CN102597776A

CN102597776A - 鉴定响应抗癌剂的可能性升高的患者的方法

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Publication number: CN102597776A
Application number: CN2010800508856A
Authority: CN
Inventors: A·戈吉内尼; M·考恩特; N·范布鲁根; A·D·巴格里; R·韦默
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2009-09-11
Filing date: 2010-09-10
Publication date: 2012-07-18
Also published as: WO2011032013A1; US20110064670A1; MX2012002862A; RU2012114094A; JP2013504595A; SG179070A1; CA2773662A1; BR112012005315A2; EP2475996A1; AU2010292060A1; IL218520A0; KR20120105423A

Abstract

本发明提供用于鉴定响应抗癌剂的可能性升高或经历转移的可能性升高的患者的方法。本发明还提供用于监测患者对抗癌剂的响应的方法。本发明还提供用于所述方法的试剂盒和制品。

Description

鉴定响应抗癌剂的可能性升高的患者的方法

相关申请

本申请要求2009年9月11日提交的美国临时专利申请No.61/241,769的权益，通过述及将其公开内容完整收入本文用于所有目的。

发明领域

本申请致力于用于鉴定哪些患者会最多地受益于抗癌剂治疗及对患者监测他们对抗癌剂治疗的敏感性和响应性的方法。

发明背景

癌症是对人类健康的最致命威胁之一。仅在美国，癌症每年影响近130万新患者，而且是位于心血管疾病之后的第二位死因，占4例死亡中的大约1例。实体瘤对大多数那些死亡负有责任。虽然某些癌症的医学治疗中已经取得了重大进步，但是所有癌症的总体5年存活率在最近20年里只改进了约10%。癌症（或称作恶性肿瘤）以不受控制的方式快速生长和转移，使得及时检测和处理极端困难。

根据癌症类型，患者通常有数个治疗选项可用，包括化疗、辐射和基于抗体的药物。对于预测不同治疗方案的临床结果有用的诊断方法会大大有利于对这些患者进行临床安排。

如此，需要更有效的手段来确定哪些患者会响应哪种治疗及将此类确定纳入抗癌剂疗法对患者的更有效的治疗方案，无论用作单一药剂或是与其它药剂组合。

发明概述

本发明提供用于鉴定会响应抗癌剂治疗的患者的方法。

本发明的一个实施方案提供鉴定有可能响应抗癌剂的患者的方法。该方法包括(a)将成像剂施用于已经接受至少一剂抗癌剂的患者；(b)检测该患者中与肿瘤引流***有关的***中的淋巴搏动频率；并(c)将该淋巴搏动频率与该抗癌剂处理前该***中的搏动频率比较，其中***中的淋巴搏动频率降低至少约10%鉴定出响应抗癌剂的可能性升高的患者。在一些实施方案中，该***连接腹股沟***至轴***(axial lymph node)。在一些实施方案中，该成像剂包含荧光染料（例如Alexafluor680）。在一些实施方案中，使用荧光显微术来检测淋巴搏动频率。在一些实施方案中，该患者为人类。在一些实施方案中，该患者已经诊断有选自下组的癌症：结肠直肠癌，乳腺癌，肺癌，成胶质细胞瘤，肾癌，及其组合。在一些实施方案中，该方法进一步包括：(d)如果检测到该***中的淋巴搏动频率降低至少约10%的话，将有效量的抗癌剂施用于该患者。在一些实施方案中，该抗癌剂选自NRP2拮抗剂、VEGF-C拮抗剂、及其组合。在一些实施方案中，该NRP2拮抗剂为抗NRP2抗体。在一些实施方案中，该VEGF-C拮抗剂为抗VEGF-C抗体。在一些实施方案中，该方法进一步包括(e)将有效量的第二抗癌剂施用于该患者。在一些实施方案中，该第二抗癌剂为VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，该VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体。在一些实施方案中，该抗VEGF抗体为贝伐单抗（bevacizumab）。

本发明的另一个实施方案提供鉴定经历转移的可能性升高的患者的方法。该方法包括：(a)将成像剂施用于已经接受至少一剂抗癌剂的患者；(b)检测该患者中与肿瘤引流***有关的***中的淋巴搏动频率；并(c)将该淋巴搏动频率与该抗癌剂处理前该***中的搏动频率比较，其中***中的淋巴搏动频率升高至少约10%鉴定出经历转移的可能性升高的患者。在一些实施方案中，该***连接腹股沟***至轴***。在一些实施方案中，该成像剂包含荧光染料。在一些实施方案中，该荧光染料为Alexafluor680。在一些实施方案中，使用荧光显微术来检测淋巴搏动频率。在一些实施方案中，该患者为人类。在一些实施方案中，该患者已经诊断有选自下组的癌症：结肠直肠癌，乳腺癌，肺癌，成胶质细胞瘤，肾癌，及其组合。在一些实施方案中，该方法进一步包括：(d)如果检测到该***中的淋巴搏动频率升高至少约10%的话，将有效量的抗癌剂施用于该患者。在一些实施方案中，该抗癌剂选自下组：NRP2拮抗剂，VEGF-C拮抗剂，及其组合。在一些实施方案中，该NRP2拮抗剂为抗NRP2抗体。在一些实施方案中，该VEGF-C拮抗剂为抗VEGF-C抗体。在一些实施方案中，该方法进一步包括(e)将有效量的第二抗癌剂施用于该患者。在一些实施方案中，该第二抗癌剂为VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，该VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体。在一些实施方案中，该抗VEGF抗体为贝伐单抗。

本发明的又一个实施方案提供监测抗癌疗法的有效性的方法。该方法包括：(a)将成像剂施用于已经接受至少一剂抗癌剂的患者；(b)检测该患者中与肿瘤引流***有关的***中的淋巴搏动频率；并(c)将该淋巴搏动频率与该抗癌剂处理前该***中的搏动频率比较，其中***中的淋巴搏动频率降低至少约10%鉴定出有效抗癌剂。在一些实施方案中，该***连接腹股沟***至轴***。在一些实施方案中，该成像剂包含荧光染料。在一些实施方案中，该荧光染料为Alexafluor680。在一些实施方案中，使用荧光显微术来检测淋巴搏动频率。在一些实施方案中，该患者为人类。在一些实施方案中，该患者已经诊断有选自下组的癌症：结肠直肠癌，乳腺癌，肺癌，成胶质细胞瘤，肾癌，及其组合。在一些实施方案中，该方法进一步包括：(d)如果检测到该***中的淋巴搏动频率降低至少约10%的话，将有效量的抗癌剂施用于该患者。在一些实施方案中，该抗癌剂是选自下组的成员：NRP2拮抗剂，VEGF-C拮抗剂，及其组合。在一些实施方案中，该NRP2拮抗剂为抗NRP2抗体。在一些实施方案中，该VEGF-C拮抗剂为抗VEGF-C抗体。在一些实施方案中，该方法进一步包括(e)将有效量的第二抗癌剂施用于该患者。在一些实施方案中，该第二抗癌剂为VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，该VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体。在一些实施方案中，该抗VEGF抗体为贝伐单抗。

本发明的另一个实施方案提供优化抗癌剂剂量的方法。该方法包括：(a)将成像剂施用于已经接受至少一剂抗癌剂的患者；(b)检测该患者中与肿瘤引流***有关的***中的淋巴搏动频率；并(c)将该淋巴搏动频率与该抗癌剂处理前该***中的搏动频率比较，其中***中的淋巴搏动频率有变化鉴定出该剂量为最小有效剂量而淋巴搏动频率无变化鉴定出该剂量为最大有效剂量。在一些实施方案中，该抗癌剂选自：NRP2拮抗剂，VEGF-C拮抗剂，及其组合。

通过下面的详述来进一步描述这些和其它实施方案。

附图简述

图1图示来自测量淋巴搏动频率的淋巴功能测定法的结果。图1A图示注射15μl推注染料后通过管的搏动淋巴运动的代表性时间过程图像。图1B图示约24个事件/5分钟的基线活性，n=6只动物。

图2图示来自测量在成像开始时在尾基部附近输注5μL/min、15min染料后到腹股沟***的大量淋巴转运的淋巴功能测定法的结果。图2A图示代表性时间过程图像，显示腹股沟***，接着是轴***的初始加载。图2B图示基线加载率和距腹股沟***最大信号强度的时间，n=4只动物。

图3图示来自淋巴功能测定法的结果，证明肿瘤相关淋巴网络中的大量淋巴转运上调。图3A图示数据，证明在肿瘤植入小鼠中淋巴搏动频率上调约%50，n=6只动物/组。图3B图示数据，证明在肿瘤植入小鼠中大量淋巴转运也上调，n=4只动物/组。图3C图示数据，证明肿瘤植入小鼠中淋巴搏动上调的时间过程，n=12只动物/组。

图4图示数据，证明抑制VEGF-C信号传导降低肿瘤相关网络中的淋巴转运。图4A图示数据，证明在荷瘤小鼠中抗NRP2、抗VEGF-C、或抗VEGF-A慢性处理(chronic treatment)显著降低淋巴搏动频率，n=6只动物/组。图4B图示数据，证明在荷瘤小鼠中抗NRP2、抗VEGF-C、或抗VEGF-A慢性处理显著降低大量淋巴转运，n=6只动物/组。

图5图示数据，证明在非荷瘤小鼠中抑制VEGF-C途径没有显著改变淋巴功能。图5A图示数据，证明在非荷瘤小鼠中抗VEGF-C慢性处理没有显著改变在3周里测量的淋巴搏动频率，n=6只动物/组。图5B图示数据，证明在非荷瘤小鼠中抗NRP2慢性处理没有显著改变在3周里测量的淋巴搏动频率，n=4只动物/组。

图6图示数据，证明抗癌剂急性注射不改变淋巴功能。图6A图示数据，证明在荷瘤小鼠中抗NRP2、抗VEGF-C、或抗VEGF-A急性注射不导致淋巴搏动频率的任何显著变化，n=6只动物/组。图6B图示数据，证明在非荷瘤小鼠中重组VEGF-C蛋白或重组VEGF-A蛋白急性注射(acute injection)不导致淋巴搏动频率的任何显著变化，n=6只动物/组。

图7图示数据，证明淋巴搏动频率在尾和背荷瘤小鼠二者中上调，但是在耳荷瘤小鼠中不上调。

发明详述

I.导言

本发明提供用于鉴定响应抗癌剂的可能性升高或经历转移的可能性升高的患者的方法。本发明还提供用于监测患者对抗癌剂的响应的方法。本发明基于下述发现，肿瘤引流***中淋巴功能的度量（例如搏动频率或大量淋巴转运）可用于鉴定对抗癌剂治疗敏感或响应的患者或鉴定经历转移的可能性升高的患者。

II.定义

术语“淋巴转运”指淋巴液经由***的移动。***在组织中开始并将淋巴液运送或“引流”至局部***（例如颈部***、腋窝***、锁骨上***、纵膈***、肠系膜***、腹股沟***、和股***），在那里淋巴过滤并加工并沿线送至下一个***（例如颈部***、腋窝***、锁骨上***、纵膈***、肠系膜***、腹股沟***、和股***）直至液体到达胸导管，在那里它进入血流。任何***可以是引流***。“肿瘤引流***”指任何接受来自肿瘤的淋巴液的***。淋巴转运包括例如“淋巴搏动”和“大量淋巴转运”。“淋巴搏动”指淋巴在通过***泵送时推进。

在某些实施方案中，术语“升高”指通过本文所述方法检测的，***中的淋巴搏动频率与用抗癌剂处理前***中的淋巴搏动频率相比5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或或更大的总体升高。在某些实施方案中，术语升高指***中的淋巴搏动频率的升高，其中该升高是用抗癌剂处理前***中的淋巴搏动频率的至少约1.5X、1.75X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、25X、50X、75X、或100X。

在某些实施方案中，术语“降低”在本文中指通过本文所述方法检测的，***中的淋巴搏动频率与用抗癌剂处理前***中的淋巴搏动频率相比5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的总体降低。在某些实施方案中，术语降低指通过本文所述方法检测的，***中的淋巴搏动频率与参照***相比的降低，其中该降低是用抗癌剂处理前***中的淋巴搏动频率的至少约0.9X、0.8X、0.7X、0.6X、0.5X、0.4X、0.3X、0.2X、0.1X、0.05X、或0.01X。

“成像剂”指在暴露于激发光时展现近红外波长的荧光的任何化合物。成像剂的例子包括例如含吲哚的染料(indol-containing dyes)、含羰花青的染料(carbocyanine-containing dyes)、聚次甲基染料(polymethine dyes)、吖啶(acridines)、蒽醌(anthraquinones)、苯并咪唑(benzimidazols)、假吲哚(indolenine)、萘酰亚胺(napthalimide)、噁嗪(oxazines)、氧鎓醇(oxonols)、多烯(polyenes)、卟吩(porphins)、方酸菁(squaraine)、苯乙烯基(styryls)、噻唑(thiazols)、黄素(xanthins)、本领域技术人员知道的其它NIR染料、或其组合。成像剂通常具有近红外范围中的激发波长。特别地，成像剂可具有约550nm至约1000nm、约600nm至约950nm、约700nm至约900nm、或约750nm至约850nm的激发波长。

术语“神经毡蛋白(neuropilin)2”、“NRP2”或“Nrp2”可互换使用，指神经毡蛋白-2(NRP2,Nrp2)及其同等型(isoform)和变体的统称，如Rossignolet al.(2000)Genomics 70:211-222中所述。神经毡蛋白是120至130kDa非酪氨酸激酶受体。有多种NRP-2剪接变体和可溶性同等型。神经毡蛋白的基本结构包含五个结构域：三个胞外结构域（a1a2、b1b2和c）、一个跨膜结构域、和一个胞质结构域。a1a2结构域与补体成分C1r和C1s (CUB)同源，其一般含有四个半胱氨酸残基，形成两个二硫桥。b1b2结构域与凝结因子V和VIII同源。c结构域的中央部分称为MAM，因为它与与跨膜肽酶(meprin)、A5和受体酪氨酸磷酸酶μ蛋白同源。a1a2和b1b2结构域负责配体结合，而c结构域对于同型二聚化或异型二聚化是至关重要的。Gu et al.(2002)J.Biol.Chem.277:18069-76;He and Tessier-Lavigne(1997)Cell 90:739-51。

“神经毡蛋白介导的生物学活性”一般指其中神经毡蛋白-1和/或神经毡蛋白-2发挥重大作用的生理性或病理性事件。此类活性的非限制性例子有胚胎神经***发育或神经元再生、血管发生（包括血管造型）、肿瘤发生和肿瘤转移期间的轴突导向。

如本文中使用的，“神经毡蛋白-2介导的生物学活性”或“Nrp2介导的生物学活性”一般指其中Nrp2发挥重大作用的生理性或病理性事件，诸如例如增强VEGF受体活化和特别地调控淋巴内皮细胞(EC)迁移的能力、在成体***发生尤其是肿瘤***发生和肿瘤转移中的作用。

术语“血管内皮生长因子-C”、“VEGF-C”、“VEGFC”、“VEGF相关蛋白”、“VRP”、“VEGF2”和“VEGF-2”可互换使用，而且指VEGF家族的成员，已知结合至少两种细胞表面受体家族，即酪氨酸激酶VEGF受体和神经毡蛋白(Nrp)受体。在三种VEGF受体中，VEGF-C能结合VEGFR2（KDR受体）和VEGFR3（Flt-4受体），导致受体二聚化(Shinkai et al.,J Biol Chem273,31283-31288(1998))、激酶活化和自磷酸化(Heldin,Cell 80,213-223(1995);Waltenberger et al.,J.Biol Chem 269,26988-26995(1994))。磷酸化后的受体诱导多种底物活化，导致血管发生和***发生(Ferrara et al.,NatMed 9,669-676(2003))。肿瘤细胞中VEGF-C的过表达显示出促进肿瘤相关***发生，导致增强的对局部***的转移(Karpanen et al.,Faseb J 20,1462-1472(2001);Mandriota et al.,EMBO J 20,672-682(2001);Skobe et al.,Nat Med 7,192-198(2001);Stacker et al.,Nat Rev Cancer 2,573-583(2002);Stacker et al.,Faseb J 16,922-934(2002))。VEGF-C表达还与多种人癌症的肿瘤相关***发生和***转移有关(综述见Achen et al.,2006,supra)。另外，阻断VEGF-C介导的信号传导在小鼠中显示出遏制肿瘤***发生和***转移(Chen et al.,Cancer Res 65,9004-9011(2005);He et al.,J.NatlCancer Inst 94,8190825(2002);Krishnan et al.,Cancer Res 63,713-722(2003);Lin et al.,Cancer Res 65,6901-6909(2005))。“血管内皮生长因子-C”、“VEGF-C”、“VEGFC”、“VEGF相关蛋白”、“VRP”、“VEGF2”和“VEGF-2”指全长多肽和/或全长多肽的活性片段。在一个实施方案中，所述活性片段包括全长氨基酸序列的任何部分，其具有少于美国专利No.6,451,764的SEQID NO:3所示全长氨基酸序列全部419个氨基酸的氨基酸，通过述及明确将其完整公开内容收入本文。此类活性片段含有VEGF-C生物学活性且包括但不限于成熟VEGF-C。在一个实施方案中，全长VEGF-C多肽经蛋白水解加工生成成熟形式的VEGF-C多肽，也称作成熟VEGF-C。此类加工包括切割信号肽和切割氨基末端肽和切割羧基末端肽以生成完全加工的成熟形式。实验证据证明了全长VEGF-C、VEGF-C的部分加工形式和VEGF-C的完全加工成熟形式能够结合VEGFR3（Flt-4受体）。然而，对VEGFR2的高亲和力结合只发生于VEGF-C的完全加工成熟形式。

关于VEGF-C多肽的术语“生物学活性”和“有生物学活性的”指与全长和/或截短的VEGF-C有关的物理/化学特性和生物学功能。在一些实施方案中，VEGF-C“生物学活性”意指具有结合并刺激Flt-4受体(VEGFR3)磷酸化的能力。一般地，VEGF-C会结合Flt-4受体的胞外域并由此活化或抑制其细胞内酪氨酸激酶域。因此，VEGF-C对受体的结合可在体内或在体外导致增强或抑制具有针对VEGF-C的Flt-4受体的细胞的增殖和/或分化和/或活化。VEGF-C对Flt-4受体的结合可使用常规技术来测定，包括竞争性结合方法，诸如RIA、ELISA、和其它竞争性结合测定法。配体/受体复合物可使用诸如过滤、离心、流式细胞术等分离方法来鉴定(参见例如Lyman et al.,Cell,75:1157-1167[1993];Urdal et al.,J.Biol.Chem.,263:2870-2877[1988];及Gearing et al.,EMBO J.,8:3667-3676[1989])。来自结合研究的结果可使用结合数据的任何常规图形呈现来分析，诸如Scatchard分析(Scatchard,Ann.NY Acad.Sci.,51:660-672[1949];Goodwin et al.,Cell,73:447-456[1993])等等。由于VEGF-C诱导Flt-4受体磷酸化，因此常规酪氨酸磷酸化测定法也可用作Flt-4受体/VEGF-C复合物形成的指示。在另一个实施方案中，VEGF-C“生物学活性”意指具有结合KDR受体(VEGFR2)的能力、血管通透性、以及内皮细胞的迁移和增殖。在某些实施方案中，VEGF-C对KDR受体的结合可在体内或在体外导致增强或抑制血管通透性以及具有针对VEGF-C的KDR受体的内皮细胞的迁移和/或增殖和/或分化和/或活化。

术语“VEGF-C拮抗剂”在本文中用于指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF-C活性的分子。在某些实施方案中，VEGF-C拮抗剂指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF-C调控血管发生、淋巴内皮细胞(EC)迁移、增殖或成体***发生，尤其是肿瘤***发生和肿瘤转移的能力的分子。VEGF-C拮抗剂包括但不限于抗VEGF-C抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF-C由此隔绝其与一种或多种受体结合的受体分子和衍生物、抗VEGF-C受体抗体和VEGF-C受体拮抗剂诸如VEGFR2和VEGFR3的小分子抑制剂。如本文中使用的，术语“VEGF-C拮抗剂”具体包括结合VEGF-C且能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF-C活性的分子，包括抗体、抗体片段、其它结合多肽、肽、和非肽小分子。如此，术语“VEGF-C活性”具体包括VEGF-C介导的VEGF-C生物学活性（如上文定义的）。

术语“抗VEGF-C抗体”或“结合VEGF-C的抗体”指能够以足够亲和力结合VEGF-C使得该抗体在靶向VEGF-C中可用作诊断和/或治疗剂的抗体。抗VEGF-C抗体记载于例如Attorney Docket PR4391，通过述及明确将该专利申请的完整内容收入本文。在一个实施方案中，抗VEGF-C抗体对无关的非VEGF-C蛋白的结合程度小于该抗体对VEGF-C的结合的约10%，如通过例如放射免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合VEGF-C的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗VEGF-C抗体结合在来自不同物种的VEGF-C间保守的VEGF-C表位。

如本文中使用的，术语“VEGF”或“VEGF-A”指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung et al.(1989)Science 246:1306;及Houck et al.(1991)Mol.Endocrin.5:1806所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示小鼠VEGF，等等。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF₁₆₅”来鉴别任何此类形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸（甲硫氨酸）也是天然VEGF中的第17位（甲硫氨酸）。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。

“VEGF生物学活性”包括对任何VEGF受体的结合或任何VEGF信号传导活性，调节诸如对正常的和异常的血管发生(angiogenesis)和脉管发生(vasculogenesis)(Ferrara和Davis-Smyth(1997)Endocrine Rev.18:4-25;Ferrara(1999)J.Mol.Med.77:527-543)；促进胚胎脉管发生和血管发生(Carmeliet etal.(1996)Nature 380:435-439;Ferrara et al.(1996)Nature 380:439-442)；及调控雌性生殖道中的和为了骨生长和软骨形成的周期性血管增殖(Ferrara et al.(1998)Nature Med.4:336-340;Gerber et al.(1999)Nature Med.5:623-628)。在作为血管发生和脉管发生中的血管发生因子之外，VEGF，作为多效生长因子，在生理过程诸如内皮细胞存活、血管通透性和血管舒张、单核细胞趋化性和钙内流中展现出多种生物学效应(Ferrara和Davis-Smyth(1997),见上文;及Cebe-Suarez et al.Cell.Mol.Life Sci.63:601-615(2006))。此外，最近的研究报道了VEGF对少数非内皮细胞类型诸如视网膜色素上皮细胞、胰导管细胞、和许旺(Schwann)细胞的促有丝***效应(Guerrin et al.(1995)J.CellPhysiol.164:385-394;Oberg-Welsh et al.(1997)Mol.Cell.Endocrinol.126:125-132;Sondell et al.(1999)J.Neurosci.19:5731-5740)。

“VEGF拮抗剂”或“VEGF特异性拮抗剂”指能够结合VEGF，降低VEGF表达水平，或者中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF生物学活性（包括但不限于VEGF与一种或多种VEGF受体的结合及由VEGF介导的血管发生和内皮细胞存活或增殖）的分子。在本发明的方法中有用的VEGF特异性拮抗剂包括特异性结合VEGF的多肽、抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子和衍生物、融合蛋白（例如VEGF-Trap(Regeneron)）、和VEGF₁₂₁-白树毒素(Peregrine)。VEGF特异性拮抗剂还包括VEGF多肽的拮抗性变体、针对VEGF的反义核碱基寡聚物、针对VEGF的小RNA分子、RNA适体、肽体、和针对VEGF的核酶。VEGF特异性拮抗剂还包括结合VEGF且能够阻断、抑制、消除、降低、或干扰VEGF生物学活性的非肽小分子。如此，术语“VEGF活性”明确包括VEGF介导的VEGF生物学活性。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂将VEGF的表达水平或生物学活性降低或抑制了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。

“抗VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。在某些实施方案中，所选择的抗体通常会具有足够的对VEGF的结合亲和力，例如，该抗体可以以介于100nM-1pM之间的K_d值结合hVEGF。抗体亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法（诸如PCT申请公开文本No.WO2005/012359中所记载的BIAcore测定法）；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法（例如RIA）来测定。

在某些实施方案中，抗VEGF抗体可用作治疗剂，用于靶向和干扰其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患。还有，该抗体可进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且取决于抗体的靶抗原和预定用途。例子包括HUVEC抑制测定法；肿瘤细胞生长抑制测定法（如例如WO 89/06692中所记载的）；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5,500,362)；及激动活性或造血测定法(参见WO 95/27062)。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。在一个实施方案中，抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗VEGF抗体是依照Presta et al.(1997)Cancer Res.57:4593-4599生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称作贝伐单抗(Bevacizumab,BV；)的抗体。

抗VEGF抗体“贝伐单抗（BV）”，也称作“rhuMAb VEGF”或

是一种依照Presta et al.(1997)Cancer Res.57:4593-4599生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。它涵盖突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1（其阻断人VEGF对其受体的结合）的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93%的氨基酸序列，包括大部分框架区，衍生自人IgG1，而大约7%的序列衍生自小鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。贝伐单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月26日公告的美国专利No.6,884,879，通过述及明确将其完整公开内容收入本文。

两种表征最全面的VEGF受体是VEGFR1（也称作Flt-1）和VEGFR2（鼠同系物也称作KDR和FLK-1）。每一种受体对每一种VEGF家族成员的特异性有所不同，但是VEGF-A结合Flt-1和KDR二者。全长Flt-1受体包括具有七个Ig结构域的胞外结构域、跨膜结构域、和具有酪氨酸激酶活性的胞内结构域。胞外结构域涉及VEGF结合，而胞内结构域涉及信号转导。

特异性结合VEGF的VEGF受体分子或其片段可以在本发明的方法中用作结合和隔绝VEGF蛋白，由此阻止它发信号的VEGF抑制剂。在某些实施方案中，VEGF受体分子或其VEGF结合片段是可溶性形式，诸如sFlt-1。受体的可溶性形式发挥对VEGF蛋白生物学活性的抑制效应，其通过结合VEGF，由此阻止它结合其在靶细胞表面上存在的天然受体来实现。还包括VEGF受体融合蛋白，下文描述了它们的例子。

嵌合VEGF受体蛋白指具有自至少两种不同蛋白质（其中至少一种是VEGF受体蛋白，例如flt-1或KDR受体）衍生的氨基酸序列且能够结合并抑制VEGF生物学活性的受体分子。在某些实施方案中，本发明的嵌合VEGF受体蛋白由自只有两种不同VEGF受体分子衍生的氨基酸序列组成；然而，可以将包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、或所有七个来自flt-1和/或KDR受体胞外配体结合区的Ig样结构域的氨基酸序列连接至来自其它无关蛋白质的氨基酸序列，例如免疫球蛋白序列。与Ig样结构域组合的其它氨基酸序列对于本领域普通技术人员会是显而易见的。嵌合VEGF受体蛋白的例子包括但不限于可溶性Flt-1/Fc、KDR/Fc、或Flt-1/KDR/Fc（也称作VEGFTrap）(参见例如PCT申请公开文本No.WO97/44453)。

可溶性VEGF受体蛋白或嵌合VEGF受体蛋白包括没有经跨膜结构域而固定至细胞表面的VEGF受体蛋白。因此，VEGF受体（包括嵌合受体蛋白）的可溶性形式，虽然能够结合并灭活VEGF，但是不包含跨膜结构域，并如此一般不会变成与该分子在其中表达的细胞的细胞膜相结合。

别的VEGF抑制剂记载于例如WO 99/24440,PCT国际申请PCT/IB99/00797,WO 95/21613,WO 99/61422,美国专利No.6,534,524,美国专利No.5,834,504,WO 98/50356,美国专利No.5,883,113,美国专利No.5,886,020,美国专利No.5,792,783,美国专利No.6,653,308,WO 99/10349,WO 97/32856,WO 97/22596,WO 98/54093,WO 98/02438,WO 99/16755,及WO 98/02437，通过述及将它们都完整收入本文。

如本文中使用的，术语“B20系列多肽”指包括结合VEGF的抗体的多肽。B20系列多肽包括但不限于自B20抗体的序列衍生的抗体或美国公开文本No.20060280747,美国公开文本No.20070141065和/或美国公开文本No.20070020267中记载的B20衍生抗体，通过述及明确将这些专利申请的内容收入本文。在一个实施方案中，B20系列多肽是美国公开文本No.20060280747,美国公开文本No.20070141065和/或美国公开文本No.20070020267中记载的B20-4.1。在另一个实施方案中，B20系列多肽是美国专利申请60/991,302中记载的B20-4.1.1，通过述及将其完整公开内容收入本文。

如本文中使用的，术语“G6系列多肽”指包括结合VEGF的抗体的多肽。G6系列多肽包括但不限于自G6抗体的序列衍生的抗体或美国公开文本No.20060280747,美国公开文本No.20070141065和/或美国公开文本No.20070020267中记载的G6衍生抗体。美国公开文本No.20060280747,美国公开文本No.20070141065和/或美国公开文本No.20070020267中记载的G6系列多肽包括但不限于G6-8,G6-23和G6-31。

对于别的抗体，参见美国专利No.7,060,269,6,582,959,6,703,020;6,054,297;WO98/45332;WO 96/30046;WO94/10202;EP 0666868B 1;美国专利申请公开No.2006009360,20050186208,20030206899,20030190317,20030203409,和20050112126;及Popkov et al.,Journal of ImmunologicalMethods 288:149-164(2004)。在某些实施方案中，其它抗体包括那些结合人VEGF上包含残基F17,M18,D19,Y21,Y25,Q89,I91,K101,E103,和C104或者包含残基F17,Y21,Q22,Y25,D63,I83和Q89的功能性表位的。

还知道其它抗VEGF抗体，而且记载于例如Liang et al.,J Biol Chem 281,951-961(2006)。

患者对抗癌剂治疗的“有效响应”(effective response)或患者对VEGF拮抗剂治疗的“响应性”(responsiveness)或“敏感性”(sensitivity)指源自用抗癌剂（诸如例如抗VEGF-A抗体、抗VEGF-C抗体、或抗NRP2抗体）进行的治疗或作为该治疗的结果，给予患者（有癌症风险或患有癌症）的临床或治疗受益。此类受益包括细胞或生物学应答、完全响应、部分响应、稳定的病情（没有进展或复发）、或源自用该拮抗剂进行的治疗或作为该治疗的结果的患者响应及稍后复发。例如，有效响应可以是诊断为与肿瘤引流***有关的***中淋巴搏动频率有降低的患者中在至少一次抗癌剂处理后缩小的肿瘤尺寸或延长的无进展存活。淋巴搏动频率的降低有效预示，或以高灵敏度预示此类有效响应。

如本文中使用的，“拮抗剂”指抑制或降低它们所结合的分子的生物学活性的化合物或药剂。拮抗剂包括结合VEGF的抗体、合成或天然序列肽、免疫粘附素、和小分子拮抗剂，任选偶联有或融合至另一分子。“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低它所结合的抗原的生物学活性的抗体。

如本文中使用的，“激动性抗体”指部分或完全模拟感兴趣多肽的至少一种功能活性的抗体。

术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体（例如双特异性抗体）、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如Lowry法的测定，抗体重量超过95%，而在有些实施方案中，重量超过99%，(2)足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(V_H)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(V_L)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。

抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。

术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的细胞毒性中的参与。

根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体（免疫球蛋白）的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体（免疫球蛋白）可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性描述于例如Abbas et al.,Cellular and Mol.Immunology,4th ed.(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价关联而形成的更大融合分子的一部分。

术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。

“裸抗体（裸露的抗体）”为本发明目的指未偶联细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)₂片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接，使得轻链和重链可以在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，每个可变域的三个HVR相互作用而在V_H-V_L二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域（或是只包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv）也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

Fab片段包含重链和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)₂抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在V_H与V_L结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见例如Plückthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，1994，第269-315页。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肽链（V_H-V_L）中包含相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097;WO 1993/01161;Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003);及Hollinger et al.,PNAS USA 90:6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四抗体(tetrabody)也记载于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例如天然存在的突变。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。

修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein,Nature,256:495-97(1975);Hongo et al.,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring HarborLaboratory Press,第2版1988);Hammerling et al.,于:Monoclonal Antibodiesand T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.,Nature352:624-628(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,PNAS USA 101(34):12467-12472(2004);Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893;WO 1996/34096;WO 1996/33735;WO 1991/10741;Jakobovits et al.,PNAS USA 90:2551(1993);Jakobovits et al.,Nature362:255-258(1993);Bruggemann et al.,Year in Immuno.7:33(1993);美国专利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;和5,661,016;Markset al.,Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994);Morrison,Nature 368:812-813(1994);Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996);Lonberg andHuszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(例如美国专利No.4,816,567;Morrison et al.,PNAS USA81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴而生成的抗体。

非人（例如鼠）抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白（受体抗体）中的HVR残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、家兔、或非人灵长类动物的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。可以进行这些修饰来进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995);Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994);及美国专利No.6,982,321和7,087,409。

“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))。还可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法：Cole et al.,MonoclonalAntibodiesand Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985);Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991)。还可参见van Dijk and van de Winkel,Curr. Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性刺激而生成人抗体但其内源基因组已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSE^TM技术)。还可参见例如Li et al.,PNAS USA,103:3557-3562(2006)，关于经人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。

术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中（H1、H2、H3），三个在VL中（L1、L2、L3）。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.Immunity13:37-45(2000);Johnsonand Wu于:Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.,Nature363:446-448(1993);及Sheriffet al.,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。

本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。作为Kabat互补决定区(CDR)的HVR是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al.,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表KabatCDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。

HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些延伸的HVR定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等,见上文编号的。

“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的HVR残基外的那些残基。

表述“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变体指Kabat et al.,见上文中的抗体编辑用于重链可变域或轻链可变域的编号***。使用此编号***，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或***。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸***（依照Kabat为残基52a）及重链FR残基82后的***残基（例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等）。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。

“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。例如，Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了HVR和/或框架残基的随机诱变：例如Barbas et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994);Schier et al.,Gene 169:147-155(1995);Yelton et al.,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);Hawkins et al.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。

“生长抑制性”抗体指那些阻止或降低表达抗体所结合之抗原的细胞增殖的抗体。

“诱导凋亡”的抗体指那些根据标准凋亡测定法的测定，诱导程序性细胞死亡的抗体，所述测定法诸如膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜囊（称作凋亡小体）形成。

抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区（天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区）且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体）下调；和B细胞活化。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-端区域，包括天然序列Fc区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸（残基447，依照EU编号***）可以消除，例如在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程改造。因而，完整抗体组合物可以包括所有K447残基都被消除的抗体群、无一K447残基被消除的抗体群、或者混合了有K447残基的抗体和没有K447残基的抗体的抗体群。

除非本文另有说明，免疫球蛋白重链的残基编号方式是如Kabat et al.,见上文中的EU索引的编号方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号方式。

“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体；BCR）下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域（例如抗体可变域）联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文定义中所公开的。

“天然序列Fc区”包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区（非A和A同种异型）；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区；及其天然存在变体。

“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰（优选一处或多处氨基酸替代）而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区与天然序列Fc区相比或与亲本多肽的Fc区相比具有至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80%的同源性，最优选与它们具有至少约90%的同源性，更优选与它们具有至少约95%的同源性。

“含Fc区的抗体”指包含Fc区的抗体。Fc区的C-末端赖氨酸（依照EU编号***的残基447）可以消除，例如在纯化抗体的过程中或者通过重组改造编码抗体的核酸。因此，依照本发明包含具有Fc区的抗体的组合物可包含具有K447的抗体、消除了所有K447的抗体、或具有与没有K447残基的抗体的混合物。

“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。在有些实施方案中，FcR是天然人FcR。在有些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR（γ受体），包括属于FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括那些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA（“活化受体”）和FcγRIIB（“抑制受体”），它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见例如Daёron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR的综述参见例如Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991);Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994);及de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-341(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。

术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24:2429-249(1994))并调节免疫球蛋白的体内稳态。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie 1997,Hinton 2004)。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie and Ward.,Immunology Today 18(12):592-8(1997);Ghetie et al.,Nature Biotechnology,15(7):637-40(1997);Hinton et al.,J.Biol.Chem.279(8):6213-6(2004);WO 2004/92219(Hinton et al.))。

可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染人细胞系中，或者在施用了具有变异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO 00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。还可参见例如Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞（例如NK细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞）上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.,PNAS (USA)95:652-656(1998)中所披露的。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体***第一组分(C1q)结合抗体（适宜亚类的）起始的，该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列（具有变异Fc区的多肽）及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于例如美国专利No.6,194,551B1和WO 1999/51642。还可参见例如Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。

“结合亲和力”通常指分子（例如抗体）的单一结合位点与其结合配偶体（例如抗原）之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员（例如抗体与抗原）之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速地结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的、示例性和例示性的、用于测量结合亲和力的实施方案。

在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的：通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的（¹²⁵I）标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen,et al.,J Mol Biol 293:865-881(1999))。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(DYNEX Technologies,Inc.)过夜，随后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白在室温（约23°C）封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与连续稀释的目的Fab混合（例如与Presta et al.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致）。然后将目的Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间（例如约65个小时）以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温（例如1小时）。然后除去溶液，并用含0.1%Tween-20^TM表面活性剂的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20^TM;Packard)，然后在TOPCOUNT^TM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。

依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用

-2000或

-3000仪器(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25°C使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml（约0.2μM），然后以5μl/分钟的流速注入至获得约十个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25°C以约25μl/分钟的流速注入在含0.05%TWEEN 20^TM表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab（0.78nM至500nM）。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(

Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen et al.,J Mol Biol 293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1s^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS,pH 7.2中的20nM抗抗原抗体（Fab形式）在25°C的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。

依照本发明的“结合速率”（on-rate,rate of association,association rate）或“k_on”也可如上所述使用

-2000或-3000***(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)来测定。

短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值（例如，一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体）之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值（例如Kd值）所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较值的函数，所述两个数值之间的差异例如小于约50%，小于约40%，小于约30%，小于约20%，和/或小于约10%。

短语“实质性降低”或“实质性不同”在用于本文时表示两个数值（通常一个与某分子有关而另一个与参照/比较分子有关）之间足够高的差异程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值（例如Kd值）所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较分子该数值的函数，所述两个数值之间的差异例如大于约10%，大于约20%，大于约30%，大于约40%，和/或大于约50%。

在某些实施方案中，本文中有用的人源化抗体进一步包含IgG Fc中的氨基酸改变且展现超出具有野生型IgG Fc的抗体升高至少60倍、至少70倍、至少80倍、更优选至少100倍、优选至少125倍、甚至更优选至少150倍至约170倍的对人FcRn的结合亲和力。

“病症”或“疾病”指将受益于本发明物质/分子或方法的治疗的任何状况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔的病症；及炎性病症、免疫学病症和其它血管发生相关病症。

术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症是血管发生。

“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌（包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌）、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric orstomach cancer)（包括胃肠癌）、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renalcancer)、***癌、外阴癌、甲状腺癌、及各种类型的头和颈癌，以及B细胞淋巴瘤（包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症）、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿（诸如与脑瘤有关的）和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。

术语“抗肿瘤组合物”或“抗癌组合物”或“抗癌剂”指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如“抗癌剂”。治疗剂（抗癌剂）的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、抗***发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它用于治疗癌症的药剂诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂（例如酪氨酸激酶抑制剂）、HER1/EGFR抑制剂（例如erlotinib(TarcevaTM)、血小板衍生生长因子抑制剂（例如GleevecTM (ImatinibMesylate)）、COX-2抑制剂（例如塞来考昔(celecoxib)）、干扰素、细胞因子、能与ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA、VEGF或VEGF受体中的一种或多种靶物结合的拮抗剂（例如中和性抗体）、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。

“血管发生因子”或“血管发生剂”指涉及刺激血管发育，例如促进血管发生(angiogenesis)、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长因子或其受体。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员及其受体（VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3）、PlGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体（血管生成素、ANGPT1、ANGPT2）、TIE1、TIE2、ephrin、Bv8、德尔塔样配体4(DLL4)、Del-1、酸性(aFGF)和碱性(bFGF)成纤维细胞生长因子、FGF4、FGF9、BMP9、BMP10、卵泡抑素(Follistatin)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、GM-CS F,肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)、白介素-8(IL-8)、CXCL12、Leptin、Midkine、神经毡蛋白(neuropilin)、NRP1、NRP2,胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生长因子尤其是PDGF-BB、PDGFR-α、或PDGFR-β、Pleiotrophin(PTN)、Progranulin、Proliferin、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、Alk1、CXCR4、Notch1、Notch4、Sema3A、Sema3C、Sema3F、Robo4等。它会进一步包括促进血管发生的因子，诸如ESM1和Perlecan。它还包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、***-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、EGF样域多重7(EGF-like domain,multiple 7,EGFL7)、CTGF及其家族的成员、及TGF-α和TGF-β。参见例如Klagsbrun andD’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39;Streit and Detmar(2003)Oncogene 22:3172-3179;Ferrara&Alitalo(1999)Nature Medicine5(12):1359-1364;Tonini等(2003)Oncogene 22:6549-6556(例如列举已知血管发生因子的表1);Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8:200-206。

术语“VEGF”在用于本文时指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung等(1989)Science 246:1306和Houck等(1991)Mol.Endocrin,5:1806所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF，等等。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF₁₆₅”来鉴别任何此类形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸（甲硫氨酸）也是天然VEGF中的第17位（甲硫氨酸）。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。依照一个优选的实施方案，所述VEGF是人VEGF。

“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性，包括其与VEGF或一种或多种VEGF受体或编码它们的核酸结合的分子。优选的是，所述VEGF拮抗剂结合VEGF或VEGF受体。VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体及其抗原结合片段、结合VEGF和VEGF受体并阻断配体-受体相互作用的多肽（例如免疫粘附素、肽体）、抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂、结合VEGF的适体和在严格条件下与编码VEGF或VEGF受体杂交的核酸（例如RNAi）。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂结合VEGF并抑制VEGF诱导的体外内皮细胞增殖。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂以大于非VEGF或非VEGF受体的亲和力结合VEGF或VEGF受体。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂以介于1uM和1pM之间的Kd结合VEGF或VEGF受体。依照另一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂以介于500nM和1pM之间的Kd结合VEGF或VEGF受体。

依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂选自：多肽诸如抗体、肽体、免疫粘附素、小分子或适体。在一个优选的实施方案中，所述抗体是抗VEGF抗体（诸如

抗体）或抗VEGF受体抗体（诸如抗VEGFR2或抗VEGFR3抗体）。VEGF拮抗剂的其它例子包括：VEGF-Trap、Mucagen、PTK787、SU11248、AG-013736、Bay 439006(sorafenib)、ZD-6474、CP632、CP-547632、AZD-2171、CDP-171、SU-14813、CHIR-258、AEE-788、SB786034、BAY579352、CDP-791、EG-3306、GW-786034、RWJ-417975/CT6758和KRN-633。

“抗VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。优选的是，本发明的抗VEGF抗体可在靶向和干预其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患时用作治疗剂。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。一种优选的抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体。更优选的是，抗VEGF抗体是依照Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称为bevacizumab(贝伐单抗;BV；

)的抗体。依照另一个实施方案，可以使用的抗VEGF抗体包括但不限于WO 2005/012359中披露的抗体。依照一个实施方案，所述抗VEGF抗体包含WO 2005/012359的图24、25、26、27和29中披露的任一抗体（例如G6、G6-23、G6-31、G6-23.1、G6-23.2、B20、B20-4和B20.4.1）的重链可变区和轻链可变区。在另一个优选的实施方案中，称为ranibizumab的抗VEGF抗体是为了眼病诸如糖尿病神经病变和AMD而施用的VEGF拮抗剂。

抗VEGF抗体“贝伐单抗”(bevacizumab,BV)，也称为“rhuMAb VEGF”或

是依照Presta et al.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。它包含突变的人IgG1框架区和来自阻断人VEGF结合其受体的鼠抗hVEGF单克隆抗体A4.6.1的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93%的氨基酸序列，包括大部分框架区，衍生自人IgG1，而大约7%的序列衍生自鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。其它抗VEGF抗体包括美国专利No.6884879和WO2005/044853中披露的抗体。

抗VEGF抗体Ranibizumab或

抗体或rhuFab V2是人源化的、亲和力成熟的抗人VEGF Fab片段。Ranibizumab是通过标准重组技术在大肠杆菌表达载体和细菌发酵中生成的。Ranibizumab是未糖基化的且分子量为约48,000道尔顿。参见WO98/45331和US20030190317。

血管发生失调可导致异常血管发生，即疾病状态中的或引起疾病状态的新血管生长过度、不足、或其它方面不当（例如从医学观点看不良的血管发生位置、时间或启动）时，即血管发生性病症。过度的、不当的或失控的血管发生发生于有促成疾病状态恶化或引起疾病状态的新血管生长时。新血管可供应患病组织，破坏正常组织，而且，在癌症的情况中，新血管可容许肿瘤细胞逃入循环并停留在其它器官中（肿瘤转移）。牵涉异常血管发生的疾病状况（即血管发生性病症）包括非肿瘤性的和肿瘤性的疾患，包括例如癌症，尤其是血管化实体瘤和转移瘤（包括结肠癌、乳腺癌、肺癌（尤其是小细胞肺癌）、脑癌（尤其是成胶质细胞瘤）或***癌）、不想要的或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病或IBD（克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎）银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、年龄相关黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、视网膜/脉络膜新血管形成、虹膜前面的新血管形成（发红）、眼新血管疾病、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑脊膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生（包括格雷夫斯氏(Graves)病）、慢性炎症、肺炎、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压、恶性肺积液(malignant pulmonary effusion)、脑水肿（例如与急性中风/闭合性头部外伤/创伤有关的）、滑液炎症、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多囊卵巢病、子宫内膜异位症、第三空间流体病(3rd spacing offluid diseases)（胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病）、子宫纤维瘤(uterinefibroids)、早产、慢性炎症诸如IBD、肾同种异体移植物排斥、炎性肠病、肾病综合征、不想要的或异常的组织块生长（非癌性的）、血友病性关节、肥厚性瘢痕、毛发生长的抑制、奥-韦二氏(Osler-Weber)综合征、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液（诸如与心包炎有关的）和胸腔积液。

在用于本文时，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或病症的发生/发展。

“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。

本发明的物质/分子、拮抗剂或激动剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。术语“治疗有效量”指在哺乳动物（aka患者）中有效“治疗”疾病或紊乱的本发明抗体、多肽、或拮抗剂的数量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞数；缩小肿瘤体积或重量；抑制（即一定程度的减缓，优选停止）癌细胞浸润到周围器官中；抑制（即一定程度的减缓，优选停止）肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。就药物可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。在一个实施方案中，治疗有效量是生长抑制量。在另一个实施方案中，治疗有效量是延长患者存活的量。在另一个实施方案中，治疗有效量是改进患者无进展存活的量。

“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量低于治疗有效量。

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)（长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)）、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和

环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)（尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)）；δ-9-四氢***酚(tetrahydrocannabinol)（屈***酚(dronabinol)，

）；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)（包括合成类似物托泊替康(topotecan)

CPT-11（伊立替康(irinotecan)，

）、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱）；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物）；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)（特别是隐藻素1和隐藻素8）；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin（包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)（如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1（参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994)）；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团）、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、

多柔比星(doxorubicin)（包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星）、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；

多糖复合物（JHS Natural Products,Eugene,OR）；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)（尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin)）；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)

达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)（“Ara-C”）；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如

紫杉醇(paclitaxel)（Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.）、ABRAXANE^TM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇（American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois）和

多西他塞(doxetaxel)（

-Poulenc Rorer,Antony,France）；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)

6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)

铂；依托泊苷(etoposide)（VP-16）；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)

能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)

任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***龙联合疗法的缩写）和FOLFOX（奥沙利铂（ELOXATIN^TM）联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写）。别的化疗剂包括可用作抗体药物偶联物的细胞毒剂，诸如美登木生物碱（例如DM1）和auristatin（例如MMAE和MMAF）。

“化疗剂”还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是***或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗***类和选择性***受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)（包括

他莫昔芬）、

雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和

托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；***受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如和

醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林（buserelin acetate）和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节***生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、

醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、

依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、

伏罗唑(vorozole)、

来曲唑(letrozole)和

阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)（例如

或

）、

依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、

唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)、

阿伦膦酸盐(alendronate)、

帕米膦酸盐(pamidronate)、

替鲁膦酸盐(tiludronate)或

利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)（1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物）；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如

疫苗和基因疗法疫苗，例如

疫苗、

疫苗和疫苗；

拓扑异构酶1抑制剂；

rmRH；lapatinib ditosylate（ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016）；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。

“生长抑制剂”在用于本文时指抑制细胞生长和/或增殖的化合物或组合物。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进（处于S期以外的位置）的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长***类(vincas)（长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)）、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如蒽环类抗生素多柔比星(doxorubicin)（(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5,12-萘二酮，即(8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacenedione）、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、***(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《The Molecular Basis ofCancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycle regulation,oncogenes,and antieioplastic drugs”，Murakaini等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类（紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)）是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(

Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(

Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝***的抑制。

如本文中所使用的，术语“患者”指想要治疗的任何单一动物，更优选哺乳动物（包括非人动物，诸如例如犬、猫、马、家兔、动物园动物、牛、猪、绵羊、和非人灵长类）。最优选的是，本文中的患者是人。

“受试者”在本文中指任何单一人类受试者，包括适于接受治疗的患者，他正经受或者已经经受血管发生性病症的一种或多种体征、症状、或其它指标。意图包括作为受试者的是参与临床研究试验且未显示疾病的任何临床体征的任何受试者，或参与流行病学研究的受试者，或曾经用作对照的受试者。所述受试者可以先前用抗癌剂治疗过，或者没有这样治疗过。受试者可以是在开始本文中的治疗时未用过所用第二药物的，即该受试者在“基线”（即在本文中治疗方法中施用第一剂抗癌剂之前的一个设定点，诸如开始治疗之前筛选受试者的日子）时可以没有用例如抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂治疗过。这样的“未接触（药物）”受试者一般认为是用所述第二药物进行治疗的候选人。

术语“有效量”指药物有效治疗血管发生性病症或***发生性病症（包括例如癌症）的量。

术语“药物配制剂”指其形式容许药物的生物学活性是有效的，且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的无菌制备物。

“无菌”配制剂是无菌的或不含所有活的微生物及其孢子。

“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品或药物的商业包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗用产品或药物应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症、与该包装产品联合的其它治疗用产品和/或警告等的信息。

“试剂盒”指包含至少一种试剂（例如用于治疗血管发生性病症的药物，或用于特异性检测本发明的生物标志物基因或蛋白的探针）的任何制品（例如包装或容器）。所述制品优选以用于实施本发明方法的单位来宣传、分发、或销售。

就对药物没有响应而言，因先前的或当前的一种或多种药物的治疗而经历“临床上不可接受的高水平毒性”的受试者经历一种或多种与该药物有关的、有经验的临床医师认为是重大的负面副作用或不良事件，诸如例如严重感染、充血性心力衰竭、脱髓鞘（引起多发性硬化）、显著的超敏感性、神经病理性事件、高度的自身免疫、癌症（诸如子宫内膜癌、非何杰金氏淋巴瘤、乳腺癌、***癌、肺癌、卵巢癌、或黑素瘤）、结核病(TB)、等。

“降低负面副作用的风险”指将源自本文中拮抗剂治疗的副作用的风险降低至比源自用先前施用的药物治疗同一患者或另一患者所观察到的风险要低的程度。此类副作用包括上文关于毒性所列出的副作用，而且优选是感染、癌症、心力衰竭、或脱髓鞘。

“关联”或“联系”指以任何方式将第一分析或方案的性能和/或结果与第二分析或方案的性能和/或结果进行比较。例如，可以将第一分析或方案的结果用于实施第二分析或方案，和/或，可以使用第一分析或方案的结果来决定是否应当实施第二分析或方案。就本发明的各个实施方案而言，可以使用分析性测定法的结果来决定是否应当实施使用抗癌剂，诸如抗VEGF抗体的特定治疗方案。

III.方法

本发明提供用于鉴定有可能响应抗癌剂的患者的方法、用于监测抗癌疗法的有效性的方法、用于鉴定经历转移的可能性升高的患者的方法、和用于优化抗癌剂剂量的方法。该等方法包括将成像剂施用于患者，(a)将成像剂施用于已经接受至少一剂抗癌剂的患者；(b)检测该患者中与肿瘤引流***有关的***中的淋巴搏动频率；并(c)将该淋巴搏动频率与该抗癌剂处理前该***中的搏动频率比较。***中的淋巴搏动频率降低至少约10%鉴定出响应抗癌剂的可能性升高的患者。***中的淋巴搏动频率升高至少约10%鉴定出经历转移的可能性升高的患者。***中的淋巴搏动频率有变化鉴定出该剂量为有效剂量。***中的淋巴搏动频率无变化鉴定出该剂量为最大有效剂量。在一些实施方案中，该等方法进一步包括将有效量的该抗癌剂施用于该患者。在一些实施方案中，该等方法进一步包括将有效量的第二、第三、或第四抗癌剂施用于该患者。

A.成像方法

所公开的方法和测定法提供方便、有效、且潜在划算的手段来获得数据和信息，该数据和信息可用于通过检测淋巴功能（例如淋巴搏动频率或大量淋巴转运）来评估用于治疗患者的适宜或有效疗法。该等方法可以使用多种成像剂和装置来进行。合适的检测方法和装置记载于例如Sharma et al.,Am.J.Physiol.Heart.Circ.Physiol.292:H3109-3118(2007);Sharma et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.1131:13-36(2008),Rasmussen et al.,Curr.Opin.Biotech.20:74-78(2009)及PCT公开号WO 2008//025005和WO 2008/02500。使用本文中描述的方法，可以对组织或皮肤表面下面深处的***成像，包括例如位于组织或皮肤表面下面至少约1cm、2cm、或3cm深度的***。

将成像剂施用于患者，使得该药剂到达与肿瘤引流***有关的***并能使用本领域已知的方法和装置来检测。可以经由任何合适手段（包括例如注射器或导管）和经任何合适路径（包括例如皮内、皮下、或肌肉内）将成像剂施用于个体。可以将成像剂在溶液（诸如例如盐水溶液）中稀释至合适浓度。例如，溶液中改良成像剂的浓度可以是约1μM至约400μM、约10μM至约200μM、或约25μM至约100μM。可以施用任何合适量的成像剂。例如，施用的量可以是约1μg至约100μg、约1μg至约75mg、约1μg至约50mg、约1μg至约25mg、约1μg至约10mg、约1μg至约5mg、或约1μg至约1mg。

为了激发淋巴***中的成像剂，可以通过激发光源在组织表面上将激发光照射到感兴趣靶区上。合适光源的例子包括例如激光二极管、半导体激光二极管、气体激光器、发光二极管(LED)、或其组合。在一些实施方案中，激发光源是连续波光源，即发射连续光强的光源。光源可以发射波长约550nm至约1000nm、约600nm至约950nm、约700nm至约900nm、或约750nm至约850nm的光。或者，激发光源可以是随时间而变化的光源，即发射变化光强的光源。对激发光源的强度调控可以是例如正弦、方波、或斜波调控。在一些实施方案中，激光光源可以以某些频率和重复率发脉冲。频率和重复率也可以随时间而变化。激发光源的时间变化可以是与本文所述方法联合使用的成像剂的寿命的约1至约3个数量级。

在通过激发光照射组织表面时，施用于患者的成像剂发射荧光。可使用传感器来检测或感觉来自荧光成像剂的发射。传感器优选能够检测自荧光靶发射的荧光及检测自介质反射的激发光。在一个实施方案中，传感器可包含电荷耦合照相机(CCD)。合适传感器的其它例子包括但不限于门控或非门控电子倍增(EM)-CCD或增强型(ICCD)照相机。传感器可进一步包含测量荧光光学断层摄影术和成像所需适宜光波长所必需的任何合适滤光片或起偏镜。

在一个实施方案中，可以通过持续捕捉或获取自成像剂发射的光的图像来持续检测来自成像剂的荧光发生，以创建通过***构的淋巴推进的一系列实时图像（即动画或视频）。图像可以捕捉一定时间段，例如约100毫秒至约30分钟、约1分钟至约20分钟、或约5分钟至约15分钟。此外，可以以任何合适积分时间捕捉或记录图像，例如约1毫秒至约5秒钟、约10毫秒至约1秒钟、或约100毫秒至约800毫秒。因而，根据时间段和帧率，收集的图像可以是100幅图像至超过1,000幅图像的任何地方。通过随着成像剂被泵送通过***构而跟踪它们，可以定量地且精确地测量淋巴推进和功能。另外，一系列记录的图像提供了推进或运输通过***构（例如***）的一或多包或块成像剂的永久光学记录，在此之上可实施进一步分析以评估淋巴功能（例如淋巴转运诸如淋巴搏动频率或大量淋巴转运）。为了对淋巴搏动频率定量，可以在荧光***上鉴定静止靶区或感兴趣区域。靶区或感兴趣区域即沿着***，可专门进行测量的点。然后可以在给定时间段里持续测量特定靶区或感兴趣区域的荧光强度。随着一包成像剂通过***，可测量到荧光强度中的对应尖峰或峰。然后可以通过将测量到的脉冲数目除以测量时间段来对***的淋巴搏动频率定量。例如，如果在5分钟的时间段里测量到八个强度峰，那么脉冲频率会等于约1.6次脉冲/分。如此，上文公开的方法是评估淋巴搏动频率的一种定量的且非侵入性的方式。

在一些实施方案中，本文所述方法可以与断层摄影成像联合使用。

本领域已知的任何合适成像剂可用于本发明的方法。合适成像剂的例子包括例如三羰花青染料、二羰花青染料、双羰花青染料、含吲哚的染料、聚次甲基染料、吖啶、蒽醌、苯并咪唑、假吲哚、萘酰亚胺、噁嗪、氧鎓醇、多烯、卟吩、方酸菁、苯乙烯基、噻唑、黄素、或其组合。合适成像剂还包括例如吲哚菁绿、

染料(Invitrogen)；Alexa Fluor 546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、AlexaFluor 700和Alexa Fluor 750、y染料(GE)；Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、IR染料(Li-Cor)；IR染料700、IR染料800、量子点(Invitrogen)；Qdot565、Qdot585、Qdot605、Qdot625、Qdot655、Qdot705、Qdot800、AngioSense680和750、AngioSpark680和750、VivoTag 680和750(VisEn)、IR染料(Sigma);IR染料740、IR染料707、IR染料743、IR染料648、IR染料814、IR染料638、IR染料762、IR染料711、IR染料784、IR染料701、IR染料712、IR染料768、IR染料683、IR染料695、IR染料668、dipicolylcyanine(DIPCY)、荧光蛋白：mCherry、IFP1.4、DsRed、HcRed、mPlum、mRFP(综述见Wang et al 2008)、X-Sight染料(Carestream Health)；X-Sight 640、X-Sight 670、X-Sight 549纳米球、X-Sight 650纳米球、X-Sight 691纳米球、X-Sight 761纳米球、罗丹明、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、DyLight(ThermoFishcer)；DyLight549、DyLight594、DyLight633、DyLight649DyLight680、DyLight750、DyLight800、Nile red、CF染料(Biotium)；CF680、CF750、CF770、XenoLight(Caliper)；XenoLightCF680、XenoLightCF750、XenoLightCF770、XenoFluor680、XenoFluor750、TransFluoSpheres(Molecular Probes)：543/620、633/720、633/760、FluoSpheres(Molecular Probes)：橙色、橙红色、红色、洋红色、绯红色、猩红色、暗红色

在一些实施方案中，将成像剂与载体偶联，包括例如聚乙二醇、甲氧基聚(乙二醇)、葡聚糖/右旋糖酐、或清蛋白。

本领域已知的任何合适检测装置可用于本文所述方法。优选地，检测装置具有以最小视野1mm和3)帧率=>0.5Hz显现各个***的解决办法。合适装置的典型元件包括例如光源（LED、白光、激光、等）、滤光片、透镜、检测器（CCD、iCCD、EMCCD、PMT、等）、和带帧接收器的计算机。合适的检测装置包括例如荧光内窥镜、落射荧光显微镜、共焦和2-光子显微镜、宏观成像***和全动物成像***。

可以在本文所述方法中使用本领域已知的其它非基于荧光的成像方法。在一些实施方案中，发光剂与合适载体偶联或作为游离的药剂使用以通过发光成像装置来显现和测量淋巴搏动和转运。合适的发光成像剂包括例如萤光素酶和BRET-Qdots(Kosaka et al.,Contrast Media and Mol.Im.DOI:10.1002/cmmi.395(2010)。

在一些实施方案中，光声成像剂与合适的载体偶联或者作为游离的药剂使用以通过光声成像来显现和测量淋巴搏动和转运(Song et al.,Med.Phys.36:3724-9(2009),Erpelding et al.,Radiology 256:102-10(2010),Kim et al.,Radiology 255:442-50(2010))。合适的光声成像剂包括例如伊文思蓝(Song etal.,Med.Phys.36:3724-9(2009))、亚甲蓝(Erpelding et al.,Radiology256:102-10(2010))和吲哚菁绿(Kim et al.,Radiology 255:442-50(2010))。

在一些实施方案中，可以使用本领域已知的其它成像方法来直接观察***，包括例如光学-相干断层摄影术(McLaughlin et al.,Cancer Res.70:2579-84(2010))和光频域成像(OFDI)(Vakoc et al.,Nat.Med.15:1219-24(2009))。可以与这些方法一起使用对比剂以提高检测和灵敏度。

可以将本领域已知的其它非基于光学的检测装置用于本文所述方法(Clement and Luciani Eur.Radiol.14:1498-1507(2004),Barrett et al.ContrastMedia and Mol.Img.1:230-245(2006))。在一些实施方案中，使用磁共振成像(MRI)剂来显现和测量淋巴搏动，通过MRI来显现和测量转运(Motoyama etal.,Surgery 141:736-47(2007),Ruddel et al.Neoplasia 10:706-13(2008)及Notohamiprodjo et al.,Eur.Radiol.19:2771-8(2009))。合适的成像剂包括例如铁氧化物颗粒(Motoyama et al.,Surgery 141:736-47(2007))、纳米管(Ananta etal.,Nano Lett.9:1023-27(2009))、钆-二葡甲胺(Notohamiprodjo et al.,Eur.Radiol.19:2771-8(2009))和基于钆的纳米管(Sitharaman and Wilson J.Nanomed.1:291-5(2006))。MRI剂可以与合适的载体缀合或者作为游离的药剂使用。

在一些实施方案中，使用超声成像剂使用超声成像来显现和测量淋巴搏动和转运(Curry et al.,Ann.Otol Rhinol Laryngol.118:645-50(2009))。合适的超声成像剂包括例如全氟那芬微泡(Sonazoid,Amersham)。超声成像剂可以与合适的载体缀合或者作为游离的药剂使用。

在一些实施方案中，使用放射性核素使用正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)或时间解析放射摄影成像来显现和测量淋巴搏动和转运(Weiss et al.,Eur.J.Nuc.Med.Mol.Img.30:202-6(2003),Mar et al.,J.Nuc.Med.Tech 35:10-16(2007))。合适的放射性核素包括例如Tc-99、F-18、Cu-64I-124、Br-76、Br77、C-11、In-111、I-123、Y-86、Cu-60、Cu-61、和Zr-89。放射性核素可以与合适的载体缀合或者作为游离的药剂使用。

在一些实施方案中，使用计算机断层摄影术(CT)成像剂使用计算机断层摄影术成像来显现和测量淋巴搏动和转运(Suga et al.,Radiology 230:543-552(2004),Suga et al.,Radiology 237:952-60(2005))。合适的CT成像剂包括例如碘帕醇(Suga et al.,Radiology 230:543-552(2004))。CT成像剂可以与合适的载体缀合或者作为游离的药剂使用。

B.别的方法

在上文所述使用成像剂的方法之外，临床医师可使用本领域已知的数种方法之任一来测量抗癌剂的特定剂量方案的功效。例如，可使用体内成像（例如MRI）来测定肿瘤大小及鉴定任何转移以确定对该疗法的相对有效响应性。可调整剂量方案来提供最佳的期望响应（例如治疗响应）。例如，可施用一剂，可以在一段时间里施用多个分剂，或者可以根据治疗情况的紧急事件成比例地降低或提高剂量。

根据诸如具体抗癌剂类型等因素，具有本领域普通技术的内科医师能容易地确定所需要的药物组合物的有效量和开出这样的处方。例如，内科医师可以以多剂此类抗癌剂（诸如抗NRP2抗体、抗VEGF-C抗体、或抗VEGF-A抗体）开始，其在药物组合物中以低于实现期望的治疗效果所需要的水平的水平使用，并逐渐提高剂量，直至实现期望的效果。拮抗剂的给定剂量或治疗方案的功效可通过例如使用标准功效度量评估患者中的体征和症状来测定。

在又一个实施方案中，至少两次用相同的抗癌剂，诸如抗NRP2抗体、抗VEGF-C抗体、或抗VEGF-A抗体治疗受试者。如此，第一次和第二次拮抗剂暴露优选用相同的拮抗剂，更优选所有拮抗剂暴露用相同的拮抗剂，即头两次暴露、优选所有暴露的处理用一种类型的抗癌剂，例如结合VEGF的拮抗剂，诸如抗VEGF抗体，例如都用贝伐单抗。

在本文中所列出的所有本发明方法中，所述抗癌剂（诸如结合VEGF的抗体）可以是未偶联的，诸如裸抗体，或者可以是为了进一步的功效（诸如例如延长半衰期）而偶联有另一分子的。

本文中的一种优选抗癌剂是嵌合、人源化、或人抗体，例如抗VEGF抗体，优选贝伐单抗。

在另一个实施方案中，VEGF拮抗剂（例如抗VEGF抗体）是对受试者施用的唯一药物。

在一个实施方案中，拮抗剂是抗VEGF抗体，以每1、2、3、或4周约100或400mg的剂量施用或者以每1、2、3、或4周约1、3、5、10、15、或20mg/g的剂量施用。剂量可以作为单剂或作为多剂（例如2或3剂）施用，诸如输注。

在又一个方面，在诊断步骤之后，本发明提供了确定是否要继续给诊断有癌症的受试者施用抗癌剂（例如抗VEGF抗体）的方法，包括使用成像技术诸如放射照相术和/或MRI测量第一次施用拮抗剂之后肿瘤尺寸的缩小，使用成像技术诸如放射照相术和/或MRI测量第二次施用拮抗剂之后受试者肿瘤尺寸的缩小，比较第一次和第二次时受试者的成像发现，如果第二次的得分比第一次少，那么继续施用所述拮抗剂。

在又一个实施方案中，治疗方法包括检验给药步骤之后受试者对治疗的响应的步骤，用于确定该响应水平对于治疗血管发生性病症是否有效。例如，包括检验给药之后的成像（放射照相术和/或MRI）得分并与给药以前获得的基线成像结果比较的步骤，用于通过测量是否发生变化和变化了多少来确定治疗是否有效。此检验可以在给药之后以多种有安排的或未安排的时间间隔重复，用于确定任何部分或完全消退的维持。

在本发明的一个实施方案，在VEGF拮抗剂以外没有给受试者施用其它药物来治疗癌症。

在本文中的任何方法中，抗癌剂可以与有效量的第二药物组合施用。合适的第二药物包括例如抗***发生剂、抗血管发生剂、抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、或其组合。

所有这些第二药物可以彼此组合或者单独与第一药物一起使用，因此表述“第二药物”在用于本文时不意味着它是第一药物以外的唯一药物。如此，第二药物不必是一种药物，而是可以包含超过一种上述药物。

本文所列的这些第二药物通常以与上文所用相同的剂量和施用途径或者迄今所用剂量的大约1-99%使用。如果确实使用此类第二药物，那么优选它们以低于不存在第一药物时的量使用，尤其是在第一药物的初始服药之后的后续给药中，以便消除或降低由此引起的副作用。

对于本文所述复治方法，其中第二药物以有效量与拮抗剂暴露一起施用，它可以与任何暴露一起施用，例如，只与一次暴露或者与超过一次暴露一起施用。在一个实施方案中，第二药物与初始暴露一起施用。在另一个实施方案中，第二药物与初始和第二暴露一起施用。在又一个实施方案中，第二药物与所有暴露一起施用。优选的是，在初始暴露（诸如类固醇的）之后，降低或清除此类第二药物的量以减少受试者对具有副作用的药剂诸如***、***龙、甲泼尼龙、和环磷酰胺的暴露。

第二药物的联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用（同时施用），以及任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有（两种或更多种）活性剂（药物）同时发挥其生物学活性。

抗癌剂以任何合适手段施用，包括胃肠外、表面、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和/或损伤内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内(i.v.)、动脉内、腹膜内或皮下施用。还涵盖鞘内施用。另外，还可合适地通过脉冲输注来施用抗癌剂，例如用剂量逐渐减少的抗癌剂。优选的是，通过静脉内或皮下，更优选通过静脉内输注来给予剂量给药。

如果提供多次抗癌剂暴露，那么每次暴露可以使用相同的或不同的施用手段来提供。在一个实施方案中，每次暴露通过静脉内施用。在另一个实施方案中，每次暴露通过皮下施用给予。在又一个实施方案中，所述暴露通过静脉内和皮下施用二者给予。

在一个实施方案中，以缓慢的静脉内输注而非静脉内推注或快速注射来施用抗癌剂诸如抗VEGF抗体。例如，在抗VEGF抗体的任何输注之前约30分钟施用类固醇诸如***龙或甲泼尼龙（例如静脉内约80-120毫克，更具体静脉内约100毫克）。所述抗VEGF抗体是通过例如专用线路输注的。

对于多剂抗VEGF抗体暴露的初始剂，或者对于所述暴露只包括一剂的单剂，此类输注优选以约50毫克/小时的速率开始。这可逐步提高，例如，每约30分钟速率提高约50毫克/小时直至约400毫克/小时的最大值。然而，如果受试者正发生输注相关反应，那么输注速率优选降低至例如当前速率的一半，例如从100毫克/小时降低至50毫克/小时。优选的是，抗VEGF抗体此类剂（例如约1000毫克总剂量）的输注用约255分钟（4小时15分钟）完成。优选的是，受试者在开始输注前大约30至60分钟通过口接受醋氨酚/对乙酰氨基酚（例如约1克）和盐酸苯海拉明(diphenhydramine HCl)（例如约50毫克或相似药剂的等效剂量）的预防性处理。

如果给予超过一次的抗VEGF抗体输注（剂）以完成整个暴露，那么优选在此输注实施方案中以高于初始输注的速率开始第二或随后的抗VEGF抗体输注，例如约100毫克/小时。此速率可以逐步提高，例如每约30分钟速率提高约100毫克/小时直至约400毫克/小时的最大值。发生输注相关反应的受试者优选将输注速率降低至该速率的一半，例如从100毫克/小时降低至50毫克/小时。优选的是，此类第二剂或随后剂的抗VEGF抗体（例如约1000毫克总剂量）的输注用约195分钟（3小时15分钟）完成。

在一个优选的实施方案中，抗癌剂是抗VEGF抗体，而且以约0.4至4克的剂量施用，而且更优选的是，抗体以约0.4至1.3克的剂量、约1个月的时段内1至4剂的频率施用。还更优选的是，剂量是约500mg至1.2g，而且在其它实施方案中，是约750mg至1.1g。在此类方面，拮抗剂优选以2至3剂施用，和/或在约2至3周的时段内施用。

在一个实施方案中，受试者先前从未施用用于治疗癌症的任何药物。在另一个实施方案中，受试者或患者先前曾经施用用于治疗癌症的一种或多种药物。在又一个实施方案中，受试者或患者对先前施用的一种或多种药物没有响应。受试者对其可没有响应的此类药物包括例如抗肿瘤剂、化疗剂、细胞毒剂、和/或生长抑制剂。更具体的说，受试者对其可没有响应的药物包括VEGF拮抗剂（诸如抗VEGF抗体）。在又一个方面，此类抗癌剂包括抗体或免疫粘附素，使得复治涵盖受试者以前对其没有响应的、本发明的一种或多种抗体或免疫粘附素。

IV.抗癌剂治疗

一旦鉴定出对抗癌剂治疗最响应或敏感的患者群，用本文中的抗癌剂单独地或与其它药物联合地进行处理导致对癌症的改善。例如，此类治疗可导致肿瘤尺寸缩小或无进展存活延长。此外，用抗癌剂与至少一种第二药物的组合进行的治疗优选导致对患者产生累加的、更优选协同的（或大于累加的）治疗受益。优选的是，在此组合方法中，第二药物的至少一次施用与本文中的抗癌剂的至少一次施用之间的时间安排是大约一个月或更短、更优选大约两周或更短。

医学领域技术人员会领会，在诊断得出患者有可能对抗癌剂有响应后对所述患者施用治疗有效量的抗癌剂的确切方式由主治医师判断。施用的模式包括剂量、与其它药剂的组合、施用的时间安排和频率、等等，可受到患者有可能对此类抗癌剂有响应的诊断以及患者的状况和历史的影响。如此，甚至预测对抗癌剂相对不敏感的诊断有病症的患者仍可受益于其治疗，特别是在与其它药剂（包括可改变患者对抗癌剂的响应性的药剂）的组合中。

会以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用包含本发明抗癌剂的组合物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的病症的具体类型、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、血管发生性病症的起因、投递药剂的部位、可能的副作用、拮抗剂的类型、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。要施用的抗癌剂的有效量会取决于此类考量。

作为一般提议，胃肠外施用的抗癌剂的每剂有效量会在约20mg至约5000mg的范围里，通过一个或多个剂量来实现。用于抗体（诸如抗VEGF抗体）的例示性剂量方案包括每1、2、3、或4周100或400mg，或者每1、2、3、或4周施用约1、3、5、10、15、或20mg/kg的一剂。该剂量可以作为单剂或作为多剂（例如2或3剂）施用，诸如输注。

然而，如上面指出的，对于抗癌剂的这些建议量要加以诸多治疗上的考量。在选择合适剂量和进度安排中，关键的因素是所得的结果，如上文提示的。在一些实施方案中，尽可能接近病症的首次体征、诊断、表现或出现，施用抗癌剂。

抗癌剂以任何合适手段施用，包括胃肠外、表面、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和/或损伤内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。还涵盖鞘内施用。另外，可合适地通过脉冲输注来施用拮抗剂，例如用剂量逐渐减少的拮抗剂。最优选地，通过静脉内注射来给予剂量给药。

可以与本文中的抗癌剂一起施用如上所述的第二药物。联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用，以及任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有（两种或更多种）活性剂同时发挥其生物学活性。

除了通过上文所述传统路径将抗癌剂施用于患者，本发明涵盖通过基因疗法进行的施用。编码抗癌剂的核酸的此类施用涵盖在表述“施用有效量的抗癌剂”中。可参见例如WO 1996/07321，其关注使用基因疗法来产生胞内抗体。

主要有两种方法使核酸（任选包含在载体中）进入患者的细胞，即体内(in vivo)和回体(ex vivo)。对于体内投递，通常在需要拮抗剂的部位将核酸直接注射入患者。对于回体治疗，采集患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞直接施用于患者，或是例如装入多孔膜再植入患者（参见例如美国专利No.4,892,538和5,283,187）。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移至目的宿主的体外培养的细胞还是体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。

目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体（诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒）和基于脂质的***（例如，可用于脂质介导的基因转移的脂质有DOTMA、DOPE和DC-Chol）进行转染。在有些情况中希望与对靶细胞特异性的药剂一起提供核酸来源，诸如对靶细胞上的细胞表面膜蛋白特异性的抗体、针对靶细胞上受体的配体等。若采用脂质体，则可以使用与胞吞作用有关的细胞表面膜蛋白结合的蛋白质靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段、针对在循环中经历内在化的蛋白质的抗体、和靶向胞内定位并延长胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞作用的技术记载于例如Wu et al.,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987)和Wagneret al.,PNAS USA 87:3410-3414(1990)。基因标记和基因治疗方案记载于例如Anderson et al.,Science 256:808-813(1992)和WO 1993/25673。

可以将抗癌剂与至少一种别的具有抗癌特性的化合物在药物组合配制剂中组合或作为组合疗法以给药方案组合。所述药物组合配制剂或给药方案中的至少一种别的化合物优选具有对VEGF拮抗剂组合物的补充活性，使得它们彼此不会产生不利影响。

所述至少一种别的化合物可以为化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、抗血管发生剂、抗***发生剂、及其组合。此类分子以对指定目的有效的量适当地组合存在。含有VEGF拮抗剂（例如抗VEGF抗体）的药物组合物还可以包含治疗有效量的抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、或其组合。

一方面，所述第一化合物是抗VEGF抗体，而且所述至少一种别的化合物是抗VEGF抗体以外的治疗性抗体。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是结合癌细胞表面标志物的抗体。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗HER2抗体，曲妥单抗（例如

Genentech,Inc.,South San Francisco,CA）。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗HER2抗体，pertuzumab(Omnitarg^TM,Genentech,Inc.,South San Francisco,CA,参见US6949245)。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗体（裸抗体或ADC），而且所述别的抗体是第二种、第三种、第四种、第五种、第六种抗体或更多，使得此类第二种、第三种、第四种、第五种、第六种、或更多种抗体（裸的或作为ADC的）的组合有效治疗血管发生性病症。

依照本发明的其它治疗方案可包括施用VEGF拮抗剂抗癌剂，而且包括但不限于放射疗法和/或骨髓和外周血移植和/或细胞毒剂、化疗剂或生长抑制剂。在一个这样的实施方案中，化疗剂是以下药剂或药剂组合，诸如例如环磷酰胺、羟基柔红霉素、阿霉素、多柔比星、长春新碱(ONCOVIN^TM)、***龙、CHOP、CVP或COP，或者免疫治疗剂，诸如PSCA、抗HER2（例如

OMNITARG^TM）。组合疗法可以作为同时或序贯方案施用。当序贯施用时，可以以两次或更多次施用来施用所述组合。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和任意次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥其生物学活性。

在一个实施方案中，使用抗VEGF抗体的治疗涉及组合施用本文中所鉴定的抗癌剂和一种或多种化疗剂或生长抑制剂，包括共施用不同化疗剂鸡尾酒样混合物。化疗剂包括紫杉烷类（诸如帕利他赛(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)）和/或蒽环类抗生素。熟练从业人员可以按照制造商的说明书或凭经验确定地使用此类化疗剂的制备和剂量给药方案。此类化疗剂的制备和剂量给药方案还记载于“Chemotherapy Service”,(1992)M.C.Perry编,Williams&Wilkins,Baltimore,Md。

任何上述共施用的药剂的合适剂量就是那些当前使用的剂量，而且可以由于新鉴定的药剂和其它化疗剂或治疗的联合作用（协同作用）而降低。

组合疗法可以提供“协同作用”并且证实是“协同性”的，即当一起使用活性组分时所实现的效果大于分开使用所述化合物时所产生的效果之和。当活性组分为如下情况时可以获得协同效应：(1)共同配制和施用或在合并的单位剂量配制剂中同时投递；(2)作为分开的配制剂交替或平行投递；或(3)通过一些其它方案。当在交替疗法中投递时，在序贯施用或投递所述化合物时，例如通过不同注射器中的不同注射，可以获得协同效应。一般而言，在交替疗法中，序贯地，即依序地施用每种活性组分的有效剂量，而在组合疗法中，一起施用两种或更多活性组分的有效剂量。

对于疾病的预防或治疗，所述别的治疗剂的适宜剂量将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和进程、施用VEGF拮抗剂和别的药剂是出于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对VEGF拮抗剂和别的药剂的响应、及主治医师的判断。合适的是，一次性或通过一系列治疗将VEGF拮抗剂和别的药剂施用于患者。VEGF拮抗剂通常如上文所述施用。根据疾病的类型和严重程度，施用于患者的初始候选剂量是约20mg/m²至600mg/m²别的药剂，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素，典型日剂量的范围可以是约20mg/m²、85mg/m²、90mg/m²、125mg/m²、200mg/m²、400mg/m²、500mg/m²或更多。对于持续数天或更长的重复施药，根据状况，持续治疗直至疾病症状发生期望的抑制。如此，可对患者施用约20mg/m²、85mg/m²、90mg/m²、125mg/m²、200mg/m²、400mg/m²、500mg/m²、600mg/m²（或其任意组合）的一剂或多剂。这些剂量可间歇施用，例如每周或每两、三、四、五、或六周（例如使得患者接受约2剂至约20剂，例如约6剂别的药剂）。可施用一剂较高的初始加载剂量，后续一剂或多剂较低剂量。然而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。

V.药物配制剂

依照本发明使用的拮抗剂的治疗用配制剂通过将具有期望纯度的拮抗剂与任选的药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，以冻干配制剂或水溶液的形式制备供贮存。关于配制剂的一般信息参见例如Gilman et al.,(eds.)(1990),The Pharmacological Bases of Therapeutics,8th Ed.,Pergamon Press;A.Gennaro(ed.),Remington′s Pharmaceutical Sciences,18th Edition,(1990),MackPublishing Co.,Eastori,Pennsylvania.;Avis et al.,(eds.)(1993)PharmaceuticalDosage Forms:Parenteral Medications Dekker,New York;Lieberman et al..，(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets Dekker,New York;及Lieberman et al.,(eds.)(1990),Pharmaceutical Dosage Forms:DisperseSystems Dekker,New York,Kenneth A.Walters(ed.)(2002)Dermatological andTransdermal Formulations(Drugs and the Pharmaceutical Sciences),Vol 119,Marcel Dekker。

可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物（例如Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

例示性的抗VEGF抗体配制剂记载于美国专利No.6,884,879。在某些实施方案中，抗VEGF抗体在单次使用管形瓶中以25mg/mL配制。在某些实施方案中，在240mg α,α-海藻糖二水合物、23.2mg钠的磷酸盐（一碱基的，一水合物）、4.8mg钠的磷酸盐（二碱基的，无水的）、1.6mg聚山梨酯20、和注射用水(USP)中配制100mg抗VEGF抗体。在某些实施方案中，在960mgα,α-海藻糖二水合物、92.8mg钠的磷酸盐（一一碱基的，一水合物）、19.2mg钠的磷酸盐（二碱基的，无水的）、6.4mg聚山梨酯20、和注射用水(USP)中配制400mg抗VEGF抗体。

适于皮下施用的冻干配制剂记载于例如美国专利No.6,267,958(Andyaet al.)。此类冻干配制剂可以用合适的稀释剂重建至高蛋白质浓度，重建的配制剂可皮下施用于本文中待治疗的哺乳动物。

还涵盖拮抗剂的结晶形式。参见例如US 2002/0136719A1(Shenoy et al.)。

本文中的配制剂还可含有超过一种活性化合物（上文提到的第二治疗药物），优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。此类治疗药物的类型和有效量取决于例如配制剂中存在的VEGF拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。优选的此类第二治疗药物如上所述。

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊）、在胶状药物投递***中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington′sPharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有所述拮抗剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)）、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTJ^TM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体）及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。

VI.试剂盒

为了用于检测淋巴功能，本发明提供了试剂盒或制品。此类试剂盒可用于确定患有癌症的受试者是否会对抗癌剂产生有效响应。这些试剂盒可包括载体手段，其隔室化以接纳紧密排列的一个或多个容器，诸如管形瓶、管等，每个容器装有本发明方法中要使用的不同成分之一。例如，所述容器之一可以装有成像剂。

此类试剂盒通常会包括上文所述容器和一个或多个其它容器，其中装有从商业和使用者观点看有需要的材料，包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用说明的包装插页。容器上可存在标签，以指示该组合物用于具体的应用，而且还可指示体内或体外使用的说明，诸如上文所描述的那些。

本发明的试剂盒有许多实施方案。一个典型的实施方案是一种试剂盒，包括容器、所述容器上的标签、和装在所述容器内的组合物，其中所述组合物包括成像剂，而且所述容器上的标签指示该组合物可用于检测淋巴搏动频率，且其中所述试剂盒包括说明书，其关于使用该成像剂来检测淋巴搏动频率。所述试剂盒可进一步包括一套用于制备并施用成像剂的说明书和材料。

试剂盒中的其它任选成分包括一种或多种缓冲液（例如稀释缓冲液等）、其它试剂（诸如载体，例如、葡聚糖/右旋糖酐、清蛋白）。试剂盒还可包括用于解释使用该试剂盒获得的结果的说明。

实施例

提供下述实施例以例示但非限制当前要求保护的发明。

实施例1：材料和方法

动物：

使用6-8周龄的来自Charles River Laboratory的雌性Balb-c裸小鼠。为了建立基线搏动频率和***加载率，我们对非荷瘤小鼠成像。在一些情况中，纵向对小鼠搏动成像，即在7天时段里对同一小鼠每天成像。贯穿整个实验，小鼠用2%异氟烷麻醉并维持于37°C。在运行搏动测定法之前，将PulseOx探针附着于腿（与注射部位相对）以监测心率。

成像剂：

对于所有实验，荧光染料注射用5mg偶联有葡聚糖70kd的AlexaFluor680(MolecularProbes)在1ml无菌PBS中实施。

淋巴搏动频率测定法：

使用带281/2号针头的3/10cc注射器(Beckton Dickinson)投递染料。在直肠侧面5mm，在尾基部附近皮内注射15μl推注染料。注射部位略微突起，然后染料在5分钟内明显地引流通过通向腹股沟***的***。

使用配备有Cy5.5红色滤光片组(Chroma)、卤素光源(ExFo Excite Series120)、4倍物镜(Olympus)和电荷耦合装置(CCD)照相机(S97827,Olympus)的落射荧光显微镜(Prairie Technologies)观察落射荧光显微术搏动流活性。染料注射后立即将小鼠转移至物镜下面的加热平台。将动物放置成侧躺，暴露腹股沟至轴***的装有染料的***。将沿着管的约5mm剖面鉴定为感兴趣区域，用于对搏动淋巴流（即淋巴搏动频率）成像。然后给此剖面轻轻覆盖可摆姿势的玻璃载玻片以提供平坦表面及降低呼吸伪像。在视频捕捉之前对搏动和心率监测(PulseOx)稳定性10分钟。为了麻醉使载物台垂直，并调节温度将动物温度维持于37°C。

用PictureFrame软件(Optronics)使用时间推移设置（282ms暴露，无帧间延迟，5分钟总获取时间）获取搏动的数字视频（5分钟）。离线分析来自所记录的时间推移视频的数据。

大量淋巴转运测定法：

通过连接在直肠侧面5mm，尾基部附近的皮内注射部位处植入的导管的输注泵投递染料。准备导管，即自3/10cc,281/2号(BD)切掉针头尖端并放置入装载有75μl染料的Micro-Renathane(Braintree Scientific)管道。

使用Kodak 4000FX Pro NIRF成像***来观察到达腹股沟***的大量淋巴转运的全动物近红外荧光(NIRF)成像。植入导管后，将小鼠转移至Kodak成像平台，并将导管在外面连接输注泵。

将小鼠以它们的侧面放置在成像表面上，以在视野(FOV)中捕捉腹股沟***和通向轴***的管。

使用Kodak成像软件捕捉注射部位指腹股沟***，然后是轴***的转运。时间推移设置设定为：2秒暴露，15秒间隔，21.5mm FOV，ex650nm/em700nm，30min总获取时间）。在输注泵启动(5μL/min)的同一时间进行转运记录。离心分析来自所记录的时间推移图像的数据。

图像分析/定量：

使用MatLab中的定制路径将在Kodak***上收集的图像转变成tiff格式。对于搏动频率和大量淋巴转运测量二者，使用NIH ImageJ软件进行分析。

为了确定搏动频率，在管剖面上取出清楚显示通过视野的淋巴运动的感兴趣区域(ROI)。使用TimeSeriesAnalyzer（通过NIH ImageJ可得的插件）在整个栈上测量随着淋巴流入/出通过ROI时的强度变化。在Excel中随时间输出生成的平均强度值并绘图。通过对5分钟成像序列里存在的峰数目计数来对所得搏动踪迹定量。

为了确定染料的大量加载率，在腹股沟***上直接取出ROI。使用TimeSeriesAnalyzer（通过NIH ImageJ可得的插件）在整个图像栈上测量随着淋巴加载结时的强度变化。在Excel中随时间输出生成的平均强度值并绘图。自平均强度值计算距峰的时间、最大加载率和dF/F。

实施例2：测量淋巴功能来监测抗癌剂的功效

此实施例演示通过测量淋巴功能（例如淋巴搏动频率和大量淋巴转运）来监测抗癌剂（例如抗VEGF-C或抗NRP2）的功效。

雌性Balb-c裸小鼠随机分入如下处理组。

1)对照-无肿瘤

2)对照-肿瘤

3)抗VEGFC 40mg/kg,IP，100μl,1x/周

4)抗VEGF 10mg/kg IP，100μl,1x/周

5)抗NRP240mg/kg,IP，100μl,1x/周

将C6大鼠成胶质细胞瘤细胞（5.0x10⁵个细胞，在200μL PBS中）皮下植入小鼠的尾基部、小鼠右耳、或高出尾基部注射部位大约20mm的背中部。植入后，小鼠不处理，或者用抗VEGF-C(10mg/kg)、抗VEGF-A(10mg/g)、或抗Nrp2(10mg/kg)i.p.处理，一周一次，持续3周。在成像前分选小鼠以给出接近相同的肿瘤大小均值，并在植入后第7天、第14天、和/或第21天成像。如上文实施例1所述对小鼠成像，并将数据图示于图3、4、5、6、和7。

图3图示来自小鼠中淋巴功能测定法的结果，证明肿瘤相关淋巴网络中的大量淋巴转运上调。图3A图示数据，证明在肿瘤植入小鼠中淋巴搏动频率上调约%50，n=6只动物/组。图3B图示数据，证明在肿瘤植入小鼠中大量淋巴转运也上调，n=4只动物/组。图3C图示数据，证明肿瘤植入小鼠中淋巴搏动上调的时间过程，n=12只动物/组。21天后由于肿瘤大小而处死小鼠。

图4图示数据，证明抑制VEGF-C信号传导降低肿瘤相关网络中的淋巴转运。图4A图示数据，证明在荷瘤小鼠中抗NRP2、抗VEGF-C、或抗VEGF-A慢性处理显著降低淋巴搏动频率，n=6只动物/组。图4B图示数据，证明在荷瘤小鼠中抗NRP2、抗VEGF-C、或抗VEGF-A慢性处理显著降低大量淋巴转运，n=6只动物/组。

图6图示数据，证明抗癌剂急性注射不改变淋巴功能。图6A图示数据，证明在荷瘤小鼠中抗NRP2、抗VEGF-C、或抗VEGF-A急性注射不导致淋巴搏动频率的任何显著变化，n=6只动物/组。图6B图示数据，证明在非荷瘤小鼠中重组VEGF-C蛋白或重组VEGF-A蛋白急性注射不导致淋巴搏动频率的任何显著变化，n=6只动物/组。

图7图示数据，证明淋巴搏动频率上调的特异性。数据证明淋巴搏动频率在尾和背荷瘤小鼠二者中上调，但是在耳荷瘤小鼠中不上调。

实施例3：测量淋巴搏动来确定剂量

此实施例描述测量淋巴搏动来在临床前确定治疗剂（例如抗癌剂）的剂量，包括例如最小有效剂量(MiED)或最大有效剂量(MxED)。将荷瘤小鼠用安慰剂和潜在治疗剂以较宽的剂量范围（例如1mg/kg至200mg/g–1、5、10、20、40、80、150、200mg/kg）处理3周。将成像剂施用于小鼠，使得该药剂到达与肿瘤引流淋巴有关的***。测量搏动频率。搏动频率与安慰剂处理组中的搏动频率相比有统计学显著变化的最低剂量定义为MiED。搏动频率与安慰剂处理组中的搏动频率相比有最大变化的最低剂量（即进一步提高不会提供更多搏动频率变化的剂量）定义为MxED。

使用本领域已知方法，包括例如Bagri et al.,Clin Cancer Res.16(15):3887-900(2010)中记载的方法，在MiED和MxED处对潜在治疗剂实施药动学分析，以确定这两种剂量处由曲线下面积(AUC)、C_最大和C_谷定义的暴露。在MiED处确定的暴露为最小暴露，而在MxED处确定的暴露为目标暴露。

在接受治疗剂的患者中进行临床研究期间，如本文所述测量淋巴搏动率。在初始施用治疗剂之前及在每剂治疗剂之后的合适时间（例如1、2、3、或更多天或周）进行测量。确定搏动率均值和搏动率变化均值。“处理时和后”搏动频率与同一患者中的处理前频率相比有统计学显著变化的最低剂量定义为MiED。“处理时和后”搏动频率与处理前搏动频率相比有最大变化的最低剂量（即进一步提高不会提供更多搏动频率变化的剂量）定义为MxED。

另外，对药剂实施药动学分析，并测定每个剂量组的平均AUC、C_最大和C_谷。会评价与临床前实验中确定的最小和目标暴露相当的暴露处搏动率的变化均值以验证临床前分析。

虽然为了清楚理解的目的已经经由例示和实施例较为详细地描述了前述发明，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过述及明确完整收录本文中引用的所有专利、专利申请、科学参考文献、和Genbank登录号的公开内容用于所有目的，就像通过述及具体和个别收录每一篇专利、专利申请、科学参考文献、和Genbank登录号。

Claims

1.一种鉴定有可能响应抗癌剂的患者的方法，该方法包括：

(a)将成像剂施用于已经接受至少一剂抗癌剂的患者；

(b)检测该患者中与肿瘤引流***有关的***中的淋巴搏动频率；并

(c)将该淋巴搏动频率与该抗癌剂处理前该***中的搏动频率比较，其中***中的淋巴搏动频率降低至少约10%鉴定出响应抗癌剂的可能性升高的患者。

2.权利要求1的方法，其中该***连接腹股沟***至轴***。

3.权利要求1的方法，其中该成像剂包含荧光染料。

4.权利要求3的方法，其中该荧光染料为Alexafluor680。

5.权利要求3的方法，其中使用荧光显微术来检测淋巴搏动频率。

6.权利要求1的方法，其中该患者为人类。

7.权利要求1的方法，其中该患者已经诊断有选自下组的癌症：结肠直肠癌，乳腺癌，肺癌，成胶质细胞瘤，肾癌，及其组合。

8.权利要求1的方法，进一步包括：

(d)如果检测到该***中的淋巴搏动频率降低至少约10%的话，将有效量的抗癌剂施用于该患者。

9.权利要求8的方法，其中该抗癌剂是选自下组的成员：NRP2拮抗剂，VEGF-C拮抗剂，及其组合。

10.权利要求9的方法，其中该NRP2拮抗剂为抗NRP2抗体。

11.权利要求9的方法，其中该VEGF-C拮抗剂为抗VEGF-C抗体。

12.权利要求8的方法，进一步包括：

(e)将有效量的第二抗癌剂施用于该患者。

13.权利要求12的方法，其中该第二抗癌剂为VEGF拮抗剂。

14.权利要求13的方法，其中该VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体。

15.权利要求14的方法，其中该抗VEGF抗体为贝伐单抗（bevacizumab）。

16.一种鉴定经历转移的可能性升高的患者的方法，该方法包括：

(a)将成像剂施用于已经接受至少一剂抗癌剂的患者；

(c)将该淋巴搏动频率与该抗癌剂处理前该***中的搏动频率比较，其中***中的淋巴搏动频率升高至少约10%鉴定出经历转移的可能性升高的患者。

17.权利要求16的方法，其中该***连接腹股沟***至轴***。

18.权利要求16的方法，其中该成像剂包含荧光染料。

19.权利要求18的方法，其中该荧光染料为Alexafluor680。

20.权利要求18的方法，其中使用荧光显微术来检测淋巴搏动频率。

21.权利要求16的方法，其中该患者为人类。

22.权利要求16的方法，其中该患者已经诊断有选自下组的癌症：结肠直肠癌，乳腺癌，肺癌，成胶质细胞瘤，肾癌，及其组合。

23.权利要求1的方法，进一步包括：

(d)如果检测到该***中的淋巴搏动频率升高至少约10%的话，将有效量的抗癌剂施用于该患者。

24.权利要求23的方法，其中该抗癌剂是选自下组的成员：NRP2拮抗剂，VEGF-C拮抗剂，及其组合。

25.权利要求24的方法，其中该NRP2拮抗剂为抗NRP2抗体。

26.权利要求24的方法，其中该VEGF-C拮抗剂为抗VEGF-C抗体。

27.权利要求23的方法，进一步包括：

(e)将有效量的第二抗癌剂施用于该患者。

28.权利要求27的方法，其中该第二抗癌剂为VEGF拮抗剂。

29.权利要求28的方法，其中该VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体。

30.权利要求29的方法，其中该抗VEGF抗体为贝伐单抗。

31.一种监测抗癌疗法的有效性的方法，该方法包括：

(a)将成像剂施用于已经接受至少一剂抗癌剂的患者；

(c)将该淋巴搏动频率与该抗癌剂处理前该***中的搏动频率比较，其中***中的淋巴搏动频率降低至少约10%鉴定出有效抗癌剂。

32.权利要求31的方法，其中该***连接腹股沟***至轴***。

33.权利要求31的方法，其中该成像剂包含荧光染料。

34.权利要求33的方法，其中该荧光染料为Alexafluor680。

35.权利要求33的方法，其中使用荧光显微术来检测淋巴搏动频率。

36.权利要求31的方法，其中该患者为人类。

37.权利要求31的方法，其中该患者已经诊断有选自下组的癌症：结肠直肠癌，乳腺癌，肺癌，成胶质细胞瘤，肾癌，及其组合。

38.权利要求31的方法，进一步包括：

39.权利要求38的方法，其中该抗癌剂是选自下组的成员：NRP2拮抗剂，VEGF-C拮抗剂，及其组合。

40.权利要求39的方法，其中该NRP2拮抗剂为抗NRP2抗体。

41.权利要求39的方法，其中该VEGF-C拮抗剂为抗VEGF-C抗体。

42.权利要求38的方法，进一步包括：

(e)将有效量的第二抗癌剂施用于该患者。

43.权利要求42的方法，其中该第二抗癌剂为VEGF拮抗剂。

44.权利要求43的方法，其中该VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体。

45.权利要求44的方法，其中该抗VEGF抗体为贝伐单抗。

46.一种优化抗癌剂剂量的方法，该方法包括：

(a)将成像剂施用于已经接受至少一剂抗癌剂的患者；

(c)将该淋巴搏动频率与该抗癌剂处理前该***中的搏动频率比较，其中***中的淋巴搏动频率有变化鉴定出该剂量为有效剂量。

47.权利要求46的方法，其中该抗癌剂是选自下组的成员：NRP2拮抗剂，VEGF-C拮抗剂，及其组合。

48.一种优化抗癌剂剂量的方法，该方法包括：

(a)将成像剂施用于已经接受至少一剂抗癌剂的患者；

(c)将该淋巴搏动频率与该抗癌剂处理前该***中的搏动频率比较，其中淋巴搏动频率无变化鉴定出该剂量为最大有效剂量。

49.权利要求48的方法，其中该抗癌剂是选自下组的成员：NRP2拮抗剂，VEGF-C拮抗剂，及其组合。