DE69909459T2

DE69909459T2 - Cd19xcd3 spezifische polypeptide und deren verwendung

Info

Publication number: DE69909459T2
Application number: DE69909459T
Authority: DE
Inventors: Peter Kufer; Ralf Lutterbüse; Ralf Bargou; Anja Löffler; Bernd DÖRKEN; Gert Riethmüller
Original assignee: Micromet GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 1998-04-21
Filing date: 1999-04-21
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2019-04-22
Also published as: CN1299410A; SK15792000A3; US7112324B1; PL199747B1; ATE244758T1; CN1302103C; EP1071752A1; PL344016A1; BRPI9909860B8; TR200003087T2; AU761587B2; HUP0102535A3; CZ20003889A3; AU4135299A; BR9909860A; HU229039B1; CA2326389C; HRP20000714B1; RU2228202C2; KR20010071150A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue multifunktionelle Einzelketten-Polypeptide, die mindestens zwei Bindungsstellen umfassen, die für die CD19- bzw. CD3-Antigene spezifisch sind. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Polypeptid, wobei das vorstehend beschriebene Polypeptid mindestens eine weitere Domäne umfasst, vorzugsweise mit vorbestimmter Funktion. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die die Polypeptide codieren, sowie Vektoren, die die Polynucleotide umfassen, und Wirtszellen, die damit transformiert wurden und deren Verwendung bei der Herstellung der Polypeptide. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen, vorzugsweise Arzneimittel und Diagnostika, die jedes der vorstehend beschriebenen Polypeptide, Polynucleotide oder Vektoren umfassen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der vorstehend erwähnten Polypeptide, Polynucleotide und Vektoren zur Herstellung von Arzneimitteln für die Immuntherapie, vorzugsweise gegen B-Zell-Malignitäten wie Non-Hodgkin-Lymphom.
Es werden mehrere Dokumente im ganzen Text dieser Beschreibung zitiert. Jedes dieser hier zitierten Dokumente (einschließlich der Spezifikationen des Herstellers, Anweisungen etc.) werden hier durch Bezugnahme einbezogen; es wird jedoch nicht eingeräumt, dass irgendein zitiertes Dokument tatsächlich Stand der Technik der vorliegenden Erfindung ist.
Trotz der medizinischen Bedeutung brachte die Forschung bei den B-Zell-vermittelten Erkrankungen wie dem Non-Hodgkin-Lymphom nur eine kleine Zahl klinisch verwendbarer Daten hervor, und konventionelle Ansätze, um derartige Erkrankungen zu heilen, bleiben anstrengend und unerfreulich und/oder bergen ein hohes Rückfallrisiko. Auch wenn beispielsweise eine hochdosierte Chemotherapie als Primärbehandlung für das hochmaligne Non-Hodgkin-Lymphom das Überleben insgesamt verbessern kann, sterben noch 50% der Patienten an dieser Erkrankung (2–4). Außerdem ist die niedrigmaligne Non-Hodgkin lymphomartige chronische lymphatische Leukämie und das Mantelzell-Lymphom immer noch nicht heilbar. Das hat die Suche nach alternativen Strategien wie die Immuntherapie angeregt. Antikörper, die gegen durch CD-Antigene definierte Zelloberflächenmoleküle gerichtet sind, stellen eine einzigartige Gelegenheit zur Entwicklung von therapeutischen Reagenzien dar.
Die Expression bestimmter CD-Antigene ist stark auf spezifische Linien von lymphohämatopoetischen Zellen begrenzt und während der letzten Jahre wurden Antikörper verwendet, die gegen lymphoid-spezifische Antigene gerichtet waren, um Behandlungen zu entwickeln, die entweder in vitro oder in Tiermodellen wirksam waren (5–13). In dieser Hinsicht hat sich CD19 als sehr nützliches Ziel erwiesen. CD19 wird in der gesamten B-Linie von der Prä-B-Zelle bis zur reifen B-Zelle exprimiert, wird nicht sekretiert, wird einheitlich auf allen Lymphomzellen exprimiert und fehlt den Stammzellen (8, 14). Eine interessante Modalität ist die Anwendung eines bispezifischen Antikörpers mit einer Spezifität für CD19 und einer anderen für das CD3-Antigen auf T-Zellen. Jedoch weisen die bisher zur Verfügung stehenden Antikörper eine niedrige T-Zellcytotoxizität auf und erfordern costimulatorische Mittel, um eine zufriedenstellende biologische Aktivität zu zeigen.
Somit bestand das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Problem darin, Mittel und Verfahren bereitzustellen, die für die Behandlung von B-Zell-vermittelten Erkrankungen wie verschiedene Formen des Non-Hodgkin-Lymphoms nützlich sind. Die Lösung des technischen Problems wird dadurch erreicht, indem die in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen bereitgestellt werden.
Demnach betrifft die vorliegende Erfindung ein multifunktionelles Einzelketten-Polypeptid, umfassend

(a) eine erste Domäne, die eine Bindungsstelle einer Immunglobulinkette oder eines Antikörpers umfasst, der das CD19-Antigen spezifisch erkennt; und
(b) eine zweite Domäne, die eine Bindungsstelle einer Immunglobulinkette oder eines Antikörpers umfasst, der das CD3-Antigen von menschlichen T-Zellen spezifisch erkennt, wobei die Domänen in der Reihenfolge V_LCD19-V_HCD19-V_HCD3-V_LCD3 angeordnet sind.

Die Begriffe „erste Domäne" und „zweite Domäne" gemäß der vorliegenden Erfindung bedeuten, dass eine Bindungsstelle gegen den pan B-Zellmarker CD19 gerichtet ist, der auf der größten Mehrheit der malignen B-Zellen einheitlich exprimiert wird, die andere Bindungsstelle ist gegen das CD3-Antigen von menschlichen T-Zellen gerichtet.
Der Begriff „Bindungsstelle", wie er gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezeichnet eine Domäne, die eine dreidimensionale Struktur umfasst, die an ein Epitop wie native Antikörper, freie scFv-Fragmente oder eine ihrer entsprechenden Immunglobulinketten, vorzugsweise die V_H-Kette, spezifisch binden kann. Somit kann die Domäne die V_H-Domäne und/oder die V_L-Domäne eines Antikörpers oder einer Immunglobulinkette, vorzugsweise mindestens die V_H-Domäne, umfassen. Andererseits können die in dem erfindungsgemäßen Polypeptid enthaltenen Bindungsstellen mindestens eine komplementaritätsbestimmende Region (CDR) eines Antikörpers oder einer Immunglobulinkette umfassen, die die C19- bzw. CD3-Antigene erkennt. In dieser Hinsicht wird angemerkt, dass die Domänen der in dem erfindungsgemäßen Polypeptid vorliegenden Bindungsstellen nicht nur von Antikörper stammen können, sondern auch von anderen CD19- oder CD3-Bindungsproteinen wie natürlich auftretende Rezeptoren oder Liganden. Erfindungsgemäß ist die Bindungsstelle in einer Domäne enthalten.
Der Begriff „multifunktionales Polypeptid", wie hier verwendet, bezeichnet ein Polypeptid, das mindestens zwei Aminosäuresequenzen umfasst, die von verschiedenen Ursprüngen stammen, d. h. von zwei verschiedenen Molekülen, die gegebenenfalls von verschiedenen Arten stammen, wobei mindestens zwei der Ursprünge die Bindungsstelle spezifizieren. Demnach spezifizieren die Bindungsstellen die Funktionen oder mindestens einige Funktionen des multifunktionalen Peptids. Derartige Polypeptide schließen beispielsweise bispezifische Einzelketten (bsc)-Antikörper ein.
Der Begriff „Einzelkette", wie er gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet, dass die erste und zweite Domäne des Polypeptids covalent gebunden sind, vorzugsweise in Form einer colinearen Aminosäuresequenz, die durch ein Nucleinsäuremolekül codierbar ist.
CD19 bezeichnet ein Antigen, dass in der B-Linie wie in der Pro-B-Zelle und der reifen B-Zelle exprtmiert wird, nicht sekretiert wird, einheitlich auf allen Lymphomzellen exprtmiert wird und Stammzellen fehlt (8, 14).
CD3 bezeichnet ein Antigen, dass auf T-Zellen als Teil des multimolekularen T-Zellrezeptorkomplexes exprtmiert wird und das aus drei verschiedenen Ketten CD3ε, CD3δ und CDγ besteht. Die gruppenartige Verteilung von CD auf T-Zellen, z. B. durch immobili sierte anti-CD3-Antikörper, führt zur Aktivierung der T-Zellen, die dem Engagement des T-Zellrezeptors ähnelt, jedoch unabhängig von seiner clontypischen Spezifität ist. Tatsächlich erkennen die meisten anti-CD3-Antikörper die CD3ε-Kette.
Antikörper, die spezifisch das CD19- oder CD3-Antigen erkennen, werden im Stand der Technik beschrieben, z. B. bei (24), (25) bzw. (43) und können durch aus dem Fachgebiet bekannte herkömmliche Verfahren erzeugt werden.
Es wurde bereits gezeigt, dass bispezifische, nicht dem Einzelkettenformat entsprechende CD19 × CD3-Antikörper in vitro (5, 6, 9–11, 13, 43), in Tiermodellen (7, 28) sowie in einigen klinischen Pilotstudien (12, 29, 30) wirksam sind, indem sie die T-Zelltoxizität auf Lymphomzellen auf eine MHC-unabhängige Weise erneut anvisieren. Bisher wurden diese Antikörper durch Hybrid-Hybridomtechniken konstruiert, indem die monoclonalen Antikörper covalent (31) oder durch einen Diabody-Ansatz verbunden wurden (43). Ausführlichere klinische Studien wurden durch die Tatsache behindert, dass diese Antikörper eine niedrige biologische Aktivität besitzen, so dass hohe Dosen angewendet werden müssen und dass die Anwendung der Antikörper alleine nicht für eine nützliche therapeutische Wirkung sorgten. Ferner war die Verfügbarkeit von Material mit klinischem Reinheitsgrad begrenzt.
Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, glaubt man, dass durch die Verwendung des bispezifischen antikörperähnlichen Formats, wie vorstehend definiert, Polypeptide wie die bispezifischen CD19 × CD3-Antikörper erzeugt werden können, die gewöhnlich CD-19-positive Zielzellen durch Rekrutierung cytotoxischer T-Lymphocyten zerstören können, ohne dass eine Prä- und/oder Costimulation der T-Zellen erforderlich ist. Das steht im starken Kontrast zu allen bekannten bispezifischen CD19 × CD3-Antikörpern, die nach anderen molekularen Formaten hergestellt wurden und hängt gewöhnlich nicht von den besonderen CD 19- oder CD3-Antikörperspezifitäten ab, die verwendet werden, um z. B. den bispezifischen Einzelketten-Antikörper zu konstruieren. Die Unabhängigkeit von der Prä- und/oder Costimulation der T-Zellen kann wesentlich zu der außergewöhnlich hohen Cytotoxizität beitragen, die von dem erfindungsgemäßen Polypeptid vermittelt wird, wie durch die besonderen bispezifischen CD19 × CD3-Antikörper veranschaulicht wird, die in den Beispielen beschrieben werden.
Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft des erfindungsgemäßen Polypeptids ist, dass es aufgrund seiner kleinen, relativ kompakten Struktur leicht herzustellen und zu reinigen ist, wobei die Probleme einer niedrigen Ausbeute und das Auftreten von schlecht definierten Nebenprodukten oder mühsamen Reinigungsverfahren umgangen werden können, über die von bei C19 × CD3-spezifischen Antikörpern berichtet wurden, die bis dahin aus Hybridhybridomen, durch chemische Bindung oder durch Renaturierung aus bakteriellen Einschlusskörpern hergestellt wurden (15–19). Im Folgenden werden die vorteilhaften und unerwarteten Eigenschaften des erfindungsgemäßen Polypeptids auf eine nicht begrenzende Weise mit den Beispielen im Anhang als Leitlinie diskutiert, einschließlich einiger der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen, auf die hier nachstehend Bezug genommen wird, die das breite Konzept der vorliegenden Erfindung veranschaulichen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein eukaryontisches Expressionssystem verwendet, das für die Herstellung rekombinanter bispezifischer Einzelketten-Antikörper entwickelt wurde (1), um einen rekombinanten bispezifischen CD19 × CD3-Einzelketten-Antikörper durch Expression in CHO-Zellen zu erzeugen. Der voll funktionsfähige Antikörper wurde einfach aus dem Kulturüberstand durch seinen C-terminalen Histidin-Tag auf einer Ni-NTA-Chromatographiesäule gereinigt. Die spezifische Bindung an CD19 und CD3 wurde durch FACS-Analyse gezeigt. Das sich ergebende erfindungsgemäße bscCD19 × CD3 (bispezifische Einzelketten-CD19 × CD3-) Molekül zeigte einige unerwartete Eigenschaften:

– Es induzierte starke Lymphom-gerichtete T-Zellcytotoxizität in vitro und in vivo. Sogar bei sehr geringen Konzentrationen von 10–100 pg/ml und niedrigem E (Effektor): T (Ziel) Verhältnis von 5 : 1 und 2,5 : 1 wurde eine signifikante spezifische Lyse von Lymphomzelllinien beobachtet. Ferner zeigten 3 μg bis 10 μg des erfindungsgemäßen bscCD19 × CD3-Moleküls bei einer Einzelfallbehandlung eine klare und signifikante Verbesserung des medizinischen Status. Im Vergleich bisher veröffentlichten CD19 × CD3-Antikörpern, die durch Hybridomtechniken oder Diabody-Ansätze hergestellt wurden (die auch ein unterschiedliches Format repräsentieren), die eine cytotoxische Aktivität im Bereich von mehreren Nanogramm/ml oder sogar μg/ml zeigen, scheint der erfindungsgemäße bscCD19 × CD3-Antikörper viel wirksamer zu sein (5–7, 27, 43), wie z. B. in den Beispielen 4, 5 und 7 im Anhang dokumentiert.
– Sogar niedrige Konzentrationen des erfindungsgemäßen bscCD19 × CD3 konnten eine rasche Lymphom-gerichtete Cytotoxizität (nach 4 h) bei niedrigen E : T-Verhältnissen induzieren, ohne dass eine T-Zellstimulation erforderlich war. Dagegen zeigte ein herkömmlicher bispezifischer CD19 × CD3 Antikörper (5–7, 27) unter diesen Bedingungen (nämlich keine Prästimulation der T-Zellen, niedriges E : T Verhältnis) sogar bei hohen Konzentrationen bis zu 3000 ng/ml keine signifikante cytotoxische Aktivität. Obwohl über die Induktion von cytotoxischer Aktivität ohne Prästimulation auch im Fall eines anderen herkömmlichen CD19 × CD3-Antikörpers berichtet wurde, wurde diese Wirkung nur bei hohen Konzentrationen und hohen E : T-Verhältnissen (100 ng/ml, 27 : 1) (9) im Vergleich zum erfindungsgemäßen bscCD19 × CD3 (100 pg/ml, 2,5 : 1) erzielt. Zudem wurde eine cytotoxische Wirkung dieses herkömmlichen Antikörpers erst 1-tägiger Prästimulation mit dem bispezifischen Antikörper selbst beobachtet, während der erfindungsgemäße bscCD19 × CD3 eine Lymphom-gerichtete Cytotoxizität bereits nach 4 Stunden induzierte. Soweit den Erfindern bekannt ist, wurde eine derartig rasche und spezifische cytotoxische Aktivität von nicht stimulierten T-Zellen bei derartig niedrigem Konzentrationen und E : T-Verhältnissen nicht für andere bisher verwendete bispezifische Antikörper beschrieben. Obwohl kürzlich gezeigt wurde, dass ein bispezifischer anti-ρ185HER2/anti-CD3-F(ab)₂-Antikörper die cytotoxische Aktivität bei ähnlichen Konzentrationen wie der erfindungsgemäße bscCD19 × CD3 induzieren kann, benötigte dieser Antikörper eine 24-stündige Prästimulation mit IL-2 (32). Somit zeigt der erfindungsgemäße bscCD19 × CD3-Antikörper einzigartige cytotoxische Eigenschaften, die dieses Molekül von anderen bisher beschriebenen bispezifischen Antikörpern unterscheiden.

Der erfindungsgemäße bscCD19 × CD3 vermittelt cytotoxische Wirkungen, die antigenspezifisch sind, was durch die Tatsachen gezeigt wird

– dass dieser Antikörper die Plasmacytomzellinien NCl und L363 nicht lysieren konnte, die Zelllinien der B-Zelllinie sind, die das CD19-Antigen nicht exprimiert; und
– dass die Cytotoxizität gegen Lymphomzellen durch den elterlichen anti-CD19-Antikörper HD37 blockiert werden könnten. (Der HD37 Antikörper stammt von dem HD37-Hybridom ab (22)).

Die Blockade des Perforin-Weges durch Calcium-Mangel mit EGTA blockierte vollkommen die bscCD19 × CD3-vermittelte Cytotoxizität, was nahe legte, dass die spezifische Lyse vielmehr eine T-Zell-vermittelte Wirkung ist als eine direkte Wirkung des Antikörpers selbst.
Im Hinblick auf seine beträchtlich höhere biologische Aktivität sowie der Möglichkeit ihn schnell und einfach herzustellen, wobei sich Material mit klinischem Reinheitsgrad von höchster Qualität gewonnen wurde, ist insgesamt gesehen der nach der allgemeinen erfin dungsgemäßen Lehre konstruierte bscCD19 × CD3-Antikörper besser als bisher beschriebene bispezifische CD19 × CD3-Antikörper.
Deshalb erwartet man, dass die erfindungsgemäßen bscCD19 × CD3-Moleküle geeignete Kandidaten sind, um einen therapeutischen Nutzen der bispezifischen Antikörper bei der Behandlung von B-Zell-vermittelten Erkrankungen wie Non-Hodgkin-Lymphom in klinischen Studien zu beweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Polypeptids sind die Domänen durch einen Polypeptidlinker verbunden. Der Linker liegt zwischen der ersten und zweiten Domäne, wobei der Polypeptidlinker vorzugsweise mehrere hydrophile, durch Peptidbindungen verbundene Aminosäuren umfasst und den N-Terminus der ersten Domäne und den C-Terminus der zweiten Domäne verbindet.
In einer weiteren erfindungsgemäßen bevorzugten Ausführungsform ahmen die erste und/oder zweite Domäne des vorstehend beschriebenen Polypeptids eine V_H- und V_L-Region aus einem natürlichen Antikörper nach oder entsprechen ihr. Der Antikörper, der die Bindungsstelle für das erfindungsgemäße Polypeptid bereitstellt, kann z. B. ein monoclonaler Antikörper, ein polyclonaler Antikörper, ein chimerer Antikörper, ein humanisierter Antikörper, ein bispezifischer Antikörper, ein synthetischer Antikörper, ein Antikörperfragment wie Fab, Fv oder scFv-Fragmente etc. sein oder ein chemisch modifizierter Abkömmling von einem davon. Monoclonale Antikörper können beispielsweise durch Techniken hergestellt werden, wie sie ursprünglich bei Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 495 und Galfré, Meth. Enzymol. 73 (1981, 3) beschrieben wurden, die die Fusion von Mausmyelomzellen mit Milzzellen umfassen, die von immunisierten Säugern mit Modifikationen stammen, die vom Fachgebiet entwickelt wurden.
Ferner können Antikörper oder Fragmente davon gegen die vorstehend erwähnten Antigene unter Verwendung von Verfahren erhalten werden, die z. B. bei Harlow und Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988, beschrieben werden. Antikörper können von mehreren Arten einschließlich dem Menschen erhalten werden. Beim Erhalten von Abkömmlingen der Antikörper durch Phagendisplayverfahren kann Oberflächenplasmonresonanz, wie beim BIAcore-System eingesetzt, verwendet werden, um die Wirksamkeit von Phagenantikörpern, die an ein Epitop des CD19- oder CD3-Antigens binden, zu erhöhen (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97–105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7–13). Die Herstellung chimerer Antikörper wird beispielsweise in WO 89/09622 beschrieben. Verfahren zur Herstellung humanisierter Antikörper werden z. B. in EP-A1 0 239 400 und WO 90/07861 beschrieben. Eine weitere Antikörperquelle, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, sind die sogenannten xenogenen Antikörper. Das allgemeine Prinzip zur Herstellung xenogener Antikörper wie menschliche Antikörper in Mäusen wird z. B. in WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 und WO 96/33735 beschrieben.
Antikörper, die erfindungsgemäß verwendet werden sollen, oder ihre entsprechende(n) Immunglobulinkette(n) können weiter unter Verwendung von herkömmlichen aus dem Fachgebiet bekannten Techniken, beispielsweise durch Verwendung von aus dem Fachgebiet bekannter Aminosäuredeletion(en), Insertion(en), Substitution(en), Additionen) und/oder Rekombination(en) und/oder andere Modifikationen) entweder allein oder in Kombination modifiziert werden. Verfahren zur Einführung derartiger Modifikationen in die DNA-Sequenz, die auf der Aminosäuresequenz einer Immunglobulinkette basiert, sind dem Fachmann gut bekannt; vgl. z. B. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. Die Modifikationen, auf die Bezug genommen wird, werden vorzugsweise auf der Nucleinsäureebene durchgeführt.
In einer weiteren erfindungsgemäßen bevorzugten Ausführungsform ist mindestens eine der Domänen in dem vorstehend beschriebenen Polypeptid ein Einzelkettenfragment der variablen Region des Antikörpers.
Wie gut bekannt ist, besteht Fv, das kleinste Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und Bindungsstelle enthält, aus einem Dimer einer schweren und einer leichten Kette der variablen Domäne (V_H und V_L) in einer nicht-covalenten Verbindung. In dieser Konfiguration, die derjenigen entspricht, die man in nativen Antikörpern findet, interagieren die drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) jeder variablen Domäne, um eine Antigenbindungsstelle auf der Oberfläche des V_H-V_L-Dimers zu definieren. Insgesamt verleihen die sechs CDRs dem Antikörper die Antigenspezifität. Frameworks (FRs), die die CDRs flankieren, besitzen eine Tertiärstruktur, die im wesentlichen in den nativen Immunglobulinen der Arten, die so verschieden wie Mensch und Maus sind, konserviert ist. Diese FRs dienen dazu, die CDRs in ihrer geeigneten Orientierung zu halten. Die konstanten Domänen sind für die Bindungsfunktion nicht erforderlich, können jedoch bei der Stabilisierung der V_H-V_L-Interaktionen helfen. Sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, das nur drei für das Antigen spezifische CDRs umfasst) besitzt die Fähigkeit, ein Antigen zu erkennen und zu binden, wenn auch gewöhnlich mit niedriger Affinität als eine ganze Bindungsstelle (Painter, Biochem. 11 (1972), 1327–1337). Es ist jedoch wichtig, dass die V_H- und V_L-Domänen so angeordnet sind, dass sich die Antigenbindungsstelle richtig falten kann.
Bei den erfindungsgemäßen Polypeptiden sind die Domänen in der Reihenfolge V_LCD19-V_HCD19-V_HCD3-V_LCD3 angeordnet, wobei „V_L" und „V_H" die leichte und schwere Kette der variablen Domäne der spezifischen anti-CD19- und anti-CD3-Antikörper bezeichnen.
Wie vorstehend diskutiert, sind die Bindungsstellen vorzugsweise durch einen flexiblen Linker, vorzugsweise durch einen Polypeptidlinker, verbunden, der zwischen den Domänen liegt, wobei der Polypeptidlinker mehrere hydrophile, durch Peptidbindungen verbundene Aminosäuren mit einer Länge umfasst, die ausreicht, um den Abstand zwischen dem C-terminalen Ende der einen Domäne zu überspannen, wobei die Bindungsstellen und der N-Terminus der anderen Domäne umfasst werden, die die Bindungsstellen umfasst, wenn das erfindungsgemäße Polypeptid eine Konformation annimmt, die beim Einbringen in eine wässrige Lösung geeignet ist. Vorzugsweise umfasst der Polypeptidlinker eine Vielzahl von Glycin-, Alanin- und/oder Serinresten. Es wird ferner bevorzugt, dass der Polypeptidlinker mehrere aufeinanderfolgende Kopien einer Aminosäuresequenz umfasst. Gewöhnlich umfasst der Polypeptidlinker 1 bis 15 Aminosäuren, obwohl Polypeptidlinker mit mehr als 15 Aminosäuren auch funktionieren können. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst der Polypeptidlinker 1 bis 5 Aminosäurereste.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Polypeptidlinker in dem erfindungsgemäßen Polypeptid 5 Aminosäuren. Wie in den Beispielen im Anhang gezeigt, umfasst der Polypeptidlinker vorteilhafterweise die Aminosäuresequenz Gly Gly Gly Gly Ser.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste Domäne des erfindungsgemäßen Polypeptids mindestens eine CDR der V_H- und V_L-Region, die die Aminosäuresequenz umfasst, die von der DNA-Sequenz codiert wird, die in 8 von den Nucleotiden 82 bis 414 (V_L) und den Nucleotiden 460 bis 831 (V_H) dargestellt wird, und/oder die zweite Domäne umfasst mindestens ein CDR, besonders bevorzugt zwei und am meisten zweite Domäne umfasst mindestens ein CDR, besonders bevorzugt zwei und am meisten bevorzugt drei CDRs der V_H- und V_L-Region, die die Aminosäuresequenz umfasst, die von der DNA-Sequenz codiert wird, die in 8 von den Nucleotiden 847 bis 1203 (V_H) und den Nucleotiden 1258 bis 1575 (V_L) dargestellt wird, gegebenenfalls in Kombination mit Framework-Regionen, die zusammen mit den CDRs in elterlichen Antikörpern auftreten. Die in den variablen Regionen enthaltenen, in 8 dargestellten CDRs können beispielsweise nach Kabat, „Sequences of Proteins of Immunological Interest" (U.S. Department of Health and Human Services, 3. Ausgabe, 1983; 4. Ausgabe, 1987; 5. Ausgabe, 1990) bestimmt werden. Dem Fachmann ist sofort bewusst, dass die Bindungsstelle oder mindestens eine davon abstammende CDR für die Konstruktion eines erfindungsgemäßen Polypeptids verwendet werden kann. Vorzugsweise umfasst das Polypeptid die Aminosäuresequenz, die von der DNA-Sequenz codiert wird, wie in 8 von den Nucleotiden 82 bis 1575 dargestellt. Dem Fachmann ist sofort bewusst, dass die Bindungsstellen des erfindungsgemäßen Polypeptids nach den aus dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert werden können, wie z. B. in EP-A1 0 451 216 und EP-A1 0 549 581 beschrieben.
Die Domänen der Bindungsstellen des erfindungsgemäßen Polypeptids besitzen vorzugsweise eine Spezifität, die mindestens im wesentlichen mit der Bindungsspezifität von z. B. dem Antikörper oder der Immunglobulinkette identisch ist, von dem/der sie abstammen. Derartige Bindungsstellendomänen können eine Bindungsaffinität von mindestens 10⁵M^–1 aufweisen, vorzugsweise nicht höher als 10⁷ M^–1 für das CD3-Antigen und vorteilhafterweise bis zu 10¹⁰M^–1 oder höher für das CD19-Antigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Polypeptids besitzt

(a) die Bindungsstelle der ersten Domäne eine Affinität von mindestens etwa 10^–7 M, vorzugsweise mindestens etwa 10^–9 M und am meisten bevorzugt mindestens etwa 10^–11 M; und/oder
(b) die Bindungsstelle der zweiten Domäne eine Affinität von weniger etwa 10^–7 M, vorzugsweise weniger als etwa 10^–6 M und am meisten bevorzugt im Bereich von 10^–5 M.

Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen, auf die vorstehend Bezug genommen wurde, ist es vorteilhaft, wenn die Bindungsstelle, die das CD19-Antigen erkennt, eine hohe Affinität besitzt, um die Zielzellen einzufangen, die mit hoher Effizienz zerstört werden sollen. Andererseits sollte die Affinität der Bindungsstelle, die das CD3-Antigen erkennt, im Bereich des natürlichen CD3-Rezeptors oder in demjenigen liegen, den man gewöhnlich für die Interakti on des T-Zellrezeptors mit seinem Liganden findet, der ein MHC-Peptidkomplex auf der Zielzelloberfläche ist.
In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das vorstehend beschriebene Polypeptid ein bispezifischer Einzelketten-Antikörper.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Polypeptid, das mindestens eine weitere Domäne umfasst, wobei die Domänen durch covalente oder nicht covalente Bindungen verbunden sind.
Die Verbindung kann auf einer genetischen Fusion nach den aus dem Fachgebiet bekannten und vorstehend beschriebenen Verfahren basieren oder kann z. B. durch chemische Vernetzung erfolgen, wie in WO 94/04686 beschrieben. Die zusätzliche Domäne, die in dem erfindungsgemäßen Polypeptid vorliegt, kann vorzugsweise durch einen flexiblen Linker, vorteilhafterweise einem Polypeptidlinker, mit einer der Bindungsstellendomänen verbunden werden, wobei der Polypeptidlinker mehrere hydrophile, über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren mit einer Länge umfasst, die ausreicht, um den Abstand zwischen dem C-Terminus der einen Domäne und dem N-Terminus der anderen Domäne zu umspannen, wenn das Polypeptid eine Konformation annimmt, die für die Bindung beim Einbringen in eine wässrige Lösung geeignet ist. Vorzugsweise ist der Polypeptidlinker ein Polypeptidlinker, wie hier in den vorstehenden Ausführungsformen beschrieben. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann ferner einen spaltbaren Linker oder eine Spaltungsstelle für Proteinasen, wie Enterokinase umfassen; vgl. auch die Beispiele im Anhang.
Ferner kann die zusätzliche Domäne eine vordefinierte Spezifität oder Funktion aufweisen. Beispielsweise enthält die Literatur viele Referenzen zum Konzept des „Targetings" von bioaktiven Substanzen wie Medikamente, Toxine und Enzyme gegen spezifische Stellen im Körper, um maligne Zellen zu zerstören oder zu lokalisieren, oder um ein lokalisiertes Medikament oder eine enzymatische Wirkung zu induzieren. Es wurde vorgeschlagen, diesen Effekt durch Konjugieren bioaktiver Substanzen an monoclonale Antikörper zu erreichen (vgl. z. B. N.Y. Oxford University Press und Ghose J., Natl. Cancer Inst. 61 (1978), 657–676)
In diesem Zusammenhang nimmt man auch an, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide durch herkömmliche aus dem Fachgebiet bekannte Verfahren weiter modifiziert werden können. Das erlaubt die Konstruktion chimerer Proteine, die die erfindungsgemäßen Polypeptide und andere funktionale Aminosäuresequenzen umfassen, z. B. Lokalisierungssignale im Kern, transaktivierende Domänen, DNA-bindende Domänen, Hormon-bindende Domänen, Protein- Tags (GST, GFP; h-myc-Peptid, FLAG, HA-Peptid), das von heterologen Proteinen stammen kann. Wie in den Beispielen im Anhang beschrieben, umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid vorzugsweise einen FLAG-Tag mit einer Länge von mindestens 8 Aminosäuren; vgl. 8.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können therapeutisch bei Patienten verwendet werden, die an B-Zell-Erkrankungen wie B-Zelllymphom, B-Zellen abstammende chronische lymphatische Leukämie (B-CLL) und/oder einer B-Zellverwandten Autoimmunkrankheit wie Myastenia gravis, Morbus Basedow, Hashimoto Thyreoiditis oder Goodpasture-Syndrom leiden. Eine derartige Therapie kann beispielsweise durch die Verabreichung von erfindungsgemäßen Polypeptiden erfolgen. Bei einer derartigen Verabreichung können sowohl nicht markierte als auch markierte Polypeptide verwendet werden.
Beispielsweise könnten die erfindungsgemäßen Polypeptide markiert mit einem Therapeutikum verabreicht werden. Diese Mittel können entweder direkt oder indirekt an die erfindungsgemäßen Antikörper oder Antigene gekoppelt werden. Ein Beispiel der indirekten Kopplung ist die Verwendung einer Spacereinheit. Diese Spacereinheiten können wiederum entweder unlöslich oder löslich sein (Diener, Science 231 (1986), 148) und können ausgewählt werden, um die Medikamentenfreisetzung aus dem Antigen an der Zielstelle zu ermöglichen. Beispiele von Therapeutika, die an erfindungsgemäße Polypeptide zur Immuntherapie gekoppelt werden können, sind Medikamente, Radioisotope, Lektine und Toxine. Die Medikamente, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide konjugiert werden können, schließen Verbindungen ein, die klassisch als Medikamente bezeichnet werden wie Mitomycin C, Daunorubicin und Vinblastin.
Bei der Verwendung von mit Radioisotopen konjugierten erfindungsgemäßen Polypeptiden für z. B. die Immuntherapie können bestimmte Isotope mehr bevorzugt werden als andere, abhängig von derartigen Faktoren wie die Leukocytenverteilung sowie Stabilität und Emission. Abhängig von der Autoimmunreaktion sind einige Emitter anderen mehr vorzuziehen. Im allgemeinen werden α- und β-Teilchen emittierende Radioisotopen in der Immuntherapie vorgezogen. Es werden hochenergetische α-Emitter mit kurzer Reichweite wie ²¹²Bi bevorzugt. Beispiele von Radioisotopen, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide für therapeutische Zwecke gebunden werden können, sind ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹²Bi, ²¹²At, ²¹¹Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd und ¹⁸⁸Re.
Lektine sind gewöhnlich aus Pflanzenmaterial isolierte Proteine, die an spezifische Zuckereinheiten binden. Viele Lektine können auch Zellen agglutinieren und Lymphocyten stimulieren. Ricin ist jedoch ein toxisches Lektin, das immuntherapeutisch verwendet wird. Das erfolgt durch Bindung der α-Peptidkette von Ricin, die für die Toxizität verantwortlich ist, an das Polypeptid, um den ortsspezifischen Transfer der toxischen Wirkung zu ermöglichen. Toxine sind giftige, von Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen produzierte Substanzen, die in ausreichender Dosis letal sind. Das Diphtherietoxin ist eine von Corynebacterium diphtheriae produzierte Substanz, die therapeutisch verwendet werden kann. Dieses Toxin besteht aus einer α- und β-Einheit, die unter den richtigen Bedingungen getrennt werden kann. Die toxische A-Komponente kann an ein erfindungsgemäßes Polypeptid gebunden werden und für den ortsspezifischen Transfer an den interagierenden B-Zellen und T-Zellen verwendet werden, die durch die Bindung an ein erfindungsgemäßes Polypeptid ganz nah zusammengebracht werden.
Andere Therapeutika, wie vorstehend beschrieben, die an das erfindungsgemäße Polypeptid gekoppelt werden können, sowie entsprechende therapeutische ex-vivo- und in-vivo-Vorschriften sind dem Fachmann bekannt oder können leicht ermittelt werden. Wo immer es passend erscheint, kann der Fachmann ein erfindungsgemäßes Polypeptid verwenden, das hier nachstehend beschrieben wird, wobei jedes der vorstehend beschriebenen Polypeptide oder die entsprechenden Vektoren anstatt dem Proteinmaterial selbst verwendet werden können.
Somit ist dem Fachmann sofort bewusst, dass das erfindungsgemäße Polypeptid zur Konstruktion anderer Polypeptide mit gewünschter Spezifität und biologischer Funktion verwendet werden kann. Man erwartet, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide eine wichtige therapeutische und wissenschaftliche Rolle, insbesondere auf dem Gebiet der Medizin spielen, beispielsweise bei der Entwicklung neuer Behandlungsansätze für B-Zell-verwandte Erkrankungen wie bestimmte Krebsformen und Autoimmunerkrankungen oder als interessante Werkzeuge zur Analyse und Modulation der entsprechenden zellulären Signalübertragungswege.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst mindestens eine weitere Domäne ein Molekül, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Effektormolekülen, die eine bestimmte Konformation besitzen, die für die biologische Aktivität geeignet ist, Aminosäuresequenzen, die ein Ion komplexieren können und Aminosäuresequenzen, die selektiv an einen festen Träger oder ein vorselektiertes Antigen binden können.
Vorzugsweise umfasst die weitere Domäne ein Enzym, Toxin, Rezeptor, Bindungsstelle, biosynthetische Antikörperbindungsstelle, Wachstumsfaktor, Zelldifferenzierungsfaktor, Lymphokin, Cytokin, Hormon, eine fern nachweisbare Einheit, einen Antimetaboliten, ein radioaktives Atom oder ein Antigen. Das Antigen kann z. B. ein Tumorantigen, ein Virusantigen, ein mikrobielles Antigen, ein Allergen, ein Autoantigen, ein Virus, ein Mikroorganismus, ein Polypeptid, ein Peptid oder mehrere Tumorzellen sein.
Ferner wird die Sequenz, die ein Ion komplexieren kann, vorzugsweise aus Calmodulin, Methallothionein, einem funktionalen Fragment davon oder einer Aminosäuresequenz ausgewählt, die reich an mindestens einer Glutaminsäure, Asparaginsäure, Lysin und Arginin ist. Zusätzlich kann die Polypeptidsequenz, die zu einer selektiven Bindung an einen festen Träger fähig ist, eine positiv oder negativ geladene Aminosäure, eine Cystein enthaltende Aminosäuresequenz, Avidin, Streptavidin, ein funktionales Fragment von Streptococcen-Protein A, GST, einen His-Tag, einen FLAG-Tag oder LexA sein. Wie in den Beispielen im Anhang beschrieben, wurde das erfindungsgemäße durch einen Einzelketten-Antikörper veranschaulichte Polypeptid auch mit einem N-terminalen FLAG-Tag und/oder einem C-terminalen His-Tag exprtmiert, das eine einfache Reinigung und Nachweis erlaubt. Der im Beispiel verwendete FLAG-Tag umfasst 8 Aminosäuren (vgl. 8) und wird somit bevorzugt gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Jedoch sind auch FLAG-Tags geeignet, die verkürzte Versionen des FLAGS umfassen, die in den Beispielen im Anhang verwendet werden, wie die Aminosäuresequenz Asp-Tyr-Lys-Asp.
Die vorstehend beschriebenen Effektormoleküle und Aminosäuresequenzen können in einer Proform vorliegen, die selbst entweder aktiv oder inaktiv ist, und die entfernt werden kann, wenn sie z. B. in eine bestimmte zelluläre Umgebung gelangt.
In einer am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Rezeptor ein costimulatorisches Oberflächenmolekül, das für die T-Zellaktivierung wichtig ist oder eine Epitopenbindungsstelle oder eine Hormonbindungsstelle umfasst.
In einer weiteren am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das costimulatorische Oberflächenmolekül CD80 (B7-1) oder CD86 (B7-2).
In einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die bei Expression die vorstehend beschriebenen Polypeptide codieren. Die Polynucleotide können mit geeigneten aus dem Fachgebiet bekannten Expressionskontrollsequenzen fusioniert werden, um eine geeignete Transkription und Translation des Polypeptids sicherzustellen.
Das Polynucleotid kann z. B. DNA, cDNA, RNA oder synthetisch hergestellte DNA oder RNA oder ein rekombinant hergestelltes chimeres Nucleinsäuremolekül sein, das jedes der Polynucleotide entweder allein oder in Kombination umfasst. Vorzugsweise ist das Polynucleotid Teil eines Vektors. Derartige Vektoren können weitere Gene wie Markergene umfassen, die eine Selektion des Vektors in einer geeigneten Wirtszelle und unter geeigneten Bedingungen zulassen. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Polynucleotid funktional an die Expressionskontrollsequenzen gebunden, die die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen zulassen. Die Expression der Polynucleotide umfasst die Transkription des Polynucleotids in eine translatierbare mRNA. Regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryontischen Zellen, vorzugsweise Säugerzellen sicherstellen, sind dem Fachmann gut bekannt. Gewöhnlich umfassen sie regulatorische Sequenzen, die die Transkriptionsinitiation sicherstellen, sowie gegebenenfalls Poly-A-Signale, die die Transkriptionstermination und Stabilisierung des Transkripts sicherstellen. Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- sowie Translationsenhancer und/oder natürlich assoziierte oder heterologe Promotorregionen umfassen. Mögliche regulatorische Elemente, die die Expression in prokaryontischen Wirtszellen zulassen, umfassen z. B. den PL, lac-, trp- oder tac-Promotor in E. coli, und Beispiele für regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryontischen Wirtszellen zulassen, sind der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe oder der CMV-, SV40-, RSV-Promotor (Rous Sarkom Virus), CMV-Enhancer, SV40-Enhancer oder ein Globinintron in Säuger- oder anderen Tierzellen. Neben Elementen, die für die Transkriptionsinitiation verantwortlich sind, können derartige regulatorische Elemente auch Transkriptionsterminationssignale wie die SV40-Poly-A-Stelle oder die tk-Poly-A-Stelle stromabwärts des Polynucleotids umfassen. Ferner können abhängig vom verwendeten Expressionssystem, Leadersequenzen, die das Polypeptid in ein zelluläres Kompartment leiten oder es in das Medium sekretieren können, der codierenden Sequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids hinzugefügt werden und sind aus dem Fachgebiet bekannt; vgl. auch z. B. die Beispiele im Anhang. Die Leadersequenz(en) ist (sind) in der geeigneten Phase mit den Translations-, Initiations- und Ter minationssequenzen zusammengefügt und ist vorzugsweise eine Leadersequenz, die die Sekretion des translatierten Proteins oder eines Teils davon in den periplasmatischen Raum oder das extrazelluläre Medium leiten kann. Gegebenenfalls kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein, einschließlich eines N-terminalen Identifikationspeptids codieren, das die gewünschten Merkmale beinhaltet, z. B. die Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts; vgl. a. a. O. In diesem Zusammenhang sind aus dem Fachgebiet bekannte Vektoren wie der Okayama-Berg cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene) oder pSPORT1 (GIBCO BRL) geeignet.
Vorzugsweise sind die Expressionskontrollsequenzen eukaryontische Promotorsysteme in Vektoren, die transfizierende eukaryontische Wirtszellen transformieren können, aber es können auch Kontrollsequenzen für prokaryontische Wirte verwendet werden. Wenn der Vektor einmal in einen geeigneten Wirt eingebracht wurde, wird der Wirt unter Bedingungen gehalten, die für die Expression der Nucleotidsequenzen in hohem Ausmaß geeignet sind, und die Sammlung und Reinigung des erfindungsgemäßen Polypeptids kann wie gewünscht folgen; vgl. z. B. die Beispiele im Anhang.
Wie vorstehend beschrieben, kann das erfindungsgemäße Polypeptid alleine oder als Teil eines Vektors verwendet werden, um das erfindungsgemäße Polypeptid in Zellen zu exprimieren, z. B. für die Gentherapie oder Diagnose von mit B-Zellerkrankungen verwandten Erkrankungen. Die Polynucleotide oder Vektoren, die die DNA-Sequenzen) enthalten, die eine der vorstehend beschriebenen Polypeptide codiert, werden in die Zellen eingebracht, die wiederum das Polypeptid von Interesse produzieren. Die Gentherapie, die auf die Einführung therapeutischer Gene in Zellen durch ex-vivo- oder in-vivo-Verfahren basiert, ist eine der wichtigsten Anwendungen des Gentransfers. Geeignete Vektoren, Verfahren oder Gentransfersysteme für in-vitro- oder in-vivo-Gentherapie werden in der Literatur beschrieben und sind dem Fachmann bekannt; vgl. z. B. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534–539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911–919; Anderson, Science 256 (1992), 808–813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370–374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077–1086, Onodera, Blood 91 (1998), 30–36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692–699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289–292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243–51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714–716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859 ; US 5,589,466 oder Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635–640 und die hier zitierten Dokumente. Die erfindungsgemäßen Polynucleotide und Vektoren können für die direkte Einführung oder für die Einführung über Liposomen oder Virusvektoren (z. B. Adenovirus, Retrovirus) in die Zelle konstruiert werden. Vorzugsweise ist die Zelle eine Zelle der Keimlinie, eine embryonale Zelle oder Eizelle oder stammt davon ab. Am meisten bevorzugt ist die Zelle eine Stammzelle. Ein Beispiel für eine embryonale Stammzelle kann u. A. eine Stammzelle sein, wie bei Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424–8428 beschrieben.
Gemäß dem Vorstehenden betrifft die vorliegende Erfindung herkömmlicherweise in der Gentechnik verwendete Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren und Bakteriophagen, die ein Polynucleotid umfassen, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert. Vorzugsweise ist der Vektor ein Expressionsvektor und/oder ein Gentransfer- oder Targeting-Vektor. Expressionsvektoren, die von Viren wie Retroviren, Vacciniavirus, Adeno-assoziierten Virus, Herpesviren oder Rinderpapillomvirus stammen, können für den Transfer der erfindungemäßen Polynucleotide oder Vektoren in anvisierte Zellpopulationen verwendet werden. Dem Fachmann gut bekannte Verfahren können zur Konstruktion rekombinanter Vektoren verwendet werden; vgl. beispielsweise die in Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y. (1989) beschriebenen Verfahren. Alternativ können erfindungemäßen Polynucleotide oder Vektoren in Liposomen zum Transfer rekonstituiert werden, um Zellen anzuvisieren. Die Vektoren, die die erfindungemäßen Polynucleotide enthalten, können in die Wirtszelle durch gut bekannte Verfahren übertragen werden, die abhängig von der Art des zellulären Wirts variieren. Beispielsweise wird gemeinhin die Calciumchloridtransfektion für prokaryontische Zellen verwendet, während die Calciumphosphatbehandlung oder Elektroporation für andere zelluläre Wirte verwendet werden kann; vgl. Sambrook, a. a. O. Wenn sie einmal exprimiert wurden, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung nach den Standardvorschriften des Fachgebiets gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und dergleichen; vgl. Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N.Y. (1982). Für pharmazeutische Zwecke werden im wesentlichen reine Polypeptide mit mindestens etwa 90 bis 95% Homogenität bevorzugt und 98 bis 99% oder mehr Homogenität werden am meisten bevorzugt. Wenn sie einmal je nach Wunsch teilweise oder bis zur Homogenität gereinigt wurden, können die Polypeptide dann therapeu tisch (einschließlich extrakorporal) oder bei der Entwicklung und Durchführung von Testverfahren verwendet werden.
In einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zelle, die das vorstehend beschriebene Polynucleotid oder den vorstehend beschriebenen Vektor enthält. Vorzugsweise ist die Zelle eine eukaryontische, am meisten bevorzugt eine Säugerzelle, wenn man sich therapeutische Zwecke des Polypeptids vorstellt. Natürlich können Hefe- und weniger bevorzugt prokaryontische z. B. Bakterienzellen ebenfalls dienen, insbesondere wenn das produzierte Polypeptid als Diagnostikum verwendet wird.
Das erfindungsgemäße Polypeptid oder der erfindungsgemäße Vektor, der in der Wirtszelle vorliegt, kann entweder in das Genom der Wirtszelle integriert werden, oder er kann extrachromosomal gehalten werden.
Der Begriff „prokaryontisch" bedeutet, dass alle Bakterien eingeschlossen sind, die mit DNA- oder RNA-Molekülen zur Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids transformiert oder transfiziert werden können. Die prokaryontischen Wirte können gram-negative sowie gram-positive Bakterien wie beispielsweise E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis einschließen. Der Begriff „eukaryontisch" bedeutet, dass Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und vorzugsweise Säugerzellen eingeschlossen sind. Abhängig vom verwendeten Wirt, der in einem rekombinanten Herstellungsverfahren eingesetzt wurde, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosiliert oder nicht glycosiliert sein. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch einen Methioninaminosäurerest am Anfang einschließen. Ein Polynucleotid, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, kann verwendet werden, um den Wirt unter Verwendung von dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren zu transformieren oder zu transfizieren. Die Verwendung eines Plasmids oder Virus, das die codierende Sequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids enthält und genetisch damit an einen N-terminalen FLAG-Tag und/oder einen C-terminalen His-Tag fusioniert ist, wird besonders bevorzugt. Vorzugsweise beträgt die Länge des FLAG-Tags etwa 4 bis 8 Aminosäuren, am meisten bevorzugt 8 Aminosäuren. Verfahren zur Herstellung von fusionierten, funktionell verbundenen Genen und deren Expression in z. B. Säugerzellen und Bakterien sind aus dem Fachgebiet gut bekannt (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y., 1989). Die genetischen Konstrukte und die darin beschriebenen Verfahren können zur Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids in eukaryontischen und prokaryontischen Wirten verwendet werden. Im allgemeinen werden Expressi onsvektoren, die Promotorsequenzen enthalten, die die effiziente Transkription des eingebauten Polynucleotids vereinfachen, in Verbindung mit dem Wirt verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsursprung, einen Promotor und einen Terminator sowie spezifische Gene, die die phänotypische Selektion der transformierten Zellen bereitstellen können. Ferner können transgene Tiere, vorzugsweise Säuger, für die Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids im großen Maßstab verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung somit ein Verfahren zur Herstellung eines vorstehend beschriebenen Polypeptids, umfassend die Züchtung einer erfindungsgemäßen Zelle unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids und Isolierung des Polypeptids aus der Zelle oder dem Kulturmedium geeignet sind.
Die transformierten Wirte können in Fermentern gezüchtet werden und nach den aus dem Fachgebiet bekannten Verfahren gezüchtet werden, um das optimale Zellwachstum zu erreichen. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann dann aus dem Wachstumsmedium, den zellulären Lysaten oder zellulären Membranfraktionen isoliert werden. Die Isolierung und Reinigung der z. B. mikrobiell exprimierten erfindungsgemäßen Polypeptide kann jedes herkömmliche Mittel wie, beispielsweise präparative chromatographische Trennung und immunologische Trennung sein, wie diejenigen, die die Verwendung von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern betreffen, z. B. gegen einen Tag des erfindungsgemäßen Polypeptids oder wie in den Beispielen im Anhang beschrieben.
Somit erlaubt die vorliegende Erfindung die rekombinante Herstellung von Polypeptiden, die die Bindungsstellen umfassen, die eine Affinität und Spezifität für ein Epitop des CD19- bzw. CD3-Antigen und gegebenenfalls eine weitere funktionale Domäne besitzen. Wie aus dem Vorstehenden offensichtlich ist, stellt die Erfindung eine große Polypeptidfamilie bereit, die derartige Bindungsstellen für jeden Zweck bei therapeutischen und diagnostischen Ansätzen umfasst. Es ist dem Fachmann klar, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide ferner an andere Einheiten gekoppelt werden können, wie vorstehend beschrieben, z. B. Medikamenten-Targeting und bildgebende Anwendungen. Eine derartige Kopplung kann chemisch nach der Expression des Polypeptids an der Bindungsstelle erfolgen oder das Kopplungsprodukt kann in das erfindungsgemäße Polypeptid auf DNA-Ebene eingebracht werden. Die DNAs werden dann in einem geeigneten Wirtssystem exprimiert und die exprimierten Proteine werden gegebenenfalls gesammelt und renaturiert. Wie vorstehend beschrieben, stammen die Bindungs stellen vorzugsweise von der variablen Region von Antikörpern. In dieser Hinsicht ermöglicht die Hybridomtechnologie die Herstellung von Zelllinien, die den Antikörper im wesentlichen zu jeder gewünschten Substanz sekretieren, die eine Immunreaktion erzeugt. Die RNA, die die leichten und schweren Ketten des Immunglobulins codiert, kann dann aus dem Cytoplasma des Hybridoms erhalten werden. Der 5'-Endanteil der mRNA kann verwendet werden, um cDNA herzustellen, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll. Die DNA, die die erfindungsgemäßen Polypeptide codiert, kann anschließend in Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, exprimiert werden.
Abhängig von der Wirtszelle können Renaturierungsverfahren erforderlich sein, um die richtige Konformation zu erhalten. Gegebenenfalls können Punktmutationen, um nach einer optimierten Bindung zu streben, in der DNA unter Verwendung der herkömmlichen Kassettenmutagenese oder anderer Proteinengineering-Verfahren durchgeführt werden, wie es hier offenbart wird. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide kann auch von der Kenntnis der Aminosäuresequenz (oder der entsprechenden DNA- oder RNA-Sequenz) bioaktiver Proteine wie Enzyme, Toxine, Wachstumsfaktoren, Zelldifferenzierungsfaktoren, Rezeptoren, Antimetaboliten, Hormone oder verschiedener Cytokine oder Lymphokine abhängen. Über derartige Sequenzen wird in der Literatur berichtet und sie stehen über Computerdatenbaken zur Verfügung. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßes Polypeptid so konstruiert werden, dass es z. B. aus einem Einzelketten-Fv-Fragment und dem extrazellulären Teil des menschlichen costimulatorischen Proteins CD80 (B7-1) besteht, das durch einen (Gly4Ser1)1-Linker verbunden ist. Das costimulatorische Protein CD80 gehört zur Ig-Superfamile. Es ist ein stark glycosyliertes Protein mit 262 Aminosäuren. Eine detailliertere Beschreibung wurde von Freeman, J. Immunol. 143 (1989), 2714–2722 veröffentlicht. Die stabile Expression kann z. B. in CHO-Zellen mit DHFR-Mangel erfolgen, wie von Kaufmann, Methods Enzymol. 185 (1990), 537–566 beschrieben. Das Protein kann dann über dessen His-Tag gereinigt werden, der an den C-Terminus unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule gebunden ist (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995), 7021–7025).
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen bereit, die das vorstehend erwähnte erfindungsgemäße Polypeptid; Polynucleotid oder den erfindungsgemäßen Vektor umfassen.
Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen, die Arzneimittel sind, die diese vorstehend erwähnte(n) erfindungsgemäße(n) Polypeptid(e), Polynucleotid(e) oder Vektoren) umfassen.
Das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung kann ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Beispiele pharmazeutisch verträglicher Träger sind aus dem Fachgebiet gut bekannt und schließen phosphatgepufferte Salzlösungen, Wasser, Emulsionen wie Öl/Wasseremulsionen, verschiedene Arten von Befeuchtungsmitteln, sterile Lösungen etc. ein. Verbindungen, die derartige Träger umfassen, können durch gut bekannte herkömmliche Verfahren formuliert werden. Diese Arzneimittel können dem Patienten in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung der geeigneten Verbindungen kann durch verschiedene Wege erfolgen, z. B. durch intravenöse, intraperitoneale, subkutane, intramuskuläre, topische oder intradermale Verabreichung. Das Dosierungsschema wird durch den anwesenden Arzt und klinische Faktoren bestimmt. Wie in der Medizin gut bekannt ist, hängt die Dosis für jeden Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe des Patienten, der Körperoberfläche, dem Alter, der speziellen zu verabreichenden Verbindung, Geschlecht, Verabreichungszeit und -weg, allgemeiner Gesundheitszustand und andere, derzeit verabreichte Arzneimittel. Im allgemeinen sollte das Schema als reguläre Arzneimittelgabe im Bereich von 1 μg bis 10 mg Einheiten pro Tag liegen. Wenn das Therapieschema eine kontinuierliche Infusion beinhaltet, sollte sie auch im Bereich von jeweils 1 μg bis 10 mg Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht pro Minute liegen. Jedoch könnte eine bevorzugtere Dosierung für die kontinuierliche Infusion im Bereich von 0,01 μg bis 10 mg Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht pro Stunde liegen. Besonders bevorzugte Dosierungen werden nachstehend aufgeführt. Der Fortschritt kann durch eine periodische Beurteilung überwacht werden. Die Dosierung variieren, aber eine bevorzugte Dosierungen für die intravenöse Verabreichung von DNA liegt bei etwa 10⁶ bis 10¹² Kopien des DNA-Moleküls. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können lokal oder systematisch verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt im allgemeinen parenteral, z. B. intravenös; die DNA kann auch verabreicht werden, indem sie zur Zielstelle gelenkt wird, z. B. durch biolistischen Transfer zu einer internen oder externen Zielstelle oder durch einen Katheter zu einer Stelle in einer Arterie. Die Zubereitungen für die parenterale Gabe schließen sterile wässrige oder nicht wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein. Beispiele von nicht wässrigen Lösungsmitteln sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Gemüseöle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Wässrige Träger schließen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Sus pensionen, einschließlich Salzlösung und gepufferten Medien ein. Parenterale Vehikel schließen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose-Lösung, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktat-Lösung oder feste Öle ein. Intravenöse Vehikel schließen flüssige Ergänzungsmittel und Nährstoffergänzungen, Elektrolytenergänzungslösungen (wie diejenigen, die auf Ringer-Dextrose-Lösung basieren) und dergleichen ein. Konservierungsstoffe und andere Zusätze wie beispielsweise antimikrobielle Lösungen, Antioxidantien, Chelatbildner sowie inerte Gase und dergleichen können ebenfalls vorliegen. Zusätzlich könnte das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung Proteinträger wie z. B. Serumalbumin oder Immunglobulin vorzugsweise menschlichen Ursprungs umfassen. Ferner ist vorstellbar, dass das erfindungsgemäße Arzneimittel weitere biologisch aktive Mittel abhängig von dem beabsichtigten Zweck des Arzneimittels umfassen könnte. Derartige Mittel könnten Arzneimittel sein, die auf das Gastrointestinalsystem wirken, Medikamente, die als Cytostatika wirken und Medikamente, die Hyperurikämie verhindern und/oder Mittel wie costimulatorische T-Zellmoleküle oder aus dem Fachgebiet bekannte Cytokine.
Es ist durch die vorliegende Erfindung vorstellbar, dass die verschiedenen erfindungsgemäßen Polynucleotide und Vektoren entweder allein oder in jeder Kombination unter Verwendung von Standardvektoren und/oder Gentransfersystemen und gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten verabreicht werden. Nach der Gabe werden die Polynucleotide oder Vektoren stabil in das Genom des Patienten integriert.
Andererseits können virale Vektoren verwendet werden, die für bestimmte Zellen oder Gewebe spezifisch sind und in den Zellen persistieren. Geeignete pharmazeutische Träger und Excipienten sind aus dem Fachgebiet gut bekannt. Die erfindungsgemäß hergestellten Arzneimittel können für die Prävention oder Behandlung oder Verzögerung verschiedener Erkrankungen verwendet werden, die mit B-Zell-verwandten Immunschwächen und Malignitäten verwandt sind.
Ferner ist es möglich, ein erfindungsgemäßes Arzneimittel zu verwenden, dass das erfindungsgemäße Polynucleotid oder den erfindungsgemäßen Vektor in der Gentherapie umfasst. Geeignete Gentransfersysteme können unter anderem Liposomen, Rezeptor-vermittelte Transfersysteme, nackte DNA und virale Vektoren wie Herpesviren, Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren umfassen. Der Transfer von Nucleinsäuren an eine spezifische Stelle im Körper zur Gentherapie kann auch unter Verwendung eines biolistischen Transfersystems erfolgen, wie das, welches von Williams (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726–2729) beschrieben wurde. Weitere Verfahren zum Transfer von Nucleinsäuren umfassen partikelvermittelten Gentransfer, wie z. B. bei Verma, Gene Ther. 15 (1998), 692–699 beschrieben. Man sollte voraussetzen, dass die eingebrachten Polynucleotide und Vektoren das Genprodukt nach der Einführung in die Zelle exprimieren und vorzugsweise in diesem Status während der Lebensspanne der Zelle bleiben. Beispielsweise können Zelllinien, die das Polynucleotid unter der Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen exprimieren, gentechnisch nach den Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Wirtszellen können entweder auf demselben Plasmid oder auf getrennten Plasmiden eher mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einem Selektionsmarker transformiert werden, als dass Expressionsvektoren verwendet werden, die virale Replikationsursprünge enthalten. Nach dem Einbringen der Fremd-DNA kann man gentechnisch hergestellte Zellen 1–2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen lassen, und man wechselt dann zu einem Selektivmedium über. Der Selektionsmarker in dem rekombinanten Plasmid überträgt die Selektionsresistenz und erlaubt die Selektion von Zellen, die das Plasmid stabil in ihre Chromosomen integriert haben, und man lässt sie wachsen, damit sie Herde bilden, die wiederum cloniert und in Zelllinien verbreitet werden können. Derartig hergestellte Zelllinien sind insbesondere bei Durchmusterungsverfahren zum Nachweis der Verbindungen nützlich, die an der z. B. B-Zell/T-Zellinteraktion beteiligt sind.
Man kann eine Vielzahl von Selektionssystemen nutzen, die die Herpes simplex Virus-Thymidinkinase (Wigler, Cell 11 (1977), 223), Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (Szybalska, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026), und Adeninphosphoribosyltransferase (Lowy, Cell 22 (1980), 817) in tk^–-, hgprt^–- bzw. aprt^–-Zellen einschließen, jedoch nicht darauf begrenzt sind. Es kann auch eine antimetabolische Resistenz als Selektionsgrundlage für dhfr verwendet werden, das eine Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht (Wigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 3567; O'Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527); für gpt, das eine Resistenz gegenüber Mycophenolsäure verleiht (Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); für neo, das eine Resistenz gegenüber Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1); füe hygro, das eine Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht (Santerre, Gene 30 (1984), 147) oder für Puromycin (pat, Puromycin-N-acetyl-Transferase). Es wurden zusätzliche Selektionsgene beispielsweise trpB beschrieben, das zulässt, dass Zellen Indol anstatt Tryptophan nutzen, hisD, das zulässt, dass Zellen Histinol anstatt Histidin nutzen (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047) und ODC (Ornithindecarboxylase), das eine Resistenz gegenüber dem Ornithindecarboxylase-Inhibitor, 2-(Difluormethyl)-DL-ornithin, DFMO verleiht (McCologue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Herausg.).
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Diagnostikum, das jedes der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide, Polynucleotide oder Vektoren und gegebenenfalls geeignete Nachweismittel umfasst.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind auch für die Verwendung in Immuntests geeignet, in denen sie in flüssiger Phase oder gebunden an einen festen Träger verwendet werden können. Beispiele von Immuntests, die das erfindungsgemäße Polypeptid nutzen können, sind kompetitive und nicht kompetitive Immuntests entweder in einem direkten oder indirekten Format. Beispiele derartiger Immuntests sind der Radioimmuntest (RIA), der Sandwich(immunometrischer Test) und der Western-Blot-Test.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können an viele verschiedene Träger gebunden und verwendet werden, um spezifisch an die Polypeptide gebundene Zellen zu isolieren. Beispiele gut bekannter Träger schließen Glas, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Dextran, Nylon, Amylosen, natürliche und modifizierte Zellulosen, colloidale Metalle, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit ein. Die Art des Trägers für die Zwecke der Erfindung kann entweder löslich oder unlöslich sein.
Es gibt verschiedene Markierungen und Markierungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Beispiele der Markierungsarten, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Enzyme, Radioisotope, kolloidale Metalle, Fluoreszenzverbindungen, chemilumineszierende Verbindungen und biolumineszierende Verbindungen ein; vgl. auch die hier vorstehend diskutierten Ausführungsformen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des hier vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptids, Polynucleotids und Vektors zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von B-Zellmalignitäten, B-Zell-vermittelten Autoimmunkrankheiten oder B-Zell-Mangel.
Neuere klinische Studien mit einer neuanvisierten cytotoxischen Aktivität menschlicher T-Zellen durch bispezifische Antikörper zeigten vielversprechende Ergebnisse bei der Behand lung von refraktorischer Hodgkin Erkrankung (33), Brust- oder Eierstockkrebs (34–37) und malignem Gliom (38). Aufgrund der Tatsachen

– dass bsc-Antikörper aufgrund ihrer niedrigen molekularen Masse das Eindringen in Tumoren erleichtern (wie für Fab- oder Fv-Fragmente gezeigt wurde) (39); und
– dass man vermutet, dass bsc-Antikörper die dosisabhängige und dosislimitierende Toxizität erniedrigen, die durch die Fc-Teile konventioneller bispezifischer Antikörper (40) vermittelte systemische Cytokinfreisetzung verursacht wird; und
– dass sogar ein intakter monoclonaler Antikörper (gerichtet gegen CD20) zu einer Tumorregression in fortgeschrittenen Stadien von NHL führten (41, 42),

Somit wird das erfindungsgemäße Arzneimittel in einer bevorzugten Ausführungsform für die Behandlung von Non-Hodgkin-Lymphom verwendet.
Die Dosierungsbereiche der Verabreichung der erfindungsgemäßen Polypeptide, Polynucleotide und Vektoren sind diejenigen, die groß genug sind, um die gewünschte Wirkung zu erzeugen, bei der die Symptome der B-Zell-vermittelten Erkrankungen verbessert werden. Die Dosierung sollte nicht so hoch sein, dass sie wesentliche Nebenwirkungen wie ungewollte Kreuzreaktionen, anaphylaktische Reaktionen und dergleichen verursacht. Im allgemeinen variiert die Dosis mit dem Alter, dem Zustand, Geschlecht und dem Ausmaß der Krankheit beim Patienten und kann von einem Fachmann bestimmt werden. Die Dosierung kann durch den einzelnen Arzt im Falle irgendeiner Kontraindikation eingestellt werden. Es ist vorstellbar, dass der Bereich der Dosis auf z. B. 0,01 μg bis 10 mg des erfindungsgemäßen Polypeptids eingestellt wird. Eine besonders bevorzugte Dosis ist 0,1 μg bis 1 mg, noch stärker bevorzugt ist 1 μg bis 100 μg und am meisten bevorzugt ist eine Dosis von 3 μg bis 10 μg, wie z. B. in dem Beispiel 7 im Anhang veranschaulicht.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von T-Zell aktivierenden oder costimulierenden Verbindungen oder zur Identifizierng von Inhibitoren der T-Zellaktivierung und Stimulation, umfassend

(a) die Züchtung von CD19-positiven Zellen (vorzugsweise B-Zellen) und T-Zellen in Gegenwart des erfindungsgemäßen Polypeptids und gegebenenfalls in Gegenwart einer Komponente, die ein nachweisbares Signal als Reaktion auf die T-Zellaktivierung mit ei ner Verbindung bereitstellen kann, die unter Bedingungen abgesucht werden soll, die eine Interaktion der Verbindung mit den Zellen erlaubt und
(b) den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals, das aus der Interaktion der Verbindung mit den Zellen erzeugt wird.

Diese Ausführungsform ist insbesondere für das Testen der Kapazität der Verbindungen als costimulatorisches Molekül nützlich. In diesem Verfahren liefert die CD19-positive Zelle/B-Zelle ein primäres Aktivierungssignal für die T-Zelle und vermeidet so den clonotypischen T-Zellrezeptor. Dann kann man erfindungsgemäß bestimmen, welche zu testende Verbindung noch notwendig ist, um die T-Zelle eigentlich zu aktivieren. Beim erfindungsgemäßen Verfahren fungiert die CD19-positive Zelle/B-Zelle als stimulierende Zelle, die bispezifische Moleküle verbindet, die an CD3-Komplexe auf der Oberfläche derselben T-Zelle gebunden werden. Die biologischen Verfahren zur Durchführung der Züchtung, des Nachweises und gegebenenfalls des Tests sind einem Fachmann klar.
Der Begriff „Verbindung" in dem erfindungsgemäßen Verfahren schließt eine einzelne Substanz oder mehrere Substanzen ein, die identisch sein können oder nicht.
Die Verbindungen) können beispielsweise in Proben z. B. Zellextrakten aus z. B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen enthalten sein. Ferner können die Verbindungen aus dem Fachgebiet bekannt sein, aber es ist hier nicht bekannt, dass sie die T-Zellaktivierung hemmen können bzw. es ist nicht bekannt, dass sie als T-Zellen costimulierender Faktor nützlich sind. Die Mehrheit der Verbindungen kann z. B. dem Kulturmedium zugegeben werden oder in die Zelle injiziert werden.
Wenn eine Probe, die (a) eine Verbindung/Verbindungen enthält, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wird, dann ist es entweder möglich, die Verbindung aus der Originalprobe zu isolieren, die als die fragliche Verbindung enthaltend Identifiziert wurde, oder man kann die Originalprobe weiter aufteilen, wenn sie beispielsweise aus mehreren verschiedenen Verbindungen besteht, damit die Anzahl der unterschiedlichen Substanzen pro Probe reduziert wird, und das Verfahren mit den Unterteilungen der Originalprobe wiederholen. Es kann dann durch aus den aus dem Fachgebiet bekannten Verfahren, die hier und in den Beispielen im Anhang beschrieben werden, ermittelt werden, ob die Probe oder die Verbindung die gewünschten Eigenschaften zeigt. Abhängig von der Komplexität der Proben können die vorstehend beschriebenen Schritte mehrmals durchgeführt werden, vorzugsweise bis die Probe, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde, nur noch eine begrenzte Anzahl an Substanzen oder nur eine Substanz enthält. Vorzugsweise umfasst die Probe Substan zen oder ähnliche chemische und/oder physikalische Eigenschaften und am meisten bevorzugt sind die Substanzen identisch. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können vom Fachmann einfach durchgeführt und konzipiert werden, beispielsweise nach anderen auf Zellen basierenden Tests, die im Stand der Technik beschrieben sind, oder durch Verwendung und Modifizierung der Verfahren, wie in den Beispielen im Anhang beschrieben. Ferner erkennt der Fachmann leicht, welche weiteren Verbindungen und/oder Zellen verwendet werden können, um die erfindungsgemäßen Verfahren durchzuführen, beispielsweise Interleukine oder Enzyme, die gegebenenfalls eine bestimmte Verbindung in den Vorläufer umwandeln, der wiederum die T-Zellaktivierung stimuliert oder unterdrückt. Derartige Adaptionen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Fähigkeiten des Fachmanns und können ohne übermäßiges Experimentieren durchgeführt werden.
Verbindungen, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, schließen Peptide, Proteine, Nucleinsäuren, Antikörper, kleine organische Verbindungen, Liganden, Peptidomimetika, PNAs und dergleichen ein. Die Verbindungen können auch funktionale Abkömmlinge oder Analoga der bekannten T-Zellaktivatoren oder Inhibitoren sein. Verfahren zur Herstellung chemischer Abkömmlinge und Analoga sind dem Fachmann gut bekannt und werden beispielsweise in Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer Ausgabe New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. und Organic Synthesis, Wiley, New York, USA beschrieben. Ferner können die Abkömmlinge und Analoga auf ihre Wirkung nach den aus dem Fachgebiet bekannten Verfahren oder wie beispielsweise in den Beispielen im Anhang beschrieben, getestet werden. Ferner können Peptidomimetika und/oder computergestütztes Design der geeigneten Aktivatoren oder Inhibitoren der T-Zellaktivierung beispielsweise nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden. Für die Identifizierung der interaktiven Stellen eines möglichen Inhibitors und des erfindungsgemäßen Antigens können geeignete Computerprogramme durch computerunterstütze Suche für komplementäre Strukturmotive verwendet werden (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114–120). Weitere geeignete Computersysteme für das computerunterstützte Design des Proteins und von Peptiden werden im Stand der Technik, beispielsweise bei Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033–1036; Wodak, Ann. N.Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1–13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987–5991 beschrieben. Die aus der vorstehend beschriebenen Computeranalyse erhaltenen Ergebnisse können in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren z. B. zur Optimierung bekannter T-Zellaktivatoren oder Inhibitoren verwendet werden. Geeignete Peptidomimetika können auch durch die Synthese von peptidomimetischen kombinatorischen Bibliotheken durch aufeinanderfolgende chemische Modifizierung und Testen der sich ergebenden Verbindungen identifiziert werden, z. B. nach dem hier und in den Beispielen im Anhang beschriebenen Verfahren. Verfahren zur Erzeugung und Verwendung von peptidomimetischen kombinatorischen Bibliotheken werden im Stand der Technik beschrieben, beispielsweise bei Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220–234 und Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709–715. Ferner kann die dreidimensionale und/oder crystallographische Struktur von Inhibitoren oder Aktivatoren der B-Zell/T-Zellinteraktion für das Design von peptidomimetischen Inhibitoren oder Aktivatoren der T-Zellaktivierung verwendet werden, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet werden sollen (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933–12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545–1558).
Zusammengefasst stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereit, die die B-Zell/T-Zell-vermittelten Immunreaktionen modulieren können. Verbindungen, bei denen man herausfand, dass sie die B-Zell/T-Zell-vermittelten Reaktionen aktivieren, können in der Behandlung von Krebs oder verwandten Erkrankungen verwendet werden. Zusätzlich kann es auch möglich sein, Viruserkrankungen spezifisch zu hemmen, wobei die Virusinfektion oder die Virusausbreitung verhindert wird. Verbindungen, die als Suppressoren der T-Zellaktivierung oder Stimulation identifiziert wurden, können bei der Organtransplantation verwendet werden, um eine Transplantatabstoßung zu vermeiden; vgl. auch a. a. O.
Man erwartet, dass die Verbindungen, die nach dem Verfahren der vorstehenden Erfindung identifiziert oder erhalten werden, sehr nützlich in der Diagnostik und insbesondere für therapeutische Anwendungen sind. Somit betrifft in einer weiteren Ausführungsform die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend die Formulierung der Verbindung, die in Schritt (b) der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren in einer pharmazeutisch verträglichen Form identifiziert wurde.
Ferner ist vorstellbar, dass die Komponente durch Peptidomimetika modifiziert werden könnte. Verfahren zur Erzeugung und Verwendung von peptidomimetischen kombinatorischen Bibliotheken werden im Stand der Technik beschrieben, beispielsweise bei Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 210–234, Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709–715, Beeley, Trends Biotechnol. 12 (1994), 213–216 oder al-Obeidi, Mol. Biotech. 9 (1998), 205–223.
Die therapeutisch nützlichen, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen können einem Patienten durch jedes geeignete Verfahren für die bestimmte Verbindung verabreicht werden, z. B. oral, intravenös, parenteral, transdermal, transmucosal oder durch einen chirurgischen Eingriff oder Implantation (wobei z. B. die Verbindung in Form einer festen oder halbfesten biologisch kompatiblen und resorbierbaren Matrix vorliegt) an oder in der Nähe der Stelle, an der die Wirkung der Verbindung erwünscht ist. Der Fachmann bestimmt, ob die therapeutischen Dosierungen geeignet sind, vgl. a. a. O.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von B-Zellmalignitäten, B-Ze1l-vermittelten Autoimmunerkrankungen oder B-Zellen-Mangel und/oder ein Verfahren zur Verzögerung eines pathologischen Zustands bereit, der durch B-Zell-Erkrankungen verursacht wird, umfassend das Einbringen des erfindungsgemäßen Polypeptids, Polynucleotids oder Vektors in einen Säuger, der von den Malignitäten, der Erkrankung und/oder dem pathologischen Zustand betroffen ist. Es wird ferner bevorzugt, dass der Säuger ein Mensch ist.
Diese und andere Ausführungsformen werden durch die Beschreibung und Beispiele der vorliegenden Erfindung offenbart und umfasst. Ferner kann Literatur, die die Antikörper, Verfahren, Verwendungszwecke und Verbindungen betrifft, die verwendet werden sollen nach der vorliegenden Erfindung von öffentlichen Bibliotheken und Datenbanken abgerufen werden, indem beispielsweise elektronische Geräte verwendet werden. Beispielsweise kann die öffentliche Datenbank „Medline" verwendet werden, die im Internet beispielsweise unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html zur Verfügung steht.
Weitere Datenbanken und Adressen, wie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/ sind dem Fachmann bekannt und können auch erhalten werden, indem z. B. http://www.lycos.com verwendet wird. Ein Überblick der Patentinformationen in der Biotechnologie und ein Überblick der relevanten Quellen der Patentinformation, die nützlich für die retrospektive Suche und für das aktuelle Wissen sind, wird bei Berks, TIBTECH 12 (1994). 352–364 gegeben.
Die Figuren zeigen:
1: SDS-Page: Coomassie-Färbung des gereinigten bscCD19 × CD3-Fragments mit verschiedenen Proteinmengen. Die molekulare Masse (kDa) des Markers ist links angegeben.
2 FACS-Analyse mit bscCD19 × CD3 (200 μg/ml) an verschiedenen CD19-positiven B-Zelllinien (BJAB, SKW6.4, Blin-1, Daudi, Raji), an der CD19-negativen B-Zelllinie BL60 und an CD3-positiven Jurkat-Zellen und primären menschlichen PBMCs. Gestrichelte Linien geben die Negativkontrollen an.
3: Cytotoxizität von bscCD19 × CD3 in einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest mit nicht stimulierten menschlichen PBMCs und verschiedenen B-Zelllinien. Verhältnis Effektor : Zielzellen 10 : 1; Inkubationszeit 4 h. Die Standardabweichung in allen Triplikaten lag unter 7%.
4: Chromfreisetzungscytotoxizitätstest mit nicht stimulierten primären menschlichen PBLs gegen die Plasmacytomzelllinen L363 und NCl und die Lymphomzellline Daudi; Verhältnis E : T 20 : 1; Inkubationszeit 8 h.
5: Hemmung der Cytotoxizität von bscCD19 × CD3 durch die elterlichen anti-CD 19-Antikörper HD37 in einem Chromfreisetzungscytotoxizitätstest; Inkubationszeit 8 h; Verhältnis E : T 20 : 1; Konzentration von bscCD19 × CD3 1 ng/ml.
6: Cytotoxizitätstest mit nicht stimulierten PBMCs gegen Daudi-Zellen nach Zugabe von zunehmenden Mengen an EGTA, Verhältnis E : T 10 : 1, Inkubationszeit 4 h.
7: Cytotoxizität von bscCD19 × CD3 in einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest mit nicht stimulierten menschlichen PBMCs und Blin-1 als Zielzellen bei verschiedenen E : T-Verhältnissen; Inkubationszeit 4 h; Konzentration des herkömmlichen bispezifischen Antikörpers 3 μg/ml; Konzentration von bsc17-1A × CD3 100 ng/ml; E : T-Verhältnisse wie angegeben.
8: DNA- und Proteinsequenz des bscCD19 × CD3-Antikörpers (FLAG-Tag enthaltende Variante). Die Zahlen geben die Nucleotid-(nt)-positionen an, die entsprechende Aminosäuresequenz wird unter der Nucleotidsequenz angegeben. Die codierende DNA-Sequenz für den bispezifischen Antikörper beginnt bei Position 1 und endet bei Position 1593. Die ersten sechs nt (Position –10 bis –5) und die letzten sechs nt (Position 1596 bis 1601) enthalten die Restriktionsenzymschnittstellen für EcoRI bzw. SalI. Die Nucleotide 1 bis 57 spezifizieren die Leadersequenz; Nucleotid 82 bis 414 und 460 bis 831 codieren V_LCD19 bzw. V_HCD19; Nucleotid 847 bis 1203 und 1258 bis 1575 codieren V_HCD3 bzw. V_LCD3; und die Nucleotide 1576 bis 1593 codieren einen His-Tag.
9: Mangel an primären (malignen) CD19⁺-B-Zellen durch Rekrutierung autologer primärer T-Lymphocyten über bscCD19 × CD3.

A) Ausgangspunkt (t = 0): n = 3 × 10⁶ PBL/Vertiefung wurden in einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen in einem Volumen von jeweils 1 ml RPMI 1640-Medium angesetzt, die mit jeweils 10% FCS ergänzt wurden. Der anfängliche Prozentsatz der CD19⁺-B-Zellen sowie derjenige der CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen ist angeben.
B–G) Relative B- und CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellzahlen nach t = 5 Tagen der Inkubation bei 37°C/5% CO₂ in Abwesenheit (B–C) oder Anwesenheit (D–G) von bscCD19 × CD3 (Konzentrationen wie angegeben) mit oder ohne 60 U/ml IL-2. Die Negativkontrollen enthielten entweder bispezifische Einzelketten-Antikörper (17-1A × CD3) mit irrelevanter Zielzellenspezifität oder überhaupt keinen bispezifischen Antikörper (C).

10: Reinigungsschritte für bscCD19 × CD3
11: SDS-PAGE-Analyse zur Reinheit von bscCD19 × CD3. Es wird ein kolloidales Coomassieblau gefärbtes 4–12%-iges SDS-Gradientenpolyacrylamidgel dargestellt. Spuren 1 und 6, molekulare Größenmarker; Spur 2 Zellkulturüberstand; Spur 3 aktive Fraktion aus der Kationenaustauschchromatographie; Spur 4; aktive Fraktion aus der Cobaltchelataffinitätschromatographie; Spur 5; aktive Fraktion aus der Gelfiltration. Gleiche Proteinmengen (2 μg) aus dem Zellkulturüberstand und die verschiedenen Säulenfraktionen wurden analysiert. Die Größe in kDa der Molekulargewichtstandards ist rechts angegeben. Der Pfeil zeigt die Position von bscCD19 × CD3.
12: Kationenaustauschchromatographie von bscCD19 × CD3. Die Proteinkonzentration wurde mittels der Absorption bei 280 nm (mAU, links) gemessen. Das Elutionsprofil des Proteins wird von der durchgehenden Linie dargestellt. Das Profil des NaCl-Schrittgradienten wird von der durchgezogenen Linie dargestellt (%B, rechts) und die gesammelten Fraktionen werden durch die gestrichelte Linien angegeben. BscCD19 × CD3 wurde in Fraktion F6 nachgewiesen.
13: Cobaltchelataffinitätschromatographie von bscCD19 × CD3. Die Proteinkonzentration wurde mittels der Absorption bei 280 nm (mAU, links) gemessen. Das Elutionsprofil des Proteins wird von der durchgehenden Linie dargestellt. Der Imidazolgradient wird durch die durchgezogene Linie (%B, rechts) dargestellt, und die gesammelten Fraktionen werden durch die gestrichelten Linien angegeben. BscCD19 × CD3 wurde in Fraktion F7 nachgewiesen.
14: Gelfiltration von anti-CD19 × anti-CD3. Die Proteinkonzentration wurde mittels der Absorption bei 280 nm (mAU, links) gemessen. Das Elutionsprofil des Proteins wird von der durchgehenden Linie gezeigt. Die gestrichelten Linien geben die gesammelten Fraktionen an. BscCD19 × CD3 wurde in Fraktion F7 gefunden und entspricht einer Molekulargröße von etwa 60 kDa.
15: Gammaglutamyltransferase (GGT)-Spiegel im Blut als Reaktion auf Behandlungen mit bscCD19 × CD3. Die GGT-Spiegel wurden durch ein klinisches biochemisches Standardverfahren bestimmt und werden in Einheit/l angegeben. Die Zeitachse zeigt die Tage (d) nach Beginn der ersten Arzneimittelbehandlung und beginnend mit null an, die Stunden (h) nach der einzelnen Arzneimittelzugaben. Die Pfeile geben die Zeitpunkte der Arzneimittelgabe an.
16: Ultraschallmessungen der Milz des Patienten A–B.

A: Bestimmung der Milzgröße am 12. April 1999 vor der bscCD19 × CD3-Therapie. Die Figur zeigt die vergrößerte Milz (Größe 146 mm × 69,2 mm) aufgrund der Infiltration mit malignen B-Zellen.
B: Bestimmung der Milzgröße am 16. April 1999 nach der Behandlung mit 3 μg am 14. April gefolgt von 10 μg am 15. April. Die Figur zeigt die Verkleinerung der Milz auf eine Größe von 132 mm × 58,9 mm, verursacht durch die systemische Behandlung mit bscCD19 × CD3. Die Größendiskrepanzen der einzelnen Messungen, dargestellt in Tabelle 1, werden durch die auf Ultraschall basierende Organgrößenbestimmung in verschiedenen Raumebenen erklärt. Die beiden Dimensionen werden durch (+) und (×) gekennzeichnet.

17: Leukocytenzahl im Blut als Reaktion auf die Behandlungen mit bscCD19 × CD3. Die Anzahl der Leukocyten wird in Giga Teile/Liter angegeben. Die Zeitachse zeigt die Tage (d) nach Beginn der ersten Arzneimittelbehandlung und beginnend mit null an, die Stunden (h) nach der einzelnen Arzneimittelzugabe. Die Pfeile geben die Zeitpunkte der Arzneimittelgabe an.
18: Spiegel des C-reaktiven Proteins (CRP) im Blut als Reaktion auf die Behandlungen mit bscCD19 × CD3. Die CRP-Spiegel wurden durch ein klinisches biochemisches Standardverfahren bestimmt und werden in mg/dl angegeben. Die Zeitachse zeigt die Tage (d) nach Be ginn der ersten Arzneimittelbehandlung und beginnend mit null an, die Stunden (h) nach der einzelnen Arzneimittelzugabe. Die Pfeile geben die Zeitpunkte der Arzneimittelgabe an.
19: Tumornekrosefaktor Alpha (TNF)-Spiegel im Blut als Reaktion auf die Behandlungen mit bscCD19 × CD3. Die TNF-Spiegel wurden durch ELISA bestimmt und werden in ng/ml angegeben. Die Zeitachse zeigt die Tage (d) nach Beginn der ersten Arzneimittelbehandlung und beginnend mit null an, die Stunden (h) nach der einzelnen Arzneimittelzugabe. Die Pfeile geben die Zeitpunkte der Arzneimittelgabe an.
20: Interleukin-6 (IL-6)-Spiegel im Blut als Reaktion auf die Behandlungen mit bscCD19 × CD3. Die IL6-Spiegel wurden durch ELISA bestimmt und werden in pg/ml angegeben. Die Zeitachse zeigt die Tage (d) nach Beginn der ersten Arzneimittelbehandlung und beginnend mit null an, die Stunden (h) nach der einzelnen Arzneimittelzugabe. Die Pfeile geben die Zeitpunkte der Arzneimittelgabe an.
21: Interleukin-8 (IL-8)-Spiegel im Blut als Reaktion auf die Behandlungen mit bscCD19 × CD3. Die IL8-Spiegel wurden durch ELISA bestimmt und werden in pg/ml angegeben. Die Zeitachse zeigt die Tage (d) nach Beginn der ersten Arzneimittelbehandlung und beginnend mit null an, die Stunden (h) nach der einzelnen Arzneimittelzugabe. Die Pfeile geben die Zeitpunkte der Arzneimittelgabe an.
22: Spiegel der löslichen Interleukin-2-Rezeptor-Alphakette (IL-2R) im Blut als Reaktion auf die Behandlungen mit bscCD19 × CD3. Die IL2R-Spiegel wurden durch ELISA bestimmt und werden als Einheiten/ml ausgedrückt. Die Zeitachse zeigt die Tage (d) nach Beginn der ersten Arzneimittelbehandlung und beginnend mit null, die Stunden (h) nach der einzelnen Arzneimittelzugabe. Die Pfeile geben die Zeitpunkte der Arzneimittelgabe an.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden biologischen Beispiele beschrieben, die nur der Veranschaulichung dienen und nicht als Begrenzung des Ausmaßes der vorliegenden Erfindung gedacht sind.
Beispiel 1: Clonieren der variablen (V) Immunglobulindomänen
Die V-leichte-Kette (VL)- und V-schwere-Kette-(VH) Domänen aus dem HD37-Hybridom (22) wurden nach den Standard-PCR-Verfahren (23) cloniert. Die cDNA-Synthese erfolgte mit Oligo-dT-Primern und Taq-Polymerase.
Primerliste
Zur Amplifizierung der V-Domänen über PCR verwendeten wir die Primer 5'L1 und 3'K, die die V_L-Domäne flankieren, und 5'H1 und 3'G für die schwere Kette, basierend auf den von Dübel et al. (24) beschriebenen Primern.
Die cDNA des anti-CD3-scFv-Fragments wurde freundlicherweise von A. Traunecker bereitgestellt (25).
Beispiel 2: Konstruktion von bispezifischen Einzelkettenfragmenten und eukaryontische Expression
Um ein anti-CD19-scFv-Fragment zu erhalten, dienten die entsprechenden, in getrennte Plasmidvektoren clonierten VL- und VH-Bereiche als Matrizen für eine VL- und VH-spezifische PCR unter Verwendung der Oligonucleotidprimerpaare 5'VLB5RRV/3'VLGS15 bzw. 5'VHGS15/3'VHBspEI. Dabei wurden sich überschneidende komplementäre Sequenzen in die PCR-Produkte eingebracht, die kombinieren, um die codierende Sequenz des 15-Aminosäure (Gly₄Ser₁)₃-Linkers während der nachfolgenden Fusions-PCR zu ergeben. Dieser Amplifizierungsschritt wurde mit dem Primerpaar 5'VLB5RRV/3'VHBspEI durchgeführt und das sich ergebende Fusionsprodukt (oder vielmehr das anti-CD19-scFv-Fragment) wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRV and BspEI gespalten und somit in den Bluescript KS-Vektor (Stratagene) cloniert, wobei entweder die (EcoRI/SalI-clonierte) codierende Sequenz des bispezifischen Einzelketten-Antikörpers antil7-1A/anti-CD3 mit einem N-terminalen FLAG-Tag [1] oder diejenige der modifizierten Version ohne FLAG/Epitop (21) enthalten war, wobei der anti-17-1A- durch die anti-CD19-Spezifität ersetzt wird und der 5-Aminosäure (Gly₄Ser₁)₃-Linker bewahrt wird, der jeweils das C-terminale anti-CD3-scFv-Fragment verbindet. Nachfolgend wurden die DNA-Fragmente, die beide Versionen des bispezifischen Einzelketten anti-CD19/anti-CD3-Antikörpers codieren, mit der Domänenanordnung VL_CD19-VH_CD19-VH_CD3-VL_CD3 mit jeweils EcoRI/SalI in den beschriebenen Expressionsvektor pEF-DHRF [1] subcloniert. Die sich ergebenden Plasmid-DNAs wurden in CHO-Zellen mit DHFR-Mangel durch Elektroporation transfiziert: Die Selektion, Genamplifizierung und Proteinproduktion erfolgte wie beschrieben [1]. In den folgenden Beispielen werden die Ergebnisse veranschaulicht, die mit der FLAG-enthaltenden Version von bscCD19 × CD3 erhalten wurden.
Die Reinigung von bscCD19 × CD3 aus dem Überstand der transfizierten CHO-Zellen ergab 4 mg/Liter Kulturüberstand. Bsc-Ab wurde über seinen C-terminalen Histidinschwanz durch Affinitätschromatographie auf einer Ni-NTA-Säule gereinigt, wie beschrieben [1]. Bsc-Ab wurde von der Ni-NTA-Säule als einzelner Peak bei einer Konzentration von 200 mM Imidazol eluiert. Die SDS-Page wurde nach Laemmli (26) mit einem 12%-igen Gel durchgeführt, gefolgt von einer Färbung mit Coomassie Brilliantblau R250 zur Analyse der Reinigung von bsc-Ab. Die Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse (1) zeigen die erwartete Größe des bsc-Ab (60 kDa).
Beispiel 3: Bindungseigenschaften von bsc-AbCD19 × CD3
Die Bindungsspezifitäten von bsc-Ab gegenüber CD3 und CD19 wurden durch eine durchflusscytometrische Analyse an CD3-positiven Jurkat-Zellen, menschlichen PBMCs und mehreren verschiedenen CD19-positiven B-Zelllymphomzelllinien einschließlich Blin I, SKW6.4, Daudi, BJAB und Raji gezeigt. Die CD19-positiven B-Zelllinien Daudi, Raji, BJAB (Burkitt Lymphom), SKW6.4 (menschliche EBV transformierte B-Zelle) und Blin-1 (PräB-Zelllinie) wurden in der durchflusscytometrischen Analyse und den Chromfreisetzungstests verwendet. Jurkat ist eine CD3-positive T-Zelllinie; BL60 und die Plasmacytomzelllinien NCl und L363 sind für beide Oberflächenmoleküle, CD3 und CD19, negativ. Die Zelllinien wurden in RPMI-Komplettmedium 1640 (Biochrom) mit 10% FCS (GIBCO) gezüchtet.
1 × 10⁶ Zellen wurden mit PBS gewaschen, in 200 μl PBS mit 10% Vernimmun (Centeon, Marburg, Deutschland) und 0,1% NaN₃ resuspendiert und 30 min bei 4°C inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (100 × g, 5 min) wurden die Zellen in 50 μl bscCD19 × CD3 (200 μg/ml in PBS mit 10% Vernimmun und 0,1% NaN₃) 30 min bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen. Zum Nachweis von bsc-Ab wurde ein a FITC-konjugierter Antikörper gegen den His-Tag (Dianova) verwendet. Das irrelevante bsc-Ab 17-1A × CD3, das von demselben Expressionssystem wie bscCD19 × CD3 produziert wurde, oder der His-Tag-Antikörper allein dienten als Negativkontrollen. Die Durchflusscytometrie wurde mit einem Becton Dickinson FACScan durchgeführt. Es war keine Bindung auf BL60-Zellen nachweisbar, die weder CD19 noch CD3 exprimieren (2).
Beispiel 4: Cytotoxische Aktivität von bsc-AbCD19 × CD3 gegen CD19-positive Lymphomzellen
Der bscCD19 × CD3-Antikörper erwies sich als hoch cytotoxisch für mehrere Lymphomzelllinien in einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest (3). Menschliche einkernige Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) als Effektorzellen wurden von frischen „Buffy-Coats" zufälliger Spender unter Verwendung von Lymphoprep^TM (Nycomed) Gradientenzentrifugation mit aufeinanderfolgenden Zentrifugationsschritten bei 100 × g isoliert, um die Thrombocyten zu entfernen. CD19-positive B-Zells wurden unter Verwendung von Dynabeads^® M-450 CD19 (Dynal) verringert. Die verringerten Zellpopulationen wurden durch Durchflusscytometrie (Becton Dickinson) analysiert, die eine 99%-ige Verringerung der CD19-positiven Zellen zeigte. Die PBMCs wurden über Nacht bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert. CD19-positive B-Zelllinien (Raji, Blin 1, Daudi, BJAB, SKM 6.4) wurden als Zielzellen verwendet.
Die Cytotoxizität wurde in einem Standard-Chromfreisetzungstest in Platten mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden (Nunc) unter Verwendung von RPMI 1640-Komplettmedium (Biochrom) mit 10% FCS (GIBCO) gemessen.
Jeder Vertiefung wurden unstimulierte PBMCs in einem Volumen von 80 μl Medium zugegeben, enthaltend 20 μl bsc-Ab in verschiedenen Konzentrationen. Dann wurden 100 μl ⁵¹Cr-markierte Zielzellen (1 × 10⁴) zugegeben, die Platten wurden 3 min bei 100 × g zentrifugiert und 4 h bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert. Nach einem zusätzlichen Zentrifugationsschritt wurden 50 μl Überstand entfernt und auf freigesetztes ⁵¹Cr in einem Gammazähler (Top-Count, Canberra Packard) getestet.
Die spontane Freisetzung wurde durch Inkubation der Zielzellen ohne Effektorzellen oder Antikörper gemessen und die maximale Freisetzung wurde durch Inkubation der Zielzellen mit 10% TritonX-100 bestimmt. Die Inkubation der Zielzellen mit bscAb ohne Effektorzellen führte zu keiner messbaren Lyse. Die prozentuale spezifische Lyse wurde als aspezifische Freisetzung (%) = [(cpm, experimentelle Freisetzung) – (cpm, spontane Freisetzung)]/[(cpm, maximale Freisetzung) – (cpm, spontane Freisetzung)] × 100 berechnet. Alle Tests wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die Standardabweichung in der Dreifachausführung lag in allen Experimenten unter 6%. Um uns an die in vivo-Bedingungen anzunähern, verwendeten wir nicht stimulierte PBMCs aus gesunden Spendern als Effektorzellen. Die schnelle Induktion der Cytotoxizität innerhalb von vier Stunden konnte ohne T- Zellprästimulationsvorschrift beobachtet werden. Als Kontrolle zeigte ein bcs-Antikörper mit unterschiedlicher Tumorspezifität (bsc17-1A × CD3), der jedoch von demselben System wie der bscCD19 × CD3-Antikörper erzeugt wurde, eine Lyseaktivität, die nicht signifikant über dem Mediumhintergrund lag. Zusätzlich konnte keine cytotoxische Aktivität bei Verwendung der Plasmacytomzelllinien NCl und L363 beobachtet werden, die CD19 nicht als Zielzellen exprimieren (4). Bei Kompetitionstests unter Verwendung ansteigender Mengen des CD19-spezifischen elterliche monoclonalen Antikörpers HD37 konnte die cytotoxische Aktivität von bscCD19 × CD3 fast vollständig blockiert werden (5). Diese Kontrollen zeigen, dass die bscCD19 × CD3-vermittelten cytotoxischen Effekte antigenspezifisch sind. Um mehr Informationen über den molekularen Mechanismen zu erhalten, wie der bscCD19 × CD3-Antikörper CD19-positive Zielzellen abtötet, versuchten wir die bscCD19 × CD3-vermittelte Cytotoxizität durch EGTA zu blockieren. Wie in 6 dargestellt, konnte die cytotoxische Aktivität von bscCD19 × CD3 fast vollständig durch EGTA blockiert werden, was zeigte, dass die spezifische Lyse ein T-zellvermittelter Effekt (wahrscheinlich über den Perforin-Weg) und kein direkter (z. B. Apoptose-induzierender Effekt) des Antikörpers selbst ist.
Unter Verwendung unstimulierter T-Zellen, auch bei Antikörperkonzentrationen unter 1 ng/ml, konnte ein signifikanter cytotoxischer Effekt gegen Blin-1 Zellen beobachtet werden (7). Sogar bei relativ niedrigen E : T-Verhältnissen (5 : 1; 2,5 : 1) und bei sehr niedrigen Antikörperkonzentrationen von 10–100 pg/ml konnte der bscCD19 × CD3-Antikörper die spezifische cytotoxische Aktivität nicht stimulierter T-Zellen schnell induzieren (7). Dagegen zeigte unter diesen Bedingungen ein herkömmlicher durch Hybrid-Hybridom-Verfahren hergestellter (5–7, 27) bispezifischer bscCD19 × CD3-Antikörper keine signifikante cytotoxische Aktivität, sogar bei Konzentrationen bis zu 3000 ng/ml (7). Dieser herkömmliche bispezifische Antikörper benötigte zusätzliche Prästimulation der T-Zellen und hohe Antikörperkonzentrationen von etwa 100 ng/ml, um spezifische T-Zellcytotoxizität zu induzieren (nicht gezeigt), was mit der Literatur übereinstimmt (5–7, 27).
Beispiel 5: Verringerung der primären (malignen) B-Zellen über autologe T-Zellen durch die cytotoxische Aktivität von bscCD19 × CD3
Um die cytotoxische Aktivität von bscCD19 × CD3 auf primären malignen B-Zellen zu beurteilen, wurden einkernige Zellen aus dem peripheren Blut (PBMC) eines Patienten, der an B-CLL (B-Zell-abstammende chronische lymphatische Leukämie) litt, durch Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Diese Zellen wurden anschließend in Gegenwart oder Abwesenheit von bscCD19 × CD3 5 Tage bei 37°C/5% CO₂ in RPMI 1640-Medium gezüchtet, das mit 10% FCS und gegebenenfalls mit 60 U/ml IL-2 ergänzt wurde. Die durchflusscytometische Analyse zeigte, dass die peripheren Blutlymphocyten (PBL) dieses besonderen NHL (Non-Hodgkin Lymphom)-Patienten (der später systemisch mit bscCD19 × CD3 behandelt wurde; vgl. Beispiel 7) 92,6% CD19-positive B-Zellen (= Zielzellen) und 7,4% CD3-positive T-Lymphocyten (= Effektorzellen) bei einem CD4/CD8 T-Zellverhältnis von 2,6 : 4,8 enthielten. Der größte Anteil dieser CD19-positiven B-Zellen bestand aus malignen Zellen. Pro Vertiefung wurden 3 × 10⁶ PBL/ml in einem Volumen von jeweils 1 ml in einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen angesetzt. Als Negativkontrollen dienten Kulturmedium plus IL-2 und Kulturmedium plus IL-2 mit dem irrelevanten bispezifische Einzelketten-Antikörper bsc17-1A × CD3 (1) in einer Konzentration von 0,5 μg/ml. Wie in 9 dargestellt, war unter diesen Bedingungen keine Verringerung der CD19-positiven Zellen nach 5-tägiger Inkubation nachweisbar. Wenn jedoch bscCD19 × CD3 bei Konzentrationen von 0,5 μg/ml oder 0,05 μg/ml zugegeben wurden (entweder in Anwesenheit oder Abwesenheit von IL-2) waren fast alle CD19-positiven B-Zellen abgetötet worden. Die zu der Zeit gezüchteten Zellen bestanden hauptsächlich aus T-Lymphocyten mit einem CD4/CD8 T-Zellverhältnis von etwa 1 : 2 bis 1 : 3. Das zeigt die außergewöhnliche Cytotoxizität von bscCD19 × CD3 gegenüber CD19-positiven B-Zellen, da die gesamte Verringerung primärer B-Zellen durch autologe T-Zellen bei einer Konzentration von nur 50 ng/ml bei einem sehr ungünstigen Zielzellenverhältnis von weniger 1 : 10 induziert werden konnte, sogar ohne IL-2 oder anderer Arten zusätzlicher T-Zellstimulation.
Beispiel 6: Reinigung von bscCD19 × CD3 für therapeutische Zwecke
BscCD19 × CD3 wurde in chinesischen Hamsterovar (CHO)-Zellen mit einem Expressionsvektor (pEF-DHFR; vgl. Beispiel 2) stabil transfiziert, der bscCD19 × CD3 und zusätzlich ein Hexahistidin und einen FLAG-Tag codiert. Die Zellen wurden in serumfreien Medium (Rencyte) in einem Hohlfaserreaktor (Unisyn) gezüchtet. 500 ml Zellkulturüberstand wurden gesammelt und durch einen 0,2 um Filter (AcroCap; Pall Gelman) sterilfiltriert.
BscCD19 × CD3 wurde durch einen Western-Blot unter Verwendung von anti-FLAG-IgG (Sigma) und Ziegen-anti-Maus-IgG, gekoppelt an alkalische Phosphatase (Sigma), nachge wiesen und quantifiziert. Der Nachweis erfolgte durch Chemolumineszenz unter Verwendung des BCIP/NBT-Systems (Devitron). Die Proteinkonzentrationen wurden durch den Bradford-Test (Biorad) bestimmt, wobei Rinder-IgG (Biorad) als Proteinstandard verwendet wurde. Die Reinheit der Säulenfraktionen wurde durch reduzierende Natriumdodecylsulfat (SDS)-Bis/Tris 4–12%-ige Polyacrylamidgradient-Gelelektrophorese (PAGE) unter Verwendung eines MOPS-Puffersystems (Novex) beurteilt.
Die Reinigung von bscCD19 × CD3 zur Homogenität erforderte eine Kationenaustauschchromatographie, Cobaltchelataffinitätschromatographie und als letzten Schritt eine Gelfiltration. Diese Reinigungsschritte wurden unter Verwendung von Standardvorschriften (vgl. nachstehend) durchgeführt. Ein Flussdiagramm des Reinigungsverfahrens wird in 10 dargestellt.
Kationenaustauschchromatographie: Der Zellkulturüberstand aus CHO-Zellen wurde mit zwei Volumina Puffer C (30 mM Morpholinoethansulfonsäure [MES], 20 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,3 mM Benzamidinhydrochlorid, pH 5,5) gemischt und über eine 70 ml-SP Sepharose Fast-Flow-Kationenaustauschsäule (Pharmacia) bei einer Fliesrate von 20 ml/min gegeben. Die Säule wurde mit Puffer A (20 mM MES, 20 mM NaCl, pH 5,8) äqulibriert. Nach dem Waschen mit 5 Säulenvolumina Puffer A wurde bscCD19 × CD3 mit einem schrittweisen Gradienten von 45% Puffer B (20 mM MES, 1 M NaCl, pH 5,8) in Puffer A eluiert. Das Eluat erhielt 0,045 Volumen 1 M Tris/HCl, pH 8,5, enthaltend 47 mM Imidazol und wurde nachfolgend sterilfiltriert (0,2 μm; AcroCap). Ein typisches Elutionsprofil der Kationenaustauschchromatographie wird in 12 dargestellt. BscCD19 × CD3 war in Fraktion 6 enthalten.
Cobaltchelataffinitätschromatographie: Das Eluat aus der Kationenaustauschsäule wurde bei einer Fliesrate von 2,5 ml/min über eine 10 ml-Chelatbildenden Sepharose Fast Flow Säule (Pharmacia) gegeben, die in Puffer AO (50 mM Na₂HPO₄, 400 mM NaCl, pH 8,0) äquilibriert wurde. Die Säule war mit einer 0,1 M Cobaltchloridlösung voräquilibriert worden. Nach dem Waschen mit 33 Säulenvolumina Puffer AO, Puffer A (50 mM Na₂HPO₄, 400 mM NaCl, 2 mM Imidazol, pH 6,4) und einem Gradienten von 0–12% Puffer B (50 mM Na₂HPO₄, 400 mM NaCl, 500 mM Imidazol, pH 6,4) in Puffer A wurde bscCD19 × CD3 in einem Schritt mit 30 ml 100% Buffer B eluiert. Das Eluat wurde sterilfiltriert, gefolgt von einer etwa 10-fachen Konzentration in einem MacroSep-Gerät (Pall Gelman; 10 kD Ausschluss). Ein typisches Elutionsprofil für die Cobaltchelataffinitätschromatographie ist in 13 dargestellt. BscCD19 × CD3 wurde in Fraktion Nr. 7 nachgewiesen.
Gelfiltration: Das konzentrierte Eluat aus der Cobaltchelataffinitätssäule wurde bei einer Fliesrate von 0,75 ml/min auf eine 124 ml-High Load Superdex 200-Säule (Pharmacia; Präparationsgrad) geladen, die äquilibriert mit phosphatgepufferter Salzlösung (Gibco) war. BscCD19 × CD3 eluierte in einer Fraktion mit einer Molekulargröße, die etwa 55 kDa entspricht (14, Fraktion Nr. 7). Die Gelfiltrationsfraktion, die bscCD19 × CD3 enthielt, wurde mit 5% menschlichem Serumalbumin (Behring) ergänzt, gefolgt von einer Sterilfiltration durch einen 0,1 μm Filter (Millex, Millipore).
Der Überschuss von bscCD19 × CD3 in dem Zellkulturüberstand und die verschiedenen aktiven Säulenfraktionen, wie sie durch SDS-PAGE analysiert wurden, werden in 11 gezeigt. BscCD19 × CD3 war die Hauptproteinbande, die in den Zellkulturüberständen nachgewiesen wurde (Spur 2). Hochgereinigter anti-CD19 × anti-CD3, der für die Therapie beim Menschen verwendet wurde, zeigte keine nachweisbaren Verunreinigungen (11, Spur 5).
Beispiel 7: Klinische Verwendung von bscCD19 × CD3 bei einem Patienten mit B-Zelllymphom
Bei einer Einzelfallbehandlung wurde eine Patientin (A–B, weiblich, geboren 1937), die an B-Zell-abstammender chronischer lymphatischer Leukämie (B-CLL) litt, mit dem bispezifische Einzelketten-Antikörper bscCD19 × CD3 behandelt.
Patientengeschichte und Gründe:
Bei der Patientin wurde 1992 B-CLL diagnostiziert. Zum Zeitpunkt der Erstdiagnose waren von der Erkrankung verschiedene Lymphknotenbereiche und die Milz betroffen. Zusätzlich wurde eine hämolytische Anämie mit autoimmunem Ursprung und ein Immunoglobulinmangel beobachtet. Die Patientin leidet an einer Struma nodosa, die gut kontrolliert ist und eine Erythrose durch Behandlung mit Carbimazol 2,5 mg/dl aufweist.
Die Patientin hatte von 1992 bis 1994 mehrere Chemotherapiezyklen mit Chlorambucil und Prednison erhalten. Nach der Progression der Erkrankung wurde die Behandlung auf Cyclophosphamid, Doxorubicin, Vincristin und Prednison (CHOP, 8 Zyklen) umgestellt, und es wurde für mehr als ein Jahr eine Remission erreicht. Nach einem neuen Rückfall erhielt die Patientin weitere 6 Zyklen mit CHOP, gefolgt von Chlorambucil und Prednison und einem einzigen Zyklus mit ausschließlich Chlorambucil, was keine Verbesserung der Erkrankung bewirkte. Im Dezember 1998 wurde eine Bestrahlung der Milz durchgeführt, um die fortschreitende Splenomegalie der Patientin zu kontrollieren. Die Patientin erlitt eine tiefgreifende Knochenmarksdepression mit multiplen infektösen Komplikationen. Ihre Anämie und Thrombocytopenie erforderte häufige Transfusionen mit roten Blutkörperchen und Thrombocytensubstitution.
Aufgrund des fortgeschrittenen Stadiums der Erkrankung und einer gehemmten Knochenmarksfunktion war bei dieser Patientin eine aggressivere oder höher dosierte Chemotherapie nicht indiziert. Die Behandlung mit dem anti-CD20-Antikörper Rituximab war nicht geeignet, da die Wirksamkeit von Rituximab bei B-CLL bisher nicht deutlich gezeigt wurde.
Eine FACS-Analyse zeigte, dass 95% der peripheren Blutzellen CD19-positive Zellen waren, während 77% der Zellen das CD20-Antigen exprimierten. Die Inkubation der peripheren Blutzellen der Patientin mit bscCD19 × CD3 zeigte eine herausragende Verringerung der CD19-positiven B-Zellen (vgl. Beispiel 5). Deshalb entschieden sich die Ärzte, die Patientin mit dem neuen bscCD19 × CD3 einer Einzelfallbehandlung zu unterziehen. Die Patientin wurde detailliert über die Neuartigkeit der Verbindung und über die potentiellen Risiken und Nutzen dieser Behandlung informiert. Sie verstand die Erklärungen vollkommen und gab ihre schriftlich Zustimmung für diese Einzelfallbehandlung.
Beschreibung der klinischen Anwendung:
Vor Beginn der Behandlung wurde die Patientin einer klinischen Untersuchung und ausführlichen diagnostischen Verfahren unterzogen, um das Ausmaß der Erkrankung zu überprüfen und alle zusätzlichen Risikofaktoren auszuschließen. Die Patientin war in einem schlechten klinischen Zustand mit Anämie, Thrombocytopenie und Gewichtsverlust, aber ohne cardiovaskuläre Beeinträchtigung oder andere Komplikationen, die die Verwendung von bscCD19 × CD3 verhinderten. Während der Nacht vor den ersten Behandlungstagen litt die Patientin an Migränekopfschmerzen. Zur Verabreichung von bscCD19 × CD3 wurde die Patientin stationär unter Intensivbedingungen aufgenommen, um eine schnelle Behandlung jedes Notfalls sicherzustellen, der auftreten könnte. Um akute Cytokinreaktionen und Komplikatio nen der Tumorlyse zu vermeiden, erhielt die Patientin prophylaktisch IV-Dosen 2 mg Clemastin (Tavegil^®) und 200 mg Cimetidin (Tagamet^®) sowie 300 mg Allopurinol und 20 mg Omeprazol (Antra^®).
Die Alkalisierung und Heparinisierung erfolgte während der Behandlung und der Follow-up-Perioden. Zusätzlich erhielt die Patientin jede notwendige symptomatische Behandlung.
Vor und während der Verabreichung des Arzneimittels wurden Blutproben genommen, um die biochemischen, hämatologischen und immunologischen Parameter zu verfolgen.
Erste Verabreichung bscCD19 × CD3 (14. April 1999)
Die Patientin erhielt eine erste Dosis 3 μg bscCD19 × CD3 als 20-minütige Infusion in isotonischem Phosphatpuffer, enthaltend 5% Humanserumalbumin (HSA). Während der Infusion hatte die Patientin keine Nebenwirkungen. Etwa 1 Stunde nach der Infusion hatte die Patientin etwa 5 Minuten Schüttelfrost, gefolgt von Schwitzen, einem leichten Blutdruckabfall von etwa 10 mmHg und einem leichten Anstieg der Körpertemperatur (+0,5°C) für mehrere Stunden. Zusätzlich verschlimmerten sich ihre Kopfschmerzen etwas. Die Patientin wurde mit weiteren 2 mg Tavegil^® und 200 mg Tagamet^®, 250 mg Prednisolon (Solu-Decortin^®) und 50 mg Pethidin (Dolantin^®) behandelt. Alle Symptome verschwanden ohne Folgeerscheinungen am selben Tag.
Zweite Verabreichung von bscCD19 × CD3 (15. April 1999)
Eine zweite Dosis 10 μg bscCD19 × CD3 wurde einen Tag später unter denselben Bedingungen verabreicht. Etwa 1 Stunde nach der Infusion hatte die Patientin starken Schüttelfrost, Fieber (39,2°C), leichte Hyperventilation und eine hypotensive Reaktion. Die Patientin wurde mit 2 mg Tavegil, 200 mg Tagamet und 300 mg Solu-Decortin und 15 mg Piritramid (Dipidolor^®) behandelt. Zur Stabilisierung ihrer cardovaskulären Funktion erhielt die Patientin eine Dopamin-Infusion und erhielt eine Volumensubstitution. Nach dieser Behandlung gingen die Symptome beträchtlich zurück. Trotzdem wurde die Patientin über Nacht in die Kardiologieabteilung verlegt, um die richtige Überwachung der Lebenszeichen und die sofortige Intervention im Notfall sicherzustellen. Die Patientin wurde am nächsten Morgen in die reguläre Station zurückverlegt, ohne dass weitere Komplikationen auftraten.
Während der nächsten 3 Tage hatte die Patientin weiterhin subfebrile Temperatur (etwa 37,2°C) und entwickelte einen Tag später eine kleinere pleurale Effusion bei der zweiten Dosis (16. April 1999) und ein mildes Ödem der unteren Extremitäten (18. April 1999). Die cardiovaskuläre Funktion blieb stabil, und die Laboruntersuchungen zeigten keine bemerkenswerten Änderungen im Hinblick auf die Sicherheit, außer einem Anstieg der γ-Glutamyltransferase nach der zweiten bscCD19 × CD3-Dosis (15).
Da bscCD19 × CD3 von der Patientin toleriert wurde und die Nebenwirkungen mit symptomatischer Behandlung kontrolliert werden konnten, wird die Verabreichung des neuen bscCD19 × CD3 bei dieser Patientin fortgesetzt.
Klinische und immunologische Wirksamkeit von bscCD19 × CD3:
Klinische Ergebnisse:
Die Ultraschalluntersuchung der Milz und fünf abdominaler und Achsellymphknoten wurde am ersten Tag und vier Tage nach der Verabreichung der zweiten bscCD19 × CD3-Dosis durchgeführt. Bereits einen Tag nach der 10 μg Dosis (16. April 1999) zeigten die Lymphknoten sowie die Milz eine Verkleinerung von etwa 20% im Vergleich zu den Ausgangswerten. Diese Beobachtung wurde in einer zweiten Ultraschalluntersuchung am 19. April 1999 bestätigt. Das Gewicht der Milz verringerte sich um 350 g (von 1630 g als Grundlinienwert auf 1280 g am 19. April 1999) (Tabelle 1; 16).
Hämatologische Ergebnisse:
Die Anzahl der weißen Blutkörperchen, die hauptsächlich maligne B-Zellen einschließen, nahm während des Behandlungsverlaufs und den darauf folgenden Tagen ab (Tabelle 2; 17). Das C-reaktive Protein (CRP) ist ein akutes Phasenprotein, das die T-Zellaktivierung und die Wirkung der proinflammatorischen Cytokine widerspiegelt. Es erhöhte sich beträchtlich nach der Verabreichung von 10 μg bscCD19 × CD3, gefolgt von einer ständigen Abnahme während der nächsten 3 Beobachtungstage (Tabelle 2; 18).
Immunologische Ergebnisse:
Der Serumcytokinspiegel, der die akute immunologische Reaktion auf die Verabreichung der Verbindung widerspiegelt, wurde vor und an verschiedenen Intervallen nach der Gabe der neuen Verbindung gemessen. Die Serumspiegel der Cytokine und des löslichen IL-2-Rezeptors wurden durch einen quantitativen ELISA-Test nach den Anweisungen des Herstellers gemessen.
Der Tumornekrosefaktor TNF-α erhöhte sich innerhalb der ersten Stunde nach Verabreichung von bscCD19 × CD3 signifikant in einer dosis-abhängigen Weise (19).
Interleukin 6 (IL-6) und Interleukin 8 (IL-8) zeigten ebenfalls eine signifikante und dosisabhängige Erhöhung. Ihre maximalen Spiegel wurden 2 bis 4 Stunden nach Verabreichung von bscCD19 × CD3 beobachtet (20, 21). Alle Cytokine gingen innerhalb einiger Stunden auf das Ausgangsniveau zurück.
Der lösliche IL-2-Rezeptor war bereits bei der Ausgangsmessung erhöht, was durch die Masse der malignen B-Zellen erklärt werden kann, die den IL-2-Rezeptor exprimieren. Nach Verabreichung des neuen bscCD19 × CD3 wurde eine Erhöhung des löslichen IL-2-Rezeptors beobachtet, was eine Aktivierung der Effektorzellen anzeigt (22).
Schlussfolgerung:
Das neue bscCD19 × CD3 wurde einem an refraktorischer B-CLL leidenden Patienten sicher verabreicht. Das Tolerieren von bscCD19 × CD3 bei Dosen von 3 μg bis 10 μg war akzeptabel und konnte gut mittels prophylaktischer Maßnahmen und symptomatischer Behandlung kontrolliert werden.
Das neue bscCD19 × CD3 verursachte eine Verkleinerung der zuvor vergrößerten Milz und Lymphknoten des Patienten, wie in der Ultraschalluntersuchung gezeigt. Da die Vergrößerung der Milz und Lymphknoten durch Infiltration mit malignen B-Zellen verursacht wird, spiegelt die Verkleinerung die Zerstörung der malignen B-Zellen als Folge der Verabreichung von bscCD19 × CD3 wider.
Im starken Gegensatz zu jedem anderen aus den im Fachgebiet bekannten bispezifischen CD19 × CD3-Antikörper zeigt der erfindungsgemäße bispezifische Antikörper (bscCD19 × CD3) klinische Wirksamkeit bei B-Zell-abstammendem Non-Hodgkin-Lymphom, wie durch die Verkleinerung der Lymphknoten gemessen wurde, die durch maligne B-Zellen infiltriert waren. Vorteilhafterweise erwies sich bscCD19 × CD3 bei überraschend niedrigen Dosierungen als klinisch wirksam, die nach systemischer Verabreichung gut toleriert werden.
Somit bestätigt die klinische Wirksamkeit von bscCD19 × CD3 dessen außergewöhnliche cytotoxische Aktivität, wie in vitro nachgewiesen.
Tabelle 1: Die Wirksamkeit von bscCD19 × CD3 auf die Lymphknotengröße und Milz bei einer an B-Zelllymphom leidenden Patientin.
Ultraschallmessungen
Die Größen von drei abdominalen Lymphknoten, ein linker und ein rechter Achsellymphknoten und der Milz wurden durch Sonographie unter Verwendung eines Toshiba-SSA100-Geräts bestimmt und gemessen. Die Größen werden in drei Dimensionen und mm angegeben. Das Gewicht der Milz wurde aufgrund ihrer Ausmaße und der Ultraschalldichte berechnet.
Tabelle 2: Spiegel ausgewählter Marker im Blut als Reaktion auf Behandlungen mit bscCD19 × CD3.
Die Spiegel von Gammaglutamyltransferase (GGT), Laktatdehydrogenase (LDH) und C-reaktivem Protein im Blut wurden durch klinische biochemische Standardverfahren bestimmt und werden in Einheiten/ml (GGT), Einheiten/l (LDH) und mg/dl (CRP) angegeben. Die Anzahl der Leukocyten wird als Giga Punkte/l angegeben und die Lymphocytenzahlen werden als Prozent der Gesamtleukocyten dargestellt. Die Ausgangsniveaus am 14. April 1999 vor der Behandlung werden in der ersten Spur angegeben. Die Reaktion auf 3 μg bscCDl9 × CD3 am 15. April (das am 14. April verabreicht wurde) ist in der zweiten Spur dargestellt. Die Reaktion auf eine zweite Behandlung mit 10 μg Arzneimittel am selben Tag ist in der dritten Spur dargestellt. Die Blutspiegel der ausgewählten Marker an vier Tagen nach der Medikamentenbehandlung sind in den letzten vier Spuren angegeben.
Literatur

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Multi-funktionelles Einzelketten-Polypeptid, umfassend (a) eine erste Domäne, die eine Bindungsstelle einer Immunglobulinkette oder eines Antikörpers umfasst, der das CD19-Antigen spezifisch erkennt; und (b) eine zweite Domäne, die eine Bindungsstelle einer Immunglobulinkette oder eines Antikörpers umfasst, der das CD3-Antigen von menschlichen T-Zellen spezifisch erkennt, wobei die Domänen in der Folge V_LCD19-V_HCD19-V_HCD3-V_LCD3 angeordnet sind.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die zwei Domänen durch einen Polypeptidlinker verbunden sind.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste und/oder die zweite Domäne einer) V_H- und V_L-Region eines natürlichen Antikörpers nachahmen oder entsprechen.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper, synthetischer Antikörper oder humanisierter Antikörper ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei mindestens eine der Domänen ein einzelkettiges Fragment der variablen Region des Antikörpers ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei der Polypeptidlinker eine Vielzahl von Glycin-, Alanin- und/oder Serinresten umfasst.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei der Polypeptidlinker eine Vielzahl von aufeinander folgenden Kopien einer Aminosäuresequenz umfasst.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei der Polypeptidlinker 1 bis 5 Aminosäurereste umfasst.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei der Polypeptidlinker die Aminosäuresequenz Gly Gly Gly Gly Ser umfasst.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die erste Domäne mindestens eine CDR der V_H- und V_L-Region umfasst, welche die Aminosäuresequenz umfasst, die von den Nucleotiden 82 bis 414(V_L) und den Nucleotiden 460 bis 831(V_H) der in 8 dargestellten DNA-Sequenz codiert wird und/oder wobei die zweite Domäne mindestens eine CDR der V_H- und V_L-Region umfasst, welche die Aminosäuresequenz umfasst, die von den Nucleotiden 847 bis 1203 (V_H) und den Nucleotiden 1258 bis 1575 (V_L) der in 8 dargestellten DNA-Sequenz codiert wird.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei (a) die Bindungsstelle der ersten Domäne eine Affinität von mindestens etwa 10^–7 M aufweist; und/oder (b) die Bindungsstelle der zweiten Domäne eine Affinität von weniger als etwa 10^–7 M aufweist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11, das ein bispezifischer einzelkettiger Antikörper ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das mindestens eine weitere Domäne umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 13, wobei die weitere Domäne durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen verbunden ist.
Polypeptid nach Anspruch 13 oder 14, wobei mindestens die eine weitere Domäne ein Effektormolekül umfasst, das eine Konformation aufweist, die für biologische Aktivität geeignet ist, die ein Ion absondern kann, die selektiv an eine feste Auflage binden kann oder die an eine vorselektierte Determinante binden kann.
Polynucleotid, das nach Expression ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 15 codiert.
Vektor, der das Polynucleotid nach Anspruch 16 umfasst.
Zelle, die mit dem Polynucleotid nach Anspruch 16 oder dem Vektor nach Anspruch 17 transfiziert ist.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Verfahren das Züchten einer Zelle nach Anspruch 18 und das Isolieren des Polypeptids aus der Kultur umfasst.
Mittel, welches das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 15, das Polynucleotid nach Anspruch 16 oder den Vektor nach Anspruch 17 umfasst.
Mittel nach Anspruch 20, welches ein Arzneimittel ist, das gegebenenfalls einen zusätzlichen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Mittel, nach Anspruch 20, welches ein Diagnosemittel ist, das gegebenenfalls zusätzlich geeignete Mittel zum Nachweis umfasst.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 15, des Polynucleotids nach Anspruch 16, oder des Vektors nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von B-Zelltumoren, B-Zell-vermittelten Autoimmunkrankheiten oder für die Depletion von B-Zellen.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei der B-Zelltumor ein B-Zelllymphom, ein Non-Hodgkin Lymphom oder eine B-Zell-abstammende chronische lymphatische Leukämie (B-CLL) ist.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei die B-Zell vermittelte Autoimmunkrankheit Myasthenia gravis, Morbus Basedow, Hashimoto-Thyreoiditis oder Goodpasture-Syndrom ist.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 15, des Polynucleotids nach Anspruch 16 oder des Vektors nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Arzneimittels zum Verzögern eines pathologischen Zustands, der durch B-Zell-Krankheiten verursacht wird.
Verwendung des Polynucleotids nach Anspruch 16 oder des Vektors nach Anspruch 17 zur Herstellung von Mitteln für Gentherapie.
Verfahren zur Identifizierung von Aktivatoren oder Inhibitoren der T-Zellaktivierung oder -stimulierung, umfassend (a) Züchten von T-Zellen und CD19-positiven Zellen, vorzugsweise B-Zellen, in der Anwesenheit eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und gegebenenfalls in der Anwesenheit einer Komponente, die ein detektierbares Signal als Antwort auf T-Zellaktivierung zur Verfügung stellen kann, mit einer zu überprüfenden Verbindung unter Bedingungen, die die Aktivierung von T-Zellen erlauben; und (b) Detektieren der Anwesenheit oder Abwesenheit des Signals, das durch die Interaktion der Verbindung mit den Zellen erzeugt wird.