CN103965359B - 抗上皮细胞粘附分子和t细胞抗原的双特异性抗体 - Google Patents

Abstract

一种双特异性抗体，其包含(1)结合EpCAM的第一功能域，(2)结合CD3的第二功能域，以及(3)连接所述第一和第二功能域的接头，所述第一功能域包含至少一个轻链可变区和至少一个重链可变区，所述轻链可变区包含如下三个互补决定区：CDR-L1：RASQDISNYLN；CDR-L2：YTSRLHS；CDR-L3：QQGSTLPYT，所述重链可变区包含如下三个互补决定区：CDR-H1：GYTFTYYGMN；CDR-H2：WINTYTGEPTYGDDFKG；CDR-H3：TGRATSFDY。

Description

抗上皮细胞粘附分子和T细胞抗原的双特异性抗体

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗相关抗体，更具体的，基因工程抗体领域。

背景技术

目前的研究已知上皮细胞粘附分子(EpCAM，Epithelialcelladhesionmolecule；CD326)是糖基化的I型跨膜糖蛋白，分子量为30到40kD，其结构包括一个表皮生长因子样，一个甲状腺球蛋白样的胞膜外区，一段跨膜区和一段26氨基酸的胞浆区。EpCAM主要定位于上皮细胞之间，以定向和高度有序的方式起作用来粘附上皮细胞。而一旦上皮细胞恶性转化，快速生长的肿瘤细胞将废弃上皮细胞的高度有序性。结果，EpCAM的表面分布变得较少受约束并且分子更多地暴露于肿瘤细胞上。大多数肿瘤细胞由于其上皮细胞的来源，其表面表达有EpCAM[7]。因此EpCAM可以成为对表面表达有该种分子的肿瘤细胞和肿瘤干细胞进行抗体免疫治疗的靶位点。

目前已有大量以EpCAM为靶标的免疫治疗研究开展，例如Adecatumumab，Catumaxomab，和一种抗EpCAM/CD3三功能抗体已进入临床试验研究阶段。其中Catumaxomab抗体在治疗结肠癌/胃癌/或胰腺癌中的效果，Adecatumumab抗体针对***癌的治疗效果，和抗EpCAM/CD3的三功能抗体对卵巢癌的治疗效果在文献中[12-14]被记载。

据称显示具有治疗胰腺癌，结肠直肠癌及卵巢癌的抗EpCAM/CD3双特异性抗体也已分别发表在研究文献[15-18]中。此外，中国专利申请CN1812999A也报道了包含抗EpCAM×CD3的双特异性单链抗体构建物的药物，其被预期用于治疗，缓解和/或预防上皮癌或微量残留癌。

但目前尚未发现显示具有期待的和理想的肝癌治疗效果的EpCAM抗体被报道。因此，本领域还需要研制具有优良特性包括但不限于有效针对和治疗肝癌的抗EpCAM抗体，从而开发出肿瘤免疫治疗效果更显著的针对性药物。

发明内容

本发明提供具有EpCAM特异性结合功能域的双特异性抗体分子，该分子同时还具有通过与CD3分子的结合引发T细胞靶向细胞毒作用来杀伤肿瘤细胞。本发明的双特异性抗体显示了优良的针对多种肝癌肿瘤细胞系和对瘤小鼠体内肿瘤的特异性杀伤，特别是针对肝癌细胞的特异性杀伤作用。

本发明涉及一种双特异性抗体，其包含(1)特异性结合EpCAM的第一功能域(2)特异性结合CD3的第二功能域以及(3)连接所述第一和第二功能域的接头，所述第一功能域包含至少一个轻链可变区和至少一个重链可变区，所述轻链可变区包含如下的三个互补决定区：

CDR-L1：RASQDISNYLN(SEQIDNO：7)

CDR-L2：YTSRLHS(SEQIDNO：8)

CDR-L3：QQGSTLPYT(SEQIDNO：9)

所述重链可变区包含如下三个互补决定区：

CDR-H1：GYTFTYYGMN(SEQIDNO：10)

CDR-H2：WINTYTGEPTYGDDFKG(SEQIDNO：11)

CDR-H3：TGRATSFDY(SEQIDNO：12)。

“功能域”指的是能够特异性识别和/或结合到表位上的三维结构，例如抗体或抗体片段，包括天然完整抗体，单链抗体(scFV)，Fd片段，Fab片段，F(ab’)₂片段，单结构域抗体片段，分离的CDR片段，及其衍生物。此处“单链”意思是第一和第二功能域共价连接，优选地以一个核酸分子可编码的共线性氨基酸序列行形成。

优选地或备选地，上述本发明的双特异性抗体中的第一和/或第二功能域选自单克隆抗体，完整抗体，单链抗体(scFV)，Fab片段，Fd片段，Fv片段，F(ab’)2片段和其功能性衍生物。值得注意的是，本发明的功能域的结合位点可以不仅来自于抗体，也可以来自其他与EpCAM和/或CD3结合的蛋白质，例如天然存在的表面受体或配体。

“完整抗体”由两个同样的重链和轻链组成，各条链分别包含一个可变区(V区)和一个或多个恒定区(C区)。可变区负责与抗原结合，而恒定区主要负责结合效应分子。在各可变区有三个具有高度多样性的柔性的环，称作互补决定区(CDR)，其主要负责识别抗原。可变区的其他部分包含刚性的β片层并支持所谓的框架区(FRs)。CDR和FR间隔排列形成三明治结构。

“单链抗体(scFV)片段”指的是通过基因工程构建的抗体片段，其是有通过接头(linker)连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的重组蛋白，接头使得这两个结构域相关联以形成抗原结合位点。ScFV的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一个核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。

“Fd片段”指的是由重链VH和CH1组成抗体片段。

“Fab片段”指的是由Fd片段(由重链VH和CH1组成)和整条轻链通过链间二硫键形成的异二聚物。“Fab抗体”的大小是完整抗体的1/3，其只包含一个抗原结合位点。

“F(ab’)₂片段“指的是包含两个相连的Fab片段的二价片段。

“单结构域抗体”由重链可变区或轻链可变区组成。由于该抗体片段只由一个结构域组成，所以得名。该片段的大小是一个完整抗体的1/12。

“抗体的衍生物”包括例如当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可使用如BIAcore***中使用的表面等离子共振技术来增加与GPC3或CD3抗原表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier，人抗体杂交瘤7(1996)，97-105；Malmborg，免疫学方法杂志183(1995)，7-13)。还包括，例如WO89/09622中描述的嵌合抗体的产生的方法，EP-A10239400和WO90/07861中描述的人源化抗体产生的方法，WO91/10741，WO94/02602和WO96/33735中有描述的产生异种抗体例如小鼠中的人抗体的方法。

本发明使用的抗体或其片段可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、***、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，Sambrook，分子克隆：实验手册，ColdSpringHarborLaboratory(1989)N.Y.。所指的修饰优选在核酸水平上进行。

“结合”定义抗原上的特定表位与其对应抗体之间的亲和性相互作用，一般也理解为“特异性识别”。“特异性识别”的意思是本发明的双特异性抗体不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。和特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式细胞技术来确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的本领域常识来判断。

“CD3”指的是作为T细胞受体复合物的一部分的表达于T细胞的抗原，其由三个不同的链CD3ε，CD3δ和CD3γ组成。CD3在T细胞上通过例如抗CD3抗体对其的固定作用而产生的集中(clustering)，导致T细胞的活化，与T细胞受体介导的活化类似，但是不依赖于TCR克隆的特异性。绝大多数抗CD3抗体识别CD3ε链。

本发明的特异性识别T细胞表面受体CD3的第二功能域不受具体的限制，只要其能够特异性地识别CD3。例如但不限于在下列专利中提到的CD3抗体：US7,994,289，US6,750,325；US6,706,265；US5,968,509；US8,076,459；US7,728,114；US20100183615。

在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体的第一功能域是单链抗体，其包含具有如SEQIDNO：1所述氨基酸序列的轻链和具有如SEQIDNO：3所述氨基酸序列的重链的。

在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体具有如SEQIDNO：5所述的氨基酸序列。

如上所述，本发明的双特异性抗体还包括连接第一和第二功能域的接头。接头序列可以是短的肽链，例如但不限于(Gly₄Ser)n，其中n从1到5，n为整数。在一个具体实施方案中，n优选为3。包含缺乏二级结构促进作用的所述接头的特征是本领域中已知的，并描述在例如Dall’sAcqua等(Biochem.1998，37，9266-9273)。所设想的具有少于5个氨基酸的接头可以包含4，3，2，或1个氨基酸。优选的单个氨基酸是Gly。如下文实施例中所描述，通过例如基因工程方法接头提供所述第一和第二功能域的相互连接。制备融合的且有效连接的双特异性抗体和在哺乳动物细胞或细菌中表达抗体的方法在本领域中是公知的。

在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体是嵌合抗体或人源化抗体。

在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体还与其他药物或标记物连接。

本发明还涉及编码上述双特异性抗体的核酸，或与所述核酸在严格条件下杂交的核酸，或由所述核酸的简并序列构成的核酸。术语“杂交”是本领域公职的，即本领域的技术人员知道必须使用什么样的杂交条件。根据本发明的严格杂交条件是指在例如含有50％甲酰胺，5×SSC(750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠，5×Denhardt氏溶液和10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的剪切鲑鱼精DNA的溶液中42度孵育过夜，然后用0.1×SSC在大约65度洗涤滤膜。同样涉及在较低严格条件下杂交至本发明核酸的核酸分子。通过控制甲酰胺浓度(较低浓度的甲酰胺导致较低的严格性)，盐浓度或温度可以实现杂交和信号检测严格性的变化。此外，为了实现较低的严格性，可以在较高盐浓度(例如5×SSC)条件下进行严格杂交后的洗涤。另外，通过包含和/或替换用于抑制杂交实验背景的封闭实际可以实现上述严格条件的变化。典型的封闭试剂包括Denhardt氏试剂，肝素，变性鲑鱼精DNA和其他商业可获得的制剂。所述核酸分子可以是例如DNA，cDNA，RNA或包含任意这些核酸(单独地或组合地)的重组产生的嵌合核酸分子。

在本发明的一个实施方案中，编码上述双特异性抗体的核酸包含(1)编码SEQIDNO：1氨基酸序列的核酸序列SEQIDNO：2，和(2)编码SEQIDNO：2氨基酸序列的核酸序列SEQIDNO：4。

在本发明的一个实施方案中，编码上述双特异性抗体的核酸具有编码SEQIDNO：5所述氨基酸序列的核酸序列SEQIDNO：6。

本发明还涉及包含所述核酸的载体。许多适当的载体对于本领域技术人员而言是公知的，对载体的选择取决于预期的功能，包括克隆载体和表达载体。载体包括质粒，粘粒，病毒，噬菌体和常规用于基因工程的其他载体。此外，本发明的核酸和载体可以重建入脂质体内以递送到靶细胞。

表达载体可以是真核细胞载体或原核细胞载体，优选的，所述表达载体还包括有效连接到所述核酸的调节序列。调节序列是指影响连接到其上的编码序列的表达所需的DNA序列。有效连接是指编码序列的调节序列是以与其相容的实现编码序列表达的方式进行连接的。此类调节序列包括例如：(a)复制起始的序列，使得该载体能够在宿主细胞中得以复制，(b)其包含有编码筛选标记的基因序列，该基因编码的蛋白是该宿主细胞在特定的选择培养基中生存和生长所必需的，等等。在宿主细胞如果没有被转染或转化包含该基因的载体的情况下，宿主细胞不能在特定选择培养基中生存。典型的筛选标记基因编码的蛋白包括具有对抗生素或毒素具有耐受性的蛋白，抗生素或毒素包括例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、新霉素、潮霉素、氨甲蝶呤等；补偿营养缺陷的相关蛋白，供应培养基中不存在的关键营养成分，例如编码D-丙氨酸消旋酶基因。采用抗性筛选的例子包括，通过转染包含新霉素抗性基因的外源载体，使宿主细胞获得在含有药物新霉素或G418的培养基的情况下，继续生存生长。另外一个例子是在哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中使用二氢叶酸还原酶(DHFR)筛选标记，哺乳动物细胞宿主细胞是指DHFR缺陷型的细胞，不含二氢叶酸还原酶基因，不能合成核酸，必须在含有HT的培养基里生长。在利用载体转染宿主细胞时，可以通过上述培养基条件的选择筛选得到同时包含目的基因和DHFR基因的外源载体的阳性克隆。(c)其编码序列包含启动子的序列，(d)表达载体还可能包括其它组成序列，包括信号肽序列、转录终止序列、增强子序列等，优选地，本发明的载体为真核细胞载体。优选地，本发明的载体为来自用于抗体真核表达的的pH载体，其包含了CMV的启动子、内部核糖体进入位点序列(Internalribosomeentrysite，IRES)、DHFR筛选标记等元件。氨甲喋呤(MTX)是DHFR的抑制剂，可阻碍其作用。当细胞培养基内含有MTX时，DHFR被抑制，通过反馈调节，使得该基因自我扩增，连带其上下游基因都会扩增，如此目的基因也得到扩增，即可提高目的蛋白的表达量。有用的调节序列对本领域技术人员而言是可知的并且是可以商业得到的。

本发明还涉及包含有上述载体的表达体系，即涉及包含有所述载体的宿主细胞，用于表达所需的多功能抗体多肽。与使用的载体相适应，本发明的宿主细胞可以是任意的原核宿主细胞或真核宿主细胞。根据所使用的宿主，本发明的核酸编码的蛋白质可以是糖基化的或非糖基化的。是使本发明的核酸序列融合C末端His标签。真核宿主细胞，包括酵母、昆虫细胞、植物细胞，哺乳动物细胞等可以是优选的，因为真核细胞存在复杂的目的蛋白的翻译后修饰(例如糖基化)，越来越多的被用于规模化的培养。常用的宿主细胞系包括猴肾细胞(COS-7ATCCCRL1651)、人胚胎肾细胞293及其亚克隆细胞系，幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。优选地，本发明的真核宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

本发明还涉及抗EpCAM/CD3双特异性抗体在制备治疗，预防或缓解肿瘤的药物中的应用。所述肿瘤包括但不限于肝癌，胰腺癌，结直肠癌，卵巢癌，肺癌，乳腺癌，头颈部肿瘤。优选的，所述肿瘤是肝癌。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含安全有效量的抗EpCAM/CD3双特异性抗体，和药学可接受的载体。

附图说明

图1是包含编码本发明的双特异性抗体EpCAM/CD3的核酸序列的重组质粒pIH-anti-EpCAM/CD3scFv的结构示意图。

图2是基因工程方式重组表达的本发明的双特异性抗体1H8/CD3的凝胶变性蛋白电泳图(SDS-PAGE)结果，左栏为核酸分子量标记物(购自：上海升正生物技术公司，商品名：低分子量标准蛋白标记)。

图3是本发明的双特异性抗体1H8/CD3与外周血淋巴细胞(PBMC)结合的流式细胞分析图(FACS)。

图4是本发明的双特异性抗体1H8/CD3分别与EpCAM阳性的肿瘤细胞Huh-7和SMMC-7721以及与EpCAM阴性肿瘤细胞PLC/PRF/5和SK-Hep-1结合的流式细胞分析图。

图5是显示本发明的双特异性抗体1H8/CD3诱导PBMC介导的对EpCAM阳性肿瘤细胞Hep3B和Huh-7的细胞毒作用数值百分比(％)的条状图。

图6显示本发明的双特异性抗体1H8/CD3诱导PBMC介导的对EpCAM阴性肿瘤细胞SK-Hep-1的细胞毒作用数值百分比(％)的条状图。

图7是显示本发明的双特异性抗体1H8/CD3募集PBMC至EpCAM阳性肿瘤细胞Huh-7的显微镜放大照片。其中红色箭头所示是Huh-7细胞，绿色箭头所示是PBMC，黑色箭头所示是聚集在Huh-7细胞周围的PBMC。

图8显示本发明的双特异性抗体1H8/CD3不募集PBMC至EpCAM阴性肿瘤细胞SK-Hep-1的显微镜放大照片。其中图8中红色箭头所示是SK-Hep-1细胞，绿色箭头所示是PBMC。

图9是显示使用不同剂量的本发明的双特异性抗体1H8/CD3及对照介质治疗Huh-7荷瘤小鼠体后体内种植瘤体积改变的折线图，

图10显示使用不同剂量的本发明的双特异性抗体1H8/CD3及对照介质治疗Hep3B荷瘤小鼠体后体内种植瘤体积改变的折线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能理解为用于限制本发明的范围。下面实施例中如未注明具体条件的实验方法，则按照常规条件如Sambrook等，“分子克隆：实验手册(NewYork：ColdSpringHarborlaboratoryPress，1989)”中所述的条件，而在实施例中明确说明有试剂公司说明书时，则按照说明书所建议的条件进行。

实施例1.抗原免疫及杂交瘤筛选

1.1抗原免疫

(1)重组蛋白免疫

EpCAM胞外区重组蛋白(购于上海锐劲生物技术有限公司，货号：RO720)与等体积完全弗氏佐剂(购自Sigma，货号：5881)充分乳化混合得到总体积200μL，其中含EpCAM抗原100μg，皮下注射免疫六周龄BALB/c小鼠。4周后，将重组EpCAM抗原与等体积不完全弗氏佐剂(购自Sigma，货号：5506)乳化混合得到总体积200μL，其中含EpCAM抗原50μg，腹腔注射免疫小鼠。间隔2周，重复进行一次腹腔加强免疫。最后一次加强免疫完成3周后，对小鼠进行脾内免疫注射20μgEpCAM抗原。

1.2杂交瘤细胞株建立和筛选

小鼠脾内免疫后4天，在无菌条件下取脾，用100目滤网分离淋巴细胞，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合，用含次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的含10％胎牛血清(购于：PAA公司，货号：A15-151)，DMEM(购于Gibco公司，货号：12800-082)择性培养基进行培养，3天后补加黄嘌呤和胸苷继续细胞培养一周。

用EpCAM胞外区重组蛋白抗原进行包被，通过酶联免疫吸附(ELISA)方法筛选阳性克隆，并对阳性克隆通过有限稀释法继续进行3次亚克隆，连续培养2个月，最后获得稳定的阳性克隆，该杂交瘤细胞株命名为1H8。

实施例2.制备抗EpCAM双特异性抗体

2.1抗EpCAM单链抗体的基因工程制备

使用Trizol(Invitrogene公司，货号：15596-026)提取上述实施例1的杂交瘤细胞株1H8的总RNA，然后使用逆转录RT-PCR试剂盒(Promega公司，货号：A3800)按照试剂盒说明书的操作步骤对上述所提取的总RNA进行逆转录得到互补DNA序列。

利用5’-FullRace试剂盒(Takara公司，货号：D315)按照试剂盒说明的步骤，以上述得到的互补DNA序列为模板，扩增包含抗体重链或轻链可变区及其上下游序列的一段DNA序列，其中：

上游引物由该试剂盒所提供，

下游外侧引物为：CCAGAGTTCCAGGTCACTGTCACT(SEQIDNO：13)，

下游内侧引物为：CCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTT(SEQIDNO：14)，

然后将PCR扩增得到的抗体重链及轻链可变区分别克隆到T-easy载体(Promega公司，货号：A1360)后，转化感受态大肠杆菌Top10，抗性培养筛选，挑取单克隆菌株，分别进行测序。

然后将测序结果分别输入PubmedBlastIgBlast数据库进行对比，数据库根据对比结果显示抗体的FWR1-CDR1-FWR2-CDR2-FWR3，根据小鼠抗体CDR3末尾特征性氨基酸，即重链：Val-Ser-Ala或Val-Ser-Ser；轻链：Ile-Lys-Arg，精确找出杂交瘤1H8单克隆细胞株重链和轻链可变区的起始部位。确定得到轻链可变区的氨基酸酸序列为SEQIDNO：1，编码其的核酸序列为SEQIDNO：2；重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：3，编码其的核酸序列为SEQIDNO：4。

SEQIDNO：1(1H8V_L)

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLDQEDIATYFCQQGSTLPYTFGGGTKLEIKR

SEQIDNO：2(1H8V_L)

GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTTCCAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTTTTCTCTCACCATTAGCAACCTGGACCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAGTACGCTTCCGTACACGTTCGGGGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG

SEQIDNO：3(1H8V_H)

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTYYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYGDDFKGRFAFSLETSASAASLQINNLKNEDTATYFCARTGRATSFDYWGQGTTLKVSS

SEQIDNO：4(1H8V_H)

CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACATATTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGGTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCGCTGCCTCTTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGAACAGGTCGGGCTACGTCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCAAAGTCTCCTCA

然后在轻链可变区下游引物末端及重链可变区上游末端加入(Gly₃Ser)₃短肽编码DNA序列，然后通过OverlapPCR将重链和轻链可变区的核酸序列通过接头(Gly₃Ser)₃短肽编码DNA连接。具体实施方法如下：

通过5’-1H8vL/3’-1H8vL引物扩增1H8vL片段，将1H8vL下游加入接头(Gly₃Ser)₃短肽编码DNA。

通过5’-1H8vH/3’-1H8vH引物扩增1H8vH，上游加入(Gly₃Ser)₃短肽编码DNA。

上述两段PCR产物胶回收。然后将胶回收产物各取20ng按下述方法进行PCR反应。

反应体系：

反应条件：退火温度50℃，进行10个循环

反应完成后，取5μL作为模板，5’-1H8vL/3’-1H8vH为引物进行PCR反应28个循环。反应产物即为1H8scFv，胶回收纯化。

引物序列如下：

5’-1H8vL：GATATCCAGATGACACAGAC(SEQIDNO：15)

3’-1H8vL：

CTGCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCCGTTTTATTTCCAGCTTG(SEQIDNO：16)

5’-1H8vH：

GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTG(SEQIDNO：17)

3’-1H8vH：TGAGGAGACTTTGAGAGTGG(SEQIDNO：18)

1H8scFv(SEQIDNO：19)

GSTLPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTYYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYGDDFKGRFAFSLETSASAASLQINNLKNEDTATYFCARTGRATSFDYWGQGTTLKVSS

1H8scFv(SEQIDNO：20)

GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTTCCAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTTTTCTCTCACCATTAGCAACCTGGACCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAGTACGCTTCCGTACACGTTCGGGGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACATATTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGGTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCGCTGCCTCTTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGAACAGGTCGGGCTACGTCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCAAAGTCTCCTCA

2.2CD3单链抗体核酸序列的制备

V_LCD3和V_HCD3基因片段分别根据专利文献US7112324B1公布的SEQIDNO：9的第857-1585位核苷酸序列获得，其中该编码CD3单链抗体片段的核苷酸序列通过在VLCD3和VHCD3核苷酸片段之间引入编码氨基酸序列VE(GGS)₄GG接头的核苷酸序列构成。

SEQIDNO：21(CD3scFv)

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK

SEQIDNO：22(CD3scFv)

GATATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGACGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA.

2.31H8/CD3双特异性抗体编码序列核酸的构建

通过PCR方法将抗上述步骤制备所得EpCAM单链抗体和抗CD3scFv用编码接头Gly₃Ser短肽的DNA连接，制备抗EpCAM/CD3双特异性抗体开放阅读框序列。

2.4表达载体的构建

通过5’-81/3’-1H8scFV引物扩增1H8scFv片段，将1H8scFv上游加入信号肽，下游加入Gly₄Ser接头连接肽。通过5’-CD3/3’-CD3-Histag引物扩增CD3单链抗体，上游加入Gly₄Ser接头连接肽，下游引入6×Histag编码序列。上述两段PCR产物胶回收。然后将胶回收产物各取20ng按下述方法进行PCR反应。

反应体系：

反应条件：退火温度50℃，进行10个循环

反应完成后，取5μL作为模板，5’-81/3’-CD3-Histag为引物进行PCR反应28个循环。反应产物胶回收纯化，该反应产物为1H8/CD3双特异性抗体的核酸序列为SEQIDNO：6，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO：5。其中反应产物由于5’-81引物引入NheI酶切位点，由于3’-CD3-Histag引物引入含有NotI酶切位点。

应用NheI和NdeI酶切，T4连接酶连接，转化Top10感受态大肠杆菌。挑取阳性克隆测序鉴定。(NheI，NdeI，T4酶购于NEB公司，反应体系及条件参考说明书)

引物序列如下：

5’-81：

TAGCTAGCCACCATGGTGTCCACAGCTCAGTTCCTTGCATTCTTGTTGCTTTGGTTTCCAGGTGCAAGATGTGATATCCAGATGACACAGAC(SEQIDNO：23)

3’-1H8scFV：

CTGACTGCTGCAGTTTGATATCGGATCCACCACCTCCTGAGGAGACTTTG(SEQIDNO：24)

5’-CD3：

CAAAGTCTCCTCAGGAGGTGGTGGATCCGATATCAAACTGCAGCAGTCAG(SEQIDNO：25)

3’-CD3-Histag：

TATGCGGCCGCCTAATGATGATGGTGATGATGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCC(SEQIDNO：26)

1H8/CD3双特异性抗体氨基酸序列

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLDQEDIATYFCQQGSTLPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTYYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYGDDFKGRFAFSLETSASAASLQINNLKNEDTATYFCARTGRATSFDYWGQGTTLKVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH(SEQIDNO：5)

1H8/CD3双特异性抗体核酸序列

GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTTCCAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTTTTCTCTCACCATTAGCAACCTGGACCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAGTACGCTTCCGTACACGTTCGGGGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACATATTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGGTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCGCTGCCTCTTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGAACAGGTCGGGCTACGTCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCAAAGTCTCCTCAGGAGGTGGTGGATCCGATATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGACGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACATCATCACCATCATCAT(SEQIDNO：6)

2.5稳定的转化宿主细胞的筛选

将包含编码双特异性抗体1H8/CD3的核酸序列的pIH质粒pIH-1H8/CD3用Pvui(购于NEB公司)酶按照说明进行酶切过夜。酶切产物加入反应体系70％的异丙醇冰上沉淀30分钟，于4℃，12000g离心10分钟，弃上清；70％冰乙醇洗涤2次，于室温下干燥10分钟，加入灭菌超纯水溶解，分光光度仪定量，随后置于-80℃冷冻过夜。

取线性化质粒转化CHO-DG44细胞(具体按照Invitrogen公司说明书步骤进行，货号A10999-01)。转染48小时后，细胞计数，以每孔500个细胞种植于96孔板中，共种植10块板。14天后，重组EpCAM蛋白以每孔30ng包被于ELISA板中，于4℃包被过夜，第二天早上，弃去ELISA板中液体，以PBS配制的5％牛奶于37℃封闭2小时，弃去板内液体，0.5％PBST洗涤3次，扣干板内液体。随后吸取50μL转化有pIH-1H8/CD3质粒的CHO-DG44细胞培养上清作为一抗，加入封闭后的ELISA板中，于37℃孵育2小时，弃去板内液体，0.5％PBST洗涤3次，扣干板内液体。以1∶1000(PBS)稀释鼠抗6×His抗体(购于生工生物工程(上海)有限公司)，作为二抗，加入各孔，每孔50μL，于37℃孵育2小时，弃去板内液体，0.5％PBST洗涤3次，扣干板内液体。以1∶1000(PBS)稀释FITC标记的羊抗鼠抗体(购于上海康成生物工程有限公司)，作为三抗，加入各孔，每孔50μL，于37℃孵育2小时，弃去板内液体，0.5％PBST洗涤3次，扣干板内液体，加入含有H₂O₂的ABTS(2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸))100μL(ABTS工作液配制：称14.7g柠檬酸三钠，溶解于dH₂O.PH调至4.0，称0.22gABTS，混匀，定容至1L，避光4°保存)(26mLABTS中加入31μLH₂O₂)，于450nm波长检测吸光值。根据结果，挑选抗体表达量高的单克隆进行培养。

2.61H8/CD3双特异性抗体的表达和纯化

CHO-DG44细胞培养条件按照Invitrogen公司推荐方法进行培养(货号A10999-01)。收集细胞培养上清，于4℃，9000转离心30分钟后，用0.45微米滤膜(购自Millex公司，型号：SLHV033RB)过滤除去固体杂质。用金属亲和层析柱NiSepharose^TM6FastFlow(购自GEHealthcareBio-ScienceAB公司)进行双体异性抗体的纯化，洗脱条件为用含有20mM，50mM，100mM，250mM，500mM咪唑浓度的磷酸盐缓冲液(pH8.0，Na₂HPO₄50Mm，NaCl300mM)顺序进行洗脱，各咪唑浓度组洗脱体积为金属亲和层析柱NiSepharose^TM6FastFlow体积的5倍。洗脱产物SDA-PAGE胶电泳，借助小分子量标记物确定洗脱产物的大小。然后进行考马斯亮蓝染胶，脱色液脱色，鉴定被特异性洗脱下的洗脱产物(具体过程严格按照：分子克隆：实验手册(NewYork：ColdSpringHarborlaboratoryPress，1989)中所述的条件)的洗脱液，特异性洗脱产物于1×冰PBS中透析，透析体积1∶1000。透析完成后使用CentrifugalFilterUnits(购于Amicon公司，货号：UFC801096)对抗体进行浓缩。

实施例3双特异性抗体的结合能力检测

3.11H8/CD3双特异性抗体的FACS分析

A.材料：

1)细胞：

B.步骤

对上表的各细胞系分别进行类似的如下操作：

取对数生长期的如表1所列各细胞接种到6cm平皿中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，细胞长满平皿的90％时用于流式细胞检测。

1)使用10mM的EDTA消化细胞，5000rpm×5min分别离心收集平皿中每孔细胞于数个2mLEppendorf管中。用含有1％NCS(新生牛血清)的1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，离心后丢弃上清。

2)一个试验组管内加入终浓度10μg/mL的100μL1×PBS中的本发明双特异性抗体1H8/CD3作为一抗，一个对照组管内加入相同体积的PBS至细胞沉淀中重悬细胞，冰浴孵育细胞45min。然后离心，弃上清，用含有1％NCS的PBS洗涤细胞2次，离心，丢弃上清。

3)加入100μL的1∶50稀释的鼠源抗6×His抗体(生工生物工程(上海)有限公司)作为二抗重悬细胞，冰浴孵育细胞45min，离心，弃上清，用含有1％NCS的PBS洗涤细胞2次，离心，丢弃上清。

4)加入100μL1∶50稀释的羊抗鼠FITC标记抗体(上海康成生物工程有限公司)作为三抗重悬细胞，冰浴孵育细胞45min，离心，弃上清，用含有1％NCS的PBS洗涤细胞2次，离心，丢弃上清。

5)用400μL的PBS重悬各管细胞沉淀，然后分别转移至流式细胞管中通过流式细胞仪监测与细胞结合的抗体产生的细胞表面的荧光强度。

6)应用流式细胞仪数据分析软件WinMDI2.9分析数据。每个样品至少采用流式细胞分析仪分析10,000个细胞。

C.结果

如图3所示，PBMC细胞显示明显高于PBS对照的荧光强度谱，表明实验的本发明1H8/CD3双特异性抗体可以与CD3阳性的PBMC细胞特异性结合。

如图4所示，EpCAM阳性细胞SMMC-7721和Huh-7显示明显高于PBS对照对照的荧光强度谱，其中SMMC-7721的荧光强度峰值约为PBS对照的4-5倍，Huh-7的荧光强度峰值约为PBS对照的10倍。又如图4所示，EpCAM阴性细胞PLC/PRF/5和SK-Hep-1显示与PBS对照几乎重合的荧光强度谱和荧光强度峰值。

图4的结果表明，本发明的双特异性抗体1H8/CD3能特异性地结合EpCAM阳性细胞而不结合EpCAM阴性细胞。

综合以上图3和图4，本发明的双特异性抗体1H8/CD3同时具有特异性结合CD3阳性的PBMC细胞和EpCAM阳性的肿瘤细胞的能力。

实施例.4抗EpCAM双特异性抗体的体外细胞毒性分析

步骤：

外周血单核细胞(PBMC)用Ficoll(来自Biochrom)密度梯度离心方法，按照标准步骤从健康人供主的血液中分离。离心后，用浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞然后重悬于RPMI1640完全培养基(Gibco)，将细胞浓度调整到7×10⁵/mL。PBMC用作细胞毒性实验中的效应细胞。不同的肿瘤细胞作为靶细胞，包括EpCAM阳性的人肝癌细胞系Hep3B(肝癌细胞系，ATCC:HB-8064^TM)，前文已述的Huh-7和EpCAM阴性的SK-Hep-1。

用RPMI1640完全培养基将靶细胞浓度调整到7×10⁴/mL。同样体积的靶细胞和效应细胞混合，使效应细胞：靶细胞(E∶T)比值为10∶1。

将混合后的细胞悬液以75μL/孔的体积加到96孔板中。然后各孔分别添加25μL从30ng/mL到0.03ng/mL的十倍系列梯度稀释的1H8/CD3单链双功能抗体。

在37℃，5％CO₂的培养箱中孵育48小时后，根据生产商的操作说明，用非放射性细胞毒性检测试剂盒(Non-RadioactiveCytotoxicityAssaykit，来自Promega)检测抗体的细胞毒作用。

非放射性细胞毒性检测是基于比色法的检测方法，可替代⁵¹Cr释放法。检测定量地测量乳酸脱氢酶(LDH)。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与⁵¹Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。

肿瘤细胞的杀伤率(即，细胞毒性％)是根据非放射性细胞毒性检测G1780产品使用说明书提供的下列公式计算的：

其中：

“实验”指的是加入抗体/效应细胞/靶细胞的实验孔所产生的LDH释放值，

“效应细胞自发”指的是只含有效应细胞的对照孔自发产生的LDH释放。本发明中是指效应细胞的对照孔

“靶细胞自发”是指只含有靶细胞的对照孔在靶细胞不受其他因素处理时产生的LDH释放。

“靶细胞最大”是用0.8％TritonX-100处理后靶细胞使其完全裂解对对照孔所产生的LDH释放，

“靶细胞最大-靶细胞自发”代表着靶细胞受外界处理后完全裂解所产生的LDH释放。

3.3实验结果：

双特异性抗体1H8/CD3在不同浓度下对各肿瘤的细胞毒性结果如下。

从上表和图5和6所示结果可知，双特异性抗体1H8/CD3对EpCAM阳性肿瘤细胞Hep3B在较低剂量组，如0.3ng/ml组，即以达到约30％，而在较高剂量组，如30ng/ml组，则高达86％。相似的，双特异性抗体1H8/CD3对EpCAM阳性肿瘤细胞Huh-7在较低剂量组，如0.3ng/ml组，即以达到约71％，而在较高剂量组，如30ng/ml组，则高达102％。这表明本发明的重组双特异性抗体1H8/CD3对EpCAM阳性肿瘤细胞显示特异性的杀伤作用。与之相对的，本发明的双特异性抗体1H8/CD3对EpCAM阴性肿瘤细胞SK-Hep-1则几乎没有杀伤作用，除了在极高剂量(100ng/ml)的情况下之外显示约14.1％的细胞杀伤毒性以外。这可能是因为大剂量CD3抗体对T细胞有活化作用，导致对肿瘤的非特异杀伤。

实施例.5

双功能抗体的荷瘤小鼠体内抗肿瘤活性

6-10周龄的免疫缺陷的NOD/SCID小鼠(由复旦大学上海医学院动物实验中心提供)用于构建人EpCAM相关肿瘤的异种移植模型，其遗传学特征是缺乏T细胞，B细胞，NK细胞以及巨噬细胞功能。

两个治疗组(每组6只)小鼠右侧皮下接种混合细胞悬液，该悬液由细胞浓度为2×10⁶的Huh-7或4×10⁶Hep3B肿瘤细胞与细胞浓度为1×10⁶的未刺激的PBMC按照1∶1(细胞数之比)混合的制成。在接种1小时后，每组的小鼠被分别尾静脉内给药0.25mg/kg/d和0.5mg/kg/d的1H8/CD3，该给药重复连续10天。

对照组包括(1)对照组1，该组接种的肿瘤细胞未与等体积PBMC混合，作为评估PBMC对肿瘤生长影响的背景对照，和(2)对照组2，该组接种肿瘤细胞和PBMC混合悬液后，只给药不含抗体的PBS的组，以评估PBMC效应细胞诱导的非特异性杀伤效果。对照组的给药方式和给药时间与治疗组平行。对照组每组包括6只小鼠。

用卡尺测量各组小鼠体内肿瘤的大小，肿瘤体积是根据下列公式计算：

如图9和10分别所示，用不同浓度的本发明的双特异性抗体1H8/CD3进行治疗两组小鼠，其体内肿瘤体积均明显小于本实验中对照组1和对照组2的小鼠体内的肿瘤体积。

具体而言，如图9所示在例如肿瘤细胞接种后第27天，Huh-7PBS组即对照组1和Huh-7PBMCPBS组即对照组2小鼠的肿瘤体积均在2000mm³以上，而两个不同剂量的本发明双特异性抗体的治疗组小鼠的肿瘤体积均显著小于2000mm³，其中0.25mg/kg剂量组小鼠肿瘤平均体积低至约463mm³，而0.5mg/kg剂量组小鼠没有肿瘤长出。如图10所示在肿瘤接种后第26天开始至第42天，对照组小鼠的肿瘤体积急剧增大，从小于100mm³迅速增长至分别为约700mm³和约2000mm³，而实验的两个剂量组不管是0.25mg/kg剂量组还是0.5mg/kg剂量组小鼠都没有肿瘤生长出来。

图9和10显示出本发明的双特异性抗体1H8/CD3对Huh-7荷瘤小鼠和对Hep-3B荷瘤小鼠的显著的特异性肿瘤杀伤治疗效果。

所有本说明书中列出的出版物的内容都包含在本说明书中。此外，本领域技术人员可以理解，在不背离权利要求书中所述的技术范围和实质内容的情况下，对本发明进行多种不同的修饰和改变是可能的。本发明还包括上述这些修饰和改变。

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Claims (12)

1.一种抑制肝癌细胞的双特异性抗体，其包含(1)结合EpCAM的第一功能域，(2)结合CD3的第二功能域，以及(3)连接所述第一和第二功能域的接头，所述第一功能域包含一个轻链可变区和一个重链可变区，所述轻链可变区包含如下三个互补决定区：SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9；所述重链可变区包含如下三个互补决定区：SEQIDNO:10，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12；

并且，所述第一功能域是单链抗体，其包含如SEQIDNO:1所述氨基酸序列的轻链可变区和如SEQIDNO:3所述氨基酸序列的重链可变区。

2.权利要求1的双特异性抗体，其氨基酸序列如SEQIDNO:5所述。

3.权利要求1-2之一的双特异性抗体，其还与标记物连接。

4.编码上述权利要求之一的双特异性抗体的核酸。

5.权利要求4的核酸，其包含(1)编码SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的核酸序列SEQIDNO:2，和(2)编码SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的核酸序列SEQIDNO:4。

6.权利要求4的核酸，其核酸序列如SEQIDNO:6所示。

7.含有权利要求4-6之一的核酸的载体。

8.权利要求7的载体，其为表达载体。

9.权利要求7或8的载体，其还包含有效连接到所述核酸的调节序列。

10.包含权利要求7-9之一的载体的宿主细胞。

11.权利要求1-3之一的双特异性抗体在制备治疗、预防或缓解肿瘤的药物中的应用；其中所述肿瘤为肝癌。

12.一种药物组合物，其包含安全有效量的权利要求1-3之一的双特异性抗体和药学可接受的载体。