CN110623921B

CN110623921B - 一种抗cd3和抗cd19的双特异性抗体注射制剂

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Publication number: CN110623921B
Application number: CN201910752831.7A
Authority: CN
Inventors: 白义; 孙宇石; 李春菊
Original assignee: Beijing Dongfang Baitai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Dongfang Baitai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-08-15
Filing date: 2019-08-15
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2039-08-15
Also published as: CN110623921A

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体提供了一种抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂，包括药效分子和注射液，药效分子为抗CD3和抗CD19双特异性抗体，注射液包括：缓冲盐、等渗透调节剂、表面活性剂。本发明保留了抗CD19抗体和抗CD3抗体的生物学活性，更好的识别肿瘤细胞和效应细胞，并将效应细胞靶向到肿瘤细胞，达到特异性杀伤作用，杀伤能力更高；单链单元的轻链和重链通过连接子linker连接，避免了双特异抗体中轻重链之间的错配；注射液中加入表面活性剂、溶液缓冲剂、渗透压调节剂相互作用，协同配合，为双抗提供了良好的存储环境，有效降低制剂中抗体聚集物的生成速率，提高抗体的物理稳定性，降低潜在的安全性风险。

Description

一种抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂。

背景技术

淋巴瘤是来源淋巴造血***的恶性肿瘤，在常见肿瘤中排名第七位，在所有肿瘤中占3-4％。它包括两大类：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。在美国霍奇金淋巴瘤的5年生存率是85％，非霍奇金淋巴瘤是69％，在中国，非霍奇金淋巴瘤以每年5％的速度增长，发病率从上世纪的2/10万上升为6.43/10万，而2012 年全球有近60万新发病例，同时有约30万病人死亡。根据淋巴瘤的不同亚型，制定有效的治疗方案是刻不容缓的。随着对淋巴瘤生物学特征的不断研究，分子靶向药物的应用有效的提髙了患者的5年生存率。因此，寻找新的肿瘤标志物，研究其在淋巴瘤中的机制有至关重要的意义。

随着生物药的不断发展，治疗性抗体已经成为癌症、自身免疫、炎症和各种其他疾病患者的主要选择药物。然而，单克隆抗体有其局限性，这些抗体所针对的都是单一的靶标，很多患者不能充分响应单一的疗法，病人可能产生耐药性或无应答。癌症和其他疾病是多因素疾病，有多种信号通路参与疾病发生。单一靶点的免疫疗法似乎并不足以推毁癌细胞。双特异性抗体(bispecific antibody， BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能够特异性识别和结合两个不同的抗原或抗原表位，其可以在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能，将特定的免疫细胞重新定向至肿瘤细胞以增强对肿瘤的杀伤力，或者同时阻断两种不同介质/通路而发挥独特的或重叠的功能。

目前，世界范围内经批准上市的双特异性抗体产品只有三个，一个是TrionPharma公司开发的catumaxomab，其能够靶向肿瘤表面抗原EpCAM和T 细胞表面受体CD3，另一个是Micromet公司和Amgen公司开发的Blinatumomab，可以同时结合CD19和CD3，最后一个是基因泰克公司开发的Emicizumab，可以同时结合凝血因子IXa和凝血因子X。前两者都是通过激活并召集杀伤性T细胞，从而达到***的目的，但是Blinatumomab药物中药效分子的半衰期较短，而且制剂为冻干粉制剂，冻干制剂的工艺复杂且难于控制，稳定性差，容易使抗体形成聚合体而失去活性，此外，冻干制剂消耗时间长，需配置冻干设备，增加车间占地面积和生产人员数量，导致生产费用昂贵。此外，冻干粉每次给药前须重悬，使用麻烦，且冻干后蛋白活性无法保证。因此，目前迫切需要一种能够同时结合免疫T细胞上的CD3抗原和肿瘤细胞上的CD19抗原，同时药物分子的半衰期时间长，保存期长，能够保证药物长期保存过程中药物质量、制剂工艺安全可靠、配方简单、注射方便的抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂及制备方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明公开了一种药物分子具有较高亲和力，半衰期长，而且制剂长期稳定，使用方便、生产成本较低的抗CD3和抗 CD19的双特异性抗体注射制剂。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供了一种抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂，所述制剂包括药效分子和注射液，所述药效分子为蛋白含量为0.01-10mg/ml的抗CD3和抗 CD19双特异性抗体，所述注射液包括以下含量的成分：

缓冲盐 5-100mM；

等渗透调节剂 20-300mM；

表面活性剂 0.005-0.2％(w/v)；

其中，所述注射液的pH值为5.0－6.5。

本发明提供的抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂除了考虑到药物的有效性，还注意到质量控制方面产品的特性分析和相似性、同质性，在需要的药物浓度下，制剂及稳定性等方面原因，本发明通过注射液中缓冲盐、等渗透调节剂和表面活性剂的相互作用，协同配合，通过大量多次的实验摸索，筛选出不同成分的特定含量范围，为抗CD3和抗CD19双特异性抗体提供了良好的存储环境，在长期的贮存和运输过程中，能有效降低制剂中抗体的聚集物的生成速率，提高抗体的物理稳定性，降低潜在的安全性风险，有效保证制剂长期稳定性。

进一步的，所述抗CD3和抗CD19双特异性抗体包括能够与CD3抗原特异性结合的单链单元和能够与CD19抗原特异性结合的单价单元，所述单链单元和所述单价单元均包括轻链和重链，所述单链单元的所述轻链C末端通过连接子 linker与其所述重链N末端连接；所述重链包括重链可变区和重链恒定区，所述轻链包括轻链可变区和轻链恒定区。

本发明提供的双特异抗体能够特异性结合T细胞表面抗原分化簇3即CD3 分子和肿瘤表面抗原分化簇19即CD19分子，抗CD19抗体采用完整的抗体轻重链结合型式，保持了抗CD19抗体的生物学活性，抗CD3的抗体轻链C末端通过连接子linker与重链N末端连接，保持了抗体与CD3抗原的结合能力，同时避免了抗CD19抗体和抗CD3抗体的轻链与重链之间的错配；通过本发明的双特异性抗体更好的识别两种不同的靶抗原，从而发挥激活免疫细胞，并将免疫细胞靶向到肿瘤细胞，提高局部免疫细胞浓度，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。最后，本发明中的单链单元和单价单元均包括完整的轻链和重链，保留了Fc片段，能够有效延长药效分子的半衰期。

进一步的，所述连接子linker的氨基酸序列为(GGGGX)n，其中，所述X 为Gly或Ser，所述n为1-6的自然数；

优选的，所述X为Ser；

优选的，所述n为6。

本发明为了避免抗CD3抗体轻重链和抗CD19抗体轻重链的错配，通过连接子linker的特殊结构设计将抗CD3抗体轻重链进行连接，保证了分子结构的稳定性。经过大量实验验证，当X为Ser，n为6时，稳定性最好。

进一步的，所述单链单元的所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；所述单链单元的所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；

所述单价单元的所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；所述单价单元的所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

进一步的，所述单链单元的所述重链恒定区和所述单价单元的所述重链恒定区均为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的一种；

优选的，所述单链单元的所述重链恒定区和所述单价单元的所述重链恒定区均为IgG4。

本发明进一步限定了单价单元和单链单元的链恒定区，保留了Fc片段，有效延长了药物中药效分子的半衰期。

进一步的，所述单链单元和所述单价单元均含有修饰的CH3结构域，所述 CH3结构域的修饰为非对称的杵臼结构。

本发明通过含有修饰的CH3结构域连接形成的异源二聚体结构非常稳定，并且很难形成同源二聚体。

进一步的，所述缓冲盐包括柠檬酸钠、L-组氨酸盐酸盐和乙酸钠中的一种或多种组合；

优选的，所述缓冲盐在所述制剂中的含量为10-20mM。

缓冲盐主要是用于调节注射液的pH值，同时能够为抗体提供适宜的存储环境，本发明选择柠檬酸钠、L-组氨酸盐酸盐和乙酸钠中的一种或多种能够保证药效成分的稳定。

进一步的，所述等渗透调节剂包括蛋白保护剂和稳定剂中一种或两种组合，所述蛋白保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖中的一种或多种组合，所述稳定剂包括精氨酸盐酸盐、甘氨酸、脯氨酸中的一种或多种组合；

优选的，所述等渗透调节剂还包括氯化钠，所述氯化钠与所述蛋白保护剂和所述稳定剂的含量比均为1:2；

优选的，所述等渗透调节剂在所述制剂中的含量为50-200mM。

等渗透调节剂能够调节注射液的渗透压，为了能够满足药效分子中双特异抗体的要求，本发明选择氯化钠、蔗糖、甘露醇、海藻糖、精氨酸盐酸盐、甘氨酸、脯氨酸中的一种或多种组合，能够保证制剂的稳定性。

进一步的，所述表面活性剂包括聚山梨醇酯20和/或聚山梨醇酯80；

优选的，所述表面活性剂在所述制剂中的含量为0.01-0.02％(w/v)。

本发明中选择的表面活性剂能够保证注射液中药效分子的活性，表面活性剂的使用能够起到对注射液内药效分子的分散作用，本发明中选择聚山梨醇酯20 和/或聚山梨醇酯80，且含量为0.01-0.02％(w/v)，能够使分散性较好，表面活性剂含量太低起不到分散作用，含量太高可能产生副作用，影响制剂输注的安全性。

本发明还提供了一种抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂在制备治疗 B淋巴细胞***恶性肿瘤疾病中的药物中的应用。

本发明的有益效果如下：本发明中药效分子为双特异性抗体，该抗体能够特异性结合T细胞表面抗原分化簇3即CD3分子和肿瘤表面抗原分化簇19即CD19 分子，完整的保留了抗CD19抗体和抗CD3抗体的生物学活性，从而使该双特异性抗体更好的识别肿瘤抗原和效应细胞，并将免疫细胞靶向到肿瘤细胞，达到特异性杀伤作用，杀伤能力更强，此外，本发明还完整的保留了Fc片段，能够有效延长药物分子的半衰期，提高了抗体的溶解性和稳定性，同时抗CD3抗体的单链单元的轻链和重链通过连接子linker进行连接的重链，有效避免了抗CD3 抗体和抗CD19抗体大分子结构的轻重链之间直接的错配，解决了纯化过程中的难点，为双特异抗体后期的放大生产提供了坚实的基础；

本发明的注射液中通过加入表面活性剂、溶液缓冲剂、渗透压调节剂相互作用，协同配合，为抗CD3和抗CD19双特异抗体提供了良好的存储环境，在贮存和运输过程中，能有效降低制剂中抗体的聚集物的生成速率，提高抗体的物理稳定性，降低潜在的安全性风险；另外，与冻干制剂相比，本发明提供的双特异性抗体注射制剂，具有制备工艺简单，成本低廉，无需特殊设备和苛刻条件，易于实现规模化生产等优点，具有较强的实用价值，相对于现有技术具有显著性进步，目前市场上缺乏较为稳定的抗CD3和抗CD19双特异抗体的制剂。

附图说明

图1为本发明提供的一种抗CD3和抗CD19双特异性抗体的分子结构示意图；

图2为本发明实施例30中PTSE–antiCD19H的质粒载体图谱；

图3为本发明实施例30中PTSE–antiCD19L的质粒载体图谱；

图4为本发明实施例30中PTSE-antiCD3的质粒载体图谱；

图5为本发明实施例31中纯化后的双特异抗体SDS-PAGE电泳图；

图6为本发明实验一中双特异抗体与Raji细胞的结合能力图；

图7为本发明实验一中双特异抗体与Jukart细胞的结合能力图；

图8为本发明实验二中双特异抗体介导的PBMC对Raji细胞的杀伤能力图。

具体实施方式

下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1-9

本发明实施例1-9分别提供了一种抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂，制剂包括药效分子和注射液，药效分子为蛋白含量为2mg/ml的抗CD3和抗 CD19双特异性抗体；

抗CD3和抗CD19双特异性抗体包括能够与CD3抗原特异性结合的单链单元和能够与CD19抗原特异性结合的单价单元，单链单元和单价单元均包括轻链和重链，单链单元的轻链C末端通过连接子linker与其重链N末端连接；重链包括重链可变区和重链恒定区，轻链包括轻链可变区和轻链恒定区。

连接子linker的氨基酸序列为(GGGGX)n，其中，X为Gly或Ser，n 为1-6的自然数；

优选的，X为Ser；

优选的，n为6。

单链单元的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；单链单元的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；

SEQ ID NO:1(单链单元的重链可变区的氨基酸序列)

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGY INPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHY CLDYWGQGTTLTVSS；

SEQ ID NO:2(单链单元的轻链可变区的氨基酸序列)

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTS KVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK 。

单价单元的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；单价单元的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

SEQ ID NO:3(单价单元的重链可变区的氨基酸序列)

QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQ IWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTV GRYYYAMDYWGQGTTVTVSS；

SEQ ID NO:4(单价单元的轻链可变区的氨基酸序列)

DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIY DASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKL EIK。

单链单元的重链恒定区和单价单元的重链恒定区均为IgG1、IgG2、IgG3或 IgG4中的一种；优选的，单链单元的重链恒定区和单价单元的重链恒定区均为 IgG4。

单链单元和单价单元均含有修饰的CH3结构域，CH3结构域的修饰为非对称的杵臼结构。

实施例1-9提供的制剂中注射液含有的成分及含量如表1所示。

表1实施例1-9注射液中各成分含量

实施例10-20

本发明实施例10-20分别提供了一种抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂，制剂包括药效分子和注射液，药效分子为蛋白含量为1.2mg/ml的抗CD3 和抗CD19双特异性抗体；

连接子linker的氨基酸序列为(GGGGS)₆。

单链单元的重链恒定区和单价单元的重链恒定区均为IgG4。

实施例10-20提供的制剂中注射液含有的成分及含量如表2所示。

表2实施例10-20注射液中各成分含量

实施例21-28

本发明实施例21-28分别提供了一种抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂，制剂包括药效分子和注射液，药效分子为蛋白含量为5mg/ml的抗CD3和抗CD19双特异性抗体；

连接子linker的氨基酸序列为(GGGGS)₆。

单链单元的重链恒定区和所述单价单元的所述重链恒定区均为IgG4。

实施例21-28提供的制剂中注射液含有的成分及含量如表3所示。

表3实施例21-28注射液中各成分含量

实施例29

本发明实施例29提供了一种抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂在制备治疗B淋巴细胞***恶性肿瘤疾病中的药物中的应用。

实施例30、双特异抗体分子表达载体的构建

按照实施例1-28任一实施例并参考图1中双特异抗体的结构形式设计相应的基因序列，选择pTSE作为表达载体，抗体基因由中美泰和生物技术(北京) 有限公司合成，基因合成时在抗CD19的抗体轻链、抗CD19的抗体重链和抗CD3 单链基因的两侧引入Sall、BamHI酶切位点，然后对pTSE表达载体和合成的基因均进行Sall、BamHI双酶切，并将载体和基因的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳和目的片段回收，最后将回收的目的片段分别连接到pTSE表达载体中，转化到TOP感受态(汇天东方，货号HT702-03)，测序正确后得到含有轻链、重链及单链基因的表达载体(如图2-4所示)，质粒分别命名为：pTSE–antiCD19L、pTSE –antiCD19H、pTSE-antiCD3。利用无内毒素大提试剂盒(康为世纪，CW2104) 进行质粒大提，具体操作步骤按照试剂盒提供的说明书进行操作，最终测定质粒浓度后，于-20℃保存质粒。

实施例31、双特异抗体分子的表达与纯化

1)、双特异抗体的表达

人胚肾细胞(HEK293ES悬浮细胞)在FreeStyle 293Expression Medium (Gibco)中培养，细胞每隔一到两天传代一次，传代后细胞起始密度维持在 0.2-0.6×10⁶个细胞/ml，细胞培养体积为摇瓶容积的15-35％，细胞培养瓶放在摇床(摇床转速:135rpm，温度:37℃，CO₂:5％)中培养。转染前一天，将处于对数生长期，生长状态良好的HEK293ES细胞，传代到细胞密度为0.5×10⁶个细胞/ml，放置摇床(135rpm，37℃，5％CO₂)培养过夜，待第二天进行转染。

转染前将准备好的1×10⁶个细胞/ml细胞悬液在摇床(135rpm，39℃，5％CO₂) 培养2h，转染时，依次加入pTSE–antiCD19L(终浓度0.3μg/ml)、pTSE– antiCD19H(终浓度0.3μg/ml)、pTSE-antiCD3(终浓度0.3μg/ml)、聚乙烯亚胺 PEI(终浓度2μg/ml)，混匀，一起共转染到HEK293ES悬浮细胞中，之后，置于摇床(135rpm，39℃，5％CO₂)培养40min。转染后的细胞继续在135rpm，37℃， 5％CO₂摇床中培养，表达抗CD3和CD19的双特异抗体。转染96小时后离心收获上清液体。

2)、双特异抗体的纯化

上清液体用0.22uM滤膜过滤，利用亲和层析柱从表达上清中获得带有Fc结构域的抗体。平衡缓冲液和洗脱缓冲液分别为50mM Tris-HCl、0.15M NaCl pH7.0 和0.1M柠檬酸-柠檬酸钠pH3.0。通过阳离子交换柱HiTrap-SPFF获得目标双特异抗体(JY039)，最后用PBS缓冲液进行换液浓缩。纯化后的双特异分子还原SDS-PAGE图如图5所示，右边为双特异抗体，从上至下依次为抗CD3、抗CD19 的抗体重链、抗CD19的轻链，左侧是蛋白质分子量Marker；结果显示所纯化的双特异抗体含有抗CD3的单链单元、抗CD19抗体的重链和抗CD19的轻链，且每条带的分子量大小与理论一致。

对照例1

本发明对照例1在实施例1的基础上，进一步限定了缓冲盐为10mM磷酸钠和10mM柠檬酸钠的混合，其他成分全部相同。

对照例2

本发明对照例2在实施例17的基础上，进一步限定了等渗透调节剂为50mM 氯化钠、50mM精氨酸盐酸盐和50mM果糖的混合，其他成分全部相同。

对照例3

本发明对照例3在实施例23的基础上，进一步限定了表面活性剂为浓度 0.01％(w/v)的聚山梨醇酯80和0.01％(w/v)的聚山梨醇酯40的混合，其他成分全部相同。

实验一、双特异抗体分子与过表达CD19或CD3细胞结合情况

本发明提供的实验采用过表达的淋巴瘤细胞系Raji(购自ATCC，CCL-86) 作为CD19阳性的细胞；采用过表达的T细胞系Jurkat(Jurkat，TIB-152)作为 CD3阳性的细胞，用人的IgG(hIgG)作为同型对照。

1.利用流式分析法检测双特异性抗体与Raji细胞的结合活性。

采用过表达CD19的淋巴瘤细胞系(Raji)来检测双特异抗体与细胞表面CD19 的结合情况，将JY039的抗CD19序列构建单克隆抗体，用此抗CD19的单克隆抗体以及专利CN105531374 A中的v5851双特异抗体、CN 106062206 A中的 v1661双特异抗体与本发明实施例31纯化得到的双特异抗体JY039进行比较，采用步骤如下：

培养足够的Raji细胞，离心收集细胞。同时稀释各种抗体，浓度从1μM开始，5倍梯度稀释，得到12个浓度梯度，备用。将收集的细胞用PBS+1％FBS 洗三遍，再加PBS+1％FBS重悬细胞至4×10⁶个细胞/ml，然后铺细胞于96孔板中，每孔50ul(2×10⁵个细胞)，加入50ul稀释好的双特异抗体，4℃孵育1小时；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，再用稀释好的Alexa488标记的抗人IgG-Fc 抗体(Biolegend，409304)重悬细胞，室温避光孵育30分钟，PBS洗三遍，， 100ulPBS重悬，用流式细胞仪检测荧光强度，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism5.0进行计算各抗体与Raji细胞的结合亲和力，计算对应的EC50 值，具体数据如下：

项目	JY039	v5851	v1661	AntiCD19McAb	hIgG
						EC50(nM)	1.023	2.486	7.923	0.1910	—

通过上述数据及如图6所示，以非相关抗体同型人IgG(hIgG)做阴性对照，本发明实施例31纯化得到的抗CD3和抗CD19双特异性抗体JY039与CD19阳性的Raji细胞结合活性比抗CD19单克隆抗体与CD19阳性的Raji细胞结合活性稍弱，本发明JY039双特异抗体与Raji细胞的结合活性与专利CN 105531374 A 中的v5851双特异抗体与Raji细胞的结合活性相当，但是本发明JY039比CN 106062206 A中的v1661双特异抗体的活性强。证明本发明提供的双特异性抗体 JY039较好的保持了其母本抗体特异性结合细胞表面CD19活性。

2.流式分析法检测双特异性抗体与Jurkat细胞的结合活性

采用过表达CD3的T细胞系(Jurkat)来检测双特异抗体与细胞表面CD3 的结合情况，将JY039的抗CD3序列构建单克隆抗体，用此抗CD3的单克隆抗体以及专利CN 105531374A中的v5851双特异抗体、CN 106062206 A中的v1661 双特异抗体与本发明实施例31纯化得到的双特异抗体JY039进行比较，采用步骤如下：

培养足够的Jurkat悬浮细胞，离心收集细胞。同时稀释各种抗体，浓度从5 μM开始，5倍梯度稀释，得到12个浓度梯度，备用。接下来的实验过程与上述实施例相同，将100μlPBS重悬的细胞，上机检测，以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism5.0进行分析计算双抗体与Jurkat细胞的结合亲和力，计算对应的EC50值，具体数据如下：

项目	JY039	v5851	v1661	AntiCD3McAb	hIgG
						EC50(nM)	21.57	59.84	117.9	8.560	—

通过上述数据及如图7所示，以非相关抗体同型人IgG(hIgG)做阴性对照，本发明实施例31得到的JY039双特异性抗体与CD3阳性的Jurkat细胞的结合活性比抗CD3的单克隆抗体与CD3阳性的Jurkat细胞的结合活性稍弱，但是JY039 双特异性抗体与CD3阳性的Jurkat细胞的结合活性比专利CN105531374A中的v5851双特异抗体和CN 106062206A中的v1661双特异抗体与CD3阳性的Jurkat 细胞的结合活性强，而同型对照(hIgG)则没有结合，所以本发明提供的双特异性抗体JY039较好的保持了其母本抗体特异性结合细胞表面CD3活性。

实验二、双特异抗体分子介导的PBMC对Raji细胞的杀伤作用

a).PBMC分离

取四只SepMate分离管，使用移液管加入约15mL人单个核细胞分离液，避免气泡产生，液面应刚好没过管中托架；将全血小心转移至两个50mL离心管中，每管25mL，各加入25mLPBS混匀；沿管壁将1:1稀释后的全血缓缓加入到 SepMate分离管中，不得破坏液体分层；1200g离心10分钟；使用移液管吸取托架上方的PBMC层，转移至新的50mL离心管中，使用PBS补齐体积至50mL， 1200g离心10分钟；弃上清，加入25mLPBS重悬，1200g离心10分钟；弃上清，加入2mL红细胞裂解液，室温孵育5分钟，加入约20mLPBS，1200g离心10分钟；重悬，使用40μm细胞筛去除大块细胞团。细胞台盼蓝计数并记录PBMC总量。

b).LDH检测

以在1640培养基(Gibico，A10491-01)+10％FBS(VisTech,SE200-ES)， 37℃，5％CO₂培养箱培养的Raji作为靶细胞，接种密度均为1×10⁴/孔，将相应细胞稀释至1×10⁵/mL，每孔加入100μL细胞悬液；分离得到的PBMC作为效应细胞时，效靶比采用25:1，将PBMC稀释至5×10⁶/mL，每孔加入50μL细胞悬液；在实验孔内加入梯度浓度的抗体药物，初始浓度0.1μM，5倍梯度稀释，12 个梯度，每孔加入50μL抗体稀释样品；另外设置背景组(靶细胞+效应细胞)，混合最大组(靶细胞+效应细胞)，37℃，5％CO₂培养箱培养培养18h后，向混合最大孔内加入20μL Lysis裂解液，37℃孵育90分钟；以3000rpm离心5分钟后，取50μL上清液，加50μL LDH底物；室温避光孵育20分钟，490nm处检测吸光度，同时计算对应的EC50值，数据如下：

细胞杀伤率(％)＝(实验孔-背景孔)/(混合最大孔-背景孔)×100；

项目

JY039

v1661

v5851

AntiCD19McAb

AntiCD3McAb

hIgG

EC50(uM)

1.26E-6

9.24E-5

3.00E-5

2.22E-4

—

通过上述数据及结果如图8所示，本发明实施例31纯化得到的JY039双特异性抗体对靶细胞的杀伤能力明显优于专利CN 105531374 A和CN 106062206 A 的双特异抗体(v5851、v1661)，更明显地优于CD19单克隆抗体和CD3单克隆抗体，证明本发明提供的JY039双特异性抗体在保持了其与过表达CD19的淋巴瘤细胞系(Raji)及其与表达CD3的T细胞系(Jurkat)的结合能力的基础上，杀伤效果明显。

经上述实施例证明，本发明的双特异性抗体在保持原有抗CD19抗体和抗 CD3抗体体内生物学活性的同时，通过靶向免疫效应细胞到肿瘤细胞，从而增加了免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞的效果。本发明的双特异性抗体为单链单元-单价单元形式，相较于ScFv，CH1和CL的存在能够帮助VH和VL形成稳定的结构，因此，单链单元-单价单元比ScFv形式在结构上更加稳定。本发明的单价单元与单链单元之间通过IgG4的CH3/CH3界面引入非对称异二聚体突变设计，进行连接，该结构相对与常用的KiH结构不同，形成的异源二聚体更加稳定，并且更难形成同源二聚体。本发明的双特异性抗体可用于制备非正常表达的B淋巴细胞相关疾病和肿瘤相关疾病的治疗药物，肿瘤相关疾病为CD19抗原阳性的B细胞恶性肿瘤。

实验三、稳定性实验测试

抗体制剂制备方法：通过超滤管将实施例31中分离纯化好的JY039抗CD3 和抗CD19双特异性抗体换液至目的注射液中，注射液按照实施例1-28和对照例 1-3设置的不同成分进行配置，并将浓缩后的样品稀释至2mg/ml，制作31种双特异抗体制剂，分别装至2ml西林瓶中，1ml/瓶。

将上述制备的31种双特异抗体同时放置于4℃和40℃的样品分别于第2周和第4周取出进行分析检测，检测项目包括SEC-HPLC、SDS-PAGE和CEX-HPLC。

分析检测方法：纯度、浓度检测：分子尺寸排阻高效液相色谱法分析和 SDS-PAGE电泳法分析；电荷异构体：采用阳离子交换色谱法测定电荷异构体主峰含量。

(1)不同缓冲盐对制剂稳定性影响

通过SEC-HPLC法考察上述实施例1-9和对照例1制备的JY039双特异抗体制剂在40℃条件下放置2周和4周后的蛋白纯度和浓度，通过CEX-HPLC方法考察上述实施例1-9和对照例1制备的JY039制剂在40℃条件下放置2周和4 周后的主峰含量。

以试验起始(0w)、放置2w和放置4w的纯度及主峰含量，计算下降速率(％/ 周)；稳定性数据汇总如下表4。

表4实施例1-9和对照例1提供的双特异抗体在不同pH值下稳定性数据汇总表

通过上述数据可知，在40℃条件下加速4周，从纯度及电荷异构体主峰含量下降速率考察，本发明提供的制剂的稳定性远高于对照例1，本发明实施例2、5、 8和对照例1相比，在相同的pH值环境下，经过4周后，本发明实施例2提供抗体制剂中加入的缓冲液为柠檬酸钠在pH值6.0时，纯度和主峰变化较小，稳定性最好，因此可以说明，本发明提供的制剂中的缓冲液成分任意增加一种均有可能导致药效成分下降，稳定性下降，实施例1-3和实施例4-6及实施例7-9相比说明，本发明在pH值5.5-6.0时稳定性较高，所以本发明提供的双特异抗体制剂，pH值优选为5.5-6.0。

(2)不同等渗透调节剂对制剂稳定性影响

通过SEC-HPLC法考察上述实施例10-20和对照例2制备的JY039双特异抗体制剂在40℃条件下放置2周和4周后的蛋白纯度和浓度，通过CEX-HPLC方法考察上述实施例10-20和对照例2制备的JY039制剂在40℃条件下放置2周和 4周后的主峰含量。

以试验起始(0w)、放置2w和放置4w的纯度及主峰含量，计算下降速率(％/ 周)；稳定性数据汇总如下表5。

表5实施例10-20和对照例2提供的双特异抗体在不同等渗透调节剂下的稳定性数据汇总表

从表5中可以看出，综合SEC-HPLC和CEX-HPLC的结果，在柠檬酸钠缓冲盐，且pH6.0条件下，添加不同等渗透调节剂，通过对照例2与其他实施例相比，在40℃条件下放置2周和4周后，对照例2 的纯度和主峰含量下降均较快，稳定性较差，其他实施例中添加的表面活性剂与对照例2相比较为稳定，尤其实施例17，其纯度和主峰含量的变化率较小，所以本发明提供的等渗透调节剂任意更换一种将有可能导致稳定性降低，而通过实施例10-20相比，实施例17提供的双特异抗体制剂中，表面活性剂含有的50mM 的氯化钠和100mM的精氨酸盐酸盐，其在放置4周后，纯度和主峰含量下降较少，说明其稳定性较高，为此，本发明优选的，表面活性剂为50mM的氯化钠和 100mM的精氨酸盐酸盐。

(3)不同表面活性剂对制剂稳定性影响

通过SEC-HPLC法考察上述实施例21-28和对照例3制备的JY039双特异抗体制剂在40℃条件下放置2周和4周后的蛋白纯度和浓度，通过CEX-HPLC方法考察上述实施例21-28和对照例3制备的JY039制剂在40℃条件下放置2周和 4周后的主峰含量。

以试验起始(0w)、放置2w和放置4w的纯度及主峰含量，计算下降速率(％/ 周)；稳定性数据汇总如下表6。

表6实施例21-28和对照例3提供的双特异抗体在不同表面活性剂下的稳定性数据汇总表

表6可以看出，本发明提供的表面活性剂包含的聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20能够保证本发明提供的制剂的稳定性，通过上述实施例与对照例3相比，说明表面活性剂中任意增加一种将有可能导致制剂在4周后纯度和主峰含量下降，同时，实施例21-28相比，说明本发明优选的表面活性剂为聚山梨醇酯80 时，其纯度和主峰含量在4周后下降较小，也就是相对选择聚山梨醇酯20而言，相对稳定，通过实施例21-24相比，说明实施例23中选择的表面活性剂为聚山梨醇酯80且含量为0.02％(w/v)时，主峰含量和纯度变化较小，将实施例23 与实施例25相比，说明，本发明优选的表面活性剂为聚山梨醇酯80，且含量为 0.02％(w/v)时，制剂在存放4周后，仍然能够保持稳定，再额外增加一种，将有可能导致稳定性降低，此外，表面活性剂的含量太低起不到分散作用，含量太高可能产生副作用，影响制剂输注的安全性。

为此，经过上述不同实施例的稳定性试验测定，筛选出最稳定的是本发明实施例23提供的抗体制剂中注射液包括以下含量的组分：20mM的柠檬酸钠， pH6.0、50mM NaCl、100mM精氨酸盐酸盐、0.02％聚山梨酯80。

(4)不同抗体蛋白浓度对制剂的影响：

经过上述实验筛选验证，本发明实施例23提供的JY039双特异抗体为最优制剂处方，我们进一步研究不同的抗体浓度对稳定性的影响。主要比较蛋白浓度为0.005mg/ml、0.01mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、8mg/ml、10mg/ml，40℃条件下放置2周和4周后进行纯度和主峰含量的检测，稳定性数据汇总如下表7。

表7双特异抗体在不同抗体浓度下的稳定性数据汇总表

从表7可以看出，除了0.005mg/ml抗体蛋白浓度外，上述其他浓度的抗体蛋白的纯度和电荷异构体主峰含量均有很好的稳定性。但是通过对比，本发明提供的最优抗体蛋白浓度为1-2mg/ml为最适宜制剂浓度。

实验四、处方验证实验

处方验证试验包括冻融稳定性试验和振摇稳定性试验。

1)冻融稳定性试验：

将实施例23、17、2提供的JY039双特异抗体换液浓缩至所需浓度，进行冻融稳定性试验，分别冻融1、2、3次。重点考察蛋白纯度和电荷异构体主峰含量，结果汇总见表8。

表8抗体制剂冻融稳定性结果汇总

2)振摇稳定性试验：

将实施例23、17、2提供的JY039双特异抗体换液浓缩至所需浓度，进行振摇稳定性试验，分别进行室温水平振摇(80-120rpm)和圆周振摇(30rpm)3天。我们重点考察蛋白纯度和电荷异构体主峰含量，结果汇总见表9。

表9抗体制剂振摇稳定性试验结果汇总

从表8和9可以看出，从蛋白纯度和电荷异构体主峰含量考察，发现本发明实施例中提供的JY039抗体制剂在经过冻融试验及振摇试验后纯度都可以达到97％以上，而且药效分子双特异抗体的浓度基本没有太大变化，说明本发明提供的制剂具有很好的稳定性。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京东方百泰生物科技有限公司

<120> 一种抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 3

<211> 124

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.一种抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂，其特征在于，所述制剂包括药效分子和注射液，所述药效分子为蛋白含量为0.01-10mg/ml的抗CD3和抗CD19双特异性抗体，所述注射液包括以下含量的成分：

缓冲盐 20mM；

等渗透调节剂 150-200mM；

表面活性剂 0.005-0.1％w/v；

其中，所述注射液的pH值为5.5－6.5；

所述抗CD3和抗CD19双特异性抗体包括能够与CD3抗原特异性结合的单链单元和能够与CD19抗原特异性结合的单价单元，所述单链单元和所述单价单元均包括完整的轻链和重链，所述单链单元的所述轻链C末端通过连接子linker与其所述重链N末端连接；所述重链包括重链可变区和重链恒定区，所述轻链包括轻链可变区和轻链恒定区；

所述单链单元的所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；所述单链单元的所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；所述单价单元的所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；所述单价单元的所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；

所述连接子linker的氨基酸序列为(GGGGX)n，其中，所述X为Ser，所述n为6；

所述单链单元的所述重链恒定区和所述单价单元的所述重链恒定区均为IgG4型；

所述单链单元和所述单价单元均含有修饰的CH3结构域，所述CH3结构域的修饰为非对称的杵臼结构；

所述缓冲盐为柠檬酸钠、L-组氨酸盐酸盐或乙酸钠中的一种或多种组合；

所述等渗透调节剂选自如下的蛋白保护剂和稳定剂中一种或两种组合，所述蛋白保护剂为蔗糖、甘露醇、海藻糖中的一种或多种组合，所述稳定剂为精氨酸盐酸盐、甘氨酸、脯氨酸中的一种或多种组合；所述表面活性剂为聚山梨醇酯20和/或聚山梨醇酯80。

2.如权利要求1所述的抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂，其特征在于，所述等渗透调节剂还包括氯化钠，所述氯化钠与所述蛋白保护剂的含量比为1:2，且所述等渗调节剂不包含所述稳定剂。

3.如权利要求1所述的抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂，其特征在于，所述等渗透调节剂还包括氯化钠，所述氯化钠与所述稳定剂的含量比均为1:2，且所述等渗调节剂不包含所述蛋白保护剂。

4.如权利要求1所述的抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂，其特征在于，所述等渗透调节剂在所述制剂中的含量为150mM。

5.如权利要求1所述的抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂，其特征在于，所述表面活性剂在所述制剂中的含量为0.01-0.02％w/v。

6.如权利要求1所述的抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂，其特征在于，所述药效分子为蛋白含量为5mg/ml的抗CD3和抗CD19双特异性抗体，所述注射液包括以下含量的成分：

所述缓冲盐为20mM的柠檬酸钠；

所述等渗透调节剂为50mM的氯化钠和100mM的精氨酸盐酸盐；

所述表面活性剂为0.02％的聚山梨醇酯80；

所述注射液的pH值为6.0。

7.权利要求1-6任一项所述的抗CD3和抗CD19的双特异性抗体注射制剂在制备治疗B淋巴细胞***恶性肿瘤疾病中的药物中的应用。