TR201904121T4 - İnsan bispesifik egfrviii antikoru birleştirme molekülleri. - Google Patents

Abstract

Yüzeyinde insan EGFRvIII mutant proteinini ifade eden bir tümör hücresini spesifik olarak birleştiren bir kola ve T hücresi aktivasyon ligamdı CD3'ü spesifik olarak birleştiren bir ikinci kola sahip olan bir bispesifik antikor birleştirme molekülünü kodlayan bir polinükleotit oluşturduk. Polinükleotit, CHO hücrelerinde ifade için optimize edilen kodondur. Birleştirme moleküllerinin alt birimleri, daha fazla verimlilik gerçekleştirmek için organize edilmektedir. Bunlar, ümit verici terapötik ajanlardır.

Description

TEKNIK ALAN Bu bulus, kanser terapisi alanEile ilgilidir. Özellikle, kanserin tedavi edilmesi için EGFRvIII ve ajanlarEifade eden kanserlerin tedavi edilmesi ile ilgilidir. ÖNCEKI TEKNIK En genel primer malign beyin tümörü, glioblastoma multiforme (GBM), cerrahi rezeksiyon, radyasyon terapisi ve kemoterapil'e ragmen degismez sekilde ölümcül olmaktadlB Immünoterapi, çoklu modalite terapiye ilave toksisite eklemeden benzersiz spesifiteye sahip neoplastik hücreleri elimine eden saglam, tümör-spesifik immün yanlfihrlîlndüklemeyi temin etmektedir. Somut kanli] kanserin eradikasyonunda T-hücrelerinin rolünü desteklemektedir.

Son zamanlarda, T-hücrelerini yeniden yönlendirmek için spesifik antikorlarI kullanilBiasIZI konsepti, CD3 gibi bir Thücresi aktivasyon ligand- karsEýönlendirilen bir tek zincirli antikora baglanan bir tümörü hedefleyen tek zincirli antikordan olusan rekombinant bispesifik T-hücresi birlestirme molekülleri veya bispesifik T-hücresi birlestirme molekülleri formunda optimize edilmistir. Bu bispesifik T hücresi birlestirme molekülleri, T-hücrelerini tümör hücrelerine baglayabilmektedir, böylelikle eslik eden tümör hücresi Iizisine sahip T-hücrelerinin yüksek derecede lokalize ve spesifik aktivasyonuna yol açmaktadE Son zamanlarda, bir CD19XCD3 bispesifik T hücresi birlestirme molekülünü kullanan insan deneyleri, kan, kemik iligi ve karaciger4'ten tümörün klirense sahip oldugu yalnlîta 0.06 mg/mZ'IIk bir dozda Hodgkin olmayan Ienfomaya sahip 7/7 hastada gözlemlenen tümör regresyonu vasitâslîla bu yapilârI potansisini dogrulamigtiEl Ancak bu ümit verici yapllârI en önemli kigflhmasü lelllZla ve homojen olarak ifade edilen tümör-spesifik hedeflerin bulunmamaslß Somatik genlerdeki mutasyondan kaynaklanan tümör-spesifik antijenlerin, otoimmünite ile iliskilendirilmesi daha az muhtemeldir ancak tümörlerin genetik instabilitesinin bir sonucu olarak siiZiiKla rastgele ortaya çiiîinaktadiîi ve böylelikle hasta-spesifik ve onkojenik prosese özgü olma egilimindedir. Ancak EGFRvIII, bir kodonu ayißn ve kaynasma yerinde yeni bir glisini üreten EGFR'nin ektrasellüler alanIan (ECD) 801 baz çiftinin bir çerçeve-içi delesyonunundan olusan neoplastik prosesin merkezinde, lei ve tutarlübir tümör spesifik mutasyondur. Bu mutasyon, neoplastîk hücre büyümesini ve migrasyonu9'u gelistiren ve tümör hücrelerine radyasyon ve kemoterapötik direnci veren esas olarak aktif bir tirosin kinazID kodlamaktadE EGFRvIII mutasyonu, en sl]Zl[lZla GBM'ye sahip hastalarda görülmektedir ancak genis bir baska genel kanser dizisinde bulunmustur. ECD k-ilarIan normal olarak uzakta kaynasma yerine eklenen yeni glisin, herhangi bir normal dokuda bulunmayan bir tümör- Beyin kanserleri gibi kanserlerin daha iyi ve daha basar[[l]]ledavilerini bulmaya yönelik teknikte ve ark., BMC Cancer 2013; 13:83 dokümanlar.. her ikisi, EGFR ve CD3'ü hedefleyen bispesifik antikorlarElaçlKlamaktadlEl ancak hiçbiri, mevcut bulusun spesifik antikorlarIEl açMamamaktadE BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Bulusun bir yönü, bir bispesifik polipeptiddir. Bispesifik polipeptit, EGFRvIII'ye baglanan bir birinci insan tek zincir degisken bölgesini içermektedir. Birinci tek zincir degisken bölge, bir ikinci insan tek zincir degisken bölgesi ile amino ila karboksi slßslüda seri halindedir. Ikinci tek zincir degisken bölge, T hücresi aktivasyon ligandECD3'e baglanmaktadlü Birinci tek zincir degisken bölge, amino ila karboksi sßsia SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5 ve 6 taraflEUan kodlanan segmentleri içermektedir. Ikinci tek zincir degisken bölge, amino ila karboksi sßslütla SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7 ve 8 tarafEdan kodlanan segmentleri içermektedir.

Bulusun baska bir yönü, bir bispesifik polipeptidi kodlayan bir polinükleotiddir. Bispesifik polipeptid, EGFRvIII'ye baglanan bir birinci insan tek zincir degisken bölgesini içermektedir.

Birinci tek zincir degisken bölge, bir ikinci insan tek zincir degisken bölgesi ile amino ila karboksi slßsIa seri halindedir. Ikinci tek zincir degisken bölge, T hücresi aktivasyon IigandlZI CD3'e baglanmaktadlü Birinci tek zincir degisken bölge, amino ila karboksi süsia SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5 ve 6 taraflEldan kodlanan segmentleri içermektedir. Ikinci tek zincir degisken bölge, amino ila karboksi sßsia SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7 ve 8 tarafIan kodlanan segmentleri içermektedir. Bispesifik polipeptidi kodlayan belirli bir polinükleotid, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1'de gösterilmektedir.

Bulusun baska bir yönü, bir EGFRvIII'ü ifade eden tümöre sahip bir hastanItedavi edilmesine kullanIia yönelik bispesifik polipeptiddir, bu sayede tümöre bir sitolitik T hücresi yanllîllîl indüklenmektedir. Bispesifik polipeptid, EGFRvIII'ye baglanan bir birinci insan tek zincir degisken bölgesini içermektedir. Birinci tek zincir degisken bölge, bir ikinci insan tek zincir degisken bölgesi ile amino ila karboksi süslütla seri halindedir. Ikinci tek zincir degisken bölge, T hücresi aktivasyon IigandEiED3'e baglanmaktadlü Birinci tek zincir degisken bölge, amino ila karboksi sßsia SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5 ve 6 tarafIan kodlanan segmentleri içermektedir. Ikinci tek zincir degisken bölge, amino ila karboksi sßsia SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7 ve 8 tarafIian kodlanan segmentleri içermektedir.

Bulusun yine baska bir yönü, bir bispesifik polipeptidin yapilmas- yönelik bir yöntemdir. Bir hücre, bir kültür ortamIa kültürlenmektedir. Hücre, bispesifik polipeptidi kodlayan bir polinükleotid içermektedir. Bispesiûk polipeptid, EGFRvIII'ye baglanan bir birinci insan tek zincir degisken bölgesini içermektedir. Birinci tek zincir degisken bölge, bir ikinci insan tek zincir degisken bölgesi ile amino ila karboksi süsia seri halindedir. Ikinci tek zincir degisken bölge, T hücresi aktivasyon IigandECD3'e baglanmaktadlE Birinci tek zincir degisken bölge, amino ila karboksi sßsia SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5 ve 6 tarafian kodlanan segmentleri içermektedir. Ikinci tek zincir degisken bölge, amino ila karboksi süsIa SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7 ve 8 tarafIan kodlanan segmentleri içermektedir. Kültürleme sonraleUa bispesifik polipeptid, hücrelerden veya kültür ortamlEtlan hasat edilmektedir.

Tarifnamenin okunmaleUan sonra teknikte uzman kisiler için asikar olacak olan bu ve diger yapllând [Binalar teknigi saglamaktadlB BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Bulus sahipleri, EGFRvIII ve T hücresi aktivasyon IigandlID3'ün her ikisini hedefleyen insan spesifik T hücresi birlestirme moleküllerini gelistirmistir. Sitotoksik T hücrelerinin, EGFRvIII ifade eden bir kanser hücresini iyilestirdigini ve Sitotoksik T hücrelerini aktive ettigini, böylelikle EGFRvIII molekülünü ifade eden kanser hücresini öldürdügünü bulmustur. Bispesifik T hücresi birlestirme molekülleri, ekstrasellüler miliyöden antikora erisebilir olan memeli hücrelerinin yüzeyinde gösterilen EGFRvIII ve T hücresi aktivasyon IIgandlZlCD3 ile seçici bir sekilde reaktiftir. Dikkate deger olan, VL segmentinin, EGFRvIII'e baglanan degisken bölgenin VH segmentinden önce geldigi insan bispesiûk T hücresi bilestirme molekülleri olmasIlE Ek olarak dikkate deger olan, bir sinyal peptîdi barlökjßn kaynasma proteinleridir. Ayrlîla, Insan bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerini kodlayan polinükleotidler, Çin Hamsteri Over (CHO) hücrelerinde ifade için optimize edilen kodon olabilmektedir.

Insan bispesifik T hücresi birlestirme molekülleri olan kaynasma proteinleri, tek tek degisken alanlar araleUa ve degisken bölgeler araleUa baglaylEÜnolekülleri barlihßbilmektedir veya barIÜmamaktadlEi BaglaylEIZlSEKANS KIMLIK NUMARASI: 9 ve 10'da gösterilenlerden veya say. monomere sahip olanlardan seçilebilmektedir. Teknikte bilindigi üzere diger baglaylîllâr da kullanHâbilmektedir.

Bir sinyal sekansü kültürdeki üreten hücrelerden insan bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerinin salgllânmaSIEkoIaylastlElnak için kaynasma proteininin amino terminali ucunda kullanllâbilmektedir. Salgllâma, hücrelerden kaynasma proteini ürününü hasat etmesi için hücreleri klîiinaya yönelik gereksinimi önlediginden dolaylZiavantajIIE SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4'te gösterilen sinyal sekansüinsan bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerinin salgllânmasllîbasarEIJEbir sekilde yönlendirdigi gösterilmesine ragmen teknikte bilinen diger sinyal sekanslarülternatif olarak kullan ilâbilmektedir.

SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1'de gösterilen insan bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerini kodlayan nükleik asit, CHO hücreleri için optimize edilen kodon olmasiEla ragmen, aynEinsan bispesifik T hücresi birlestirme molekülleri, aynüamino asidi kodlayan ancak farkIEkodonlarlZI kullanan diger nükleik asitlerden yapllâbilmektedir. Bunlar, farklEhücre hatlarIia veya farklEi hayvan sistemlerinde i'n i//vo üretim için optimize edilebilmektedir.

SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1, 2 ve 3'te sunulan degisken alanlarI sßsEi/üksek derecede etkili olarak görülmesine ragmen degisken alanlarI diger SlBiIarÇlbelirli özellikleri paylasabilen ancak essiz olan baska faydaIEIözeIIiklere sahip olabilen diger insan bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerini gerçeklestirmek için kullanilâbilmektedir. Örnegin üretim, alanlarI bir süsüle optimize edilebilmektedir, oysa avidite veya sitotoksisite, baska bir si& ile optimize edilebilmektedir. Degisken alanlarI olasßülarüasag-kileri kapsamaktadE SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5, 6, 7, 8; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8, 7, 6, 5; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 6, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 6, 5, 8, 7. Bu segmentlerin herhangi birinin aras-a baglaylEllâr kullanliâbilmektedir. Sinyal sekanslarlÇlalanlarI bu sekanslarüban herhangi birinden N-terminal olarak önce gelmektedir.

Bispesifik antikorlarI birçok türü yapllâbilmektedir ve kullanilâbilmektedir. Bunlar, kigtiiama olmaksIZIEl, quadroma-kaynaklElF(ab')2, heterodimerik scFv, heterodimerik Fab, diakorlar, tandem diakorlarü/e tandem scFv molekülleri kapsamaktadlE Bispesifik antikorlar, ayrlîla, üç islevli antikorlar, baska bir deyisle EGFRvIII ve bir T hücresi aktivasyon ligandElçin baslangIÇliki spesifiteye ek olarak bir üçüncü spesifiteye sahip olan antikorlar kullanllârak yapllâbilmektedir.

Teknikte birçok form iyi bilinmektedir.

Bispesifik T hücresi birlestirme molekülleri yapIlglIa bunlar, rekombinant hücrelerde üretilebilmektedir. Herhangi bir uygun hücre türü kullanllâbilmektedir. Bispesifik T hücresi birlestirme molekülleri salgllândlgEtakdirde bunlar, kültür ortamIan hasat edilebilmektedir.

Intrasellüler kaldllZlarEtakdirde, uygun hücre fraksiyonundan bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerini hasat etmek için hücreler herhangi bir uygun kosulda toplanabilmektedir ve bozulabilmektedir. Bakteri, maya, böcek hücreleri, bitki hücreleri, alg hücreleri, memeli hücreleri kapsayan herhangi bir uygun hücre konakçlgl bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerinin üretilmesi için kullanllâbilmektedir. Bir senaryoda bispesifik T hücresi birlestirme molekülleri, uygun bir sekilde transfekte edilmis CHO hücrelerinde üretilebilmektedir ve süpernatan, üretilmis bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerini barilücaktlîl EGFRvIII'ü ifade eden herhangi bir tümör hedeflenebilmektedir ve bispesifik T hücresi birlestirme molekülleri ile tedavi edilebilmektedir. EGFRvIII antijenini ifade ettigi bulunan tümörler, glioblastoma multiforme gibi beyin tümörleri, meme tümörleri ve akciger tümörlerini kapsamaktadlü Bu ve diger tümörlerden herhangi biri, mutant antijeni ifade ettigi takdirde hedeflenebilmektedir.

Birimler, önekler ve semboller, Systeme International de Unites (SI) taraf-an kabul edilen formlarIia gösterilmektedir. Saylîbl aralllZlar, arallgübelirleyen sayllârElkapsay-lEI Aksi gösterilmedigi sürece nükleik asitler, 5' ila 3' yöneliminde soldan saga yazüßîaktadE ve amino asit sekanslarüamino ila karboksi yöneliminde soldan saga yazllBwaktadE Burada saglanan baslllZlar, bir bütün olarak tarifnameye atlîlile sahip olunabilen bulusun çesitli yönlerinin veya yapllândlElnalarII klglflhmalarlîdegildir. Bu dogrultuda, hemen asagi tanIilanan terimler, kendi bütünlügü içerisinde tarifnameye at[Elile daha tam bir sekilde tan lanmaktadlîl çerçeve delesyonunda bir 801 baz çifti ile karakterize edilen epidermal büyüme faktör reseptörünün bir mutant formu anlam. gelmektedir. Reseptörün bu formu, Önceki teknikte belirtilen Wickstrand ve ark., Moscatello ve ark. ve Lorimer ve ark. referanslarElile örneklendirildigi üzere teknikte bilinmektedir. Terminolojideki bir degisiklikten dolayEEGFRvIII, U.S. 5,212,290 sayiElIibatent dokümanIa örneklendirildigi üzere teknikteki daha önceki birkaç çalismada bir Tip II mutasyonu olarak aslen kullanilßîlgtß karsEýönlendirilen antikorlar, T lenfositlerinde bir aktivasyon sinyali üretebilmektedir. Klîlfilama olmaks- CD28, CDl34, CD137 ve CD27 gibi diger T hücresi aktivasyon IigandlarElda kullanliâbilmektedir.

Burada kullanIlgiElüzere “antikor", belirli bir antijen ile immünolojik olarak reaktif bir immünoglobülin molekülüne atfEkapsamaktadlEl Terim, ayrlîa, kimerik antikorlar (örnegin, insanlastlElBiE murin antikorlarD] heterokonjugat antikorlar (örnegin, bispesifik antikorlar) ve rekombinant tek zincir Fv fragmentleri (scFv), disülfit ile stabilize (dst) Fv fragmentleri (BakIlîl U.S. 08/077,252 Seri SayiIJIPatent DokümanD] veya pFv fragmentleri (BakIlZl U.S. formlarlîlkapsamaktadlü “Antikor” terimi, ayrlîlsi, antikorlar. antijen baglama formlarIIZI (örnegin, F(ab')2, Fab, Fv ve rIgG (BakIEIayrlEa, Pierce Catalog ve Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, III.) kapsamaktadE Belirli bir antijen ile immünolojik olarak reaktif bir antikor, fajdaki veya benzer vektörlerdeki rekombinant antikorlarlEl kitaplilZlarII seçimi gibi rekombinant yöntemler ile üretilebilmektedir Tipik olarak bir immünoglobülin, aglîlve hafif bir zincire sahiptir. Her bir agIElve hafif zincir, bir sabit bölge ve bir degisken bölge barlEUBnaktadE Hafif ve ag& zincir degisken bölgeleri, ayrlîla tamamlaylEIDEJ belirleme bölgeleri veya CDR'Ier olarak adlandlîllân, üç hiper-degisken bölge tarafIian kesilen bir “çerçeve” bölgesini barilElnaktadlEl Çerçeve bölgesinin ve CDR'Ierin kapsamlZbeIirlenmistir (bakIlîl SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL hafif ve agIElzincirlerin çerçeve sekanslarünispeten bir tür içerisinde korunmaktadlEl Yapltîlislîl hafif ve aglElzincirlerin birlesik çerçeve bölgeleri olan bir antikorun çerçeve bölgesi, CDR'leri üç boyutsal boslukta konumlandlElna ve hizalamak üzere islev görmektedir. CDR'Ier, önceli bir antijenin bir epitopuna baglanmaleUan sorumludur. CDR'Iere, tipik olarak, N-terminusundan baslayarak slüsMa numaralandlEllân CDR1, CDRZ ve CDR3 olarak atliîla bulunulmaktadE zincirinin, bir zincir olusturmak Için bitistirildigi bir antikora at[Ella bulunmaktadE Tipik olarak, bir aktif baglama sahasII düzgün bir sekilde katlanmasüle olusturulmalea olanak saglamasEl için iki zincir araleia eklenmektedir. üzere islev gören bir antikor baglama fragmenti (örnegin, Fv fragmenti) içerisindeki bir peptide atlekapsamaktadE BaglaylEÇl örnegin, bir dizi bir tek amino asit veya amino asitlerin bir degisimli deseni olabilmektedir.

Bu bulus ile ilgili olarak bu terim, antikor-antijen bag. atilîlla bulunmaktadlEl Burada kullan-[gllîlüzere “bispesifik T-hücresi birlestirme molekülü” terimi, istenilen bir molekülü ifade eden tümör hücrelerini hedefleyerek kanser hücrelerini öldürmesi amaclýla bir süjenin T hücrelerinden yararlanmak üzere tasarlanan bir moleküle atiflla bulunmaktadlEl Belirli yaplIândlEnalarda istenilen molekül, insan EGFRvIII'tür. Diger yapliândlünalarda bispesifik T hücresi birlestirme molekülleri, iki Fv alanlarIülçermektedir. Diger yapüândlElnalarda bispesifik T hücresi birlestirme molekülü, EGFRvIII'e yönlendirilen bir birinci Fv alanIElve CD3'e yönlendirilen bir ikinci Fv alanIEEÇermektedir. Fv alanlarßcFv alanlarüilabilmektedir. taslýan bir hücre veya doku ile olan öncelikli iliskisine ve EGFRvIII veya CD3 bulunmayan hücreler veya dokular ile olmayan iliskisine atfEkapsamaktadlE Elbette, belirli bir derecede spesifik olmayan etkilesim, bir molekül ve bir hedef olmayan hücre veya doku arasIa olusabilecegi kabul edilmektedir. Yine de seçici reaktiflik, EGFRvIII ve CDB'ün spesifik tanlEtnaslZlle arachlundugu üzere ayI edilebilmektedir. Seçici bir sekilde reaktif antikorlar antijeni baglamas. ragmen bunu düsük afinite ile yapabilmektedir. Öte yandan spesifik baglanma, baglElantikor ve EGFRvIII veya CD3 bulunmayan hücreler veya düsük afiniteye sahip antikor-antijen bag araleUakine klýhsla antikor ve EGFRvIII veya CD3 taslýhn hücreler arasIa çok daha güçlü bir iliskiye yol açmaktadlEl Spesifik baglanma, tipik olarak, EGFRvIII veya CD3 bulunmayan bir hücreye veya dokuya klýlasla EGFRvIII veya CD3 taslýlan bir hücreye veya dokuya baglilntikorun miktarIa (birim zaman basi) 2 kat daha fazla, tercihen 5 kat daha fazla, daha da tercihen 10 kat daha fazla ve en fazla tercihen 100 kat daha fazla artigla yol açmaktadE Bu gibi kosullar aItIa bir proteine spesifik baglanma, belirli bir protein için bunun spesifitesi için seçilen bir antikoru gerektirmektedir. Bir dizi immünotahlil formatÇIbelirli bir protein ile spesifik olarak immüoreaktif antikorlarI seçilmesi için uygundur. Örnegin katEllaz ELISA immünotahlilleri, bir protein ile spesifik olarak immünoreaktif monoklonal antikorlarEl seçmek üzere rutin bir sekilde kullanüBiaktadlEl Spesifik immünoreaktifligi belirlemek için kullanllâbilen immünotahlil formatlarII bir açüaamasEl için bakIlZ Harlow & Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988).

Bulusun baziîyapllândiüinalaria antikor, yabani-tip EGFR'den daha iyi bir sekilde EGFRvIII'e baglanacaktE BazEörneklerde bir antikor, her ikisine de baglanacaktlEl Diferansiyel baglanma, sabit bir süre miktarEile sabit bir miktarda antijene daha saglam bir baglanmada veya daha hlîIElbir baglanmada veya daha fazla bir baglanmada yansßilâbilmektedir. Daha iyi baglanma, en az 2, 4, 6, 8 veya 10'un bir faktörü ile yapüâbilmektedir. BazElliastalllZJkosuIIarIa, EGFR'nin hem mutant hem de yabani-tip formlar. yönelik olarak, örnegin her iki formunda da bir tümör hedefinde ortak bir sekilde ifade edildigi bir baglanma derecesine sahip olmak avantajlü olabilmektedir. Diger hastalilZl durumlarlEUa örnegin, olumsuz yan etkileri azaltmak amaclýia mutant form için mevcut maksimum miktarda spesifiteye sahip olunmasEîBtenilebilmektedir.

Burada kullan-[giüjzere “polipeptit", “peptit" ve "protein” terimleri, birbirinin yerine geçecek sekilde kullanilâbilmektedir ve amino asit kaIlEtllârII bir polimerine atfIIkapsamaktadE Bu terimler, bir veya daha fazla amino asit kallEtIlEi, karsUJKJ gelen dogal olarak olusan amino asidin bir yapay kimyasal analogu oldugu amino asit polimerlerine, ve ayrlEb dogal olarak olusan amino asit polimerlerine uygulanmaktadE Bu terimler, ayrü, protein islevsel kalacak sekilde koruyucu amino asit ikamelerini barlEtllîan polimerlere uygulanmaktadlü (toplu olarak “peptit”) içine dâhil edilen bir amino aside atfEkapsamaktadB Amino asit, dogal olarak olusan bir amino asit olabilmektedir, ve aksi sIlEllandlEllüîadl'giElsürece, dogal olarak olusan amino asitler ile benzer bir sekil islev görebilen dogal amino asitlerin bilinen analoglarIEl ka psayabilmektedir. disülfit bagEblusturmak için oksitlendigi iki sistein arasIaki bir kovalent etkilesime atiflia bulunmaktadlEl Bir clisülfit bag ortalama bag enerjisi, bir hidrojen baglEliçin 1 ila 2 kcaI/mole klýbsla yaklaslKl 60 kcal/moldür. Bu bulusun kapsamIa, disülfit baglîblusturan sisteinler, tek zincir antikorun çerçeve bölgelerinin içerisindedir ve antikorun konformasyonunu stabilize etmek üzere islev görmektedir. Sistein kallötilârü örnegin, mutajeneze yönlendirilen saha tarafIan getirilebilmektedir, böylelikle disülfidin stabilize edilmesi, molekül içerisinde yapllâbilmektedir.

Burada kullanlglîüzere “rekombinant”, dogal durumlarIda, protein ifade edebilen DNA'nI bir endojen kopyasi sahip olmayan hücreleri kullanarak üretilen bir proteine atfIZl kapsamaktadB Hücreler, rekombinant protein üretmektedir çünkü bunlar, uygun izole nükleik asit sekansII dâhil edilmesiyle genetik olarak degistirilmistir. Terim, ayrlEla, bir heterolog nükleik asidin dâhil edilmesi veya bir dogal nükleik asidin bu hücreye dogal olmayan bir forma degistirilmesi ile modifiye edilmis veya hücrenin, bu sekilde modifiye edilmis bir hücreden kaynaklandfglîbir hücreye veya nükleik aside veya vektöre atfIIkapsamaktadE Dolayßsîla, örnegin rekombinant hücreler, hücrenin dogal (rekombinant olmayan) formu içerisinde bulunmayan genleri ifade etmektedir, dogal form içerisinde bulunan genlerin mutantlarIIZi'fade etmektedir veya sonuçta ifade edilmis veya ifade edilmemis kapsamda, aksi takdirde anormal olarak ifade edilen dogal genleri ifade etmektedir.

Burada kullanIigilîüzere “nükleik asit" veya “nükleik asit sekansE] ya tek ya da çift dizgili formda bir deoksiribonükleotit veya ribonükleotit polimere bir atflîlkapsamaktadß ve aksi sIiEIiandlElBiadgBürece, dogal olarak olusan nükleotitlere benzer bir sekilde nükleik asitlere hibridize eden dogal nükleotitlerin bilinen analoglarlElükapsamaktadlEl Aksi gösterilmedigi sürece belirli bir nükleik asit sekansü bunun tamamlaylEElsekansIElve ayrlîla koruyucu varyantlarIÇlbaska bir deyisle, kodonlarI sarsak konumlarüda bulunan nükleik asitleri, ve bir proteine dönüstürüldügünde bir amino asidin bir koruyucu ikamesine neden olan varyantlarlîl kapsamaktadB Burada kullanligEIüzere, belirtilmis bir nükleik aside göre "kodlama", belirtilmis proteine translasyon için bilgiyi içeren nükleik asitlere atfEkapsamaktadlE Bilgi, kodonlarI kullanIEile belirtilmektedir. Tipik olarak amino asit sekansÇl"evrenseI” genetik kod kullanlßrak nükleik asit tarafIan kodlanmaktadE Ancak, bazElbitki, hayvan veya mantar mitokondrileri, bakteri Makronukleusta bulunan gibi evrensel kodun varyantlarlÇl nükleik asidin, bu organizmalarlEl translasyonal düzeneginde kullanilârak ifade edildigi durumlarIa kullanllâbilmektedir. Bir amino asit için herhangi bir kodon, kodlanmlglproteini degistirmeden aynümino aside yönelik baska bir kodon için ikame edilebilmektedir. Ancak translasyon verimliligi modifiye edilebilmektedir.

Zincirlerini Içeren bir tek zincir proteinine çevirmesi için polipeptitleri kodlayan iki veya daha fazla nükleik asit sekansII bitistirilmesine atlflia bulunmaktadlEl Burada kullanllgiEüzere “ifade edilmis”, bir nükleik asidin bir proteine translasyonuna atfEl kapsamaktadB Proteinler, intrasellüler ifade edilebilmektedir ve kalabilmektedir, hücre yüzeyi membranIlEl bir bileseni olmaktadlüveya ekstrasellüler matrise veya ortama salgllânmaktadü anlasllhiaktadß KonakçEhücreler, E. co/i' gibi prokaryotik hücreler veya maya, böcek, amfibi veya memeli hücreleri gibi ökaryotik hücreler olabilmektedir. rekombinant olarak kaynastlîllân bir yabancüDNA barlEdlmigiElbir bakteriyofaj popülasyonuna atlflia bulunmaktadlEl Faj, kendi yüzeyinden cDNA tarafIan kodlanan yabanclZIproteini görüntülemektedir. Bir bakteriyel konakç., tipik olarak 1:', co//deki replikasyon sonrasIa, ilgili yabanclîtDNA'yEßarlEUEan faj, faj yüzeyinde yabanclîproteinin ifadesi ile seçilmektedir.

Iki nükleik asit veya polipeptit sekansIZlbaglam an “sekans kimligi”, belirtilmis bir karsilâstlüina penceresi üzerinden maksimum uygunluk için hizalandlgilda aynEloIan iki sekanstaki nükleotitlere (veya kallEtliâra) atfIZkapsamaktadIEI Sekans kimligi yüzdesi, proteinlere atiiîiia bulunarak kullan.@lEtla, aynElolan kallükonumlarIlEI, koruyucu amino asit ikameleri dolaylglýla siEliEla farklilâstigllilkabul edilmektedir, burada amino asit kallîitüârlglbenzer kimyasal niteliklere (örnegin, sarj veya hidrofobisite) sahip diger amino asit kaIlEtilârEliçin ikame edilmektedir ve bundan dolayülnolekülün islevsel niteliklerini degistirmemektedir. SekanslarlBl, koruyucu Ikamelerde farklllâstgülurumlarda sekans kimligi yüzdesi, Ikamenin koruyucu dogasEl için düzeltmek amaclEa yukarEldogru ayarlanabilmektedir. Bu ayar. yapllüiaslüb yönelik araçlar, teknikte uzman kisiler taraflian iyi bilinmektedir. Tipik olarak bu, tam bir uyumsuzluktan ziyade klîmi bir uyumsuzluk olarak bir koruyucu ikamenin puanII hesaplanmaslü böylelikle sekans kimligi yüzdesinin arttlîlllfnasllîliçermektedir. DolayElýla, örnegin, ayn Übir amino aside bir 1 puanlîlrerildiginde ve koruyucu olmayan bir ikameye bir sifIEl puanü/erildiginde bir koruyucu ikameye, sElEve 1 arasIa bir puan verilmektedir. Koruyucu ikamelerin puanII hesaplanmasÇlörnegin, PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif., ABD) programlEhan uygulandgiügiibi örnegin, Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4:11- 17 (1988) algoritmas. göre yapilîhaktadlîl Iki peptit sekansII büyük ölçüde benzer olduguna dair bir gösterge, bir peptidin, ikinci peptide karslîüiretilmis antikorlar ile immünolojik olarak reaktif olmas_ Dolaylâlsîla bir peptit, örnegin iki peptidin yalnlîta koruyucu bir ikame ile farklüâstlglüiurumlarda bir ikinci peptide büyük ölçüde benzerdir.

Burada kullan-[gilîüzere bir "karsliâstlîilna penceresi”, iki sekans optimal olarak hizalandilîtan sonra bir sekanleJ, aynEbay- bitisik konumun bir referans sekansEiIe karsüâstülâbildigi yaklasllZ] 10 ila 20 kallIlEl bir segmentine atfElkapsamaktadlB Karsllâstlîilnaya yönelik sekanslarI hizalanma yöntemleri teknikte iyi bilinmektedir. Karsilâstülnaya yönelik sekanslarI optimal hizalanmasü Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)'in lokal homoloji algoritmasEliarafEUan; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)'in homoloji hizalama benzerlik yöntemine yönelik arastlE'masEltarafIan; bu algoritmalarlöl bilgisayarlastlîüönlgl uygulamalarEltarafIdan (bunlarla sIlEHElolmamak kaydlîla, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis., ABD'de Intelligenetics, Mountain View, Calif., GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA ve TFASTA tarafIdan PC/Gene programIia sentezinin en az %50 oranlEtla inhibe edilmesi veya hücrenin öldürülmesi gibi istenilen bir sonucu elde etmek için yeterli terapötik bir ajan. bir dozaj. atfERapsamaktadlEl aktivatörleri veya inhibitörleri, allosterik degistiriciler, antibiyotikler veya bir hastada istenilen bir terapötik etkiyi indüklemek için uygulanan diger ajanlar olarak hareket etmek üzere halihazlElia bilinen veya daha sonra gelistirilecek olan herhangi bir say. bilesigi ka psamaktadE kapsamaktadE “Ex vivo” ve “in vitro” terimi, hücrenin elde edildigi organizmanI vücudunun dlgtir- yönelik atfülapsamaktadlü Mevcut bulusun bir bispesifik T hücresi birlestirme molekülünü kodlayan nükleik asitler izole edildiginde veya klonlandlglIa biri, bakteri, bitki, maya, böcek ve memeli hücreleri gibi rekombinant olarak degistirilmis bir hücrede istenilen proteini ifade edebilmektedir. Teknikte uzman kisilerin, E. 60/1, diger bakteriyel konakçllâr, maya ve COS, CHO, HeLa ve miyeloma hücre hatlarlZlgibi çesitli daha yüksek ökaryotik hücreleri kapsayan proteinlerin ifadesi için mevcut çok sayüla ifade sisteminde bilgili olmalarlîlbeklenmektedir. Prokaryotlardaki veya ökaryotlardaki proteinlerin ifadesi için bilinen çesitli yöntemleri ayrlEtlIJJIlolarak aç[lZlamaya yönelik hiçbir girisim yapllfnayacaktlü Klgcaslglbulusun izole proteinlerini kodlayan dogal veya sentetik nükleik asitlerin ifadesi, tipik olarak, bir ifade kasetine dâhil edilmesinden sonra DNA veya cDNA'nI bir promotöre (ya temel olan ya da indüklenebilir) islevsel bir sekilde baglanmasls-Lla gerçeklestirilecektir. Kasetler, ya prokaryotlar ya da ökaryotlarda replikasyon ve entegrasyon için uygun olabilmektedir. Tipik ifade kasetleri, transkripsiyon ve translasyon sonlandlîlEliârIlZIbaslatmekanslarEi/e proteini kodlayan DNA'nlEl ifadesinin regülasyonu için kullanlglîbromotörleri barIlEinaktadIB Klonlanmlg bir genin yüksek seviyede ifadesini elde etmek amaclýla, minimumda, transkripsiyonu yönlendirmek için güçlü bir promotör, translasyonal baslatlîEliçin bir ribozom baglama sahasEIve bir transkripsiyon/translasyon sonland-Elbarißn ifade kasetlerinin yapllB1asEilstenmektedir. E. co/i' için bu; T7, trp, lac veya Iambda promotörleri gibi bir promotörü, bir ribozom baglama sahasID/e tercihen bir transkripsiyon sonlandüna sinyalini kapsamaktadlEl Ökaryotik hücreler Için kontrol sekanslarü bir promotörü ve tercihen immünoglobülin genleri, SV40, sitomegalovirüs ve bir poliadenilasyon sekansIan kaynaklanan bir gelistiriciyi kapsayabilmektedir, ve donör ve akseptör sekanslarEbirbirine ekleyebilmektedir. Bulusun kasetleri, E. co/i' için kalsiyum klorür dönüstürme veya elektroporasyon ve memeli hücreler için kalsiyum fosfat islemi, elektroporasyon veya lipofeksiyon gibi iyi bilinen yöntemler ile seçilen konakçlZlhücreye aktarüâbilmektedir. Kasetler tarafIian dönüstürülmüs hücreler; amp, gpt, neo ve hyg genleri gibi kasetlerde barEUlElliân genler tarafüdan verilen antibiyotiklere yönelik direnç dolaylîlýla seçilebilmektedir. Ayrlîla, DNA'nlEl, örnegin nanopartiküller veya diger DNA iletim sistemi üzerinde bir aIlEDhastaya iletilebilecegi ve hastanlEl, kendi bispesifik T-hücresi birlestirme moleküllerini in i//i/o üretebilecegi tasarlanmaktadlEl Uzman bir kisi, biyolojik aktivitesini azaltmadan mevcut bulusun bir polipeptidini kodlayan bir nükleik aside (baska bir deyisle, anti-EGFRvIII veya anti-CDB) yönelik modifikasyonlarI yapilâbilecegini kabul edecektir. BazErnodifikasyonIarlEi, hedeflenen molekülün bir kaynasma proteinine klonlanmasIlZiifadesini veya dâhil edilmesini kolaylastlEinak için yapüâbilmektedir.

Bu gibi modifikasyonlar, teknikte uzman kisiler taraflEhan iyi bilinmektedir ve örnegin, bir baslatiîßaha saglamak için amino asit terminusunda eklenen bir metiyonin, veya ya uygun bir sekilde konumlandEilüüSi kElfllama sahalarIElolusturmak için terminus ya da sonlandHna kodonlarEl/eya saflastlüna sekanslarEüzerinde yerlestirilen ilave amino asitleri (örnegin, poli His) kapsamaktadiEi bir kanseröz hücreye maruz kalabilen tümörlere veya tümör hücrelerine atlflia bulunmaktadiEI Rekombinant yöntemlere ek olarak mevcut bulusun bispesifik T hücresi birlestirme molekülleri, ayrlîia, standart peptit sentezi kullanilârak tamamen veya kiîlnen yapiiâbilmektedir. Uzunluk bakIiEUan yaklasiEI 50 amino asitten daha az olan, mevcut bulusun polipeptitlerinin katEfaz sentezi, sekansta kalan amino asitlerin sißllîieklenmesi sonrasIa çözülmez bir destege sekansI C-terminal amino asidinin tutturulmaslîla gerçeklestirilebilmektedir. Katlîliaz sentezine yönelik teknikler, Barany & Merrifield, THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. CILT 2: SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS, KISIM A. s. 3-284; Merrifield, ve ark. J. Am. 2'NCI BASKI., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984) tarafIan açiElanmaktadiEi Daha fazla uzunluktaki proteinler, daha kisa fragmentlerin amino ve karboksil terminuslarII kondensasyonu ile sentezlenebilmektedir. Bir karboksil terminal ucunun aktivasyonu ile (örnegin, kaplin reaktifi N,N'-disikiloheksilkarbodiimidin kullanHâsEl ile) peptit baglarII olusturulmas- yönelik yöntemler teknikte uzman kisiler tarafIan bilinmektedir.

T-hücrelerinin tümör-spesifik antijenlere yeniden yönlendirilmesine ek olarak bispesifik T hücresi birlestirme molekülleri, ayrlîia, diger tanigial veya terapötik bilesiklerin, kendi yüzeylerinde EGFRvIII ifade eden hücrelere taslErnasElçin kullanllâbilmektedir. Dolayiîlýla bir bispesifik T hücresi birlestirme molekülü, örnegin bir baglayEEaraciügilîLIa bir ilaca dogrudan veya dolaylüolarak tutturulabilmektedir, böylelikle EGFRvIII tasiýhn hücrelere dogrudan iletilecektir. Terapötik ajanlar, nükleik asitler, proteinler, peptitler, amino asitler veya türevleri, glikoproteinler, radyoizotoplar, lipitler, karbohidratlar veya rekombinant virüsler gibi bilesikleri kapsamaktadß Nükleik asit terapötik ve tanElal k'larüantisens nükleik asitleri, tek veya çift DNA ila kovalent çapraz baglanmasEiçin türevlendirilmis oligonükleotitleri ve oligonükleotitleri olusturan üçlüleri kapsamaktadE Alternatif olarak, bispesifik T hücresi birlestirme molekülüne baglülnolekül; bir ilaç, bir nükleik asit (örnegin, bir antisens nükleik asit) veya dolas! sistemine dogrudan maruziyetten tercihen korunan baska bir terapötik kEmEgibi bir terapötik bilesimi barIÜn bir lipozom veya misel gibi bir enkapsülasyon sistemi olabilmektedir. Antikorlara tutturulan IipozomlarI halehnmasIEb yönelik araçlar, teknikte uzman kisiler taraflEUan iyi bilinmektedir. BakIlîl (1985).

Bu bulusun bispesifik T hücresi birlestirme molekülleri, özellikle, intravenöz uygulama veya bir vücut kavitesine veya bir organ. Iümenine uygulama gibi parental uygulama için özellikle kullanlglIE Örnegin ovaryan maligniteler, intravenöz uygulama ile veya tümörü çevreleyen dokuya lokalize iletim ile tedavi edilebilmektedir. Beyinde tümörlerin tedavisi için moleküller, örnegin enjeksiyon vasißslîla beyine dogrudan iletilebilmektedir veya moleküller, intravenöz olarak uygulanabilmektedir ve sonrasIa kan beyin bariyerini geçebilmektedir.

Uygulamaya yönelik bilesimler, ortak bir sekilde, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasma, tercihen bir sulu taslsîlîlöh çözünmüs bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerinin bir çözeltisini içerecektir. Örnegin tamponlu tuzlu su ve benzeri gibi bir dizi sulu taslýlîEl kullanliâbilmektedir. Bu çözeltiler sterildir ve genellikle istenmeyen madde bulundurmamaktadlü Bu bilesimler, geleneksel, iyi bilinen sterilizasyon teknikleri ile sterilize edilebilmektedir. Bilesimler, örnegin sodyum asetat, sodyum klorür, potasyum klorür, kalsiyum klorür, sodyum Iaktat ve benzeri gibi pH ayarlama ve tamponlama ajanlarlÇltoksisite ayarlama ajanlarElie benzeri gibi fizyolojik kosullarEi/akIastlElnak için gerekli farmasötik olarak kabul edilebilir yardnclîlmaddeleri barlîidßbilmektedir. Bu formülasyonlarda kaynasma proteinin konsantrasyonu genis çapta degiskenlik gösterebilmektedir, ve seçilen belirli uygulama modu ve hastanI gereksinimlerine göre öncelikle aklgkan hacimleri, viskoziteler, vücut aglEIligilZl/e benzerine baglljblarak seçilecektir.

Dolaylîlîla, intravenöz uygulama için mevcut bulusun tipik bir farmasötik bilesimi, hasta bas. günlük yaklasllîl0.1 ila 10 mg aras-a olacaktlE Günlük hasta baslEa 0.1 ila yaklaslKl 100 mg'lilZl dozajlar, özellikle ilaç bir vücut kavitesi veya bir organ. lümeni gibi dolasIi veya lenf sistemine degil ancak gizli bir sahaya uygulandigilîtakdirde kullanilâbilmektedir. Uygulanabilir bilesimlerin hazlEllanmalea yönelik gerçek yöntemler, teknikte uzman kisiler tarafian bilinmektedir veya asikardlEve REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 19'UNCU BASKI., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995) gibi yayIarda daha ayrlEtHIDoIarak açiEIanmaktadlE Mevcut bulusun bilesimleri, terapötik tedaviler için uygulanabilmektedir. Terapötik uygulamalarda bilesimler, hastaligiEive bunun komplikasyonlarlütedavi etmeye veya en azIan klýnen önlemeye yetecek bir miktarda, bir hastaliEtan muzdarip bir hastaya uygulanmaktadlB Bunun gerçeklestirilmesi için yeterli bir miktar, bir “terapötik olarak etkili doz” olarak tanIilanmaktadE Bu kullanma yönelik etkili miktarlar, hastaligiI siddetine ve hastanI sagligiII genel durumuna bagliîlolacaktß Bilesigin etkili bir miktarÇl bir semptomun (semptomlarlEJ) sübjektif dinmesini veya hekim veya baska nitelikli gözlemci tarafIan belirtildigi üzere objektif bir sekilde tanIilanabiIirIigi saglayan miktardiü Bilesimlerin tek veya çoklu uygulamalarühasta tarafIdan istendigi veya tolere edildigi kadar dozaj ve frekansa baglüilarak uygulanmaktadlE Herhangi bir durumda bilesim, hastanI etkili bir sekilde tedavi edilmesi için bu bulusun proteinlerinin yeterli bir miktarIEisagIamaktadE Tercihen dozaj bir kere uygulanmaktadiîiancak bir terapötik sonuç gerçeklesene kadar veya yan etkiler, terapinin kesilmesini temin edene kadar periyodik olarak uygulanabilmektedir.

Genelde doz, hastaya kabul edilmeyen toksisite üretmeden hastaligil semptomlar.. veya belirtilerinin tedavi edilmesi veya hafifletilmesi için yeterlidir.

Mevcut bulusun farmasötik bilesimlerinin kontrollü saIIIiIEi parental formülasyonlarÇi implantlar, yaglllnjeksiyonlar olarak veya partikülat sistemler olarak yapilâbilmektedir. Protein iletim sistemlerinin genel bir bak@ açlgiîiçin bakIlîJ Banga, A. J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, Pa., (1995), burada atitîlolarak bulunmaktadE Partikülat sistemler, mikrosferleri, mikroparikülleri, mikrokapsülleri, nanokapsülleri, nanosferleri ve nanopartikülleri kapsamaktadlEi Mikrokapsüller, bir merkezi öz olarak terapötik protein barIiEinaktadiEl Mikrosferlerde terapötik, partikül boyunca dagiiIhaktadlE Yaklas[iZi 1 m'den daha küçük partiküller, mikrosferler ve mikrokapsüller, genellikle nanopartiküller, nanosferler ve nankapsüller olarak slîasMa atlfiia bulunulmaktadlü Kapilerler, yalnlîta nanopartiküllerin intravenöz olarak uygulanmasEiçin yaklasiEl 5 m'Iik bir çapa sahiptir. Mikropartiküller, tipik olarak çap bak“dan 100 m'dir ve subkütanöz veya intramüsküler olarak uygulanmaktadE BakIiîJ örnegin, Kreuter, J., COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, J. Kreuter, baskü Marcel CONTROLLED DRUG DELIVERY, A. Kydonieus, basklgi Marcel Dekker, Inc. New York, N.Y., s.

Polimerler, mevcut bulusun farmasötik bilesimlerinin iyon-kontrollü sallEMlîl için kullanüâbilmektedir. Kontrollü ilaç iletiminde çesitli bozunur ve bozunmaz polimerik matrisler kopolimeri, polaksamer 407, bir viskoz olarak ancak düsük lehklllZlarda mobil slîlîlolarak bulunmaktadlEama vücut lelakllg1Ia bir yarÜkatEjleli olusturmaktadlEl Rekombinant interlökin- 2 ve üreazI formülasyonu ve sürekli iletimi için etkili bir vehikül oldugu gösterilmistir baska bir yönde lipozomlar, kontrollü salIIi, ayrlîb lipit ile kapsüle edilmis ilacI ilaç hedeflemesi için kullanllîhaktadlE(Betageri, ve ark., LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing C0., Inc., Lancaster, Pa. (1993)). Terapötik proteinlerin kontrollü iletimi Dokümanlarlîl Mevcut bulusun bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerinin çesitli kullanHIarElarasa, kaynasma proteinin toksik etkisi dolayElýla elimine edilebilen spesifik insan hücreleri tarafli-Man neden olunan bir dizi hastal[lZldurumu kapsanmaktadlEl Bulusun bispesifik T hücresi birlestirme molekülleri için tercih edilen bir uygulama, EGFRvIII ifade eden malign hücrelerinin tedavisidir. Örnekleyici malign hücreler, astrositomas, glioblastomas, melanom ve benzerini ka psamaktadE Burada kullan-[glîlüzere “memeli hücreler”, insanlarÇl sigianlarü fareleri, gine domuzlarIÇl domuzlarüsempanzeleri veya makaklarEkapsayan memelilerden kaynaklanan hücrelere atfEl kapsamaktadEl Hücreler, in vivo veya in vitro kültürlenebilmektedir.

Yukarlâbki açllZJama, genellikle mevcut bulusu açlElamaktadlEl Daha iyi bir anlama, burada yalnlîta örnekleme olarak saglanan ve mevcut bulusun kapsamIEl sIlElhndlEnayEl amaçlamayan asaglîliaki spesifik örneklere atüîlile saglanabilmektedir. ÖRNEKLER MRl-l, murin anti-insan EGFRvIII tek zincirli Fv ve aCD3, murin anti-insan CD3 tek zincirli Fv'den olusan molekül MR1-1XaCD3'ü yaptEEl MR1-1XaCD3, bakteri BL21 (DE3)'te ifade edilmistir ve buradan saflastlülßilstß ve bu çift islevli molekülün aktivitesi, bunun, EGFRvIII- ifade eden hücre hatlarlfib ve ayrlEla insan T hücrelerine spesifik baglanmasIEgösteren FACS tarafIan dogrulanmlStlEl EGFRvIII-ifade eden GBM D54MG.EGFRvIII hücre hatlarEilJzerinden MR1-1XaCD3 sitotoksisitesi, standart sallEll tahlili tarafIdan in vitro ölçülmüstür. MR1- 1XaCD3'ün etkinligi, insan EGFRvIII-ifade eden hücre hatlarII implant edildigi NOD/SCID gamma farelerinde degerlendirilmistir. SonuçlarIilîJ MR1-1XaCD3'ün yaplggl yabani-tip kontrolü üzerinden D54MG. EGFRvIII için spesifik Iiziste bir 8 katlllîl artigi ile yüksek derecede sitotoksik ve antijen-spesifik oldugunu göstermistir. Bir subkütanöz modelinde tümör büyümesi, bir doza baglüsekilde inhibe edilmistir. 100 mcg/fare/gün oranlEUa toplam inhibisyon gerçeklestirildiginde düsük doz, optimizasyon sonrasIa etkili bir sekilde islev görebilmektedir. KEhcasEldeneylerimiz, bir insan EGFRvIII-spesifik T-hücresi birlestirme moleküllerinin, MR1-1XaCD3, EGFRvIII-ifade eden tümör üzerinde etkili oldugunu göstermistir.

EGFRvIII için spesifik bir murin MAb scFv MR1-1'in, kurumumuzdaki bir klinik deneyde olan rekombinant immünotoksinlerin formatIa GBM tedavisi için uygun bir vehikül oldugu gösterilmistir (BB-IND-12,589). Ancak murin-kaynaklljantikorlarl dogal nitelikleri, bunlar. daha genis uygulanmasIEkEflhyan nötrlestirici antikorlarEindükleyebilmektedir. Bundan dolaylIl tamamen insan MAb'ler, klinik deneyler için rekombinant bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerinin yaplîigin daha fazla istenilir olmaktadlE Yüksek afiniteye sahip insan anti-EGFRvIII MAb'Ier ve scFv'Ierin elde edilmesi amaclýla (1) bir elektro-kaynasma teknigi kullanliârak EGFRvIII-spesifik B-hücrelerini HMMA2.5 salgliâmayan miyeloma partnerine kaynastEacaglZl veya (2) bir EGFRvIII-spesifik epitop ile asHânmlglGBM hastalarlEblan dogrudan elde edilen antikor-salgüâyan B-hücresi klonlarIan hazlîllanan DNA kitapllKlarIan degisken agßve hafif zincirleri klonlayacaglZ Bu hastalarda devam eden bir klinik deneyin kapsamlda bir EGFRvIII-spesifik peptit (PEPvIII) ile asllâmanlEl, 43 hastadan 32'sinde EGFRvIII'e spesifik yüksek-titreli antikorlarEindükledigini, bazEhastaIarI >1:2,000,000 titre gelistirdigini gösterdik. Bir ortalama 6 nM (KD)'ye sahip yüksek-aünite EGFRvIII-spesifik antikorlarI üretimi, BIAcore SPR analizi kullanüârak EGFRvIII ECD'nin analiz edilmesi vasltâslîla dogrulanmlgtß Insan B hücrelerinden MAb'Ieri etkili bir sekilde klonlamaya çaligßügtiî.] Preliminer sonuçlarlilîda, PEPvIII ile stimülasyondan sonra bir asüânmg GBM hastasII (ACT 11-18) insan B-hücrelerinden kaynaklanan süpernatan, sonraki günlerde EGFRvIII ile transfekte hücreleri (NR6M) ve yabani-tip EGFRwt transfektanlarü(NR6W) üzerinde pozitif reaktiflik göstermistir. HastalarIiiîdan aIlEhn numuneler ile, B-hücrelerini Epstein-Barr virüsü (EBV) ile dönüstürebildik ve bu hücrelerin, en az 2 haftalllîi uzatiiüilgl periyotlar boyunca peptit stimülasyonunda sonra yüksek-titreli EGFRvIII-spesifik antikorlarElsalgiiâma kabiliyetlerini sürdürdüklerini gösterdik. Pilot çaliSinaIarIilîüa dört hasta numunesinden üçü, basarliIbir sekilde dönüstürülmüstür ve yüksek-titreli ve yüksek-afiniteli antikor üretimi göstermistir.

Bu insan EGFRvIII-spesifik scFv'Iere dayanarak bir rekombinant T hücresi birlestirme molekülünün yapüöîaslîiçin anti-EGFRvIII scFv'Ierini, MRl-lscFv bölümünün ikame edilmesi vaslüslýia, bir MR1-1XCD3 molekülünü olusturmak için önceden kulland[giIi|Zmevut bir kasete alt-klonlayacagiîi Fare anti-insan CD3 scFv, bir hibridoma hattElDKT3'ten klonlanmigtlE(ATCC, CRL 8001). SaflastiEina sonrasIa MR1-1 bispesifik T hücresi birlestirme proteini, 55 kDa'liIZi bir moleküler aglEIiigia sahip olarak SDS-PAGE jelinde gösterilmistir. MR1-1 bispesifik T hücresi birlestirme molekülü, spesifik olarak EGFRvIII'e baglanmaktadEve CD3'e baglanma valeislýla eslik edecek sekilde T hücrelerini birlestirmektedir. EGFRvIII baglama kapasitesi ve spesifitesi, NR6M (EGFRvIII) ve NR6W (EGFRwt) hücre hatlarlîile EGFRvIII (U87MG.AEGFR) ile transfekte bir GBM hücre hattEkullanllârak dogrulanmlgtiEl Benzer sekilde CD3'e baglanma, insan PBMC veya Jurkat hücrelerinden aynElT-hücresi altpopülasyonunda bispesifik T hücresi birlestirme molekülleri ile ya anti-CD4 ya da anti-CD8'in ortak baglanmasllîgösteren, insan periferal kan mononükleeer hücrelerinin (PBMC'ler) ve Jurkat hücrelerinin boyanmasigla dogrulanmlgtiü Bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerini üretmek için insan scFv'Ierin kullanllIhasiÇl nötrlestirici antikorlarI üretimini azaltabilmesine ve tekrarlEl uygulamalara olanak saglayabilmesine ragmen mevcut MR1-1 bispesifik T hücresi birlestirme molekülü de kullanüâbilmektedir.

Tümör hücrelerine karsEipotansiyel allojeneik yanlBbrElen aza indirmek için bu tahlillerde mevcut eslestirilmis insan periferal kan Ienfositlerine (PBL'ler) ve GBM hücre hatlar. ait bankamlZJkullandHZl MR1-1 bispesifik T hücresi birlestirme molekülünün sitotoksisitesi, efektör hücreler olarak stimüle edilmemis PBL'Ierin ve hedef hücreler olarak yabani-tip EGFR ifade eden insan GBM hücre hattEU87MG ve transfekte U87MG-EGFRvIII hücre hattEkullanilârak standart bir krom-saIIIiIEtahlil ile ölçülmüstür. Sonuçlar, MR1-1'in yaplgÇlyabani-tip kontrol, U87MG üzerinden U87MGEGFRVIII için spesifik Iiziste yaklaslKl bir 25 katIlElartlSO/o) ile yüksek derecede sitotoksik ve antijen-spesifik oldugunu göstermistir. Bu sonuçlar, asmadlgllîtakdirde, insan deneylerinde test edilmis ve Hodgkin olmayan Ienfomaya sahip hastalarda potent tümör regresyonunu indükledigi bulunan bir bispesifik yapÇlbscCDleCD34 için baslanglgta in vitro raporlanmlgl bulgularElyansltînaktadIE MR1-1 bispesifik T hücresi birlestirme molekülü taraf-an spesifik Iizis, 18 saatte kontrol ~ %1 ila %2 oranIda kontrol hücrelerine klýbsla MR1-1 bispesifik T hücresi birlestirme molekülünün verimliligi NSG farelerinde degerlendirilmistir. NSG fareleri s.c.'de U87MGEGFRVIII'e karsElMRl-l bispesifik T hücresi birlestirme molekülünün verimliligi degerlendirilmistir. Klîaca U87 MG-EGFRIII hücreleri (%70 ila %80 oranIa konflüans), %0.25 oranIa Tripsin-EDTA ile hasat edilmistir. Hücreler, steril PBS ile 2x defa yllZlanmlgtlü PBL'ler, AIM-V %2 HABS'de bir 1 saatlik inkübasyon sonrasIda sagllElEdJonör PBMC lökaferezlerden yaplSkan olmayan bölüm olarak hasat edilmistir. Üç X105 U87MG-EGFRvIII hücresi, ve grup basi 8 erkek NSG faresinin sag yan. s.c. enjekte edilmistir. 1 ;19, 10 tig, 100 ug'lik son damar enjeksiyonlarÜ/e vehikül kontrolü ile tedavi, tümör hücrelerinin implantasyonundan 1 saat sonra baslatüfhlgtß Tedavi, dört ardlglKl gün boyunca tekrarlanmlgtlü Sonuçlar, MR1- 1xCD3 dolaylîlýla NSG farelerinde subkütanöz U87MG-EGFRVIII tümör büyümesinin inhibisyonunun, 28 günlük gözlem sonraleUa doza bagllîloldugunu göstermistir. Tedavi görmemis tümör düzgün bir sekilde büyümeye devam etmistir. l-pg grubunda 8 tümörden iki palpe edilebilir tümör bulunmustur. 10-ug ile tedavi edilmis grupta bir palpe edilebilir tümör bulunmustur. 100-pg ile tedavi edilmis grupta hiçbir tümör bulunmamlgtlEl MR1-1 bispesifik T hücresi birlestirme molekülünün, U87MG-EGFRVIII'ün tedavisi üzerindeki etkinligi, potensi ve doz baglüglüiakuan çok önemli ve tesvik edici olmustur. ÖRNEKS EBV ile dönüstürülmüs B hücreleri, insan genomuna viral inkorporasyonun yüksek instabilitesi yüzünden multi-klonal anti-EGFRvIII antikorlarII yalnlîta geçici bir rezervuar saglamaktadlü Antikor salgliâyan stabil hatlarEl/apmak için ve bu numunelerden EGFRvIII-spesifik scFv'Ieri klonlanmak için daha önce açlKland[gil:lüzere insan hibridoma teknolojisini ve elektro- kaynasmayükullanacaglZ (13). KEbcasüEBV ile dönüstürülmüs PBMC'Ier, bir CytoPulse Hybrimune Electrofusion Sistemi (Cytopulse) kullanliârak hetermiyelloma hücre hattÜHMMAZ.5 ile kaynastlülâcaktlü Tek hücre klonlarÇlHAT (hipoksantin, aminoprotein ve timidin) seçimi ile taranmlgtlîl ve rekombinant EGFRvIII ECD'ye karsEbüpernatana ait ELISA vasitâslýla veya EGFRvIII ifade hücre hatlari ve B-hücresi isaretçilerinin bir kokteyline karsllklg sitometrisi vasüslýla dogrulanmlgtß Alternatif olarak EGFRvIII ECD üzerinde görüntülenebilen insan immünglobülin genlerini ifade eden bir faj scFv görüntü kitapllglüyapacaglîl ve afinite- maturasyonu daha önce aç[Eland[gll:lüzere gerekli görüldügü üzere yapüâcaktlü Baska bir yaklasIi, açüZIandigEl üzere plazma hücrelerinden antikor degisken bölge (V)-geni repertuarlarIElçEbrmak için yüksek-verimli DNA sekanslamasElve biyoinformatik analiz kullanllârak tarama adIiII baypas edilmesi 0lacaktlE19. Seçilmis EGFRvIII-spesifik MAb-Ifade eden hibridomlarII VH ve VL CDR'leri, izotip-spesifik primerlerin kullan[lî:haslýla güçlendirilecektir ve scFv yapliâcaktlü burada scFv proteini, saflastlElna ve tespit için heksahistidin sekanslarEile karboksi terminusunda etiketlenmistir. scFv'nin ifadesi, üretimi ve karakterizasyonu, bir metal afinite kolonu kullanilârak açUZlandlglEüzere gerçeklestirilecektir. scFv'nin baglanmasüEGFRvIII ifade eden hücreler üzerinde aklglsitometrisi ile dogrulanmlgtE En az bir tamamen insan anti-EGFRvIII MAb izole edilecektir ve bunun scFv'sinin, MR1-1'den daha yüksek bir afiniteye sahip olmasüîieklenmektedir (.

Tam anti-EGFRvIII bispesifik T hücresi birlestirme molekülü insan yapmak için, bir insan scFv fajElgörüntü kitapl[g]Ian tarama aracHJIjilîzla CD3 antijeni ile reaksiyona giren murin MAb OKT3'ün bir insan scFv mimotopunu üretecegiz. Los Alamos National Laboratory'den elde edilen insan scFv fajmid kitapllglEQZl), çok yüksek büyüklüge (7.1 X 1013 pfu/mL) ve çesitlilige (3 x 1011) sahiptir. Seçim sÜsIa biyotinlenmis hedef antijen, CD3 (Sino Biological Inc.), scFv kitapl[g]lîile inkübe edilmistir, ve olusturulan kompleksler, manyetik streptavidin-kaplÜboncuklar üzerine yakalanmaktadE Boncuk + Ag/scFv kompleksi, spesifik olmayan veya düsük-afiniteli baglama fajIEIçilZarmak için yüîlanmaktadEI Boncuk + Ag/scFv kompleksi, hedef antijene baglanan tüm scFv'Ieri geri kazanmak için asit ( ile Islenmektedir. Fare antikorlarII taklitlerini geri kazanmak için boncuk + Ag/scFv kompleksi, baglanma scFv antikorlarII kompetisyon/elüsyonu için karsiIIEJ gelen fare OKT3 IgG ile inkübe edilecektir. En yüksek afiniteye sahip bu scFv antikorlarlElü'uretmek için seçim baletÇB sefer boyunca her bir seferde arttlBlâcaktlEI CD3'ü baglayan scFv'Ier geri kazanlllgtan sonra kompetisyon ELISA, bunlarI fare OKT3'ün gerçek taklitleri olup olmad[glIEbelirlemek için gerçeklestirilecektir ve afinite- maturasyon gerekli görüldügü takdirde yapilâcaktlEl SonrasIa (a) T-Ienfosit proliferasyon tahlilleri, (b) sitokin saIIIi tahlilleri ve (c) aç[Eland[gll1izere FACS tarafIan erken T-hücresi aktivasyon isaretçisinin ifadesinin tespiti gerçeklestirilerek anti-CD3 scFv'nin 7 insan versiyonu OKT3'ünün T-hücresi aktivasyon islevini belirleyecegi222.

Bir (Gly4Ser)3 peptit baglaylEEile VH ve VL fragmentlerini baglayarak bir insan anti-EGFRvIII scFv ve bir insan anti-CD3 scFv yapacaglîl Bir heksahistidin etiketi, tespite ve saflastlElnaya yardIichlmasElçin insan anti-CD3 scFv'nin C-terminusuna eklenmistir. Yeni tamamen anti- EGFRvIII bispesifik T hücresi birlestirme molekülünün ifadesi ve saflastlEIlÜiasÇl önceki protokolümüze göre MR1-1 bispesifik T hücresi birlestirme molekülü için yukari açilîlanan ile MR1-1 bispesifik T hücresi birlestirme molekülü çallgl'nalarlilîüan bu ümit verici preliminer verilere dayanarak, yukarlEIh açlKlanan ile aynEbrotokoIü takip ederek yeni tamamen insan EGFRvIII-hedeflenmis bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerinin sitotoksik aktivitesini degerlendirecegiz. Negatif kontrol deneyleri, bispesifik T hücresi birlestirme molekülü veya efektör hücreler yerine ortam ile gerçeklestirilecektir. Sonraslrîha spesifik Iizis, [(cpm, deneysel saIIIi) - (cpm, spontan saIIIi]/[(cpm, maksimum saIIIi) - (cpm, spontan saIIIi)] olarak hesaplanacaktlü Yeni tamamen insan EGFRvIII bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerinin verimliligi, önceden ve ayri& prelimer çallgmalarda açllZJand[glEü.izere NSG farelerinde degerlendirilecektir.

Programllîl halihazüda, dondurularak korunan eslestirilmis otolog lenfositlere sahip çok say. EGFRvIII-ifade eden insan GBM ksenogrefti ve hücre hattlEb sahiptir. Klglacasübispesifik T hücresi birlestirme molekülü uygulanmasIan önce tümör hücreleri ve Ienfositler, 1:1 oranIda karlgtßlâcaktlîi ve önceden açilZland iglü üzere bir Kopf stereotaktik çerçevesi kullanllârak NSG farelerinin kaudat nükleusunda implant edilmektedir24. NSG fare modeli, CNS'de EGFRvIII ifade eden bir GBM'ye karsD"k0nsept kan[t]EI etkinligi çallglnalarlEJEl saglayacaktlEl Ancak etkinlik deneylerinin baslamasIan önce her bir aday bispesifik T hücresi birlestirme molekülünün maksimum bir tolere edilen dozu (MTD), bu farelerde belirlenecektir. 40 hayvanI her birinin tek tek kohortlar, bir MTD belirlenene kadar bir yarEIog (10) ile arttiBlân gruplar arasIa 0.001 ila 1 pg araleUa dozlar ile bir aday moleküle uygulanacaktlü Önceki çallSh-iaya dayanarak fareler, 5 gün boyunca günlük bispesifik T hücresi birlestirme molekülü dozlarEiIe intravenöz (i.v.) olarak tedavi edilecektedir. MTD'de terapi, bu tümörler ile önceki deneyimimize göre medyan hayatta kalma süresinin yaklasilZl üçte biri geçtikten sonra baslayacaktlîi Tedavi, önceden belirlenmis dozlarda bispesifik T hücresi birlestirme molekül yaplglEllEl i.v. uygulanmaleUan olusacaktlEl Tamamen Insan BiTE TasarIiE139x28F11 olarak belirlenmis bir tamamen insan EGFRvIII- spesifik BiTE'yi kodlayan cDNA'ylîilusturduk. mAbs ve 28F11 (U.S. tamamen insan antikorlardlEl 28F11, murin OKT3 klonu için tamamen insan analog olarak açlKlanmlSIlE ve OKT3'e benzer bu reseptör valeislýla CD3'ü baglamaya ve T hücre aktivasyonunu indüklemeye yönelik kabiliyeti için bu yaklasnda seçilmistir. bir tamamen insan anti-CD3 aktiflestirici mAb'den VH ve VL genlerini alt-klonladlEl Iyi bilinen teknikler vaslüslýla, bir (GIy4Ser)3 peptit baglayiîüile her bir antikorun VH ve VL fragmentlerinin baglanmaslýla insan tek zincirli Fv'lerini yaptiEl Yukari açEEIanan mevcut MR1-1XOKT3 BiTE'yi üretmek için ticari olarak bulunan insan CD3-spesifik mAb OKT3 ve murin anti-EGFRvIII mAb MR1-1 için bu aynÜnanipülasyonlarlîönceden gerçeklestirdik. Bu teknik kullanüârak, nötrlestirici antikorlarI potansiyel üretimini böylelikle azaltan ve mevcut MR1- 1xOKT 3 yap-I tekrarlEüygulamasI olanak saglayan bir tamamen insan BiTE'yi ürettik, murin antikorlarian kaynaklanan BiTE'Ier ile klinik deneylerde önceki basar- verilen bir alternatif olarak klinik olarak daha da arastülâbilmektedir. 139x28F11 yapEEllEl sitotoksisitesi, efektör hücreler olarak stimüle edilmemis periferal kan U87MG.AEGFR kullanliârak standart krom-salIIilEiiahlil ile ölçülecektir.

Preliminer verilerimizi elde etmek için kullandlgllimkesnogreft sistemi, ilgili terapötik molekülü dogrudan klinik çalismalara çevirme potansiyeline sahip, insan tümör dokusunu kullanan bir hayvan sisteminde etkinlik için ilaç adaylarII degerlendirilmesine dair farklElbir avantaja sahiptir. Ancak bu modelin önemli bir engeli, bir endojen immün sisteminin bulunmamaslalü böylelikle molekülümüzün güvenligini ve toksisitesini uygun bir sekilde degerlendirme ve ayrlîla yalnlîta sinjeneik konakçllârda uygun bir sekilde gerçeklestirilebilen çok say. mekanik çallglna gerçeklestirme kabiliyetimizi önemli ölçüde zedelemektedir. Önemli bir sekilde diger T hücresi aktiflestirici antikorlar, esdeger baglama afinitede yüzey moleküllerini isleyen uygun immünokompetan kemirgen modellerin bulunmamasEl/e insanlarda bulunanlara yönelik islevi yüzünden en azIan klýnen, erken klinik deneylerde çevrildiginde öngörülmemis toksisite ile karsilâsmlgtlEIS.

CD3-birlestirme BiTE, EGFRvIIIxCD3'ümüzün klinik öncesi degerlendirmesin insan CD3 transjenik farelerinin kullan Ecblagan degildir. Bu farelerin, önceden, bilinmeyen lokasyonlarda kromozomal olarak entegre edilen insan CD3 transgeninin ~3 kopyaslüla sahip oldugu açlElanmlStlfZ6. Heterozigot oldugunda tgs600± fareleri, hem Insan hem de murin CD3'ü Ifade eden normale yaklEl say. periferal T hücrelerine sahiptir. Dikkate deger bir sekilde t92600± fare susu, T hücresi deplesyonu ve greft hayatta kalmasII klinik öncesi modellerinde anti- insan CD3 immünotoksinlerin islevini test etmek için basarllliIbir sekilde kullanlliîlsIlEU.

Dr. Cox Terhorst'den (Beth Israel Deaconess Medical Center) tgs600± fare susunu embriyolar olarak basarllIEbir sekilde dâhil ettik. Bir tgeGOO± kolonisinin belirlenmesini öneriyoruz, ve hedefler olarak önceden mevcut murin EGFRvIII-ifade eden hücre hatlarIilîElkullanarak öncelikle, standart krom salIIi tahlili vaslüsüla in vitro tümör hücrelerine karsEtgsGOO± farelerinden splenositleri yeniden yönlendirmek için EGFRvIIIxCD3'e yönelik kabiliyeti inceleyecegiz. tgs600± fare modelinde minimum tümörijenik dozlarlZlbelirledikten sonra, immünkompromize ksenogreft sisteminde daha önce gerçeklestirdigimiz deneylerden elde edilen sonuçlari bir dogrulanmaslîile devam edecegiz.

CHO hücrelerinde ifade için insan bispesiük T hücresi birlestirme molekülünü kodlayan nükleik asidi kodon optimize ettik. Insan bispesifik T hücresi birlestirme moleküllerimiz, molekülün EGFRvIII hedefleme bölümü için bir sinyal sekansIEl/e bir VL-VH sßsllîkapsamlgtß Ayrlîla, her bir degisken alan arasIa baglaylEDmolekülleri barilElnlStlB Bu slßya sahip bir molekülün daha etkili oldugunu bulduk. Insan bispesiFik T hücresi birlestirme molekül yap-, protein saflastlîilnaslüolaylastlîilnak için önceden dâhil edilmis bir polihistidin etiketini dâhil etmedir.

Claims (1)

ISTEMLER

1. Bir bispesifik polipeptit olup, asaglâbkileri içermektedir: EGFRvIII'e baglanan, ve amino ila karboksi süsia SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5 ve 6 tarafIan kodlanan segmentleri içeren bir birinci tek zincir insan degisken bölgesi; asag .ki ile seri halindedir T hücresi aktivasyon ligandECD3'e baglanan ve amino ila karboksi sÜsIa SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7 ve 8 tarafIan kodlanan segmentleri içeren bir ikinci tek zincir insan degisken bölgesi; burada birinci ve ikinci tek zincir insan degisken bölgeleri, amino ila karboksi süs-adla Amino ila karboksi slßsia SEKANS KIMLIK NUMARALARI: 5, 6, 10, 7 ve 8 tarafIan kodlanan segmentleri içeren, Istem 1'e göre bispesifik polipeptit. Amino ila karboksi sßsia SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5, 9, 6, 10, 7, 9 ve 8 tarafIan kodlanan segmentleri içeren, Istem 1'e göre bispesifik polipeptit. Amino ila karboksi sÜsIa SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4, 5, 9, 6, 10, 7, 9 ve 8 tarafldan kodlanan segmentleri içeren, Istem 1'e göre bispesifik polipeptit. Istem 1'e göre bispesifik polipeptidi kodlayan bir polinükleotit. SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1'in sekanslügeren, Istem 5'e göre polinükleotit. Bir EGFRvIII-ifade eden tümöre sahip bir hastanI tedavi edilmesinde kullanma yönelik Istem 1'e göre bispesifik polipeptit olup, bu sayede bir sitolitik T hücresinin tümöre yanlEll]1düklenmektedir. Bir ara polipeptit segmentinin, birinci ve ikinci tek zincir degisken bölgeleri baglad[glDIstem 1'e göre bispesifik polipeptit. Ara polipeptit segmentinin, (G4S)n oldugu, n'nin 1 ila 5 arasIa oldugu, Istem 8'e göre bispesifik polipeptit. Bir ara polipeptit segmentinin, birinci tek zincir degisken bölge içerisinde VL ve V.. alanlarIEl bagladlglDIstem 1'e göre bispesifik polipeptit. Bir ara polipeptit segmentinin, ikinci tek zincir degisken bölge içerisinde VH ve VL alanlarIEl bagladlgiÇlIstem 1'e göre bispesifik polipeptit. Ara polipeptit segmentinin, (G4S)n oldugu, n'nin 1 ila 5 aras-a oldugu, Istem 10'a göre bispesifik polipeptit. Ara polipeptit segmentinin, (G4S)n oldugu, n'nin 1 ila 5 arasIa oldugu, Istem 11'e göre bispesiûk polipeptit. Her bir tek zincir degisken bölgenin, VH ve VL alan Brasa bir disülfit bagEiÇerdigi, Istem 1'e göre bispesifik polipeptit. Bir bispesifik polipeptidin yapilmasi yönelik bir yöntem olup, asag-kileri içermektedir: bir kültür ortamIa Istem 5 veya Istem 6'ya göre polinükleotit içeren bir hücrenin kültürlenmesi ve hücrelerden veya kültür ortamlEUan bispesifik polipeptidin toplanmaslZI