CN103080300B - 增加细胞培养物的产率和活力的二肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及动物细胞在无血清培养基中的培养。本发明提供了可提高此类培养物的重组蛋白质产量和细胞活力(特别地在蛋白胨不存在的情况下)的特殊二肽。

Description

增加细胞培养物的产率和活力的二肽
相关申请的交叉参考
本申请要求2010年8月5日提交的美国临时申请61/371,119的权益，所述临时申请通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及在培养的重组细胞中生产蛋白质的领域。
发明背景
可从培养的已被工程化以表达高水平的特定目标蛋白质或多肽的哺乳动物细胞产生治疗性蛋白和其它商业上重要的多肽。在哺乳动物细胞培养物中产生此类蛋白质的一个有利方面是，它们可被设计来进行分泌、折叠和翻译后修饰例如糖基化。在此类哺乳动物培养物中，细胞培养条件的控制和优化对于蛋白质和多肽的成功的商业生产是至关重要的。所产生的蛋白质或多肽的最终的量和质量可受到细胞培养条件和试剂的极大影响。
用血清补充动物细胞培养基通常提高细胞活力(viability)以及重组蛋白质的产量。在过去10年或20年中，出于调节和安全的考虑以及关于采购异质性的问题，已驱动工业朝向下述发展：在蛋白质的商业生产中消除血清。Grillberger等人，Biotechnol.J.2009，4，186-201。然而，在无血清培养基中生长的动物细胞对营养缺乏可能十分敏感，且营养缺乏可诱导细胞凋亡。细胞凋亡不利地影响重组蛋白质的质量和滴度。Franek和Fussenegger，2005，Biotechnol.Prog.21，96-98。从大豆和小麦谷蛋白产生的蛋白质水解物或胨类有时可帮助补偿血清的缺乏。已作出许多努力来鉴定负责这些有利作用的此类添加剂的组分及它们的最佳浓度范围。
Franek等人从植物蛋白质水解物制备级分，并且测试了它们支持鼠杂交瘤细胞的生长和分泌的能力。Franek等人，2000，Biotechnol.Prog.16，688-692。作为备选方法，Franek等人就它们在无血清培养基中对小鼠单克隆细胞系的产量的影响筛选了可获得的合成的肽。Franek等人，2002，Biotechnol.Prog.18，155-158。他们报导，虽然单个氨基酸或二肽不显著改变培养参数，但三-、四-和五-甘氨酸以及三-和四-丙氨酸增加活细胞的密度和活力。同上。某些三肽增加该小鼠单克隆细胞系的单克隆抗体产量。同上。在随后关于经重组工程化以产生SEAP的CHO细胞的实验中，该研究小组报导，四-甘氨酸增加活细胞的密度，并且三肽Gly-Lys-Gly增加SEAP产量。Franek和Fussengger2005，Biotechnol.Prog.21，96-98。
本领域仍然需要开发用于在完全成份确定的培养基或化学成份确定的培养基中重组产生蛋白质的方法。虽然蛋白质水解物可改善存活，但它们仍然是异质性的。虽然已报导某些三肽和四肽改善培养参数，但优选具有使重组蛋白质滴度最大化的尽可能简单和明确的细胞培养方法。重组多肽表达、滴度、细胞生长和/或细胞活力的任何改善可导致更高的产量水平，从而减少与制造蛋白质治疗剂相关的成本。本发明通过提供增加细胞生长和蛋白质产量的简单易行的新方法，满足了这些需要。
发明概述
本发明提供了，培养已被重组工程化以表达目标蛋白质的动物细胞的方法，所述方法包括，在生长相中在无血清培养基中生长CHO细胞，和在生产相中在无血清的、成份确定的生产培养基中生长CHO细胞，其中在生产相中，用选自Tyr-His、Tyr-Lys、Tyr-Ala、Tyr-Val、His-Gly和Ala-His的至少一种二肽补充所述无血清培养基，其中与不存在所述二肽的情况相比，在存在所述二肽的情况下蛋白质的滴度得到提高。本发明还提供了，用至少一种选自Thr-Phe、His-Glu、Glu-His、His-Ser和His-Gln的二肽进一步补充无血清的成份确定的生产培养基。此类二肽的添加还可提高滴度，和/或可提高所得的生产培养物的活力和活细胞密度。
本发明还提供了培养已进行重组工程化以表达蛋白质的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的方法，所述方法包括，在生长相中在无血清培养基中生长CHO细胞，和在生产相中在无血清的成份确定的生产培养基中生长CHO细胞，其中在生产相中，用至少一种选自His-Glu、Glu-His、His-Ser、His-Gln、Tyr-His、Tyr-Lys、Tyr-Ala、Tyr-Val、His-Gly和Ala-His的二肽补充无血清培养基，其中与不存在所述二肽的情况相比，在存在所述二肽的情况下细胞培养物的活力得到提高。
因此，通过使用本发明的方法，相对于在不含二肽的化学成分确定的培养基中生长的细胞，细胞活力、活细胞密度和目标蛋白质的表达得到提高。
本发明还提供了，在补充有至少一种选自Tyr-His、Tyr-Lys、Tyr-Ala、Tyr-Val、His-Gly和Ala-His的二肽的无血清的成份确定的生产培养基中的、经重组工程化以表达蛋白质的动物细胞培养物。本发明还提供了，在补充有至少一种选自Thr-Phe、His-Glu、Glu-His、His-Ser和His-Gln的二肽的无血清的成份确定的生产培养基中的动物细胞系。
在本发明的实施方案内，可以以约0.1g/L至5g/L的终浓度在无血清的成份确定的生产培养基中添加二肽。还可将所述二肽于补料培养基中添加至所述生产相。本发明的实施方案中还包括的是，添加两种或更多种二肽。一个实施方案是，添加二肽Tyr-His和Thr-Phe。无血清的成份确定的生产培养基还可包含腐胺和/或精胺和/或***1型(IGF-1)。
在本发明的实施方案内，目标蛋白质可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组蛋白、重组融合蛋白、生长因子、酶或细胞因子。
附图概述
图1显示了，向细胞系A的生产培养物中添加指定的各种二肽对滴度(图1A)和培养物活力(图1B)的影响。
图2显示了，向细胞系B的生产培养物中添加指定的各种二肽对滴度(图2A)和培养物活力(图2B)的影响。
图3显示了，向细胞系C的生产培养物中添加指定的各种二肽对滴度(图3A)和培养物活力(图3B)的影响。
图4显示了，向细胞系D的生产培养物中添加指定的各种含His二肽对滴度(图4A)和培养物活力(图4B)的影响。
图5显示了，指定的各种二肽在第11天对来自细胞系C的滴度的影响。
图6显示了，在细胞系C的生产培养物中细胞大小随时间过去的增加。
图7显示了，在细胞系A中添加Ala-His后提高的滴度(图7A)和培养物活力(图7B)。
图8是生物反应器实验，其显示了，当以指定量向细胞系C的生产培养物中添加Tyr-Lys或Tyr-His时，提高的滴度(图8A)和培养物活力(图8B)。
图9举例说明了，图8中所示的相同生物反应器实验的所得的乳酸盐曲线(profile)(图9A)和钠水平(图9B)。
发明详述
这些研究的目的是，开发这样的无血清无蛋白胨培养基和/或细胞培养制剂，其中每一种组分都是确定的，并且所述培养基的性能超过或与补充有血清或蛋白胨的培养基的性能一样。成份确定的培养基制剂使得能够拥有更大的灵活性来优化和改善细胞生长及重组蛋白质产量，包括增加细胞生长速率、生长至高细胞密度、控制细胞分化的阶段和量、增加蛋白质分泌、增加表型和遗传稳定性以及消除许多细胞类型的衰老。
本发明包括，培养已被重组工程化以表达蛋白质的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的方法，所述方法包括，在生长相中在无血清培养基中生长CHO细胞，和在生产相中在无血清的成份确定的生产培养基中生长CHO细胞，其中在生产相中，用至少一种二肽补充无血清培养基，其中与所述二肽不存在的情况相比较，在所述二肽存在的情况下蛋白质的滴度得到提高。
已测试了各种二肽在化学成分确定的培养基中提高CHO细胞的重组蛋白质表达的能力。已显示提高滴度的二肽包括Tyr-His、Tyr-Lys、Tyr-Ala、Tyr-Val、His-Gly和Ala-His。此外，此类二肽的任意组合也可提高滴度。如下文工作实施例中所显示的，此类二肽的添加能够将重组蛋白质产量的滴度提高多达10至20％或更多(参见实施例2、4和6)。这样的提高可在商业生产过程中显著节约成本。此类二肽还可在蛋白胨不存在的情况下用于提高活力。然而，不希望受限于任何特定的作用机制，据认为，此类二肽的添加显示将细胞的代谢从细胞增殖转换至细胞生产力(cellproductivity)。该假说得到下文实施例5中提供的数据的支持。
事实上，补充有二肽的培养物在11天的持续时间中，显示优于对照条件的、超过常规方法的增加的活力和单位生产率(specificproductivity)，从而允许培养延长至多达15天，如下文实施例7中显示的。除了显示增强的活力和单位生产率外，我们还描述了，补充有二肽的培养物如何显示最小的营养物消耗、改善的代谢特征和pH维持。该作用在实施例8中进行了举例说明。因此，本发明的方法还包括，延迟或阻止乳酸盐在已被重组工程化以表达蛋白质的CHO细胞中积累的方法，所述方法包括，在生长相中在无血清培养基中生长CHO细胞，和在生产相中在无血清的成份确定的生产培养基中生长CHO细胞，其中在生产相中，用至少一种选自Tyr-His和Tyr-Lys的二肽补充无血清培养基。
也可与上述二肽组合使用的其它二肽包括Thr-Phe，以及任何数目的其它二肽。如下文中通过工作实施例显示的，当其本身在无血清、无蛋白胨生产培养基中用作补充剂时，Thr-Phe对活力和重组蛋白质产量没有或几乎没有影响。Tyr-His使滴度提高了约15％。然而，当将Thr-Phe与Tyr-His组合添加至类似的培养物中时，滴度被进一步提高(高至20％)。
还可向无血清的成份确定的生产培养基中添加其它二肽，所述肽已显示提高活细胞密度和/或活力。此类肽为His-Glu、Glu-His、His-Ser和His-Gln。如下文实施例3中所示的，在细胞培养物中使用此类二肽可显著提高无血清细胞培养物的活力。提高活力可提高产品质量。此类二肽的混合物以及其与经显示增加滴度的上述二肽的混合物也可用于细胞培养物中，以提高活力和/或VCD。然而，并非所有二肽都是有利的。例如，虽然His-Gly能够提高表达两种不同重组抗体的两种不同CHO细胞系的生产率和培养性能，但Gly-His具有负面作用。这表明，二肽的具体结构特征可能是非常重要的因素，并且某些二肽实际上可提供负面影响。
细胞和细胞培养物：本发明特别地可用于在细胞培养过程中改善细胞生长、活力和/或蛋白质产量。用于本发明的细胞系经遗传工程化以表达商业或研究目的的多肽。细胞系通常来源于从原代培养物产生的谱系，所述谱系可在培养物中得到无限维持。遗传工程化细胞系包括，用重组多核苷酸分子转染、转化或转导细胞，和/或以其他方式改变所述细胞系(例如，通过同源重组和基因激活或重组细胞与非重组细胞的融合)以引起宿主细胞表达期望的重组多肽。用于遗传工程化细胞和/或细胞系以表达目的多肽的方法和载体对于本领域技术人员来说是公知的；例如，在CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等人，eds.(Wiley&Sons，NewYork，1988，并且按季更新)；和Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual(ColdSpringLaboratoryPress，1989)；Kaufman，R.J.，LargeScaleMammalianCellCulture，1990，pp.15-69中举例说明了各种技术。
动物细胞系来源于其祖先源自多细胞动物的细胞。动物细胞系的一个类型是哺乳动物细胞系。适于在培养物中生长的许多种哺乳动物细胞系可从美国典型培养物保藏中心(Manassas，Va.)和商业提供商获得。工业上常用的细胞系的实例包括，VERO、BHK、HeLa、CV1(包括Cos)、MDCK、293、3T3、骨髓瘤细胞系(例如，NSO、NS1)、SP2O、PC12、WI38细胞、Per.C6和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
使用CHO细胞来举例说明本发明的方法。CHO细胞是可广泛获得的并且在工业上用于生产商业量的重组蛋白质。CHO细胞被广泛用于生产复杂重组蛋白质例如细胞因子、凝血因子和抗体(Brasel等人(1996)，Blood88：2004-2012；Kaufman等人(1988)，J.BiolChem263：6352-6362；McKinnon等人(1991)，JMolEndocrinol6：231-239；Wood等人(1990)，J.Immunol.145：3011-3016)。通常，宿主CHO细胞具有适合于用可选择标记进行转化的遗传背景。用作宿主的最常用CHO细胞是二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型细胞系。DHFR缺陷型突变体细胞系(Urlaub等人(1980)，ProcNatlAcadSciUSA77：4216-4220)DXB11和DG-44是期望的CHO宿主细胞系，因为有效的DHFR可选择和可扩增的基因表达***允许在此类细胞中进行高水平重组蛋白质表达(KaufmanR.J.(1990)，MethEnzymol185：537-566)。此外，此类细胞作为贴壁或悬浮培养物易于操作，并且显示相对良好的遗传稳定性。CHO细胞的其它可选择标记***也是可获得的。CHO细胞和在其中重组表达的蛋白质已被广泛表征，并且已被监管机构批准用于临床商业生产。
重组蛋白：本发明的方法可用于培养已进行重组工程化以表达目标蛋白质的细胞。所表达的蛋白质可在细胞内产生或分泌进入可从其回收和/或收集所述蛋白质的培养基。此外，可使用已知的方法和可以从商业提供商获得的产品，将蛋白质从此类培养物或组分(例如，从培养基或细胞提取物)纯化或部分化纯化。随后可“配制”纯化的蛋白质，这意指更换缓冲液，灭菌，将其分散包装和/或包装以用于最终的用户。药物组合物的适当制剂包括Remington′sPharmaceuticalSciences，第18版，1995，MackPublishingCompany，Easton，PA中描述的制剂。
可利用本发明的方法产生的多肽的实例包括，与下列蛋白之一的全部或部分具有氨基酸序列同一性或大体上的相似性的蛋白质：肿瘤坏死因子(TNF)、flt3配体(WO94/28391)、***、血小板生成素、降钙素、IL-2、血管生成素-2(Maisonpierre等人(1997)、Science277(5322)：55-60)、NF-κB的受体激活物的配体(RANKL、WO01/36637)、肿瘤坏死因子(TNF)-相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL、WO97/01633)、胸腺间质来源的淋巴细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF、澳大利亚专利588819)、肥大细胞生长因子、干细胞生长因子(美国专利6,204,363)、表皮生长因子、角质形成细胞生长因子、巨核细胞生长发育因子、RANTES、人血纤蛋白原-样蛋白2(FGL2；NCBI登录号NM_00682；Rüegg和Pytela(1995)，Gene160：257-62)生长激素、胰岛素、胰岛素调理素、***、甲状旁腺激素、干扰素包括α-干扰素、γ-干扰素和复合干扰素(美国专利No.4,695,623和4,897471)、神经生长因子、脑源性神经营养因子、突触结合蛋白样蛋白(SLP1-5)、神经营养因子-3、胰高血糖素、白细胞介素、集落刺激因子、淋巴毒素-β、白血病抑制因子和制癌蛋白-M。可按照本发明方法产生的蛋白质的描述可见于例如，HumanCytokines：HandbookforBasicandClinical Research，所有卷(Aggarwal和Gutterman，eds.BlackwellSciences，Cambridge，MA，1998)；GrowthFactors：APractical Approach(McKay和Leigh，eds.，OxfordUniversityPressInc.，NewYork，1993)；和TheCytokineHandbook，第1和2卷(Thompson和Lotzeeds.，AcademicPress，SanDiego，CA，2003)。
此外，本发明的方法可用于产生包含任意上述蛋白质的受体、针对这样的受体或任意上述蛋白质的拮抗剂和/或与此类受体或拮抗剂大体上类似的蛋白质的氨基酸序列的全部或部分的蛋白质。此类受体和拮抗剂包括：肿瘤坏死因子受体的两种形式(TNFR，称为p55和p75，美国专利No.5,395,760和美国专利No.5,610,279)、白细胞介素-1(IL-1)受体(I和II型；欧洲专利No.0460846，美国专利No.4,968,607和美国专利No.5,767,064，)、IL-1受体拮抗剂(美国专利No.6,337,072)、IL-1拮抗剂或抑制剂(美国专利No.5,981,713、6,096,728和5,075,222)、IL-2受体、IL-4受体(欧洲专利No.0367566和美国专利No.5,856,296)、IL-15受体、IL-17受体、IL-18受体、Fc受体、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体、粒细胞集落刺激因子受体、制癌蛋白-M和白血病抑制因子的受体、NF-κB的受体激活物(RANK，WO01/36637和美国专利No.6,271,349)、骨保护素(美国专利No.6,015,938)、TRAIL的受体(包括TRAIL受体1、2、3和4)以及包含死亡结构域的受体例如Fas或细胞凋亡诱导受体(AIR)。
可使用本发明产生的其它蛋白质包括，包含分化抗原(称为CD蛋白)或其配体或与这两者之一大体上类似的蛋白质的氨基酸序列的全部或部分的蛋白质。此类抗原公开于LeukocyteTypingVI(ProceedingsoftheVIthInternationalWorkshopandConference，Kishimoto，Kikutani等人，eds.，Kobe，Japan，1996)中。类似的CD蛋白公开于随后的专题研讨会(workshops)。此类抗原的实例包括CD22，CD27，CD30，CD39，CD40和针对其的配体(CD27配体、CD30配体等)。CD抗原中的几种为TNF受体家族的成员，其还包括41BB和OX40。配体通常是TNF家族的成员，41BB配体和OX40配体亦如此。
还可使用本发明产生具有酶促活性的蛋白质或其配体。实例包括，包含下列蛋白质或其配体或与这两者之一大体上相似的蛋白质之一的全部或部分的蛋白质：解聚素(disintegrin)和金属蛋白酶结构域家族成员包括TNF-α转化酶、各种激酶、葡糖脑苷脂酶、超氧化物歧化酶、组织型纤溶酶原激活物、因子VIII、因子IX、载脂蛋白E、载脂蛋白A-I、珠蛋白、IL-2拮抗剂、α-1抗胰蛋白酶、任意上述酶的配体以及众多的其它酶及其配体。
本发明还可用于产生抗体或其部分。术语“抗体”包括，任何同种型或亚类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白或与完整抗体竞争特异性结合的其抗原结合区域，并且除非另外指明，否则包括人、人源化、嵌合、多特异性、单克隆、多克隆抗体及其寡聚物或抗原结合片段。抗体可以是任意种类的免疫球蛋白。还包括的是，具有抗原结合片段或区域的蛋白质，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双体抗体(diabody)、Fd、dAb、maxibody、单链抗体分子、互补决定区(CDR)片段、scFv、双体抗体、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)和包含至少免疫球蛋白的足以赋予对靶多肽的特异性抗原结合的部分的多肽。术语“抗体”包括但不限于，通过重组方法制备、表达、产生或分离的抗体，例如从被转染以表达抗体的宿主细胞分离的抗体。
抗体的实例包括但不限于，识别蛋白质中的任一个或其组合的抗体，所述蛋白质包括但不限于上述蛋白质和/或下列抗原：CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD147、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-7、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-2受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-13受体、IL-18受体亚单位、FGL2、PDGF-β及其类似物(参见美国专利5,272,064和5,149,792)、VEGF、TGF、TGF-β2、TGF-β1、EGF受体(参见美国专利No.6,235,883)、VEGF受体、肝细胞生长因子、骨保护素配体、干扰素γ、B淋巴细胞刺激物(BlyS，也称为BAFF、THANK、TALL-1和zTNF4；参见Do和Chen-Kiang(2002)，CytokineGrowthFactorRev.13(1)：19-25)、C5补体、IgE、肿瘤抗原CA125、肿瘤抗原MUC1、PEM抗原、LCG(其是与肺癌关联表达的基因产物)、HER-2、肿瘤相关糖蛋白TAG-72、SK-1抗原、以升高的水平存在于患有结肠癌和/或胰腺癌的患者的血清中的肿瘤相关表位、在乳腺癌、结肠癌、鳞状上皮细胞癌、***癌、胰腺癌、肺癌和/或肾癌细胞上和/或黑素瘤、神经胶质瘤或神经母细胞瘤细胞、肿瘤的坏死核心上表达的癌症相关表位或蛋白质、整联蛋白α4β7、整联蛋白VLA-4、B2整联蛋白、TRAIL受体1、2、3和4、RANK、RANK配体、TNF-α、粘附分子VAP-1、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、胞间粘附分子-3(ICAM-3)、白细胞整合素粘附分子(leukointegrinadhesin)、血小板糖蛋白gpIIb/IIIa、心肌肌球蛋白重链、甲状旁腺激素、rNAPc2(其为因子VIIa-组织因子的抑制剂)、MHCI、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、肿瘤坏死因子(TNF)、CTLA-4(其为细胞毒性T淋巴细胞相关抗原)、Fc-γ-1受体、HLA-DR10β、HLA-DR抗原、L-选择蛋白、呼吸道合胞病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、变异链球菌(Streptococcusmutans)和金黄色葡萄球菌(Staphlycoccusaureus)。可使用本发明方法产生的已知抗体的具体实例包括但不限于，阿达木单抗、贝伐单抗、英利昔单抗、阿昔单抗、阿伦单抗、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗、贝利木单抗、布雷奴单抗、卡那单抗、赛妥珠单抗、西妥昔单抗、可那木单抗、地诺单抗、艾库组单抗、吉妥单抗奥加米星、戈利木单抗、替伊莫单抗、拉贝珠单抗、马帕木单抗、马妥珠单抗、美泊利单抗、莫维珠单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、尼妥珠单抗、奥法木单抗、奥马佐单抗、奥戈伏单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、pemtumomab、帕妥珠单抗、来尼珠单抗、利妥昔单抗、罗维珠单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、乌司奴单抗、扎鲁单抗(zalutumumab)和他珠单抗(zanolimumab)。
还可将本发明用于产生重组融合蛋白，所述蛋白包括例如任意上文提及的蛋白质。例如，可使用本发明方法产生包含上述蛋白质之一加多聚化结构域例如亮氨酸拉链、卷曲螺旋、免疫球蛋白的Fc部分或大体上相似的蛋白质的重组融合蛋白。参见，例如WO94/10308；Lovejoy等人(1993)，Science259：1288-1293；Harbury等人(1993)，Science262：1401-05；Harbury等人(1994)，Nature371：80-83；等人(1999)，Structure7：255-64。此类重组融合蛋白中特别地包括，其中受体的一部分融合至抗体的Fc部分的蛋白质，例如依那西普(p75TNFR：Fc)和贝拉西普(CTLA4：Fc)。
培养基和培养：本发明的方法包括在细胞培养基中生长动物细胞。为了本发明的目的，细胞培养基为适合于动物细胞例如哺乳动物细胞在体外细胞培养物中生长的培养基。细胞培养基制剂在本领域是公知的。通常，细胞培养基包含缓冲剂、盐、碳水化合物、氨基酸、维生素和微量必需元素。细胞培养基可以包含或可以不包含蛋白胨和/或蛋白质。各种组织培养基，包括无血清的和成份确定的培养基可商购获得，例如，可使用下列细胞培养基中的任一种或其组合：RPMI-1640培养基、RPMI-1641培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、伊格尔最低基础培养基(MinimumEssentialMediumEagle)、F-12K培养基、Ham′sF12培养基、伊思考夫改良达尔伯克培养基、McCoy′s5A培养基、Leibovitz′sL-15培养基和无血清培养基例如EX-CELLTM300系列(JRHBiosciences，Lenexa，Kansas)等等。无血清的成份确定的细胞培养基的其它实例可见于美国专利No.7,294,481和WO2006/026445，所述两者通过引用并入本文。取决于待培养的细胞的需要和/或期望的细胞培养参数，可用其它组分或增加的浓度的组分例如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子、缓冲剂、抗生素、脂质、微量元素等补充细胞培养基。例如，可用聚胺例如腐胺、精脒和精胺补充细胞培养基，以改善与特定细胞相关的细胞生长、细胞活力和/或重组蛋白产量。无血清细胞培养基可包含浓度至少约0.1μM的精胺或精脒，或浓度至少约100μM的腐胺，或肌肽。(参见，例如，WO2008/154014和WO2007/050498，所述两者通过引用并入本文)。
细胞培养基可以是无血清、无蛋白质和/或无蛋白胨的培养基。“无血清”培养基适用于不包含动物血清例如胎牛血清的细胞培养基。“无蛋白质”适用于不含外源添加的蛋白质例如转铁蛋白、蛋白质生长因子IGF-1或胰岛素的细胞培养基。无蛋白质培养基可包含或可以不包含蛋白胨。“无蛋白胨”适用于不包含外源蛋白质水解物例如动物和/或植物蛋白质水解物的细胞培养基。从细胞培养基消除血清和/或水解物具有减小批次间的变异性和增强处理步骤例如过滤的有利方面。然而，当从细胞培养基中除去血清和/或蛋白胨时，细胞生长、活力和/或蛋白质表达可能下降或低于最佳状态。因此，可使无血清和/或无蛋白胨细胞培养基高度富集氨基酸、微量元素等。参见，例如，美国专利No.5,122,469和5,633,162。虽然存在许多培养基制剂，但仍然需要开发与包含动物血清和/或蛋白胨的培养基相比性能相同或优选更好的成份确定的培养基制剂。
无血清的成份确定的生产培养基是指，不用血清、蛋白胨或其它动物和/或植物水解物配制的富集培养基。此类成份确定的细胞培养制剂可包含氨基酸、无机盐、碳水化合物、脂质、维生素、缓冲剂和微量必需元素。任选地，此类成份确定的细胞培养制剂可包含外源添加的蛋白质，只要蛋白质的来源是确定的并且纯的，优选重组产生的即可。
细胞培养或“培养”意指，细胞在多细胞生物体或组织外的生长和繁殖。用于哺乳动物细胞的适当培养条件在本领域是已知的。参见例如Animalcellculture：APracticalApproach，D.Rickwood，ed.，OxfordUniversityPress，NewYork(1992)。可悬浮培养哺乳动物细胞，或将其附着至固体基质上进行培养。具有或不具有微载体并且以分批、补料分批、连续、半连续或灌注模式操作的流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶、摇瓶或搅拌罐生物反应器可用于哺乳动物细胞培养。可在培养期间连续地或间隔地将细胞培养基和/或浓缩的补料培养基添加至培养物中。例如，可每天1次、每隔1天1次、每3天1次给培养物补料，或当正被监测的特定培养基组分的浓度落在期望的范围之外时给培养物补料。
可在小规模培养物中例如在具有约30ml培养基的100ml容器，具有约80至约90ml培养基的250ml容器，具有约150至约200ml培养基的250ml容器中培养动物细胞例如CHO细胞。或者，培养可以是大规模的，例如具有约300至约1000ml培养基的1000ml容器，具有约500ml至约3000ml培养基的3000ml容器，具有约2000ml至约8000ml培养基的8000ml容器和具有约4000ml至约15000ml培养基的15000ml容器。
大规模细胞培养(例如用于蛋白质治疗剂的临床制造)通常维持数天，或甚至数周，同时细胞产生期望的蛋白质。在该时间过程中，可用包含组分例如营养物和氨基酸的浓缩补料培养基补充培养物，所述组分在培养过程中被消耗。浓缩的补料培养基可基于几乎任何细胞培养基制剂。此类浓缩的补料培养基可以以例如其正常量的约5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、400倍、600倍、800倍或甚至约1000倍包含细胞培养基的大部分组分。浓缩的补料培养基通常用于补料分批培养法。
本发明的方法可用于在单相(singlephase)和多相(multiplephase)培养法中提高重组蛋白质的产量。在单相法中，将细胞接种入培养环境，在单生产相过程中使用公开的方法。在多阶段培养法中，以两个或更多个不同的相培养细胞。例如，可首先在使细胞增殖和活力最大化的环境条件下在一个或多个生长相中培养细胞，随后在使蛋白质产量最大化的条件下将细胞转移至生产相。在利用哺乳动物细胞产生蛋白质的商业方法中，通常在最终的生长相之前存在多个例如至少约2、3、4、5、6、7、8、9或10个在不同培养容器中进行的生长相。在生长相和生产相之前可进行一个或多个过渡相，或在生长相和生产相之间可间隔一个或多个过渡相。在多相法中，可至少在生产相中使用本发明的方法，虽然它们也可用于在先的生长相。可大规模进行生产相。可以以至少约100、500、1000、2000、3000、5000、7000、8000、10,000、15,000、20,000升的体积进行大规模方法。生长相可以在比生产相更高的温度下进行。例如，生长相可在约35℃至约38℃的第一温度下进行，生产相可在约29℃至约37℃，任选地约30℃至约36℃或约30℃至约34℃的第二温度下进行。此外，可在温度变换的同时、之前和/或之后添加蛋白质生产的化学诱导物例如咖啡因、丁酸盐/酯和六亚甲基二乙酰胺(HMBA)。如果在温度变换之后添加诱导物，则可在温度变换之后1小时至5天，任选地温度变换之后1至2天添加诱导物。
因此，本发明的方法包括，在生长相中在无血清培养基中生长CHO细胞，以便细胞在数量上增加至期望的浓度。生长相中的无血清培养基可以包含或可以不包含蛋白质水解物。生长相可包括多个分批和/或补料分批相，或可包括灌注相。在获得期望的细胞数量和/或活细胞密度后，随后在生产相中生长细胞。通常将来自生长相的无血清培养基中的细胞接种至无血清的成份确定的生产培养基以进行生产相。如上文中所指出的，无血清的成份确定的生产培养基经配制不含蛋白胨或其它动物和/或蛋白质水解物。然而，由于来自生长相的细胞被稀释至无血清的成份确定的生产培养基中，因此其中可遗留一些来自生长相的水解物和/或蛋白胨，如果在先前的相中使用此类组分的话。进入生产相的常用接种密度可以为2x105个细胞/mL至5x106个细胞/mL。
至少在生产相中，用至少一种选自Tyr-His，Tyr-Lys，Tyr-Ala，Tyr-Val，His-Gly，Ala-His的二肽补充无血清培养基。当将此类二肽的一种或多种添加至培养物时，与在二肽不存在的情况下相比较，在二肽存在的情况下重组蛋白的滴度得到提高。此外，当将二肽Thr-Phe与上文所列二肽之一一起添加时，滴度得到进一步提高。
还可添加其它二肽。已显示提高活细胞密度(VCD)和/或活力的一些具体二肽为His-Glu、Glu-His、His-Ser和His-Gln。VCD是指在特定体积(通常每ml)细胞培养基中存活的细胞的总数。活力是指以百分数表示的与细胞(死的和活的)的总数相比较的活细胞数目。还可将此类二肽的混合物以及其与已显示增加滴度的上述二肽的混合物用于细胞培养物中，以提高活力和/或VCD。增加活力和/或VCD是高度期望的，因为这避免细胞凋亡并且导致更高的产品质量。因此，还可单独地或组合地，甚至在不添加已显示增加滴度的二肽(特别地，Tyr-His、Tyr-Lys、Tyr-Ala、Tyr-Val、His-Gly、Ala-His和His-Glu)的情况下使用此类二肽。
可将二肽包含在无血清的成份确定的生产培养基中，和/或可将其作为浓缩补料培养基的部分添加。可在1天或多天后向培养物中添加此类补料培养基，并且还可在生产相的过程中重复添加所述补料培养基。例如，生产相可持续7天至长至8、9、10、11、12、13或14天或更长时间。可立即和/或在第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和/或13天用二肽补充培养物。通常，培养物中二肽的终浓度为约0.01至10g/L，更常见地约0.05至6g/L，更常见地约0.1至4g/L，更常见地约0.2至2g/L。当然，如果在单个细胞培养物中使用多种二肽，那么总的二肽浓度可更高。在一个实施方案中，二肽的浓度范围为约0.1至约5g/L。
可收集通过本发明的方法表达的蛋白质。此外，可使用已知的方法从这样的培养物或组分(例如，从细胞培养基或细胞提取物或体液)纯化或部分纯化蛋白质。术语“部分纯化的”意指，已进行了一些分级分离法，但存在期望的蛋白质之外的其他多肽种类(至少10％)。“纯化的”意指，蛋白质基本上是均一的，即，存在少于1％的污染性蛋白质。分级分离法可包括但不限于，一个或多个步骤的过滤、离心、沉淀、相分离、亲和纯化、凝胶过虑、离子交换层析、大小排阻层析(SEC)、疏水相互作用层析(HIC；使用这样的树脂如苯基醚、丁基醚或丙基醚)、HPLC，或上述步骤的一些组合。
本发明还任选地包括进一步配制蛋白质。术语“配制”意指，可对蛋白质进行缓冲液交换、灭菌、分散包装和/或包装以用于最终的用户。为了本发明的目的，术语“无菌散装形式(sterilebulkform)”意指，制剂不含或基本不含微生物污染(至对于食品和/或药物目的是可接受的程度)，并且具有确定的组成和浓度。
术语″无菌单位剂量形式″意指，适合用于消费者和/或患者施用或消费的形式。此类组合物可包括与其它组分例如生理上可接受的稀释剂、载体或赋形剂组合的有效量的蛋白质。术语″生理上可接受的″意指，不干扰活性成分的生物学活性的效力的无毒物质。
已描述了本发明，并且下列实施例用于举例说明本发明的细节，但无意以任何方式限定其范围。
实施例1
使用化学成份确定的培养基获得的初步结果显示，酪氨酸显示在重组抗体的生产过程中被耗尽。然而，酪氨酸是难溶性氨基酸，因此难以增加培养基中酪氨酸的浓度。因此，据推测，可使用包含酪氨酸的二肽来补充酪氨酸。测试了几种不同二肽的溶解度，如下文表1中显示的。
表1
由于Tyr-His和Tyr-Lys在这些测试条件下是易溶性的，因此设计细胞培养实验来将它们作为无血清无蛋白胨的培养基的添加剂进行测试。
实施例2
导言：在本实验中，将Tyr-His和Tyr-Lys作为包含IGF-1和腐胺的富集的成份确定的培养基的添加剂来进行测试。
材料和方法：二肽购自Bachem(Torrance，CA)。将每一种二肽溶解在水中以制备浓缩原液(100mg/mL)，随后使用Spin-X过滤单元(CorningInc.，Corning，NY)进行无菌过滤。
在第0天，在接种生产细胞系之前，将适当体积的浓缩二肽原液添加至无血清的成份确定的生产培养基以获得0.5-2.0g/L的二肽终浓度。对于对照，添加相同体积的水。以5x105个细胞/mL在250mL培养瓶(具有50mL的终培养体积)中接种细胞。以5％CO2和160rpm的搅拌速率，将摇瓶培养物在36℃下培养于培养箱中。
在第3、6和8天利用成份确定的补料培养基对培养物进行补料，第3天的补料体积为5-6％，第6天为9％，以及第8天为9％。第11天终止培养并且收获培养物。然而，如果第11天的培养物活力超过70％，则将培养持续时间延长超过第11天，并且必要时在第11天引入第4次补料和在第13天引入第5次补料。取决于培养物性能，第11天的补料体积为5％至8％。第13天的补料体积为2.5％至3.0％。需要时补充葡萄糖，并且通常的靶浓度为7-8g/L。
在生产过程中在选择的日期，取出小体积的培养物，并使用CEDEX细胞计数器(RocheInnovatisAG)来评估活细胞密度和活力％。还使用高通量HPLC分析法来测定收集的样品的滴度。
结果：在该系列实验中，在3种不同的CHO细胞系上测试两种二肽Tyr-His和Tyr-Lys的作用。各细胞系已进行重组工程化以表达不同的人抗体。
图1举例说明了利用细胞系A在无血清的成份确定的生产培养基中以2g/L、1g/L和0.5g/L终浓度用Tyr-His(标记为YH)和Tyr-Lys(标记为YK)进行测试而获得的结果。在所有3个测试的浓度上对于两种肽都观察到第13天和第14天的滴度和活力的显著提高。未测定“对照”的第14天的滴度和活力，因为第13天的活力低于50％。
图2举例说明对于细胞系B获得的结果。YH为1g/L的Tyr-His的添加，YK为1g/L的Tyr-Lys的添加，YH+YK为Tyr-His和Tyr-Lys的组合(各个二肽的浓度为0.5g/L)。再次地，滴度和活力得到显著的增加。
图3举例说明对于细胞系C获得的结果。测试0.5g/L和1g/L的Tyr-His。测试0.5g/L和1g/L的Tyr-Lys。再次地，滴度和活力得到显著的增加。
随后在两个另外的CHO细胞系上测试Tyr-His和Tyr-Lys，它们在一个细胞系中也以类似方式提高了滴度和活性，但程度低于第5细胞系(数据未显示)。
实施例3
在一系列内部(in-house)蛋白胨分级分离实验中，已尝试表征或分离蛋白胨中的在细胞培养中赋予有利性质的组分。据推测，包含氨基酸His的酪蛋白来源的肽可能是有益的，并且选择了几种不同的包含His的合成的肽进行进一步研究。
材料和方法：将产生完全人重组抗体的CHO细胞系D用于该实验。将细胞以2x106个细胞/mL接种入无血清的成份确定的生产培养基(终培养体积为2.0mL)。实验样品包含1至4g/L的二肽His-Glu、Glu-His、His-Ser和His-Gln。对照孔经设置不包含添加的二肽作为阴性对照，或包含10g/L的蛋白胨作为阳性对照。将培养物作为分批培养物温育6天，在该时间点收获细胞，测定滴度和活力。
结果：在无血清的成份确定的培养基中测试二肽His-Glu、Glu-His、His-Ser和His-Gln替代蛋白胨的能力。各种此类二肽的作用示于图4中。虽然滴度较阴性对照未获得显著增加(图4A)，但在各种此类二肽以及4种二肽的组合存在的情况下活力得到显著提高(图4B)。然而，4种二肽的组合仅显示比单独的各种二肽略好的活力。
实施例4
在本实施例中，在细胞系C上测试了多种含酪氨酸和组氨酸的二肽的作用。此外，由于Phe为Tyr的前体，因此还测试了二肽Thr-Phe。
材料和方法：如实施例2一样培养CHO细胞系C。测试的二肽为Tyr-Lys、Thr-Phe、His-Gly、Tyr-Ala、Gly-His、Tyr-His、Tyr-Val以及Tyr-His与Thr-Phe的组合。培养期为11天，在该时间点上评估滴度和活力。
结果：结果示于图5中。Tyr-Lys、Tyr-Ala、Tyr-His和Tyr-Val全都显著提高滴度。His-Gly适度地提高滴度，Thr-Phe几乎不具有或不具有作用，Gly-His在该实验中对于该细胞系不利地影响滴度。
实施例5
在本实验中，尝试确定Tyr-His诱导的滴度和活力提高背后的机制。因此，检查了在Tyr-His存在的情况下生长的细胞培养物的其它参数。
材料和方法：将CHO细胞系C用于本实验，如实施例2中一样进行培养。从细胞培养的第6天至第13天或第14天，每天测定滴度、活力、活细胞密度、单位生产率和细胞直径。测试0.5g/L和1g/L的Tyr-His二肽，将其与无二肽的添加相比较。
结果：如先前一样，Tyr-His在该CHO细胞系中显著提高培养物活力和重组蛋白滴度。此外，当将Tyr-His添加至培养物中时，生长(测量为活细胞密度和整体的细胞密度(IntegratedCellDensity))被抑制。抑制在1g/L的更高浓度上比0.5g/L时更大。此外，细胞的单位生产率从第10至14天以浓度响应方式在含Tyr-His的培养物中得到维持。相反地，无二肽的对照细胞在细胞培养的晚期阶段显示生产率的严重下降。据推测，Tyr-His的添加诱导了从细胞增殖至生产力的代谢转换。这得到了数据的支持，所述数据显示因二肽的添加而导致的更慢的生长、增加的单位生产率(Qp)和增加的细胞尺寸。细胞尺寸的增加的结果示于图6中。此外，添加Tyr-His二肽的培养物显示比对照培养物更好的pH控制、乳酸盐特征和铵特征。
实施例6
在本实施例中，测试了Ala-His二肽对CHO细胞系A的重组蛋白质滴度和活力的影响。
材料和方法：如实施例2中一样培养CHO细胞系A。将二肽Ala-His(以1g/L添加)的作用与无二肽添加(对照)和二肽His-Gly的作用相比较。培养期为13至14天，在该时间点上评估滴度和活力。
结果：结果示于图7中。与对照相比较，His-Gly使滴度提高超过10％。Ala-His也提高滴度，但不如His-Gly多。His-Gly在维持活力上也更好，特别是在该细胞培养的晚期阶段。然而，Ala-His确实显示维持增加的活力的能力，特别是在该细胞系培养的早期阶段。
实施例7-生物反应器中的活力和滴度
使用CHO细胞系C在生物反应器中重现了在摇瓶中观察到的合成的二肽Tyr-His和Tyr-Lys的有益作用。
材料和方法：进行生物反应器实验以检查利用酪氨酸-组氨酸(YH)和酪氨酸-赖氨酸(YK)二肽的CHO细胞系C的性能。在下列条件下运行6个2-L的生物反应器：以一式两份进行对照条件，而其余的反应器补充有0.5g/LYH、1.0g/LYH、0.5g/LYK和1.0g/LYK(对于每一个条件，单管(singlet))。起始体积为1500±50ml，接种密度为5x105个细胞/ml，温度设置点为36.0℃，pH设置点为6.95，DO设置点为48mmHg，搅拌速率为315rpm，并使用双侧pH控制。利用如下进料方案使过程延长至15天：第3天(5％)、第6天(9％)、第8天(9％)+第11天(5％)和第13天(2.5％)的额外进料。还引入日葡萄糖进料(在第3-11天直至7g/L；第12-14天直至5g/L)和止泡剂(根据需要；直至25ppm)。
每天取出少量培养物，使用CedexAS20细胞计数器(RocheInnovatis，Beilefed，Germany)评估活细胞密度和细胞活力。从NovaBioprofile100Plus(NovaBiomedical，Waltham，MA)获得代谢数据，使用AdvancedInstrument(Norwood，MA)渗透计2020型来测量重量克分子渗透压浓度。使用Chiron248型血气分析仪(SiemensHealthcareDiagnostics，Deerfield，IL)来测量pH、溶解的二氧化碳和溶解的氧。
还使用在生产过程中获取的条件培养基来测定滴度和氨基酸含量。将离心的上清液于-20℃下冷冻和贮存，以待以后进行滴度和氨基酸分析。使用亲和蛋白A，然后进行HPLC分析来测量滴度值。将适当的消光系数值用于每一种分子以测定最终的滴度。氨基酸分析法利用AccuTag试剂盒和柱前衍生化学(pre-columnderivatizationchemistry)。按照提供商推荐提供的说明书(WatersCorporation，Milford，MA)进行衍生化、层析和数据分析步骤。
结果：在2升容器中，Tyr-His和Tyr-Lys二肽在pH-受控的生物反应器环境中显著提高滴度(参见图8A)和单位生产率。此外，两种二肽都能够通过提高培养物活力(参见图8B)延长培养持续时间。补充有二肽的培养物的容积生产率持续增加超过第11天。
实施例8-补充有二肽的培养物的改善的代谢特征
材料和方法：在实施例6中运行的生物反应器实验中，监测乳酸盐和铵(NH4+)的特征。此外，从培养的第6天至第15天监测游离酪氨酸、组氨酸、赖氨酸和天冬酰胺水平。
结果：与滴度和活力的提高相关，通过二肽的添加获得了改善的代谢特征。在生物反应器实验中，对照反应器在第10天开始积累乳酸盐(图9A)，然而补充有二肽的生物反应器在相同时间范围中消耗乳酸盐。与乳酸盐积累一致，Na+水平在对照反应器中也开始升高(图9B)，这反映了外源添加的缓冲剂碳酸氢钠响应pH的下降。然而，Na+水平在补充有二肽的条件下得到良好维持，这很可能归因于它们维持相对恒定的pH的能力。这些数据表明，补充的二肽可在生产运行的晚期阻止培养基酸化发生，从而需要添加较少的碱。
与该细胞系的生物反应器结果类似，在振荡条件下观察到改善的乳酸盐特征(数据未显示)。然而，仅对较高浓度(1.0g/LYH)的二肽观察到乳酸盐消耗。当添加较低量(0.5g/LYH)时，乳酸盐积累不能被阻止，但被推迟。这些结果与培养物的pH特征相关。在较高的二肽浓度(1.0g/L)上，pH被维持在相对恒定的水平上，然而在较低的二肽浓度(0.5g/L)上，检测到pH的显著降低。然而，在较低的二肽浓度条件下的pH下降的程度不如“对照”条件下严重。由于振荡器条件未从外部补充碳酸氢盐缓冲液来控制pH，因此可能需要更高水平的二肽，以获得与生物反应器中相似水平的益处。
也在补充有二肽的条件下观察到改善的NH4 +特征(数据未显示)。然而，与乳酸盐特征类似，在降低NH4 +水平方面，振荡条件对二肽浓度的敏感性比生物反应器更高。
来自生物反应器实验的氨基酸分析显示，在对照反应器中，到第11天酪氨酸(Tyr)和天冬酰胺(Asn)都被耗尽。相反地，在补充有Tyr-Lys或Tyr-His的条件下未检测到酪氨酸耗尽。然而，这些合成的二肽都不能拯救培养物的天冬酰胺耗尽。与酪氨酸特征(其在对照与二肽条件之间显著不同)相反，天冬酰胺特征在不同条件下保持相对相当。对于较低的二肽水平(0.5g/L的YH或YK)观察到，酪氨酸在第15天被最终耗尽，而具有较高二肽浓度(1.0g/L的YH或YK)的培养物在15天的培养期中未经历酪氨酸耗尽。这些结果表明，游离酪氨酸在生产过程中从二肽释放出来。二肽补充越高(1.0g/L)，可获得的游离酪氨酸的量越高。由于Tyr-Lys和Tyr-His都不包含Asn部分，因此天冬酰胺水平未受影响。有趣地，在1.0g/LYH条件下观察到比1.0g/LYK条件下更高水平的游离酪氨酸。这可部分归因于在1.0g/LYH条件下观察到的被抑制的细胞生长(数据未显示)。
仅在含His的二肽(即Tyr-His)的条件下观察到更高的组氨酸(His)水平，这进一步支持此类二肽随时间过去离解成游离氨基酸的想法。在甚至早至第6天，在较低(0.5g/L)与较高(1.0g/L)YH条件之间观察到组氨酸水平的极其明显的差异。由于仅从第6天以后获得氨基酸分析数据，因此，无法在该点准确地确定此类二肽开始分解成游离氨基酸的时间。
赖氨酸特征也显示，在补充有YK的条件下游离赖氨酸水平的剂量依赖性增加(图7D)。然而，与未接收YK补充剂的条件相比较，在补充0.5g/LYK的条件下赖氨酸水平的差异较不明显。例如，在第9天和在第15天，在补充有YH的条件下(在YH0.5g/L或YH1.0g/L下)检测到的游离赖氨酸水平与在补充有0.5g/LYK的条件下检测到的赖氨酸水平相似(图7D)。这可归因于，YH处理的培养物不能有效消耗赖氨酸。
生物反应器结果显示，CHO细胞系C细胞中酪氨酸的耗尽对单位生产率(Qp)具有有害作用。在对照反应器中在第11天观察到的酪氨酸耗尽与Qp的急剧降低相关。相反地，在补充有二肽的条件(可获得较高水平的酪氨酸)下观察到Qp的增加。在第14至15天之间再次观察到酪氨酸与Qp之间的该功能相关性，在该过程中在补充有较低二肽浓度的培养物中(即在补充YK0.5g/L和YH0.5g/L的条件下)观察到Qp的急剧下降。氨基酸特征显示，在该时间范围中，酪氨酸在0.5g/L二肽条件下被完全耗尽。相反地，在第15天在1.0g/L二肽的条件下可获得充足水平的酪氨酸，并且高Qp得以维持。
本发明不限于由本文中描述的具体实施方案确定的范围，所述实施方案意欲仅作为本发明的个别方面的举例说明，并且功能上等同的方法和组分在本发明的范围内。事实上，除了本文中显示和描述的那些外，根据上述说明和附图，本发明的各种变动对于本领域技术人员来说将变得显然。此类变动意欲落在所附权利要求的范围内。

Claims (18)

1.一种培养已被重组工程化以表达蛋白质的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的方法，所述方法包括：
在生长相中在无血清培养基中生长所述CHO细胞，和
在生产相中在无血清的成份确定的生产培养基中生长所述CHO细胞，
其中在所述生产相中，用至少一种选自Tyr-His、Tyr-Lys、Tyr-Ala、Tyr-Val、His-Gly和Ala-His的二肽补充所述无血清培养基，并且
其中与在所述二肽不存在的情况下相比较，在所述二肽存在的情况下所述蛋白质的滴度得到提高。
2.一种培养已被重组工程化以表达蛋白质的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的方法，所述方法包括：
在生长相中在无血清培养基中生长所述CHO细胞，和
在生产相中在无血清的成份确定的生产培养基中生长所述CHO细胞，
其中在所述生产相中，用至少一种选自His-Glu、Glu-His、His-Ser、His-Gln、Tyr-His、Tyr-Lys、Tyr-Ala、Tyr-Val、His-Gly和Ala-His的二肽补充所述无血清培养基，并且
其中与在所述二肽不存在的情况下相比较，在所述二肽存在的情况下所述细胞培养物的活力得到提高。
3.权利要求1或2的方法，其中以0.1g/L至5g/L的终浓度将所述二肽添加至无血清的成份确定的生产培养基中。
4.权利要求2的方法，其中以0.2g/L至5g/L的终浓度将所述二肽添加至无血清的成份确定的生产培养基中。
5.权利要求3的方法，其中添加至少两种二肽，即，第一种二肽和第二种二肽。
6.权利要求5的方法，其中
第一种二肽选自Tyr-His、Tyr-Lys、Tyr-Ala、Tyr-Val、His-Gly和Ala-His，并且
第二种二肽选自Thr-Phe、His-Glu、Glu-His、His-Ser或His-Gln。
7.权利要求6的方法，其中所述二肽包括Tyr-His和Thr-Phe。
8.权利要求3的方法，其中所述无血清的成份确定的生产培养基包含腐胺和/或精胺。
9.权利要求3的方法，其中所述无血清的成份确定的生产培养基包含***1型(IGF-1)。
10.权利要求3的方法，其中所述蛋白质为人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组融合蛋白或细胞因子。
11.一种培养物，其包含：
已被重组工程化以表达蛋白质的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，以及
补充有下列的无血清的成份确定的生产培养基：
(a)至少一种选自Tyr-His、Tyr-Lys、Tyr-Ala、Tyr-Val、His-Gly和Ala-His的二肽；和/或
(b)至少一种选自His-Glu、Glu-His、His-Ser和His-Gln的二肽。
12.权利要求11的细胞培养物，其中所述二肽浓度为0.1g/L至5g/L。
13.权利要求11或12的细胞培养物，其中所述细胞培养物经配制不含蛋白胨。
14.权利要求11或12的细胞培养物，其包含至少两种二肽。
15.权利要求14的细胞培养物，其中一种二肽为Thr-Phe、His-Glu、Glu-His、His-Ser或His-Gln。
16.权利要求15的细胞培养物，其中所述二肽包含Tyr-His和Thr-Phe。
17.权利要求11或12的细胞培养物，其中所述无血清的成份确定的生产培养基包含腐胺、精胺和/或***1型(IGF-1)。
18.权利要求11或12的细胞培养物，其中所述蛋白质为人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组融合蛋白或细胞因子。
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
AU2007294731B2 (en) 2006-09-13 2014-04-17 Abbvie Inc. Cell culture improvements
CA2911256A1 (en) 2008-10-20 2010-12-09 Robert K. Hickman Isolation and purification of antibodies using protein a affinity chromatography
NZ592097A (en) 2008-10-20 2013-01-25 Abbott Lab Viral inactivation during purification of il-12 and il-18 antibodies
US20110262965A1 (en) * 2010-04-23 2011-10-27 Life Technologies Corporation Cell culture medium comprising small peptides
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9334319B2 (en) 2012-04-20 2016-05-10 Abbvie Inc. Low acidic species compositions
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
WO2013176754A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
KR20150043523A (ko) 2012-09-02 2015-04-22 애브비 인코포레이티드 단백질 불균일성의 제어 방법
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
SG11201507230PA (en) 2013-03-12 2015-10-29 Abbvie Inc Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9217168B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
WO2014159579A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
CN104817615A (zh) * 2014-01-30 2015-08-05 陈光健 寡肽cd05及其制备方法和应用
CN104817617A (zh) * 2014-01-30 2015-08-05 陈光健 寡肽分子及其制备方法和应用
CN104817613A (zh) * 2014-01-30 2015-08-05 陈光健 寡肽cd06及其制备方法和应用
EP3371297A1 (en) * 2015-11-02 2018-09-12 Ares Trading S.A. Methods for modulating production profiles of recombinant proteins in perfusion mode
DK3372671T3 (da) * 2017-03-09 2022-01-24 Evonik Operations Gmbh Dyrkningsmedium, som omfatter oligopeptider
DE102017203908B3 (de) 2017-03-09 2018-05-30 Evonik Technochemie Gmbh Kulturmedium, umfassend Oligopeptide
JP2023511291A (ja) * 2020-01-15 2023-03-17 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド 培養細胞から生産された生体物質を連続的に収穫するための装置及び方法
CA3233315A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Evonik Operations Gmbh Salts of dipeptides and their uses in cell culture

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008035631A1 (fr) * 2006-09-20 2008-03-27 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procédé de production d'une substance
WO2010050448A1 (ja) * 2008-10-28 2010-05-06 中外製薬株式会社 ペプチド含有動物細胞培養用培地

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
AU588819B2 (en) 1984-10-29 1989-09-28 Immunex Corporation Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
US5075222A (en) 1988-05-27 1991-12-24 Synergen, Inc. Interleukin-1 inhibitors
WO1990005183A1 (en) 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
DK0939121T4 (da) 1989-09-12 2008-02-04 Ahp Mfg B V TNF-bindende proteiner
US6204363B1 (en) 1989-10-16 2001-03-20 Amgen Inc. Stem cell factor
US5272064A (en) 1989-12-19 1993-12-21 Amgen Inc. DNA molecules encoding platelet-derived growth factor B chain analogs and method for expression thereof
US5149792A (en) 1989-12-19 1992-09-22 Amgen Inc. Platelet-derived growth factor B chain analogs
US5350683A (en) 1990-06-05 1994-09-27 Immunex Corporation DNA encoding type II interleukin-1 receptors
WO1991018982A1 (en) 1990-06-05 1991-12-12 Immunex Corporation Type ii interleukin-1 receptors
DE4022267C2 (de) * 1990-07-12 1994-09-15 Degussa N-Acyldipeptide und deren Verwendung
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
DE69332981T2 (de) 1992-10-23 2004-05-19 Immunex Corp., Seattle Methoden zur herstellung löslicher, oligomerer proteine
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
US5981713A (en) 1994-10-13 1999-11-09 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Antibodies to intereleukin-1 antagonists
ES2253753T3 (es) 1995-06-29 2006-06-01 Immunex Corporation Citocina que induce apoptosis.
US6613544B1 (en) 1995-12-22 2003-09-02 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US6096728A (en) 1996-02-09 2000-08-01 Amgen Inc. Composition and method for treating inflammatory diseases
US5801159A (en) * 1996-02-23 1998-09-01 Galileo Laboratories, Inc. Method and composition for inhibiting cellular irreversible changes due to stress
US6271349B1 (en) 1996-12-23 2001-08-07 Immunex Corporation Receptor activator of NF-κB
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6337072B1 (en) 1998-04-03 2002-01-08 Hyseq, Inc. Interleukin-1 receptor antagonist and recombinant production thereof
US7294481B1 (en) 1999-01-05 2007-11-13 Immunex Corporation Method for producing recombinant proteins
AU1920301A (en) 1999-11-17 2001-05-30 Immunex Corporation Receptor activator of nf-kappa b
TWI384069B (zh) 2004-08-27 2013-02-01 Pfizer Ireland Pharmaceuticals 多胜肽之製法
DE102005046225B4 (de) * 2005-09-28 2012-01-05 Cellca Gmbh Verbessertes Zellkulturmedium
PE20070796A1 (es) 2005-10-24 2007-08-15 Wyeth Corp Metodo de produccion proteica utilizando compuestos anti-senescencia
WO2008154014A2 (en) 2007-06-11 2008-12-18 Amgen Inc. A method for culturing mammalian cells to improve recombinant protein production
US20110262965A1 (en) * 2010-04-23 2011-10-27 Life Technologies Corporation Cell culture medium comprising small peptides

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008035631A1 (fr) * 2006-09-20 2008-03-27 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procédé de production d'une substance
WO2010050448A1 (ja) * 2008-10-28 2010-05-06 中外製薬株式会社 ペプチド含有動物細胞培養用培地

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Advantage of Alagln as an Additive to Cell Culture Medium;Yasufumi Imamoto等;《 Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects》;20100726;1-7 *
Comparison of Cell Lines for Stable Production of Fucose-Negative Antibodies With Enhanced ADCC;Yutaka Kanda 等;《Biotechnology and Bioengineering》;20060411;680-688 *

Also Published As

Publication number Publication date
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US9012178B2 (en) 2015-04-21
SG187198A1 (en) 2013-03-28
HK1185918A1 (zh) 2014-02-28
CN103080300A (zh) 2013-05-01

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