MX2012005164A - Tratamiento de cancer que involucra genes kras o braf mutados. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para tratar cáncer en un sujeto en donde el cáncer comprende genes KRAS o BRAF mutados. El método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo compite con SC1O4 para el enlace a la línea de células de cáncer de colon humano Co1o205.

Description

TRATAMIENTO DE CÁNCER QUE INVOLUCRA GENES KRAS O BRAF MUTADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a métodos para tratar cáncer en un sujeto en donde el cáncer comprende genes KRAS o BRAF mutados . El método involucra la administración de un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo al sujeto. La presente invención también se relaciona a métodos de tratamiento de cáncer que involucran la determinación del estado de KRAS o BRAF del paciente.

ANTECEDENTES Las estructuras de carbohidrato pueden ser antigenos específicos de tumor o asociados con tumor y asi son el enfoque de muchas estrategias de inmunización de generación de anticuerpo. Sin embargo, la generación de anticuerpos específicos de anti-carbohidrato es una tarea de gran reto ya que puede carecer de especificidad, afinidad o son solamente de la clase IgM (Christensen y colaboradores, 2009) . Por otra parte, la generación de anticuerpos anticarbohidrato humanizados que tienen la capacidad para exterminar células de cáncer es una tarea de gran reto, un hecho que es reflejado en el número raro de reportes sobre tales anticuerpos. Hay solamente un ejemplo de un anticuerpo anti-glicolípido que se ha humanizado exitosamente; el anticuerpo reconoce el gangliósido GM2 y extermina las células de tumor humanas in vitro e in vivo (patentes norteamericanas 6,423,511 y 6,872,392). Aunque no humanizados hay otros dos ejemplos de anticuerpos de enlace de carbohidrato que se han diseñado para la administración humana. En primer lugar, el anticuerpo ant i-carbohidrato RAV-12 es un IgGi de ratón-humano quimérico que muestra eficacia in vitro e in vivo contra células de cáncer de colon humano (Loo y colaboradores, 2007). En segundo lugar, el anticuerpo anti-carbohidrato HMMC-1 ha mostrado eficacia in vitro contra el cáncer ovárico humano. HMMC-I es un anticuerpo completamente humano generado por ratones KM transcromosómicos (Nozawa y colaboradores, 2004).

La solicitud de patente internacional No. WO 2005/108430 divulga un anticuerpo monoclonal de ratón anticáncer que es designado SC104. Las secuencias CDR de este anticuerpo se exponen en la Tabla 1. La descripción de esta solicitud se incorpora en la presente por referencia. La naturaleza exacta del antigeno al cual SC104 se enlaza es poco entendible pero WO2005/108430 sugiere que el antigeno es un carbohidrato de sialiltetraosilo . También se divulga que SC104 es capaz de inducir directamente la muerte célular sin la necesidad para células efectoras inmunes. Como es descrito en la solicitud de patente internacional copendiente No. WO 2010/105290, un número de versiones humanizadas de SC104 se han desarrollado. La descripción de esta solicitud también se incorpora en la presente por referencia.

El tratamiento terapéutico de cánceres humanos es un gran reto y puede, en algunos casos, ser aumentado al correlacionar biomarcadores moleculares con el efecto del tratamiento. Por ejemplo, las mutaciones en los genes KRAS (alternativamente llamado ki-ras o k-ras) o BRAF dan origen a proteínas con propiedades de señalización alteradas en las células de tumor. Las mutaciones en estos biomarcadores se conocen que se correlacionan con efectos no exitosos en el tratamiento de cáncer que usan anticuerpos terapéuticos que se dirigen al receptor de factor de crecimiento epidérmico, por ejemplo, cetuximab o panitumumab (Amado, olf y colaboradores 2008; Karapetis, Khambata-Ford y colaboradores 2008; Di Nicolantonio, Martini y colaboradores 2008; Loupakis, Ruzzo y colaboradores 2009; Lievre, Bachet y colaboradores 2006) . Las mutaciones KRAS son de significado medico particular ya que ocurren en 35%-45% de pacientes de cáncer colorrectal; las mutaciones BRAF ocurren en menos de 15% (Siena, Sartore-Bianchi y colaboradores 2009) . Además, las mutaciones KRAS se encuentran en 70%-95% de tejidos de carcinoma pancreático (Saif y colaboradores 2007).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar cáncer en un sujeto en donde el cáncer comprende genes KRAS o BRAF mutados, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo compite con SC104 para el enlace a la línea de células de cáncer de colón humano Colo205.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar cáncer en un sujeto, el método gue comprende someter a prueba el cáncer para la presencia de genes KRAS o BRAF mutados y la administración a los sujetos en los cuales el cáncer comprender genes KRAS o BRAF mutados de una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo compite con SC104 para el enlace a la línea de células de cáncer de colon humano Colo205.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que compite con SC104 para el enlace a la línea de células de cáncer de colon humano Colo205 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer en un sujeto en donde el cáncer comprende genes KRAS o BRAF mutados .

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que compite con SC104 para el enlace a la línea de células de cáncer de colon humano Colo205 en el tratamiento de cáncer de un sujeto en donde el cáncer comprende genes KRAS o BRAF mutados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 - El anticuerpo SC104 humanizado (SEQ ID N0:7/SEQ ID NO:50) se enlaza al cáncer gastrointestinal humano con los genes KRAS mutados y de tipo silvestre. Mostrado en la Figura 1 están la intensidad de enlace de inmunohistoquimica individual y media a un panel de muestras de tumor de donador (n=número de donadores); no hubo diferencia estadística significante de intensidad de manchado entre los grupos de tipo silvestre o mutados de cada tipo de tumor respectivo como es determinado por una prueba de Mann- hitney .

Figura 2 - El anticuerpo SC104 humanizado (SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:94) se enlaza a las células de cáncer de colon humano con genes KRAS mutados y de tipo silvestre, como es determinado mediante la inmunohistoquimica.

Figura 3 - Las variantes de anticuerpo SC104 humanizado que incorporan la estructura 1U6A (VL/VH SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50 and SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:25) y las variantes de anticuerpo SC104 humanizado que incorporan la estructura 1QLR (VL/VH SEQ ID NO:8/SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO:8/SEQ ID NO: 26) tienen potente citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo como es determinado mediante ensayos de liberación de LDH utilizando la línea de células de cáncer de colon humano C170 positiva de antigeno SC104. El anticuerpo SC104 quimérico (SEQ ID N0:4/SEQ ID N0:2) se muestra como un comparador y el isotipo IgGl humano se utiliza como un control negativo. Cada punto representa la media ± SD de tres muestras replicadas.

Figura 4 - Las variantes de anticuerpo SC104 humanizado que incorporan la estructura 1U6A (VL/VH SEQ ID N0:7/SEQ ID NO:50 y SEQ ID N0:7/SEQ ID NO:25) y las variantes de anticuerpo SC104 humanizado que incorporan la estructura 1QLR (VL/VH SEQ ID NO:8/SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO:8/SEQ ID NO: 26) tienen potente citotoxicidad dependiente de complemento como es determinado mediante los ensayos de viabilidad celular utilizando la linea de células de cáncer de colon humano Colo205 positiva de antigeno SC10 . El anticuerpo SC104 quimérico (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO: 2) se muestra como un comparador junto con un control negativo de isotipo IgGl humano. Cada punto representa la media ± SD de tres muestras replicadas.

Figura 5 - El anticuerpo SC104 humanizado (SEQ ID NO:7/SEQ ID NO: 50) tiene potente citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo contra la linea de células de cáncer de colon humano DLD-1 (KRAS mutado) como es estimado mediante ensayos de liberación de LDH. El isotipo IgGl humano se utiliza como un control negativo. Cada punto representa la media ± SD de tres muestras replicadas.

Figura 6 - El anticuerpo SC104 humanizado (SEQ I D N0:7/SEQ ID NO: 50) tiene potente citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo contra las lineas de célula de cáncer de colon humano Colo201 (A), Colo205 (B) , WiDr (C) y HT-29 (BRAF mutado) ( D ) como es estimado mediante los ensayos de liberación de LDH . El isotipo IgGl humano se utiliza como un control negativo para Colo201. Cada punto representa la media ± SD de tres muestras replicadas.

Figura 7 - El anticuerpo SC104 humanizado tratado con Kifunensina (SEQ I D NO:7/SEQ ID NO:50) tiene citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo más alta comparada con el anticuerpo no tratado como es estimado mediante ensayos de liberación de LDH utilizando las lineas de células de cáncer de colon humano WiDr positivas de antigeno SC104. Cada punto representa la media ± SD de tres muestras replicadas.

Figura 8 - El tratamiento de ratones que llevan tumor de xenoinjerto HT2 9 con el anticuerpo SC104 humanizado (SEQ I D NO : 7 /SEQ I D NO: 50) conduce a una carga de tumor reducida, significante comparada con el tratamiento de control de vehículo. A: media ± SEM del volumen de tumor en grupos de 6-10 ratones. Los asteriscos indican diferencias significantes entre los grupos de tratamiento, p<0.05 prueba de Mann-Whitney . B : peso del tumor medio e individual al final del estudio. Valor P como es determinado por la prueba de Mann- Whitney.

Figura 9 - El anticuerpo competidor (SEQ ID NO:7/SEQ ID NO: 50 (- ? -)), pero no el anticuerpo de control de isotipo humano (-o-) , marcadamente reduce el enlace del anticuerpo SC104 de ratón marcado fluorescentemente (A - 1 ug/ml; B - 10 ug/ml) como es estimado mediante la citometria de flujo utilizando la linea de células positiva de antigeno Colo205.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a métodos para tratar cáncer en el cual el cáncer comprende mutaciones en ya sea los genes KRAS o BRAF. El método involucra el uso de anticuerpos o fragmentos de enlace de antigeno de los mismos que compiten con SC104 para el enlace a la linea de células de cáncer de colon humano Colo205. En varias modalidades la invención involucra el uso de SC104, quimeras SC104, SC104 humanizado, SC104 desinmunizado o fragmentos de enlace de los mismos en el tratamiento de cáncer en donde el cáncer comprende mutaciones en cualquiera de los genes KRAS o BRAF. Se prefiere que el anticuerpo no sea SC104.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar cáncer en un sujeto en donde el cáncer comprende genes KRAS o BRAF mutados, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo compite con SC104 para el enlace a la linea de células de cáncer de colon humano Colo205.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar cáncer en un sujeto, el método que comprende someter a prueba el cáncer para la presencia de genes KRAS o BRAF mutados y la administración a los sujetos en los cuales el cáncer comprende genes KRAS o BRAF mutados de una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo compite con SC104 para el enlace a la linea de células de cáncer de colon humano Colo205.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo que compite con SC104 para el enlace a la linea de células de cáncer de colon humano Colo205 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer en un sujeto en donde el cáncer comprende genes KRAS o BRAF mutados .

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo que compite con SC104 para el enlace a la linea de células de cáncer de colon humano Colo205 en el tratamiento de cáncer en un sujeto en donde el cáncer comprende genes KRAS o BRAF mutados.

Como se utiliza en la presente "compite" significa que el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo cuando se utiliza en la misma concentración como SC104 reduce el enlace de SC104 a la linea de células de cáncer de colon humano Colo205 por al menos 10%. El nivel de enlace de SC104 a Colo205 se puede estimar en un ensayo de enlace basado en citometria de flujo conocido para aquellos expertos en la técnica. En tal ensayo la señal de enlace del anticuerpo SC104 marcado con fluorocromo a Colo205 se mide en la presencia de varias diluciones del anticuerpo competidor. La marcación con fluorocromo de SC104 podría ser lograda mediante la conjugación directa o mediante métodos de detección indirecta tal como el anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo o biotina/estreptavidina-fluorocromo de SC104 que detecta SC104 pero no el anticuerpo competido .

Como será apreciado se prefiere que el estado de KRAS y/o BRAF del cáncer sea determinado antes de la terapia. Métodos para determinar si las células comprenden genes KRAS o BRAF mutados son bien conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen aquellos descritos en (Lievre, Bachet y colaboradores 2006) y (Seth, Crook y colaboradores 2009) .

En varias formas de la invención el anticuerpo es SC104 de ratón (regiones variables listadas en S EQ ID N0:3/SEQ ID N0:1) o quimera SC104. Como será entendido una quimera es un anticuerpo en la cual la región constante de murino se ha reemplazado con una región constante de humano o de primate. Un ejemplo de tal quimera se muestra en SEQ ID N0:4/SEQ ID NO: 2. Como se menciona en lo anterior se prefiere que el anticuerpo no sea SC104 con el fin de evitar una respuesta de Anticuerpo Anti Ratón Humana (HAMA) en humanos.

En otras formas de la invención el anticuerpo es una versión desinmunizada de SC104 o un fragmento de enlace de antigeno del mismo. La desinmunización de anticuerpos es una metodología bien entendida en la técnica. Por ejemplo la reducción de la inmunogenicidad de anticuerpos tales como anticuerpos de murino mediante la desinmunización es descrita en los documentos WO 00/34317, WO 98/52976, WO 02/079415, WO 02/012899 y WO 02/069232 (las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia cruzada) . En general, la desinmunización comprende llevar a cabo sustituciones de aminoácidos con epítopes de célula T potenciales. De esta manera, la probabilidad de que una secuencia dada dará origen a epítopes de célula T en el procesamiento de proteína intracelular se reduce. Por otra parte, el documento WO 92/10755 describe un procedimiento en el cual se diseñan determinantes antigénicos sobre proteínas. Particularmente, las proteínas son mapeadas con epítope y su secuencia de aminoácidos es cambiada a través de la ingeniería genética.

En otras modalidades el anticuerpo es una versión humanizada de SC104. En general, la humanización comprende sustituciones de secuencias de anticuerpo no humanas para secuencias humanas correspondientes, como por ejemplo es el caso con el injerto de CDR. Ejemplos de este procedimiento se describen en el documento WO 91/09968 y la patente norteamericana No. 6,407,213. Como es mencionado en lo anterior, un número de versiones humanizadas de SC104 se han desarrollado que compiten con SC104 para el enlace a la línea de células de cáncer de colon humano Colo205. Estos anticuerpos humanizados se describen en la solicitud de patente internacional copendiente No. WO 2010/105290.

A este respecto en una modalidad de la presente invención el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende por lo menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEC ) ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ : ID NO : 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, : SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO :34, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO :38, SEQ ID NO :39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO :42, SEQ ID NO :43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID O: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: :87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, y SEQ ID NO: 94.

En una modalidad preferida adicional del anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo comprende combinaciones de cadena ligera y pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:7/SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:38.

Como será apreciado las secuencias descritas en la presente invención se pueden modificar utilizando los métodos bien conocidos en la técnica para incrementar el enlace, mediante por ejemplo, la maduración de afinidad, o para disminuir la inmunogenicidad al remover las porciones de enlace de MHC clase II predichas. La utilidad terapéutica de las secuencias desarrolladas y descritas en la presente se puede aumentar adicionalmente al modular sus características funcional, tal como la citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) , citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) , y la media del suero, biodistribución y enlace de los receptores Fe o la combinación de cualquiera de estos. Esta modulación se puede lograr mediante la ingeniería de proteína, o métodos de glico-ingeniería o químicos. Dependiendo de la aplicación terapéutica requerida, podría ser ventajoso ya sea incrementar o disminuir cualquiera de estas actividades.

Un ejemplo de glico-ingeniería utilizada es el método Potelligent® como es descrito en Shinkawa T. y colaboradores, 2003 (J Biol Chem 278:3466-73). Las regiones de cadena ligera y pesada variable de las variantes de anticuerpo humanizado se expresaron como un IgGl en una estructura principal de región constante estándar. La secuencia de la cadena pesada constante fue GenBank número de acceso P01857.1 y la secuencia de la cadena ligera constante fue NCBI número de acceso P01834.

Numerosos métodos para la maduración por afinidad de anticuerpos son conocidos en la técnica. Muchos de estos se basan en estrategia general de generar paneles o librerías de proteínas variantes mediante mutagénesis seguido por la selección y/o clasificación para la afinidad mejorada. La mutagénesis frecuentemente se realiza en el nivel de DNA, por ejemplo mediante la PCR propensa a error (Thie, Voedisch y colaboradores 2009) , mediante el entremezclado de genes (Kolkman and Stemmer 2001), mediante el uso de sustancias químicas mutagénicas o irradiación, mediante el uso de cepas 'imitadoras' con maquinaria de replicación propensa a error (Greener 1996) o mediante procedimientos de hipermutación somática que utiliza la maquinaria de maduración de afinidad natural (Peled, Kuang y colaboradores 2008). La mutagénesis también se puede realizar en el nivel de RNA, por ejemplo mediante el uso de <2ß replicasa (Kopsidas, Roberts y colaboradores 2006) . Los métodos basados en librería permiten la clasificación para proteínas variantes mejoradas que se pueden basar en varias tecnologías de exhibición tal como fago, levadura, ribosoma, o células bacterianas o mamíferas, y son bien conocidos en la técnica (Benhar 2007) . La maduración por afinidad se puede lograr mediante métodos más dirigidos/predictivos, por ejemplo, mediante la mutagénesis dirigida al sitio o la síntesis génica guiada por descubrimientos de la modelación de proteína 3D (ver por ejemplo Queen, Schneider y colaboradores 1989 o la patente norteamericana 6,180,370 o la patente norteamericana 5, 225, 539) .

Métodos para incrementar ADCC se han descrito por Ferrara, Brunker y colaboradores 2006; Li, Sethuraman y colaboradores 2006; Stavenhagen, Gorlatov y colaboradores 2007; Shields, Namenuk y colaboradores 2001; Shinkawa, Nakamura y colaboradores 2003; and WO 2008/006554.

Métodos para incrementar CDC se han descrito por Idusogie, Wong y colaboradores 2001; Dall'Acqua, Cook y colaboradores 2006; ichaelsen, Aase y colaboradores 1990; Brekke, Bremnes y colaboradores 1993; Tan, Shopes y colaboradores 1990; y Norderhaug, Brekke y colaboradores 1991.

Las referencias que describen métodos para incrementar ADCC y CDC incluyen Natsume, In y colaboradores 2008. La descripción de cada una de estas referencias se incluye en la presente por referencia cruzada.

Un número de métodos para modular la vida media en el suero del anticuerpo y la biodistribución están basados en modificar la interacción entre el anticuerpo y el receptor Fe neonato (FcRn), un receptor con una función clave en proteger la IgG del catabolismo, y mantener la alta concentración de anticuerpo en el suero. Dall'Acqua y colaboradores describe sustituciones de la región Fe de IgGl que aumentan la afinidad de enlace a FcRn, para de esta manera incrementar la vida media en el suero (Dall'Acqua, Woods y colaboradores 2002) y además demuestran la biodisponibilidad aumentada y la modulación de la actividad ADCC con sustitución de triple de M252Y/S254T/T256E (Dall'Acqua, Kiener y colaboradores 2006). Ver también las patentes norteamericanas Nos 6,277,375; 6,821,505; y 7,083,784. Hinton y colaboradores han descrito sustituciones de aminoácido de dominio constante en las posiciones 250 y 428 que confieren vida media in vivo incrementada (Hinton, Johlfs y colaboradores 2004). (Hinton, Xiong y colaboradores 2006) . Ver también la patente norteamericana No 7,217,797. Petkova y colaboradores han descrito sustituciones de aminoácido de dominio constante en las posiciones 307, 380 y 434 que confieren vida media in vivo incrementada (Petkova, Akilesh y colaboradores 2006). Ver también Shields y colaboradores 2001 y el documento WO 2000/42072. Otros ejemplos de sustituciones de aminoácido de dominio constante que modula el enlace a los receptores Fe y la función subsecuente mediada por estos receptores, incluyendo el enlace de FcRn y la vida media en el suero, se describen en las solicitudes de patente norteamericana Nos 20090142340; 20090068175; y 20090092599.

Los glicanos enlazados a moléculas de anticuerpo se conocen que influencian las interacciones de anticuerpo con receptores Fe y receptores de glicano y de esta manera influencian la actividad del anticuerpo, incluyendo la vida media en el suero (Kaneko, Nimmerjahn y colaboradores 2006; Jones, Papac y colaboradores 2007; y Kanda, Yamada y colaboradores 2007). Por consiguiente, ciertas glicoformas que modulan las actividades de anticuerpo deseadas deben conferir ventaja terapéutica. Métodos para generar glicoformas diseñadas son conocidos en la técnica e incluyen pero no están limitados a aquellos descritos en las patentes norteamericanas Nos 6,602,684; 7,326,681; 7,388,081; y WO 2008/006554.

La extensión de la vida media mediante la adición de polietilenglicol (PEG) se ha utilizado ampliamente para extender la vida media en el suero de las proteínas, como es revisado, por ejemplo, por Fishburn 2008.

Como será reconocido es posible hacer sustituciones de aminoácido conservativas dentro de las secuencias de la invención actual. Por "sustitución conservativa" se proponen aminoácidos que tienen propiedades similares. Como se utiliza en esta especificación los siguientes grupos de aminoácidos se van a observar como sustituciones conservativas: H, R y K; D, E, N y Q; V, I y L; C y M; S, T, P, A y G; y F, Y y W.

Por toda esta especificación la palabra "comprende" o variaciones tales como "se comprende" o "que comprende" será entendido que implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa establecido, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entro o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Todas las publicaciones mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente por referencia.

Cualquier discusión de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o similares que se han incluido en la presente especificación es solamente para el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. No se va a tomar como una admisión de que cualquiera o todas estas materias forman parte de la base de la técnica previa o fueron del conocimiento general común en el campo relevante de la presente invención como existió en Australia o en otra parte antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

Con el fin de que la naturaleza de la presente invención se pueda entender mejor, formas preferidas de la misma ahora serán descritas por referencia en los siguientes Ej emplos .

EJEMPLO 1 Protocolo de Inmunohistoquímica Un microarreglo de tejido humano de multi-tumor que contiene muestras de una gama de tipos de tumor de diferentes donadores se clasificó para el enlace a las variantes de anticuerpo SC104 humanizado biotinilado utilizando la inmunohistoquímica. El isotipo IgGi humano biotinilado se utilizó para el manchado de control negativo. La inmunorreactividad mediante el anticuerpo se graduó mediante la inspección visual en una escala de cuatro etapas basada en la intensidad de manchado y el porcentaje de células positivas .

La variante de anticuerpo SC104 humanizado se enlaza a varios tipos de cáncer humano Un número de diferentes tipos de cáncer de diferentes pacientes humanos se analizaron para el enlace con un anticuerpo SC104 humanizado ( SEQ ID NO:7/SEQ ID NO: 50). El anticuerpo SC104 humanizado, pero no el control de isotipo humano, se enlazó a los tejidos de cáncer de colon humano demostrando la especificidad de las condiciones de enlace utilizadas (datos no mostrados). La Tabla 2 resume que el manchado de membrana positivo se encontró en el cáncer de colon hasta 75%. De manera sorprendente, el manchado positivo de alta frecuencia se encontró en el cáncer pancreático hasta 95% y aun grado menor en otros tumores sólidos. En contraste, no se observó manchado para tumores de estroma gastrointestinal. Estos resultados indican que el anticuerpo SC104 humanizado es útil para la diagnosis de tumor en indicaciones de malignidades colorrectales , pancreáticas, ováricas y de pulmón. Además, se puede contemplar que el anticuerpo SC104 humanizado es útil para el tratamiento terapéutico del cáncer colorrectal, pancreático, ovárico y de pulmón en humanos. Tal eficacia anti-tumor in vivo podría ser evaluada en modelos de xenoinjerto de tumor de ratón.

Un microarreglo de tejido adicional se construyó de tumores de colon y gástricos humanos primarios que se sometieron a pasaje como xenotransplantes en ratones desnudos. Las muestras de tumor se clasificaron para el enlace de anticuerpo SC104 humanizado utilizando un método de preformación de complejo de anticuerpo y visualización de HRP. El anticuerpo SC104 humanizado se preformó en complejo con un Fab-FITC anti-humano, se bloqueó con IgG humano en exceso y subsecuentemente este complejo se utilizó como el reactivo de anticuerpo primario que se incubó en el microarreglo de tejido. Para el manchado de control negativo el anticuerpo SC104 humanizado se intercambió con un control de isotipo IgGl humano. La inmunorreact ividad mediante el anticuerpo se graduó mediante la inspección visual en una escala de cinco etapas: 0=sin manchado, l=pocos puntos de manchado, 2=manchado positivo sólido, 3=>50% de manchado positivo, 4=manchado saturado. Los datos de manchado se representan como una media de tres secciones y se muestran en la Figura 1.

Análisis del estado del gen KRAS El DNA genómico de tumores humanos primarios sometidos a pasaje como xenotransplantes de ratón se analizaron en exon 1 y exon 2 del gen KRAS. El análisis de secuenciación de nucleótido reveló si los exones codificaron mutaciones normales o de activación en la proteína KRAS. La mayoría de las muestras KRAS mutadas fueron heterocigotas .

El anticuerpo SC104 humanizado (SEQ ID N0:7/SEQ ID NO:50) se enlaza al tenido de cáncer gastrointestinal humano con el estado del gen KRAS mutado normal utilizando el análisis de inmunohistoquímica (Figura 1).

El anticuerpo SC104 humanizado y diseñado con Potelligent® (SEQ ID N0:7/SEQ ID NO: 94) también se mostró mediante histoquimica que enlaza las células de cáncer de colon humano con los genes KRAS mutados o de tipo silvestre (Figura 2) .

EJEMPLO 2 Ensayos de enlace basados en citometría de flujo Células de tumor viables y células de control (2xl05, como es determinado mediante la exclusión de azul de tripano) se incubaron por triplicado con SC104 de ratón, SC104 quimérico o variantes humanizadas, y el isotipo IgGi humano (Sigma- Aldrich®) en varias concentraciones en 100 µ? de solución reguladora (PBS más FCS al 1%) en placas de 96 cavidades en V (Eppendorf) durante 20 min en hielo en la oscuridad. Las células se lavaron dos veces con solución reguladora antes de la incubación durante 20 min en 100 µ? de solución reguladora que contiene IgG anti-humano de cabra (especifico de Fe, Sigma- Aldrich®, conjugado a FITC) o IgG anti-ratón de cabra (especifico de Fe, Sigma- Aldrich®, conjugado a FITC) para detectar anticuerpos quiméricos o de ratón, respectivamente. Después del lavado, las células se resuspendieron en solución reguladora y analizaron para el enlace de anticuerpo mediante citometria de flujo en un Cell Lab Quanta™ SC MPL (Beckman Coulter) utilizando Volumen Electrónico (EV), dispersión lateral y compuerta de FL-1; durante la adquisición las células en la placa de 96 cavidades se enfriaron al someterlas a un empaque frió (Eppendorf ) . Los resultados se expresaron como intensidad fluorescente media (MFI); los valores dependientes de la curva se calcularon utilizando el análisis de regresión no lineal mediante el software GraphPad Prism®.

Ensayo de citotoxicidad mediado por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) Las células efectoras (mononucleares de sangre periférica) se purificaron de la preparación de Linfa Cuajada de donadores humanos normales (proporcionada por Australian Red Cross Blood Services) utilizando Lymphoprep™ de acuerdo con el protocolo del fabricante (Axis-Shield PoC AS) . Las células efectoras viables (5xl06/ml) se incubaron durante la noche en RPMI 1640 (Gibco®) más FCS al 10% a 37°C y 10% de C02. Las células objetivo de tumor y las células efectoras se lavaron en PBS seguido por el medio (RPMI1640 w/o rojo de fenol, Gibco®, más FCS al 0.5%), se resuspendieron en el medio y se incubaron con varias concentraciones de anticuerpo (SC104 quimérico, SC104 humanizado o isotipo IgGi humano, Sigma- Aldrich®, # 15154) por triplicado en placas de 96 cavidades en U (Corning®) en un ensayo de 200 µ? que consiste de las siguientes concentraciones finales: células objetivo, lxlO5 células/ml; células efectoras, 2.5xl06 células/ml; intervalo de anticuerpo 10 a 0.001 ug/ml. Para los controles, las células objetivo solamente se incubaron en la ausencia (objetivo min) o presencia (objetivo max) de Triton®-X al 1% (Sigma- Aldrich®) , y las células objetivo y efectoras (antecedente) se incubaron en la ausencia de anticuerpo. Las placas se centrifugaron durante 2 min a 160 xg y se incubaron en una atmósfera de C02 humidificada en 37 °C durante 4 horas. La muerte celular se midió utilizando un ensayo de liberación de Lactato Deshidrogenasa . Brevemente, las placas se centrifugaron durante 5 min en 250 xg y 100 µ? de sobrenadante de células se analizó para la liberación de Lactato Deshidrogenasa utilizando el Equipo de Detección de Citotoxicidad (Roche) de acuerdo con las guias del fabricante. Para minimizar la contaminación de las células portadoras el sobrenadante se filtró a través de una placa AcroPrep™ de 0.2 mieras de 96 cavidades (Pall) . La liberación de LDH se cuantificó al leer la absorbancia en 492 nm y el porcentaje de citotoxicidad se calculó utilizando la siguiente fórmula: lOOx [muestra - media (antecedente)] / media (objetivo max - objetivo min) ; los valores de EC50 se calcularon utilizando el análisis de regresión no lineal mediante el software GraphPad Prism®.

Ensayo de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) Las células objetivo de tumor viable se incubaron en el medio (RPMI1640 w/o rojo de fenol, Gibco®, más FCS al 5%), con suero de complemento humano (Sigma- Aldrich® #S1764) y varias concentraciones de anticuerpo (SC104 quimérico, SC104 humanizado o isotipo IgGi humano, Sigma-Aldrich®, # 15154) por triplicado en placas de 96 cavidades planas (Corning®) en un ensayo de 150 µ? que consiste de las siguientes concentraciones finales: células objetivo, 13.3xl04 células/ml; complemento, 15%; intervalo de anticuerpo 10 a 0.01 ug/ml. Para los controles, las células objetivo solamente se incubaron en la ausencia (antecedente objetivo) o presencia (antecedente objetivo y complemento) del complemento, y el complemento (antecedente de complemento) se incubó en el medio solamente. Las placas se centrifugaron durante 2 min en 160 xg y se incubaron en una atmósfera de CO2 humidificada en 37°C durante 2-3 horas. La muerte celular se midió utilizando el equipo CellTiter 96® (Promega®) de acuerdo con las guias del fabricante incluyendo un período de incubación adicional de 3-4 horas. La muerte de células objetivo se cuantificó en la absorbencia en 492 nm y el porcentaje de citotoxicidad se calculó utilizando la siguiente fórmula lOOx [muestra - media (antecedente objetivo y complemento) ] / [media (antecedente de complemento) - media (antecedente de objetivo y complemento)]; los valores de EC50 se calcularon utilizando el análisis de regresión no lineal mediante el software GraphPad Prism®.

Las variantes de anticuerpo SC104 humanizado novedosas tienen potente citotoxicidad contra células de tumor de colon humano Las citotoxicidad contra las células de tumor de colon de variantes SC104 humanizadas se probó en la citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo y los ensayos de citotoxicidad dependiente de complemento. Las variantes de anticuerpo SC104 humanizado y el anticuerpo SC104 quimérico, pero no el control de isotipo humano, tuvo potente citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo contra las células de tumor C170 utilizando células mononucleares de sangre periférica de un donador humano normal (Figura 3) . Resultados similares se obtuvieron utilizando células mononucleares de sangre periférica de otros donadores humanos (datos no mostrados) . La Figura 4 muestra que el mismo panel de variantes de anticuerpo SC104 humanizado y el anticuerpo SC104 quimérico, pero no el control de isotipo humano, tiene potente citotoxicidad dependiente del complemento contra las células de tumor Colo205 utilizando el complemento humano. Las actividades de enlace y exterminación para las variantes de anticuerpo SC104 humanizado se resumen en la Tabla 3.

EJEMPLO 3 Ensayos de exterminación directa basada en citometria de fl uj o Células de tumor viables (2xl05, como es estimado mediante la exclusión con azul de tripano) se incubaron por triplicado con SC104 de ratón, SC104 quimérico o variantes humanizadas y el isotipo de IgGi humano (Sigma- Aldrich®) en varias concentraciones en 80 µ? de solución reguladora (PBS más FCS al 1%) en placas de 96 cavidades en V (Eppendorf) durante 2.5 a 3 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. A cada cavidad se adicionó 0.15 g de 7AAD (BD® Biosciences) en 20 µ? de solución reguladora, y las células se incubaron durante 20 min adicionales antes de que la viabilidad de enlace estimada se analizara mediante la citometría de flujo en un Cell Lab Quanta™ SC MPL (Beckman Coulter) utilizando Volumen Electrónico (EV) , dispersión lateral y compuerta FL-3; durante la adquisición a las células en la placa de 96 cavidades se enfriaron al someterlas a un empaque frió (Eppendorf) . Los resultados se expresaron como porcentaje de células 7AAD+'; los valores dependientes de la curva se calcularon utilizando el análisis de regresión no lineal mediante el software GraphPad Prism®.

Actividad de enlace y exterminación contra líneas de células pancreáticas humanas El anticuerpo SC104 humanizado y diseñado con Potelligent® (SEQ ID NO:7/SEQ ID NO: 94) se enlaza a y directamente extermina las lineas de célula de tumor pancreático humano con o sin mutaciones KRAS como es medido en los ensayos de citometría de flujo.

Nota: el estado de KRAS descrito en Konishi y colaboradores, 2007 Cáncer Research 67:8460-8467 y Song y colaboradores, 2000 Neoplasia 2:261-272. La actividad se califica como -, <0.1; +, 0.1% -24%; ++, 25% -49%, +++ , >50 de células positivas .

EJEMPLO 4 Líneas de células de cáncer de colon humano utilizadas para ensayos DLD-1 (número de acceso de ATCC CCL-221; KRAS mutante; BRAF tipo silvestre) , Colo201 (número de acceso de ATCC CCL-224; KRAS tipo silvestre; BRAF mutante), Colo205 (número de acceso de ATCC CCL-222; KRAS tipo silvestre; BRAF mutante), WiDr (número de acceso de ATCC CCL-218; KRAS tipo silvestre; BRAF mutante) y HT-29 (número de acceso de ATCC HTB-38; KRAS tipo silvestre; BRAF mutante) . Estas líneas de células se conocen que llevan mutaciones en sus genes KRAS o BRAF ( (Seth, Crook y colaboradores 2009) ; (Davies, Logie y colaboradores 2007)) .

El anticuerpo SC104 humanizado tiene potente actividad de exterminación contra células de tumor de colon humano que llevan mutaciones en los genes KRAS o BRAF El anticuerpo SC104 humanizado (SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50) , pero no el control de isotipo humano, tiene potente citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo contra un panel de lineas de células de cáncer de colon humano que llevan mutaciones KRAS o BRAF utilizando células mononucleares de sangre periférica de donadores humanos normales. La Figura 5 representa la exterminación de la linea de célula DLD-1 conocida que lleva KRAS mutado pero genes BRAF de tipo silvestre. La Figura 6 representa la exterminación de lineas de células Colo201, Colo205, WiDr y HT-29 conocidas que llevan BRAF mutado pero genes KRAS de tipo silvestre. Resultados similares se obtuvieron utilizando estas lineas de células y células mononucleares de sangre periférica derivadas de otros donadores humanos. La función ADCC se midió como es descrito en el Ejemplo 2.

EJEMPLO 5 Aumento de función efectora de los anticuerpos SC104 La función efectora de los anticuerpos se puede aumentar al incrementar la citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo o la citotoxicidad dependiente de complemento o mediante la combinación déla citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo y la citotoxicidad dependiente de complemento.

Aumento de ADCC Las variantes de anticuerpo SC104 y SC104 quimérico se diseñaron para la actividad de citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo aumentada (ADCC) utilizando modificaciones estándares a la región Fe del anticuerpo. Los métodos estándares incluyen por ejemplo la ingeniería de la proteína o glico-ingeniería de la región Fe del anticuerpo.

Como un ejemplo de glico-ingeniería, las células CHO que producen variantes de anticuerpo SC104 humanizado o anticuerpo SC104 quimérico se incubaron durante 8 a 10 días con kifunensina (0.25 yg/ml) de acuerdo con Zhou y colaboradores (Zhou, Shankara y colaboradores 2008). Subsecuentemente el anticuerpo se purificó, y la función ADCC se midió como es descrito en el Ejemplo 2.

Como un ejemplo de la ingeniería de proteína, las mutaciones en las secuencias de cadena pesada constante se generaron como es descrito por Lazar y colaboradores, 2006 (Lazar, Dang y colaboradores 2006) . Específicamente, las mutaciones S122D, S181A, I215E se introdujeron en la secuencia Fe SEQ ID NO: 52, para formar SEQ ID NO: 53. Un número de anticuerpos humanizados junto con el anticuerpo quimérico que posee la región Fe aumentada SEQ ID NO: 53 se probaron en ensayos ADCC después de su expresión en células CHO y la purificación mediante la cromatografía de proteína A. La función ADCC se midió como es descrito en el Ejemplo 2.

Otro ejemplo de glico-ingenieria utilizó el método Potelligent® como es descrito en Shinkawa T. y colaboradores, 2003 (J Biol Chem 278:3466- 3). Las regiones de cadena ligera y pesada variable de las variantes de anticuerpo humanizado se expresaron como en IgGl en una cadena principal de región constante estándar. La secuencia de la cadena pesada constante fue GenBank P01857.1 y la secuencia de la cadena ligera constante fue NCBI número de acceso P01834. La función ADCC se midió como es descrito en el Ejemplo 2.

Las variantes de anticuerpo humanizado SC104 aumentadas efectoras y el anticuerpo SC104 quimérico tienen citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo incremen ada En una serie de experimentos de ingeniería de proteína o glico-ingenieria se aplicó al incrementar la citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo del anticuerpo SC104 quimérico y las variantes de anticuerpo humanizado SC104. Comparado con los anticuerpos no modificados, la Fc-diseñada (SEQ ID NO: 53) o las variantes de anticuerpo humanizado SC104 tratadas con kifunensina y el anticuerpo SC104 quimérico mostraron citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo contra las células de tumor Colo205. La Figura 7 muestra un ejemplo para la exterminación marcadamente incrementada de la célula de cáncer de colon humano WiDr (ATCC número de acceso CCL-218) mediante el anticuerpo SC104 humanizado tratado con kifunensina ( SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50).

EJEMPLO 6 Modelo de tumor de xenoinjerto de ratón Ratones desnudos de BALB/c hembras se inocularon subcutáneamente con 2xl06 células HT-29 de cáncer de colon humano (ATCC número de acceso HTB-38). En el mismo día como la inoculación de células de tumor (dia 0), los ratones se aleatorizaron basados en el peso corporal en dos grupos de tratamiento (n=10 por grupo) . Cada grupo se trató intraperitonealmente con ya sea el control de vehículo (PBS, 10 ml/kg) o el anticuerpo SC104 humanizado (10 mg/kg) . El control de vehículo y el anticuerpo SC104 humanizado se administraron dos veces por semana durante cuatro semanas. El volumen de tumor se calculó tres veces semanalmente utilizando la siguiente fórmula: Volumen (mm3) = longitud x diámetro 2 x p/6.

Durante el curso del estudio algunos ratones tuvieron que ser rechazados debido a la pérdida de peso corporal excesiva que da por resultado números de ratones reducidos para los grupos de tratamiento de control de vehículos (n=6) y anticuerpo (n=9). En la terminación del estudio (día 27), los tumores se extirparon post-mortem de todos los ratones, se limpiaron de piel y se pesaron.

Eficacia anti-tumor potente del anticuerpo SC104 humanizado in vivo.

El tratamiento de ratones que llevan tumor con el anticuerpo SC104 humanizado (SEQ ID N0:7/SEQ ID NO: 50) dio por resultado un volumen de tumor reducido, significante y peso de tumor comparado con el tratamiento de control de vehículos (Figura 8). Se puede contemplar que las variantes de anticuerpo SC104 humanizado son útiles para el tratamiento de cánceres colorrectales en humanos ya sea como mono-terapia o en combinación con otros agentes anti-tumor terapéuticos, por ejemplo quimioterapia, moléculas pequeñas o sustancias biológicas. La eficacia in vivo de tales terapias de combinación se podría evaluar en modelos de xenoinjerto de tumor de ratón.

EJEMPLO 7 Ensayo de competición Células de cáncer de colon positivas de antígeno SC104 (Colo205; células fijadas con formaldehído) se incubaron en varias concentraciones con el anticuerpo competidor (variante SC104 humanizada SEQ ID NO:7/SEQ ID NO: 50 o isotipo IgGl humano de control) seguido por la incubación con una concentración fijada (1 ug/ml, panel superior; 10 ug/ml, panel inferior) del anticuerpo SC104 de ratón conjugado con FITC; el análisis de señal subsecuente se realizó mediante el análisis de citometria de flujo.

Como se muestra en la Figura 9 la incubación con el anticuerpo competidor específicamente disminuyó el enlace del SC104 de ratón en un aspecto dependiente de dosis (contra incubación con el anticuerpo de isotipo de control) ; en niveles de concentración iguales de anticuerpos de ratón y competidores, el enlace de SC104 de ratón se redujo por ~23% (panel superior) o -32% (panel inferior) comparado con el anticuerpo de control de isotipo. Cada punto representa la media ± SD de tres muestras replicadas.

Tabla 1. Secuencias CDR de SC104 Tabla 2. El anticuerpo SC104 humanizado se enlaza a varios tipos de tumor humano Tabla 3. Las variantes de anticuerpo SC104 humanizado demuestran potente citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) y actividades de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) expresado como porcentaje de actividad con relación a SC104 quimérico; nd, no determinado; cuando datos similares probados se obtuvieron en otros experimentos.

Bibliografía Amado, R. G., M . Wolf, y colaboradores (2008). "Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cáncer". J Clin Oncol 26 (10) : 1626-34.

Benhar, I. (2007). Design of synthetic antibody librarles".

Expert Opin Biol Ther 7(5):763-79.

Brekke, O. H . , B. Bremnes, y colaboradores (1993). "Human IgG3 can adopt the disulfide bond pattern characteristic for IgGl without resembling it in complement mediated cell lysis". Mol Immunol 30 ( 16) : 1419-25.

Dall'Acqua, W. F. , K. E. Cook, y colaboradores (2006).

"Modulation of the effector functions of a human IgGl through engineering of its hinge región". J Immunol 177 (2) : 1129-38.

Dall'Acqua, W. F. , P. A. Kiener, y colaboradores (2006).

"Properties of human igGls engineered for enhanced binding to the neonatal Fe receptor (FcRn)". J Biol Chem 281 (33) :23514-24.

Dall'Acqua, W. F. , R. M. Woods, y colaboradores (2002).

"Increasing the affinity of a human IgGl for the neonatal Fe receptor : biological consequences" . J Immunol 169 (9) : 5171-80.

Davies, B. R., A. Logie, y colaboradores (2007). "AZD6244 (ARRY- 142886) , a potent inhibitor of mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase 1/2 kinases: mechanism of action in vivo, pharmacokinetic/pharmacodynamic relationship, and potential for combination in preclinical models". Mol Cáncer Ther 6 ( 8 ) : 2209-19.

Di Nicolantonio, F. , M. Martini, y colaboradores (2008).

"Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorrectal cáncer". J Clin Oncol 26(35) : 705-12.

Ferrara, C, P. Brunker, y colaboradores (2006) . "Modulation of therapeutic antibody effector functions by glycosylat ion engineering: influence of Golgi enzyme localization domain and co-expression of heterologous betal, 4-N- acetylglucosaminyltransferase III and Golgi alpha-mannosidase II". Biotechnol Bioeng 93 (5) : 851-61.

Fishburn, C. S. (2008) . "The pharmacology of PEGylation: balancing PD with PK to genérate novel therapeutics" . J Pharm Sci 97 ( 10 ) : 4167-83.

Hinton, P. R . , M. G. Johlfs, y colaboradores (2004) .

"Engineered human IgG antibodies with longer serum half- lives in primates". J Biol Chem 279 ( 8 ) : 6213-6.

Hinton, P. R . , J. M. Xiong, y colaboradores (2006) . "An engineered human IgGl antibody with longer serum half- life". J Immunol 176 ( 1 ) : 3 6-56.

Idusogie, E. E., P. Y. Wong, y colaboradores (2001) .

"Engineered antibodies with increased activity to recruit complement". J Immunol 166 (4 ) : 2571-5.

Jones, A. J., D. I. Papac, y colaboradores (2007) . "Selective clearance of glycoforms of a complex glycoprotein pharmaceutical caused by terminal N-acetylglucosamine is similar in humans and cynomolgus monkeys". Glycobiology 17(5) : 529-40.

Kanda, Y., T. Yamada, y colaboradores (2007) . "Comparison of biological activity among nonfucosylated therapeutic IgGl antibodies with three different N-linked Fe oligosaccharides : the high-mannose , hybrid, and complex types". Glycobiology 17 (1) : 104-18.

Kaneko, Y., F. Nimmer ahn, y colaboradores (2006). "Anti- inflammatory activity of immunoglobulin G resulting from Fe sialylation" . Science 313 ( 5787 ): 670-3.

Karapetis, C. S., S. Khambata-Ford, y colaboradores (2008).

"K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorrectal cáncer". N Engl J Med 359 ( 17 ): 1757-65.

Kolkman, J. A. and W. P. Stemmer (2001) . "Directed evolution of proteins by exon shuffling". Nat Biotechnol 19(5) :423- 8.

Konishi H, Karakas B, y colaboradores (2007) "Knock-in of mutant K-ras in nontumorigenic human epithelial cells as a new model for studying K-ras mediated transformation" Cáncer Res. 15; 67 ( 18 ): 8 60-7 Kopsidas, G., A. S. Roberts, y colaboradores (2006). "In vitro improvement of a shark IgNAR antibody by Qbeta replicase mutation and ribosome display mimics in vivo affinity maturation". Immunol Lett 107 (2 ): 163-8.

Lazar, G. A., W. Dang, y colaboradores (2006). "Engineered antibody Fe variants with enhanced effector function". Proc Nati Acad Sci U S A 103 ( 11 ): 4005-10.

Li, H., N. Sethuraman, y colaboradores (2006). "Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris". Nat Biotechnol 24(2):210-5.

Lievre, A . , J. B. Bachet, y colaboradores (2006). "KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorrectal cáncer". Cáncer Res 66 ( 8 ) : 3992-5.

Loo D, Pryer N, y colaboradores (2007). "The glycotope- specific RAV12 monoclonal antibody induces oncosis in vitro and has antitumor activity against gastrointestinal adenocarcinoma tumor xenografts in vivo" Mol Cáncer Ther. 6(3) : 856-65.

Loupakis, F . , A. Ruzzo, y colaboradores (2009). "KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild- type metastatic colorrectal cáncer". Br J Cáncer 101 (4) :715-21.

Michaelsen, T. E . , A. Aase, y colaboradores (1990).

"Enhancement of complement activation and cytolysis of human IgG3 by deletion of hinge exons". Scand J Immunol 32 (5) : 517-28.

Natsume, A., M. In, y colaboradores (2008). "Engineered antibodies of IgGl/IgG3 mixed isotype with enhanced cytotoxic activities". Cáncer Res 68 ( 10 ) : 3863-72.

Norderhaug, L., O. H. Brekke, y colaboradores (1991).

"Chimeric mouse human IgG3 antibodies with an IgG4-like hinge región induce complement-mediated lysis more efficiently than IgG3 with normal hinge". Eur J Immunol 21(10) : 2379-84.

Nozawa S, Aoki D, y colaboradores (2004). "HMMC-l: a humanized monoclonal antibody with therapeutic potential against Miillerian duct-related carcinomas". Clin Cáncer Res . 10 (20) : 7071-8 Peled, J. U., F. L. Kuang, y colaboradores (2008). "The biochemistry of somatic hypermutation" . Annu Rev Immunol 26:481-511.

Petkova, S. B., S. Akilesh, y colaboradores (2006). "Enhanced half-life of genetically engineered human IgGl antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease". Int Immunol 18 (12) : 1759-69.

Queen, C, . P. Schneider, y colaboradores (1989). "A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor". Proc Nati Acad Sci U S A 86 (24 ): 10029-33.

Saif MW, Karapanagiotou L, y colaboradores (2007) "Genetic alterations in pancreatic cáncer" World J Gastroenterol . 13 (33) : 4423-30 Seth, R., S. Crook, y colaboradores (2009). "Concomitant mutations and splice variants in KRAS and BRAF demónstrate complex perturbation of the Ras/Raf signalling pathway in advanced colorrectal cáncer". Gut 58 (9) : 1234-41.

Shields, R. L. , A . K. Namenuk, y colaboradores (2001). "High resolution mapping of the binding site on human IgGl for Fe gamma RI, Fe gamma RII, Fe gamma RUI, and FcRn and design of IgGl variants with improved binding to the Fe gamma R" . J Biol Chem 276 ( 9 ): 6591-604.

Shinkawa, T . , K. Nakamura, y colaboradores (2003). "The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgGl complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity" . J Biol Chem 278 (5) : 3466-73.

Siena, S., A. Sartore-Bianchi , y colaboradores (2009).

"Biomarkers predicting clinical outeome of epidermal growth factor receptor- targeted therapy in metastatic colorectal cáncer". J Nati Cáncer Inst 101 ( 19 ): 1308-2 .

Song SY, Meszoely IM, Coffey RJ, y colaboradores " -Ras- independent effects of the farnesyl transferase inhibitor L-744,832 on eyelin Bl/Cdc2 kinase activity, G2/M cell eyele progression and apoptosis in human pancreatic ductal adenocarcinoma cells" Neoplasia. 2000; 2(3):261-72 Stavenhagen, J. B., S. Gorlatov, y colaboradores (2007). "Fe optimization of therapeutic antibodies enhances their ability to kill tumor cells in vitro and controls tumor expansión in vivo via low-affinity activating Fcgamma receptors". Cáncer Res 67 ( 18 ): 8882-90.

Tan, L. K., R. J. Shopes, y colaboradores (1990) . "Influence of the hinge región on complement activation, Clq binding, and segmental flexibility in chimeric human immunoglobulins". Proc Nati Acad Sci U S A 87(1): 162-6. 5 Thie, H., B. Voedisch, y colaboradores (2009). "Affinity maturation by phage display". ethods Mol Biol 525:309- 22, xv.

Zhou, Q., S. Shankara, y colaboradores (2008). "Development of a simple and rapid method for producing noni o fucosylated oligomannose containing antibodies with increased effector function". Biotechnol Bioeng 99 (3) : 652-65.

RESUMEN DE LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO:l: Secuencia de aminoácidos de la región 15 variable de cadena pesada de SC104 de murino .

SEQ ID NO : 2 : Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SC104 quimérico con la región variable de ratón y la cadena principal 20 IgGl humana (CH1 de cadena pesada de IgGl humano, articulación, dominios CH2 y CH3) .

SEQ ID NO: 3: Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de SC104 de 25 murino.

SEQ ID NO: : Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de SC104 quimérico con la región variable de ratón y la región constante de cadena ligera humana.

SEQ ID NO: 5: Secuencia de señal de cadena pesada.

SEQ ID NO: 6: Secuencia de señal de cadena ligera.

SEQ ID NO: 7: Secuencia de polipéptido de cadena ligera de SC104 basado en 1U6A que incorpora la sustitución A15P.

SEQ ID NO: 8: Cadena ligera de SC104 basado en IQLR.

SEQ ID NO: 9: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado con Kabat .

SEQ ID NO: 10: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en IQLR injertado con Kabat.

SEQ ID NO: 11: CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A.

SEQ ID NO: 12: CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en IQLR.

SEQ ID NO: 13: CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora seis sustituciones .

SEQ I D NO: 14: CDR-H1 injertado con AbM, CDH2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora ocho sustituciones .

SEQ I D NO: 15: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora seis sustituciones. SEQ I D NO: 16: Secuencia de polipéptido de cadena ligera de SC104 basado en 1U6A que incorpora tres sustituciones.

SEQ I D NO: 17: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1QLR injertado por Kabat que incorpora cuatro sustituciones. SEQ I D NO: 18: Secuencia de polipéptido de cadena ligera de SC104 basado en 1QLR que incorpora tres sustituciones.

SEQ I D NO: 19: C DR-H1 injertado con AbM, C DR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones QIE y Q46E.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada dé SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones QIE y I48 .

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones QIE y V67I.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones QIE y T68S.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones QIE y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones QIE y E72D.

SEQ ID NO: 25: CDR-H1 injertado con AbM, CDH2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora la sustitución V71R.

SEQ ID NO: 26: CDR-H1 injertado con AbM, CDH2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en IQLR que incorpora la sustitución V71R.

SEQ ID NO: 27: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en IQLR injertado por Kabat que incorpora la sustitución V71R. SEQ ID NO: 28: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora la sustitución V71R. SEQ ID NO:29: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en IQLR injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y y V71R.

SEQ ID NO: 30: Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SC104 quimérico con la región variable de ratón y la cadena principal de IgGl (CH1 de cadena pesada de IgGl humana, articulación, dominios CH2 y CH3) que incorpora CDR-H2 con la sustitución F53 .

Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SC104 quimérico con la región variable de ratón y la cadena principal de IgGl (CH1 de cadena pesada de IgGl humana, articulación, dominios CH2 y CH3) que incorpora CDR-H2 con la sustitución F53Y.

Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SC104 quimérica con la región variable de ratón y la cadena principal de IgGl (CH1 de cadena pesada de IgGl humana, articulación, dominios CH2 y CH3) que incorpora CDR-H2 con la sustitución F53P.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en IQLR que incorpora las sustituciones S64K y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en IQLR que incorpora las sustituciones S64L y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en IQLR que incorpora las sustituciones S64H y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en IQLR que incorpora las sustituciones S64F y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en IQLR que incorpora las sustituciones S64R y V71R.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en IQLR injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, F29I, T30S, S64K y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones S64K y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones S64L y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones S64H y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones S64F y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones S64R y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones S40P y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones S40P, S64K y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones S40P, S64L y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones S40P, S64H y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones S40P, S64F y V71R.

CDR-H1 injertado con AbM, CDR-H2 definido por Kabat y CDR-H3 de la secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A que incorpora las sustituciones S40P, S64R y V71R.

SEQ ID NO: 50: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71R.

SEQ ID NO: 51: Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SC104 quimérico con región variable de ratón y la cadena principal de IgGl (CH1 de cadena pesada de IgGl humana, articulación, dominios CH2 y CH3) que incorpora la sustitución N60D.

SEQ ID NO: 52: Región constante de cadena pesada que incorpora la articulación, dominios CH1, CH2 y CH3.

SEQ ID NO: 53: Región constante de cadena pesada que incorpora la articulación, dominios CH1, CH2 y CH3, que incorpora las sustituciones de aminoácido S122D, S181A, I215E.

SEQ ID NO: 54: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29A, T30S, S40P, S64K y V71R.

SEQ ID NO: 55: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29C, T30S, S40P, S64K y V71R.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29D, T30S, S40P, S64K y V71R.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29E, T30S, S40P, S64K and V71R. Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29F, T30S, S40P, S64K y V71R.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29G, T30S, S40P, S64K y V71R.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29H, T30S, S40P, S64K y V71R.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29K, T30S, S40P, S64K y V71R.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29L, T30S, S40P, S64K y V71R.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29M, T30S, S40P, S64K y V71R.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29N, T30S, S40P, S64K y V71R.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29P, T30S, S40P, S64K y V71R.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29Q, T30S, S40P, S64K y V71R.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29R, T30S, S40P, S54K y V71R.

SEQ ID NO: 68: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29S, T30S, S40P, S64K y V71R.

SEQ ID NO: 69: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29T, T30S, S40P, S64K y V71R.

SEQ ID NO: 70: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29V, T30S, S40P, S64K y V71R.

SEQ ID NO: 71: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29W, T30S, S40P, S64K y V71R.

SEQ ID NO: 72: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, I29Y, T30S, S40P, S64K y V71R.

SEQ ID NO: 73: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71A.

SEQ ID NO: 74: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71C.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71D.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71E.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71F.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71G.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71H.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71I.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71K.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71L.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71M.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71N.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71P.

Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71Q.

SEQ ID NO: 87: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71S.

SEQ ID NO: 88: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71T.

SEQ ID NO: 89: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71V.

SEQ ID NO: 90: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71W.

SEQ ID NO: 91: Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71Y.

SEQ ID NO: 92: Región constante de cadena pesada que incorpora la articulación, dominios CH1, CH2 y CH3.

SEQ ID NO: 93 Dominio constante de cadena ligera.

SEQ ID NO: 94 Secuencia de polipéptido de cadena pesada de SC104 basado en 1U6A injertado por Kabat que incorpora las sustituciones G27Y, T30S, S40P, S64K y V71R

Claims (13)

i REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar cáncer en un sujeto en donde el cáncer comprende genes KRAS o BRAF mutados, el método caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo compite con SC104 para el enlace a la linea de células de cáncer de colon humano Colo205.

2. Un método para tratar cáncer en un sujeto, el método caracterizado porque comprende someter a prueba el cáncer para la presencia de genes KRAS o BRAF mutados y administrar a los sujetos en los cuales el cáncer comprende genes KRAS o BRAF mutados una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo compite con SC104 para el enlace a la linea de células de cáncer de colon humano Colo205.

3. Un método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de colon, pancreático y gástrico.

4. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el anticuerpo es una quimera de SC104.

5. Un método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la quimera- es SEQ ID N0:4/SEQ ID NO: 2.

6. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo SC104 desinmunizado o fragmento de enlace de antigeno del mismo.

7. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo SC104 humanizado o fragmento de enlace de antigeno del mismo.

8. Un método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el anticuerpo humanizado o fragmento de enlace de antigeno comprende por lo menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO: 14, SEQ ! ICi NO: 15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO :37, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO :41, SEQ ID NO :42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO :45, SEQ ID NO :46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO :49, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO :53, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO :73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO :77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO :81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO : 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ : ID N0:91, y SEQ ID NO: 94.

9. Un método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el anticuerpo humanizado o fragmento de enlace de antigeno comprende combinaciones de cadena ligera y pesada seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:94, SEQ ID NO.-8/SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:8/SEQ ID NO: 38.

10. Uso de un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo que compite con SC104 para el enlace a la linea de células de cáncer de colon humano Colo205, caracterizado porque es para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer en un sujeto en donde el cáncer comprende genes KRAS o BRAF mutados.

11. El uso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el cáncer se ha probado para la presencia de genes KRAS o BRAF mutados.

12. Un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo, caracterizado porque compite con SC104 para el enlace a la linea de células de cáncer de colon humano Colo205 en el tratamiento de cáncer en un sujeto en donde el cáncer comprende genes KRAS o BRAF mutados.

13. El anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el cáncer se ha probado para la presencia de genes KRAS o BRAF mutados.