化を使用してbiMabのドメインをドメインが適切に折りたたまれた構造にする場合、リンカーは、システイン残基を含んでもよい。いくつかの態様では、biMabは、ポリペプチドのドメインを連結する少なくとも2つのポリペプチドリンカーを含む。他の態様では、biMabは少なくとも3つのポリペプチドリンカーを含む。他の態様では、biMabは4つ以上のポリペプチドリンカーを含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは1〜50残基、1〜25残基、25〜50残基または30〜50残基を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーはFc部分の一部を含む。たとえば、いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーはIgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体および/またはIgG4抗体の免疫グロブリンヒンジドメインの一部を含んでもよい。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーはIgG1、IgG2、IgG3および/またはIgG4の突然変異免疫グロブリンヒンジドメインの一部を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体および/またはIgG4抗体の免疫グロブリンヒンジ領域/ドメインの少なくとも5アミノ酸残基、7アミノ酸残基、8アミノ酸残基または15アミノ酸残基を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体および/またはIgG4抗体の修飾免疫グロブリンヒンジ領域/ドメインの少なくとも5アミノ酸残基、7アミノ酸残基、8アミノ酸残基または15アミノ酸残基を含む。
ポリペプチドリンカーは、3つのシステインを天然に含むヒンジ領域の全部または一部を含んでもよい。ある態様では、完全なおよび/または天然のヒンジ領域に対してシステイン残基の1つまたは2つのみが残るように、選択されたヒンジ領域を切断するか、あるいは他の方法で改変または置換する。同様に、ある種の他の態様では、ポリペプチドリンカーは、システイン残基の数がアミノ酸の置換または欠失により減少しているヒンジ領域の突然変異部分または他の方法で改変された部分を含んでもよく、たとえば突然変異ヒンジ領域または他の方法で改変されたヒンジ領域は、本明細書に記載するように0、1つまたは2つのシステイン残基を含む。
したがって、突然変異ヒンジドメインまたは他の方法で改変されたヒンジドメインは、1つまたは複数のシステイン残基を含む野生型免疫グロブリンヒンジドメインに由来しても、あるいは(それを用いて)構築してもよい。ある態様では、ヒンジ領域の突然変異部分または他の方法で改変された部分はシステイン残基を含まなくても、あるいはシステイン残基を1つのみ含んでもよく、突然変異ヒンジ領域または他の方法で改変されたヒンジ領域は、それぞれ1つ以上のシステイン残基または2つ以上のシステイン残基を含む、野生型免疫グロブリンヒンジ領域であるか、またはそれに由来している。ヒンジ領域の突然変異部分または他の方法で改変された部分では、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のシステイン残基は、好ましくは欠失している、またはジスルフィド結合を形成できないアミノ酸で置換されている。いくつかの態様では、ヒンジ領域の突然変異部分または他の方法で改変された部分は、4つのヒトIgGアイソタイプサブクラスIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のいずれを含んでもよいヒトIgG野生型ヒンジ領域であるか、またはそれに由来している。
いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、免疫グロブリン軽鎖とジスルフィド結合を形成するシステイン残基(EU残基220)を含むヒンジ領域の一部を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、EU残基C220にアミノ酸置換を含むヒンジ領域の改変された部分を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、アミノ酸置換C220Vを含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、ヒンジ関連の自発的自己切断を防止するアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、EU位置D221の位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーはアミノ酸置換D221Gを含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーはアミノ酸D221を欠損している。
いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーはgly−serリンカーを含むか、またはgly−serリンカーからなる。本明細書で使用する場合、「gly−serリンカー」という用語は、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドをいう。例示的gly−serリンカーは、式(Gly4Ser)nのアミノ酸配列を含み、式中、nは正の整数(たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10)である。好ましいgly−serリンカーは(Gly4Ser)2および(Gly4Ser)4である。別の例示的gly−serリンカーは(Gly4Ser)3である。なお他の態様では、ポリペプチドリンカーに2つ以上のgly−serリンカーを直列に組み込む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、ヒンジ領域(たとえば、IgG1分子、IgG2分子、IgG3分子またはIgG4分子に由来する)の少なくとも一部、および一連のgly−serアミノ酸残基(たとえば、(Gly4Ser)nなどのgly−serリンカー)を含む。
ある態様では、L1および/またはL2はヒンジ部分、およびリンカー部分、たとえばgly−serリンカーを含むリンカー部分の両方を含む。他の態様では、L1および/またはL2はヒンジ部分のみ、またはリンカー部分のみ、たとえばgly−serリンカーのみを含む。他の態様では、L1およびL2はgly−serリンカー部分を含む。ある態様では、L1およびL2のgly−serリンカー部分は同じ長さであるのに対し、他の態様では、L1およびL2のgly−serリンカー部分は異なる長さである。biMabがscFvを含む場合、scFvの重鎖および軽鎖はフレキシブルリンカーにより連結されていてもよい。このフレキシブルリンカーは一般にヒンジ部分を含まず、むしろgly−serリンカーまたは他のフレキシブルリンカーである。scFvのドメインを相互に連結するフレキシブルリンカーの長さおよびアミノ酸配列は、容易に選択して最適化することができる。
いくつかの態様では、ポリペプチドリンカー(特にL1および/またはL2)は、gly−serリンカーまたは全glyリンカー、およびヒンジドメインの一部または修飾部分を含む。いくつかの態様では、FabドメインをbiMabの結合ドメイン(BD;結合ユニット2)に連結するポリペプチドリンカー(L1)は、アミノ酸配列EPKSCDKTGGGGSGGGGS(配列番号63)またはEPKSCGKTGGGGSGGGGS(配列番号64)またはEPKSCGGGGSGGGGS(配列番号65)を含む。いくつかの態様では、結合ドメインおよび結合ドメインをbiMabのFcドメインに連結するポリペプチドリンカー(L2)は、アミノ酸配列GGGGSGGGGSEPKSVDKTHTCPPCP(配列番号67)またはGGGGSGGGGSCPPCP(配列番号69)またはGGGGSGGGGSDKTHTCPPCP(配列番号71)を含む。
結合ユニット1を結合ユニット2に、および結合ユニット2をFcに相互に連結するのに使用するポリペプチドリンカー(たとえば、L1およびL2)を問わず、biMabは任意に、追加のポリペプチドリンカーを含んでもよい。そうした追加のポリペプチドリンカーの長さおよび配列は独立に選択される。たとえば、biMabは、scFvの可変重鎖および軽鎖を相互に連結するフレキシブルなポリペプチドリンカーをさらに含んでもよい。このフレキシブルなポリペプチドリンカーはgly−serリンカーを含んでもよい。一般に、このリンカーはヒンジ部分を含まない。
5. biMabの特定の構造
本開示のbiMabは2つの重鎖−軽鎖対を含む。biMabキメラ重鎖のポリペプチド配列は、抗体重鎖可変ドメイン(VH1)を含むポリペプチド配列、抗体重鎖定常ドメイン1(CH1)を含むポリペプチド配列、第1のポリペプチドリンカー(L1)を含むポリペプチド配列、結合ドメイン(BD1)を含むポリペプチド配列、第2のポリペプチドリンカー(L2)を含むポリペプチド配列、およびFcドメインを含むポリペプチド配列を含んでもよい。いくつかの態様では、Fcドメインは、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。このため、biMabキメラ重鎖は、N末端からC末端に以下の配向:VH1−CH1−L1−BD−L2−CH2−CH3でポリペプチド配列を含んでもよい。biMab軽鎖のポリペプチド配列は、軽鎖可変ドメイン(VL1)および軽鎖定常ドメイン(CL)を含んでもよい。このため、biMab軽鎖は、N末端からC末端に以下の配向:VL1−CL1でポリペプチド配列を含んでもよい。VH1、VL1およびCL1は、第1のエピトープに結合する結合ユニット1の一部を示すのに使用される点に留意されたい。BDは、第2のエピトープに結合する結合ユニット2の一部を示すのに使用される。ある態様では、1つまたは複数の追加の結合ユニット(たとえば、scFv)がbiMabコアのN末端および/またはC末端に存在する。たとえば図26および27を参照されたい。他の態様では、1つまたは複数の追加の結合ユニット(たとえば、scFv)がヒンジ内に存在する。このため、biMab重鎖は伸長型コアを含み、N末端からC末端に以下の配向:VH1−CH1−L1−(BD)n−L2−CH2−CH3(n>1)でポリペプチド配列を有してもよい。伸長型コアを有する例示的biMabを図28に示す。
本開示のbiMabは2つの重鎖−軽鎖対を含む。biMabキメラ重鎖のポリペプチド配列は、抗体重鎖可変ドメイン(VH1)を含むポリペプチド配列、抗体重鎖定常ドメイン1(CH1)を含むポリペプチド配列、第1のポリペプチドリンカー(L1)を含むポリペプチド配列、結合ドメイン(BD1)を含むポリペプチド配列、第2のポリペプチドリンカー(L2)を含むポリペプチド配列、およびFcドメインを含むポリペプチド配列を含んでもよい。いくつかの態様では、Fcドメインは、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。このため、biMabキメラ重鎖は、N末端からC末端に以下の配向:VH1−CH1−L1−BD−L2−CH2−CH3でポリペプチド配列を含んでもよい。biMab軽鎖のポリペプチド配列は、軽鎖可変ドメイン(VL1)および軽鎖定常ドメイン(CL)を含んでもよい。このため、biMab軽鎖は、N末端からC末端に以下の配向:VL1−CL1でポリペプチド配列を含んでもよい。VH1、VL1およびCL1は、第1のエピトープに結合する結合ユニット1の一部を示すのに使用される点に留意されたい。BDは、第2のエピトープに結合する結合ユニット2の一部を示すのに使用される。ある態様では、1つまたは複数の追加の結合ユニット(たとえば、scFv)がbiMabコアのN末端および/またはC末端に存在する。たとえば図26および27を参照されたい。他の態様では、1つまたは複数の追加の結合ユニット(たとえば、scFv)がヒンジ内に存在する。このため、biMab重鎖は伸長型コアを含み、N末端からC末端に以下の配向:VH1−CH1−L1−(BD)n−L2−CH2−CH3(n>1)でポリペプチド配列を有してもよい。伸長型コアを有する例示的biMabを図28に示す。
結合ドメインがscFvである態様では、biMabキメラ重鎖は、抗体重鎖可変ドメイン(VH1)を含むポリペプチド配列、抗体重鎖定常ドメイン1(CH1)を含むポリペプチド配列、第1のポリペプチドリンカー(L1)を含むポリペプチド配列、抗体軽鎖可変ドメイン(VL2)を含むポリペプチド配列、フレキシブルリンカーを含むポリペプチド配列、抗体重鎖可変ドメイン(VH2)を含むポリペプチド配列、第2のポリペプチドリンカー(L2)を含むポリペプチド配列、および抗体Fcドメインを含むポリペプチド配列を含んでもよい。このため、BDとしてscFvを含むbiMabのキメラ重鎖は、N末端からC末端に以下の配向:VH1−CH1−L1−VL2−L3−VH2−L2−Fcでポリペプチド配列を含んでもよい。キメラ重鎖は、アミノ酸配列(たとえば、各ポリペプチドドメインのアミノ酸配列)を含むポリペプチド鎖である。あるいは、結合ドメインとしてscFvを含むbiMabのキメラ重鎖は、N末端からC末端に以下の配向:VH1−CH1−L1−VH2−L3−VL2−L2−Fcでポリペプチド配列を含んでもよい。キメラ重鎖は、アミノ酸配列(たとえば、各ポリペプチドドメインのアミノ酸配列)を含むポリペプチド鎖である。VH1、VL1およびCL1は結合ユニット1の一部を示すのに使用され、VH1およびVL1はその第1のエピトープに結合する部分を示す点に留意されたい。VH2およびVL2は、第2のエピトープに結合する結合ユニット2の一部を示すのに使用される。ある態様では、追加のscFv結合ドメインが、biMabコアを構成するポリペプチドのN末端および/またはC末端に存在する。たとえば図26〜27(結合ユニット3および/または4および/または5をさらに含むbiMabコアを図示する)を参照されたい。ある態様では、2つ以上のscFv結合ドメインがbiMabコア内に存在する。たとえば図28(結合ユニット2aおよび2bを含む伸長型biMabコアを図示する)を参照されたい。追加のscFvは各々、VH3、VH4、VH5で示す抗体重鎖可変領域、およびVL3、VL4、VL5で示す対応する抗体軽鎖可変領域を含む。
6. 標識、コンジュゲートおよび部分
本開示のbiMabは、診断および他のアッセイを目的として標識にコンジュゲートしてもよく、biMabおよび/またはそれが結合する標的を検出することができる。標識には、以下に限定されるものではないが、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、リン光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素および放射性同位元素がある。
本開示のbiMabは、診断および他のアッセイを目的として標識にコンジュゲートしてもよく、biMabおよび/またはそれが結合する標的を検出することができる。標識には、以下に限定されるものではないが、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、リン光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素および放射性同位元素がある。
ある態様では、biMabをフルオロフォアにコンジュゲートする。biMabに結合するフルオロフォアの選択により、コンジュゲートしたbiMabの吸収および蛍光発光特性が決定される。biMabおよびbiMab結合リガンドに使用することができるフルオロフォア標識の物理的性質には、スペクトル特性(吸収、発光およびストークスシフト)、蛍光強度、寿命、偏光および光退色速度またはこれらの組み合わせがあるが、これに限定されるものではない。これらの物理的性質はすべて、あるフルオロフォアを別のフルオロフォアと区別するのに使用することができ、したがって多重解析が可能になる。蛍光標識の他の望ましい特性として、たとえば細胞または生体(たとえば、生きている動物)においてbiMabの標識を行った場合の細胞透過性および低毒性を挙げることができる。
ある態様では、酵素が標識であり、biMabにコンジュゲートされる。酵素は、検出可能なシグナルの増幅を行い、アッセイ感度を高められるため望ましい標識である。酵素自体は検出可能な反応を起こさないが、適切な基質に接触すると基質を分解する働きをし、変質した基質が蛍光シグナル、比色シグナルまたは発光シグナルを発するようになる。標識試薬上の1つの酵素が複数の基質を検出可能なシグナルに変換できるため、酵素により検出可能なシグナルが増幅される。酵素基質は、測定可能な好ましい結果、たとえば比色、蛍光または化学発光が得られるように選択する。こうした基質は当該技術分野において広く使用され、当業者に公知であり、たとえば、オキシドレダクターゼ、たとえば西洋わさびペルオキシダーゼおよび基質、たとえば3,3’−ジアミノベンジジン(DAB);ホスファターゼ酵素、たとえば酸性ホスファターゼ、アルカリ性および基質、たとえば5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリルホスフェート(BCIP);グリコシダーゼ、たとえばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼまたはβ−グルコシダーゼおよび基質、たとえば5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルβ−D−ガラクトピラノシド(X−gal)が挙げられ、別の酵素として、加水分解酵素、たとえばコリンエステラーゼおよびペプチダーゼ、オキシダーゼ、たとえばグルコースオキシダーゼおよびシトクロムオキシダーゼ、ならびに好適な基質が公知であるレダクーゼが挙げられる。
酵素および化学発光を示すその適切な基質は、いくつかのアッセイに好適である。そうしたものとして、天然および組換え形態のルシフェラーゼおよびエクオリンがあるが、これに限定されるものではない。加えて、ホスファターゼ、グリコシダーゼおよびオキシダーゼの化学発光性基質、たとえば安定なジオキセタン、ルミノール、イソルミノールおよびアクリジニウムエステルを含むものも有用である。
また、別の態様では、ビオチンなどのハプテンを標識として利用してもよい。ビオチンは、酵素系で検出可能なシグナルをさらに増幅する働きをすることができ、さらに単離を目的としてアフィニティークロマトグラフィーに使用されるタグとしても機能できるため有用である。検出には、ビオチンに対して親和性を有する酵素コンジュゲート、たとえばアビジン−HRPを使用する。その後ペルオキシダーゼ基質を加えて検出可能なシグナルを発生させる。
ハプテンはさらに、ホルモン、天然および合成薬剤、汚染物質、アレルゲン、アフェクター分子、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、アミノ酸、ペプチド、化学中間体、ヌクレオチドおよび同種のものも含む。
ある態様では、標識として蛍光タンパク質をbiMabにコンジュゲートしてもよい。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質(GFP)およびフィコビリンタンパク質ならびにこれらの誘導体が挙げられる。蛍光タンパク質、特にフィコビリンタンパク質は、タンデム色素標識した標識試薬を作製するのに特に有用である。こうしたタンデム色素には、より大きなストークスシフトを得ることを目的とした蛍光タンパク質およびフルオロフォアがあり、発光スペクトルが蛍光タンパク質の吸収スペクトルの波長からさらにシフトする。
ある態様では、標識は放射性同位元素である。好適な放射性物質として、ヨウ素(121I、123I、125I、131I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(111In、112In、113mIn、115mIn、)、テクネチウム(99Tc、99mTc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(135Xe)、フッ素(18F)、153SM、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rhおよび97Ruがあるが、これに限定されるものではない。
いくつかの態様では、薬剤をbiMabにコンジュゲートしてもよい。たとえば、scFvを含むbiMabは、細胞傷害性薬物にコンジュゲートしてもよい。この例では、scFvが細胞表面上の標的抗原に結合することができ、その後細胞傷害性薬物が細胞に送達される。いくつかの態様では、biMabコンジュゲートは細胞内移行し、細胞傷害性薬物を細胞に放出する。当該技術分野において公知の任意の細胞傷害性薬物をbiMabにコンジュゲートしてもよい。抗体コンジュゲートの中にはFDAにより既に承認されているもの、あるいは現在臨床試験が行われているものもある。
ある特徴では、薬剤および他の分子は、部位特異的なコンジュゲーションによりbiMabを標的としてもよい。たとえば、biMabは、コンジュゲーション反応のための遊離チオール基が得られるシステイン操作ドメイン(結合ユニットおよび/またはFcドメインに導入されたシステインを含む)を含んでもよい。ある態様では、特異的なコンジュゲーション部位を含むようにbiMabを操作してもよい。図225は、薬剤コンジュゲーション用に修飾したbiMabを模式化したものである。いくつかの態様では、本開示は、Fc領域が、EUインデックスにより番号付けされた239位、282位、289位、297位、312位、324位、330位、335位,337位、339位、356位、359位、361位、383位、384位、398位、400位、440位、422位および442位の1つまたは複数にアミノ酸置換を含むFc変異biMabを提供する。いくつかの態様では、Fc領域は、以下の群:a)289位および440位;b)330位および440位;c)339位および440位;d)359位および440位;e)289位および359位;f)330位および359位;g)339位および359位;h)289位および339位;i)330位および339位;j)289位および330位;k)339位および442位;l)289位、339位および442位;m)289位、330位および339位;n)330位、339位および442位;ならびにo)289位、330位および442位の群の1つまたは複数に置換を含む。他の態様では、本開示は、FabアームのCH1ドメインが、EUインデックスにより番号付けされた131位、132位、134位、135位、136位および139位の1つまたは複数に置換を含むbiMabを提供する。一態様では、置換は、システイン、リジン、チロシン、ヒスチジン、セレノシステインおよびセレノメチオニンから選択されるアミノ酸の置換を含む。特定の態様では、置換はシステインである。安定なシステイン操作抗体を作製するための方法は、その内容全体を本明細書に援用する米国特許第7,855,275号明細書、米国特許出願公開第20110033378号明細書および国際公開第2011/005481号パンフレットに記載されている。
7. 例示的な標的
いくつかの態様では、特定の分子対がbiMabの標的となる(たとえば、結合ユニット1は標的の一方に結合し、結合ユニット2は他方の標的に結合する)。本開示のbiMabは、たとえば、IL−1αおよびIL−1β;IL−12およびIL−18;TNFαおよびIL−23;TNFαおよびIL−13;TNFおよびIL−18;TNFおよびIL−12;TNFおよびIL−1β;TNFおよびMIF;TNFおよびIL−17;ならびにTNFおよびIL−15;TNFおよびVEGF;VEGFRおよびEGFR;IL−13およびIL−9;IL−13およびIL−4;IL−13およびIL−5;IL−13およびIL−25;IL−13およびTARC;IL−13およびMDC;IL−13およびMIF;IL−13およびTGF−β;IL−13およびLHRアゴニスト;IL−13およびCL25;IL−13およびSPRR2a;IL−13およびSPRR2b;IL−13およびADAM8;TNFαおよびPGE4;IL−13およびPED2;TNFおよびPEG2から選択されるサイトカインの対に結合することができる。
いくつかの態様では、特定の分子対がbiMabの標的となる(たとえば、結合ユニット1は標的の一方に結合し、結合ユニット2は他方の標的に結合する)。本開示のbiMabは、たとえば、IL−1αおよびIL−1β;IL−12およびIL−18;TNFαおよびIL−23;TNFαおよびIL−13;TNFおよびIL−18;TNFおよびIL−12;TNFおよびIL−1β;TNFおよびMIF;TNFおよびIL−17;ならびにTNFおよびIL−15;TNFおよびVEGF;VEGFRおよびEGFR;IL−13およびIL−9;IL−13およびIL−4;IL−13およびIL−5;IL−13およびIL−25;IL−13およびTARC;IL−13およびMDC;IL−13およびMIF;IL−13およびTGF−β;IL−13およびLHRアゴニスト;IL−13およびCL25;IL−13およびSPRR2a;IL−13およびSPRR2b;IL−13およびADAM8;TNFαおよびPGE4;IL−13およびPED2;TNFおよびPEG2から選択されるサイトカインの対に結合することができる。
ある態様では、本開示のbiMabは、たとえば、CD138およびCD20;CD138およびCD40;CD19およびCD20;CD20およびCD3;CD38およびCD138;CD38およびCD20;CD38およびCD40;CD40およびCD20;CD−8およびIL−6;CSPGおよびRGM A;CTLA4およびBTNO2;IGF1およびIGF2;IGF1/2およびErbB2;IGFRおよびEGFR;ErbB2およびErbB3;ErbB2およびCD64;IL−12およびTWEAK;IL−13およびIL−1β;MAGおよびRGM A;NgRおよびRGM A;NogoAおよびRGM A;OMGpおよびRGM A;PDL−1およびCTLA4;RGM AおよびRGM B;Te38およびTNFα;TNFαおよびBlys;TNFαおよびCD−22;TNFαおよびCTLA−4;TNFαおよびGP130;TNFαおよびIL−12p40;およびTNFαおよびRANKリガンドから選択される標的の対に結合することができてもよい。
いくつかの態様では、本開示のbiMabは、たとえばBMP1、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1(M−CSF)、CSF2(GM−CSF)、CSF3(G−CSF)、EPO、FGF1(αFGF)、FGF2(βFGF)、FGF3(int−2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST−2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、INFα1、INFα2、INFα4、INFα5、INFα6、INFα7、INFβ1、INFγ、INFω1、FIL1、FIL1(EPSIRON)、FIL1(ZETA)、IL1α、IL1β、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、LTA(TNF−β)、LTB、TNF(TNF−α)、TNFSF4(OX40リガンド)、TNFSF5(CD40リガンド)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27リガンド)、TNFSF8(CD30リガンド)、TNFSF9(4−1BBリガンド)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM−L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、FIGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(レプチン)、PTN、およびTHPOの中から選択される1種、2種もしくはそれ以上のサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質およびサイトカイン受容体に結合することができてもよい。
さらなる態様では、本開示のbiMabは、たとえば、CCL1(I−309)、CCL2(MCP−1/MCAF)、CCL3(MIP−1a)、CCL4(MIP−1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP−3)、CCL8(mcp−2)、CCL11(エオタキシン)、CCL13(MCP−4)、CCL15(MIP−1d)、CCL16(HCC−4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP−3b)、CCL20(MIP−3a)、CCL21(SLC/exodus−2)、CCL22(MDC/STC−1)、CCL23(MPIF−1)、CCL24(MPIF−2/エオタキシン−2)、CCL25(TECK)、CCL26(エオタキシン−3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCL1(GRO1)、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA−78)、CXCL6(GCP−2)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP 10)、CXCL11(I−TAC)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYD1)、SCYE1、XCL1(リンホタクチン)、XCL2(SCM−1b)、BLR1(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp−1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR−L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR−L1)、CCR9(GPR−9−6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L−CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR−L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Ra)、IL8RB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HIF1A、IL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2およびVHLの中から選択される1種または複数種のケモカイン、ケモカイン受容体およびケモカイン関連タンパク質に結合することができてもよい。
さらなる態様では、本開示のbiMabは、たとえば、707−AP、ALK、AFP、AKAP−4、ANHYDRASE IX、ART−4、B7H3、BAGE、b−カテニン変異(b−catenin−mutated)、Bcr−abl、BORIS、CAMEL、CAP−1、CASP−8、CDC27変異(CDC27 mutated)、CDK4変異(CDK4 mutated)、CEA、CT、サイクリンB1(CYCLIN B1)、Cyp−B、CYP1B1、DAM−6/MAGE−B2、DAM−10/MAGE−B1、EGFRvIII、ELF2M、EPCAM、EPHA2、EPHA4、ERG、ETV6−AML1、FAP、FLUCOSYL、G250、GAGE、GD2、GD3、GLOBOH、GM1、GM3、GnT−V、Gp100、HAGE、HER2、HER3、HER4、HLA−A*0201−R170I、HPV−E6、HPV−E7、HSP70−2M、HST−2、HTERT、iCE、KIAA0205、LAGE、LCK、LDLR/FUT、LMP2、LUGUMAIN、MAD−CT1、MAD−CT2、MAGE、MAGE−A1、MAGE−A3、MART1、MC1R、MESOTHELIN、ML−IAP、MUC1、MUM−1、−2、−3、MYCN、NA17、NA88−A、NY−ESO−1、P15、p190 minor bcr−abl、P53、PAGE4、PAP、PAXS、PDGFR B、PLAC1、Pml/RARa、ポリシアル酸(POLYSIALIC ACID)、PR1、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、RAGE、RAS−ミュータント、RGS5、RHOC、RU1、RU2、SAGE、SART−1、SART−3、SSX2、STN、SURVIVIN、TEL/AML1、TIE2、TPI変異(TPI mutated)、TRP−1、TRP−2、TRP−2/INT2、VEGFR2、WT1およびXAGE1の中から選択される1種または複数種の癌抗原に結合することができてもよい。
他のbiMabは、たとえば、膜内在性タンパク質、たとえばイオンチャネル、イオンポンプ、Gタンパク質共役型受容体、構造タンパク質、接着タンパク質、たとえばインテグリン、トランスポーター、膜結合酵素、エネルギーの蓄積および伝達に関わるタンパク質および脂質アンカー型タンパク質、たとえばGタンパク質、ならびに一部の膜アンカー型キナーゼの中から選択される細胞表面タンパク質に結合することができてもよい。また、biMabは、酵素、たとえばキナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、脂肪酸シンテターゼ、消化酵素、たとえばペプシン、トリプシンおよびキモトリプシン、リゾチーム、ならびにポリメラーゼに結合することができてもよい。さらに、biMabは、受容体、たとえばホルモン受容体、リンホカイン受容体、モノカイン受容体、増殖因子受容体、Gタンパク質共役型受容体などに結合することができてもよい。
さらなる態様では、本開示のbiMabは、1つまたは複数の感染性因子(たとえば、細菌、ウイルス)に結合することができる。感染細菌には、グラム陰性菌およびグラム陽性菌があるが、これに限定されるものではない。グラム陽性菌には、パスツレラ属(Pasteurella species)、ブドウ球菌属(Staphylococci species)、およびストレプトコッカス属(Streptococcus species)があるが、これに限定されるものではない。グラム陰性菌には、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、シュードモナス属(Pseudomonas species)、およびサルモネラ属(Salmonella species)があるが、これに限定されるものではない。感染細菌の具体的な例としては、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pyloris)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、レジオネラ・ニューモフィリア(Legionella pneumophilia)、マイコバクテリア属(Mycobacteria sps)(たとえば、M.ツベルクローシス(M.tuberculosis)、M.アビウム(M.avium)、M.イントラセルラーレ(M.intracellulare)、M.カンサシ(M.kansasii)、M.ゴルドナエ(M.gordonae))、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)(A群ストレプトコッカス(Group A Streptococcus))、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)(B群ストレプトコッカス(Group B Streptococcus))、ストレプトコッカス(Streptococcus)(ビリダンス群)、ストレプトコッカス・フェカリス(Streptococcus faecalis)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス(Streptococcus)(嫌気性種)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、病原性カンピロバクター・エスピー(Campylobacter sp.)、エンテロコッカス・エスピー(Enterococcus sp.)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)、コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・エスピー(Corynebacterium sp.)、エリシペロスリクス・ルシオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasturella multocida)、バクテロイデス・エスピー(Bacteroides sp.)、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、ストレプトバチルス・モニリフォルミス(Streptobacillus moniliformis)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、トレポネーマ・ペルテニュ(Treponema pertenue)、レプトスピラ(Leptospira)、リケッチア(Rickettsia)およびアクチノマイセス・イスラエリ(Actinomyces israelli)があるが、これに限定されるものではない。ウイルスには、エンテロウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、肝炎ウイルスがあるが、これに限定されるものではない。ヒトで見出された具体的なウイルスの例には、レトロウイルス科(Retroviridae)(たとえば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV);ピコルナウイルス科(Picornaviridae)(たとえば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス;エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス);カリシウイルス科(Calciviridae)(たとえば、胃腸炎を引き起こす菌株);トガウイルス科(Togaviridae)(たとえば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス);フラビウイルス科(Flaviviridae)(たとえば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス);コロナウイルス科(Coronaviridae)(たとえば、コロナウイルス);ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)(たとえば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス);フィロウイルス科(Filoviridae)(たとえば、エボラウイルス);パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)(たとえば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス);オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)(たとえば、インフルエンザウイルス);ブンガウイルス科(Bungaviridae)(たとえば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス);アレナウイルス科(Arenaviridae)(出血熱ウイルス);レオウイルス科(Reoviridae)(たとえば、レオウイルス、オルビビウルスおよびロタウイルス);ビルナウイルス科(Birnaviridae);ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)(B型肝炎ウイルス);パルボウイルス科(Parvoviridae)(パルボウイルス);パポバウイルス科(Papovaviridae)(パピローマウイルス、ポリオーマウイルス);アデノウイルス科(大部分のアデノウイルス);ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)(単純ヘルペスウイルス(HSV)1および2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV));ポックスウイルス科(Poxviridae)(痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス);イリドウイルス科(Iridoviridae)(たとえば、アフリカ豚コレラウイルス);および未分類ウイルス(たとえば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の病原体、非A非B型肝炎の病原体;ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス)があるが、これに限定されるものではない。
ある態様では、本開示のbiMabは同じ標的上の2つの異なるエピトープに結合する(たとえば、結合ユニット1は標的上の第1のエピトープに結合し、結合ユニット2は同じ標的上の第2のエピトープに結合する)。
ある態様では、本開示のbiMabはEGFRおよびIGFR1に結合する。ある態様では、結合ユニット1はEGFRに結合し、結合ユニット2はIGFR1に結合する。他の態様では、結合ユニット1はIGFR1に結合し、結合ユニット2はEGFRに結合する。他の態様では、本開示のbiMabはVEGFおよびAng2に結合する。ある態様では、結合ユニット1はVEGFに結合し、結合ユニット2はAng2に結合する。他の態様では、結合ユニット1はAng2に結合し、結合ユニット2はVEGFに結合する。
いくつかの態様では、本開示のbiMabが多量体であることにより、標識または療法剤が特定の細胞型または分子の標的を標的とすることができる。たとえば、biMabの1つの機能ドメインが細胞表面の標的に結合し、同時に同じbiMabの別の機能ドメインが検出に有用なハプテンまたは標識剤に結合することができる。同様に、1つの機能ドメインが細胞標的に結合し、同時に第2の機能ドメインがトキシンに結合することができる。両方の結合反応が単一の分子により媒介されるため、トキシンが細胞傷害機能に影響を及ぼす細胞標的の近傍にトキシンを配置することができる。
B.biMabをコードする核酸分子
本開示は、biMabをコードする核酸分子を提供する。本開示の一態様は、本開示のbiMabのいずれかをコードする核酸分子を提供する。核酸分子は、biMabの重鎖および/または軽鎖をコードしてもよい。
本開示は、biMabをコードする核酸分子を提供する。本開示の一態様は、本開示のbiMabのいずれかをコードする核酸分子を提供する。核酸分子は、biMabの重鎖および/または軽鎖をコードしてもよい。
いくつかの態様では、biMabの重鎖をコードする核酸分子は、VH1ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分;CH1ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分;第2のエピトープに結合する結合ドメイン(BD)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分;Fcドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分を含む連続する核酸分子であり、核酸分子は、ポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸部分をさらに含む。いくつかの態様では、CH1ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分は、第1のポリペプチドリンカー(L1)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分を介して、結合ドメイン(BD)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分に結合される。いくつかの態様では、結合ドメイン(BD)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分は、第2のポリペプチドリンカー(L2)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分を介して、Fc領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分に結合される。
いくつかの態様では、結合ドメイン(BD)はscFvであり、scFvをコードする核酸部分は、VL2ドメインをコードするヌクレオチド配列およびVH2をコードするヌクレオチド配列を含み、VL2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、フレキシブルなポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列を介して、VH2ドメインをコードするヌクレオチド配列に結合される。
いくつかの態様では、biMabの重鎖をコードする連続する核酸分子は、VH1ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分の5’末端に結合した結合ユニットをコードする核酸部分および/またはFc領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分の3’末端に結合した結合ユニットをコードする核酸部分をさらに含む。ある態様では、結合ユニットをコードする核酸部分は、ポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分を介して、VH1ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分に結合される。他のある種の態様では、Fc領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分は、ポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分を介して、結合ユニットをコードする核酸部分に結合される。
いくつかの態様では、核酸分子はbiMabの軽鎖をコードする。biMabの軽鎖をコードする核酸は、VL1ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分、およびCLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分を含んでもよい。
いくつかの態様では、biMabの軽鎖をコードする核酸分子は、VL1ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分の5’末端に結合した結合ユニットをコードする核酸部分および/またはCLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分の3’末端に結合した結合ユニットをコードする核酸部分をさらに含む。ある態様では、結合ユニットをコードする核酸部分は、ポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分を介して、VL1ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分に結合される。他のある種の態様では、CLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分は、ポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸部分を介して、結合ユニットをコードする核酸部分に結合される。本開示の別の態様は、本明細書に記載するような核酸分子を含むベクターであって、本明細書に記載するようなbiMabをコードするベクターを提供する。
さらなる態様は、本明細書に記載するような核酸分子のいずれかで形質転換された宿主細胞を提供する。本開示の別の態様では、本明細書に記載するような核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。一態様では、宿主細胞は2つ以上のベクターを含んでもよい。
本開示は、本開示の任意のbiMabのほか、biMabの軽鎖あるいはキメラ重鎖をコードする核酸分子を意図している。たとえば、本開示は、biMab軽鎖をコードするヌクレオチド配列(たとえば、第1のエピトープに結合する結合ユニット1、たとえばFabのVL1+CL)および/またはbiMabキメラ重鎖をコードするヌクレオチド配列(たとえば、VH1+CH1+L1+BD+L2+Fc)を含む核酸分子を意図している。本開示はさらに、追加の結合ユニットをさらに含む本開示の任意のbiMabをコードする核酸分子を意図している。たとえば、追加の結合ユニットをさらに含むbiMab軽鎖をコードするヌクレオチド配列(たとえば、結合ユニット2+結合ユニット1のVL1+CL)および/または追加の結合ユニットをさらに含むbiMabキメラ重鎖をコードするヌクレオチド配列(たとえば、結合ユニット4+VH1+CH1+L1+BD+L2+Fc)を含む核酸分子。
C.biMabを作製するための方法
本開示は、biMabを作製するための方法を提供する。ある態様では、組換え核酸を発現コンストラクトの1つまたは複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結してもよい。biMabの軽鎖およびキメラ重鎖をコードする核酸配列は、任意の配向(たとえば、軽鎖が重鎖の前またはその逆)で同じ発現ベクターにクローニングしてもよいし、あるいは2つの異なるベクターにクローニングしてもよい。1つのベクターを用いて発現を行う場合、2つのコーディング遺伝子は、それ自体の遺伝子エレメント(たとえば、プロモーター、RBS、リーダー、停止、ポリAなど)を有していてもよいし、あるいは1セットの遺伝子エレメントでクローニングしてもよいが、シストロンエレメントに連結する。調節ヌクレオチド配列は一般に、発現に使用される宿主細胞に適切なものとする。種々の宿主細胞に適切な発現ベクターおよび好適な調節配列の多くの種類が当該技術分野において公知である。典型的には、前記1つまたは複数の調節ヌクレオチド配列として、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始配列および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を挙げることができるが、これに限定されるものではない。本開示は、当該技術分野において公知の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを意図している。プロモーターは、天然プロモーターでも、あるいは2つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターでもよい。発現コンストラクトは細胞のエピソーム、たとえばプラスミド上に存在してもよいし、あるいは発現コンストラクトを染色体に挿入してもよい。
本開示は、biMabを作製するための方法を提供する。ある態様では、組換え核酸を発現コンストラクトの1つまたは複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結してもよい。biMabの軽鎖およびキメラ重鎖をコードする核酸配列は、任意の配向(たとえば、軽鎖が重鎖の前またはその逆)で同じ発現ベクターにクローニングしてもよいし、あるいは2つの異なるベクターにクローニングしてもよい。1つのベクターを用いて発現を行う場合、2つのコーディング遺伝子は、それ自体の遺伝子エレメント(たとえば、プロモーター、RBS、リーダー、停止、ポリAなど)を有していてもよいし、あるいは1セットの遺伝子エレメントでクローニングしてもよいが、シストロンエレメントに連結する。調節ヌクレオチド配列は一般に、発現に使用される宿主細胞に適切なものとする。種々の宿主細胞に適切な発現ベクターおよび好適な調節配列の多くの種類が当該技術分野において公知である。典型的には、前記1つまたは複数の調節ヌクレオチド配列として、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始配列および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を挙げることができるが、これに限定されるものではない。本開示は、当該技術分野において公知の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを意図している。プロモーターは、天然プロモーターでも、あるいは2つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターでもよい。発現コンストラクトは細胞のエピソーム、たとえばプラスミド上に存在してもよいし、あるいは発現コンストラクトを染色体に挿入してもよい。
ある態様では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は当該技術分野において周知であり、使用する宿主細胞によって異なる。ある態様では、本開示は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも1つの調節配列に作動可能に連結された発現ベクターに関する。調節配列は当該技術分野で知られており、コードされたポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的かつ非限定的な調節配列については、Goeddel;Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Academic Press,San Diego,CA(1990)に記載される。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および/または発現が望まれるタンパク質の種類のような要因によって異なることがあることを理解すべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、およびベクターによりコードされた他の任意のタンパク質、たとえば抗生物質マーカーの発現も考慮すべきである。
本開示はさらに本開示のbiMabを作製する方法に関する。たとえば、biMabをコードする1つまたは2つ以上の発現ベクター(たとえば、キメラ重鎖および軽鎖をコードする単一のベクター、またはキメラ重鎖をコードするベクターと軽鎖をコードするベクターとの2つのベクター)をトランスフェクトした宿主細胞を適切な条件下で培養してポリペプチドの発現が起こるようにしてもよい。biMabを分泌させ、ポリペプチドを含む細胞と培地との混合物から単離してもよい。あるいは、biMabを細胞質または膜画分に保持し、細胞を採取、溶解してタンパク質を単離してもよい。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に好適な培地は当該技術分野において周知である。タンパク質を精製するには、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動およびイムノアフィニティ精製などの当該技術分野において公知の技術を用いてbiMabを細胞培養培地、宿主細胞または両方から単離してもよい。ある態様では、biMabは、その精製を容易にするドメインを含む融合タンパク質として作製する。
クローン化遺伝子またはその一部を、原核細胞、真核細胞(酵母、トリ、昆虫または哺乳動物)あるいは両方の発現に好適なベクターにライゲートして組換え核酸を作製してもよい。組換えポリペプチドを産生する発現媒体には、プラスミドおよび他のベクターがある。たとえば、好適なベクターとして、原核細胞、たとえばE.コリ(E.coli)での発現用の下記の種類のプラスミド:pBR322由来のプラスミド、pEMBL由来のプラスミド、pEX由来のプラスミド、pBTac由来のプラスミドおよびpUC由来のプラスミドが挙げられる。ある態様では、哺乳動物発現ベクターは、細菌においてベクターを伝播しやすくする原核生物配列および真核細胞に発現する1つまたは複数の真核生物転写ユニットの両方を含む。pcDNAI/amp由来、pcDNAI/neo由来、pRc/CMV由来、pSV2gpt由来、pSV2neo由来、pSV2−dhfr由来、pTk2由来、pRSVneo由来、pMSG由来、pSVT7由来、pko−neo由来およびpHyg由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、細菌プラスミド、たとえばpBR322由来の配列で修飾して、原核生物細胞および真核細胞の両方において複製および薬剤耐性選択を行いやすくする。あるいは、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現には、ウイルス、たとえばウシパピローマウイルス(BPV−1)またはエプスタインバーウイルス(pHEBo、pREP由来およびp205)の誘導体を使用してもよい。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換に使用される様々な方法は、当該技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞の両方に好適な他の発現系のほか、一般的な組換え手順については、Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.,ed.by Sambrook,Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)Chapters 16 and 17を参照されたい。場合によっては、組換えポリペプチドを、バキュロウイルス発現系の使用により発現させると望ましい場合がある。そうしたバキュロウイルス発現系の例として、pVL由来のベクター(pVL1392、pVL1393およびpVL941など)、pAcUW由来のベクター(pAcUW1など)、およびpBlueBac由来のベクター(β−galを含むpBlueBac III)が挙げられる。
融合遺伝子を作製するための技術はよく知られている。基本的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々な核酸フラグメントの連結は、ライゲーションのための平滑末端または付着末端、適切な末端を与える制限酵素消化、必要に応じて付着末端の平滑化、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを利用して従来の技術により行われる。別の態様では、融合遺伝子は、自動DNA合成装置を含む従来の技術により合成してもよい。あるいは、アンカープライマーを用いて遺伝子フラグメントのPCR増幅を行ってもよく、2つの連続した核酸フラグメント間に相補的オーバーハングを形成し、その後これをアニールしてキメラ遺伝子配列を得てもよい(たとえば、Current Protocols in Molecular Biology,eds.Ausubel et al.,John Wiley & Sons:1992を参照されたい)。
いくつかの態様では、上述の核酸のいずれかを発現する発現ベクターを使用して宿主細胞にbiMab発現させてもよい。たとえば、biMabは、細菌細胞、たとえばE.コリ(E.coli)、昆虫細胞(たとえば、バキュロウイルス発現系を使用)、酵母または哺乳動物細胞に発現させてもよい。他の好適な宿主細胞も当業者に知られている。
従来の技術により発現ベクターを宿主細胞に導入したら、次いで従来の技術によりトランスフェクト細胞を培養して抗体を産生させる。このため、本開示は、biMabまたはそのフラグメントをコードし、異種プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。ある態様では、全biMabの発現のため、キメラ重鎖および軽鎖の両方を宿主細胞に(同一または異なるベクターから)共発現させてもよい。ある態様では、biMabの重鎖および軽鎖の両方を単一のプロモーターから発現させる。ある態様では、biMabの重鎖および軽鎖を複数のプロモーターから発現させる。ある態様では、biMabの重鎖および軽鎖は単一のベクターにコードされる。ある態様では、biMabの重鎖および軽鎖は複数のベクターのベクターにコードされる。
組換え抗体の発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該技術分野において周知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から入手できる多くの不死化細胞株、以下に限定されるものではないが、チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(たとえば、Hep G2)、ヒト腎臓上皮293細胞、およびいくつかの他の細胞株がある。各宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系を選択すれば、発現される抗体またはその一部の正しい修飾およびプロセシングを確実なものにすることができる。この目的のため、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用してもよい。こうした哺乳動物宿主細胞としては、CHO細胞、VERY細胞、BHK細胞、Hela細胞、COS細胞、MDCK細胞、293細胞、3T3細胞、W138細胞、BT483細胞、Hs578T細胞、HTB2細胞、BT2O細胞およびT47D細胞、NS0細胞(機能的免疫グロブリン鎖を内因性にまったく産生しないマウス骨髄腫細胞株)、SP20細胞、CRL7O3O細胞およびHsS78Bst細胞があるが、これに限定されるものではない。一態様では、ヒトリンパ球の不死化により開発されたヒト細胞株を使用して組換え技術によりモノクローナル抗体を産生させてもよい。一態様では、ヒト細胞株PER.C6.(Crucell,Netherlands)を使用して組換え技術によりモノクローナル抗体を産生してもよい。
組換え抗体の発現用の宿主として使用してもよい別の細胞株には、昆虫細胞(たとえばSf21/Sf9、トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)Bti−Tn5b1−4)または酵母細胞(たとえばS.セレビシエ(S.cerevisiae)、ピキア(Pichia)、米国特許第7,326,681号明細書;など)、植物細胞(米国特許出願公開第20080066200号明細書);およびニワトリ細胞(国際公開第2008142124号パンフレット)があるが、これに限定されるものではない。
ある態様では、本開示のbiMabは細胞株に安定発現させる。安定発現は、組換えタンパク質を長期間高い収率で産生するために使用してもよい。たとえば、抗体分子を安定発現する細胞株を作製してもよい。発現制御エレメント(たとえば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)および選択可能なマーカー遺伝子を含む適切に設計されたベクターで宿主細胞を形質転換してもよい。外来DNAの導入後、細胞を濃縮培地で1〜2日間増殖させてから、選択培地に切り換えてもよい。組換えプラスミドの選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、染色体にプラスミドを安定に組み込んだ細胞を増殖させて細胞増殖巣を形成させ、次にこれをクローニングにし、細胞株として増殖させてもよい。高収率で安定な細胞株を作製するための方法は当該技術分野において周知であり、試薬は一般に市販されている。
ある態様では、本開示のbiMabを細胞株に一過性に発現させる。一過性トランスフェクションは、細胞に導入された核酸がその細胞のゲノムまたは染色体DNAに組み込まれないプロセスである。実際、核酸は細胞内に染色体外エレメント、たとえばエピソームとして維持される。エピソームの核酸の転写プロセスは影響を受けず、エピソームの核酸によりコードされたタンパク質が産生される。
細胞株は、安定なトランスフェクションあるいは一過性トランスフェクションを問わず、モノクローナル抗体の発現および産生につながる当該技術分野において周知の細胞培養培地及び条件で維持される。ある態様では、哺乳動物細胞培養培地は、たとえば、DMEMまたはHam’s F12を含む市販されている培地(media formulation)に基づく。他の態様では、細胞増殖および生物学的タンパク質発現の両方の増加を支援するように細胞培養培地を改変する。本明細書で使用する場合、「細胞培養培地」、「培養培地」および「培地(medium formulation)」という用語は、多細胞生物または組織の外側の人工的なインビトロ環境で細胞を維持、成長、伝播または増殖するための栄養液をいう。細胞培養培地は、たとえば、細胞増殖を促進するように処方された細胞培養増殖培地、または組換えタンパク質の産生を促進するように処方された細胞培養産生培地を含む特定の細胞培養用途に最適化してもよい。栄養素、成分および要素という用語は、本明細書において同義で使われ、細胞培養培地を構成する成分をいう。
分子が産生されたら、分子を免疫グロブリン分子または他の多量体分子を精製するための当該技術分野において公知の任意の方法により、たとえば、クロマトグラフィー(たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー(特に特異的な抗原プロテインAまたはプロテインGに対する親和性による)およびサイズカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製ための他の任意の標準的技術により精製してもよい。さらに、本開示の分子またはそのフラグメントは、上述あるいはそれ以外の当該技術分野において公知の異種ポリペプチド配列(本明細書で「タグ」という)と融合して精製しやすくしてもよい。
組換え技術を用いる場合、分子は、細胞内のペリプラズムに産生させても、あるいは培地に直接分泌させてもよい。分子を細胞内に産生させる場合、第1のステップとして、たとえば、遠心分離または限外濾過により、宿主細胞または溶解フラグメントを問わず、微粒子状の破片を除去する。Carter et al.,Bio/Technology,10:163−167(1992)には、E.コリ(E.coli)のペリプラズムに分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。分子を培地に分泌させる場合、市販されているタンパク質濃縮フィルター、たとえば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過装置を用いて、そうした発現系の上清を最初に濃縮するのが一般的である。プロテアーゼ阻害剤、たとえばPMSFを前述のステップのいずれかに含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来汚染物質の増殖を防止してもよい。
細胞から調製された組成物は、たとえば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析および/またはアフィニティークロマトグラフィーを単独あるいは他の精製ステップと組み合わせて精製してもよい。プロテインAの親和性リガンドとしての適合性は、分子に任意の免疫グロブリンFcドメインが存在する場合、その種およびアイソタイプに依存し、その適合性は当業者に理解されるであろう。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用できる。機械的に安定なマトリックス、たとえばコントロールドポアガラスまたはポリ(スチレンジビニル)ベンゼンを用いると、アガロースで達成できるよりも流速を速くし処理時間を短縮することができる。回収される分子に応じてタンパク質精製の他の技術、たとえばイオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂(ポリアスパラギン酸カラムなど)を用いたセファロースクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS−PAGEおよび硫酸アンモニウム沈殿も利用することができる。
任意の予備精製ステップ後、目的の分子および汚染物質を含む混合物は、pH約2.5〜4.5の溶出緩衝液を用いて低pH疎水性相互作用クロマトグラフィーに付し、低塩濃度(たとえば、約0〜0.25M塩)で行ってもよい。
biMabは、たとえば、上記および/または実施例に記載の技術の任意の1つまたは組み合わせを用いて作製および精製してもよい。あくまで例示であるが、biMabは、PBS 1×で平衡化したHiTrap rProteinA FFカラムを用いて標準的プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより親和性精製してもよい。biMabをカラムに充填すればよく、これを洗浄して汚染物質および非結合材料を除去することができる。洗浄はPBS 1×で、A280の記録がベースラインに達するまで行ってもよい。その後結合タンパク質を25mMのグリシンpH2.8で溶出すればよい。画分は、0.1倍量の1Mのトリス−HCl緩衝液pH8の添加により直ちに中和してもよい。次いで画分をbiMab含有量についてA280の吸光度を読み取ることで解析することができる。biMabを含む各画分はまとめてプールして、10,000キロダルトン(kDa)のカットオフ透析膜を使用して4℃、10倍量のPBS 1×で一晩透析してもよい。次いで透析したbiMabは、0.22ミクロンのフィルターを使用して濾過し、還元および非還元SDS−PAGE、たとえば4〜12%Nupageゲル、MOPS泳動用緩衝液で解析してもよい。
プロテインA精製後、コンストラクトの分子量(MW、ダルトン)およびモノマー含有量を判定するため、biMabを分析用サイズ排除クロマトグラフィーで解析してもよい。100mMのリン酸ナトリウム、pH6.8を含む緩衝液を用い1ml/minの流量で、約10〜500kDaの範囲のMWを有する球状タンパク質を分離するTSK−GEL G3000SWXLカラム(Tosoh Bioscience LLC,Montgomeryville,PA)を使用してSEC−HPLCを行ってもよい。
どのようにbiMabを精製するかにかかわらず、本開示のbiMabの機能的結合を確認するため、結合アッセイ(精製の前および/または後)を行ってもよい。たとえば、二重ELISAアッセイを行ってもよい。いくつかの態様では、第1の抗原をウェルにコートし、この抗原に結合するとbiMabが固定化される。タグを付けた第2の抗原をウェルに加えて検出する。第1の抗原への結合により固定化され、かつ第2の抗原にも結合する二重特異性分子のみが検出される。
D. 医薬製剤
ある態様では、本開示は医薬組成物を提供する。こうした医薬組成物は、biMabをコードする核酸分子を含む組成物であってもよい。また、こうした医薬組成物は、biMabまたはbiMabの組み合わせと、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物であってもよい。ある態様では、本開示の医薬組成物は薬物として使用される。
ある態様では、本開示は医薬組成物を提供する。こうした医薬組成物は、biMabをコードする核酸分子を含む組成物であってもよい。また、こうした医薬組成物は、biMabまたはbiMabの組み合わせと、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物であってもよい。ある態様では、本開示の医薬組成物は薬物として使用される。
ある態様では、biMabまたはbiMabの組み合わせ(またはbiMabまたはbiMabの組み合わせをコードする核酸分子)を薬学的に許容されるキャリア、賦形剤または安定剤と共に医薬組成物として製剤化してもよい。ある態様では、こうした医薬組成物は、当該技術分野において公知の方法を用いて任意の1つまたは複数の投与経路を介してヒトまたは非ヒト動物に投与するのに好適である。当業者であれば理解するように、経路および/または投与モードは所望の結果によって異なる。「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、活性成分の生物活性の有効性を阻害しない1種または複数種の無毒性材料を意味する。こうした調製物は通常、塩、緩衝剤、防腐剤、相性のよいキャリアおよび任意に他の治療薬を含んでもよい。こうした薬学的に許容される調製物は、相性のよい固体もしくは液体充填剤、希釈液またはヒトへの投与に好適なカプセル化材料をさらに含んでもよい。本明細書に記載の製剤に利用してもよい他の意図しているキャリア、賦形剤および/または添加剤には、たとえば、着香剤、抗菌剤、甘味料、酸化防止剤、帯電防止剤、脂質、タンパク質賦形剤、たとえば血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン、塩形成対イオン、たとえばナトリウムおよび同種のものがある。これらおよび本明細書に記載の製剤に使用するのに好適な別の公知の薬学的キャリア、賦形剤および/または添加剤については、たとえば、「Remington:The Science & Practice of Pharmacy」、21st ed.,Lippincott Williams & Wilkins,(2005)、および「Physician’s Desk Reference」、60th ed.,Medical Economics,Montvale,N.J.(2005)に記載されているように当該技術分野において公知である。所望または要求される投与モード、溶解性および/または安定性に好適な薬学的に許容されるキャリアを選択すればよい。
本明細書に記載の製剤は、所望の投与に適切なw/vが得られる濃度で有効剤を含む。ある態様では、有効剤は、約1mg/ml〜約200mg/ml、約1mg/ml〜約100mg/ml、約1mg/ml〜約50mg/mlまたは約1mg/ml〜約25mg/mlの濃度で製剤に存在する。ある態様では、有効剤は約25mg/mlの濃度で存在する。ある態様では、製剤における有効剤の濃度は、約0.1〜約100重量%の範囲であってもよい。ある態様では、有効剤の濃度は、0.003〜1.0モルの範囲である。
一態様では、本開示の製剤は、エンドトキシンおよび/または関連する発熱性物質を実質的に含まないパイロジェンフリー製剤である。エンドトキシンには、微生物内部に閉じ込められており、微生物が破壊されるかまたは死んだときにのみ放出されるトキシンがある。発熱性物質には、細菌および他の微生物の外膜由来の、発熱を引き起こす耐熱性物質(糖タンパク質)がある。これらの物質はどちらも、ヒトに投与される場合、発熱、低血圧およびショックを引き起こす恐れがある。有害作用の可能性があるため、少量のエンドトキシンでも静脈内投与される医薬品溶液から除去しなければならない。食品医薬品局(「FDA」)は、静脈内薬剤投与の場合、1回につき体重1キログラム当たり1回1時間以内に5エンドトキシン単位(EU)の上限を設定している(The United States Pharmacopeial Convention,Pharmacopeial Forum 26(1):223(2000))。ある特定の態様では、組成物におけるエンドトキシンおよび発熱性物質のレベルは10EU/mg未満、または5EU/mg未満、または1EU/mg未満、または0.1EU/mg未満、または0.01EU/mg未満、または0.001EU/mg未満である。
本開示の製剤は、インビボ投与に使用する場合、無菌にすべきである。本開示の製剤は、無菌化濾過、放射線などを含む様々な滅菌方法により滅菌することができる。一態様では、滅菌済0.22ミクロンフィルターで製剤を濾過滅菌する。注射用無菌組成物は、「Remington:The Science & Practice of Pharmacy」、21st ed.,Lippincott Williams & Wilkins,(2005)に記載されているような従来の医療慣行に従い、製剤化してもよい。
本開示の治療用組成物は、経口投与、経鼻投与、経肺投与、局所(頬粘膜および舌下など)投与、直腸投与、経膣投与および/または非経口投与など特定の投与経路用に製剤化してもよい。「非経口投与」および「非経口投与する」という語句は、本明細書で使用する場合、経腸投与および局所投与以外の通常注射による投与モードをいい、以下に限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄膜内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内の注射および注入がある。局所投与または経皮投与に好適な本開示の製剤には、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液剤、パッチ剤および吸入剤がある。biMabは、滅菌条件下で薬学的に許容されるキャリア、および必要とされる場合がある任意の防腐剤、緩衝液または噴霧剤と混合してもよい(米国特許第7,378,110号明細書;同第7,258,873号明細書;同第7,135,180号明細書;米国特許出願公開第2004−0042972号明細書;および同第2004−0042971号明細書)。
製剤は、単位剤形で提供すると都合がよいことがあり、薬学の技術分野において公知の任意の方法により調製することができる。本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、個々の患者に毒性がなく、患者、組成物および投与モードに求められる治療反応を達成するのに効果的な活性成分の量(たとえば、「治療有効量」)を得られるように変化させてもよい。選択される投与量レベルは、利用する特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、利用している特定の化合物の***速度、処置の期間、他の薬剤、利用する特定の組成物と組み合わせて使用される化合物および/または材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態および既往歴、および医療技術分野でよく知られている同様の因子など種々の薬物動態学的因子によって異なる。好適な投与量は、約0.0001〜約100mg/kg体重以上、たとえば約0.1mg/kg体重、1mg/kg体重、10mg/kg体重または50mg/kg体重の範囲であってもよく、約1〜約10mg/kg体重が好適である。
本開示は同様に、診断および研究用途に好適な製剤を製造することも意図していることに留意されたい。こうした製剤の有効剤の濃度のほか、賦形剤および/または発熱性物質の有無は、個々の用途および使用目的に基づき選択することができる。
E. 使用
biMabは、本明細書に記載するように、疾患または障害に関連する標的に結合することで、標的の活性を除去または他の方法で阻害し、疾患または障害を処置する、および/または、その症状を軽減するために使用することができる。いくつかの態様では、本開示のbiMabは、被検体の血管新生、細胞増殖、細胞運動、細胞浸潤または細胞接着に関連する障害の処置を必要とする被検体に、疾患または障害の症状に関連する標的に結合する治療有効用量の本開示のbiMabを投与することにより、被検体の血管新生、細胞増殖、細胞運動、細胞浸潤または細胞接着に関連する障害を処置するために使用してもよい。たとえば、増殖因子および/または増殖因子受容体による異常なシグナル伝達は、望ましくない細胞増殖および癌の一因になることが示されている。したがって、biMabを使用して、増殖因子のシグナル伝達に関連する望ましくない細胞増殖および/または癌を処置してもよい。特に、増殖因子シグナル伝達経路のタンパク質を標的とするbiMabの投与により、腫瘍の腫瘍増殖曲線および/または腫瘍の体積を低下させることができる。同様の戦略を特定の癌または他のシグナル伝達分子に関連する望ましくない細胞増殖の例に使用してもよい。
biMabは、本明細書に記載するように、疾患または障害に関連する標的に結合することで、標的の活性を除去または他の方法で阻害し、疾患または障害を処置する、および/または、その症状を軽減するために使用することができる。いくつかの態様では、本開示のbiMabは、被検体の血管新生、細胞増殖、細胞運動、細胞浸潤または細胞接着に関連する障害の処置を必要とする被検体に、疾患または障害の症状に関連する標的に結合する治療有効用量の本開示のbiMabを投与することにより、被検体の血管新生、細胞増殖、細胞運動、細胞浸潤または細胞接着に関連する障害を処置するために使用してもよい。たとえば、増殖因子および/または増殖因子受容体による異常なシグナル伝達は、望ましくない細胞増殖および癌の一因になることが示されている。したがって、biMabを使用して、増殖因子のシグナル伝達に関連する望ましくない細胞増殖および/または癌を処置してもよい。特に、増殖因子シグナル伝達経路のタンパク質を標的とするbiMabの投与により、腫瘍の腫瘍増殖曲線および/または腫瘍の体積を低下させることができる。同様の戦略を特定の癌または他のシグナル伝達分子に関連する望ましくない細胞増殖の例に使用してもよい。
特異的biMabの例示的かつ非限定的な例として、EGFRおよびIGFRに結合する二重特異性を持つ二価分子がある。このbiMabを使用して、EGFおよびIGFシグナル伝達に関連する望ましくない細胞増殖および/または癌を処置してもよい。別の非限定的かつ例示的な特異的biMabとして、VEGFおよびAng2に結合する二重特異性を持つ二価の分子がある。このbiMabを使用して、VEGFおよびAng2シグナル伝達に関連する望ましくない細胞増殖および/または癌を処置してもよい。たとえば、biMabを使用して、腫瘍増殖を阻害する、および/または、存在している腫瘍の体積を減少させることができる。同様に、biMabを診断に使用して、細胞または腫瘍を検出またはモニターしてもよい。さらに、biMabを研究の場面で使用して、たとえば、野生型細胞および組織または病変細胞および組織の細胞増殖および生存率を研究してもよい。
他の態様では、本開示のbiMabを使用して、感染性因子、たとえばウイルス、細菌または寄生虫により引き起こされた疾患または障害を処置してもよい。biMabは、感染性因子上の1つまたは複数の生体分子標的に結合することで、その因子が宿主細胞に侵入および/または感染できなくなるように設計してもよい。あるいは、複数のbiMabが感染性因子に結合して、天然の免疫グロブリンのように免疫反応を誘発してもよい。最後に、biMabは、感染性因子により放出される標的分子が宿主細胞および組織に作用するのを防止するため、標的に結合させるのに使用してもよい。
さらに他の態様では、本開示のbiMabを使用して、抗原、たとえば花粉、植物、昆虫の体の一部および/もしくは分泌物、動物のフケ、堅果または自己抗原に対する免疫反応を調節してもよい。biMabは、これらの抗原に存在する生体分子標的、および/または、IgE、アナフィラトキシンまたはヒスタミンのようにこれらの標的に対して免疫反応を媒介する標的に結合するように操作してもよい。
本明細書に記載のものなど、本開示のbiMabはまた診断を目的として使用してもよい。たとえば、標的の発現の変化に関連する疾患または障害をスクリーニングするため、被検体の組織または細胞において1つまたは複数の標的生体分子を検出してもよい。診断キットは、標的分子に結合する1種または複数種のbiMab、およびbiMabと標的との反応がある場合にそれを知らせる検出系を含んでもよい。
本開示は、治療用途、診断用途および研究用途を含むbiMabの多くの用途を意図している。診断用途および研究用途はインビボでも、あるいはエキソビボでもよい。たとえば、特定のbiMabを使用して、細胞培養物、組織生検または動物もしくは動物モデルにおいて細胞または組織が特定の抗原を発現するかどうか、および抗体分子が2つの抗原に同時に結合することで検出が向上するかどうか、細胞生存または挙動が変化するか、および同種のものを明らかにしてもよい。さらに、biMabの活性を通常の抗体の活性と比較して、正常状態または疾患状態における複数の標的または複数のシグナル伝達経路の相互作用または役割を評価してもよい(たとえば、2つの標的の阻害を同時に行うと、各標的を別々に阻害するのと比較して細胞挙動に異なる影響を与える)。
F. キット
本開示の別の態様はキットである。一態様では、キットは、上述の核酸、ポリペプチド、発現ベクターまたは宿主細胞の組成物または医薬組成物のいずれか、および適切な使用または投与を指示する説明書またはラベルを含む。任意に、キットは、1つまたは複数の容器および/もしくはシリンジ、または送達もしくは使用を容易にする他の装置をさらに含んでもよい。本開示は、研究アッセイ、診断アッセイを行うための、および/または、治療有効量の投与を行うための要素の全サブセットまたは任意のサブセットがキットに入れられていてもよいことを意図している。同様に、キットは、たとえば本開示のbiMabをコードする核酸を好適な条件下で発現する宿主細胞を培養して、ポリペプチドを作製するための説明書を含んでもよい。別の例として、本開示のbiMabの治療投与用のキットは、biMabの医薬製剤を含む溶液またはbiMabの凍結乾燥調製物と、組成物の投与を必要とする患者に組成物を投与するための説明書および/または凍結乾燥物を再溶解するための説明書とを含んでもよい。
本開示の別の態様はキットである。一態様では、キットは、上述の核酸、ポリペプチド、発現ベクターまたは宿主細胞の組成物または医薬組成物のいずれか、および適切な使用または投与を指示する説明書またはラベルを含む。任意に、キットは、1つまたは複数の容器および/もしくはシリンジ、または送達もしくは使用を容易にする他の装置をさらに含んでもよい。本開示は、研究アッセイ、診断アッセイを行うための、および/または、治療有効量の投与を行うための要素の全サブセットまたは任意のサブセットがキットに入れられていてもよいことを意図している。同様に、キットは、たとえば本開示のbiMabをコードする核酸を好適な条件下で発現する宿主細胞を培養して、ポリペプチドを作製するための説明書を含んでもよい。別の例として、本開示のbiMabの治療投与用のキットは、biMabの医薬製剤を含む溶液またはbiMabの凍結乾燥調製物と、組成物の投与を必要とする患者に組成物を投与するための説明書および/または凍結乾燥物を再溶解するための説明書とを含んでもよい。
本開示はまた、パッケージ化され、ラベルが付けられた最終医薬製品を包含する。この製品は、適切な入れ物または容器、たとえばガラスバイアルまたは密封された他の容器に適切な単位剤形を含む。非経口投与に好適な剤形の場合、活性成分、たとえば、上述のbiMabは無菌であり、粒子を含まない溶液としての投与に好適である。ある態様では、製剤は静脈内投与、たとえばヒトまたは動物への点滴静注に好適である。
特定の態様では、本開示の製剤は滅菌液として単回投与バイアルに処方される。例示的容器には、バイアル、ビン、プレフィルドシリンジ、IVバッグ、ブリスターパック(1種または複数種の丸剤を含む)があるが、これに限定されるものではない。任意に、こうした容器には、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた形式の注意書が添付されていてもよく、注意書は、ヒトの診断および/または投与のための製造、使用または販売に関する政府機関による承認を反映する。
どのような医薬製品であっても、包装材料および容器は、保管および輸送中の製品の安定性を保護するように設計される。さらに、本開示の製品は、使用説明書、または対象の疾患または障害を適切に予防または処置する方法について医師、技術者または患者に助言する他の情報資料を含む。言い換えれば、製品は、投与レジメン、以下に限定されるものではないが、実際の用量、モニタリング手順など、および他のモニタリング情報を指示または推奨する指示手段を含む。
診断アッセイ用のキットは、本開示のbiMabを含む溶液またはbiMabの凍結乾燥調製物を含んでもよく、biMabは1つまたは複数の標的のほか、そうしたbiMabを検出するための試薬に特異的に結合する。biMabは、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載の方法により標識してもよく、以下に限定されるものではないが、小分子蛍光タグなどの標識、ビオチン、GFPもしくは他の蛍光タンパク質などのタンパク質、またはhisもしくはmycなどのエピトープ配列がある。同様に、キットには、biMabの検出に使用される一次抗体を含めてもよい。一次抗体は、biMab上の配列を標的としても、あるいはbiMabを標識した標識、タグもしくはエピトープを標的としてもよい。さらに、一次抗体は検出のために標識されていてもよいし、あるいは、一次抗体は、さらなるシグナルの増幅が求められる場合、やはりキットに含まれていてもよい二次抗体により検出されてもよい。
また、研究用途のキットも考慮されている。こうしたキットは、たとえば、診断用途または治療用途向けのキットに類似していてもよいが、キットおよびその用途が研究目的のみに限定されることを明記するレベルを含む。
例示的な実施形態
1.タンパク質であって、
第1のエピトープに結合するFabアーム、
第2のエピトープに結合する結合ドメイン(BD)、および
CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc領域;
を含み、
BDは第1のポリペプチドリンカー(L1)を介してFabアームに、第2のポリペプチドリンカー(L2)を介してFc領域に相互に連結されており;かつタンパク質は第1および第2の各エピトープへの結合に対して二価である
タンパク質。
1.タンパク質であって、
第1のエピトープに結合するFabアーム、
第2のエピトープに結合する結合ドメイン(BD)、および
CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc領域;
を含み、
BDは第1のポリペプチドリンカー(L1)を介してFabアームに、第2のポリペプチドリンカー(L2)を介してFc領域に相互に連結されており;かつタンパク質は第1および第2の各エピトープへの結合に対して二価である
タンパク質。
2.L1は1〜50アミノ酸残基を含む、実施形態1に記載のタンパク質。
3.L2は1〜50アミノ酸残基を含む、実施形態1または2に記載のタンパク質。
4.L1およびL2は各々1〜50アミノ酸残基を含む、実施形態1〜3のいずれかに記載のタンパク質。
5.L1およびL2は各々15〜30アミノ酸残基を含む、実施形態1〜4のいずれかに記載のタンパク質。
6.L1はヒンジ部分およびリンカー部分を含む、実施形態1〜5のいずれかに記載のタンパク質。
7.L2はヒンジ部分およびリンカー部分を含む、実施形態1〜6のいずれかに記載のタンパク質。
8.L1およびL2は各々ヒンジ部分およびリンカー部分を含む、実施形態1〜7のいずれかに記載のタンパク質。
9.L1は抗体ヒンジ領域の少なくとも5アミノ酸残基含む、実施形態1〜8のいずれかに記載のタンパク質。
10.L2は抗体ヒンジ領域の少なくとも5アミノ酸残基含む、実施形態1〜9のいずれかに記載のタンパク質。
11.L1は抗体ヒンジ領域の少なくとも7アミノ酸残基含む、実施形態1〜10のいずれかに記載のタンパク質。
12.L2は抗体ヒンジ領域の少なくとも7アミノ酸残基含む、実施形態1〜11のいずれかに記載のタンパク質。
13.L2は抗体ヒンジ領域の少なくとも12アミノ酸残基含む、実施形態1〜12のいずれかに記載のタンパク質。
14.L1は抗体ヒンジ領域の8アミノ酸残基含む、実施形態1〜13のいずれかに記載のタンパク質。
15.L2は抗体ヒンジ領域の15アミノ酸残基含む、実施形態1〜14のいずれかに記載のタンパク質。
16.L1およびL2は各々抗体ヒンジ領域または修飾抗体ヒンジ領域の全部または一部を含む、実施形態1〜15のいずれかに記載のタンパク質。
17.L1は抗体ヒンジ領域の少なくとも5アミノ酸残基含み、かつヒンジ領域はEU221位にアスパラギン酸からグリシンへの置換を含む、実施形態1〜16のいずれかに記載のタンパク質。
18.ヒンジ領域はシステインが別のアミノ酸で置換されている置換を含む、実施形態16または17に記載のタンパク質。
19.L2は抗体ヒンジ領域の少なくとも5アミノ酸残基含み、かつヒンジ領域はEU220位にシステインからバリンへの置換を含む、実施形態1〜18のいずれかに記載のタンパク質。
20.L1はGly−Serペプチドを含むリンカー部分を含む、実施形態1〜19のいずれかに記載のタンパク質。
21.L2はGly−Serペプチドを含むリンカー部分を含む、実施形態1〜20のいずれかに記載のタンパク質。
22.L1およびL2は各々Gly−Serペプチドを含むリンカー部分を含む、実施形態1〜21のいずれかに記載のタンパク質。
23.Gly−Serペプチドは式(Gly4Ser)nであり、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9および10からなる群から選択される正の整数である、実施形態20〜22のいずれかに記載のタンパク質。
24.L1はヒンジ部分を含まない、実施形態1〜5のいずれかに記載のタンパク質。
25.L2はヒンジ部分を含まない、実施形態1〜5のいずれかに記載のタンパク質。
26.L1およびL2はヒンジ部分を含まない、実施形態1〜5のいずれかに記載のタンパク質。
27.L1はアミノ酸配列EPKSCDKT(配列番号4)を含む、実施形態1〜23のいずれかに記載のタンパク質。
28.L1はアミノ酸配列EPKSCGKT(配列番号6)を含む、実施形態1〜23のいずれかに記載のタンパク質。
29.L1はアミノ酸配列EPKSC(配列番号38)を含む、実施形態1〜23のいずれかに記載のタンパク質。
30.L2はアミノ酸配列EPKSVDKTHTCPPCP(配列番号12)を含む、実施形態1〜23、27〜29のいずれかに記載のタンパク質。
31.L2はアミノ酸配列CPPCP(配列番号14)を含む、実施形態1〜23、27〜29のいずれかに記載のタンパク質。
32.L2はアミノ酸配列DKTHTCPPCP(配列番号40)を含む、実施形態1〜23、27〜29のいずれかに記載のタンパク質。
33.BDはscFv、単一ドメイン抗体、一本鎖ダイアボディ、抗体模倣体、抗体可変ドメインおよび受容体結合ドメインからなる群から選択される、実施形態1〜32のいずれかに記載のタンパク質。
34.BDはscFvを含む、実施形態33に記載のタンパク質。
35.scFvはVHドメイン、ポリペプチドリンカーおよびVLドメインを含む、実施形態34に記載のタンパク質。
36.FabドメインはL1を介してscFvのVHドメインのN末端に相互に連結される、実施形態35に記載のタンパク質。
37.FabドメインはL1を介してscFvのVLドメインのN末端に相互に連結される実施形態35に記載のタンパク質。
38.Fc領域はL2を介してscFvのVHドメインのC末端に相互に連結される、実施形態35または37に記載のタンパク質。
39.Fc領域はL2を介してscFvのVLドメインのC末端に相互に連結される、実施形態35または36に記載のタンパク質。
40.scFvのVLドメインはKabat位置100にシステインを有する、実施形態35〜39のいずれかに記載のタンパク質。
41.scFvのVHドメインはKabat位置44にシステインを有する、実施形態35〜40のいずれかに記載のタンパク質。
42.抗体模倣体はミニボディ、マキシボディ(maxybody)、アビマー、Fn3を用いたタンパク質スキャフォールド、アンキリンリピート、VASPポリペプチド、トリ膵ポリペプチド(aPP)、テトラネクチン、アフィリリン、ノッチン(knottin)、SH3、PDZドメイン、プロテインAドメイン、リポカリン、トランスフェリンおよびkunitzドメインからなる群から選択される、実施形態33に記載のタンパク質。
43.Fc領域はIgG1由来のFc領域、IgG2由来のFc領域、IgG3由来のFc領域、IgG4由来のFc領域、IgA由来のFc領域、IgM由来のFc領域、IgE由来のFc領域およびIgD由来のFc領域からなる群から選択される、実施形態1〜42のいずれかに記載のタンパク質。
44.Fc領域は変異Fc領域を含む、実施形態43に記載のタンパク質。
45.Fc領域は非グリコシル化される、実施形態43または44に記載のタンパク質。
46.Fc領域は脱グリコシル化される、実施形態43または44に記載のタンパク質。
47.Fc領域はフコシル化を低下させてあるか、または非フコシル化されている、実施形態43または44に記載のタンパク質。
48.変異Fc領域は297位に置換を含む、実施形態44〜47のいずれかに記載のタンパク質。
49.297位の置換は297Qである、実施形態48に記載のタンパク質。
50.変異Fc領域はEUインデックスにより番号付けされた239位、282位、289位、297位、312位、324位、330位、335位、337位、339位、356位、359位、361位、383位、384位、398位、400位、440位、422位および442位の1つまたは複数に置換を含む、実施形態43〜49のいずれかに記載のタンパク質。
51.FabアームのCH1ドメインはEUインデックスにより番号付けされた131位、132位、134位、135位、136位および139位の1つまたは複数に置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のタンパク質。
52.置換はシステイン、リジン、チロシン、ヒスチジン、セレノシステインおよびセレノメチオニンから選択されるアミノ酸への置換を含む、実施形態50または51に記載のタンパク質。
53.置換はシステインである、実施形態52に記載のタンパク質。
54.タンパク質はN末端からC末端に以下のポリペプチドドメインを含むキメラ重鎖を含み
VH1−CH1−L1−BD−L2−Fc;
VH1はFabの重鎖可変ドメインを含み、CH1はFabの重鎖定常ドメイン1を含み、L1は第1のリンカーポリペプチドを含み、BDは結合ユニット2を含み、L2は第2のリンカーポリペプチドを含み、FcはCH2およびCH3ドメインを含む、実施形態1〜53のいずれかに記載のタンパク質。
VH1−CH1−L1−BD−L2−Fc;
VH1はFabの重鎖可変ドメインを含み、CH1はFabの重鎖定常ドメイン1を含み、L1は第1のリンカーポリペプチドを含み、BDは結合ユニット2を含み、L2は第2のリンカーポリペプチドを含み、FcはCH2およびCH3ドメインを含む、実施形態1〜53のいずれかに記載のタンパク質。
55.BDはscFvを含む、実施形態54に記載のタンパク質。
56.scFvはN末端からC末端に下記を含み、
VH2−ポリペプチドリンカー−VL2またはVL2−ポリペプチドリンカー−VH2;
VH2はscFvの重鎖可変ドメインを含み、VL2はscFvの軽鎖可変ドメインを含む、実施形態55記載のタンパク質。
VH2−ポリペプチドリンカー−VL2またはVL2−ポリペプチドリンカー−VH2;
VH2はscFvの重鎖可変ドメインを含み、VL2はscFvの軽鎖可変ドメインを含む、実施形態55記載のタンパク質。
57.L1はヒンジ部分およびリンカー部分を含む、実施形態54〜56のいずれかに記載のタンパク質。
58.L2はヒンジ部分およびリンカー部分を含む、実施形態54〜57のいずれかに記載のタンパク質。
59.L1はN末端からC末端にヒンジ部分およびリンカー部分を含む、実施形態57または58に記載のタンパク質。
60.L2はN末端からC末端にリンカー部分およびヒンジ部分を含む、実施形態57〜59のいずれかに記載のタンパク質。
61.Fabアームは第1のエピトープに結合し、かつ前記第1のエピトープはEGFR、IGFR1、VEGF、Ang2、PslまたはPcrVから選択される標的上にある、実施形態1〜60のいずれかに記載のタンパク質。
62.BDは第2のエピトープに結合し、前記第2のエピトープはEGFR、IGFR1、VEGF、Ang2、PslまたはPcrVから選択される標的上にある、実施形態1〜60のいずれかに記載のタンパク質。
63.FabアームはEGFRに結合する、実施形態61または62に記載のタンパク質。
64.FabアームはVEGFに結合する、実施形態61または62に記載のタンパク質。
65.FabアームはPcrVに結合する、実施形態61または62に記載のタンパク質
66.BDはIGFR1に結合する、実施形態61〜65のいずれかに記載のタンパク質。
67.BDはAng2に結合する、実施形態61〜65のいずれかに記載のタンパク質。
68.BDはPslに結合する、実施形態61〜65のいずれかに記載のタンパク質
69.Fabアームは配列番号24、27、33、36、46および49のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むVH1ドメインを含む、実施形態1〜68のいずれかに記載のタンパク質。
70.Fabアームは配列番号21、26、30、35、43および48のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むVL1ドメインを含む、実施形態1〜69のいずれかに記載のタンパク質。
71.Fabアームは配列番号24に記載のアミノ酸配列を含むVH1ドメインおよび配列番号21に記載のアミノ酸配列を含むVL1ドメインを含む、実施形態69または70に記載のタンパク質。
72.Fabアームは配列番号33に記載のアミノ酸配列を含むVH1ドメインおよび配列番号30に記載のアミノ酸配列を含むVL1ドメインを含む、実施形態69または70に記載のタンパク質。
73.Fabアームは配列番号46に記載のアミノ酸配列を含むVH1ドメインおよび配列番号43に記載のアミノ酸配列を含むVL1ドメインを含む、実施形態69または70に記載のタンパク質。
74.BDはscFvを含み、scFvは配列番号24、27、33、36、49、49、21、26、30、35 43および48に記載の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態1〜673のいずれかに記載のタンパク質。
75.scFvは配列番号25に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態74に記載のタンパク質。
76.scFvは配列番号34に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態74に記載のタンパク質。
77.scFvは配列番号47に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態74に記載のタンパク質。
78.タンパク質は配列番号23または32または45に記載のアミノ酸配列を含むキメラ重鎖を含む、実施形態1〜54のいずれかに記載のタンパク質。
79.タンパク質は配列番号19または28または41に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態78に記載のタンパク質。
80.第1および第2のエピトープは異なる、実施形態1〜79のいずれかに記載のタンパク質。
81.第1および第2のエピトープは同じである、実施形態1〜68のいずれかに記載のタンパク質。
82.Fabアームおよび/またはFc領域は少なくとも1つの結合ユニットをさらに含む、実施形態1〜81のいずれかに記載のタンパク質。
83.少なくとも1つの結合ユニットはポリペプチドリンカーを介してFabアームおよび/またはFcに相互に連結される、実施形態82に記載のタンパク質。
84.少なくとも1つの結合ユニットはキメラ重鎖のN末端および/またはC末端で相互に連結される、実施形態82または83に記載のタンパク質。
85.少なくとも1つの結合ユニットは軽鎖のN末端および/またはC末端で相互に連結される、実施形態82〜84のいずれか1つに記載のタンパク質。
86.少なくとも1つの結合ユニットが重鎖のN末端および/またはC末端で相互に連結され、かつ少なくとも1つの結合ユニットが軽鎖のN末端および/またはC末端に相互に連結される、実施形態84または85に記載のタンパク質。
87.少なくとも1つの結合ユニットが重鎖のN末端およびC末端で相互に連結され、および/または少なくとも1つの結合ユニットが軽鎖のN末端およびC末端に相互に連結される、実施形態84または85に記載のタンパク質。
88.少なくとも1つの結合ユニットが重鎖のN末端およびC末端で相互に連結され、かつ少なくとも1つの結合ユニットが軽鎖のN末端およびC末端に相互に連結される、実施形態84または85に記載のタンパク質。
89.タンパク質はFabアームとFc領域との間に相互に連結された少なくとも1つの追加の結合ユニットをさらに含む、実施形態1〜88のいずれかに記載のタンパク質。
90.少なくとも1つの追加の結合ユニットがL1とBDとの間に相互に連結される、実施形態89に記載のタンパク質。
91.少なくとも1つの追加の結合ユニットがBDとL2との間に相互に連結される、実施形態89に記載のタンパク質。
92.少なくとも1つの追加の結合ユニットがポリペプチドリンカーによりBDに相互に連結される、実施形態90または91に記載のタンパク質。
93.各結合ユニットはFabドメイン、scFv、単一ドメイン抗体、一本鎖ダイアボディ、抗体模倣体、抗体可変ドメインおよび受容体結合ドメインからなる群から選択される、実施形態82〜92のいずれかに記載のタンパク質。
94.結合ユニットは各々異なるエピトープに結合する、実施形態82〜93のいずれか1つに記載のタンパク質。
95.2つ以上の結合ユニットが各々同じエピトープに結合する、実施形態82〜93のいずれか1つに記載のタンパク質。
96.少なくとも1つの結合ユニットは第1のエピトープおよび/または第2のエピトープに結合しない、実施形態82〜95のいずれか1つに記載のタンパク質。
97.少なくとも1つの結合ユニットは第1のエピトープに結合せず、かつ第2のエピトープにも結合しない、実施形態82〜95のいずれか1つに記載のタンパク質。
98.薬学的に許容されるキャリアを用いて製剤化された、実施形態1〜97のいずれかに記載のタンパク質を含む組成物。
99.実施形態1〜97のいずれかに記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
100.第1のヌクレオチド配列を含む第1の核酸分子および
第2のヌクレオチド配列を含む第2の核酸分子;
を含み、
実施形態1〜97のいずれかに記載のタンパク質が第1および第2の核酸分子によりコードされる
核酸組成物。
第2のヌクレオチド配列を含む第2の核酸分子;
を含み、
実施形態1〜97のいずれかに記載のタンパク質が第1および第2の核酸分子によりコードされる
核酸組成物。
101.実施形態99または100に記載の核酸を含むベクター。
102.実施形態101に記載のベクターを含む宿主細胞。
次に以下の例を参照しながら本開示を説明する。これらの例は、例示のみを目的として提供されるものであり、本開示をこれらの例に限定されるものと決して解釈してはらならず、むしろ本明細書に提供される教示内容により明らかになるあらゆる変更形態を包含するものと解釈すべきである。一般的に言えば、本開示は、他に記載がない限り、分子生物学、化学、生化学、生物物理学、組換えDNA技術、免疫学および抗体工学の従来の技術を利用する。これらの技術はすべて、同じ分野で働いている人にとって周知の事実である。言うまでもなく、使用される特定の装置および試薬、大きさ、製造者などの具体的な記載または説明は、本開示を限定するものと見なしてはならないことが理解されよう。ただし、そうした記載がある場合、この限りではない。同様に機能する他の装置および試薬を容易に代用できることもさらに理解されよう。
実施例1:代表的なbiMab。
図1は、本開示の代表的なbiMabの模式図である。このbiMabは、各エピトープに対して二価の二重特異性結合タンパク質であり、第1のエピトープに結合するFabドメイン(結合ユニット1)は、ここでscFv(結合ユニット2)として示される第2のエピトープに結合する結合ドメインと遺伝的に連鎖しており、次いでこの結合ドメインは、Fcドメインの少なくとも一部と遺伝的に連鎖している。キメラ重鎖(6つのドメインおよび3つの相互連結リンカーポリペプチド;VH1+CH1+上方ヒンジ/リンカー(L1ともいう)+scFv(ここではVL2+リンカー+VH2として示す)+リンカー/下方ヒンジ(L2ともいう)+Fc(ここではCH2+CH3を含む)で示す)は、一本鎖分子として発現させてもよい。biMabはまた、κアイソタイプでも、あるいはλアイソタイプでもよい通常の軽鎖からなる。さらに、結合ユニット1および2が、通常の抗体の単一特異性を有するが四価である同じエピトープに結合するbiMabも意図している。biMabは任意に、この図に示すように、軽鎖、重鎖の1つもしくは複数またはヒンジ領域に1つまたは複数の天然の鎖間ジスルフィド架橋を有してもよい。しかしながら、本開示のbiMabは、任意の鎖間ジスルフィド架橋を含まなくてもよく、ある態様では、鎖間ジスルフィド架橋をまったく含まない。簡潔にするため、図1に示すbiMabの半分のみ模式的に符牒を付した。
図1は、本開示の代表的なbiMabの模式図である。このbiMabは、各エピトープに対して二価の二重特異性結合タンパク質であり、第1のエピトープに結合するFabドメイン(結合ユニット1)は、ここでscFv(結合ユニット2)として示される第2のエピトープに結合する結合ドメインと遺伝的に連鎖しており、次いでこの結合ドメインは、Fcドメインの少なくとも一部と遺伝的に連鎖している。キメラ重鎖(6つのドメインおよび3つの相互連結リンカーポリペプチド;VH1+CH1+上方ヒンジ/リンカー(L1ともいう)+scFv(ここではVL2+リンカー+VH2として示す)+リンカー/下方ヒンジ(L2ともいう)+Fc(ここではCH2+CH3を含む)で示す)は、一本鎖分子として発現させてもよい。biMabはまた、κアイソタイプでも、あるいはλアイソタイプでもよい通常の軽鎖からなる。さらに、結合ユニット1および2が、通常の抗体の単一特異性を有するが四価である同じエピトープに結合するbiMabも意図している。biMabは任意に、この図に示すように、軽鎖、重鎖の1つもしくは複数またはヒンジ領域に1つまたは複数の天然の鎖間ジスルフィド架橋を有してもよい。しかしながら、本開示のbiMabは、任意の鎖間ジスルフィド架橋を含まなくてもよく、ある態様では、鎖間ジスルフィド架橋をまったく含まない。簡潔にするため、図1に示すbiMabの半分のみ模式的に符牒を付した。
本明細書でbiMab「コア」ともいう図1に示す代表的なbiMabでは、第2のエピトープに結合する結合ドメイン(BD)(符牒を付した結合ユニット2)は、エピトープ2に結合するscFvである。biMabがscFv、たとえば第2のエピトープに結合するscFvを含む場合、scFvは、VH−リンカー−VLの配向でも、あるいはVL−リンカー−VHの配向でもよい。ある態様では、結合ユニット2としての役割を果たすscFvは、VL−リンカー−VHの配向である。一般に、scFvのVL部分およびVH部分を相互に連結するリンカーはフレキシブルリンカー、たとえばグリシン−セリンリンカーである。好適なグリシン−セリンリンカーを含む好適なリンカーは当該技術分野において周知である。scFvは任意に、安定化突然変異を導入することにより、あるいは鎖間ジスルフィド結合(図1に白抜き三角形として示す)を導入することにより構造的に安定化してもよい。しかしながら、安定化突然変異および/または鎖間ジスルフィド結合の導入は必須ではなく、ある態様では、存在しない。
図1に第1のエピトープに結合するFabドメインとして示す第1の結合ユニットは、ポリペプチドリンカーを介してscFvに相互に連結される。このポリペプチドリンカーは上方ヒンジ/リンカーまたはL1とも呼ばれる。「ポリペプチドリンカー」という用語は、結合ユニット1と結合ユニット2とを、または結合ユニット2とFcドメインとを相互に連結するポリペプチドリンカーをいい、この用語は、リンカー配列のみを含む、ヒンジ配列のみを含む、またはリンカーおよびヒンジ配列の両方を含むポリペプチドを含む。ある態様では、Fabドメインは、鎖間ジスルフィド結合を作ることができるシステイン(少なくとも1つのシステイン)を含むポリペプチドリンカーを介して結合ユニット2のN末端(ここではscFvのVHあるいはVL)に相互に連結される。結合ユニット2のC末端(ここではscFvのVHあるいはVL)は、リンカーによりIgヒンジ−FcのN末端に相互に連結される。このリンカーは、Igヒンジと類似の組成でもよく、システインを有してもよい。こうしたシステインは、鎖間ジスルフィド結合を作ることができる。
図1に示したbiMabは、少なくともCH2領域およびCH3領域を含むFcドメインをさらに含む。Fcドメインは、CH2ドメインなどでグリコシル化されてもよいし(図1に白丸として示す)、あるいはFcドメインは脱グリコシル化または非グリコシル化されてもよい。さらにまたはあるいは、Fcドメインは任意に、安定化突然変異、たとえば操作された鎖内ジスルフィド結合を含んでもよい。Fc CH3ドメインは、安定化突然変異またはヘテロ2量化に都合がよい突然変異を含んでも、あるいは含まなくてもよい。さらに、Fcドメインは本明細書に記載するような変異Fcドメインであってもよい。
図2は、例示的biMabキメラ重鎖の核酸コード配列およびアミノ酸配列の情報を提供する。キメラ重鎖の各部分を図2Aおよび2Bに示す。図2Aの上部に、VH1領域のDNA配列およびタンパク質配列を模式的に示す。任意の特定のbiMabでは、この配列は特定の結合ユニット1のVH1、たとえば特定のFabのVH1に対応すると考えられる。次いで図2Aは、CH1ドメインのDNA配列およびタンパク質配列を提供する。この後に、biMabのFabとBDとを相互に連結するポリペプチドリンカー1(L1)のDNA配列およびアミノ酸配列を示す。L1は、ヒンジ部分およびリンカー部分(上方ヒンジ/リンカー)を含んでもよく、これを図2Aに示す。図2Aは最初にL1のヒンジ部分(上方ヒンジと表示、この場合はヒトIg1上方ヒンジ)を示す。図2Aは、ヒトIgG1上方ヒンジまたは修飾ヒトIgG1上方ヒンジと表示した、L1のヒンジ部分について考えられる3つの態様を示している点に留意されたい。これらのヒンジ部分は、修飾ヒンジ部分がDからGへの置換をシステインの直後に含むという点で異なる。次いで図2Aは、L1のリンカー部分、ここではG4Sリンカーを示す。比較のため全ヒトヒンジの配列を示す(配列番号9および10)。上方ヒンジ部分およびリンカー部分は、一緒にL1(上方ヒンジ/リンカーともいう)を形成する。しかしながら、ある態様では、L1はリンカー部分のみ、またはヒンジ部分のみを含む。図2Bは、VH2−リンカー−VL2配向でも、あるいはVL2−リンカー−VH2配向でもよい結合ユニット2、ここではscFvのDNA配列およびタンパク質配列を模式的に示す。
第2のポリペプチドリンカー(L2;リンカー/下方ヒンジとも呼ばれる)のDNA配列およびアミノ酸配列を図2Bに示す。L2のリンカー部分を図2Bの下部に示す。図示したように、このリンカー部分はG4Sリンカーである。L2のヒンジ部分を図2Bの中央部に示す(注記、このヒンジ部分を下方ヒンジまたはヒンジ変異体として示す)。図2Bは、L2のヒンジ部分、ヒトIgG1のヒンジ変異体およびヒトIgG1の下方ヒンジの3つの態様を提供する。下方ヒンジ部分およびリンカー部分は一緒にL2(リンカー/下方ヒンジとも呼ばれる)を形成する。しかしながら、ある種の態様ではL2は、リンカー部分のみまたはヒンジ部分のみを含む。図2Cは、FcのCH2ドメインおよびCH3ドメインのDNA配列およびアミノ酸配列を提供する。上記に詳述したように、図2Cに示したCH2ドメインおよびCH3ドメインはIgG1に由来するが、biMabは、任意のIgクラス、たとえばIgM、IgG、IgD、IgAおよびIgE、さらに任意のアイソタイプ、たとえばIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4由来のFcを用いて容易に作製することができる。
図2Aに図示したように、上方ヒンジの一態様(L1の一部として存在する)は、Fabドメインの軽鎖と重鎖との間の鎖間ジスルフィド架橋の形成に関与する、ヒトIgG1上方ヒンジの標準的なシステインを含む。図2Aにこのシステインを太字および下線で示す。このシステインは、図2Aに示した修飾上方ヒンジにも存在するが、下線で区別していない。図2Bに図示したように、下方ヒンジ領域(L2)の一態様は、ヒンジ領域のジスルフィドスクランブリングを最小限に抑えるためEU位置に突然変異C220Vを有する変異体である。図2Bにこの変異体を太字および下線で示す。
図3は、biMabを例示的に模式化したもののキメラ重鎖のアミノ酸配列をもう1つ示す。言うまでもなく、VH1の特定配列(結合ユニット1の可変重鎖ドメイン1)および結合ドメイン2の特定配列(VH2−リンカー−VL2配向のscFvとして図示される)は、示していないことを理解すべきである。これらの配列は、特定のbiMabを構成する個々の結合ユニットによって異なる。しかしながら、相互に関連するbiMabの各部分の相対位置は、維持される(たとえば、個々の結合ユニットが変わっても、biMab型は同じである)。
図3では、L1およびL2を下線およびイタリック体で示し、L1およびL2のヒンジ部分を太字で示す。上のパネルではL1のヒンジ部分がヒトIgG1上方ヒンジに対応するのに対し、下のパネルではL1のヒンジ部分が修飾ヒトIgG1上方ヒンジに対応する。上のパネルではL2のヒンジ部分がヒトIgG1の下方ヒンジ変異体に対応するのに対し、下のパネルではL2のヒンジ部分がヒトIgG1の下方ヒンジに対応する。いずれの場合も、L1は、たとえば、結合ユニット1のVH1と結合ユニット2のVH2と相互に連結することにより結合ユニット1と結合ユニット2とを相互に連結する。L2は、たとえば、結合ユニット2のVL2とFcのCH2ドメインとを相互に連結することにより結合ユニット2とFcとを相互に連結する。
biMabをさらに模式化したものを図4および5に示す。これらの図は、L1およびL2のヒンジ部分の分子の相対位置を図示する。たとえば、図4A、4Bおよび4Cでは、L1のヒンジ部分の相対位置を図示する。L1は、図4A、4Bまたは4Cにその配列を示していないリンカー部分をさらに含んでもよい。リンカー部分をさらに含むL1の例は、配列番号63、64および65に示す)。しかしながら、存在する場合、L1のヒンジ部分は結合ユニット1に直接相互に連結し(たとえば、結合ユニット1の一部と隣接し)、リンカー部分は結合ユニット2と直接相互に連結する(たとえば、結合ユニット2の一部と隣接する)点に留意されたい。この構造ため、L1は上方ヒンジ/リンカーともいう。図4Bに示したヒンジ部分は、ヒンジ関連の自発的自己切断を防止するために導入された突然変異D221Gを有する修飾ヒンジ部分である。変異させたDNA配列およびアミノ酸残基を太字、下線およびイタリック体で示す。図4Cに示したヒンジ部分は、図4Aに示したヒンジの最後の3アミノ酸を欠損している短縮型である。さらに例を挙げると、図5A、5Bおよび5CはL2のヒンジ部分の相対位置を示す。L2は、図5Aまたは5Bにその配列を示していない追加のリンカー部分をさらに含んでもよい。しかしながら、存在する場合、L2のヒンジ部分はFcドメインと直接相互に連結し(たとえば、Fcドメインの一部と隣接し)、リンカー部分は結合ユニット2と直接相互に連結する(たとえば、結合ユニット2の一部と隣接する)点に留意されたい。この構造のため、L2はリンカー/下方ヒンジとも呼ばれる。図5Aに示した下方ヒンジ部分は、ヒンジ領域のジスルフィドスクランブリングを最小限に抑えるため導入された突然変異C220Vを有する修飾ヒンジである。あるいは、ヒンジ関連の自発的自己切断を防止するため、図5Bおよび5Cに示した下方ヒンジドメイン(すなわち、切断されたヒンジ領域)を使用してもよい。図4および5に示したL1およびL2の具体的なヒンジ部分は単に例示であり、本開示は、これらの任意の組み合わせの使用のほか、ヒンジ部分の非使用または他のヒンジ部分の使用を意図している。
図6A〜Cは、EGFR(Fabドメイン)およびIGF1R(scFvドメイン)を標的とするbiMabの軽鎖およびキメラ重鎖のDNA配列およびタンパク質配列を示し、EGFR結合ユニットは通常のモノクローナル抗体パニツムマブに由来し、IGF1R結合ユニットは通常のモノクローナル抗体ダロツズマブに由来する。このbiMabコンストラクトは、本出願ではbiMab−EI(PaniX/Dalo)という。この特異的なbiMabは、図4〜5に記載されているような相互に連結するリンカーを含む。IGF1Rを標的とするscFvドメインはVL−リンカー−VHの配向であり、VLドメインおよびVHドメインを連結するリンカーは20アミノ酸長であり、4回繰り返されるグリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリンからなる。scFvのVLドメインおよびVHドメイン(biMabの模式図に示されるVL2およびVH2)は、鎖間ジスルフィド結合を形成してscFvを安定化するVL−システイン100突然変異およびVH−システイン44突然変異を含む。
図7A〜Cは、VEGF(Fabドメイン)およびAng2(scFvドメイン)を標的とするbiMabの軽鎖およびキメラ重鎖のDNA配列およびタンパク質配列を示し、VEGF結合ユニットは通常のモノクローナル抗体ベバシズマブ/アバスチンに由来し、Ang2結合ユニットはLC06と呼ばれる通常のモノクローナル抗体に由来する。このbiMabコンストラクトは、本出願ではbiMab−VA(Ava/LC06)という。このbiMabは、図4〜5に記載されているような相互に連結するリンカーを含む。Ang2を標的とするscFvドメインは、VL−リンカー−VHの配向であり、VLドメインおよびVHドメインを連結するリンカーは20アミノ酸長であり、4回繰り返されるグリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリンからなる。scFvのVLドメインおよびVHドメイン(biMabの模式図に示されるVL2およびVH2)は、scFvを安定化するため鎖間ジスルフィド結合を形成するVL−システイン100突然変異およびVH−システイン44突然変異を含む。
図8A〜Dは、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)(P.エルジノーサ(P.aeruginosa))PcrV(Fabドメイン)およびPslエキソポリサッカライド(scFvドメイン)を標的とするbiMabの軽鎖およびキメラ重鎖のDNA配列およびタンパク質配列を示し、PcrV結合ユニットはV2L2と呼ばれる通常のモノクローナル抗体に由来し、Psl結合ユニットはW4−RADと呼ばれる通常のモノクローナル抗体に由来する。このbiMabコンストラクトは、本出願ではBs4−V2L2−2Cという。このbiMabは、図4および5に記載されているような相互に連結するリンカーを含む。Pslエキソポリサッカライドを標的とするscFvドメインはVH−リンカー−VLの配向であり、VLドメインおよびVHドメインを連結するリンカーは20アミノ酸長であり、4回繰り返されるグリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリンからなる。scFvのVLドメインおよびVHドメイン(biMabの模式図に示されるVL2およびVH2)は、scFvを安定化するため鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン突然変異を含む。
これらのbiMabの具体的な例は、本明細書に記載するようなbiMab型に存在する、二重特異性を持つ二価のポリペプチドの例示である。残りの例は、これらの例示的biMabの構造および機能特性を評価するための実験の結果を報告する。これを行うには、多くの場合、その特性を各結合ユニットが由来した従来の親モノクローナル抗体の特性と比較する。言い換えれば、上述の特異的なbiMab−EIは、従来の親抗体パニツムマブまたはダロツズマブと比較してもよい。また、特異的なbiMab−EIは、同じ標的あるいはさらに同じエピトープに結合するが、それ自体biMabの結合ユニットを作製するのに使用していない他の通常の抗体と比較してもよい。同様に、上述の特異的なbiMab−VAは、従来の親抗体ベバシズマブまたはLC06と比較してもよい。あるいは、特異的なbiMab−VAはさらに、同じ標的あるいはさらに同じエピトープに結合する他の通常の抗体と比較してもよい。加えて、これらの例示的biMabの特性はまた、同じ標的あるいはさらに同じエピトープに結合する従来の二重特異性抗体型と比較してもよい。
実施例2:代表的なbiMabの安定性。
代表的なbiMab biMab−EI(PaniX/Dalo)およびbiMab−VA(Ava/LC06)の一過性発現レベルを、293細胞における発現から10日後、mg/L単位で解析した(図9)。発現レベルは、プロテインA結合法を用いて判定した。さらに詳しくは、biMabをコードするDNAをHEK293F細胞および/またはCHO細胞に標準的なプロトコルを用いてトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をInvitrogenのFreestyle(商標)培地で10日間培養した。組換え発現は、プロテインA結合アッセイを用いて判定した。簡単に説明すると、HPLCシステム(Agilent 1100 Capillary LC System,Foster City,CA)を用いて培養培地をプロテインAカラムに自動的に充填した。非結合材料を100mMのリン酸ナトリウム緩衝液の溶液、pH6.8で洗浄し、抗体を0.1%リン酸、pH1.8で溶出した。溶出ピークに相当する面積を積分し、全抗体濃度を免疫グロブリン標準と比較して判定した。また、理論的に求められた吸光係数を用いて、280nmの吸光度を読み取ることにより、精製されたコンストラクトの濃度も判定した。タンパク質の発現後、biMabは、PBS 1×で平衡化したHiTrap rProteinA FFカラムを用いて、標準的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより親和性精製した。biMabをカラムに充填し、充填後PBS 1×でA280の記録がベースラインに達するまでカラムを洗浄し、汚染物質および非結合材料を除去した。次いで結合タンパク質を25mMのグリシンpH2.8で溶出した。画分は、0.1倍量の1M トリス−HCl緩衝液pH8を添加して直ちに中和した。画分は、そのbiMab含有量についてそのA280の吸光度を読み取ることで解析した。所望のbiMabを含む画分をまとめてプールして、10,000キロダルトン(kDa)のカットオフ透析膜を使用して4℃、10倍量のPBS 1×で一晩透析した。
代表的なbiMab biMab−EI(PaniX/Dalo)およびbiMab−VA(Ava/LC06)の一過性発現レベルを、293細胞における発現から10日後、mg/L単位で解析した(図9)。発現レベルは、プロテインA結合法を用いて判定した。さらに詳しくは、biMabをコードするDNAをHEK293F細胞および/またはCHO細胞に標準的なプロトコルを用いてトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をInvitrogenのFreestyle(商標)培地で10日間培養した。組換え発現は、プロテインA結合アッセイを用いて判定した。簡単に説明すると、HPLCシステム(Agilent 1100 Capillary LC System,Foster City,CA)を用いて培養培地をプロテインAカラムに自動的に充填した。非結合材料を100mMのリン酸ナトリウム緩衝液の溶液、pH6.8で洗浄し、抗体を0.1%リン酸、pH1.8で溶出した。溶出ピークに相当する面積を積分し、全抗体濃度を免疫グロブリン標準と比較して判定した。また、理論的に求められた吸光係数を用いて、280nmの吸光度を読み取ることにより、精製されたコンストラクトの濃度も判定した。タンパク質の発現後、biMabは、PBS 1×で平衡化したHiTrap rProteinA FFカラムを用いて、標準的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより親和性精製した。biMabをカラムに充填し、充填後PBS 1×でA280の記録がベースラインに達するまでカラムを洗浄し、汚染物質および非結合材料を除去した。次いで結合タンパク質を25mMのグリシンpH2.8で溶出した。画分は、0.1倍量の1M トリス−HCl緩衝液pH8を添加して直ちに中和した。画分は、そのbiMab含有量についてそのA280の吸光度を読み取ることで解析した。所望のbiMabを含む画分をまとめてプールして、10,000キロダルトン(kDa)のカットオフ透析膜を使用して4℃、10倍量のPBS 1×で一晩透析した。
これらの研究から、biMabは、通常のIgG抗体のようにプロテインAに結合することができることが示される。本biMab−EIの発現レベルは本biMab−VAの発現レベルより低いものの、観察された発現は、biMab−EIの結合ユニット2が由来する通常の抗体で観察された発現と整合する。
本研究に使用した代表的なbiMabを図6Dおよび7Dに模式的に示す。図6Dに図示したbiMabはbiMab−EIといい、使用した具体的な例がbiMab−EI(PaniX/Dalo)である。このbiMabのFab部分(結合ユニット1)はEGFR(EGF受容体)に結合し、結合ドメイン(結合ユニット2)はIGF1R(IGF1受容体)に結合するscFvである。このbiMabは、FabとscFvとを相互に連結するポリペプチドリンカー(L1)、およびscFvとFc領域とを相互に連結するポリペプチドリンカー(L2)をさらに含むことに留意されたい。図7Dに図示したbiMabはbiMab−VAといい、使用した具体的な例がbiMAb(Ava/LC06)である。このbiMabのFab部分(結合ユニット1)はVEGFに結合し、結合ドメイン(結合ユニット2)はAng2に結合するscFvである。このbiMabは、FabとscFvとを相互に連結するポリペプチドリンカー(L1)、およびscFvとFc領域とを相互に連結するポリペプチドリンカー(L2)をさらに含むことに留意されたい。これらのbiMabの具体例の配列情報を図6A、6B、6C、7A、7Bおよび7Cに示す。
サイズ排除クロマトグラギーを使用して代表的なbiMabのモノマー含有量を判定した。これを図9に示す。図10は、プロテインAによる精製および25mMのヒスチジン−HCl pH6による透析後のbiMab−EIおよびbiMab−VAのサイズ排除クロマトグラム(SEC−HPLC)を示す。
SEC−HPLCは、100mMのリン酸ナトリウム、pH6.8を含む緩衝液を用い1ml/minの流量で約10〜500kDaの範囲のMWを有する球状タンパク質を分離するTSK−GEL G3000SWXLカラム(Tosoh Bioscience LLC,Montgomeryville,PA)を使用して、280nmおよび25℃で行った。ビタミンB12(11,350Da)、ウマミオグロビン(17,000Da)、ニワトリオボアルブミン(44,000Da)、ウシγ−グロブリン(158,000Da)およびチログロブリン(670,000Da)を含むBio−Rad(Hercules,CA)製の低分子量ゲル濾過較正キットを分子量標準として使用した。さらに、高度に精製された99%モノマーIgGを免疫グロブリン分子量標準とした使用した。
図10に示すように、プロテインAによる精製後に高レベルのモノマー含有量(>70%)が得られた。SEC−HPLC解析からは、プロテインAによる精製後のbiMabが伝統的な抗体と同様に主にモノマーであり、単分散であることが示される。
これらの代表的なbiMab−EIタンパク質およびbiMab−VAタンパク質を示差走査熱量測定(DSC)によりさらに解析した。図11は、biMab−EI(PaniX/Dalo)(図11A)およびbiMab−VA(Ava/LC06)(図11B)のDSCを用いて得られたサーモグラムを示す。biMabドメインに対応する転移温度を模式的に示し(図11AおよびBのどちらも黒線)、これらのbiMabの結合ユニットが由来したそれぞれの通常の抗体(たとえば、biMab−EIの場合、通常の抗EGFR抗体(PaniX)および通常の抗IGF1R抗体(Dalo);biMab−VAの場合、通常の抗VEGF抗体(Ava)および通常の抗Ang2抗体(LC06))の融解転移を重ねて示してある。図11A〜Bに図示したような示差走査熱量測定(DSC)実験は、Microcal VP−DSC(Microcal,Northampton,MA)を使用して1℃/minの昇温速度で行った。
DSC実験を25mMのヒスチジン−HCl、pH6を用いて行った。DSCに使用した溶液およびサンプルはすべて0.22ミクロンフィルターを用いて濾過し、熱量計に充填する前に脱気した。DSC研究に使用した2種のbiMabおよび4種の親抗体は、前述のように行った分析用ゲル濾過クロマトグラフィーで判断して>99%モノマーであった。測定セットごとに、少なくとも4回の緩衝液のベースラインラン(run)を最初に得た。直後に、緩衝液溶液をサンプルセルから除去し、約0.75mlのサンプルを1mg/mlの濃度で充填した。測定ごとに参照セルをサンプル緩衝液で満たした。サンプルと緩衝液との各実験では、対応する緩衝液の緩衝液ベースラインラン(run)を差し引いた。生データは濃度および走査速度で補正した。データの解析およびデコンボリューションは、Microcalが提供するOrigin(商標)DSCソフトウェアを用いて行った。
図11Aおよび11Bに示したこのデータから、例示的biMabが高い熱安定性を有することが示される。実際、これらの2つの例示的biMabの最も低い融解転移が>60℃であり、ドメイン安定性は、そのそれぞれの通常の親抗体アームのそれに類似している。
この例に記載された実験から、biMab型が、妥当な量で発現することができ、高いモノマー含有量および通常の抗体と同程度の熱安定性を有する安定な抗体型であることが証明される。
実施例3:代表的なbiMabの結合活性。
本biMab−EIタンパク質およびbiMab−VAタンパク質を解析して、biMab型においてこれらの結合ユニットがその標的抗原に結合する能力を保持し、かつこの結合がそのそれぞれの親抗体、本具体例では、biMab−EIのEGFRおよびIGF1Rと、biMab−VAのVEGFおよびAng2と同程度であることを確認した。図12Aは、biMab−EI、通常の親抗EGFR抗体(PaniX)、および通常の親抗IGF1R抗体(Dalo)のELISAにより測定した結合に関するデータを示す。図12Aの左側のパネルに示した実験では、固定化したEGFRに対する結合を評価した。予想通り、biMab−EIおよび通常の親抗EGFR抗体は、固定化したEGFRに特異的に結合したが、通常の親抗IGF1R抗体は結合しなかった。実際に、biMabおよび通常の親抗EGFR抗体の結合は非常に類似しており、biMabが通常の親抗EGFR抗体の結合特性を保持するという結論を裏付けた。図12Aの右側のパネルに示した実験では、固定化したIGFR1に対する結合を評価した。予想通り、biMab−EIおよび通常の親抗IGFR1抗体は、固定化したIGFR1に特異的に結合したが、通常の親抗EGFR抗体は結合しなかった。実際に、biMabおよび通常の親抗IGFR1抗体の結合は非常に類似しており、biMabが通常の親抗IGFR1抗体の結合特性を保持するという結論を裏付けた。
本biMab−EIタンパク質およびbiMab−VAタンパク質を解析して、biMab型においてこれらの結合ユニットがその標的抗原に結合する能力を保持し、かつこの結合がそのそれぞれの親抗体、本具体例では、biMab−EIのEGFRおよびIGF1Rと、biMab−VAのVEGFおよびAng2と同程度であることを確認した。図12Aは、biMab−EI、通常の親抗EGFR抗体(PaniX)、および通常の親抗IGF1R抗体(Dalo)のELISAにより測定した結合に関するデータを示す。図12Aの左側のパネルに示した実験では、固定化したEGFRに対する結合を評価した。予想通り、biMab−EIおよび通常の親抗EGFR抗体は、固定化したEGFRに特異的に結合したが、通常の親抗IGF1R抗体は結合しなかった。実際に、biMabおよび通常の親抗EGFR抗体の結合は非常に類似しており、biMabが通常の親抗EGFR抗体の結合特性を保持するという結論を裏付けた。図12Aの右側のパネルに示した実験では、固定化したIGFR1に対する結合を評価した。予想通り、biMab−EIおよび通常の親抗IGFR1抗体は、固定化したIGFR1に特異的に結合したが、通常の親抗EGFR抗体は結合しなかった。実際に、biMabおよび通常の親抗IGFR1抗体の結合は非常に類似しており、biMabが通常の親抗IGFR1抗体の結合特性を保持するという結論を裏付けた。
図12Bは、biMab−VA、通常の親抗VEGF抗体(Ava)、および通常の親抗Ang2抗体(LC06)のELISAにより測定した結合に関するデータを示す。図12Bの左側のパネルに示した実験では、固定化したVEGF−165に対する結合を評価した。予想通り、biMab−VAおよび通常の親抗VEGF抗体は、固定化したVEGF−165に特異的に結合したが、通常の親抗Ang2抗体は結合しなかった。実際に、biMabおよび通常の親抗VEGF抗体の結合は非常に類似しており、biMabが通常の親抗VEGF抗体の結合特性を保持するという結論を裏付けた。図12Bの右側のパネルに示した実験では、固定化したAng2に対する結合を評価した。予想通り、biMab−VAおよび通常の親抗Ang2抗体は、固定化したAng2に特異的に結合したが、通常の親抗VEGF抗体は結合しなかった。実際に、biMabおよび通常の親抗Ang2抗体の結合は非常に類似しており、biMabが通常の親抗An2抗体の結合特性を保持するという結論を裏付けた。
上記のELISA結合アッセイでは、30μLのPBS、pH7.4中の各標的抗原(EGFR、IGF1R、VEGF165およびAng2)2μg/mLをマイクロタイターウェルに室温で1時間コートした。抗原をコートしたウェルを、0.1%(v/v)Tween−20を含むPBSで3回洗浄し、室温にて1時間3%BSAでブロッキングした。biMabおよび抗体を30μLのブロッキング溶液で段階希釈し、2時間37℃でインキュベートし、続いて0.1%(v/v)Tween−20を含むPBSで十分に洗浄した。結合したbiMabおよび抗体は、HRPコンジュゲート抗κ(図12A左パネル)二次抗体、抗ヒトFc(図11A右パネルおよび図12A〜B)二次抗体により検出し、30μLの3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン基質(Pierce)を用いて可視化した。0.18Mの硫酸(Pierce)30μLを加えて反応を止めた。マイクロタイタープレートリーダーを用いて450nmの吸光度を測定した。得られたデータは、Prism 5ソフトウェア(GraphPad,San Diego,CA)を用いて解析した。
実施例4:代表的なbiMabの同時結合活性。
図13は、biMab−EI(PaniX/Dalo)がその標的EGFRおよびIGF1Rに同時に結合する能力をBIAcoreアッセイにより示す。biMab−EI(PaniX/Dalo)をCM5 BIAcoreセンサーチップ(図13AおよびB)に固定化した。EGFRおよびIGF1Rの両方への同時結合は、レスポンスユニット(RU、図13に示す2つのグラフのY軸)の上昇で表される。どちらのグラフも、EGFRおよびIGF1Rの注入と、2つの標的の同時注入とを示す。biMab−EI(PaniX/Dalo)のその標的への同時結合は、注入現象(たとえば、上のパネルに示すようにEGFRを最初に注入し、IGFR1を次に注入、または下のパネルに示すようにその逆)またはアッセイフォーマットに関係なく観察された。同時結合は、IGF1Rを最初に注入してから、EGFRおよびIGF1Rを同時注入しても(図13A)、これらの注入現象を戻してEGFRを最初に注入してからIGF1RおよびEGFR(図13B)を同時注入しても観察された。
図13は、biMab−EI(PaniX/Dalo)がその標的EGFRおよびIGF1Rに同時に結合する能力をBIAcoreアッセイにより示す。biMab−EI(PaniX/Dalo)をCM5 BIAcoreセンサーチップ(図13AおよびB)に固定化した。EGFRおよびIGF1Rの両方への同時結合は、レスポンスユニット(RU、図13に示す2つのグラフのY軸)の上昇で表される。どちらのグラフも、EGFRおよびIGF1Rの注入と、2つの標的の同時注入とを示す。biMab−EI(PaniX/Dalo)のその標的への同時結合は、注入現象(たとえば、上のパネルに示すようにEGFRを最初に注入し、IGFR1を次に注入、または下のパネルに示すようにその逆)またはアッセイフォーマットに関係なく観察された。同時結合は、IGF1Rを最初に注入してから、EGFRおよびIGF1Rを同時注入しても(図13A)、これらの注入現象を戻してEGFRを最初に注入してからIGF1RおよびEGFR(図13B)を同時注入しても観察された。
図14は、biMab−VA(Ava/LC06)がその標的VEGFおよびAng2に同時に結合する能力を示す。図14Aおよび14Bにまとめた実験では、biMab−VA(Ava/LC06)をCM5 BIAcoreセンサーチップに固定化した。VEGFおよびAng2の両方への同時結合は、レスポンスユニット(RU、図14AおよびBに示した2つのグラフの左軸)の上昇で表される。どちらのグラフも、VEGFおよびAng2の注入と、2つのリガンドの同時注入とを示す。biMab−VA(Ava/LC06)のその標的への同時結合は、注入現象(たとえば、パネルAに示すようにVEGFを最初に注入し、Ang2を次に注入、またはパネルBに示すようにその逆)またはアッセイフォーマットに関係なく観察された。同時結合は、VEGFを最初に注入してから、Ang2およびVEGFを同時注入しても(図14A)、これらの注入現象を戻してAng2を最初に注入してからAng2およびVEGFを同時注入しても(図14B)観察された。
さらに、図14CおよびDに示すように、同時結合はさらに、標的タンパク質のどちらか一方をセンサーチップに固定化した場合にも観察される。図14Cに示した実験では、Ang2を固定化した。図14Dに示した実験では、VEGFを固定化した。どちらの場合も、同時結合が観察された(レスポンスユニットの上昇により表される)。
図13および14に記載した結果の場合、biMabの同時結合は、BIAcore 3000機器(GE Healthcare)を用いて測定した。簡単に説明すると、CM5センサーチップの異なるフローセルに、異なるタンパク質サンプル(20mMの酢酸塩緩衝液pH4.0緩衝液中)をアミンカップリングにより固定化した。フローセル−1にはアイソタイプコントロール抗体(IgG1)、フローセル−2にはbiMab−VA、フローセル−3にはVEGFおよびフローセル−4にはAng−2であった。アイソタイプコントロール抗体(IgG1)をフローセル−1に、biMab−EIをフローセル−2に固定化して別のCM5センサーチップを調製した。biMabおよび抗原(VEGF、Ang−2、EGFR−Fc、IGF1R)は、ランニング緩衝液(HBS−EP−10mMのHepes、pH7.4、150mMのNaCl、3mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)および0.05%P20)で希釈した。同時結合は、「同時注入(co−inject)」手順を用いて判定した。biMab−EIの同時結合は、固定化したbiMab−EIを含むCM5センサーチップを使用して解析した。アナライトの注入は、EGFR、続いてEGFRおよびIGF1Rの混合物で構成した(図13A)。実験の次のステップで抗原の注入順序を逆にした(すなわちIGF1R、続いてIGF1RおよびEGFRの混合物)(図13B)。biMab−VAの同時結合は、考えられる4つの配向すべてで行った。第1の実験(図14A)では、VEGFとVEGFおよびAng−2の混合物との同時注入を、固定化したbiMab−VA表面上で測定したのに対し、第2の実験(図14B)では、抗原注入の順序を逆にした。第3の実験(図14C)では、biMab−VAとbiMab−VAおよびVEGFの混合物との同時注入を、固定化したAng−2表面上で測定した。第4の実験(図14D)では、biMab−VAとbiMab−VAおよびAng−2の混合物の同時注入を、固定化したVEGF表面上で測定した。
実施例5:代表的なbiMabはFcRnに結合する。
代表的なbiMabがFcRnに結合する能力をBIAcore解析により評価した。簡単に説明すると、biMabおよび対照抗体(20mMの酢酸塩緩衝液pH4.0中に10μg/mL)をCM5センサーチップにアミンカップリングにより固定化して所望の固定化レベル(約600RU)にした。HiTrap脱塩カラム(GE lifesciences)を用いてヒトFcRnの緩衝液をランニング緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム、pH6.0)と交換した。ヒトFcRnの倍数希釈液(30μM〜30nM)を固定化した抗体に注入して30μL/minで1分間結合平衡を測定した。アナライトをランニング緩衝液で5分間チップから解離させた。残りの任意のFcRnは、PBS pH7.4を2回60秒注入してチップから除去した。BiaEvalソフトウェアバージョン3.1を使用してセンサーグラムを作成して解析した。各注入で観察された平衡RUをFcRnの濃度に対してプロットした。平衡KD値は、BiaEvalソフトウェアに含まれる定常状態の親和性モデルを使用してプロットを解析することにより得た。
代表的なbiMabがFcRnに結合する能力をBIAcore解析により評価した。簡単に説明すると、biMabおよび対照抗体(20mMの酢酸塩緩衝液pH4.0中に10μg/mL)をCM5センサーチップにアミンカップリングにより固定化して所望の固定化レベル(約600RU)にした。HiTrap脱塩カラム(GE lifesciences)を用いてヒトFcRnの緩衝液をランニング緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム、pH6.0)と交換した。ヒトFcRnの倍数希釈液(30μM〜30nM)を固定化した抗体に注入して30μL/minで1分間結合平衡を測定した。アナライトをランニング緩衝液で5分間チップから解離させた。残りの任意のFcRnは、PBS pH7.4を2回60秒注入してチップから除去した。BiaEvalソフトウェアバージョン3.1を使用してセンサーグラムを作成して解析した。各注入で観察された平衡RUをFcRnの濃度に対してプロットした。平衡KD値は、BiaEvalソフトウェアに含まれる定常状態の親和性モデルを使用してプロットを解析することにより得た。
図15は、BIAcoreで測定したbiMab−EI(PaniX/Dalo)およびbiMab−VA(Ava/LC06)のFcRn結合に対するKDを示す。代表的な親抗体(PaniX、抗EGFR)のFcRn結合に対するKDをさらに示す。図15に示すように、biMabはどちらもFcRnに結合する能力を保持し、こうした結合は親の従来抗体のそれと同程度である。観察されたKDの差異は、通常のBIAcoreの標準誤差内にある。
実施例6:代表的なbiMabはC1qに結合する。
代表的なbiMabがC1qに結合する能力をELISAにより評価した。簡単に説明すると、PBS(Invitrogenカタログ番号20012)を用いて1ミリリットル当たり5マイクログラム(30μl/ウェル)のbiMabまたは抗体抗EGFRまたはBSAをELISAプレート(Costar 3690)に一晩コートした。ELISAプレートをPBST(1×PBS pH7.2、0.1%Tween−20)で5回洗浄し、150μlのBSB−PBST(3%BSA(Sigmaカタログ番号A2153)、50%Superblock(Thermo Scientfic カタログ番号37515)を含むPBSTで1時間37℃にてブロッキングした。BSB−PBSTによる100μg/mlからのヒトC1q(Cell Sciencesカタログ番号CRC 162B)の倍数希釈液を加え(30μl/ウェル)、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、ELISAプレートをPBSTで5回洗浄し、1μg/mlのヒツジ抗ヒトC1q(Immunology Consultants Labカタログ番号SC1Q−80A)を含むBSB−PBST30μlを加えた。ELISAプレートをPBSTで再び5回洗浄し、1:2500希釈のロバ抗ヒツジ/ヤギ−HRP(SeroTecカタログ番号Star88P)を含むBSB−PBST30μlを加えた。プレートを最後にPBSTで5回洗浄し、(30μl/ウェル)TMB(KPLカタログ番号53−0−03)で5分発色させた。その後、30μlの0.2N HClを加えて反応を止めた。データはPrism5ソフトウェアを用いてプロットした。
代表的なbiMabがC1qに結合する能力をELISAにより評価した。簡単に説明すると、PBS(Invitrogenカタログ番号20012)を用いて1ミリリットル当たり5マイクログラム(30μl/ウェル)のbiMabまたは抗体抗EGFRまたはBSAをELISAプレート(Costar 3690)に一晩コートした。ELISAプレートをPBST(1×PBS pH7.2、0.1%Tween−20)で5回洗浄し、150μlのBSB−PBST(3%BSA(Sigmaカタログ番号A2153)、50%Superblock(Thermo Scientfic カタログ番号37515)を含むPBSTで1時間37℃にてブロッキングした。BSB−PBSTによる100μg/mlからのヒトC1q(Cell Sciencesカタログ番号CRC 162B)の倍数希釈液を加え(30μl/ウェル)、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、ELISAプレートをPBSTで5回洗浄し、1μg/mlのヒツジ抗ヒトC1q(Immunology Consultants Labカタログ番号SC1Q−80A)を含むBSB−PBST30μlを加えた。ELISAプレートをPBSTで再び5回洗浄し、1:2500希釈のロバ抗ヒツジ/ヤギ−HRP(SeroTecカタログ番号Star88P)を含むBSB−PBST30μlを加えた。プレートを最後にPBSTで5回洗浄し、(30μl/ウェル)TMB(KPLカタログ番号53−0−03)で5分発色させた。その後、30μlの0.2N HClを加えて反応を止めた。データはPrism5ソフトウェアを用いてプロットした。
図16に示すように、biMab−EI(PaniX/Dalo)およびbiMab−VA(Ava/LC06)はC1qに結合し、結合の親和性は、代表的な親の従来抗体の1つで陽性対照ともなる抗EGFR(PaniX)のそれと同程度である。これらのデータは、biMab型が通常の抗体と同じ様な補体依存性細胞傷害(CDC)を媒介する能力を保持するという結論を裏付ける。
実施例7:代表的なbiMabはその親の従来抗体で観察される細胞殺傷活性を保持する。
図17は、(i)biMab−EI(PaniX/Dalo)、または(ii)親の従来の抗EGFR抗体(抗体PaniX)と親の従来の抗IGF1R抗体(抗体Dalo)との組み合わせ、または(iii)親の従来の抗EGFR抗体(PaniX)単独、または(iv)親の従来の抗IGF1R抗体(Dalo)単独、または(v)アイソタイプ陰性対照抗体を対象とした細胞殺傷アッセイの結果を示す。この細胞毒性アッセイに使用した細胞はH358(EGFR受容体およびIGF1R受容体の両方を発現するヒト非小細胞肺腺癌細胞;ATCCカタログ番号CRL−5807)であった。H358細胞を、120μlの完全な細胞培養培地(1×RPMI1640 Gibcoカタログ番号11875+10%Hi FBS Gibcoカタログ番号25300)を用いて50,000細胞/ウェルで96ウェルプレート(Costarカタログ番号3788)に蒔いた。細胞培養培地を用いて200nMから5×最終濃度で、各抗体の希釈系列を作成した。30μl/ウェルの希釈抗体をアッセイプレートに加え、37℃、95%湿度で72時間インキュベートした。室温で平衡化したCellTiter−Glo(登録商標)細胞生存率アッセイ試薬(Promegaカタログ番号G7571)をアッセイプレートに加え(120μl/ウェル)、続いて穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートした。インキュベーション後、製造者の推奨に従いEnvision 2014 multilabel readerを用いてATPの発光を測定した。CellTiter−Glo(登録商標)発光細胞生存率アッセイは、代謝的に活性な細胞の存在を示唆するATPの存在の定量化に基づき、生存している培養細胞の数を判定するホモジニアス法である。
図17は、(i)biMab−EI(PaniX/Dalo)、または(ii)親の従来の抗EGFR抗体(抗体PaniX)と親の従来の抗IGF1R抗体(抗体Dalo)との組み合わせ、または(iii)親の従来の抗EGFR抗体(PaniX)単独、または(iv)親の従来の抗IGF1R抗体(Dalo)単独、または(v)アイソタイプ陰性対照抗体を対象とした細胞殺傷アッセイの結果を示す。この細胞毒性アッセイに使用した細胞はH358(EGFR受容体およびIGF1R受容体の両方を発現するヒト非小細胞肺腺癌細胞;ATCCカタログ番号CRL−5807)であった。H358細胞を、120μlの完全な細胞培養培地(1×RPMI1640 Gibcoカタログ番号11875+10%Hi FBS Gibcoカタログ番号25300)を用いて50,000細胞/ウェルで96ウェルプレート(Costarカタログ番号3788)に蒔いた。細胞培養培地を用いて200nMから5×最終濃度で、各抗体の希釈系列を作成した。30μl/ウェルの希釈抗体をアッセイプレートに加え、37℃、95%湿度で72時間インキュベートした。室温で平衡化したCellTiter−Glo(登録商標)細胞生存率アッセイ試薬(Promegaカタログ番号G7571)をアッセイプレートに加え(120μl/ウェル)、続いて穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートした。インキュベーション後、製造者の推奨に従いEnvision 2014 multilabel readerを用いてATPの発光を測定した。CellTiter−Glo(登録商標)発光細胞生存率アッセイは、代謝的に活性な細胞の存在を示唆するATPの存在の定量化に基づき、生存している培養細胞の数を判定するホモジニアス法である。
図17に示すように、biMab−EI(PaniX/Dalo)は、親の2つの従来抗体を組み合わせた(PaniX(抗EGFR)+Dalo(抗IGF1R))処理のレベルと同様のレベルでH358細胞を殺傷した(生細胞の%の低下として表される)。これらの結果から、biMab型は、それが由来した通常の抗体のそれぞれの機能を保持していたことが示される。
実施例8:代表的なbiMabは標的リガンドを阻害する機能活性を保持する。
図18は、biMab−VAによるTie2(Ang2の天然の受容体)リン酸化(図18A)およびVEGFR2(VEGFの天然の受容体)リン酸化(図18B)の阻害を示す。
図18は、biMab−VAによるTie2(Ang2の天然の受容体)リン酸化(図18A)およびVEGFR2(VEGFの天然の受容体)リン酸化(図18B)の阻害を示す。
biMab−VA、抗Ang2(LC06)およびアイソタイプ陰性対照がヒトAng2に結合し、Ang2によるTie2受容体リン酸化を阻止する能力を、以下の手順を用いて判定した。96ウェル培養プレート(Sigma−Aldrich製のCorning Cell−bind組織培養プレート)を用いて、全長ヒトTie2受容体を発現する安定にトランスフェクトされたHEK293細胞株を、10%FBSおよび2μg/mLのピューロマイシンを補充したDMEMで37℃および5%CO2にて増殖させ、次いで18時間血清飢餓させた。細胞を精製ヒト組換えAng2(R&D Systemsカタログ番号623−AN−CF;3.6μg/mLの原液を含むPBSに溶解させたAng2)の存在下で25分間刺激し、biMab−VA、抗Ang2(LC06)あるいはアイソタイプ陰性対照抗体とプレインキュベートした。抗体とAng2との混合物を細胞に加え、120nMの溶液から段階希釈した。次いで40μLの氷***解緩衝液(7mlのRIPA溶解緩衝液、1チューブのHalt阻害剤、ベンゾナーゼ−Thermo Scientific−)で細胞を溶解し、捕捉用にマウス全Tie2抗体(Abcamカタログ番号ab24859)を、検出用にウサギ特異抗体(R&D Systemsカタログ番号AF2720)を用いMeso Scale Discoveryを使用して、Tie2受容体のチロシン992のリン酸化レベルを全細胞ライセートから判定した。
図18Aに示すように、Ang2により媒介されるTie2リン酸化の阻害は、biMab−VA(Ava/LC06、IC50 1.79nM)またはその親の従来の抗Ang2抗体(LC06、IC50 1.72nM)の添加時に同程度である。アイソタイプ陰性対照抗体は、Ang2によるTie2のリン酸化を阻害しない。この実験から、biMab−VA(Ava/LC06)がAng2を機能的に阻害することが明らかにされる。nM単位のIC50(半数阻害濃度)値を模式的に報告する。図示したように、biMab−VA(Ava/LC06)およびその親の従来抗体、抗Ang2(LC06)は類似のIC50を有する。
biMab−VA、抗VEGF抗体およびアイソタイプ陰性対照抗体が、VEGFにより媒介されるVEGFR2リン酸化を阻害する能力を、以下の手順を用いて判定した。ヒトVEGFR受容体(hVEGFR2)を、10%FBS(Invitrogen)を含むDMEM培地で増殖させたAD293細胞に組換え技術により安定に発現させた。96ウェル平底Corning Cell−bind組織培養プレート(Sigma−Aldrich)を用いて、細胞を100μLの培地に15000細胞ウェルで播種した。増殖から24時間後、培地をまったく洗浄せず除去し、DMEM+0.2%FBS+0.1%BSAからなる「飢餓」培地(Sigma−Aldrich)を50μL/ウェルで加えた。次いで細胞を一晩インキュベートした。培地を各ウェルから除去し、飢餓培地で調製した4nMのヒトVEGF165(Peprotechカタログ番号100−20)50μLを細胞に加え、続いて4℃で30分インキュベートした。同時に、biMab−VA、抗VEGF(Ava)およびアイソタイプ陰性対照抗体をさらに加え、200μg/mLから段階希釈した。次いで細胞を7分間37℃でインキュベートし、培地を除去し、洗浄ステップを行わなかった。次いで細胞を40μLの氷***解緩衝液(7mlのRIPA溶解緩衝液、1チューブのHalt阻害剤、ベンゾナーゼ−Thermo Scientific−)で溶解し、Meso Scale Discoveryアッセイキット(MSDカタログ番号K151DJD−2)を使用してVEGFR2のリン酸化を判定した。このキットは、ヒト全細胞ライセートにおいてホスホ−VEGFR−2(Tyr1054)を定量するためのアッセイ特異的成分を提供する。
図18Bに示すように、VEGFにより媒介されるVEGFR2リン酸化の阻害は、biMab−VA(Ava/LC06、IC50 4.58nM)およびその親の従来の抗VEGF抗体(Ava、IC50 4.78nM)の添加時に同程度である。アイソタイプ陰性対照抗体はVEGFによるpVEGFR2のリン酸化を阻害しない。この実験から、biMab−VA(Ava/LC06)がVEGFを機能的に阻害することが明らかにされる。nM単位のIC50(半数阻害濃度)値を模式的に報告する。図示したように、biMab−VA(Ava/LC06)およびその親の従来抗体、抗VEGF(Ava)は類似のIC50を有する。
実施例9:代表的なbiMabの均一なモノマー含有量は濃度を上げても維持される。
図19は、モノマー含有量に有害な影響を与えることなく代表的なbiMabを濃縮することができることを示す。簡単に説明すると、プロテインA、および製造者の推奨に従いCeramic Hydroxyapatite Type II Media(BioRadカタログ番号158−2200)を用いてbiMabタンパク質を高いモノマー含有量に精製し、標準的なランニング緩衝液(0.1mMのリン酸ナトリウム、0.1mMの硫酸ナトリウムpH6.8)でSEC−HPLCにより解析した。精製したモノマータンパク質を25mMのヒスチジン−HCl pH6で一晩透析し、濃縮前のモノマー率を標準的なランニング緩衝液でHPLC−SECにより再び解析した。次いでVivaspin 20,100kDa MWCO(GE healthcareカタログ番号28−9323−63)を用いて1455×gでbiMabを1ミリリットル未満に濃縮し、A280nm吸光度値を読み取り、モル吸光係数1.4を使用して濃度を判定した。濃縮した材料を、0.22ミクロンシリンジフィルターを用いて濾過し、粒子の存在を目視し、25mg/mLに補正した。25mg/mL溶液の250マイクログラムのタンパク質のアリコートを、標準的な緩衝液を使用してHPLC−SECにより解析して濃縮後のモノマー率を判定した。SEC−HPLCは、上記の実施例2に記載されているように行った。
図19は、モノマー含有量に有害な影響を与えることなく代表的なbiMabを濃縮することができることを示す。簡単に説明すると、プロテインA、および製造者の推奨に従いCeramic Hydroxyapatite Type II Media(BioRadカタログ番号158−2200)を用いてbiMabタンパク質を高いモノマー含有量に精製し、標準的なランニング緩衝液(0.1mMのリン酸ナトリウム、0.1mMの硫酸ナトリウムpH6.8)でSEC−HPLCにより解析した。精製したモノマータンパク質を25mMのヒスチジン−HCl pH6で一晩透析し、濃縮前のモノマー率を標準的なランニング緩衝液でHPLC−SECにより再び解析した。次いでVivaspin 20,100kDa MWCO(GE healthcareカタログ番号28−9323−63)を用いて1455×gでbiMabを1ミリリットル未満に濃縮し、A280nm吸光度値を読み取り、モル吸光係数1.4を使用して濃度を判定した。濃縮した材料を、0.22ミクロンシリンジフィルターを用いて濾過し、粒子の存在を目視し、25mg/mLに補正した。25mg/mL溶液の250マイクログラムのタンパク質のアリコートを、標準的な緩衝液を使用してHPLC−SECにより解析して濃縮後のモノマー率を判定した。SEC−HPLCは、上記の実施例2に記載されているように行った。
初濃度および最終濃度をmg/mL単位で示す。作られた各biMabの初濃度を図19に示した表の上半分に、その初濃度で観察されたモノマー含有量(%)と共に示す。これらの初濃度でのモノマー含有量は99%を超えていた。20mg/mLで作られた各biMabのより濃縮された調製物を図19に示した表の下半分に示す。図の上半分の各行を、それ対応する図の下半分の行と比較する(たとえば、図の上半分の第1行を図の下半分の第1行と比較する)と分かるように、biMabは、モノマーを減少させずに濃縮することができる。%で表したモノマー含有量は、SEC−HPLCを用いて判定した。
実施例10:代表的なbiMabと従来の二重特異性を持つ二価抗体型との比較。
抗PcrV抗体V2L2(配列番号43および46)および抗Psl抗体W4−RAD(配列番号48および49)由来の可変領域を含む2つの従来の二重特異性を持つ二価型を用いて、別の二重特異性抗体(たとえば、Dimasi et al.,J Mol.Biol.,2009 393:627−92を参照されたい)を作製した。従来のBs2二重特異性抗体型およびBs3二重特異性抗体型と、同じ可変領域から作製された例示的biMabとを模式化したものを図20に示す。4抗体はすべて、いくつかのインビトロアッセイおよびインビボアッセイで以下の通り試験した。
抗PcrV抗体V2L2(配列番号43および46)および抗Psl抗体W4−RAD(配列番号48および49)由来の可変領域を含む2つの従来の二重特異性を持つ二価型を用いて、別の二重特異性抗体(たとえば、Dimasi et al.,J Mol.Biol.,2009 393:627−92を参照されたい)を作製した。従来のBs2二重特異性抗体型およびBs3二重特異性抗体型と、同じ可変領域から作製された例示的biMabとを模式化したものを図20に示す。4抗体はすべて、いくつかのインビトロアッセイおよびインビボアッセイで以下の通り試験した。
様々な二重特異性抗体およびR347(陰性対照)について、そのRBCの溶解を防止する能力を評価した。簡単に説明すると、抗体を対数期P.エルジノーサ(P.aeruginosa)6077(exoU+)および、洗浄したウサギ赤血球(RBC)と混合し、2時間37°でインキュベートする。インタクトなRBCはペレット状にし、溶解の程度は無細胞上清のOD405を測定することで判定する。抗体の存在下での溶解を、mAbを含まないウェルと比較してRBC溶解の阻害率阻害率を判定する。図21に示すように、二重特異性抗体は親V2L2抗体と同様のレベルでRBC溶解を阻害した。
さらに、単一のBs2(BS2−V2L2−2C)抗体、Bs3抗体およびbiMab抗体は、(DiGiandomenico,A.,et al.,Infect Immun 72,7012−7021(2004))の記載を改変してインビトロオプソニン貪食(OPK)殺傷アッセイでも試験した。簡単に説明すると、アッセイは、OPK要素;P.エルジノーサ(P.aeruginosa)株;希釈幼令ウサギ血清;分化HL−60細胞;およびモノクローナル抗体をそれぞれ0.025ml使用して96ウェルプレートで行った。一部のOPKアッセイでは、記載されているように(Choi,K.H.,et al.,Nat Methods 2,443−448(2005))構築した発光性P.エルジノーサ(P.aeruginosa)株を使用した。発光性OPKアッセイは上記のように行ったが、相対ルシフェラーゼ単位(RLU)の判定にはPerkin Elmer ENVISION Multilabelプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用した。図22に示すように Bs2−V2L2−2CおよびBs4−V2L2−2C抗体は、親W4−RAD抗体と比較して同様の殺傷率を示す。一方、Bs3−V2L2−2C抗体の殺傷率は低下した。このアッセイでは、biMab型は、親抗体型およびBs2二重特異性抗体型の両方と同等の活性を有した。
Bs2−V2L2コンストラクト、Bs3−V2L2コンストラクトおよびBs4−V2L2コンストラクトについて、急性肺炎感染症の生存率をインビボP.エルジノーサ(P.aeruginosa)6202急性肺炎モデルを用いていくつかの試験で評価した。マウス(n=10)は、以下の通り処置した:(試験A)R347(陰性対照、0.2mg/kg)、Bs2−V2L2(0.28mg/kg)、Bs3−V2L2(0.28mg/kg)、V2L2(0.2mg/kg)またはW4−RAD(0.2mg/kg);(試験BおよびC)R347(陰性対照、1mg/kg)、Bs2−V2L2(0.5mg/kgまたは1mg/kg)またはBs4−V2L2−2C(0.5mg/kgまたは1mg/kg);(試験D):R347(陰性対照、1mg/kg)、Bs3−V2L2(0.5mg/kgまたは1mg/kg)またはBs4−V2L2−2C(0.5mg/kgまたは1mg/kg)。処置から24時間後、すべてのマウスに約(6.25×105〜1×106CFU/動物)の6206(O11−ExoU+)を感染させた。すべてのマウスを120時間モニターした。試験結果をそれぞれ図23A〜Dに示す。(A)対照マウスはすべて感染から約30時間で感染で死亡した。Bs3−V2L2動物はV2L2対照を投与された動物と共にすべて生存した。W4−RAD接種動物の約90%は生存した。一方、Bs2−V2L2動物の約50%は120時間で感染で死亡した。(B〜D):対照マウスはすべて感染から約48時間で感染により死亡した。(B):Bs4−V2L2−2Cは1.0および0.5mg/kgの両方でBs2−V2L2と比較して大きな活性を有した。(C):Bs4−V2L2−2Cは1.0mg/kgでBs2−V2L2と比較して大きな活性を有するようであった(結果は統計学的に有意ではない)。(D):Bs4−V2L2−2Cは0.5mg/kgでBs3−V2L2と比較して大きな活性を有した。各抗体コンストラクトの有効性を解析するため、マウスを0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kgまたは15mg/kgで処置し、6206致死的肺炎モデルの生存率について解析した。生存率を、それぞれ比較のため括弧内に示した動物数と共に図24に示した表に示す。
これらのデータから、Bs4−V2L2−2C biMab抗体型がP.エルジノーサ(P.aeruginosa)株6206(ExoU+)をチャレンジしたマウスの致死的肺炎の予防において親W4−RAD抗体+V2L2抗体の混合物として有効であり、かつ従来のBs2二重特異性抗体型およびBs3二重特異性抗体型より少なくとも有効である、あるいはさらにより有効であることが示される。
援用
本明細書に言及した刊行物および特許はすべて、各個別の刊行物または特許を援用するために具体的に個々に示してかのようにその全体を本明細書に援用する。さらに、2011年11月7日に出願された米国仮特許出願第61/556,645号明細書;2012年4月16日に出願された同第61/624,651号明細書;2012年4月17日に出願された同第61/625,299号明細書;2012年9月6日に出願された同第61/697,585号明細書および2012年11月6日に出願された国際出願PCT/US2012/______(代理人整理番号PSEUD−100WO1、「抗シュードモナス(PSEUDOMONAS)PSL結合分子および抗シュードモナス(PSEUDOMONAS)PCRV結合分子を用いた併用療法(COMBINATION THERAPIES USING ANTI− PSEUDOMONAS PSL AND PCRV BINDING MOLECULES)」という名称)をあらゆる目的においてその全体を援用する。
本明細書に言及した刊行物および特許はすべて、各個別の刊行物または特許を援用するために具体的に個々に示してかのようにその全体を本明細書に援用する。さらに、2011年11月7日に出願された米国仮特許出願第61/556,645号明細書;2012年4月16日に出願された同第61/624,651号明細書;2012年4月17日に出願された同第61/625,299号明細書;2012年9月6日に出願された同第61/697,585号明細書および2012年11月6日に出願された国際出願PCT/US2012/______(代理人整理番号PSEUD−100WO1、「抗シュードモナス(PSEUDOMONAS)PSL結合分子および抗シュードモナス(PSEUDOMONAS)PCRV結合分子を用いた併用療法(COMBINATION THERAPIES USING ANTI− PSEUDOMONAS PSL AND PCRV BINDING MOLECULES)」という名称)をあらゆる目的においてその全体を援用する。
本開示の具体的な態様について考察してきたが、上記の記載は例示であり、限定するものではない。本明細書および下記の特許請求の範囲を検討すると、本開示の多くの変更形態が当業者には明らかになるであろう。本開示の全範囲は、特許請求の範囲をその均等物の全範囲と共に、および本明細書をその変更形態と共に参照して決定されるべきである。
Claims (83)
- タンパク質であって、
第1のエピトープに結合するFabアーム、
第2のエピトープに結合する結合ドメイン(BD)、および
CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc領域;
を含み、
前記BDは第1のポリペプチドリンカー(L1)を介して前記Fabアームに、そして第2のポリペプチドリンカー(L2)を介して前記Fc領域に相互に連結されており;かつ前記タンパク質は前記第1および第2の各エピトープへの結合に対して二価である
タンパク質。 - 前記L1は1〜50アミノ酸残基を含む、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記L2は1〜50アミノ酸残基を含む、請求項1または2に記載のタンパク質。
- 前記L1および前記L2は各々1〜50アミノ酸残基を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1および前記L2は各々15〜30アミノ酸残基を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1はヒンジ部分およびリンカー部分を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L2はヒンジ部分およびリンカー部分を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1および前記L2は各々ヒンジ部分およびリンカー部分を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1は抗体ヒンジ領域の少なくとも5アミノ酸残基を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L2は抗体ヒンジ領域の少なくとも5アミノ酸残基含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1は抗体ヒンジ領域の少なくとも7アミノ酸残基含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L2は抗体ヒンジ領域の少なくとも7アミノ酸残基含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L2は抗体ヒンジ領域の少なくとも12アミノ酸残基含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1は抗体ヒンジ領域の8アミノ酸残基含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L2は抗体ヒンジ領域の15アミノ酸残基含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1および前記L2は各々抗体ヒンジ領域または修飾抗体ヒンジ領域の全部または一部を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1は抗体ヒンジ領域の少なくとも5アミノ酸残基含み、かつ前記ヒンジ領域はEU221位にアスパラギン酸からグリシンへの置換を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記ヒンジ領域はシステインが別のアミノ酸で置換されている置換を含む、請求項16または17に記載のタンパク質。
- 前記L2は抗体ヒンジ領域の少なくとも5アミノ酸残基含み、かつ前記ヒンジ領域はEU220位にシステインからバリンへの置換を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載のタンパク質
- 前記L1はGly−Serペプチドを含むリンカー部分を含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L2はGly−Serペプチドを含むリンカー部分を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1および前記L2は各々Gly−Serペプチドを含むリンカー部分を含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記Gly−Serペプチドは式(Gly4Ser)nであり、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9および10からなる群から選択される正の整数である、請求項20〜22のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1はヒンジ部分を含まない、請求項1〜5のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L2はヒンジ部分を含まない、請求項1〜5のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1および前記L2はヒンジ部分を含まない、請求項1〜5のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1はアミノ酸配列EPKSCDKT(配列番号4)を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1はアミノ酸配列EPKSCGKT(配列番号6)を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1はアミノ酸配列EPKSC(配列番号38)を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L2はアミノ酸配列EPKSVDKTHTCPPCP(配列番号12)を含む、請求項1〜23、27〜29のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L2はアミノ酸配列CPPCP(配列番号14)を含む、請求項1〜23、27〜29のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L2はアミノ酸配列DKTHTCPPCP(配列番号40)を含む、請求項1〜23、27〜29のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記BDはscFv、単一ドメイン抗体、一本鎖ダイアボディ、抗体模倣体、抗体可変ドメインおよび受容体結合ドメインからなる群から選択される、請求項1〜32のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記BDはscFvを含む、請求項33に記載のタンパク質。
- 前記scFvはVHドメイン、ポリペプチドリンカーおよびVLドメインを含む、請求項34に記載のタンパク質。
- 前記Fabドメインは前記L1を介して前記scFvの前記VHドメインのN末端に相互に連結される、請求項35に記載のタンパク質。
- 前記Fabドメインは前記L1を介して前記scFvの前記VLドメインのN末端に相互に連結される、請求項35に記載のタンパク質。
- 前記Fc領域は前記L2を介して前記scFvの前記VHドメインのC末端に相互に連結される、請求項35または37に記載のタンパク質。
- 前記Fc領域は前記L2を介して前記scFvの前記VLドメインのC末端に相互に連結される、請求項35または36に記載のタンパク質。
- 前記scFvの前記VLドメインはKabat位置100にシステインを有する、請求項35〜39のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記scFvの前記VHドメインはKabat位置44にシステインを有する、請求項35〜40のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記抗体模倣体はミニボディ、マキシボディ、アビマー、Fn3を用いたタンパク質スキャフォールド、アンキリンリピート、VASPポリペプチド、トリ膵ポリペプチド(aPP)、テトラネクチン、アフィリリン、ノッチン、SH3、PDZドメイン、プロテインAドメイン、リポカリン、トランスフェリンおよびkunitzドメインからなる群から選択される、請求項33に記載のタンパク質。
- 前記Fc領域はIgG1由来のFc領域、IgG2由来のFc領域、IgG3由来のFc領域、IgG4由来のFc領域、IgA由来のFc領域、IgM由来のFc領域、IgE由来のFc領域およびIgD由来のFc領域からなる群から選択される、請求項1〜42のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記Fc領域は変異Fc領域を含む、請求項43に記載のタンパク質。
- 前記Fc領域は非グリコシル化される、請求項43または44に記載のタンパク質。
- 前記Fc領域は脱グリコシル化される、請求項43または44に記載のタンパク質。
- 前記Fc領域はフコシル化を低下させてあるか、または非フコシル化されている、請求項43または44に記載のタンパク質。
- 前記変異Fc領域は297位に置換を含む、請求項44〜47のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 297位の前記置換は297Qである、請求項48に記載のタンパク質。
- 前記変異Fc領域はEUインデックスにより番号付けされた239位、282位、289位、297位、312位、324位、330位、335位、337位、339位、356位、359位、361位、383位、384位、398位、400位、440位、422位および442位の1つまたは複数に置換を含む、請求項43〜49のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記Fabアームの前記CH1ドメインはEUインデックスにより番号付けされた131位、132位、134位、135位、136位および139位の1つまたは複数に置換を含む、請求項1〜50のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 置換はシステイン、リジン、チロシン、ヒスチジン、セレノシステインおよびセレノメチオニンから選択されるアミノ酸への置換を含む、請求項50または51に記載のタンパク質。
- 前記置換はシステインである、請求項52に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質はN末端からC末端に以下のポリペプチドドメインを含むキメラ重鎖を含み
VH1−CH1−L1−BD−L2−Fc;
VH1は前記Fabの前記重鎖可変ドメインを含み、CH1は前記Fabの前記重鎖定常ドメイン1を含み、L1は第1のリンカーポリペプチドを含み、BDは結合ユニット2を含み、L2は第2のリンカーポリペプチドを含み、FcはCH2およびCH3ドメインを含む、請求項1〜53のいずれか一項に記載のタンパク質。 - BDはscFvを含む、請求項54に記載のタンパク質。
- 前記scFvはN末端からC末端に下記を含み、
VH2−ポリペプチドリンカー−VL2またはVL2−ポリペプチドリンカー−VH2;
VH2は前記scFvの前記重鎖可変ドメインを含み、VL2は前記scFvの前記軽鎖可変ドメインを含む、請求項55に記載のタンパク質。 - 前記L1はヒンジ部分およびリンカー部分を含む、請求項54〜56のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L2はヒンジ部分およびリンカー部分を含む、請求項54〜57のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記L1はN末端からC末端にヒンジ部分およびリンカー部分を含む、請求項57または58に記載のタンパク質。
- 前記L2はN末端からC末端にリンカー部分およびヒンジ部分を含む、請求項57〜59のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記第1および第2のエピトープは異なる、請求項1〜60のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記第1および第2のエピトープは同じである、請求項1〜60のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記Fabアームおよび/またはFc領域は少なくとも1つの結合ユニットをさらに含む、請求項1〜62のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記少なくとも1つの結合ユニットはポリペプチドリンカーを介して前記Fabアームおよび/またはFcに相互に連結される、請求項63に記載のタンパク質。
- 前記少なくとも1つの結合ユニットは前記キメラ重鎖のN末端および/またはC末端で相互に連結される、請求項63または64に記載のタンパク質。
- 前記少なくとも1つの結合ユニットは前記軽鎖のN末端および/またはC末端で相互に連結される、請求項63〜65のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記少なくとも1つの結合ユニットは前記重鎖のN末端および/またはC末端で相互に連結され、かつ少なくとも1つの結合ユニットが前記軽鎖のN末端および/またはC末端に相互に連結される、請求項65または66に記載のタンパク質。
- 少なくとも1つの結合ユニットが前記重鎖のN末端およびC末端で相互に連結され、および/または少なくとも1つの結合ユニットが前記軽鎖のN末端およびC末端に相互に連結される、請求項65または80に記載のタンパク質。
- 少なくとも1つの結合ユニットが前記重鎖のN末端およびC末端で相互に連結され、かつ少なくとも1つの結合ユニットが前記軽鎖のN末端およびC末端に相互に連結される、請求項65または66に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質は前記Fabアームと前記Fc領域との間に相互に連結された少なくとも1つの追加の結合ユニットをさらに含む、請求項1〜69のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 少なくとも1つの追加の結合ユニットがL1と前記BDとの間に相互に連結される、請求項70に記載のタンパク質。
- 少なくとも1つの追加の結合ユニットが前記BDとL2との間に相互に連結される、請求項70に記載のタンパク質。
- 少なくとも1つの追加の結合ユニットがポリペプチドリンカーにより前記BDに相互に連結される、請求項71または72に記載のタンパク質。
- 各結合ユニットはFabドメイン、scFv、単一ドメイン抗体、一本鎖ダイアボディ、抗体模倣体、抗体可変ドメインおよび受容体結合ドメインからなる群から選択される、請求項63〜73のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記結合ユニットは各々異なるエピトープに結合する、請求項63〜75のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 2つ以上の結合ユニットが各々同じエピトープに結合する、請求項63〜75のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記少なくとも1つの結合ユニットは前記第1のエピトープおよび/または前記第2のエピトープに結合しない、請求項63〜76のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記少なくとも1つの結合ユニットは前記第1のエピトープに結合せず、かつ前記第2のエピトープにも結合しない、請求項63〜76のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 薬学的に許容されるキャリアを用いて製剤化された、請求項1〜78のいずれか一項に記載のタンパク質を含む組成物。
- 請求項1〜78のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
- 第1のヌクレオチド配列を含む第1の核酸分子および
第2のヌクレオチド配列を含む第2の核酸分子;
を含み、
請求項1〜78のいずれか一項に記載のタンパク質が前記第1および第2の核酸分子によりコードされる
核酸組成物。 - 請求項80または81に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項82に記載のベクターを含む宿主細胞。
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