NO326523B1

NO326523B1 - CD19xCD3-spesifikke polypeptid, vektor, celle, sammensetning, fremgangsmate for fremstilling samt anvendelse av nevnte polypeptid eller et polynukleotid som koder for nevnte polypeptid.

Info

Publication number: NO326523B1
Application number: NO20005296A
Authority: NO
Inventors: Peter Kufer; Bernd Dorken; Gert Riethmueller; Ralf Lutterbuese; Ralf Bargou; Anja Loffler
Original assignee: Micromet Ag
Priority date: 1998-04-21
Filing date: 2000-10-20
Publication date: 2008-12-22
Also published as: CN1299410A; SK15792000A3; US7112324B1; PL199747B1; ATE244758T1; CN1302103C; EP1071752A1; PL344016A1; BRPI9909860B8; TR200003087T2; AU761587B2; HUP0102535A3; CZ20003889A3; AU4135299A; BR9909860A; HU229039B1; CA2326389C; HRP20000714B1; DE69909459T2; RU2228202C2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye, enkeltkjedede, multifunksjonelle polypeptider som omfatter minst to bindingsseter som er spesifikke for hhv. CD19- og CD3-antigenene. Foreliggende oppfinnelse vedrører dessuten polynukleotider som koder for disse polypeptider, så vel som vektorer som omfatter disse polynukleotidene, og vertsceller som er transformert med disse og deres anvendelser ved fremstillingen av polypeptidene. Foreliggende oppfinnelse vedrører dessuten preparater, fortrinnsvis farmasøytiske og diagnostiske preparater, som omfatter hvilke som helst av de ovennevnte angitte polypeptidene, polynukleotidene eller vektorene. Et ytterligere mål med foreliggende oppfinnelse er anvendelsen av de ovennevnte polypeptidene, polynukleotidene og vektorene for fremstilling av farmasøytiske preprater for immunoterapi, fortrinnsvis B-celle-maligniteter, slik som ikke-Hodgkin-lymfom.

Til tross for den medisinske betydning har forskning i B-celle-medierte sykdommer, slik som ikke-Hodgkin-lymfom, bare frembrakt et lite antall klinisk nyttige data og vanlige fremgangsmåter for å helbrede slike sykdommer er fortsatt arbeidskrevende ube-hagelige og/eller har en høy risiko for tilbakefall. Selv om høydosekjemoterapi som en primær behandling for sterk grad av ikke-Hodgkin-lymfom, f.eks. kan forbedre total overlevelse, dør fortsatt 50 % av pasientene av denne sykdommen (2-4). Langsomt-voksende ikke-Hodgkin-lymfom-lignende, kronisk, lymfatisk leukemi og mantelcelle-lymfom er fortsatt uhelbredelige. Dette har stimulert til leting etter alternative strategier, slik som immunoterapi. Antistoffer rettet mot celleoverflatemolekyler kjennetegnet ved antigener, representerer en unik mulighet for utviklingen av terapeutiske reagenser. Eks-presjonen av visse CD-antigener er sterkt begrenset til spesifikke lymfohematopoetiske cellelinjer og i løpet av de siste årene har antistoffer rettet mot lymfoid-spesifikke antigener, blitt anvendt for å utvikle behandlinger som var virksomme i enten in vitro eller i dyremodeller (5-13). I dette henseende har CD19 vist seg å være et meget nyttig mål. CD 19 blir uttrykt i hele B-linjen fra pro-B-cellen til den modne B-cellen, den blir ikke avgitt, og er jevnt uttrykt hos alle lymfomceller og er ikke til stede hos stamceller (8, 14). En interessant modalitet er anvendelsen av et bispesifikt antistoff med én spesifisitet for CD 19 og den andre for CD3-antigenet på T-celler. Bispesifikke antistoffer som er tilgjengelig inntil nå, har imidlertid lav T-cellesytotoksisitet og behov for kostimulerende midler for å utøve tilstrekkelig biologisk aktivitet.

I Cancer Immunol Immunother,1997, vol. 45(3-4), side 162-165 er biotilgjengeligheten av et enkeltkjedet konstrukt, som har spesifisitet for CD3 og membran bundet IgM, beskrevet. Et bispesifikt antistoff som gjenkjenner mus-CD19 og mus-CD3 er også nevnt i denne publikasjonen.

DE19531348 vedrører antistoff med to eller flere antigen spesifisiteten De antistoffene som nevnes er kjennetegnet ved at de gjenkjenner to eller flere forskjellige antigener på en kreft celle, men ingen cytotoksisitet er tilveiebrakt.

Fra Int. Jour. Of Cancer, 1998, vol. 77(5), side 763-772 er det kjent et rekombinant bispesifikt enkeltkjedet CD19xCD3 antistoff som induserer B-celle lymfoma rettet cytotoksisitet.

Det tekniske problem som ligger til grunn for foreliggende oppfinnelse var således å tilveiebringe midler som er nyttige for behandlingen av B-celle-medierte sykdommer, slik som forskjellige former av ikke-Hodgkin-lymfom. Løsningen på dette tekniske problem er oppnådd ved å tilveiebringe utførelsesformer som er nærmere angitt i kravene.

Foreliggende oppfinnelse vedrører således et enkeltkjedet, multifunksjonelt polypeptid som omfatter: (a) et første domene som omfatter et første bindingssete av en immunoglobulinkjede

eller et antistoff som spesifikt gjenkjenner CD19-antigenet; og

(b) et andre domene som omfatter et bindingssete av en immunoglobulinkjede eller

et antistoff som spesifikt gjenkjenner CD3-antigenet på humane T-celler,

hvori nevnte domener er arrangert i følgende rekkefølge VlCD19-VhCD19-VhCD3-VLCD3.

Betegnelsene "første domene" og "andre domene" ifølge foreliggende oppfinnelse, betyr at et bindingssete er rettet mot pankreas-B-cellemarkøren CD 19, som er jevnt uttrykt på størstedelen av maligne B-celler, det andre bindingssetet er rettet mot CD3-antigenet til humane T-celler.

Betegnelsen "bindingssete" som anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse, betyr et domene som omfatter en tredimensjonal struktur som er i stand til spesifikt å binde seg til epitoplignende, native antistoffer, frie scFv-fragmenter og én av deres tilsvarende im-munoglobulinkjeder, fortrinnsvis Vn-kjeden. Domenet kan således omfatte Vh- og/eller VL-domenet av et antistoff eller en immunoglobulinkjede, fortrinnsvis minst Vn-domenet. På den annen side kan bindingssetene som finnes i polypeptidet ifølge oppfinnelsen, omfatte minst ett komplementærbestemmende område (CDR) av et antistoff eller immunoglobulinkjede som gjenkjenner hhv. CD 19- og CD3-antigenene. Med hensyn til dette skal det bemerkes at domenene til bindingsstedene som er til stede i polypeptidet ifølge oppfinnelsen, kan ikke bare bli fremstilt ved antistoffer, men også fra andre CD 19- eller CD3-bindingsproteiner, slik som naturlig forekommende overflatereseptor-er eller ligander. Ifølge oppfinnelsen regnes bindingsstedet som del av et domene.

Betegnelsen "multifunksjonelt polypeptid" som anvendt her, betyr et polypeptid som omfatter minst to aminosyresekvenser fremstilt fra forskjellige opprinnelser, dvs. fra to forskjellige molekyler, eventuelt fremstilt fra forskjellige grupper hvor minst to av opp-rinnelsene angir bindingssetene. Disse bindingssetene angår følgelig funksjonene eller minst noen funksjoner til det multifunksjonelle peptid. Slike peptider inkluderer f.eks. bispesifikke, enkeltkjedede (bsc) antistoffer.

Betegnelsen "enkeltkjede" som anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse, betyr at det første og det andre domenet av polypeptidet er kovalent bundet, fortrinnsvis i form av en ko-lineær aminosyresekvens som kan kodes av et nukleinsyremolekyl. CD 19 betyr et antigen som blir uttrykt i B-linjen slik som i pro-B-cellen og den modne B-cellen, den blir ikke avgitt, er jevnt uttrykt på alle lymfomceller og finnes ikke i stamceller (8,14).

CD3 betyr et antigen som blir uttrykt på T-celler som del av det multimolekylære T-cellereseptorkomplekset og som består av tre forskjellige kjeder CD3e, CD38 og CD3y. Clusterdannelse av CD3 på T-celler, f.eks. ved immobiliserte anti-CD3-antistoffer, fører til T-celleaktivering som ligner på anvendelsen av T-cellereseptoren, men uavhengig av dens klonetypiske spesifisitet. De fleste anti-CD3-antistoffer gjenkjenner til og med

CD3s-kjeden.

Antistoffer som spesifikt gjenkjenner CD19- eller CD3-antigen, er tidligere omtalt i litteraturen, f.eks. hhv. i (24), (25) og (43), og kan bli fremstilt etter vanlige kjente metoder.

Bispesifikke cD19xCD3 -antistoffer som ikke er anordnet på enkeltkjedeformat, som igjen målsøker T-celle-cytotoksisitet på lymfomceller på en MHC-uavhengig måte, er allerede vist å være effektive in vitro (5, 6, 9-11,13,43), i dyremodeller (7, 28), så vel som i noen kliniske forsøk i halvteknisk skala (12, 29, 30). Inntil nå ble disse antistoffene bygget opp ved hjelp av hybrid-hybridoma-teknikker, ved kovalent binding av de monoklonale antistoffene (31) eller ved "diabody"-tilnærming (43). Mer omfattende kliniske undersøkelser er vanskeliggjort av at disse antistoffene har lav biologisk aktivitet, slik at det må anvendes høye doseringer og at anvendelsen av antistoffer alene ikke gir en gunstig, terapeutisk effekt. Tilgjengeligheten av materialet av klinisk kvalitet er dessuten begrenset.

Uten å være bundet til noen spesiell teori blir det antatt at å anvende det bispesifikke antistofflignende formatet som angitt ovenfor, og således fremstilte polypeptider, slik som bispesifikke CD 19xCD3-antistoffer, er vanligvis i stand til å ødelegge CD 19-positive målceller med tilgang til cytotoksiske T-lymfocytter uten at man har noe behov for T-celle-pre- og/eller ko-stimulering. Dette er i sterk motsetning til alle kjente bispesifikke CD 19xCD3-antistoffer fremstilt ved andre molekylformater og er vanligvis ikke avhengig av de spesielle CD 19- eller CD3-antistoffspesifisitetene anvendt for å bygge opp, f.eks. det bispesifikke, enkeltkjedede antistoffene. Uavhengigheten av T-celle-pre- og/eller ko-stimulering kan bidra vesentlig til den eksepsjonelt høye cytotok-sitet mediert av polypeptidet ifølge oppfinnelsen, som illustrert av de spesielle CD 19cCD3-bispesifikke antistoffer angitt i eksempelene..

En annen ytterligere fordelaktig egenskap av polypeptidet ifølge oppfinnelsen er at det pga. sin lille, relativt kompakte struktur, er lett å fremstille og å rense, og derved omgå problemene med lave utbytter, forekomsten av dårlig definerte biprodukter eller arbeidskrevende rensingsmetoder (15-19) rapportert for CD 19xCD3-spesifikke antistoffer som hittil er fremstilt fra hybrid-hybridomaer ved kjemisk binding eller ved denaturer-ing fra bakterielle inklusjonslegemer. I det følgende vil de fordelaktige og uventede egenskapene til polypeptidet ifølge oppfinnelsen bli omtalt ved hjelp av eksemplene, som inkluderer noen av de foretrukne utførelsesformene ifølge oppfinnelsen som er kort omtalt nedenfor, som vil belyse det brede konsept ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ifølge foreliggende oppfinnelse ble det anvendt et eukaryotisk ekspresjonssystem som var blitt utviklet for fremstilling av rekombinante, bispesifikke, enkeltkjedede antistoffer (1) for å fremstille et rekombinant, bispesifikt, CD 19xCD3-enkeltkjedet antistoff ved ekspresjon i CHO-celler. Det fullstendig funksjonelle antistoff ble lett renset fra overlegne kulturer ved hjelp av dets C-terminale histidin-merke i en Ni-NTA-kromato-grafikolonne. Spesifikk binding til CD 19 og CD3 ble vist ved hjelp av FACS-analyse. Det resulterende bscCD19xCD3(bispesifikke, enkeltkjedede CD19xCD3)-molekylet ifølge oppfinnelsen viste noen uventede egenskaper: Det fremkalte sterk lymfomrettet T-cellesytotoksisitet in vitro og in vivo. Selv ved meget lave konsentrasjoner på 10-100 pg/ml og lav E (effektor):T(mål)-forhold på 5:1 og 2,5:1, ble det observert signifikant, spesifikk lysis av lymfom-cellelinjer. 3 ug til 10 ug av bscCD19xCD3-molekylet ifølge oppfinnelsen, viste ved bruk i praksis, klar og vesentlig forbedring i medisinsk status. Sammenlignet med det inntil nå publiserte CD 19xCD3-antistoffet fremstilt ved hybrid-hybridoma-teknikker eller ved "diabody"-tilnærminger (som også er et forskjellig format) som viser cytotoksisk aktivitet i området på flere nanogram/ml eller til og med ug/ml, synes bscCD19xCD3-antistoffet ifølge oppfinnelsen å være meget virksommere (5-7,27,43) som f.eks. dokumentert i eksempler 4, 5 og 7.

Selv lave konsentrasjoner av bscCD19xCD3 ifølge oppfinnelsen var i stand til å

fremkalle hurtig lymfomrettet cytotoksisitet (etter 4 h) ved lav E:T-forhold uten behov for noen T-celle-prestimulering. Et vanlig CD19xCD3-bispesifikt antistoff (5-7,27) viste i motsetning til dette ingen vesentlig cytotoksisk aktivitet under disse betingelser (nemlig ingen T-celle-prestimulering, lavt E:T-forhold) selv ved høye konsentrasjoner opp til 3 000 ng/ml. Skjønt induksjon av cytotoksisk aktivitet uten prestimulering er blitt rapportert i tilfellet av et annet kon-vensjonelt CD19xCD3-antistoff, ble denne virkning oppnådd bare ved høye konsentrasjoner og høye E:T-forhold (100 ng/ml, 27:1) (9) sammenlignet med bscCD19xCD3 ifølge oppfinnelsen (100 pg/ml, 2,5:1). En cytotoksisk virkning av dette vanlige antistoff ble dessuten observert bare etter 1 dags prestimulering med selve det bispesifikke antistoff, mens bscCD19xCD3 ifølge oppfinnelsen fremkalte lymfomrettet cytotoksisitet allerede etter 41. Så vidt oppfinnerne har kjennskap til, har en slik hurtig og spesifikk, cytotoksisk aktivitet av ikke stimulerte T-celler, slike lave konsentrasjoner og E:T-forhold, ikke blitt beskrevet for andre bispesifikke antistoffer som er blitt anvendt inntil nå. Skjønt nylig er det blitt vist at et anti-pl85HER2/anti-CD3-bispesifikt F(ab)2-antistoff fremkaller cytotoksisk aktivitet ved lignende konsentrasjoner som bscCD19xCD3 ifølge oppfinnelsen, trenger dette antistoffet 24 timers prestimulering med IL-2 (32). bscCD19xCD3-antistoffet ifølge oppfinnelsen, viser unike, cytotoksiske egenskaper som atskiller dette molekyl fra andre bispesifikke antistoffer som er blitt beskrevet.

bscCD19xCD3 ifølge oppfinnelsen medierer cytotoksiske virkninger som er antigenspesifikke, som vist ved

at dette antistoffet ikke er i stand til å lyse plasmacytoma-cellelinjene NC1 og L363 som er cellelinjer av B-linjen som ikke uttrykker CD19-antigenet: og

at cytotoksisiteten mot lymfomceller kan bli blokkert ved parental anti-CD 19-antistoff HD37. [HD37-antistoff er fremstilt fra HD37-hybridoma (22)].

Å blokkere perforinreaksjonsrekken ved hjelp av kalsium-deprivasjon med EGTA, blokkerer fullstendig bscCD19xCD3-mediert cytotoksisitet og antyder at den spesifikke lysis er en T-cellemediert virkning heller enn en direkte virkning av selve antistoffet.

Totalt sett er bscCD19xCD3-antistoffet oppbygd ifølge foreliggende oppfinnelse, over-legen i forhold til de inntil nå angitte CD 19xCD3-bispesifikke antistoffer med hensyn til dets betraktelig høyere biologiske aktivitet så vel som muligheten til en hurtig og lett produksjon, og derfor gir tilstrekkelig mengder av klinisk materiale av høy kvalitet.

bscCD19xCD3-molekylene ifølge oppfinnelsen er derfor forventet å være en egnet kandidat til å vise den terapeutiske fordelen ved bispesifikke antistoffer ved behandlingen av B-celle-medierte sykdommer, slik som ikke-Hodgkin-lymfom i kliniske forsøk.

Ved en foretrukket utførelsesform av polypeptidet ifølge oppfinnelsen er domenene bundet av en polypeptidlinker. Denne linkeren er plassert mellom det første og det andre domene, hvor polypeptidlinkeren fortrinnsvis omfatter flere hydrofile, peptidbundne aminosyrer og knytter sammen den N-terminale enden av det første domene og den C-terminale enden av det andre domene.

Ved en ytterligere foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen etterligner eller tilsvarer det første og/eller andre domenet av det ovenfor angitte polypeptid et Vh- og Vl-oiii-råde fra et naturlig antistoff. Antistoffet som gir bindingssteder for polypeptidet ifølge oppfinnelsen, kan være f.eks. et monoklonalt antistoff, polyklonalt antistoff, kimært antistoff, humanisert antistoff, bispesifikt antistoff, syntetisk antistoff, antistoffragment, slik som Fab, Fv eller scFv-fragmenter etc, eller et kjemisk modifisert derivat av hvilke som helst av disse. Monoklonale antistoffer kan bli fremstilt f.eks. ved teknikken som opprinnelig er beskrevet i Kohler og Milstein, Nature 256 (1975), 495, og Galfré, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, som omfatter fusjonen av muse-myelomaceller til miltceller fremstilt fra immuniserte pattedyr med fagmessig utviklede modifikasjoner. Antistoffer eller fragmenter av disse til de ovenfor nevnte antigenene kan oppnås ved å anvendes fremgangsmåter som er angitt, f.eks. i Harlow og Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Antistoffer kan oppnås fra flere arter og omfatter menneske. Når derivater av disse antistoffene ble oppnådd ved fag-display-teknikk, kan det anvendes overflateplasmonresonans som anvendt i BIAcore-systemet for å øke effektiviteten av fagantistoffer som binder sg til en epitop av CD 19- eller CD3-antigenet (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Fremstillingen av kimære antistoffer er angitt f.eks. i WO 89/09622. Fremgangsmåter for fremstilling av humaniserte antistoffer er beskrevet i f.eks. EP-A1 0 239 400 og WO 90/07861. En ytterligere kilde til antistoffer som kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse, er såkalte xenogene antistoffer. Det generelle prinsipp for fremstilling av xenogene antistoffer, slik som humane antistoffer hos mus, er angitt i f.eks. WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 og WO 96/33735.

Antistoffer som skal anvendes ifølge oppfinnelsen eller deres tilsvarende immunoglobulinkjede(er), kan bli ytterligere modifisert ved å anvende konvensjonelle, kjente teknikker, ved å anvende aminosyredelesjon(er), insertion(er), substitusjon(er), addisjon(er) og/eller rekombinasjon(er) og/eller hvilke som helst annen kjent modifikasjon(er) enten alene eller i kombinasjon. Fremgangsmåte for å innføre slike modifikasjoner i DNA-sekvensen som danner basis for aminosyresekvensen av en immunoglobulinkjede, er kjent, se f.eks. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), N.Y. Den omtalte modifikasjonen blir fortrinnsvis utført ved nukleinsyrenivået.

Ved en ytterligere foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen, er minst ett av domenene i det ovenfor angitte polypeptid et enkeltkjedet fragment i det variable området av antistoffet.

Som er godt kjent, består Fv, minste antistoffragment som inneholder et fullstendig anti-gengjenkjennelses- og bindingssete, av en dimer av ett tungt og ett lett kjede-variabelt domene (VH og VL) i ikke-kovalent binding. I denne konfigurasjon som tilsvarer den ene funnet i native antistoffer, påvirker de tre komplementærbestemmende områdene (CDRer) av hvert variabelt domene for å angi et antigenbindingssete på overflaten av VH-VL-dimeren. Samlet gir de seks CDR-ene antigen bindingsspesifisitet til antistoffet. Strukturer "Frameworks" (FRs), som flankerer CDR-ene, har en tertiær struktur som er vesentlig bevart i native immunoglobuliner av arter så forskjellig som menneske og mus. Disse FRene tjener til å holde CDRene i sin hensiktsmessige orientering. De kon-stante domenene er ikke nødvendige for bindingsfunksjonen, men kan hjelpe til i å sta-bilisere VH-VL-interaksjon. Selv et enkelt variabel domene (eller halvparten av en Fv som omfatter bare tre CDRer spesifikke for et antigen) har evnen til å gjenkjenne og binde antigen, skjønt vanligvis ved en lavere affinitet enn et helt bindingssete (Painter, Biochem. 11 (1972), 1327-1337). Det er imidlertid viktig at VH- og VL-domenene er plassert slik at antigenbindingssetet kan folde seg sammen riktig.

I polypeptidene ifølge oppfinnelsen er domenene plassert i rekkefølgen VlCD19-VHCD19-VHCD3-VLCD3, hvor "VL" og "VH" betyr den lette og tunge kjeden av det variable domenet av spesifikke anti-CD19- og anti-CD3-antistoffer.

Som redegjort for ovenfor er bindingssetene fortrinnsvis bundet av en fleksibel linker, fortrinnsvis er en polypeptidlinker plassert mellom domenene, hvor polypeptidlinkeren omfatter flere hydrofile, peptidbundne aminosyrer av en tilstrekkelig lengde for å spenne over avstanden mellom den C-terminale enden av ett av domenene som omfatter bindingssetene, og den N-terminale enden av det andre av domenene som omfatter bindingssetene når polypeptidet ifølge oppfinnelsen antar en konformasjon som er egnet for binding når de blir plassert i vandig løsning. Polypeptidlinkeren omfatter fortrinnsvis en rekke av glysin-, alanin- og/eller serinrester. Det er ytterligere foretrukket at polypeptidlinkeren omfatter en rekke påfølgende kopier av en aminosyresekvens. Polypeptidlinkeren omfatter vanligvis 1 til 15 aminosyrer skjønt polypeptidlinkere på mer enn 15 aminosyrer kan fungere likeså godt. Ved en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter polypeptidlinkeren 1 til 5 aminosyrerester.

Ved en spesielt foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter polypeptidlinkeren i polypeptidet ifølge oppfinnelsen, 5 aminosyrer. Som vist i eksemplene omfatter polypeptidlinkeren fordelaktig aminosyresekvensen Gly Gly Gly Gly Ser.

Ved en ytterligere spesielt foretrukket utførelsesform omfatter det første domenet av polypeptidet ifølge oppfinnelsen, minst ett CDR av Vh- og VL-regionen som omfatter aminosyresekvensen innkodet av DNA-sekvensen vist i figur 8 fra nukleotider 82 til 414 (Vl) og nukleotider 460 til 831 (Vh) og/eller det andre domene omfatter minst ett CDR, mer foretrukket to, mest foretrukket tre CDRer av Vh- og VL-regionen som omfatter aminosyresekvensen innkodet av DNA-sekvensen vist i figur 8 fra nukleotider

847 til 1203 (VH) og nukleotider 1258 til 1575 (VL), eventuelt i kombinasjon med struktur("framework")-områder som forekommer sammen med CDRene i parentale antistoffer. CDRene som finnes i de variable områdene vist i figur 8, kan bli bestemt f.eks. etter Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (U.S. Department of Health and Human Services, third edition, 1983; fourth edition, 1987; fifth edition, 1990). Man vil lett forstå at bindingssetet eller minst ett CDR avledet fra dette, kan anvendes for å

bygge opp et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Polypeptidet omfatter fortrinnsvis aminosyresekvensen innkodet av DNA-sekvensen som vist i figur 8, fra nukleotider 82 til 1575. Man vil lett forstå at bindingsseter av polypeptidet ifølge oppfinnelsen kan byg-ges opp etter kjente metoder, f.eks. som angitt i EP-A1 0 451 216 og EP-A1 0 549 581.

Bindingssetedomenene i polypeptidet ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis en spesifisitet som i alt vesentlig er minst identisk til bindingsspesifisiteten av f.eks. antistoffet eller immunoglobulinkjeden som de er avledet fra. Slike bindingssetedomener kan ha en bin-dingsaffinitet på minst 10<5>M"', fortrinnsvis ikke høyere enn 10<7>M"' for CD3-antigenet og fordelaktig opp til 10<10>M"' eller høyere for CD19-antigenet.

Ved en foretrukket utførelsesform av polypeptidet ifølge oppfinnelsen

(a) har bindingssetet av det første domenet en affinitet på minst ca. 10"<7> M, fortrinnsvis minst ca. IO"<9> M og mest foretrukket minst ca. IO'<11>M; og/eller (b) har bindingssetet av det andre domenet en affinitet på minst ca. 10"<7> M, fortrinnsvis mindre enn ca. IO"<6> M og mest foretrukket i størrelsesorden IO"<5> M.

Ifølge de foretrukne utførelsesformene antatt ovenfor, er det fordelaktig dersom bindingssetet som gjenkjenner CD 19-antigenet, har en høy affinitet for meget effektivt å fange målcellene som skal ødelegges. På den annen side bør bindingsaffiniteten av bindingsstedet som gjenkjenner CD3-antigenet, være i størrelsesorden til den naturlige CD3-reseptoren eller den som vanligvis finnes for interaksjonen av T-cellereseptoren med sin ligand, dvs. et MHC-peptidkompleks på målcelleoverflaten. Ved en annen foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen, er polypeptidet som angitt ovenfor, et bispesifikt enkeltkjedet antistoff.

Foreliggende oppfinnelse vedrører dessuten et polypeptid som omfatter minst ett ytterligere domene, og domenene er bundet av kovalente eller ikke-kovalente bindinger. Bindingen kan være basert på genetisk fusjon ifølge fremgangsmåter som er kjent på området og beskrevet ovenfor, eller kan utføres f.eks. ved kjemisk tverrbinding som angitt i f.eks. WO 94/04686. Det ytterligere domenet som finnes i polypeptidet ifølge oppfinnelsen, kan fortrinnsvis være bundet av en fleksibel linker, fordelaktig en polypeptidlinker til ett av bindingssetedomenene hvor polypeptidlinkeren består av flere hydrofile, peptidbundne aminosyrer med en lengde som er tilstrekkelig for å spenne over avstanden mellom den C-terminale enden av ett av domenene og den N-terminale enden av det andre av domenene når polypeptidet antar en konformasjon som er egnet for binding når det fordeles i vandig løsning. Fortrinnsvis er polypeptidlinkeren en polypeptidlinker som angitt i utførelsesformene ovenfor. Polypeptidet ifølge oppfinnelsen kan dessuten omfatte en spaltbar liker eller spaltningssetet for proteinaser, slik som enterokinase; se også eksemplene.

Det ytterligere domenet kan dessuten være av en på forhånd bestemt spesifisitet eller funksjon. Litteraturen inneholder f.eks. et stort antall henvisninger til konseptet mål-rettede, bioaktive substanser, slik som legemidler, toksiner og enzymer, til bestemte punkter i legemet for å ødelegge eller lokalisere maligne celler og for å frembringe et lokalisert legemiddel eller enzymatisk virkning. Det er blitt foreslått å oppnå denne effekt ved å konjugere den bioaktive substansen til monoklonale antistoffer (se f.eks. N. Y. Oxford University Press; og Ghose, J. Nati. Cancer Inst. 61 (1978), 657-676).

I denne forbindelse vil man forstå at polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan ytterligere bli modifisert ved vanlige kjente fremgangsmåter. Dette muliggjør oppbygningen av kimære proteiner som omfatter polypeptidet ifølge oppfinnelsen, og andre funksjonelle aminosyresekvenser, f.eks. nukleære lokaliseringssignaler, transaktiviserende domener, DNA-bindingsdomener, hormonbindingsdomener, proteinmerker (GST, GFP, h-myc-peptid, FLAG, HA-peptid) som kan fremstilles fra heterologe proteiner. Som angitt i eksemplene omfatter polypeptidet ifølge oppfinnelsen et flaggmerke som har lengde på 8 aminosyrer; se figur 8.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan anvendes terapeutisk hos pasienter som lider av B-cellelidelser, slik som B-celle-lymfom, B-celle-rfemkalt, kronisk, lymfatisk leukemi (B-CLL) og/eller som har en B-celle-relatert, autoimmun sykdom, slik som myasthenia gravis, Morbus Basedow, Hashimoto thyreoiditt, eller Goodpastures syndrom. Slik terapi kan oppnås f.eks. ved administrering av polypeptider ifølge oppfinnelsen. Slik administrering kan anvende umerkede så vel som merkede polypeptider.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan f.eks. bli administrert merket med et terapeutisk middel. Disse midlene kan koples enten direkte eller indirekte til antistoffer eller antigener ifølge oppfinnelsen. Ett eksempel på indirekte kopling er ved hjelp av en spacer-gruppe. Disse spacergruppene kan i sin tur være enten uløselige eller løselige (Diener, Science 231 (1986), 148) og kan være valgt for å muliggjøre legemiddelfrigiving fra antigenet ved målsetet. Eksempler på terapeutiske midler som kan kobles til polypeptidet ifølge oppfinnelsen for immunoterapi, er legemidler, radioisotoper, lektiner og toksiner. Legemidler som kan konjugeres til polypeptidene ifølge oppfinnelsen, omfatter forbindelser som tradisjonelt blir betegnet som legemidler, slik som mitomycin C, dauno-rubicin og vinblastin.

Ved å anvende radioisotopisk konjugerte polypeptider ifølge oppfinnelsen for f.eks. immunoterapi, kan visse isotoper være mer foretrukket enn andre, avhengig av slike faktorer som leukocyttfordeling så vel som stabilitet og emisjon. Avhengig av auto-immunresponsen, kan noen emittere være foretrukne fremfor andre, a- og (i-partik-kelemitterende radioisotoper er foretrukne i immunoterapi. Foretrukne er høyenergi a-emittere med kort rekkevidde, slik som <212>Bi. Eksempler på radioisotoper som kan bindes til polypeptidene ifølge oppfinnelsen for terapeutiske formål, er <125>1,<131>1, <90>Y, 67Cu, 212Bi, 212At,21'Pb, 47Sc, ,09Pd og 188Re.

Lecitiner er proteiner, vanligvis isolert fra plantematerialet som binder seg til spesifikke sukkergrupper. Mange lecitiner er også i stand til å agglutinere celler og stimulere lymfocytter. Ricin er imidlertid et toksisk lektin som har blitt anvendt immunoterapeutisk. Dette ble oppnådd ved å binde ct-peptidkjeden av ricin, som var årsaken til toksisitet, til polypeptidet for å muliggjøre setespesifikk administrasjon av den toksiske virkning.

Toksiner er giftige substanser fremstilt av planter, dyr eller mikroorganismer som, i tilstrekkelig dose, ofte er dødelige. Difteritoksin er en substans fremstilt av Corynebacteri-um diphtheria som kan anvendes terapeutisk. Dette toksin består av en a- og (3-sub-enhet som under egnede betingelser kan bli atskilt. Den toksiske A-komponenten kan bindes til et polypeptid ifølge oppfinnelsen og bli anvendt for setespesifikk administrasjon til den gjensidig påvirkende B-celle og T-celle som er brakt i umiddelbar nærhet ved en binding til et polypeptid ifølge oppfinnelsen.

Andre terapeutiske midler, slik som er angitt ovenfor, som kan bli koblet til polypeptidet ifølge oppfinnelsen, så vel som tilsvarende eks vivo og in vivo terapeutiske fremgangsmåter, er kjente, eller kan lett bestemmes av fagmannen. Over alt hvor det er egnet kan fagmannen anvende et polynukleotid ifølge oppfinnelsen som angitt nedenfor, som koder for hvilke som helst av de ovenfor angitte polypeptider eller de tilsvarende vektorer istedenfor selve proteinholdige materialet.

Man vil således lett forstå at polypeptidet ifølge oppfinnelsen kan anvendes for oppbyg-ging av andre polypeptider av ønsket spesifisitet og biologisk funksjon. Polypeptidene ifølge oppfinnelsen er forventet å spille en viktig terapeutisk og vitenskapelig rolle særlig på det medisinske området, f.eks. ved utviklingen av nye behandlingsfremgangsmåt-er for B-celle-relaterte lidelser, slik som visse former av cancer og autoimmune sykdommer eller som interessante verktøy for analysen og moduleringen av de tilsvarende cellulære signaltransduksjonsreaksjonsrekker.

Ved en ytterligere foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter minst ett ytterligere domene et molekyl valgt fra gruppen som består av effektormolekyler som har en konformasjon som er egnet for biologisk aktivitet, aminosyresekvenser som er i stand til å sekvestere et ion og aminosyresekvenser som er i stand til selektivt å binde seg til en fast bærer eller et på forhånd valgt antigen.

Det ytterligere domenet omfatter fortrinnsvis et enzym, toksin, reseptor, bindingssete, biosyntetisk antistoffbindende sete, vekstfaktor, celledifferensieringsfaktor, lymfokin, cytokin, hormon, en fjernet påviselig gruppe, antimetabolitt, et radioaktivt atom eller et antigen. Antigenet kan være f.eks. et tumorantigen, et virusantigen, en mikrobielt antigen, et allergen, et autoantigen, et virus, en mikroorganisme, et polypeptid, et peptid eller et stort antall tumorceller.

Sekvensen som er i stand til å sekvestere et ion, er dessuten fortrinnsvis valgt fra calmo-dulin, metallotionein, et funksjonelt fragment av disse, eller en aminosyresekvens rik på minst én av glutaminsyre, asparaginsyre, lysin og arginin. Polypeptidsekvensen som er i stand til selektivt å binde seg til en fast bærer, kan i tillegg være en positiv eller en nega-tiv ladet aminosyresekvens, en cysteinholdig aminosyresekvens, avidin, streptavidin, et funksjonelt fragment av stafylokokkprotein A, GST, et His-merke, et FLAG-merke eller Lex A. Som angitt i eksemplene er polypeptidet ifølge oppfinnelsen, eksemplifisert ved et enkeltkjedet antistoff, også blitt uttrykt med et N-terminalt FLAG-merke og/eller C-terminalt His-merke, som muliggjør lett rensing og deteksjon. FLAG-merket som er anvendt i eksemplet, omfatter 8 aminosyrer (se figur 8) og blir således fortrinnsvis anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse. FLAG-merker som består av forkortede versjoner av FLAG anvendt i eksemplene, slik som f.eks. aminosyresekvensen Asp-Tyr-Lys-Asp, er også egnet.

Effektormolekylene og aminosyresekvensene som er angitt ovenfor, kan forekomme i en proform som selv er enten aktiv eller ikke, og som kan bli fjernet når de kommer inn i et visst cellulært miljø.

Ved en mest foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er reseptoren et kostimulerende overflatemolekyl viktig for T-celleaktiveringen, eller omfatter et epitop bindingssete eller et hormonbindingssete.

Ved en ytterligere mest foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er det kostimulerende overflatemolekyl CD80 (B7-1) eller CD86 (B7-2).

Ved en ytterligere utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse polynukleotider som ved ekspresjon koder for de ovenfor angitte polypeptidene. Polynukleotidene kan bli fusjonert til egnede, kjente ekspresjonskontrollsekvenser for å være sikker på riktig transkripsjon og translasjon av polypeptidet.

Polynukleotidene kan være f.eks. DNA, cDNA, RNA eller syntetisk fremstilt DNA eller RNA eller et rekombinant fremstilt, kimært nukleinsyremolekyl som omfatter hvilke som helst av disse polynukleotidene enten alene eller i kombinasjon. Fortrinnsvis er polynukleotidet del av en vektor. Slike vektorer kan omfatte ytterligere gener, slik som markørgener som muliggjør seleksjonen av vektoren i en egnet vertscelle og under egnede betingelser. Polynukleotidet ifølge oppfinnelsen blir fortrinnsvis operativt bundet til ekspresjonskontrollsekvenser som muliggjør ekspresjon i prokaryote og eukaryote celler. Ekspresjon av polynukleotidene omfatter transkripsjon av polynukleotidet til en translaterbar mRNA. Regulatoriske elementer som sikrer ekspresjon i eukaryote celler, fortrinnsvis pattedyrceller, er kjente. De omfatter vanligvis reguleringssekvenser som sikrer initieringen av transkripsjon og eventuelt poly-A-signaler som sikrer terminering-en av transkripsjon og stabiliseringen av transkriptet. Ytterligere reguleringselementer kan omfatte transskirpsjonene så vel som translasjonelle enhancere, og/eller naturlig assosierte eller heterologe promoterregioner. Mulige regulatoriske elementer som muliggjør ekspresjon i prokaryote vertsceller, omfatter f.eks. PL-, lac-, trp- eller tac-promoter i E. coli og eksempler på regulatoriske elementer som muliggjør ekspresjon i eukaryote versceller, er AOX1- eller GALI-promoter i gjær eller CMV-, SV40-, RSV-promoter (Rous sarkomavirus), CMV-enhancer, SV40-enhancer eller et globin intron i pattedyr og andre dyreceller. Foruten elementer som forårsaker initieringen av transkripsjon, kan slike regulatoriske elementer også omfatte transkripsjonsterminasjons-signaler, slik som SV40-poly-A-sete eller tk-poly-A-sete, nedstrøms til polynukleotidet. Avhengig av det anvendte ekspresjonssystem kan ledesekvensene som er i stand til å dirigere polypeptidet til en cellulær kompartment eller å utskille de i mediet, dessuten bli tilsatt til kodesekvensen til polynukleotidet ifølge oppfinnelsen og er velkjente på området; se også f.eks. eksemplene. Ledersekvensen (e) blir samlet i egnede faser med translasjons-, initierings- og termineringssekvenser, og fortrinnsvis en ledersekvens som er i stand til å rette sekresjonen av translatert protein, eller en del av det, til det periplas-miske rom eller ekstracellulære medium. Den heterologe sekvensen kan eventuelt kode for et fusjonsprotein som inkluderer et N-terminalt identifiseringspeptid som gir ønskede egenskaper, f.eks. stabilisering eller forenklet rensing av uttrykt, rekombinant pro-dukt; se supra. I denne forbindelse er egnede kjente vektorer Okayama-Berg cDNA-ekspresjonsvektor pcDVl (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (In-vitrogene) eller pSPORTl (GIBCO BRL).

Ekspresjonskontrollsekvensene vil fortrinnsvis være eukaryote promotersystemer i vektorer som er i stand til transformering av transfekterende, eukaryote vertsceller, men det kan også anvendes kontrollsekvenser for prokaryote verter. Straks vektoren er blitt in-korporert i den egnede verten, blir verten holdt under betingelser som er egnet for høy-nivåekspresjonen av nukleotidsekvensene, og om ønsket kan følge oppsamling og rensing av polypeptidet ifølge oppfinnelsen; se f.eks. eksemplene.

Som angitt ovenfor kan polynukleotidet ifølge oppfinnelsen anvendes alene eller som del av en vektor for å uttrykke polypeptidet ifølge oppfinnelsen i celler, f.eks. genterapi eller diagnostikk av sykdommer som vedrører B-celle-lidelser. Polynukleotidene eller vektorene som inneholder DNA-sekvensen(e) som koder for hvilke som helst av de ovenfor angitte polypeptidene, ble innført i cellene som i sin tur fremstiller polypeptidet som er av interesse. Genterapi, som er basert på å innføre terapeutiske gener inn i celler ved hjelp av eks-vivo- eller in-vivo-teknikker, er én av de viktigste anvendelser av gen-overføring. Kjente, egnede vektorer, fremgangsmåter eller gen-administreringssystemer for in-vitro- eller in-vivo-genterapi, er angitt i litteraturen, se f.eks. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sei. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2

(1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859; US 5,589,466; eller

Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640, og henvisninger som er sitert i disse. Polynukleotider og vektorer ifølge oppfinnelsen kan bli utviklet for direkte innføring eller for innføring via liposomer, eller virusvektorer (f.eks. adenovirus, retrovirus) inn i cellen. Cellen er fortrinnsvis en kimlinjecelle, embryonisk celle eller egg-celle eller fremstilt av disse, mest foretrukket er cellen en stamcelle. Et eksempel på en embryonisk stamcelle kan blant annet være en stamcelle som angitt i Nagy, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90 (1993), 8424-8428.

Ifølge det som er angitt ovenfor vedrører foreliggende oppfinnelse vektorer, særlig plasmider, kosmider, viruser og bakteriofager som vanligvis er anvendt i genteknikken som omfatter et polynukleotid som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Vektoren er fortrinnsvis en ekspresjonsvektor og/eller en genoverførings- eller målsøkende vektor. Ekspresjonsvektorer fremstilt fra viruser, slik som retrovirus, vaksiniavirus, adeno-asso-siert virus, herpesvirus eller bovin papillomavirus, kan bli anvendt for administrering av polynukleotidene eller vektoren ifølge oppfinnelsen, inn i målcellepopulasjoner. Fremgangsmåter som er velkjente på området kan anvendes for å bygge opp rekombinant-vektorer: se f.eks. teknikkene beskrevet i Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), N. Y. og Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989). Alternativt kan polynukleotidene og vektorene ifølge oppfinnelsen bli rekonstituert til liposomer for administrering til målceller. Vektorene som inneholder polynukleotidene ifølge oppfinnelsen, kan bli overført til vertscellen etter velkjente metoder som varierer avhengig av den cellulære vertstypen. Kalsiumkloridtransfeksjon blir f.eks. vanligvis anvendt for prokaryote celler, mens kalsiumfosfatbehandling eller elektroporering kan anvendes for andre celleverter; se Sambrook, supra. Straks de er uttrykt kan polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse renses etter vanlige fremgangsmåter, som inkluderer ammoniumsulfatutfelling, affinitetskolonner, kolonnekromatografi, gelelektroforese og lignende; se Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N. Y. (1982). Hovedsakelig rene polypeptider med minst ca. 90 til 95 % homogenitet er foretrukne, og 98 til 99 % eller mer homogenitet er mest foretrukket, for farmasøytisk anvendelse. Straks de er renset delvis eller til ønsket homogenitet, kan polypeptidene deretter bli anvendt terapeutisk (og inkludere ekstrakorporealt) eller ved utviklingen eller utførelsen av analyse-fremgangsmåter.

Ved enda en ytterligere utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse en celle som inneholder polynukleotidet eller vektoren som er angitt ovenfor. Fortrinnsvis er cellen en eukaryot, mest foretrukket en pattedyrcelle dersom man overveier å anvende polypeptidet terapeutisk. Gjær og mindre foretrukne prokaryote, f.eks. bakterieceller, kan også selvfølgelig anvendes, særlig dersom det fremstilte polypeptid blir anvendt som et diagnostisk middel.

Polynukleotidet eller vektoren ifølge oppfinnelsen som finnes i vertscellen, kan enten bli innebygd i genomet av vertscellen eller den kan opprettholdes ekstrakromosomalt.

"Prokaryot" er ment å inkludere alle bakterier som kan bli overført eller transfektert med DNA- eller RNA-molekyler for ekspresjon av et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Prokaryote verter kan inkludere gram-negative så vel som gram-positive bakterier, slik som f.eks. E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens og Bacillus subtilis. Betegnelsen "eukaryot" er ment å omfatte gjær, høyere plante, insekter og fortrinnsvis pattedyrceller. Avhengig av den anvendte verten i en rekombinant fremstillingsfremgangsmåte, kan polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse være glykosylerte eller kan være ikke-glykosylerte. Polypeptider ifølge oppfinnelsen kan også inkludere en initial metio-ninaminosyrerest. Et polynukleotid som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen kan bli anvendt for å transformere eller transfektere verten ved å anvende en hvilke som helst kjent teknikk. Spesielt foretrukket er anvendelsen av et plasmid eller et virus som inneholder den kodende sekvensen av polypeptidet ifølge oppfinnelsen og genetisk fusjonert til det et N-terminalt FLAG-merke og/ellerC-terminalt His-merke. Lengden av FLAG-merket er fortrinnsvis ca. 4 til 8 aminosyrer, mest foretrukket 8 aminosyrer. Fremgangsmåter for å fremstille fusjonerte, operativt bundne gener og uttrykke dem i f.eks. pattedyrceller og bakterier, er vel kjent på området (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989). De genetiske former og fremgangsmåter som er angitt her, kan bli anvendt for å uttrykke polypeptidet ifølge oppfinnelsen i eukaryote eller prokaryote verter. Ekspresjonsvektorer som inneholder promotersekvenser som gjør den effektive transkrip-sjonen av det inserterte polynukleotidet lettere, blir vanligvis anvendt i forbindelse med verten. Ekspresjonsvektoren inneholder vanligvis et replikasjonsstartområde, en promoter og en terminator, så vel som spesifikke gener som er i stand til å gi fenotyp seleksjon av de transformerte cellene. Dessuten omfatter transgene dyr, fortrinnsvis pattedyr, celler ifølge oppfinnelsen som kan anvendes for fremstilling i stor skala av polypeptidet ifølge oppfinnelsen.

Ved en ytterligere utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse således en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som er angitt ovenfor og omfatter å dyrke en celle ifølge oppfinnelsen under egnede betingelser for ekspresjon av polypeptidet og å isolere polypeptidet fra cellen eller kulturmediet.

De transformerte vertene kan bli dyrket i fermentorer og dyrket etter kjente teknikker for å oppnå optimal cellevekst. Polypeptidet ifølge oppfinnelsen kan deretter bli isolert fra vekstmediet, cellulære lysater eller cellulære membranfraksjoner. Isoleringen og rensingen av f.eks. mikrobiell uttrykte polypeptider ifølge oppfinnelsen kan utføres ved hvilken som helst vanlig måte, slik som f.eks. preparative, kromatografiske atskillelser og immunologiske atskillelser slik som de som involverer anvendelsen av monoklonale eller polyklonale antistoffer direkte f.eks. mot et merke av polypeptidet ifølge oppfinnelsen eller som beskrevet i eksemplene.

Foreliggende oppfinnelse muliggjør således rekombinant fremstilling av polypeptider som omfatter bindingsseter som har affinitet og spesifisitet til en epitop på hhv. CD 19-og CD3-antigenet, og eventuelt et ytterligere funksjonelt domene. Som det fremgår av det som er nevnt ovenfor, tilveiebringer oppfinnelsen en stor familie av polypeptider som omfatter slike bindingsseter for enhver anvendelse i terapeutiske og diagnostiske fremgangsmåter. Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan åpenbart dessuten kobles til andre grupper som angitt ovenfor, f.eks. legemiddelsøkende og billeddannende anvendelser. Slike koblinger kan bli utført kjemisk etter ekspresjon av polypeptidene til bindingssetet, eller koblingsproduktet kan bli utviklet til polypeptidet ifølge oppfinnelsen ved DNA-nivået. DNAene blir deretter uttrykt i et egnet vertssystem og de uttrykte pro-teinene blir oppsamlet og denaturert om nødvendig. Som angitt ovenfor blir bindingssetene fortrinnsvis fremstilt fra de variable områdene av antistoffer. I denne forbindelse muliggjør hybridomateknologi fremstilling av cellelinjer som utskiller antistoff til hovedsakelig enhver ønsket substans som bevirker en immunrespons. RNA som koder for de lette og de tunge kjedene i immunoglobulinet, kan deretter oppnås fra hybridoma-cytoplasmaen. 5'-enden av mRNA kan bli anvendt for å fremstille cDNA som skal anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. DNA som koder for polypeptidene ifølge oppfinnelsen, kan deretter bli uttrykt i celler, fortrinnsvis pattedyrceller.

Avhengig av vertscellen kan det være nødvendig med denatureringsteknikker for å oppnå egnet konformasjon. Om nødvendig kan punktsubstitusjoner som søker å optimalisere binding, bli fremstilt i DNA ved å anvende vanlig kassettmutagenese eller annen protein-"engineering"-metode, slik som er omtalt i beskrivelsen. Fremstillingen av polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan også være avhengig av kunnskap om aminosyresekvensen (eller tilsvarende DNA- eller RNA-sekvensene) til bioaktive proteiner, slik som enzymer, toksiner, vekstfaktorer, celledifferensieringsfaktorer, reseptorer, anti-metabolitter, hormoner eller forskjellige cytokiner eller lymfokiner. Slike sekvenser er beskrevet i litteraturen og er tilgjengelig ved hjelp av datoriserte databanker. Et polypeptid ifølge oppfinnelsen kan f.eks. bli oppbygd bestående av det enkeltkjedede Fv-fragmentet og den ekstracellulære delen av det humane, kostimulerende proteinet CD80 (B7-1) bundet av en (Gly4Serl)l-linker. Det CD80-kostimulerende proteinet hører til Ig-superfamilien. Det er et sterkt glykosylert protein med 262 aminosyrer. En mer detaljert beskrivelse ble publisert av Freeman, J. Immunol. 143 (1989), 2714-2722. Stabil ekspresjon kan utføres i f.eks. CHO-celler med DHFR-underskudd som beskrevet av Kaufrnann, Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566. Proteinet kan deretter bli renset ved hjelp av sin His-merke bundet til C-terminusen ved å anvende en Ni-NTA-kolonne (Mack, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 92 (1995), 7021-7025).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten preparater som omfatter de ovenfor nevnte polypeptidene, polynukleotidene eller vektoren ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører fortrinnsvis preparater som er farmasøytiske preparater som omfatter det ovenfor nevnte polypeptid(ene), polynukleotid(ene) eller vektorene) ifølge oppfinnelsen.

Det farmasøytiske preparat ifølge foreliggende oppfinnelse kan dessuten omfatte en farmasøytisk akseptabel bærer. Eksempler på egnede farmasøytiske bærere er kjent på

området og omfatter fosfatbuffrede saltløsninger, vann, emulsjoner, slik som olje/vann-emulsjoner, forskjellige typer fuktemidler, sterile løsninger, etc. Preparater som omfatter slike bærere kan bli formulert etter kjente vanlige fremgangsmåter. Disse farmasøyt-iske preparatene kan bli administrert til individet i en egnet dose. Administrering av

egnede sammensetninger kan utføres på forskjellige måter, f.eks. ved intravenøs, intra-peritoneal, subkutan, intramuskulær, topisk eller intradermal administrering. Doserings-regimet vil bli bestemt av behandlende lege og kliniske faktorer. Som kjent er doseringene til enhver pasient avhengig v mange faktorer, og inkluderer pasientens størrelse,

kroppsoverflate, alder, den bestemte forbindelse som skal administreres, kjønn, admini-streringstid og administreirngsmåte, generell helse og andre legemidler som administreres samtidig. Regimet som en regulær administrering av det terapeutiske preparat, bør vanligvis være i området 1 ug til 100 mg enheter pr. dag. Dersom regimet er en kontinuerlig fusjon, bør det også være i området fra 1 ug til 10 mg enheter pr. kilo kroppsvekt pr. minutt. En mer foretrukket doseringsform for kontinuerlig infusjon, kan imidlertid være i området fra 0,01 ug til 10 mg enheter pr. kilo kroppsvekt pr. time. Spesielt foretrukne doseringer er oppregnet nedenfor. Fremskritt kan følges ved periodisk vurdering. Doseringer vil variere, men en foretrukket dosering for intravenøs administrering av DNA, er fra ca. IO<6> til IO12 kopier av DNA-molekylet. Forbindelser ifølge oppfinnelsen kan bli administrert lokalt eller systematisk. Administreringen vil

vanligvis være parenteral, f.eks. intravenøs; DNA kan også administreres direkte til målsetet, f.eks. ved biolistisk administrering til et inert eller eksternt målsete eller ved hjelp av kateter til et sted i en arterie. Preparater for parenteral administrering inkluderer sterile vandige eller ikke-vandige løsninger, suspensjoner og emulsjoner. Eksempler på ikke-vandige løsningsmidler er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer,, slik som olivenolje, og injiserbare organiske estere, slik som etyloleat. Vandige bærere inkluderer vann, alkohol/vandige løsninger, emulsjoner eller suspensjoner, og omfatter saltløsninger og buffrede medier. Parenterale vehikler inkluderer natriumkloridløsning, Ringers dekstrose, dekstrose og natriumklorid, laktatisert Ringers eller ikke flyktige oljer. Intravenøse vehikler omfatter væsker og næringssupplementer, elektrolyttsupple-menter (slik som de som er basert på Ringers dekstrose) og lignende. Preserverings-midler og andre tilsetningsstoffer kan også være til stede, slik som f.eks. antimikrobielle midler, antioksidanter, chelateringsmidler og inerte gasser og lignende. Det farmasøyt-iske preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse kan dessuten omfatte proteinholdige bærere, slik som f.eks. serumalbumin eller immunoglobulin, fortrinnsvis av human opprinnelse. Dessuten blir det antatt at det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen kan omfatte ytterligere biologisk aktive midler, avhengig av den tilsiktede anvendelse av det farmasøytiske preparatet. Slike midler kan være legemidler som virker på det gastrointestinale system, legemidler som virker som cytostatika, legemidler som fore-bygger hyperurikemi og/eller midler slik som kjente T-cellekostimulerende molekyler eller cytokiner.

Det ble antatt ved foreliggende oppfinnelse at de forskjellige polynukleotidene og vektorene ifølge oppfinnelsen blir administrert enten alene eller i enhver annen kombinasjon ved å anvende standardvektorer og/eller genadministreirngssystemer, og eventuelt sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipiens. Etter administreringen kan polynukleotidene eller vektorene bli stabilt integrert i genomet til individet.

På den annen side kan anvendes virusvektorer som er spesifikke for visse celler eller

vev og som blir igjen i cellene. Egnede farmasøytiske bærere og eksipienser er kjent på området. De farmasøytiske preparatene fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan bli anvendt for forebyggelse eller behandling eller forsinkelse av forskjellige typer av sykdommer som er beslektet med B-cellerelaterte immundefekter og maligniteter.

Det er dessuten mulig å anvende et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen som omfatter polynukleotid eller vektor ifølge oppfinnelsen, i genterapi. Egnede genadmini-streringssystemer kan omfattet blant annet liposomer, reseptormedierte administreringssystemer, "naked"-DNA og virusvektorer, slik som herpesvirus, retrovirus, adenovirus og adeno-assosierte virus. Administrering av nukleinsyrer til et bestemt sete i kroppen for genterapi kan også oppnås ved å anvende et biolistisk administreringssystem, slik som beskrevet av Williams (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88 (1991), 2726-2729). Ytterligere fremgangsmåter for administreringen av nukleinsyrer omfatter partikkelmediert genoverføring som f.eks. beskrevet i Verma, Gene Ther. 15 (1998), 692-699. Det vil forstås at de innførte polynukleotider og vektorene uttrykker genproduktet etter innfør-ingen i cellen og opprettholder fortrinnsvis denne statusen i løpet av cellens levetid. Cellelinjer som stabilt uttrykker polynukleotidet under kontroll av egnede regulatoriske sekvenser, kan bli fremstilt'etter kjente fremgangsmåter. Heller enn å anvende ekspresjonsvektorer som inneholder viralt replikasjonsstartområde, kan vertscellene bli over-ført med polynukleotidet ifølge oppfinnelsen og en selekterbar markør, enten den samme eller forskjellige plasmider. Etter innføringen av fremmed DNA, lar man de fremstilte cellene få lov til å vokse 1 til 2 dager i det anriket medium og kobles deretter over til et selektivt medium. Den selekterbare markør i rekombinantplasmidet overfører resistens til seleksjonen og tar hensyn til seleksjonen av celler som har stabilt integrert plas-midet inn i sine kromosomer og vokser for å danne foci som i sin tur kan bli klonet og ekspandert til cellelinjer. Slike fremstilte cellelinjer er også spesielt nyttige i screenings-metoder for deteksjon av forbindelser involvert i f.eks. B-celle/T-celle-interaksjon.

Det kan anvendes en rekke seleksjonssystemer, som omfatter, men er ikke begrenset til, herpes simpleks virus tymidinkinase (Wigler, Cell 11 (1977), 223), hypoksantin-guanin-fosforibosyltransferase (Szybalska, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 48 (1962), 2026) og adenin-fosforibosyltransferase (Lowy, Cell 22 (1980), 817) i hhv. tk"-, hgprt"- eller aprf-celler. Antimetabolittresistens kan også bli anvendt som seleksjonsbasis for dhfr, som gir resistens til metotreksat (Wigler, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77 (1980), 3567; 0'Hare, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78 (1981), 1527), gpt, som gir resistens til myko-fenolsyre (Mulligan, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78 (1981), 2072); neo, som gir resistens til aminoglykosidet G-418 (Colberre-Garapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1); hygro, som gir resistens til hygromycin (Santerre, Gene 30 (1984), 147); eller puromycin (pat, puromycin N-acetyl-transferase). Ytterligere selekterbare gener er beskrevet f.eks. trpB, som lar cellene utnytte indol istedenfor tryptofan, hisD, som lar cellene utnytte histinol istedenfor histidin (Hartman, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85 (1988), 8047); og ODC (ornitindekarboksylase) som gir resistens til ornitindekarboksylaseinhibitoren, 2-(di-fluormetyl)-DL-ornitin, DFMO (McCologue, 1987,1: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.).

Ved en annen utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse et diagnostisk preparat som omfatter hvilken som helst av de ovenfor angitte polypeptidene, polynukleotidene eller vektorene ifølge oppfinnelsen og eventuelt egnede midler for deteksjon.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen er også egnet for anvendelse i immuntester hvor de

kan anvendes i flytende fase eller bundet til en fast fasebærer. Eksempler på immuntester som kan anvende polypeptidene ifølge oppfinnelsen, er kompetitive og ikke-kompetitive immunotester i enten et direkte eller indirekte format. Eksempler på slike immunotester er radioimmunotesten (RIA), sandwich (immunometrisk test) og Western blot-testen.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan bli bundet til mange forskjellige bærere og anvendt for å isolere celler som spesielt er bundet til polypeptidene. Eksempler på velkjente bærere omfatter glass, polystyren, polyvinylklorid, polypropylen, polyetylen, polykarbonat, dekstran, nylon, amylose, naturlig og modifisert cellulose, kolloidale metaller, polyakrylamider, agaroser og magnetitt. Anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse kan bæreren være enten løselig eller uløselig.

Det finnes mange forskjellige, kjente merker og fremgangsmåter for å merke. Eksempler på typer av merker som kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse, inkluderer enzymer, radioisotoper, kolloidale metaller, fluorescerende forbindelser, kjemilumin-escensforbindelser og bioluminescerende forbindelser, se også utførelsesformene som er omtalt i det foregående.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelsen av polypeptidet, polynukleotidet og vektoren ifølge oppfinnelsen som angitt i det foregående for fremstillingen av et far-masøytisk preparat for behandling av B-celle-maligniteter, B-celle-medierte autoimmune sykdommer eller deplesjonen av B-celler.

Nyere kliniske studier med igjen målrettet cytotoksisk aktivitet for humane T-celler ved hjelp av bispesifikke antistoffer, har vist lovende resultater ved behandlingen av refraktær Hodgkins sykdom (33), bryst- og ovarialcancer (34-37) og malign gliom (38). Forutsatt

at bsc-antistoffer pga. deres lave molekylmasse, gjør inntrengningen i tumorer lettere (som er blitt vist for Fab- eller Fv-fragmenter) (39); og

at bsc-antistoffer blir antatt å redusere den doseavhengige og dosebegrensende toksisiteten forårsaket av den systemiske cytokinfrigivingen mediert av Fe-delene av vanlige, bispesifikke antistoffer (40); og

at selv et intakt monoklonalt antistoff (rettet mot CD20) fører til tumorregresjon

ved fremskredne stadier av NHL (41,42),

er det forventet - og har faktisk blitt vist - at polypeptidene ifølge oppfinnelsen er interessante molekyler som bidrar til ytterligere terapeutiske forbedringer.

Ved en foretrukket utførelsesform blir det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen således anvendt for behandlingen av ikke-Hodgkin-lymfom.

Doseringsområdene for administrering av polypeptidene, polynukleotidene og vektorene ifølge oppfinnelsen er de som er store nok til å frembringe den ønskede virkning hvor symptomene av de B-celle-medierte sykdommene blir lindret. Doseringene bør ikke være så store at de forårsaker vesentlige skadelige bivirkninger, slik som uønskede kryssreaksjoner, anafylaktiske reaksjoner og lignende. Generelt vil doseringen variere med alderen, tilstanden, kjønn og hvor omfattende pasientens sykdom er, og kan bestemmes av fagmannen. Dosering kan justeres av legen i tilfelle av motindikasjoner. Det er antatt at området for dosen bestemmes til f.eks. 0,01 ug til 10 mg av polypeptidet ifølge oppfinnelsen. En spesielt foretrukket dosering er 0,1 ug til 1 mg, enda mer foretrukket er 1 ug til 100 ug og mest foretrukket er en dosering på 3 ug til 10 ug, som f.eks. belyst i eksempel 7.

Forbindelsen vedrører dessuten en fremgangsmåte for å identifisere T-celle-aktiverende eller kostimulerende forbindelser eller for å identifisere inhibitorer av T-celle-aktivering og stimulering som omfatter (a) å dyrke CD19-positive celler (fortrinnsvis B-celler) og T-celler i nærvær av polypeptidet ifølge opprinnelsen, og eventuelt i nærvær av en komponent som er i stand til å gi et påvisbart signal i respons til T-celleaktivering med en forbindelse som skal screenes under betingelser som muliggjør interaksjon av forbindelsen med cellene; og (b) å detektere tilstedeværelsen eller fraværet av et signal frembrakt av interaksjonen av forbindelsen med cellene.

Denne utførelsesform er spesielt nyttig for å analysere kapasiteten av forbindelsene som kostimulerende molekyler. Ved en fremgangsmåte tilveiebringer den CD19-positive celle/B-celle et primært aktiviseringssignal for T-cellen, og unngår således den klono-typiske T-cellereseptoren. Selv om det kan bli bestemt ifølge oppfinnelsen hvilken forbindelse som skal analyseres, er det fortsatt faktisk nødvendig å aktivere T-cellen. Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fungerer den CD19-positive cellen/B-cellen som en stimulerende celle som binder bispesifikke molekyler som er bundet til CD3-kom-pleksene på overflaten av den samme T-cellen. De biologiske fremgangsmåtene for å utføre dyrkning, deteksjon og eventuelt analyse, er kjent for fagmannen.

Betegnelsen "forbindelse" ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen inkluderer en enkelt substans eller et stort antall substanser som kan være eller ikke være identiske.

Forbindelsen(e) kan f.eks. finnes i prøver, f.eks. celleekstrakter fra f.eks. planter, dyr eller mikroorganismer. Forbindelsene kan dessuten være kjente, men hittil ikke kjente for hhv. å være i stand til å inhibere T-celleaktiveringen eller ikke kjent for å være nyttige som en T-cellekostimulerende faktor. Det store antall av forbindelser kan f.eks. bli tilsatt til dyrkningsmediet eller injiseres i cellen. Dersom en prøve som inneholder (a) forbindelse(r) ble identifisert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, så er det enten mulig å isolere forbindelsen fra den opprinnelige identifiserte prøven som inneholder den aktuelle forbindelsen, eller en kan ytterligere oppdele den opprinnelige prøven, f.eks. dersom den består av et stort antall forskjellige forbindelser, slik at man reduserer antallet av forskjellige substanser pr. prøve og gjentar metoden med underoppdelinger av den opprinnelige prøven. Det kan deretter bli bestemt ved kjente metoder hvorvidt prøven eller forbindelsen utviser de ønskede egenskaper slik som angitt i beskrivelsen og i eksemplene. Avhengig av kompleksiteten av prøvene kan de angitte trinn bli utført flere ganger, fortrinnsvis inntil prøven som er identifisert etter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, bare omfatter et begrenset antall av, eller bare én, substans(er). Fortrinnsvis omfatter prøven substanser eller lignende kjemiske og/eller fysikalske egenskaper, og mest foretrukket er substansene identiske. Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli lett utført og planlagt f.eks. i overensstemmelse med andre kjente cellebaserte analyser som er angitt i litteraturen eller ved å anvende og modifisere fremgangsmåtene som er angitt i eksemplene. Man vil dessuten lett bli klar over hvilke forbindelser og/eller celler som kan anvendes for å utføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, f.eks. interleukiner eller enzymer, om nødvendig, som overfører en bestemt forbindelse til forløperen som i sin tur stimulerer eller undertrykker T-celleaktiveringen. Slik tilpasning av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ligger innenfor kunnskaps-området til fagmannen og kan utføres uten altfor mye eksperimentering.

Forbindelser som kan anvendes etter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, omfatter peptider, proteiner, nukleinsyrer, antistoffer, små organiske forbindelser, ligander, peptidetterligninger, PNA-er og lignende. Forbindelsene kan også være funksjonelle derivater eller analoger av kjente T-celle-aktivatorer eller inhibitorer. Fremgangsmåter for å fremstille kjemiske derivater og analoger er velmente og er beskrevet f.eks. i Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. og Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Derivatene og analogene kan dessuten bli undersøkt på deres virkninger etter kjente fremgangsmåter eller som beskrevet f.eks. i eksemplene. Peptidetterligninger og/eller datamaskinassistert design av egnede aktivatorer eller inhibitorer av T-celleaktivering, kan bli anvendt, f.eks. etter fremgangsmåtene angitt nedenfor. Egnede datamaskinpro-grammer kan bli anvendt for å identifisere interaktive seter i en antatt inhibitor og antigenet ifølge oppfinnelsen ved datamaskinassistert søk på komplementære struktur-motiver (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Ytterligere egnede datamaskin-systemer for datamaskinassistert design av protein og peptider, er angitt i litteraturen f.eks. i Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N.Y. Acad. Sei. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Resultatene oppnådd fra de ovenfor angitte computeranalyser kan anvendes sammen med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, f.eks. ved å optimalisere kjente T-celle-aktivatorer eller inhibitorer. Egnede peptidetterligninger kan også bli identifisert ved syntesen av peptidetterligningskombinatoriske biblioteker ved suksessiv kjemisk modifisering og undersøkelse av de resulterende forbindelser, f.eks. etter fremgangsmåten angitt i beskrivelsen og i eksemplene. Fremgangsmåter for utviklingen og anvendelse av peptidetterligningskombinatoriske biblioteker er angitt i litteraturen, f.eks. i Ostresh, Methods in Enzymology

267 (1996), 220-234 og Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Den tredimen-sjonale og/eller krystallografiske struktur av inhibitorene eller aktivatorene av B-celle/- T-celle-interaksjon kan bli anvendt for design av peptidetterligningsinhibitorer eller aktivatorer av T-celleaktivering som skal analyseres etter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4(1996), 1545-1558).

Kort sagt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for å identifisere forbindelser som er i stand til å modulere B-celle/T-celle-medierte immunresponser. Forbindelser som er funnet å aktivere B-celle/T-celle-medierte responser, kan bli anvendt ved behandlingen av cancer og beslektede sykdommer. I tillegg kan det også være mulig å spesifikt inhibere virussykdommer, og derved forebygge virusinfeksjon eller virus-spredning. Forbindelsene identifisert som suppressorer av T-celle-aktivering eller -stimulering, kan bli anvendt i organtransplantasjon for å unngå transplantatavstøtning: se også supra.

Forbindelser som er identifisert eller oppnådd etter fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, er således forventet å være meget nyttige i diagnostiske og spesielt i terapeutiske anvendelser. Slike forbindelser, i form av et farmasøytisk preparat, kan fremstilles ved en fremgangsmåte som omfatter å formulere forbindelsen som er identifisert i trinn (b) i den ovenfor angitte fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen i en farmasøytisk akseptabel form. Det er dessuten antatt at bestanddelen kan bli modifisert ved hjelp av peptidetterligninger. Fremgangsmåter for utviklingen og anvendelsen av peptidetterligningskombinatoriske biblioteker er angitt i litteraturen, f.eks. Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 210-234, Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715, Beeley, Trends Biotechnol. 12 (1994), 213-216, eller al-Obeidi, Mol. Biotech. 9(1998), 205-223.

De terapeutisk nyttige forbindelsene som er identifisert etter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan bli administrert til en pasient ved hjelp av enhver egnet fremgangsmåte for den spesielle forbindelsen, f.eks. oralt, intravenøst, parenteralt, transdermalt, transmukosalt eller ved kirurgi eller implantasjon (f.eks. med forbindelsen som er i form av en fast eller viskøs biologisk kompatibel eller resorberbar matriks) ved eller nær stedet hvor virkningen av forbindelsen er ønsket. Egnede terapeutiske doser blir bestemt av fagmannen, se supra.

Disse og andre utførelsesformer er omtalt og omfattet av beskrivelsen og eksemplene ifølge foreliggende oppfinnelse. Ytterligere litteratur som vedrører noen av antistoffene, fremgangsmåtene, anvendelsene og forbindelsene som skal anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse, kan gjenvinnes fra offentlige biblioteker og databaser, ved å anvende f.eks. elektronisk utstyr. Den offentlige databasen "Medline", som er tilgjengelig på Internett, kan anvendes f.eks. under http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.-html. Ytterligere databaser og adresser, slik som http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.ifni.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/, kan også oppnås ved å anvende, f.eks. http://www.lycos.com. En oversikt over patentinformasjon i bioteknologi og en oversikt over relevante kilder av patentinformasjon som er nyttig for retrospektiv søk og for løpende forståelse, er gitt i Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Figurene viser:

Figur 1:

SDS-Page: Coomassie-farging av det rensede bscCD19xCD3-fragment med forskjellige mengder av protein. Molekylmasse (kDa) av markøren er angitt på venstre side.

Figur 2:

FACS-analyse med bscCD19xCD3 (200 ug/ml) av forskjellige CD19-positive B-cellelinjer (BJAB, SKW6.4, Blin-1, Daudi, Raji), av CD19-negativ B-cellelinje BL60 og av CD3-positive Jurkat-celler og primære, humane PBMCer. Stiplede linjer angir negative kontroller.

Figur 3:

Cytotoksisitet av bscCD19xCD3 i et <51>Cr-frigivningsforsøk med ikke-stimulerte, humane PBMCer og forskjellige B-cellelinjer. Effektor: Målcelleforhold 10:1; inkubasjonstid 4 h. Standard avvik i alle tre paralleller var under 7 %.

Figur 4:

Kromfrigivningscytotoksisitetsforsøk med ikke-stimulerte, primære, humane PBLer mot plasmacytoma-cellelinjene L363 og NCI og lymfomacellelinje Daudi E:T-forholdet 20:1; inkubasjonstid 8 h.

Figur 5:

Inhibisjon av cytotoksisiteten av bscCD19xCD3 av det parentale anti-CD19-antistoff HD37 i et kromfrigivningsforsøk; inkubasjonstid 8 h; E:T-forhold 20:1; konsentrasjon avbscCD19xCD3 1 ng/ml.

Figur 6:

Cytotoksisitetsforsøk med ikke-stimulerte PBMCer mot Daudi-celler etter tilsetning av økende mengder av EGTA, E:T-forhold 10:1, inkubasjonstid 4 h.

Figur 7:

Cytotoksisitet av bscCD19xCD3 i et <51>Cr-frigivningsforsøk med ikke-stimulerte, humane PBMCer og Blin-1 som målceller ved forskjellige E:T-forhold; inkubasjonstid 4 h; konsentrasjon av vanlig bispesifikt antistoff 3 ug/ml; konsentrasjon av bsc 17-1 AxCD3 100 ng/ml; E:T-forholdene som angitt.

Figur 8:

DNA- og proteinsekvens av bscCD19xCD3-antistoffet (FLAG-merke som inneholder variant). Nummer indikerer nukleotid(nt)-posisjonene, den tilsvarende aminosyresekvensen er vist under nukleotidsekvensen. Den innpodede DNA-sekvensen for det bispesifikke antistoff begynner i posisjon 1 og slutter i posisjon 1593. De første seks nt (posisjon -10 til -5) og de siste nt (stilling 1596 til 1601) inneholder restriksjonsenzym-spaltningssetene for hhv. EcoRI og Sali. Nukleotider 1 til 57 angir ledersekvensen; nukleotid 82 til 414 og 460 til 831 innkoder hhv. VLCD19 og VHCD19; nukleotid 847 til 1203 og 1258 til 1575 innkoder hhv. VHCD3 og VLCD3; og nukleotider 1576 til 1593 innkoder et His-merke.

Figur 9:

Deplesjon av primære (maligne) CD19<+->B-celler ved tilgangen av autologe, primære T-lymfocytter ved hjelp av bscCD19xCD3.

A) Utgangspunkt (t = 0): n = 3 x 106 PBL/brønn ble tilsatt til hver brønn i en 24-brønners vevskulturplate i et volum på 1 ml RPMI 1640-medium, hver supple-mentert med 10 % FCS. Den initiale prosenten av CD19<+->B-celler så vel som

CD4<+-> og CD8<+->T-celler er angitt.

B-G) relativ B- og CD4<+-> og CD8<+->T-celletelling etter t = 5 dagers inkubasjon ved 37 °C / 5 % C02 i fravær (B-C) eller nærvær (D-G) av bscCD19xCD3 (konsentrasjoner angitt) med eller uten 60 U/ml IL-2. Negative kontroller inneholder enten bispesifikt enkeltkjedet antistoff (17-1 AxCD3) med irrelevant målcelle-spesifisitet eller intet bispesifikt antistoff i det hele tatt (C).

Figur 10:

Rensningstrinn for bscCD19xCD3

Figur 11:

SDS-PAGE-analyse av renheten av bscCD19xCD3. En kolloidal Coomassie-blåfarget SDS 4-12 % gradient polyakrylamidgel er vist. Striper 1 og 6, molekylstørrelsemarkør-er; stripe 2, overliggende væske av cellekultur; stripe 3, aktiv fraksjon fra kationebytterkromatografi; stripe 4, aktiv fraksjon fra kobolt chelataffinitetskromatografi; stripe 5, aktiv fraksjon fra gelfiltrering. Like mengder av protein (2 jag) fra overliggende væske av cellekulturen og de forskjellige kolonnerfaksjoner ble analysert. Størrelsen i kDa av molekylvektstandarder er vist på høyre side. Pilen viser posisjonen til bscCD19xCD3.

Figur 12:

Kationebytterkromatografi av bscCD19xCD3. Proteinkonsentrasjonen ble målt ved absorpsjon ved 280 nm (mAU, venstre). Elueringsprofilen av protein er vist med heltrukken linje. Profilen av NaCl-trinngradienten er vist med en heltrukken linje (% B, høyre) og fraksjoner som er oppsamlet, er angitt ved stiplede linjer. BscCD19xCD3 ble påvist i fraksjon F6.

Figur 13:

Kobolt chelataffinitetskromatografi av bscCD19xCD3. Proteinkonsentrasjonen ble målt ved absorpsjon ved 280 nm (mAU, venstre). Elueringsprofilen av protein er vist med heltrukken linje. Imidazolgradienten er vist med en heltrukken linje (% B, høyre) og fraksjoner som er oppsamlet, er angitt med stiplede linjer. BscCD19xCD3 ble påvist i fraksjon F7.

Figur 14:

Gel filtrering av anti-CD19xanti-CD3. Proteinkonsentrasjonen ble målt ved hjelp av absorpsjon ved 280 nm (mAU, venstre). Elueringsprofilen av protein er vist med heltrukken linje. Stiplede linjer angir fraksjoner som er oppsamlet. BscCD19xCD3 ble funnet i fraksjon F7 som tilsvarer en molekylstørrelse på ca. 60 kDa.

Figur 15:

Blodnivåer av gamma-glutamyltransferase (GGT) i respons til behandlinger med bscCD19xCD3. GGT-nivåer ble bestemt ved hjelp av en standard, klinisk, biokjemisk metode og er uttrykt som enhet/l. Tidsaksen viser dager (d) etter begynnelsen av første legemiddelbehandling og, begynner med null, timer (h) etter de individuelle legemiddeltilsetningene. Piler viser tidspunktene for legemiddeladministrering.

Figur 16:

Ultralydmålinger av milten til pasient A-B.

A: Bestemmelse av miltstørrelse datert 12. april 1999, før bscCD19xCD3-terapi.

Figuren viser forstørret milt (størrelse 146 mm x 69,2 mm) som skyldes infil-trering med maligne B-celler.

B: Bestemmelse av miltstørrelse datert 16. april 1999, etter behandling med 3 ug den 14. april, etterfulgt av 10 ug den 15. april. Figuren viser innskrumpning av milten til en størrelse på 132 mm x 58,9 mm forårsaket av systemisk behandling med bscCD19xCD3. Uoverensstemmelser av enkeltmålinger vist i tabell 1, forklares ved ultralydbasert organstørrelsebestemmelse i forskjellige, rommelige plan. De to dimensjonene er merket med (+) og (x).

Figur 17:

Blodleukocytttelling i respons til behandlinger med bscCD19xCD3. Antall leukocytter er angitt som Giga deler/liter. Tidsaksen viser dager (d) etter begynnelsen av første legemiddelbehandling og, starter med null, timer (h) etter de individuelle legemiddeltilsetningene. Piler viser tidspunktene for legemiddeladministrering.

Figur 18:

Blodnivåer av C-reaktivt protein (CRP) i respons til behandlinger med bscCD19xCD3. CRP-nivåer ble bestemt ved hjelp av en standard, klinisk, biokjemisk metode og er uttrykt som mg/dl. Tidsaksen viser dager (d) etter begynnelsen av første legemiddelbehandling og, starter med null, timer (h) etter de individuelle legemiddeltilsetningene. Piler viser tidspunktene for legemiddeladministrering.

Figur 19:

Blodnivåer av tumornekrosefaktor-alfa (TNF) i respons til behandlinger med bscCD19xCD3. TNF-nivåer ble bestemt ved hjelp av ELISA og er uttrykt som ng/ml. Tidsaksen viser dager (d) etter begynnelsen av første legemiddelbehandling og, starter med null, timer (h) etter de individuelle legemiddeltilsetningene. Piler viser tidspunktene for legemiddeladministrering.

Figur 20:

Blodnivåer av interleukin-6 (IL-6) i respons til behandlinger med bscCD19xCD3. IL-6-nivåer ble bestemt ved hjelp av ELISA og er uttrykt som pg/ml. Tidsaksen viser dager (d) etter begynnelsen av første legemiddeltilsetning og, starter med null, timer (h) etter de individuelle legemiddeltilsetningene. Piler viser tidspunktene for legemiddeladministrering.

Figur 21:

Blodnivåer av interleukin-8 (IL-8) i respons til behandlinger med bscCD19xCD3. IL-8-nivåer ble bestemt ved hjelp av ELISA og er uttrykt som pg/ml. Tidsaksen viser dager (d) etter begynnelsen av første legemiddelbehandling og, begynner med null, timer (h) etter de individuelle legemiddeltilsetningene. Piler viser tidspunktene for legemiddeladministrering.

Figur 22:

Blodnivåer av løselig interleukin-2-reseptor alfa-kjede (IL-2R) i respons til behandlinger med bscCD19xCD3. IL-2R-nivåer ble bestemt ved hjelp av ELISA og er uttrykt i enheter/ml. Tidsaksen viser dager (d) etter begynnelsen av den første legemiddelbehand-lingen og, begynner med null, timer (h) etter de individuelle legemiddeltilsetningene. Piler viser tidspunktene for legemiddeladministrering.

Oppfinnelsen vil nå bli omtalt med henvisning til de følgende biologiske eksempler som bare er ment å belyse oppfinnelsen og er ikke ment å begrense omfanget av foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Kloning av variable ( V) immunoglobulindomener

De V-lette kjede(VL)- og V-tunge kjede(VH)-domener fra HD37 hybridoma (22) ble klonet etter standard PCR-fremgangsmåter (23). cDNA-syntese ble utført med oligo-dT-primere og Taq-polymerase.

Liste over primere

For amplifikasjonen av V-domenene ved hjelp av PCR anvendte vi primerne 5'LI og 3'K, som flankerer VL,-domenet og 5'H1 og 3'G av den tunge kjeden basert på primere som angitt av Diibel et al. (24).

cDNA av anti-CD3-scFv-fragmentet ble velvillig skaffet til veie av A. Traunecker (25).

Eksempel 2

Konstruksjon av bispesifikke. enkeltkjedede fragmenter og eukarvotisk ekspresjon

For å oppnå et anti-CD19-scFv-fragment tjente de tilsvarende VL- og VH-regionene klonet inn i atskilte plasmidvektorer, som templater for en VL- og VH-spesifikk PCR ved å anvende de oligonukleotide primerparene hhv. 5'VLB5RRV/3'VLGS15 og 5'VHGS15/3'VHBspEI. Overlappende komplementærsekvenser ble derved innført i PCR-produktene, som sammen danner kodesekvensen til 15-aminosyre (Gly4Seri)3-linker under den påfølgende fusjon-PCR. Dette amplifikasjonstrinnet ble utført med primerparet 5'VLB5RRV/3'VHBspEI og det resulterende fusjonsprodukt (eller heller anti-CD19-scFv-fragment) ble spaltet med reaksjonsenzymene EcoRV og BspEI og således klonet inn i bluescript KS-vektoren (Stratagene) som hhv. inneholder den (EcoRI/Sall-klonet) -kodende sekvensen av det anti-17-lA/anti-CD3 -bispesifikke enkeltkjedeantistoffet med et N-terminalt FLAG-merke [1] eller av den modifiserte versjon uten FLAG/epitop (21), og derved erstatter anti-17-IA- med anti-CD19-spesifisiteten og bevarer 5-aminosyre(Gly4Seri)i-linkeren som forbinder C-terminalt anti-CD3-scFv-fragment. DNA-fragmentene som innkoder hhv. begge versjoner av det anti-CDl9/anti-CD3-bispesifikke enkeltkjedeantistoffet med domenearrangementet VLcdi9-VHcdi9-VHcd3-VLcd3, ble subklonet EcoRI/Sall inn i den angitte ekspresjonsvektoren pEF-DHRF [1]. De resulterende plasmid-DNAene ble transfektert inn i CHO-celler med DHFR-deficit ved elektroporering: seleksjon, genamplifikasjon og proteinproduksjon ble utført som angitt [1]. I de følgende eksempler er belyst resultatene oppnådd med FLAG-inneholdende versjon av bscCD19xCD3.

Rensing av bscCD19xCD3 fra overliggende væske av transfekterte CHO-celler, gir

4 mg/liter overliggende kulturvæske. bsc-Ab ble renset ved hjelp av sin C-terminale histidinende ved hjelp av affinitetskromatografi på en Ni-NTA-kolonne som angitt [1]. bsc-Ab ble eluert fra Ni-NTA-kolonnen som en tydelig topp ved en konsentrasjon på 200 mM imidazol. SDS-Page ble utført etter Laemmli (26) med en 12 % gel, etterfulgt av farging med Coomassie brilliantblått R250 for å analysere rensingen av bsc-Ab. Resultatene av SDS-PAGE-analyse (Fig. 1) viser den forventede størrelse av bsc-Ab (60 kDa).

Eksempel 3

Bindingsegenskaper av bsc- AbCD19xCD3

Bindingsspesifisiteter av bsc-Ab til CD3 og CD 19 ble vist ved gjennomstrømningscyto-metrisk analyse på CD3-positive Jurkat-celler, humane PBMCer og et antall forskjellige CD19-positive B-cellelymfomacellelinjer som omfatter Blin I, SKW6.4, Daudi, BJAB og Raji. De CD19-positive B-cellelinjene Daudi, Raji, BJAB (Burkitfs lymfom), SKW6.4 (human EBV-transformert B-celle) og Blin-1 (pre-B-cellelinje) ble anvendt i gjennomstrømningscytometrisk analyse og kromfrigivningsanalyse. Jurkat er en CD3-positiv T-cellelinje; BL60 og plasmacytoma-cellelinjene NC1 og L363 er negative for begge overflatemolekyler, CD3 og CD 19. Cellelinjene ble dyrket i komplett RPMI1640 (Biochrom) med 10 % FCS (GIBCO).

1 x IO<6> celler ble vasket med PBS, suspendert igjen i 200 ul PBS med 10 % Vernimmun (Centeon, Marburg, Tyskland) og 0,1 % NaN3 og inkubert i 30 min ved 4 °C. Etter et sentrifugeirngstrinn (100 x g, 5 min) ble cellene inkubert i 50 (il bscCD19xCD3

(200 ug/ml i PBS med 10 % Venimmun og 0,1 % NaN3) i 30 min ved 4 °C. Cellene ble vasket to ganger med PBS. For deteksjon av bsc-Ab ble det anvendt et FITC-konjugert antistoff mot His-merket (Dianova). Den irrelevante bsc-Ab-17-1 AxCD3, fremstilt ved hjelp av det samme ekspresjonssystem som bscCD19xCD3, eller det His-merkede antistoff alene, tjener som negative kontroller. Gjennomstrømningscytometri ble utført med et Becton Dickinson FACScan. Det ble ikke påvist noen binding på BL60-celler som uttrykker verken CD 19 eller CD3 (Fig. 2).

Eksempel 4

Cytotoksisk aktivitet av bsc- AbCD19xCD3 mot CD19- positive lymfomceller

bscCD19xCD3-antistoffet viser seg å være sterkt cytotoksisk overfor flere lymfomcelle-linjer i en 51Cr-frigivningsanalyse (Figur 3). Humane, perifere, blodmononukleære celler (PBMCer) som effektorceller, ble isolert fra frisk "buffy coats" fra tilfeldig valgte

donorer ved å anvende Lymphoprep™ (Nycomed) gradient sentrifugering med påfølg-ende 100 x g sentrifugeirngstrinn for å fjerne trombocytter. CD19-positive B-celler ble redusert i antall ved å anvende Dynabeads® M-450 CD 19 (Dynal). De reduserte celle-populasjoner ble analysert ved gjennomstrømningscytometri (Becton Dickinson) som viste en 99 % reduksjon av CD19-positive celler. PBMCene ble inkubert natten over ved 37 °C, 5 % C02 CD19-positive B-cellelinjer (Raji, Blin I, Daudi, BJAB, SKW6.4) ble anvendt som målceller. Cytotoksisitet ble målt i en standard kromfrigivningsanalyse i 96-brønnplater med runde bunner (Nunc) ved å anvende RPMI 1640 komplett medium (Biochrom) med 10 % FCS (GIBCO).

Ikke-stimulerte PBMCer ble tilsatt i et volum på 80 (il medium til hver brønn som inneholder 20 (il av bsc-Ab i forskjellige konsentrasjoner. 100 ul av<5>'Cr-merket målceller (1 x IO<4>) ble deretter tilsatt, plater ble sentrifugert i 3 min ved 100 x g og inkubert i 4 h ved 37 °C, 5 % C02. Etter et ytterligere sentrifugeirngstrinn ble 50 (il overliggende væske fjernet og analysert på frigitt51 Cr i en gammateller (TopCount, Canberra Packard).

Spontan frigivning ble målt ved å inkubere målcellene uten effektorceller eller antistoffer, og maksimal frigivning ble målt ved å inkubere målcellene med 10 % TritonX-100. Inkubering av målceller med bscAb uten effektorceller, resulterte ikke i målbar lysis. Prosent spesifikk lysis ble beregnet aspesifikk frigivning (%) = [(cpm, eksperimentell frigivning) - (cpm, spontan frigivning)]/ [(cpm, maksimal frigivning) - (cpm, spontan frigivning)] x 100. Alle tester ble utført i tre paralleller. SD i de tre parallellene var i alle forsøkene under 6 %. For å etterligne in v/vo-betingelsene anvendte vi ikke-stimulerte PBMCer fra friske donorer som effektorceller. Hurtig induksjon av cytotoksisitet i løpet av 4 timer kunne observeres uten noen T-celle-prestimuleringsfremgangsmåte. Som en kontroll viste et bsc-antistoff med forskjellig tumorspesifisitet (bscl7-lAxCD3), men fremstilt etter det samme systemet som bscCD19xCD3-antistoffet, lysisaktivitet ikke vesentlig over middels bakgrunn. Ingen cytotoksisk aktivitet kunne observeres i tillegg ved å anvende plasmacytomacellelinjene NC1 og L363 som ikke uttrykker CD 19 som målceller (Figur 4). Ved konkurranseanalyser som anvender økende mengder av CD 19-spesifikt, parentalt, monoklonalt antistoff, kan HD37-cytotoksisk aktivitet av bscCD19xCD3 nesten fullstendig blokkeres (Figur 5). Disse kontroller viser at bscCD19xCD3-medierte, cytotoksiske virkninger er antigenspesifikke. For å få mer informasjon om molekylærmekanismen på hvordan bscCD19xCD3-antistoff dreper CD19-positive målceller, forsøkte vi å blokkere bscCD19xCD3-mediert cytotoksisitet med EGTA. Som vist i figur 6 kan cytotoksisk aktivitet av bscCD19xCD3 bli fullstendig blokkert av EGTA og indikerer at spesifikk lysis er en T-celle-mediert virkning

(sannsynligvis ved hjelp av perforin-reaksjonsrekken) heller enn en direkte (f.eks. apop-tosis-indusert) virkning av selve antistoffet. Ved å anvende ikke-stimulerte T-celler selv ved antistoffkonsentrasjoner under 1 ng/ml, kan det bli observert en signifikant, cytotoksisk virkning mot Blin-l-celler (Figur 7). Selv ved relativt lave E:T-forhold (5:1; 2,5:1) og ved meget lave antistoffkonsentrasjoner på 10-100 pg/ml, kunne bscCD19xCD3-antistoffet hurtig indusere spesifikk, cytotoksisk aktivitet av ikke-stimulert T-celle (figur 7). I motsetning til dette viste ikke et vanlig bispesifikt CD19xCD3-antistoff fremstilt ved hybrid-hybridoma-teknikk (5-7,27), signifikant cytotoksisk aktivitet under disse betingelser selv ved konsentrasjoner inntil 3 000 ng/ml (figur 7). Dette vanlige, bispesifikke antistoff trenger ytterligere T-celleprestimulering og høye antistoffkonsentrasjoner på ca. 100 ng/ml for å indusere spesifikk T-celle-cytotoksisitet (ikke vist) som er i overensstemmelse med hva som fremgår av litteraturen (5-7, 27).

Eksempel 5

Deplesion av primære ( maligne) B- celler ved hjelp av autolo<g>e T- celler ved den c<y>to-toksiske aktivitet av bscCD19xCD3

For å bestemme den cytotoksiske aktivitet av bscCDl 9xCD3 på primære, maligne B-celler, ble mononukleære celler fra det perifere blodet (PBMC) av en pasient som lider av B-CLL (B-cellerfemkalt, kronisk, lymfatisk leukemi), isolert ved Ficoll densitets-gradientssentrifugering,. Disse celler ble deretter dyrket i nærvær eller fravær av bscCD19xCD3 i 5 dager ved 37 °C/5 % C02 i RPMI 1640-medium tilsatt 10 % FCS og, eventuelt, med 60 U/ml IL-2. Strømningscytometrisk analyse viste at de perifere blod-lymfocyttene (PBL) av denne bestemte NHL(ikke-Hodgkin-lymfom)-pasient (som senere ble systemisk behandlet med bscCD19xCD3; se eksempel 7) inneholdt 92,6 % CD19-positive B-celler (= målceller) og 7,4 % CD3-positive T-lymfocytter (= effektorceller) ved CD4/CD8-T-celleforhold på 2,6 : 4,8. Størstedelen av disse CD19-positive B-celler består av maligne celler. 3 x 10<6> PBL/ml pr. brønn ble tilsatt i et volum på 1 ml hver til en 24-brønners vevskulturplate. Som negative kontroller tjente kulturmedium pluss IL-2 og kulturmedium pluss IL-2 med det irrelevante, bispesifikke, enkeltkjedede antistoff bsc 17-1 AxCD3 (1) ved en konsentrasjon på 0,5 ug/ml. Som vist i fig. 9, ble det ikke påvist noen deplesjon av CD19-positive celler under disse betingelser etter 5 dagers inkubasjon. Når imidlertid bscCD19xCD3 ble tilsatt ved konsentrasjon på 0,5 ug/ml eller 0,05 ug/ml (enten i nærvær eller fravær av IL-2) var nesten alle CD19-positive B-celler drept. De dyrkede cellene bestod ved dette tidspunkt hovedsakelig av T-lymfocytter med et CD4/CD8-T-celleforhold på ca. 1:2 til 1:3. Dette viser den eksepsjonelle cytotoksisiteten av bscCD19xCD3 mot CD19-positive B-celler, siden total deplesjon av primære B-celler ved autologe T-celler kunne bli indusert ved en konsentrasjon på ca. 50 ng/ml ved et meget ufordelaktig initialt effektormålcelleforhold på mindre enn 1:10, til om med uten IL-2 eller et annet slag av ytterligere T-cellestimulering.

Eksempel 6

Rensin<g> av bscCD19xCD3 for terapeutisk anvendelse

BscCD19xCD3 ble fremstilt i kinesiske hamsterovarie-(CHO)-celler stabilt transfektert med en ekspresjonsvektor (pEF-DHFR; se eksempel 2) som innkoder bscCD19xCD3 og, dessuten, et heksahistidin og et FLAG-merke. Cellene ble dyrket i serumfritt medium (Rencyte) i en hul fiberreaktor (Unisyn). 500 ml overliggende cellevæske ble oppsamlet og sterilfiltrert gjennom 0,2 um filter (AcroCap; Pall Gelman).

BscCD19xCD3 ble påvist og mengde bestemt ved western blotting ved å anvende muse-anti-FLAG-IgG (Sigma) og geit-anti-mus-IgG koblet til alkalisk fosfatase (Sigma). Deteksjon ble utført ved kemoluminescens ved å anvende BCIP/NBT-systemet (Devitron). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved Bradford assay (Biorad) ved å anvende bovint-IgG (Biorad) som proteinstandard. Renhet av kolonnefraksjoner ble bestemt ved hjelp av reduserende natriumdodecylsulfat (SDS) Bis/Tris 4-12 % polyakryl-amidgradientgelelektroforese (PAGE) ved å anvende et MOPS-buffersystem (Novex).

Rensing av bscCD19xCD3 til homogenitet har behov for kationebytterkromatografi, koboltchelataffinitetskromatografi og, som sluttrinn, gelfiltrering. Disse rensningstrinn ble utført ved å anvende standard fremgangsmåter (se nedenfor). Et flytskjema av rens-ningsmetoden er vist i figur 10.

Kationebytterkromatografi: Overliggende cellekultur fra CHO-celler ble blandet med to volumer av buffer C (30 mM morfolinoetansulfonsyre [MES], 20 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,3 mM benzamidinhydroklorid, pH 5,5) og ført over en 70 ml-SP Sepharose Fast Flow-kationebytterkolonne (Pharmacia) ved en lav strømningshastighet på 20 ml/min. Kolonnen ble likevektsinnstilt med buffer A (20 mM MES, 20 mM NaCl, pH 5,8). Etter vasking med 5 kolonnevolumer av buffer A, bscCD19xCD3 ble eluert med en trinngradient på 45 % buffer B (20 mM MES, 1 M NaCl, pH 5,8) i buffer A. Eluatet ble tilsatt 0,045 volumer av 1 M Tris/HCl, pH 8,5, som inneholder 47 mM imidazol, og ble deretter sterilfiltrert (0,2 um; AcroCap). En typisk elueringsprofil av kationebytterkromatografien er vist i figur 2. BscCD19xCD3 befant seg i fraksjon 6. Koboltchelataffinitetsrensing: Eluatet fra kationebytterkolonnen ble ved en strømnings-hastighet på 2,5 ml/min ført over en 10 ml Chelaterende Sepharose Fast Flow-kolonne (Pharmacia) likevektsinnstilt i buffer AO (50 mM Na2HP04,400 mM NaCl, pH 8,0). Kolonnen var blitt likevektsinnstilt på forhånd med en løsning av 0,1 M koboltklorid. Etter vasking med 33 kolonnevolumer buffer AO, buffer A (50 mM Na2HP04,400 mM NaCl, 2 mM imidazol, pH 6,4) og en gradient fra 0-12 % buffer B (50 mM Na2HP04, 400 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 6,4) i buffer A, ble bscCD19xCD3 eluert i ett trinn ved hjelp av 30 ml av 100 % buffer B. Eluatet ble sterilfiltrert etterfulgt av ca. 10 gangers konsentrering i en MacroSep-anordning (Pall Gelman; 10 kD avslutning). En typisk elueringsprofil for koboltchelataffinitetskromatografien er vist i figur 13. BscCD19xCD3 ble påvist i fraksjon nr. 7.

Gelfiltrering: Det konsentrerte eluatet fra koboltchelataffinitetskolonnen ble tilsatt ved en strømningshastighet på 0,75 ml/min til en 124 ml High Load Superdex 200-kolonne (Pharmacia; analysekvalitet) likevektsinnstilt med fosfatbuffret saltløsning (Gibco). BscCD19xCD3 ble eluert i en fraksjon med en molekylstørrelse som tilsvarer ca. 55 kDa (figur 14, fraksjon nr. 7). Gelfiltreringsfraksjonen som inneholder bscCD19xCD3, ble tilsatt med 5 % humant serumalbumin (Behring), etterfulgt av steril-filtrering gjennom et 0,1 um filter (Millex; Millipore).

Mengden av bscCD19xCD3 i overliggende cellekulturvæske, og de forskjellige, aktive kolonnefraksjonene, som analysert ved hjelp av SDS-PAGE, er vist i figur 11. bscCD19xCD3 var det viktigste proteinbåndet påvist i overliggende cellekulturvæske (stripe 2). Sterkt renset anti-CD19xanti-CD3 som ble anvendt for humanterapi, viste ikke påvisbare forurensninger (figur 11, stripe 5).

Eksempel 7

Klinisk anvendelse av bscCD19xCD3 hos en pasient med B- cellelvmfoma

Ved praktisk anvendelse ble en pasient (A-B, kvinne, født 1937) som lider av B-celle-fremkalt, kronisk, lymfatisk leukemi (B-CLL), behandlet med det bispesifikke enkeltkjedeantistoffet bscCD19xCD3.

Pasienthistorie og logisk begrunnelse:

Pasienten er blitt diagnostisert med B-CLL i 1992. Ved tidspunktet for første diagnose hadde sykdommen påvirket forskjellige lymfekjertelområder og milten; i tillegg ble det observert hemolytisk anemi av autoimmun opprinnelse og en immunoglobulinmangel. Pasienten har en struma-nodosa som er godt kontrollert og i eutyreotisk tilstand ved behandling med karbimazol 2,5 mg/d.

Pasienten fikk flere perioder av kjemoterapi med klorambucil og prednison fra 1992 til 1994. Etter progresjon av sykdommen ble behandlingen forandret til syklofosfamid, doksorubicin, vinkristin og prednison (CHOP, 8 perioder) og det ble oppnådd en remi-sjon på mer enn ett år. Etter et nytt tilbakefall fikk pasienten ytterligere 6 perioder av CHOP, etterfulgt av klorambucil og prednison og en enkel kur med klorambucil alene som ikke ga noen forbedring av sykdommen. I desember 1998 ble det utført bestråling av milten for å kontrollere fremadskridende splenomegali hos pasienten. Pasienten fikk en kraftig benmargsdepresjon med flere infektiøse komplikasjoner. Hennes anemi og trombocytopeni hadde behov for hyppige transfusjoner av røde blodceller og blodplate-erstatning.

Pga. det sene trinnet av sykdommen og redusert benmargsfunksjon, ble det ikke indikert en mer aggressiv eller høydose-kjemoterapi for denne pasienten. Behandling med anti-CD20-antistoff-rituximab var ikke egnet siden virkningen av rituximab i B-CLL inntil nå, ikke var klart vist.

En FACS-analyse viste at 95 % av pasientens perifere blodceller var CD19-positive celler med 77 % av cellene uttrykt i CD20-antigenet. Inkubasjon av pasientens perifere blodceller med bscCD19xCD3 viste en tydelig deplesjon av CD19-positive B-celler (se eksempel 5). Legene bestemte seg derfor til å behandle pasienten med den nye bscCD19xCD3. Pasienten ble detaljert informert om nyheten av forbindelsen og om de potensielle risiki og fordeler ved denne behandling. Hun forstod fullt ut forklaringene og ga skriftlig meddelt samtykke til dette.

Beskrivelse av den kliniske administrering:

Før man starter med behandlingen ble pasienten underkastet klinisk undersøkelse og omfattende diagnostiske metoder for å verifisere hvor omfattende sykdommen var og for å utelukke ytterligere risikofaktorer. Pasienten var i temmelig god tilstand med anemitrombocytopeni og vekttap, men uten noen kardiovaskulær svekkelse eller andre komplikasjoner som forhindrer anvendelsen av bscCD19xCD3.1 løpet av natten før den første behandlingsdagen led pasienten av migrenehodepine. For administreringen av bscCD19xCD3 ble pasienten holdt i sykehusavdeling med intensivbehandling for å sikre hurtig behandling ved eventuelle krisetilstander som kan oppstå. For å forhindre eventuelle akutte, cytokine reaksjoner og komplikasjoner av tumorlysis, fikk pasienten profylaktisk IV-doser av 2 mg klemastin (Tavegil®) og 200 mg cimetidin (Tagamet®), så vel som 300 mg allopurinol og 20 mg omeprazol (Antra®).

Alkalisering og heparinisering ble utført i løpet av behandlingen og oppfølgingsperiod-ene. I tillegg fikk pasienten all nødvendig symptomatisk behandling.

Det ble tatt blodprøver før og etter administreringen av legemidlet for å følge biokjemiske, hematologiske og immunologiske parametere.

1. administrering avbscCD19xCD3 ( 14. april 1999):

Pasienten fikk en første dose på 3 ug bscCD19xCD3 som 20 min-infusjon i isotonisk fosfatbuffer som inneholder 5 % humant serumalbumin (HSA). Under infusjonen hadde ikke pasienten noen ugunstige virkninger. Ca. 1 time etter infusjonen hadde pasienten frysninger i ca. 5 min, etterfulgt av svetting, en moderat reduksjon av blodtrykk på ca. 10 mmHg og en moderat økning av kroppstemperaturen (+ 0,5 °C) i noen få timer. I tillegg ble hodepinen litt verre. Pasienten ble behandlet med 2 mg Tavegil® og 200 mg Tagamet®, 250 mg prednisolon (Solu-Decortin®) og 50 mg petidin (Dolantin®). Alle symptomer forsvant uten sekveler samme dag.

2. administrering avbscCD19xCD3 ( 15. april 1999):

En andre dose av 10 ug bscCD19xCD3 ble gitt én dag senere under de samme betingelser. Ca. 1 time etter infusjonen hadde pasienten merkbare frysninger, feber (39,2 °C), litt hyperventilasjon og en hypotensiv reaksjon. Pasienten ble behandlet med 2 mg Tavegil, 200 mg Tagamet og 300 mg Solu-Decortin og 15 mg piritramid (Dipidolor®). For stabiliseringen av hennes kardiovaskulære funksjon fikk pasienten en dopamin-infusjon og fikk volumsubstitusjon. Etter denne behandlingen avtok symptomene merkbart. Ikke desto mindre ble pasienten overført til hjerteavdelingen natten over for å sikre passende oppfølging av vitale tegn og umiddelbar intervensjon i tilfellet av krisesitua-sjon. Pasienten ble overført til vanlig avdeling den neste morgen uten å få noen ytterligere komplikasjoner.

I løpet av de neste tre dager fortsatte pasienten å ha subfebril temperatur (ca. 37,2 °C) og utviklet mindre pleural effusjon én dag senere den andre dosen (16. april 1999) og svakt ødem i de lavere ekstremiteter (18. april 1999). Kardiovaskulær funksjon forble stabil og laboratorieevalueringene viste ingen merkbar forandring med hensyn til sikkerhet, bortsett fra en økning av y-glutamyltransferase etter den andre doseringen av bscCD19xCD3 (figur 15).

Siden bscCD19xCD3 ble tolerert av pasienten og ugunstige virkninger kunne bli kontrollert med symptomatisk behandling, vil man fortsette administreringen av det nye bscCD19xCD3 til pasienten.

Klinisk og immunologisk virkning av bscCD19xCD3:

Kliniske resultater:

Ultralydundersøkelse av milten og fem abdominale og aksillære lymfekj eitler ble utført én dag og 4 dager etter administrering av den andre dosen av bscCD19xCD3. Allerede én dag etter 10 jag dosen (16. april 1999) viste lymfekj eitelen så vel som milten, en innskrumping til ca. 20 % sammenlignet med basislinjeevalueringen. Denne observasjon ble bekreftet i en andre ultralydevaluering 19. april 1999. Vekten av milten avtok med 350 g (fra 1 630 g ved basislinjen til 1 280 g 19. april 1999) (tabell 1; figur 16). Hematologiske resultater: Antallet av hvite blodceller som omfatter størsteparten maligne B-celler, avtok i løpet av behandlingen og oppfølgingsdagene (tabell 2; figur 17). Det C-reaktive protein (CRP) er et akutt fasereaksjonsprotein som avspeiler T-celleaktivering og virkningen av pro-inflammatoriske cytokiner. Det økte merkbart etter administreringen av 10 ug bscCD19xCD3, etterfulgt av en kontinuerlig reduksjon i løpet av de neste tre observa-sjonsdagene (tabell 2; figur 18).

Immunologiske resultater:

Nivået av serumcytokiner som avspeiler den akutte immunologiske responsen til administreringen til forbindelsen, ble målt før og ved forskjellige intervaller etter administrering av den nye forbindelsen. Serumnivåer av cytokiner og av den løselige IL-2-reseptor ble målt ved hjelp av en kvantitativ ELISA-analyse etter produsentens instruksjoner.

Tumornekrosefaktor TNF-a økte signifikant på en doseavhengig måte i løpet av den første timen etter administreringen av bscCD19xCD3 (figur 19). Interleukin 6 (IL-6) og interleukin 8 (IL-8) viste også en signifikant og doseavhengig økning. Deres maksi-mumsnivåer ble observert 2 til 4 timer etter administreringen av bscCD19xCD3 (figurene 20, 21). Alle cytokiner gikk tilbake til basislinjenivåer i løpet av noen få timer.

Den løselige IL-2-reseptoren var forhøyet allerede ved basislinjen som kan forklares ved den store mengde av maligne B-celler som uttrykker IL-2-reseptoren. Etter administrering av den nye bscCD19xCD3 ble det observert en økning av den løselige IL-2-reseptoren som indikerer en aktivering av effektorceller (figur 22).

Konklusjon:

Den nye bscCD19-CD3 ble administrert sikkert til en pasient som lider av refraktær B-CLL. Tolerabiliteten av bscCD19xCD3 ved doser på 3 ug og 10 ug, var akseptable og kunne kontrolleres godt ved hjelp av profylaktiske målinger og symptomatisk behandling.

Den nye bscCD19xCD3 forårsaket en innskrumping av den på forhånd forstørrede milten og lymfekjertlene til pasienten som vist i ultralydundersøkelsen. Siden forstørrelsen av milten og lymfekjertlene er forårsaket av infiltrasjonen av maligne B-celler, reflek-terer innskrumpingen ødeleggelsen av maligne B-celler som resultat av administreringen av bscCD19xCD3.

I skarp motsetning til et hvilket som helst annet kjent bispesifikt CD 19xCD3-antistoff utviser det bispesifikke CD19xCD3-antistoff ifølge oppfinnelsen, klinisk virkning i B-celle-fremkalt ikke-Hodgkin-lymfom, målt som innskrumping av lymfoide organer in-filtrert av maligne B-celler. bscCD19xCD3 viser seg med fordel å være klinisk virksomme ved overraskende lave doseringer som tolereres godt etter systemisk administrering. Den kliniske virkning av bscCD19xCD3 bekrefter således dens eksepsjonelle cytotoksiske aktivitet som bestemt in vitro.

Størrelsene av tre abdominale lymfekj ertler, én venstre og én høyre aksillær lymfekj ert-el og av milten, ble bestemt og målt ved hjelp av sonografi ved anvendelse av et Toshiba SSAlOO-apparat. Størrelsene er gitt i tre dimensjoner og i mm. Vekten av milten ble beregnet ut fra dens størrelse og ultralyddensitet.

Blodnivåer av gamma-glutamyltransferase (GGT), laktatdehydrogenase (LDH) og C-reaktivt protein (CRP) ble bestemt ved standard kliniske, biokjemiske fremgangsmåter og er uttrykt som enheter/ml (GGT), enheter/l (LDH) og mg/dl (CRP). Antall leukocytter er uttrykt som Giga-punkter/1, og lymfocyttantallet er angitt som prosent av totale leukocytter. Basislinjenivåene den 14. april 1999 før behandling, er angitt i første stripe. Responsen til 3 ug bscCD19xCD3 den 15. april (som ble administrert den 14. april) er vist i den andre stripen. Responsen til den andre behandling med 10 ug forbindelse den samme dagen, er vist i den tredje stripen. Blodnivåer av de selekterte markørene fire dager etter legemiddelbehandlingene, er angitt i de siste fire stripene.

Litteraturhenvisninger

1. Mack, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92 (1995), 7021 -5

2. Gianni, N Engl. J. Med. 336 (1997), 1290-7

3. Urba, J. Nati. Cancer Inst. Monogr. (1990), 29-37

4. Fisher, Cancer (1994)

5. Bohlen, Blood 82 (1993), 1803-121

6. Bohlen, Cancer Res 53 (1993), 18:4310-4.

7. Bohlen, Cancer Res 57 (1997), 1704-9.

8. Haagen, Clin Exp Immunol 90 (1992), 368-75.

9. Haagen, Cancer Immunol Immunother. 39 (1994), 391-6. 10. Haagen, Blood 84 (1994), 556-63. 11. Haagen, Blood 85 (1995), 3208-12.

12. Weiner, Leuk Lymphoma 16 (1995), 199-207.

13. Csoka, Leukemia 10 (1996), 1765-72. 14. Uckun, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85 (1988), 8603-7. 15. Staerz, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83 (1986), 1453-7.

16. Lanzavecchia, Eur J Immunol 17 (1987), 105-11.

17. Mailender, J Biol Chem 269 (1994), 199-206.

18. Gruber, J Immunol 152 (1994), 5368-74.

19. Kostelny, J Immunol 148 (1992), 1547-53.

20. Mack, J Immunol 158 (1997), 3965-70. 21. Kufer, Cancer Immunol Immunother 45 (1997), 193-7.

22. Pezzutto, J Immunol 138 (1987), 2793-9.

23. Orlandi, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86 (1989), 3833-7.

24. Dubel, J Immunol Methods 175 (1994), 89-95.

25. Traunecker, Embo J 10 (1991), 3655-9.

26. Laemmli, Nature 227 (1970), 680-5.

27. Bohlen, J Immunol Methods 173 (1994), 55-62.

28. Demanet, Int J Cancer Suppl 7 (1992), 67-8.

29. De, J Hematother 4 (1995), 433-7.

30. Haagen, Leuk Lymphoma 19 (1995), 381-93.

31. Anderson, Blood 80 (1992), 2826-34.

32. Zhu, Int J Cancer 62 (1995), 319-24.

33. Hartmann, Blood 89(1997), 2042-7.

34. Valone, J Clin Oncol 13 (1995), 2281-92.

35. Valone, J Hematother 4 (1995), 471-5.

36. Bolhuis, Int J Cancer Suppl 7 (1992), 78-81. 37. Canevari, J Nati Cancer Inst 87 (1995), 1463-9. 38. Nitta, Lancet 335 (1990), 368-71.

39. Yokota, Cancer Res 52 (1992), 3402-8.

40. Weiner, J Immunol 152 (1994), 2385-92. 41. Maloney, Blood 84 (1994), 2457-66. 42. Reff, Blood 83 (1994), 435-45. 43. Kipriyanov, Int. J. Cancer 77 (1998), 763-772.

Claims

1. Et enkeltkjedet, multifunksjonelt polypeptid, karakterisert ved at det omfatter: (a) et første domene som omfatter et første bindingssete av en immunoglobulinkjede eller et antistoff som spesifikt gjenkjenner CD19-antigenet; og (b) et andre domene som omfatter et bindingssete av en immunoglobulinkjede eller et antistoff som spesifikt gjenkjenner CD3-antigenet på humane T-celler, hvori nevnte domener er arrangert i følgende rekkefølge VlCD19-VhCD19-VhCD3-VLCD3.

2. Polypeptid som angitt i krav 1, karakterisert ved at de to domenene er linket sammen med en polypeptidlinker.

3. Polypeptid som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert v e d at det første og/eller andre domenet etterligner eller tilsvarer en Vh- og Vl-område fra et naturlig antistoff.

4. Polypeptid som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at antistoffet er et monoklonalt antistoff, et syntetisk antistoff eller et humanisert antistoff.

5. Polypeptid som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at minst ett av domenene er et enkeltkjedefragment av det variable området av antistoffet.

6. Polypeptid som angitt i hvilket som helst av kravene 2 til 5, karakterisert ved at polypeptidlinkeren omfatter et stort antall av glysin-, alanin- og/eller serinrester.

7. Polypeptid som angitt i hvilket som helst av kravene 2 til 6, karakterisert ved at polypeptidlinkeren omfatter et stort antall av etterfølgende kopier av en aminosyresekvens.

8. Polypeptid som angitt i hvilket som helst av kravene 2 til 7, karakterisert ved at polypeptidlinkeren omfatter 1 til 5 aminosyrerester.

9. Polypeptid som angitt i hvilket som helst av kravene 2 til 8, karakterisert ved at polypeptidlinkeren omfatter aminosyresekvensen Gly Gly Gly Gly Ser.

10. Polypeptid som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 9, karakterisert ved at det første domenet omfatter minst ett CDR av Vh- og VL-området som omfatter aminosyresekvensen som kodes av DNA-sekvensen ifølge SEK ID NO:9 fra nukleotider 82 til 414 (VL) og nukleotider 460 til 831 (VH) og/eller hvor det andre domenet omfatter minst ett CDR av VH- og VL-området som omfatter aminosyresekvensen som kodes av DNA-sekvensen ifølge SEK ID NO:9 fra nukleotider 847 til 1203 (VH) og nukleotider 1258 til 1575 (VL).

11. Polypeptid som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 10, karakterisert ved at (a) nevnte bindingssete til det første domenet har en affinitet på minst ca. 10"<7> M; og/eller (b) nevnte bindingssete til det andre domenet har en affinitet på mindre enn ca. 10" <7>M.

12. Polypeptid som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 11, karakterisert ved at det er et bispesifikt enkeltkjedeantistoff.

13. Polypeptid som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 12, karakterisert ved at det omfatter minst ett ytterligere domene.

14. Polypeptid som angitt i krav 13, karakterisert ved at nevnte ytterligere domene er linket med kovalente eller ikke-kovalente bindinger.

15. Polypeptid som angitt i krav 13 eller 14, karakterisert v e d at minst ett ytterligere domene omfatter et effektormolekyl som har en konformasjon som er egnet for biologisk aktivitet, er i stand til å kompleksbinde et ion eller selektivt binde seg til en fast bærer eller til en på forhånd valgt determinant.

16. Polynukleotid, karakterisert ved at det ved ekspresjon koder for et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 15.

17. Vektor, karakterisert ved at den omfatter polynukleotidet i krav 16.

18. Celle, karakterisert ved at den er transfektert med polynukleotidet i krav 16 eller vektoren i krav 17.

19. Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptidet i hvilket som helst av kravene 1 til 15, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter å dyrke en celle angitt i krav 18 og å isolere polypeptidet fra kulturen.

20. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter polypeptidet i hvilket som helst av kravene 1 til 15, polynukleotidet i krav 16 eller vektoren i krav 17.

21. Sammensetning som angitt i krav 20, karakterisert v e d at det er et farmasøytisk preparat som eventuelt ytterligere omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer.

22. Sammensetning som angitt i krav 20, karakterisert v e d at den er en diagnostisk sammensetning som eventuelt ytterligere omfatter egnede midler for deteksjon.

23. Anvendelse av polypeptidet i hvilket som helst av kravene 1 til 15, polynukleotidet i krav 16 eller vektoren i krav 17, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandlingen av B-cellemaligniteter, B-cellemedierte autoimmune sykdommer eller deplesjonen av B-celler.

24. Anvendelse som angitt i krav 23, hvor nevnte B-cellemaligniteten er B-celle lymfom, ikke-Hodgkin-lymfom eller B-celle avledet kronisk lymfatisk leukemi (B-CLL).

25. Anvendelse som angitt i krav 23, hvor nevnte B-cellemedierte autoimmune sykdom er Myastenia gravis, Morbus Basedow, Hashimoto tyreoiditis eller Goodpasture syndrom.

26. Anvendelse av polypeptidet i hvilket som helst av kravene 1 til 15, polynukleotidet i krav 16 eller vektoren i krav 17, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for å forsinke en patologisk tilstand som er forårsaket av B-celle lidelser.

27. Anvendelse av polynukleotid som angitt i krav 16 eller vektoren i krav 17, for fremstilling av preparater for genterapi.

28. Fremgangsmåte for å identifisere aktivatorer eller inhibitorer av T-celle-aktivering eller stimulering, karakterisert ved at den omfatter (a) å dyrke T-celler og CD19-positive celler, fortrinnsvis B-celler, i nærvær av et polypeptid som er angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 15, og eventuelt i nærvær av en komponent som er i stand til å tilveiebringe et påvisbart signal i respons til T-celleaktivering med en forbindelse som skal screenes under betingelser som tillater aktivering av T-cellen, og (b) å påvise tilstedeværelsen eller fraværet av signalet som er frembrakt fra interaksjonen av forbindelsen med cellene.