CN106349391A

CN106349391A - Hbv特异性双靶向抗体及其制备方法和应用、含该双靶向抗体表达盒的微环dna及应用

Info

Publication number: CN106349391A
Application number: CN201510423484.5A
Authority: CN
Inventors: 陈志英; 谌平; 何成宜; 徐文娟
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2015-07-17
Filing date: 2015-07-17
Publication date: 2017-01-25

Abstract

本发明提供了一种特异性双靶向抗体及其方法和应用。所述双靶向特异性抗体具有特异性与人类CD3结合的第一抗原结合结构域和特异性与HBV抗原结合的第二抗原结合结构域，能特异地识别并结合HBV抗原阳性细胞，同时也能结合T细胞受体；并介导T细胞发挥杀伤作用，从而清除慢性HBV感染，在诊疗、预防、检测HBV相关疾病中具有很大的应用价值。本发明还提供了一种具有所述编码所述双靶向特异性抗体的核苷酸序列的微环DNA。本发明提供了的特异性双靶向抗体以及微环DNA可用于制备抗体药物组合物或HBV诊断试剂。

Description

HBV特异性双靶向抗体及其制备方法和应用、含该双靶向抗体表达盒的微环DNA及应用

技术领域

本发明涉及生物医药和诊疗领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒特异性双靶向抗体及其制备方法和应用、含该双靶向抗体表达盒的微环DNA及应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒科中的一员，它会引发急性和慢性肝炎。世界人口中大约3.5亿人，尤其在韩国和中国5-8％的人口是慢性HBV患者，而且HBV是肝病和肝癌的主因。虽然抗HBV疫苗的发展使预防乙型肝炎成为可能，但仍有很多人由于HBV感染而患上慢性肝炎。HBV感染会引起肝炎、肝硬化和肝癌，而且在慢性肝炎患者中肝癌的发生率比正常人高300倍，WHO(世界卫生组织)透露大约80％的肝癌是通过HBV感染由慢性乙型肝炎引起的。

HBV cccDNA(Covalently closed circular DNA，共价闭合环状DNA)长期稳定存在于肝细胞内，对现有药物不敏感，是HBV持续感染和乙型肝炎停药后复发的分子基础。因此，根治慢性乙肝(CHB)关键在于清除cccDNA。而CHB患者机体对HBV感染免疫应答不足，特别是病毒特异性T细胞功能性受损，无法有效清除病毒感染的肝细胞。理论上，通过恢复病毒特异性T细胞的作用可靶向性地破坏感染的肝细胞，间接地降解残留于肝细胞内的HBV cccDNA，从而达到彻底根治HBV感染的目的。

近年来，在肿瘤免疫治疗领域，出现了利用双靶向抗体介导T细胞杀灭癌细胞的新疗法。人体免疫***中，细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)扮演着重要的角色，具有T细胞受体(T cell receptor，TCR)，能特异性识别并结合表达目标抗原的细胞，并分泌穿孔素和颗粒酶杀灭靶细胞。肿瘤细胞由于肿瘤抗原表达缺陷、缺少免疫粘附分子和共刺激分子等原因,使得机体免疫无法有效识别、CTL无法清除癌细胞。

目前报道了一种HBV T细胞受体样(T cell receptor-like，TCR-L)抗体，能特异性识别并结合HBV感染细胞。TCR-L特异性识别并结合的是HBV衍生肽段：表面抗原(HBsAg)或核心抗原(HBcAg)抗原表位与MHCI分子(主要组织相容性复合物I类分子)形成的复合物。这种TCR-L抗体特异性很高，不会与未经MHCI递呈的游离HBV抗原结合。

目前报道的HBV TCR-L抗体只能结合HBV感染的细胞，不能结合T细胞，无法介导T细胞杀伤；使得这种抗体只能通过ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)或CDC(complement-dependent cytotoxicity)能靶向并杀灭HBV感染的肝细胞，但疗效不定。BsAb能够同时与T细胞和肿瘤细胞特异性抗原结合，可在T细胞与肿瘤细胞之间形成免疫突触(immune synapse)，发挥T细胞受体(TCR)一样的功能，从而激活T细胞免疫机制，介导T细胞杀死靶细胞。虽然BsAb已经开始用于肿瘤治疗，但是申请人尚未见BsAb用于治疗包括HBV在内的感染性疾病的报道。

此外，约80％的肝细胞癌(HCC)与慢性HBV感染有关，HBV基因组通常会整合进由HBV感染引发的HCC肿瘤细胞基因组中，因此HBV抗原可在这类HCC细胞中表达；使得HBV特异性BsAb也可用于HBV感染相关的HCC治疗。

本发明旨在提供一个高效、低成本、乙型肝炎病毒特异性双靶向抗体及其制备方法和应用。

发明内容

第一方面，本发明提供了一种特异性双靶向抗体，所述特异性双靶向抗体具有特异性与人类CD3结合的第一抗原结合结构域和特异性与HBV抗原结合的第二抗原结合结构域，其中，所述的HBV抗原为经MHCI递呈的MHCI-HBV抗原复合物。

本发明提供了的特异性双靶向抗体(Bispecific antibody,BsAb)，能够同时与CD3和HBV抗原结合；特异地识别并结合HBV抗原阳性细胞，同时也结合表达CD3的T细胞，可在T细胞与肿瘤细胞之间形成免疫突触(immune synapse)，发挥T细胞受体(T cell receptor，TCR)一样的功能，从而激活T细胞免疫机制，介导T细胞发挥杀伤HBV阳性细胞的作用，从而清除慢性HBV感染。

本发明所述的“双靶向”表示“能够同时与CD3和HBV抗原结合”,其中，HBV抗原为经MHCI递呈的抗原。

本发明所述的“MHCI-HBV抗原复合物”或“MHCI/HBV抗原肽复合物(pMHC/peptide)”，是指HBV抗原经MHCI递呈，形成的复合抗原，优选为如下步骤获得：将HBV抗原和MHCI蛋白分别变性，然后将变性后的HBV抗原和MHCI蛋白混合(优选混合摩尔比1：1)，共同稀释复性，获得所述MHCI-HBV抗原复合物。

在本发明一个实施例中，所述的HBV抗原包括HBV表面抗原(HBsAg)和核心抗原(HBcAg)中的至少一种。

在本发明一个实施例中，本发明提供了的特异性双靶向抗体，可与CD3和HBsAg结合；该特异性双靶向抗体在文中亦称为“抗-CD3/抗-HBsAg特异性双靶向抗体”。“抗-CD3/抗-HBsAg特异性双靶向抗体”的抗-HBsAg部分可用于靶向表达HBsAg的细胞(即HBV阳性细胞)，而特异性双靶向抗体分子的抗-CD3部分可用于活化T细胞。通过与HBV阳性细胞上的HBsAg和T细胞上的CD3的同时结合，促进活化的T细胞定向杀死(细胞裂解)被靶向的HBV阳性细胞。本发明的抗-CD3/抗-HBsAg特异性双靶向抗体，特别地，用于诊断、治疗与HBV感染的HBV阳性细胞、由HBV引起或相关的疾病和病症(例如肝炎或慢性肝癌)。

在本发明一个实施例中，本发明提供了了的特异性双靶向抗体，可与CD3和HBcAg结合；该特异性双靶向抗体在文中亦称为“抗-CD3/抗-HBcA特异性双靶向抗体”。“抗-CD3/抗-HBcAg特异性双靶向抗体”的抗-HBcAg部分可用于靶向表达HBcAg的细胞(即HBV阳性细胞)，而特异性双靶向抗体分子的抗-CD3部分可用于活化T细胞。通过与HBV阳性细胞上的HBcAg和T细胞上的CD3的同时结合，促进活化的T细胞定向杀死(细胞裂解)被靶向的HBV阳性细胞。本发明的抗-CD3/抗-HBcAg特异性双靶向抗体，特别地，用于诊断、治疗与HBV感染的HBV阳性细胞、由HBV引起或相关的疾病和病症(例如肝炎或慢性肝癌)。

本发明所述的，“HBV阳性细胞”为经过MHCI递呈的表达HBV抗原的细胞，其中，所述的表达HBV抗原的细胞，包括但不限于表达HBsAg或HBcAg的细胞。

本发明所述BsAb既能特异性结合HBV感染肝细胞(也包括HBV抗原阳性的HCC癌细胞)，也能结合T细胞，介导T细胞杀灭靶细胞。

本发明的示例性特异性双靶向抗体列于文中的表1和表2。本发明提供的特异性双靶向抗体中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域均包括的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR))。表1表2列出了本发明提供的特异性双靶向抗体的HCVR、LCVR的氨基酸序列，及其在序列表中的序列号。表2列出了编码本发明所述的HCVR、LCVR氨基酸序列对应的核苷酸序列，及其在序列表中的序列号。

本发明提供的特异性双靶向抗体的氨基酸序列包括：至少一条第一抗原结合结构域的HCVR氨基酸序列、至少一条第一抗原结合结构域的LCVR氨基酸序列、至少一条第二抗原结合结构域的HCVR氨基酸序列、以及至少一条第二抗原结合结构域的LCVR氨基酸序列；具体HCVR和LCVR优选为任一选自表1的氨基酸序列。

编码本发明提供的特异性双靶向抗体的核苷酸序列包括：至少一条第一抗原结合结构域的HCVR核苷酸序列、至少一条第一抗原结合结构域的LCVR核苷酸序列、至少一条第二抗原结合结构域的HCVR核苷酸序列、以及至少一条第二抗原结合结构域的LCVR核苷酸序列；具体HCVR和LCVR优选为任一选自表2的核苷酸序列。

表1序列表中的氨基酸序列

具体地，在表1各序列中，高变区为如下带下划线序列：

SEQUENCE NO.1中，

CD3.HCVR-1

DVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGYTNYADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVTVSSGE

SEQUENCE NO.2中，

CD3.HCVR-2

DVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGYTNYADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLR SEDTATYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVTVSSGE

SEQUENCE NO.3中，

CD3.HCVR-3

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVE

SEQUENCE NO.4中，

CD3.LCVR-1

TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK

SEQUENCE NO.5中，

CD3.LCVR-2

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEAEDAATYYC QQWSSNPLTFGGGTKVEIKRILQISSTVAAARGGP

SEQUENCE NO.6中，

CD3.LCVR-3

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC QQWSSNPLTFGAGTKLELK

SEQUENCE NO.7中，

HBsAg-HCVR

QVQLQQPGAEFVKPGASVRLSCKASGYTFSSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYCATSGYDVGVDYWGQGTTLTVSS

SEQUENCE NO.8中，

HBsAg-LCVR

DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYLAWYHQKQGKSPQLLVYIAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKIDSLQPEDVGSYYCQHHYGTPYTFGGGTKLEIKR

SEQUENCE NO.9中，

HBcAg-HCVR

QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGHTFTSYDINWVKQRPGQGLEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSENSAVYFCARRDYGYSYAMDYWGQGTSVTVSS

SEQUENCE NO.10中，

HBcAg-LCVR

DIQMTQSPASLSTSVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPFTFGSGTKLEIK

表2序列表中的核苷酸序列

具体地，在表2各序列中，高变区为如下带下划线序列：

SEQUENCE NO.11中，

CD3.HCVR-1

GACGTCCAACTGGTGCAGTCAGGGGCTGAAGTGAAAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAGGCAGGCACCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACGCAGACAGCGTCAAGGGCCGCTTCACAATCACTACAGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGTTCTGAGGACACTGCAACCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCGAA

SEQUENCE NO.12中，

CD3.HCVR-2

SEQUENCE NO.13中，

CD3.HCVR-3

GATATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGTCGAA

SEQUENCE NO.14中，

CD3.LCVR-1

GACATTCAGATGACCCAGTCTCCATCTAGCCTGTCTGCATCTGTCGGGGACCGTGTCACCATCACCTGCAGAGCCAGTCAAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCGGGCAAGGCACCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCGACTACTCTCTCACAATCAACAGCTTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGGCGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

SEQUENCE NO.15中，

CD3.LCVR-2

GACATTGTACTGACCCAGTCTCCAGCAACTCTGTCTCTGTCTCCAGGGGAGCGTGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGTCAAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCGGGCAAGGCACCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCGACTACTCTCTCACAATCAACAGCTTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGGCGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGGAGGGCCC

SEQUENCE NO.16中，

CD3.LCVR-3

GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA

SEQUENCE NO.17中，

HBcAg-LCVR

GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTACATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATTTTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGAGTACTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA

SEQUENCE NO.18中，

HBcAg-HCVR

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTCACACCTTCACAAGCTACGATATAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAGATGGAAGTACTAAGTACAATGAGAAATTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACTTCTGAGAACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAAGGGACTACGGCTACTCTTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

SEQUENCE NO.19中，

HBsAg-LCVR

GACATTCAGATGACCCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACTTAGCATGGTATCACCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATATTGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCGACAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTATGGTACTCCGTACACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGT

SEQUENCE NO.20中，

HBsAg-HCVR

CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGTTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGCGGCTGTCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCAGCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGAGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAACTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGTTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAACATCGGGGTACGACGTCGGCGTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA

具体地，SEQUENCE NO.10-20分别编码SEQUENCE NO.1-10的氨基酸序列。

在本发明一些实施例中，所述的第一抗原结合结构域的HCVR为与表1中所示的第一抗原结合结构域中任一HCVR氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的氨基酸序列。

在本发明一些实施例中，所述的第一抗原结合结构域的LCVR为与表1中所示的第一抗原结合结构域中任一LCVR氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的氨基酸序列。

在本发明一些实施例中，所述的第二抗原结合结构域的HCVR为与表1中所示的第一抗原结合结构域中任一HCVR氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的氨基酸序列。

在本发明一些实施例中，所述的第二抗原结合结构域的LCVR为与表1中所示的第一抗原结合结构域中任一LCVR氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的氨基酸序列。

在本发明一些实施例中，所述的第一抗原结合结构域的HCVR为与表2中所示的第一抗原结合结构域中任一HCVR核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的核苷酸序列。

在本发明一些实施例中，所述的第一抗原结合结构域的LCVR为与表2中所示的第一抗原结合结构域中任一LCVR核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的核苷酸序列。

在本发明一些实施例中，所述的第二抗原结合结构域的HCVR为与表2中所示的第一抗原结合结构域中任一HCVR核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的核苷酸序列。

在本发明一些实施例中，所述的第二抗原结合结构域的LCVR为与表2中所示的第一抗原结合结构域中任一LCVR核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的核苷酸序列。

可以理解的，由于“核苷酸序列”具有碱基简并、突变等情况，行业内普通技术人员可调整某些碱基的种类，所述的碱基变化虽然导致了密码子的变化，但不会引起密码子翻译的氨基酸的变化，很常见的，亮氨酸的密码子就具有多种密码子，比如：UUA、UUG、CUU。

在本发明一些实施例中，所述双靶向特异性抗体的氨基酸序列为：任选自表1中的序列，按如下连接形式为(a)～(h)中的一种组合所得(“V_LCD3”表示双靶向特异性抗体的第一抗原结合结构域的LCVR；“V_HCD3”表示双靶向特异性抗体的第一抗原结合结构域的HCVR；“V_LHBV”表示双靶向特异性抗体的第二抗原结合结构域的LCVR；“V_HHBV”表示双靶向特异性抗体的第二抗原结合结构域的HCVR)：

(a)V_LHBV-linker1-V_HHBV-linker2-V_LCD3-linker1-V_HCD3，

(b)V_HHBV-linker1-V_LHBV-linker2-V_LCD3-linker1-V_HCD3，

(c)V_LHBV-linker1-V_HHBV-linker2-V_HCD3-linker1-V_LCD3，

(d)V_HHBV-linker1-V_LHBV-linker2-V_HCD3-linker1-V_LCD3，

(e)V_LCD3-linker1-V_HCD3-linker2-V_LHBV-linker1-V_HHBV，

(f)V_LCD3-linker1-V_HCD3-linker2-V_HHBV-linker1-V_LHBV，

(g)V_HCD3-linker1-V_LCD3-linker2-V_LHBV-linker1-V_HHBV，

(h)V_HCD3-linker1-V_LCD3-linker2-V_HHBV-linker1-V_LHBV，

其中，横杠“-”代表各氨基酸序列顺序排列。

在本发明一个实施例中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域的HCVR(V_H)和LCVR(V_L)之间的Linker的氨基酸序列为(GGGGS)_n(n＝1-4)、(GGS)₄或(Gly)n(n＝6-8)，但不限于此。

在本发明一个实施例中，各抗原结合结构域之间的Linker的氨基酸序列为为(GGGGS)n(n＝1-4)，但不限于此。

在本发明一优选实施例中，双特异性单链抗体氨基酸序列为具有与(a)～(h)任一所示序列的同源性不小于90％、95％、98％或99％的氨基酸序列。

在本发明一些实施例中，各抗原结合结构域的HCVR(V_H)和LCVR(V_L)之间、各抗原结合结构域之间通过linker相连，Linker为连接肽，该连接肽主要采用了以甘氨酸和丝氨酸为主构成的多肽序列，其中，甘氨酸是分子量最小、侧链最短的氨基酸，可增加侧链的柔韧性；丝氨酸是亲水性最强的氨基酸，可增加肽链的亲水性。

如本文所用，“双靶向特异性抗体”包括但不限于人源、兔源或鼠源抗体。

在本发明一些实施例中，所述双靶向特异性抗体的N段具有免疫球蛋白κ链信号肽的氨基酸序列。

本发明提供的所述特异性双靶向抗体的N端加上了免疫球蛋白轻链κ链的分泌信号肽，从而保证抗体的表达并分泌到宿主细胞外。

第二方面，本发明提供了一种获取特异性双靶向抗体序列的方法，其特征在于，所述方法包括：

a)在免疫抗原表位数据库中搜索HBV T细胞抗原表位；

b)选择优势抗原表位并合成HBV抗原肽；

c)体外表达MHCI蛋白，并与HBV抗原肽形成MHCI/HBV抗原肽复合物；

d上述复合物免疫动物，分离表达HBV特异抗体的B细胞克隆并对抗体可变区进行测序；

e)筛选出(优选采用经过功能表位测定、亲和力测定及中和HBV活性测定的方法进行筛选)HBV特异抗体可变区序列与CD3抗体序列进行排列组合，获得所述的特异性双靶向抗体序列。

本发明第二方面还提供了一种制备如第一方面所述的特异性双靶向抗体的方法，该方法包括：

a)在免疫抗原表位数据库(优选为Immune Epitope Database；IEDB)中搜索HBV T细胞抗原(比如HBsAg和HBcAg)表位；

b)选择优势抗原表位(Dominant T cell epitope)并合成HBV抗原肽；

c)体外表达MHCI蛋白，并与HBV抗原肽形成MHCI/HBV抗原肽复合物(pMHC/peptide)；

d)上述复合物免疫动物(优选为小鼠)，分离表达HBV特异抗体的B细胞克隆并对抗体可变区进行测序；

e)筛选出(优选采用经过功能表位测定、亲和力测定及中和HBV活性测定的方法进行筛选)的HBV特异抗体可变区序列与CD3抗体序列进行排列组合，获得所述的特异性双靶向抗体序列。

在本发明一实施例中，将第二方面获得的特异性双靶向抗体序列用于构建表达所述的特异性双靶向抗体的重组表达载体；导入宿主细胞；在表达条件下，培养宿主细胞，表达，分离纯化，获得所述特异性双靶向抗体。

在本发明一实施例中，步骤c)中，将MHCI蛋白与HBV抗原肽变形，然后混合(摩尔比优选为1:1)复性，获得所述MHCI/HBV抗原肽复合物。

第三方面，本发明还提供了如第一方面所述的特异性双靶向抗体按下述一种或多种方法进行应用：

(1)将所述特异性双靶向抗体单独进行应用；

(2)将所述特异性双靶向抗体与化疗、放疗、手术、生物治疗、免疫治疗中的一种或几种联合应用；

(3)采用体内投递的方式将所述特异性双靶向抗体直接投递到患者体内进行治疗；

(4)先通过体外转染技术将所述特异性双靶向抗体与免疫效应细胞混合，然后将所述混有特异性双靶向抗体的免疫效应细胞输回患者体内实施治疗。

在本发明一些实施例中，如第三方面所述的应用，包括但不限于用于治疗肝炎、肝癌或其他HBV相关疾病。

在本发明一些实施例中，如第三方面所述的应用(3)和(4)中，向患者施用如上所述的抗体，可向患者施用多于一次。

在本发明一些实施例中，如第三方面所述的应用(3)中，所述的投递的方式为靶向投递，包括但不限于采用可靶向投递的liposome脂质体(或其多聚体)等行业常用载体进行投递。

通过向包括人的哺乳动物施用本发明第一方面提供的抗体或第四方面提供的药物组合物，可预防或治疗HBV感染和HBV相关疾病。

第四方面，本发明提供了一种药物组合物，包括至少一种如第一方面所述的特异性双靶向抗体，及可药用的载剂、赋形剂或稀释剂。

本发明提供的药物组合物可根据常规方法制成药物制剂。制剂过程中，优选将抗体与载体混合或用载体稀释，或装入容器形式的载体中。当载体作为稀释剂时，其可以为固体、半固体或液体，用作用于抗体的囊泡、赋形剂或培养基。因此，制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、袋装剂、胶囊、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软和硬明胶胶囊、注射用无菌溶液、无菌粉剂等形式。合适的载体、赋形剂或稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。制剂还可以包括填充剂、抗凝血剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。

在本发明一些实施例中，所述的药物组合物还包括第二治疗剂，第二治疗剂为任何有利地与所述的特异性双靶向抗体组合的活性剂。包括但不限于结合和/或活化CD3讯号传递的其他活性剂(包括其他抗体或其抗原结合片段等)，和/或不直接与CD3结合，但却活化或刺激免疫细胞活化的活性剂。

在本发明一些实施例中，所述的第二治疗剂包括与抗体协同作用的干扰剂、抗-HBV单克隆抗体、抗-HBV多克隆抗体、核苷类似物、DNA聚合酶抑制剂、siRNA制剂、用作抗病毒剂的治疗用疫苗、细胞因子、毒素、化学治疗剂、放射治疗剂、激素、抗体Fc片段、TLR激动剂、含CpG的分子或免疫共刺激分子。

第五方面，本发明提供了一种诊断试剂，包括至少一种如第一方面所述的特异性双靶向抗体，及诊断剂，所述的诊断剂包括但不限于荧光团、发色团、染料、放射性同位素、化学发光分子、顺磁性离子或自旋捕获试剂。

第六方面，本发明提供了一种抗体药物，为任一如第一方面所述的特异性双靶向抗体，与人类CD3结合并于体外诱导人类T细胞增殖。

第七方面，本发明提供了一种抗体药物，为任一如第一方面所述的特异性双靶向抗体，与人类CD3结合并于体外诱导T细胞介导的对HBV阳性细胞进行杀伤。

第八方面，本发明提供了一种核酸分子，编码如第一方面所述的特异性双靶向抗体的氨基酸序列；在某些实施方式中，所述的核酸分子编码的氨基酸序列，为与如第一方面所述特异性双靶向抗体的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的氨基酸序列。

第九方面，本发明提供了一种表达如第一方面所述的特异性双靶向抗体的重组载体；在某些实施方式中，所述的重组载体具有本发明第八方面提供的任一核酸分子序列。

在本发明一些实施例中，所述的载体为微环DNA重组母质粒或微环DNA。

在本发明一些实施例中，所述微环DNA重组母质粒是在微环DNA空质粒的多克隆位点中***本发明第八方面提供的任一核酸分子序列组合而成。具体***方法可采用常规的基因克隆，也可采用无缝克隆(Seamless cloning)。

在本发明一些实施例中，所述微环DNA空质粒优选为p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒。具体地，所述空质粒p2ФC31构建方法参照Chen ZY等,Molecular Therapy,8(3),495-500(2003)、Chen ZY等,Human Gene Therapy,16(1),126-131(2005)和美国专利US7897380B2。具体地，所述空质粒pMC.BESPX构建方法及全基因序列参照Chen ZY等,Nature Biotechnology,28,(12),1289-1291(2010)。

本发明典型实施例中采用的p2ФC31质粒、pMC.BESPX质粒分别获得的p2ФC31重组母质粒、pMC.BESPX重组母质粒，区别在于：p2ФC31载体上具有编码ФC31重组酶和I-Sce1内切酶的核苷酸序列，而pMC.BESPX载体上没有编码ФC31重组酶和I-Sce1内切酶的核苷酸序列，所以采用pMC.BESPX载体制备的微环DNA母质粒更加优质，大大减少了重组酶和内切酶的核苷酸序列的污染；但是pMC.BESPX需配套使用了大肠杆菌E.coli ZYCY10P3S2T工程菌，ZYCY10P3S2T工程菌具有编码ФC31重组酶和I-Sce1内切酶功能，无ФC31重组酶(即phiC31组酶)和I-Sce1内切酶核苷酸编码序列的pMC.BESPX重组母质粒需要配套使用ZYCY10P3S2T工程菌才能产生体内位点特异性重组(而大肠杆菌E.coli TOP 10无此功能)并最终生产出微环DNA；相应的，p2ФC31重组母质粒可配套使用TOP 10即可产生体内位点特异性重组，并最终生产出微环DNA。

在本发明一些实施例中，所述的微环DNA为本发明提供的微环DNA重组母质粒通过特异性重组位点的位点特异性重组产生。本发明提供的微环DNA重组母质粒具有特异性重组位点，所述的“微环DNA重组母质粒”通过特异性重组位点的位点特异性重组产生微环DNA和骨架DNA序列。p2ФC31重组母质粒生产微环DNA的方法参照Chen ZY等,Molecular Therapy,8(3),495-500(2003)、Chen ZY等,Human Gene Therapy,16(1),126-131(2005)和美国专利US7897380B2。pMC.BESPX重组母质粒生产微环DNA的方法参照Chen ZY等,Nature Biotechnology,28,(12),1289-1291(2010)。

如本文所用，“骨架DNA序列”具有标准质粒中负责细菌质粒的复制、或筛选含质粒的宿主等功能的DNA序列，比如细菌复制序列、抗性基因、未甲基化的CpG基序等。

在本发明一些实施例中，所述的重组载体还包含表达目的多肽(本发明中为特异性双靶向抗体)所需的所有必要元件的基因表达***，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“可操作地连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。优选地，所述信号肽为免疫球蛋白κ链信号肽。优选地，所述标签为His标签、GST标签、c-myc标签和Flag标签中的至少一种。以上的信号肽和标签种类为本发明人的优选方式，本领域技术人员可以根据具体需要选择合适的信号肽和标签。

第十方面，本发明提供了一种具有如第九方面所述载体的宿主细胞(优选为真核细胞或包括人在内的哺乳动物细胞)；还提供了将如第九方面所述载体导入宿主细胞中的方法；还提供了通过在允许产生抗体的条件下培养具有所述载体的宿主细胞，并分离力所产生的抗体的方法。

第十一方面，本发明提供了一种检测试剂盒，包括固体检测支持物，所述的固体检测支持物包含至少一种如第一方面所述的特异性双靶向抗体。在一些实施方式中，所述固体支持物是可连接大分子如抗体、蛋白质、多肽、肽、多核苷酸的固体表面，如磁性珠、胶乳珠、微量滴定板孔、玻璃平板、尼龙、琼脂糖、聚丙烯酰胺、二氧化硅颗粒、硝酸纤维素膜等。

第十二方面，本发明提供了一种在待测样品中检测异常细胞的方法，其包括使所述样品与至少一种如第一方面所述的特异性双靶向抗体相接触。在一些实施方式中，所述的样品来自肝脏或经切除的肿瘤床。

如本发明所述，“异常细胞”是具有对于该细胞类型为非典型特征(包括非典型生长、非典型位置处的典型生长或针对非典型靶标的典型作用)的任何细胞。这样的细胞包括癌细胞、良性增生细胞或发育异常细胞、炎性细胞或自身免疫细胞。

在本发明一些实施例中，采用如第十二方面所述的方法对移植前捐赠的组织或器官进行筛选，以提供基本不含HBV的组织或器官。

在本发明一些实施例中，采用如第十二方面所述的方法对血液供给品进行筛选，以提供基本不含HBV的血液供给品。

第十三方面，如第一方面所述的特异性双靶向抗体或如第九方面所述的重组载体在制备诊断、预防、治疗HBV疾病的试剂或药物中的应用。

如本发明所述的，所述的“HBV疾病”包括但不限于HBV感染相关疾病、HBV抗原阳性的HCC癌细胞肝癌。

本发明提供的技术方案，通过设计一组特异性双靶向抗体，并将抗体表达框(DNA序列)***微环DNA载体(优选为Kay MA*,He CY and Chen ZY*(*通讯作者).A Robust system for production of minicircle DNA vecrtors.Nat Biotechnology,28:1287,2010)中。由微环DNA表达的抗体具有以下特性：2)特异性结合MHCI递呈的HBV抗原(HBsAg或HBcAg)；3)特异性结合T细胞；4)介导T细胞对HBV抗原阳性细胞发挥杀伤作用。此外，在一些实施例中，由于抗体表达框带有分泌信号肽的编码序列，抗体表达后能分泌至胞外、保持生物活性。

附图说明

图1为本发明提供的MHCI/HBV抗原肽复合物的Western Blot结果；

图2为本发明实施例2制备的pMC.BESXP微环母质粒的质粒图谱；

图3为本发明实施例4提供的Western Blot检测培养基上清中BsAb抗体表达水平的结果；

图4为本发明提供的HBV BsAb细胞结合实验结果；

图5本发明提供的HBV BsAb联合DCIK细胞杀伤实验的结果；

图6为IEDB中HBcAg T细胞抗原表位；

图7为HBsAg T细胞抗原表位。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。

实施例1

本发明提供的特异性双靶向抗体(BsAb)的设计，包括如下步骤：

a)首先在免疫抗原表位数据库(Immune Epitope Database；IEDB)中搜索HBV T细胞抗原(HBsAg和HBcAg)表位；

b)选择其中的几种优势抗原表位(Dominant T cell epitope)并合成HBV抗原肽：

IEDB中HBcAg T细胞抗原表位共21个(部分epitope如图6)；选择HLA-A*02:01(此种HLA类型在人群，尤其是中国人中分布最广，超过60％；使得BsAb适用范围更广)限制性的抗原表位，且排序靠前的抗原表位(references>10；assays>10)。

最终选择了1条HBcAg epitope，序列为：FLPSDEFPSV

HBsAg T细胞抗原表位共37个(部分epitope如图7)，按照同样的原则，选择了2条HBsAg epitope，序列分别为：WLSLLVPFV；FLLTRILTI；

c)体外表达MHCI蛋白，序列为：

(SEQ ID NO:29)

其中，双下划线为HLA-β2m的序列，单下划线为linker的序列，波浪线为HLA-A2α的序列；

MHCI蛋白与HBV抗原肽形成MHCI/HBV抗原肽复合物(pMHC/peptide)；

(1)体外用大肠杆菌(BL21)经IPTG诱导表达MHCI蛋白(HLA-β2m-linker-HLA-A2α)；经尿素变性后纯化

(2)在4℃层析室中,将变性的MHCI蛋白和HBV抗原肽(摩尔比1：1)共同稀释复性(复性缓冲液：1O0mM Tris-HCl(pH8.O)，400mM L-精氨酸(L-Arginine)，2mM EDTA，还原型谷胱甘肽(reduced glutathione)5mM，氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione)0.5mM，PMSF 0.5mM；蛋白稀释至0.01mg/mL),形成MHCI/HBV抗原肽复合物。MHCI/HBV抗原肽复合物使用构象抗体W6/32(Abcam)，通过Western Blot检测。W6/32能识别并结合正确折叠的MHCI/抗原肽复合物(见图1)。

d)上述正确折叠的MHCI/抗原肽复合物免疫小鼠，分离表达HBV特异抗体的B细胞克隆并对抗体可变区进行测序；

e)选择高亲和力的HBV特异抗体可变区序列(如表1中的HBV抗体所示)；并选择CD3抗体序列进行排列组合(参见表1和表2)，此外，在各抗原结合结构域中的V_H和V_L***linker1相连；第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域之间***linker2相连；获得本发明的特异性双靶向抗体(BsAb抗体)氨基酸序列。

具体的，各BsAb抗体的具体氨基酸序列组合如下：

(a)V_LHBV-linker1-V_HHBV-linker2-V_LCD3-linker1-V_HCD3，氨基酸序列为

(b)V_HHBV-linker1-V_LHBV-linker2-V_LCD3-linker1-V_HCD3，氨基酸序列为

(c)V_LHBV-linker1-V_HHBV-linker2-V_HCD3-linker1-V_LCD3，氨基酸序列为

(d)V_HHBV-linker1-V_LHBV-linker2-V_HCD3-linker1-V_LCD3，氨基酸序列为

(e)V_LCD3-linker1-V_HCD3-linker2-V_LHBV-linker1-V_HHBV，氨基酸序列为

(f)V_LCD3-linker1-V_HCD3-linker2-V_HHBV-linker1-V_LHBV，氨基酸序列为

(g)V_HCD3-linker1-V_LCD3-linker2-V_LHBV-linker1-V_HHBV，氨基酸序列为

(h)V_HCD3-linker1-V_LCD3-linker2-V_HHBV-linker1-V_LHBV，氨基酸序列为

其中，横杠“-”代表各氨基酸序列顺序连接；

其中，antiHBV-V_H选自表1中第一抗原结合结构域的任一HVCR序列；antiHBV-V_L选自表1中第一抗原结合结构域的任一LVCR序列；antiCD3-V_H选自表1中第二抗原结合结构域的任一HVCR序列；antiCD3-V_L选自表1中第二抗原结合结构域的任一LVCR序列；

本发明实施例1提供的特异性双靶向抗体中，各抗原结合结构域中的V_H和V_L通过(GGGGS)₃相连，具体氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS；第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域之间，通过GGGGS相连；

f)根据各氨基酸序列，获得编码上述BsAb抗体的核苷酸序列:

编码antiHBV-V_H的核苷酸序列选自表2中第一抗原结合结构域的任一HVCR序列；编码antiHBV-V_L的核苷酸序列选自表2中第一抗原结合结构域的任一LVCR序列；编码antiCD3-V_H的核苷酸序列选自表2中第二抗原结合结构域的任一HVCR序列；编码antiCD3-V_L的核苷酸序列选自表21中第二抗原结合结构域的任一LVCR序列。

实施例2

具有编码BsAb抗体核苷酸序列的微环母质粒的构建，包括如下步骤：

1)设计BsAb抗体基因表达盒

本发明实施例2的BsAb抗体基因表达盒除含有编码实施例1BsAb的核苷酸序列之外，还包括启动子、分泌信号肽、蛋白纯化标签、polyA加尾信号的编码序列。

在一具体实施方式中，本发明实施例2的BsAb抗体基因表达盒包括依次连接的：

编码免疫球蛋白κ链信号肽的核苷酸序列(SEQ ID NO:21)-编码Flag标签的核苷酸序列(SEQ ID NO:22)-BsAb抗体的基因序列(antiHBV-V_L—antiHBV-V_H—antiCD3-V_H—antiCD3-V_L；具体核苷酸序列对应表2中的SEQ ID NO:17？-linker1-SEQ ID NO:18？-linker2-SEQ ID NO:11？-linker1-SEQ ID NO:14？)-编码组氨酸His6标签的核苷酸序列(SEQ ID NO:23)-终止密码子(TAA)；其中，

编码免疫球蛋白κ链信号肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO:21所示。

编码Flag标签的核苷酸序列，如SEQ ID NO:22所示。

编码组氨酸His6标签的核苷酸序列，如SEQ ID NO:23所示。

本发明实施例2的BsAb抗体基因表达盒还包括巨细胞病毒CMV启动子的核苷酸序列，位于Signal peptide分泌信号肽的N段；序列为SEQ ID NO:24。

本发明实施例2的BsAb抗体基因表达盒还包括牛生长激素多聚核苷酸bpA的核苷酸序列，位于终止密码子(TAA)的C端；序列为SEQ ID NO:25：

为了增强微环DNA载体的表达效率，添加了元件chimeric intron(介于CMV启动子和Signal peptide分泌信号肽之间；文献报道，在多种细胞上能增强10-20倍)，序列为SEQ ID NO:26。

本发明实施例2的BsAb抗体基因表达盒中，linker1为(GGGGS)₃，核苷酸序列为SEQUENCE NO.26所示核苷酸序列。

linker2为GGGGS，核苷酸序列为SEQUENCE NO.27所示核苷酸序列。

2)将所述的BsAb抗体基因表达盒***p2ФC31空载体或pMC.BESXP空载体的attB和attP位点之间，具体步骤包括A)或B)中的任一一种：

A)

具体步骤参照本申请人在2014年递交的PCT申请(申请号：PCT/CN2014/083741)说明书：

实施例1“一种含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA重组母质粒p2ФC31.Bab的构建方法”，至获得本发明实施例2的具有编码BsAb抗体核苷酸序列的p2ФC31微环母质粒；以及

实施例6“一种含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA重组母质粒pMC.Bab的构建方法”的步骤；至获得本发明实施例2的具有编码BsAb抗体核苷酸序列的pMC.BESXP微环母质粒。

本发明步骤1-2)与上述PCT申请不同的地方仅在于，本发明实施例2步骤1-2)将上述PCT申请实施例1或6中的“BiTE的基因序列”替换为本发明实施例2的“BsAb抗体基因”。

B)

直接采用无缝克隆(Seamless cloning)的方法，在BsAb抗体基因表达盒两端设计15bp左右与pMC.BESXP空载体或p2ФC31空载体两端的同源序列，将合成的BsAb抗体基因表达盒直接***p2ФC31空载体或pMC.BESXP空载体的attB和attP位点之间；(该方法不依赖于酶切位点，无需考虑BsAb中所含的酶切位点，更加简单快捷)分别获得本发明实施例2的具有编码BsAb抗体核苷酸序列的p2ФC31微环母质粒或pMC.BESXP微环母质粒。

本发明实施例2制备的pMC.BESXP微环母质粒的质粒图谱如图2所示。

实施例3

具有编码BsAb抗体核苷酸序列的微环DNA的构建

参照本申请人在2014年递交的PCT申请(申请号：PCT/CN2014/083741)说明书：

实施例2和实施例7“一种含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA的制备方法”，分别至获得本发明实施例3的具有编码BsAb抗体核苷酸序列的微环DNA。

p2ФC31微环母质粒；以及

本发明与上述PCT申请实施例2和实施例7不同的地方仅在于，本发明实施例3将上述PCT申请实施例2或7中的微环母质粒替换为本发明实施例2提供的p2ФC31微环母质粒或pMC.BESXP微环母质粒。

实施例4

BsAb抗体的表达和纯化，包括如下步骤：

(1)BsAb抗体在293T细胞中的表达

采用superfect质粒转染试剂盒(Invitrogen公司)将实施例3的微环DNA(图2所示pMC.BESXP微环母质粒制备的微环DNA)转染293T细胞，在无血清培养基中培养三天后分别收集293T细胞上清液，应用流式细胞仪检测BsAb抗体的表达。

(2)BsAb抗体的纯化

先将CHO细胞培养上清液进行低温超速离心，取上清，再采用His-Tag亲和树脂纯化(cOmplete His-Tag Purification Resin，Roche)，纯化后的抗体采用ELISA法检测蛋白质浓度；纯化后蛋白浓度达到0.4mg/ml，置于-20℃长期保存。

293T细胞转染HBV BsAb微环载体72小时后，Western Blot检测培养基上清中BsAb抗体表达水平，结果如图3所示。

实施例5

流式细胞术检测BsAb抗体与HepG2、HepG2.117、Jurkat细胞的结合活性，包括如下步骤：

a)细胞培养：HepG2(DMEM medium；无HBV肝癌细胞；阴性对照)，HepG2.117(DMEM medium；HBV-positive细胞)，Jurkat细胞(1640medium；CD3+细胞)

b)胰酶消化HepG2和HepG2.117，加含血清培养基中和后离心弃上清得细胞；Jurkat为悬浮细胞直接离心收集细胞。

c)均用预冷PBS洗涕2次，200g离心4min，收集细胞，分别计数；

d)平均分配每实验组1*10⁵个/组样品，分组如下：

HepG22组:空白组(Blank，不加BsAb)；HBV BsAb组(实施例4所得的BsAb表达微环DNA载体转染293T细胞后的上清；预先准备)

HepG2.117 2组:分组如上，空白组&HBV BsAb组

Jurkat 2组:分组如上，空白组&HBV BsAb组

e)加入上述上清100μl/组冰上孵育30min；

f)加入1ml预冷PBS洗涤，200g离心4min，收集细胞，加事先预冷并混好anti-flag抗体的PBS 100μl，冰上孵育30min，

g)加入1ml预冷PBS洗涤，200g离心4min，收集细胞，100μl PBS重悬。上流式观察结合情况。

图4为HBV BsAb细胞结合实验，其中，(A)为BsAb结合CD3阳性细胞(Jurkat)；(B)为BsAb结合HBV抗原阳性细胞(HepG2.117)。

实施例6

BsAb抗体联合DCIK细胞杀伤HepG2.117细胞的方法

本例中靶细胞(T)为HepG2.117细胞；效应细胞(E)为DCIK细胞(树突状细胞调节的细胞因子诱导的杀伤细胞，dendritic cell activated and cytokine induced killer cell)

步骤：

a)提前1天种靶细胞(HepG2.117)于96孔板，细胞接种量为2×10⁴/孔；同时设置分组(如下表 3；每组3个复孔)：

表 3不同分组

b)第二天更换新鲜optiDMEM培养基，100μL/孔；

c)效应细胞DCIK(E)计数并重悬于optiDMEM培养基，按照T:E＝1：8的比例，根据a)中分组加入相应数量的DCIK(1.6×10⁵/孔，100μL/孔)；

d)根据分组，相应孔加入10μL/孔纯化的BsAb抗体(浓度分别为0.02、0.04、0.06μg/μL)，混匀；

e)37℃细胞培养箱孵育6小时；

f)加入cck8(Dojindo，日本)试剂(20μL/孔)，37℃细胞培养箱孵育2小时后，450nm处测定吸光度；

g)根据cck8试剂盒(Dojindo，日本)说明书，统计活细胞数目并推算杀伤效率：

杀伤率＝[((T+E)-T&E])/T]×100％

其中，T代表活的靶细胞数量；E代表活的效应细胞数量；则T+E等于活的靶细胞和效应细胞的总数；T&E代表靶细胞经效应细胞杀伤后的活细胞数量。

HBV BsAb联合DCIK细胞杀伤实验的结果如图5所示。

在图5中，纵轴表示靶细胞死亡率的相对值，1表示100％的靶细胞均死亡；横坐标表示不同组别。由图5可知，BsAb 0.02、BsAb 0.04、BsAb 0.06分别对应表 3-组4中的BsAb抗体浓度分别为0.02、0.04、0.06μg/μL的设置；DICK为表 3-组3的结果；由此可知，单纯加入效应细胞DICK，对靶细胞杀伤效果不佳，仅为35％左右；而同时加入DICK和BsAb的组4，靶细胞杀伤效果分别可达69％、82％和92％，且随BsAb抗体浓度的增加，杀伤效果越好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种特异性双靶向抗体，其特征在于，所述双靶向特异性抗体具有特异性与人类CD3结合的第一抗原结合结构域和特异性与HBV抗原结合的第二抗原结合结构域。

2.如权利要求1所述的特异性双靶向抗体，其特征在于，所述双靶向特异性抗体包括至少一条第一抗原结合结构域的HCVR氨基酸序列、至少一条第一抗原结合结构域的LCVR氨基酸序列、至少一条第二抗原结合结构域的HCVR氨基酸序列、以及至少一条第二抗原结合结构域的LCVR氨基酸序列；其中，所述HCVR和LCVR分别为在表1中任选的HCVR和LCVR氨基酸序列。

3.一种特异性双靶向抗体按下述一种或多种方法进行应用：

(1)将所述特异性双靶向抗体单独进行应用；

4.一种药物组合物，包括至少一种如权利要求1所述的特异性双靶向抗体，及诊断剂、可药用的载剂、赋形剂或稀释剂。

5.一种核酸分子，其特征在于，编码如权利要求1所述的特异性双靶向抗体的氨基酸序列。

6.一种重组载体，其特征在于，具有如权利要求7所述的任一核酸分子序列。

7.如权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为表达载体或微环DNA。

8.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求6所述的重组载体。

9.一种抗体药物，其特征在于，为如权利要求1所述的任一特异性双靶向抗体，与人类CD3结合，并于体外诱导T细胞介导的对HBV阳性细胞进行的杀伤。

10.如权利要求1所述的特异性双靶向抗体或如如权利要求6所述的重组载体在制备诊断、预防、治疗HBV疾病的试剂或药物中的应用。