TW202021616A - 結合至cd33和cd3的雙特異性抗體構建體之延長投與 - Google Patents
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Abstract
本發明提供了雙特異性抗體構建體,該雙特異性抗體構建體包含特異性結合至靶標(如CD33)的第一結合結構域和特異性結合至效應子(如CD3)的第二結合結構域,用於治療髓性白血病的方法中,其中該構建體係在應用包含至少兩個階梯的階梯式給藥的一個或多個超過14天的治療週期中投與的,在治療週期之後視需要係不投與該構建體的時間段。此外,本發明還提供了治療髓性白血病之方法,該方法包括投與治療有效量的這種雙特異性抗體構建體;並且涉及這種雙特異性抗體構建體用於製備治療髓性白血病的藥物組成物的用途。
Description
本發明係關於雙特異性抗體構建體,該雙特異性抗體構建體包含特異性結合至靶標(如CD33)的第一結合結構域和特異性結合至等效應子(如CD3)的第二結合結構域,較佳的是用於治療髓性白血病的方法中,其中在超過14天的時間段內投與該構建體,之後視需要在至少7天的時間段內不投與該構建體。此外,本發明還是關於治療髓性白血病之方法,該方法包括投與治療有效量的這種雙特異性抗體構建體;並且是關於這種雙特異性抗體構建體用於製備治療髓性白血病的藥物組成物之用途。
雙特異性抗體構建體,如BiTE®
(雙特異性T細胞接合器(engager))抗體構建體,係重組蛋白構建體,由兩個柔性連接的抗體衍生的結合結構域製得。雙特異性抗體構建體的一個結合結構域對靶細胞上的所選腫瘤相關表面抗原具有特異性;第二結合結構域對CD3具有特異性,該CD3係T細胞上的T細胞受體複合物的亞基。藉由其特殊設計,BiTE®
抗體構建體獨特地適合於將T細胞與靶細胞暫態連接,並且同時強有力地激活T細胞對靶細胞的固有細胞溶解潛力。第一代雙特異性抗體構建體(參見WO 99/54440和WO 2005/040220)作為布利妥莫單抗(blinatumomab)和索利托單抗(solitomab)研發用於臨床中。該等雙特異性抗體構建體藉由連續靜脈內輸注來投與。例如,布利妥莫單抗在B急性淋巴細胞性白血病中是以4週輸注的形式來投與,其中在第1週投與較低初始用量,並在第1週期的剩餘治療中和在所有其他週期中從開始起以較高用量投與。在開始第二週期之前,有兩週的無治療時間段。類似的投與方案已經用於索利托單抗,其係以連續靜脈內輸注的形式在至少28天期間投與,其中用量遞增,並且在兩個週期之間也有兩週的無治療時間段。
第一代雙特異性抗體構建體的重要的進一步開發係提供結合至人和普通狨(Callithrix jacchus
)、絨頂檉柳猴(Saguinus oedipus
)或松鼠猴(Saimiri sciureus
)的CD3ε鏈的N末端處的背景獨立表位的雙特異性抗體構建體(WO 2008/119567)。因此,此類雙特異性抗體構建體已經成為解決迄今未滿足的治療需求的萬能手段。
一種這樣的需求係急性髓性白血病(AML),特別是復發性或難治性AML(r/r AML)的有效且安全的療法。患有復發性或難治性AML的患者的預後較差,因為除了在具有特定突變(如IDH1/2突變)的AML的情況下,不存在標準挽救療法。研究型藥劑的大多數試驗開始於r/r AML並且已經積累了眾多具有不同特徵的患者。可以使用結果的歷史背景作為參考用於研發未來的方案和新穎藥劑。對這樣的歷史背景的分析揭示,總體存活和無事件存活係中等的,並且隨著後續挽救而降低。年齡、細胞遺傳學、前驅疾病、新發/療法誘導的AML、首次緩解的持續時間和血小板計數與存活相關。重要的是,在大多數病例中,患者(特別是大多數r/r AML患者)無法實現持續的第二次或後續緩解,也就是疾病的長期改善或甚至治癒。因此,需要其他治療手段及其優化用途。
CD33係被稱為髓系分化抗原的唾液酸依賴性細胞黏附分子,尤其發現於大多數患者的AML母細胞上以及白血病幹細胞上。因此,已經將CD33鑒定為髓性白血病的有前景的標記和此類疾病的治療中的靶分子。為此,美國已經藉由加快審批來批准將Mylotarg®
(吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamcin))用於患有AML的患者,Mylotarg®
係與針對存在於白血病成髓細胞上的CD33抗原的重組單株抗體連接的細胞毒性抗生素。然而,在該藥物未能在驗證性試驗中證實臨床益處,並且在上市後環境中觀察到靜脈閉塞性疾病的風險增加後,製造商主動將該藥物從美國市場暫時撤出。使用吉妥珠單抗奧佐米星觀察到的經常報導的毒性包括嗜中性粒細胞減少症和血小板減少症,並且較不常報導的毒性包括與急性輸注相關反應(過敏反應)、肝毒性和靜脈閉塞性疾病有關的事件。考慮到基於CD33的藥劑可能具有的所述副作用,已經提出將有前景的CD33xCD3雙特異性抗體構建體用於治療AML,其中將一個治療週期內的投與持續時間預先限制為最長14天。因此,應避免嚴重副作用,如嗜中性粒細胞減少症,尤其是粒細胞缺乏症。雖然避免了嚴重副作用已經是引入有效藥劑(如CD33xCD3雙特異性抗體構建體)的主要且重要的成就,但仍然非常希望能同時最佳地利用其治療潛力,以有效並可持續地治療該疾病。因此,本發明的目標係提供CD33xCD3雙特異性抗體構建體的改良投與,其避免副作用,並且同時最佳地利用所述構建體的治療潛力。
在第一方面,本發明涉及一種雙特異性抗體構建體,該雙特異性抗體構建體包含特異性結合至CD33的第一結合結構域和特異性結合至CD3的第二結合結構域,較佳的是用於治療髓性白血病的方法中,其中該雙特異性抗體構建體係在一個或多個治療週期中投與,其中至少一個治療週期包含應用至少兩個劑量階梯以至少三個不同劑量投與該雙特異性抗體構建體超過14天,視需要之後是不投與該雙特異性抗體構建體的時間段,
其中根據如下時間表在該一個或多個治療週期中的至少一個週期中投與雙特異性抗體構建體,該時間表包含以下步驟:
(a) 投與第一劑量的雙特異性抗體構建體,之後
(b) 投與第二劑量的雙特異性抗體構建體,其中所述第二劑量超過所述第一用量,之後
(c) 投與第三劑量的雙特異性抗體構建體,其中所述第三劑量超過所述第二劑量,視需要之後
(d) 投與第四劑量的雙特異性抗體構建體,其中所述視需要的第四用量超過所述第三劑量。
在本發明的一個方面中設想,在一個包括所有步驟(a)至(c)或(d)的治療週期中投與雙特異性抗體構建體的時間為至少15天、較佳的是15至60天、更較佳的是28至56天、較佳的是28天。
在本發明的一個方面中設想,步驟(a)中的第一劑量為至少5 µg/天、較佳的是在5至20 µg/天的範圍內、較佳的是10 µg/天,步驟(b)中的第二劑量為至少30 µg/天、較佳的是在30至240 µg/天的範圍內、較佳的是60或240 µg/天,並且步驟(c)中的第三劑量和步驟(d)中的視需要的第四劑量為至少240 µg/天、較佳的是240至1500 µg/天、更較佳的是在480至960 µg/天的範圍內。
在本發明的一個方面中設想,投與步驟(a)中的第一劑量的時間段為1至4天、較佳的是2或3天,投與步驟(b)中的第二劑量的時間段為2至5天、較佳的是2或3天,並且投與步驟(c)中的第三劑量和步驟(d)中的視需要的第四劑量的時間段總計為7至52天、較佳的是14至23或52天、更較佳的是22、23或52天。
在本發明的一個方面中設想,髓性白血病的治療包含兩個或更多個治療週期,較佳的是兩個、三個、四個、五個、六個或七個治療週期,其中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個治療週期包含超過14天的雙特異性抗體構建體投與。
在本發明的一個方面中設想,在該至少一個治療週期之後是不投與雙特異性抗體構建體的時間段,較佳的是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天不進行治療。
在本發明的一個方面中設想,在至少一個治療週期之後不是不投與該構建體的時間段。
在本發明的一個方面中設想,僅第一治療週期包含根據步驟(a)投與,而之後的週期以根據步驟(b)的劑量開始。
在本發明的一個方面中設想,雙特異性抗體構建體的第一結合結構域係單鏈雙特異性抗體構建體。
在本發明的一個方面中設想,雙特異性抗體構建體的第一結合結構域包含六個CDR的群組,這六個CDR選自由以下組成之群組:SEQ ID NO: 10至12和14至16、SEQ ID NO: 22至24和26至28、SEQ ID NO: 34至36和38至40、SEQ ID NO: 46至48和50至52、SEQ ID NO: 58至60和62至64、SEQ ID NO: 70至72和74至76、SEQ ID NO: 82至84和86至88、SEQ ID NO: 94至96和98至100,較佳的是SEQ ID NO: 94至96和98至100。
在本發明的一個方面中設想,雙特異性抗體構建體的第二結合結構域包含六個CDR的群組,這六個CDR選自由以下組成之群組:SEQ ID NO: 148-153、SEQ ID NO: 154-159、SEQ ID NO: 160-165、SEQ ID NO: 166-171、SEQ ID NO: 172-177、SEQ ID NO: 178-183、SEQ ID NO: 184-189、SEQ ID NO: 190-195、SEQ ID NO: 196-201和SEQ ID NO: 202-207,較佳的是SEQ ID NO: 202-207。
在本發明的一個方面中設想,該雙特異性抗體構建體係單鏈構建體,該單鏈構建體包含選自以下群組的胺基酸序列,該群組由以下組成:SEQ ID NO: 18、19、20、30、31、32、42、43、44、54、55、56、66、67、68、78、79、80、90、91、92、102、103、104、105、106、107和108,較佳的是選自由以下組成之群組:SEQ ID NO: 104、105、106、107和108,更較佳的是SEQ ID NO: 104。
在本發明的一個方面中設想,雙特異性抗體構建體係與以下組合投與:PD-1抑制劑,PDL-1抑制劑,和/或一種或多種選自由以下組成之群組的表觀遺傳因子:組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、DNA甲基轉移酶(DNMT)I抑制劑、羥基脲、顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)、組蛋白去甲基酶抑制劑和ATRA(全反式視黃酸),並且其中:
(a) PD-1抑制劑、PDL-1抑制劑和/或一種或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性抗體構建體之前投與;
(b) PD-1抑制劑、PDL-1抑制劑和/或一種或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性抗體構建體之後投與;或
(c) PD-1抑制劑、PDL-1抑制劑和/或一種或多種表觀遺傳因子和雙特異性抗體構建體係同時投與。
在本發明的一個方面中設想,該PD-1抑制劑、PDL-1抑制劑和/或一種或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性抗體構建體之前投與,較佳的是在投與雙特異性抗體構建體之前1、2、3、4、5、6或7天投與。
在本發明的一個方面中設想,該表觀遺傳因子係羥基脲。
在本發明的一個方面中設想,該髓性白血病選自由以下組成之群組:急性骨髓母細胞性白血病較佳的是復發性或難治性急性髓性白血病、慢性嗜中性球白血病、髓性樹突狀細胞白血病、加速期慢性骨髓性白血病、急性骨髓性單核球白血病、幼年型骨髓性單核球白血病、慢性骨髓性單核球白血病、急性嗜鹼球白血病、急性嗜酸球白血病、慢性嗜酸球白血病、急性巨核母細胞白血病、原發性血小板增多症、急性紅系白血病、真性紅血球增多症(polycythemia vera)、脊髓發育不良綜合症、急性全骨髓性白血病、髓樣肉瘤和混合表型急性白血病。
在本發明的另一個方面中設想,提供了治療有需要的患者的髓性白血病之方法,該方法包括在一個或多個治療週期中投與治療有效量的包含特異性結合至CD33的第一結合結構域和特異性結合至CD3的第二結合結構域的雙特異性抗體構建體,其中該至少一個治療週期包含應用至少兩個劑量階梯以至少三個不同劑量投與該雙特異性抗體構建體超過14天,
其中根據如下時間表在一個治療週期中投與雙特異性抗體構建體,該時間表包含以下步驟:
(a) 投與第一劑量的雙特異性抗體構建體,之後
(b) 投與第二劑量的雙特異性抗體構建體,其中所述第二劑量超過所述第一劑量,之後
(c) 投與第三劑量的雙特異性抗體構建體,其中所述第三劑量超過所述第二劑量,視需要之後
(d) 投與第四劑量的雙特異性抗體構建體,其中所述視需要的第四劑量超過所述第三劑量,視需要之後是不投與構建體的時間段。
在本發明的另一個方面中設想,在一個治療週期中投與雙特異性抗體構建體的時間係至少15天、較佳的是15至60天、更較佳的是28至56天、更較佳的是28天。
在本發明的另一個方面中設想,步驟(a)中的第一劑量為至少5 µg/天、較佳的是在5至20 µg/天的範圍內、更較佳的是10 µg/天,步驟(b)中的第二劑量為至少30 µg/天、較佳的是在30至240 µg/天的範圍內、較佳的是60或240 µg/天,並且步驟(c)中的第三劑量和視需要的步驟(d)中的視需要的第四劑量為至少240 µg/天、較佳的是在120至1500 µg/天的範圍內、較佳的是240至960 µg/天、更較佳的是480至960 µg/天。
在本發明的另一個方面中設想,投與步驟(a)中的第一劑量的時間段為1至4天、較佳的是2或3天,投與步驟(b)中的第二劑量的時間段為2至5天、較佳的是2或3天,並且投與步驟(c)和視需要的步驟(d)中的第三用量和視需要的第四用量的時間段分別為7至52天、較佳的是14至23天、更較佳的是22、23、50或52天。
在本發明的另一個方面中設想,髓性白血病的治療包含兩個或更多個治療週期,較佳的是2、3、4、5、6或7個治療週期,其中至少1、2、3、4、5、6或7個治療週期各自包含超過14天的雙特異性抗體構建體投與。
在本發明的另一個方面中設想,在治療之後是不投與雙特異性抗體構建體的時間段,較佳的是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天不進行治療。
在本發明的另一個方面中設想,在治療之後是至少14天不投與雙特異性抗體構建體的時間段。
在本發明的另一個方面中設想,僅第一治療週期包含根據步驟(a)投與,而之後的週期以根據步驟(b)的用量開始。
在本發明的另一個方面中設想,構建體係單鏈雙特異性抗體構建體。
在急性淋巴細胞性白血病(ALL)的治療中藉由以下方式給予具有上市許可的雙特異性抗體構建體布利妥莫單抗(Blinatumomab):連續靜脈內輸注4週(第一週5 μg/m²/天,之後15 μg/m²/天),之後兩週無治療(即,一個週期),持續長達五個週期。如此,治療消除CD19+
細胞的區室,該區室係受限於B細胞譜系的區室。
在測試CD33特異性BiTE®
的動物研究中,與所提出的這種分子的作用模式一致,觀察到短暫的骨髓抑制,包括循環嗜中性白血球、血小板和紅血球團的減少。與所提出的作用模式一致,白血球的減少以及激活的動物研究中的預期增加導致短暫的骨髓抑制,包括循環嗜中性白血球、血小板和紅血球團的減少。在所有用量組中都觀察到白血球的減少以及激活的T淋巴細胞的預期增加和細胞介素水平的升高。發熱性嗜中性粒細胞減少症和嗜中性粒細胞減少症係在患有血液學惡性腫瘤的患者中以及在組合化學療法之前觀察到的常見事件。
出血症係AML治療的常見並且可能嚴重的併發症,最常繼發於血小板減少症。特別重要的出血症併發症包括彌漫性血管內凝血(DIC)綜合症,其係由於血液凝固的大規模血管內激活以及凝血因子和血小板的消耗所致,導致嚴重出血。在患有AML的成年患者中,在住院當天觀察到1%的致命出血症,都是在白血球極度過多症或急性前骨髓性細胞白血病(APL)存在下發生。患有AML的患者的近期數據顯示9.9%的出血性死亡率。此外,在這個AML患者群中,在全血細胞減少患者的未消退感染與最終出血之間可能存在強相關性。
同樣被廣為接受的是,免疫受損患者易患常見的社區獲得性和機會性兩種感染。感染係癌症患者發病和死亡的主要原因,並且雖然某些癌症本質上與免疫受損相關,但是感染風險主要與細胞毒性和免疫抑制性療法的強度和持續時間有關。
然而,在急性髓性白血病中,情況與急性淋巴細胞性白血病相比係不同的。髓樣區室包括較寬的存活所需細胞譜系譜。因此,不可能將ALL中布利妥莫單抗的投與方案簡單地轉移至使用AML特異性雙特異性抗體構建體治療AML。對於使用CD33+
細胞清除治療方法有效治療AML,治療需要足夠長以有效,並且足夠短以使對髓樣區室中那些存活必需的(例如,考慮到維持免疫能力以抵抗機會性感染)細胞類型的毒性降至最低。此外,實現功效還需要足夠劑量。
這個問題係藉由例如提供雙特異性抗體構建體來解決的,該雙特異性抗體構建體包含特異性結合至CD33的第一結合結構域和特異性結合至CD3的第二結合結構域(CD33/CD3),較佳的是用於治療髓性白血病的方法中,其中雙特異性抗體構建體係在一個或多個治療週期中來投與,其中一個治療週期包含應用至少兩個劑量階梯以至少三個不同劑量投與雙特異性抗體構建體超過14天,視需要之後是不投與構建體的時間段。
使用與本發明一致的投與時間表,以至少三個漸增的劑量水平應用至少兩倍階梯式給藥,可能在超過14天的CD33/CD3雙特異性抗體構建體(例如,SEQ ID NO: 104)投與期期間有效消除髓性白血病細胞,同時仍允許患者在治療週期之間的不投與構建體的時間段中恢復髓樣區室。採用至少240 µg的靶劑量(即,治療週期內最後一階梯的最大劑量)較佳的是使得能完全緩解如本文所示的疾病。同時,根據本發明的階梯式給藥較佳的是顯著降低嚴重免疫副作用(如細胞介素釋放綜合症或其症狀)的風險,但對靶用量的暴露要長於先前預期可耐受的暴露。藉由根據本發明應用階梯式給藥,即應用產生至少三個漸增的劑量的至少兩個劑量階梯,可使患者暴露於靶劑量持續延長的時間段,如最長52天。所述最長時間段得自分別持續兩天的第一和第二階梯、以及剩餘第一治療週期的持續24天的第三階梯和下一(第二)治療週期的另外28天的靶劑量,該下一(第二)治療週期僅包含第三劑量而沒有先前的階梯式給藥。因此,治療週期之間的至少一個無治療時間段可以是非必要的(即,在不間斷地投與根據本發明的雙特異性抗體構建體時)。因此,在第一所關注治療週期的靶劑量之後不間斷地立即投與下一(即,第二)所關注治療週期的相同靶劑量。因此,患者對靶劑量的暴露發生顯著擴展以實現根除AML母細胞及白血病幹細胞的治療目標,作為在受影響和如此治療的患者中的長期治療效果和最終根除AML疾病的先決條件。因此,根據本發明的方法提供了平衡對較佳的長期治療效果(即,有效根除造血和髓性白血病幹細胞)和避免或減弱嚴重的和可能終止治療的副作用(如CRS)的需求的方法。具體而言,較佳的是可以避免最高級5級(如本領域中一般所定義)的CRS事件,並且較高級3級和4級的CRS事件的發生率顯著降低,即分別地,3級典型地在至多10%的所治療患者中發生,並且4級典型地在至多5%的所治療患者中發生。
在本發明的背景下,如果兩個治療週期不被無治療時間段隔開,則在一個治療週期中患者對雙特異性抗體構建體的暴露的持續時間長於14天並且可以長達60天。典型地,在每個包括至少兩個、較佳的是三個劑量階梯的治療週期之後是無治療時間段,以允許患者恢復。然而,在需要延長靶劑量暴露以解決除了AML母細胞外還有白血病幹細胞時,藉由取消無治療時間段將兩個治療週期彼此連接。然而,較佳的是不超過兩個治療週期在彼此之間沒有無治療時間段以允許患者充分恢復,但仍延長靶劑量暴露時間。
在所述兩個治療週期相連時,在前一個治療週期後的後一個治療週期的特徵在於,僅具有一個劑量並且沒有階梯式給藥。這由以下事實來促進:前一治療週期的階梯式給藥降低副作用(如CRS(尤其是較高級3級和4級以及最高級5級))的風險,還降低之後立即進行的治療週期(即,兩個相連週期之間沒有無治療時間段)的風險,因為在前一治療週期後的治療週期受益於前一治療週期所應用的階梯式給藥。因此,可以完全避免最高級的副作用CRS,並且較高級3級和4級減弱至少見的個位數發生率。可以在大多數所治療患者中避免治療間斷,並確保連續有效用量投與以治療患有高進展性r/r AML的高級患者。
因此,在本發明的背景下,至少一個治療週期必須滿足如本文所述的特定階梯式給藥的需求。在僅應用一個治療週期的情況下,所述一個治療週期包含階梯式給藥。在應用兩個不被無治療時間段隔開的治療週期的情況下,則僅兩個治療週期中的第一個就足以滿足如本文所述的特定的至少三個階梯的特定階梯式給藥的需求。
如本文所提及的暴露時間段典型地是指對在一個治療週期期間應用的所有至少三個不同劑量的總暴露。對靶用量的典型暴露較短,即在達到治療週期內的第三或視需要的第四最大(靶)劑量之前,縮短第一和第二(以及視需要第三)劑量的持續時間。這種靶劑量暴露可持續例如56、55、54、53、52、51、50、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15或14天,這同時允許充分利用根據本發明的CD33xCD3雙特異性抗體構建體(例如,SEQ ID NO: 104)的抗腫瘤功效。因此,本發明劑量方案藉由使用如本文所述的階梯式給藥,允許延長的所治療患者對靶用量的暴露,同時使藥物投與的初始階段期間的副作用(如細胞介素釋放綜合症及其症狀)最小化。同時,由如本文所述的投與時間表或劑量方案限制的優越功效較佳的是證實為所治療患者中腫瘤負荷的顯著降低,更較佳的是分別在一個治療週期或多個治療週期後的部分或甚至完全緩解或甚至重複完全緩解。
具有臨床上證實的疾病(AML)完全緩解的根據本發明的典型治療週期包括投與CD33xCD3雙特異性抗體構建體(例如,SEQ ID NO: 104):連續2或3天的10 µg/天的第一劑量,之後立即係60 µg/天的第二劑量持續2、3或4天,之後立即係240 µg/天的第三劑量持續21、22或23天,其中總治療週期持續時間為28天。可替代地,較佳的治療週期包含連續兩天或三天的10 µg/天的第一劑量,之後立即係60 µg/天的第二劑量持續2、3或4天,之後立即係480 µg/天的第三劑量持續21、22或23天,其中總治療週期持續時間為28天。可替代地,較佳的治療週期包含連續兩天或三天的10 µg/天的第一劑量,之後立即係60 µg/天的第二劑量持續2、3或4天,之後立即係600 µg/天的第三劑量持續21、22或23天,其中總治療週期持續時間為28天。可替代地,較佳的治療週期包含連續兩天或三天的10 µg/天的第一劑量,之後立即係60、120或240 µg/天的第二劑量持續2、3或4天,之後立即係720 µg/天的第三劑量持續21、22或23天,其中總治療週期持續時間為28天。可替代地,較佳的治療週期包含連續兩天或三天的10 µg/天的第一劑量,之後立即係60、120或240 µg/天的第二劑量持續2、3或4天,之後立即係840 µg/天的第三劑量持續21、22或23天,其中總治療週期持續時間為28天。可替代地,較佳的治療週期包含連續兩天或三天的10 µg/天的第一劑量,之後立即係60或120 µg/天的第二劑量和120或240 µg/天的第三劑量持續總計2天,之後立即係840 µg/天的第四劑量持續21、22或23天,其中總治療週期持續時間為28天。可替代地,較佳的治療週期包括連續兩天或三天的10 µg/天的第一劑量,之後立即係60或120 µg/天的第二劑量和120或240 µg/天的第三劑量持續總計2天,之後立即係960 µg/天的第四劑量持續21、22或23天,其中總治療週期持續時間為28天。為了更好地說明,此類治療週期也顯示於圖5中。
在本發明的背景下值得注意的發現係,240 µg/天的靶劑量已經可以導致MRD+之AML疾病,但較佳為MRD-,的完全緩解。如本文所述的較高靶劑量確實甚至更加定量地根除除了AML母細胞外還有白血病幹細胞並且可能降低復發風險,並且由此為患者提供較長的無疾病狀態,從而提高患者的生活品質。
較佳的是,在本發明的背景下,劑量限制性毒性(DLT)窗口可以縮短至4週的標準(其中至少14天投與靶用量),允許監測CRS的發作及其消退、有效受試者內增加和總體患者安全性。
如本領域中已知的,CD33在髓系細胞(包含普通髓系祖細胞、成髓細胞、單核細胞)表面上的表現已經藉由流動式細胞術描述於文獻中。此外,CD33在巨噬細胞表面上的表現已經藉由免疫組織化學來證實。髓樣區室中的那些CD33+
細胞群在使用本文所述雙特異性抗體構建體對患者的治療下被消除。由於那些細胞群中的一些本身是髓樣區室中的其他細胞群的祖細胞的事實,普通髓系祖細胞下游所有細胞類型的造血作用都受到影響,從而導致骨髓抑制。作為進一步的行動方法,本發明之CD33雙特異性抗體構建體亦可消除在局部微環境中對免疫抑制有貢獻之骨髓抑制源(即,MDSC)。
對於髓性白血病的成功治療,需要患者對本文所述雙特異性抗體構建體的大量暴露(即,某一暴露長度)以誘導T細胞激活/增殖和那些T細胞的細胞毒性活性。然而,基於上述觀察結果,雙特異性抗體構建體持續的投與期越長,預期的全血細胞減少症越長。考慮到這一點,本發明潛在問題的解決方案係用中止治療期平衡雙特異性抗體構建體的暴露長度與用量從而使得能有效清除白血病細胞,在這個中止治療期期間,允許患者的髓樣區室恢復。這藉由上述投與方案來反映。
無投與時間段用作髓樣區室的恢復期以重建例如對防禦細菌感染重要的髓系細胞。所需最短的無投與時間段的長度典型地取決於殘留腫瘤負荷。例如,對於已經顯示部分反應的患者,該時間段可以短至7天或更短,如1、2、3、4、5或6天,較佳的是7天,而那些具有較高殘留腫瘤負荷和對髓樣區室的更多損傷的患者典型地需要更長時間段以重建髓系細胞,典型地至少8、9、10、11、12、13或14天,較佳的是14天。通常,設想使患者對靶用量的暴露最大化,並且同時盡可能多地限制包括無治療恢復期的單一治療週期的持續時間,以允許用於經常處於危險狀態中並且典型地需要快速功效的患者的治療週期的總體快速序列。
在本發明的一個特定實施方式中,包含超過14天的投與時間的第一治療週期提供較長的患者對靶用量的暴露,並且因此將腫瘤負荷減小至使得後續治療週期可能不需要超過14天的投與時間的水平。在這種情況下,在第一治療週期後的治療週期可以持續至多14天,這藉由一個週期內的較長治療:恢復時間比降低副作用風險,前提係已經達到足夠效率。可替代地,第二、第三、第四或任何後續治療週期可以持續超過14天,之後是一個或多個長度至多14天的治療週期。同樣,超過14天投與的治療週期可以與至多14天投與的治療週期交替進行,以平衡功效與副作用的減輕。
如本文所述的本發明的特殊成就是提供不浪費時間以達到有效用量來靶向癌細胞並且同時降低觸發嚴重副作用(如CRS)的風險的劑量方案。浪費時間將不利於患有嚴重且侵襲性的進行性疾病的所治療患者。另一方面,由於過快階梯式給藥觸發副作用(如CRS)可能導致由於過高毒性而間斷或放棄治療。藉由根據本發明的方法減輕兩種缺點。再者,藉由加入第四階梯,劑量間的間隔乃被減少,從而CRS之可能性亦減少。因此,在本發明的背景下,當施用高靶劑量(如每日至少480、720或960 µg),一包含四階梯(如每日30-240-600-900µg)之階梯式給藥將比包含三階梯(如每日30-240-900µg)更好,即便其進行時間相同,這是由於前一階梯與靶劑量間之差距較小。
根據本發明的方法避免或減弱嚴重副作用,如CRS。具體而言,較佳的是可以避免最高級5級(如本領域中一般所定義)的CRS事件,並且較高級3級和4級的CRS事件的發生率顯著降低,即分別地,3級典型地在至多10%的進行如本文所述方法的所治療患者中發生,並且4級典型地在至多5%的所治療患者中發生。
如熟悉該項技術者所瞭解,在每次復發後,新的完全緩解越來越難以實現。考慮到經歷藉由雙特異性抗體構建體進行的當前所述療法的患者典型地已經經歷標準化學療法並且可能已經經歷緩解和復發的事實,需要藉由根據本發明的方法賦予顯著活性。因此,延長的對高劑量雙特異性抗體構建體(例如,SEQ ID NO 104)的暴露如本文所述係較佳的。這典型地需要階梯式給藥,其包含三個給藥階梯,意味著4個不同並且遞增的劑量,即第一、第二、第三和第四用量。因此,這種較佳的治療週期包含連續兩天或三天的10 µg/天的第一劑量,之後立即係60或120 µg/天的第二劑量和120或240 µg/天的第三劑量持續總計2天,之後立即係840 µg/天的第四劑量持續21、22或23天,其中總治療週期持續時間為28天。可替代地,較佳的治療週期包含連續兩天或三天的10 µg/天的第一劑量,之後立即係60或120 µg/天的第二劑量和120或240 µg/天的第三劑量持續總計2天,之後立即係960 µg/天的第四劑量持續21、22或23天,其中總治療週期持續時間為28天。在組合兩個治療週期並且在每個治療週期後沒有間歇式的無投與時間段時,第四有效劑量的施用具有長達52天的持續時間。例如,考慮到此類參數,延長的對高劑量雙特異性抗體構建體(例如,SEQ ID NO 104)的暴露如本文所述係較佳的。
在活性化合物(例如雙特異性化合物)的血清水平下降至低於所定義的閾值時,認為已達到投與時間段的終點。這個閾值的實例係低於EC90
值、較佳的是低於EC50
值、更較佳的是低於EC10
值的血清水平。此類EC值可以在細胞毒性測定中使用CD33+
靶細胞和人PBL作為效應細胞根據該等測定來定義。
在雙特異性單鏈抗體構建體(如在本發明背景下較佳的CD33xCD3雙特異性抗體構建體(參見SEQ ID NO: 104),已知其具有短血清半衰期,CD33XCD3雙特異性抗體構建體在小鼠中的半衰期為6.5至8.7 h,而CD33XCD3雙特異性抗體構建體在人類中的預測半衰期為約2小時)的情況下,血清水平會在停止連續靜脈內投與後短時間內(即,幾乎在投與階段結束後立即)下降至低於上述閾值。
用於確定適合於本發明的雙特異性抗體構建體的特定ECx
值的測定描述於下文的實例中。
術語「用量(dose)」在本文中理解為本文所述藥劑(即,雙特異性抗體構建體)的測量量,典型地以質量單位(如微克[µg])來表示。
術語「劑量(dosage)」在本文中理解為施用一定用量的本文所述藥劑(即,雙特異性抗體構建體)的速率,典型地以質量/時間的單位(如微克/天[µg/d])來表示。在本發明的背景下,施用係靜脈內輸注,較佳的是連續靜脈內輸注(CIV)。其中,投與(即提交治療性雙特異性抗體構建體)在所提供的投與時間段期間不間斷。
術語「治療週期」在本文中理解為治療時間段,其包含待應用的產生至少三個劑量的至少兩個劑量階梯,其中劑量按其序列順序遞增。一個治療週期內的所述劑量較佳的是不被在應用如本文所述的階梯式給藥的一個治療週期內投與的不同劑量之間的任何無治療時間段間斷。相反,關於所治療患者的連續輸注持續進行,較佳的是在整個治療週期長度期間不間斷。在競爭後,在所述治療週期之後可典型地是休息時間段(無投與時間段,即無治療),並且按規律的時間表重複治療期與無治療期的組合。例如,給予4週治療和之後的2週休息係一個治療週期。在按照規律的時間表將這個週期重複多次時,其構成治療過程。
術語「階梯式給藥(step dosing)」在本文中理解為較佳的是在一個治療週期內施用一系列漸增的劑量,以避免治療相關的副作用,如CRS。
術語「劑量階梯(dosage step)」在本文中理解為從一個劑量向另一個劑量的變化。因此,如果階梯式給藥提供三個不同劑量,那麼必須應用兩個劑量階梯,即分別是從第一劑量變為第二劑量的階梯、和從第二劑量變為第三劑量的階梯。
在本發明的背景下,緩解被理解為疾病AML的體征和症狀的減少或消失。該術語也可用於指發生此減少的時間段。在本文中,可以將緩解視為部分緩解或完全緩解。例如,可以將AML的部分緩解定義為AML的可測量參數減少50%或更多,如例如可在身體檢查、放射性研究中或藉由來自血液或尿液測試的生物標記水平所發現。
在本發明的背景下,完全緩解典型地是疾病的表現完全消失。雖然可能復發(即疾病再現),但是可以將處於完全緩解狀態的患者視為已經治癒或恢復。
在本發明的背景下,無數字的完全緩解(CR)典型地意味著第一CR,例如剛診斷患有AML的患者在一個或多個週期中(即,在接受根據本發明的雙特異性抗體構建體之前)接受化學療法,並且發生緩解,這就是第一CR(通常僅稱為CR),然後復發,接受某種其他療法並且再次發生緩解,現在這係第二完全緩解(CR2),等等。
術語「群組(cohort)」在本發明的背景下被理解為一組患者,其共用明確特徵,即其經歷相同的治療週期,該等治療週期的特徵在於相同的階梯式給藥、劑量和施用持續時間。
術語「有效劑量」係靶用量,在這個用量下有效殺死AML母細胞及白血病幹細胞。這個用量典型地是一個治療週期的最高並且較佳的是最後一個劑量。
術語「雙特異性抗體構建體」係指具有適合於特異性結合兩種單獨的靶結構的結構的分子。在本發明的背景下,此類雙特異性抗體構建體特異性結合至靶標(較佳的是靶細胞的細胞表面上的CD33)和效應子(較佳的是T細胞的細胞表面上的CD3)。然而,如本文所述的較佳的投與(即,階梯式給藥以減輕副作用(如細胞介素釋放綜合症)和延長的暴露以使功效最大化)也適用於靶向並非CD33的另一種靶標(除T細胞的細胞表面上的CD3之外)的其他雙特異性抗體構建體。在雙特異性抗體構建體的一個較佳的實施方式中,雙特異性抗體構建體的至少一個(更較佳的是兩個)結合結構域係基於抗體的結構和/或功能。可以將此類構建體命名為與本發明一致的「雙特異性抗體構建體」。
術語「抗體構建體」係指其中結構和/或功能係基於抗體(例如,全長或完整免疫球蛋白分子)的結構和/或功能的分子。因此,抗體構建體能夠結合至其特異性靶標或抗原和/或從抗體或其片段的可變重鏈(VH)和/或可變輕鏈(VL)結構域提取。此外,根據本發明與其結合配偶體結合的結構域在本文中被理解為根據本發明的抗體構建體的結合結構域。典型地,根據本發明的結合結構域包含允許靶標結合的抗體的最低結構要求。這種最小要求可以例如藉由至少三個輕鏈CDR(即VL區的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三個重鏈CDR(即VH區的CDR1、CDR2和CDR3)、較佳的是全部六個CDR的存在來定義。定義抗體的最低結構要求的替代方法係分別定義特異性靶標的結構內的抗體表位、構成表位區(表位簇)的靶蛋白的蛋白結構域或參考與所定義抗體的表位競爭的特定抗體。根據本發明的構建體所基於的抗體包括例如單株抗體、重組抗體、嵌合抗體、去免疫抗體、人源化抗體和人抗體。
根據本發明的抗體構建體的結合結構域可以例如包含上文提及的CDR組。較佳的是,那些CDR包含於抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)的框架中;然而,其不一定包含二者。例如,Fd片段具有兩個VH區並且通常保留完整抗原結合結構域的一些抗原結合功能。抗體片段、抗體變體或結合結構域的形式的其他實例包括(1) Fab片段,其為具有VL、VH、CL和CH1結構域的單價片段;(2) F(ab')2
片段,其為具有藉由鉸鏈區的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段;(3) Fd片段,其具有兩個VH和CH1結構域;(4) Fv片段,其具有抗體單臂的VL和VH結構域;(5) dAb片段(Ward等人, (1989) Nature [自然] 341 :544-546),其具有VH結構域;(6) 分離的互補決定區(CDR);和(7) 單鏈Fv(scFv),後者係較佳的(例如,源自scFV文庫)。根據本發明的抗體構建體的實施方式的實例例如描述於WO 00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、W O2014/144722、WO 2014/151910和WO 2015/048272中。
此外,術語「抗體構建體」的定義包括單價、二價和多價(polyvalent/multivalent)構建體,並且由此包括特異性結合至僅一個抗原性結構的單特異性構建體、以及藉由獨特的結合結構域特異性結合多於一個(例如,兩個、三個或更多個)抗原性結構的雙特異性和多特異性構建體。此外,術語「抗體構建體」的定義包括由僅一條多肽鏈組成的分子以及由多於一條多肽鏈組成的分子,該等鏈可以相同(同二聚體、同三聚體或同寡聚體)或不同(異二聚體、異三聚體或異寡聚體)。上文所鑒定的抗體及其變體或衍生物的實例尤其描述於以下文獻中:Harlow和Lane, Antibodies a laboratory manual [抗體:實驗室手冊], CSHL Press [冷泉港實驗室出版社] (1988)和Using Antibodies: a laboratory manual [使用抗體:實驗室手冊], CSHL Press [冷泉港實驗室出版社] (1999);Kontermann和Dübel, Antibody Engineering [抗體工程化], Springer [斯普林格出版社], 第2版 2010;和Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy [用於免疫療法的重組抗體], Cambridge University Press [劍橋大學出版社] 2009。
本發明的抗體構建體較佳的是「體外產生的抗體構建體」。這個術語係指根據上文定義的抗體構建體,其中可變區的全部或部分(例如,至少一個CDR)係在非免疫細胞選擇中產生,該非免疫細胞選擇係例如體外噬菌體展示、蛋白質晶片或其中可測試候選序列結合至抗原的能力的任何其他方法。因此,這個術語較佳的是排除僅在動物的免疫細胞中藉由基因組重排產生的序列。「重組抗體」係藉由使用重組DNA技術或基因工程化製得的抗體。
本發明的雙特異性抗體構建體的實施方式係「單鏈抗體構建體」。那些單鏈抗體構建體僅包括由單條肽鏈組成的抗體構建體的上述實施方式。
如本文所用的術語「單株抗體」(mAb)或單株抗體構建體係指從基本上均質的抗體群體獲得的抗體,即,除了可能少量存在的可能的天然存在的突變和/或翻譯後修飾(例如,異構化、醯胺化)以外,構成該群體的單獨抗體係相同的。單株抗體具有高度特異性,針對抗原上的單一抗原性位點或決定簇,與常規(多株)抗體製劑相反,該等常規(多株)抗體製劑典型地包括針對不同決定簇(或表位)的不同抗體。除了其特異性之外,單株抗體的有利之處還在於,其係藉由雜交瘤培養合成的,因此未被其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體的特徵為,係從基本上均質的抗體群獲得,並且不應視為需要藉由任何特定方法產生抗體。
對於單株抗體的製備,可以使用提供藉由連續細胞系培養產生的抗體的任何技術。例如,待使用的單株抗體可以藉由首先由Koehler等人, Nature [自然], 256: 495 (1975)描述的雜交瘤方法製得,或者可以藉由重組DNA方法製得(參見例如,美國專利案號4,816,567)。用於產生人單株抗體的其他技術的實例包括三源雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術(Kozbor, Immunology Today [今日免疫學] 4 (1983), 72)和EBV-雜交瘤技術(Cole等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy [單株抗體和癌症治療], Alan R. Liss, Inc. [阿蘭R.里茲公司] (1985), 77-96)。
然後可以使用標準方法(如酶聯免疫吸附測定(ELISA)和表面電漿共振(BIACORETM
)分析)篩選雜交瘤,以鑒定產生與指定抗原特異性結合的抗體的一種或多種雜交瘤。可以使用任何形式的相關抗原作為免疫原,例如重組抗原、天然存在的形式、其任何變體或片段以及其抗原性肽。可以使用如在BIAcore系統中採用的表面電漿共振來提高結合至靶抗原(如靶細胞表面抗原CD33或CD3ε)的表位的噬菌體抗體的效率(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 [人抗體雜交瘤7] (1996), 97-105;Malmborg, J. Immunol. Methods [免疫學方法雜誌] 183 (1995), 7-13)。
另一種製備單株抗體的示例性方法包括篩選蛋白質表現文庫,例如噬菌體展示或核糖體展示文庫。噬菌體展示描述於例如以下文獻中:Ladner等人, 美國專利案號5,223,409;Smith (1985) Science [科學] 228:1315-1317;Clackson等人, Nature [自然], 352: 624-628 (1991);和Marks等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], 222: 581-597 (1991)。
除了使用展示文庫之外,還可以使用相關抗原來免疫非人動物,例如齧齒動物(如小鼠、倉鼠、兔或大鼠)。在一個實施方式中,非人動物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如,有可能用人Ig(免疫球蛋白)基因座的大片段來工程化在小鼠抗體產生方面有缺陷的小鼠品系。使用雜交瘤技術,可以產生並選擇源自具有所需特異性的基因的抗原特異性單株抗體。參見例如,XENOMOUSETM
,Green等人 (1994) Nature Genetics [自然遺傳學] 7:13-21;US 2003-0070185;WO 96/34096和WO 96/33735。
單株抗體也可以從非人動物獲得,並且然後使用本領域已知的重組DNA技術進行修飾,例如人源化、去免疫、呈現嵌合等。經修飾抗體構建體的實例包括非人抗體的人源化變體、「親和力成熟的」抗體(參見例如,Hawkins等人 J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 254, 889-896 (1992)和Lowman等人, Biochemistry [生物化學] 30, 10832- 10837 (1991))以及具有一種或多種改變的效應子功能的抗體突變體(參見例如,美國專利5,648,260;Kontermann和Dübel (2010),上述引文;和Little (2009),上述引文)。
在免疫學中,親和力成熟係這樣的過程:藉由該過程,在免疫應答的過程期間,B細胞產生具有增加的與抗原的親和力的抗體。藉由反復暴露至相同的抗原,宿主會產生依次更高親和力的抗體。與天然原型類似,體外親和力成熟係基於突變和選擇的原理。體外親和力成熟已經成功地用於優化抗體、抗體構建體和抗體片段。使用輻射、化學誘變劑或易錯PCR引入CDR內的隨機突變。此外,遺傳多樣性可以藉由鏈改組來增加。使用展示方法(如噬菌體展示)進行兩輪或三輪突變和選擇通常產生具有在低納莫耳範圍內的親和力的抗體片段。
抗體構建體的胺基酸取代變化的較佳的類型涉及取代親代抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個超變區殘基。通常,所選擇用於進一步研發的一種或多種所得變體將具有相對於產生其的親代抗體有所改良的生物特性。用於產生此類取代變體的便利方式涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡單來說,使若干個超變區位點(例如,6-7個位點)突變以在每個位點產生所有可能的胺基酸取代。將由此產生的抗體變體以單價方式從絲狀噬菌體顆粒展示為與每個顆粒內包裝的M13的基因III產物的融合物。然後如本文所揭露篩選噬菌體展示的變體的生物活性(例如結合親和力)。為了鑒定用於修飾的候選超變區位點,可以進行丙胺酸掃描誘變以鑒定對抗原結合有重要貢獻的超變區殘基。可替代地,或另外地,分析抗原-抗體複合物的晶體結構以鑒定結合結構域與例如人靶細胞表面抗原CD33之間的接觸點可能是有益的。此類接觸殘基和鄰近殘基係根據本文所詳述的技術進行取代的候選殘基。一旦產生了此類變體,使變體組經歷如本文所述的篩選,並且可以在一種或多種相關測定中選擇具有優異特性的抗體用於進一步研發。
本發明的單株抗體和抗體構建體具體地包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白),其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源,同時該一條或多條鏈的其餘部分與源自另一種物種或屬於另一種抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源,以及此類抗體的片段,只要其展現所需生物活性即可(美國專利案號4,816,567;Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 81: 6851-6855 (1984))。本文感興趣的嵌合抗體包括「靈長類化(primitized)」抗體,其包含源自非人靈長類動物(例如,舊大陸猴(Old World Monkey)、猿等)的可變結構域抗原結合序列和人恒定區序列。已經描述了多種用於製備嵌合抗體的方法。參見例如,Morrison等人, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. [美國國家科學院院刊] 81:6851, 1985;Takeda等人, Nature [自然] 314:452, 1985;Cabilly等人, 美國專利案號4,816,567;Boss等人, 美國專利案號4,816,397;Tanaguchi等人, EP 0171496;EP 0173494;和GB 2177096。
抗體、抗體構建體或抗體片段還可以藉由WO 98/52976和WO 00/34317中所揭露的方法,藉由人T細胞表位的特定缺失(一種稱為「去免疫」的方法)來修飾。簡單來說,可以針對結合至MHC II類的肽分析抗體的重鏈和輕鏈可變結構域;該等肽代表潛在的T細胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317中所定義)。為了檢測潛在的T細胞表位,可以應用稱為「肽穿線(peptide threading)」的電腦建模方法,並且此外可以在人MHC II類結合肽的數據庫中搜索存在於VH和VL序列中的模體,如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。該等模體結合至18種主要MHC II類DR同種異型中的任一種,並且由此構成潛在的T細胞表位。所檢測到的潛在的T細胞表位可以藉由取代可變結構域中的少量胺基酸殘基,或者較佳的是藉由單一胺基酸取代來消除。典型地,進行保守取代。通常但不排他地,可以使用人種系抗體序列中的位置共有的胺基酸。人種系序列揭露於例如以下文獻中:Tomlinson等人 (1992) J. MoI. Biol. [分子生物學雜誌] 227:776-798;Cook, G.P.等人 (1995) Immunol. Today [今日免疫學] 第16卷(5): 237-242;和Tomlinson等人 (1995) EMBO J. [歐洲分子生物學學會雜誌] 14: 14:4628-4638。V BASE目錄提供了人免疫球蛋白可變區序列的綜合目錄(由Tomlinson, LA.等人編輯,英國劍橋MRC蛋白質工程中心(MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK))。該等序列可以用作人序列的來源,例如用於框架區和CDR。也可以使用共有的人框架區,例如如美國專利案號6,300,064中所述。
「人源化」抗體、抗體構建體或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2
或抗體的其他抗原結合子序列)係主要具有人序列的抗體或免疫球蛋白,其含有一個或多個源自非人免疫球蛋白的最小序列。就大部分來說,人源化抗體係人免疫球蛋白(受體抗體),其中來自受體超變區(也稱為CDR)的殘基被來自非人(例如,齧齒類動物)物種(供體抗體)(如小鼠、大鼠、倉鼠或兔)的具有所需特異性、親和力和能力的超變區的殘基替代。在一些情況下,人免疫球蛋白的Fv框架區(FR)殘基被相應非人殘基替代。此外,如本文所用的「人源化抗體」也可以包含在受體抗體或供體抗體中都未發現的殘基。進行該等修飾以進一步改進和優化抗體性能。人源化抗體還可以包含典型地是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定區(Fc)的至少一部分。關於進一步的細節,參見Jones等人, Nature [自然], 321: 522-525 (1986);Reichmann等人, Nature [自然], 332: 323-329 (1988);和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. [結構生物學新見], 2: 593-596 (1992)。
人源化抗體或其片段可以藉由用來自人Fv可變結構域的等效序列替代Fv可變結構域中不直接參與抗原結合的序列來產生。產生人源化抗體或其片段的示例性方法提供於以下文獻中:Morrison (1985) Science [科學] 229:1202-1207;Oi等人 (1986) BioTechniques [生物技術] 4:214;和US 5,585,089;US 5,693,761;US 5,693,762;US 5,859,205;和US 6,407,213。那些方法包括分離、操縱和表現編碼來自重鏈或輕鏈中的至少一者的全部或部分免疫球蛋白Fv可變結構域的核酸序列。此類核酸可以獲得自如上所述的產生針對預定靶標的抗體的雜交瘤、以及其他來源。然後可以將編碼人源化抗體分子的重組DNA選殖到合適的表現載體中。
人源化抗體還可以使用轉基因動物(如表現人重鏈和輕鏈基因但不能表現內源性小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的小鼠)產生。Winter描述了可用於製備本文所述的人源化抗體的示例性CDR移植方法(美國專利案號5,225,539)。特定人抗體的所有CDR可以用非人CDR的至少一部分替代,或者僅一些CDR可以用非人CDR替代。僅需要替代使人源化抗體與預定抗原結合所需數目的CDR。
人源化抗體可以藉由引入保守取代、共有序列取代、種系取代和/或回復突變來優化。此類經改變的免疫球蛋白分子可以藉由若干種本領域已知的技術中的任一種來製備(例如,Teng等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊], 80: 7308-7312, 1983;Kozbor等人, Immunology Today [今日免疫學], 4: 7279, 1983;Olsson等人, Meth. Enzymol. [酶學方法], 92: 3-16, 1982;和EP 239 400)。
術語「人抗體」、「人抗體構建體」和「人結合結構域」包括如下抗體、抗體構建體和結合結構域,其具有基本對應於本領域已知的人種系免疫球蛋白序列的抗體區域(如可變和恒定區或結構域),包括例如Kabat等人(1991)(上述引文)所述的那些。本發明的人抗體、抗體構建體或結合結構域可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如,藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變引入的突變),例如在CDR中,並且特別是在CDR3中。人抗體、抗體構建體或結合結構域可以具有至少一個、兩個、三個、四個、五個或更多個被不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基替代的位置。如本文所用的人抗體、抗體構建體和結合結構域的定義還考慮了完全人抗體,其僅包含非人工和/或遺傳改變的人抗體序列,如可藉由使用如Xenomouse等技術或系統衍生的那些。
在一些實施方式中,本發明的抗體構建體係「分離的」或「基本上純的」抗體構建體。在用於描述本文所揭露的抗體構建體時,「分離的」或「基本上純的」意味著抗體構建體已經從其產生環境的組分鑒定、分離和/或回收。較佳的是,抗體構建體不與或基本上不與來自其產生環境的所有其他組分締合。其產生環境的污染組分(如由重組轉染細胞產生的污染組分)係典型地會干擾多肽的診斷或治療用途的材料,並且可能包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。抗體構建體可以例如占給定樣本中總蛋白質按重量計的至少約5%或至少約50%。應理解,根據情況,分離的蛋白質可以占總蛋白質含量按重量計的5%至99.9%。藉由使用誘導型啟動子或高表現啟動子,可以按顯著更高的濃度製備多肽,使得以增加的濃度水平製備多肽。該定義包括在本領域已知的眾多生物體和/或宿主細胞中產生抗體構建體。在較佳的實施方式中,將抗體構建體 (1) 藉由使用旋杯式序列分析儀純化至足以獲得至少15個殘基的N末端或內部胺基酸序列的程度,或 (2) 藉由SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍或較佳的是銀染色純化至均質。然而,通常將藉由至少一個純化步驟來製備分離的抗體構建體。
結合本發明,術語「結合結構域」分別表徵(特異性)結合至靶分子(抗原)和CD3上的給定靶表位或給定靶位點/與該靶表位或靶位點相互作用/識別該靶表位或靶位點的結構域。第一結合結構域(識別靶細胞表面抗原CD33)的結構和功能以及較佳的是還有第二結合結構域(CD3)的結構和/或功能係基於抗體(例如,全長或完整免疫球蛋白分子)的結構和/或功能。根據本發明,第一結合結構域的特徵在於,三個輕鏈CDR(即,VL區的CDR1、CDR2和CDR3)和三個重鏈CDR(即,VH區的CDR1、CDR2和CDR3)的存在。第二結合結構域較佳的是還包含允許靶標結合的抗體的最低結構要求。更較佳的是,第二結合結構域包含至少三個輕鏈CDR(即VL區的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三個重鏈CDR(即VH區的CDR1、CDR2和CDR3)。設想第一結合結構域和/或第二結合結構域係藉由噬菌體展示或文庫篩選方法產生或可獲得的,而不是藉由將CDR序列從預先存在的(單株)抗體移植到支架中產生或可獲得的。
根據本發明,結合結構域較佳的是呈多肽的形式。此類多肽可以包括蛋白質部分和非蛋白質部分(例如化學連接子(linker)或化學交聯劑,如戊二醛)。蛋白質(包括其片段(較佳的是生物活性片段)和肽,通常具有少於30個胺基酸)包含兩個或更多個經由共價肽鍵彼此偶合的胺基酸(產生胺基酸鏈)。如本文所用的術語「多肽」描述了一組分子,該等分子通常由超過30個胺基酸組成。多肽可以進一步形成多聚體,如二聚體、三聚體和更高級寡聚體,即由多於一個多肽分子組成。形成此類二聚體、三聚體等的多肽分子可以是相同的或不相同的。因此,將此類多聚體的相應較高階結構稱為同二聚體或異二聚體、同三聚體或異三聚體等。異多聚體的實例係抗體分子,其在其天然存在的形式中由兩條相同的輕多肽鏈和兩條相同的重多肽鏈組成。術語「肽」、「多肽」和「蛋白質」還是指天然修飾的肽/多肽/蛋白質,其中該修飾係藉由例如翻譯後修飾(如糖基化、乙醯化、磷酸化等)來實現。當在本文中提及時,「肽」、「多肽」或「蛋白質」也可以是化學修飾的,如聚乙二醇化的。此類修飾在本領域係熟知的並且在下文描述。
包含至少一個人結合結構域的抗體和抗體構建體避免了與具有非人(如齧齒動物(例如鼠類、大鼠、倉鼠或兔))可變區和/或恒定區的抗體或抗體構建體相關的一些問題。此類齧齒動物衍生的蛋白質的存在可以導致抗體或抗體構建體的快速清除或可以導致患者產生針對抗體或抗體構建體的免疫應答。為了避免使用齧齒動物衍生的抗體或抗體構建體,可以藉由將人抗體功能引入齧齒動物中以使齧齒動物產生完全人抗體來產生人或完全人抗體/抗體構建體。
在YAC中選殖並重構兆鹼基大小的人基因座並將其引入小鼠種系中的能力提供了闡明極大或粗略定位的基因座的功能組分以及產生人類疾病的有用模型的有效方法。此外,使用這種技術將小鼠基因座取代為其人等效物可以提供關於人基因產物在發育期間的表現和調控、其與其他系統的通信以及其參與疾病誘導和進展的獨特見解。
這種策略的重要實際應用係小鼠體液免疫系統的「人源化」。將人免疫球蛋白(Ig)基因座引入其中內源性Ig基因已經失活的小鼠中提供了研究抗體的程式化表現和組裝的根本機制以及其在B細胞發育中的作用的機會。此外,這種策略可以為完全人單株抗體(mAb)的產生提供理想來源-這係有助於實現抗體療法在人類疾病中的前景的重要里程碑。預期完全人抗體或抗體構建體將小鼠或小鼠衍生的mAb所固有的免疫原性和變應性反應最小化,並且由此增加投與的抗體/抗體構建體的功效和安全性。可以預期使用完全人抗體或抗體構建體可以在治療需要重複投與化合物的慢性和復發性人類疾病(如炎症、自體免疫和癌症)中提供顯著的優勢。
實現這一目標的一種方法係用人Ig基因座的大片段工程化在小鼠抗體產生方面有缺陷的小鼠品系,預期此類小鼠在不存在小鼠抗體的情況下將產生大的人抗體組庫。大的人Ig片段將保持大的可變基因多樣性以及對抗體產生和表現的適當調控。藉由利用小鼠機構進行抗體多樣化和選擇以及缺乏對人蛋白質的免疫耐受性,在該等小鼠品系中再生的人抗體組庫應產生針對任何感興趣的抗原(包括人抗原)的高親和力抗體。使用雜交瘤技術,可以容易地產生和選擇具有所需特異性的抗原特異性人mAb。結合第一XenoMouse小鼠品系的產生來證實這種通用策略(參見Green等人 Nature Genetics [自然遺傳學] 7:13-21 (1994))。用酵母人工染色體(YAC)工程化XenoMouse品系,該等酵母人工染色體分別含有人重鏈基因座和κ輕鏈基因座的245 kb和190 kb大小的種系構型片段,該等片段含有核心可變區和恒定區序列。證明含有人Ig的YAC與小鼠系統相容以重排和表現抗體,並且該等YAC能夠取代失活的小鼠Ig基因。這藉由其誘導B細胞發育、產生完全人抗體的成人樣人組庫和產生抗原特異性人mAb的能力來證實。該等結果還表明,引入含有較大數目的V基因、其他調控元件和人Ig恒定區的人Ig基因座的較大部分可能基本上再現特徵為對感染和免疫的人體液應答的完整組庫。Green等人的工作最近擴展到藉由分別引入兆鹼基大小的人重鏈基因座和κ輕鏈基因座的種系構型YAC片段來引入大於大約80%的人抗體組庫。參見Mendez等人 Nature Genetics [自然遺傳學] 15:146-156 (1997);和美國專利申請序號08/759,620。
XenoMouse小鼠的產生進一步論述和描繪於美國專利申請序號07/466,008、序號07/610,515、序號07/919,297、序號07/922,649、序號08/031,801、序號08/112,848、序號08/234,145、序號08/376,279、序號08/430,938、序號08/464,584、序號08/464,582、序號08/463,191、序號08/462,837、序號08/486,853、序號08/486,857、序號08/486,859、序號08/462,513、序號08/724,752和序號08/759,620;以及美國專利案號6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598;以及日本專利案號3 068 180 B2、3 068 506 B2和3 068 507 B2中。還參見Mendez等人 Nature Genetics [自然遺傳學] 15:146-156 (1997);和Green和Jakobovits J. Exp. Med. [實驗醫學雜誌] 188:483-495 (1998);EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310和WO 03/47336。
在一種替代方法中,其他公司(包括真藥物國際公司(GenPharm International, Inc.))利用了「微基因座」方法。在微基因座方法中,藉由包含來自Ig基因座的碎片(單獨的基因)來模擬外源性Ig基因座。因此,將一個或多個VH基因、一個或多個DH基因、一個或多個JH基因、μ恒定區和第二恒定區(較佳的是γ恒定區)形成為用於***到動物中的構建體。這種方法描述於授予Surani等人的美國專利案號5,545,807以及各自授予Lonberg和Kay的美國專利案號5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458;授予Krimpenfort和Berns的美國專利案號5,591,669和6,023.010;授予Berns等人的美國專利案號5,612,205、5,721,367和5,789,215;以及授予Choi和Dunn的美國專利案號5,643,763;以及真藥物國際公司的美國專利申請序號07/574,748、序號07/575,962、序號07/810,279、序號07/853,408、序號07/904,068、序號07/990,860、序號08/053,131、序號08/096,762、序號08/155,301、序號08/161,739、序號08/165,699、序號08/209,741中。還參見EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884以及美國專利案號5,981,175。還參見Taylor等人(1992)、Chen等人(1993)、Tuaillon等人(1993)、Choi等人(1993)、Lonberg等人(1994)、Taylor等人(1994)以及Tuaillon等人(1995)、Fishwild等人(1996)。
Kirin也證實了從藉由微細胞融合引入大段染色體或整個染色體的小鼠產生人抗體。參見歐洲專利申請號773 288和843 961。Xenerex Biosciences正在研發用於人抗體的潛在產生的技術。在這種技術中,用人淋巴細胞(例如,B和/或T細胞)重構SCID小鼠。然後將小鼠用抗原免疫並且可以產生針對抗原的免疫應答。參見美國專利案號5,476,996、5,698,767和5,958,765。
人抗小鼠抗體(HAMA)反應已經導致該行業製備嵌合的或在其他方面人源化的抗體。然而,預期特別是在抗體的長期或多用量利用中會觀察到某些人抗嵌合抗體(HACA)反應。因此,可能需要提供如下抗體構建體,其包含針對靶細胞表面抗原的完全人結合結構域和針對CD3的完全人結合結構域,以消除HAMA或HACA反應的問題和/或效應。
根據本發明,術語「(特異性)結合至」、「(特異性)識別」、「(特異性)針對」和「與......(特異性)反應」意味著,結合結構域與位於靶蛋白或抗原(靶細胞表面抗原CD33/CD3)上的表位的一個或多個、較佳的是至少兩個、更較佳的是至少三個、最較佳的是至少四個胺基酸相互作用或特異性相互作用。
術語「表位」係指抗原上的位點,結合結構域(如抗體或免疫球蛋白或者抗體或免疫球蛋白的衍生物或片段)與該位點特異性結合。「表位」係抗原性的,並且因此術語表位在本文中有時也稱為「抗原性結構」或「抗原決定簇」。因此,結合結構域係「抗原相互作用位點」、所述結合/相互作用也被理解為定義「特異性識別」。結合本申請,術語「表位」被理解為描述完整抗原性結構,而術語「表位的部分」可以用於描述給定結合結構域的特異性表位的一個或多個亞基。
「表位」可以藉由連續的胺基酸或藉由蛋白質的三級折疊並置的非連續胺基酸形成。「線性表位」係如下表位,其中胺基酸一級序列構成所識別表位。線性表位典型地在獨特的序列中包含至少3個或至少4個、更通常地至少5個或至少6個或至少7個(例如,約8個至約10個)胺基酸。
與線性表位相反,「構象表位」係如下表位,其中構成表位的一級胺基酸序列並非所識別表位的唯一定義性組分(例如,其中一級胺基酸序列不一定被結合結構域識別的表位)。典型地,構象表位相對於線性表位包含增加數目的胺基酸。關於構象表位的識別,結合結構域識別抗原、較佳的是肽或蛋白質或其片段的三維結構(在本發明的背景下,一種結合結構域的抗原包含於靶細胞表面抗原CD33內)。例如,當蛋白質分子折疊以形成三維結構時,形成構象表位的某些胺基酸和/或多肽骨架並置,使得抗體能夠識別表位。確定表位構象的方法包括但不限於x射線晶體學、二維核磁共振(2D-NMR)光譜學和定點自旋標記和電子順磁共振(EPR)光譜學。
結合結構域與表位或表位簇之間的相互作用意指,結合結構域對特定蛋白質或抗原(此處:分別是靶細胞表面抗原CD33和CD3)上的表位或表位簇展現可察覺的親和力,並且通常不展現與靶細胞表面抗原CD33或CD3以外的蛋白質或抗原的顯著反應性。「可察覺的親和力」包括以約10-6
M(KD)或更強的親和力結合。較佳的是,在結合親和力為約10-12
至10-8
M、10-12
至10-9
M、10-12
至10-10
M、10-11
至10-8
M,較佳的是約10-11
至10-9
M時,將結合視為特異性的。結合結構域是否與靶標特異性反應或結合尤其可以藉由以下方式容易地測試:比較所述結合結構域與靶蛋白或抗原的反應和所述結合結構域與靶細胞表面抗原CD33或CD3以外的蛋白質或抗原的反應。較佳的是,本發明的結合結構域實質上或基本上不結合至靶細胞表面抗原CD33或CD3以外的蛋白質或抗原(即,第一結合結構域不能結合至靶細胞表面抗原CD33以外的蛋白質,並且第二結合結構域不能結合至CD3以外的蛋白質)。
術語「實質上/基本上不結合」或「不能結合」意味著,本發明的結合結構域不結合靶細胞表面抗原CD33或CD3以外的蛋白質或抗原,即,不顯示大於30%,較佳的是不超過20%,更較佳的是不超過10%,特別較佳的是不超過9%、8%、7%、6%或5%的與靶細胞表面抗原CD33或CD3以外的蛋白質或抗原的反應性,其中將與靶細胞表面抗原CD33或CD3的結合分別設定為100%。
據信特異性結合係藉由結合結構域和抗原的胺基酸序列中的特定模體實現的。因此,由於其一級、二級和/或三級結構以及所述結構的二次修飾的結果,實現了結合。抗原相互作用位點與其特異性抗原的特異性相互作用可以導致所述位點與抗原的簡單結合。此外,抗原相互作用位點與其特異性抗原的特異性相互作用可以可替代地或另外地導致訊號的引發,例如由於誘導抗原構象變化、抗原寡聚化等所致。
術語「可變的」係指抗體或免疫球蛋白結構域的如下部分,該等部分在其序列中展現可變性並且參與決定特定抗體(即,「一個或多個可變結構域」)的特異性和結合親和力。可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)的配對一起形成單一抗原結合位點。
可變性在抗體的整個可變結構域中並非均勻分佈;其集中於重鏈和輕鏈可變區中各自的子結構域中。該等子結構域被稱為「超變區」或「互補決定區」(CDR)。可變結構域中較保守(即,非超變性)的部分被稱為「框架」區(FRM),並在三維空間中提供這六個CDR的支架,以形成抗原結合表面。天然存在的重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含4個FRM區(FR1、FR2、FR3和FR4),主要採取β片層構型,藉由三個超變區連接,該等超變區形成連接β片層結構的環,並且在一些情況下形成β片層結構的一部分。每條鏈中的超變區藉由FRM緊密靠近地保持在一起,並且與另一條鏈的超變區一起促進形成抗原結合位點(參見Kabat等人, 上述引文)。
術語「CDR」及其複數「CDR」係指互補決定區,三個互補決定區構成輕鏈可變區的結合特徵(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)並且三個互補決定區構成重鏈可變區的結合特徵(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)。CDR含有大部分負責抗體與抗原特異性相互作用的殘基,並且因此有助於抗體分子的功能活性:它們係抗原特異性的主要決定因素。
準確定義的CDR邊界和長度受制於不同的分類和編號系統。因此,CDR可以藉由Kabat、Chothia、接觸(contact)或任何其他邊界定義(包括本文所述的編號系統)來引用。儘管有不同的邊界,但該等系統各自在構成可變序列內所謂的「超變區」的序列中具有一定程度的重疊。因此,根據該等系統的CDR定義可以在相對於相鄰框架區的長度和邊界區域中不同。參見例如Kabat(基於跨物種序列可變性的方法)、Chothia(基於抗原-抗體複合物的結晶學研究的方法)和/或MacCallum(Kabat等人, 上述引文;Chothia等人, J. MoI. Biol [分子生物學雜誌], 1987, 196: 901-917;和MacCallum等人, J. MoI. Biol [分子生物學雜誌], 1996, 262: 732)。表徵抗原結合位點的還另一種標準係由牛津大學分子公司(Oxfbrd Molecular)的AbM抗體建模軟體使用的AbM定義。參見例如,Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains [抗體可變結構域的蛋白質序列和結構分析]. 於Antibody Engineering Lab Manual [抗體工程化實驗室手冊](編輯:Duebel, S.和Kontermann, R., 海德堡施普林格出版社(Springer-Verlag, Heidelberg))中。就兩種殘基鑒定技術定義重疊區而非相同區而言,可以將它們組合以定義雜合CDR。然而,根據所謂的Kabat系統進行編號係較佳的。
典型地,CDR形成可以分類為規範結構的環結構。術語「規範結構」係指抗原結合(CDR)環採取的主鏈構象。從比較結構研究中,已經發現六個抗原結合環中的五個僅具有有限的可用構象組庫。每個規範結構可以藉由多肽骨架的扭轉角來表徵。因此,雖然環的大部分中具有高胺基酸序列可變性,但抗體之間的相應環可具有極為類似的三維結構(Chothia和Lesk, J. MoI. Biol. [分子生物學雜誌], 1987, 196: 901;Chothia等人, Nature [自然], 1989, 342: 877;Martin和Thornton, J. MoI. Biol [分子生物學雜誌], 1996, 263: 800)。此外,所採用的環結構與其周圍的胺基酸序列之間存在關係。特定規範類別的構象由環的長度和位於環內關鍵位置以及保守框架內(即,環外)的胺基酸殘基決定。因此,可以基於該等關鍵胺基酸殘基的存在對特定的規範類別進行分配。
術語「規範結構」還可以包括關於抗體的線性序列的考慮因素,例如,如Kabat(Kabat等人, 上述引文)所編目。Kabat編號方案(系統)係以一致方式對抗體可變結構域的胺基酸殘基進行編號的廣泛採用的標準,並且是本發明應用的較佳的方案,也如本文其他地方所提及。另外的結構考慮因素也可以用於確定抗體的規範結構。例如,藉由Kabat編號未完全反映的那些差異可以藉由Chothia等人的編號系統來描述和/或藉由其他技術(例如,結晶學和二維或三維計算建模)來揭示。因此,可以將給定的抗體序列置於規範的類別中,該類別尤其允許鑒定適當的基礎結構(chassis)序列(例如,基於在文庫中包括多種規範結構的期望)。抗體胺基酸序列的Kabat編號和如Chothia等人(上述引文)所述的結構考慮因素以及其用於解釋抗體結構的規範方面的含義描述於文獻中。不同類別免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型在本領域係熟知的。關於抗體結構的綜述,參見Antibodies: A Laboratory Manual [抗體:實驗室手冊], Cold Spring Harbor Laboratory [冷泉港實驗室出版社], Harlow等人編輯, 1988。
輕鏈的CDR3以及特別是重鏈的CDR3可以構成輕鏈可變區和重鏈可變區內抗原結合中最重要的決定簇。在一些抗體構建體中,重鏈CDR3似乎構成抗原與抗體之間的主要接觸區域。可以使用其中僅CDR3變化的體外選擇方案來改變抗體的結合特性,或確定哪些殘基有助於抗原結合。因此,CDR3典型地是抗體結合位點內的分子多樣性的最大來源。例如,H3可以短至兩個胺基酸殘基或多於26個胺基酸。
在經典的全長抗體或免疫球蛋白中,每條輕(L)鏈藉由一個共價二硫鍵與重(H)鏈連接,而兩條H鏈藉由一個或多個二硫鍵彼此連接,這取決於H鏈同種型。最靠近VH的CH結構域通常命名為CH1。恒定(「C」)結構域不直接參與抗原結合,但展現各種效應子功能,如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性和補體激活。抗體的Fc區包含於重鏈恒定結構域內,並且例如能夠與位於細胞表面的Fc受體相互作用。
在組裝和體細胞突變後,抗體基因序列高度變化,並且估計該等變化的基因編碼1010
種不同的抗體分子(Immunoglobulin Genes [免疫球蛋白基因], 第2版, Jonio等人編輯, Academic Press, San Diego, CA [加利福尼亞州聖地牙哥學術出版社], 1995)。因此,免疫系統提供了免疫球蛋白組庫。術語「組庫(repertoire)」係指完全或部分源自編碼至少一種免疫球蛋白的至少一個序列的至少一個核苷酸序列。一個或多個序列可以藉由重鏈的V、D和J區段以及輕鏈的V和J區段的體內重排來產生。可替代地,一個或多個序列可以響應於發生哪種重排(例如,體外刺激)從細胞產生。可替代地,一個或多個序列的一部分或全部可以藉由DNA剪接、核苷酸合成、誘變及其他方法獲得,參見例如美國專利5,565,332。組庫可以僅包括一個序列或可以包括多個序列,包括遺傳多樣性集合中的序列。
如本文所用的術語「雙特異性」係指「至少雙特異性」的構建體,即,該構建體包含至少第一結合結構域和第二結合結構域,其中第一結合結構域結合至一種抗原或靶標,並且第二結合結構域結合至另一中抗原或靶標(此處:CD3)。因此,根據本發明的雙特異性抗體構建體包含對至少兩種不同抗原或靶標的特異性。術語本發明的「雙特異性抗體構建體」還涵蓋多特異性構建體,如三特異性構建體,後者包括三個結合結構域,或者具有多於三種(例如,4種、5種......)特異性的構建體。在結合本發明使用的構建體係抗體構建體的情況下,該等所涵蓋的相應構建體係多特異性抗體構建體,如三特異性抗體構建體,後者包括三個結合結構域,或者具有多於三種(例如,4種、5種......)特異性的構建體。
鑒於根據本發明的抗體構建體係(至少)雙特異性的,它們不是天然存在的並且與天然存在的產物明顯不同。因此,「雙特異性」抗體構建體或免疫球蛋白係具有至少兩個具有不同特異性的不同結合位點的人工雜合抗體或免疫球蛋白。雙特異性抗體可以藉由多種方法(包括雜交瘤的融合或Fab'片段的連接)來產生。參見例如,Songsivilai和Lachmann, Clin. Exp. Immunol. [臨床和實驗免疫學] 79:315-321 (1990)。
本發明的抗體構建體的至少兩個結合結構域和可變結構域可以包含或可以不包含肽連接子(間隔肽)。術語「肽連接子」根據本發明定義胺基酸序列,藉由該胺基酸序列將本發明的抗體構建體的一個(可變和/或結合)結構域與另一個(可變和/或結合)結構域彼此連接。這種肽連接子的基本技術特徵在於,所述肽連接子不含任何聚合活性。合適的肽連接子包括美國專利4,751,180和4,935,233或WO 88/09344中所述的那些。肽連接子也可以用於將其他結構域或模組或區(如半衰期延長結構域)附接到本發明的抗體構建體。
在使用連接子的情況下,這種連接子的長度和序列較佳的是足以確保第一和第二結構域可以各自彼此獨立地保留其差異性結合特異性。對於連接本發明的抗體構建體中的至少兩個結合結構域(或兩個可變結構域)的肽連接子,那些僅包含少量胺基酸殘基(例如,12個或更少胺基酸殘基)的肽連接子係較佳的。因此,12、11、10、9、8、7、6或5個胺基酸殘基的肽連接子係較佳的。所設想的具有少於5個胺基酸的肽連接子包含4、3、2或1個胺基酸,其中富含Gly的連接子係較佳的。在所述「肽連接子」的背景下,特別較佳的「單一」胺基酸係Gly。因此,所述肽連接子可以由單一胺基酸Gly組成。肽連接子的另一個較佳的實施方式的特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser,即Gly4
Ser,或其聚合物,即(Gly4
Ser)x,其中x係1或更大的整數。所述肽連接子的特徵(包含不存在二級結構的促進)在本領域係已知的並且描述於例如以下文獻中:Dall'Acqua等人(Biochem. [生物化學] (1998) 37, 9266-9273)、Cheadle等人(Mol Immunol [分子免疫學] (1992) 29, 21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB [美國實驗生物學學會聯合會] (1995) 9(1), 73-80)。也不促進任何二級結構的肽連接子係較佳的。所述結構域的相互連接可以藉由例如基因工程化來提供,如實例中所述。製備融合且操作性連接的雙特異性單鏈構建體並在哺乳動物細胞或細菌中表現該等構建體的方法在本領域係熟知的(例如,WO 99/54440或Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖:實驗室手冊], Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York [紐約冷泉港的冷泉港實驗室出版社], 2001)。
雙特異性單鏈分子在本領域係已知的並且描述於以下文獻中:WO 99/54440;Mack, J. Immunol. [免疫學雜誌] (1997), 158, 3965-3970;Mack, PNAS [美國國家科學院院刊], (1995), 92, 7021-7025;Kufer, Cancer Immunol. Immunother. [癌症免疫學免疫療法], (1997), 45, 193-197;Löffler, Blood [血液], (2000), 95, 6, 2098-2103;Brühl, Immunol. [免疫學], (2001), 166, 2420-2426;Kipriyanov, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], (1999), 293, 41-56。可以採用針對產生單鏈抗體所述的技術(尤其參見美國專利4,946,778;Kontermann和Dübel (2010),上述引文;和Little (2009),上述引文)產生特異性識別一種或多種所選靶標的單鏈抗體構建體。
二價(bivalent)(也稱為二價(divalent))或雙特異性單鏈可變片段(具有形式(scFv)2
的雙scFv或二scFv)可以藉由連接兩種scFv分子來工程化。在這兩種scFv分子具有相同結合特異性的情況下,所得(scFv)2
分子將較佳的是被稱為二價的(即,其具有針對同一靶表位的兩個價)。在兩種scFv分子具有不同結合特異性的情況下,所得(scFv)2
分子將較佳的是被稱為雙特異性的。該連接可以藉由產生具有兩個VH區和兩個VL區的單條肽鏈,從而產生串聯scFv來實現(參見例如,Kufer P.等人, (2004) Trends in Biotechnology [生物技術趨勢] 22(5):238-244)。另一種可能性係產生具有連接子肽的scFv分子,該等連接子肽對於兩個可變區來說太短以致於不能折疊在一起(例如約五個胺基酸),從而迫使scFv二聚化。這種類型被稱為雙抗體(參見例如,Hollinger, Philipp等人, (1993年7月) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America [美國國家科學院院刊] 90 (14): 6444-8.)。
單結構域抗體僅包含一個(單體)抗體可變結構域,該抗體可變結構域能夠獨立於其他V區或結構域而選擇性結合至特定抗原。第一單結構域抗體係從駱駝中發現的重鏈抗體工程化而來,並且該等被稱為VH
H片段。軟骨魚類也具有重鏈抗體(IgNAR),可以從該等重鏈抗體中獲得稱為VNAR
片段的單結構域抗體。一種替代方法係將來自常見免疫球蛋白(例如來自人或齧齒動物)的二聚體可變結構域***成單體,由此獲得作為單結構域Ab的VH或VL。儘管對單結構域抗體的大多數研究目前都是基於重鏈可變結構域,但源自輕鏈的奈米抗體也顯示出與靶表位特異性結合。單結構域抗體的實例係所謂的sdAb、奈米抗體或單一可變結構域抗體。
因此,(單結構域mAb)2
係由(至少)兩個單結構域單株抗體構成的單株抗體構建體,該等單結構域單株抗體單獨地選自包含VH、VL、VHH和VNAR
的組。連接子較佳的是呈肽連接子的形式。類似地,「scFv-單結構域mAb」係由至少一種如上所述的單結構域抗體和一種如上所述的scFv分子構成的單株抗體構建體。同樣,連接子較佳的是呈肽連接子的形式。
還設想,本發明的抗體構建體除了其結合至靶抗原CD33和CD3的功能以外,還包含另一種功能。在這種形式中,抗體構建體係三功能或多功能抗體構建體,其藉由結合至靶抗原靶向靶細胞,藉由CD3結合介導細胞毒性T細胞活性,並提供另一種功能,如標記(螢光標記等)、治療劑(如毒素或放射性核素)等。
抗體構建體的共價修飾也包括在本發明的範圍內,並且通常但不總是在翻譯後進行。例如,藉由使抗體構建體的特定胺基酸殘基與能夠與選擇的側鏈或N或C末端殘基反應的有機衍生劑反應,將抗體構建體的若干種類型的共價修飾引入分子中。
半胱胺醯殘基最常見地與α-鹵代乙酸酯(和相應的胺)(如氯乙酸或氯乙醯胺)反應,以得到羧甲基或羧醯胺甲基衍生物。半胱胺醯殘基還可以藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙醯酯、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑反應來衍生出。
組胺醯殘基係藉由在pH 5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應來衍生出,因為這種試劑對組胺醯側鏈相對具有特異性。對溴苯醯甲基溴也有用;反應較佳的是在0.1 M二甲胂酸鈉(pH 6.0)中進行。賴胺醯殘基和胺基末端殘基與琥珀酸酐或其他羧酸酐反應。用該等試劑衍生化具有逆轉賴胺醯殘基的電荷的效應。用於衍生含有α-胺基的殘基的其他合適的試劑包括亞胺酸酯(如甲基吡啶亞胺甲酯);磷酸吡哆醛;吡哆醛;硼氫化氯;三硝基苯磺酸;O-甲基異脲;2,4-戊二酮;和轉胺酶催化的與乙醛酸鹽的反應。
精胺醯殘基藉由與一種或多種常規試劑(其中苯甲醯甲醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮和茚三酮)反應而被修飾。由於胍官能基的高pKa,精胺酸殘基的衍生化要求反應在鹼性條件下進行。此外,該等試劑可以與離胺酸基團以及精胺酸ε-胺基基團反應。
可以對酪胺醯殘基進行特定修飾,特別感興趣的是藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記引入酪胺醯殘基中。最常見地,將N-乙醯基咪唑和四硝基甲烷分別用於形成O-乙醯基酪胺醯物質和3-硝基衍生物。使用125
I或131
I碘化酪胺醯殘基以製備用於放射免疫測定的標記蛋白質,上述氯胺T法係合適的。
羧基側基團(天冬胺醯基或穀胺醯基)藉由與碳二亞胺(R'-N=C=N--R')反應而被選擇性地修飾,其中R和R'視需要為不同的烷基基團,如1-環己基-3-(2-𠰌啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外,天冬胺醯殘基和穀胺醯殘基藉由與銨離子反應而轉化為天冬醯胺醯殘基和麩醯胺酸醯殘基。
用雙功能劑衍生化可用於將本發明的抗體構建體交聯到水不溶性載體基質或表面以用於多種方法中。常用的交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯(例如,與4-疊氮基水楊酸的酯)、同雙官能亞胺酸酯(包括二琥珀醯亞胺酯,如3,3'-二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯))、和雙官能馬來醯亞胺(如雙-N-馬來醯亞胺-1,8-辛烷)。衍生劑(如3-[(對疊氮基苯基)二硫代]丙醯亞胺酸甲基酯)產生能夠在光存在下形成交聯的可光激活的中間體。可替代地,採用反應性水不溶性基質(如溴化氰激活的碳水化合物)和美國專利案號3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440中所述的反應性基材進行蛋白質固定。
麩醯胺酸醯殘基和天冬醯胺醯殘基通常分別脫醯胺成相應的穀胺醯殘基和天冬胺醯殘基。可替代地,該等殘基在弱酸性條件下脫醯胺。該等殘基的任一形式都落入本發明的範圍。
其他修飾包括脯胺酸和離胺酸的羥基化、絲胺醯殘基或蘇胺醯殘基的羥基基團的磷酸化、離胺酸、精胺酸和組胺酸側鏈中α-胺基的甲基化(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties [蛋白質:結構和分子特性], W. H. Freeman & Co., San Francisco [三藩市W. H.弗裡曼出版公司], 1983, 第79-86頁)、N末端胺的乙醯化和任何C末端羧基基團的醯胺化。
包括在本發明範圍內的抗體構建體的另一種類型的共價修飾包括改變蛋白質的糖基化模式。如本領域中已知的,糖基化模式可以取決於蛋白質的序列(例如,下文論述的特定糖基化胺基酸殘基的存在或不存在)或產生蛋白質的宿主細胞或生物體二者。下面論述特定的表現系統。
多肽的糖基化典型地是N-連接的或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分附接至天冬醯胺殘基的側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸和天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸以外的任何胺基酸)係將碳水化合物部分酶促附接至天冬醯胺側鏈的識別序列。因此,在多肽中該等三肽序列中的任一者的存在產生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化係指將糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一種附接至羥基胺基酸,最常見的是絲胺酸或蘇胺酸,但是也可以使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
藉由改變胺基酸序列以使得它含有上述三肽序列中的一者或多者而方便地完成向抗體構建體中添加糖基化位點(用於N-連接的糖基化位點)。還可以藉由向起始序列中添加一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或由一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代來作出改變(用於O-連接的糖基化位點)。為方便起見,抗體構建體的胺基酸序列較佳的是藉由DNA水平的變化來改變,特別是藉由在預選鹼基處突變編碼多肽的DNA,使得產生將翻譯成所需胺基酸的密碼子。
增加抗體構建體上的碳水化合物部分的數目的另一種手段係藉由將糖苷化學或酶促偶聯至蛋白質。該等程序的有利之處在於它們不需要在具有用於N-和O-連接的糖基化的糖基化能力的宿主細胞中產生蛋白質。取決於所使用的偶聯方式,一種或多種糖可以附接至 (a) 精胺酸和組胺酸;(b) 游離羧基基團;(c) 游離巰基基團,如半胱胺酸的那些;(d) 游離羥基基團,如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸的那些;(e) 芳香族殘基,如***酸、酪胺酸或色胺酸的那些;或 (f) 麩醯胺酸的醯胺基團。該等方法描述於以下文獻中:WO 87/05330,以及Aplin和Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem. [CRC生物化學關鍵評論], 第259-306頁。
存在於起始抗體構建體上的碳水化合物部分的去除可以化學地或酶促地完成。化學去糖基化要求將蛋白質暴露於化合物三氟甲磺酸或等效化合物。該處理導致除連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)以外的大多數或所有糖切割,同時使多肽保持完整。化學去糖基化描述於以下文獻中:Hakimuddin等人, 1987,Arch. Biochem. Biophys.
[生物化學與生物物理學集刊] 259:52和Edge等人, 1981,Anal. Biochem.
[分析生物化學] 118:131。多肽上的碳水化合物部分的酶促切割可以藉由使用多種內切糖苷酶和外切糖苷酶來實現,如Thotakura等人, 1987, Meth. Enzymol.
[酶學方法]
138:350中所述。可以藉由使用化合物衣黴素(tunicamycin)來防止潛在糖基化位點處的糖基化,如Duskin等人, 1982, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌]
257:3105中所述。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷鍵的形成。
本文考慮了抗體構建體的其他修飾。例如,抗體構建體的另一種類型的共價修飾包括以美國專利案號4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所述的方式將抗體構建體連接至各種非蛋白質聚合物,包括但不限於各種多元醇,如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物。此外,如本領域中已知的,可以在抗體構建體內的不同位置進行胺基酸取代,例如以有利於添加聚合物(如PEG)。
在一些實施方式中,本發明的抗體構建體的共價修飾包括添加一種或多種標記。標記基團可以藉由各種長度的間隔臂偶聯至抗體構建體,以減小潛在的空間位阻。用於標記蛋白質的各種方法在本領域係已知的並且可以用於進行本發明。術語「標記」或「標記基團」係指任何可檢測的標記。通常,標記屬於多種類別,這取決於檢測該等標記的測定-以下實例包括但不限於:
a) 同位素標記,其可以為放射性或重同位素,如放射性同位素或放射性核素(例如,3
H、14
C、15
N、35
S、89
Zr、90
Y、99
Tc、111
In、125
I、131
I)
b) 磁性標記(例如,磁性顆粒)
c) 氧化還原活性部分
d) 光學染料(包括但不限於生色團、磷光體和螢光團),如螢光基團(例如,FITC、玫瑰紅、鑭系元素磷光體)、化學發光基團和可以為「小分子」螢光劑或蛋白質螢光劑的螢光團
e) 酶促基團(例如,辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)
f) 生物素化基團
g) 由第二報導分子識別的預定多肽表位(例如,亮胺酸拉鍊對序列、第二抗體的結合位點、金屬結合結構域、表位標籤等)
「螢光標記」意指可以藉由其固有螢光特性檢測的任何分子。合適的螢光標記包括但不限於螢光素、玫瑰紅、四甲基玫瑰紅、伊紅、赤蘚紅、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石綠、茋、螢光黃、瀑布藍J、德克薩斯紅、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC紅640、Cy5、Cy5.5、LC紅705、俄勒岡綠、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、瀑布藍、瀑布黃和R-藻紅蛋白(PE)(俄勒岡州尤金市的分子探針公司(Molecular Probes, Eugene, OR))、FITC、玫瑰紅和德克薩斯紅(伊利諾州羅克福德的皮爾斯公司(Pierce, Rockford, IL))、Cy5、Cy5.5、Cy7(賓夕法尼亞州匹茲堡市的阿默舍姆生命科學公司(Amersham Life Science, Pittsburgh, PA))。合適的光學染料(包括螢光團)描述於Richard P. Haugland的Molecular Probes Handbook [分子探針手冊]中。
合適的蛋白質螢光標記還包括但不限於綠色螢光蛋白,包括GFP的海腎(Renilla)、海筆(Ptilosarcus)或水母(Aequorea)種類(Chalfie等人, 1994,Science
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263:802-805)、EGFP(選殖技術實驗室公司(Clontech Laboratories, Inc.),基因庫(Genbank)登錄號U55762);藍色螢光蛋白(BFP,量子生物科技公司(Quantum Biotechnologies, Inc.),1801 de Maisonneuve Blvd. West,8樓,加拿大魁北克蒙特利爾H3H 1J9;Stauber, 1998,Biotechniques
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亮胺酸拉鍊結構域係促進其所在蛋白質的寡聚化的肽。亮胺酸拉鍊最初係在若干種DNA結合蛋白中鑒定的(Landschulz等人, 1988,Science
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344:191中。允許與其融合的異源性蛋白的穩定三聚化的經修飾亮胺酸拉鍊的使用描述於Fanslow等人, 1994,Semin. Immunol
. [免疫學研討會] 6:267-78中。在一種方法中,使包含融合至亮胺酸拉鍊肽的靶抗原抗體片段或衍生物的重組融合蛋白在合適的宿主細胞中表現,並且從培養上清液中回收所形成的可溶性寡聚靶抗原抗體片段或衍生物。
本發明的抗體構建體還可以包含另外的結構域,該等結構域例如有助於分離分子或係關於分子的適應性藥物動力學 特徵。有助於分離抗體構建體的結構域可以選自肽模體或輔助性地引入的部分,該等部分可以在分離方法(例如分離柱)中捕獲。此類另外的結構域的非限制性實施方式包括稱為Myc-標籤、HAT-標籤、HA-標籤、TAP-標籤、GST-標籤、幾丁質結合結構域(CBD-標籤)、麥芽糖結合蛋白(MBP-標籤)、Flag-標籤、Strep-標籤及其變體(例如StrepII-標籤)和His標籤的肽模體。本文所揭露的所有特徵在於所鑒定CDR的抗體構建體較佳的是包含His-標籤結構域,通常將其稱為分子胺基酸序列中連續His殘基的重複序列,較佳的是6個His殘基的重複序列。
T細胞或T淋巴細胞係在細胞介導的免疫中發揮核心作用的一類淋巴細胞(其本身是一類白血球)。有若干個T細胞亞組,每個亞組具有不同的功能。T細胞可以藉由細胞表面上存在T細胞受體(TCR)而與其他淋巴細胞(如B細胞和NK細胞)區分開。TCR負責識別與主要組織相容性複合體(MHC)分子結合的抗原,並且由兩種不同的蛋白質鏈構成。在95%的T細胞中,TCR由阿爾法(α)和貝塔(β)鏈組成。在TCR與抗原性肽和MHC(肽/MHC複合物)接合時,藉由一系列生物化學事件激活T淋巴細胞,該等事件由相關的酶、共受體、特化銜接分子和所激活或釋放的轉錄因子來介導。
CD3受體複合物係一種蛋白質複合物,並且由四條鏈構成。在哺乳動物中,複合物含有CD3γ(伽馬)鏈、CD3δ(德爾塔)鏈和兩條CD3ε(伊蒲賽龍)鏈。該等鏈與T細胞受體(TCR)和所謂的ζ(截塔)鏈締合以形成T細胞受體CD3複合物並在T淋巴細胞中生成激活訊號。CD3γ(伽馬)、CD3δ(德爾塔)和CD3ε(伊蒲賽龍)鏈係含有單一細胞外免疫球蛋白結構域的免疫球蛋白超家族的高度相關的細胞表面蛋白。CD3分子的細胞內尾含有對於TCR的訊號傳導能力所必需的單一保守模體,稱為基於免疫受體酪胺酸的激活模體或簡稱ITAM。CD3ε分子係一種多肽,其在人類中由位於11號染色體上的CD3E
基因編碼。較佳的人CD3ε細胞外結構域的序列顯示於SEQ ID NO: 1中,並且對應於人CD3ε細胞外結構域的胺基酸殘基1-27的最較佳的CD3結合表位顯示於SEQ ID NO: 2中。
經由多特異性(至少雙特異性)抗體構建體募集T細胞對靶細胞的重定向裂解涉及溶細胞突觸形成以及穿孔素和顆粒酶的遞送。所接合的T細胞能夠進行連續靶細胞裂解,並且不受干擾肽抗原處理和呈遞或選殖T細胞分化的免疫逃逸機制影響;參見例如,WO 2007/042261。
可以按多種方式測量由雙特異性抗體構建體介導的細胞毒性。效應細胞可以是例如刺激的富集的(人)CD8陽性T細胞或未刺激的(人)外周血單核細胞(PBMC)。如果靶細胞係獼猴來源的或者表現獼猴靶細胞抗原或經獼猴靶細胞抗原轉染,則效應細胞應該也是獼猴來源的,如獼猴T細胞系,例如4119LnPx。靶細胞應表現靶細胞抗原(至少其細胞外結構域),例如人或獼猴靶細胞抗原。靶細胞可以是經靶細胞抗原(例如,人或獼猴靶細胞抗原)穩定或暫態轉染的細胞系(如CHO)。可替代地,靶細胞可以是靶細胞抗原陽性自然表現細胞系,如人癌細胞系。通常對於在細胞表面上表現較高水平靶細胞抗原的靶細胞系,預期EC50值較低。效應子與靶細胞(E:T)比率通常為約10:1,但也可以改變。雙特異性抗體構建體的細胞毒活性可以在51
鉻釋放測定(孵育時間為約18小時)中或在基於FACS的細胞毒性測定(孵育時間為約48小時)中測量。也可以對測定孵育時間(細胞毒性反應)進行修改。其他測量細胞毒性的方法對熟悉該項技術者來說係熟知的,並且包括MTT或MTS測定、基於ATP的測定(包括生物發光測定)、磺基玫瑰紅B(SRB)測定、WST測定、選殖生成測定和ECIS技術。
由本發明的雙特異性抗體構建體介導的細胞毒活性較佳的是在基於細胞的細胞毒性測定中測量。其由EC50
值表示,該值對應於半數最大有效濃度(誘導在基線與最大值之間的中途的細胞毒性反應的抗體構建體的濃度)。較佳的是,雙特異性抗體構建體的EC50
值≤ 20.000 pg/ml,更較佳的是≤ 5000 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 1000 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 500 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 350 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 250 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 100 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 50 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 10 pg/ml,最較佳的是≤ 5 pg/ml。
上文給定EC50
值中的任一值可以與基於細胞的細胞毒性測定的任一種所指示場景組合,例如與隨附實例中描述的方法一致。例如,在使用(人)CD8陽性T細胞或獼猴T細胞系作為效應細胞時,本發明的雙特異性抗體構建體(例如,靶細胞抗原/CD3雙特異性抗體構建體)的EC50
值較佳的是≤ 1000 pg/ml,更較佳的是≤ 500 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 250 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 100 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 50 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 10 pg/ml,最較佳的是≤ 5 pg/ml。如果在這個測定中,靶細胞係經靶抗原(例如,靶細胞抗原CD33)轉染的(人或獼猴)細胞,如CHO細胞,則雙特異性抗體構建體的EC50
值較佳的是≤ 150 pg/ml,更較佳的是≤ 100 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 50 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 30 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 10 pg/ml,最較佳的是≤5 pg/ml。如果靶細胞係(例如,靶細胞抗原的)陽性天然表現細胞系,則EC50
值較佳的是≤ 350 pg/ml,更較佳的是≤ 250 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 200 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 100 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 150 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 100 pg/ml,最較佳的是≤ 50 pg/ml或更低。在使用(人)PBMC作為效應細胞時,雙特異性抗體構建體的EC50
值較佳的是≤ 1000 pg/ml,更較佳的是≤ 750 pg/ml,更較佳的是≤ 500 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 350 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 250 pg/ml,甚至更較佳的是≤ 100 pg/ml,最較佳的是≤ 50 pg/ml或更低。
較佳的是,本發明的雙特異性抗體構建體不誘導/介導靶細胞抗原陰性細胞(如CHO細胞)的裂解或者基本上不誘導/介導該裂解。術語「不誘導裂解」、「基本上不誘導裂解」、「不介導裂解」或「基本上不介導裂解」意味著,本發明的抗體構建體不誘導或介導超過30%、較佳的是不超過20%、更較佳的是不超過10%、特別較佳的是不超過9%、8%、7%、6%或5%的靶細胞抗原陰性細胞的裂解,其中將靶細胞抗原陽性細胞系設定為100%。這通常適用於濃度高達500 nM的抗體構建體。熟悉該項技術者知道如何毫不費力地測量細胞裂解。此外,本說明書教導了如何測量細胞裂解的具體說明。
較佳的是,根據如下時間表投與根據本發明使用的雙特異性抗體構建體,該時間表包含以下步驟:
(a) 投與第一用量的雙特異性抗體構建體,之後
(b) 投與第二用量的雙特異性抗體構建體,其中所述第二用量超過所述第一用量,之後
(c) 投與第三用量的雙特異性抗體構建體,其中所述第三用量超過所述第二用量,視需要之後
(d) 投與第四用量的雙特異性抗體構建體,其中所述視需要的第四用量超過所述第三用量。
與上文一致,進一步較佳的是,第一用量的投與時間段多達七天。第一用量的這個投與時間段可以在投與雙特異性抗體構建體的初始階段/第一週期期間使用,例如以降低患者的腫瘤負荷(腫瘤減積),同時避免如細胞介素風暴和/或細胞介素釋放綜合症等狀況,該等狀況係在投與第一用量的時間段期間使用較高用量的情況下可預期的。
雖然在本發明的一個實施方式中,投與第一用量的時間段長達七天,但是在六天、五天、四天、三天、兩天或一天的時間段中投與此第一用量也在這個較佳的實施方式內。在個別患者的腫瘤負荷或一般狀況確實需要在第一限制用量步驟中投與限制用量的雙特異性抗體構建體的情況下,這個第一用量步驟應理解為導入階段/適應階段,這個階段應避免或限制由於患者與雙特異性抗體構建體首次接觸造成的副作用。對於規範BiTE®
(如CD33XCD3雙特異性抗體構建體,其係54 kDa單鏈多肽),在這個導入階段/適應階段中用量的較佳的範圍可以在1至50 µg/d的範圍內,較佳的是在3至30 µg/d的範圍內,進一步較佳的是在4至20 µg/d的範圍內,並且甚至更較佳的是在5至15 µg/d的範圍內。在一個非常較佳的實施方式中,根據本發明的雙特異性抗體構建體係以10 µg/d的用量來投與。
例如對於規範BiTE®
(如CD33XCD3雙特異性抗體構建體),雙特異性抗體構建體的第二用量的較佳的範圍在10 µg/d至10 mg/d的範圍內,更較佳的是在25 µg/d至1 mg/d的範圍內,並且甚至更較佳的是在30 µg/d至500 µg/d的範圍內。在一個非常較佳的實施方式中,第二用量為30 µg/d或60 µg/d。與上文一致,雙特異性抗體構建體的第三用量的較佳的範圍超過第二用量的相應用量。第三用量典型地在60 µg/d至500 µg/d的範圍內,並且較佳的是根除可能已經逃過等效於根據本發明的第二用量的治療的殘留靶細胞。
令人驚訝地發現,在根據本發明應用包含至少兩個劑量階梯的階梯式給藥時,則可以有效預防免疫副作用(如不期望的細胞介素釋放,例如細胞介素釋放綜合症)。相反,如果在先前不給予等效於本發明的第一用量的較低用量的情況下給予等效於第二劑量的用量,則可能發生副作用(如不期望的細胞介素釋放,例如細胞介素釋放綜合症)。這也適用於關於第二劑量的第三劑量。
對於本發明也較佳的是,投與第一和第二用量的時間段盡可能地短,以盡可能快地達到解決白血病幹細胞的靶用量。對於關於侵襲性和進行性疾病(如AML)的治療成功,這係決定性的。因此,根據本發明的主要成就是提供劑量方案,其具有投與第一劑量僅2或3天、較佳的是2天的時間段,以及投與第二劑量2至4天的時間段。繼而,第三劑量或視需要的第四劑量(即靶劑量)包含較佳的是至少天的延長的投與時間段。
同樣與本發明一致,對於用於治療髓性白血病的雙特異性抗體構建體較佳的是,雙特異性抗體構建體的第一結合結構域包含六個CDR的群組,這六個CDR選自由以下組成之群組:SEQ ID NO: 10至12和14至16、SEQ ID NO: 22至24和26至28、SEQ ID NO: 34至36和38至40、SEQ ID NO: 46至48和50至52、SEQ ID NO: 58至60和62至64、SEQ ID NO: 70至72和74至76、SEQ ID NO: 82至84和86至88、SEQ ID NO: 94至96和98至100。
此外,與本發明一致,對於用於治療髓性白血病的雙特異性抗體構建體較佳的是,雙特異性抗體構建體的第二結合結構域包含六個CDR的群組,這六個CDR選自由以下組成之群組:WO 2008/119567的SEQ ID NO: 9至14、SEQ ID NO: 27至32、SEQ ID NO: 45至50、SEQ ID NO: 63至68、SEQ ID NO: 81至86、SEQ ID NO: 99至104、SEQ ID NO: 117至122、SEQ ID NO: 135至140、SEQ ID NO: 153至158和SEQ ID NO: 171至176。
與第二結合結構域一樣,本發明的抗體構建體的一個或多個第一(或任何其他)結合結構域較佳的是對於靈長類動物的哺乳動物目成員具有跨物種特異性。跨物種特異性CD3結合結構域例如描述於WO 2008/119567中。根據一個實施方式,第一和第二結合結構域除了分別結合至人CD33靶細胞抗原和人CD3以外,還將結合至靈長類動物的CD33靶細胞抗原/CD3,該等靈長類動物包括(但不限於)新大陸靈長類動物(如普通狨、絨頂檉柳猴或松鼠猴)、舊大陸靈長類動物(如狒狒和獼猴)、長臂猿和非人人亞科。普通狨和絨頂檉柳猴都是屬於狨亞科(Callitrichidae
)的新大陸靈長類動物,而松鼠猴係屬於懸猴科(Cebidae
)的新大陸靈長類動物。
在本發明的一個較佳的實施方式中,雙特異性抗體構建體係雙特異性抗體構建體。與上文所提供的定義一致,這個實施方式係關於雙特異性抗體構建體,其為抗體構建體。在本發明的一個較佳的實施方式中,雙特異性抗體構建體係單鏈構建體。與本發明一致,這種雙特異性單鏈抗體構建體可以包含選自以下群組的胺基酸序列,該群組由以下組成:SEQ ID NO: 18、19、20、30、31、32、42、43、44、54、55、56、66、67、68、78、79、80、90、91、92、102、103、104、105、106、107和108。
也考慮了對本文所述的雙特異性抗體構建體的胺基酸序列修飾。例如,可能需要改良雙特異性抗體構建體的結合親和力和/或其他生物特性。雙特異性抗體構建體的胺基酸序列變體係藉由將適當核苷酸變化引入雙特異性抗體構建體核酸中或藉由肽合成來製備。下文所述的所有胺基酸序列修飾應產生仍保留未經修飾親代分子的所需生物活性(結合至靶細胞抗原和CD3)的雙特異性抗體構建體。
術語「胺基酸」或「胺基酸殘基」典型地是指具有本領域公認的定義的胺基酸,如選自由以下組成之群組的胺基酸:丙胺酸(Ala或A);精胺酸(Arg或R);天冬醯胺(Asn或N);天冬胺酸(Asp或D);半胱胺酸(Cys或C);麩醯胺酸(GIn或Q);麩胺酸(GIu或E);甘胺酸(GIy或G);組胺酸(His或H);異亮胺酸(He或I);亮胺酸(Leu或L);離胺酸(Lys或K);甲硫胺酸(Met或M);***酸(Phe或F);脯胺酸(Pro或P);絲胺酸(Ser或S);蘇胺酸(Thr或T);色胺酸(Trp或W);酪胺酸(Tyr或Y);和纈胺酸(VaI或V),但是可視需要使用經修飾的、合成的或稀有的胺基酸。通常,可以將胺基酸分組為具有非極性側鏈(例如,Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、VaI);帶負電側鏈(例如,Asp、GIu);帶正電側鏈(例如,Arg、His、Lys);或不帶電極性側鏈(例如,Asn、Cys、GIn、GIy、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。
胺基酸修飾包括例如雙特異性抗體構建體的胺基酸序列內的殘基的缺失和/或***和/或取代。進行缺失、***和取代的任何組合以得到最終構建體,條件係最終的構建體具有所需特徵。胺基酸變化還可以改變雙特異性抗體構建體的翻譯後處理,如改變糖基化位點的數目或位置。
例如,在每個CDR中可以***或缺失1、2、3、4、5或6個胺基酸(當然,取決於其長度),而在每個FR中可以***或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸。較佳的是,胺基酸序列***包括胺基末端和/或羧基末端融合,長度在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基至含有一百個或更多殘基的多肽的範圍內,以及單一或多個胺基酸殘基的序列內***。本發明的雙特異性抗體構建體的***變體包括雙特異性抗體構建體的N末端或C末端與酶的融合或與多肽的融合,這種融合增加雙特異性抗體構建體的血清半衰期。
增加的半衰期通常可用於體內施用免疫球蛋白,特別是抗體,並且最特別是小尺寸抗體片段。雖然此類基於抗體片段(Fv、二硫鍵鍵合的Fv、Fab、scFv、dAb)的抗體構建體能夠快速到達身體的大部分部位,但是那些抗體構建體可能經歷從身體快速清除。本領域中所述用於延長抗體構建體(如單鏈雙抗體)的半衰期的策略包括聚乙二醇鏈的綴合(聚乙二醇化)、融合至IgG Fc區或者融合至白蛋白或白蛋白結合結構域。
血清白蛋白係肝臟以生理方式產生的蛋白質;其溶解於血漿中存在並且是哺乳動物中最豐富的血液蛋白。白蛋白係維持體液在血管與身體組織之間適當分佈所需膠體滲透壓必需的。其還藉由非特異性結合若干種疏水類固醇激素起血漿載體的作用,並且起氯化血紅素和脂肪酸的轉運蛋白的作用。術語「血清白蛋白」及其人變體(「人白蛋白」)在所發明蛋白質的背景下分別定義親代人血清白蛋白(如SEQ ID NO: 109中所述的序列)或其任何變體(例如,如SEQ ID NO: 110-138中所繪示的白蛋白)或片段,該變體或片段較佳的是作為至少與一種治療性蛋白的遺傳融合蛋白和藉由至少與一種治療性蛋白化學交聯等表現。包含白蛋白的單一或多個突變或片段的變體提供與其親代或參考相比改良的特性,如對FcRn受體的親和力以及延長的血漿半衰期。人白蛋白的變體描述於例如WO 2014/072481中。與本發明一致,血清白蛋白可以藉由肽連接子連接至抗體構建體。較佳的是,肽連接子具有胺基酸序列(GGGGS)n
(SEQ ID NO: 13)n
,其中「n」係在1至5範圍內的整數。進一步較佳的是,「n」係在1至3範圍內的整數,最較佳的是「n」為1或2。
取代誘變最感興趣的位點包括重鏈和/或輕鏈的CDR,特別是超變區,但是也考慮了重鏈和/或輕鏈中的FR改變。取代較佳的是如本文所述的保守取代。較佳的是,可以在CDR中取代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸,而可以在框架區(FR)中取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸,這取決於CDR或FR的長度。例如,如果CDR序列包含6個胺基酸,則設想該等胺基酸中的一個、兩個或三個被取代。類似地,如果CDR序列包含15個胺基酸,則設想該等胺基酸中的一個、兩個、三個、四個、五個、或六個被取代。
鑒定雙特異性抗體構建體中是較佳的誘變位置的某些殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」,如Cunningham和Wells在Science [科學], 244: 1081-1085 (1989)中所述。在此,鑒定雙特異性抗體構建體內的殘基或靶殘基組(例如帶電殘基,如arg、asp、his、lys和glu),並且用中性或帶負電的胺基酸(最較佳的是丙胺酸或聚丙胺酸)替代以影響胺基酸與表位的相互作用。
然後藉由在取代位點處或針對取代位點引入另外的或其他變體來細化那些證實對取代的功能敏感性的胺基酸位置。因此,雖然預先確定用於引入胺基酸序列變化的位點或區域,但突變本身的性質無需預定。例如,為了分析或優化給定位點處突變的性能,可以在靶密碼子或區域處實施丙胺酸掃描或隨機誘變,並且篩選所表現的雙特異性抗體構建體變體以獲得所需活性的最優組合。用於在具有已知序列的DNA中的預定位點進行取代突變的技術係熟知的,例如M13引物誘變和PCR誘變。對突變體的篩選係使用靶抗原結合活性測定來進行。
通常,如果在重鏈和/或輕鏈的一個或多個或所有CDR中取代胺基酸,則較佳的是,隨後獲得的「經取代」序列與「初始」CDR序列至少60%、更較佳的是65%、甚至更較佳的是70%、特別較佳的是75%、更特別較佳的是80%相同。這意指該取代取決於CDR與「經取代」序列的相同程度的長度。例如,具有5個胺基酸的CDR較佳的是與其經取代序列80%相同,以便取代至少一個胺基酸。因此,雙特異性抗體構建體的CDR可以與其經取代序列具有不同程度的同一性,例如,CDRL1可以具有80%同一性,而CDRL3可具有90%同一性。
較佳的取代(或替代)係保守取代。然而,設想了任何取代(包括非保守取代或者一個或多個來自下表1中所列的「示例性取代」的取代),只要雙特異性抗體構建體保留其藉由第一結合結構域結合至靶細胞抗原並藉由第二結合結構域結合至CD3ε的能力和/或其CDR與隨後經取代的序列具有一定同一性(與「初始」CDR序列至少60%、更較佳的是65%、甚至更較佳的是70%、特別較佳的是75%、更特別較佳的是80%同一)即可。
保守取代示於表1中「較佳的取代」標題之下。如果此類取代導致生物活性變化,則可以將在表1中命名為「示例性取代」的、或如在下文進一步參考胺基酸類別所述的更多實質性變化引入,並且篩選產物的所需特徵。
本發明的雙特異性抗體構建體的生物特性的實質性修飾係藉由以下方式來完成:選擇在維持以下的效應方面顯著不同的取代:(a) 取代區域中的多肽骨架的結構,例如呈片層或螺旋構象;(b) 分子在靶位點的電荷或疏水性;或(c)側鏈體積。基於以下常見的側鏈特性將天然存在的殘基分組:(1) 疏水性:正亮胺酸、met、ala、val、leu、ile;(2) 中性親水性:cys、ser、thr、asn、gln;(3) 酸性:asp、glu;(4) 鹼性:his、lys、arg;(5) 影響鏈取向的殘基:gly、pro;和 (6) 芳香族:trp、tyr、phe。
非保守取代將需要該等類別中一個類別的成員與另一種類別交換。不參與維持雙特異性抗體構建體的適當構象的任何半胱胺酸殘基可以被取代,通常經絲胺酸取代,以改良分子的氧化穩定性並防止異常交聯。相反,可以將一個或多個半胱胺酸鍵添加至抗體中以改良其穩定性(特別是在抗體係抗體片段(如Fv片段)的情況下)。
對於胺基酸序列,序列同一性和/或相似性係藉由使用本領域已知的標準技術來確定,該等標準技術包括但不限於局部序列同一性演算法(Smith和Waterman, 1981,Adv. Appl. Math.
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12:387-395所述),較佳的是使用預設設置,或者藉由檢查來進行。較佳的是,同一性百分比係藉由FastDB基於以下參數來計算:錯配罰分為1;空位罰分為1;空位大小罰分為0.33;並且連接罰分為30,「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis [序列比較和分析的當前方法]」, Macromolecule Sequencing and Synthesis [大分子測序與合成], Selected Methods and Applications [所選擇的方法和應用], 第127-149頁 (1988), Alan R. Liss, Inc [阿蘭R.里茲公司]。
有用的演算法的實例係PILEUP。PILEUP使用漸進式成對比對從一組相關序列中創建多序列比對。它還可以繪製顯示用於創建比對的聚類關係的樹狀圖。PILEUP使用進行性比對方法的簡化形式(Feng和Doolittle, 1987,J. Mol. Evol.
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有用的演算法的另一個實例係BLAST演算法,描述於以下文獻中:Altschul等人, 1990,J. Mol. Biol.
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266:460-480獲得。WU-BLAST-2使用多個搜索參數,其中大部分都設定為預設值。用以下值設定可調節參數:重疊跨度 = 1,重疊分數 = 0.125,字閾值(T) = II。HSP S和HSP S2參數係動態值,並且是藉由自身取決於特定序列的組成和特定數據庫(針對其搜索感興趣序列)的組成的程式來確立;然而,可以調節該等值以增加靈敏度。
另一種有用演算法係空位BLAST,如Altschul等人, 1993,Nucl. Acids Res.
[核酸研究]
25:3389-3402所報導。空位BLAST使用BLOSUM-62取代評分;閾值T參數設定為9;兩次命中方法以觸發未空位化延伸,對k的空位長度收取10+k的成本;Xu設定為16,並且對於數據庫搜索階段,Xg設定為40,並且對於演算法輸出階段,Xg設定為67。空位比對由對應於約22比特的評分觸發。
通常,各個變體CDR與本文所繪示的序列之間的胺基酸同源性、相似性或同一性為至少60%,並且更典型地具有至少65%或70%、更較佳的是至少75%或80%、甚至更較佳的是至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和幾乎100%的較佳的是增加的同源性或同一性。以類似方式,關於本文所鑒定的結合蛋白的核酸序列的「核酸序列同一性百分比(%)」定義為候選序列中與雙特異性抗體構建體編碼序列中的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比。具體方法係利用設定為預設參數的WU-BLAST-2的BLASTN模組,重疊跨度和重疊分數分別設定為1和0.125。
通常,編碼各個變體CDR的核苷酸序列與本文所繪示的核苷酸序列之間的核酸序列同源性、相似性或同一性為至少60%,並且更典型地具有至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%和幾乎100%的較佳的是增加的同源性或同一性。因此,「變體CDR」係與本發明的親代CDR具有指定同源性、相似性或同一性的CDR,並且共用生物功能,包括但不限於親代CDR的至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的特異性和/或活性。
在一個實施方式中,將用於根據本發明使用的雙特異性抗體構建體與一種或多種選自由以下組成之群組的表觀遺傳因子組合投與:組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、DNA甲基轉移酶(DNMT)I抑制劑、羥基脲、顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)、組蛋白去甲基酶抑制劑和ATRA(全反式視黃酸),並且其中:
(a) 該一種或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性抗體構建體之前投與;
(b) 該一種或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性抗體構建體之後投與;或
(c) 該一種或多種表觀遺傳因子和雙特異性抗體構建體係同時投與。
結合本發明,術語「表觀遺傳因子」定義能夠在投與後改變細胞群的基因表現或細胞表型的化合物。應理解,這種變化涉及對基因組的一種或多種功能相關修飾,而不涉及核酸序列的變化。此類修飾的實例係DNA甲基化和組蛋白修飾,二者對於在不改變基礎DNA序列的情況下調控基因表現都很重要。
包括投與雙特異性抗體構建體與一種或多種上述表觀遺傳因子的組合的髓性白血病治療的細節已經提供於PCT/EP2014/069575中。
在本發明的一個實施方式中,較佳的是,該一種或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性抗體構建體之前多達七天投與。
同樣在本發明的一個實施方式中,較佳的是,表觀遺傳因子係羥基脲。
對於本發明較佳的是,髓性白血病選自由以下組成之群組:急性骨髓母細胞性白血病、慢性嗜中性球白血病、髓性樹突狀細胞白血病、加速期慢性骨髓性白血病、急性骨髓性單核球白血病、幼年型骨髓性單核球白血病、慢性骨髓單核球白血病、急性嗜鹼球白血病、急性嗜酸球白血病、慢性嗜酸球白血病、急性巨核母細胞白血病、原發性血小板增多症、急性紅系白血病、真性紅血球增多症、脊髓發育不良綜合症、急性全骨髓性白血病、髓樣肉瘤和急性雙表型白血病。更較佳的是,髓性白血病係急性髓性白血病(AML)。AML的定義尤其包括急性骨髓母細胞性白血病、急性髓性樹突狀細胞白血病、急性骨髓性單核球白血病、急性嗜鹼球白血病、急性嗜酸球白血病、急性巨核母細胞白血病、急性紅系白血病和急性全骨髓性白血病。
可以將結合本發明所述的雙特異性抗體構建體配製用於以藥物組成物的形式適當地投與有需要的受試者。
本文所述的配製物可作為藥物組成物用於治療、改善和/或預防有需要的患者的如本文所述的病理性醫學病症。術語「治療」係指治療性治療和預防性(prophylactic或preventative)措施兩者。治療包括將配製物施用或投與至患有疾病/障礙、具有疾病/障礙的症狀或具有患疾病/障礙的傾向的患者的體內、分離的組織或細胞,目的是治癒、痊癒、緩和、減輕、改變、補救、緩解、改善或影響該疾病、該疾障礙狀或患該疾病的傾向。
術語「疾病」係指將受益於用本文所述的雙特異性抗體構建體或藥物組成物治療的任何病症。這包括慢性和急性障礙或疾病,包括那些使哺乳動物易患所考慮疾病的病理性病症。
術語「有需要的受試者」或「需要治療的那些」包括已經患有障礙的那些以及有待預防障礙的那些。有需要的受試者或「患者」包括接受預防性或治療性治療的人及其他哺乳動物受試者。
通常將本發明的雙特異性抗體構建體設計為尤其用於特定的投與途徑和方法,用於特定投與劑量和頻率,用於特定疾病的特定治療,具有生體可用率和持久性範圍。組成物的材料較佳的是以對於投與位點可接受的濃度配製。
因此,可以根據本發明設計配製物和組成物以藉由任何合適的投與途徑遞送。在本發明的背景下,投與途徑包括但不限於
• 局部途徑(如表皮、吸入、鼻、眼、耳(auricular/aural)、***、黏膜);
• 腸內途徑(如口服、胃腸道、舌下、唇下、經頰、直腸);和
• 腸胃外途徑(如靜脈內、動脈內、骨內、肌內、大腦內、腦室內、硬膜外、鞘內、皮下、腹膜內、羊膜外、關節內、心內、真皮內、病灶內、子宮內、膀胱內、玻璃體內、經皮、鼻內、經黏膜、滑膜內、管腔內)。
結合本發明所述的藥物組成物和雙特異性抗體構建體特別可用於腸胃外投與,例如皮下或靜脈內遞送,例如藉由注射(如快速濃注)或藉由輸注(如連續輸注)。藥物組成物可以使用醫療裝置來投與。用於投與藥物組成物的醫療裝置的實例描述於美國專利案號4,475,196、4,439,196、4,447,224、4,447,233、4,486,194、4,487,603、4,596,556、4,790,824、4,941,880、5,064,413、5,312,335、5,312,335、5,383,851和5,399,163中。
特別地,本發明提供了合適的組成物的不間斷投與。作為非限制性實例,可以藉由患者佩戴的用於計量治療劑進入患者體內的流入的小型泵系統來實現不間斷或基本上不間斷(即連續)的投與。包含結合本發明所述的雙特異性抗體構建體的藥物組成物可以藉由使用所述泵系統來投與。此類泵系統在本領域通常是已知的,並且通常依賴於含有待輸注的治療劑的藥筒的定期更換。在更換這種泵系統中的藥筒時,治療劑原本不間斷地進入患者體內的流動可能會發生暫時間斷。在這種情況下,在藥筒更換前的投與階段和藥筒更換後的投與階段仍將被認為在一起構成這種治療劑的一次「不間斷投與」的本發明的藥學手段和方法的含義內。
結合本發明所述的雙特異性抗體構建體的連續或不間斷投與可以是靜脈內或皮下投與,借助流體遞送裝置或小型泵系統進行,包括用於將流體從儲器驅出的流體驅動機構和用於致動驅動機構的致動機構。用於皮下投與的泵系統可以包括用於穿透患者皮膚並將合適的組成物遞送到患者體內的針或套管。所述泵系統可以獨立於靜脈、動脈或血管而直接固定或附接到患者皮膚,從而允許泵系統與患者皮膚直接接觸。泵系統可以附接到患者皮膚上24小時多至數天。泵系統可能尺寸較小,具有小容積的儲器。作為非限制性實例,待投與的合適的藥物組成物的儲器容積可以在0.1與50 ml之間。
連續投與也可以藉由佩戴在皮膚上的貼片經皮投與,並且以一定間隔進行更換。熟悉該項技術者知道適用於該目的的用於藥物遞送的貼片系統。值得注意的是,經皮投與尤其適合於不間斷投與,因為第一用盡的貼片的更換可以有利地與在將新的第二貼片放置在例如緊鄰第一用盡的貼片的皮膚表面上的同時並在即將移除第一耗盡的貼片之前來完成。不會出現流動間斷或電池故障的問題。
如果藥物組成物已被凍乾,則在投與之前首先將凍乾材料在適當液體中重構。可以將凍乾材料在例如抑菌注射用水(BWFI)、生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或與冷凍乾燥前蛋白質所處於的相同配製物中重構。
可以將本發明的組成物以合適的用量投與受試者,該用量可以藉由用量遞增研究,藉由將增加用量的展現本文所述跨物種特異性的結合本發明所述的雙特異性抗體構建體投與非黑猩猩靈長類動物(例如獼猴)來確定。如上所述,展現本文所述跨物種特異性的結合本發明所述的雙特異性抗體構建體可以有利地以相同形式用於非黑猩猩靈長類動物的臨床前測試中以及作為藥物用於人類中。劑量方案將由主治醫師和臨床因素決定。如在醫學領域中熟知的,任何一名患者的劑量取決於許多因素,包括患者體型、體表面積、年齡、有待投與的具體化合物、性別、投與時間和途徑、一般健康狀況和同時投與的其他藥物。
術語「有效用量」或「有效劑量」定義為足以實現或至少部分實現所需效果的量。術語「治療有效用量」定義為足以治癒或至少部分阻止已患疾病的患者的疾病及其併發症的量。對此用途有效的量或用量將取決於有待治療的病症(適應症)、所遞送的雙特異性抗體構建體、治療背景和目標、疾病的嚴重程度、先前療法、患者的臨床病史和對治療劑的反應、投與途徑、患者的體型(體重、體表或器官大小)和/或狀況(年齡和一般健康狀況)、以及患者自體免疫系統的一般狀態。可以根據主治醫生的判斷調整適當的用量,使得它可以一次投與至患者或經一系列投與而投與至患者,並且以便獲得最佳治療效果。
結合本發明所述的雙特異性抗體構建體的治療有效量較佳的是導致疾病症狀的嚴重程度降低、無疾病症狀期的頻率或持續時間增加或對疾病困擾所致的損傷或殘疾的預防。對於治療表現靶細胞抗原的腫瘤,治療有效量的結合本發明所述的雙特異性抗體構建體(例如,抗靶細胞抗原/抗CD3抗體構建體)較佳的是相對於未治療患者,將細胞生長或腫瘤生長抑制至少約20%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。可以在預測在人腫瘤中的功效的動物模型中評價化合物抑制腫瘤生長的能力。
藥物組成物可以作為單獨的治療劑或與另外的療法(如視需要的抗癌療法,例如其他蛋白質和非蛋白質藥物)組合投與。該等藥物可以與如本文所定義的包含結合本發明所述的雙特異性抗體構建體的組成物同時投與,或在投與所述雙特異性抗體構建體之前或之後以時間限定的間隔和用量分開投與。
另外,本發明人觀察到,可以借助糖皮質素(前)和/或(共)治療來預防或緩和稀有副作用(如免疫副作用)。
因此,本發明確立,糖皮質素(如***)減輕或甚至預防在用根據本發明的CD33/CD3特異性雙特異性抗體構建體治療的過程中可能出現的不良反應。
糖皮質素(GC)仍然是最廣泛使用的用於治療炎性障礙和自身免疫疾病的免疫抑制劑。糖皮質素(GC)係一類類固醇激素,其結合至糖皮質素受體(GR),該受體存在於包括人類在內的幾乎每一種脊椎動物細胞中。該等化合物係有效的消炎劑,與炎症病因無關。糖皮質素尤其藉由抑制編碼細胞介素IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8和IFN-γ的基因來抑制細胞介導的免疫力。
屬於GC組的皮質酮係重要的治療藥物,其用於對抗介於艾迪森氏病(Addison's disease)至類風濕性關節炎範圍內的多種疾病。自從發現其抗風濕特性(導致其作為奇效藥物而受到歡迎)起,已經生產出皮質酮的多種具有更好抵抗特定疾病的增強特性的衍生物。皮質酮屬於稱為皮質類固醇的類固醇組。該等類固醇由腎上腺皮質產生,腎上腺皮質係腎臟附近的腎上腺的外層部分。將皮質類固醇分為兩個主要組:控制脂肪、蛋白質、鈣和碳水化合物代謝的糖皮質素(GC);和控制鈉和鉀水平的鹽皮質激素。皮質酮屬於前一組,即屬於GC。皮質酮及其多種衍生物用於多種疾病。由於皮質酮能夠使身體針對存於所植入器官中的外來蛋白質的防禦反應降至最低,並由此使對所植入器官的功能的損害降至最低,皮質酮也有助於實現器官移植。然而,雖然已在臨床使用超過50年,但GC對免疫系統中不同細胞區室的特異性抗炎效應仍未明瞭。GC影響免疫系統中的幾乎每個細胞,並且有越來越多的證據顯示細胞類型特異性機制。
在一個具體實施方式中,本發明係關於用於改善、治療或預防由CD33/CD3雙特異性抗體構建體引起的不良反應的糖皮質素(GC)。如上文所概述,該等不期望的不良反應可以藉由如本文所述的階梯式給藥來預防。然而,僅為了謹慎起見,可以提供一種或多種糖皮質素用於改善、治療或預防患者的(免疫)不良反應,其中所述患者經歷使用CD33/CD3雙特異性抗體構建體的治療。因此,在另一個方面中,本發明係關於糖皮質素(GC),其用於改善、治療或預防由根據本發明的CD33/CD3雙特異性抗體構建體引起的免疫不良反應的方法中。
本發明還是關於改善、治療或預防由CD33/CD3雙特異性抗體構建體引起的免疫不良反應的方法,所述方法包括向有需要的患者投與IL-6R 阻斷抗體托珠單抗(tocilizumab)或糖皮質素(GC)。GC較佳的是以足以改善、治療或預防由CD33/CD3雙特異性抗體構建體引起的所述免疫不良反應的量來投與。
術語「糖皮質素」意指較佳的是特異性結合至糖皮質素受體的化合物。所述術語包括一種或多種選自由以下組成之群組的化合物:皮質酮、皮質醇(氫皮質酮)、氯潑尼醇、潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、地夫可特(deflazacort)、氟可龍(fluocortolone)、曲安西龍(triamcinolone)、***(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、可的伐唑(cortivazol)、帕拉米松(paramethasone)和/或氟替卡松(fluticasone),包括其藥學上可接受的衍生物。在本發明實施方式的背景下,所提及的化合物可以單獨或組合使用。***係較佳的。然而,本發明並不限於上文所提及的特定GC。設想,已經或將要分類為「糖皮質素」的所有物質也都可以用於本發明的背景下。此類未來糖皮質素包括特異性結合至並激活糖皮質素受體的化合物。根據本發明,術語「特異性結合至GC受體」意味著,如與蛋白質/受體一般性締合(即,非特異性結合)相比,GC(或假定作用類似於GC的化合物)與GC受體(還稱為NR3C1)締合(例如,相互作用)至統計學上顯著的程度。在GC受體結合至糖皮質素時,其主要作用機制係調控基因轉錄。在不存在GC的情況下,糖皮質素受體(GR)駐留於與多種蛋白質複合的胞質溶膠中,該等蛋白質包括熱休克蛋白90(hsp90)、熱休克蛋白70(hsp70)和蛋白FKBP52(FK506結合蛋白52)。GC與糖皮質素受體(GR)的結合導致釋放熱休克蛋白。因此設想,未來GC或者GC的藥學上可接受的衍生物或鹽較佳的是能夠結合至GC受體並釋放上文所提及的熱休克蛋白。所激活的GR複合物上調細胞核中抗炎蛋白的表現或阻遏胞質溶膠中促炎蛋白的表現(藉由防止其他轉錄因子從胞質溶膠易位至細胞核中)。
在一個較佳的實施方式中,所述GC選自臨床上使用最多且相關的GC,如***、丙酸氟替卡松、普賴蘇穠、甲潑尼龍(methylprednisolone)、倍他米松(betamethasone)、曲安奈德(triamcinolonacetonide)或其組合。
在一個甚至更較佳的實施方式中,所述GC係***。
在最常用的類固醇中,***具有最高糖皮質素潛能,並且還具有最長半衰期(參見下表2)。但是熟悉該項技術者可以選擇其他已知糖皮質素中的一種,該等糖皮質素中的一些揭露於本文中,並選擇適當有效用量以改善或預防可源自對有需要的患者的治療的免疫不良事件。
***在惡性中樞神經系統(CNS)疾病(例如CNS淋巴瘤或腦轉移)中也具有有益效應,可能是由於特異性穿透至CNS中所致。其還優先(相對於其他類固醇)用於治療腦水腫。雖然皮質類固醇降低腫瘤本身中的毛細血管通透性,但是已經在動物模型中發現,***能以不同方式作用並藉由對離開腫瘤的總體流量的效應降低水腫(Molnar, Lapin和Goothuis, 1995, Neurooncol. [神經腫瘤學] 1995;25(1):19-28)。
對於結合CD33/CD3雙特異性抗體構建體的應用的臨床試驗,本發明人已經研發出有效並且可被大多數患者良好耐受的治療方案。為此,本發明人應用如本文所概述的CD33/CD3雙特異性抗體構建體的逐步施用。因此,可以在數量上減少、改善並且甚至預防不良反應。
待根據本發明實施方式使用的GC的用量不受限制,即其將取決於個別患者的情況。GC可以靜脈內或口服投與。然而,GC的較佳的劑量包括介於給藥下限的1至6 mg(***當量)至40 mg(***當量)之間。所述劑量可以全部一次性投與或細分為較小劑量。細分用量係較佳的,其中在根據如本文所述的階梯式給藥輸注第一和/或第二用量之前投與一個用量的GC,並且在根據如本文所述的階梯式給藥投與第二或第三用量之前投與另一個用量的GC。因此,GC較佳的是每個治療週期給藥兩次。甚至更較佳的是,GC係在開始治療週期之前或在開始投與所述治療週期內的下一較高用量之前24 h或8 h或4 h或1 h投與一次。就此而言,1 h係最較佳的。用量為每次1至40 mg,較佳的是5至20 mg,最較佳的是每次8 mg。「d」表示一天。可從隨附實例推導其他劑量方案。在這個段落中給出的所有劑量都涉及***當量。
如本文所用的術語「有效且無毒的用量」係指雙特異性抗體構建體的可耐受用量,其高至足以引起病理細胞耗盡、腫瘤消除、腫瘤縮小或疾病穩定化,但不引起或基本上不引起嚴重毒性效應。此類有效且無毒的用量可以例如藉由本領域中所述的用量遞增研究來確定,並且應低於誘導嚴重不良副作用(用量限制毒性,DLT)的用量。
可替代地,托珠單抗可以用於術前用藥中。
如本文所用的術語「毒性」係指在不良事件或嚴重不良事件中表現的藥物的毒性效應。該等副作用可能是指投與後缺乏系統性藥物耐受性和/或缺乏局部耐受性。毒性還可能包括由藥物引起的致畸或致癌效應。
如本文所用的術語「安全性」、「體內安全性」或「耐受性」定義在投與後(局部耐受性)以及在施用藥物的較長時間段期間在不直接誘發嚴重不良事件的情況下投與藥物。例如,可以在治療和隨訪期期間以規律的間隔評價「安全性」、「體內安全性」或「耐受性」。測量包括臨床評價(例如器官表現)以及實驗室異常的篩選。可以進行臨床評價,並且根據NCI-CTC和/或MedDRA標準記錄/編碼與正常發現的偏差。器官表現可以包括如過敏/免疫學、血液/骨髓、心律失常、凝血等標準,如例如不良事件的通用術語標準v4(CTCAE)中所述的。可以測試的實驗室參數包括例如血液學、臨床化學、凝血特徵和尿液分析以及其他體液(如血清、血漿、淋巴或脊髓液、液體等)的檢查。因此,安全性可以藉由例如身體檢查、成像技術(即超音波波、x射線、CT掃描、磁共振成像(MRI)、其他具有技術裝置的措施(即心電圖術))、生命體征、藉由測量實驗室參數和記錄不良事件來評估。例如,根據本發明的用途和方法中非黑猩猩靈長類動物中的不良事件可以藉由組織病理學和/或組織化學方法進行檢查。
上述術語在例如以下文獻中也被提及:Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6 [生物技術衍生的藥物的臨床前安全性評價S6]; ICH Harmonised Tripartite Guideline [ICH三方協調指南]; 於1997年7月16日的ICH Steering Committee [ICH指導委員會]會議。
在本發明方法的一個較佳的實施方式中,僅第一治療週期包含根據步驟(a)投與,而後續週期以根據步驟 (b)、(c) 或(d)的用量開始。
對於本發明方法較佳的是,雙特異性抗體構建體的第一結合結構域包含六個CDR的群組,這六個CDR選自由以下組成之群組:SEQ ID NO: 10至12和14至16、SEQ ID NO: 22至24和26至28、SEQ ID NO: 34至36和38至40、SEQ ID NO: 46至48和50至52、SEQ ID NO: 58至60和62至64、SEQ ID NO: 70至72和74至76、SEQ ID NO: 82至84和86至88、SEQ ID NO: 94至96和98至100。
同樣與本發明方法的一個較佳的實施方式一致,雙特異性抗體構建體的第二結合結構域包含六個CDR的群組,這六個CDR選自由以下組成之群組:WO 2008/119567的SEQ ID NO: 9至14、SEQ ID NO: 27至32、SEQ ID NO: 45至50、SEQ ID NO: 63至68、SEQ ID NO: 81至86、SEQ ID NO: 99至104、SEQ ID NO: 117至122、SEQ ID NO: 135至140、SEQ ID NO: 153至158和SEQ ID NO: 171至176。
在本發明方法的一個較佳的實施方式中,雙特異性抗體構建體係雙特異性抗體構建體。
此外,對於本發明方法較佳的是,該雙特異性抗體構建體係單鏈構建體,該單鏈構建體包含選自以下群組的胺基酸序列,該群組由以下組成:SEQ ID NO: 18、19、20、30、31、32、42、43、44、54、55、56、66、67、68、78、79、80、90、91、92、102、103、104、105、106、107和108。
在本發明方法的一個實施方式中,雙特異性抗體構建體與一種或多種選自由以下組成之群組的表觀遺傳因子組合投與:組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、DNA甲基轉移酶(DNMT)I抑制劑、羥基脲、顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)、組蛋白去甲基酶抑制劑和ATRA(全反式視黃酸),並且其中:
(a) 該一種或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性抗體構建體之前投與;
(b) 該一種或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性抗體構建體之後投與;或
(c) 該一種或多種表觀遺傳因子和雙特異性抗體構建體係同時投與。
對於本發明方法較佳的是,該一種或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性抗體構建體之前多達七天投與。
對於本發明方法的一個實施方式,較佳的是,表觀遺傳因子係羥基脲。
如上文所述,與本發明一致,髓性白血病選自由以下組成之群組:急性骨髓母細胞性白血病、慢性嗜中性球白血病、髓性樹突狀細胞白血病、加速期慢性骨髓性白血病、急性骨髓性單核球白血病、幼年型骨髓性單核球白血病、慢性骨髓性單核球白血病、急性嗜鹼球白血病、急性嗜酸球白血病、慢性嗜酸球白血病、急性巨核母細胞白血病、原發性血小板增多症、急性紅系白血病、真性紅血球增多症、脊髓發育不良綜合症、急性全骨髓性白血病、髓樣肉瘤和急性雙表型白血病。較佳的是,髓性白血病係急性髓性白血病(AML)。
在一個實施方式中,本發明還提供了包含特異性結合至CD33的第一結合結構域和特異性結合至CD3的第二結合結構域的雙特異性抗體構建體的較佳的是用於製備治療髓性白血病的藥物組成物的用途,其中將在超過14天中投與雙特異性抗體構建體,之後是至少14天不投與該構建體的時間段。
對於本發明用途較佳的是,將根據如下時間表投與雙特異性抗體構建體,該時間表包含以下步驟:
(a) 投與第一用量的雙特異性抗體構建體,之後
(b) 投與第二用量的雙特異性抗體構建體,其中所述第二用量超過所述第一用量,之後
(c) 投與第三用量的雙特異性抗體構建體,其中所述任選第三用量超過所述第二用量,視需要之後
(d) 投與第四用量的雙特異性抗體構建體,其中所述任選第三用量超過所述第三用量。
在本發明用途的一個較佳的實施方式中,僅第一治療週期包含根據步驟(a)投與,而後續週期以根據步驟 (b)、(c) 或(d)的用量開始。
對於本發明用途較佳的是,雙特異性抗體構建體的第一結合結構域包含六個CDR的群組,這六個CDR選自由以下組成之群組:SEQ ID NO: 10至12和14至16、SEQ ID NO: 22至24和26至28、SEQ ID NO: 34至36和38至40、SEQ ID NO: 46至48和50至52、SEQ ID NO: 58至60和62至64、SEQ ID NO: 70至72和74至76、SEQ ID NO: 82至84和86至88、SEQ ID NO: 94至96和98至100。
同樣與本發明用途的較佳的實施方式一致,雙特異性抗體構建體的第二結合結構域包含六個CDR的群組,這六個CDR選自由以下組成之群組:WO 2008/119567的SEQ ID NO: 9至14、SEQ ID NO: 27至32、SEQ ID NO: 45至50、SEQ ID NO: 63至68、SEQ ID NO: 81至86、SEQ ID NO: 99至104、SEQ ID NO: 117至122、SEQ ID NO: 135至140、SEQ ID NO: 153至158和SEQ ID NO: 171至176。
在本發明用途的一個較佳的實施方式中,雙特異性抗體構建體係雙特異性抗體構建體。
此外,對於本發明用途較佳的是,該雙特異性抗體構建體係單鏈構建體,該單鏈構建體包含選自以下群組的胺基酸序列,該群組由以下組成:SEQ ID NO: 18、19、20、30、31、32、42、43、44、54、55、56、66、67、68、78、79、80、90、91、92、102、103、104、105、106、107和108。
在本發明用途的一個實施方式中,雙特異性抗體構建體與一種或多種選自由以下組成之群組的表觀遺傳因子組合投與:組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、DNA甲基轉移酶(DNMT)I抑制劑、羥基脲、顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)、組蛋白去甲基酶抑制劑和ATRA(全反式視黃酸),並且其中:
(a) 該一種或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性抗體構建體之前投與;
(b) 該一種或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性抗體構建體之後投與;或
(c) 該一種或多種表觀遺傳因子和雙特異性抗體構建體係同時投與。
對於本發明用途較佳的是,該一種或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性抗體構建體之前多達七天投與。
對於本發明用途的一個實施方式,較佳的是,表觀遺傳因子係羥基脲。
如上文所述,與本發明一致,髓性白血病選自由以下組成之群組:急性骨髓母細胞性白血病、慢性嗜中性球白血病、髓性樹突狀細胞白血病、加速期慢性骨髓性白血病、急性骨髓性單核球白血病、幼年型骨髓性單核球白血病、慢性骨髓性單核球白血病、急性嗜鹼球白血病、急性嗜酸球白血病、慢性嗜酸球白血病、急性巨核母細胞白血病、原發性血小板增多症、急性紅系白血病、真性紅血球增多症、脊髓發育不良綜合症、急性全骨髓性白血病、髓樣肉瘤和急性雙表型白血病。較佳的是,髓性白血病係急性髓性白血病(AML)。
認為對本發明方法敏感的患者群體係在一個或多個療程後持續或復發的如WHO分類所定義的AML,但前骨髓性細胞白血病(APML)除外。患者群體可能包含繼發於先前脊髓發育不良綜合症的AML。較佳的是,該患者群體包含在至少1個原發性誘導過程後持續/難治(即,在至少1個先前化學治療週期後無反應)或在已實現對化學療法的初始反應後復發的如WHO分類所定義的AML,但前骨髓性細胞白血病(APML)除外並且繼發於先前脊髓發育不良綜合症的AML除外。另外,較佳的患者群體的特徵在於,骨髓中具有超過1%的母細胞,較佳的是超過5%的母細胞。典型地,患者群體ECOG體能狀態低於2。通用定義
應指出的是,除非上下文另有明確指明,否則如本文所用,單數形式「一種(a)」、「一種(an)」和「該(the)」包括複數個指示物。因此,例如,對「試劑」的提及包括此類不同試劑中的一種或多種,並且對「該方法」的提及包括提及熟悉該項技術者已知的可以修改或取代本文所述的方法的等效步驟和方法。
除非另外指明,否則在一系列元素前面的術語「至少」應被理解為指該系列中的每一個元素。熟悉該項技術者僅使用常規實驗就將認識到或能夠確定本文所述的本發明的具體實施方式的許多等效物。此類等效物旨在由本發明所涵蓋。
術語「和/或」無論在本文何處使用時包括「和」、「或」和「由所述術語連接的要素的全部或任何其他組合」的含義。
如本文所用的術語「約」或「大約」意指在給定值或範圍的± 20%內,較佳的是在± 15%內,更較佳的是在± 10%內,最較佳的是在± 5%內。
貫穿本說明書及其後的申請專利範圍,除非上下文另有要求,否則詞語「包含(comprise)」以及變型如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」應當被理解成隱含包括所陳述的整體或步驟或者整體或步驟的組,但不排除任何其他整體或步驟或者整體或步驟的組。當在本文中使用時,術語「包含(comprising)」可以用術語「含有(containing)」或「包括(including)」來取代,或者有時在本文中使用時用術語「具有(having)」來取代。
當在本文中使用時,「由......組成(consisting of)」排除了在申請專利範圍要素中未指定的任何要素、步驟或成分。當在本文中使用時,「基本上由......組成(consisting essentially of)」並不排除不實質性地影響申請專利範圍的基本和新穎特徵的材料或步驟。
在本文的每種情況下,術語「包含」、「基本上由......組成」和「由......組成」中的任一者都可以用另外兩個術語中的任一者來替換。
應理解,本文中的發明並不限於特定的方法、方案或試劑,因為該等可以變化。本文所提供的討論和實例僅呈現用於描述特定實施方式的目的,並非旨在限制本發明的範圍,本發明的範圍只由申請專利範圍來限定。
本說明書全文中引用的所有出版物和專利(包括所有專利、專利申請、科學出版物、製造商的說明書、說明書等)(無論是上文還是下文)均藉由引用以其整體而特此併入。本文沒有任何內容應解釋為承認本發明無權由於先前發明而早於該等揭露內容。藉由引用併入的材料在一定程度上與本說明書發生衝突或不一致時,本說明書將替代任何此類材料。實例:
提供以下實例用於說明本發明的具體實施方式或特徵的目的。不應將該等實例解釋為限制本發明的範圍。包括該等實例用於說明的目的,並且本發明只由申請專利範圍來限制。實例 1 :
這項研究的目標係評價呈現r/r AML的患者的結果。
方法
數據來源自MD安德森癌症中心白血病中心數據儲存庫(MD Anderson Cancer Center Leukemia Central Data Repository),其係反映患有白血病的患者的經歷的臨床數據的綜合性保藏中心。在2002年與2016年之間,在MDACC針對r/r AML所包括患者治療了至少一個療程。在納入這項研究中時,患者已有至少一次先前治療失敗,在AML診斷時≥ 18歲,並且沒有睾丸或CNS髓外疾病。不包括急性前骨髓性細胞白血病診斷。
用平均值和標準差和/或中值和四分位距來歸納患者的描述性特徵。將完全緩解(CR)和具有不完全血液學恢復的完全緩解(CRi)比率描述為具有Wald 95%置信區間的比例。使用Kaplan-Meier中值估計事件發生時間分析,並且以Wald 95%置信區間以特定時間間隔3/6/9/12個月估計概率。亞組分析使用Wald卡方檢驗。
結果
總共納入1021名患者。所納入患者的中值年齡為60歲,43%(n = 439)的患者的首次復發/難治性AML發生於2011年-2016年。至少一種細胞遺傳學異常存在於該群體的53.3%(n = 546)中,34.5%(n = 352)具有前驅血液學疾病史,並且10.5%(n = 107)患有治療誘導的AML。對於具有可獲得的誘導記錄的患者,大約46%(295/635)係難治性的。在實現針對誘導的CR的患者中,45%(118/264)的CR持續時間< 6個月。
總體上,所有r/r AML患者中僅少部分能夠實現第二完全緩解(CR2)。CR率隨著每次後續挽救嘗試而降低(表1)。比率在年齡> 60歲的患者中較低。在各種類型的挽救方案中,CR範圍為0至36%。基於高用量阿糖胞苷的方案最常用(n = 299)。雖然樣本大小適中,但是含有FLT3抑制劑的方案誘導最高的CR和CR/CRi率(36% CR2,33% CR3)(表2)。年齡、細胞遺傳學、前驅疾病、首次緩解的持續時間和復發年份與CR率相關。
總體存活和無事件存活適中並隨著後續挽救而降低(表3)。年齡、細胞遺傳學、前驅疾病、新發/療法誘導的AML、首次緩解的持續時間和血小板計數與存活相關。
結論
總體上,大多數患者未能實現第2或以上之CR2。較少患者在第二次治療失敗或復發後能夠實現後續CR。EFS由於大多數患者未能實現CR而較短。即使在第一次挽救時,OS也短於1年。該等數據證實,復發性或難治性AML患者具有較差的總體結果,並且需要用於患者的其他選擇。該等數據可以用於説明指導研發針對多種不同終點的AML中的新方案和治療選擇。實例 2
這項研究的目標係評價CD33XCD3雙特異性抗體構建體在R/R AML中的安全性、藥物動力學 和藥效學,並估計最大耐受用量。
方法(參見圖 1 ):
這係1期用量遞增研究,其在患有R/R AML的患者中評價作為連續靜脈內輸注的CD33xCD3雙特異性抗體構建體,其中單一患者群組用於最初3個用量,並且隨後每個群組有3-6名患者(NCT02520427)。反應符合修訂的IWG標準,其中添加了具有部分血液學恢復的完全反應(CR)。在沒有出現用量限制性毒性(DLT)的情況下完成第一週期後,可以再給予多達5個週期以實現臨床益處。在30 μg/天(d)群組後,實施針對細胞介素釋放綜合症(CRS)的風險減輕措施,包括階梯式給藥和用單一用量的皮質類固醇進行預治療。經修改的治療方案由10 μg/d × 4d的初始導入用量和之後的靶用量組成。然後測試2階式方案,即10 μg/d、60 μg/d,然後投與靶用量,持續14d或28d的治療持續時間,之後1-4週中止治療。
結果(參見表 1 至 3 、圖 2 至 4 ):
在這項正在進行的研究中,已經將35名患者招募於12個用量群組中,其中靶用量範圍為0.5-480 μg/d。超過一半(20/35,57%)的患者為男性並且中值年齡為58(範圍:18-80)歲;14/35(40%)先前已接受幹細胞移植。在基線時中值AML疾病持續時間為1.3(範圍:0.3-9.6)年,在基線時母細胞的中值比例為37%(範圍:3%-95%),並且先前治療的中值數目為4(範圍:1-15)。中值基線ANC為0.2(範圍:0-8.6) × 109
/L。
患者接受中值為1(範圍:1-6)個週期的CD33xCD3雙特異性抗體構建體;31/35(89%)的患者因疾病進展(n = 24)、不良事件(AE;n = 5,2名與治療相關)和患者要求(n = 2)而中斷治療。一名患者完成所允許的最多6個週期,並且3名患者仍在接受研究藥物。在23/35(66%)的患者中見到嚴重AE(SAE)(在15名患者中與治療相關);在> 1名患者中見到的SAE包括CRS(n = 11)、發熱性嗜中性粒細胞減少症(n = 6)、肺炎(n = 4)、白血球減少症(n = 3)、血小板減少症(n = 2)和硬膜下血腫(n = 2);1名患者在研究中因AML進展而死亡(與治療無關)。10 μg/d和30 μg/d群組(無引入)中各有一名患者經歷嚴重CRS;使用皮質類固醇、血管加壓藥和IV流體使CRS體征和症狀在1d內消退,並間斷CD33xCD3雙特異性抗體構建體。使用480 μg/d的靶用量時存在2級CRS和4級心室顫動的DLT;然後將靶用量降低至240 μg/d。
兩名患者在240 μg/d的靶用量下具有CR(10 μg/d→60 μg/d的引入);在120 μg/d和240 μg/d的靶用量下各有1名患者具有CRi,並且1名接受1.5 μg/d的患者具有形態學無白血病狀態(MLFS,< 5%母細胞,無血液學恢復)。藉由流動式細胞術測得,截至d29,1名具有CR的患者的骨髓母細胞從約5%-10%(由於斑片狀疾病所致的估計值)下降至2.5%,沒有殘留AML和正常細胞至過多細胞骨髓以及外周血計數恢復的形態學證據。在接受一個週期的CD33xCD3雙特異性抗體構建體後,截至d42,第二名CR患者的母細胞從40%下降至3%,具有外周血計數恢復。將呈現相關數據。
結論:
以高達480 μg/d給藥的CD33xCD3雙特異性抗體構建體的初步數據提供了在深度預治療的患有R/R AML的患者中的耐受性和抗白血病活性的鼓勵性的早期證據。藉由階升(step-up)式給藥、皮質類固醇預治療、IV流體、托珠單抗和藥物間斷(如果需要)減輕預期的CRS;大多數患者具有短CRS時間段,這對治療反應良好。在未來將使用2階式方法以快速達到靶用量並優化臨床反應。迄今,在120 μg/d和240 μg/d的靶用量下已經觀察到2個CR和2個CRi。由於幾乎所有患者在基線時都基本上患有血細胞減少,所以難以評價CD33xCD3雙特異性抗體構建體對血細胞減少的影響。值得注意的是,兩名CR患者在一個治療週期後都具有血細胞計數的完全恢復。該等有前景的數據確認了BiTE®
平台靶向CD33的用途。實例 3
這項研究的目標係縮短CD33xCD3雙特異性抗體構建體的用量限制性毒性(DLT)窗口。應用於其他實例中的DLT窗口包括治療週期(例如,4週)以及週期結束後例如2週的另外的無治療時間段。這項研究集中於實際治療期並在第一週期後從DLT窗口去除週期後2週時間段。
結論
:該等變化改良了已招募的和未來的受試者中SEQ ID NO: 104的益處:風險比(benefit:risk profile)。研究20120252設計為評價SEQ ID NO: 104在患有復發性或難治性急性髓性白血病(AML)的患者中的安全性、耐受性、藥物動力學 、藥效學和功效,並且目前正在德國、荷蘭和美國(US)實施。
更新 DLT 窗口的原理:
將2週停藥時間段預先添加至DLT窗口中以在實現完全反應(CR)的患者中監測外周血細胞恢復的動力學。由於成熟髓系細胞和髓系祖細胞表現CD33,問題在於用SEQ ID NO: 104治療可能導致抑制骨髓譜系,反映為持久的骨髓抑制。為了研究SEQ ID NO: 104對骨髓譜系的效應,在所治療的所有受試者中分析絕對嗜中性白血球計數(ANC)。用二用量階梯時間表(即,時間表3:10 µg/天的第一用量階梯,之後是60 µg/天的第二用量階梯,之後是靶用量)治療招募於群組11、12和13中的受試者。對個別受試者結果的審查顯示,在群組11-13中治療的大多數受試者在基線時患有3-4級嗜中性粒細胞減少症,這反映潛在疾病的性質(圖6)。對於按照時間表1(群組1-5,靶用量遞增,無用量階梯)和時間表2(群組6-10,一個10 µg/天的用量階梯,之後是靶用量)治療的受試者獲得類似結果(數據未顯示)。
大多數受試者保持嗜中性白血球減少,但一些受試者顯示在SEQ ID NO: 104治療期間嗜中性白血球計數改良。對來自每一群組的數據的審查未顯示嗜中性白血球計數在基線與治療週期結束之間有任何臨床上有意義的變化。此外,在群組11-13中治療的大多數受試者由於疾病進展而未完成最後2週的DLT時間段(即,停藥時間段)。然而,在群組11和12種治療的2名受試者實現具有完全血液學恢復的CR,表明SEQ ID NO: 104可能不干擾正常的血細胞生成。
顯示在DLT窗口期間,在群組11(240 µg)、12(240 µg)和13(360 µg)中,所治療患者的外周血中的絕對嗜中性白血球計數(圖6)。顯示平均值 ± SE。G4線(下線)和G3線(上線)顯示依據CTCAE的4級和3級嗜中性粒細胞減少症。
除了分析FIH研究中的臨床數據以外,在符合Good Laboratory Practice [優良實驗室規範](GLP)的28天重複用量毒理學研究(研究119422,SEQ ID NO: 104:食蟹猴中的28天連續靜脈內輸注或皮下毒理學研究)中在食蟹猴中評價連續靜脈內(CIV)或皮下(SC)投與的SEQ ID NO: 104對循環單核細胞和嗜中性白血球的潛在效應。在研究前(兩次)和第1天(4 hr)、第2天、第10天和第29天進行血液學評估。在第1天或第2天檢測到3、10和30 µg/kg/天CIV和25 ug/kg/天SC用量組中的單核細胞和/或10和30 µg/kg/天CIV和25 µg/kg/天SC用量組中的嗜中性白血球的減少。將該等減少按照5分式量表(最低、輕度、中度、顯著、嚴重)評級為「輕度至顯著」。循環單核細胞數截至第29天有利地恢復至用量前值,並且循環嗜中性白血球數截至第29天恢復至用量前值。因此,對於維持藥物暴露至第28天的3、10和30 µg/kg/天CIV組中的動物,SEQ ID NO: 104誘導的循環髓系細胞的減少只是短暫的。
雖然血小板係CD33陰性的並且不被SEQ ID NO: 104直接靶向,但是其源自表現CD33的髓系祖細胞。因此,評估外周血中的血小板計數以評價SEQ ID NO: 104對普通髓系祖細胞的潛在抑制效應。對在群組11-13中治療的受試者中血小板數的分析顯示,大多數受試者在基線時患有血小板減少症。對在用SEQ ID NO: 104治療期間的血小板動力學的審查未揭示與基線相比,血小板數的任何臨床上有意義的變化(圖7)。這個發現與毒理學研究結果一致,顯示在食蟹猴中藉由CIV途徑投與≥ 10 µg/kg/天的SEQ ID NO: 104僅導致短暫且極小的血小板計數降低。
顯示在DLT窗口期間,在群組11(240 µg)、12(240 µg)和13(360 µg)中,所治療受試者的外周血中的血小板計數。顯示平均值 ± SE。G4線(下線)和G3線(上線)顯示依據CTCAE的4級和3級嗜中性粒細胞減少症。
已經在研究20120252中將CRS定義為在中靶毒性。為了理解CRS發作和消退的動力學,分析在群組11、12和13中按照當前時間表治療的受試者的可得數據。所有CRS事件的發作均發生於SEQ ID NO: 104用量(即用量階梯和/或靶用量)的最初10天內或之後不久。在群組1-10中治療的受試者中觀察到類似動力學(數據未顯示)。這個發現與當前知識一致,即CRS係在用量投與或用量增加後早期觀察到的急性毒性。迄今尚未在受試者中觀察到延遲的CRS。因此,所提出的DLT窗口(總共4週,其中至少14天投與靶用量)為CRS提供了足夠的消退時間。另外,在2-3級CRS於7天內未消退的情況下,將其歸類為符合方案的DLT。
顯示在DLT窗口期間,在群組11(240 µg)、12(240 µg)和13(360 µg)中,所治療患者中的CRS的發作和消退。在左側,數據顯示初始用量,並且用量的重新開始導致DLT窗口的重新開始。在右側,將數據相對於最終DLT窗口的開始歸一化。
總之,研究20120252的示例性群組11至13中的絕對嗜中性白血球計數顯示,受試者在基線時受到骨髓抑制,並且在用SEQ ID NO: 104治療後未觀察到嗜中性白血球計數減少。這與食蟹猴中的研究一致,其中SEQ ID NO: 104對骨髓譜系的效應發生在藥物暴露期間的早期,並且具有暫態性。另外,在研究20120252的群組11至13中,CRS的發作發生於SEQ ID NO: 104的所給予用量階梯和靶用量的最初10天內,沒有任何延遲毒性的證據。基於該等發現,DLT窗口可以縮短至4週的標準(其中至少14天投與靶用量),允許監測CRS的發作及其消退、有效受試者內增加和總體患者安全性。實例 4
對避免或減弱副作用(CRS事件)的評價
在已經在示例性群組1-14(靶用量0.5至480 µg)中治療的46名受試者中,所治療的46名受試者中的29名(63%)經歷一些CRS事件。29名受試者經歷56次CRS事件,該等事件的嚴重程度為29/56(52%)的1級、21/56(37.5%)的2級、4/56(7%)的3級和2/56(3.5%)的4級。沒有5級CRS事件。19/56(34%)間斷藥物並且僅1/56(2%)退出。對於36/56(64%)的受試者,未進行關於SEQ ID NO: 104的行動。因此,可以完全避免最高級的副作用CRS,並且較高級3級和4級減弱至少見的個位數發生率。可以在大多數所治療患者中避免治療間斷,並確保連續有效用量投與以治療患有高進展性r/r AML的高級患者。
[圖1]:關於CD33xCD3雙特異性抗體構建體的I期臨床研究之概述,該研究包含最初的12名患者的群組。
[圖2]:關於I期臨床研究中最初12名患者的群組的抗腫瘤活性的概述。關於研究群組之抗腫瘤功效:在240 μg/d靶劑量(包含三個劑量的治療週期內的第三劑量)下2個完全緩解(CR),在120 μg/d下1個CRi和在240 μg/d下1個CRi,在1.5 μg/d下的1名患者具有MLFS(< 5%母細胞,無血液學恢復)。藉由流動式細胞術測得,具有CR的患者在基線時具有約5%-10%的骨髓(bm)母細胞(由於斑片狀疾病所致的估計值)並且截至第29天下降至2.5%,沒有殘留AML和正常細胞至過多細胞骨髓以及最重要地外周血計數恢復的形態學證據。(說明:CR:完全緩解,CRi:具有不完全計數恢復的完全緩解,MLFS:形態學無白血病狀態)。
[圖3]:在CD33xCD3雙特異性抗體構建體治療下的腫瘤反應的概述:依賴於CD33xCD3劑量的骨髓(BM)抽取物母細胞計數[%]的變化,作為腫瘤反應的指示物。
[圖4]:在相應治療週期中患者反應之概述
[圖5]:在患有R/R AML的患者中評價呈連續靜脈內輸注形式的AMG 330之1期用量遞增研究,該研究顯示階梯式給藥的延長的靶用量暴露和CRS副作用的減輕。
[圖6]:顯示在DLT窗口期間,在群組11(240 µg)、12(240 µg)和13(30 µg)中,所治療患者的外周血中的絕對嗜中性白血球計數。顯示平均值 ± SE。G4線(下基線)和G3線(上基線)顯示依據CTCAE的4級和3級嗜中性粒細胞減少症。
[圖7]:顯示在DLT窗口期間,在群組11(10、30和240 µg)、12(240 µg)和13(30 µg)中,所治療患者的外周血中的血小板計數。顯示平均值 ± SE。G4線(下基線)和G3線(上基線)顯示依據CTCAE的4級和3級嗜中性粒細胞減少症。
Claims (16)
- 一種雙特異性抗體構建體之用途,其較佳用於製備治療髓性白血病之藥物,該雙特異性抗體構建體包含特異性結合至CD33的第一結合結構域和特異性結合至CD3的第二結合結構域,其中該雙特異性抗體構建體係在一個或多個治療週期中投與,其中至少一個治療週期包含應用至少兩個劑量階梯以至少三個不同劑量投與該雙特異性抗體構建體超過14天,視需要之後是不投與該構建體的時間段, 其中根據如下時間表在該一個或多個治療週期中的至少一個週期中投與該雙特異性抗體構建體,該時間表包含以下步驟: (a) 投與第一劑量的該雙特異性抗體構建體,之後 (b) 投與第二劑量的該雙特異性抗體構建體,其中所述第二劑量超過所述第一劑量,之後 (c) 投與第三劑量的該雙特異性抗體構建體,其中所述第三劑量超過所述第二劑量,視需要之後 (d) 投與第四劑量的該雙特異性抗體構建體,其中所述視需要的第四劑量超過所述第三劑量。
- 如請求項1之雙特異性抗體構建體之用途,其中在一個治療週期中投與該雙特異性抗體構建體的時間為至少15天、較佳的是15至60天、更較佳的是28至56天、較佳的是28天。
- 如請求項1或2之雙特異性抗體構建體之用途,其中步驟(a)中的該第一劑量為至少5 µg/天、較佳的是在5至20 µg/天的範圍內、更較佳的是10 µg/天,步驟(b)中的該第二劑量為至少30 µg/天、較佳的是在30至240 µg/天的範圍內、更較佳的是60或240 µg/天,並且步驟(c)中的該第三劑量和步驟(d)中的該視需要的第四劑量為至少240 µg/天、較佳的是在240至1500 µg/天的範圍內、較佳的是在240至960 µg/天的範圍內、更較佳的是在480至960 µg/天的範圍內。
- 如請求項1之雙特異性抗體構建體之用途,其中投與步驟(a)中的該第一劑量的時間段為1至4天、較佳的是2或3天,投與步驟(b)中的該第二劑量的時間段為2至5天、較佳的是2或3天,並且投與步驟(c)中的該第三劑量和步驟(d)中的該視需要的第四劑量的時間段總計為7至52天、較佳的是14至52天、更較佳的是22、23或52天。
- 如請求項2之雙特異性抗體構建體之用途,其中該髓性白血病之治療包含兩個或更多個治療週期,較佳的是兩個、三個、四個、五個、六個或七個治療週期,其中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個治療週期包含超過14天的雙特異性抗體構建體投與。
- 如請求項2之雙特異性抗體構建體之用途,其中至少一個治療週期之後是不投與該構建體的時間段,較佳的是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天不進行治療。
- 如請求項2之雙特異性抗體構建體之用途,其中至少一個治療週期之後不是不投與該構建體的時間段。
- 如請求項5之雙特異性抗體構建體之用途,其中僅第一治療週期包含根據步驟(a)之投與,而後續週期以根據步驟(b)之用量開始。
- 如請求項1之雙特異性抗體構建體之用途,其中該構建體係單鏈雙特異性抗體構建體。
- 如請求項1之雙特異性抗體構建體之用途,其中該雙特異性抗體構建體的該第一結合結構域包含六個CDR的群組,這六個CDR選自由以下組成之群組:SEQ ID NO: 10至12和14至16、SEQ ID NO: 22至24和26至28、SEQ ID NO: 34至36和38至40、SEQ ID NO: 46至48和50至52、SEQ ID NO: 58至60和62至64、SEQ ID NO: 70至72和74至76、SEQ ID NO: 82至84和86至88、SEQ ID NO: 94至96和98至100,較佳的是SEQ ID NO: 94至96和98至100。
- 如請求項1之雙特異性抗體構建體之用途,其中該雙特異性抗體構建體的該第二結合結構域包含六個CDR的群組,這六個CDR選自由以下組成之群組:SEQ ID NO: 148-153、SEQ ID NO: 154-159、SEQ ID NO: 160-165、SEQ ID NO: 166-171、SEQ ID NO: 172-177、SEQ ID NO: 178-183、SEQ ID NO: 184-189、SEQ ID NO: 190-195、SEQ ID NO: 196-201和SEQ ID NO: 202-207,較佳的是SEQ ID NO: 202-207。
- 如請求項1之雙特異性抗體構建體之用途,其中該雙特異性抗體構建體係單鏈構建體,該單鏈構建體包含選自以下群組的胺基酸序列,該群組由以下組成:SEQ ID NO: 18、19、20、30、31、32、42、43、44、54、55、56、66、67、68、78、79、80、90、91、92、102、103、104、105、106、107和108,較佳的是選自由以下組成之群組:SEQ ID NO: 104、105、106、107和108,更較佳的是SEQ ID NO: 104。
- 如請求項1之雙特異性抗體構建體之用途,其中該雙特異性抗體構建體係與以下組合投與:PD-1抑制劑,PDL-1抑制劑,和/或一種或多種選自由以下組成之群組的表觀遺傳因子:組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、DNA甲基轉移酶(DNMT)I抑制劑、羥基脲、顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)、組蛋白去甲基酶抑制劑和ATRA(全反式視黃酸),並且其中: (a) 該PD-1抑制劑、PDL-1抑制劑和/或一種或多種表觀遺傳因子係在投與該雙特異性抗體構建體之前投與; (b) 該PD-1抑制劑、PDL-1抑制劑和/或一種或多種表觀遺傳因子係在投與該雙特異性抗體構建體之後投與;或 (c) 該PD-1抑制劑、PDL-1抑制劑和/或一種或多種表觀遺傳因子和該雙特異性抗體構建體係同時投與。
- 如請求項13之雙特異性抗體構建體之用途,其中該PD-1抑制劑、PDL-1抑制劑和/或一種或多種表觀遺傳因子係在投與該雙特異性抗體構建體之前多達七天投與。
- 如請求項14之雙特異性抗體構建體之用途,其中該表觀遺傳因子係羥基脲。
- 如請求項1之雙特異性抗體構建體之用途,其中該髓性白血病選自由以下組成之群組:急性骨髓母細胞性白血病較佳的是復發性或難治性急性髓性白血病、慢性嗜中性球白血病、髓性樹突狀細胞白血病、加速期慢性骨髓性白血病、急性骨髓性單核球白血病、幼年型骨髓性單核球白血病、慢性骨髓性單核球白血病、急性嗜鹼球白血病、急性嗜酸球白血病、慢性嗜酸球白血病、急性巨核母細胞白血病、原發性血小板增多症、急性紅系白血病、真性紅血球增多症、脊髓發育不良綜合症、急性全骨髓性白血病、髓樣肉瘤和混合表型急性白血病。
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