KR20210122243A - ＴＮＦα 및 ＩＬ-17Ａ에 대한 특이성을 가지는 다중 특이적 항체, ＩＬ-17Ａ를 표적화하는 항체, 그리고 이의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TNFα와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, IL-17A와 특이적으로 결합하는 제2 도메인, 그리고 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 단리 다중 특이적 항체에 관한 것이다. 뿐 아니라, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 상기 항체의 사용 방법, 상기 항체를 포함하는 약학 조성물 및 이의 사용 방법, 그리고 상기 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포, 그리고 상기 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＴＮＦα 및 ＩＬ-17Ａ에 대한 특이성을 가지는 다중 특이적 항체, ＩＬ-17Ａ를 표적화하는 항체, 그리고 이의 사용 방법
본 발명은 TNFα와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, IL-17A와 특이적으로 결합하는 제2 도메인, 그리고 선택적으로 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 단리 다중 특이적 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체의 사용 방법, 상기 항체를 포함하는 약학 조성물 및 이의 사용 방법, 그리고 상기 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포, 그리고 상기 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체, 상기 본 발명의 단리 항체를 포함하는 다중 특이적 분자, 이의 약학 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체를 포함하는 키트, 상기 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포, 그리고 상기 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
TNFα는 면역계의 세포에 의해 방출되고 면역계 세포와 상호작용하는 동종 삼량체 전염증 사이토카인이다. TNFα는 가용성 단백질로서뿐 아니라, 제II형 세포 표면 폴리펩티드로서 발현되는 전구체 형태(경막 TNFα라 지칭됨)로 발견된다. 경막 TNFα는 Ala76 잔기 및 Val77 잔기 사이에서 메탈로프로티나아제, 예컨대 TNFα-전환 효소(TACE)에 의해 가공됨으로써, 157개 아미노산 잔기로 된 TNFα의 가용성 형태로 방출이 이루어진다. 가용성 TNFα는 17-kDa의 절단된 단량체들로 이루어진 동종 삼량체이다. 경막 TNFα도 또한 26-kDa의 미절단 단량체들로 이루어진 동종 삼량체로서 존재한다. 막성 TNFα 및 가용성 TNFα 둘 다는 생물학적으로 활성이다. TNFα는 2개의 수용체, 즉 TNF 수용체 1(TNFR1) 및 TNF 수용체 2(TNFR2)에 결합할 수 있는데, 단 경막 TNFα는 주로 TNFR2를 통해 작용을 한다. TNFR1은 다양한 세포상에 널리 발현되고, TNFα의 TNFR1에 의한 점유는 전염증 반응을 촉발한다. TNFR2 발현은 면역 세포에 거의 배타적으로 제한되고, TNFα와 TNFR2의 결합은 세포 생존 및 증식을 촉진한다(Bazzoni F, Beutler B, N Engl J Med (1996) 334(26):1717-25; Locksley RM, et al., Cell (2001) 104(4):487-501; Cabal-Hierro L, Lazo PS, Cell Signal (2012) 24(6):1297-305; Brenner D, et al., Nat Rev Immunol (2015) 15(6):362-74).
TNFα는 다수의 인간 질환, 예컨대 염증성 및 자가면역성 장애, 예컨대 만성 질환, 예컨대 류머티즘성 관절염, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 장염 및 다발성 경화증에서 상향 조절되는 것으로 확인된 바 있다. TNFα에 대한 항체는 내독소 쇼크의 예방 및 치료용으로서 제안된 바 있다(Beutler et al., Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer외 다수(Critical Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) 그리고 Wherry외 다수(Critical Care Medicine, 21, S436-S440, 1993)는 패혈성 쇼크 치료에서 항 TNFα 항체의 치료적 잠재성을 논의하고 있다. 패혈성 쇼크 치료에서 항 TNFα 항체를 사용하는 것도 또한 Kirschenbaum외 다수(Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998)에 의해 논의되었다. 콜라겐 유도성 관절염은 항 TNFα 모노클로날 항체가 사용되어 유효하게 치료될 수 있다(Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9784-9788, 1992). 류머티즘성 관절염 및 크론병 치료에서 항 TNFα 항체를 사용하는 것은 문헌[Feldman et al., Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998; Adorini et al., Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997; 및 Feldman et al., Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997]에 논의되어 있다. 이러한 치료에서 이전에 사용되었던, TNFα에 대한 항체는 일반적으로 키메라 항체, 예컨대 미국 특허 제5,919,452호에 기재된 바와 같은 키메라 항체이다.
TNFα에 대한 모노클로날 항체는 선행 기술에 기재된 바 있다. Meager외 다수는, 재조합 TNFα에 대한 마우스 모노클로날 항체를 기재하였다 (Hybridoma, 6, 305-311, 1987). Fendly외 다수는, TNFα상 중화 에피토프(neutralizing epitope)를 한정함에 있어 재조합 TNFα에 대한 마우스 모노클로날 항체를 사용한다고 기재하였다(Hybridoma, 6, 359-370, 1987). 뿐 아니라, 국제특허출원 공개공보 WO 92/11383에는 CDR 이식 항체를 비롯하여 TNFα에 특이적인 재조합 항체가 개시되어 있다. Rankin외 다수는 류머티즘성 관절염 치료에서 이러한 CDR 이식 항체를 사용하는 것에 관하여 기재하였다(British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995). 미국 특허 제5,919,452호는, 항 TNFα 키메라 항체와, TNFα의 존재와 연관된 병상을 치료함에 있어 이것을 사용하는 것에 대해 개시하고 있다. 또한, 항 TNFα 항체는 문헌[Stephens et al., Immunology, 85, 668-674, 1995, GB-A-2 246 570, GB-A-2 297 145, 미국 특허 제8,673,310호, US 2014/0193400, EP 2 390 267 B1, 미국 특허 제8,293,235호, 동 제8,697,074호, WO 2009/155723 A2 및 WO 2006/131013 A2]에 개시되어 있다.
현재 승인된 항 TNFα 바이오테라퓨틱스(biotherapeutics)로서는 (i) 인플릭시맙(키메라 IgG 항 인간 모노클로날 항체(레미케이드(Remicade)®; Wiekowski M et al., "Infliximab (Remicade)", Handbook of Therapeutic Antibodies, WILEY-VCH; Weinheim, 2007-01-01, p.885-904)); (ii) 에타너셉트(IgG1 Fc 보유 TNFR2 이량체 융합 단백질(엔브렐(Enbrel)®); (iii) 아달리무맙(전체가 인간의 것인 인간 모노클로날 항체(mAb)(휴미라(Humira)®; Kupper H et al: "Adalimumab (Humira)", Handbook of Therapeutic Antibodies, WILEY-VCH; Weinheim, 2007-01-01, p.697-732)); (iv) 세르톨리주맙(PEG화 Fab 단편(심지아(Cimzia)®; Melmed G Y et al: "Certolizumab pegol", Nature Reviews. Drug Discovery, Nature Publishing Group, GB, Vol. 7, No. 8, 2008-08-01, p.641-642)); (v) 골리무맙(인간 IgG1K 모노클로날 항체(심포니(Simponi)®; Mazumdar S et al: "Golimumab", mAbs, Landes Bioscience, US, Vol. 1, No. 5, 2009-09-01, p.422-431))를 포함한다.
그러나 항 TNFα 치료는 몇 가지 한계를 가지는 것으로 보였다. 모든 환자가 시간이 경과함에 따라 항 TNFα에 대해 충분한 임상 반응을 달성하거나 항 TNFα에 대한 임상 반응을 유지하는 것은 아니었는데, 이 점은 환자들의 질환을 억제하기 위한 신규 치료법으로 바꾸고자 하는 요망에 불을 지폈다. 예를 들어 류머티즘성 관절염(RA) 환자의 항 TNFα 치료가 진행되었을 때, 환자의 약 40%는 반응을 전혀 보이지 않았고, 환자의 단 20%만이 질환 활성도(disease activity)에 유의미한 감소를 경험하였을 따름이었다. 그러므로 이처럼 염증 및 자가면역성 장애와 같은 장애의 진행을 더 효과적으로 억제하는 것에 관한 치료에 대하여 충족되지 않는 임상적 요망은 여전히 간절한 실정이다.
항 TNFα 치료후의 환자에 있어서 상보적 생물학적 경로의 활성화는, 다수의 환자가 왜 항 TNFα 치료법에 반응하지 않는지, 또는 반응하더라도 왜 단지 부분적으로만 반응하는지에 대한 이유의 하나일 수 있다. 최근 나타난 증거는, 염증성 및 자가면역성 장애, 예컨대 RA의 발병에 있어 IL-17A의 역할을 나타낸다.
인간 및 마우스에 있어 인터루킨 17(IL-17) 과는 6개의 사이토카인, 즉 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E(IL-25라고도 칭하여짐) 및 IL-17F로 이루어져 있으며, 급성 및 만성 염증 반응에 관여한다. 인터루킨 17 수용체(IL-17R) 과는 5개의 일원, 즉 IL-17RA, IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD 및 IL-17RE로 이루어져 있다.
인터루킨 17A(IL-17A 또는 IL17A; IL-17 또는 세포독성 T 림프구 연관 항원 8(CTLA-8)과 유의어)는 동종 이량체 전염증 사이토카인이다. IL-17A는 기억 CD4+ T 세포(Th17라 명명됨), CD8+ T 세포(Tc17), 불변(invariant) NKT 세포, γδ T 세포, 비 T 비 B 림프구(제3형 선천적 림프 세포라 명명됨) 및 호중구의 하위세트에 의해 생산된다. IL-17A 및 IL-17F는 IL-17 과에 속하는 변별적 하위군을 형성한다. IL-17A 및 IL-17F는 IL-17 과에서 가장 큰 서열 상동성 및 동일성을 공유하는 반면에, IL-17 과의 다른 일원들은 IL-17A에 대해 유의미하게 낮은 서열 동일성을 보인다(Starnes, T., et al., J Immunol. 167(8):4137-40 (2001); Aggarwal, S. and Gurney, A. L., J. Leukoc Biol, 71(1): 1-8 (2002)). IL-17A 및 IL-17F는 둘 다 IL-17RA 및 IL-17RC로 이루어진 이종 이량체형 수용체 복합체를 통해 신호를 전달한다(Toy D., et al., J Immunol. 2006; Wright JF., et al., J Immunol. 2008; 181(4):2799-2805). IL-17A 및 IL-17F는 IL-17A/A 또는 IL-17F/F 이황화물 결합 동종 이량체 및 IL-17A/F 이황화물 결합 이종 이량체를 형성할 수 있다(Wright JF. et al., J Immunol. 2008; 181(4):2799-2805; Liang SC. et al., J Immunol. 2007; 179(11):7791-7799). IL-17A뿐 아니라 IL-17F는 전염증 사이토카인 및 항 미생물 펩티드의 발현을 유도한다.
인간 IL-17A(CTLA-8, Swiss Prot Q 16552; IL-17 또는 IL17이라고도 지칭됨; 서열 번호 33)는 다양한 염증성 병태, 예컨대 자가면역성 질환, 대사 장애 및 암에 연루되어 있다(Ouyang W., et al., Immunity. 2008; 28(4):454-467; Milner JD., Curr Opin Immunol. 2011; 23(6):784-788; Kuchroo VK., et al., Nat Med. 2012; 18(1):42-47; Ahmed M. and Gaffen SL., Cytokine Growth Factor Rev. 2010; 21(6):449-453; Trinchieri G., Annu Rev Immunol. 2012; 30:677-706; Gallimore AM, Godkin A., N Engl J Med. 2013; 368(3):282-284; Ye P., et al., J Exp Med. 2001; 194(4):519-527; Chung DR., et al., J Immunol. 2003; 170(4):1958-1963; Huang W., et al., J Infect Dis. 2004; 190(3):624-631; Ishigame H., et al., Immunity. 2009; 30(1):108-119; 검토를 위하여는 문헌(Gu C., et al., Cytokine. 2013 Nov 64(2))을 참조함). IL-17A는 호중구 보충(neutrophil recruitment)을 위한 케모카인 및 기타 사이토카인, 급성기 단백질, 항 미생물성 펩티드, 뮤신, 기질 메탈로프로티나아제 및 부착 분자 유도에 관여한다. IL-17A는 또한 기타 사이토카인, 예컨대 TNFα 및 IL-1 베타와 상승 작용을 하여, 케모카인 발현을 한층 더 많이 유도한다(Chabaud M., et al., J. Immunol. 161(1):409-14 (1998)).
IL-17A의 병리학적 생산은 과도한 염증 및 조직 손상을 유도한다(검토를 위하여는 문헌(Gu et al., Cytokine. 2013 November; 64(2))을 참조함). 높은 다발성 경화증(MS), 건선, 천식, 크론병 및 류머티즘성 관절염 환자에서는 IL-17A 수준이 높은 것으로 발견되었다. IL-17A 중화 항체로 동물이 치료되었을 때, 자가면역성 뇌척수염에서 해당 질환의 발생률과 중증도가 감소하였다(Komiyama, Y. et al, J. Immunol. 177 (2006) 566-573). 또한, IL-17A 중화 항체는 마우스의 류머티즘성 관절염 모델, 즉 콜라겐 유도성 관절염 모델의 중증도와 발생률을 낮추고, 류머티즘성 관절염 환자의 염증발생 관절 활액은 IL-17A 수준이 높은것으로 확인될 수 있다(Ziolkowska, M. et al, J. Immunol. 164 (2000) 2832-2838; Kotake, S. et al, J. Clin. Invest. 103 (1999) 1345-1352; Hellings P.W. et al, Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28 (2003) 42-50)
인간 및 동물 모델에서의 실험적 증거 다수는 IL-17A 표적화 치료법의 개발을 뒷 받침하였다. AIN457(세쿠키누맙; 미국 특허 제7, 807,155호 및 WO 2006/013107 참조), LY2439821(익세키주맙; 미국 특허 제7,838,638호 및 동 제8,110,191호 및 WO 2007/070750 참조), SCH900117(Merck), RG4943(Roche) 등을 비롯하여 몇몇 항 IL-17 항체가 개발되었다. 항 IL-17A 항체의 예들은 WO 2006/013107, WO 2006/054059, WO 2007/070750, WO 2007/149032, WO 2008/001063, WO 2008/021156, WO 2010/034443, WO 2010/102251, WO 2012/018767, WO 2014/161570, WO 2014/001368, WO 2014/122613, WO 2015/070697, WO 2015/137843, WO 2016/048188, WO 2016/113557, WO 2016/138842, WO 2017/068472에 개시되어 있다.
IL-17A 신호전달을 차단하는 다양한 분자를 이용하는 몇몇 임상 시험이 수행된 바 있거나 여전히 진행중이다. IL-17A 또는 이의 수용체중 어느 하나를 표적화하는 생물의약품과 이의 효능은 염증성 또는 자가면역성 장애 환경, 예컨대 류머티즘성 관절염, 강직성 척추관절증, 크론병, 건선, 다발성 경화증 및 오존 유도성 호중구증가증에서 평가되고 있다.
예를 들어 세쿠키누맙, 즉 전체가 인간의 것인 인간 IgG1κ 항 IL-17A 모노클로날 항체(미국 특허 제7,807,155호 및 WO 2006/013107)는 현재 건선, 건선 관절염 및 강직성 척추염 반응 치료용으로 승인되어 있다[검토를 위해서는 문헌(Wang et al., Eur J Rheumatol 2017 (4) 272-7)을 참조함]. 건선 관절염 환자에서 세쿠키누맙의 장기 효능 및 안전성을 평가하는 III상 임상 연구(퓨처(FUTURE) I 및 퓨처 II)에서 세쿠키누맙은 건선 관절염의 징후 및 증상을 개선하는데 위약보다 유의미하게 더 유효하였다(Mease PJ. et al. N Engl J Med 2015; 373: 1329-39; McInnes IB. et al. The Lancet; 386:1137-46).
익세키주맙, 즉 인간화된 항 IL-17A 모노클로날 항체(미국 특허 제7,838,638 및 동 제8,110,191호 및 WO 2007/070750)는 생물의약품 치료 이력이 없는(biologic-naive) 활동성 건선 관절염 환자를 대상으로 24주간의 III상 시험(스피릿(SPIRIT)-P1)에서 연구되었다(Mease PJ. Et al., Ann Rheum Dis. 2017 Jan;76(1):79-87). 생물의약품 치료력이 없는 활동성 건선 관절염 환자에 있어 익세키주맙 치료는 질환의 활동성 감소 및 신체 기능의 개선뿐 아니라 구조적 손상 진행의 억제를 달성하였음이 입증되었다. 익세키주맙은 또한 중등도에서 중증의 판형 건선 환자를 치료하는데 유효한 것으로 보였다(Griffiths CEM, et al., The Lancet; 386: 541-51).
브로달루맙은 전체가 인간의 것인 인간 IL-17 수용체(IL-17RA) 모노클로날 항체로서(미국 특허 제7,767,206호 참조), 건선 치료에 유효한 것으로 입증되었다(Papp KA. et al. N Engl J Med 2012; 366: 1181-9). 위약 대조 II상 연구에서는 건선 관절염 환자에 유의미하고 지속적인 반응도 또한 보였다(Mease PJ. et al., N Engl J Med 2014; 370: 2295-306). 하지만, 브로달루맙 치료는 상기도 감염, 피로감, 설사, 자살 충동 및 행동의 호소와 같은 심각한 부작용이 동반되었다[검토를 위해서는 문헌(Wang et al., Eur J Rheumatol 2017 (4) 272-7)을 참조함].
그러므로 IL-17A는 염증성 및 자가면역성 장애의 치료법에서 각광받는 표적이다. 비록 지금까지 다수의 항 IL-17A 항체가 동정되었지만, 염증 반응 및 자가면역성 질환에서 IL-17A 활성을 유효하게 감소 또는 없앨 수 있음과 동시에 안전성 프로필이 개선되었고 개발에 적합한, 개선된 치료 항체의 개발은 여전히 필요하다. 치료 항체는 유리한 친화성, 효능 및 면역원성에 더하여 개선된 생물물리학적 특성을 가져서, 더 나은 개발 가능성과, 고수율 생산성 및 단백질 안정성을 달성해야할 것이다. TNFα 생물학적 경로 및 IL-17A 생물학적 경로 둘 다를 동시에 차단함에 의한 치료는 반응 속도를 유의미하게 개선하는 잠재성을 가지며, TNFα 및 IL-17A에 의해 매개되는 질환의 치료에서 충족되지 않은 요구를 해결해준다. 지금까지 IL-17 및 TNFα 둘 다와 특이적으로 결합하는 생물치료제 몇 가지가 제안되었다. WO 2010/102251(Abbvie Inc.)는 TNFα 및 IL-17 둘 다와 결합하는 이중 특이적 4가 항체를 개시하고 있다. WO 2013/063110(Abbvie Inc.)는 TNF 및 IL-17과 결합할 수 있는 다가 DVD-Ig 결합 단백질을 개시하고 있다. WO 2014/044758(Covagen ACJ)는 당화 IL-17A를 억제하고 TNFα와 결합할 수 있는 융합 구조체를 개시하고 있다. 또한 WO 2014/137961(Eli Lilly and Company) 및 WO 2017/132457(Janssen Biotech)은 항 TNF 및 항 IL-17A 이중 특이적 항체를 개시하고 있다. WO 2017/102830(UCB Biopharma)은 TNFα, IL-17A 및 IL-17F를 억제할 수 있고, 특히 인간 TNFα에 특이적인 결합 도메인과, 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 개시하고 있다. Xu외 다수는 IgG 유사 이중 특이적 항체(bsAb)로서, IgG 유사 분자의 두 팔(arm)이 TNFα 및 IL-17A 각각에 대해 유도된 항체를 제조하였다(Oncotarget, 8 (2017) 81860-81872). 흥미롭게도, WO 2015/014979(Roche, 문헌(Fischer et al., Arthritis & Rheumatology 67 (2015) 51-62)도 또한 참조)는 2개의 항원 각각에 대해 2가("2 + 2" 구조체) 또는 1가("2 + 2" 구조체)인 이중 특이적 4가 IL-17AxTNF 항체 구조체를 개시하고 있다. WO 2015/014979에 따르면, 2가 구조체는 1가 대안 구조체에 비하여 바람직하다고 한다.
그러나, 유의미한 비율의 환자들이 아직도 치료법에 대해 적절하게 반응하지 않는 염증성 및 자가면역성 질환과 같은 장애, 예를 들어 류머티즘성 관절염 치료를 위해 IL-17A 및 TNFα 둘 다의 활성을 유효하게 중화할 수 있는 약물로서 개선된 항 염증 약물에 대한 필요는 여전히 남아 있다. IL-17A 및 TNFα 둘 다의 활성을 유효하게 중화하고, 유리한 친화성과 효능을 가지며, 개선된 안전성 프로필, 예컨대 작은 면역원성을 가지는, 개선된 치료 항체를 개발할 필요도 또한 여전히 존재한다. 더욱이 치료 항체는 더 나은 개발 가능성, 고수율 생산성 및 월등한 항체 안정성을 달성하는, 개선된 생물물리학적 특성을 가져야 할 것이다.
염증성 및 자가면역성 장애의 치료를 개선하는 의약을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명의 항체는 충족되지 않은 의료적 필요를 가지는 환자의 신규 치료 선택권을 제공한다. 본 발명은 IL-17A 및 TNFα를 동시에 억제할 수 있고, 치료법에 사용하기 유리한, 더욱 개선된 특성, 예컨대 더 큰 친화성, 개선된 효능, 선택성, 안전성 등, 더 작은 면역원성 및 개선된 생물물리학적 특성, 예컨대 개발 가능성과 안정성을 가지는 신규 다중 특이적 항체를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인, 그리고 선택적으로는 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 단리 다중 특이적 항체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 의약품으로서 사용하기 위한 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 본 발명의 약학 조성물을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 L-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애 또는 Gro-α 분비를 억제함으로써 치료될 수 있는 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 구체적으로는 염증성 병태 또는 자가면역성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 본 발명의 약학 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 IL-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애 또는 Gro-α 분비를 억제함으로써 치료될 수 있는 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 구체적으로는 염증성 병태 또는 자가면역성 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 본 발명의 약학 조성물의 용도를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 IL-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애 또는 Gro-α 분비를 억제함으로써 치료될 수 있는 장애를 치료하기 위한 의약품을 제조함에 있어, 구체적으로는 염증성 병태 또는 자가면역성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 의?e품을 제조함에 있어 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 본 발명의 약학 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 IL-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애를 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 IL-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 본 발명의 약학 조성물 유효량만큼을 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 본 발명의 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 결합 도메인 또는 이의 단편을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 결합 도메인 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 양태들, 유리한 특징들 및 바람직한 구현예들은 이하 항목들에 요약되어 있으며, 이하 항목들은 각각 단독으로 또는 조합하여 본 발명의 과제를 해결하는데 추가로 기여한다:
1. IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리 다중 특이적 항체.
2. 항목 1의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체는 IL-17A와 특이적으로 결합하는 도메인 단 하나 및/또는 TNFα와 특이적으로 결합하는 도메인 단 하나를 포함하는 다중 특이적 항체.
3. 항목 1 또는 항목 2의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체는 인간 TNFα 및 인간 IL-17A의 생물학적 활성을 중화할 수 있는 다중 특이적 항체.
4. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, ELISA에 의해 측정되는 바에 따르면 상기 항체는 인간 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F보다는 인간 IL-17A에 선택적으로 결합하는 다중 특이적 항체.
5. IL-17A 또는 TNFα 이외의 항원에 대한 특이성을 가지는 제3 도메인을 추가로 포함하는, 선행 항목들중 어느 하나의 다중특이적 항체.
6. 항목 5의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체는 인간 혈청 알부민(HSA)과 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하고, 바람직하게 상기 항체는 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 도메인 단 하나를 포함하는 다중 특이적 항체.
7. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 도메인들은 자체의 각각의 항원 또는 수용체와 동시에 결합할 수 있는 다중 특이적 항체.
8. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 제1 도메인 및 상기 제2 도메인, 그리고 선택적으로 상기 제3 도메인은 독립적으로 Fab, Fv, scFv, dsFv, scAb, STAB, 단일 도메인 항체(sdAb 또는 dAb), 단일 도메인 중쇄 항체, 단일 도메인 경쇄 항체, VHH, VNAR, 상어 유래 VNAR 구조 기반 단일 도메인 항체, 그리고 대안적 스캐폴드(scaffold) 기반 결합 도메인, 예컨대 안키린 기반 도메인, 파이노머, 아비머, 안티칼린, 피브로넥틴, 및 항체의 불변 영역으로 구축될 결합 부위들(예컨대 F-star의 Modular AntibodyTechnologyTM)(이에 한정되는 것은 아님)로 이루어진 군, 바람직하게는 Fab, Fv 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게 상기 제1 도메인 및/또는 상기 제2 도메인 및/또는 상기 제3 도메인은 Fv 또는 scFv인 다중 특이적 항체.
9. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 다중 특이적 항체는 단일 사슬 다이아바디(scDb), 탠덤 scDb(Tandab), 선형 이량체 scDb(LD-scDb), 원형 이량체 scDb(CD-scDb), 2중 특이적 T 세포 점유체(Bispecific T-cell Engager; BiTE; 탠덤 디-scFv), 탠덤 트리-scFv, 트리바디(Fab-(scFv)2), 바이바디(Fab-(scFv)1), Fab, Fab-Fv2, Morrison(IgG CH3-scFv 융합체(Morrison L) 또는 IgG CL-scFv 융합체(Morrison H)), 트리아바디, scDb-scFv, 2중 특이적 Fab2, 디-미니항체, 테트라바디, scFv-Fc-scFv 융합체, scFv-HSA-scFv 융합체, 디-다이아바디, DVD-Ig, COVD, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, IgG-scFv 융합체, 예컨대 bsAb(경쇄의 C 말단에 결합된 scFv), Bs1Ab(경쇄의 N 말단에 결합된 scFv), Bs2Ab(중쇄의 N 말단에 결합된 scFv), Bs3Ab(중쇄의 C 말단에 결합된 scFv), Ts1Ab(경쇄와 중쇄 둘 다의 N 말단에 결합된 scFv), Ts2Ab(중쇄의 C 말단에 결합된 dsscFv), 이종 이량체 Fc 도메인을 기반으로 하는 2중 특이적 항체, 예컨대 납-인투-홀(Knob-into-Hole) 항체(KiH); Fv, scFv, scDb, 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv, Fab-(scFv)2, Fab-(scFv)1, Fab, Fab-Fv2, 이종 이량체 Fc 도메인 또는 기타 임의의 이종 이량체 도메인의 사슬 중 어느 하나의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합된 COVD, MATCH 그리고 듀오바디(DuoBody)로 이루어진 군으로부터 선택된 포맷을 취하고, 바람직하게는 트리바디 또는 scDb-scFv을 취하는 다중 특이적 항체.
10. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체는 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하지 않고, 선택적으로는 CH1 영역 및/또는 CL 영역을 포함하지 않는 다중 특이적 항체.
11. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체는 트리바디인 다중 특이적 항체.
12. 항목 11의 다중 특이적 항체로서, 상기 제1 도메인, 상기 제2 도메인 및 상기 제3 도메인은 독립적으로 Fab 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게 상기 제2 도메인은 Fab이고, 상기 제1 도메인 및 제3 도메인은 scFv인 다중 특이적 항체.
13. 항목 9의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체는 scDb-scFv이고, 바람직하게 상기 scFv부는 C 말단에서 scDb에 융합되고, 더욱 바람직하게 상기 제1 도메인 및 상기 제2 도메인은 scDb를 형성하며, 상기 제3 도메인은 scFv인 다중 특이적 항체.
14. 항목 13의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체는 하기 식, 즉 VLA - L1 - VHC - L2 - VLC - L3 - VHA - L4 - VLB - L5 - VHB 또는 VLB - L1 - VHA - L2 - VLA - L3 - VHB - L4 - VLC - L5 - VHC 또는 VLC - L1 - VHB - L2 - VLB - L3 - VHC - L4 - VLA- L5 - VHA 또는 VLA - L1 - VHB - L2 - VLB - L3 - VHA - L4 - VLC - L5 - VHC, 바람직하게 VLB - L1 - VHA - L2 - VLA - L3 - VHB - L4 - VLC - L5 - VHC 또는 VLA - L1 - VHB - L2 - VLB - L3 - VHA - L4 - VLC - L5 - VHC, 더욱 바람직하게 VLB - L1 - VHA - L2 - VLA - L3 - VHB - L4 - VLC - L5 - VHC로 표시되되, VLA 및 VHA는 각각 제1 도메인의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이고; VLB 및 VHB는 각각 제2 도메인의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이고; VLC 및 VHC는 각각 제3 도메인의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이고, L1, L2, L3, L4 및 L5는 폴리펩티드 링커인 다중 특이적 항체.
15. 항목 14의 다중 특이적 항체로서, 상기 L1 및 L3는 서열 번호 132에 제시된 바와 같은 다중 특이적 항체.
16. 항목 14 내지 15중 임의의 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 L2, L4 및 L5는 서열 번호 23에 제시된 바와 같은 다중 특이적 항체.
17. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체는 하기의 특성들을 가지는, 즉 상기 항체는
(a) HT-29 검정에서 Gro-α 분비 측정에 의해 확정되는 역가, 즉 세쿠키누맙의 역가를 기준으로 하였을 때 2 이상의 역가(상대적 역가; relative potency), 예컨대 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 바람직하게는 50 이상의 역가로 IL-17A를 중화하는 능력을 가지고[단 상기 상대적 역가는 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은 세쿠키누맙의 IC50 값(ng/mL) 대 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은 상기 다중 특이적 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비임];
(b) HT-29 검정에서 Gro-α 분비 측정에 의해 확정되는 역가, 즉 서열 번호 149에 따른 scDb(A13)의 역가를 기준으로 하였을 때 적어도 1의 역가(상대적 역가), 예컨대 1 이상, 1.5 이상, 2 이상, 2.5 이상, 3 이상, 3.5 이상, 바람직하게는 4 이상, 더욱 바람직하게는 4.5 이상의 역가로 TNFα를 중화하는 능력을 가지고[단 상기 상대적 역가는 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은, 서열 번호 149에 따른 상기 scDb의 IC50 값(nM) 대 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은 상기 다중 특이적 항체의 IC50 값(nM)의 비임];
(c) 선택적으로 ELISA 검정에서 확정되는 역가, 즉 세쿠키누맙의 역가를 기준으로 하였을 때 2 이상의 역가(상대적 역가), 예컨대 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 바람직하게는 10 이상의 역가로 IL-17A와 IL-17RA 사이의 상호작용을 차단하는 능력을 가지고[단 상기 상대적 역가는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 세쿠키누맙의 IC50 값(ng/mL) 대 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 상기 다중 특이적 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비임];
(d) 선택적으로 L929 검정에서 확정되는 역가, 즉 서열 번호 149에 따른 scDb(A13)의 역가를 기준으로 하였을 때 적어도 0.4의 역가(상대적 역가), 예컨대 적어도 0.5, 적어도 1의 역가로 TNFα를 중화하는 능력을 가지고[단 상기 상대적 역가는 L929 검정에서 측정된 바와 같은, 서열 번호 149에 따른 상기 scDb의 IC50 값(nM) 대 L929 검정에서 측정된 바와 같은 상기 다중 특이적 항체의 IC50 값(nM)의 비임];
(e) 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 바람직하게 0.5 nM 미만으로 인간 IL-17A와 결합하고, 선택적으로 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 KD 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 바람직하게 0.5 nM 미만으로 사이노몰거스 IL-17A와 결합하고;
(f) 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 바람직하게 0.5 nM 미만, 더욱 바람직하게 0.25 nM 미만으로 인간 TNFα와 결합하고;
(g) 선택적으로 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 바람직하게 2 nM 미만으로 인간 혈청 알부민과 결합하고, 선택적으로는 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 바람직하게 2 nM 미만으로 사이노몰거스 혈청 알부민과 결합하는, 다중 특이적 항체.
18. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 항체는 하기의 특성들을 가지는, 즉 상기 항체는
(a) 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4, 150 mM NaCl 포함)중 시차주사형광측정법(differential scanning fluorimetry)에 의해 확정된 용융 온도(Tm)가 적어도 55℃, 바람직하게 적어도 58℃, 더욱 바람직하게 적어도 60℃이고;
(b) 상기 다중 특이적 항체의 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.4)중 출발 농도가 10 mg/ml일 때, 5회 연속 동결-해동 주기 후 단량체 함량 감소율이 5% 미만, 예컨대 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 바람직하게 1% 이하이고;
(c) 상기 다중 특이적 항체의 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.4)중 출발 농도가 10 mg/ml일 때, 적어도 2주, 특히 적어도 4주 동안 4℃에 보관하였을 때 단량체 함량 감소율이 10% 미만, 바람직하게 5% 미만이고/이거나;
(d) 상기 다중 특이적 항체의 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.4)중 출발 농도가 10 mg/ml일 때, 적어도 2주, 특히 적어도 4주 동안 37℃에 보관하였을 때 단량체 함량 감소율이 20% 미만, 바람직하게 15% 미만인, 다중 특이적 항체.
19. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, 각각의 도메인은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되
(a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 엉역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 이 순서로 포함하고,
(b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하는 다중 특이적 항체.
20. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, IL-17A와 특이적으로 결합하는 상기 제1 도메인은 CDR들의 세트, 즉 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하고; 이 CDR들의 세트는, (i) HCDR1'은 서열 번호 1에 제시된 바와 같고; HCDR2'는 서열 번호 2에 제시된 바와 같고; HCDR3'는 서열 번호 3에 제시된 바와 같고; LCDR1'는 서열 번호 12에 제시된 바와 같고; LCDR2'는 서열 번호 13에 제시된 바와 같고; LCDR3'는 서열 번호 14에 제시된 바와 같거나, 또는 (ii) HCDR1'는 서열 번호 39에 제시된 바와 같고; HCDR2'는 서열 번호 40에 제시된 바와 같고; HCDR3'는 서열 번호 41에 제시된 바와 같고; LCDR1'는 서열 번호 50에 제시된 바와 같고; LCDR2'는 서열 번호 51에 제시된 바와 같고; LCDR3'는 서열 번호 52에 제시된 바와 같은 CDR들의 세트에 10개 이하의 아미노산 치환이 발생한 것인, 다중 특이적 항체.
21. 항목 20의 다중 특이적 항체로서,
(i)(a) 상기 HCDR1은 서열 번호 1, 4 및 7중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(b) 상기 HCDR2는 서열 번호 2, 5 및 8중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(c) 상기 HCDR3은 서열 번호 3, 6 및 9중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(d) 상기 LCDR1은 서열 번호 12, 15 및 18중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(e) 상기 LCDR2는 서열 번호 13, 16 및 19중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(f) 상기 LCDR3은 서열 번호 14, 17 및 20중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같거나; 또는
(ii)(a) 상기 HCDR1은 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(b) 상기 HCDR2는 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(c) 상기 HCDR3은 서열 번호 41, 44 및 47중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(d) 상기 LCDR1은 서열 번호 50, 53 및 56중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(e) 상기 LCDR2는 서열 번호 51, 54 및 57중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(f) 상기 LCDR3은 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같은, 다중 특이적 항체.
22. (i) 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각, 또는 (ii) 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하는, 항목 21의 다중 특이적 항체.
23. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, IL-17A와 특이적으로 결합하는 상기 제1 도메인은 중쇄 가변 영역 VHA를 포함하고, 상기 VHA는 VH3 또는 VH4, 바람직하게는 VH3인 다중 특이적 항체.
24. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, IL-17A와 특이적으로 결합하는 상기 제1 도메인은 경쇄 가변 영역 VLA를 포함하고, 상기 VLA는 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 바람직하게 Vκ1 FR1 ~ FR3, 및 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4, Vκ3 FR4, 및 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 26 또는 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 더욱 바람직하게 서열 번호 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4로부터 선택된 틀 FR4를 포함하는, 다중 특이적 항체.
25. 항목 23 내지 24중 임의의 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 VHA는 (i) 아미노산 서열인 서열 번호 10과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 VLA는 아미노산 서열인 서열 번호 21과 적어도 90% 동일하거나, 또는 (ii) 아미노산 서열인 서열 번호 48과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 VLA는 아미노산 서열인 서열 번호 59와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 다중 특이적 항체.
26. 항목 25의 다중 특이적 항체로서, 상기 VHA는 (i) 서열 번호 10 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 VLA는 서열 번호 21 및 22로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 (ii) 서열 번호 48 및 49로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 VLA는 서열 번호 59 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 다중 특이적 항체.
27. 항목 26의 다중 특이적 항체로서, (i) 서열 번호 10의 VHA 서열 및/또는 서열 번호 21의 VLA 서열, 또는 (ii) 서열 번호 48의 VHA 서열 및/또는 서열 번호 59의 VLA 서열 포함하는 다중 특이적 항체.
28. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 CDR들의 세트, 즉 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하고, 이 CDR들의 세트는, HCDR1'은 서열 번호 63에 제시된 바와 같고; HCDR2'는 서열 번호 64에 제시된 바와 같고; HCDR3'는 서열 번호 65에 제시된 바와 같고; LCDR1'는 서열 번호 76에 제시된 바와 같고; LCDR2'는 서열 번호 77에 제시된 바와 같고; LCDR3'는 서열 번호 78에 제시된 바와 같은 CDR들의 세트에 10개 이하의 아미노산 치환이 발생한 것인, 다중 특이적 항체.
29. 항목 28의 다중 특이적 항체로서,
(a) 상기 HCDR1은 서열 번호 63, 66 및 69중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(b) 상기 HCDR2는 서열 번호 64, 67 및 70중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(c) 상기 HCDR3은 서열 번호 65, 68 및 71중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(d) 상기 LCDR1은 서열 번호 76, 79 및 82중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(e) 상기 LCDR2는 서열 번호 77, 80 및 83중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(f) 상기 LCDR3은 서열 번호 78, 81 및 84중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같은, 다중 특이적 항체.
30. 항목 29의 다중 특이적 항체로서, 서열 번호 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 76, 77 및 78의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하는 다중 특이적 항체.
31. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 중쇄 가변 영역 VHB를 포함하고, 상기 VHB는 VH3 또는 VH4, 바람직하게 VH3인 다중 특이적 항체.
32. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체로서, TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 경쇄 가변 영역 VLB를 포함하고, 상기 VLB는 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 바람직하게 Vκ1 FR1 ~ FR3, 및 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4, Vκ3 FR4, 및 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 26 또는 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 더욱 바람직하게 서열 번호 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4로부터 선택된 틀 FR4를 포함하는, 다중 특이적 항체.
33. 항목 31 내지 32중 임의의 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 VHB는 서열 번호 72, 73, 74 및 75로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 72와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 VLB는 서열 번호 85, 86, 87, 88 및 89로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 85와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 다중 특이적 항체.
34. 항목 33의 다중 특이적 항체로서, 상기 VHB는 서열 번호 72, 73, 74 및 75로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 VLB는 서열 번호 85, 86, 87, 88 및 89로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 다중 특이적 항체.
35. 항목 34의 다중 특이적 항체로서, (i) 서열 번호 72의 VHB 서열 및/또는 서열 번호 85의 VLB 서열; 또는 (ii) 서열 번호 75의 VHB 서열 및/또는 서열 번호 88의 VLB 서열; 또는 (iii) 서열 번호 75의 VHB 서열 및/또는 서열 번호 89의 VLB 서열을 포함하는, 다중 특이적 항체.
36. 항목 6 내지 35중 임의의 하나의 다중 특이적 항체로서, HSA와 특이적으로 결합하는 상기 제3 도메인은 CDR들의 세트, 즉 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하고, 이 CDR들의 세트는,
(a) HCDR1'는 서열 번호 90에 제시된 바와 같고; HCDR2'는 서열 번호 91에 제시된 바와 같고; HCDR3'은 서열 번호 92에 제시된 바와 같고; LCDR1'는 서열 번호 100에 제시된 바와 같고; LCDR2'는 서열 번호 101에 제시된 바와 같고; LCDR3'는 서열 번호 102에 제시된 바와 같거나; 또는
(b) HCDR1'는 서열 번호 111에 제시된 바와 같고; HCDR2'는 서열 번호 112에 제시된 바와 같고; HCDR3'은 서열 번호 113에 제시된 바와 같고; LCDR1'는 서열 번호 120에 제시된 바와 같고; LCDR2'는 서열 번호 121에 제시된 바와 같고; LCDR3'는 서열 번호 122에 제시된 바와 같은, CDR들의 세트에 10개 이하의 아미노산 치환이 발생한 것인, 다중 특이적 항체.
37. 항목 36의 다중 특이적 항체로서,
(a) 상기 HCDR1은 서열 번호 90, 93 및 96중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 HCDR2는 서열 번호 91, 94 및 97중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 HCDR3은 서열 번호 92, 95 및 98중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 LCDR1은 서열 번호 100, 103 및 106중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 LCDR2는 서열 번호 101, 104 및 107중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 LCDR3은 서열 번호 102, 105 및 108중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같거나; 또는
(b) 상기 HCDR1은 서열 번호 111, 114 및 117중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 HCDR2는 서열 번호 112, 115 및 118중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 HCDR3은 서열 번호 113, 116 및 119중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 LCDR1은 서열 번호 121, 124 및 127중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 LCDR2는 서열 번호 122, 125 및 128중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 LCDR3은 서열 번호 123, 126 및 129중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같은, 다중 특이적 항체.
38. 항목 37의 다중 특이적 항체로서,
(a) 서열 번호 90, 91 및 92의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 100, 101 및 102의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각; 또는
(b) 서열 번호 111, 112 및 113의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 121, 122 및 123의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각
을 포함하는 다중 특이적 항체.
39. 항목 6 내지 38중 임의의 하나의 다중 특이적 항체로서, HSA와 특이적으로 결합하는 상기 제3 도메인은 중쇄 가변 영역 VHC를 포함하고, 상기 VHC는 VH3 또는 VH4, 바람직하게 VH3인 다중 특이적 항체.
40. 항목 6 내지 39중 임의의 하나의 다중 특이적 항체로서, HSA와 특이적으로 결합하는 상기 제3 도메인은 경쇄 가변 영역 VLC를 포함하고, 상기 VLC는 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 바람직하게 Vκ1 FR1 ~ FR3 및 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4, Vκ3 FR4, 및 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 26 또는 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 더욱 바람직하게 서열 번호 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4로부터 선택된 틀 FR4를 포함하는, 다중 특이적 항체.
41. 항목 39 내지 40중 임의의 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 VHC는 아미노산 서열인 서열 번호 99와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 VLC는 아미노산 서열인 서열 번호 109와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 다중 특이적 항체.
42. 항목 41의 다중 특이적 항체로서, 서열 번호 99의 VHC 서열 및/또는 서열 번호 109의 VLC 서열을 포함하는 다중 특이적 항체.
43. 항목 39 내지 40중 임의의 하나의 다중 특이적 항체로서, 상기 VHC는 아미노산 서열인 서열 번호 110과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 VLC는 아미노산 서열인 서열 번호 120과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 다중 특이적 항체.
44. 항목 43의 다중 특이적 항체로서, 서열 번호 110의 VHC 서열 및/또는 서열 번호 120의 VLC 서열을 포함하는 다중 특이적 항체.
45. 선행 항목들 중 임의의 항목의 다중 특이적 항체로서, 항체는 인간화된 것인 다중 특이적 항체.
46. 선행 항목들중 임의의 항목의 다중 특이적 항체로서, 항체는 서열 번호 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147 및 148중 임의의 것으로부터 선택된 서열, 바람직하게 서열 번호 143의 서열에 대해 적어도 80%의 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, CDR은 항목 22, 30 및 38의 (a)에 따른 서열을 가지는 다중 특이적 항체.
47. 선행 항목들중 임의의 항목의 다중 특이적 항체로서, 항체는 서열 번호 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147 및 148중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게는 서열 번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 다중 특이적 항체.
48. 선행 항목들중 어느 하나의 다중 특이적 항체와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
49. 의약품으로 사용하기 위한, 항목 1 내지 47중 어느 하나의 다중 특이적 항체, 또는 항목 48의 약학 조성물.
50. IL-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애 또는 Gro-α 분비를 억제함으로써 치료될 수 있는 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 항목 1 내지 47중 어느 하나의 다중 특이적 항체, 또는 항목 48의 약학 조성물.
51. 염증성 병태 또는 자가면역성 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 항목 1 내지 47중 어느 하나의 다중 특이적 항체, 또는 항목 48의 약학 조성물.
52. 암, 관절염, 류머티즘성 관절염, 골관절염, 반응성 관절염, 건선, 만성 폐색성 폐질환, 전신 홍반성 낭창(SLE), 낭창성 신염, 자가면역 염증성 장 질환, 천식, 다발성 경화증, 낭포성 섬유증, 골 손실, 기도 과민증, 탈수초 장애, 피부 과민증, 급성 이식편 거부, 동종이식편 거부, 이식편대숙주병, 전신 경화증, 비뇨기 염증 장애, 심혈관질환, 혈관염, 주기열, 당 대사 장애, 폐질환, 치주염, 간기질각화증(hepatic stromal keratitis), 알레르기, 염증성 통증, 척추관절증, 패혈증, 패혈성 또는 내독소 쇼크, 뇌수막염, 수술외상, 자가면역성 혈액학적 장애, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 사르코이드증, 간경변, 간염, 사구체신염 또는 이상지질혈증을 치료하는데 사용하기 위한, 항목 1 내지 47중 어느 하나의 다중 특이적 항체, 또는 항목 48의 약학 조성물.
53. IL-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애 또는 Gro-α 분비를 억제함으로써 치료될 수 있는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 의약품을 제조함에 있어 항목 1 내지 47중 어느 하나의 다중 특이적 항체 또는 항목 48의 약학 조성물의 용도,
54. 염증성 병태 또는 자가면역성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 의약품을 제조함에 있어 항목 1 내지 47중 어느 하나의 다중 특이적 항체 또는 항목 48의 약학 조성물의 용도.
55. 암, 관절염, 류머티즘성 관절염, 골관절염, 반응성 과?∃㈎?, 건선, 만성 폐색성 폐질환, 전신 홍반성 낭창(SLE), 낭창성 신염, 자가면역 염증성 장 질환, 천식, 다발성 경화증, 낭포성 섬유증, 골 손실, 기도 과민증, 탈수초 장애, 피부 과민증, 급성 이식편 거부, 동종이식편 거부, 이식편대숙주병, 전신 경화증, 비뇨기 염증 장애, 심혈관질환, 혈관염, 주기열, 당 대사 장애, 폐질환, 치주염, 간기질각화증, 알레르기, 염증성 통증, 척추관절증, 패혈증, 패혈성 또는 내독소 쇼크, 뇌수막염, 수술외상, 자가면역성 혈액학적 장애, 알츠하이머병, 사르코이드증, 간경변, 간염, 사구체신염 또는 이상지질혈증을 치료하는데 사용하기 위한 의약품을 제조함에 있어 항목 1 내지 47중 어느 하나의 다중 특이적 항체 또는 항목 48의 약학 조성물의 용도.
56. IL-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 47중 어느 하나의 다중 특이적 항체 또는 항목 48의 약학 조성물 유효량만큼을 투여하여 해당 병태를 완화시키는 단계를 포함하는 방법.
57. 항목 56에 따른 방법으로서, IL-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애는 염증성 병태 또는 자가면역성 질환인 방법.
58. 항목 56에 따른 방법으로서, IL-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애는 암, 관절염, 류머티즘성 관절염, 골관절염, 반응성 관절염, 건선, 만성 폐색성 폐질환, 전신 홍반성 낭창(SLE), 낭창성 신염, 자가면역 염증성 장 질환, 천식, 다발성 경화증, 낭포성 섬유증, 골 손실, 기도 과민증, 탈수초 장애, 피부 과민증, 급성 이식편 거부, 동종이식편 거부, 이식편대숙주병, 전신 경화증, 비뇨기 염증 장애, 심혈관질환, 혈관염, 주기열, 당 대사 장애, 폐질환, 치주염, 간기질각화증, 알레르기, 염증성 통증, 척추관절증, 패혈증, 패혈성 또는 내독소 쇼크, 뇌수막염, 수술외상, 자가면역성 혈액학적 장애, 알츠하이머병, 사르코이드증, 간경변, 간염, 사구체신염 또는 이상지질혈증인 방법.
59. 항목 1 내지 47중 어느 하나의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산.
60. 항목 59의 핵산을 포함하는 벡터.
61. 항목 59의 핵산 또는 항목 60의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
62. 항목 1 내지 47중 어느 하나의 다중 특이적 항체를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 항목 1 내지 47중 어느 하나의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
63. 항목 1 내지 47중 어느 하나의 다중 특이적 항체 또는 항목 48의 약학 조성물을 포함하는 키트.
개선된 친화성, 효능 및 개선된 생물물리학적 특성, 예컨대 개선된 가용성, 개발가능성 및 안정성을 가지는 항 IL-17A 항체를 제공하는 것은 본 발명의 또 다른 목적이다.
본 발명의 항 IL-17A 항체는 치료법에 사용하기 유리한, 개선된 특성, 예컨대 큰 친화성, 개선된 효능, 선택성, 개선된 생물물리학적 특성, 예컨대 가용성, 개발가능성 및 안정성을 가진다.
따라서 일 양태에서, 본 발명은 인간 IL-17A에 대해 결합 특이성을 가지고, 구체적으로는 CDR들의 세트, 즉 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하며, 이 CDR들의 세트는, HCDR1'은 서열 번호 1, 4 및 7중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고; HCDR2'는 서열 번호 2, 5 및 8중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고; HCDR3'는 서열 번호 3, 6 및 9중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고; LCDR1'는 서열 번호 12, 15 및 18중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고; LCDR2'는 서열 번호 13, 16 및 19중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고; LCDR3'는 서열 번호 14, 17 및 20중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 CDR들의 세트에 10개 이하, 바람직하게는 0개의 아미노산 치환이 발생한 것인, 단리 항체를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단리 항체를 포함하는 다중 특이적 분자에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지는 단리 항체, 구체적으로 CDR들의 세트, 즉 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하며, 이 CDR들의 세트는, HCDR1'은 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고; HCDR2'는 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고; HCDR3'는 서열 번호 41, 44 및 47중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고; LCDR1'는 서열 번호 50, 53 및 56중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고; LCDR2'는 서열 번호 51, 54 및 57중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고; LCDR3'는 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 CDR들의 세트에 10개 이하, 바람직하게는 0개의 아미노산 치환이 발생한 것인, 단리 항체를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단리 항체를 포함하는 다중 특이적 분자에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단리 항체, 또는 본 발명의 단리 항체를 포함하는 다중 특이적 분자, 그리고 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 의약품으로서 사용하기 위한, 본 발명의 항체, 또는 상기 단리 항체를 포함하는 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 IL-17A에 의해 매개되는 장애 또는 GRO-α 분비를 억제함으로써 치료될 수 있는 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명의 항체, 또는 상기 단리 항체를 포함하는 다중 특이적 분자, 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 IL-17A에 의해 매개되는 장애, 또는 GRO-α 분비를 억제함으로써 치료될 수 있는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 의약품을 제조함에 있어 본 발명의 항체, 또는 상기 단리 항체를 포함하는 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 IL-17A에 의해 매개되는 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 항체, 또는 본 발명의 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물 유효량만큼을, IL-17A에 의해 매개되는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 본 발명은 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 양태들, 유리한 특징들 및 바람직한 구현예들은 이하 항목에 요약되었으며, 이는 각각 단독으로나 조합되었을 때 본 발명의 과제를 해결하는데 추가로 기여한다:
1. CDR들의 세트, 즉 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하고, 인간 IL-17A에 대하여 결합 특이성을 가지는 항체로서, 이 CDR들의 세트는
(i) HCDR1'은 서열 번호 1, 4 및 7중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고;
HCDR2'는 서열 번호 2, 5 및 8중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고;
HCDR3'은 서열 번호 3, 6 및 9중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고;
LCDR1'은 서열 번호 12, 15 및 18중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고;
LCDR2'는 서열 번호 13, 16 및 19중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고;
LCDR3'은 서열 번호 14, 17 및 20중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이거나; 또는
(ii) HCDR1'은 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고;
HCDR2'는 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고;
HCDR3'은 서열 번호 41, 44 및 47중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고;
LCDR1'은 서열 번호 50, 53 및 56중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고;
LCDR2'는 서열 번호 51, 54 및 57중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열이고;
LCDR3'은 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열인 CDR들의 세트에 10개 이하의 아미노산 치환이 발생한 것인 항체.
2. CDR들의 세트, 즉 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하는 항목 1의 항체로서, 이 CDR들의 세트는
(i) HCDR1'은 서열 번호 1에 제시된 바와 같고;
HCDR2'는 서열 번호 2에 제시된 바와 같고;
HCDR3'는 서열 번호 3에 제시된 바와 같고;
LCDR1'는 서열 번호 12에 제시된 바와 같고;
LCDR2'는 서열 번호 13에 제시된 바와 같고;
LCDR3'는 서열 번호 14에 제시된 바와 같거나, 또는
(ii) HCDR1'는 서열 번호 39에 제시된 바와 같고;
HCDR2'는 서열 번호 40에 제시된 바와 같고;
HCDR3'는 서열 번호 41에 제시된 바와 같고;
LCDR1'는 서열 번호 50에 제시된 바와 같고;
LCDR2'는 서열 번호 51에 제시된 바와 같고;
LCDR3'는 서열 번호 52에 제시된 바와 같은 CDR들의 세트에 10개 이하의 아미노산 치환이 발생한 것인 항체.
3. 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항목 1 또는 항목 2의 항체로서,
(c) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 이 순서로 포함하고,
(d) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하는 항체.
4. 항목 3의 항체로서,
(i) (g) 상기 HCDR1은 서열 번호 1, 4 및 7중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(h) 상기 HCDR2는 서열 번호 2, 5 및 8중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(i) 상기 HCDR3은 서열 번호 3, 6 및 9중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(j) 상기 LCDR1은 서열 번호 12, 15 및 18중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(k) 상기 LCDR2는 서열 번호 13, 16 및 19중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(l) 상기 LCDR3은 서열 번호 14, 17 및 20중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같거나; 또는
(ii) (a) 상기 HCDR1은 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(b) 상기 HCDR2는 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(c) 상기 HCDR3은 서열 번호 41, 44 및 47중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(d) 상기 LCDR1은 서열 번호 50, 53 및 56중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(e) 상기 LCDR2는 서열 번호 51, 54 및 57중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고;
(f) 상기 LCDR3은 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 항체.
5. 항목 4의 항체로서, 항체는 (i) 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각, 또는 (ii) 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하는 항체.
6. 항목 3 내지 5중 어느 하나의 항체로서, 상기 VH는 VH3 또는 VH4, 바람직하게 VH3인 항체.
7. 항목 3 내지 6중 어느 하나의 항체로서, 상기 VL은 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 바람직하게 Vκ1 FR1 ~ FR3, 및 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4, Vκ3 FR4, 및 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 26 또는 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 더욱 바람직하게 서열 번호 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4로부터 선택된 틀 FR4를 포함하는 항체.
8. 항목 3 내지 7중 어느 하나의 항체로서, (i) 상기 VH는 아미노산 서열인 서열 번호 10과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 VL은 아미노산 서열인 서열 번호 21과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 (ii) 상기 VH는 아미노산 서열인 서열 번호 48과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 VL은 아미노산 서열인 서열 번호 59와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체.
9. 항목 8의 항체로서, (i) 상기 VH는 서열 번호 10 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 VL은 서열 번호 21 및 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 (ii) 상기 VH는 서열 번호 48 및 49로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 VL은 서열 번호 59 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체.
10. 항목 9의 항체로서, (i) 서열 번호 10의 VH 서열 및/또는 서열 번호 21의 VL 서열; 또는 (ii) 서열 번호 48의 VH 서열 및/또는 서열 번호 59의 VL 서열을 포함하는 항체.
11. 항목 9의 항체로서, (i) 서열 번호 11의 VH 서열 및/또는 서열 번호 49의 VL 서열; 또는 (ii) 서열 번호 11의 VH 서열 및/또는 서열 번호 60의 VL 서열을 포함하는 항체.
12. 선행 항목들중 어느 하나의 항체로서, 항체는 사이노몰거스 원숭이 IL-17A에 대해 결합 특이성을 가지는 항체.
13. 선행 항목들중 어느 하나의 항체로서, ELISA에 의해 측정되는 바에 따르면 상기 항체는 인간 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F보다는 인간 IL-17A에 선택적으로 결합하는 항체.
14. 선행 항목들중 어느 하나의 항체로서, IL-17A와의 결합은
(a) IL-17A와 이의 수용체(IL-17RA) 사이의 결합을 억제하거나 차단하고,
(b) IL-17A 활성을 감소 또는 중화시키는 항체.
15. 항목 14의 항체로서, 상기 항체는 HT-29 검정에서 시험관내 평가될 때 GRO-α 분비를 억제할 수 있는 항체.
16. 선행 항목들중 어느 것의 항체로서, 상기 항체는
(h) ELISA 검정에서 확정되는 역가, 즉 세쿠키누맙의 역가를 기준으로 하였을 때 5 이상의 역가(상대적 역가), 바람직하게 10 이상, 더욱 바람직하게 15 이상, 더욱더 바람직하게 20 이상의 역가로 IL-17A와 IL-17RA 사이의 상호작용을 차단하는 능력을 가지고/가지거나[단 상기 상대적 역가는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 세쿠키누맙의 IC50 값(ng/mL) 대 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 본 발명의 scFv 포맷 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비임];
(i) HT-29 검정에서 Gro-α 분비 측정에 의해 확정되는 역가, 즉 세쿠키누맙의 역가를 기준으로 하였을 때 50 이상의 역가(상대적 역가), 바람직하게 100 이상, 더욱 바람직하게 150 이상의 역가로 IL-17A를 중화하는 능력을 가지고/가지거나[단 상기 상대적 역가는 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은 세쿠키누맙의 IC50 값(ng/mL) 대 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은 본 발명의 scFv 포맷 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비임];
(j) 1 ng/mL 이하, 바람직하게는 0.5 ng/mL 이하, 더욱 바람직하게는 0.2 ng/mL 이하의 농도에서 인간 IL-17A 1 ng의 활성을 50%까지 억제할 수 있되, 상기 억제 활성은 50 pg/ml TNFα 존재하에 HT-29 검정에서 인간 IL-17A에 의해 유도된 GRO-α 분비를 측정함으로써 결정되는 항체.
17. 선행 항목들중 어느 것의 항체로서, 상기 항체는
(a) 표면플라스몬공명법, 구체적으로는 직접 환경(direct setup)에서의 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 5 nM 미만, 구체적으로 1 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.2 nM 미만, 더욱 구체적으로 100 pM 미만, 더욱 구체적으로 50 pM 미만으로 인간 IL-17A와 결합하고;
(b) 선택적으로 표면플라스몬공명법, 구체적으로는 포착 환경에서의 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 KD 10 nM 미만, 구체적으로 7 nM 미만, 5 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 더욱 구체적으로 0.5 nM 미만으로 사이노몰거스 IL-17A와 결합하는 항체.
18. 항목 17의 항체로서, 상기 항체는 표면플라스몬공명법, 구체적으로는 직접 환경에서의 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 0.5 nM 미만, 0.2 nM 미만, 100 pM 미만, 구체적으로 50 pM 미만으로 인간 IL-17A와 결합하는 항체.
19. 선행 항목들중 어느 것의 항체로서, 상기 항체는
(e) scFv 포맷일 때, 시차 주사형광측정법(differential scanning fluorimetry)에 의해 확정된 용융 온도(Tm)가 적어도 60℃, 구체적으로 적어도 62℃, 적어도 65℃, 더욱 바람직하게 적어도 70℃이고[단 상기 항체는 구체적으로 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4, 150 mM NaCl 포함) 중에 존재함];
(f) scFv 포맷일 때, 연속 동결-해동 주기를 5회 거친 후 단량체 함량 감소율이 5% 미만, 구체적으로 3% 미만, 더욱 구체적으로 1% 미만이며[단 이때 본 발명의 항체의 출발 농도는 10 mg/ml이고, 상기 항체는 구체적으로 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.4) 중에 존재함];
(g) scFv 포맷일 때, 적어도 2주 동안, 구체적으로 적어도 4주 동안 4℃에 보관하였을 때 단량체 함량 감소율이 5% 이하, 구체적으로 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 더욱 구체적으로 1% 미만이고/이거나[단 이때 본 발명의 항체의 출발 농도는 10 mg/ml이고, 구체적으로 상기 항체는 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.4) 중에 존재함];
(h) 적어도 2주 동안, 구체적으로 적어도 4주 동안 37℃에 보관하였을 때 단량체 함량 감소율이 5% 미만인[단 이때 본 발명의 항체의 출발 농도는 10 mg/ml임] 항체.
20. 선행 항목들중 어느 것의 항체로서, 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, Fab, Fv, scFv, dsFv, scAb, STAB, 단일 도메인 항체(scAb 또는 dAb), 단일 도메인 중쇄 항체, 단일 도메인 경쇄 항체, VHH, VNAR, 상어 유래 VNAR 구조를 기반으로 한 단일 도메인 항체, 그리고 대안적 스캐폴드를 기반으로 하는 결합 도메인, 예컨대 안키린 기반 도메인, 파이노머, 아비머, 안티칼린, 피브로넥틴, 및 항체의 불변 영역으로 구축될 결합 부위들(예컨대 F-star의 Modular AntibodyTechnologyTM)(이에 한정되는 것은 아님)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 scFv인 항체.
21. 항목 20의 항체로서, 상기 scFv는 (i) 서열 번호 24 및 서열 번호 25로 이루어진 군[단 상기 scFv는, 바람직하게 서열 번호 24의 아미노산 서열을 가짐]; 또는 (ii) 서열 번호 61 및 서열 번호 62로 이루어진 군[단 상기 scFv는 서열 번호 61의 아미노산 서열을 가짐]으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 항체.
22. 항목 20의 단리 항체로서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 IgG이고, 바람직하게 항체는 IgG1 또는 IgG4인 단리 항체.
23. 선행 항목들중 어느 것의 단리 항체로서, 항체는 인간화된 것인 단리 항체.
24. 항목 1 내지 23중 어느 하나의 항체로서, 다중 특이적 분자인 항체.
25. 항목 24의 항체로서, 상기 항체는 단일 사슬 다이아바디(scDb), 탠덤 scDb(Tandab), 선형 이량체 scDb(LD-scDb), 원형 이량체 scDb(CD-scDb), 2중 특이적 T 세포 점유체(BiTE; 탠덤 디-scFv), 탠덤 트리-scFv, 트리바디(Fab-(scFv)2), 바이바디(Fab-(scFv)1), Fab, Fab-Fv2, Morrison(IgG CH3-scFv 융합체(Morrison L) 또는 IgG CL-scFv 융합체(Morrison H)), 트리아바디, scDb-scFv, 2중 특이적 Fab2, 디-미니항체, 테트라바디, scFv-Fc-scFv 융합체, scFv-HSA-scFv 융합체, 디-다이아바디, DVD-Ig, COVD, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, IgG-scFv 융합체, 예컨대 bsAb(경쇄의 C 말단에 결합된 scFv), Bs1Ab(경쇄의 N 말단에 결합된 scFv), Bs2Ab(중쇄의 N 말단에 결합된 scFv), Bs3Ab(중쇄의 C 말단에 결합된 scFv), Ts1Ab(경쇄와 중쇄 둘 다의 N 말단에 결합된 scFv), Ts2Ab(중쇄의 C 말단에 결합된 dsscFv), 이종 이량체 Fc 도메인을 기반으로 하는 2중 특이적 항체, 예컨대 납-인투-홀 항체(KiH); Fv, scFv, scDb, 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv, Fab-(scFv)2, Fab-(scFv)1, Fab, Fab-Fv2, 이종 이량체 Fc 도메인 또는 기타 임의의 이종 이량체 도메인의 사슬 중 어느 하나의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합된 COVD, MATCH 그리고 듀오바디로 이루어진 군으로부터 선택된 포맷을 취하는 항체.
26. 항목 1 내지 25중 어느 하나의 항체와, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
27. 의약품으로 사용하기 위한, 항목 1 내지 25중 어느 하나의 항체 또는 항목 26의 약학 조성물.
28. IL-17A에 의해 매개되는 장애 또는 GRO-α 분비를 억제함으로써 치료될 수 있는 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 항목 1 내지 25중 어느 하나의 항체 또는 항목 26의 약학 조성물.
29. 염증성 병태 또는 자가면역성 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 항목 1 내지 25중 어느 하나의 항체 또는 항목 26의 약학 조성물.
30. 암, 관절염, 류머티즘성 관절염, 골관절염, 반응성 과?∃㈎?, 건선, 만성 폐색성 폐질환, 전신 홍반성 낭창(SLE), 낭창성 신염, 자가면역 염증성 장 질환, 천식, 다발성 경화증, 낭포성 섬유증, 골 손실, 기도 과민증, 탈수초 장애, 피부 과민증, 급성 이식편 거부, 동종이식편 거부, 이식편대숙주병, 전신 경화증, 비뇨기 염증 장애, 심혈관질환, 혈관염, 주기열, 당 대사 장애, 폐질환, 치주염, 간기질각화증, 알레르기, 염증성 통증, 척추관절증, 패혈증, 패혈성 또는 내독소 쇼크, 뇌수막염, 수술외상, 자가면역성 혈액학적 장애, 알츠하이머병, 사르코이드증, 간경변, 간염, 사구체신염 또는 이상지질혈증을 치료하는데 사용하기 위한, 항목 1 내지 25중 어느 하나의 항체 또는 항목 26의 약학 조성물.
31. IL-17A에 의해 매개되는 장애 또는 Gro-α 분비를 억제함으로써 치료될 수 있는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 의약품을 제조함에 있어 항목 1 내지 25중 어느 하나의 항체 또는 항목 26의 약학 조성물의 용도.
32. 염증성 병태 또는 자가면역성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 의약품을 제조함에 있어 항목 1 내지 25중 어느 하나의 항체 또는 항목 26의 약학 조성물의 용도.
33. 암, 관절염, 류머티즘성 관절염, 골관절염, 반응성 관절염, 건선, 만성 폐색성 폐질환, 전신 홍반성 낭창(SLE), 낭창성 신염, 자가면역 염증성 장 질환, 천식, 다발성 경화증, 낭포성 섬유증, 골 손실, 기도 과민증, 탈수초 장애, 피부 과민증, 급성 이식편 거부, 동종이식편 거부, 이식편대숙주병, 전신 경화증, 비뇨기 염증 장애, 심혈관질환, 혈관염, 주기열, 당 대사 장애, 폐질환, 치주염, 간기질각화증, 알레르기, 염증성 통증, 척추관절증, 패혈증, 패혈성 또는 내독소 쇼크, 뇌수막염, 수술외상, 자가면역성 혈액학적 장애, 알츠하이머병, 사르코이드증, 간경변, 간염, 사구체신염 또는 이상지질혈증을 치료하는데 사용하기 위한 의약품을 제조함에 있어 항목 1 내지 25중 어느 하나의 항체 또는 항목 26의 약학 조성물의 용도.
34. IL-17A에 의해 매개되는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 25중 어느 하나의 항체 또는 항목 26의 약학 조성물 유효량만큼을 투여하여, 해당 병태를 완화시키는 단계를 포함하는 방법.
35. 항목 34에 따른 방법으로서, IL-17A에 의해 매개되는 장애는 염증성 병태 또는 자가면역성 질환인 방법.
36. 항목 34에 따른 방법으로서, IL-17A에 의해 매개되는 장애는 암, 관절염, 류머티즘성 관절염, 골관절염, 반응성 과?∃㈎?, 건선, 만성 폐색성 폐질환, 전신 홍반성 낭창(SLE), 낭창성 신염, 자가면역 염증성 장 질환, 천식, 다발성 경화증, 낭포성 섬유증, 골 손실, 기도 과민증, 탈수초 장애, 피부 과민증, 급성 이식편 거부, 동종이식편 거부, 이식편대숙주병, 전신 경화증, 비뇨기 염증 장애, 심혈관질환, 혈관염, 주기열, 당 대사 장애, 폐질환, 치주염, 간기질각화증, 알레르기, 염증성 통증, 척추관절증, 패혈증, 패혈성 또는 내독소 쇼크, 뇌수막염, 수술외상, 자가면역성 혈액학적 장애, 알츠하이머병, 사르코이드증, 간경변, 간염, 사구체신염 또는 이상지질혈증인 방법.
37. 항목 1 내지 25의 항체를 암호화하는 핵산.
38. 항목 37의 핵산을 포함하는 벡터.
39. 항목 37의 핵산 또는 항목 38의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
40. 항목 1 내지 25의 항체를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 항목 1 내지 25의 항체를 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
41. 항목 1 내지 25중 어느 하나의 항체 또는 항목 26의 약학 조성물을 포함하는 키트.
본 발명은 상기 양태들 및/또는 구현예들중 임의의 것 1개 이상의 모든 조합뿐 아니라 상세한 설명과 실시예에 제시된 구현예들중 임의의 것 1개 이상과의 조합을 고려한다.
본원의 조성물 및 방법의 기타 특징들, 목적들, 그리고 이점들은 발명의 설명과 도면, 그리고 특허청구의 범위로부터 분명해질 것이다.
도 1은 표지화된 IL-17A가 분류 공정(sorting process)에 사용하기 적합함을 보여주는 것이다. HT-29 검정에 있어 표지화된 IL-17A의 생물학적 활성. 표지화 및 미표지화 IL-17A의 3배 연속 희석물들을 대상으로 이것들이 HT-29 세포에서 GRO-α 분비를 유도하는 잠재성에 대해 동시에 시험하였다. 표지화된 IL-17A(IL-17A-RPE) 및 미표지화된 IL-17A(IL-17A)의 EC50 값은 각각 82.8 ng/ml 및 55 ng/ml였다.
도 2는 HT-29 검정에서 27-07-G02 토끼 IgG(A) 및 27-31-C04 IgG(B)가 IL-17A를 중화할 때의 역가(potency)를 보여주는 것이다.
도 3은 27-07-G02 토끼 IgG(A) 및 27-31-C04 IgG(B)가 IL-17A 및 IL-17RA 사이의 상호작용을 억제할 때의 역가를 보여주는 것이다.
도 4는 HT-29 검정에서 인간화 scFv A1 및 A2(A), 그리고 PRO571 및 PRO592(B)가 IL-17A를 중화할 때의 역가를 보여주는 것이다.
도 5는 항 IL-17A scFv A1 및 A2(A)와, PRO571 및 PRO592(B)가 인간 IL-17A 및 IL-17RA 사이의 상호작용을 억제할 때의 역가를 보여주는 것이다(ELISA 분석).
도 6은 scFv A1(A)과, scFv PRO571 및 PRO592(B)의 표적 특이성을 보여주는 것이다. IL-17B ~ IL-17F가, 바이오틴화된 IL-17A와 scFv의 상호작용을 억제하는 잠재성은 경쟁 ELISA(competition ELISA)에 의해 분석되었다. IL-17A와, IL-17B ~ IL-17F의 용량 의존적 효과가 보인다.
도 7은 scFv A1 및 A2(A)와, scFv PRO571 및 PRO592(B)의 DSF 측정으로부터 얻어진 열 언폴딩 곡선(thermal unfolding curve)을 보여주는 것이다. 얻어진 Tm 값은 데이터를 볼츠만(Boltzmann) 방정식에 적용시켜 전이의 중간점을 구함으로써 확정되었다.
도 8은 10 mg/mL를 초과하는 농도에서 4주 동안 3가지 온도(즉 37℃, 4℃ 및 -80℃)에서 수행된, scFv A1(A)과, scFv PRO571 및 PRO592(B)의 보관 안정성 연구 결과를 보여주는 것이다. 상이한 보관 온도에서 시간이 경과함에 따른 단량체 함량은 좌측에, 상이한 보관 온도(4℃(좌측) 및 37℃(우측))에서 시간이 경과함에 따른 단백질의 농도는 우측에 보였다. 단량체 함량은 SE-HPLC 피크 면적들을 적분함으로써 확정되었으며, 단백질 농도는 UV280 측정에 의해 산정되었다.
도 9는 scFv A1(A)과, scFv PRO571 및 PRO592(B)를 대상으로 5회 반복 수행된 동결-해동 주기를 거쳤을 때 이것들의 단량체 함량을 모니터링한 결과를 보여주는 것이다.
도 10은 3중 특이적 포맷을 보여주는 것이다. A. Fab-(scFv)2 분자들의 도메인 순열 변이체(domain permutation variant) 3가지가 디자인되었다. 트리바디 포맷의 CL 및 CH1 위치에서의 scFv 융합은 균등한 것으로 간주되며, 이로부터 이 포맷의 변이체 3가지가 나오게 된다. B, scDb-scFv 도메인 순열 변이체 3가지가 디자인되었다. 도메인 특이성은 하단에 표시되었다. 가변 도메인들을 연결하는 Gly-Ser 링커와 도메인간 이황화 결합은 회색 괄호로 표시되어 있다.
도 11은 일반적인 본보기 제작 공정을 보여주는 것이다. A, 최종 A3 ~ A5(좌측 그래프) 및 A6 ~ A8(우측 그래프) 시료를 대상으로 한 SE-HPLC 트레이싱(tracing) 결과에 대한 오버레이. 유지 시간(retention time) 7분 ~ 8분인 피크들은 각각의 분자 단량체의 겉보기 분자량에 대응하고; 유지 시간이 10분을 초과하는 피크들은 완충제 및 염 관련 인공물의 것이다. B, 비환원 완충 조건(좌측) 및 환원 완충 조건(우측)하에서 A3 ~ A8을 SDS-PAGE 분석한 결과. 참조기준 분자량은 중간 래인(lane)에 로딩하였다. 비환원 조건하의 밴드들은 각각 예상 분자량 약 100 kDa인 것(A3 ~ A5)과 약 75 kDa인 것(A6 ~ A8)에 대응한다. 예상대로 이종 이량체 Fab-(scFv)2 항체 포맷(A3 ~ A5) 밴드들은 환원 조건하에서 약 50 kDa의 위치로 이동하는 반면에, 분자량 약 75 kDa인 A6 ~ A8 밴드들은 또한 환원 조건하에서 관찰될 수 있다.
도 12는 L929 검정에서 TNFα를 중화할 때의 역가를 보여주는 것이다. 세포 카운팅 키트-8을 이용하여 측정된 흡광도는 3중 특이적 분자 A3 ~ A8의 농도(nM) 함수로 제시되어 있다. A13(모 2중 특이적 HSA 결합제 및 TNFα 차단제)은 참조기준으로 사용되었다.
도 13은 인간 및 사이노몰거스의 TNFα를 중화할 때의 역가들을 비교한 결과를 보여주는 것이다. 인간 또는 사이노몰거스 TNF-α 존재하에서 세포 카운팅 키트-8을 이용하여 측정된 흡광도는 A5 및 A7 농도에 대한 함수로 제시되어 있다.
도 14는 HSA의 존재하에 HT-29 검정에서 TNF-α 및 IL-17A가 수반되어 차단됨을 보여주는 것이다. 6개의 3중 특이적 분자 A3 ~ A8에 의한 TNFα 및 IL-17A의 시험관 내 수반적 차단은 1　mg/ml HSA 존재하에 HT-29 세포 기반 검정을 사용하여 분석되었다. 세쿠키누맙(IL-17A 차단제) 및 A13(모 2중 특이적 HSA 결합제 및 TNFα 차단제)이 참조기준으로 사용되었다. 구하여진 GRO-α 분비 데이터는 분자 농도(A, C 및 E = nM; 그리고 B, D 및 F = ng/ml)의 함수로 제시되어 있다. "TNFα 부재"는 IL-17A만이 첨가되었을 때의 GRO-α 분비를 보여주는 것으로서, TNFα 차단에 의한 최대 효과에 대응한다. "IL17a 부재"는 TNFα만이 첨가되었을 때의 GRO-α 분비를 보여주는 것으로서, IL-17A 차단에 의한 최대 효과에 대응한다. "IL17a 부재, TNFa 부재"는 IL-17A 및 TNFα가 첨가되지 않았을 때인 백그라운드 GRO-α 분비를 보여주는 것으로서, 수반적 TNFα 및 IL-17A 차단에 의한 최대 효과에 대응한다.
도 15는 경쟁적 ELISA에서 IL-17RA와 IL-17A의 결합이 중화되었을 때를 보여주는 것이다. IL-17RA와 IL-17A의 결합을 평가하는 경쟁적 ELISA에서 측정된 흡광도는 6개의 3중 특이적 분자(A3 ~ A8)의 농도 증가에 따른 함수로 제시되어 있다. 세쿠키누맙(IL-17A 차단제)이 참조기준으로 사용되었다.
도 16은 인간 TNFα, 인간 IL-17A 및 HSA와의 동시 결합을 SPR에 의해 보여주는 것이다. 상이한 피분석물(인간 TNFα, 인간 IL-17A 및 HSA)의 주입 순서로서 실현 가능한 순서 6가지가 MASS-1 SPR 기기상에서 구현되었으며, 이때 얻어진 센서그램(sensorgram)을 보여주고 있다. 3중 특이적 분자는 센서칩상에 부동화되었으며(채널 1B, 즉 Ch1B상 A3, 채널 2B, 즉 Ch2B상 A4, 채널 3B, 즉 Ch3B상 A5, 채널 4B, 즉 Ch4B상 A6, 채널 5B, 즉 Ch5B상 A7, 채널 6B, 즉 Ch6B상 A8), 항원은 순차적으로 주입되었다.
도 17은 37℃, 4℃ 및 -80℃의 온도 및 10 mg/mL의 단백질 농도에서 4주 동안 수행된 보관 안정성 연구 결과를 보여주는 것이다. 시간이 경과함에 따른 단량체 함량% 및 단량체 손실% 변화추이는 당일(d0), 2일차(d2), 7일차(d7), 14일차(d14), 21일차(d21) 및 28일차(d28)에 기록되었다.
도 18은 A5(좌측), A7(중앙) 및 A8(우측)의 d0(검정색 빗금친 부분) 및 d28(회색) 안정성 시료들에 관한 SE-HPLC 트리이싱 결과의 오버레이를 보여주는 것이다.
도 19는 정맥내 투여(n=3) 및 피하 투여(n=3) 이후 사이노몰거스 원숭이에서 A7의 약동학적 프로필과 ADA 분석 결과를 보여주는 것이다.
도 20은 Morrison L 구조체 A14 및 A15의 도식적 구조를 보여주는 것이다.
도 21은 scDb-scFv A7에 대한 동적 광 산란법에 의해 확정된, 가용성 복합체의 평균 크기를 보여주는 것이다.
도 22는 A14에 대한 동적 광 산란법에 의해 확정된, 가용성 복합체의 평균 크기를 보여주는 것이다.
도 23은 A15에 대한 동적 광 산란법에 의해 확정된, 가용성 복합체의 평균 크기를 보여주는 것이다.
도 24는 scDb-scFv A7에 대한 가용성 복합체의 단백질 농도 회복률을 보여주는 것이다.
도 25는 A14에 대한 가용성 복합체의 단백질 농도 회복률을 보여주는 것이다.
도 26은 A15에 대한 가용성 복합체의 단백질 농도 회복률을 보여주는 것이다.
본 발명은 IL-17A 및 TNFα와 특이적으로 결합하고, 개선된 친화성, 효능 및 선택성을 가지는 다중 특이적 항체 분자의 발견을 기반으로 한다. 뿐 아니라, 본 발명의 다중 특이적 항체는, 본 발명의 발명자들에 의해 상기 항체가 TNFα와 면역 복합체를 형성하지 않는 관계로 면역원성이 잠재적으로 낮다는 것이 입증되었던 바, 개선된 안전성 프로필을 가진다. 기타 다중 특이적 분자들의 2가 결합(예컨대 Covagen, Abbvie 등)으로 말미암아, 면역원성 또는 기타 부작용을 초래할 수 있는 면역 복합체가 형성될 확률은 높다. 이와는 대조적으로, 본 발명의 1가 2중 특이적 및 3중 특이적 구조체는 이러한 복합체를 형성할 잠재성이 줄어든 관계로, 항 약물 항체 및 면역 관련 부작용을 초래할 가능성이 더 낮다. 게다가, 본 발명의 다중 특이적 항체는 개선된 생물물리학적 특성, 예컨대 개발 가능성, 불순물은 비교적 소량 생성되면서 다량으로 생산되는 특성, 그리고 월등한 안정성을 가진다.
게다가 본 발명은 인간 IL-17A 단백질과 특이적으로 결합하는 항체, 약학 조성물, 이러한 항체와 약학 조성물을 제조하는 방법 및 사용하는 방법을 제공한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명에 속하는 분야의 당 업자에 의해 통상 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다.
"~를 포함하는(comprising)" 및 "~를 포함하는(including)"과 같은 용어들은, 달리 명시되지 않는 한 본원에서 자체에 제약을 두지 않고 비제한적 의미로 사용된다. 이처럼 비제한적 의미로 사용되는 것과 관련하였을 때, "~를 포함하는(comprising)"이란 용어는 이보다 더 협소한 범위를 나타내는 용어 "~로 이루어진(consisting of)"을 포함한다.
본 발명을 기술하는 내용(특히 하기 특허청구의 범위의 청구항들의 내용) 중 "하나의" 및 "한" 및 "본", 그리고 이와 유사한 용어는, 본원에 달리 명시되어 있거나 내용에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 단수의 것과 복수의 것 둘 다를 아우르는 것으로 해석되어야 할 것이다. 예를 들어 "하나의 세포"란 용어는, 세포들의 혼합물을 비롯한 복수의 세포를 포함한다. 복수의 형태가 화합물 및 염 등에 대해 사용되는 경우, 이는 단일 화합물 또는 염 등을 의미하기도 한다.
본 발명의 다중 특이적 항체
일 양태에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리 다중 특이적 항체를 제공한다.
"TNFα" 또는 "TNF-α" 또는 "종양 괴사 인자"란 용어는, 구체적으로 인간 TNFα를 지칭한다. TNFα는 가용성 단백질로서뿐 아니라, II형 세포 표면 폴리펩티드로서 발현되는 전구체 형태(경막 TNFα라 칭하여짐)로서 발견된다. 경막 TNFα는 Ala76 잔기 및 Val77 잔기 사이에서 메탈로프로티나아제, 예컨대 TNFα 전환 효소(TACE)에 의해 가공되고, 그 결과 157개 아미노산 잔기로 된 TNFα의 가용성 형태가 방출된다. 가용성 TNFα는 17-kDa의 절단된 단량체들로 된 동종 삼량체이다. 경막 TNFα는 또한 26-kD의 미절단 단량체들로 된 동종 삼량체로 존재하기도 한다. 본원에 사용된 바와 같은 "TNFα"란 용어는, 가용성 형태 및 경막 형태 둘 다를 포함한다. "TNFα"란 용어는, 구체적으로 UniProt 식별 번호 P01375(본원에서는 서열 번호 134로 재현됨)인 인간 경막 TNFα를 지칭한다. "TNFα"란 용어는, 구체적으로 UniProt 식별 번호 P01375(본원에서는 서열 번호 135로 재현됨)인 가용성 경막 TNFα를 지칭한다.
적합하게 본 발명의 항체는 단리 항체이다. 본원에 사용된 바와 같은 "단리 항체"란 용어는 상이한 항원 특이성을 가지는 기타 항체로부터 실질적으로 분리되어 있는 항체를 지칭한다(예컨대 IL-17A 및 TNFα와만 특이적으로 결합하는 단리 항체는 실질적으로 IL-17A 및 TNFα 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체로부터 실질적으로 분리되어 있음). 그러나 IL-17A 및 TNFα와 특이적으로 결합하는 단리 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터 유래한 IL-17A 및 TNFα 분자에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 게다가 단리 항체는 기타 세포성 물질 및/또는 화학물질로부터 실질적으로 분리되어 있을 수 있다.
적합하게 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다. 본원에 사용되는 바와 같은 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"이란 용어는, 아미노산 서열이 동일한 유전자 공급원의 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나 이러한 공급원으로부터 유래하는 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정의 에피토프 하나에 결합 특이성 및 친화성 하나를 보이거나, 특이 에피토프들에 결합 특이성들 및 친화성들을 보인다.
본 발명의 항체는 키메라 및 인간화된 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"키메라 항체"란 용어는, (a) 불변 영역 또는 이의 일부가 변경, 치환 또는 교체되어, 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이하거나 변경된 군의 불변 영역, 상이하거나 변경된 효과기 기능을 보이는 불변 영역 및/또는 상이한 종들의 불변 영역과 결합되거나, 또는 키메라 항체에 새로운 특성들을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예컨대 효소, 독소, 호르몬, 생장 인자, 약물 등과 결합되었거나; 또는 (b) 가변 영역 또는 이의 일부가, 상이하거나 변경된 항원 특이성을 가지는 가변 영역으로 변경, 치환 또는 교체된 항체 분자이다. 예를 들어 마우스 항체는 자체의 불변 영역을 인간 면역글로불린 유래 불변 영역으로 치환함으로써 변형될 수 있다. 인간 불변 영역으로 치환됨으로 말미암아, 키메라 항체는 항원을 인지함에 있어서 특이성을 보유할 수 있는 동시에, 인간에서의 항원성은 원래 마우스 항체와 비교되었을 때 감소한다.
본원에 사용된 바와 같은 "인간화" 항체는 비인간 항체의 반응성을 보유하되, 인간에서의 면역원성은 작은 항체이다. 이는, 예를 들어 비인간 CDR들은 유지시키면서, 항체의 나머지 부분들은 인간에 있어 대응 부분(즉 불변 영역과, 가변 영역의 틀 부분)으로 치환하여 달성될 수 있다. 추가의 틀 영역 변형은 인간 틀 서열뿐만 아니라 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래하는 CDR 서열 내에서 이루어질 수 있다. 본 발명의 인간화 항체는 인간 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예컨대 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발법에 의해 시험관내 도입된 돌연변이, 또는 체세포 돌연변이에 의해 생체내 도입된 돌연변이, 또는 안정성을 촉진하거나 제조를 용이하게 만들기 위한 보존적 치환에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 예를 들어 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; 및 Padlan, Molec. Immun., 31: 169-217, 1994]을 참조한다. 인간 공학 기술의 다른 예로서는 미국 특허 제5,766,886호에 개시된 Xoma 기술을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 "재조합 인간화 항체"란 용어는, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 본 발명의 인간화 항체 모두, 예컨대 동물(예컨대 토끼)로부터 단리된 항체; 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합체, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱(splicing)하는 것을 수반하는 임의의 기타 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 (만일 존재한다면) 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 영역 및 불변 영역을 가진다. 그러나 이러한 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 인간 Ig 서열이 이식된 동물이 사용될 때, 생체내 체세포 돌연변이유발)의 대상이 될 수 있으므로, 재조합 항체의 VH(항체 중쇄 가변 영역) 및 VL(항체 경쇄 가변 영역) 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 서열 및 VL 서열로부터 유래하였으며 이와 관련될 때, 자연상 인간 항체 생식계열내에 존재할 수 없는 서열이다.
적합하게 본 발명의 항체 또는 이의 결합 도메인은 인간화된 것이다. 적합하게 본 발명의 항체 또는 이의 결합 도메인은 인간화된 것으로서, 토끼 유래 CDR들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "다중 특이적 항체"란 용어는, 적어도 2개 이상의 상이한 표적(예컨대 IL-17A 및 TNFα) 상에 존재하는 상이한 에피토프 2개 이상과 결합하거나, 또는 동일한 표적의 상이한 에피토프 2개 이상과 결합하는 항체를 지칭한다. 본 발명의 "다중 특이적 항체"는 2개 이상의 결합 도메인, 예를 들어 2개 또는 3개의 결합 도메인을 가진다. "다중 특이적 항체"란 용어는 2중 특이적, 3중 특이적, 4중 특이적, 5중 특이적 및 6중 특이적 항체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "2중 특이적 항체"란 용어는, 상이한 표적 2개(예컨대 IL-17A 및 TNFα)에 존재하는 상이한 에피토프 2개 또는 동일 표적에 존재하는 상이한 에피토프 2개와 결합하는 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "3중 특이적 항체"란 용어는, 상이한 표적 3개(예컨대 IL-17A, TNFα 및 HSA)에 존재하는 상이한 에피토프 3개 또는 동일 표적에 존재하는 상이한 에피토프 3개와 결합하는 항체를 지칭한다.
"다가 항체"란 용어는, 1가를 초과하는 가 수(valency)를 가지는 단일 결합 분자를 지칭하는데, 여기서 "가 수"는 동일한 표적 분자상 에피토프와 결합하는 항원 결합부의 수로서 기술된다. "~가"란, 분자내 항원에 특이적인 결합 도메인들이 지정된 수만큼 존재함을 지칭한다. 그러므로 "1가", "2가", "4가" 및 "6가"란 용어는 각각 분자내 항원에 특이적인 결합 도메인이 1개, 2개, 4개 및 6개 존재함을 지칭한다. 그러므로 본원에 사용된 바와 같은 "1가 항체"란 용어는, 표적 분자, 예컨대 IL-17A 또는 TNFα상 에피토프 1개에 결합하는 하나의 항원 결합부를 가지는 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "2가 항체"란 용어는, 각각 동일한 에피토프와 결합하는 항원 결합부를 2개 가지는 항체를 지칭한다.
본 발명의 다중 특이적 항체는 IL-17A와의 결합에 대해 1가 또는 다가, 예컨대 2가, 3가 또는 4가일 수 있으며, 바람직하게 1가일 수 있다.
본 발명의 다중 특이적 항체는 TNFα와의 결합에 대해 1가 또는 다가, 예컨대 2가, 3가 또는 4가일 수 있으며, 바람직하게 1가일 수 있다. TNFα는 삼량체를 형성하므로, 본 항체는 잠재적으로 3가이며, TNFα와 특이적으로 결합하는 도메인을 몇 개 가지는 항체, 예컨대 TNFα와의 결합에 대해 2가. 3가 또는 다가인 항체와 3차원 면역 복합체를 형성할 수 있다. 이를 입증하기 위한 연구로서, TNF와, 인플릭시맙(키메라 TNFα IgG 항체) 및 에타너셉트(IgG1 Fc와의 TNFR2 이량체 융합 단백질) 사이에 (항원/항체의 비에 차이를 두고) 형성된 면역 복합체 크기에 관한 연구는, 각각의 항체는 고유의 크기 프로필을 보이는 면역 복합체를 형성하였음을 보여주었다(Kim MS, et al., J Mol Biol. 2007;374:1374-1388). 그러므로 면역원성이 잠재적으로 높다는 점은 TNFα를 표적화하는 치료 항체에 대한 우려 사항중 하나이다. 그러므로 바람직한 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 TNFα와의 결합에 대해 1가이다.
적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체는 IL-17A와 특이적으로 결합하는 도메인 단 하나 및/또는 TNFα와 특이적으로 결합하는 도메인 단 하나를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 TNFα와 특이적으로 결합하는 도메인 단 하나를 포함한다. 적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체는 IL-17A와 특이적으로 결합하는 도메인 단 하나와 TNFα와 특이적으로 결합하는 도메인 단 하나를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인, 그리고 선택적으로 이 두 도메인 사이의 폴리펩티드 링커로 이루어져 있다. 구체적인 구현예에서, 이 선택적 폴리펩티드 링커가 존재하고, 4개 ~ 25개의 아미노산 잔기를 가지는 폴리펩티드로 이루어져 있다.
적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체는 유리하게 인간 TNFα 및 인간 IL-17A의 생물학적 활성을 중화할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "중화"란 용어는, 부분적이거나 온전할 수 있는, 생물 신호전달 활성의 감소를 지칭함이 이해될 것이다. 중화 여부를 확정하는데 적합한 검정은 당 분야에 공지되어 있으며, 그러한 검정중 임의의 것은 본원의 실시예에 제공되어 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 제1 도메인은, 구체적으로 ELISA에 의해 측정되는 바에 따르면, 인간 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F보다는 인간 IL-17A에 선택적으로 결합한다. 본원에 사용된 바와 같은 "~에 선택적으로 결합하다"란 용어는, 항체, 조성물, 제제 등이 IL-17B/C/D/E/F와는 거의 결합하지 않되, IL-17A와는 결합함을 의미할 것이다. 선택적 결합은, 보통 작은 친화성(또는 높은 KD)과, 중간 IC50 내지 높은 IC50를 보이는 비특이적 결합과는 구별되게, 큰 친화성(또는 낮은 KD)과, 낮은 IC50 내지는 중간 IC50에 의해 특징지어진다. 통상 결합은 항체가 10-7 M 미만의 KD로 결합할 때 선택적인 것으로 간주된다. 적합하게 본 발명의 항체 또는 이의 제1 도메인은, SPR에 의해 측정되는 바에 따르면, 인간 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F와 결합할 때보다 더 큰 친화성 또는 더 낮은 KD로 인간 IL-17A와 결합한다. 적합하게 본 발명의 항체 또는 이의 제1 도메인의 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F에 대한 IC50 값은, ELISA에 의해 측정되는 바에 따르면, IL-17A에 대한 IC50보다 적어도 100배, 예컨대 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배 더 크다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 제1 도메인은, 구체적으로 SPR 및/또는 ELISA에 의해 측정되는 바에 따르면, 인간 IL-17A와 결합하되, 인간 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F와는 결합하지 않는다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 IL-17A 및 TNFα와는 상이한 항원에 대한 특이성을 가지는 제3 도메인을 추가로 포함한다. 적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체는 3중 특이적 항체이다. 본원에 사용된 바와 같은 "3중 특이적 항체"란, 항원 결합 도메인 3개, 예를 들어 인간 TNFα와 결합하는 결합 도메인 하나, 인간 IL-17A와 결합하는 결합 도메인 또 다른 하나, 그리고 항체 분자의 반감기를 연장시킬 수 있는 것으로서, 항원, 예컨대 인간 혈청 알부민과 결합하는 결합 도메인 나머지 하나를 가지는 항체 분자를 지칭한다.
구체적으로 본 발명의 다중 특이적 항체는 인간 혈청 알부민(HSA)과 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 추가로 포함한다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 제3 도메인을, IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 본 발명의 다중 특이적 항체에 부가되면, 하기와 같은 유리한 효과들이 달성될 수 있음을 발견하였다:
(i) 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 도메인 적어도 하나를 포함하는, 본 발명의 다중 특이적 항체의 혈청중 반감기 증가; 및
(ii) 인간 혈청 알부민 결합 도메인의, 본 발명의 다중 특이적 항체에의 부가는 기타 결합 도메인의 기능, 예컨대 Il-17A 및 TNFα 결합 도메인의 중화 활성과 양립 가능함.
"HSA"란 용어는, 구체적으로 UniProt 식별 번호 P02768의 인간 혈청 알부민을 지칭한다. 인간 혈청 알부민(HSA)은 인간의 혈청중에 풍부한(총 단백질의 50%) 66.4 kDa의 단백질로서, 585개의 아미노산으로 구성되어 있다(Sugio, Protein Eng, Vol. 12, 1999, 439-446). 다기능성 HSA 단백질은 다수의 대사물질, 예컨대 지방산, 금속 이온, 빌리루빈 및 몇몇 약물의 결합 및 운반을 허용하였던 자체의 구조와 연관되어 있다(Fanali, Molecular Aspects of Medicine, Vol. 33, 2012, 209-290). 혈청중 HSA의 농도는 약 3.5 ~ 5 g/dL이다. 알부민 결합 항체는, 예를 들어 이에 접합된 단백질 또는 약물의 생체내 혈청중 반감기를 연장시키는데 사용될 수 있다.
적합하게 일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인, 그리고 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함한다. 본 발명의 다중 특이적 항체는 인간 혈청 알부민과의 결합에 대해 1가 또는 다가, 예컨대 2가, 3가 또는 4가일 수 있으며, 바람직하게는 1가일 수 있다. 적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체는 IL-17A와 특이적으로 결합하는 도메인 단 하나와 TNFα와 특이적으로 결합하는 도메인 단 하나, 그리고 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 도메인 단 하나를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인, 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 제3 도메인, 그리고 선택적으로 두 도메인 사이의 폴리펩티드 링커로 이루어져 있다. 구체적인 구현예에서, 이 선택적 폴리펩티드 링커가 존재하며, 4개 ~ 25개의 아미노산 잔기를 가지는 폴리펩티드로 이루어져 있다.
유리하게도, 본 발명의 다중 특이적 항체는 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인, 그리고 선택적으로 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는데, 단 상기 도메인들은 자체의 각각의 항원(들) 또는 수용체(들)와 동시에 결합할 수 있다.
본 발명의 다중 특이적 항체의 도메인, 예컨대 상기 제1 도메인, 상기 제2 도메인, 상기 제3 도메인은 Fab, Fv, scFv, dsFv, scAb, STAB, 단일 도메인 항체(sdAb 또는 dAb), 단일 도메인 중쇄 항체, 그리고 단일 도메인 경쇄 항체, VHH, VNAR, 상어 유래 VNAR 구조 기반 단일 도메인 항체, 그리고 대안적 스캐폴드 기반 결합 도메인, 예컨대 안키린 기반 도메인, 파이노머, 아비머, 안티칼린, 피브로넥틴, 및 항체의 불변 영역으로 구축될 결합 부위들(예컨대 F-star의 Modular AntibodyTechnologyTM)(이에 한정되는 것은 아님)로 이루어진 군, 바람직하게는 Fab, Fv 및 scFv로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 더욱 바람직하게 상기 제1 도메인 및/또는 상기 제2 도메인 및/또는 상기 제3 도메인은 Fv 또는 scFv이다.
본 발명의 다중 특이적 항체는 임의의 적당한 포맷을 이룰 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 단일 사슬 다이아바디(scDb), 탠덤 scDb(Tandab), 선형 이량체 scDb(LD-scDb), 원형 이량체 scDb(CD-scDb), 2중 특이적 T 세포 점유체(BiTE; 탠덤 디-scFv), 탠덤 트리-scFv, 트리바디(Fab-(scFv)2) 또는 바이바디(Fab-(scFv)1), Fab, Fab-Fv2, Morrison(IgG CH3-scFv 융합체(Morrison L) 또는 IgG CL-scFv 융합체(Morrison H)), 트리아바디, scDb-scFv, 2중 특이적 Fab2, 디-미니항체, 테트라바디, scFv-Fc-scFv 융합체, scFv-HSA-scFv 융합체, 디-다이아바디, DVD-Ig, COVD, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, IgG-scFv 융합체, 예컨대 bsAb(경쇄의 C 말단에 결합된 scFv), Bs1Ab(경쇄의 N 말단에 결합된 scFv), Bs2Ab(중쇄의 N 말단에 결합된 scFv), Bs3Ab(중쇄의 C 말단에 결합된 scFv), Ts1Ab(중쇄 및 경쇄 둘 다의 N 말단에 결합된 scFv), Ts2Ab(중쇄의 C 말단에 결합된 dsscFv), 이종 이량체 Fc 도메인을 기반으로 한 2중 특이적 항체, 예컨대 납-인투-홀 항체(KiHs); Fv, scFv, scDb, 탠덤-디-scFv, 탠덤 트리-scFv, Fab-(scFv)2, Fab-(scFv)1, Fab, Fab-Fv2, 이종 이량체 Fc 도메인 또는 기타 임의의 이종 이량체화 도메인의 사슬 중 어느 하나의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합된 COVD, MATCH 및 듀오바디로 이루어진 군으로부터 선택된 포맷을 취하며, 바람직하게는 트리바디 또는 scDb-scFv를 취한다.
"다이아바디"란 용어는 항원 결합 부위를 2개 가지는 항체 단편을 지칭하는데, 이 단편은 동일 폴리펩티드 사슬 내 VL과 결합된 VH(VH-VL)를 포함한다. 지나치게 짧아서 동일 사슬상 도메인 2개 사이의 쌍 형성을 허용하지 않는 링커가 사용되면, 이들 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 쌍을 형성하게 되고, 이로써 2개의 항원 결합 부위가 생성된다. 다이아바디는 2가 또는 2중 특이적일 수 있다. 다이아바디는, 예컨대 문헌[EP404097, WO1993/01161, Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003), 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 더욱 자세히 기술되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디도 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기술되어 있다. 2중 특이적 scDb, 구체적으로 2중 특이적 단량체 scDb는, 구체적으로 링커 L1, L2 및 L3에 의해 VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA, VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA, VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA, VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA, VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB, VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB, VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB 또는 VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB와 같은 순서로 결합되어 있는, 2개의 가변 중쇄 도메인(VH) 또는 이의 단편과, 2개의 가변 경쇄 도메인(VL) 또는 이의 단편을 포함하되, 단 상기 VLA 도메인 및 VHA 도메인은 함께 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 VLB 및 VHB는 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성한다. 링커 L1은, 구체적으로 2개 ~ 10개 아미노산, 더욱 구체적으로 3개 ~ 7개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 5개 아미노산으로 이루어진 펩티드이고, 링커 L3은, 구체적으로 1개 ~ 10개 아미노산, 더욱 구체적으로 2개 ~ 7개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 5개 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 중간 링커인 L2는, 구체적으로 10개 ~ 40개 아미노산, 더욱 구체적으로 15개 ~ 30개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 20개 ~ 25개 아미노산으로 이루어진 펩티드이다.
일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 면역 글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 "Fc 영역"이란 용어는, 원산 서열 Fc 영역 및 변이 Fc 영역을 비롯하여 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 정의하는데 사용된다. 적합한 원산 서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2(IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4를 포함한다. "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합하는 수용체를 기술한다. 바람직한 FcR은 원산 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체와 결합하고(감마 수용체) FcγRI, FcyRII 및 FcγRIII 하위군의 수용체, 예컨대 이러한 수용체의 대립형질 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하는 것이고, FcγRII 수용체는 주로 그것의 세포질 도메인에 차이가 있되 유사한 아미노산 서열을 가지는 FcγRIIA("활성화 수용체(activating receptor)") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이것의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그것의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)를 함유한다[(M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 5:203-234(1997)) 참조]. FcR에 관하여는 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92(1991); Capet et al, Immunomethods 4: 25-34(1994); 및 de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41(1995)]에 검토되어 있다. 미래에 동정될 것들을 포함한 기타 FcR은 본원의 "FcR"이란 용어에 포함된다. "Fc 수용체" 또는 "FcR"이란 용어는 또한 모체의 IgG를 태아로 운반하는 역할을 하는 신생아 수용체인 FcRn을 포함한다[Guyer et al, J. Immunol. 117: 587(1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249(1994)]. FcRn과의 결합을 측정하는 방법이 공지되어 있다[예컨대 문헌(Ghetie and Ward, Immunol. Today 18:(12): 592-8(1997); Ghetie et al, Nature Biotechnology 15(7): 637-40(1997); Hinton et al, J. Biol. Chem. TJI(8): 6213-6(2004); WO 2004/92219(Hinton et al))을 참조한다]. 생체내 FcRn과의 결합과, 인간 FcRn 고친화성 결합 폴리펩티드의 혈청중 반감기는, 예컨대 인간 FcRn을 발현하는 유전자이식 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주, 또는 변이 Fc 영역을 가지는 폴리펩티드가 투여된 영장류에서 검정될 수 있다. WO 2004/42072(Presta)에는 FcR과의 결합이 개선되었거나 감소된 항체 변이체가 기술되어 있다. 예컨대 문헌[Shields et al, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001)]을 참조한다.
동일하거나 더 작은 분자량에서 특이성/기능성 수치를 증가시키기 위해서는 항체 단편, 예컨대 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편 및 기타 항체 단편을 포함하는 항체를 사용하는 것이 유리하다. 이와 같이 더 작은 분자는 전체 항체의 항원 결합 활성을 보유할뿐더러, 전체 면역글로불린 분자에 비하여 개선된 조직 침투성과 약동학적 특성을 보일 수 있다. 이러한 단편은 전체 면역글로불린에 비해 다수의 이점을 보이는 것으로 나타난 반면에, 생체내 반감기를 늘리는 Fc 도메인이 결여되어 있는 관계로 혈청으로부터의 소멸 속도가 증가한다는 단점을 가진다(Medasan et al., 1997, J. Immunol. 158:2211-2217). 분자량이 더 작은 분자는 더 효율적으로 표적 조직(예컨대 고형 암)에 침투하므로, 동일하거나 더 작은 용량일 때 개선된 효능을 보장한다. 적합하게 본 발명의 항체는, 구체적으로 상기 다중 특이적 항체가 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함할 경우, 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하지 않고, 선택적으로는 CH1 영역 및 CL 영역을 포함하지 않는다.
적합하게 본 발명의 항체는 트리바디 포맷(Fab-(scFv)2)을 이룰 수 있다. 적합하게 제1 도메인 및/또는 제2 도메인 및/또는 제3 도메인은 Fab 도메인 또는 scFv 도메인이다. 구체적으로 본 발명의 다중 특이적 항체는 하나의 Fab 도메인과 2개의 scFv 도메인을 가지는데, 특히 scFv 도메인이 Fab 도메인의 각 사슬 카복시 말단에 융합될 때 그러하다. 본 발명의 발명자들은 약동학적 및 생물물리학적 특성의 관점에서 3중 특이적 포맷중 개별 결합 도메인의 상대적 최적 위치를 시험하였으며, 그 결과 놀랍게도 본 발명의 다중 특이적 항체는 트리바디 포맷일 때 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인이 Fab 도메인이고, 각각 IL-17A 및 HSA와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 제3 도메인이 상기 Fab 도메인에 융합된 scFv 도메인이면, 유리한 특성을 가짐을 발견하였다.
바람직하게 본 발명의 항체는 scDb-scFv 포맷을 이룬다. "scDb-scFv"란 용어는, 단일 사슬 Fv(scFv) 단편이 가요성 Gly-Ser 링커에 의해 단일 사슬 다이아바디(scDb)에 융합된 항체 포맷을 지칭한다. 적합하게 제1 도메인 및/또는 제2 도메인 및/또는 제3 도메인은 Fv 도메인 또는 scFv 도메인이다. 구체적으로 본 발명의 다중 특이적 항체는 scDb-scFv 포맷일 때 다른 도메인 2개로 이루어진 scDb에 대해 C 말단에서 융합된 scFv 도메인 하나를 가진다. 본 발명의 다중 특이적 항체는 scDb-Fv 포맷일 때 하기 식으로 표시될 수 있다: VLA - L1 - VHC - L2 - VLC - L3 - VHA - L4 - VLB - L5 - VHB 또는 VLB - L1 - VHA - L2 - VLA - L3 - VHB - L4 - VLC - L5 - VHC 또는 VLC - L1 - VHB - L2 - VLB - L3 - VHC - L4 - VLA- L5 - VHA 또는 VLA - L1 - VHB - L2 - VLB - L3 - VHA - L4 - VLC - L5 - VHC, 바람직하게 VLB - L1 - VHA - L2 - VLA - L3 - VHB - L4 - VLC - L5 - VHC 또는 VLA - L1 - VHB - L2 - VLB - L3 - VHA - L4 - VLC - L5 - VHC, 더욱 바람직하게 VLB - L1 - VHA - L2 - VLA - L3 - VHB - L4 - VLC - L5 - VHC [식 중, VLA 및 VHA는 각각 (IL-17A와 특이적으로 결합하는) 제1 도메인의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이고; VLB 및 VHB는 각각 (TNFα와 특이적으로 결합하는) 제2 도메인의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이고; VLC 및 VHC는 각각 (HSA와 특이적으로 결합하는) 제3 도메인의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이고; L1, L2, L3, L4 및 L5는 폴리펩티드 링커임].
본 발명의 내용중 "폴리펩티드 링커"란 용어는, 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 잔기들의 사슬로 이루어진 링커로서, 각각 링커의 한쪽 말단에 부착된 두 도메인을 연결해주는 링커를 지칭한다. 폴리펩티드 링커의 길이는 두 분자가 서로에 대해 올바른 입체형태를 이루어, 원하는 활성을 보유하게 만드는 방식으로 두 분자를 연결하는데 적당해야 한다. 구체적인 구현예에서, 폴리펩티드 링커는 2개 내지 30개 아미노산 잔기(예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개 아미노산 잔기)로 이루어진 연속 사슬을 가진다. 뿐 아니라, 폴리펩티드 링커에 포함되도록 선택된 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 활성을 유의미하게 방해하지 않는 특성을 보여야 한다. 그러므로 링커 펩티드는 대체로 폴리펩티드 활성과 양립 불가능하거나, 내부 폴딩을 방해하거나, 또는 단량체 도메인들의 결합을 심각하게 방해할 단량체중 1개 이상의 아미노산 잔기와 결합하거나 기타 상호작용을 하는 전하를 보여서는 안 된다. 구체적인 구현예들에서, 폴리펩티드 링커는 구조화되지 않은 폴리펩티드이다. 유용한 링커는 글리신-세린, 즉 GS 링커를 포함한다. "Gly-Ser" 또는 "GS" 링커란, 당 업자에 의해 이해될 바와 같이, 글리신과 세린이 일렬로 늘어선 중합체[예를 들어 (Gly-Ser)n,(GSGGS)n(GGGGS)n 및(GGGS)n을 포함하되, 여기서 n은 1 이상의 정수임], 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 기타 가요성 링커, 예컨대 쉐이커 칼륨 채널(shaker potassium channel)용 테터(tether), 그리고 기타 다양한 가요성 링커를 의미한다. 글리신과 세린은 둘 다 비교적 구조화되지 않았으므로 글리신-세린 중합체가 바람직하고, 따라서 구성성분들간 중성 테더로서 사용될 수 있다. 두 번째로, 세린은 친수성으로서, 구형 글리신 사슬일 수 있었던 것을 가용화할 수 있다. 세 번째, 유사한 사슬이 재조합 단백질, 예컨대 단일 사슬 항체의 서브유닛들을 연결하는데 유효한 것으로 보였다.
적합하게 본 발명의 상기 L1 및 L3은 서열 번호 132에 제시된 바와 같다. 적합하게 본 발명의 상기 L2, L4 및 L5는 서열 번호 23에 제시된 바와 같다.
본 발명의 발명자들은 약동학적 및 생물물리학적 특성의 관점에서 3중 특이적 포맷중 개별 결합 도메인들의 상대적 최적 위치를 시험하였으며, 그 결과 놀랍게도 본 발명의 다중 특이적 항체는, scDb-scFv 포맷일 때 IL-17A 및 TNFα와 특이적으로 결합하는 제1 도메인 및 상기 제2 도메인 각각이 scDb를 형성하고, HSA와 특이적으로 결합하는 상기 제3 도메인이 scFv이면, 유리한 특성을 가짐을 발견하였다.
본 발명의 다중 특이적 항체는 하기 유리한 특성들을 가진다:
(a) HT-29 검정에서 Gro-α 분비 측정에 의해 확정되는 역가, 즉 세쿠키누맙의 역가를 기준으로 하였을 때 2 이상의 역가(상대적 역가), 예컨대 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 바람직하게는 50 이상의 역가로 IL-17A를 중화하는 능력을 가지고[단 상기 상대적 역가는 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은 세쿠키누맙의 IC50 값(ng/mL) 대 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은 상기 다중 특이적 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비임];
(b) HT-29 검정에서 Gro-α 분비 측정에 의해 확정되는 역가, 즉 서열 번호 149에 따른 scDb(A13)의 역가를 기준으로 하였을 때 적어도 1의 역가(상대적 역가), 예컨대 1 이상, 1.5 이상, 2 이상, 2.5 이상, 3 이상, 3.5 이상, 바람직하게는 4 이상, 더욱 바람직하게는 4.5 이상의 역가로 TNFα를 중화하는 능력을 가지고[단 상기 상대적 역가는 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은, 서열 번호 149에 따른 상기 scDb의 IC50 값(nM) 대 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은 상기 다중 특이적 항체의 IC50 값(nM)의 비임];
(c) 선택적으로 ELISA 검정에서 확정되는 역가, 즉 세쿠키누맙의 역가를 기준으로 하였을 때 2 이상의 역가(상대적 역가), 예컨대 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 바람직하게는 10 이상의 역가로 IL-17A와 IL-17RA 사이의 상호작용을 차단하는 능력을 가지고[단 상기 상대적 역가는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 세쿠키누맙의 IC50 값(ng/mL) 대 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 상기 다중 특이적 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비임];
(d) 선택적으로 L929 검정에서 확정되는 역가, 즉 서열 번호 149에 따른 scDb(A13)의 역가를 기준으로 하였을 때 적어도 0.4의 역가(상대적 역가), 예컨대 적어도 0.5, 바람직하게 적어도 1의 역가로 TNFα를 중화하는 능력을 가지고[단 상기 상대적 역가는 L929 검정에서 측정된 바와 같은, 서열 번호 149에 따른 상기 scDb의 IC50 값(nM) 대 L929 검정에서 측정된 바와 같은 상기 다중 특이적 항체의 IC50 값(nM)의 비임];
(e) 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 바람직하게 0.5 nM 미만으로 인간 IL-17A와 결합하고, 선택적으로 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 KD 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 바람직하게 0.5 nM 미만으로 사이노몰거스 IL-17A와 결합하고;
(f) 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 바람직하게 0.5 nM 미만, 더욱 바람직하게 0.25 nM 미만으로 인간 TNFα와 결합하고;
(g) 선택적으로 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 바람직하게 2 nM 미만으로 인간 혈청 알부민과 결합하고, 선택적으로는 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 바람직하게 2 nM 미만으로 사이노몰거스 혈청 알부민과 결합함.
본원에 사용된 바와 같은 "친화성"이란 용어는, 단일 항원성 부위에서의 항체와 항원간 상호작용의 세기를 지칭한다. 각각의 항원성 부위내에서 항체 "팔"의 가변 영역은 약한 비공유성 외력을 통해 다양한 부위에서 항원과 상호작용하고; 그 상호작용이 클수록 친화성도 더 크다.
"결합 친화성"이란, 일반적으로 분자(예컨대 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예컨대 항원)간 비 공유 상호작용을 모두 합하였을 때의 세기를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 "결합 친화성", "에 결합한다", "에 결합하다" 또는 "에 결합하는"이란, 고유ㅢ 결합 친화성이 결합 쌍의 일원들(예컨대 항체 단편과 항원) 간 1:1 상호작용을 반영하는 경우를 지칭한다. 분자 X와, 이의 파트너인 Y의 친화성은, 일반적으로 해리 상수(KD)로 표시될 수 있다. 친화성은 당 분야에 공지된 통상의 방법, 예컨대 본원에 기술된 방법들로 측정될 수 있다. 저 친화성 항체는, 일반적으로 천천히 항원과 결합하고, 쉽게 항원과 해리되는 경향이 있는 반면, 고 친화성 항체는, 일반적으로 항원과 더 빨리 결합하고, 결합된 채 더 오래 유지되는 경향이 있다. 결합 친화성을 측정하는 방법 다수가 당 분야에 공지되어 있는데, 이 방법들 중 임의의 방법이 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 결합 친화성, 즉 결합 세기를 측정하기 위한 방법으로서, 특정의 예시적 및 모범적 구현예가 이하에 기술되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "K결합", "Ka" 또는 "Kon"이란 용어는, 특정의 항체-항원 상호작용에서의 결합 속도를 지칭하도록 의도되는 반면, 본원에 사용된 바와 같은 "K해리", "Kd" 또는 "Koff"란 용어는, 특정의 항체-항원 상호작용에서의 해리 속도를 지칭하도록 의도된다. 일 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 "KD"란 용어는, Kd 대 Ka의 비(즉 Kd/Ka)로부터 구하여진 해리 상수를 지칭하도록 의도되고, 몰 농도(M)로서 표현된다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 "KD" 또는 "KD 값" 또는 "KD" 또는 "KD 값"은 실시예에 기재된 바와 같이 MASS-1 SPR 기기(Sierra Sensors)를 사용하는 표면 플라스몬공명검정에 의해 측정된다. 항체의 결합 친화성은, 예컨대 해리 상수(KD)에 의해 결정될 수 있다. 더 큰 친화성은 더 낮은 KD로 표시되는 반면에, 더 약한 친화성은 더 높은 KD로 표시된다.
그러므로 적합한 구현예에서, 본 발명의 항체는 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, 1 pM 내지 10 nM, 1 pM 내지 7 nM, 1 pM 내지 5 nM, 1 pM 내지 4 nM, 1 pM 내지 3 nM, 1 pM 내지 2.5 nM, 1 pM 내지 2 nM, 1 pM 내지 1.5 nM, 1 pM 내지 1 nM, 바람직하게 1 pM 내지 0.5 nM의 해리 상수(KD)로 인간 IL-17A와 결합한다. 적합한 구현예에서, 본 발명의 항체는 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면 1 pM 내지 500 pM의 해리 상수(KD)로 인간 IL-17A와 결합한다. 적합한 구현예에서, 본 발명의 항체는 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 바람직하게 0.5 nM 미만의 해리 상수(KD)로 인간 IL-17A와 결합한다. 적합하게 본 발명의 항체는 1 nM 미만의 해리 상수(KD)로 인간 IL-17A와 결합한다. 적합하게 본 발명의 항체는 0.5 nM 미만의 해리 상수(KD)로 인간 IL-17A와 결합한다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는 표면플라스몬공명법(SPR)에 의해 측정되는 바에 따르면, 10 nM 미만, 예컨대 7 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 바람직하게 0.5 nM 미만의 KD로 사이노몰거스 IL-17A와 결합한다.
적합하게 본 발명의 항체는 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, 1 pM 내지 10 nM, 1 pM 내지 7 nM, 1 pM 내지 5 nM, 1 pM 내지 4 nM, 1 pM 내지 3 nM, 1 pM 내지 2.5 nM, 1 pM 내지 2 nM, 1 pM 내지 1.5 nM, 1 pM 내지 1 nM, 바람직하게 1 pM 내지 0.5 nM, 더욱 바람직하게 1 pM 내지 0.25 nM의 해리 상수(KD)로 인간 TNFα와 결합한다. 적합한 구현예에서, 본 발명의 항체는 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, 1 pM 내지 500 pM, 바람직하게 1 pM 내지 250 pM의 해리 상수(KD)로 인간 TNFα와 결합한다. 적합한 구현예에서, 본 발명의 항체는 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 바람직하게 0.5 nM 미만, 더욱 바람직하게 0.25 nM 미만의 해리 상수(KD)로 인간 TNFα와 결합한다. 적합하게 본 발명의 항체는 0.5 nM 미만의 해리 상수(KD)로 인간 TNFα와 결합한다. 적합하게 본 발명의 항체는 0.25 nM 미만의 해리 상수(KD)로 인간 TNFα와 결합한다.
적합한 구현예에서, 본 발명의 항체는 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, 1 pM 내지 10 nM, 1 pM 내지 7 nM, 1 pM 내지 5 nM, 1 pM 내지 4 nM, 1 pM 내지 3 nM, 바람직하게 1 pM 내지 2 nM의 해리 상수(KD)로 인간 혈청 알부민과 결합한다. 적합한 구현예에서, 본 발명의 항체는 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, 1 pM 내지 2000 pM의 해리 상수(KD)로 인간 혈청 알부민과 결합한다. 적합한 구현예에서, 본 발명의 항체는 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 바람직하게 2 nM 미만의 해리 상수(KD)로 인간 혈청 알부민과 결합한다. 적합하게 본 발명의 항체는 2 nM 미만의 해리 상수(KD)로 인간 혈청 알부민과 결합한다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는 표면플라스몬공명법(SPR)에 의해 측정되는 바에 따르면, 10 nM 미만, 예컨대 7 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 바람직하게 2 nM 미만의 KD 로 사이노몰거스 혈청 알부민과 결합한다.
적합하게 본 발명의 항체는 하기와 같은 유리한 생물물리학적 특성들을 가진다:
(a) 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4, 150 mM NaCl 포함)중 시차주사형광측정법에 의해 확정된 용융 온도(Tm)가 적어도 55℃, 바람직하게 적어도 58℃, 더욱 바람직하게 적어도 60℃이고;
(b) 상기 다중 특이적 항체의 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.4)중 출발 농도가 10 mg/ml일 때, 5회 연속 동결-해동 주기 후 단량체 함량 감소율이 5% 미만, 예컨대 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 바람직하게 1% 이하이고;
(c) 상기 다중 특이적 항체의 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.4)중 출발 농도가 10 mg/ml일 때, 적어도 2주, 특히 적어도 4주 동안 4℃에 보관하였을 때 단량체 함량 감소율이 10% 미만, 바람직하게 5% 미만이고/이거나;
(d) 상기 다중 특이적 항체의 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.4)중 출발 농도가 10 mg/ml일 때, 적어도 2주, 특히 적어도 4주 동안 37℃에 보관하였을 때 단량체 함량 감소율이 20% 미만, 바람직하게 15% 미만임.
용융 온도(Tm)는 이전에 기술된 바와 같이 시차주사형광측정법(DSF)에 의해 확정된다(Egan, et al., MAbs, 9(1)(2017), 68-84; Niesen, et al., Nature Protocols, 2(9)(2007) 2212-2221). 열 언폴딩에 대한 전이의 중간점은 형광 염료인 SYPRO® 오렌지를 사용하여 시차주사형광측정법(DSF)에 의해 확정된다(Wong & Raleigh, Protein Science 25 (2016) 1834-1840 참조). 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4) 중 시료는 최종 단백질 농도가 50 μg/mL이고, 총 부피 100 μl 중 5x SYPRO® 오렌지 최종 농도만큼을 함유하도록 제조된다. 제조된 시료 25 마이크로리터만큼이 백색의 벽으로 둘려있는 AB 유전자 PCR 평판에 3회 첨가된다. 이 검정은 열 순환기로서 사용되는 qPCR 기계 안에서 수행되고, 형광 발광도는 소프트웨어의 맞춤 염료 보정 루틴에 따라서 검출된다. 시험 시료가 담긴 PCR 평판 온도는 1℃씩 승온하여 25℃에서 96℃까지 상승되고, 매 승온 시마다 30초씩 휴지기를 둔다. 총 검정 시간은 약 2시간이다. Tm은 곡선의 변곡점을 산정하기 위한 산술적 2차도함수법을 이용하여 소프트웨어 GraphPad Prism에 의해 산정된다. 보고된 Tm은 3회 측정값의 평균이다.
단량체 함량 감소율은 SE-HPLC에 의해 확정된다. SE-HPLC는 USP의 챕터 621에 개략적으로 기술된 바와 같이 고체 정지상 및 액체 이동상을 기반으로 하는 분리 기술이다. 이 방법은 소수성 정지상과 수성 이동상을 이용하여 분자들을 자체의 크기와 형상을 바탕으로 분리한다. 분자의 분리는 특정 컬럼의 허공부피(void volume; V0)와 총 투과 부피(total permeation volume; VT) 사이에서 일어난다. SE-HPLC에 의한 측정은 자동 시료 주입장치 및 UV 검출기(검출 파장 280 nm로 설정)가 장착된 Chromaster HPLC 시스템(Hitachi High-Technologies Corporation)에서 수행된다. 장비는 구하여진 크로마토그램의 분석을 지원해주기도 하는 소프트웨어 EZChrom Elite(Agilent Technologies, Version 3.3.2 SP2)로 제어된다. 단백질 시료는 원심분리에 의해 청징화되고, 주입되기 전 자동시료추출기 안에 담긴다(온도는 6℃로 유지). scFv 시료를 분석하기 위해 컬럼 Shodex KW403-4F(Showa Denko Inc., #F6989202)가 사용되는데, 이 경우 표준화된 완충 염 이동상(50 mM 인산나트륨 pH6.5, 300 mM 염화나트륨)이 0.35 mL/분의 권장 유속으로 흐른다. 1회 주입당 표적 시료량은 5 μg이었다. 시료는 280 nm의 파장에서 UV 검출기로 검출되고, 데이터는 적합한 소프트웨어 슈트로 기록되었다. 구하여진 크로마토그램은 V0 ~ VT의 범위에서 분석되고, 그로 말미암아 용리 시간 10분을 초과하는 매트릭스 연관 피크는 배제된다.
IL-17A와 특이적으로 결합하는 예시적 도메인
본 발명의 다중 특이적 항체는 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인을 포함하는데, 상기 도메인은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, (a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하고, (b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함한다.
IL-17A와 특이적으로 결합하는 것으로서, 본 발명의 다중 특이적 항체에 사용하기 적합한 도메인으로서는 하기의 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다:
- 이하 "본 발명의 항 IL-17A 항체" 섹션에 제시된 인간화 모노클로날 항체 또는 이의 결합 도메인(그 서열은 표 1에 나열되어 있음);
- AIN457(세쿠키누맙이라고도 지칭됨; 본원에 전체가 참고문헌으로서 첨부되어 있는 미국 특허 제7,807,155호 및 WO 2006/013107에 개시됨) 또는 이의 항원 결합 단편;
- LY2439821(익세키주맙이라고도 지칭됨; 본원에 전체가 참고문헌으로서 첨부되어 있는 미국 특허 제7,838,638호 및 동 제8,110,191호 및 WO 2007/070750에 개시됨) 또는 이의 항원 결합 단편;
- SCH900117 또는 이의 항원 결합 단편(Merck);
- RG4943 또는 이의 항원 결합 단편(Roche);
- 본원에 전체가 참고문헌으로서 첨부되어 있는 WO 2006/013107, WO 2006/054059, WO 2007/070750, WO 2007/149032, WO 2008/001063, WO 2008/021156, WO 2010/034443, WO 2010/102251, WO 2012/018767, WO 2014/161570, WO 2014/001368, WO 2014/122613, WO 2015/070697, WO 2015/137843, WO 2016/048188, WO 2016/113557, WO 2016/138842, WO 2017/068472에 개시된 항 IL-17A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
IL-17A와 특이적으로 결합하는 것으로서, 본 발명의 다중 특이적 항체에 사용하기 바람직한 도메인은 이하에 제시된 것으로서, 그 서열이 표 1에 나열되어 있는 인간화 모노클로날 항체 또는 이의 결합 도메인을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
그러므로 일 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제1 도메인은 CDR들의 세트, 즉 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하고, 이 CDR들의 세트는, (i) HCDR1'은 서열 번호 1, 4 및 7중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 1의 아미노산 서열이고; HCDR2'는 서열 번호 2, 5 및 8중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 2의 아미노산 서열이고; HCDR3'는 서열 번호 3, 6 및 9중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 3의 아미노산 서열이고; LCDR1' 서열 번호 12, 15 및 18중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 12의 아미노산 서열이고; LCDR2'는 서열 번호 13, 16 및 19중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 13의 아미노산 서열이고; LCDR3'는 서열 번호 14, 17 및 20중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 14의 아미노산 서열을 가지거나; (ii) HCDR1'은 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 39의 아미노산 서열이고; HCDR2'는 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 40의 아미노산 서열이고; HCDR3'는 서열 번호 41, 44 및 47중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 41의 아미노산 서열이고; LCDR1'은 서열 번호 50, 53 및 56중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 50의 아미노산 서열이고; LCDR2'는 서열 번호 51, 54 및 57중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 51의 아미노산 서열이고; LCDR3'는 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 52의 아미노산 서열을 가지는 CDR들의 세트에 10개 이하의 아미노산 치환, 예컨대 9개 이하의 아미노산 치환, 8개 이하의 아미노산 치환, 7개 이하의 아미노산 치환, 6개 이하의 아미노산 치환, 5개 이하의 아미노산 치환, 4개 이하의 아미노산 치환, 3개 이하의 아미노산 치환, 2개 이하의 아미노산 치환, 1개 또는 0개의 아미노산 치환, 바람직하게는 0개의 아미노산 치환이 발생한 것인 다중 특이적 항체를 제공한다.
구체적으로 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제1 도메인은 표 1에 나열된 VH CDR들중 임의의 하나의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR을 포함한다. 구체적으로 상기 도메인은 표 1에 나열된 VH CDR들중 임의의 것의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR을 1개, 2개, 3개 또는 그 이상 포함한다(또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있다).
적합하게 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는데, 상기 VH는 (i) 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 HCDR1은 서열 번호 1, 4 및 7중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR2는 서열 번호 2, 5 및 8 중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR3은 서열 번호 3, 6 및 9중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다. 구체적으로 본 발명은 인간 IL-17A에 대하여 결합 특이성을 가지는 항체를 제공하고, 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함하거나; 또는 (ii) 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하되, 상기 HCDR1은 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR2는 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR3은 서열 번호 41, 44 및 47중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다. 구체적으로 본 발명은 인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지는 항체를 제공하고, 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함한다.
본 발명은 또한 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인 및 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제1 도메인은 표 1에 나열된 VL CDR들중 임의의 하나의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR을 포함한다. 구체적으로 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인은 표 1에 나열된 VL CDR들중 임의의 것의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR을 1개, 2개, 3개 또는 그 이상 포함한다(또는 대안적으로 이것들로 이루어져 있다).
적합하게 IL-17A와 결합하는 상기 제1 도메인은 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는데, 단 상기 VL은 (i) 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 LCDR1은 서열 번호 12, 15 및 18중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR2는 서열 번호 13, 16 및 19중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR3은 서열 번호 14, 17 및 20중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다. 구체적으로 본 발명은 인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지는 항체를 제공하고, 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하거나; 또는 (ii) 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하되, 단 상기 LCDR1은 서열 번호 50, 53 및 56중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR2는 서열 번호 51, 54 및 57중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR3은 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다. 구체적으로 본 발명은 인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지는 항체를 제공하고, 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
적합하게 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제1 도메인은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고,
(i)(a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 HCDR1은 서열 번호 1, 4 및 7중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR2는 서열 번호 2, 5 및 8중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR3은 서열 번호 3, 6 및 9중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고;
(b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 LCDR1은 서열 번호 12, 15 및 18중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR2는 서열 번호 13, 16 및 19중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR3은 서열 번호 14, 17 및 20중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지거나; 또는
(ii) (a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 HCDR1은 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR2는 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR3은 서열 번호 41, 44 및 47중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고;
(b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 LCDR1은 서열 번호 50, 53 및 56중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR2는 서열 번호 51, 54 및 57중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR3은 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.
구체적으로 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제1 도메인은 (i)(a) 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, (b) 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각; 또는 (ii)(a) 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, (b) 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
IL-17A와 특이적으로 결합하는 본 발명의 기타 도메인은 돌연변이되었으되, CDR 영역내의 것들이 표 1에 제시된 서열에 도시된 CDR 영역내의 것들과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는, 아미노산을 포함한다. 적합하게 IL-17A와 특이적으로 결합하는 본 발명의 기타 도메인은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하되, 단 표 1에 제시된 서열들에 도시된 CDR 영역들과 비교되었을 때 CDR 영역내 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 10개 이하의 아미노산이 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이되었다. 돌연변이, 예컨대 치환은 CDR들의 세트내 임의의 잔기에서 잠재적으로 이루어질 수 있으며, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 내에서 이루어질 수 있다.
“아미노산”이란 용어는, 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산의 작용 방식과 유사한 방식으로 작용을 하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모의체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화된 것들뿐만 아니라, 사후에 변형된 아미노산, 예컨대 하이드록시프롤린, 감마-카복시글루탐산염 및 O-포스포세린이다. “폴리펩티드” 및 “단백질”이란 용어는 본원에서 아미노산 잔기들로 이루어진 중합체를 지칭하는 것으로서 호환되어 사용되고 있다. 이 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기가 대응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 인공 모의체인 아미노산 중합체에 적용될 뿐만 아니라, 자연 발생 아미노산 중합체 및 비 자연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. 달리 명시되지 않는 한, 특정의 폴리펩티드 서열은 또한 암묵적으로 이 서열의 보존적으로 변형된 변이체도 포함한다.
CDR들, 항체 VH 또는 VL 도메인, 그리고 항체의 아미노산 서열내 돌연변이, 예컨대 치환을 수행하는데 필요한 기술은, 일반적으로 당 분야에 이용 가능하다. 변이체 서열은 활성에 대해 최소 또는 유리한 효과를 발휘하는 것으로 예측될 수 있거나 예측될 수 없으며, IL-17A, 대안적으로 TNFα 또는 인간 혈청 알부민과 결합하고/결합하거나 중화하는 능력 및/또는 기타 임의의 원하는 특성에 대해 시험될 수 있거나 시험될 수 없는 돌연변이, 예컨대 치환으로 제조될 수 있다. CDR내 적합한 돌연변이, 예컨대 치환은 기능 살실을 초래하지 않으므로, 이처럼 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 항체 또는 이의 결합 도메인은 IL-17A, 대안적으로 TNFα 또는 인간 혈청 알부민과 결합하고/결합하거나 중화하는 능력을 보유한다. 예를 들어 이것은, 예컨대 본원에 기재된 검정에서 측정된 바에 따르면, 변경이 일어나지 않은 본 발명의 도메인의 경우와 동일한 정량적 결합 및/또는 중화 능력을 보유할 수 있다. 적합하게 이처럼 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단편의 본 발명에 따른 도메인은, IL-17A, 대안적으로는 TNFα 또는 인간 혈청 알부민과 결합하는 능력 및/또는 이를 중화하는 능력이 개선될 수 있다. 적합하게 IL-17A와 특이적으로 결합하고, 이처럼 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 제1 도메인은, HT-29 검정에서 Gro-α 분비를 측정함으로써 확정되는, 세쿠키누맙 역가를 기준으로 한 역가(상대적 역가) 2 이상, 예컨대 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 바람직하게 50 이상으로 IL-17A를 중화하는 능력을 가지고, 상기 상대적 역가는 HT-29 검정에서 측정되는 바와 같은 세쿠키누맙의 IC50 값(ng/mL) 대 HT-29 검정에서 측정되는 바와 같은 상기 다중 특이적 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비이다.
더욱이 CDR내 적합한 돌연변이, 예컨대 치환은 본 발명의 다중 특이적 항체의 가용성, 안정성 및 고수율 생산성 저하를 초래하지 않으므로, 이처럼 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 결합 도메인은 생물물리학적 특징을 보유한다. 예를 들어 이러한 다중 특이적 항체 또는 이의 결합 도메인은, 예를 들어 본원에 기재된 검정에서 측정되는 바에 따르면 변경이 이루어지지 않은 본 발명의 다중 특이적 항체의 경우와 동일한, 고수율 생산성 및/또는 안정성을 보유할 수 있다. 적합하게 이처럼 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는 다중 특이적 항체 또는 이의 결합 도메인은 개선된 생물물리학적 특징을 가진다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 관한 내용중 “동일한” 또는 “동일성”%란 용어는, 서열 또는 종속서열 2개 이상이 동일한 경우를 지칭한다. 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 항체 서열과 관련하여 “아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)” 및 “상동성”은, 필요에 따라 최대의 서열 동일성%를 달성하기 위해 서열들을 정렬하고 갭을 도입한 후, 서열 동일성의 일환으로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않았을 때, 특정 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 중 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 중 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성% 확정을 목표로 하는 정렬은 당 업자의 능력안에 있는 다양한 방법, 예컨대 공중이 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2 또는 ALIGN 소프트웨어로 달성될 수 있다. 당 업자들은 정렬결과를 측정하기에 적당한 매개변수, 예컨대 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 확정할 수 있다.
서열 비교를 위해, 통상 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조기준 서열로서의 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘이 사용될 때, 시험 서열 및 참조기준 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요에 따라 종속 서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트 프로그램 매개변수가 사용될 수 있거나, 또는 대안적 매개변수가 지정될 수 있다. 그 다음, 서열 비교 알고리즘은 참조기준 서열을 기준으로 프로그램 매개변수에 입각하여 시험 서열에 대한 서열 동일성%를 산정한다.
서열 동일성%와 서열 유사성%를 확정하기에 적합한 알고리즘 2가지 예로서는 BLAST 알고리즘 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있는데, 이 알고리즘들은 각각 문헌[Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1977] 및 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립생물정보센터를 통해 공중이 이용가능하다.
아미노산 서열 2개 사이의 동일성%는 또한, PAM120 가중 잔기표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 적용하는 ALIGN 프로그램(2.0 버전)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘(Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17, 1988)을 이용하여 확정될 수 있다. 또한, 아미노산 서열 2개 사이의 동일성%는, Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 어느 하나와, 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4, 그리고 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 적용하여 GCG 소프트웨어 팩키지 내 GAP 프로그램(www.gcg.com으로부터 입수 가능함)에 통합된 Needleman 및 Wunsch 알고리즘(J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)을 이용하여 확정될 수 있다.
적합하게 IL-17a와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 다중 특이적 항체의 제1 도메인은 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는데, 단
(i)(a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하되,
상기 HCDR1은 서열 번호 1, 4 및 7중 임의의 하나, 바람직하게는 서열 번호 1에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고;
상기 HCDR2는 서열 번호 2, 5 및 8중 임의의 하나, 바람직하게는 서열 번호 2에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고;
상기 HCDR3은 서열 번호 3, 6 및 9중 임의의 하나, 바람직하게는 서열 번호 3에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고/가지거나;
(b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하되,
상기 LCDR1은 서열 번호 12, 15 및 18중 임의의 하나, 바람직하게는 서열 번호 12에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고;
상기 LCDR2는 서열 번호 13, 16 및 19중 임의의 하나, 바람직하게는 서열 번호 13에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고;
상기 LCDR3은 서열 번호 14, 17 및 20중 임의의 하나, 바람직하게는 서열 번호 14에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지거나; 또는
(ii) (a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하되,
상기 HCDR1은 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나, 바람직하게는 서열 번호 39에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고;
상기 HCDR2는 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나, 바람직하게는 서열 번호 40에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고;
상기 HCDR3은 서열 번호 41, 44 및 47중 임의의 하나, 바람직하게는 서열 번호 41에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고/가지거나;
(b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하되,
상기 LCDR1은 서열 번호 50, 53 및 56중 임의의 하나, 바람직하게는 서열 번호 50에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고;
상기 LCDR2는 서열 번호 51, 54 및 57중 임의의 하나, 바람직하게는 서열 번호 51에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고;
상기 LCDR3은 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나, 바람직하게는 서열 번호 52에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가진다.
적합하게 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인은 (i) 서열 번호 1, 2 및 3의 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 각각, 및/또는 서열 번호 12, 13 및 14의 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 각각; 또는 (ii) 서열 번호 39, 40 및 41의 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 각각, 및/또는 서열 번호 50, 51 및 52의 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 각각을 포함한다.
추가의 구현예에서, IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인은 중쇄 가변 영역 VHA 및 경쇄 가변 영역 VLA를 포함한다.
본 발명의 내용 중 "VH"(가변 중쇄 또는 중쇄 가변 영역), "VL"(가변 경쇄 또는 경쇄 가변 영역),"Vκ" 및 "Vλ"란 용어는, 서열 동일성 및 상동성에 따라서 분류되는 항체 중쇄 서열 및 항체 경쇄 서열의 과들을 지칭한다. 예컨대 상동성 검색 매트릭스, 예컨대 BLOSUM(Henikoff, S. &Henikoff, J. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 10915-10919)을 사용하여 서열 상동성을 확정하기 위한 방법과, 상동성에 따라서 서열을 분류하기 위한 방법은 당 업자에게 널리 공지되어 있다. VH의 경우 상이한 하위 과 Vκ 및 Vλ는, 예컨대 VH1A, VH1B 및 VH2 ~ VH6인 VH, Vκ1 ~ Vκ4인 Vκ, 그리고 Vλ1 ~ Vλ3인 Vλ로 구분한 문헌[Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86]에 보인 바와 같이 식별될 수 있다. 항체 Vκ 사슬, Vλ 사슬 및 VH 사슬은 생식계열 κ 사슬 V 및 J 분절, 생식계열 λ 사슬 V 및 J 분절, 그리고 중쇄 V, D 및 J 분절 각각의 생체 내 무작위 재배열의 결과이다. 주어진 항체 가변 사슬이 어느 하위 과에 속하는지는, 대응하는 V 분절, 구체적으로 틀 영역 FR1 ~ FR3에 의해 결정된다. 그러므로 본 출원에서 오로지 특정의 틀 영역 HFR1 ~ HFR3 세트에 의해서만 특징지어지는 임의의 VH 서열은, 임의의 HFR4 서열, 예컨대 중쇄 생식계열 J 분절중 하나로부터 취하여진 HFR4 서열, 또는 재배열된 VH 서열로부터 취하여진 HFR4 서열과 합하여질 수 있다.
적합하게 IL-17A와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 다중 특이적 항체의 제1 도메인은 VH1A, VH1B, VH3 또는 VH4인 중쇄 가변 영역 VHA를 포함한다. 일 구현예에서, IL-17A와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 상기 제1 도메인은 VH4인 중쇄 가변 영역 VHA를 포함한다. 바람직한 구현예에서, IL-17A와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 상기 제1 도메인은 VH3인 중쇄 가변 영역 VHA를 포함한다.
적합하게 IL-17A와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 다중 특이적 항체의 제1 도메인은 경쇄 가변 영역 VLA를 포함하되, 상기 VLA는 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 바람직하게 Vκ1 틀 FR1 ~ FR3, 그리고 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4, Vκ3 FR4, 및 Vλ FR4로부터 선택된 틀 FR4를 포함한다. 적합한 Vλ FR4는 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32에 재시된 바와 같다. 일 구현예에서, IL-17A와 결합하는 상기 제1 도메인은 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 26 또는 서열 번호 27의 아미노산 서열, 더욱 바람직하게 서열 번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4를 포함한다. 적합하게 IL-17A와 특이적으로 결합하는 상기 제1 도메인은 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 26 또는 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 더욱 바람직하게 서열 번호 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4를 포함한다.
그러므로 일 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제1 도메인은
(i)(a) 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각; 또는 (i)(b) 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각;
(ii) VH3 도메인 또는 VH4 도메인, 바람직하게 VH3 도메인; 및
(iii) Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 바람직하게 Vκ1 FR1 ~ FR3, 및 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4, Vκ3 FR4, 및 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 더욱 바람직하게 서열 번호 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4로부터 선택된 틀 FR4를 포함하는 VL 틀을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
적합하게 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제1 도메인은 표 1에 나열된 VH를 포함한다. 적합하게 본 발명은 또한 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제1 도메인은 표 1에 나열된 VH 아미노산 서열을 포함하되(또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있되), 틀 서열(예를 들어 CDR이 아닌 서열)내 약 20개 이하의 아미노산, 바람직하게 약 10개 이하의 아미노산은 돌연변이되었다[단 이때의 돌연변이는 다양한 비제한적 예로서 부가, 치환 또는 결실임]. IL-17A와 특이적으로 결합하는 본 발명의 기타 도메인은 돌연변이되었으되, VH 영역내의 것들이 표 1에 제시된 서열에 도시된 VH 영역내의 것들과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는, 아미노산을 포함한다.
적합하게 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제1 도메인은 표 1에 나열된 VL 도메인을 포함한다. 적합하게 본 발명은 또한 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제1 도메인은 표 1에 나열된 VL 아미노산 서열을 포함하되(또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있되), 틀 서열(예를 들어 CDR이 아닌 서열)내 약 20개 이하의 아미노산, 바람직하게 약 10개 이하의 아미노산은 돌연변이되었다[단 이때의 돌연변이는 다양한 비제한적 예로서 부가, 치환 또는 결실임]. IL-17A와 특이적으로 결합하는 본 발명의 기타 도메인은 돌연변이되었으되, VL 영역내의 것들이 표 1에 제시된 서열에 도시된 VL 영역내의 것들과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는, 아미노산을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제1 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 10 또는 서열 번호 11, 바람직하게 서열 번호 10과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 도메인은 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함한다. 추가의 구현예에서, IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 11과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 Q14K, G16E 및 G56A(AHo 번호매김)를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제1 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 48 또는 서열 번호 49, 바람직하게 서열 번호 48과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 항체는 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 상기 항체는 아미노산 서열인 서열 번호 49와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 R20T 및 Q141P(AHo 번호매김)를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제1 도메인은 (i) 아미노산 서열인 서열 번호 21 또는 서열 번호 22, 바람직하게 서열 번호 21과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 겨쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 항체는 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하거나; 또는 (ii) 아미노산 서열인 서열 번호 59 또는 서열 번호 60, 바람직하게 서열 번호 59와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 항체는 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제1 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 22와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 A51P(AHo 번호매김)를 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제1 도메인은 (i) 아미노산 서열인 서열 번호 10과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과; 아미노산 서열인 서열 번호 21과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는 (ii) 아미노산 서열인 서열 번호 48과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과; 아미노산 서열인 서열 번호 59와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직하게, IL-17A와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 다중 특이적 항체의 상기 제1 도메인은 (i) 아미노산 서열인 서열 번호 10과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과; 아미노산 서열인 서열 번호 21과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이 항체는 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각 및/또는 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고; 구체적으로 이 항체는 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하거나; 또는 (ii) 아미노산 서열인 서열 번호 48과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과; 아미노산 서열인 서열 번호 59와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이 항체는 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각 및/또는 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고; 구체적으로 이 항체는 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 39, 40 및 41의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
구체적인 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제1 도메인은 (i) 서열 번호 10 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 21 및 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 이의 VL; 또는 (ii) 서열 번호 48 및 19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 59 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 이의 VL을 포함한다.
구체적인 구현예에서, IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인은 (i) 서열 번호 10의 VH 서열과 서열 번호 21의 VL 서열; 또는 (ii) 서열 번호 48의 VH 서열과 서열 번호 59의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 구현예에서, IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인은 (i) 서열 번호 11의 VH 서열과 서열 번호 22의 VL 서열; 또는 (ii) 서열 번호 49의 VH 서열과 서열 번호 60의 VL 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 도메인은 표 1에 제시된 도메인이다. 일 구현예에서, 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 도메인은 (i) 서열 번호 24 및 25로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 24의 아미노산 서열 또는 (ii) 서열 번호 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 61의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 도메인은 (i) 서열 번호 24 또는 서열 번호 25, 바람직하게 서열 번호 24, 또는 (ii) 서열 번호 61 또는 서열 번호 62, 바람직하게 서열 번호 61에 제시된 바와 같다.
인간 IL-17A에 대하여 결합 특이성을 가지는 본 발명의 기타 도메인은, 아미노산 또는 이 아미노산을 암호화하는 핵산이 돌연변이되었으되, 표 1에 제시된 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 보이는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 이는 표 1에 제시된 서열에 도시된 가변 영역과 비교되었을 때 가변 영역의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이되었으되, 실질적으로 동일한 활성을 보유하는, 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "실질적으로 동일한 활성"이란 용어는, 모 항체, 예컨대 본 발명의 다중 특이적 항체, 구체적으로 표 1에 제시된, 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인 및/또는 표 1에 제시된, 인간 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 본 발명의 다중 특이적 항체에 대해 측정되었을 때, 그 활성이 이러한 항체 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 100% 또는 적어도 110%, 또는 적어도 120%, 또는 적어도 130%, 또는 적어도 140%, 또는 적어도 150%, 또는 적어도 160%, 또는 적어도 170%, 또는 적어도 180%, 또는 적어도 190%, 예컨대 200% 이하인 것과 같이 실질적으로 동일한 것으로 나타나는 경우를 지칭한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제1 도메인은 표 1에 제시된 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 도메인은 인간 IL-17A와 결합하고, 표 1에 제시된 도메인의 원하는 기능상 특성들을 보유한다.
일 구현예에서, IL-17A와 특이적으로 결합하는 본 발명의 도메인은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지는데, 여기서 이 CDR 서열들 중 1개 이상은 본원에 기술된 도메인들을 바탕으로 지정된 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형을 가지고, 이 도메인들은 본 발명의 항체의 원하는 기능상 특성들을 보유한다.
"보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 변이체"란 용어는 아미노산 서열과 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정의 핵산 서열에 관하여 보존적으로 변형된 변이체란, 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 말미암아 기능상 동일한 핵산 다수가 임의의 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들어 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 그러므로 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서 이 코돈은, 암호화된 폴리펩티드를 변경시키지 않고, 기술된 대응 코돈들 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형되는 변이의 일종인 "침묵 변이"이다. 어떤 폴리펩티드를 암호화하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산에 일어날 수 있는 모든 침묵 변형을 기술하기도 한다. 당 업자는 핵산 내에 있는 각각의 코돈(보통 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG와, 보통 트립토판의 유일한 코돈인 TGG는 제외)이 변형되어, 기능상 동일한 분자가 수득될 수 있음을 인지할 것이다. 그러므로 어떤 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 일어나는 침묵 변이 각각은 기술된 각각의 서열 내에 내포되어 있다.
폴리펩티드 서열에 있어서 "보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 변이체"는 어떤 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 일으키는, 폴리펩티드 서열에 대한 각각의 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 기능상 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 이처럼 보존적으로 변형된(즉 "보존적 변형"이 1회 이상 이루어진) 변이체는 본 발명의 대립형질, 종간 상동체 및 다형성 변이체에 부가적이고, 이것들을 배제하지 않는다. 하기 8개의 군은 서로 간에 보존적 치환인 아미노산들을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소루신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 그리고 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(에컨대 문헌(Creighton, Proteins (1984)) 참조). 일 구현예에서, "보존적 서열 변형"이란 용어는, 어떤 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의미한 영향을 미치지 않거나, 이를 유의미하게 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하는데 사용된다.
그러므로 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제1 도메인은
(i)
3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 HCDR1은 아미노산 서열인 서열 번호 1 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 HCDR2는 아미노산 서열인 서열 번호 2 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 HCDR3은 서열 번호 3 또는 이의 보존적 변이체중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열인 중쇄 가변 영역(VH)과;
3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 LCDR1은 아미노산 서열인 서열 번호 12 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 LCDR2는 아미노산 서열인 서열 번호 13 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 LCDR3은 아미노산 서열인 서열 번호 14 또는 이의 보존적 변이체를 가지는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(ii)
3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 HCDR1은 아미노산 서열인 서열 번호 39 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 HCDR2는 아미노산 서열인 서열 번호 40 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 HCDR3은 서열 번호 41 또는 이의 보존적 변이체중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열인 중쇄 가변 영역(VH)과;
3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 LCDR1은 아미노산 서열인 서열 번호 50 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 LCDR2는 아미노산 서열인 서열 번호 51 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 LCDR3은 아미노산 서열인 서열 번호 52 또는 이의 보존적 변이체를 가지는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고(또는 이것으로 이루어져 있고),
이 항체는 인간 IL-17A 와 특이적으로 결합하고/결합하거나 IL-17A를 중화시킨다.
본 발명의 항 IL-17A 항체
본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하고, 개선된 친화성, 효능 및 선택성을 가지는 항체 분자의 발견을 기반으로 한다. 더욱이 본 발명의 항체는 개선된 생물물리학적 특성, 예컨대 개선된 가용성, 개발가능성 및 고수율이면서 비교적 적은 불순물을 동반하는(SE-HPLC에 의해 검출되는 바에 따르면 단량체가 98%를 초과, 구체적으로 99%를 초과하는) 생산성, 그리고 안정성을 가진다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 IL-17A에 대해 결합 특이성을 가지고, CDR들의 세트, 즉 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하되, 이 CDR들의 세트는, (i) HCDR1'은 서열 번호 1, 4 및 7중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 1의 아미노산 서열이고; HCDR2'는 서열 번호 2, 5 및 8중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 2의 아미노산 서열이고; HCDR3'는 서열 번호 3, 6 및 9중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 3의 아미노산 서열이고; LCDR1' 서열 번호 12, 15 및 18중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 12의 아미노산 서열이고; LCDR2'는 서열 번호 13, 16 및 19중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 13의 아미노산 서열이고; LCDR3'는 서열 번호 14, 17 및 20중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 14의 아미노산 서열을 가지거나; (ii) HCDR1'은 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 39의 아미노산 서열이고; HCDR2'는 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 40의 아미노산 서열이고; HCDR3'는 서열 번호 41, 44 및 47중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 41의 아미노산 서열이고; LCDR1'은 서열 번호 50, 53 및 56중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 50의 아미노산 서열이고; LCDR2'는 서열 번호 51, 54 및 57중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 51의 아미노산 서열이고; LCDR3'는 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 52의 아미노산 서열을 가지는 CDR들의 세트에 10개 이하의 아미노산 치환, 예컨대 9개 이하의 아미노산 치환, 8개 이하의 아미노산 치환, 7개 이하의 아미노산 치환, 6개 이하의 아미노산 치환, 5개 이하의 아미노산 치환, 4개 이하의 아미노산 치환, 3개 이하의 아미노산 치환, 2개 이하의 아미노산 치환, 1개 또는 0개의 아미노산 치환, 바람직하게는 0개의 아미노산 치환이 발생한 것인, 단리 항체를 제공한다.
"IL-17A" 또는 "IL17A"란 용어는, 구체적으로 UniProt 식별 번호 Q16552(본원에서는 서열 번호 33으로서 재현됨)인 인간 IL-17A를 지칭한다. "사이노몰거스 IL-17A" 또는 "사이노몰거스 원숭이 IL-17A"란 용어는, UniProt 식별 번호 G1QUS7인 마카카 파스큘라리스(Macaca fascicularis) IL-17A를 지칭한다.
"IL-17B"란 용어는, 구체적으로 UniProt 식별 번호 Q9UHF5(본원에서는 서열 번호 34로서 재현됨)인 인간 IL-17B를 지칭한다. "IL-17C"란 용어는, 구체적으로 UniProt 식별 번호 Q9P0M4(본원에서는 서열 번호 35로서 재현됨)인 인간 IL-17C를 지칭한다. "IL-17D"란 용어는, 구체적으로 UniProt 식별 번호 Q8TAD2(본원에서는 서열 번호 36으로서 재현됨)인 인간 IL-17D를 지칭한다. "IL-17E"란 용어는, 구체적으로 UniProt 식별 번호 Q9H293(본원에서는 서열 번호 37로서 재현됨)인 인간 IL-17E를 지칭한다. "IL-17F"란 용어는, 구체적으로 UniProt 식별 번호 Q96PD4(본원에서는 서열 번호 38로서 재현됨)인 인간 IL-17F를 지칭한다.
"에피토프"란 용어는, 항체와 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소화 영역을 의미한다. 에피토프는, 예를 들어 폴리펩티드의 연속 아미노산일 수 있거나, 또는 에피토프는, 예를 들어 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 불연속 영역 2개 이상이 모아진 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체" 등의 용어는 전항체; 전항체의 임의의 항원 결합 단편(즉 "항원 결합부") 또는 이의 단일 사슬; 및 항체 CDR, VH 영역들 또는 VL 영역들을 포함하는 분자(예컨대 다중 특이적 항체(이에 한정되는 것은 아님))를 포함한다. 자연 발생 "전항체"는 적어도 2개의 중(H) 쇄 및 2개의 경(L) 쇄가 이황화 결합에 의해 상호 연결되어 포함되어 있는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3로 구성되어 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로서 약칭됨)과 경쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, 즉 CL로 구성되어 있다. VH 영역 및 VL 영역은 추가로, 틀 영역(FR)이라 칭하여지는 더욱 잘 보존된 영역들 사이에 배치된, 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하여지는 초가변 영역으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단으로부터 카복시 말단 방향으로 하기 순서로 배열된 CDR 3개와 FR 4개로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역글로불린과, 숙주 조직 또는 인자, 예컨대 면역계의 다양한 세포(예컨대 효과기 세포) 및 고전적 보체계의 제1 성분(Clq)의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "이소타입"이란 용어는, 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 군(예컨대 IgM, IgE, IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4)을 지칭한다. 이소타입은 또한 이러한 군들 중 하나의 변형된 것도 포함하는데, 이 경우 변형은 Fc 기능을 변경하도록 이루어지고, 그 결과, 에컨대 Fc 수용체에의 결합 또는 효과기 기능이 향상되거나 감소된다. 적합하게 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 IgG이다. 더욱 적합하게 본 발명의 항체는 IgG1 또는 IgG4이다.
본원에 사용된 바와 같은 "항원 결합 단편" 및 "항원 결합부"등의 용어는, 주어진 항원(예컨대 IL-17A)과 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 비변형 전항체의 단편 1개 이상을 지칭한다. 항체의 "항원 결합부"란 용어에 포함되는 결합 단편의 예들로서는, VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 2개의 Fab 단편이 경첩 영역에서 이황화 가교에 의해 연결되어 포함되어 있는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인들로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인들로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체(dAb) 단편(Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 단리된 상보성 결정 영역(CDR), dsFv, scAb, STAB, 단일 도메인 항체(scAb 또는 dAb), 단일 도메인 중쇄 항체, 단일 도메인 경쇄 항체, VHH, VNAR, 상어 유래 VNAR 구조를 기반으로 한 단일 도메인 항체, 그리고 대안적 스캐폴드를 기반으로 하는 결합 도메인, 예컨대 안키린 기반 도메인, 파이노머, 아비머, 안티칼린, 피브로넥틴, 및 항체의 불변 영역으로 구축될 결합 부위들(예컨대 F-star의 Modular AntibodyTechnologyTM)(이에 한정되는 것은 아님)을 포함한다.
"상보성 결정 영역"("CDR")이란 용어는, Kabat외 다수에 의해 기술된 체계(1991)("Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) ("Kabat" 번호매김 체계), Al-Lazikani외 다수에 의해 기술된 체계(1997)(JMB 273, 927-948) ("Chothia" 번호매김 체계) 및 ImMunoGenTics(IMGT) 번호매김 체계(Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P외 다수(Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)("IMGT" 번호매김 체계) 및 문헌[Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670]에 기술된 번호매김 체계("AHo" 번호매김 체계)를 비롯한 다수의 널리 공지된 체계 중 임의의 것이 사용되어 경계가 결정되는 아미노산 서열이다. 예를 들어 고전적인 포맷의 경우 Kabat 체계하에서 중쇄 가변 도메인(VH) 중의 CDR 아미노산 잔기들은 31번 ~ 35번(HCDR1), 50번 ~ 65번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3)과 같이 번호가 매겨지고; 경쇄 가변 도메인(VL) 중의 CDR 아미노산 잔기들은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2), 그리고 89번 ~ 97번(LCDR3)과 같이 번호가 매겨진다. Chothia 체계하에서 VH 중의 CDR 아미노산은 26번 ~ 32번(HCDR1), 52번 ~ 56번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3)과 같이 번호가 매겨지고; VL 중의 아미노산 잔기들은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3)과 같이 번호가 매겨진다. Kabat 체계 및 Chothia 체계 둘 다에 의한 CDR 정의들을 조합하였을 때, 인간 VH 중의 CDR은 26번 ~ 35번(HCDR1), 50번 ~ 65번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3) 아미노산 잔기들로 이루어지고, 인간 VL 중의 CDR은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3) 아미노산 잔기들로 이루어진다. IMGT 체계 하에서 VH 중의 CDR 아미노산 잔기들은 대략 26번 ~ 35번(HCDR1), 51번 ~ 57번(HCDR2) 및 93번 ~ 102번(HCDR3)으로 번호가 매겨지고, VL 중의 CDR 아미노산 잔기들은 대략 27번 ~ 32번(LCDR1), 50번 ~ 52번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3)으로 번호가 매겨진다("Kabat" 체계에 따른 번호매김). IMGT 체계 하에 항체의 CDR들은 IMGT/DomainGap Align이라는 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 내용에서는 특별히 달리 언급되지 않는 한, Honegger 및 Pluckthun에 의해 제안된 번호매김 체계("AHo")가 사용된다(Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670). 또한 하기 잔기들이 AHo 번호매김 체계에 따라 CDR로서 정의된다: LCDR1(CDR-L1라고도 지칭됨): L24 ~ L42; LCDR2(CDR-L2라고도 지칭됨): L58 ~ L72; LCDR3(CDR-L3라고도 지칭됨): L107 ~ L138; HCDR1(CDR-H1라고도 지칭됨): H27-H42; HCDR2(CDR-H2라고도 지칭됨): H57 ~ H76; HCDR3(CDR-H3라고도 지칭됨): H108-H138. 명료함을 도모하기 위해, Honegger 및 Pluckthun에 따른 번호매김 체계는 자연 발생 항체의 상이한 VH 및 VL 하위 과, 구체적으로 CDR에서 발견되는 길이의 다양성을 고려하고, 서열들에 갭을 제공한다. 그러므로 주어진 항체에서 보통 1번 ~ 149번 위치 모두인 것은 아닌 가변 도메인은 아미노산 잔기들에 의해 점유될 것이다.
바람직하게 "항원 결합 영역"은 가변 경쇄(VL)의 적어도 4번 ~ 138번 아미노산 잔기와 가변 중쇄(VH)의 5번 ~ 138번 아미노산 잔기(각각의 경우 번호매김은 Honegger 및 Pluckthun에 따름), 더욱 바람직하게 VL의 3번 ~ 144번 아미노산 잔기 및 VH의 4번 ~ 144번 아미노산 잔기, 특히 바람직하게는 전체 VL 및 VH 사슬(VL의 1번 ~ 149번 아미노산 위치 및 VH의 1번 ~ 149번 아미노산 위치)을 포함한다. 항원 결합부는 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv에 통합될 수 있다(예컨대 문헌(Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 29.9.1 Hel 136) 참조). 항체의 항원 결합부는 제III형 피브로넥틴(Fn3)과 같은 폴리펩티드를 기반으로 하는 스캐폴드에 이식(grafting)될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디가 기술되어 있는 미국 특허 제6,703,199호 참조). 항원 결합부는 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 영역 쌍을 형성하는, 탠덤 Fv 분절(VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함하는 단일 사슬 분자에 통합될 수 있다(Zapata et al., 1995 단백질 Eng. 8 (10): 1057-1062; 및 미국 특허 제5,641,870호).
본원에 사용된 바와 같은 항체의 "도메인" 또는 "X와 특이적으로 결합하는 도메인" 또는 "결합 도메인", "이의 항원 결합 단편", "항원 결합부"등의 용어는, 주어진 항원(예컨대 IL-17A, TNFα, HSA)와 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는, 비변형 전 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 비변형 항체의 단편에 의해 달성될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 경첩 영역에 이황화물 가교에 의해 결합된 Fab 단편 2개를 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체 단일 팔의 VL 도메인 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체(dAb) 단편(Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 단리 상보성 결정 영역(CDR), dsFv, scAb, STAB, 단일 도메인 항체(sdAb 또는 dAb), 단일 도메인 중쇄 항체 및 단일 도메인 경쇄 항체, VHH, VNAR, 상어 유래 VNAR 구조 기반 단일 도메인 항체, 그리고 대안적 스캐폴드 기반 결합 도메인, 예컨대 안키린 기반 도메인, 파이노머, 아비머, 안티칼린, 피브로넥틴, 및 항체의 불변 영역으로 구축될 결합 부위들(예컨대 F-star의 Modular AntibodyTechnologyTM)(이에 한정되는 것은 아님)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적합하게 본 발명의 결합 도메인은 Fv 단편(Fv)이다. 적합하게 본 발명의 결합 도메인은 단일 사슬 Fv 단편(scFv)이다. 적합하게 본 발명의 결합 도메인은 Fab 단편이다.
바람직하게 "도메인" 또는 "X와 특이적으로 결합하는 도메인" 또는 "결합 도메인", "이의 항원 결합 단편", "항원 결합부"는 가변 경쇄(VL)의 적어도 4번 ~ 138번 아미노산 잔기와 가변 중쇄(VH)의 5번 ~ 138번 아미노산 잔기(각각의 경우 번호매김은 Honegger 및 Pluckthun에 따름), 더욱 바람직하게 VL의 3번 ~ 144번 아미노산 잔기 및 VH의 4번 ~ 144번 아미노산 잔기, 특히 바람직하게는 전체 VL 및 VH 사슬(VL의 1번 ~ 149번 아미노산 위치 및 VH의 1번 ~ 149번 아미노산 위치)를 포함한다. 항원 결합부는 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv에 통합될 수 있다(예컨대 문헌(Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23, 9, 1 Hel l 36) 참조). 항체의 항원 결합부는 제III형 피브로넥틴(Fn3)과 같은 폴리펩티드를 기반으로 하는 스캐폴드에 이식될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디가 기술되어 있는 미국 특허 제6,703,199호 참조). 항원 결합부는 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 영역 쌍을 형성하는, 탠덤 Fv 분절(VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함하는 단일 사슬 분자에 통합될 수 있다(Zapata et al., 1995 단백질 Eng. 8 (10): 1057-1062; 및 미국 특허 제5,641,870호).
본원에 사용된 바와 같은 "결합 특이성" 또는 "특이적으로 결합하는"이란 용어는, 개별 항체 또는 항체 도메인이 하나의 항원 결정기와 반응하되, 상이한 항원 결정기와는 반응하지 않는 능력을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 "와 특이적으로 결합하다" 또는 "에 특이적인"이란 용어는 측정 가능하거나 재현 가능한 상호작용, 예컨대 생물학적 분자를 비롯한 분자의 이종 집단이 존재할 때 표적이 존재함을 나타내는, 표적과 항체 또는 항체 도메인 사이의 결합을 지칭한다. 예를 들어 표적(에피토프일 수 있음)과 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 도메인은, 더욱 큰 친화성, 결합력으로 더욱 용이하게, 그리고/또는 다른 표적과 결합하는 기간 보다 더 오랜 기간 해당 표적과 결합하는 항체 또는 항체 도메인이다. 이것이 가장 일반적인 형태를 가질 때(그리고 한정된 참조기준이 언급되지 않을 때) "특이적 결합"이란, 항체 또는 항체 도메인이, 예를 들어 당 분야에 공지된 특이성 검정 방법에 따라 확정되는 바와 같이, 관심 표적과 무관 분자를 구별할 수 있는 능력을 지칭한다. 이러한 방법으로서는 웨스턴 블럿팅(Western blotting), ELISA, RIA, ECL, IRMA, SPR(표면플라스몬공명법) 검사 및 펩티드 스캔을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 표준 ELISA 검정이 수행될 수 있다. 점수매김(scoring)은 표준 발색법(예컨대 서양고추냉이 과산화물과 2차 항체, 그리고 테트라메틸벤지딘과 과산화수소)에 의해 수행될 수 있다. 임의의 웰 내에서의 반응은, 예컨대 450 nm에서의 광학 밀도에 의해 점수가 매겨진다. 통상의 백그라운드(= 음성 반응)는 약 0.1 OD일 수 있고, 통상의 양성 반응은 약 1 OD일 수 있다. 이는, 양의 점수와 음의 점수 사이의 비가 10배 이상일 수 있음을 의미한다. 추가의 예에서, SPR 검정이 수행될 수 있는데, 이때 백그라운드와 신호 간 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 100배 차이가 있음은 특이적 결합이 이루어졌음을 나타낸다. 통상적으로 결합 특이성의 확정은 단일 참조기준 분자를 사용하여 수행되는 것이 아니라, 약 3개 내지 약 5개의 무관한 분자, 예컨대 분유 또는 트랜스페린 등으로 이루어진 세트를 사용하여 수행된다. 본 발명의 특정 항체 또는 항체 도메인들은 인간 IL-17A 또는 인간 TNFα에 대해 결합 특이성을 가진다.
본 발명의 다중 특이적 항체는 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하므로, IL-17A 및 TNFα에 대한 결합 특이성을 가지고, 구체적으로는 인간 IL-17A 및 인간 TNFα에 대한 결합 특이성을 가진다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 IL-17A 및 마카카 파스큘라리스(사이노몰거스 원숭이 또는 "사이노몰거스"라고도 공지됨) IL-17A에 대한 결합 특이성을 가진다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 TNFα 및 마카카 파스큘라리스(사이노몰거스 원숭이 또는 "사이노몰거스"라고도 공지됨) TNFα에 대한 결합 특이성을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은 인간 IL-17A 및 마카카 파스큘라리스(사이노몰거스 원숭이 또는 "사이노몰거스"라고도 공지됨) IL-17A에 대해 결합 특이성을 가지는 항체 또는항체 도메인에 관한 것이다.
적합하게 본 발명의 항 IL-17A 항체는 단리 항체이다.
적합하게 본 발명의 항 IL-17A 항체는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 항 IL-17A 항체는 키메라 항체 및 인간화 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
적합하게 본 발명의 항 IL-17A 항체는 인간화된다. 적합하게 본 발명의 항 IL-17A 항체는 인간화되고, 토끼 유래 CDR들을 포함한다.
본 발명의 항체는 실시예를 포함하여 본원에 기재된 바와 같이 단리된 인간화 모노클로날 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 항 인간 IL-17A 항체의 예는 그 서열이 표 1에 나열된 항체이다. 본원에 기재된 항체의 제조 및 특성규명에 관한 추가의 상세한 설명은 실시예에 제공되어 있다.
인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지는 본 발명의 단리 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가면 영역(VL)을 포함하는데, 단 (a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하고, (b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함한다.
본 발명은 IL-17A 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는데, 상기 항체는 표 1에 나열된 VH CDR들중 임의의 하나의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR을 포함한다. 구체적으로 본 발명은 IL-17A 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는데, 상기 항체는 표 1에 나열된 VH CDR들중 임의의 것의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR을 1개, 2개, 3개 또는 이 이상 포함한다.
본 발명은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지는 항체를 제공하는데, 단 상기 VH는 (i) 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 이 순서로 포함한다[단 상기 HCDR1은 서열 번호 1, 4 및 7중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR2는 서열 번호 2, 5 및 8중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR3은 서열 번호 3, 6 및 9중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가짐]. 구체적으로 본 발명은 인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지고, 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함하거나; 또는 (ii) 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3[단 상기 HCDR1은 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR2는 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR3은 서열 번호 41, 44 및 47중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가짐]을 포함하는 항체를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지고, 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 IL-17A 단백질과 특이적으로 결합하는 항체로서, 표 1에 나열된 VL CDR들중 임의의 하나의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR을 포함하는 항체를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 IL-17A 단백질과 특이적으로 결합하는 항체로서, 표 1에 나열된 VL CDR들중 임의의 것의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR을 1개, 2개, 3개 또는 이 이상 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명은 인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지고, 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체를 제공하는데, 상기 VL은 (i) 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 이 순서로 포함한다[단 상기 LCDR1은 서열 번호 12, 15 및 18중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR2는 서열 번호 13, 16 및 19중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR3은 서열 번호 14, 17 및 20중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가짐]. 구체적으로 본 발명은 인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지고, 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하거나; 또는 (ii) 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하는 항체를 제공한다다[단 상기 LCDR1은 서열 번호 50, 53 및 56중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR2는 서열 번호 51, 54 및 57중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR3은 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가짐]. 구체적으로 본 발명은 인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지고, 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하는 항체를 제공한다.
적합하게 본 발명은 인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지고, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체를 제공하는데, 단
(i) (a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 이 순서로 포함하되, 단 상기 HCDR1은 서열 번호 1, 4 및 7중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR2는 서열 번호 2, 5 및 8중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR3은 서열 번호 3, 6 및 9중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고;
(b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 이 순서로 포함하되, 단 상기 LCDR1은 서열 번호 12, 15 및 18중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR2는 서열 번호 13, 16 및 19중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR3은 서열 번호 14, 17 및 20중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지거나; 또는
(ii) (a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 이 순서로 포함하되, 단 상기 HCDR1은 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR2는 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR3은 서열 번호 41, 44 및 47중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고;
(b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 이 순서로 포함하되, 단 상기 LCDR1은 서열 번호 50, 53 및 56중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR2는 서열 번호 51, 54 및 57중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR3은 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.
구체적으로 본 발명은 인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지고, (i)(a) 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, (b) 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각; 또는 (ii)(a) 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, (b) 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명의 기타 항체는 돌연변이되었으되, CDR 영역내의 것들이 표 1에 제시된 서열에 도시된 CDR 영역내의 것들과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는, 아미노산을 포함한다. 적합하게 본 발명의 기타 항체는 그 CDR 영역이 표 1에 제시된 서열에 도시된 CDR 영역과 비교되었을 때 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 10개 이하의 아미노산이 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된, 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이, 예컨대 치환은 CDR들의 세트내 임의의 잔기에서 잠재적으로 이루어질 수 있고, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3내에 있을 수 있다.
적합하게, 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 항체는 상기 항체의 농도, 즉 50 ng/ml, 바람직하게 20 ng/ml, 바람직하게 10 ng/ml, 바람직하게 5 ng/ml, 더욱 바람직하게 1 ng/ml, 더욱 바람직하게 0.5 ng/ml, 더욱더 바람직하게 0.2 ng/ml의 농도에서 인간 IL-17A 1 ng의 활성을 50%까지 억제할 수 있는데, 이때 상기 억제 활성은 50 pg/ml TNFα 존재하에 HT-29 검정에서 인간 IL-17A에 의해 유도되는 GRO-α 분비를 측정함으로써 확정된다.
적합하게 인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지는 본 발명의 단리 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, 단
(i) (a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 이 순서로 포함하되,
단 상기 HCDR1은 서열 번호 1, 4 및 7중 임의의 하나, 바람직하게 서열 번호 1에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고,
상기 HCDR2는 서열 번호 2, 5 및 8중 임의의 하나, 바람직하게 서열 번호 2에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고,
상기 HCDR3은 서열 번호 3, 6 및 9중 임의의 하나, 바람직하게 서열 번호 3에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고/가지거나;
(b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 이 순서로 포함하되,
단 상기 LCDR1은 서열 번호 12, 15 및 18중 임의의 하나, 바람직하게 서열 번호 12에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고,
상기 LCDR2는 서열 번호 13, 16 및 19중 임의의 하나, 바람직하게 서열 번호 13에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고,
상기 LCDR3은 서열 번호 14, 17 및 20중 임의의 하나, 바람직하게 서열 번호 14에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지거나; 또는
(ii) (a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 이 순서로 포함하되,
단 상기 HCDR1은 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나, 바람직하게 서열 번호 39에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고,
상기 HCDR2는 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나, 바람직하게 서열 번호 40에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고,
상기 HCDR3은 서열 번호 41, 44 및 47중 임의의 하나, 바람직하게 서열 번호 41에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고/가지거나;
(b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 이 순서로 포함하되,
단 상기 LCDR1은 서열 번호 50, 53 및 56중 임의의 하나, 바람직하게 서열 번호 50에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고,
상기 LCDR2는 서열 번호 51, 54 및 57중 임의의 하나, 바람직하게 서열 번호 51에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고,
상기 LCDR3은 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나, 바람직하게 서열 번호 52에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가진다.
적합하게, 인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지는 본 발명의 단리 항체는 (i) 서열 번호 1, 2 및 3의 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 각각, 및/또는 서열 번호 12, 13 및 14의 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 각각; 또는 (ii) 서열 번호 39, 40 및 41의 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 각각, 및/또는 서열 번호 50, 51 및 52의 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 각각을 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 것으로서, VH 도메인과 VL 도메인을 포함하는 항체를 제공한다.
적합하게, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 것으로서, VH1A, VH1B, VH3 또는 VH4를 포함하는 항체를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 단리 항체는 VH4 도메인을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 단리 항체는 VH3 도메인을 포함한다.
적합하게, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 단 상기 항체는 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 바람직하게 Vκ1 틀 FR1 ~ FR3, 및 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4, Vκ3 FR4, 및 Vλ FR4로부터 선택된 틀 FR4를 포함한다. 적합한 Vλ FR4는 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32에 제시된 바와 같다. 일 구현예에서, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 단 상기 항체는 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 26 또는 서열 번호 27의 아미노산 서열, 더욱 바람직하게 서열 번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4를 포함한다. 적합하게 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 단 상기 항체는 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 26 또는 서열 번호 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 더욱 바람직하게 서열 번호 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4를 포함한다.
그러므로 일 구현예에서, 본 발명은
(i)(a) 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각; 또는 (i)(b) 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각;
(ii) VH3 도메인 또는 VH4 도메인, 바람직하게 VH3 도메인; 그리고
(iii) Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 바람직하게 Vκ1 FR1 ~ FR3 및 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4, Vκ3 FR4, 및 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 더욱 바람직하게 서열 번호 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4로부터 선택된 틀 FR4를 포함하는 VL 틀을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는 항체를 제공한다.
적합하게 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 단 상기 항체는 표 1에 나열된 VH 도메인을 포함한다.
적합하게 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 단 상기 항체는 표 1에 나열된 VH 아미노산 서열을 포함하고, 틀 서열(예컨대 CDR이 아닌 서열)내 약 10개 이하의 아미노산이 돌연변이된 것이다(단 여기서 돌연변이는 다양한 비제한적 예로서 부가, 치환 또는 결실임).
적합하게 본 발명은 또한 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 단 상기 항체는 표 1에 나열된 VH 아미노산 서열을 포함하고, 틀 서열(예컨대 CDR이 아닌 서열)내 약 20개 이하의 아미노산이 돌연변이된 것이다(단 여기서 돌연변이는 다양한 비제한적 예로서 부가, 치환 또는 결실임).
본 발명의 기타 항체는 돌연변이되었으되, VH 영역내의 것들이 표 1에 제시된 서열에 도시된 VH 영역내의 것들과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는, 아미노산을 포함한다.
적합하게 본 발명은 표 1에 나열된 VL 도메인을 포함하고, 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공한다.
적합하게 본 발명은 또한 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 단 상기 항체는 표 1에 나열된 VL 도메인을 포함하고, 틀 서열(예컨대 CDR이 아닌 서열)내 약 10개 이하의 아미노산이 돌연변이된 것이다(단 여기서 돌연변이는 다양한 비제한적 예로서 부가, 치환 또는 결실임).
적합하게 본 발명은 또한 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 단 상기 항체는 표 1에 나열된 VL 아미노산 서열을 포함하고, 틀 서열(예컨대 CDR이 아닌 서열)내 약 20개 이하의 아미노산이 돌연변이된 것이다(단 여기서 돌연변이는 다양한 비제한적 예로서 부가, 치환 또는 결실임).
본 발명의 기타 항체는 돌연변이되었으되, VL 영역내의 것들이 표 1에 제시된 서열에 도시된 VL 영역내의 것들과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는, 아미노산을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 단 상기 항체는 아미노산 서열인 서열 번호 10 또는 서열 번호 11, 바람직하게 서열 번호 10과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 항체는 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 단 상기 항체는 아미노산 서열인 서열 번호 11과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 Q14K, G16E 및 G56A(AHo 번호매김)를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 상기 항체는 아미노산 서열인 서열 번호 48 또는 서열 번호 49, 바람직하게 서열 번호 48과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 항체는 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 상기 항체는 아미노산 서열인 서열 번호 49와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 R20T 및 Q141P(AHo 번호매김)를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 단 상기 항체는 (i) 아미노산 서열인 서열 번호 21 또는 서열 번호 22, 바람직하게 서열 번호 21과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 항체는 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하거나; 또는 (ii) 아미노산 서열인 서열 번호 59 또는 서열 번호 60, 바람직하게 서열 번호 59와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 항체는 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 상기 항체는 아미노산 서열인 서열 번호 22와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 A51P(AHo 번호매김)를 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는데, 단 (i) 상기 항체는 아미노산 서열인 서열 번호 10과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 아미노산 서열인 서열 번호 21과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는 (ii) 상기 항체는 아미노산 서열인 서열 번호 48과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 아미노산 서열인 서열 번호 59와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
그러므로 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는데, 단 (i) 상기 항체는 아미노산 서열인 서열 번호 10과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 아미노산 서열인 서열 번호 21과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이 항체는 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고; 구체적으로 이 항체는 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하거나; 또는 (ii) 상기 항체는 아미노산 서열인 서열 번호 48과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 아미노산 서열인 서열 번호 59와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이 항체는 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고; 구체적으로 이 항체는 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 39, 40 및 41의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 상기 항체는 아미노산 서열인 서열 번호 49와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과; 아미노산 서열인 서열 번호 60과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 중쇄 가변 영역은 R20T 및 Q141P(AHo 번호매김)를 포함한다.
그러므로 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 단리 항체를 제공하는데, 상기 항체는 아미노산 서열인 서열 번호 49와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과; 아미노산 서열인 서열 번호 60과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 중쇄 가변 영역은 R20T 및 Q141P(AHo 번호매김)를 포함하고, 상기 항체는 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고; 구체적으로 이 항체는 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
구체적인 구현예에서, 본 발명은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호 10 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 21 및 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 이의 VL; 또는 (ii) 서열 번호 48 및 49로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 59 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 이의 VL을 포함하는 단리 항체를 제공한다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 항체는 (i) 서열 번호 10의 VH 서열과 서열 번호 21의 VL 서열; 또는 (ii) 서열 번호 48의 VH 서열과 서열 번호 59의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 구현예에서, 본 발명의 항체는 (i) 서열 번호 11의 VH 서열과 서열 번호 22의 VL 서열; 또는 (ii) 서열 번호 49의 VH 서열과 서열 번호 60의 VL 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 항체는 표 1에 제시된 항체이다. 일 구현예에서, 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 항체는 (i) 서열 번호 24 및 25, 바람직하게 서열 번호 24; 또는 (ii) 서열 번호 61 및 62, 바람직하게 서열 번호 61로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 항체는 (i) 서열 번호 24 또는 서열 번호 25, 바람직하게 서열 번호 24; 또는 (ii) 서열 번호 61 또는 서열 번호 62, 바람직하게 서열 번호 61에 제시된 바와 같다.
인간 IL-17A에 대한 결합 특이성을 가지는 본 발명의 기타 항체는 아미노산 또는 이 아미노산을 암호화하는 핵산이 돌연변이되었으되, 표 1에 제시된 서열에 대하여 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 동일성을 보이는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 이는 표 1에 제시된 서열에 도시된 가변 영역과 비교되었을 때 가변 영역에 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이되었으되, 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은"실질적으로 동일한 활성"이란 용어는, 모 항체, 예컨대 본 발명의 항체, 구체적으로 표 1에 제시된 본 발명의 항체에 대해 측정되었을 때, 그 활성이 이러한 항체 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 100% 또는 적어도 110%, 또는 적어도 120%, 또는 적어도 130%, 또는 적어도 140%, 또는 적어도 150%, 또는 적어도 160%, 또는 적어도 170%, 또는 적어도 180%, 또는 적어도 190%, 예컨대 200% 이하인 것과 같이 실질적으로 동일한 것으로 나타나는 경우를 지칭한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 표 1에 제시된 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공하는데, 상기 항체는 인간 IL-17A와 결합하고, 표 1에 제시된 항체들의 원하는 기능상 특성들을 보유한다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지는데, 여기서 이 CDR 서열들중 1개 이상은 본원에 기재된 항체 또는 이의 보존적 변형을 기반으로 하였을 때 특정의 아미노산 서열을 가지고, 이 항체는 본 발명의 항체의 원하는 기능상 특성을 보유한다.
그러므로 본 발명은
(i)
3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)[단 상기 HCDR1은 아미노산 서열인 서열 번호 1 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 HCDR2는 아미노산 서열인 서열 번호 2 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 HCDR3은 서열 번호 3 또는 이의 보존적 변이체중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열임]; 및
3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)[단 상기 LCDR1은 아미노산 서열인 서열 번호 12 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 LCDR2는 아미노산 서열인 서열 번호 13 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 LCDR3은 아미노산 서열인 서열 번호 14 또는 이의 보존적 변이체를 가짐]; 또는
(ii)
3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)[단 상기 HCDR1은 아미노산 서열인 서열 번호 39 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 HCDR2는 아미노산 서열인 서열 번호 40 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 HCDR3은 서열 번호 41 또는 이의 보존적 변이체중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열임]; 및
3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)[단 상기 LCDR1은 아미노산 서열인 서열 번호 50 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 LCDR2는 아미노산 서열인 서열 번호 51 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 LCDR3은 아미노산 서열인 서열 번호 52 또는 이의 보존적 변이체임]
을 포함하고, 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하고/결합하거나 IL-17A를 중화시키는 모노클로날 항체를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 포유동물 세포내에서의 발현에 대해 최적화된 것으로서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 가지는데, 단 이 서열들중 1개 이상은 본원에 기재된 항체를 기반으로 하는 특정의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형을 가지고, 이 항체는 본 발명의 항체의 원하는 기능상 특성을 보유한다. 그러므로 본 발명은 포유동물 세포내에서의 발현에 대해 최적화된 것으로서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 제공하는데, 단 중쇄 가변 영역은 (i) 서열 번호 10 및 11중 임의의 것과 이의 보존적 변형; 또는 (ii) 서열 번호 48 및 49중 임의의 것과 이의 보존적 변이로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 (i) 서열 번호 21 및 22중 임의의 것과 이의 보존적 변형; 또는 (ii) 서열 번호 59 및 60중 임의의 것과 이의 보존적 변이로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 이 항체는 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하고/결합하거나 IL-17A를 중화시킨다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 포유동물 세포내에서의 발현에 최적화된 것으로서, 전장 중쇄 서열과 전장 경쇄 서열을 가지고, 이 서열들중 1개 이상은 본원에 기재된 항체를 기반으로 하는 특정의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형을 가지고, 이 항체는 본 발명의 항체의 원하는 기능상 특성을 보유한다.
본원에 사용된 바와 같이 "최적화된"이란 용어는 뉴클레오티드 서열이 변경되어, 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로는 진핵생물 세포, 예컨대 피치아(Pichia) 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 이용하여 아미노산 서열을 암호하게 됨을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 원래 출발 뉴클레오티드 서열("모" 서열이라고도 공지됨)에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 전부 또는 가능한한 많이 보유하도록 조작된다. 본원에 있어 최적화된 서열은 포유동물 세포에서 바람직한 코돈을 가지도록 조작되었다. 그러나 이러한 서열의 다른 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포내 최적화된 발현도 또한 본원에서 상상된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열도 또한 최적화되었다고 지칭된다.
가변 영역 변형의 또다른 유형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내 아미노산 잔기를 돌연변이시켜, 관심 항체의 결합 특성(예컨대 친화성) 1가지 이상을 개선하는 것이다("친화성 성숙"이라 공지됨). 돌연변이(들)를 도입하기 위해 부위 유도성 돌연변이유발 또는 PCR 매개 돌연변이유발이 수행될 수 있으며, 항체 결합 또는 기타 관심이 있는 기능상의 특성에 대한 영향력이, 본원에 기술되어 있고 실시예에 제공된 시험관내 또는 생체내 검정에서 평가될 수 있다. (상기 논의된 바와 같은) 보존적 변형이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 더욱이 통상적으로는 CDR 영역내 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
"친화성 성숙된(affinity-matured)" 항체는 가변 도메인 1개 이상에 1회 이상의 변경이 발생하여, 항원에 대한 항체의 친화성이, 이러한 변경(들)이 발생하지 않은 모 항체의 항원에 대한 친화성과 비교되었을 때 개선된 항체이다. 일 구현예에서, 친화성 성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화성을 가진다. 친화성 성숙된 항체는 당 분야에 공지된 방법에 의헤 제조된다. 예를 들어 문헌[Marks et al, Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH-도메인 및 VL-도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화성 성숙이 기술되어 있다. HVR 및/또는 틀 잔기의 무작위 돌연변이유발은, 예를 들어 문헌[Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Jackson et al, J. Immunol. 154(7):3310- 9 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기술되어 있다. 그러므로 본 발명은 친화성 성숙된 항체를 제공한다.
본 발명의 항체는 변형 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서, 본원에 보인 VH 및/또는 VL 서열들 중 1개 이상을 가지는 항체를 사용하여 추가로 제조될 수 있는데, 단 이 변형 항체는 출발 항체의 특성과는 달리 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 가변 영역 1개 또는 둘 다(즉 VH 및/또는 VL), 예컨대 CDR 영역 1개 이상 및/또는 틀 영역 1개 이상 내에 있는 잔기 1개 이상을 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 항체는, 예컨대 항체의 효과기 기능(들)을 변경시키기 위해 불변 영역(들) 내에 있는 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 조작의 한 유형은 CDR 이식이다. 항체는 대개 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치하는 아미노산 잔기들을 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로 말미암아, 개별 항체들간에는 CDR 외부 아미노산 서열보다는 CDR 내부 아미노산 서열이 더욱 가변적이다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용에 관여하므로, 상이한 특성을 가지는 상이한 항체로부터 유래한 틀 서열상에 이식된, 특정의 자연 발생 항체로부터 유래한 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구성함으로써, 특정의 자연 발생 항체의 특성을 모의하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다[예컨대 문헌(Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522- 525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86: 10029-10033; 미국 특허 제5,225,539호(Winter), 및 미국 특허 제5,530,101호; 동 제5,585,089호; 동 제5,693,762호 및 동 제6,180,370호(Queen et al.))을 참조한다].
이러한 틀 서열은 생식계열 항체 유전자 서열 또는 재배열된 항체 서열을 포함하는 간행된 참고문헌 또는 공공의 DNA 데이터베이스로부터 입수될 수 있다. 예를 들어 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스(인터넷 사이트 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 입수 가능함)에서뿐 아니라, 문헌[Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836]에서도 살펴볼 수 있는데; 단 이 문헌들 각각의 내용은 본원에 참조로 명백하게 첨부되어 있다. 예를 들어 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열과 재배열된 항체 서열은 "IMGT" 데이터베이스(인터넷 사이트 www.imgt.org에서 입수 가능; Lefranc, M.P. et al., 1999 Nucleic Acids Res. 27:209-212 참조(이것들 각각의 내용은 본원에 참조로 명백하게 인용됨))에서 살펴볼 수 있다.
본 발명의 항체에 사용하기 위한 틀 서열의 예는 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 틀 서열과 구조상 유사한 것, 예컨대 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 공통 서열 및/또는 틀 서열이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 틀 서열의 기원이 되는 생식 계열 면역글로불린 유전자에서 발견되는 서열과 동일한 서열을 가지는 틀 영역에 이식될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 생식계열 서열에 비하여 돌연변이를 1개 이상 함유하는 틀 영역에 이식될 수 있다. 예를 들어 임의의 경우, 틀 영역 내 잔기들을 돌연변이시켜, 항체의 항원 결합능을 유지시키거나 향상시키는 것이 유리할 수 있음이 확인되었다(예를 들어 미국 특허 제5,530,101호; 동 제5,585,089호; 동 제5,693,762호 및 동 제6,180,370호(Queen외 다수) 참조).
생성되는 폴리펩티드가 IL-17A와 특이적으로 결합하는 결합 영역을 적어도 1개 포함하는 한, 다양한 항체/면역글로불린 틀 또는 스캐폴드가 사용될 수 있다. 이러한 틀 또는 스캐폴드는 인간 면역글로불린의 주요 이디오타입 5개, 이것들의 항원 결합 단편을 포함하고, 기타 동물 종의 면역글로불린, 바람직하게는 인간화된 양태를 보이는 면역글로불린을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 CDR들이 이식될 수 있는 비 면역글로불린 스캐폴드를 사용하여 비 면역글로불린 기반 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 공지되었거나 미래의 비 면역글로불린 틀 및 스캐폴드가 표적 IL-17A 단백질에 대해 특이적인 결합 영역을 포함하는 한, 이러한 비 면역글로불린 틀 및 스캐폴드가 사용될 수 있다. 공지의 비 면역글로불린 틀 또는 스캐폴드로서는 피브로넥틴(Compound Therapeutics, Inc., Waltham, Mass.), 안키린(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland), 도메인 항체(Domantis, Ltd., Cambridge, Mass., and Ablynx nv, Zwijnaarde, Belgium), 리포칼린(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany), 소형 모듈성 면역의약품(small modular immuno-pharmaceuticals)(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, Wash.), 맥시바디(Avidia, Inc., Mountain View, Calif), 단백질 A(Affibody AG, Sweden), 및 아필린(감마-크리스탈린 또는 유비쿼틴)(Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 항체는 인간 IL-17A 표적화 치료법을 필요로 하는 인간 환자에게 유리할 것으로 예측되는 유익한 특성을 가진다. 본 발명에 따른 항체는 (실시예 1 및 2에서 확정되는 바와 같은) 이하 특성들중 1개 이상에 의해 특징지어지는데:
이 항체는 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하고,
(a) 사이노몰거스 원숭이 IL-17A에 대해 결합 특이성을 가지며;
(b) ELISA에 의해 측정되는 바에 따르면, 인간 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F 보다는 인간 IL-17A와 선택적으로 결합하고;
(c) IL-17A와 이의 수용체(IL-17RA) 사이의 결합을 억제 또는 차단하며;
(d) IL-17A 활성을 감소 또는 중화시키고;
(e) HT-29 검정에서 시험관내 평가되었을 때 Gro-α 분비를 억제할 수 있으며;
(f) ELISA 검정에서 확정되는 역가, 즉 세쿠키누맙의 역가를 기준으로 하였을 때 5 이상의 역가(상대적 역가), 구체적으로 10 이상, 15 이상, 더욱 구체적으로 20 이상의 역가로 IL-17A와 IL-17RA 사이의 상호작용을 차단하는 능력을 가지고[단 상기 상대적 역가는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 세쿠키누맙의 IC50 값(ng/mL) 대 ELISA에 의해 측정된 바와 같은, scFv 포맷인 본 발명의 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비임];
(g) HT-29 검정에서 Gro-α 분비 측정에 의해 확정되는 역가, 즉 세쿠키누맙의 역가를 기준으로 하였을 때 50 이상의 역가(상대적 역가), 구체적으로 100 이상, 더욱 구체적으로 150 이상의 역가로 IL-17A를 중화하는 능력을 가지고[단 상기 상대적 역가는 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은 세쿠키누맙의 IC50 값(ng/mL) 대 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은, scFv 포맷인 본 발명의 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비임];
(h) 1 ng/mL 이하, 구체적으로 0.5 ng/mL 이하, 더욱 구체적으로 0.2 ng/mL 이하의 농도에서 인간 IL-17A 1 ng의 활성을 50%까지 억제할 수 있으며[단 상기 억제 활성은 50 pg/ml TNFα 존재하에 HT-29 검정에서 인간 IL-17A에 의해 유도된 GRO-α 분비를 측정함으로써 결정됨];
(i) 표면플라스몬공명법, 바람직하게 직접 환경에서의 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 5 nM 미만, 구체적으로 1 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.2 nM 미만, 구체적으로 100 pM 미만, 더욱 구체적으로 50 pM 미만으로 인간 IL-17A와 결합하고;
(j) 표면플라스몬공명법, 구체적으로는 포착 환경에서의 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 KD 10 nM 미만, 예컨대 7 nM 미만, 5 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 구체적으로 0.5 nM 미만으로 사이노몰거스 IL-17A와 결합하며;
(k) scFv 포맷일 때, 시차 주사형광측정법에 의해 확정된 용융 온도(Tm)가 적어도 60℃, 구체적으로 적어도 62℃, 더욱 구체적으로 적어도 65℃, 더욱더 구체적으로 적어도 70℃이고[단 상기 항체는 구체적으로 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4, 150 mM NaCl 포함) 중에 존재함];
(l) scFv 포맷일 때, 연속 동결-해동 주기를 5회 거친 후 단량체 함량 감소율이 5% 미만, 구체적으로 3% 미만, 더욱 구체적으로 1% 미만이며/이거나[단 이때 본 발명의 항체의 출발 농도는 10 mg/ml이고, 상기 항체는 구체적으로 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.4) 중에 존재함];
(m) scFv 포맷일 때, 적어도 2주 동안, 구체적으로 적어도 4주 동안 4℃에 보관하였을 때 단량체 함량 감소율이 5% 이하, 구체적으로 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 구체적으로 1% 미만이고/이거나[단 이때 본 발명의 항체의 출발 농도는 10 mg/ml이고, 구체적으로 상기 항체는 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.4) 중에 존재함];
(n) 적어도 2주 동안, 구체적으로 적어도 4주 동안 37℃에 보관하였을 때 단량체 함량 감소율이 5% 미만이다[단 이때 본 발명의 항체의 출발 농도는 10 mg/ml임].
일 구현예에서, 본 발명의 항체는, ELISA에 의해 측정되는 바에 따르면, 인간 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F보다는 인간 IL-17A에 선택적으로 결합한다. 본원에 사용된 바와 같은 "~에 선택적으로 결합하다"란 용어는, 항체, 조성물, 제제 등이 IL-17B/C/D/E/F와는 거의 결합하지 않되, IL-17A와는 결합함을 의미할 것이다. 선택적 결합은, 보통 작은 친화성(중간 내지 높은 IC50)을 보이는 비특이적 결합과는 구별되게, 큰 친화성(또는 낮은 KD)과, 낮은 IC50 내지는 중간 IC50에 의해 특징지어진다. 통상 결합은 항체가 10-7 M 미만의 KD로 결합할 때 선택적인 것으로 간주된다. 적합하게 본 발명의 항체는 SPR에 의해 측정되는 바에 따르면, 인간 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F와 결합할 때보다 더 큰 친화성 또는 더 낮은 KD로 인간 IL-17A와 결합한다. 적합하게 본 발명의 항체는 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F에 대한 IC50 값이, ELISA에 의해 측정되는 IL-17A에 대한 IC50보다 100 이상의 팩터(factor), 구체적으로 200 이상의 팩터, 300 이상의 팩터, 400 이상의 팩터만큼 더 크다.
본 발명의 항체는 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는데, 이 때 IL-17A와의 결합은 (a) IL-17A와 이의 수용체(IL-17RA) 사이의 결합을 억제 또는 차단하고, (b) IL-17A 활성을 감소시키거나 중화시킨다.
본원에 사용된 바와 같은 "중화 항체"란 용어는, 예를 들어 IL-17A와 이의 수용체중 1개 이상의 결합을 차단, 구체적으로 IL-17A와 IL-17RA의 결합을 차단함으로써 IL-17A의 생물학적 신호전달 활성을 중화시킬 수 있는 항체를 설명한다. 본 발명의 항체는 IL-17A 중화 항체이다. 본원에 사용된 바와 같은 "중화"란 용어는, 생물학적 신호전달 활성의 부분적이거나 완전할 수 있는 감소를 지칭함이 이해될 것이다. IL-17A의 중화는, 그 예가 본원의 어딘가에 기재된 바와 같은 다양한 검정에 의해 확정될 수 있다.
따라서 본 발명의 항체는 HT-29 검정에서 시험관내 평가되었을 때 GRO-α 분비를 억제할 수 있다(실시예 1 및 2에 설명됨). 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 HT-29 검정에서 Gro-α 분비 측정에 의해 확정되는 역가, 즉 세쿠키누맙의 역가를 기준으로 하였을 때 50 이상의 역가(상대적 역가), 바람직하게 100 이상, 더욱 바람직하게 150 이상의 역가로 IL-17A를 중화시키는 능력을 가지며, 상기 상대적 역가는 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은 세쿠키누맙의 IC50 값(ng/mL) 대 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은, scFv 포맷인 본 발명의 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는 1 ng/mL 이하, 바람직하게는 0.5 ng/mL 이하, 더욱 바람직하게는 0.2 ng/mL 이하의 농도에서 인간 IL-17A 1 ng의 활성을 50%까지 억제할 수 있되, 상기 억제 활성은 50 pg/ml TNFα 존재하에 HT-29 검정에서 인간 IL-17A에 의해 유도된 GRO-α 분비를 측정함으로써 결정된다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 ELISA 검정에서 확정되는 역가, 즉 세쿠키누맙의 역가를 기준으로 하였을 때 5 이상의 역가(상대적 역가), 바람직하게는 10 이상, 15 이상, 더욱 구체적으로 20 이상의 역가로 IL-17A와 IL-17RA 사이의 상호작용을 차단하는 능력을 가지고, 상기 상대적 역가는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 세쿠키누맙의 IC50 값(ng/mL) 대 ELISA에 의해 측정된 바와 같은, scFv 포맷인 본 발명의 상기 다중 특이적 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비이다.
본원에 사용된 바와 같은 "친화성"이란 용어는, 단일 항원성 부위에서의 항체와 항원간 상호작용의 세기를 지칭한다. 각각의 항원성 부위내에서 항체 "팔"의 가변 영역은 약한 비공유성 외력을 통해 다양한 부위에서 항원과 상호작용하고; 그 상호작용이 클수록 친화성도 더 크다.
"결합 친화성"이란, 일반적으로 분자(예컨대 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예컨대 항원)간 비 공유 상호작용을 모두 합하였을 때의 세기를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 "결합 친화성", "에 결합한다", "에 결합하다" 또는 "에 결합하는"이란, 고유의 결합 친화성이 결합 쌍의 일원들(예컨대 항체 단편과 항원) 간 1:1 상호작용을 반영하는 경우를 지칭한다. 분자 X의, 이의 파트너인 Y에 대한 친화성은, 일반적으로 해리 상수(KD)로 표시될 수 있다. 친화성은 당 분야에 공지된 통상의 방법, 예컨대 본원에 기술된 방법들로 측정될 수 있다. 저 친화성 항체는, 일반적으로 천천히 항원과 결합하고, 쉽게 항원과 해리되는 경향이 있는 반면, 고 친화성 항체는, 일반적으로 항원과 더 빨리 결합하고, 결합된 채 더 오래 유지되는 경향이 있다. 결합 친화성을 측정하는 방법 다수가 당 분야에 공지되어 있는데, 이 방법들 중 임의의 방법이 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 결합 친화성, 즉 결합 세기를 측정하기 위한 방법으로서, 특정의 예시적 및 모범적 구현예가 이하에 기술되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "K결합", "Ka" 또는 "Kon"이란 용어는, 특정의 항체-항원 상호작용에서의 결합 속도를 지칭하도록 의도되는 반면, 본원에 사용된 바와 같은 "K해리", "Kd" 또는 "Koff"란 용어는, 특정의 항체-항원 상호작용에서의 해리 속도를 지칭하도록 의도된다. 일 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 "KD"란 용어는, Kd 대 Ka의 비(즉 Kd/Ka)로부터 구하여진 해리 상수를 지칭하도록 의도되고, 몰 농도(M)로서 표현된다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 "KD" 또는 "KD 값" 또는 "KD" 또는 "KD 값"은 T200 기기(Biacore, GE Healthcare)를 사용하여 측정된다. 인간 IL-17A에 대한 인간화된 scFv의 친화성을 측정하기 위해, Biotin-CAPture 키트(Biacore)가 사용됨으로써 바이오틴화된 인간 IL-17A가 포착된다. 매회 피분석물 주입 주기 후, CAP 센서칩은 재생되고, 새로운 항원이 포착된다. 용량 반응 다회 주기 역학 검정이 사용되어 scFv가 피분석물로서 주입되며, 이 때 피분석물의 농도는 전개 완충제중 희석되어 0.35 nM ~ 90 nM의 범위이다. 얻어진 센서그램은 1:1 결합 모델이 사용되어 피팅(fitting)된다. 대안적으로, 또는 추가로, 인간화된 scFv의 친화성은 대안적 SPR 검정 환경이 적용되어 측정 및 분석될 수 있는데: 이 때 IL-17A는 아민 결합에 의해 CM5 센서칩(GE Healthcare)상에 부동화되고, scFv의 연속 희석물(농도 범위 0.35 nM ~ 90 nM)은 부동화된 IL-17A위에 주입된다.
적합하게 IL-17A에 대한 본 발명의 항체의 친화성은, IL-17RA에 대한 IL-17A의 친화성보다 더 클 수 있다. 본 발명의 항체의 친화성이 IL-17RA에 대한 IL-17A의 친화성보다 더 크다는 점은 예비 형성된 IL-17RA/IL-17A 복합체를 해리 또는 중화시키는데 특히 유리할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 IL-17RA/IL-17A 상호작용을 중화시킨다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 IL-17A와 이의 수용체(IL-17RA) 사이의 결합을 억제하거나 차단한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 IL-17A 활성을 중화시킨다.
적합하게 IL-17A에 대한 본 발명의 항체의 친화성은 IL-17A에 대한 세쿠키누맙의 친화성과 거의 동일하거나 더 클 수 있으며, 바람직하게는 더 클 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 세쿠키누맙의 역가와 동일하거나 더 큰 역가, 바람직하게는 더 큰 역가로 IL-17A의 활성을 중화시킨다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는 세쿠키누맙의 역가와 동일하거나 더 큰 역가, 바람직하게는 더 큰 역가로 IL-17RA/IL-17A 상호작용을 중화시킨다.
항체의 결합 친화성은, 예컨대 해리 상수(KD)에 의해 확정될 수 있다. 더 큰 친화성은 더 낮은 KD로 표시되는 반면에, 더 작은 친화성은 더 높은 KD로 표시된다.
그러므로 적합한 구현예에서, 본 발명의 항체는, 바람직하게 표면플라스몬공명법, 더욱 바람직하게 직접 환경에서의 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, KD가 1 pM 내지 10000 pM, 1 pM 내지 7000 pM, 1 pM 내지 5000 pM, 1 pM 내지 2500 pM, 1 pM 내지 2000 pM, 1 pM 내지 1000 pM, 1 pM 내지 750 pM, 1 pM 내지 500 pM, 1 pM 내지 400 pM, 1 pM 내지 300 pM, 1 pM 내지 200 pM, 1 pM 내지 100 pM, 1 pM 내지 50 pM일 수 있다. 적합한 구현예에서, 본 발명의 항체는, 직접 환경에서의 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, KD가 1 pM 내지 200 pM, 구체적으로 1 pM 내지 100 pM이다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 항체는 직접 환경에서의 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면 1 pM 내지 50 pM의 KD를 가진다. 적합한 구현예에서, 본 발명의 항체는, 바람직하게 표면플라스몬공명법, 더욱 바람직하게 직접 환경에서의 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, KD가 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.4 nM 미만, 0.3 nM 미만, 0.25 nM 미만, 0.2 nM 미만, 150 pM 미만, 100 pM 미만, 또는 50 pM 미만일 수 있다. 적합하게 본 발명의 항체의 KD는 1 nM 미만, 구체적으로는 100 pM 미만이다. 적합하게 본 발명의 항체의 KD는 0.5 nM 미만, 구체적으로는 50 pM 미만이다. 더욱 적합하게 본 발명의 항체의 KD는, 직접 환경에서의 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, 0.2 nM 미만, 구체적으로는 50 pM 미만이다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는 포착 환경에서의 표면플라스몬공명법(SPR)에 의해 측정되는 바에 따르면, 사이노몰거스 IL-17A와 10 nM 미만, 예컨대 7 nM 미만, 5 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 구체적으로 0.5 nM 미만의 KD로 결합한다.
적합하게 본 발명의 항체는 표면플라스몬공명법(SPR)에 의해 측정되는 바, 바람직하게는 직접 환경에서의 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, 적어도 103 M-1s-1 이상, 적어도 104 M-1s-1 이상, 적어도 5x104 M-1s-1 이상, 적어도 105 M-1s-1 이상, 적어도 5x105 M-1s-1 이상, 적어도 106 M-1s-1 이상의 Kon 속도로 인간 IL-17A와 결합한다. 바람직하게 본 발명의 항체는 SPR에 의해 측정되는 바, 바람직하게는 직접 환경에서의 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, Kon 속도가 적어도 105 M-1s-1 이상, 구체적으로는 적어도 5x105 M-1s-1 이상, 더욱 구체적으로는 적어도 106 M-1s-1 이상이다.
적합하게 본 발명의 항체는 표면플라스몬공명법(SPR)에 의해 측정되는 바, 바람직하게는 직접 환경에서의 표면플라스몬공명법에 의해 측정돠는 바에 따르면, 5x10-3 s-1 이하, 3x10-3 s-1 이하, 10-3 s-1 이하, 5x10-4 s-1 이하, 3x10-4 s-1 이하, 10-4 s-1 이하, 5x10-5 s-1 이하의 Koff 속도로 인간 IL-17A와 결합한다. 바람직하게 본 발명의 항체는 SPR에 의해 측정되는 바에 따르면, 바람직하게는 직접 환경에서의 표면플라스몬공명법에 의해 측정되는 바에 따르면, Koff 속도가 10-4 s-1 이하, 구체적으로 5x10-5 s-1 이하이다.
적합하게 본 발명의 항체는 유리한 생물물리학적 특성을 가진다.
적합하게 본 발명의 항체가 scFv(단일 사슬 가변 단편) 항체 포맷으로 발현될 때, 이 항체의 용융 온도(Tm)는, 앞서 기술된 바와 같은 시차 주사형광측정법(DSF)에 의해 확정되는 바에 따르면, 적어도 60℃, 바람직하게 적어도 62℃, 더욱 바람직하게 적어도 65℃, 더욱더 바람직하게 적어도 70℃이다[Egan, et al., MAbs, 9(1) (2017), 68-84; Niesen, et al., Nature Protocols, 2(9) (2007) 2212-2221]. scFv 구조체의 열 언폴딩에 대한 전이의 중간점은 형광 염료인 SYPRO® 오렌지를 사용하여 시차주사형광측정법에 의해 확정된다(Wong & Raleigh, Protein Science 25 (2016) 1834-1840 참조). 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4) 중 시료는 최종 단백질 농도가 50 μg/mL이고, 총 부피 100 μl 중 5x SYPRO® 오렌지 최종 농도만큼을 함유하도록 제조된다. 제조된 시료 25 마이크로리터만큼이 백색의 벽으로 둘려있는 AB 유전자 PCR 평판에 3회 첨가된다. 이 검정은 열 순환기로서 사용되는 qPCR 기계 안에서 수행되고, 형광 발광도는 소프트웨어의 맞춤 염료 보정 루틴에 따라서 검출된다. 검정 시료가 담긴 PCR 평판의 온도는 1℃씩 승온하여 25℃에서 96℃까지 상승되고, 매 승온 시마다 30초씩 휴지기를 둔다. 총 검정 시간은 약 2시간이다. Tm은 곡선의 변곡점을 산정하기 위한 산술적 2차도함수법을 이용하여 소프트웨어 GraphPad Prism에 의해 산정된다. 보고된 Tm은 3회 측정값의 평균이다.
본 발명의 항체는, 구체적으로 scFv(단일 사슬 가변 단편) 항체 포맷으로 발현되고, 본 발명의 항체의 출발 농도가 10 mg/ml일 때, 5회 연속 동결-해동 주기 후 단량체 함량 감소율이 5% 미만, 구체적으로 3% 미만, 더욱 구체적으로 1% 미만인 것을 특징으로 한다.
적어도 2주, 구체적으로는 적어도 4주 동안 4℃에 보관된 후, 본 발명의 항체, 구체적으로 scFv(단일 사슬 가변 단편) 항체 포맷으로 발현될 때의 본 발명의 항체는, 본 발명의 항체의 출발 농도가 10 mg/ml일 때 단량체 함량 감소율 5% 이하, 구체적으로 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 바람직하게 1% 미만인 것을 특징으로 한다. 단량체 함량 감소율은 SE-HPLC 크로마토그램의 곡선하 면적 산정에 의해 확정된다. SE-HPLC는 USP의 챕터 621에 개략적으로 기술된 바와 같이 고체 정지상 및 액체 이동상을 기반으로 하는 분리 기술이다. 이 방법은 소수성 정지상과 수성 이동상을 이용하여 분자들을 자체의 크기와 형상을 바탕으로 분리한다. 분자의 분리는 특정 컬럼의 허공 부피(V0)와 총 투과 부피(VT) 사이에 일어난다. SE-HPLC에 의한 측정은 자동 시료 주입장치 및 UV 검출기(검출 파장 280 nm로 설정)가 장착된 Chromaster HPLC 시스템(Hitachi High-Technologies Corporation)에서 수행된다. 장비는 구하여진 크로마토그램의 분석을 지원해주기도 하는 소프트웨어 EZChrom Elite(Agilent Technologies, Version 3.3.2 SP2)로 제어된다. 단백질 시료는 원심분리에 의해 청징화되고, 주입되기 전 자동시료추출기 안에 담긴다(온도 4℃ ~ 6℃로 유지). scFv 시료를 분석하기 위해 컬럼 Shodex KW403-4F(Showa Denko Inc., #F6989202)가 사용되는데, 이 경우 표준화된 완충 염 이동상(50 mM 인산나트륨 pH6.5, 300 mM 염화나트륨)이 0.35 mL/분의 권장 유속으로 흐른다. 1회 주입당 표적 시료량은 5 μg이었다. 시료는 280 nm의 파장에서 UV 검출기로 검출되고, 데이터는 적합한 소프트웨어 슈트로 기록되었다. 구하여진 크로마토그램은 V0 ~ VT의 범위에서 분석되고, 이로써 매트릭스 연관 피크(용리 시간: 10분 초과)가 배제된다
적합하게 본 발명의 단리 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, Fab, Fv, scFv, dsFv, scAb, STAB, 단일 도메인 항체(sdAb 또는 dAb), 단일 도메인 중쇄 항체, 단일 도메인 경쇄 항체, VHH, VNAR, 상어 유래 VNAR 구조를 기반으로 한 단일 도메인 항체, 그리고 대안적 스캐폴드를 기반으로 한 결합 도메인, 예컨대 안키린 기반 도메인, 파이노머, 아비머, 안티카린, 피브로넥틴, 그리고 항체의 불변 영역으로 구축되는 결합 부위(예컨대 F-star의 Modular Antibody TechnologyTM)(이에 한정되는 것은 아님)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 scFv이다.
적합하게 본 발명의 항체는 Fv이다. 적합하게 본 발명의 항체는 scFv 항체 단편이다. "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는데, 단 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 일반적으로 Fv 폴리펩티드는 VH 도메인 및 VL 도메인 사이에, sFv가 표적 결합에 바람직한 구조를 형성하도록 만들 수 있는 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는데, 단 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 일반적으로 scFv 폴리펩티드는 VH 도메인 및 VL 도메인 사이에, scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성하도록 만들 수 있는 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다(예컨대 문헌(Pluckthun, The pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, 1994, pp. 269-315) 참조). 구체적인 구현예에서, 상기 기능성 단편은 서열 번호 23에 따른 링커를 포함하는 scFv 포맷이다. 일 구현예에서, 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 항체는 표 1에 제시된 항체이다. 일 구현예에서, 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하는 항체는 (i) 서열 번호 24 및 서열 번호 25로 이루어진 군; 또는(ii) 서열 번호 61 및 서열 번호 62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는 (i) 서열 번호 24 또는 서열 번호 25에 보인 바와 같거나; (ii) 서열 번호 61 또는 서열 번호 62에 보인 바와 같은 단일 가변 단편(scFv)이다.
적합하게 본 발명의 항체는 IgG 항체이다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 IgG, 바람직하게 IgG1이다.
TNFα와 특이적으로 결합하는 예시적 도메인
본 발명의 다중 특이적 항체는 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는데, 상기 도메인은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, (a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하고, (b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함한다.
TNFα와 특이적으로 결합하는 것으로서, 본 발명의 다중 특이적 항체에 사용하기 적합한 도메인으로서는 하기의 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다:
- 그 서열이 표 1에 나열되어 있는 인간화된 모노클로날 항체 또는 이의 결합 도메인(본원에 전체로서 참고문헌으로 첨부된 WO 2017/158101에 기재됨);
- 인플릭시맙(레미케이드®; 본원에 전체로서 참고문헌으로 첨부된 미국 특허 제6,277,969호, 동 제6,284,471호, 동 제6,790,444호 및 동 제6,835,823호);
- 아달리무맙/D2E7(휴미라®; 본원에 전체로서 참고문헌으로 첨부된 미국 특허 제6,090,382호에 기재됨);
- 세르톨리주맙, 즉 PEG화된 Fab 단편(심지아®; 본원에 전체로서 참고문헌으로 첨부된 미국 특허 제7,012,135호 및 동 제7,186,820호에 기재됨);
- 골리무맙(심포니®; 본원에 전체로서 참고문헌으로 첨부된 공개 미국 특허출원 2009/214528).
TNFα와 특이적으로 결합하는 것으로서, 본 발명의 다중 특이적 항체에 사용하기 바람직한 도메인은, 그 서열이 표 1에 나열된 인간화 모노클로날 항체 또는 이의 결합 도메인을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다(본원에 전체로서 참고문헌으로 첨부된 WO 2017/158101에 기재됨).
그러므로 일 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제2 도메인은 CDR들의 세트, 즉 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하고, 이 CDR들의 세트는, HCDR1'은 서열 번호 25, 28 및 31중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 25의 아미노산 서열이고; HCDR2'는 서열 번호 26, 29 및 32중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 2의 아미노산 서열이고; HCDR3'는 서열 번호 27, 30 및 33중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 27의 아미노산 서열이고; LCDR1'은 서열 번호 38, 41 및 44중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 38의 아미노산 서열이고; LCDR2'는 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 39의 아미노산 서열이고; LCDR3'는 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 40의 아미노산 서열을 가지는 CDR들의 세트에 10개 이하의 아미노산 치환, 예컨대 9개 이하의 아미노산 치환, 8개 이하의 아미노산 치환, 7개 이하의 아미노산 치환, 6개 이하의 아미노산 치환, 5개 이하의 아미노산 치환, 4개 이하의 아미노산 치환, 3개 이하의 아미노산 치환, 2개 이하의 아미노산 치환, 1개 또는 0개의 아미노산 치환, 바람직하게는 0개의 아미노산 치환이 발생한 것이다.
구체적으로 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제2 도메인은 표 1에 나열된 VH CDR들중 임의의 하나의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR을 포함한다. 구체적으로 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인은 표 1에 나열된 VH CDR들중 임의의 것의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR을 1개, 2개, 3개 또는 그 이상 포함한다(또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있다).
적합하게 본 발명은 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 제공하는데, 상기 제2 도메인은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 HCDR1은 서열 번호 25, 28 및 31중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR2는 서열 번호 26, 29 및 32중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR3은 서열 번호 27, 30 및 33중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다. 구체적으로 상기 제2 도메인은 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함한다.
본 발명은 또한 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제2 도메인은 표 1에 나열된 VL CDR들중 임의의 하나의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR을 포함한다. 구체적으로 TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 표 1에 나열된 VL CDR들중 임의의 것의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR을 1개, 2개, 3개 또는 그 이상 포함한다(또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있다).
적합하게 TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는데, 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 LCDR1은 서열 번호 38, 41 및 44중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR2는 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR3은 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다. 구체적으로 상기 제2 도메인은 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
적합하게 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제2 도메인은 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되,
(a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 HCDR1은 서열 번호 25, 28 및 31중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR2는 서열 번호 26, 29 및 32중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 HCDR3은 서열 번호 27, 30 및 33중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고;
(b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 LCDR1은 서열 번호 38, 41 및 44중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR2는 서열 번호 39, 42 및 45중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 상기 LCDR3은 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.
구체적으로 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제2 도메인은 (a) 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, (b) 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
TNFα와 특이적으로 결합하는 본 발명의 기타 도메인은 돌연변이되었으되, CDR 영역내의 것들이 표 1에 제시된 서열에 도시된 CDR 영역내의 것들과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 보이는, 아미노산을 포함한다. 적합하게 TNFα와 특이적으로 결합하는 본 발명의 기타 도메인은 표 1에 제시된 서열에 도시된 CDR 영역과 비교되었을 때 CDR 영역내 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 10개 이하의 아미노산이 아미노산 부가, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된, 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이, 예컨대 치환은 CDR들의 세트내 임의의 잔기에서 잠재적으로 이루어질 수 있으며, CDR1, CDR2 및/또는 CDR내에서 이루어질 수 있다.
적합하게 TNFα와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 다중 특이적 항체의 제2 도메인은 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는데, 단
(a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 HCDR1은 서열 번호 25, 28 및 31중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고; 상기 HCDR2는 서열 번호 26, 29 및 32중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고; 상기 HCDR3은 서열 번호 27, 30 및 33중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고/가지거나;
(b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 LCDR1은 서열 번호 38, 41 및 44중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고; 상기 LCDR2는 서열 번호 39, 42 및 45에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고; 상기 LCDR3은 서열 번호 40, 43 및 46중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가진다.
적합하게 TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 서열 번호 25, 26 및 27의 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 각각 및/또는 서열 번호 38, 39 및 40에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 각각을 포함한다.
추가의 구현예에서, TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 중쇄 가변 영역 VHB와 경쇄 가변 영역 VLB를 포함한다.
적합하게 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제2 도메인은 중쇄 가변 영역 VHB를 포함하고, 상기 VHB는 VH1A, VH1B, VH3 또는 VH4이다. 일 구현예에서, TNFα와 특이적으로 결합하는 본 발명의 상기 제2 도메인은 중쇄 가변 영역 VH1B를 포함하는데, 상기 VHB는 VH4이다. 바람직한 구현예에서, TNFα와 특이적으로 결합하는 본 발명의 상기 제2 도메인은 중쇄 가변 영역 VH1B를 포함하는데, 상기 VHB는 VH3이다.
적합하게 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제2 도메인은 경쇄 가변 영역 VLB를 포함하고, 상기 VLB는 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 바람직하게 Vκ1 틀 FR1 ~ FR3, 그리고 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4, Vκ3 FR4, 및 Vλ FR4로부터 선택된 틀 FR4를 포함한다. 적합한 Vλ FR4는 서열 번호 97 ~ 서열 번호 103에 제시된 바와 같다. 일 구현예에서, TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 서열 번호 97 ~ 서열 번호 103중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 97 또는 서열 번호 98의 아미노산 서열, 더욱 바람직하게 서열 번호 97의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4를 포함한다. 적합하게 TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 서열 번호 97 ~ 서열 번호 103중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 97 또는 98에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 더욱 바람직하게 서열 번호 98에 제시된 바와 같은 Vλ FR4를 포함한다.
그러므로 일 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제2 도메인은
(a) 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각;
(b) VHB[단 상기 VHB는 VH3 또는 VH4, 바람직하게는 VH3임]; 및
(c) Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 바람직하게 Vκ1 틀 FR1 ~ FR3, 그리고 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4, Vκ3 FR4, 및 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 97 ~ 서열 번호 103중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 97 ~ 서열 번호 103중 임의의 것에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 97 또는 98에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 더욱 바람직하게 서열 번호 98에 제시된 바와 같은 Vλ FR4로부터 선택된 틀 FR4를 포함하는 VL 틀을 포함하는 VLB
를 포함한다.
적합하게 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제2 도메인은 표 1에 나열된 VH를 포함한다. 적합하게 본 발명은 또한 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과 TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제2 도메인은 표 1에 나열된 VH 아미노산 서열을 포함하고(또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있고), 틀 서열(예를 들어 CDR이 아닌 서열)내 약 20개 이하의 아미노산, 바람직하게 약 10개 이하의 아미노산이 돌연변이되었다[단 이때의 돌연변이는 다양한 비제한적 예로서 부가, 치환 또는 결실임]. TNFα와 특이적으로 결합하는 본 발명의 기타 도메인은 돌연변이되었으되, VH 영역내의 것들이 표 1에 제시된 서열에 도시된 VH 영역내의 것들과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는, 아미노산을 포함한다.
적합하게 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제2 도메인은 표 1에 나열된 VL 도메인을 포함한다. 적합하게 본 발명은 또한 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제2 도메인은 표 1에 나열된 VL 아미노산 서열을 포함하되(또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있되), 틀 서열(예를 들어 CDR이 아닌 서열)내 약 20개 이하의 아미노산, 바람직하게 약 10개 이하의 아미노산은 돌연변이되었다[단 이때의 돌연변이는 다양한 비제한적 예로서 부가, 치환 또는 결실임]. TNFα와 특이적으로 결합하는 본 발명의 기타 도메인은 돌연변이되었으되, VL 영역내의 것들이 표 1에 제시된 서열에 도시된 VL 영역내의 것들과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는, 아미노산을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제2 도메인은 서열 번호 34, 35, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 34의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 도메인은 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함한다. 바람직한 구현예에서, TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 34와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 G56A, R82L, S85A, K86Q(AHo 번호매김)를 포함하고, 구체적으로 상기 도메인은 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함한다. 적합하게 TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 36과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 중쇄 가변 영역은 A24K, G56A, R82L(AHo 번호매김)을 포함하고, 구체적으로 상기 도메인은 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함한다. 적합하게 TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 37과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 중쇄 가변 영역은 G56A, R82L, S85A, K86Q(AHo 번호매김)를 포함하고, 구체적으로 상기 도메인은 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제2 도메인은 서열 번호 47, 48, 49, 50 및 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 47의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 도메인은 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
바람직한 구현예에서, TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 47과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 T22N, A51R, F89Y(AHo 번호매김)를 포함하고, 구체적으로 상기 도메인은 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다. 적합하게 TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 49와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 경쇄 가변 영역은 T22N, D88E, S95G, E99A(AHo 번호매김)을 포함하고, 구체적으로 상기 도메인은 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다. 적합하게 TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 50과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 경쇄 가변 영역은 T22N, A51R, F89Y, S95G, G141T, L145V(AHo 번호매김)을 포함하고, 구체적으로 상기 도메인은 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다. 적합하게 TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 51과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 경쇄 가변 영역은 T22N, K50Q, A51R, F89Y, G141T, L145V(AHo 번호매김)을 포함하고, 구체적으로 상기 도메인은 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제2 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 34와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 아미노산 서열인 서열 번호 47과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직하게 TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 34와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 아미노산 서열인 서열 번호 47과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 도메인은 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각 및/또는 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고, 바람직하게 상기 도메인은 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각 및 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
적합하게 TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 37과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과; 아미노산 서열인 서열 번호 50 또는 51과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 도메인은 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각 및/또는 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고, 바람직하게 상기 도메인은 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각 및 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
구체적인 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제2 도메인은 서열 번호 34, 35, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 47, 48, 49, 50 및 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 이의 VL을 포함한다. 구체적인 구현예에서, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인은 서열 번호 34의 VH 서열과 서열 번호 47의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 구현예에서, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인은 서열 번호 37의 VH 서열과 서열 번호 50 또는 서여 번호 51의 VL 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 인간 TNFα와 특이적으로 결합하는 도메인은 표 1에 제시된 도메인이다. 인간 TNFα에 대해 결합 특이성을 보이는 본 발명의 기타 도메인은, 아미노산 또는 이 아미노산을 암호화하는 핵산이 돌연변이되었으되, 그 서열이 표 1에 제시된 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 보이는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 이는 표 1에 제시된 서열에 도시된 가변 영역과 비교되었을 때, 그 가변 영역내 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이되었으되, 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제2 도메인은 표 1에 제시된 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 상기 도메인은 인간 TNFα와 결합하며, 표 1에 제시된 도메인의 원하는 기능상 특성을 보유한다.
일 구현예에서, TNFα와 특이적으로 결합하는 본 발명의 도메인은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는데, 이 CDR 서열들중 1개 이상은 본원에 기재된 도메인을 기반으로 한 특정 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형을 가지고, 이 도메인은 본 발명의 항체의 원하는 기능상 특성을 보유한다.
그러므로 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제2 도메인은
3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)[단 상기 HCDR1은 아미노산 서열인 서열 번호 25 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 HCDR2는 아미노산 서열인 서열 번호 26 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 HCDR3는 서열 번호 27 또는 이의 보존적 변이체중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열임]; 그리고
3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)[단 상기 LCDR1은 아미노산 서열인 서열 번호 38 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 LCDR2는 아미노산 서열인 서열 번호 39 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 LCDR3는 아미노산 서열인 서열 번호 40 또는 이의 보존적 변이체임]
을 포함하되(또는 이것으로 이루어져 있되), 상기 도메인은 인간 TNFα와 특이적으로 결합하고/결합하거나 TNFα를 중화시킨다.
인간 혈청 알부민(HSA)과 특이적으로 결합하는 예시적 도메인
본 발명의 다중 특이적 항체는 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는데, 상기 도메인은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, (a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하고, (b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함한다.
적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체는 제1 도메인 및 제2 도메인의 특이성과는 상이한 제3의 특이성을 가지는 제3 결합 도메인을 포함할 수 있다. 적합하게 본 발명의 다중 특이적 항체는 인간 혈청 알부민(HSA)과 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함할 수 있다. 그러므로 일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체는 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인, 그리고 인간 혈창 알부민과 특이적으로 ?쳬朗求? 제3 도메인을 포함한다.
인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 것으로서, 본 발명의 다중 특이적 항체에 사용하기 적합한 도메인은 그 서열이 표 1에 나열된 인간화 모노클로날 항체 또는 이의 결합 도메인을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 도메인은 CDR들의 세트, 즉 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하고, 이 CDR들의 세트는
(a) HCDR1'은 서열 번호 52에 제시된 바와 같고; HCDR2'는 서열 번호 53에 제시된 바와 같고; HCDR3'는 서열 번호 54에 제시된 바와 같고; LCDR1'은 서열 번호 62에 제시된 바와 같고; LCDR2'는 서열 번호 63에 제시된 바와 같고; LCDR3'는 서열 번호 64에 제시된 바와 같거나; 또는
(b) HCDR1'은 서열 번호 73에 제시된 바와 같고; HCDR2'는 서열 번호 74에 제시된 바와 같고; HCDR3'는 서열 번호 75에 제시된 바와 같고; LCDR1'은 서열 번호 83에 제시된 바와 같고; LCDR2'는 서열 번호 84에 제시된 바와 같고; LCDR3'는 서열 번호 85에 제시된 바와 같은,
CDR들의 세트에 10개 이하의 아미노산 치환, 예컨대 9개 이하의 아미노산 치환, 8개 이하의 아미노산 치환, 7개 이하의 아미노산 치환, 6개 이하의 아미노산 치환, 5개 이하의 아미노산 치환, 4개 이하의 아미노산 치환, 3개 이하의 아미노산 치환, 2개 이하의 아미노산 치환, 1개 또는 0개의 아미노산 치환, 바람직하게는 0개의 아미노산 치환이 발생한 것이다.
구체적으로 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 도메인은 표 1에 나열된 VH CDR들중 임의의 하나의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR을 포함한다. 구체적으로 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 도메인은 표 1에 나열된 VH CDR들중 임의의 것의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR 1개, 2개, 3개 또는 그 이상을 포함한다(또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있다).
적합하게 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 도메인은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는데, 단 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하고,
(a) 상기 HCDR1은 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 HCDR2는 서열 번호 53, 56 및 59중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 HCDR3은 서열 번호 54, 57 및 60중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같거나; 또는
(b) 상기 HCDR1은 서열 번호 73, 76 및 79중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 HCDR2는 서열 번호 74, 77 및 80중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 HCDR3은 서열 번호 75, 78 및 81중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같다.
바람직한 구현예에서, 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 도메인은 서열 번호 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함한다. 다른 구현예에서, 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 도메인은 서열 번호 73, 74 및 75의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함한다.
적합하게 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 도메인은 표 1에 나열된 VL CDR들중 임의의 하나의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR을 포함한다. 구체적으로 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 도메인은 표 1에 나열된 VL CDR들중 임의의 것의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR 1개, 2개, 3개 또는 그 이상을 포함한다(또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있다).
적합하게 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 도메인은 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는데, 단 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하고,
(a) 상기 LCDR1은 서열 번호 62, 65 및 68중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63, 66 및 69중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 LCDR3은 서열 번호 64, 67 및 70중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같거나; 또는
(b) 상기 LCDR1은 서열 번호 83, 86 및 89중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 LCDR2는 서열 번호 84, 87 및 90중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같고; 상기 LCDR3은 서열 번호 85, 88 및 91중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같다.
바람직한 구현예에서, 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 도메인은 서열 번호 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다. 다른 구현예에서, 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 도메인은 서열 번호 83, 84 및 85의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
적합하게 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고,
(a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 HCDR1은 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고; 상기 HCDR2는 서열 번호 53, 56 및 59중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고; 상기 HCDR3은 서열 번호 54, 57 및 60중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고; 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 LCDR1은 서열 번호 62, 65 및 68중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63, 66 및 69중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고; 상기 LCDR3은 서열 번호 64, 67 및 70중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지거나; 또는
(b) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 HCDR1은 서열 번호 73, 76 및 79중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고; 상기 HCDR2는 서열 번호 74, 77 및 80중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고; 상기 HCDR3은 서열 번호 75, 78 및 81중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고; 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 LCDR1은 서열 번호 83, 86 및 89중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고; 상기 LCDR2는 서열 번호 84, 87 및 90중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고; 상기 LCDR3은 서열 번호 85, 88 및 91중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 도메인은 (a) 서열 번호 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, (b) 서열 번호 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 (a) 서열 번호 73, 74 및 75의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, (b) 서열 번호 83, 84 및 85의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
HSA와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 기타 도메인은 돌연변이되었으되, CDR 영역내의 아미노산들이 표 1에 제시된 서열에 도시된 CDR 영역내의 아미노산들과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보인다. 적합하게 HSA와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 기타 도메인은 표 1에 제시된 서열들에 도시된 CDR 영역들과 비교되었을 때, CDR 영역내 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 10개 이하의 아미노산이 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된, 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이, 예컨대 치환은 CDR들의 세트내 임의의 잔기에서 잠재적으로 이루어질 수 있으며, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3내에서 이루어질 수 있다.
적합하게 HSA와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 다중 특이적 항체의 제3 도메인은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는데, 단
(a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 HCDR1은 서열 번호 52, 55 및 58중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고; 상기 HCDR2는 서열 번호 53, 56 및 59중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고; 상기 HCDR3은 서열 번호 54, 57 및 60중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고/가지거나;
(b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 LCDR1은 서열 번호 62, 65 및 68중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고; 상기 LCDR2는 서열 번호 63, 66 및 69에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고; 상기 LCDR3은 서열 번호 64, 67 및 70중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가진다.
적합하게 다중 특이적 항체는 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는데, 상기 제3 도메인은 서열 번호 52, 53 및 54의 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 각각 및/또는 서열 번호 62, 63 및 64의 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 각각을 포함한다.
적합하게 HSA와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 다중 특이적 항체의 제3 도메인은 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는데, 단
(a) 상기 VH는 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 HCDR1은 서열 번호 73, 76 및 79중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고; 상기 HCDR2는 서열 번호 74, 77 및 80중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고; 상기 HCDR3은 서열 번호 75, 78 및 81중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고/가지거나;
(b) 상기 VL은 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하되, 상기 LCDR1은 서열 번호 83, 86 및 89중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고; 상기 LCDR2는 서열 번호 84, 87 및 90에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가지고; 상기 LCDR3은 서열 번호 85, 88 및 90중 임의의 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 가진다.
적합하게 다중 특이적 항체는 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는데, 상기 제3 도메인은 서열 번호 73, 74 및 75의 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 각각 및/또는 서열 번호 83, 84 및 85의 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 각각을 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 중쇄 가변 영역 VHC 및 경쇄 가변 영역 VLC를 포함한다.
적합하게 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 VH1A, VH1B, VH3 또는 VH4인 중쇄 가변 영역 VHC를 포함한다. 일 구현예에서, HSA와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 제3 도메인은 VH4인 중쇄 가변 영역 VHC를 포함한다. 바람직한 구현에에서, HSA와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 제3 도메인은 VH3인 중쇄 가변 영역 VHC를 포함한다.
적합하게 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제3 도메인은 경쇄 가변 영역 VLC를 포함하고, 상기 VLC는 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 바람직하게 Vκ1 틀 FR1 ~ FR3, 및 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4, Vκ3 FR4, 및 Vλ FR4로부터 선택된 틀 FR4를 포함한다. 적합한 Vλ FR4는 서열 번호 97 내지 서열 번호 103에 제시된 바와 같다. 일 구현예에서, 상기 제3 도메인은 서열 번호 97 ~ 서열 번호 103중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 97 또는 서열 번호 98의 아미노산 서열, 더욱 바람직하게 서열 번호 97의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4를 포함한다. 적합하게 상기 제3 도메인은 서열 번호 97 ~ 서열 번호 103중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 97 또는 98에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 더욱 바람직하게 서열 번호 98에 제시된 바와 같은 Vλ FR4를 포함한다.
그러므로 바람직한 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은
(a) 서열 번호 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각;
(b) VHC[단 상기 VHC는 VH3 또는 VH4, 바람직하게는 VH3임]; 및
(c) Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 바람직하게 Vκ1 FR1 ~ FR3, 그리고 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4, Vκ3 FR4, 및 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 97 ~ 서열 번호 103중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 97 ~ 서열 번호 103중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 97 또는 98에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 더욱 바람직하게 서열 번호 98에 제시된 바와 같은 Vλ FR4로부터 선택된 틀 FR4를 포함하는 VL 틀을 포함하는 VLC
를 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은
(i) 서열 번호 73, 74 및 75의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 83, 84 및 85의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각;
(ii) VHC[단 상기 VHC는 VH3 또는 VH4, 바람직하게는 VH3임]; 및
(iii) Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 바람직하게 Vκ1 FR1 ~ FR3, 그리고 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4, Vκ3 FR4, 및 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 97 ~ 서열 번호 103중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 97 ~ 서열 번호 103중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 97 또는 98에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 더욱 바람직하게 서열 번호 98에 제시된 바와 같은 Vλ FR4로부터 선택된 틀 FR4를 포함하는 VL 틀을 포함하는 VLC
를 포함한다.
적합하게 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 표 1에 나열된 VH를 포함한다. 적합하게 본 발명은 또한 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 표 1에 나열된 VH 아미노산 서열을 포함하되(또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있되), 틀 서열(예를 들어 CDR이 아닌 서열)내 약 20개 이하의 아미노산, 바람직하게 약 10개 이하의 아미노산은 돌연변이되었다[단 이때의 돌연변이는 다양한 비제한적 예로서 부가, 치환 또는 결실임]. HSA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 기타 도메인은 돌연변이되었으되, VH 영역내의 것들이 표 1에 제시된 서열에 도시된 VH 영역내의 것들과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는, 아미노산을 포함한다.
적합하게 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 표 1에 나열된 VL 도메인을 포함한다. 적합하게 본 발명은 또한 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 표 1에 나열된 VL 아미노산 서열을 포함하되(또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있되), 틀 서열(예를 들어 CDR이 아닌 서열)내 약 20개 이하의 아미노산, 바람직하게 약 10개 이하의 아미노산은 돌연변이되었다[단 이때의 돌연변이는 다양한 비제한적 예로서 부가, 치환 또는 결실임]. HSA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 기타 도메인은 돌연변이되었으되, VL 영역내의 것들이 표 1에 제시된 서열에 도시된 VL 영역내의 것들과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보이는, 아미노산을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 61과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 도메인은 서열 번호 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 71과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 도메인은 서열 번호 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 61과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과; 아미노산 서열인 서열 번호 71과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 61과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과; 아미노산 서열인 서열 번호 71과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 도메인은 서열 번호 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각 및/또는 서열 번호 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고, 바람직하게 상기 도메인은 서열 번호 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각 및 서열 번호 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
구체적인 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 61을 포함하는 VH 및/또는 아미노산 서열인 서열 번호 71을 포함하는 이의 VL을 포함한다. 바람직한 구현예에서, HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인은 서열 번호 61의 VH 서열 및 서열 번호 71의 VL 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 82와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 도메인은 서열 번호 73, 74 및 75의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 92와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 구체적으로 상기 도메인은 서열 번호 83, 84 및 85의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 82와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 아미노산 서열인 서열 번호 92와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 82와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과; 아미노산 서열인 서열 번호 92와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 도메인은 서열 번호 73, 74 및 75의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각 및/또는 서열 번호 83, 84 및 85의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고, 바람직하게 상기 도메인은 서열 번호 73, 74 및 75의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각 및 서열 번호 83, 84 및 85의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
구체적인 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 82를 포함하는 VH 및/또는 아미노산 서열인 서열 번호 92를 포함하는 이의 VL을 포함한다. 바람직한 구현예에서, HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인은 서열 번호 82의 VH 서열과, 서열 번호 92의 VL 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 도메인은 표 1에 제시된 도메인이다. 일 구현예에서, HSA와 특이적으로 결합하는 도메인은 서열 번호 72 및 93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 72의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, HSA와 특이적으로 결합하는 도메인은 서열 번호 72 또는 서열 번호 93, 바람직하게 서열번호 72에 제시된 바와 같다.
HSA에 대해 결합 특이성을 가지는 본 발명의 기타 도메인은 돌연변이되었으되, 표 1에 제시된 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 동일성을 보이는 아미노산 또는 이 아미노산을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 이는 표 1에 제시된 서열에 도시된 가변 영역과 비교되었을 때, 가변 영역내 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이되었지만, 실질적으로 동일한 활성을 보유하는, 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 표 1에 제시된 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 상기 도메인은 인간 혈청 알부민과 결합하고, 표 1에 제시된 도메인들의 원하는 기능상 특성을 보유한다.
일 구현예에서, HSA와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 도메인은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지고, 이 CDR 서열들중 1개 이상은 본원에 기재된 도메인을 기반으로 특정의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형을 가지고, 이 도메인은 본 발명의 항체의 원하는 기능상 특성을 보유한다.
그러므로 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은
3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)[단 상기 HCDR1은 아미노산 서열인 서열 번호 52 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 HCDR2는 아미노산 서열인 서열 번호 53 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 HCDR3는 서열 번호 54 또는 이의 보존적 변이체중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열임]; 그리고
3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)[단 상기 LCDR1은 아미노산 서열인 서열 번호 62 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 LCDR2는 아미노산 서열인 서열 번호 63 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 LCDR3는 아미노산 서열인 서열 번호 64 또는 이의 보존적 변이체를 가짐]
을 포함하되(또는 이것으로 이루어져 있되), 상기 도메인은 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합한다.
본 발명은 또한 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은
3개의 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 이 순서로 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)[단 상기 HCDR1은 아미노산 서열인 서열 번호 73 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 HCDR2는 아미노산 서열인 서열 번호 74 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 HCDR3는 서열 번호 75 또는 이의 보존적 변이체중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열임]; 그리고
3개의 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 이 순서로 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)[단 상기 LCDR1은 아미노산 서열인 서열 번호 83 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 LCDR2는 아미노산 서열인 서열 번호 84 또는 이의 보존적 변이체이고; 상기 LCDR3는 아미노산 서열인 서열 번호 85 또는 이의 보존적 변이체를 가짐]
을 포함하되(또는 이것으로 이루어져 있되), 상기 도메인은 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합한다.
본 발명의 다중 특이적 항체의 추가 도메인
본 발명의 다중 특이적 항체에 추가로 사용하기 적합한 도메인은 그 서열이 표 1에 나열되어 있고, 추가로 변형된(즉 이의 변형된 형태인) 항체 또는 그의 결합 도메인을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 다중 특이적 항체는 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는데, 단 상기 제1 도메인은 포유동물 세포내에서의 발현에 대해 최적화된 것으로서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 가지는데, 단 이 서열들중 1개 이상은 본원에 기재된 도메인을 기반으로 특정의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형을 가지고, 이 도메인은 본 발명의 도메인의 원하는 기능상 특성을 보유한다.
일 구현예에서, 다중 특이적 항체는 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는데, 단 상기 제2 도메인은 포유동물 세포내에서의 발현에 대해 최적화된 것으로서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 가지는데, 단 이 서열들중 1개 이상은 본원에 기재된 도메인을 기반으로 특정의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형을 가지고, 이 도메인은 본 발명의 도메인의 원하는 기능상 특성을 보유한다.
일 구현예에서, 다중 특이적 항체는 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는데, 단 상기 제3 도메인은 포유동물 세포내에서의 발현에 대해 최적화된 것으로서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 가지는데, 단 이 서열들중 1개 이상은 본원에 기재된 도메인을 기반으로 특정의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형을 가지고, 이 도메인은 본 발명의 도메인의 원하는 기능상 특성을 보유한다.
본원에 사용된 바와 같이 "최적화된"이란 용어는 뉴클레오티드 서열이 변경되어, 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로는 진핵생물 세포, 예컨대 피치아 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 이용하여 아미노산 서열을 암호하게 됨을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 원래 출발 뉴클레오티드 서열("모" 서열이라고도 공지됨)에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 전부 또는 가능한한 많이 보유하도록 조작된다. 본원에 있어 최적화된 서열은 포유동물 세포에서 바람직한 코돈을 가지도록 조작되었다. 그러나 이러한 서열의 다른 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포에서의 최적화된 발현도 또한 본원에서 상상된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열도 또한 최적화되었다고 지칭된다.
그러므로 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제1 도메인은 포유동물 세포내에서의 발현에 대해 최적화된 것으로서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하고; 중쇄 가변 영역은 서열 번호 10 및 11중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열과 이의 보존적 변형을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21 및 22중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열과 이의 보존적 변형을 포함하고; 상기 제1 도메인은 인간 IL-17A와 특이적으로 결합하고/결합하거나 IL-17A를 중화시킨다.
그러므로 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제2 도메인은 포유동물 세포내에서의 발현에 대해 최적화된 것으로서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하고; 중쇄 가변 영역은 서열 번호 34, 35, 36 및 37중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열과 이의 보존적 변형을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 47, 48, 49, 50 및 51중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열과 이의 보존적 변형을 포함하고; 상기 도메인은 인간 TNFα와 특이적으로 결합하고/결합하거나 TNFα를 중화시킨다.
그러므로 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 돔인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제3 도메인은 포유동물 세포내에서의 발현에 대해 최적화된 것으로서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하고; 중쇄 가변 영역은 서열 번호 61 및 서열 번호 82중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열과 이의 보존적 변형을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 71 및 서열 번호 92중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열과 이의 보존적 변형을 포함하고; 상기 도메인은 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합한다.
가변 영역 변형의 또 다른 유형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역내 아미노산 잔기들을 돌연변이시켜, 관심 항체의 결합 특성 1개 이상(예컨대 친화성)을 개선하는 것이다(이 과정은 "친화성 성숙"이라 공지되어 있음). 돌연변이(들)를 도입하기 위해 부위 유도성 돌연변이유발 또는 PCR 매개 돌연변이유발이 수행될 수 있으며, 항체 결합 또는 기타 관심이 있는 기능상의 특성에 대한 영향력이, 본원에 기술되어 있고 실시예에 제공된 시험관내 또는 생체내 검정에서 평가될 수 있다. (상기 논의된 바와 같은) 보존적 변형이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 더욱이 통상적으로는 CDR 영역내 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
"친화성 성숙된" 항체는 가변 도메인 1개 이상에 1개 이상의 변경이 발생하여, 항원에 대한 항체의 친화성이, 이러한 변경(들)이 발생하지 않은 모 항체의 항원에 대한 친화성과 비교되었을 때 개선된 항체이다. 일 구현예에서, 친화성 성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화성을 가진다. 친화성 성숙된 항체는 당 분야에 공지된 방법에 의헤 제조된다. 예를 들어 문헌[Marks et al, Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH-도메인 및 VL-도메인 셔플링에 의한 친화성 성숙이 기술되어 있다. HVR 및/또는 틀 잔기의 무작위 돌연변이유발은, 예를 들어 문헌[Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Jackson et al, J. Immunol. 154(7):3310- 9 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기술되어 있다. 그러므로 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 상기 제1 도메인은 친화성 성숙된 도메인이고/도메인이거나 상기 제2 도메인은 친화성 성숙된 도메인이다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 추가로 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 제3 도메인은 친화성 성숙된 도메인이다.
본 발명의 항체는 또한 변형 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서, 본원에 보인 VH 및/또는 VL 서열들 중 1개 이상을 가지는 항체를 사용하여 제조될 수 있는데, 단 이 변형 항체는 출발 항체의 특성과는 달리, 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 가변 영역 1개 또는 둘 다(즉 VH 및/또는 VL), 예컨대 CDR 영역 1개 이상 및/또는 틀 영역 1개 이상 내에 있는 잔기 1개 이상을 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 항체는, 예컨대 항체의 효과기 기능(들)을 변경시키기 위해 불변 영역(들) 내에 있는 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 조작의 한 유형은 CDR 이식이다. 항체는 대개 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치하는 아미노산 잔기들을 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로 말미암아, 개별 항체들간에 CDR 외부 아미노산 서열보다는 CDR 내부 아미노산 서열이 더욱 가변적이다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용에 관여하므로, 상이한 특성을 가지는 상이한 항체로부터 유래한 틀 서열상에 이식된, 특정의 자연 발생 항체로부터 유래한 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구성함으로써, 특정의 자연 발생 항체의 특성을 모의하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다[예컨대 문헌(Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522- 525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86: 10029-10033; 미국 특허 제5,225,539호(Winter), 및 미국 특허 제5,530,101호; 동 제5,585,089호; 동 제5,693,762호 및 동 제6,180,370호(Queen et al.))을 참조한다].
이러한 틀 서열은 생식계열 항체 유전자 서열 또는 재배열된 항체 서열을 포함하는, 간행된 참고문헌 또는 공공의 DNA 데이터베이스로부터 입수될 수 있다. 예를 들어 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스(인터넷 사이트 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 입수 가능함)에서뿐 아니라, 문헌[Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836]에서도 살펴볼 수 있는데; 단 이것들 각각의 내용은 본원에 참조로 명백하게 첨부되어 있다. 예를 들어 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열과 재배열된 항체 서열은 "IMGT" 데이터베이스(인터넷 사이트 www.imgt.org에서 입수 가능; Lefranc, M.P. et al., 1999 Nucleic Acids Res. 27:209-212 참조(이것들 각각의 내용은 본원에 참조로 명백하게 인용됨))에서 살펴볼 수 있다.
본 발명의 다중 특이적 항체의 결합 도메인에 사용하기 위한 틀 서열의 예는 본 발명의 선택된 도메인에 의해 사용되는 틀 서열과 구조상 유사한 것, 예컨대 본 발명의 도메인에 의해 사용되는 공통 서열 및/또는 틀 서열이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 틀 서열의 기원이 되는 생식 계열 면역글로불린 유전자에서 발견되는 서열과 동일한 서열을 가지는 틀 영역에 이식될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 생식계열 서열에 비하여 돌연변이를 1개 이상 함유하는 틀 영역에 이식될 수 있다. 예를 들어 임의의 경우 틀 영역 내 잔기들을 돌연변이시켜, 항체의 항원 결합능을 유지시키거나 향상시키는 것이 유리할 수 있음이 확인되었다(예를 들어 미국 특허 제5,530,101호; 동 제5,585,089호; 동 제5,693,762호 및 동 제6,180,370호(Queen외 다수) 참조).
본 발명의 예시적인 다중 특이적 항체
구체적인 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인, 그리고 선택적으로 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 (i) 상기 제1 도메인은 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고; (ii) 상기 제2 도메인은 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고; (iii) 선택적으로 상기 제3 도메인은 서열 번호 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
더욱 구체적인 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인, 그리고 선택적으로 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단
(i) IL-17A와 특이적으로 결합하는 본 발명의 다중 특이적 항체의 상기 제1 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 10과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과; 아미노산 서열인 서열 번호 21과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 도메인은 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고;
(ii) TNFα와 특이적으로 결합하는 상기 제2 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 34와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과; 아미노산 서열인 서열 번호 47과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 도메인은 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고;
(iii) 선택적으로 상기 제3 도메인은 아미노산 서열인 서열 번호 61과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과; 아미노산 서열인 서열 번호 71과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 도메인은 서열 번호 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
특정의 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인, 그리고 선택적으로 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 다중 특이적 항체는 서열 번호 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123 및 124중 임의의 것으로부터 선택된 서열, 바람직하게 서열 번호 119의 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성, 바람직하게 적어도 80% 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하되, 구체적으로
(a) 상기 제1 결합 도메인은 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고;
(b) 상기 제2 도메인은 서열 번호 25, 26 및 27의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 38, 39 및 40의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하고;
(c) 상기 제3 도메인은 서열 번호 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함한다.
더욱 구체적인 구현예에서, 본 발명은 IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인, 그리고 구체적으로 HSA와 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포함하는 다중 특이적 항체를 제공하는데, 단 상기 다중 특이적 항체는 서열 번호 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123 및 124중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이것으로 이루어져 있다).
본 발명의 추가 다중 특이적 분자
본 발명은 또한 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하고, 적어도 또 다른 특이성을 가지는 다중 특이적 분자, 예컨대 2중 특이적 분자, 3중 특이적 분자, 4중 특이적, 5중 특이적, 6중 특이적 분자인 항체를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 "다중 특이적 분자" 또는 "다중 특이적 항체"란 용어는, 적어도 2개 이상의 상이한 표적(예컨대 IL-17A 및 IL-17A와 상이한 또 다른 표적) 상에 존재하는 상이한 에피토프 2개 이상과 결합하거나, 또는 동일 표적의 상이한 에피토프 2개 이상과 결합하는 항체를 지칭한다.
"다중 특이적 분자"란 용어는 2중 특이적, 3중 특이적, 4중 특이적, 5중 특이적 및 6중 특이적 항체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "2중 특이적 항체"란 용어는, 상이한 표적 2개 또는 동일한 표적에 존재하는 상이한 에피토프 2개와 결합하는 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "3중 특이적 항체"란 용어는, 상이한 표적 3개 또는 동일한 표적에 존재하는 상이한 에피토프 3개와 결합하는 항체를 지칭한다.
본 발명의 항체는 다른 기능성 분자, 예컨대 다른 펩티드 또는 단백질(예컨대 수용체에 대한 다른 리간드 또는 항체)로 유도체화되거나 이에 결합하여, 적어도 2개의 결합 부위 및/또는 상이한 표적 분자와 결합하는 다중 특이적 분자로 제조될 수 있다. 본 발명의 항체는 사실 1개를 초과하는 기타 기능성 분자로 유도체화되거나 이에 결합하여, 2개를 초과하는 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자와 결합하는 다중 특이적 분자로 제조될 수 있다. 본 발명의 다중 특이적 분자를 제조하기 위해 본 발명의 항체는 (예컨대 화학 결합, 유전자 융합, 비공유 결합 또는 기타에 의해) 다른 항체, 펩티드 또는 결합 모의체와 같은 기타 결합 분자 1개 이상에 기능상 결합되어, 다중 특이적 분자로 만들어질 수 있다.
그러므로 본 발명은 적어도 하나의 IL-17A에 대한 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 다중 특이적 분자를 포함한다. 예를 들어 제2 표적 에피토프는 IL-17A와는 상이한 또 다른 표적 분자상에 존재한다. 따라서, 본 발명은 적어도 하나의 IL-17A에 대한 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 다중 특이적 분자를 포함한다. 예를 들어 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와는 상이한 IL-17A의 또 다른 에피토프이다. 다중 특이적 분자는 제1 표적 에피토프 및 제2 표적 에피토프에 더하여 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 IL-17A 특이성에 대하여 1가, 2가 또는 다가, 바람직하게는 1가인 다중 특이적 분자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체적 구현예에서, 본 발명의 항체는 IL-17A 특이성 분자에 대해 1가 또는 다가, 예컨대 2가, 3가, 4가, 5가, 6가이다.
본원에 사용된 바와 같은 "1가 분자" 또는 "1가 항체"란 용어는, 표적 분자, 예컨대 IL-17A상 단일 에피토프와 결합하는 단일 항원 결합부를 가지는 항체를 지칭한다.
"다가 항체"란 용어는, 가 수가 1을 초과하는 단일 결합 분자를 지칭하는데, 여기서 "가 수"는 동일한 표적 분자상 에피토프와 결합하는 항원 결합부의 수로서 기술된다. 그러므로 단일 결합 분자는 1개를 초과하는 표적 분자, 또는 에피토프 다수개의 복사체를 함유하는 표적 분자상 1개를 초과하는 결합 부위와 결합할 수 있다. 다가 항체의 예로서는 2가 항체, 3가 항체, 4가 항체 및 5가 항체 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같은 "2가 항체"란 용어는, 각각이 동일한 에피토프와 결합하는 항원 결합부 2개를 가지는 항체를 지칭한다.
적합하게 본 발명의 다중 특이적 분자, 예컨대 2중 특이적 분자 및/또는 다가 분자, 예컨대 IL-17A 특이성에 대해 1가인 분자, IL-17A 특이성에 대해 2가인 분자는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 다중 특이적(예컨대 2중 특이적) 포맷으로부터 선택된 항체 포맷으로서, 비제한적 예를 들자면 단일 사슬 다이아바디(scDb), 탠덤 scDb(Tandab), 선형 이량체 scDb(LD-scDb), 원형 이량체 scDb(CD-scDb), 2중 특이적 T 세포 점유체(BiTE; 탠덤 디-scFv), 탠덤 트리-scFv, 트리바디(Fab-(scFv)2), 바이바디(Fab-(scFv)1), Fab, Fab-Fv2, Morrison(IgG CH3-scFv 융합체(Morrison L) 또는 IgG CL-scFv 융합체(Morrison H)), 트리아바디, scDb-scFv, 2중 특이적 Fab2, 디-미니항체, 테트라바디, scFv-Fc-scFv 융합체, scFv-HSA-scFv 융합체, 디-다이아바디, DVD-Ig, COVD, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, IgG-scFv 융합체, 예컨대 bsAb(경쇄의 C 말단에 결합된 scFv), Bs1Ab(경쇄의 N 말단에 결합된 scFv), Bs2Ab(중쇄의 N 말단에 결합된 scFv), Bs3Ab(중쇄의 C 말단에 결합된 scFv), Ts1Ab(경쇄와 중쇄 둘 다의 N 말단에 결합된 scFv), Ts2Ab(중쇄의 C 말단에 결합된 dsscFv), 이종 이량체 Fc 도메인을 기반으로 하는 2중 특이적 항체, 예컨대 납-인투-홀 항체(KiH)(KiH 기술에 의해 제조된 2중 특이적 IgG); Fv, scFv, scDb, 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv, Fab-(scFv)2, Fab-(scFv)1, Fab, Fab-Fv2, 이종 이량체 Fc 도메인 또는 기타 임의의 이종 이량체 도메인의 사슬 중 어느 하나의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합된 COVD, MATCH(WO 2016/0202457; Egan T., et al., mAbs 9 (2017) 68-84에 기재됨) 그리고 듀오바디(Duobody 기술에 의해 제조된 2중 특이적 IgG)(MAbs. 2017 Feb/Mar;9(2):182-212. doi: 10.1080/19420862.2016.1268307)를 기반으로 한 포맷이다. 본원에서 사용하기에 특히 적합한 것은 단일 사슬 다이아바디(scDb) 또는 scDb-scFv이다.
"다이아바디"란 용어는 항원 결합 부위를 2개 가지는 항체 단편을 지칭하는데, 이 단편은 동일 폴리펩티드 사슬 내 VL과 결합된 VH(VH-VL)를 포함한다. 지나치게 짧아서 동일 사슬상 도메인 2개 사이의 쌍 형성을 허용하지 않는 링커가 사용되면, 이들 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 쌍을 형성하게 되고, 이로써 2개의 항원 결합 부위가 생성된다. 다이아바디는 2가 또는 2중 특이적일 수 있다. 다이아바디는, 예컨대 문헌[EP404097, WO1993/01161, Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003), 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 더욱 자세히 기술되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디도 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기술되어 있다. "scDb-scFv"란 용어는, 단일 사슬 Fv(scFv) 단편이 가요성 Gly-Ser 링커에 의해 단일 사슬 다이아바디(scDb)에 융합된 항체 포맷을 지칭한다.
2중 특이적 scDb, 구체적으로 2중 특이적 단량체 scDb는, 구체적으로 링커 L1, L2 및 L3에 의해 VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA, VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA, VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA, VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA, VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB, VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB, VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB 또는 VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB와 같은 순서로 결합되어 있는, 2개의 가변 중쇄 도메인(VH) 또는 이의 단편과, 2개의 가변 경쇄 도메인(VL) 또는 이의 단편을 포함하되, 단 VLA 도메인 및 VHA 도메인은 함께 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 VLB 및 VHB는 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성한다.
링커 L1은, 구체적으로 2개 ~ 10개 아미노산, 더욱 구체적으로 3개 ~ 7개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 5개 아미노산으로 이루어진 펩티드이고, 링커 L3은, 구체적으로 1개 ~ 10개 아미노산, 더욱 구체적으로 2개 ~ 7개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 5개 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 중간 링커인 L2는, 구체적으로 10개 ~ 40개 아미노산, 더욱 구체적으로 15개 ~ 30개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 20개 ~ 25개 아미노산으로 이루어진 펩티드이다.
일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 및/또는 다가 분자는 문헌[WO2016/0202457; Egan T., et al., mAbs 9 (2017) 68-84]에 기술된 MATCH 포맷을 취한다.
본 발명의 다중 특이적 및/또는 다가 분자는 당 분야에 공지된 임의의 편리한 항체 제조 방법을 이용하여 제조될 수 있다[예컨대 2중 특이적 구조체의 제조에 관한 문헌(Fischer, N. & Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14); 2중 특이적 다이아바디 및 탠덤 scFv에 관한 문헌(Hornig, N. &Farber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907 (2012)713-727, 및 WO 99/57150) 참조]. 본 발명의 2중 특이적 구조체를 제조하는데 적합한 방법의 구체 예로서는, 여타의 것들 중 Genmab 기술(Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150 참조) 및 Merus 기술(de Kruif et al., Biotechnol. Bioeng. 106 (2010) 741-750 참조)을 추가로 포함한다. 기능성 항체 Fc 부분을 포함하는 2중 특이적 항체를 제조하기 위한 방법도 또한 당 분야에 공지되어 있다[예컨대 문헌(Zhu et al., Cancer Lett. 86 (1994) 127-134; 및 Suresh et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 210-228) 참조].
본 발명의 다중 특이적 분자 및 다가 분자에 사용될 수 있는 기타 항체는 마우스, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
본 발명의 다중 특이적 분자는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 구성 결합 특이성을 접합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어 2중 특이적 분자의 각각의 결합 특이성은 별도로 생성된 다음, 서로 접합될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드일 때, 다양한 커플링제 또는 가교제가 공유 접합을 위해 사용될 수 있다. 가교제의 예로서는 단백질 A, 카보디이미드, N-숙신이미딜-5-아세틸-티오아세트산염(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피온산염(SPDP) 및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실산염(설포-SMCC)을 포함한다[예를 들어 문헌(Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, M A et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)을 참조한다]. 기타 방법으로서는 문헌[Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83] 및 문헌[Glennie et al., 1987 J. Immunol.139: 2367-2375]에 기술된 방법을 포함한다. 접합제는 SATA 및 설포-SMCC인데, 이것들 둘 다는 Pierce Chemical Co.(Rockford, Ill.)로부터 입수 가능하다.
결합 특이성이 항체일 때, 이는 중쇄 2개의 C 말단 경첩 영역의 설프히드릴 결합에 의해 접합될 수 있다. 구체적 구현예에서, 경첩 영역은 접합 전 홀수 개(예컨대 1개)의 설프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로 2개 이상의 결합 특이성은 동일 벡터에서 암호화되어, 동일 숙주 세포에서 발현 및 조립될 수 있다. 이 방법은 2중 특이적 분자가 mAb X mAb, mAb X Fab, Fab X F (ab')2 또는 리간드 X Fab 융합 단백질일 때 특히 유용하다. 적합하게 본 발명의 다중 특이적 분자는 1개의 단일 사슬 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일 사슬 분자, 또는 결합 결정기 2개를 포함하는 단일 사슬 다중 특이적 분자일 수 있다. 다중 특이적 분자는 단일 사슬 분자 적어도 2개를 포함할 수 있다. 다중 특이적 분자를 제조하기 위한 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호; 미국 특허 제5,455,030호; 미국 특허 제4,881,175호; 미국 특허 제5,132,405호; 미국 특허 제5,091,513호; 미국 특허 제5,476,786호; 미국 특허 제5,013,653호; 미국 특허 제5,258,498호; 및 미국 특허 제5,482,858호에 기술되어 있다.
다중 특이적 분자와 이의 특이적 표적의 결합은, 예를 들어 효소결합면역흡착검정(ELISA), 방사성면역검정(REA), FACS 분석, 바이오검정(예컨대 생장 억제) 또는 웨스턴블럿검정(Western Blot assay)에 의해 확인될 수 있다. 이 검정들 각각은, 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지화된 시약(예컨대 항체)를 사용하여 특히 관심있는 단백질-항체 복합체의 존부를 확인한다.
본 발명의 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 제조 방법
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 단편 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 IL-17A 단백질에 특이적으로 결합하는 CDR, VH, VL 및 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 TNFα 단백질에 특이적으로 결합하는 CDR, VH, VL 및 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 HSA 단백질에 특이적으로 결합하는 CDR, VH, VL 및 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 이러한 핵산 서열은 포유동물 세포에서의 발현에 대해 최적화될 수 있다.
"핵산"이란 용어는 본원에서 "폴리뉴클레오티드"란 용어와 호환되어 사용되고 있으며, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드와 이것들의 중합체(단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 형태)를 지칭한다. 이 용어는 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본(backbone) 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산을 포함하는데, 이것들은 합성, 자연발생 및 비 자연발생되는 것이고, 참조기준 핵산의 결합 특성과 유사한 결합 특성을 가지며, 참조기준 뉴클레오티드의 대사 방식과 유사한 방식으로 대사된다. 이러한 유사체의 예들로서는 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포레이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 달리 명시되지 않는 한, 특정의 핵산 서열은 또한 암묵적으로 (예컨대 축퇴성 코돈 치환으로 인한) 자체의 보존적 변형 변이체와 상보성 서열을 포함할뿐만 아니라, 명백하게 명시된 서열을 포함하기도 한다. 특히 이하에 상세히 기술된 바와 같이, 축퇴성 코돈 치환은 1개 이상의 선택 코돈(또는 모든 코돈)의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).
본 발명은 전술된 다중 특이적 항체 사슬의 분절 또는 도메인 및/또는 전술된 IL-17A 결합 항체 사슬의 분절 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는, 실질적으로 정제된 핵산 분자를 제공한다. 핵산이 적당한 발현 벡터로부터 발현될 때, 이 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드는 IL-17A 및/또는 TNFα 및/또는 HSA 항원 결합능을 보일 수 있다.
본 발명에서는 또한 표 1에 제시된 IL-17A 결합 항체, 표 1에 제시된 TNFα 결합 도메인, 또는 표 1에 제시된 HSA 결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄로부터 유래하는 CDR 영역 적어도 1개, 보통은 CDR 영역 3개 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 제공된다. 기타 폴리뉴클레오티드 몇몇은 표 1에 제시된 IL-17A 결합 항체, 표 1에 제시된 TNFα 결합 도메인, 또는 표 1에 제시된 HSA 결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 서열 모두 또는 실질적으로 모두를 암호화한다. 암호의 축퇴성으로 말미암아, 다양한 핵산 서열은 면역글로불린 아미노산 서열 각각을 암호화할 것이다.
폴리뉴클레오티드 서열은 표 1에 제시된 IL-17A 결합 항체, 표 1에 제시된 TNFα 결합 도메인, 또는 표 1에 제시된 HSA 결합 도메인을 암호화하는 기존 서열(예컨대 이하 실시예에 기술된 서열)의 신규 고체상 DNA 합성 또는 PCR 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학 합성은 당 분야에 공지된 방법, 예컨대 문헌[Narang et al., 1979, Meth. Enzymol.68:90]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌[Brown et al., Meth.Enzymol.68: 109, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌[Beaucage et al., Tetra.Lett., 22: 1859, 1981]의 디에틸포스포라미다이트 방법; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고체 지지체 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하는 것은, 예컨대 문헌[PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods 및 Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 및 Eckert et al., PCR Methods 및 Applications 1:17, 1991]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명에서는 본 발명의 항체를 제조하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포도 또한 제공된다.
"벡터"란 용어는, 결합된 다른 폴리뉴클레오티드를 운반할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭하도록 의도된다. 벡터의 한 가지 유형으로서는 "플라스미드"가 있는데, 이는 내부에 추가의 DNA 분절이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 또 다른 유형으로서는 추가의 DNA 분절이 바이러스 게놈 안에 들어가 결찰될 수 있는 바이러스 벡터가 있다. 임의의 벡터는 이 벡터가 도입되는 숙주 세포내에서 자율 복제가 가능하다(예컨대 세균 복제 기원을 가지는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 기타 벡터(예컨대 비 에피좀 포유동물 벡터)가 숙주 세포에 도입될 때, 이 벡터는 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있으며, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다.
게다가 임의의 벡터는 작동 가능하도록 결합된 유전자들의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단하게 "발현 벡터")라 지칭된다. 일반적으로 재조합 DNA 기술에 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태를 가진다. 본 명세서에 있어서, "플라스미드"와 "벡터"는 호환되어 사용될 수 있는데, 그 이유는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다. 그러나 본 발명은 이처럼 동일한 기능을 보이는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터(예컨대 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스)를 포함하도록 의도된다.
"작동 가능하도록 결합된"이란 용어는, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드(예컨대 DNA) 분절간 기능상 관계를 지칭한다. 통상적으로 이는, 전사된 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능상 관계를 지칭한다. 예를 들어 프로모터 또는 인핸서 서열은, 만일 이것이 적당한 숙주 세포 또는 기타 발현계에 있는 암호화 서열의 전사를 자극하거나 조정한다면, 암호화 서열과 작동 가능하도록 결합되어 있는 것이다. 일반적으로 전사된 서열과 작동 가능하도록 결합되어 있는 프로모터 전사 조절 서열은 전사된 서열에 대해 물리적으로 연속적인데, 즉 이 프로모터 전사 서열은 시스 작동성(cis-acting)이다. 그러나 몇몇 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는, 이것의 전사 향상 대상인 암호화 서열에 물리적으로 연속적이어야 한다거나, 가까이에 위치하여야 한다거나 할 필요가 없다.
본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해서는 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 바이러스 기반 발현 벡터 및 비 바이러스 발현 벡터 둘 다가 포유동물 숙주 세포 내에서 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 비 바이러스 벡터 및 계로서는 통상 단백질 또는 RNA를 발현시키기 위한 발현 카세트를 가지는 플라스미드, 에피좀 벡터, 그리고 인간 인공 염색체를 포함한다(예컨대 문헌(Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997)을 참조한다). 예를 들어 포유동물(예컨대 인간) 세포에서 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 도메인, 예를 들어 IL-17A 결합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현에 유용한 비 바이러스 벡터로서는 pThioHis A, B 및 C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B 및 C(Invitrogen, San Diego, Calif.), MPS V 벡터와, 기타 단백질을 발현시키기 위한 것으로서 당 분야에 공지된 다수의 기타 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터로서는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스 바이러스를 기반으로 한 벡터, SV40, 인간유두종바이러스, HBP 엡스타인 바 바이러스를 기반으로 한 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus; SFV)를 포함한다. 문헌[Brent et al., 상동; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; 및 Rosenfeld et al., Cell 68: 143, 1992]을 참조한다.
발현 벡터의 선택은, 벡터가 발현되도록 의도된 숙주 세포에 의존적이다. 통상적으로 발현 벡터는 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 도메인, 예컨대 IL-17A 결합 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 결합된 프로모터와 기타 조절 서열(예컨대 인핸서)을 함유한다. 일 구현예에서, 유도성 프로모터는, 유도 조건하에 있을 때를 제외하고, 삽입된 서열의 발현을 막기 위해 사용된다. 유도성 프로모터로서는, 예컨대 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 충격 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양액은, 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 더 잘 관용되는 암호화 서열 군집에 대한 편향(biasing) 없이 비유도성 조건하에서 증식될 수 있다. 프로모터에 더하여 기타 조절 요소들도 또한 본 발명의 항체 또는 이의 단편, 예컨대 IL-17A 결합 항체의 효율적인 발현에 필요할 수 있거나, 이에 요망될 수 있다. 이러한 요소는 통상 ATG 개시 코돈 및 인접 리보좀 결합 부위 또는 기타 서열을 포함한다. 뿐만 아니라 발현 효율은 세포계에서 사용되기 적당한 인핸서를 포함시킴으로써 향상될 수 있다[예를 들어 문헌(Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125, 1994; 및 Bittner et al., Meth.Enzymol. 153:516, 1987)을 참조한다]. 예를 들어 SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서는 포유동물 숙주 세포 내에서 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다.
발현 벡터는 또한 분비 신호 서열 위치를 제공하여, 삽입된 다중 특이적 항체 암호화 서열, 예컨대 IL-17A 결합 항체 암호화 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 가지는 융합 단백질을 생성할 수도 있다. 더 빈번하게, 삽입된 항체 서열, 예컨대 다중 특이적 항체 암호화 또는 IL-17A 결합 항체 암호화 서열은 벡터에 포함되기 전 신호 서열에 결합된다. 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 도메인, 예컨대 IL-17A 결합 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 수용하는데 사용될 벡터는 또한 종종 이의 불변 영역 또는 일부를 암호화하기도 한다. 이러한 벡터는 가변 영역이, 불변 영역을 가지는 융합 단백질로서 발현되는 것을 허용하고, 이를 통하여 비변형 항체의 생성이 유도된다. 통상적으로 이러한 불변 영역은 인간의 것이다.
"재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")란 용어는, 내부에 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정의 대상 세포뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손까지라도 지칭하도록 의도됨이 이해될 것이다. 돌연변이 또는 환경의 영향 중 어느 하나로 말미암은 임의의 변형은 후세대에서 일어날 수 있으므로, 이러한 후손은 실상 모 세포와 동일할 수는 없지만, 본원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포"란 용어의 범위 안에는 여전히 포함된다.
다중 결합 항체 또는 이의 단편 또는 도메인, 예컨대 IL-17A 결합 항체 사슬을 보유하면서 이를 발현시키기 위한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 중 어느 하나일 수 있다. 이.콜라이(E. coli)는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝과 발현에 유용한 원핵생물 숙주 중 하나이다. 사용하기 적합한 기타 미생물 숙주로서는 간균류, 예컨대 바실러스 서브틸리스 및 기타 장내세균, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이러한 원핵생물 숙주에 있어, 통상 숙주 세포와 양립 가능한 발현 제어 서열(예컨대 복제 기원)을 함유하는 발현 벡터가 제조될 수도 있다. 더욱이 널리 공지된 다수의 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터계, 트립토판(trp) 프로모터계, 베타-락타마아제 프로모터계 또는 파아지 람다로부터 유래하는 프로모터계 임의의 수만큼이 존재할 것이다. 프로모터는 통상 선택적으로 작동인자 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사와 번역을 개시 및 종결하기 위한 리보좀 결합 부위 서열 등을 가진다. 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 도메인, 예컨대 IL-17A 결합 항체를 발현시키기 위해 기타 미생물, 예컨대 효모도 또한 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 함께 곤충 세포도 또한 사용될 수 있다
일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 도메인, 예컨대 IL-17A 결합 항체를 발현 및 생산하는데 포유동물 숙주 세포가 사용된다. 예를 들어 이 포유동물 숙주 세포는 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주 중 어느 하나일 수 있다. 이 포유동물 숙주 세포는 임의의 정상 유한증식성 동물 세포 또는 인간 세포, 또는 정상이거나 비정상인 무한증식성 동물 세포 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어 비변형 면역글로불린을 분비할 수 있는 숙주 세포주로서 적합한 것 다수(예컨대 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B 세포 및 하이브리도마)가 개발되었다. 폴리펩티드를 발현시키기 위해 포유동물 조직 세포 배양액을 사용하는 것은, 일반적으로 문헌, 예컨대 문헌[Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에 논의되어 있다. 포유동물 숙주 세포용 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기원, 프로모터 및 인핸서[예를 들어 문헌(Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986) 참조], 그리고 필요한 가공 정보 부위, 예컨대 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위, 그리고 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터는, 보통 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래한 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형 특이적, 단계 특이적 및/또는 변조 가능한 것이거나, 조절 가능한 것일 수 있다. 유용한 프로모터로서는, 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(major late promoter), 덱사메타손 유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPS V 프로모터, 테트라사이클린 유도성 CMV 프로모터(예컨대 인간 즉시 초기(immediate-early) CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 그리고 당 분야에 공지된 프로모터-인핸서 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하기 위한 방법은 세포성 숙주의 유형에 따라서 달라진다. 예를 들어 염화칼슘 형질감염은 보통 원핵생물 세포에 사용되는 반면, 인산칼슘 처리 또는 전기천공법은 기타 세포성 숙주에 사용될 수 있다, [일반적으로 문헌(Sambrook, et al. 상동)을 참조한다]. 기타 방법으로서는, 예컨대 전기천공법, 인산칼슘 처리, 리포좀 매개 형질전환법, 주입법 및 미세주입법, 탄도 방법(ballistic method), 바이로좀(virosome), 면역리포좀, 다가 양이온:핵산 접합체, 나출 DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에의 융합(Elliot & O'Hare, Cell 88:223, 1997), 제제에 의해 향상되는 DNA 흡수, 그리고 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기 고수율 생산을 위해, 안정적인 발현이 종종 요망될 것이다. 예를 들어 다중 특이적 항체 또는 이의 단편 또는 도메인, 예컨대 IL-17A 결합 항체 폴리펩티드를 안정적으로 발현하는 세포주는 바이러스 복제 기원 또는 내인성 발현 요소 및 선택 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조될 수 있다. 벡터 도입후 세포는 선택적 배지에 대해 스위칭(switching)되기 전, 농축 배지 중에서 1일 ~ 2일 동안 생장하도록 허용될 수 있다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하는 것으로서, 이 마커의 존재는 도입된 서열을 선택 배지에서 성공적으로 발현하는 세포의 생장을 허용한다. 내성으로서, 안정적으로 형질감염된 세포는 세포 유형에 적당한 조직 배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다. 그러므로 본 발명은 본 발명의 항체를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 경우 상기 방법은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양함으로써, 본 발명의 상기 항체 또는 이의 단편이 발현되도록 만드는 단계를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 항체와, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 향상 또는 안정화하거나, 조성물의 제조를 가속화한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서는 생리적으로 양립 가능한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라서 달라진다. 투여는 정맥내, 근육내, 복막내 또는 피하 투여될 수 있거나, 표적 부위에 가까운 부위에서 투여가 이루어질 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 (예컨대 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하여야 할 것이다. 투여 경로에 따라서, 활성 화합물, 즉 항체 및 다중 특이적 분자가 재료 내부에 코팅될 수 있고, 이로써 화합물은, 이 화합물을 비활성화할 수 있는 산 및 기타 자연 조건으로부터 보호될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 널리 공지되어 있고, 당 분야에서 일상적으로 행하여지는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; 및 Sustained 및 Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다. 약학 조성물은, 바람직하게 GMP 조건 하에서 제조될 수 있다. 통상적으로 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자 치료적 유효 용량 또는 유효 용량만큼이 본 발명의 약학 조성물에 사용된다. 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자는 당 업자들에게 공지된 종래의 방법에 의해 약학적으로 허용 가능한 투여형으로 제제화된다. 투여 계획은 최적의 원하는 반응(예컨대 치료 반응)이 제공되도록 조정된다. 예를 들어 단일 볼루스 투여가 수행될 수 있거나, 수 회 분할 용량만큼이 경시적으로 투여될 수 있으며, 용량은 치료 상황의 응급도에 의해 의해 알려지는 바와 비례하여 감소 또는 증가할 수 있다. 투여의 용이함과 투여량의 균일성을 도모하기 위해 비경구 조성물을 투여 단위형으로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위형이란, 치료될 대상체에 맞춘, 단위 투여형과 같이 물리적으로 별개인 단위들을 지칭하는데; 이 경우 각각의 단위에는 원하는 치료 효과가 발휘되도록 산정된 소정량만큼의 활성 화합물이, 필요한 약학 담체와 함께 담겨있다.
본 발명의 약학 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성을 미치지 않고 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 유효한 활성 성분 양만큼을 수득하기 위해 변경될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 약동학적 인자, 예컨대 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용된 특정 조성물과 함께 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 재료, 치료중인 환자의 나이, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강상태 및 지금까지의 병력, 그리고 이와 유사한 인자들에 의존적이다.
항체는 보통 다수의 때에 투여된다. 단일 투여간 간격은 1주일, 1개월 또는 1년일 수 있다. 간격은 또한 환자에 있어 항체의 혈중 수준을 측정함으로써 알려지는 바와 같이 불규칙적일 수도 있다. 대안적으로 항체는 적은 투여 횟수가 요구되는 경우 지연 방출 제제로서 투여될 수 있다. 투여량과 투여횟수는 환자에 있어 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 키메라 항체 및 비 인간 항체의 반감기보다 더 긴 반감기를 보인다. 투여량과 투여 횟수는 치료가 예방적인 것인지 또는 치료적인 것인지에 따라서 달라질 수 있다. 예방적 적용의 경우, 비교적 적은 투여량이 비교적 빈번하지 않은 간격을 두고 오랜 기간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자들은 자신의 남은 생애 동안 계속해서 치료를 받기도 한다. 치료적 적용의 경우, 비교적 많은 투여량이 비교적 짧은 간격을 두고 투여되는데, 이는 종종 질환의 진행이 느려지거나 종결될 때까지 이루어져야 하고, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 완화를 보일 때까지 이루어져야 한다. 그 다음, 환자는 예방적 계획에 따라 투여받을 수 있다.
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 항체는 시험관내 및 생체내 진단용 및 치료용으로서 사용된다. 예를 들어 이러한 분자는 배양액 중의 세포에 투여될 수 있거나(예컨대 시험관내 또는 생체내), 또는 대상체에 투여될 수 있고(예컨대 생체내), 그 결과 다양한 장애가 치료, 예방 또는 진단될 수 있다.
"대상체"란 용어는 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 비인간 동물은 모든 척추동물, 예컨대 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 명시된 경우를 제외하고, "환자" 또는 "대상체"란 용어들은 본원에서 호환되어 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료", "치료하는 것", "치료하다", "치료된" 등과 같은 용어는, 원하는 약리학적 및/또는 생리적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 이 효과는 어떤 질환 및/또는 해당 질환으로 인할 수 있는 부작용을 부분적으로나 완전히 치유하거나, 해당 질환의 진행을 지연시킨다는 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "치료"는, 포유동물, 예컨대 인간에서 어떤 질환에 대한 임의의 치료를 포괄하며, (a) 해당 질환을 억제하는 것, 예컨대 이 질환의 발현을 중단시키는 것; 그리고 (b) 해당 질환을 완화시키는 것, 즉 이 질환의 퇴행을 유발시키는 것을 포함한다.
"예방하다" 또는 "예방"이란 용어는, 질환의 발현 또는 질환의 임의의 2차적 영향을 완전히 억제하는 것을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "예방하다" 또는 "예방"이란 용어는, 어떤 질환이 발생할 경향이 있을 수 있되, 해당 질환이 발생하였다는 진단은 아직 받지 못한 개체에서 질환 또는 병태가 발생하는 것을 예방하는 것을 아우른다.
"치료적 유효량" 또는 "유효 양"이란 용어들은, 어떤 질환을 치료하기 위해 포유동물 또는 기타 대상체에 투여될 때 해당 질환의 이와 같은 치료를 달성하기 충분한, 어떤 제제의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"은 제제, 질환 및 이의 심각성, 치료받을 대상체의 나이, 체중 등에 따라서 달라질 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 의약품으로서 사용하기 위한 본 발명의 항체, 본 발명의 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명의 다중 특이적 항체 또는 본 발명의 약학 조성물은 치료, 예방 또는 진단, 구체적으로 IL-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애 또는 Gro-α 분비를 억제함으로써 치료될 수 있는 장애의 치료, 예방 또는 진단에 사용하기 적합하다.
다른 양태에서, 본 발명의 IL-17A 결합 항체 또는 본 발명의 약학 조성물은 치료, 예방 또는 진단, 구체적으로 IL-17A에 의해 매개되는 장애 또는 Gro-α 분비를 억제함으로써 치료될 수 있는 장애의 치료, 예방 또는 진단에 사용하기 특히 적합하다.
본 발명에서 "IL-17A에 의해 매개되는 장애"란 용어는, 어떤 질환 또는 의학적 상태의 발병, 발현, 진행, 지속 또는 병상을 비롯하여, 해당 질환 또는 의학적 상태에서 IL-17A가 직접적으로든 아니면 간접적으로든 어떤 역할을 담당하는 모든 질환 및 의학적 상태를 포함한다. 그러므로 "IL-17A에 의해 매개되는 장애"란 용어는, 비정상 IL-17A 수준과 연관되거나 이에 의해 특징지어지는 병태 및/또는 표적 세포나 조직에서 IL-17A 유도 활성(예컨대 IL-6 또는 GRO-α의 생성)을 감소시키거나 억제함으로써 치료될 수 있는 질환이나 병태를 포함한다. 본 발명에서, "TNFα에 의해 매개되는 장애"란 용어는, 어떤 질환 또는 상태의 발병, 발현, 진행, 지속 또는 병상을 비롯하여, 해당 질환 또는 의학적 상태에서 TNFα가 직접적으로든 아니면 간접적으로든 어떤 역할을 담당하는 모든 질환 및 의학적 상태를 포함한다. 그러므로 "TNFα에 의해 매개되는 장애"란 용어는, 비정상 TNFα 수준과 연관되거나 이에 의해 특징지어지는 병태 및/또는 표적 세포나 조직에서 TNFα 유도 활성(예컨대 GRO-α의 생성)을 감소시키거나 억제함으로써 치료될 수 있는 질환이나 병태를 포함한다. IL-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애는 염증성 병태 및 자가면역성 질환, 예컨대 관절염, 류머티즘성 관절염 또는 건선을 포함한다. 이것들은 알레르기 및 알레르기성 병태, 과민성 반응, 만성 폐색성 폐질환, 낭포성 섬유증, 그리고 장기나 조직의 이식 거부를 추가로 포함한다. 예를 들어 본 발명의 항체는 심장, 폐, 심폐 복합, 간, 신장, 췌장, 피부 또는 각막 이식이 이루어진 수용개체, 예컨대 동종이식편 거부 또는 이종이식편 거부 발생 수용체의 치료를 위해 사용될 수 있으며, 예컨대 골수 이식 이후의 이식편대숙주병과, 장기 이식 연관 동맥경화증의 예방을 위해 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물은 염증성 병태 또는 자가면역성 질환의 치료, 예방 또는 진단, 특히 이의 치료에 사용하기에 특히 적합하다.
본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물은 자가면역성 질환 및 염증성 병태, 구체적으로 병인이 자가면역성 구성요소를 포함하는 염증성 병태, 예컨대 관절염(예를 들어 류머티즘성 관절염, 만성 진행성 관절염 및 변형 관절염) 및 류머티즘성 질환, 예컨대 골손실 연루 류머티즘성 질환 및 염증성 병태, 염증성 통증, 척추관절증, 예컨대 강직성 척추염, 레이터(Reiter) 증후근, 반응성 관절염, 건선성 관절염, 소아 특발성 관절염, 장병성 관절염, 부착부염, 과민증(기도 과민증 및 피부 과민증) 및 알레르기의 치료, 예방 또는 완화에 사용하기 적합하다. 본 발명의 항체가 사용될 수 있는 구체적인 자가면역성 질환으로는 자가면역성 혈액학적 장애(예컨대 용혈성 빈혈, 무력성 빈혈, 순적혈구 빈혈 및 특발성 혈소판감소증) 전신 홍반성 낭창(SLE), 낭창성 신염, 염증성 근질환(피부근염), 치주염, 다발연골염, 피부경화증, 베게너(Wegener) 육아종증, 피부근염, 만성 활동성 간염, 중증근무력증, 건선, 스티븐-존슨(Steven-Johnson) 증후군, 특발성 스프루, 자가면역 염증성장질환(예컨대 궤양성 장염, 크론병 및 과민성 장 증후군), 내분비 안병증, 그레이브스병(Graves' disease), 사르코이드증, 다발성 경화증, 전신 경화증, 섬유질환, 원발성 담즙간경변, 소아 당뇨병(I형 진성당뇨병, I형 당뇨병), 포도막염, 건성각결막염, 알레르기결막염, 간질성폐섬유증, 인공고관절주변 골융해, 사구체신염(신증후군 동반 및 미동반, 예컨대 특발성 신증후군 또는 최소 변화 신병증(minimal change nephropathy)), 종양의 또 다른 유형인 다발성 골수종, 피부 및 각막의 염증성 질환, 근염, 골 임플란트의 풀림(loosening), 대사 장애(에컨대 비만, 죽상경화증 및 기타 심혈관질환, 예컨대 확장성 심근병증, 심근염, II형 진성 당뇨병 및 이상지질혈증), 자가면역성 갑상선 질환(예컨대 하시모토(Hashimoto) 갑상선염), 중소혈관(small and medium vessel) 원발성 혈관염, 대혈관 혈관염, 예컨대 거대세포동맥염, 화농성한선염, 시신경척수염, 쇼그렌(Sjogren) 증후군, 베쳇(Behcet)병, 아토피성 및 접촉성 피부염, 기관지염, 염증성 근질환, 자가면역성 말초신경병증, 면역성 신장, 간 및 갑상선 질환, 염증 및 죽상혈전증, 자가염증성 열 증후군(autoinflammatory fever syndrome), 면역혈액학적 장애, 그리고 피부 및 점막의 수포성 질환을 포함한다. 해부학적으로 포도막염은 전 포도막염, 중간 포도막염, 후 포도막염 또는 범 포도막염일 수 있다. 이는 만성 또는 급성일 수 있다. 포도막염의 병인은 전신 질환과 연관된 자가면역성, 비 감염성, 감염성일 수 있거나, 또는 흰점 증후군일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물은 다발성 경화증, 건선, 천식, 전신 홍반성 낭창(SLE) 및 낭창성 신염의 치료에 사용하기 적합하다. 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 당뇨병, 구체적으로 I형 또는 II형 진성 당뇨병의 치료에 사용하기 적합하다.
"IL-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애"란 용어는 또한 염증과 연관된 암을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 항체는 암, 구체적으로 IL-17A 및/또는 TNFα 매개 암 치료에 사용하기 적합하다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 항체는 염증 연관 암의 치료에 사용하기 적합하다.
"암"이란 용어는 비정상 세포의 급속하고 제어가 불가능한 생장으로 특징지어지는 질환을 지칭한다. 암 세포는 국소적으로, 또는 혈류 및 림프계를 통해서 몸의 다른 부분으로 퍼져나갈 수 있다. 다양한 암의 예가 본원에 기술되어 있으며, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병 및 폐암 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. "종양" 및 "암"이란 용어는 본원에서 호환되어 사용되고 있는데, 예컨대 상기 두 용어는 고형 및 액체형, 예컨대 확산성(diffuse) 또는 순환성(circulating) 종양을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "암" 또는 "종양"이란 용어는 전악성뿐만 아니라, 악성인 암과 종양을 포함한다.
염증 연관 암의 비제한적 예로서는 위암, 결장직장암, 비소세포 폐암, 간세포 암종 및 선암중을 포함한다(Wu et al., 2014 Tumour Biol. 35(6):5347-56; Wu et al., 2012 PLoS One 7(12); Zhang et al. 2012 Asian Pac J Cancer Prev 13(8):3955-60; Liu et al., 201 1 Biochem Biophys Res Commun.407(2):348-54).
본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자도 또한 임의의 암, 예컨대 염증 연관 암, 예컨대 위암, 결장직장암, 비소세포 폐암, 간세포 암종 및 선암종의 진단 및/또는 예후에 사용하기 적합하다. 예를 들어 IL-17A는 비소세포 폐암 환자(Chen et al., 2010 Lung Cancer 69(3):348-54), 결장직장암종 및 간세포 암종 환자(Punt et al., 2015 Oncoimmunology, 4(2): e984547)에서 예후 및 낮은 생존률과 연관되어 있다.
그러므로 특정 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자는 암, 관절염, 류머티즘성 관절염, 골관절염, 반응성 관절염, 건선, 만성 폐색성 폐질환, 전신 홍반성 낭창(SLE), 낭창성 신염, 자가면역 염증성장질환, 천식, 다발성 경화증, 낭포성 섬유증, 골 손실, 기도 과민증, 탈수초 장애, 피부 과민증, 급성 이식편 거부, 동종이식편 거부, 이식편대숙주병, 전신 경화증, 비뇨기 염증 장애, 심혈관질환, 혈관염, 주기열, 당 대사 장애, 폐질환, 치주염, 간기질각화증, 알레르기, 염증성 통증, 척추관절증, 패혈증, 패혈성 또는 내독소 쇼크, 뇌수막염, 수술외상, 자가면역성 혈액학적 장애, 알츠하이머병, 사르코이드증, 간경변, 간염, 사구체신염 또는 이상지질혈증의 치료에 사용하기 적합하다.
일 양태에서, 본 발명은 의약품을 제조하는데 있어 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 IL-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애 또는 Gro-α 분비를 억제함으로써 치료될 수 있는 장애의 치료, 예방 또는 진단, 구체적으로 치료에 사용하기 위한 의약품을 제조하는데 있어 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 염증성 병태 또는 자가면역성 질환의 치료, 예방 또는 진단, 구체적으로 치료에 사용하기 위한 의약품을 제조하는데 있어 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명은 다발성 경화증, 건선, 천식, 전신 홍반성 낭창(SLE) 및 낭창성 신염의 치료, 예방 또는 진단, 구체적으로 치료에 사용하기 위한 의약품을 제조하는데 있어 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 I형 또는 II형 진성 당뇨병의 치료, 예방 또는 진단, 구체적으로 치료에 사용하기 위한 의약품을 제조하는데 있어 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 IL-17A 및/또는 TNFα 매개성 암, 구체적으로 염증 연관 암의 치료, 예방 또는 진단, 구체적으로 치료에 사용하기 위한 의약품을 제조하는데 있어 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물 치료적 유효량만큼을 대상체에 투여하는 것에 의해 특징지어지는, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 IL-17A 및/또는 TNFα에 의해 매개되는 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물을 투여하여, 해당 병태가 완화되도록 만드는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 염증성 병태 또는 자가면역성 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물 유효량만큼을 투여하여, 해당 병태가 완화되도록 만드는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 다발성 경화증, 건선, 천식, 전신 홍반성 낭창(SLE) 및 낭창성 신염을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물 유효량만큼을 투여하여, 해당 병태가 완화되도록 만드는 단계를 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 당뇨병, 구체적으로 I형 또는 II형 진성 당뇨병을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물 유효량만큼을 투여하여, 해당 병태가 완화되도록 만드는 단계를 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 암, 구체적으로 IL-17A 및/또는 TNFα 매개 암, 구체적으로 염증 연관 암을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물 유효량만큼을 투여하여, 해당 병태가 완화되도록 만드는 단계를 포함한다.
본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자, 또는 본 발명의 약학 조성물을 포함하는 키트도 또한 본 발명에 포함된다. 키트는 1개 이상의 다른 요소, 예컨대 사용 지침; 기타 시약, 예컨대 표지, 치료제, 또는 항체의 표지 또는 치료제에 대한 킬레이트화 또는 커플링에 유용한 제제, 또는 방사선 방호 조성물; 투여될 항체 분자를 제조하기 위한 기기 또는 기타 재료; 약학적으로 허용 가능한 담체; 그리고 대상체에의 투여를 위한 기기 또는 기타 재료를 포함할 수 있다. 특정의 구현예에서, 키트는 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자를 약학적 유효량만큼 포함한다. 추가의 구현예에서, 키트는 동결건조된 형태의 본 발명의 다중 특이적 항체, 본 발명의 항 IL-17A 항체, 또는 본 발명의 항 IL-17A 항체를 포함하는 또 다른 다중 특이적 분자 약학적 유효량만큼과, 희석제, 그리고 선택적으로는 사용 지침을 포함한다. 상기 키트는 재구성(reconstitution)을 위한 필터 바늘 및 주사를 위한 바늘을 추가로 포함할 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
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Figure pct00015
명확함을 구현하기 위해 별도의 구현예들의 내용에 기술된 본 발명의 임의의 특징들은 또한 하나의 구현예와 조합하여 제공될 수 있다. 거꾸로 말하면, 간략함을 도모하기 위하여 하나의 구현예의 내용에 기술된 본 발명의 다양한 특징은 또한 별도로 제공될 수 있거나 임의의 적합한 하위 조합을 통해 제공될 수 있다. 본 발명에 관한 구현예들의 모든 조합들은, 특히 본 발명에 포함되고, 마치 각각의 조합과 모든 조합들이 개별적으로나 명백하게 개시되어 있는 것처럼 본원에 개시되어 있다. 더욱이 다양한 구현예 및 이를 이루는 요소의 모든 하위 조합도 또한 본 발명에 의해 특별히 포함되고, 마치 각각의 하위 조합과 모든 하위 조합이 개별적으로나 명백하게 개시되어 있는 것처럼 본원에 개시되어 있다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예들이 이루는 범위에 제한되지 않을 것이다. 실제로 본원에 기술된 변형 이외의 본 발명의 다양한 변형은 전술된 발명의 설명을 통해 당 업자들에게 명료해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 특허 청구의 범위 안에 속하도록 의도된다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허출원, 간행물, 시험 방법, 문헌 및 기타 자료들은 각각의 특허법하에서 허용될 수 있는 정도로 본원에 참조로 인용되어 있다.
하기 실시예들은 전술된 본 발명을 설명하는 것이지, 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다. 당 업자에게 공지되어 있는, 보통 말하는 그런 시험 모델로서 기타의 것도 또한 청구된 발명의 유리한 효과를 확정할 수 있다.
실시예
실시예 1: 인간 IL-17A에 대해 유도된 토끼 항체의 생성
1.1 면역화
재조합에 의해 제조되어 정제된 IL-17A(Peprotech, Cat. No. 200-17)로 토끼를 면역화하였다. 면역화 도중에, 폴리클로날 혈청 항체와 그 항원의 검출 가능한 결합을 여전히 초래하는, 각각의 토끼 혈청에 대한 최대 희석률(적정률)을 확정함으로써 항원에 대한 체액성 면역 반응의 세기를 질적으로 평가하였다. 부동화한 항원(재조합 인간 IL-17A)에 대한 혈청 항체 적정률을, 효소연계면역흡착검정법(ELISA)을 이용하여 평가하였다.
IL-17A 자극이 있을 때 GRO-α를 분비하는 HT-29 세포를 이용한, 세포 기반 검정법을 이용하여 토끼 혈청이 IL-17A의 생물학적 활성을 억제하는 능력을 평가하였다. 96웰 평판의 웰당 HT-29 세포 50,000개를 접종한 다음, 50 ng/ml IL-17A로 자극하였다. IL-17A 면역화 토끼의 최종 채혈시료의 5배 연속 희석액을 대상으로, 이것이 IL-17A의 생물학적 기능을 중화시키는 역가에 대해 시험하였다. 혈청 5개 모두는 HT-29 세포에서의 GRO-α 분비를 억제하였다. 면역화한 동물의 비장으로부터 림프구를 단리하여, 후속 히트 동정 절차를 수행하였다.
1.2 항 IL-17A 항체의 동정
1.2.1 항 IL-17A 항체를 발현하는 B 세포의 단리
IL-17A 결합 B 세포를 동정하기 위해, IL-17A를 R-피코에리트린(RPE)으로 표지화하였다. 표지화한 IL-17A상 IL-17 수용체 A 결합 부위는 부피가 큰 RPE 표지에 의해 잠재적으로 차단될 수 있었으므로, 에피토프의 접근 가능성은 2개의 접근법에 의해 확인하였다. 첫 번째 검정에서, RPE 표지화 IL-17A와 세쿠키누맙 및 IL-17 수용체 A의 결합은 유세포분석법을 이용하여 분석하였다. 인간 IgG1의 Fc부에 융합시킨 IL-17 수용체 A 세포외 도메인 및 세쿠키누맙을 단백질 G 비드상에 포착시켰으며, RPE 표지화 IL-17A의 결합을 유세포분석법에 의해 확인하였다. 이로써 IL-17A와 세쿠키누맙 및 IL-17 수용체 A Fc 키메라의 결합이 확인되었던 반면에, 이때 무관한 IgG 또는 사이토카인 수용체와의 결합은 확인되지 않았다. 두 번째 접근법에서는, 표지화한 IL-17A의 생물학적 활성을 HT-29 검정에서 확인하였다. 도 1에 보인 바와 같이, RPE 표지화 IL-17A는 미표지화 IL-17A와 비교되었을 때 단지 약간만 감소한 생물학적 활성을 보였다[IL-17A 의존적 GRO-α 분비 유도에 대한 EC50은 1.5배 더 컸다]. 따라서, 표지화한 IL-17A가 분류 공정(sorting process)에 사용하기 적합함이 확인되었다.
1.2.2 IL-17A 결합 상청액의 스크리닝
스크리닝 단계 동안 얻어진 결과는, 항체 분비 세포(ASC)의 배양 상청액으로부터 유래한 미정제 항체가 사용되어 수행된 검정을 기반으로 한다. 고처리량 ELISA에서 ASC 상청액을 대상으로 재조합 인간 IL-17A와의 결합에 대해 스크리닝하였다. 세포 기반 HT-29 검정 및 경쟁 ELISA에서 IL-17A 표지화 상청액을 대상으로, 이것의 결합 역학 및 이것이 IL-17A의 생물학적 활성을 중화시키는 잠재성에 대해 추가로 특성규명하였다. IL-17A 결합 상청액을 대상으로, 이것이 사이노몰거스 원숭이 IL-17A와 결합하는지에 대해 ELISA에 의해 추가로 특성규명하였다.
1.2.2.1 IL-17A의 결합(ELISA에 의한 분석)
인간 IL-17A와 결합하는 항체를 생산하는 B 세포 클론을 동정하기 위해, B 세포 클론의 세포 배양 상청액을 대상으로, 인간 IL-17A에 대한 항체가 존재하는지 ELISA로 분석하였다. 이용한 ELISA 방법은 재조합 인간 IL-17A에 결합된 IgG 아형 항체의 "양"을 평가하는데 사용되었지만, 항체의 친화성이나 농도에 대한 그 어떠한 정보도 제공하지 못했다.
1.2.2.2 인간 IL-17A에 대한 친화성
1차 스크리닝중 양성인 것으로 분석된, 배양 상청액 유래 인간 IL-17A에 대한 모노클로날 토끼 항체의 결합 친화성을, MASS-1 SPR 기기(Sierra Sensors)를 사용하는 표면플라스몬공명법(SPR)에 의해 확정하였다. 친화성 스크리닝을 위해 토끼 IgG의 Fc 영역에 특이적인 항체를, 표준적 아민 결합 절차를 이용하여 센서칩(SPR-2 친화성 센서, High Capacity Amine, Sierra Sensors)상에 부동화하였다. 부동화한 항 토끼 IgG 항체에 의해 B 세포 상청액중 토끼 모노클로날 항체를 포착시켰다. 충분한 포착이 허용되기 위해서는 B 세포 상청액중 최소 IgG 농도가 요구되었다. 모노클로날 항체를 포착한 후, 인간 IL-17A를 유세포에 90 nM의 농도로 3분 동안 주입하였으며, 센서칩상에 포착되었던 IgG로부터의 단백질 해리가 진행되도록 5분 동안 허용하였다. 겉보기 해리 속도 상수(kd) 및 결합 속도 상수(ka), 그리고 겉보기 해리 평평 상수(KD)를 MASS-1 분석 소프트웨어(Analyzer, Sierra Sensors)로 산정하였다(1:1 랑뮈르(Langmuir) 결합 이용).
1.2.2.3 IL-17A의 중화(HT-29 검정 및 경쟁 ELISA에 의한 분석)
역가를 평가하기 위해 세포 기반 검정(HT-29 검정)뿐 아니라 수용체 리간드 경쟁-ELISA를 진행하였다.
IL-17A 자극이 이루어질 때 GRO-α를 분비하는 HT-29 세포가 사용되는 세포 기반 검정을 이용하여, B 세포 상청액중 항체가 IL-17A의 생물학적 활성을 억제하는 능력을 평가하였다. 96웰 평판의 웰당 HT-29 세포 50,000개를 접종한 다음, 5 ng/ml IL-17A로 자극하였다. 최종 농도 50%인 B 세포 상청액을 대상으로 이것이 IL-17A의 생물학적 기능을 중화시키는 역가를 분석하였다.
경쟁적 ELISA에 의해 hIL-17RA와 hIL-17A의 결합 억제를 평가하였다. hIL-17RA를 ELISA 평판상에 4 μg/ml의 농도로 코팅하였다. 바이오틴화 hIL-17A(20 ng/ml)를 B 세포 상청액(95%)과 함께 1시간 동안 예비 항온처리하였으며, 그 다음 혼합물을 ELISA 평판에 첨가하여, hIL-17RA와 결합하도록 1.5 시간 동안 허용하였다. 이후 바이오틴화 IL-17A에 사용한 스트렙타비딘-HRP를 스트렙타비딘-HRP에 의해 검출하였다.
1.2.2.4 종간 교차 반응성(사이노몰거스 원숭이 IL-17A와의 결합, SPR에 의한 분석)
선택한 히트(hit)를 대상으로 사이노몰거스 원숭이 IL-17A에 대한 종간 교차 반응성에 대하여 SPR에 의해 분석하였다. 인간 IL-17A에 대한 결합 친화성을, 인간 IL-17A 대신 90 nM 사이노몰거스 원숭이 IL-17A를 사용하였다는 점을 제외하고 섹션 1.2.2.2에 기재된 바와 유사하게 MASS-1 SPR 기기(Sierra Sensors)를 이용한 표면플라스몬공명법(SPR)으로 확정하였다.
1.2.2.5 IL-17F 결합(ELISA에 의한 분석)
항 IL-17A scFv의 특이성을 확인하기 위해, 최고의 성능을 보이는 인간화 scFv와 IL-17 과 일원들 모두(IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17F 및 IL-17E)의 결합을 평가하였다. IL-17F는 IL-17A에 대해 가장 큰 동일성을 보였으므로(47%, 표 2 참조), 분류한 상청액을 대상으로 IL-17F와의 결합에 대하여 ELISA로 스크리닝하였다. 2 μg/ml 세쿠키누맙으로 얻어진 신호를 기준으로 결합을 정량하였다.
Figure pct00016
1.3 기능에 관한 특성규명
히트 확인 분석을 위해, B 세포 상청액중 모노클로날 항체의 약리학적 특성을 기반으로 다수의 클론을 선택하였다. B 세포 상청액중 선택한 클론의 모노클로날 항체에 대한 약리학적 특성을 표 3에 제시하였다.
1.3.1 IL-17A 결합 역학(SPR에 의한 분석)
정제한 모노클로날 토끼 항체 다수의, 인간 IL-17A에 대한 결합 역학을 SPR(MASS-1) 측정에 의해 확정하였다. 카복시메틸화 덱스트란 표면(SPR-2 친화성 센서, High Capacity Amine, Sierra Sensors)과 결합시킨 항 토끼 IgG(Bethyl Laboratories, Cat. No. A120-111A)를 통해 각각의 IgG를 포착시켰으며, IL-17A 용량 반응을 측정하여, 역학 매개변수의 정확한 피팅(fitting)이 허용되도록 만들었다. 모노클로날 항체의 포착후 인간 IL-17A(Peprotech, Cat. No. 200-17)를 유세포에 3분 동안 주입한 다음, 센서칩상에 포착시킨 IgG로부터의 단백질 해리가 5분 동안 진행되도록 허용하였다. 매 주입 주기후 10 mM 글리신-HCl을 2회 주입하여 표면을 재생시켰다. 겉보기 해리 속도 상수(kd) 및 겉보기 결합 속도 상수(ka), 그리고 겉보기 해리 평형 상수(KD)를, 1:1 랑뮈르 결합 모델을 이용하여 MASS-1 분석 소프트웨어(Analyzer, Sierra Sensors)로 산정하였으며, 피팅의 품질은 상대적 Chi2(즉 피분석물의 외삽된 최고 결합 수준에 대해 정규화된 Chi2)를 기반으로 모니터링하였는데, 여기서 상대적 Chi2는 곡선 피팅의 품질에 대한 척도이다.
모든 항체의 경우, 서브피코몰의(sub-picomolar) 친화성까지 떨어진 범위(2.87 x 10-10 ~ 1.51 x 10-13 M 이하)의 KD 값으로 인간 IL-17A에 대해 고 친화성 결합이 이루어짐을 확인하였다. 선택한 클론 27-07-G02의 모노클로날 항체는 SPR에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 1.88 pM이었고, 온 속도(on-rate)에 대한 ka는 2.44 x 106 M-1s-1이었으며, 오프 속도(off-rate)에 대한 kd는 4.58 x 10-6 s-1였다(표 3 참조). 선택한 클론 27-31-C04의 모노클로날 항체는 SPR에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 0.5 pM이었고, 온 속도에 대한 ka는 1.99 x 106 M-1s-1이었으며, 오프 속도에 대한 kd는 1 x 10-6 s-1였다(표 3 참조).
1.3.2 사이노몰거스 원숭이 IL-17A에 대한 교차 반응성(SPR에 의한 분석)
전술한 바와 유사하게, 사이노몰거스 원숭이 IL-17A에 대한 종간 교차 반응성을, 선택한 정제 모노클로날 토끼 항체에 대해 SPR(Mass-1) 측정으로 확정하였다. Trenzyme사 자체 주문 제작 사이노몰거스 원숭이 IL-17A를 검정에 사용하였다. SPR에 의해 측정된 바에 따르면, 선택한 클론 27-07-G02의 모노클로날 항체는 해리 상수(KD) 0.6 pM, 온 속도에 대한 ka 1.24 x 106 M-1s-1, 그리고 오프 속도에 대한 kd 7.72 x 10-6 s-1였다(표 3 참조). SPR에 의해 측정된 바에 따르면 KD사이노IL-17A 및 KD인간IL-17A의 비율은 0.3인 것으로 확정되었다(표 3 참조). SPR에 의해 측정된 바에 따르면, 선택한 클론 27-31-C04의 모노클로날 항체는 해리 상수(KD) 25 pM 미만, 온 속도에 대한 ka 1.69 x 106 M-1s-1, 그리고 오프 속도에 대한 kd 4.22 x 10-5 s-1였다(표 3 참조). SPR에 의해 측정된 바에 따르면 KD사이노IL-17A 및 KD인간IL-17A의 비율은 5를 초과하는 것으로 확정되었다(표 3 참조).
1.3.3 인간 IL-17A의 중화(HT-29 검정에 의한 분석)
정제 토끼 모노클로날 항체가, 인간 결장 암종 세포주 HT-29의 IL-17A 유도 GRO-α 분비에 미치는 영향을 관찰하였다. 항체 모두의 연속 희석액을 대상으로 IL-17A 유도 GRO-α 분비를 중화시키는 역가(IC50)(상업적 ELISA에 의해 정량됨)를 분석하였으며, 이를 세쿠키누맙의 역가와 비교하였다. 4 매개변수 로지스틱 곡선 피팅을 이용하여 데이터를 분석하였으며, GRO-α 분비를 50%로 감소시키는데 필요한 IL-17A 억제제의 몰 농도(IC50)를 억제 곡선으로부터 유추하였다. 상이한 검정 평판으로부터 직접 구한 IC50 값들을 서로 간에 거의 동일하게 만들기 위해, 각각의 평판에 대한 각각의 IC50 값을, 각각의 평판마다 구한 참조기준 분자 세쿠키누맙의 IC50 값에 대해 교정하였다(상대적 IC50: IC50, 세쿠키누맙/IC50, 시험대상 항체). 상대적 IC50 값들을 세쿠키누맙과 scFv의 질량 단위(ng/ml)로 산정하였다.
중화 검정은 오로지 표적 차단 항체가 자체의 표적과, 역가 검정에 적용된 표적 농도보다 더 큰 평형 결합 상수(KD)(표적 농도를 초과하는 KD)로 결합할 때에만 표적 차단 항체의 역가들을 식별할 수 있었다. HT-29 검정을 위해서, IL-17A 농도 20 ng/ml(= 645 pM)가 적용되었다. 따라서, 이론상 HT-29 검정은 645 pM을 초과하는 KD로 IgG들간 역가를 구별할 수 있다. 분석한 IgG 모두는 645 pM 이하의 KD 값을 보였으므로, 상이한 친화성을 가지는(하지만 작용 기작은 유사한) IgG들간 역가는 이것으로 구별할 수 없었다. 그러므로 HT-29 검정은 역가를 더 잘 해석하기 위해 50 pg/ml의 TNFα를 포함하도록 추가로 발전시켰다. 이 사이토카인은 IL-17A와 함께 상승적으로 작용하여 GRO-α 분비를 유도하였고, 그 결과 TNFα 존재시 IL-17A 농도는 1 ng/ml(= 32 pM)로 감소할 수 있었다.
선택한 클론 27-07-G02는 50배를 초과하는 역가를 보였다(표 3 및 도 2 참조). 더욱 구체적으로 HT-29 검정에서 확정되는 바에 따르면 클론 27-07-G02는, 세쿠키누맙이 IL-17A를 중화시키는 역가를 기준으로 하는, IL-17A를 중화시키는 역가를 가지는 것으로 보였는데(상대적 역가; IC50에 대해서는 75, 그리고 IC90에 대해서는 48), 단 상기 상대적 역가는 HT-29 검정에서 세쿠키누맙의 IC50 값 또는 IC90 값(ng/mL) 대 HT-29 검정에서 클론 27-07-G02의 모노클로날 항체의 IC50 값 또는 IC90 값(ng/mL)의 비이다(표 3 및 도 2 참조).
선택한 클론 27-31-C04는 세쿠키누맙 역가의 100배를 초과하는 역가를 보였다(표 3 및 도 2 참조). 더욱 구체적으로, HT-29 검정에서 확정되는 바에 따르면 선택한 클론 27-31-C04는, 세쿠키누맙이 IL-17A를 중화시키는 역가를 기준으로 하는, IL-17A를 중화시키는 역가를 가지는 것으로 보였는데(상대적 역가; IC50에 대해서는 287, 그리고 IC90에 대해서는 704), 단 상기 상대적 역가는 HT-29 검정에서 세쿠키누맙의 IC50 값 또는 IC90 값(ng/mL) 대 HT-29 검정에서 클론 27-07-C04의 모노클로날 항체의 IC50 값 또는 IC90 값(ng/mL)의 비이다(표 3 및 도 2 참조).
1.3.4 인간 IL-17A/IL-17RA 상호작용의 차단(경쟁적 ELISA에 의한 분석)
경쟁적 ELISA에 의해 hIL-17RA와 hIL-17A의 결합 억제를 평가하였다. 4℃에서 4 μg/ml IL-17RA(Sino Biological Cat. No. 10895-H08H)를 함유하는 PBS 50 μl를 첨가하여 ELISA 평판에 hIL-17RA를 코팅하였다. 바이오틴화한 hIL-17A를 토끼 모노클로날 항체와 함께 1시간 동안 예비 항온처리한 다음, 이 혼합물을 ELISA 평판에 첨가하여 1.5시간 동안 hIL-17RA와의 결합을 허용하였다. 그 다음, 바이오틴화한 IL-17A를 검출하는데 사용하였던 10 ng/ml의 스트렙타비딘-폴리HRP40(SDT Cat. No. SP40C) 50 μl를 첨가한 후, 이 평판을 1시간 동안 항온처리하였다. 마지막으로 테트라메틸벤지딘 용액(KPL, Cat. No. 53-00-00)을 첨가하여 평판을 5분 ~ 10분 동안 전개시키고 나서, 1 M HCl로 반응을 중지시켰다. 450 nm 및 570 nm 파장(참조기준 파장)에서 미세적정 평판 판독기(Infinity reader M200 Pro, Tecan)를 사용하여 평판을 판독하였다.
선택한 토끼 IgG에 대해 구한 용량-반응 곡선을 도 3에 제시하였다. 참조기준 세쿠키누맙의 IC50 값과 IC90 값에 비한 IC50 값과 IC90 값을 표 3에 요약하여 두었다. 이전 섹션에서 언급한 바와 같이, 중화 검정은 오로지 표적 차단 항체가 자체의 표적과, 역가 검정에 적용된 표적 농도보다 더 큰 평형 결합 상수(KD)(표적 농도를 초과하는 KD)로 결합할 때에만 표적 차단 항체의 역가들을 식별할 수 있었다. HT-29 검정을 위해서는 IL-17A 농도 32 pM이 적용되었던 반면에, IL-17A/IL-17RA 억제 ELISA에서는 IL-17A 농도 193 pM이 적용되었다. 따라서, 이론상 HT-29 검정은 32 pM을 초과하는 KD로 IgG들간 역가를 구별할 수 있는 반면에, 억제 ELISA는 오로지 193 pM을 초과하는 KD로 IgG들간 역가를 구별할 수 있을 뿐이다. HT-29 검정에서처럼 클론 27-07-G02 및 클론 27-31-C04는 세쿠키누맙의 역가보다 더 큰 역가를 보였다. 클론 27-07-G02는 ELISA 검정에서 확정된 바에 따르면, 세쿠키누맙이 IL-17A/IL-17RA 상호작용을 차단하는 역가를 기준으로 한, IL-17A/IL-17RA 상호작용을 차단하는 역가를 가지는 것으로 보였는데(상대적 역가; IC50에 대해서는 5, 그리고 IC90에 대해서는 14), 단 상기 상대적 역가는 ELISA 검정에서 세쿠키누맙의 IC50 값 또는 IC90 값(ng/mL) 대 ELISA 검정에서 클론 27-07-G02의 모노클로날 항체의 IC50 값 또는 IC90 값(ng/mL)의 비이다. 마찬가지로 클론 27-31-C04은 ELISA 검정에서 확정된 바에 따르면, 세쿠키누맙이 IL-17A/IL-17RA 상호작용을 차단하는 역가를 기준으로 한, IL-17A/IL-17RA 상호작용을 차단하는 역가를 가지는 것으로 보였다(상대적 역가; IC50에 대해서는 8, 그리고 IC90에 대해서는 21)(표 3 참조).
1.3.5 사이노몰거스 원숭이 IL-17A에 대한 교차 반응성(HT-29 검정에 의한 분석)
96웰 평판의 웰당 HT-29 세포 50,000개를 도말하였다. 토끼 모노클로날 항체와 내부 참조기준인 세쿠키누맙의 연속 희석액에 더하여, 인간 TNFα(50 pg/ml)의 예비 희석액과, 인간 또는 사이노몰거스 원숭이 IL-17A(1 ng/ml)의 예비 희석액 각각을 HT-29 세포에 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 항온처리한 후, 상청액을 수집하여 GRO-α(CXCL1 케모카인) 분비를 ELISA로 정량하였다. 사이노몰거스 IL-17A로 구한 IC50 값들을 서로간에 거의 동일하게 만들기 위하여, 각각의 평판에 대한 각각의 IC50 값들을, 각각의 평판마다 취한 인간 IL-17A로 직접 구한 IC50 값에 대해 교정하였다 (상대적 IC50: IC50, 사이노몰거스 IL-17A/IC50, 인간 IL-17A). 선택한 클론의 역가를 표 3에 제시하여 두었다. 클론 27-07-G02의 경우 사이노몰거스 IL-17A 유도 GRO-α 분비를 중화시키는 역가(IC50)는 0.64 ng/ml인 것으로 확정되었으며, 클론 27-31-C04의 경우 사이노몰거스 IL-17A 유도 GRO-α 분비에 대한 역가(IC50)는 0.49 ng/ml인 것으로 확정되었다(표 3 참조).
Figure pct00017
Figure pct00018
1.3.6 IL-17A에 대한 선택성 대 IL-17F에 대한 선택성
표적 특이적 결합을 보장하기 위해 IL-17 이외 기타 IL-17 과 일원들과 IgG의 결합 특이성에 비한 IL-17A와 IgG의 결합 특이성을 확정하였다. 항 IL-17A IgG와 IL-17F의 결합을 확정하기 위해, 평판을 IL-17A 또는 IL-17F(Peprotech Cat. No. 200-25)로 코팅한채 직접 ELISA를 진행시키고 나서, (대조군인 세쿠키누맙을 포함하여) 재조합 항 IL-17A IgG 10 μg/ml와 함께 항온처리하였다. IL-17F와의 결합에 대한 OD(450 nm ~ 690 nm)를, a) IL-17A와의 결합에 대한 OD(450 nm ~ 690nm)와, b) 세쿠키누맙의 결합에 대한 OD(450 nm ~ 690nm) 각각을 기준으로 산정하였다. 데이터는 표 4에 요약하였다.
실시예 2: scFv의 인간화 및 제조
2.1 인간화 scFv 항체의 제조
히트 확인을 통해 구한 데이터를 기반으로, 클론 27-07-G02 및 27-31-C04를 인간화를 위해 선택하였다. 선택한 클론의 인간화는 WO 2014/206561에 기재된 바와 같이 토끼 CDR을 Vκ1-λ캡/VH3 유형의 scFv 수여 틀에 전달하는 것을 포함하였다. 이 과정에서 6개의 CDR 영역의 아미노산 서열을 공여 서열(토끼 mAb)에서 동정한 다음, 수여 스캐폴드 서열에 이식함으로써, "CDR 이식편"이라 칭하여지는 구조체를 만들었다(A1 서열 번호 24; 및 PRO571 서열 번호 61 각각 참조). 게다가 클론 27-07-G02 및 클론 27-31-C04 둘 다에 대하여 제2 이식편을 디자인하였는데(A2 서열 번호 25; 및 PRO592 서열 번호 62 각각), 이 이식편은, CDR 위치선정(positioning)에 잠재적으로 영향을 미치고, 그에 따라 항원 결합 및/또는 안정성에도 영향을 미치는 것으로 기재된(Borras et al., 2010; J. Biol. Chem., 285:9054-9066), 임의의 틀 위치내에 토끼 공여개체에서의 추가 아미노산 변형을 포함하였다. 이 인간화 구조체를 "구조적(STR) 이식편"이라 칭하였다. 뿐 아니라, 클론 27-07-G02의 경우, 4개의 돌연변이, 즉 가변 경쇄상 A51P와, 가변 중쇄상 Q14K, G16E 및 G56A(AHo 번호매김에 따름)를 구조 기반 이식편(A2 서열 번호 25)에 도입하여 친화성을 개선하였다. 클론 27-31-C04의 경우에는 2개의 돌연변이, 즉 R20T 및 Q141P(AHo 번호매김에 따름)를 구조 기반 이식편(PRO592 서열 번호 62)의 가변 중쇄에 도입하여 친화성을 개선하였다.
이들 구조체에 대한 특성규명 데이터 비교가 STR 구조체의 유의미한 이점을 규명하였을 경우, CDR 이식 VL과 STR 이식 VH를 조합한 추가 변이체가 디자인될 수 있다. 이 조합은, 종종 STR 이식편의 활성을 보유하기 충분한 것으로 판명되었으며(Borras et al. JBC. 2010;285:9054-9066), 인간 수여 스캐폴드내 소수의 비 인간 변경이 안정성 손상 위험뿐 아니라 면역원성 발현 잠재성도 감소시키므로 일반적으로 바람직할 것이다.
2.2 인간화 scFv의 제조
일단 컴퓨터 시뮬레이션과 같은 가상 환경에서의 구조체 디자인이 종료되면, 대응하는 유전자를 합성하여, 세균 발현 벡터를 구성하였다. 발현 구조체의 서열을 DNA 수준에서 확인하였으며, 일반적인 발현 및 정제 프로토콜에 따라 구조체를 제조하였다.
소규모(55 mL)로 밤새 유도된 발현에 의해 단백질 이종 발현(불용성 봉입체(insoluble inclusion body))을 이.콜라이(E.coli) 내에서 수행하였다. 균질화한 세포 펠릿으로부터 원심분리 프로토콜(세포 파편과 기타 숙주 세포 불순물을 제거하기 위한 수 회의 세척 단계를 포함)에 의해 봉입체를 단리하였다. 정제한 봉입체를 변성 완충제(100 mM Tris/HCl pH 8.0, 6 M Gdn-HCl, 2 mM EDTA)에 용해한 다음, scFv를, 확장이나 축소를 하여도 난조가 생기지 않는 리폴딩 프로토콜에 의해 다시 폴딩하여, 원래대로 폴딩된 단량체 scFv를 밀리그램 단위의 양만큼 제조하였다. 이 시점에서, 표준화한 프로토콜을 사용하여 scFv를 정제하였다. 리폴딩후 생성물을 친화성 크로마토그래피에 의해 포착시켜 정제 scFv를 만들었다. 또한, 이하 단락들에 기재된 약동학적 특성규명 종료후 더욱 광범위한 안정성 평가에 돌입할 분자의 선택을 뒷받침하기 위해, 시차주사형광측정법(DSF)에 의한 측정으로 scFv의 용융 온도를 확정하였다. 선택한 분자의 DSF 측정은 이하 2.4.2 단락에 더 상세히 기술하였다.
2.3 인간화 scFv의 기능 특성규명
이하에서는 히트 확인 단계용으로 기재된 검정 시스템과 동일하되, 단 scFv 분자의 상이한 포맷에 부응하여 임의의 변경이 가하여진 검정 시스템을 이용하여 인간화 scFv를 대상으로 1차 약동학적 특성에 대해 특성규명을 수행하였다.
2.3.1 인간 IL-17A 및 사이노몰거스 원숭이 IL-17A에 대한 친화성
인간 IL-17A뿐 아니라, 사이노몰거스 원숭이(마카카 파스큘라리스) IL-17A에 대한 인간화 scFv의 친화성을, T200 기기(Biacore, GE Healthcare)상에서의 SPR 분석에 의해 확인하였다. 이 실험에서는 바이오틴화한 인간 IL-17A를 Biotin-CAPture 키트(Biacore사)를 사용하여 포착하였다("포착 환경"). 각각의 피분석물 주입 주기를 거친 후, CAP 센서칩을 재생하여 새 항원을 포착시켰다. 용량 반응 다회 주기 역학 검정을 이용하여 scFv를 피분석물로서 주입하였다(단 이 때 피분석물의 농도는 전개 완충제중 희석하여 0.35 nM ~ 90 nM의 범위임). 얻어진 센서그램을, 1:1 결합 모델을 이용하여 피팅하였다. 또한, 대안적 SPR 검정 환경("직접 환경")에서 scFv를 분석하였다. 아민-결합에 의해 IL-17A를 CM5 센서칩(GE Healthcare)상에 부동화하였다. scFv 연속 희석액(농도 범위 0.35 nM ~ 90 nM)을 부동화한 IL-17A에 주입하였다. 직접 환경을 적용하였을 때, 시험 대상 scFv와의 친화성은 포착 환경에서에 비하여 2배 ~ 50배 이상 더 컸다. 포착 환경이 이용되었을 때 친화성이 더 작았던 것은 scFv와의 결합을 바이오틴이 방해하였기때문이었다.
사이노몰거스 IL-17A에 대한 교차 반응성을, 인간 IL-17A와의 결합을 측정하기 위해 사용한 검정과 유사한 검정에서 Trenzyme에 의해 제조한 IL-17A로써 측정하였다.
SPR 포착 환경에서 측정한 바에 따르면, scFv인 A1(CDR) 및 A2(STR)는 각각 2.5 x 10-10 M 및 3 x 10-9 M의 친화성으로 인간 IL-17A와 결합하였다(표 5). 직접 SPR 환경에서 scFv인 A1(CDR) 및 A2(STR)는 각각 1.4 x 10-10 및 5.5 x 10-11 M의 친화성으로 인간 IL-17A와 결합하였다(표 5). scFv인 A1(CDR) 및 A2(STR)는 각각 9 x 10-10 및 5 x 10-9 M의 친화성으로 사이노몰거스 IL-17A와 결합하였다(표 5).
SPR 포착 환경에서 측정한 바에 따르면, scFv PRO571(CDR) 및 PRO592(STR)는 각각 1.2 x 10-10 M 및 3.7 x 10-10 M의 친화성으로 인간 IL-17A와 결합하였다(표 5). 직접 SPR 환경에서 scFv PRO571(CDR) 및 PRO592(STR)는 각각 4 x 10-11 M 및 3.8 x 10-11 M의 친화성으로 인간 IL-17A와 결합하였다(표 5). scFv PRO571(CDR) 및 PRO592(STR)는 각각 3.3 x 10-11 M 및 1.6 x 10-10 M의 친화성으로 사이노몰거스 IL-17A와 결합하였다(표 5).
2.3.2 HT-29 검정(인간 IL-17A의 중화)
인간화 scFv가 인간 결장 암종 세포주 HT-29의 IL-17A 유도 GRO-α 분비를 억제하는 능력을 HT29 검정으로 시험하였다. 상기 섹션 1.3.3 및 1.3.5에 기재된 바와 같이, IL-17A에 더해 TNFα를 첨가하여 검정의 감수성을 증가시켰다. HT-29 세포 50,000개를 96웰 평판의 각각의 웰에 도말하였다. 연속 희석한 scFv뿐 아니라 내부 참조기준인 세쿠키누맙에 더해 인간 TNFα(50 pg/ml) 및 인간 IL-17A(1 ng/ml)의 예비 희석액을 HT-29 세포에 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 24시간동안 항온처리한 후 상청액을 수집한 다음, ELISA에 의해 GRO-α(CXCL1 케모카인) 분비를 정량하였다.
인간화 scFvs A1, PRO571 및 PRO592에 대한 억제 곡선을 도 4에 보였다. 모든 역가 데이터를 표 5와 표 6에 요약하였다. 각각의 분자에 대해 보고된 상대적 IC50 값을 참조기준 항체 세쿠키누맙에 대해 교정하여, 상이한 검정 평판의 IC50 값들에 대한 직접 비교를 수행할 수 있었다. 상대적 IC50 값을, 세쿠키누맙 및 scFv의 질량 단위(ng/ml)로 산정하였다.
클론 27-07-G02, A1 및 A2 유래 인간화 scFv뿐 아니라, 클론 27-31-C04, PRO571 및 PRO592 유래 인간화 scFv는 IL-17A 유도 GRO-α 분비를 세쿠키누맙 IC50보다 더 낮은 IC50으로 억제하였으며(표 5 및 표 6 참조), 세쿠키누맙의 역가와 비교되었을 때 100배 이상 더 큰 역가를 보였다(표 5 및 표 6 참조).
Figure pct00019
Figure pct00020
2.3.3 경쟁적 ELISA(hIL-17A와 hIL-17RA의 결합 억제)
HT-29 검정에 더하여, 섹션 1.3.4에 기재된 절차와 동일한 절차의 ELISA로써 각각의 인간화 scFv가 인간 IL-17A 및 인간 IL-17RA 사이의 상호작용을 억제히는 역가를 평가하였다. HT-29 검정과 바찬가지로 각각의 평판에서의 각각의 IC50 값을, 참조기준 분자인 세쿠키누맙의 각각의 평판에 대해 취한 IC50 값 및 상대적 IC50 (상대적 IC50 = IC50, 세쿠키누맙/IC50, 시험 항체)에 대하여 교정하였다(표 5 및 표 7). 이 검정에서는 6 ng/ml의 IL-17A가 제공되었는데, 이는 곧 본 검정은 KD가 193 pM을 초과하는 IgG들 사이의 역가를 오로지 분석할 수만 있음을 의미한다. A1, A2, PRO571 및 PRO592에 대한 억제 곡선을 도5에 보였으며, 그 역가들은 표 5 및 표 7에 요약하였다.
Figure pct00021
2.3.4 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F에 대한 선택성(경쟁 ELISA에 의한 분석)
각각의 scFv와 IL-17A의 결합의 잠재성과 비교되는, 각각의 scFv와 IL-17A의 결합을 최대치의 절반만큼 억제할 IL-17B ~ IL-17F의 상대적 잠재성을 경쟁 ELISA에 의해 평가하였다. 바이오틴화 IL-17A와 scFv의 상호작용을 미표지화 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F가 억제할 잠재성을 경쟁 ELISA에 의해 분석하였다. 이를 위해 scFv를 96웰 ELISA 평판상에 코팅하였다. 연속 희석한 IL-17A, 또는 IL-17B ~ IL-17F가 존재할 때 코팅한 scFv와, 바이오틴화된 IL-17A의 결합을, HRP에 접합한 바이오틴 결합 스트렙타비딘을 사용하여 검출하였다. 4 매개변수 로지스틱 곡선 피팅을 이용하여 IL-17A 데이터가 표시된 용량 반응 곡선을 분석하였으며, 바이오틴화한 IL-17A와, 코팅한 scFv의 상호작용을 50% 차단하는데 필요한 IL-17A 농도(EC50)를 산정하였다. IL-17B ~ IL-17F는 바이오틴화 TNF 및 scFv간 상호작용에 대해 그 어떠한 유의미한 억제도 보이지 않았다(도 6 참조). 각각의 scFv와 IL-17A의 결합 잠재성과 비교되는, 각각의 scFv와 IL-17A의 결합을 억제할 IL-17 과 일원들의 상대적 잠재성을 정량하기 위해, IL-17 과 일원들이 이 상호작용을 억제할 때의 EC50을 IL-17A가 이 상호작용을 억제할 때의 EC50과 비교하였다. IL-17A 이외의 IL-17 일원들이 IL-17A의 EC50보다 약 100배 ~ 약 40,000배 더 높은 농도로 사용되었을 때 유의미한 억제가 관찰되지 않았던 것으로 보아, 이 IL-17 과 일원들과의 결합에 대한 선택성에 비해, IL-17A와의 결합에 대한 선택성은 100배 ~ 40,000배 유의미하게 더 큰 것으로 확인되었다.
A1, PRO571 및 PRO592에 대하여 도 6에 보인 바와 같이, 그리고 표 8에 요약한 바와 같이, 바이오틴화 IL-17A와, scFv인 A1, PRO571 및 PRO592간 상호작용은 미표지화 IL-17A에 의해 차단되었던 반면, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F는 시험대상 사이토카인이 최고 농도(20 μg/ml ~ 500 μg/ml)일 때조차 그 어떠한 유의미한 효과도 보이지 않았다. 그러므로 A1, PRO571 및 PRO592는 IL-17A와 특이적으로 결합하지만, 이 IL-17A와 가장 가까운 상동체인 IL-17B ~ IL-17F와는 그렇지 않다. 따라서 본원에 기재된 scFv의 표적을 벗어난 결합은 거의 일어날 것 같지 않다.
2.4 인간화 sFv의 생물물리학적 특성규명
2.4.1 안정성 재료의 제조
전술된 바(섹션 2.2 참조)와 동일한 제조 공정을 이용하여 scFv를 더 큰 규모(발현 부피 1.2 L ~ 2.4 L)로 다시 제조하였다. 추가로, 정제후 원심분리 농축 튜브를 이용하여 단백질 시료를 10 mg/mL를 초과하도록 농축하였다. 안정성 평가를 위한 재료의 대규모 제조를 표 9에 편집하여 제시하였다. 모든 분자는 충분한 양과 순도(단량체 95% 초과)로 제조할 수 있었다.
상이한 통보점(reporting point)에 의해 scFv 구조체의 생산성에 대한 특성규명을 진행하였다(표 9). 생산성 기준은, 선택한 scFv 실체가, 발현되어 리폴딩된 다음 충분한 양으로 정제됨으로써, 본보기 분자(lead molecule)의 후속 개발을 지지할 수 있도록 보장하여야 한다. 규정기준은 발효 브로스 1 리터당 scFv 발현 수득량(SDS-PAGE에 의하여 평가) 및 일반적인 실험실 규모의 공정에서 달성한 정제 수득량(UV 분광분석법에 의해 정제 단백질 양을 측정함으로써 평가한 후 다시 리폴딩 용액 1 리터에 대해 산정)이었다.
원심분리에 의해 세포를 수득한 후 미정제 이.콜라이 용해물 수준에 대하여 발현 적정률을 확정하였다. 수득중 세포의 소량 손실이 예상되었지만, 이 요소는 생산성의 더 보존적인 추산을 위하여 발현 수득량 산정시 무시하였다. 용해물중 scFv 생산물의 정량을 위해 쿠마시 염색 환원 SDS-PAGE를 선택하였는데, 그 이유는 본 방법의 특이성이 시료중 숙주 세포 단백질과 생산물의 구별을 허용할 정도로 컸기 때문이다.
생산성을 평가하기 위한 두 번째 기준은, 리폴딩 용액 1 리터당 산정한 scFv의 정제 수득량이었다. 이 매개변수는 단백질 리폴딩 단계를 포함하는 예상 제조 공정에서의 잠재적 병목현상을 다룬다. 리폴딩 절차의 효율은 거의 동일한 제조 공정에서 제한적인 것으로 판명되었으므로, 상이한 구조체들의 성능은, 규정된 리폴딩 부피에 대해 정규화한 생산성에 관하여 비교될 수 있었다. 수득량 산정을 위해, 각각의 회분에서 취한 최종 단백질 시료를 UV 흡광도로 정량한 다음, 각각의 정제의 실제 리폴딩 부피로 나누었다.
Figure pct00022
2.4.2 열 언폴딩
scFv 구조체 A1, PRO571 및 PRO592의 DSF 측정으로 작성한 열 언폴딩 곡선을 도 7에 제시하였다. DSF 측정을 위해 소규모 발현으로 제조한 재료를 사용하였다. pH 6.4의 50 mM 인산염-시트르산염 완충제중 시료를 제조하였다(총 부피 100 μl, 5x SYPRO® 오렌지 최종 농도 및 최종 단백질 농도 50 μg/mL). 제조한 시료 25 마이크로리터만큼을 백색 벽으로 둘린 AB 유전자 PCR 평판에 3회 첨가하였다. 본 검정을 qPCR 기기(열 순환기로서 사용)에서 수행하였으며, 소프트웨어 주문제작 염료 교정 루틴을 이용하여 형광 발광도를 검출하였다. 시험 시료를 함유하는 PCR 평판 온도는 1℃씩 승온하여 25℃ → 96℃로 상승하고, 매 승온시마다 30초씩 휴지기를 두었다. 총 검정 시간은 약 2시간이었다. 산술적 2차도함수법을 이용하는 소프트웨어 GraphPad Prism으로 Tm을 산정하여, 곡선의 변곡점을 산정하였다. 오차 막대로 보인 바와 같이, 측정은 매번 2회씩 또는 3회씩 수행하였다. 구한 Tm 값은 데이터를 볼츠만 방정식에 피팅함으로써 확정하였다.
Figure pct00023
도 7은, 데이터를 볼츠만 방정식에 피팅함으로써 Tm을 산정하기 위해 사용된 용융 곡선으로서, 선택한 도메인의 용융 곡선을 보여주는 것이다. 표 10에 A1, PRO571 및 PRO592의 SE-HPLC에 의해 측정한 순도와 용융온도 추정치를 요약하였다.
Figure pct00024
2.4.3 보관 안정성 연구
scFv인 A1, PRO571 및 PRO592를 대상으로 추가의 안정성 연구, 예컨대 4주 안정성 연구(즉 scFv를 수성 완충제에 10 mg/ml로 제제화한 다음, -65℃ 미만, 4℃ 및 37℃에 4주 동안 보관함)를 수행하였다. 1주차, 2주차 그리고 각 연구의 막바지에 SE-HPLC 피크 면적을 적분함으로써, 제제중 단량체와 올리고머의 분률을 평가하였다. 표 11은 본 연구의 28일차에 얻은 종점 측정치(endpoint measurement)들을 비교한 것이다. 28일이라는 시간이 경과함에 따른 단량체 함량(%) 및 단백질 농도(mg/mL)를 도 8에 보였다. 본 발명의 scFv는 4℃의 온도와 10 mg/ml를 초과하는 농도에서 보관하였을 때, 단량체 손실률이 5% 이하였는데, 특히 A1의 경우에는 단량체 손실률이 1% 미만인 것으로 보였다. 더욱이 본 발명의 scFv인 A1은 37℃의 온도와 10 mg/ml를 초과하는 농도에서 보관하였을 때, 단량체 손실률이 5% 미만인 것으로 보였다.
2.4.4 동결-해동 안정성 연구
전술한 보관 안정성 연구에 더하여, scFv인 A1, PRO571 및 PRO592의 동결-해동(F/T) 주기와 관련한 양립가능성(콜로이드 안정성)을 평가하였다.
F/T 안정성 평가를 위해 보관 안정성 연구를 위한 것과 동일한 분석 방법(SE-HPLC, SDS-PAGE) 및 매개변수(단량체 함량% 및 단량체 손실%)를 적용하여 5회 F/T 주기후 분자의 품질을 모니터링하였다. 시료를 PBS중에 제제화한 다음, VivaSpin 농축 기기를 사용하여 10 mg/mL로 농축한 후, 연구를 개시하였다. 작은 시료 부피(20 μL 미만)는 동결 및 해동의 짧은 간격을 허용하였다. 시료를 대상으로 동결-해동 주기를 5회 반복 수행하였다. 시료를 -80℃의 온도에서 동결시키고, RT에서 해동시켰다. A1, PRO571 및 PRO592의 안정성을 평가하기 위해 매 주기를 완료한 후 상이한 시점에서 SE-HPLC 및 UV280 측정을 통해 단백질 함량과 순도와 같이 분석을 위한 판독결과를 기록하였다. 데이터는 표 12에 제시하여 두었다. 도 9는 F/T 주기를 5회 반복 수행할 동안 단량체 함량(%)의 변화를 도시하고 있다.
2.4.5 pH 안정성 연구
scFv인 A1, PRO571 및 PRO592를 대상으로 단기 스트레스 안정성 연구를 수행하였는데, 이 때 scFv 분자를 수성 (인산염-시트르산염) 완충제 시스템(pH 값 3.5 ~ 7.5) 세트에 20 mg/ml로 제제화하였다. 4℃에서 48시간 및 25℃에서 8시간 동안 보관한 후 단량체 함량(%) 및 단량체 손실률(%)을 분석하였다(표 13 및 표 12). A1, PRO571 및 PRO592는 시험된대상 완충제 시스템중 임의의 것 및 임의의 측정 시점에서 5% 미만의 단량체 손실을 보였다(표 13 및 표 14).
이 평가 범주내에서 제안된 상이한 연구는 단백질 안정성에 관한 변별적이고 기계론적인 양태를 다룬다는 것에 주목하는 것이 중요하다. 두 방법은 생성물의 잠재적 유통기한과 안정성 추산을 제공하기위해 디자인된 것인 반면, 다루어진 기작들은 완전히 상이하였다. 열 언폴딩에 의해 평가된 전이의 중간지점(Tm)은 단백질 도메인 안정성에 대한 품질 측정이다[ΔG의 열역학적 확정을 허용하지 않음]. 매우 안정한(고 Tm) 단백질 도메인은 상온에서 자발적으로 언폴딩될 가능성이 덜하였으므로, 언폴딩된 도메인 상호작용에 의해 유도되는 불가역적 응집/침전 경향도 줄어들었다. 도메인 안정성이 큼은, 아미노산 잔기들의 팩키징이 조밀함을 나타내는데, 이 점은 또한 프로테아제 절단에 대항하는 저항과도 상관되어 있다. 다른 한편, SE-HPLC 평가는 단량체 분률뿐 아니라 가용성 올리고머/응집체의 함량도 정량적으로 확정한다. 이와 같은 가용성 올리고머는 종종 올바르게 폴딩된 단백질들 사이의 정전기적 상호작용 또는 소수성 상호작용에 의해 그 회합이 비교적 느슨하게 가역적으로 유도된다. 열 언폴딩에 의해 평가되는 Tm과, SE-HPLC에 의해 평가되는 올리고머/응집체 형성 성향, 특히 "경계선" 안정성을 보이는 단백질에 대한 올리고머/응집체 형성 성향 사이에는 약간의 상관관계가 존재한다. 특정 역치 Tm(대략 60℃)을 초과할 때, 항체 가변 도메인은 일반적으로 상온에서의 부분적 도메인 언폴딩으로 말미암은 단백분해성 분해와 응집/침전에 저항하기에 충분히 안정적이다.
그러나 표면 잔기들의 소수성 상호작용 및/또는 정전기적 상호작용에 의해 유도되는 올리고머 형성은 여전히 발생할 수 있다. 중요한 점은, 가속화된 (스트레스) 안정성 연구(상승한 온도, 예컨대 37℃)에서 올리고머 형성 및 침전에 관한 다양한 기작은 동시에 일어날 수 있다.
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
2.4.6 방법
2.4.6.1 환원 SDS-PAGE
도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)은 품질에 관한 특성규명과 단백질 순도 제어를 위해 사용되는 분석 기술이다. 미합중국 약전(USP)(USP 챕터 1056)에 따르면, 분석용 겔 전기영동은 약 성분내 단백질의 균질성을 확인하고 평가하기에 적당하고 일상적인 방법이다.
본 방법은 발효후 발현 수율을 구하기 위해 이.콜라이 용해물로부터 유래한 scFv 생성물의 양을 정량하는데 사용된다. 본 방법의 또 다른 응용예는 시험 물질의 이론상의 값에 관한 분자량을 바탕으로 이 시험 물질의 동일성을 인증하는 것이다. 이를 뒷받침하기 위해 이 방법은 공정 관련 불순물(숙주 세포 단백질) 및 생성물 관련 불순물(분해 생성물 또는 부산물)에 관한 시험 시료의 순도를 정량하는데 사용된다.
시판중인 예비 성형 겔 시스템 "Mini Protean”(Bio-Rad Laboratories Inc. 제품)으로 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 인간화 scFv들을 "Any kD” 분석 겔(#456-9036)상에서 분석하였다. 두 경우에 제조자가 권장하는 트리스/글리신 완충제 시스템을 사용하였다. 단백질 밴드를 검출하기 위해, SimplyBlueTM 염색 용액(Life Technologies Corp., #LC6060)으로 쿠마시 염색을 이용하였다. 공급자의 프로토콜을 따라 염색 절차를 수행하였다.
염색한 단백질 겔의 기록 및 분석은, 기록 시스템인 ChemiDoc XRS 시스템(Bio-Rad Laboratories Inc., #170-8265) 및 소프트웨어 Image Lab, 4.0.1 버전(Bio-Rad Laboratories Inc., # 170-9690)을 이용하여 수행하였다.
2.4.6.2 280 nm에서의 UV 흡광도
280 nm에서의 UV 흡광도 측정 방법은 USP 챕터 1057에 개략적으로 소개된 총 단백질 검정이다. 단백질 용액은 방향족 아미노산의 존재로 말미암아 파장 280 nm의 UV 광선을 흡수한다. UV 흡광도는 단백질중 티로신 및 트립토판 잔기의 함량에 관한 함수로서, 단백질 농도에 비례한다. 미지의 단백질 용액의 흡광도는 USP 챕터 851에 따라 분광분석으로 확정될 수 있다[비어(Beer)의 법칙, 즉 A = ε*l*c [식 중 흡광도(A)는 성분의 몰 흡수 계수(molar absorptivity)(ε), 흡수 경로 길이(absorption path length) 및 농도임] 적용]. scFv에 대한 몰 흡수 계수는 소프트웨어 Vector NTI®(Life Technologies Corporation)로 산정하였다.
UV 흡광도 측정은 Infinity 판독기 M200 Pro(Nanoquant 평판(Tecan Group Ltd.) 장착)으로 수행하였다. 단백질 시료의 흡광도는 280 nm 및 310 nm에서 측정하였는데, 여기서 파장 310 nm는 280 nm 신호로부터 공제되는 참조기준 신호로 사용된다. 시료 매트릭스의 잠재적 간섭을 고려하기 위해, 각각의 측정에 대해 블랭크 공제(blank subtraction)를 수행하였다. 램버트-비어(Lambert-Beer) 법칙을 이용하여 단백질 농도를 산정하기 위해, 얻어진 단백질 시료의 최종 흡광 신호를 사용하였다.
모든 측정은 기구의 사양에 의해 주어진 범위내, 즉 측정 범위 0 OD ~ 4 OD에서 수행하였는데, 이 때 1% 미만의 재현가능성과 3% 미만의 균일성은 제조자에 의해 명시된 것이었다.
2.4.6.3 SE-HPLC(크기별 배제 고압 액체 크로마토그래피)
SE-HPLC는 USP 챕터 621에 개략적으로 소개된 바와 같이 고체 정지상과 액체 이동상을 기반으로 하는 분리 기술이다. 이 방법은 소수성 정지상과 수성 이동상을 이용하여 분자들의 크기와 형상을 기반으로 분자들을 분리한다. 분자의 분리는 특정 컬럼의 허공부피(V0)와 총 투과 부피(VT) 사이에서 이루어진다. 자동 시료 주입장치 및 UV 검출기(검출 파장 280 nm로 설정)가 장착된 Chromaster HPLC 시스템(Hitachi High-Technologies Corporation)에서 SE-HPLC에 의한 측정을 수행하였다. 구하여진 크로마토그램의 분석을 지원해주기도 하는 소프트웨어 EZChrom Elite(Agilent Technologies, Version 3.3.2 SP2)로 장비를 제어하였다. 단백질 시료를 원심분리에 의해 청징화하였고, 주입전 자동시료추출기 안에 담았다(온도 4℃ ~ 6℃로 유지). scFv 시료를 분석하기 위해 컬럼 Shodex KW403-4F(Showa Denko Inc., #F6989202)를 사용하였는데, 이 경우 표준화한 완충 염 이동상(50 mM 아세트산나트륨 pH6.0, 250 mM 염화나트륨)을 0.35 mL/분의 권장 유속으로 흘려보냈다. 1회 주입당 표적 시료 로딩량은 5 μg로 하였다. 시료를 280 nm의 파장에서 UV 검출기로 검출하였고, 데이터는 적합한 소프트웨어 슈트로 기록하였다. 구하여진 크로마토그램을 V0 ~ VT 범위에서 분석하였고, 이로써 매트릭스 연관 피크(용리 시간: 10분 초과)를 배제하였다.
본 방법의 정확도를 중간정도로라도 보장하기 위해, 매회 HPLC 절차의 처음과 막바지에 일상적으로 참조 기준을 측정하였다. 이 시스템의 안정성 시험을 위해 사용한 참조 기준은 회분으로서 제조하여, 각각의 측정 시점에 사용하도록 분취한 scFv였다.
2.4.6.4 DSF(시차주사형광측정법)
시험 대상인 scFv 구조체의 열 언폴딩에 대한 전이의 중간점을, 본질적으로 Niesen의 저서(Niesen et al., Nat Protoc. 2 (2007) 2212-21)에 기재된 바와 같은 시차주사형광측정법(DSF)으로 확정하였다. DSF 방법은 온도 의존적 단백질 언폴딩을 확인하기 위한 비 공정서상 방법(non-compendial method)이다. DSF에 의한 열 언폴딩 온도 측정은, MX Pro 소프트웨어 팩키지(Agilent Technologies)로 제어되고, 492 nm/610 nm로 설정된 여기/방출 필터가 장착된 MX3005P qPCR 기기(Agilent Technologies)를 사용하여 수행하였다. 반응을 Thermo 급속 96 백색 PCR 평판(Abgene; #AB-0600/W)에 세팅하였다. 단백질 언폴딩을 확인하기 위해, 시판중인 염료 SYPRO 오렌지(Molecular Probes; # S6650)의 스톡 용액을 사용하였다(최종 희석률 1:1,000). 언폴딩 측정을 위해 단백질 시료를 표준화 완충 염 용액중 최종 농도 50 μg/mL로 희석하였다. 20℃에서 시작하여 96℃에 이르기까지 1℃씩 단계적으로(지속 기간 30초) 상승시키는 온도 프로그램에 의해 열 언폴딩을 수행하였다. 온도 프로그램이 작동하는중 각 시료의 형광 발광도를 기록하였다. 기록한 미가공 데이터를 마이크로소프트사 엑셀 템플릿 팩키지(Niesen, Nature Protocols 2007, Vol. 2 No.9)로 처리하여 평가하였으며, 형광도 데이터는 GraphPad Prism 프로그램(GraphPad Software, Inc.)을 이용하여 볼츠만 방정식으로 피팅함으로써, 전이의 중간점(Tm)을 구하였다.
언폴딩의 중간점에 대하여 신뢰할 수 있고 확고한 측정을 수행하기 위해 측정을 적어도 2회 실시하였다. 평가가 중간정도의 정확도를 보이도록 만들기 위해 참조기준(특성규명된 공지의 scFv)을 모든 측정에 포함시켜, 상이한 날의 검정 성능 비교를 가능하게 하였다.
2.4.6.5 안정성 연구
상이한 scFv 구조체들의 안정성을, 이 분자들의 개발 가능성에 대한 판독결과로서 평가하기 위해, 단기 안정성 연구 프로토콜을 디자인할 수 있었다. 단백질 구조체를 간단히 완충한 염수 제제(상기 참조)에 표적 농도 10 mg/mL로 농축하였다. 단량체 함량을 SE-HPLC로 확정하여, 순도가 성공 기준인 95%를 초과함을 확인하였다. 이후 단백질 시료를 -80℃ 미만, 4℃ 및 37℃에 4주간의 지속기간 동안 보관한 다음, 다양한 시점에서 분취액을 분석하였다. 1차 판독결과는 SE-HPLC에 의하여 분석하였는데, 이는 가용성 고분자량 올리고머와 응집체의 정량을 허용하였다. 지원 측정으로서, UV 흡광도(280 nm)에 의해 단백질 함량을 확정하였는데, 이 결과는 보관 기간 동안 상당량의 단백질이 침전에 의해 손실되는지 여부에 대한 암시를 제공하였다. 또한, 연구의 막바지에서의 순도를 SDS-PAGE에 의해 확정하였는데, 이 결과는 분해 또는 공유 다량체화에 관한 구조체의 안정성을 나타내었다.
실시예 3: 다중 특이적 구조체의 제조
항 IL-17(27-07-G02-sc01, 표 1 참조), 항 TNFα(16-19-B11-sc06, 표 1 참조, WO 2017/158101에 기재) 및 항 HSA-결합 도메인(19-01-H04-sc03, 표 1 참조)을 2개의 상이한 3중 특이적 항체 포맷으로 조합하였다: 트리바디 및 scDb-scFv 포맷(표 1). 트리바디 포맷은 Fab 단편과, 이 Fab의 각 사슬 카복시 말단에 융합된 scFv 분자 하나의 융합체로서, 3중 특이적 분자(Fab-(scFv)2)를 이루는 것이다. 이 포맷은, 제1 단백질 사슬상 불변 경 도메인(CL)에 융합된 가변 경 도메인(VL)과, 제2 단백질 사슬상 불변 중 도메인(CH1)에 융합된 가변 중 도메인(VH)으로 이루어진, Fab 단편의 이종 이량체 조립을 이용한다. 불변 도메인 각각은 가요성 Gly-Ser 링커를 통해 카복시 말단에서 scFv 단편에 연결된다. scDb-scFv는, scFv 단편이 가요성 Gly-Ser 링커에 의해 매우 안정한 단일 사슬 다이아바디(scDb) 포맷에 융합된 포맷이다. 두 포맷, 즉 Fab-scFv2(트리바디) 및 scDb-scFv는 CHO-S 숙주 세포에서 재조합에 의해 발현될 수 있다.
3중 특이적 포맷내 각각의 결합 도메인의 상대적인 최적 위치를 약동학적 매개변수 및 생물물리학적 매개변수의 관점에서 시험하였다. 각각의 포맷은 상이한 입체배열, 즉 도메인들의 서로에 대한 상대적 위치선정을 허용하였다.
트리바디 단편의 CL 및 CH1 위치에서의 ScFv 융합은 균등한 것으로 간주하여, 이 포맷의 변이체 3가지가 만들어졌다(도 10a). 분자의 단일 사슬 다이아바디(scDb) 코어 도메인과 scFv부의 C 말단 융합은 N 말단 융합보다 월등하였으므로, 이 포맷의 오로지 C 말단 융합만을 평가하였다. 이 포맷의 몇몇 순열 변이체를 분석하였다(도 10b). 분자 모두의 서열을 표 1에 나열하였다.
실시예 4: 일반적인 본보기 제조 방법
CHOgro 일시적 형질감염 키트(Mirus)를 이용하여 CHO-S 세포에서 3중 특이적 구조체 모두의 발현을 수행하였다. 37℃에서 발현시킨지 5일 ~ 7일후(세포 생존률 70% 미만일 때), 원심분리에 의해 배양액을 수득하였으며, 청징화한 배양 상청액으로부터 Protein L 친화성 크로마토그래피후 크기별 배제 크로마토그래피에 의한 폴리싱(polishing) 단계를 통해 단백질을 정제하였다. 제조한 재료의 품질 제어를 위하여 표준 분석 방법, 예컨대 SE-HPLC, SDS-PAGE 및 UV280을 이용하였다.
표 16은 3중 특이적 포맷 변이체의 제조와 특성규명에 관하여 요약한 것을 개략적으로 제시하고 있다. 도 11은 A3 ~ A8의 제조와 정제에 관하여 개략적으로 제시하고 있다. 인산염 완충 염수(PBS) 결합 완충제중 예비 평형화한 컬럼으로서, 팩킹한 Protein L 컬럼을 사용하여 항체 단편을 CHO 세포 배양 상청액으로부터 바로 포착하였다. 시료 적용후 컬럼을 결합 완충제로 세척하고, 1단계 pH 구배를 가하면서 단백질을 용리시켰다. 단백질 분획의 단량체 함량을 크기별 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)로 확정하였으며, 분획들을 풀링(pooling)한 다음, 완충제를 투석에 의해 인산염-시트르산염 완충제(pH6.4)로 교환하였다. 후속 예비 크기별 배제 크로마토그래피(SEC)를 위해 원심분리 농축을 이용함으로써 분획 풀을 농축하였으며, 그 결과 총 시료 부피가 감소하였는데, 이 과정은 PBS중 예비 평형화한 GE Superdex 200 10/300 컬럼을 이용하여 단백질 시료를 폴리싱하기 위해 수행하였다. 최종 완충제를 사용하여 등용매 용리하였으며, SE-HPLC, SDS-PAGE 및 UV280에 의해 추가로 특성규명하였다.
Figure pct00029
실시예 5: 약리학적 특성규명
5.1 pH 5.5 및 pH 7.4에서의 HSA 및 CSA에 대한 친화성
정제한 3중 특이적 분자와 인간 혈청 알부민(HSA) 및 사이노몰거스 혈청 알부민(CSA)의 결합을, MASS-1 기기(Sierra Sensors)상에서 SPR 분광분석법을 진행함으로써 평가하였다. HSA는 고용량 아민 센서칩(Sierra Sensors)상에 직접 부동화하였으며, 3중 특이적 분자는 용량 반응 다회 주기 역학 검정을 이용하여 피분석물로서 주입하였는데, 이 때 피분석물의 농도는 전개 완충제(pH5.5 또는 pH7.5)중 희석하여 0.35 nM ~ 90 nM 범위였다. 이로부터 얻은 센서그램을 1:1 결합 모델을 이용하여 피팅하였다. CSA에 대한 친화성은, 센서칩에 부동화한 CSA를 사용하는 접근법과 유사한 접근법에서 평가하였다. A5 및 A7과 CSA의 결합은 pH5.5 및 pH7.5에서만 분석하였다. 이하 표(표 17)는 HSA 및 CSA에 대하여 얻어진 친화성을 요약한 것이다.
Figure pct00030
5.2 인간 TNFα와, 인간 및 사이노몰거스 원숭이 IL-17A에 대한 친화성
T200 기기(Biacore, GE Healthcare)상 SPR 분석을 이용하여 인간 TNFα와, 인간 및 사이노몰거스 IL-17A에 대한 친화성을 측정하였다. 이 실험에서 바이오틴화한 항원을 Biotin-CAPture 키트(Biacore사)를 이용하여 포착하였다. 각각의 피분석물 주입 주기를 거친 후, CAP 센서칩을 재생하여 새 항원을 포착시켰다. 용량 반응 다회 주기 역학 검정을 이용하여 3중 특이적 분자를 피분석물로서 주입하였다(단 이 때 피분석물의 농도는 전개 완충제중 희석하여 0.35 nM ~ 90 nM의 범위임). 얻어진 센서그램을 1:1 결합 모델을 이용하여 피팅하였다. A5 및 A7에 대해서만 사이노몰거스 IL-17A와의 결합을 분석하였다. 이하 표(표 18)에 인간 TNFα와, 인간 및 사이노몰거스 IL-17A에 대해 얻어진 친화성을 요약하였다. 이 표에 보인 바와 같이, 몇몇 분자는 TNFα 또는 IL-17A와의 결합율이 10%보다 낮았다. 이 발견은 아마도 각각의 표적에 대한 도메인들의 접근 가능성이 감소하였음에 의해 설명될 수 있을 것이다. 비록 이처럼 결합율이 낮은 결합제의 친화성 측정치는, 더 높은 결합 수준에 이르렀던 분자의 친화성 측정치와 비교되었을 때 유사한 범위에 있었거나, 종종은 유의미하게 더 컸지만, 분자가, TNFα 및 IL-17A의 생물학적 활성을 억제하는 잠재성은 유의미하게 감소하였다(표 19 및 표 21 참조).
정제한 3중 특이적 분자가 TNF 유도 생물학적 반응에 미치는 영향은 마우스 L929 섬유아세포를 사용하여 분석하였다. 우선, L929 세포의 생장을 악티노마이신 D로 지연시켰다. 그 다음, 웰당 60,000개의 세포를 도말하고 나서, 인간 TNFα(5 pM) 또는 사이노몰거스 TNFα(5 pM)뿐 아니라, 3배 연속 희석한 3중 특이적 분자 및 내부 참조기준 A13, 즉 3중 특이적 분자의 항 TNF 도메인과 동일한 항 TNF 도메인을 함유하는 scDb(서열 번호 125)로 처리하였다. 20시간 항온처리한 후, 세포 계수 키트-8(Sigma-Aldrich사)을 이용하여 세포 생존률을 평가하였다. 3중 특이적 분자 6개에 의한 TNFα 중화에 관하여 구한 데이터를 도 12에 도시하였다. 또한, A5 및 A7에 대해 얻은 결과로서, 인간 및 사이노몰거스 TNFα를 중화하는, A5 및 A7의 능력을 비교한 결과를 도 13에 제시하였다. 인간 TNFα에 대하여 확정한 IC50 값으로서, 참조 A13의 경우에 대해 상대적인 IC50 값뿐 아니라, 인간 TNFα 및 사이노 TNFα에 대해 얻은 IC50 값들간의 비를 표 19에 요약하였다.
Figure pct00031
Figure pct00032
5.3 HT-29 검정(인간 TNF 및 인간 L-17A의 수반적 차단)
IL-17A는 결장직장 선암종 세포주 HT-29에서 케모카인 및 사이토카인 하위세트, 에컨대 Gro-α/CXCL1의 발현을 상향 조절함에 있어 TNF와 함께 상승작용을 보인다. 그러므로 인간 TNFα 및 인간 IL-17A의 수반적 차단은 HT-29 세포에 의한 Gro-α/CXCL1 분비를 분석함으로써 평가하였다. HSA 결합이 역가에 미치는 영향을 시험하기 위해, IL-17A 및 TNFα에 의하여 유도되는 Gro-α/CXCL1 분비를 억제할 때의 IC50도 또한 HSA 존재하에 평가하였다. 1 mg/ml HSA 부재하에서, 그리고 존재하에서 실험을 수행하였다. HT-29 세포 50,000개를 96웰 평판의 각각의 웰에 도말하였다. 적정한 시험 대상 3중 특이적 분자뿐 아니라 내부 참조기준인 A13(서열 번호 125) 및 세쿠키누맙에 더하여, 인간 TNFα(0.2 ng/ml) 및 인간 IL-17A(2 ng/ml)의 예비 희석액을 HT-29 세포에 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 항온처리한 후, 상청액을 수집한 다음, GRO-α(CXCL1 케모카인) 분비를 ELISA로 정량하였다. 1 mg/ml 인간 혈청 알부민(HSA)의 존재하에 3중 특이적 분자 6개에 대해 작성한 적정 곡선을 도 14에 제시하였다. 2개의 참조기준, 즉 세쿠키누맙과 A13에 대한 상대적 IC50 값뿐 아니라, HSA 존재 또는 부재하에 관찰되는 억제 백분율을 표 20에 요약하였다. 세쿠키누맙의 IC50(ng/ml)을 시험대상 3중 특이적 분자의 IC50(ng/ml)으로 나누어 세쿠키누맙에 대한 상대적 IC50을 산정하였다. A13의 IC50(nM)을 시험대상 3중 특이적 분자의 IC50(nM)으로 나누어 A13에 대한 상대적 IC50을 산정하였다.
A5, A7 및 A8에서 최고의 역가가 관찰되었다. 3중 특이적 분자의 역가는 세쿠키누맙의 역가보다 50배 ~ 90배 더 컸으며, A13의 역가보다는 2배 ~ 5배 더 컸다. TNFα 및 IL-17A의 수반적 차단은, TNFα 또는 IL-17A의 단일 차단과 비교되었을 때 효과 크기(effect size)를 극적으로 증가시켰다. 세쿠키누맙과 A13으로 달성되었던 최대 효과와 동일한 효과를 달성하기 위해서는 각각 대략적으로 200배 및 60배 더 낮은 농도가 필요하였다.
Figure pct00033
5.4 경쟁적 ELISA(hIL-17A와 hIL-17RA의 결합 억제)
경쟁적 ELISA에 의해 hIL-17A와 hIL-17RA의 결합 억제를 평가하였다. hIL-17RA를 ELISA 평판상에 코팅하였다. 바이오틴화한 hIL-17A를 3중 특이적 분자와 함께 1.5시간 동안 예비 항온처리한 다음, 이 혼합물을 ELISA 평판에 첨가하여, 1시간 동안 hIL-17RA와 결합하도록 허용하였다. 이후, 바이오틴화 IL-17A를 검출하는데 사용한 스트렙타비딘-HRP를 첨가하고 나서, 평판을 1시간 동안 항온처리하였다. 마지막으로 테트라메틸벤지딘 용액을 첨가하여, 이 평판을 5분 ~ 10분 동안 전개하였으며, 1 M HCl로 반응을 중단시켰다. 평판을 450 nm 및 570 nm(참조 파장)에서 판독하였다. 3중 특이적 분자 6개에 대하여 얻은 적정 곡선을 도 15에 재시하였다. 참조 세쿠키누맙에 대해 산정한 상대적 IC50 값을 표 21에 요약하였다.
Figure pct00034
5.5 TNF, IL-17A 및 HSA와의 동시 결합
3중 특이적 분자와 인간 TNFα, 인간 IL-17A 및 HSA의 동시 결합을 입증하기 위해, SPR 실험을 이용하였다. 간단히 말해서, 3중 특이적 분자 6개(A3 ~ A8)를 고용량 아민 센서칩(Sierra Sensors)상에 직접 부동화하였으며, 피분석물로서 항원들 HSA(2500 nM), TNFα(180 nM) 및 IL-17A (90 nM)을 순차적으로 주입하여, 각각의 결합이 포화에 도달하도록 보장하였다. 실행 가능한 모든 항원 주입 순서를 시험하여, 실행 가능한 순서 6개를 확보하였다. 3중 특이적 분자 모두에 대해, 3개 항원 모두와의 동시 결합을 관찰하였다. 3중 특이적 분자들과의 동시 결합을 입증하는 센서그램을 도 16에 보였다.
각각의 항원과 3중 특이적 분자의 수반적 결합을 평가하기 위해, 이론상 Rmax에 상대적인 결합 수준을, 3중 특이적 분자 각각의 리간드와 피분석물 분자 질량, 그리고 부동화 수준을 이용하여 각각의 주입에 대해 산정하였다. 2개의 주입에 대해 얻어진 이론상 Rmax에 상대적인 각각의 최대 결합을 평균내어 각각의 항원에 대한 이론상 Rmax에 상대적인 최대 결합의 평균을 구하였으며, 이 경우 각각의 항원은 (기타 결합 항원 부재시) 첫 번째 피분석물로서 주입하였다. 그 다음, 각각의 피분석물 주입의 이론상 Rmax에 상대적인 결합을, 이의 평균 최대 결합과 비교하여, 기타 결합 항원 존재시 얻어진 분획의 결합을 산정하였다. 각각의 항원의 평균 최대 결합에 상대적인, 각각의 항원의 결합 수준을 표 12에 보였는데, 이 표 12는 평균 최대 결합에 비한, 각각의 항원의 상대적 결합 수준을 보인다. 각각의 항원의 이론상 Rmax에 상대적인 결합 수준과 최대 결합(기타 항원 부재시 결합 수준)의 평균을 산정하였다. 기타 결합 항원 존재시 각각의 항원의 결합을 평가하기 위해, 각각의 피분석물 주입의 이론상 Rmax에 상대적인 결합을, 이의 평균 최대 결합에 대해 정규화하여, 기타 항원 존재시 결합 정도를 보여주는 결합 값을 구하였다.
모든 조합에 대해, 항원 결합은 이론상 Rmax에 상대적인 평균 최대 결합의 적어도 70%였다[예를 들어 부동화한 A3상에 TNFα를 제2 피분석물 또는 제3 피분석물로서 주입하였을 때, 얻어진 상대적 결합 수준은 기타 항원 부재시 결합 수준에 비하여 92.8%로 약간 감소하였거나 126.6%로 약간 증가하였음이 확인되었다]. 주목할 점은, HSA를 마지막 피분석물로서 주입하였을 때, 상대적 결합 수준은 A3을 제외한 3중 특이적 분자 모두에 대해 약 70%까지 감소하였다. 요약하면, 3중 특이적 분자 모두에 대해 동시 결합이 관찰되었는데, 이때 시험대상 분자들간에는 차이를 거의 보이지 않았다.
Figure pct00035
Figure pct00036
5.6 기초 개발가능성 평가를 위한 약동학적 특성규명 및 분자 선택 요약
표 23에는 3중 특이적 분자 6개의 약리학적 특성규명을 요약하여 두었는데, 이는 개발가능성 평가를 위한 분자 선택의 기초를 제공하였다. 개발가능성 평가를 위해, L929 검정에서의 TNF 중화 및 HT29 검정에서의 TNFα 및 IL-17A 수반적 중화의 관점에서 A3, A4 및 A6의 성능보다 전반적으로 더 우수한 3개의 분자, A5, A7 및 A8의 성능을 기반으로 이 A5, A7 및 A8을 선택하였다. 3개의 분자 모두는, 3개의 표적 각각에 대해 유사한 친화성을 보였다. A7은 IL-17A 및 TNFα 둘 다를 중화시키는 역가를 가장 크게 보였던 반면에, A5는 A7의 경우에 비해 IL-17A를 중화시키는 역가를 대략 2배 감소하여 보였으며, A8은 A7의 경우에 비해 IL-17A를 중화시키는 역가를 대략 2배 작게 보였다.
실시예 6: 개발가능성 평가
A3, A4 및 A6은 유의미하게 감소한 결합과, 항 TNF 도메인 역가를 보였던 관계로, 개발가능성 평가를 위해 오로지 A5, A7 및 A8만을 선택하였다.
6.1 탐구적 pH 양립가능성
선택한 정제 3중 특이적 후보(A5, A7 및 A8)를 20 g/L를 초과하도록 농축한 후, 제제화 공정의 잠재적 pH 범위를 포괄하는 완충제중에 제제화하였다. 이처럼 pH 3.5 ~ 7.5 범위의 조건에서 분자들을 대상으로 20℃에서 8시간, 또는 4℃에서 48시간 동안 항온처리를 수행한 다음, 일반적 안정성을 나타내는 방법인 SE-HPLC 및 SDS-PAGE를 적용하여, 분자들의 잠재적 가공 조건과의 초기 양립가능성 프로필을 확립하고, 분자들의 보관 안정성 평가에 대한 완충제 조건을 규정하였다.
다수의 인산염-시트르산염 완충제(50 mM)(pH 3.5 ~ 7.5)중 A5 및 A7로 탐구적 pH 실험을 수행하였다(표 24). 뿐 아니라, PBS 완충제(pH7.4)중에서도 A5, A7 및 A8로 실험을 수행하였다(표 25). 3개 분자 모두 평가 완충제중 그 어떤 것에서도 단량체 함량이 5%를 초과하여 감소하지 않았다.
Figure pct00037
Figure pct00038
6.2 열 언폴딩
시차주사형광측정법(DSF)은 온도 의존적 단백질 언폴딩을 확인하기 위한 비 공정서상 방법으로서, 이하 기재된 바와 같이 수행하였다.
50 mM 인산염-시트르산염 완충제(pH6.4)중 시료를, 최종 단백질 농도 50 μg/mL 및 5x SYPRO® 오렌지 최종 농도가 되도록 제조하였다(총 부피 100 μl). 제조한 시료들 25 마이크로리터씩을 백색 벽으로 둘린 AB 유전자 PCR 평판에 3회씩 첨가하였다. 본 검정은 열 순환기로서 사용하였던 qPCR 기기에서 수행하였으며, 소프트웨어 주문제작 염료 교정 루틴을 이용하여 형광 발광도를 검출하였다. 시험 시료를 함유하는 PCR 평판 온도는 1℃씩 승온하여 25℃ → 96℃로 상승시켰고, 매 승온시마다 30초씩 휴지기를 두었다. 총 검정 시간은 약 2시간이었다. 산술적 2차도함수법을 이용하는 소프트웨어 GraphPad Prism으로 Tm을 산정하여, 곡선의 변곡점을 계산하였다. 보고된 Tm은 3회 측정치의 평균이었다.
표 26은 일반적 완충제(인산염-시트르산염 완충제)(pH 6.4, 150 mM NaCl 포함)에 제제화한 3중 특이적 분자의 용융 온도를 보여준다.
Figure pct00039
6.3 보관 안정성
선택한 3중 특이적 분자의 안정성, 그리고 궁극적으로는 개발가능성에 대한 지표로서, 최적화하지 않고 제제화한 일반 완충제(PBS, pH7.4)중 단백질 농도와 상이한 온도에서의 단기 안정성 연구를, 선택한 분자(A5, A7 및 A8)를 대상으로 수행하였다.
시료를 PBS중에 제제화한 다음, VivaSpin 농축 기기를 사용하여 10 mg/mL로 농축한 다음, 연구를 개시하였다. 본 연구에 적용한 항온처리 조건은, 온도 -80℃, 4℃ 및 37℃와, 단백질 농도 10 mg/mL, 그리고 지속기간 4주였다. 분자들의 안정성을 평가하기 위해, 단백질 함량과 순도와 같은 분석 판독결과를 SE-HPLC, UV280 측정 및 SDS-PAGE에 의해 상이한 시점에 기록하였다(도 17 및 표 27).
Figure pct00040
37℃에서의 시간이 경과함에 따른 단량체 함량% 기록은, 당일 및 28일차 안정성 시료에 대한 SE-HPLC 트레이싱 오버레이에 의해 확인되는 바와 같이 분자들간에 많은 차이가 있음을 밝혔다(도 18). A8은 A5 및 A7과 비교되었을 때 그 안정성이 명백히 열등하였으며 고분자량 종을 상당량 보였는데, 이 점은, A8이 순열 도메인 배향을 보이긴 하지만 동일한 항체 포맷을 공유하고, A7의 도메인과 동일한 도메인으로 이루어져 있었기 때문에, 예상치 못하였던 점이다.
6.4 동결/해동 안정성
상기 기재된 보관 안정성 연구에 더하여, 5회 반복 동결-해동(F/T) 주기와 관련하여 분자들의 양립 가능성을 평가하였다(표 28). F/T 안정성 평가를 위해, 보관 안정성 연구에서의 분석 방법과 동일한 분석방법을 사용하여 5회 F/T 주기를 거친 분자들의 품질을 모니터링하였다. 모든 분자는 1% 이하의 단량체 함량 감소를 보였다(표 28).
시료를 PBS중에 제제화한 다음, VivaSpin 농축 기기를 사용하여 10 mg/mL로 농축한 후 연구를 개시하였다. 작은 시료 부피(20 μL 미만)는 짧은 동결 및 해동 간격을 허용하였다. 시료들을 대상으로 5회의 동결-해동 주기를 반복하였다. 시료들을 -80℃의 온도에서 동결시킨 다음, RT에서 해동시켰다. 매 주기가 끝난 후 분자의 안정성을 평가하기 위해, 상이한 시점에서의 분석 판독결과, 예컨대 단백질 함량 및 순도를 SE-HPLC 및 UV280 측정을 통해 기록하였다.
Figure pct00041
6.5 기본적 개발가능성 평가 요약
개발가능성 평가를 표 29에 요약하였다.
Figure pct00042
실시예 7: 사이노몰거스 원숭이에서의 약동학적(PK) 특성규명
항 HSA 도메인을 포함하는 3중 특이적 포맷을 사용하여 반감기 연장여부를 확인하기 위해, 사이노몰거스 원숭이를 대상으로 비 GLP 약동학 연구를 수행하였다. 이하에 개략적으로 간단히 기술된 연구 계획에 따라 A7을 사이노몰거스 원숭이에 투여하였다(표 30 참조). A7을 수컷 사이노몰거스 원숭이에 정맥내 및 피하 투여한 후 A7의 약동학적 양태를 확인하였다. 유경험(non-naive) 동물 총 6마리(각 군당 3마리)에 A7(표적 용량 수준 = 3 mg/kg)을 1회 투여하였다. pH 7.5에서 멸균 1x 인산염 완충 염수, 150 mM L-아르기닌, 500 mM 수크로스중에 단백질을 예비 제제화하였다(표 30).
Figure pct00043
이하와 같은 시점에서 혈액 시료로부터 혈청을 마련하였다: 투여전, 투여후 10분 및 30분, 1시간, 2시간, 4시간 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간, 96시간, 144시간, 192시간, 240시간, 288시간, 336시간, 384시간, 432시간 및 504시간.
혈청 농도 측정치를 도 19에 보였다. 192시간부터 A7 농도가 많이 감소함이 관찰되었다. 투여후 288시간 ~ 504시간의 시점에서 취한 시료 모두 정량 한계 이하(BLQ)였다. 이와 같은 신호 감소는, 항 약물 항체(ADA; Anti-Drug Antibody)가 본 원숭이에 의해 개발되었음을 시사하는 것이었다. 인간 가변 도메인에 대한 ADA가 제조된 것으로 예상되었으며, 이 ADA는 이전에 항 TNFα x HSA 과도기적 항체(interim antibody)를 통해 관찰된 바 있다. 그러므로 A7을 ELISA 평판에 코팅한 다음, 혈청 시료와 함께 항온처리하는 검정을 수행하였다. A7과 결합한 사이노몰거스 IgG를 항 원숭이 IgG 항체를 사용하여 검출하였다. ADA의 존재가 확인되었으며, 그 결과를 도 19에 보였다. 동물은 투여후 192시간부터 ADA를 생성하였던 관계로, A7의 반감기를 너무 짧게 잡는 것을 피하기 위해 이후 시점은 PD 매개변수 추산에서 제외하였다.
이후 PK-ELISA에서 원숭이 혈청 시료를 분석하였다. 처리한 동물 모두로부터 얻은 혈청 시료를 희석하였다. ELISA 평판을 인간 TNFα로 밤새 코팅하였으며, 5% 사이노몰거스 혈청중 A7의 연속 희석액을 평판에 첨가하여, 교정 곡성을 작성하였다. 바이오틴화 인간 IL-17A로, 이후에는 스트렙타비딘 폴리-HRP로 TNFα 결합 A7을 검출하였다. 농도가 공지되어 있지 않은 혈청 시료를 필요에 따라 20배 이상 희석하였으며, A7 농도는 교정 곡선으로부터 내삽하였다. 검정 정량을 위해, 분석 범위 50 ng/ml ~ 600 ng/ml를 규정하도록 정량 및 품질 제어의 하한치와 상한치를 설정하였다. 희석의 선형성(dilution linearity), 후크 현상(hook effect) 및 선택성에 대해 본 검정을 시험하였다. 또한, 1회 ~ 3회의 동결-해동 주기를 거친 사이노몰거스 혈청중 A7의 안정성을 보인후 정량하였다.
그 다음, PK 분석으로부터 구한 데이터를 이용하여 PK 매개변수를 산정하였다. 약동학적 매개변수는 비구획 접근법을 이용하는 WinNonlin 약동학 소프트웨어(Phoenix 1.4 버전)를 이용하여 추산하였다.
상이한 역학 매개변수에 대한 정확한 평가는 제로시로부터 무한대까지의 AUC를 필요로 한다. 농도를 마지막으로 측정한 시간(tlast)으로부터의 외삽은 tlast으로부터 무한대까지의 구간의 곡선을 산술 적분함으로써 수행하였다. 시료 농도의 마지막 측정 시간으로부터 무한대에 이르는 구간의 외삽 면적은 파생적 역학 매개변수의 정확도를 확인하기 위해 총 AUC의 20% 미만이어야 했다. A7의 IV 투여 및 SC 투여 둘 다에 있어서, 무한대로의 AUC 외삽은 총 면적의 20%를 초과하는 것으로 보였다. 결과적으로, 산정한 데이터(표 31)는 주의해서 해석할 필요가 있다. 이 효과는, 검정을 방해하는 항 약물 항체의 개발로 말미암아 발생할 가능성이 가장 크다. 이러한 방해는 더 많은 양의 투여를 통해 잠재적으로 피할 수 있었다.
항 HSA 도메인을 포함하는 scDb-scFv의 경우 분명한 반감기 연장이 관찰되었다. A7의 반감기(t1/2)는 5일을 초과하였다. 이는, 투여 양상과는 독립적으로 달성되었다(표 31 참조). 제거 단계의 마지막 시점(신호 감소 이전)에 일어난 더 많은 변화로 말미암아, 동물 006M에서의 반감기 산정치(436시간)는 나머지 동물에서 확정된 반감기보다 그 정확도가 떨어질 수 있다. 평균 반감기는 SC 주입후가 IV 투여후보다 더 길었는데, 평균 반감기는 각각 237시간(9.9일) 및 153시간(6.4일)이었다.
Figure pct00044
실시예 8: 복합체 형성 분석
본 연구에서는 다양한 비율의 scDb-scFv A7과, Morrison L A14 및 A15(도 20 참조) 및 표적 결합 분자, 인간 IL-17A 및 인간 TNFα를 공동 항온처리하였으며, 이로부터 형성된 복합체를 대상으로 특성규명을 수행하였다.
A14는 항 TNFα 결합 도메인들이 Fab 팔에 이격되어 존재하고, 항 IL-17A 결합 도메인들은 경쇄에 대해 C 말단 쪽에 부착되어 있는 Morrison L 포맷(scFv)이다.
A15는 항 IL-17A 결합 도메인들이 Fab 팔에 이격되어 존재하고, 항 TNFα 결합 도메인들은 경쇄에 대해 C 말단 쪽에 부착되어 있는 Morrison L 포맷(scFv)이다.
A7, A14 및 A15의 발현을 일시적 CHOgro 발현계(Mirus)를 사용하여 FreeStyle CHO-S 세포에서 진행하였다. 관심 유전자를 포유동물 발현에 대해 최적화한 다음, 합성하고 나서, 표준 pcDNA3.1 벡터에 클로닝하였다. 신호 서열은 마우스 중쇄 IgG로부터 유래한 것이었다. 발현 배양액을 6일 ~ 7일 동안 37℃에서(세포 생존률 70% 미만), 또는 1일 동안 37℃에서, 그리고 이후에는 온도를 32℃로 변경한채 5일 ~ 6일 동안 회분 배양하였다. 배양 상청액을 원심분리후 0.45　μm 여과하여 분리하였다. Protein L 친화성 크로마토그래피후 폴리싱 크기별 배제 크로마토그래피를 통하여, 청징화한 배양 상청액으로부터 A7을 포착하였다.
재조합 인간 IL-17A는 Peprotech사(Rocky Hill, NJ, USA)로부터 이황화물 결합 동종이량체(이.콜라이에서 발현시킨 후, SDS-PAGE 및 HPLC에 의해 순도 98% 이상으로 정제함)(Catalog# 200-17, Lot# 061184)로서 구입하였다.
재조합 인간 TNFα는 Peprotech사(Rocky Hill, NJ, USA)로부터 이황화물 결합 동종이량체(이.콜라이에서 발현시킨 후, SDS-PAGE 및 HPLC에 의해 순도 98% 이상으로 정제함)(Catalog# 300-01A, Lot# 0906CY25)로서 구입하였다.
형성된 복합체의 특성규명은 원심분리후에 수행하였으며, 이 때 동적 광산란(DLS)으로 확정된 유체역학적 반경 확정 및 280 nm에서의 흡광도 측정에 의한 단백질 농도 회복도 함께 이루어졌다.
동적 광산란은 산란된 광선 세기 변화를 경시적으로 기록함으로써 용액중 입자들의 크기 분포를 확정하는 신속하고 감수성이 큰 방법이다. 데이터를 대상으로 자기상관함수로의 산술적 전환을 실시하여, 병진확산계수(Dt)를 산출하였다. 이후 유체역학적 반경을 Stokes-Einstein 방정식, 즉
Figure pct00045
[식 중, k b 는 볼츠만 상수이고, T는 Kelvin 온도이며, η는 용매 점도임]
으로부터 추론하였다.
유체역학적 반경은 DynaPro® Plate Reader?? II 및 Dynamics 소프트웨어 팩키지(Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA, USA)를 사용하여 확정하였다. 25 μL을 384 웰 광학 투명 바닥 미세적정 평판(예컨대 Corning® 384 웰 미세평판, Merck, CLS3540-50EA)에 적용하였고, 남아있던 기포를 원심분리(1000 g, 4분)로 제거하였다. 25℃에서 10회 획득(5초 ~ 10초) 동안 시료를 측정하였다. 점도는 PBS로 설정하였다.
복합체 형성 실험 동안, A7은 자체의 가용성 표적 각각, 즉 인간 IL-17A 및 인간 TNFα와 함께, 표 32에 주어진 상대 몰비(A7상 결합 부위(파라토프)의 상대적 수 및 각각의 표적상 에피토프의 수), 그리고 KD보다 적어도 1000배 더 높은 농도(표 32)로 항온처리하였다. 각각의 에피토프/결합 부위 및 A7의 농도 범위는 0.5 μM 내지 5μM이었다.
시험한 각각의 결합 파트너 비율로 형성된 가용성 복합체들의 유체역학적 반경을 도 21, 도 22 및 도 23에 요약하였다. 회복한 가용성 단백질 농도의 백분율을 도 24, 도 25 및 도 26에 요약하였다.
Figure pct00046
1. 대부분의 조건에서 단백질 농도의 완전한 회복이 관찰되었는데, 이는 A7에 대한 불용성 복합체의 형성이 일어나지 않았거나 제한적임을 나타낸다.
2. 복합체 크기 형성(complex size formation)중 유체역학적 반경 증가는 제한적이었다(A7의 경우 최대 5배).
3. A7에 대한 가용성 복합체 형성 및 약간의 크기 증가로 인하여 면역원성 위험이 제한되었다.
4. 각각의 표적과 A7의 1가 결합은 복합체 형성시 약간의 크기 증가를 동반하며 가용성 복합체만의 형성을 촉진하였다.
결론:
항체 매개 면역 복합체 형성은 면역원성 및 면역 관련 부작용과 연관되어 있었다. 이러한 면역 복합체는, 예를 들어 2가 항체가 표적 분자, 즉 다량체 형태(즉, 이량체, 삼량체, 사량체 등)로 존재하는 표적 분자를 가교하는 경우 형성되었다. 삼량체 표적(예컨대 TNFα)의 경우 항체는 자체의 Fab 팔 2개를 통해 상이한 TNF 삼량체 2개와 결합하여, 소형의 가용성 복합체를 생성할 수 있었다. 복합체를 점유하고 있는 TNF 삼량체 2개 각각의 미결합 단위 2개에는 다른 항체가 차례로 결합할 수 있었다. 다수의 항체에 의한 수반적 점유가 일어났을 때, 이는 고차원 복합체 및 면역 침전물 형성을 유도하였다. 이러한 대형 면역 복합체는 치료 항체의 면역원성을 증가시켰고, 항 약물 항체의 형성과 면역 관련 부작용을 촉발할 수 있었다. 면역 복합체 형성의 위험은, 하나의 분자가 하나를 초과하는 표적류를 동시에 점유(각각 2가 상호 작용에 의함)할 수 있는 경우에 더욱 분명졌다. 이에 대한 예로서는 2가 결합 양상으로 자체의 표적 각각과 상호작용하는 2중 특이적 항 TNFα/IL-17 차단제 ABT122 및 COVA322가 있다. ABT122는 높은 발생률로 항 약물 항체 형성을 촉발하는 것으로 보고된 반면, COVA322는 면역 복합체 형성에 의해 촉발되는 것으로 추정되는 면역 관련 이상 반응(피부 발진)을 일으키기까지 했다.
여기에서 본 발명자들은 A7로 예시되는 2중 특이적 1가 scDb-scFv가, A7 결합 도메인과 동일한 결합 도메인을 포함하는 것으로서, 자체의 표적과 2가 방식으로 상호작용하는 2중 특이적 포맷(예컨대 A14 및 A15)와 비교되었을 때, 면역 복합체 형성을 매개하는 능력이 현저히 감소하였음을 확인하였다. 따라서 본 발명자들은 ADA 형성 위험이 감소한다는 점과, 위험 대 이익 프로필이 유리하다는 점을 근거로 하여 1가인 2중 특이적 포맷이 2가인 2중 특이적 포맷보다 바람직하다는 결론을 내리게 되었다.
종종 2가 포맷은 상대적으로 작은, 표적에 대한 친화성을 보상하기 위해 선택된다(예컨대 IL-17과 결합하는 COVA322). 따라서 다중 특이적 접근법에서 1가 포맷을 구현가능하게 하려면, 각각의 표적에 대한 친화성이 매우 커야 한다. A7(그리고 이의 변이체)내 Fv 도메인의 큰 친화성은 1가 포맷의 사용을 가능하게 하고, 그 결과 매우 강력한 2중 특이적 치료제가 실현된다.
그뿐만 아니라, 1가 2중 특이적 scDb-scFv 포맷에 Fc 영역이 존재하지 않으면, 면역 세포상 Fc 수용체와의 결합(이 또한 면역 관련 부작용 발생에 기여할 수 있음)이 방지될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Numab Therapeutics AG <120> MULTISPECIFIC ANTIBODIES HAVING SPECIFICITY FOR TNFa AND IL-17A, ANTIBODIES TARGETING IL-17A, AND METHODS OF USE THEREOF <130> 115527P877PC <150> EP19154852.8 <151> 2019-01-31 <150> EP19154846.0 <151> 2019-01-31 <150> EP19154850.2 <151> 2019-01-31 <160> 149 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody-related sequence <400> 1 Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asp Tyr Trp Met Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody-related sequence <400> 2 Cys Ile Tyr Ala Gly Asp Val Asp Asp Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala 1 5 10 15 Arg Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody-related sequence <400> 3 Arg Val Asp Gly Phe Asp Ile Thr Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody-related sequence <400> 4 Ser Asp Tyr Trp Met Cys 1 5 <210> 5 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Claims (15)

  1. IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인, 그리고 선택적으로 인간 혈청 알부민(HSA)과 특이적으로 결합하는 제3 도메인을 포하하는, 단리 다중 특이적 항체로서,
    (a) 상기 제1 도메인은 (i) CDR들의 세트, 즉 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각의 세트, 또는 (ii) CDR들의 세트, 즉 서열 번호 39, 40 및 41의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 50, 51 및 52의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각의 세트를 포함하고;
    (b) 상기 제2 도메인은 CDR들의 세트, 즉 서열 번호 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 76, 77 및 78의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각의 세트를 포함하고;
    (c) 상기 제3 도메인은, 이것이 존재할 경우, CDR들의 세트, 즉 (i) 서열 번호 90, 91 및 92의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 100, 101 및 102의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각의 세트; 또는 (ii) 서열 번호 111, 112 및 113의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 121, 122 및 123의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각의 세트를 포함하는, 단리 다중 특이적 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 IL-17A와 특이적으로 결합하는 도메인 단 하나 및/또는 TNFα와 특이적으로 결합하는 도메인 단 하나를 포함하고/포함하거나, 선택적으로 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 도메인 단 하나를 포함하는, 다중 특이적 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 도메인은 각각의 자체 항원 또는 수용체 와 동시에 결합할 수 있는 다중 특이적 항체.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 하기 특성들을 가지는, 즉 상기 항체는
    (a) HT-29 검정에서 Gro-α 분비 측정에 의해 확정되는 역가, 즉 세쿠키누맙의 역가를 기준으로 하였을 때 2 이상의 역가(상대적 역가), 예컨대 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 바람직하게는 50 이상의 역가로 IL-17A를 중화하는 능력을 가지고[단 상기 상대적 역가는 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은 세쿠키누맙의 IC50 값(ng/mL) 대 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은 상기 다중 특이적 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비임];
    (b) HT-29 검정에서 Gro-α 분비 측정에 의해 확정되는 역가, 즉 서열 번호 149에 따른 scDb(A13)의 역가를 기준으로 하였을 때 적어도 1의 역가(상대적 역가), 예컨대 1 이상, 1.5 이상, 2 이상, 2.5 이상, 3 이상, 3.5 이상, 바람직하게는 4 이상, 더욱 바람직하게는 4.5 이상의 역가로 TNFα를 중화하는 능력을 가지고[단 상기 상대적 역가는 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은, 서열 번호 149에 따른 상기 scDb의 IC50 값(nM) 대 HT-29 검정에서 측정된 바와 같은 상기 다중 특이적 항체의 IC50 값(nM)의 비임];
    (c) 선택적으로 ELISA 검정에서 확정되는 역가, 즉 세쿠키누맙의 역가를 기준으로 하였을 때 2 이상의 역가(상대적 역가), 예컨대 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 바람직하게는 10 이상의 역가로 IL-17A와 IL-17RA 사이의 상호작용을 차단하는 능력을 가지고[단 상기 상대적 역가는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 세쿠키누맙의 IC50 값(ng/mL) 대 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 상기 다중 특이적 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비임];
    (d) 선택적으로 L929 검정에서 확정되는 역가, 즉 서열 번호 149에 따른 scDb(A13)의 역가를 기준으로 하였을 때 적어도 0.4의 역가(상대적 역가), 예컨대 적어도 0.5, 바람직하게 적어도 1의 역가로 TNFα를 중화하는 능력을 가지고[단 상기 상대적 역가는 L929 검정에서 측정된 바와 같은, 서열 번호 149에 따른 상기 scDb의 IC50 값(nM) 대 L929 검정에서 측정된 바와 같은 상기 다중 특이적 항체의 IC50 값(nM)의 비임];
    (e) 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 바람직하게 0.5 nM 미만으로 인간 IL-17A와 결합하고, 선택적으로 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 KD 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 바람직하게 0.5 nM 미만으로 사이노몰거스 IL-17A와 결합하고;
    (f) 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 바람직하게 0.5 nM 미만, 더욱 바람직하게 0.25 nM 미만으로 인간 TNFα와 결합하고;
    (g) 선택적으로 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 바람직하게 2 nM 미만으로 인간 혈청 알부민과 결합하고, 선택적으로는 표면플라스몬공명법에 의해 측정된 바에 따르면 해리 상수(KD) 5 nM 미만, 예컨대 4 nM 미만, 3 nM 미만, 바람직하게 2 nM 미만으로 사이노몰거스 혈청 알부민과 결합하는, 다중 특이적 항체.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 하기의 특성들을 가지는, 즉 상기 항체는
    (a) 인산염-시트르산염 완충제(pH 6.4, 150 mM NaCl 포함)중 시차주사형광측정법에 의해 확정된 용융 온도(Tm)가 적어도 55℃, 바람직하게 적어도 58℃, 더욱 바람직하게 적어도 60℃이고;
    (b) 상기 다중 특이적 항체의 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.4)중 출발 농도가 10 mg/ml일 때, 5회 연속 동결-해동 주기 후 단량체 함량 감소율이 5% 미만, 예컨대 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 바람직하게 1% 이하이고;
    (c) 상기 다중 특이적 항체의 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.4)중 출발 농도가 10 mg/ml일 때, 적어도 2주, 특히 적어도 4주 동안 4℃에 보관하였을 때 단량체 함량 감소율이 10% 미만, 바람직하게 5% 미만이고/이거나;
    (d) 상기 다중 특이적 항체의 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.4)중 출발 농도가 10 mg/ml일 때, 적어도 2주, 특히 적어도 4주 동안 37℃에 보관하였을 때 단량체 함량 감소율이 20% 미만, 바람직하게 15% 미만인, 다중 특이적 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인 및/또는 상기 제2 도메인, 그리고/또는 선택적으로 상기 제3 도메인은 중쇄 가변 영역 VH를 포함하고, 상기 VH는 VH3 또는 VH4, 바람직하게는 VH3인 다중 특이적 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인 및/또는 상기 제2 도메인, 그리고/또는 선택적으로 상기 제3 도메인은 경쇄 가변 영역 VL을 포함하고, 상기 VL은 Vκ 틀 FR1, FR2 및 FR3, 구체적으로 Vκ1 또는 Vκ3 FR1 ~ FR3, 바람직하게 Vκ1 FR1 ~ FR3, 및 Vκ FR4, 구체적으로 Vκ1 FR4, Vκ3 FR4, 및 Vλ FR4, 구체적으로 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 26 ~ 서열 번호 32중 임의의 것에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 바람직하게 서열 번호 26 또는 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4, 더욱 바람직하게 서열 번호 27에 제시된 바와 같은 Vλ FR4로부터 선택된 틀 FR4를 포함하는, 다중 특이적 항체.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 제1 도메인의 상기 VH는 아미노산 서열인 서열 번호 10과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 제1 도메인의 상기 VL은 아미노산 서열인 서열 번호 21과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고,
    바람직하게 상기 제1 도메인의 상기 VH는 서열 번호 10 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 제1 도메인의 상기 VL은 서열 번호 21 및 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    더욱 바람직하게 상기 제1 도메인의 상기 VH는 서열 번호 10에 제시된 바와 같고/같거나 상기 제1 도메인의 VL은 서열 번호 21에 제시된 바와 같은, 다중 특이적 항체.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 도메인의 상기 VH는 서열 번호 72, 73, 74 또는 75로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 72와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 제2 도메인의 상기 VL은 서열 번호 85, 86, 87, 88 및 89로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열, 바람직하게 서열 번호 85와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 제2 도메인의 상기 VH는 서열 번호 72, 73, 74 또는 75로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 제2 도메인의 상기 VL은 서열 번호 85, 86, 87, 88 및 89로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게 상기 제2 도메인의 상기 VH는 서열 번호 72에 제시된 바와 같고/같거나 상기 제2 도메인의 상기 VL은 서열 번호 85에 제시된 바와 같은, 다중 특이적 항체.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 도메인이 존재하고,
    (i) 상기 제3 도메인의 상기 VH는 아미노산 서열인 서열 번호 99와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 제3 도메인의 상기 VL은 아미노산 서열인 서열 번호 108과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 제3 도메인의 상기 VH는 서열 번호 99의 서열에 제시된 바와 같고/같거나 상기 제3 도메인의 VL은 서열 번호 108에 제시된 바와 같거나; 또는
    (ii) 상기 제3 도메인의 상기 VH는 아미노산 서열인 서열 번호 120과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나; 상기 VL은 아미노산 서열인 서열 번호 130과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 제3 도메인의 상기 VH는 서열 번호 120에 제시된 바와 같고/같거나 상기 제3 도메인의 상기 VL은 서열 번호 130에 제시된 바와 같은, 다중 특이적 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중 특이적 항체는 단일 사슬 다이아바디(scDb), 탠덤 scDb(Tandab), 선형 이량체 scDb(LD-scDb), 원형 이량체 scDb(CD-scDb), 2중 특이적 T 세포 점유체(BiTE; 탠덤 디-scFv), 탠덤 트리-scFv, 트리바디(Fab-(scFv)2), 바이바디(Fab-(scFv)1), Fab, Fab-Fv2, Morrison(IgG CH3-scFv 융합체(Morrison L) 또는 IgG CL-scFv 융합체(Morrison H)), 트리아바디, scDb-scFv, 2중 특이적 Fab2, 디-미니항체, 테트라바디, scFv-Fc-scFv 융합체, scFv-HSA-scFv 융합체, 디-다이아바디, DVD-Ig, COVD, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, IgG-scFv 융합체, 예컨대 bsAb(경쇄의 C 말단에 결합된 scFv), Bs1Ab(경쇄의 N 말단에 결합된 scFv), Bs2Ab(중쇄의 N 말단에 결합된 scFv), Bs3Ab(중쇄의 C 말단에 결합된 scFv), Ts1Ab(경쇄와 중쇄 둘 다의 N 말단에 결합된 scFv), Ts2Ab(중쇄의 C 말단에 결합된 dsscFv), 이종 이량체 Fc 도메인을 기반으로 하는 2중 특이적 항체, 예컨대 납-인투-홀 항체(KiH); Fv, scFv, scDb, 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv, Fab-(scFv)2, Fab-(scFv)1, Fab, Fab-Fv2, 이종 이량체 Fc 도메인 또는 기타 임의의 이종 이량체 도메인의 사슬 중 어느 하나의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합된 COVD, MATCH 그리고 듀오바디로 이루어진 군으로부터 선택된 포맷을 취하고, 바람직하게는 트리바디 또는 scDb-scFv를 취하는 다중 특이적 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147 및 148중 임의의 것으로부터 선택된 서열, 바람직하게 서열 번호 143의 서열에 대해 적어도 80%의 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 항체는
    (i) 서열 번호 1, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 12, 13 및 14의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하는, IL-17A와 특이적으로 결합하는 제1 도메인,
    (ii) 서열 번호 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 76, 77 및 78의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하는, TNFα와 특이적으로 결합하는 제2 도메인, 그리고
    (iii) 서열 번호 90, 91 및 92의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 서열 각각과, 서열 번호 100, 101 및 102의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열 각각을 포함하는, HSA와 특이적으로 결합하는 제3도메인
    을 포함하되, 단 상기 항체는 서열 번호 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147 및 148중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 바람직하게는 서열 번호 143의 아미노산 서열을 포함하는, 다중 특이적 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 의한 다중 특이적 항체와, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  14. 의약품으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 의한 다중 특이적 항체 또는 제13항에 의한 약학 조성물.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 의한 다중 특이적 항체 또는 제14항에 의한 약학 조성물을 포함하는 키트.
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