KR19990082430A - 사람 TNFα와 결합하는 사람 항체 - Google Patents

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데보라 제이. 알렌
제라 카이막칼란
보리스 라브코브스키
존 에이. 만코비치
브라이언 티. 맥귀네스
앤드류 제이. 로버츠
폴 사코라파스
헨드리커스 알. 제이. 엠. 후겐붐
데이비드 스쵸엔하우트
트리스탄 제이. 바우겐
마이클 화이트
앨리슨 제이. 윌톤
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Abstract

본 발명은 사람 종양 괴사 인자 α(hTNFα)와 특이적으로 결합하는 사람 항체, 바람직하게는 재조합 사람 항체에 관한 것이다. 이들 항체는 hTNFα에 대한 높은 친화력(예를 들어, Kd= 10-8M 이하) 및 hTNFα 해리에 대한 느린 오프 속도(예를 들어, Koff= 10-3s-1이하)를 갖고, 시험관내 및 생체내에서 hTNFα 활성을 중화시킨다. 본 발명의 항체는 온길이 항체 또는 이것의 항원 결합 부분일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 예를 들어, hTNFα 활성이 유해한 질환을 앓는 사람 환자에서, hTNFα를 검출하고, hTNFα 활성을 억제하는 데에 유용하다. 본 발명의 재조합 사람 항체를 발현시키기 위한 핵산, 벡터 및 숙주 세포, 및 재조합 사람 항체를 합성하는 방법도 본 발명에 포함된다.

Description

사람 ＴＮＦα와 결합하는 사람 항체
종양 괴사 인자 α(TNFα)는 단핵세포 및 대식세포를 포함하는 수 많은 세포 유형에 의해 생성되는 시토카인이며, 본래는 특정한 마우스 종양의 괴사를 유도하는 기능을 기초로 하여 동정되었다[참조: Old,L.(1985)Science 230:630-632]. 계속하여, 카헥시와 관련있는 카켁틴이라 명명되는 인자가 TNFα와 동일한 것으로 밝혀졌다. TNFα는 쇼크(shock)를 매개하는데 관여한다[참조: Beutler, B. 및 Cerami, A.(1988)Annu.Rev.Biochem.57:505-518; Beutler, B. 및 Cerami, A.(1989)Annu.Rev.Immunol.7:625-655]. 더욱이, TNFα는 패혈증, 감염증, 자가면역 질병, 이식편 거부반응 및 이식편대숙주 질병을 포함하는 그 밖의 다양한 사람 질병 및 질환의 병태생리에 관여한다 [참조: Moeller, A., 등 (1990)Cytokine2:162-169; U.S.Patent No. 5,231,024 to Moeller 등; European Patent Publication No. 260610 B1 by Moeller, A., 등 Vailli, P.(1992)Annu. Rev. Immunol.10:411-452; Tracey, K.J. 및 Cerami, A. (1994)Annu. Rev. Med. 45:491-503].
다양한 사람 질환에서의 사람 TNFα(hTNFα)의 유해한 역할로 인해, 치료법은 hTNFα 활성을 억제하거나 중화하도록 고안되어 왔다. 상세하게는, hTNFα와 결합하거나 이를 중화하는 항체가 hTNFα 활성을 억제하는 수단으로서 모색되었다. 가장 초기의 이러한 항체의 일부는 hTNFα로 면역된 마우스의 림프구로부터 제조된 하이브리도마에 의해 분비되는 마우스 단클론성 항체(mAb) 였다 [참조: Hahn T 등, (1985)Proc Natl Acad SciUSA82:3814-3818; Liang, C-M. 등 (1986)Biochem. Biophys. Res. Commun.137:847-854; Hirai, M. 등 (1987)J. Immunol. Methods 96:57-62; Fendly, B.M. 등 (1987)Hybridoma 6:359-370; Moeller, A. 등 (1990)Cytokine 2:162-169; U.S. Patent No. 5,231,024 to Moeller 등; European Patent Publication No. 186833 B1 by Wallach, D.; European Patent Application Publication No. 218868 A1 by Old 등; European Patent Publication No. 260610 B1 by Moeller, A. 등]. 이러한 마우스 항-hTNFα 항체는 종종 hTNFα에 대해 높은 친화력(예를 들어, 10-9M 이상의 Kd)을 나타내고 hTNFα 활성을 중화시킬 수 있지만, 체내에서 사용하는 경우, 짧은 혈청 수명, 특정 사람 이펙터 기능의 유도 불능 및 인체내에서 마우스 항체에 대한 바람직하지 못한 면역 반응("사람 안티-마우스 항체"(HAMA) 반응)과 같은 마우스 항체의 인체내 투여와 관련된 문제들에 의해 제약을 받을 수 있다.
완전한 쥐과 동물 항체의 인체내 사용과 관련된 문제들을 극복하기 위해, 쥐과 동물 항-hTNFα 항체가 더욱 "사람과 유사(human-like)" 하도록 유전공학적으로 처리되었다. 예를 들어, 항체 사슬의 가변 영역이 쥐과 동물 유래되고 항체의 불변 영역이 사람 유래된 키메라 항체가 제조되었다 [참고문헌: Knight, D.M, 등 (1993) Mol. Immunol. 30:1443-1453; PCT Publication No. WO 92/16553 by Daddona, P.E., 등]. 또한, 항체 가변 영역의 고가변(hypervariable) 도메인은 쥐과 동물 유래되지만 가변 영역의 나머지 부분과 항체 불변 영역은 사람 유래된, 인간화된 항체가 또한 제조되었다 [참고문헌: PCT Publication No. WO 92/11383 by Adair, J.R. 등). 그러나, 이러한 키메라 항체 및 인간화된 항체는 여전히 일부 쥐과 동물 서열을 보유하고 있기 때문에, 이들 항체는 특히 장기간 투여되는 경우, 예를 들어 류마티스성 관절염과 같은 만성적 적응증에 대해, 바람직하지 못한 면역 반응, 사람 항-키메라 항체(HACA) 반응을 여전히 유도할 수 있다 [참조: Elliott, M.J. 등 (1994)Lancet344:1125-1127; Elliot, M.J. 등 (1994)Lancet344:1105-1110].
쥐과 동물 mAB에 대한 바람직한 hTNFα 억제물질 또는 이것의 유도체(예를 들어, 키메라 항체 또는 인간화된 항체)는, 이러한 제제가 장기간 사용되는 경우라도 HAMA 반응을 유도하지 않아야 하기 때문에, 전적으로 안티-hTNFα 항체일 것이다. hTNFα에 대한 사람 단클론성 자가항체는 사람 하이브리도마 기술을 이용하여 제조되었다[참고문헌: Boyle, P. 등 (1993)Cell. Immunol.152:556-568; Boyle, P. 등 (1993)Cell.Immunol.152:569-581; European Patent Application Publication No. 614984 A2 by Boyle 등]. 그러나, 이러한 하이브리도마 유래된 단클론성 자가항체는 통상적인 방법에 의해서는 측정할 수 없을 정도로 낮은 hTNFα에 대한 친화력을 갖는 것으로 보고되었고, 용해성 hTNFα와 결합할 수 없고, hTNFα 유도된 세포독성을 중화할 수 없었다 [참조: 상기한 Boyle 등의 문헌]. 사람 하이브리도마 기술의 성공은 hTNFα에 특이적인 자가항체를 생성하는 사람의 림프구 말초혈에 선천적으로 존재하는가에 좌우된다. 특정한 실험은 사람 피검자 내에서 hTNFα에 대한 혈청 자가항체를 검출하였지만[참고문헌: Formsgaar, A. 등 (1989)Scand. J. Immunol.30:219-233; Bendtzen, K. 등 (1990)Prog. Leukocyte Biol.10B:447-452], 그외의 실험은 그렇지 않았다[참고문헌: Leusch, H-G. 등 (1991)J. Immunol. Methods 139:145-147].
자연발생적인 사람 항-hTNFα 항체에 대한 대안적인 항체는 재조합 hTNFα 항체일 것이다. 비교적 낮은 친화력(즉, 10-7M 이하의 Kd) 및 빠른 오프(off) 속도(즉, 10-2sec-1이하의 Koff)를 갖는, hTNFα와 결합하는 재조합 사람 항체가 기술되었다[참고문헌: Griffiths, A.D. 등 (1993)EMBO J.12:725-734]. 그러나, 빠른 해리 속도로 인해, 이들 항체는 치료적 용도로서는 부적합할 것이다. 또한, hTNFα 활성을 중화하지 않지만 세포 표면에 hTNFα가 결합하는 것을 강화시키고 hTNFα의 내면화를 강화시키는 재조합 사람 항-hTNFα가 기술되었다[참고문헌: Lidbury, A. 등 (1994) Biotechnol. Ther. 5:27-45; PCT Publication No. WO 92/03145 by Aston, R. 등].
따라서, 높은 친화력 및 느린 해리 속도로 용해성 hTNFα와 결합하고, hTNFα 유도된 세포독성(체외 및 체내) 및 hTNFα 유도된 세포 활성화를 포함하는 hTNFα 활성을 중화하는 기능을 갖는, 재조합 사람 항체와 같은 사람 항체가 여전히 요구되고 있다.
본 발명은 사람 TNFα와 특이적으로 결합하는 사람 항체, 바람직하게는 재조합 사람 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 높은 친화력 및 느린 해리 속도로 hTNFα와 결합하고, hTNFα 유도된 세포독성(체외 및 체내) 및 hTNFα 유도된 세포 활성화를 포함하는 hTNFα 활성을 중화시킴을 특징으로 한다. 본 발명의 항체는 또한 hTNFβ(림프독소)가 아닌 hTNFα와 결합하고, 사람 TNFα 뿐만 아니라 그 밖의 영장류 TNFα 및 영장류 이외의 동물의 TNFα와 결합하는 기능을 지님을 특징으로 한다.
본 발명의 항체는 온길이(full-length)(예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체) 일 수 있거나 항원 결합 부분(예를 들어, Fab, F(ab')2또는 scFv 단편)만을 포함할 수 있다. D2E7이라 명명되는 본 발명의 가장 바람직한 재조합 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 도메인 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 도메인을 갖는다. 바람직하게는, D2E7 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(LCVR)을 갖는다.
1가지 구체예에 있어서, 본 발명은 1x10-8M 이하의 Kd및 1x10-3s-1이하의 Koff속도상수 (두 값은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정됨)로 사람 TNFα로부터 해리되고, 표준 시험관내 L929 검정법에서 1x10-7M 이하의 IC50을 지니며 사람 TNFα 세포독성을 중화하는, 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 제공한다. 더욱 바람직하게는, 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 5x10-4s-1이하의 Koff, 더욱 바람직하게는 1x10-4s-1이하의 Koff로 사람 TNFα로부터 해리된다. 더욱 바람직하게는, 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 표준 체외 L929 검정법에서 1x10-8M 이하의 IC50, 더욱 바람직하게는 1x10-9M 이하의 IC50, 한층 더 바람직하게는 5x10-10M 이하의 IC50로 사람 TNFα 세포독성을 중화한다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 다음의 특성을 지니는 사람 항체 또는 항원 결합 부분을 제공한다:
a) 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 1x10-3s-1이하의 Koff로 사람 TNFα로부터 해리되고;
b) 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 1, 4, 5, 7 또는 8번 위치에서의 단일 알라닌 치환이나 1, 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9번 위치에서의 1 내지 5개의 아미노산의 보존적 치환에 의해 서열번호 3으로부터 수식된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 도메인을 가지며;
c) 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번 위치에서의 단일 알라닌 치환이나 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및 12번중 하나의 위치에서의 1 내지 5개의 아미노산의 보존적 치환에 의해 서열번호 4로부터 수식된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 도메인을 가진다.
더욱 바람직하게, 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 5x10-4s-1이하의 Koff로 사람 TNFα로부터 해리된다. 한층 더 바람직하게, 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 1x10-4s-1이하의 Koff로 사람 TNFα로부터 해리된다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 1, 4, 5, 7 또는 8번 위치에서의 단일 알라닌 치환에 의해 수식된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 갖는 LCVR 및 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번 위치에서의 단일 알라닌 치환에 의해 서열번호 4로부터 수식된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 HCVR를 지니는 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 제공한다. 더욱 바람직하게, LCVR은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인을 더 가지며, HCVR은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인을 더 갖는다. 한층 더 바람직하게, LCVR은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 더 가지며, HCVR은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 더 갖는다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR을 지닌 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 제공한다. 특정한 구체예에 있어서, 항체는 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 갖는다. 그 밖의 구체예에 있어서, 항체는 Fab 단편, F(ab')2단편 또는 단일 사슬 Fv 단편이다.
그 밖의 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 LCVR, 및 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 및 서열번호 35로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 HCVR을 지닌 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 제공한다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 사람 TNFβ(림프독소)가 아닌 사람 TNFα의 활성을 중화하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 제공한다. 바람직한 구체예에 있어서, 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 사람 TNFα , 침팬지 TNFα, 및 개코원숭이 TNFα, 명주원숭이 TNFα, 게잡이원숭이 TNFα 및 붉은털 원숭이 TNFα로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 또 다른 영장류 TNFα의 활성을 중화시킨다. 바람직하게는, 항체는 하나 이상의 영장류 이외의 동물 TNFα의 활성을 또한 중화시킨다. 예를 들어, 한 가지 하위구체예에 있어서, 단리된 사람 항체 도는 이것의 항원 결합 부분은 개과동물 TNFα의 활성을 또한 중화시킨다. 또 다른 하위구체예에 있어서, 단일된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 돼지 TNFα의 활성을 또한 중화시킨다. 또 다른 하위구체예에 있어서, 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 마우스 TNFα의 활성을 또한 중화시킨다.
본 발명의 또 다른 일면은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 부분을 코드화하는 핵산 분자에 관한 것이다. D2E7 LCVR을 코드화하는 본 발명의 바람직한 핵산은 도 7 및 서열번호 36에 도시된 누클레오티드 서열을 갖는다. D2E7 HCVR을 코드화하는 본 발명의 또 다른 바람직한 핵산은 도 8 및 서열번호 37에 도시된 누클레오티드 서열을 갖는다. 본 발명의 항체 코드화 핵산을 지닌 재조합 발현 벡터 및 이러한 벡터가 도입되는 숙주 세포도 본 발명에 포함되며, 본 발명의 숙주 세포를 배양하여 본 발명의 항체를 제조하는 방법 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 또 다른 일면은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 부분을 사용하여 사람 TNFα 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 한 가지 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 사람 TNFα 활성이 억제되도록 사람 TNFα를 본 발명의 항체 또는 이것의 항원 결합 부분과 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 사람 환자에서의 사람 TNFα 활성을 억제시키도록, TNFα 활성이 유해한 질환에 걸린 사람 환자에 본 발명의 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 투여하는 것을 포함한다. 질환은 예를 들어, 패혈증, 자가면역 질병(예를 들어, 류마티스성 관절염, 알레르기, 다발성 경화증, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염 및 신증), 감염성 질병, 악성종양, 이식편 거부 또는 이식편대숙주 질병, 폐 질환, 뼈 질환, 장 질환 또는 심장 질환일 수 있다.
도 1A 및 1B는 D2E7의 경쇄 가변 영역(D2E7 VL; 서열번호 1에도 나타나 있음), D2E7 VL의 알라닌-스캔 돌연변이체(LD2E7*.A1, LD2E7*.A3, LD2E7*.A4, LD2E7*.A5, LD2E7*.A7 및 LD2E7*.A8), D2E7 관련된 항체 2SD4의 경쇄 가변 영역(2SD4 VL; 서열번호 9에도 나타나 있음) 및 그 외의 D2E7 관련된 경쇄 가변 영역(EP B12, VL10E4, VL100A9, VL100D2, VL10F4, LOE5, VLLOF9, VLL0F10, VLLOG7, VLLOG9, VLLOH1, VLLOH10, VL1B7, VL1C1, VL1C7, VL0.1F4, VL0.1H8, LOE7, LOE7.A 및 LOE7.T)의 아미노산 서열을 도시한다. 도 1A 는 FR1, CDR1, FR2 및 CDR2 도메인을 도시한다. 도 1B는 FR3, CDR3 및 FR4 도메인을 도시한다. 경쇄 CDR1("CDR L1"), CDR2("CDR L2") 및 CDR3("CDR L3") 도메인은 박스로 되어있다.
도 2A 및 2B는 D2E7의 중쇄 가변 영역(D2E7 VH; 서열번호 2에도 나타나 있음), D2E7 VH의 알라닌-스캔 돌연변이체(HD2E7*.A1, HD2E7*.A2, HD2E7*.A3, HD2E7*.A4, HD2E7*.A5, HD2E7*.A6, HD2E7*.A7, HD2E7*.A8 및 HD2E7*.A9), D2E7 관련된 항체 2SD4의 중쇄 가변 영역(2SD4 VH; 서열번호 10에도 나타나 있음) 및 그 외의 D2E7 관련된 중쇄 가변 영역(VH1B11, VH1D8, VH1A11, VH1B12, VH1-D2, VH1E4, VH1F6, VH1G1, 3C-H2, VH1-D2.N 및 VH1-D2.Y)의 아미노산 서열을 도시한다. 도 2B는 FR3, CDR3 및 FR4 도메인을 도시한다. 중쇄 CDR1("CDR H1"), CDR2("CDR H2") 및 CDR3("CDR H3") 도메인은 박스로 되어 있다.
도 3은 사람 항-hTNFα 항체 D2E7에 의한 TNFα 유도된 L929 세포독성의 억제를 쥐과 동물 항-hTNFα 항체 MAK 195와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 사람 항-hTNFα 항체 D2E7에 의한 U-937 세포 상에서의 hTNFα 수용체로의 rhTNFα 결합의 억제를 쥐과 동물 항-hTNFα 항체 MAK 195와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 사람 항-hTNFα 항체 D2E7에 의한 U-937 세포 상에서의 TNFα 유도된 ELAM-1 발현의 억제를 쥐과 동물 항-hTNFα 항체 MAK 195와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 사람 항-hTNFα 항체 D2E7(검은색 막대)의 투여에 의한 D-갈락토사민 감작성 마우스에서의 TNFα 유도된 치사작용으로부터의 보호를 나타내는 막대 그래프이다.
도 7은 D2E7의 경쇄 가변 영역의 누클레오티드 서열을 도시하며, 누클레오티드 서열 아래에는 예측되는 아미노산 서열이 표시되어 있다. CDR L1, CDR L2 및 CDR L3 영역은 밑줄그어져 있다.
도 8은 D2E7의 중쇄 가변 영역의 누클레오티드 서열을 도시하며, 누클레오티드 서열 아래에는 예측되는 아미노산 서열이 표시되어 있다. CDR H1, CDR H2 및 CDR H3 영역은 밑줄그어져 있다.
도 9는 다발성관절염 모형으로서 Tg197 트랜스유전자를 갖는 마우스의 평균 관절 크기에 대한 D2E7 항체 처리의 효과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 높은 친화력, 느린 오프 속도 및 높은 중화력을 지니며 사람 TNFα와 결합하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분에 관한 것이다. 본 발명의 다양한 일면은 항체 및 항체 단편, 및 이들의 약제학적 조성물 뿐만 아니라 이러한 항체 및 단편을 생산하는 숙주 세포에 관한 것이다. 체내 또는 체외에서 사람 TNFα를 검출하거나 사람 TNFα 활성을 억제하기 위해 본 발명의 항체를 사용하는 방법은 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명을 더욱 용이하게 이해할 수 있도록, 먼저 특정한 용어의 뜻을 정의한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "사람 TNFα"(본 명세서에서 hTNFα 또는 간단히 hTNF로 약기됨)는 17kD의 분비형 및 26kD의 막 연관형으로서 존재하는 사람 시토카인을 의미하려고 하며, 이것의 생물학적 활성형은 비공유적으로 결합된 17kD 분자의 3량체로 구성되어 있다. hTNFα의 구조는 예를 들어 문헌[Pennica, D. 등 (1984)Nature 312:724-729; Davis, J.M., 등 (1987)Biochemistry 26:1322-1326; 및 Jones, E.Y., 등 (1989)Nature 338:225-228]에 또한 기재되어 있다. 사람 TNFα란 용어는 표준 재조합 발현 방법에 의해 제조될 수 있거나 알 앤 디 시스템스[R & D Systems, Catalog No. 210-TA, Minneapolis, MN]으로부터 상업적으로 구입할 수 있는 재조합 사람 TNFα(rhTNFα)를 포함하고자 한다.
본 명세서에서 사용되는 "항체"란 용어는 4개의 폴리펩티드 사슬(이황화 결합에 의해 상호연결된 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄)로 이루어진 면역글로불린 분자를 의미하고자 한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 HCVR 또는 VH로 약기됨) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 이루어져 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 LCVR 또는 VL로 약기됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. VH 및 VL 영역은 골격 부위(FR)라 명명되는 더욱 보존되는 부위로 산재된 상보성 결정 부위(CDR)이라 명명되는 고가변 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되고, 다음 순서로 아미노 말단으로부터 카르복시 말단 까지 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
본 명세서에서 사용되는 항체의 "항원 결합 부분"(또는 간단히 "항체 부분")은 항원(예를 들어, hTNFα)과 특이적으로 결합하는 기능을 보유한 하나 이상의 항체 단편을 의미한다. 항체의 항원 결합 기능은 온길이 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 항체의 "항원 결합 부분"이란 용어에 포함되는 결합성 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편[참고문헌: Ward 등, (1989)Nature 341:544-546]; 및 (vi) 단리된 상보성 결정 부위(CDR) 가 있다. 또한, Fv 단편의 2가지 도메인인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩된다고 하더라도, 이러한 2가지 도메인은 이들을 단일의 단백질 사슬[단일 사슬 Fv(scFv)로 공지됨; 참조: Bird 등 (1988)Science242:423-426; 및 Huston 등 (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883]로 만들 수 있는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 이용하여 결합될 수 있으며, 상기 단백질 사슬에서 VL 및 VH 영역은 1가 분자를 형성하도록 접합한다. 이러한 단일 사슬 항체는 항체의 "항원 결합 부분"이란 용어에 또한 포함시키고자 한다. 디아바디(diabody)와 같은 그 밖의 형태의 단일 사슬 항체도 포함시키고자 한다. 디아바디는, VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되지만 동일한 사슬 상의 2가지 도메인 간의 접합을 이루기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 이들 도메인을 또 다른 사슬의 상보성 도메인과 접합시키고 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨 2가의 양쪽 특이적인 항체이다[참조: Holliger, P. 등 (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J. 등 (1994)Structure 2:1121-1123].
또한, 본 발명의 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 항체 또는 항체 부분과 하나 이상의 그 외의 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 결합에 의해 생성된 거대 면역점착(immunoadhesive) 분자의 부분일 수 있다. 이러한 면역점착 분자의 예로는 4량체 scFv 분자[참고문헌: Kipriyanov, S.M. 등 (1995)Human Antibodies and Hybridomas6:93-101]의 제조에 스트렙트아비딘 코아 영역을 사용하는 방법 및 2가의 비오티닐화된 scFv 분자[참고문헌: Kipriyanov, S.M. 등 (1994)Mol.Immunol 31:1047-1058]의 제조에 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그(tag)를 사용하는 방법이 있다. Fab 및 F(ab')2단편과 같은 항체 부분은 전체 항체의 각각의 파파인 또는 펩신 분해와 같은 종래 기술을 이용하여 전체 항체로부터 제조할 수 있다. 더욱이, 항체, 항체 부분 및 면역점착 분자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "사람 항체"란 용어는 사람 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함시키고자 한다. 본 발명의 사람 항체는 예를 들어 CDRs 및 특히 CDR3에 존재하는, 사람 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 코드화되지 않은 아미노산 서열(예를 들어, 임의 또는 부위 특이적 체외 돌연변이유발 또는 체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이체)을 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에 사용된 "사람 항체"란 용어는 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식세포계열로부터 유래된 CDR 서열이 사람 골격 서열로 이식된 항체를 포함하지는 않는다.
본 명세서에 사용된 "사람 재조합 항체"란 용어는, 숙주세포로 트랜스펙션되는 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현시킨 항체(하기 II 절에서 더 설명됨), 재조합된 결합성 사람 항체 라이브러리로부터 단리된 항체(하기 III 절에서 더 설명됨), 사람 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스유전자를 갖는 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체[참조: Taylor, L.D. 등 (1992)Nucl. Acids Res.20:6287-6295], 또는 다른 DNA 서열에 대한 사람 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 그 밖의 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함시키고자 한다. 이러한 재조합 사람 면역글로불린 유전자 서열은 사람 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 특정한 구체예에 있어서, 이러한 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발되고(또는, 사람 Ig 서열에 대해 트랜스유전자를 갖는 동물이 사용되는 경우는 생체내 체세포 돌연변이), 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 사람 생식세포계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 관련되지만, 생체내의 사람 항체 생식세포계열 레퍼터리에는 본래 존재할 수 없는 서열이다.
본 명세서에서 사용된 "단리된 항체"란 용어는 상이한 항원 특이성을 갖는 그 밖의 항체가 실질적으로 갖지 않는 항체(예를 들어, hTNFα와 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 hTNFα 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 갖지 않음)를 의미하고자 한다. 그러나, hTNFα와 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종으로부터의 TNFα 분자와 같은 그 밖의 항원에 대해 교차반응성을 가질 수 있다(하기에 더욱 상세히 논의됨). 더욱이, 단리된 항체는 그 밖의 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 갖지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "중화 항체"(또는 hTNFα 활성을 중화하는 항체")란 용어는 hTNFα와 결합하여 hTNFα와 생체 활성을 억제하는 항체를 의미하고자 한다. hTNFα의 생체 활성의 이러한 억제는, hTNFα 유도된 세포독성(체외 또는 체내 둘 모두), hTNFα 유도된 세포 활성화 및 hTNFα 수용체에 결합하는 hTNFα와 같은 하나 이상의 hTNFα 생체 활성의 지표를 측정함으로써 평가할 수 있다. hTNFα 생체 활성의 이들 지표는 당해 분야에 공지된 다수의 표준 시험관내 또는 생체내 검정법중 하나 이상의 방법에 의해 평가할 수 있다(실시예 4 참조). 바람직하게는, hTNFα 활성을 중화시키는 항체의 기능은 L929 세포의 hTNFα 유도된 세포독성의 억제에 의해 평가된다. hTNFα 활성의 또 다른 파라미터로서, HUVEC 상의 ELAM-1의 hTNFα 유도된 발현을 억제하는 항체의 기능이 hTNFα 유도된 세포 활성화의 척도로서 평가될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "표면 플라즈몬 공명"이란 용어는 바이오센서 매트릭스 내에서, 예를 들어 비아코아 시스템[BIAcore system, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Swenden and Piscataway, NJ]을 사용하여, 단백질 농도의 변화를 검출함으로써 실시간 생체특이적 상호작용을 분석을 가능하게 하는 최적의 현상을 의미한다. 보다 상세한 설명은 실시예 1 및 다음의 참고문헌을 참조하라: [Joensson, U.et al. (1993)Ann. Biol. Clin.51:19-26; Joensson, U.,et al.(1991)Biotechniques11:620-627; Johnsson, B.,et al. (1995)J. Mol. Recognit.8:125-131; and Johnnson, B.,et al.(1991)Anal. Biochem.198:268-277].
본 명세서에 사용된 "Koff"란 용어는 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리에 대한 오프 속도 상수를 의미하고자 한다.
본 명세서에 사용된 "Kd"란 용어는 특수한 항체-항원 상호작용에 대한 해리 상수를 의미하고자 한다.
본 명세서에 사용된 "핵산 분자"란 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하고자 한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게, 이중 가닥 DNA 이다.
hTNFα와 결합하는 항체 또는 항체 부분(예를 들어, VH, VL, CDR3)을 코드화하는 핵산과 관련하여 본 명세서에 사용된 "단리된 핵산 분자"란 용어는 항체 또는 항체 부분을 코드화하는 누클레오티드 서열이, hTNFα 이외의 항원과 결합하는 항체 또는 항체 부분을 코드화하며 본래 인체 게놈 DNA 내의 핵산을 플랭킹시킬 수 있는 그 외의 누클레오티드 서열을 갖고 있지 않은 핵산 분자를 의미하고자 한다. 따라서, 예를 들어, 항-TNFα 항체의 VH 영역을 코드화하는 본 발명의 단리된 핵산은 TNFα 이외의 항원과 결합하는 그 외의 VH 영역을 코드화하는 그 외의 서열을 함유하지 않는다.
본 명세서에 사용된 "벡터"란 용어는 또 다른 핵산과 결합할 수 있는 핵산 분자를 의미하고자 한다. 벡터의 1가지 유형은 "플라스미드"이며, 이는 또 다른 DNA 단편이 리게이션될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 벡터의 또 다른 유형은 또 다른 DNA 단편이 바이러스 게놈 내로 리게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정한 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포 내에서 자기 복제를 할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 그 밖의 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입되는 동안에 숙주 세포의 게놈 내에 통합될 수 있으며, 이로 인해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정한 벡터는 이들이 작동가능하게 결합된 유전자의 발현을 지배할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")라 명명한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"란 용어는, 플라스미드가 가장 보편적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문에 혼용하여 쓰일 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 하는, 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노결합성 바이러스).
본 명세서에 사용된 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")란 용어는 재조합 발현 벡터가 도입되는 세포를 의미하고자 한다. 이러한 용어들은 특수한 주제 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 프로제니도 의미하고자 한다. 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 특정한 변형이 세대를 거듭하면서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 프로제니는 사실상 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본 명세서에서 사용된 용어인 "숙주 세포"의 범위에는 여전히 포함된다.
하기에 본 발명의 다양한 일면을 보다 상세히 설명한다.
I.사람 TNFα와 결합하는 사람 항체
본 발명은 높은 친화력, 낮은 오프 속도 및 높은 중화력을 지니면서 사람 TNFα와 결합하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 사람 항체는 재조합된 중화성 사람 항-hTNFα 이다. 가장 바람직한 본 발명의 재조합된 중화성 항체는 본 명세서에서 D2E7로 언급되며, 도 1A, 1B 및 도 2A, 2B에 각각 도시된 VL 및 VH 서열을 갖는다(D2E7 VL 영역의 아미노산 서열은 또한 서열 1로 도시되고; D2E7 VH 영역의 아미노산 서열은 또한 서열 2로 도시됨). 높은 친화력 및 느린 해리 속도를 나타내는 쥐과 동물 항-hTNFα MAK 195 mAb 및 D2E7과 서열면에서 관련이 있는 또 다른 사람 항-hTNFα인 2SD4와 비교한 D2E7의 결합 특성이 하기에 요약되어 있다:
항체 K(sec) k(Msec) K(M) 화학량론
D2E7 IgG1 8.81 × 10-5 1.91 × 105 6.09 × 10-10 1.2
2SD4 IgG4 8.4 × 10-3 4.20 × 105 2.00 × 10-8 0.8
MAK 195 F(ab')2 8.70 × 10-5 1.90 × 105 4.60 × 10-10 1.4
D2E7 항체 및 관련 항체는 여러 가지 시험관내 및 생체내 검정에 의해 평가된 바와 같이 hTNFα 활성을 중화하는 강력한 기능을 또한 나타낸다 (실시예 4 참조). 예를 들어, 이러한 항체는 약 10-7M 내지 약 10-10M의 IC50값으로 L929 세포의 hTNFα 유도된 세포독성을 중화시킨다. 온길이 IgG1 항체로 발현되는 경우 D2E7은 약 1.25 x 10-10M의 IC50로 L929 세포의 hTNFα 유도된 세포독성을 중화시킨다. 더욱이, D2E7의 중화력은 항체가 Fab, F(ab')2또는 scFv 단편으로 발현되는 경우 유지된다. D2E7은, HUVEC 상에서의 hTNFα 유도된 ELAM-1 발현에 의해 측정된 바와 같이 TNFα 유도된 세포 활성화를 억제하고(IC50= 약 1.85 x 10-10M), U-937 세포 상에서 hTNFα 수용체에 hTNFα가 결합하는 것을 억제한다(IC50= 약 1.56x10-10M). 후자에 대하여, D2E7은 hTNFα가 p55 및 p75 hTNFα 수용체 둘 모두에 결합하는 것을 억제한다. 또한, 항체는 마우스 생체내에서의 hTNFα 유도된 치사작용을 억제한다(ED50= 1 내지 2.5㎍/마우스).
D2E7의 결합 특이성에 관해서는, 이러한 항체는 용해성 hTNFα, 트랜스멤브레인 hTNFα 및 세포 수용체에 결합된 hTNFα를 포함하는 다양한 형태의 사람 TNFα와 결합한다. D2E7은 림프독소(TNFβ), IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IFNγ 및 TGFβ와 같은 그 밖의 시토카인과 특이적으로 결합하지 않는다. 그러나, D2E7은 그 외의 종으로부터의 종양 괴사 인자에 대해 교차반응성을 나타내지 않는다. 예를 들어, 항체는 hTNFα의 중화에 관해 거의 동등한 IC50값으로 5종 이상의 영장류의 동물의 TNFα(침팬지, 개코원숭이, 명주원숭이, 게잡이원숭이 및 붉은털원숭이)의 활성을 중화시킨다 (실시예 4의 E부분 참조). D2E7은 사람 TNFα보다 약 1000배 미만임에도 불구하고, 또한 마우스 TNFα의 활성을 중화시킨다. D2E7은 또한 개과 동물 및 돼지의 TNFα와 결합한다.
한 가지 일면에서, 본 발명은 D2E7 항체 및 항체 부분, D2E7 관련된 항체 및 항체 부분, 및 느린 해리 속도로 hTNFα와 결합하는 높은 친화력 및 높은 중화력과 같은 D2E7과 동등한 특성을 갖는 그 밖의 사람 항체 및 항체 부분에 관한 것이다. 한 가지 구체예에서, 본 발명은, 1 x 10-8M 이하의 Kd및 1 x 10-3s-1이하의 Koff(둘 모두 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정됨)로 사람 TNFα로부터 해리되고, 표준 시험관내 L929 검정에서 1 x 10-7M 이하의 IC50로 사람 TNFα 세포독성을 중화시키는, 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 제공한다. 더욱 바람직하게, 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 5 x 10-4s-1이하의 Koff, 보다 더욱 바람직하게, 1 x 10-4s-1이하의 Koff로 사람 TNFα로부터 해리된다. 더욱 바람직하게, 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 표준 시험관내 L929 검정에서 1 x 10-8M 이하, 보다 더욱 바람직하게, 1 x 10-9M 이하, 보다 더욱더 바람직하게, 5 x 10-10M의 IC50로 사람 TNFα 세포독성을 중화시킨다. 한 가지 바람직한 구체예에서, 항체는 단리된 사람 재조합 항체 또는 이것의 항원 결합 부분이다. 또 다른 구체예에서, 항체는, 사람 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC) 상에서 TNFα 유도된 ELAM-1 발현에 대한 표준 시험관내 검정법을 이용하여 평가된 바와 같이, 또한 TNFα 유도된 세포 활성화를 중화시킨다.
Kd및 Koff를 결정하기 위한 표면 플라즈몬 공명 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. IC50값을 결정하기 위한 표준 시험관내 L929 검정은 실시예 4의 A부분에 기술되어 있다. 사람 배꼽정맥 내피 세포(HUVEC) 상에서의 TNFα 유도된 ELAM-1 발현을 위한 표준 시험관내 검정은 실시예4의 C부분에 기술되어 있다. 전술한 동력학 및 중화 범주를 충족시키거나 충족할 것으로 예측된 재조합 사람 항체의 예로는 다음의 [VH/VL] 쌍을 갖는 항체가 있으며, 이들의 서열은 각각 도 1A, 2A, 및 2B에 도시되어 있다(동력학 및 중화 분석에 대해서는 실시예 2, 3 및 4를 참조): [D2E7 VH/D2E7 VL]; [HD2E7*.A1/D2E7 VL],[HD2E7*.A2/D2E7 VL],[HD2E7*.A3/D2E7 VL],[HD2E7*.A4/D2E7 VL],[HD2E7*.A5/D2E7 VL],[HD2E7*.A6/D2E7 VL],[HD2E7*.A7/D2E7 VL],[HD2E7*.A8/D2E7 VL],[HD2E7*.A9/D2E7 VL],[D2E7 VH/LD2E7*.A1],[D2E7 VH/LD2E7*.A4],[D2E7 VH/LD2E7*.A5],[D2E7 VH/LD2E7*.A7],[D2E7 VH/LD2E7*.A8],[HD2E7*.A9/LD2E7*.A1],[VH1-D2/LOE7],[VH1-D2.N/LOE7.T],[VH1-D2.Y/LOE7.T],[VH1-D2.Y/LOE7.A],[VH1-D2.N/LOE7.A],[VH1-D2/EP B12] 및 [3C-H2/LOE7].
항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화력 면에서 중요한 역할을 한다는 것은 당업 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 또 다른 일면에서, 본 발명은 hTNFα와의 결합에 대해 느린 해리 속도를 가지며 D2E7의 것과 구조적으로 동일하거나 동족의 경쇄 및 중쇄 CDR3 도메인을 갖는 사람 항체에 관한 것이다. 실시예 3에 설명된 바와 같이, D2E7 VL CDR3의 9번 위치는 Koff에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 Ala 또는 Thr에 의해 점유될 수 있다. 따라서, D2E7 VL CDR3에 대한 컨센서스 모티프(consensus motif)는 아미노산 서열 Q-R-Y-N-A-P-Y-(T/A)(서열 3)을 포함한다. 추가적으로, D2E7 VH CDR3의 12번 위치는 Koff에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 Tyr 또는 Asn에 의해 점유될 수 있다. 따라서, D2E7 VH CDR3에 대한 컨센서스 모티프는 아미노산 서열 V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N)(서열 4). 더욱이, 실시예 2에 설명된 바와 같이, D2E7 중쇄 및 경쇄의 CDR3 도메인은 Koff에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 단일 알라닌 잔기에 의한 치환에 순응한다 (VL CDR3 내의 1,4,5,7 또는 8번 위치 또는 VH CDR3 내의 2,3,4,5,6,8,9,10 또는 11번 위치에서). 또한, 당업자는 알라닌에 의한 치환에 대한 D2E7 VL 및 VH CDR3의 순응성이 주어진 경우, 항체의 느린 오프 속도를 보유하면서 CDR3 도메인 내에서 그 외의 아미노산에 의한 치환, 특히 보존적 아미노산에 의한 치환이 가능함을 인지할 것이다. 본 명세서에서 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 1개의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 교체되는 치환을 의미한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 족은 당업 분야에 규정되어 왔으며, 다음과 같은 측쇄를 포함한다: 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-가지 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘). 바람직하게, 1개 내지 5개의 아미노산 치환만이 D2E7 VL 및/또는 VH CDR3 도메인 내에서 이루어진다. 더욱 바람직하게, 1개 내지 3개의 보존적 아미노산 치환만이 D2E7 VL 및/또는 VH CDR3 도메인 내에서 이루어진다. 추가적으로, hTNFα와의 결합에 중요한 아미노산 위치에서는 치환이 이루어지지 않아야 한다. 실시예 3에 나타난 바와 같이, D2E7 VL CDR3의 2번 및 5번 위치 및 D2E7 VH CDR3의 1번 및 7번 위치는 hTNFα와의 상호작용에 중요한 것으로 보이며, 따라서 이러한 위치에서는 보존적 아미노산 치환이 이루어지지 않는 것이 바람직하다 (전술한 바와 같이, D2E7 VL CDR3의 5번 위치에선의 알라닌 치환이 허용된다고 하더라도).
따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 다음과 같은 특징을 갖는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 제공한다:
a) 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같이, 1 x 10-3s-1이하의 Koff속도 상수를 지니며 사람 TNFα로부터 해리되고;
b) 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 1, 4, 5, 7 또는 8번 위치에서의 단일 알라닌 치환 또는 1, 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9번 위치에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 3으로부터 변형된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 도메인을 가지며;
c) 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번 위치에서의 단일 알라닌 치환 또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및 12번중의 하나의 위치에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 4로부터 변형된 아미노산을 포함하는 중쇄 CDR3 도메인을 가진다.
더욱 바람직하게, 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 5 x 10-4s-1이하의 Koff를 지니며 사람 TNFα로부터 해리된다. 보다 더욱 바람직하게, 항체 또는 항원 결합 부분은 1 x 10-4s-1이하의 Koff를 지니며 사람 TNFα로부터 해리된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 1,4,5,7 또는 8번 위치에서의 단일 알라닌 치환에 의해 서열번호 3으로부터 변형된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR), 및 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번 위치에서의 단일 알라닌 치환에 의해 서열번호 4로부터 변형된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 갖는, 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 제공한다. 바람직하게, LCVR은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인(즉, D2E7 VL CDR2)을 더 가지며, HCVR은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인(즉, D2E7 VH CDR2)을 더 가진다. 보다 더욱더 바람직하게, LCVR은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인(즉, D2E7 VL CDR1)을 더 가지며, HCVR은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인(즉, D2E7 VH CDR1)을 더 가진다. VL에 대한 프레임워크 영역은, 바람직하게, Vκl 사람 생식세포계열 족, 더욱 바람직하게, A20 사람 생식세포계열 Vk 유전자, 가장 바람직하게, 도 1A 및 1B에 도시된 D2E7 VL 프레임워크 서열로부터 유래된다. VH에 대한 프레임워크 영역은, 바람직하게, VH3 사람 생식세포계열 족, 더욱 바람직하게, DP-31 사람 생식세포계열 VH 유전자, 가장 바람직하게, 도 2A 및 2B에 도시된 D2E7 VH 프레임워크 서열로부터 유래된다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은, 서열번호 1의 아미노산 서열(즉, D2E7 VL)을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 서열번호 2의 아미노산 서열(즉, D2E7 VH)을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 갖는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 제공한다. 특정한 구체예에 있어서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역과 같은 중쇄 불변 영역을 포함한다. 바람직하게, 중쇄 불변 영역은 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 IgG4 중쇄 불변 영역이다. 더욱이, 항체는 κ 경쇄 불변 영역 또는 λ 경쇄 불변 영역 중의 하나의 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 바람직하게, 항체는 κ 경쇄 불변 영역을 포함한다. 대안적으로, 항체 부분은 예를 들어 Fab 단편 또는 단일 사슬 Fv 단편일 수 있다.
그 밖의 구체예에 있어서, 본 발명은 D2E7 관련된 VL 및 VH CDR3 도메인, 예를 들어 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 제공하며, 이들은 서열번호 3, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR), 또는 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 및 서열번호 35로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 갖는다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 사람 TNFβ가 아닌 사람 TNFα의 활성을 중화시키는 재조합 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 제공한다. 바람직하게, 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 또한 침팬지 TNFα, 및 개코원숭이 TNFα, 명주원숭이 TNFα, 게잡이원숭이 TNFα 및 붉은털 원숭이 TNFα로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 또 다른 영장류 TNFα의 활성을 중화시킨다. 바람직하게, 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 사람, 침팬지 및/또는 또 다른 영장류 동물 TNFα를 표준 시험관내 L929 검정법에서 1 x 10-8M 이하, 더욱 바람직하게, 1 x 10-9M 이하, 보다 더욱 바람직하게, 5 x 10-10M 이하의 IC50으로 중화시킨다. 한 가지 소구체예에 있어서, 항체는 개과 동물 TNFα를 표준 시험관내 L929 검정법에서 바람직하게, 1 x 10-7M 이하, 더욱 바람직하게 1 x 10-8이하, 보다 더욱 바람직하게 5 x 10-9M 이하의 IC50으로 중화시킨다. 또 다른 소구체예에 있어서, 항체는 또한 돼지 TNFα를, 바람직하게, 1 x 10-5M 이하, 더욱 바람직하게, 1 x 10-6M 이하, 보다 더욱 바람직하게, 5 x 10-7M 이하의 IC50으로 중화시킨다. 또 다른 구체예에 있어서, 항체는 또한 마우스 TNFα 활성을, 바람직하게, 1 x 10-4M 이하, 더욱 바람직하게, 1 x 10-5M 이하, 보다 더욱 바람직하게, 5 x 10-6M 이하의 IC50으로 중화시킨다.
본 발명의 항체 또는 항체 부분은 유도체화되거나, 또 다른 기능성 분자(예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질)와 결합될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 부분은 면역부착 분자를 포함하여, 본 명세서에 기술된 사람 항-hTNFα 항체의 유도체화되거나 변형된 형태를 포함하고자 한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은, 또 다른 항체(예를 들어, 양쪽특이적 항체 또는 디아바디), 검출제, 세포독성제, 약제, 및/또는 항체 또는 항체 부분과 또 다른 분자와의 결합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드(예를 들어, 스트렙트아비딘 코아 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와 같은 하나 이상의 그 외의 분자체에 기능적으로 결합될 수 있다(화학적 커플링, 유전자 융합, 비극성 결합 등에 의해).
유도체화된 항체의 1가지 유형은 2개 이상의 항체(예를 들어, 양쪽 특이성 항체를 생성하기 위해, 동일한 유형 또는 상이한 유형을 갖는 항체)를 교차결합시킴으로써 생성된다. 적합한 교차결합제는 적당한 스페이서에 의해 분리된 2개의 상이한 반응군을 갖는 헤테로이중기능성 교차결합제(예를 들어, m-말레이미노벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르) 또는 호모이중기능성 교차결합제(예를 들어, 디숙신이미딜 수버레이트)를 포함한다. 이러한 교차결합제는 피어스 케미칼 컴패니(Pierce Chemical Company, Rockford, IL)로부터 구입할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 부분을 유도체화시킬 수 있는 유용한 검출제는 형광 화합물을 포함한다. 전형적인 형광 검출제는 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 염화 5-디메틸아민-1-나프탈렌술포닐, 피코에리트린 등을 포함한다. 항체는 또한 알칼리성 포스파타아제, 양고추냉이 퍼옥시다아제, 글루코오스 옥시다아제 등과 같은 검출성 효소에 의해 유도체화될 수 있다. 항체가 검출성 효소에 의해 유도체화된 경우, 항체는 효소가 검출가능한 반응 생성물을 생성하는 데에 사용하는 추가의 시약을 첨가함으로써 검출된다. 예를 들어, 검출제인 양고추냉이 퍼옥시다아제가 존재하는 경우, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 검출가능한 착색된 반응 생성물을 유도한다. 항체는 또한 비오틴에 의해 유도체화될 수 있고, 아비딘 또는 스트렙트아비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출될 수 있다.
II.항체의 발현
본 발명의 항체 또는 항체 부분은 숙주 세포에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다.
항체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 숙주 세포를 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 코드화하는 DNA 단편을 함유하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 트랜스펙션시켜, 경쇄 및 중쇄를 숙주 세포에서 발현시키고, 바람직하게, 숙주 세포가 배양되는 배지로 분비시켜, 배지로부터 항체를 회수할 수 있다. 표준 재조합 DNA 방법으로는 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고, 이들 유전자를 재조합 발현 벡터로 통합시키고, 벡터를 숙주 세포에 도입하는 방법이 이용된다. (참조: Sambrook, Fritsch and Maniais(eds),Molecular Cloning;A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. 등 (eds)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Asscociates, (1989) and in U.S. Patent No. 4,816,397 by Boss 등)
D2E7 또는 D2E7 관련된 항체를 발현시키기 위해, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 코드화하는 DNA 단편을 먼저 수득한다. 이들 DNA는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 생식세포계열 경쇄 및 중쇄의 증폭 및 변형에 의해 수득할 수 있다. 사람 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식세포계열 DNA 서열은 당업 분야에 공지되어 있다 [참조: the "Vbase" human germline sequence database; Kabat, E.A. 등 (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fith Edition, U.S. Department tof Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I.M. 등 (1992) "The Repertoire of Human Germline VHSequences Reveals about Fifty Groups of VHSegments with Different Hypervariable Loops"J. Mol. Biol.227:776-798; 및 Cox, J.P.L. 등 (1994)" A Directory of Human Germ-line Vκ Segmetns Reveals a Strong Bias in their Usage"Eur. J. Immunol. 24:827-836; 각각의 문헌 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 명백히 포함되어 있다] D2E7 또는 D2E7 관련된 항체의 중쇄 가변 영역을 코드화하는 DNA 단편을 수득하기 위해, 사람 생식세포계열 VH 유전자의 VH3 족 중의 하나를 표준 PCR에 의해 증폭시킨다. 가장 바람직하게, DP-31 VH 생식세포계열 서열을 증폭시킨다. D2E7 또는 D2E7 관련된 항체의 경쇄 가변 영역을 코드화하는 DNA 단편을 수득하기 위해, 사람 생식세포계열 VL 유전자의 VκI족 중의 하나를 표준 PCR에 의해 증폭시킨다. 가장 바람직하게, A20 VL 생식세포계열 서열을 증폭시킨다. DP-31 생식세포계열 VH 및 A20 생식세포계열 VL 서열의 증폭에 사용하기에 적합한 PCR 프라이머는 표준 방법을 이용하여 앞서 인용된 참고문헌에 기재된 누클레오티드 서열을 기초로 하여 고안될 수 있다.
생식세포계열 VH 및 VL 단편이 수득되면, 이들 서열은 본 명세서에 기재된 D2E7 또는 D2E7 관련된 아미노산 서열을 코드화하기 위해 돌연변이시킬 수 있다. 생식세포계열 VH 및 VL DNA 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열은, 생식세포계열과 다른 D2E7 또는 D2E7 관련된 서열에서의 아미노산 잔기를 확인하기 위해 D2E7 또는 D2E7 관련된 VH 및 VL 아미노산 서열과 먼저 비교한다. 그후, 생식세포계열 DNA 서열의 적합한 누클레오티드를, 변화가 이루어져야 할 누클레오티드를 결정하는 유전 암호를 이용하여 돌연변이시켜, 돌연변이된 생식세포계열 서열이 D2E7 또는 D2E7 관련된 아미노산 서열을 코드화하도록 만든다. 생식세포계열의 돌연변이유발은 PCR 매개성 돌연변이유발(여기서, 돌연변이된 누클레오티드가 PCR 프라이머로 통합됨으로써, PCR 생성물은 돌연변이체를 함유함) 또는 특정부위 돌연변이유발과 같은 표준 방법에 의해 수행된다.
더욱이, PCR 증폭에 의해 수득된 "생식세포계열" 서열이 실제 생식세포계열 배열로부터의 프레임워크 영역에서 아미노산 차이(즉, 예를 들어 체세포 돌연변이의 결과로서, 실제 생식세포계열 서열과 비교할 때 증폭된 서열에서의 차이)를 코드화하는 경우, 이러한 아미노산 차이를 실제 생식세포계열 서열로 다시 변화시키는 것(즉, 생식세포계열 배열로의 프레임워크 잔기의 "복귀돌연변이")이 바람직함을 인식해야 한다.
D2E7 또는 D2E7 관련된 VH 및 VL을 코드화하는 DNA 단편이 수득되기만 하면(전술한 바와 같이, 생식세포계열 VH 및 VL 유전자의 증폭 및 돌연변이유발에 의해), 이들 DNA 단편을, 예를 들어 가변 영역 유전자를 온길이 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위해, 표준 재조합 DNA 기술에으해 더 조작할 수 있다. 이러한 조작에 있어서, VL- 또는 VH-코드화 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 플렉시블 링커와 같은 또 다른 단백질을 코드화하는 또 다른 DNA 단편에 작동가능하게 결합시킨다. 여기서, "작동가능하게 결합된"이란 2개의 DNA 단편이 결합되어, 2개의 DNA 단편에 의해 코드화된 아미노산 서열은 프레임적으로 남아있음을 의미하고자 한다.
VH 영역을 코드화하는 단리된 DNA는, VH-코드화 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)를 코드화하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 결합시킴으로써 온길이 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업 분야에 공지되어 있으며(참조: Kabat, E.A. 등 (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) 및 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있고, 가장 바람직하게, IgG1 또는 IgG4 불변 영역일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자를 위해, VH-코드화 DNA를 중쇄 CH1 불변 영역만을 코드화하는 또 다른 DNA 분자와 결합시킬 수 있다.
VL 영역을 코드화하는 단리된 DNA는, VL-코드화 DNA를 경쇄 불변 영역인 CL을 코드화하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 결합시킴으로써 온길이 경쇄 유전자(또한 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업 분야에 공지되어 있으며(참조: Kabat, E.A. 등 (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) 및 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게, κ 불변 영역이다.
scFv 유전자를 생성시키기 위해, VH- 및 VL-코드화 DNA 단편을, 예를 들어 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 코드화하는 플렉시블 링커를 코드화하는 또 다른 단편에 작동가능하게 결합시켜, VH 및 VL 서열을 플렉시블 링커에 의해 결합된 VL 및 VH 영역에 의해 연속 단일-사슬 단백질로 발현시킬 수 있다 [참조: Bird 등 (1988) Science 242:423-426; Huston 등 (1988) Proc. Natl. Acad Sci.USA 85:5879-5883; McCaffery 등,Nature(1990)348:552-554].
본 발명의 항체 또는 이것의 항체 부분을 발현시키기 위해, 전술한 바와 같이 수득된 부분적인 또는 온길이의 경쇄 및 중쇄를 코드화하는 DNAs를 발현 벡터에 삽입시켜, 유전자를 전사 및 해독 조절 서열과 작동가능하게 결합시킨다. 여기서, "작동가능하게 결합시킨"이란 용어는 항체 유전자를 벡터 내에 리게이션시켜, 벡터 내의 전자 및 해독 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 해독을 조절하는 계획된 기능을 수행하게 하는 것을 의미하고자 한다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 적합하도록 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터에 삽입시킬 수 있지만, 두 유전자를 동일한 발현 벡터에 삽입시키는 것이 보다 일반적이다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적인 제한 부위의 리게이션 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 리게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입시킨다. D2E7 또는 D2E7 관련된 경쇄 또는 중쇄 서열의 삽입 전에, 발현 벡터는 이미 항체 불변 영역 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, D2E7 또는 D2E7 관련된 VH 및 VL 서열을 온길이 항체 유전자로 전환시키는 한 가지 방법은 이들 서열을 이미 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 코드화하는 발현 벡터 내에 삽입시켜, VH 분획을 벡터 내의 CH 분획(들)에 작동가능하게 결합시키고, VL 분획을 벡터 내의 CL 분획에 작동가능하게 결합시키는 것이다. 부가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진시키는 신호 펩티드를 코드화할 수 있다. 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 프레임적으로 결합되도록 항체 사슬 유전자를 벡터 내에 클로닝시킬 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자 뿐만 아니라, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 함유한다. "조절 서열"이란 용어는 하에 사슬 유전자의 전사 또는 해독을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 그 밖의 발현 조절 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)을 포함하고자 한다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 다음 문헌에 기술되어 있다. [Goeddel;Gene Expression Technology;Methods in Enzymology185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]. 당업자라면 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 고안이 형질전환시키려는 숙주 세포, 소망하는 단백질 발현 수준 등의 선택과 같은 인자에 좌우될 수 있다. 포유동물 숙주세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 세포확대바이러스(CMV)(예를 들어, CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40(SV40)(예를 들어, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 포유동물 세포에서 고농도의 단백질 발현을 유도하는 바이러스성 요소를 포함한다. 다음의 특허 문헌에는 바이러스성 조절 요소 및 이것의 서열에 대한 부가적인 설명이 기술되어 있다. [U.S. Patent No.5,168,062 by Stinski, U.S. Patent No.4,510,245 by Bell 등, 및 U.S. Patent No. 7,968,615 by Schaffner 등].
항체 사슬 유전자 및 조절 서열 뿐만 아니라, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기원)과 같은 추가 서열을 함유할 수 있다. 선택가능 마커 유전자는 벡터를 도입시킨 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(참조: U.S. Patents Nos. 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017, all by Axel 등). 예를 들어, 전형적으로 선택가능 마커 유전자는 벡터를 도입시킨 숙주 세포 상에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트랙세이트와 같은 약제에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택가능 마커 유전자는 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트랙세이트 선택/증폭에 의해 dhfr-숙주 세포에서 사용됨) 및neo유전자(G418 선택용).
경쇄 및 중쇄 사슬의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코드화하는 발현 벡터(들)을 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 트랜스펙션시킨다. 다양한 표현방식을 갖는 "트랜스펙션"이란 외래 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 도입시키는 데에 보편적으로 이용되는 광범위한 기술, 예를 들어 일렉트로포레이션, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 등을 포함하고자 한다. 본 발명의 항체를 원핵 숙주세포 또는 진핵 숙주세포 둘 모두에서 발현시킬 수 있다고 하더라도, 진핵숙주세포, 가장 바람직하게, 포유동물 숙주세포에서 항체를 발현시키는 것이 가장 바람직한데, 이는 이러한 진핵세포, 특히 포유동물 세포가 적당하게 폴딩되고 면역적으로 활성인 항체를 조립하고 분비하는 데에 있어 원핵세포 보다 알맞기 때문이다. 항체 유전자의 원핵세포 발현은 활성 항체의 고수율 생산에 비효율적인 것으로 보고되어 왔다[참고문헌: Boss, M.A. 및 Wood, C.R. (1985)Immunology Today6:12-13].
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기에 바람직한 포유동물 숙주세포는 중국산 햄스터 난소(CHO 세포)(dhfr-CHO 세포를 포함함[참고문헌: Urlaub 및 Chasin, (1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:4216-4220], DHFR 선택가능 마커와 사용됨[참고문헌: R.J. Kaufman 및 P.A.Sharp(1982)Mol. Biol.159:601-621]), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 코드화하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주세포 내로 도입시키는 경우, 항체는, 숙주 세포에서 항체가 발현되기에, 또는 가장 바람직하게, 숙주세포가 성장하는 배양기 내로 항체를 분비시키기에 충분한 시간 동안 숙주세포를 배양함으로써 생성시킨다. 항체는 표준 단백질 정제법을 이용하여 배양기로부터 회수할 수 있다.
숙주 세포는 Fab 단편 또는 scFv 분자와 같은 온전한 항체의 부분을 생성시키는 데에 또한 사용할 수 있다. 상기 과정에 대한 변형은 본 발명의 범위 내에 포함됨이 인식될 것이다. 예를 들어, 숙주세포를 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄(둘 모두는 아님)를 코드화하는 DNA로 트랜스펙션시킴이 바람직할 것이다. 재조합 DNA 기술은 hTNFα와의 결합에 불필요한 경쇄 및 중쇄 중의 하나 또는 둘 모두를 코드화하는 일부 또는 모든 DNA를 제거하는 데에 또한 이용할 수 있다. 이러한 절단된 DNA 분자로부터 발현되는 분자는 또한 본 발명의 항체에 포함된다. 부가하여, 이중기능성 항체는 1개의 중쇄 및 경쇄가 본 발명의 항체이고 나머지 중쇄 및 경쇄가 hTNFα 이외의 항원에 특이적이며, 표준 화학적 교차결합법에 의해 본 발명의 항체를 제 2의 항체에 교차결합시킴으로써 생성시킬 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이것의 항원 결합 부분의 재조합 발현을 위한 바람직한 시스템에 있어서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 모두를 코드화하는 재조합 발현 벡터를 칼슘 포스페이트 매개성 트랜스펙션에 의해 dhfr-CHO 세포 내에 도입시킨다. 재조합 발현 벡터 내에는, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 고농도의 유전자 전사를 유도하기 위해 각각 인핸서/프로모터 조절 요소(예를 들어, SV40, CMV, 아데노바이러스 등에서 유래된 CMV 인핸서/ AdMLP 프로모터 조절 요소 또는 SV40 인핸서/ AdMLP 프로모터 조절 요소)와 작동가능하게 결합되어 있다. 재조합 발현 벡터는, 메토트랙세이트 선택/증폭을 이용하여 벡터로 트랜스펙션시킨 CHO 세포의 선택을 가능하게 하는 DHFR 유전자를 또한 함유하고 있다. 선택된 형질전환체 숙주 세포는 항체 중쇄 및 경쇄를 발현시키도록 배양하고, 온전한 항체는 배양기로부터 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 트랜스펙션시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주세포를 배양하고, 배양기로부터 항체를 회수한다.
전술한 관점에서 보면, 본 발명의 일면은 핵산, 벡터, 및 본 발명의 항체 및 항체 부분의 재조합 발현에 사용될 수 있는 숙주세포 조성물에 관한 것이다. D2E7 경쇄 가변 영역을 코드화하는 누클레오티드 서열은 도 7 및 서열번호 36에 도시되어 있다. LCVR의 CDR1 도메인은 70 내지 102개의 누클레오티드를 포함하고, CDR2 도메인은 148 내지 168개의 누클레오티드를 포함하고, CDR3 도메인은 265 내지 291개의 누클레오티드를 포함한다. D2E7 중쇄 가변 영역을 코드화하는 누클레오티드 서열은 도 8 및 서열번호 37에 도시되어 있다. HCVR의 CDR1 도메인은 91 내지 105개의 누클레오티드를 포함하고, CDR2 도메인은 148 내지 198개의 누클레오티드를 포함하고, CDR3 도메인은 295 내지 330개의 누클레오티드를 포함한다. 본 발명의 당업자라면 D2E7 관련된 항체 또는 이것의 부분을 코드화하는 누클레오티드 서열(예를 들어, CDR3 도메인과 같은 CDR 도메인)은 유전 암호 및 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 D2E7 LCVR 및 HCVR을 코드화하는 누클레오티드 서열로부터 유도할 수 있다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은, 서열번호 3의 아미노산 서열(즉, D2E7 VL CDR3), 또는 1,4,5,7 또는 8번 위치에서의 단일 알라닌 치환 또는 1,3,4,6,7,8 및/또는 9번 위치에서의 1 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 3으로부터 변형된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 도메인을 코드화하는 단리된 핵산을 제공한다. 이러한 핵산은 CDR3 영역만을 코드화할 수 있지만, 더욱 바람직하게, 완전한 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)을 코드화한다. 예를 들어, 핵산은 서열번호 5의 아미노산 서열(즉, D2E7 VL CDR2)을 포함하는 CDR2 도메인 및 서열번호 7의 아미노산 서열(즉, D2E7 VL CDR1)을 포함하는 CDR1 도메인을 갖는 LCVR을 코드화할 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열(즉, D2E7 VH CDR3), 또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번 위치에서의 단일 알라닌 치환 또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및 12번중의 하나 이상의 위치에서의 1 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 4로부터 변형된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 도메인을 코드화하는 단리된 핵산을 제공한다. 이러한 핵산은 CDR3 영역만을 코드화할 수 있지만, 더욱 바람직하게, 완전한 중쇄 가변 영역(HCVR)을 코드화한다. 예를 들어, 핵산은 서열번호 6의 아미노산 서열(즉, D2E7 VH CDR2)를 포함하는 CDR2 도메인 및 서열번호 8의 아미노산 서열(즉, D2E7 VH CDR1)을 포함하는 CDR1 도메인을 갖는 HCVR을 코드화할 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은, 예를 들어 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20. 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 및 서열번호 35로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 D2E7 관련된 CDR3 도메인을 코드화하는 단리된 핵산을 제공한다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열(즉, D2E7 LCVR)을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 코드화하는 단리된 핵산을 제공한다. 바람직하게, 이러한 핵산이 서열번호 36의 누클레오티드 서열을 포함한다고 하더라도, 당업자라면 유전 암호의 축중으로 인해 그 밖의 누클레오티드 서열이 서열번호 1의 아미노산 서열을 코드화할 수 있음을 인식할 것이다. 핵산은 LCVR만을 코드화할 수 있거나, LCVR에 작동가능하게 결합되는 항체 경쇄 불변 영역을 또한 코드화할 수 있다. 한 가지 구체예에 있어서, 이러한 핵산은 재조합 발현 벡터 안에 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열(즉, D2E7 HCVR)을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역을 코드화하는 단리된 핵산을 제공한다. 바람직하게, 이러한 핵산이 서열번호 37의 누클레오티드 서열을 포함한다고 하더라도, 당업자라면 유전 암호의 축중으로 인해 그 밖의 누클레오티드 서열이 서열번호 2의 아미노산 서열을 코드화할 수 있음을 인식할 것이다. 핵산은 HCVR만을 코드화할 수 있거나, HCVR에 작동가능하게 결합되는 중쇄 불변 영역을 또한 코드화할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 IgG1 또는 IgG4 불변 영역을 포함할 수 있다. 한 가지 구체예에 있어서, 이러한 핵산은 재조합 발현 벡터 안에 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 재조합 사람 항체가 합성될 때까지 본 발명의 숙주 세포를 적당한 배양기 내에서 배양함으로써 본 발명의 재조합 사람 항체를 합성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 배양기로부터 재조합 사람 항체를 단리시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
III.재조합 사람 항체의 선택
본 명세서에 기재된 D2E7 또는 D2E7 관련된 항체 뿐만 아니라 본 발명의 재조합 사람 항체는 사람 림프구로부터 유래된 mRNA로부터 제조된 사람 VL 및 VH cDNAs를 사용하여 제조된, 재조합 연합 항체 라이브러리, 바람직하게, scFv 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리시킬 수 있다. 이러한 라이브러리의 제조 및 스크리닝 방법은 당업 분야에 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리의 생성을 위해 시판되는 키트(예를 들어, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalog no. 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAPTMphage display kit, catalog no. 240612) 뿐만 아니라, 항체 디스플레이 라이브러리의 생성 및 스크리닝에 사용하기에 특히 유용한 방법 및 시약의 예로는 다음 문헌들을 참조하라 [Ladner 등, U.S. Patent No. 5,223,409; Kang 등 PCT Publication No. WO 92/18619; Dower 등 PCT Publication No. WO 91/17271; Winter 등 PCT Publication No. WO 92/20791; Markland 등 PCT Publication No. WO 92/15679; Breitling 등 PCT Publication No. WO 93/01288; McCafferty 등 PCT Publication No. WO 92/01047; Garrard 등 PCT Publication No. WO 92/09690; Fuchs 등 (1991)Bio/Technology 9:1370-1372; Hay 등 (1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse 등 (1989)Science 246:1275-1281; McCafferty 등,Nature(1990)348:552-554; Griffiths 등 (1993)EMBO J 12:725-734; Hawkins 등 (1992)J Mol Biol 226:889-896; Clackson 등 (1991)Nature 352:624-628; Gram 등 (1992)PNAS 89:3576-3580; Garrad 등 (1991)Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom 등 (1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137; 및 Barbas 등 (1991)PNAS 88:7978-7982].
바람직한 구체예에 있어서, hTNFα에 대한 높은 친화력 및 낮은 오프 속도 상수를 갖는 사람 항체를 단리시키기 위해, 후겐붐(Hoogenboom) 등의 특허공보 제 WO 93/06213호에 기술된 방법인 에피토프 각인 또는 유도 선택을 이용하여 hTNFα에 대해 유사한 결합 활성을 갖는 사람 중쇄 및 경쇄 서열을 선택하도록 hTNFα에 대해 높은 친화력 및 낮은 오프 속도 상수를 갖는 쥐과 동물 항-hTNFα 항체(예를 들어, MAK 195, ECACC 기탁번호 제 87 050801호인 하이브리도마)를 먼저 사용한다. 이러한 방법에 사용되는 항체 라이브러리는 바람직하게 다음의 문헌에 기술된 바와 같이 제조 및 스크리닝된 scFv 라이브러리이다 [참고문헌: McCafferty 등, PCT Publication No. WO 92/01047, McCafferty 등,Nature(1990)348:552-554; 및 Griffiths 등, (1993)EMBO J 12:725-734]. scFv 항체 라이브러리는 바람직하게 항원으로서 재조합 사람 TNFα를 사용하여 스크리닝한다.
최초의 사람 VL 및 VH 분획이 선택되면, 최초로 선택된 VL 및 VH 분획의 상이한 쌍을 hTNFα 결합을 위해 스크리닝하는 "믹스 앤 매치(mix and match)" 실험을 수행하여 소망하는 VL/VH 쌍 조합을 선택한다. 부가적으로, hTNFα 결합을 위한 친화력을 더 향상시키고/시키거나 오프 속도 상수를 더 감소시키기 위해, 소망하는 VL/VH 쌍(들)의 VL 및 VH 분획을, 바람직하게, VH 및/또는 VL의 CDR3 영역 내에서 자연 면역 반응 동안에 항체의 친화력 성숙을 초래하는 생체내 체세포 돌연변이 방법과 유사한 방법으로 무작위적으로 돌연변이시킬 수 있다. 이러한 생체내 친화력 성숙은 각각 VH CDR3 또는 VL CDR3에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 VH 및 VL 영역을 증폭시킴으로써 달성될 수 있으며, 이러한 프라이머는 특정한 위치에서 4개의 누클레오티드 염기의 무작위 혼합물로 "스파이킹(spike)"시켜, 생성되는 PCR 생성물이 무작위 돌연변이체가 VH 및/또는 VL CDR3 영역으로 도입시킨 VH 및 VL 분획을 코드화하게 만들었다. 이러한 무작위적으로 돌연변이시킨 VH 및 VL 분획은 hTNFα와의 결합을 위해 리스크리닝할 수 있고, hTNFα 결합에 대해 높은 친화력 및 낮은 오프 속도을 나타내는 서열을 선택할 수 있다.
선택된 항체 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 생식세포계열 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열과 비교될 수 있다. 선택된 VL 및/또는 VH 사슬의 특정 프레임워크 잔기가 생식세포계열 배열과 상이할 경우(예를 들어, 파지 라이브러리 제조에 사용된 면역글로불린의 체세포 돌연변이의 결과로써), 선택된 항체의 변형된 프레임워크 잔기를 생식세포계열 배열로 "복귀돌연변이"시키는 것이(즉, 선택된 항체의 프레임워크 아미노산 서열을 변화시켜 생식세포계열 프레임워크 아미노산 서열과 동일하게 만듦) 바람직할 수 있다. 프레임워크 잔기의 이러한 "복귀돌연변이"(또는 "생식세포계열화")는 특이적인 돌연변이체를 도입시키는 표준 분자생물학 방법(예를 들어, 특정부위 돌연변이유발; PCR 매개성 돌연변이유발 등)에 의해 달성될 수 있다.
재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터 본 발명의 항-hTNFα 항체의 스크리닝 및 단리를 수행한후, 선택된 항체를 코드화하는 핵산은 디스플레이 패키지(예를 들어, 파지 게놈으로부터)로부터 회수할 수 있고, 표준 재조합 DNA 기술에 의해 그 밖의 발현 벡터로 서브클로닝시킬 수 있다. 소망에 따라, 핵산은 본 발명의 그 밖의 항체 형태를 생성시키기 위해 더 조작될 수 있다(예를 들어, 추가의 불변 부위와 같은 추가의 면역글로불린 도메인을 코드화하는 핵산에 결합시킴). 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리시킨 재조합 사람 항체를 발현시키기 위해, 상기 II 부분에 보다 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 항체를 코드화하는 DNA를 재조합 발현 벡터로 클로닝시키고, 포유동물 숙주 세포로 도입시킨다.
IV.약제학적 조성물 및 약제학적 투여
본 발명의 항체 및 항체 부분은 환자에게 투여하기에 적당한 약제학적 조성물로 혼입시킬 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 부분 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"란 생리학적으로 적합한, 모든 용매, 분산매, 코우팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 1가지 이상의 물, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합물이 있다. 다수의 경우에 있어서, 조성물 중에 예를 들어, 당, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 폴리알코올, 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직하다. 약제학적으로 허용되는 담체는, 항체 또는 항체 부분의 저장 기간 또는 효능을 강화시키는 습윤제, 에멀션화제, 방부제 또는 완충제와 같은 소량의 보조 물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들 조성물은 예를 들어, 액체 용액(예를 들어, 주사가능하고 주입가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 분말, 리포솜 및 좌약과 같은 액체, 반고체 및 고체 제형을 포함한다. 바람직한 형태는 투여 방식 및 치료 적용에 좌우된다. 일반적으로 바람직한 형태는 그 밖의 항체에 의한 사람의 수동 면역화에 사용되는 것과 유사한 조성물과 같은 주사가능하거나 주입가능한 용액의 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구적(예를 들어, 정맥내, 피하, 복막내, 근내)인 것이다. 바람직한 구체예에 있어서, 항체는 정맥 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 항체는 근내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
일반적으로, 치료 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 무균적이고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 분산액, 리포솜, 또는 고농도 약제에 적합한 그 밖의 정연한 구조로 제형화시킬 수 있다. 주사가능한 무균 용액은 적당한 용매 중의 필요량의 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체 부분)을 상기 열거한 성분 중의 1가지 또는 이들의 조합물과 통합시키고, 필요에 따라 여과 멸균법을 수행함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산매 및 상기 열거한 성분 중의 그 밖의 필요한 성분을 함유하는 무균 비히클에 혼입시킴으로써 제조한다. 주사가능한 무균 용액 제조용 무균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조법이며, 이들 방법은 활성 성분 + 미리 멸균여과시킨 용액으로부터의 추가의 소망하는 성분을 갖는 분말을 산출시킨다. 용액의 적합한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코우팅의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 주사가능한 조성물의 장기적인 흡수는 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 조성물 내에 포함시킴으로써 일으킬 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 부분은 당업 분야 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다고 하더라도, 다수의 치료 적용에 대해 바람직한 투여 경로/방식은 정맥 주사 또는 주입이다. 당업자라면 투여 경로/방식은 소망하는 결과에 따라 다르다는 것을 인식할 것이다. 특정한 구체예에 있어서, 활성 화합물은, 삽입물, 경피 패취 및 미세캡슐화 운반 시스템을 포함하는 조절된 방출 제형과 같은, 빠른 방출에 대해 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조할 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성이고 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 다수의 방법은 특허되어 있거나 당업자들에게 일반적으로 공지되어 있다. [참조:Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]
특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 예를 들어, 비활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 경구적으로 투여될 수 있다. 화합물(및 소망에 따라 그 밖의 성분)은 또한 경질 또는 연질 껍질 젤라틴 캡슐 내에 넣거나, 정제로 압착시키거나, 환자의 식이에 직접 혼입시킬 수 있다. 경구 치료적 투여를 위해, 화합물을 부형제와 통합시켜, 섭취가능한 정제, 뷰칼 정제, 트로키, 캡슐, 일릭서, 현탁액, 시럽, 와퍼 등의 형태로 사용할 수 있다. 비경구적 이외의 투여에 의해 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물을, 이것의 불활성화를 방지하는 물질로 코우팅시키거나 이러한 물질과 동시투여하는 것이 필요할 수 있다.
보충적인 활성 화합물이 또한 조성물내로 혼입될 수 있다. 특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 TNFα 활성이 해로운 질환을 처리하는 데에 유용한 하나 이상의 치료제와 동시제형화되고/되거나 동시투여된다. 예를 들어, 본 발명의 항-hTNFα 항체 또는 항체 부분은 그 외의 표적과 결합하는 하나 이상의 추가 항체(예를 들어, 그 외의 시토카인 또는 세포 표면 분자와 결합하는 항체), 하나 이상의 시토카인, 용해성 TNFα 수용체(참조: PCT Publication No. WO 94/06476) 및/또는 hTNFα 생성 또는 활성을 억제하는 하나 이상의 화학제(예를 들어, PCT Publication No. WO 93/19751에 기술되어 있는 시클로헥산-일리덴(cyclohexane-ylidene) 유도체)와 동시제형화되거나/되고 동시투여될 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 본 발명의 항체는 둘 이상의 전술한 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 조합 치료법은 적은 용량의 투여되는 치료제를 유리하게 이용할 수 있기 때문에, 다양한 단일치료법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 회피할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 부분과 조합될 수 있는 류마티스성 관절염에 대한 치료제로는 다음과 같은 예들이 있지만 이들에 제한되는 것은 아니다: 비스테로이드성 소염약(들)(NSAIDs); 시토카인 억제 소염약(들)(CSAIDs); CDP-571/BAY-10-3356(인간화된 항-TNFα 항체; Celltech/Bayer); cA2(키메라 항-TNFα 항체; Centocor); 75kdTNFR-IgG(75kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Immunex; 참조:Arthritis & Rheumatism(1994) Vol.37,S295;J. Invest. Med.(1996) Vol.44,235A); 55kdTNFR-IgG(55kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (비고갈성 영장류화된 항-CD4 항체; IDEC/SmithKline; 참조:Arthritis & Rheumatism(1995) Vol.38,S185); DAB 486-IL-2 및/또는 DAB 389-IL-2(IL-2 융합 단백질; Seragen; 참조:Arthritis & Rheumatism(1993) Vol.36, 1223); Anti-Tac(인간화된 항-IL-2Rα; Protein Design Labs/Roche); IL-4(소염 시토카인; DNAX/Schering); IL-10(SCH 52000; 재조합 IL-10, 소염 시토카인; DNAX/Schering); IL-4; IL-10 및/또는 IL-4 작용물질(예를 들어, 작용물질 항체); IL-1RA(IL-1 수용체 길항물질; Synergen/Amgen); TNF-bp/s-TNFR(용해성 TNF 결합 단백질; 참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39,No.9(supplement), S284;Amer. J. Physiol.- Heart and Circulatory Physiology(1995) Vol.268, pp. 37-42); R973401(포스포디에스테라아제 타입 IV 억제물질; 참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39,No. 9(supplement),S282); MK-966(COX-2 억제물질; 참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39,No.9(supplement),S81); Iloprost(참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39,No.9(supplement),S82); 메토트랙세이트; 탈리도미드(thalidomide)(참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39,No.9(supplement),S282) 및 탈리도미드 관련된 약제(예를 들어, Celgen); 레플루노미드(leflunomide)(소염 및 시토카인 억제물질; 참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39,No.9(supplement),S131;Inflammation Research(1996) Vol.45,pp. 103-107); 트래넥삼산(tranexamic acid)(플라스미노겐 활성화 억제물질; 참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39,No.9(supplement),S284); T-614(시토카인 억제물질; 참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39,No.9(supplement),S282); 프로스타글란딘 E1(참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39,No.9(supplement),S282); 테니답(Tenidap)(비스테로이드성 소염약; 참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39,No.9(supplement),S280); 나프록센(비스테로이드성 소염약; 참조:Neuro Report(1996) Vol.7, pp.1209-1213); 멜록시캄(비스테로이드성 소염약); 이부페론(비스테로이드성 소염약); 피록시캄(비스테로이드성 소염약); 디클로페낙(비스테로이드성 소염약); 인도메타신(비스테로이드성 소염약); 술파살라진(참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39, No.9(supplement), S281); 아자티오프린(참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39, No.9(supplement), S281); ICE 억제물질(효소인 인터루킨-1β 전환 효소의 억제물질); zap-70 및/또는 lck 억제물질(티로신 키나아제 zap-70 또는 lck의 억제물질); VEGF 억제물질 및/또는 VEGF-R 억제물질(혈관 내피 세포 성장 인자 또는 혈관 내피 세포 성장 인자 수용체의 억제물질; 맥관형성의 억제물질); 코르티코스테로이드 소염약(예를 들어, SB203580); TNF-전환효소 억제물질; 항-IL-12 항체; 인터루킨-11(참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39, No.9(supplement), S296); 인터루킨-13(참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39, No.9(supplement), S308); 인터루킨-17 억제물질(참조:Arthritis & Rheumatism(1996) Vol.39, No.9(supplement), S120); 금; 페니실아민; 클로로퀸; 히드록시클로로퀸; 클로람부실; 시클로포스파미드; 시클로스포린; 전체 림프양 방사선조사; 항-흉선세포 글로불린; 항-CD4 항체; CD5-톡신; 경구 투여된 펩티드 및 콜라겐; 로벤자리트 2나트륨; 시토카인 조절제(CRAs) HP228 및 HP466(Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ICAM-1 안티센스 포스포로티오에이트 올리고데옥시누클레오티드(ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); 용해성 보체 수용체 1(TP10; T Cell Sciences, Inc.); 프레드니손; 오르고테인; 글리코사미노글리칸 폴리술페이트; 미노시클린; 항-IL2R 항체; 해양 및 식물 지질(어류 및 식물 종자 지방산; 참조: DeLuca 등. (1995)Rheum. Dis. Clin. North Am.21:759-777); 오라노핀; 페닐부타존; 메클로페남산; 플루페남산; 정맥내 면역글로불린; 질레우톤; 미코페놀산(RS-61443); 타크로리무스(FK-506); 시롤리무스(라파마이신); 아미프릴로오스(테라펙틴); 클라디리빈(2-클로로데옥시아데노신); 및 아자리빈.
본 발명의 항체 또는 항체 부분과 조합될 수 있는 염증성 장 질환에 대한 치료제로는 다음과 같은 예들이 있지만 이들에 제한되는 것은 아니다: 부데노시드; 상피 성장 인자; 코르티코스테로이드; 시클로스포린, 술파살라진; 아미노살리실레이트; 6-메르캅토퓨린; 아자티오프린; 메트론이미다졸; 리폭시제나아제 억제물질; 메살아민; 올살아진; 발살라지드; 산화방지제; 트롬복산 억제물질; IL-1 수용체 길항물질; 항-IL-1β 단클론성 항체; 항-IL-6 단클론성 항체; 성장 인자; 엘라스타아제 억제물질; 피리디닐-이미다졸 화합물; CDP-571/BAY-10-3356(인간화된 항-TNFα 항체; Celltech/Bayer); cA2(키메라 항-TNFα 항체; Centocor); 75kdTNFR-IgG(75kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Immunex; 참조:Arthritis & Rheumatism(1994) Vol.37, S295;J. Invest. Med.(1996) Vol.44, 235A); 55kdTNFR-IgG(55kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Hoffmann-LaRoche); 인터루킨-10(SCH 52000; Schering Plough); IL-4; IL-10 및/또는 IL-4 작용물질(예를 들어, 작용물질 항체); 인터루킨-11; 프레드니솔론의 글루쿠로니드- 또는 덱스트란-컨쥬게이트된 프로드러그, 덱사메타손 또는 버데소니드; ICAM-1 안티센스 포스포로티오에이트 올리고데옥시누클레오티드(ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); 용해성 보체 수용체 1(TP10:T Cell Sciences, Inc.); 완속 방출 메살라진; 메토트렉세이트; 혈소판 활성 인자(PAF)의 길항물질; 시프로플록사신; 및 리그노카인.
본 발명의 항체 또는 항체 부분과 조합될 수 있는 다발성 경화증에 대한 치료제로는 다음과 같은 예들이 있지만 이들에 제한되는 것은 아니다: 코르티코스테로이드; 프레드니솔론; 메틸프레드니솔론; 아자티오프린; 시클로포스포파미드; 시클로스포린; 메토트렉세이트; 4-아미노피리딘; 티자니딘; 인터페론-β1a(AvonexTM; Biogen); 인터페론-β1b(BetaseronTM; Chiron/Berlex); 코폴리머 1(Cop-1; CopaxoneTM; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); 고압 산소; 정맥내 면역글로불린; 클라브리빈; CDP-571/BAY-10-3356(인간화된 항-TNFα 항체; Celltech/Bayer); cA2(키메라 항-TNFα 항체; Centocor); 75kdTNFR-IgG(75kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Immunex; 참조:Arthritis & Rheumatism(1994) Vol. 37, S295;J. Invest. Med.(1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG(55kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Hoffmann-LaRoche); IL-10; IL-4; 및 IL-10 및/또는 IL-4 작용물질(예를 들어, 작용물질 항체).
본 발명의 항체 또는 항체 부분과 조합될 수 있는 패혈증에 대한 치료제로는 다음과 같은 예들이 있지만 이들에 제한되는 것은 아니다: 고장 식염액; 항생제; 정맥내 감마 글로불린; 연속 헤모필트레이션; 카르바페넴(예를 들어, 메로페넴); TNFα, IL-1β, IL-6 및/또는 IL-8과 같은 시토카인의 길항물질; CDP-571/BAY-10-3356(인간화된 항-TNFα 항체; Celltech/Bayer); cA2(키메라 항-TNFα 항체; Centocor); 75kdTNFR-IgG(75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Immunex; 참조:Arthritis & Rheumatism(1994) Vol.37, S295;J. Invest. Med. (1996) Vol.44, 235A); 55 kdTNFR-IgG(55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Hoffmann-LaRoche); 시토카인 조절제(CRAa) HP228 및 HP466(Houghten Pharmaceuticals, Inc.); SK&F 107647(저분자량 펩티드; SmithKline Beecham); 4가 구아닐히드라존 CNI-1493(Picower Institute); 조직 인자 경로 억제물질(TFPI; Chiron); PHP (화학적으로 변형된 헤모글로빈; APEX Bioscience); 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 철(III) 복합체(DPTA 철(III); Moichem Medicines)을 포함하는 철 킬레이터 및 킬레이트; 리소필린(합성 저분자량 메틸잔틴; Cell Therapeutics, Inc.); PGG-글루칸(수용성 β1,3글루칸; Alpha-Beta Technology); 지질로 재구성된 아폴리포프로테인 A-1(지질 A 생합성을 억제하는 합성 항균제); 항-엔도톡신 항체; E5531(합성 지질 A 길항물질; Eisai America, Inc.); rBPI(사람 살균/투과가능성-증가 단백질의 재조합 N-말단 단편); 및 합성 항-엔도톡신 펩티드(SAEP; Bios Ynth Research Laboratories).
본 발명의 항체 또는 항체 부분과 조합될 수 있는 성인 호흡 곤란증(ARDS)에 대한 치료제로는 다음과 같은 예들이 있지만 이들에 제한되는 것은 아니다: 항-IL-8 항체; 계면활성제 치환 치료법; CDP-571/BAY-10-3356(인간화된 항-TNFα 항체; Celltech/Bayer); cA2(키메라 항-TNFα 항체; Centocor); 75 kdTNFR-IgG(75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Immunex; 참조:Arthritis & Rheumatism(1994) Vol. 37, S295;J. Invest. Med.(1996) Vol.44, 235A); 및 55 kdTNFR-IgG(55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Hoffmann-LaRoche).
본 발명의 항체 또는 항체 부분을 그 밖의 치료제와 조합하여 사용하는 방법은 IV절에서 더 논의된다.
본 발명의 치료 조성물은 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"의 본 발명의 항체 또는 항체 부분을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"이란 소망하는 치료 결과를 달성하기에 필요한 용량으로 필요한 시간 동안 유효한 양을 의미한다. 항체 또는 항체 부분의 치료적 유효량은 개체의 병세, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 소망하는 반응을 유도하는 항체 또는 항체 부분의 기능에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료적으로 유리한 효과에 의해 압도당하는 양이다. "예방적 유효량"은 소망하는 예방 결과를 달성하기에 필요한 용량으로 필요한 시간 동안 유효한 양을 의미한다. 전형적으로, 예방적 용량은 발병 전에 또는 질병의 초기 단계에 환자에게 사용하기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량 이하일 것이다.
용량 섭생법은 최적의 소망하는 반응(예를 들어, 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 거환이 투여될 수 있고, 수 개로 분할된 용량이 시간에 걸쳐서 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상태의 긴박성에 의해 지적된 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 용이한 투여 및 용량의 균일성을 위해 비경구적 조성물을 용량 단위형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용된 용량 단위형은 치료하려는 포유동물 환자에 대한 단위 용량으로 적합하는 물리적으로 분리된 단위를 의미하며; 각각의 단위는 요구되는 약제학적 담체와 함께 소망하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 소정량을 함유한다. 본 발명의 용량 단위형에 대한 규격은, (a) 활성 화합물의 특유한 특성 및 달성하려는 특수한 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체 내의 감도의 치료를 위한 이러한 활성 화합물의 합성에 있어 당업 분야에 내재하는 한계에 의해 규정되고, 직접적으로 좌우된다.
본 발명의 항체 또는 항체 부분의 치료적 또는 예방적 유효량에 대한 전형적인 범위는 0.1 내지 20 mg/kg, 더욱 바람직하게, 1 내지 10 mg/kg이며, 이에 제한되지 않는다. 용량 값은 완화시키려는 질환의 타입 및 정도에 따라 달라질 수 있음을 인식해야 한다. 임의의 특수한 환자에 대해, 특이적인 용량 섭생법은 개체의 필요 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간에 걸쳐 조정되어야 하고, 본 명세서에 설명된 용량 범위는 예시적인 것이며 본 발명의 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다.
IV.본 발명의 항체의 용도
hTNFα와 결합하는 기능이 주어진 경우, 본 발명의 항-hTNFα 항체 또는 이것의 부분은, 효소 결합된 면역흡수 검정법(ELISA), 방사면역검정법(RIA) 또는 조직 면역조직화학과 같은 통상의 면역검정법을 이용하여 hTNFα(예를 들어, 혈청 또는 혈장과 같은 생물학적 샘플 중의)을 검출하는 데에 사용할 수 있다. 본 발명은생물학적 샘플 중의 hTNFα를 검출하는 방법을 제공하며, 이 방법은 생물학적 샘플을 본 발명의 항체 또는 항체 부분과 접촉시키고, hTNFα와 결합한 항체(또는 항체 부분) 또는 결합하지 않은 항체(또는 항체 부분)을 검출함으로써 생물학적 샘플 중의 hTNFα를 검출하는 것을 포함한다. 항체는 검출가능한 물질로 직접 또는 간접 표지화시켜, 결합된 또는 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하게 한다. 적합한 검출가능한 물질은 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예로는 양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제가 있고; 적합한 보결분자단 착물의 예로는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 있고; 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 염화 단실 또는 피코에리트린이 있고; 발광 물질의 예로는 루미놀이 있고; 적합한 방사성 물질의 예로는125I,131I,35S 또는3H이 있다.
항체를 표지화하는 대안으로서, hTNFα는, 검출가능한 물질로 표지화시킨 rhTNFα 표준 및 표지화되지 않은 항-hTNFα 항체를 이용하는 경합 면역검정법에 의해 생물학적 유체 중에서 검정될 수 있다. 이러한 검정법에 있어서, 생물학적 샘플, 표지화된 rhTNFα 표준 및 항-hTNFα 항체는 조합되고, 표지화되지 않은 항체와 결합하는 표지화된 rhTNFα 표준의 양이 측정된다. 생물학적 샘플 중의 hTNFα의 양은 항-hTNFα 항체와 결합하는 표지화된 rhTNFα 표준의 양에 역비례한다.
본 발명의 D2E7 항체는 또한 사람 이외의 종, 특히 영장류 동물(예를 들어, 침팬지, 개코원숭이, 명주원숭이, 게잡이원숭이 및 붉은털원숭이), 돼지 및 마우스로부터의 TNFαs를 검출하는 데에 사용될 수 있는데, 이는 D2E7이 각각 이들 TNFαs와 결합할 수 있기 때문이다 (E절의 실시예 4에서 더 논의됨).
본 발명의 항체 및 항체 부분은 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 hTNFα 활성을 중화시킬 수 있다 (실시예 4 참조). 더욱이, D2E7과 같은 일부 이상의 본 발명의 항체는 다른 종으로부터의 TNFα 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 부분은, 예를 들어, hTNFα를 함유하는 세포 배양물, 사람 환자 또는 본 발명의 항체와 교차반응하는 TNFαs를 갖는 그 밖의 동물 환자(예를 들어, 침팬지, 개코원숭이, 명주원숭이, 게잡이원숭이 및 붉은털원숭이, 돼지 또는 마우스) 중의 TNFα 활성을 억제시키기 위해 사용될 수 있다. 한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 TNFα 활성을 억제하도록 TNFα를 본 발명의 항체 또는 항체 부분과 접촉시키는 것을 포함하여, TNFα을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직하게, TNFα는 사람 TNFα 이다. 예를 들어, hTNFα를 함유하거나 함유하는 것으로 추측되는 세포 배양물의 경우, 배양물 중의 hTNFα 활성을 억제하기 위해 본 발명의 항체 또는 항체 부분을 배양기에 첨가시킬 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 TNFα 활성이 유해한 질환에 걸린 환자 중의 TNFα 활성을 억제하는 방법을 제공한다. TNFα는 광범위한 질환의 병태생리학에 관련되어 왔다(참조: Moeller A., 등 (1990)Cytokine 2:162-169; U.S.Patent No. 5,231,024 to Moeller 등; European Patent Publication No. 260 610 B1 by Moeller, A.). 본 발명은 이러한 질환에 걸린 환자 중의 TNFα 활성을 억제하는 방법을 제공하며, 이 방법은 환자 중의 TNFα 활성을 억제하도록 환자에게 본 발명의 항체 또는 항체 부분을 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게, TNFα는 사람 TNFα이고, 환자는 사람 환자이다. 대안적으로, 환자는 본 발명의 항체와 교차반응하는 TNFα를 발현시키는 포유동물일 수 있다. 또한 환자는 hTNFα가 도입된(예를 들어, hTNFα의 투여 또는 hTNFα 트랜스유전자의 발현에 의해) 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료를 목적으로 사람 환자에게 투여될 수 있다(하기에서 더 논의됨). 더욱이, 본 발명의 항체는, 수의학용으로 또는 사람 질병의 동물 모델로서, 항체와 교차반응하는 TNFα를 발현하는 사람 이외의 포유동물(예를 들어, 영장류 동물, 돼지 또는 마우스)에게 투여될 수 있다. 동물 모델용인 경우, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는 데에 유용할 것이다(예를 들어, 용량 및 투여의 시간경과 시험).
본 명세서에서 사용된 "TNFα활성이 유해한 질환"이란 질환에 걸린 환자 내의 TNFα의 존재가 질환의 병태생리학 또는 질환의 악화에 기여하는 인자를 초래하거나 초래하는 것으로 생각되는 질병 및 그 외의 질환을 포함하고자 한다. 따라서, TNFα 활성이 유해한 질환은 TNFα 활성을 억제하면 질환의 증상 및/또는 진행이 완화될 것으로 예측되는 질환이다. 이러한 질환은 예를 들어, 질환에 걸린 환자의 생물학적 유체 내의 TNFα의 농도 증가(예를 들어, 환자의 혈청, 혈장, 활액 유체 등의 TNFα의 농도 증가)에 의해 증명될 수 있으며, 농도 증가는 예를 들어, 전술된 항-TNFα 항체를 사용하여 검출할 수 있다. TNFα 활성이 유해한 질환의 다수의 예가 존재한다. 특정 질환의 치료에서 본 발명의 항체 및 항체 부분의 사용하는 방법은 하기에서 더 논의된다:
A.패혈증
종양 괴사 인자는 패혈증의 병태생리학에서 확정된 역할을 담당하며, 고혈압, 심근경색, 혈관누출증, 장기괴사, 독성 2차 매개물 방출 자극 및 응고 캐스케이드의 활성화를 포함하는 생물학적 작용을 나타낸다(참조: Moeller, A. 등 (1990)Cytokine 2:162-169; U.S.Patent No. 5,231,024 to Moeller 등; European Patent Publication No. 260 610 B1 by Moeller, A.; Tracey, K.J. 및 Cerami,A.(1994)Annu. Rev. Med.45:491-503; Russell,D 및 Thompson, R.C.(1993)Curr. Opin. Biotech. 4:714-721). 따라서, 본 발명의 사람 항체 및 항체 부분은 패혈성 쇽, 내독소성 쇽, 그램음성패혈증 및 중독성 쇽증후군을 포함하는 임의의 임상 환경에서 패혈증을 치료하는 데에 사용할 수 있다.
더욱이, 패혈증을 치료하기 위해, 본 발명의 항-hTNFα 항체 또는 항체 부분은, 인터루킨-1 억제물질(예를 들어, PCT Publication No. WO 92/16221 및 WO 92/17583), 시토카인 인터루킨-6(참조: PCT Publication No. WO 93/11793) 또는 혈소판 활성 인자의 길항물질(참조: European Patent Application Publication No. EP 374 510)와 같은, 패혈증을 더 완화시킬 수 있는 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 동시투여할 수 있다. 패혈증 치료용 그 밖의 조합 치료법은 III절에서 더 논의된다.
부가적으로, 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 항-hTNFα 항체 또는 항체 부분은 치료시에 500pg/ml를 초과하는, 더욱 바람직하게, 1000 pg/ml의 IL-6의 혈청 또는 혈장 농도를 갖는 패혈증 환자의 하위그룹 내의 사람 환자에게 투여한다(참조: PCT Publication No. WO 95/20978 by Daum, L. 등).
B.자가면역 질병
종양 괴사 인자는 다양한 자가면역 질병의 병태생리학에서 일정한 역할을 담당하는 것과 관련되어 왔다. 예를 들어, TNFα는 조직 염증을 활성화시키고, 류마티스성 관절염에서 관절 파손을 초래하는 것과 관련되어 왔다(참조: Moeller, A. 등 (1990)Cytokine 2:162-169; U.S.Patent No. 5,231,024 to Moeller 등; European Patent Publication No. 260 610 B1 by Moeller, A.; Tracey 및 Cerami 상기참조; Arend, W.P. 및 Dayer, J-M.(1995)Arth. Rheum.38:151-160; Fava, R.A. 등(1993)Clin. Exp. Immunol. 94:261-266). TNFα는 또한 소도 세포의 치사를 촉진하고, 당뇨병에서 인슐린 내성을 매개하는 것과 관련되어 왔다(참조: Tracey 및 Cerami, 상기참조; PCT Publication No. WO 94/08609). TNFα는 또한 핍지 세포에 대한 세포독성 및 다발성 경화증에서 염증성 플라크의 유도를 매개하는 것과 관련되어 왔다(참조: Tracey 및 Cerami, 상기참조). 키메라 및 인간화된 쥐과 동물 항-hTNFα 항체가 류마티스성 관절염의 치료를 위해 임상 시험되어 왔다(참조: Elliott, M.J. 등 (1994)Lancet 344:1125-1127; Elliot, M.J. 등 (1994)Lancet 344:1105-1110; Rankin, E.C. 등 (1995)Br. J.Rheumatol. 34:334-342).
본 발명의 사람 항체 및 항체 부분은, 류마티스성 관절염, 류마티스성 척추염, 골관절염 및 통풍성 관절염, 알레르기, 다발성 경화증, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염 및 신증을 포함하는, 자가면역 질병, 특히 염증 관련된 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 특정한 질환의 경우 항체 또는 항체 부분을 염증 부위에 국소적으로 투여하는(예를 들어, PCT 공개공보 제 WO 93/19751호에 기재된 시클로헥산-일리덴 유도체와 조합하여, 또는 단독으로, 류마티스성 관절염의 관절에 국소적으로 투여되거나 당뇨병성 궤양에 국부적으로 투여하는 것) 것이 유리할 수 있다고해도, 전형적으로 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 전신적으로 투여된다. 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 제 III절에서 더 논의되는 바와 같이 자가면역 질병의 치료에 유용한 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 투여될 수 있다.
C.감염성 질병
종양 괴사 인자는 다양한 감염성 질병에서 관찰되는 생물학적 작용을 매개하는 것과 관련되어 왔다. 예를 들어, TNFα는 말라리아에서 뇌염 및 모세관혈전증 및 경색증을 매개하는 것과 관련되어 왔다. TNFα는 또한 뇌막염에서 뇌염을 매개하고, 혈뇌장벽의 파괴를 유도하고, 패혈성쇽 증후군을 촉발시키고, 정맥 경색을 활성화시키는 것과 관련되어 왔다. TNFα는 또한 후천성면역결핍증(AIDS)에서 카켁시아를 유도하고, 바이러스 증식을 자극하고, 중추신경계 손상을 매개하는 것과 관련되어 왔다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 부분은 박테리아성 뇌막염(참조: European Patent Application Publication No. EP 585 705), 뇌말라리아, AIDS 및 AIDS 관련 콤플렉스(ARC)(참조: European Patent Application Publication No. EP 230 574) 뿐만 아니라 이식에 대해 2차적인 거대세포바이러스 감염(참조: Fieze, E. 등 (1994)Transplantation 58:675-680)을 포함하는 감염성 질병의 치료에 사용할 수 있다. 본 발명의 항체 및 항체 부분은 또한 감염(예를 들어, 인플루엔자)으로 인한 발열 및 근육통 및 감염에 대해 2차적인 카켁시아(예를 들어, AIDS 또는 ARC에 대해 2차적인)을 포함하는 감염성 질병과 관련된 증상을 완화시키기 위해 사용할 수 있다.
D.이식
종양 괴사 인자는 이식편 거부반응 및 이식편대숙주 질병(GVHD)의 중요한 매개물질로 관련되어 왔고, T 세포 수용체 CD3 복합체에 대해 유도된 래트 항체 OKT3가 신이식물이 거부반응을 억제하기 위해 사용되는 경우 관찰되는 불리한 반응을 매개하는 것과 관련되어 왔다(참조: Eason, J.D. 등 (1995)Transplantation 59:300-305; Suthanthiran, M. 및 Strom, T.B.(1994)New Engl. J.Med.331:365-375). 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 부분은 이식편 및 이종이식의 거부반응을 포함하는 이식편 거부반응을 억제하고, GVHD를 억제하기 위해 사용할 수 있다. 항체 또는 항체 부분이 단독으로 사용될 수 있다고 하더라도, 이식편에 대한 면역반응을 억제하거나 GVHD를 억제하는 하나 이상의 그 외의 제제와 조합하여 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 예를 들어, 한 가지 구체예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 OKT3 유도된 반응을 억제하기 위해 OKT3와 조합하여 사용한다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 세포 표면 분자 CD25(인터루킨-2 수용체-α), CD11a(LFA-1), CD54(ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80(B7-1) 및/또는 CD86(B7-2)와 같은, 면역반응을 조절하는데 관여하는 다른 표적에 대해 유도된 하나 이상의 항체와 조합하여 사용한다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 시클로스포린 A 또는 FK506과 같은 하나 이상의 일반적인 면역억제제와 조합하여 사용한다.
E.악성종양
종양 괴사 인자는 악성종양에서, 카켁시아를 유도하고, 종양 성장을 자극하고, 전이성 잠재력을 증강시키고, 세포독성을 매개하는 것과 관련되어 왔다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 부분은 종양 성장 또는 전이를 억제하고/하거나 악성종양에 대해 2차적인 카켁시아를 완화시키기 위해 악성종양의 치료에 사용할 수 있다. 항체 또는 항체 부분은 종양 부위에 전신적으로 또는 국소적으로 투여할 수 있다.
F.폐 질환
종양 괴사 인자는 내피성백혈구 활성화를 자극하고, 폐포세포에 대한 세포독성을 유도하고, 혈관누출증을 유도하는 것을 포함하는, 성인 호흡 곤란증(ARDS)의 병태생리학과 관련되어 왔다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 부분은 성인 호흡곤란증(참조: PCT Publication No. WO 91/04054), 쇽폐, 만성 폐렴 질병, 폐 사르코이도시스, 폐섬유증 및 규폐증을 포함하는 다양한 폐 질환을 치료하기 위해 사용할 수 있다. 항체 또는 항체 부분은 예를 들어, 에어로졸로서 전신적으로 또는 폐 표면에 국소적으로 투여할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 제 III절에 더 논의되는 바와 같이, 폐 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 투여할 수 있다.
G.장 질환
종양 괴사 인자는 염증성 장 질환의 병태생리학과 관련되어 왔다(참조: Tracy, K.J., 등 (1986)Science234:470-474; Sun, X-M. 등 (1988)J.Clin.Invest. 81:1328-1331; MacDonald, T.T. 등 (1990)Clin. Exp. Immunol.81:301-305). 키메라 쥐과 동물 항-hTNFα 항체는 크론병의 치료를 위해 임상 시험되어 왔다[참고문헌: van Dullemen, H.M. 등 (1995)Gastroenterology109:129-135]. 본 발명의 사람 항체 및 항체 부분은 또한 2가지 증상, 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하는 특발성 염증성 장 질환과 같은 장 질환을 치료하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 또한 제 III절에서 더 논의되는 바와 같이, 장 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 투여할 수 있다.
H.심장 질환
본 발명의 항체 및 항체 부분은 또한 심장 허혈(참조: European Patent Application Publication No. EP 453 898) 및 심부전증(심근 박약)(참조: PCT Publication No. WO 94/20139)을 포함하는 다양한 심장 질환을 치료하기 위해 사용할 수 있다.
I.기타
본 발명의 항체 및 항체 부분은 또한 TNFα 활성이 해로운 다양한 그 외의 질환을 치료하기 위해 사용할 수 있다. TNFα 활성이 병태생리학과 관련되어온, 즉 본 발명의 항체 또는 항체 부분을 사용하여 치료할 수 있는, 그 외의 질병 및 질환의 예로는 다음과 같은 것이 있다: 염증성 골 질환 및 골흡수 질병(참조: Bertolini. D.R. 등 (1986) Nature 319:516-518; Konig,A. 등 (1988) J.Bone Miner. Res. 3:621-627; Lerner, U.H. 및 Ohlin, A. (1993) J. Bone Miner Res. 8:147-155; 및 Shankar. G. 및 Stern. P.H.(1993) Bone 14:871-876), 알코올성 간염(참조: McClain, C.F. 및 Cohen, D.A. (1989) Hepatology 9:349-351; Felver, M.E. 등 (1990) Alcohol. Clin Exp. Res. 14:225-229; 및 Hansen, J. 등 (1994) Hepatology 20:461-474), 바이러스성 간염(참고문헌: Sheron,N. 등 (1991) J. Hepatol. 12:241-245; 및 Hussain, M.J. 등 (1994) J.Clin. Pathol. 47:1112-1115) 및 격증 간염을 포함하는 간염, 응고 장애(참조: van der Poll, T. 등 (1990) N. Engl. J.Med. 322:1622-1627; 및 van der Poll, T. 등 (1991) Prog. Clin. Biol. Res. 367:55-60), 화상(참조: Giroir, B.P. 등 (1994) Am. J.Physiol. 267:H118-124; 및 Liu, X.S. 등 (1994) Burns 20:40-44), 재환류 손상(참조: Scales, W.E. 등 (1994) Am. J.Physiol. 267:G1122-1127; Serrick, C. 등 (1994) Transplantation 58:1158-1162; 및 Yao, Y.M. 등 (1995) Resuscitation 29:157-168), 켈로이드 형성(참조: McCauley, R.L. 등 (1992) J.Clin. Immunol. 12:300-308), 반흔 조직 형성; 발열; 치주 질환; 비만 및 방사선 독성.
본 발명은 다음의 실시예에 의해 더 설명되지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허출원의 내용은 본 명세서에 포함되어 있다.
실시예 1 : hTNFα에 대한 사람 항체의 결합의 동력학적 분석
리간드(바이오센서 매트릭스에 고정된 비오티닐화된 재조합 사람 TNFα(rhTNFα)) 및 피분석물(용액중의 항체) 사이의 실시간 결합 상호작용을 비아코어 시스템(BIAcore system, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)을 이용한 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. 시스템은 SPR의 광학 특성을 이용하여 덱스트란 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도 변화를 검출한다. 단백질은 공지 농도로 덱스트란 매트릭스에 공유결합된다. 항체는 덱스트란 매트릭스를 통해 주입하며, 주입된 항체 및 고정 리간드 사이의 특이적 결합은 매트릭스 단백질 농도를 증가시키고, 결과적으로 SPR 신호를 변화시킨다. 이러한 SPR 신호의 변화는 공명 단위(RU)로 기록되며 센서그램(sensorgram)의 y축을 따라 시간에 관해 디스플레이된다.
비오티닐화된 rhTNFα를 바이오센서 매트릭스 상에 고정시키는 것을 촉진하기 위해, 우선 매트릭스 상의 카르복실 그룹을 100mM N-히드록시숙신이미드(NHS) 및 400mM N-에틸-N'-(3-디에틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC)에 의해 활성화시킴으로써 스트렙트아비딘을 유리 아민 그룹을 통해 덱스트란 매트릭스에 공유결합시킨다. 그런 다음, 스트렙트아비딘을 활성화 매트릭스를 가로질러 주입시킨다. 아세트산나트륨(pH 4.5)중에서 희석된 35㎕의 스트렙트아비딘(25㎍/ml)을 활성화 바이오센서를 가로질러 주입시켜, 단백질 상의 유리 아민을 활성화 카르복실 그룹에 직접 결합시킨다. 미반응된 매트릭스 EDC-에스테르은 1M의 에탄올아민에 의해 불활성화시킨다. 스트렙트아비딘과 커플링된 바이오센서 칩은 시판되고 있다 (Pharmacia BR-1000-16, Pharmaci Biosensor, Piscataway, NJ).
비오티닐화된 rhTNFα는 우선 5.0mg의 비오틴(D-비오티닐-ε-아미노카프로산 N-히드록시숙신이미드 에스테르; Boehringer Mannheim Cat. No. 1008 960)을 500㎕의 디메틸술폭시드 중에 용해시켜 10mg/ml 용액을 만듦으로써 제조하였다. 10㎕의 비오틴을 1ml의 rhTNFα당 첨가하여(2.65mg/ml로) 비오틴 대 rhTNFα의 몰비를 2:1로 만들었다. 반응물을 천천히 혼합하고, 어두운 상태로 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PD-10 칼럼(Sephadex G-25M, Pharmacia Catalog No. 17-0851-01)을 25ml의 저온 PBS로 평형을 맞추고, 칼럼 당 2ml의 rhTNFα-비오틴을 충전하였다. 칼럼을 10 x 1ml의 저온 PBS로 용리시켰다. 분획을 수집하고, OD280(1.0 OD = 1.25mg/ml)에서 판독하였다. 적합한 분획을 풀링시키고, 사용전 까지 -80℃로 보관하였다. 비오티닐화된 rhTNFα는 또한 시판되고 있다 (R & D Systems Catalog No. FTA00, Minneapolis, MN).
스트렙트아비딘을 통해 매트릭스 상에 고정시킬 비오티닐화 rhTNFα을 0.05%(BIAcore) 계면활성제 P20(Pharmacia BR-1000-54, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)가 보충된 PBS 러닝 버퍼(running buffer)(Gibco Cat. No. 14190-144, Gibco BRL, Grand Island, NY) 중에서 희석시켰다. 고정화된 rhTNFα와 결합하는 rhTNFα 특이적인 항체의 기능을 측정하기 위해, 결합 검정법을 다음과 같이 수행하였다. 비오티닐화된 rhTNFα의 분액(25nM; 10㎕ 분액)을 5㎕/분의 유속으로 스트렙트아비딘과 커플링된 덱스트란 매트릭스를 통해 주입하였다. 단백질 주입전 및 주입 직후, PBS 버퍼만을 각각의 플로우 셀을 통해 흘려보냈다. 기선 및 비오티닐화된 rhTNFα 주입 완료후 30초째 사이의 신호의 순 변화는 결합값을 나타내기 위해 취하였다(약 500 RU). 고정화되고 비오티닐화된 rhTNFα에 대한 rhTNFα 특이적인 항체 직접 결합을 측정하였다. 항체(20㎍/ml)를 PBS 러닝 버퍼 중에 희석시키고, 25㎕ 분액을 5㎕/분의 유속으로 고정화 단백질 매트릭스를 통해 주입하였다. 항체의 주입전 및 주입 직후, PBS 버퍼만을 각각의 플로우 셀을 통해 흘려보냈다. 기선 신호 및 항체 주입 완료후의 신호의 순 변화는 특수 샘플의 결합값을 나타내기 위해 취하였다. 바이오센서 매트릭스는 다음 샘플의 주입 전에 100mM HCl을 사용하여 재생시켰다. 오프 속도(Koff), 온 속도(Kon), 결합 속도(Ka) 및 해리 속도(Kd) 상수를 측정하기 위해, 비아코아 동력학 평가 소프트웨어(버전 2.1)을 사용하였다.
마우스 mAb MAK 195(F(ab')2단편)과 비교한, 비오티닐화된 rhTNFα에 대한 D2E7(IgG4 온길이 항체) 결합의 대표적인 결과는 하기의 표 1에 나타난다.
비오티닐화된 rh TNFα에 대한 D2E7 IgG4 또는 MAK의 결합
항체 [Ab], nM rhTNFα, 결합, RUs Ab, 결합, RUs rhTNFα/Ab Koff, sec-1, (Avg)
D2E7 267 373 1215 1.14 8.45 × 10-5
133 420 1569 1.30 5.42 × 10-5
67 434 1633 1.31 4.75 × 10-5
33 450 1532 1.19 4.46 × 10-5
17 460 1296 0.98 3.47 × 10-5
8 486 936 0.67 2.63 × 10-5
4 489 536 0.38 2.17 × 10-5
2 470 244 0.18 3.68 × 10-5
(4.38 × 10-5)
MAK 195 400 375 881 1.20 5.38 × 10-5
200 400 1080 1.38 4.54 × 10-5
100 419 1141 1.39 3.54 × 10-5
50 427 1106 1.32 3.67 × 10-5
25 446 957 1.09 4.41 × 10-5
13 464 708 0.78 3.66 × 10-5
6 474 433 0.47 7.37 × 10-5
3 451 231 0.26 6.95 × 10-5
(4.94 × 10-5)
일련의 제 2 실험에서, D2E7의 IgG1 온길이형 및 비오티닐화돈 rhTNFα 사이의 분자적 동력학적 상호작용을 전술한 바와 같은 비아코아법을 이용하여 정량 분석하였고, 동력학적 속도 상수를 유도하였으며, 이들을 하기의 표 2, 3 및 4에 요약하였다.
D2E7 및 비오티닐화된 rhTNF 사이의 상호작용의 겉보기 해리 속도 상수
실험 Kd(s-1)
1 9.58 × 10-5
2 9.26 × 10-5
3 7.60 × 10-5
평균 8.81±1.06 × 10-5
D2E7 및 비오티닐화된 rhTNF 사이의 상호작용의 겉보기 결합 속도 상수
실험 Ka(M-1, s-1)
1 1.33 × 10-5
2 1.05 × 10-5
3 3.36 × 10-5
평균 1.91±1.26 × 10-5
D2E7 및 비오티닐화된 rhTNF의 겉보기 동력학 속도 및 친화력 상수
실험 Ka(M-1, s-1) Kd(s-1) Kd(M)
1 1.33 × 105 9.58 × 10-5 7.20 × 10-10
2 1.05 × 105 9.26 × 10-5 8.82 × 10-10
3 3.36 × 105 7.60 × 10-5 2.26 × 10-10
평균 1.91±1.26 × 105 8.81±1.06 × 10-5 6.09±3.42 × 10-10
해리 및 결합 속도 상수는 BIA 분석 소프트웨에 의해 센서그램의 해리 및 결합 영역을 분석함으로써 계산하였다. 통상적인 화학 반응속도론은 D2E7 및 비오티닐화된 rhTNF 분자 사이의 상호작용을 위해 생각하였다: 0차 해리 및 1차 결합 속도론. 분석을 위하여, 2가 D2E7 항체의 하나의 아암 및 3량체 비오티닐화된 rhTNF 사이의 상호작용만이 동력학 데이타 분석을 위한 분자 모형을 선택하는 경우 고려하였다. 3가지 독립적 실험을 수행하고, 그 결과를 개별적으로 분석하였다. D2E7 및 비오티닐화된 rhTNF 사이이 상호작용의 평균 겉보기 해리 속도 상수(Kd)는 8.81±1.06 x 10-5s-1이고, 평균 겉보기 결합 속도 상수(Ka)는 1.91±1.26 x 105M-1s-1이다. 그후, 겉보기 고유 해리 상수(Kd)는 식 Kd=kd/ka에 의해 계산하였다. 따라서, 동력학적 파라미터로부터 유도된 rhTNFα에 대한 D2E7의 평균 Kd는 6.09±3.42 x 10-10M 이다. D2E7의 IgG1형(표 2, 3 및 4에 나타남) 및 D2E7의 IgG4형(표 1 및 실시예 2 및 3에 나타남)에 대한 동력학적 값의 작은 차이는 IgG1 또는 IgG4 불변영역의 존재에 기인하는 실제 차이가 아니라, IgG1 동력학 분석에 사용된 더욱 정확한 항체 농도 측정에 기인하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 명세서에 나타난 D2E7의 IgG1형에 대한 동력학 값은 D2E7 항체에 대한 가장 정확한 동력학 파라미터로 생각된다.
실시예 2 : D2E7 CDR3 도메인의 알라닌 스캐닝 돌연변이유발
일련의 단일 알라닌 돌연변이체를 표준 방법에 의해 D2E7 VL 및 D2E7 VH 영역의 CDR3 도메인을 따라 도입시켰다. 경쇄 돌연변이체는 도 1B에 도시되어 있다(LD2E7*.A1, LD2E7*.A3, LD2E7*.A4, LD2E7*.A5, LD2E7*.A7 및 LD2E7*.A8은 각각 D2E7 VL CDR3 도메인의 1, 3, 4, 5, 7 또는 8번 위치에서 알라닌 돌연변이를 가짐). 중쇄 돌연변이체는 도 2B에 도시되어 있다(HD2E7.A1, HD2E7.A2, HD2E7.A3, HD2E7.A4, HD2E7.A5, HD2E7.A6, HD2E7.A7, HD2E7.A8 및 HD2E7.A9는 각각 D2E7 VH CDR3 도메인의 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번 위치에서 알라닌 돌연변이를 가짐). 야생형 D2E7 VL 및 VH로 이루어진 항체와 rhTNFα의 상호작용의 동력학은, 1) 알라닌 치환된 D2E7 VH와 쌍을 이룬 야생형 D2E7 VL; 2) 알라닌 치환된 D2E7 VL과 쌍을 이룬 야생형 D2E7 VL; 또는 3) 알라닌 치환된 D2E7 VH와 쌍을 이룬 알라닌 치환된 D2E7 VH로 이루어진 항체의 것과 비교하였다. 모든 항체는 온길이 IgG4 분자로 시험하였다.
rhTNFα와 항체의 상호작용의 동력학은 실시예 1에 기술된 바와 같은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하였다. 다양한 VH/VL 쌍에 대한 Koff속도는 하기의 표 5에 요약되어 있다.
비오티닐화된 rhTNFα로의 D2E7 알라닌-스캔 돌연변이체의 결합
VH VL Koff(sec-1)
D2E7 VH D2E7 VL 9.65 × 10-5
HD2E7*.A1 D2E7 VL 1.4 × 10-4
HD2E7*.A2 D2E7 VL 4.6 × 10-4
HD2E7*.A3 D2E7 VL 8.15 × 10-4
HD2E7*.A4 D2E7 VL 1.8 × 10-4
HD2E7*.A5 D2E7 VL 2.35 × 10-4
HD2E7*.A6 D2E7 VL 2.9 × 10-4
HD2E7*.A7 D2E7 VL 1.0 × 10-4
HD2E7*.A8 D2E7 VL 3.1 × 10-4
HD2E7*.A9 D2E7 VL 8.1 × 10-4
D2E7 VH LD2E7*.A1 6.6 × 10-5
D2E7 VH LD2E7*.A3 불검출
D2E7 VH LD2E7*.A4 1.75 × 10-4
D2E7 VH LD2E7*.A5 1.8 × 10-4
D2E7 VH LD2E7*.A7 1.4 × 10-4
D2E7 VH LD2E7*.A8 3.65 × 10-4
HD2E7*.A9 LD2E7*.A1 1.05 × 10-4
이들 결과는 D2E7 VL 영역 및 VH 영역의 CDR3 도메인의 다수의 위치가 단일 알라닌 잔기로 치환될 수 있음을 입증한다. D2E7 VL CDR3 도메인의 1, 4, 5 또는 7번 위치, 또는 D2E7 VH CDR3 도메인의 2, 5, 6, 8, 9 또는 10번 위치에서의 단일 알라닌 치환은 야생형 D2E7 모항체와 비교해 볼때 hTNFα 결합의 오프 속도에 유의할 정도의 영향은 미치지 않는다. D2E7 VL CDR3의 8번 위치 또는 D2E7 VH CDR3의 3번 위치에서의 알라닌 치환은 Koff를 4배 빠르게 하고, D2E7 VH CDR3의 4 또는 11번 위치에서의 알라닌 치환은 Koff를 8배 빠르게 하는데, 이는 이들 위치가 hTNFα와의 결합에 더욱 중요함을 나타낸다. 그러나, D2E7 VL CDR3 도메인의 1, 4, 5, 7 또는 8번 위치, 또는 D2E7 VH CDR3 도메인의 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번 위치에서의 단일 알라닌 치환은 여전히 1 x 10-3sec-1이하의 K를 갖는 항-hTNFα 항체를 생성시킨다.
실시예 3 : D2E7 관련된 항체의 결합 분석
D2E7과 서열이 관련있는 일련의 항체를 rhTNFα와의 결합에 대해 D2E7과 비교하여 실시예 1에 기술된 바와 같은 표면 플라즈몬 공명에 의해 분석하였다. 시험된 VL 영역의 아미노산 서열은 도 1A 및 1B에 도시된다. 시험된 VH 영역의 아미노산 서열은 도 2A 및 2B에 도시된다. 다양한 VH/VL 쌍(나타난 포맷에서, 온길이 IgG1 또는 IgG4 항체 또는 scFv로서)에 대한 Koff속도는 하기의 표 6에 요약되어 있다.
비오티닐화된 rhTNFα로의 D2E7 관련된 항체의 결합
VH VL 포맷 Koff(sec-1)
D2E7 VH D2E7VL IgG1/IgG4 9.65 × 10-5
VH1-D2 LOE7 IgG1/IgG4 7.7 × 10-5
VH1-D2 LOE7 scFv 4.6 × 10-4
VH1-D2.N LOE7.T IgG4 2.1 × 10-5
VH1-D2.Y LOE7.A IgG4 2.7 × 10-5
VH1-D2.N LOE7.A IgG4 3.2 × 10-5
VH1-D2 EP B12 scFv 8.0 × 10-4
VH1-D2 2SD4 VL scFv 1.94 × 10-3
3C-H2 LOE7 scFv 1.5 × 10-3
2SD4 VH LOE7 scFv 6.07 × 10-3
2SD4 VH 2SD4 VL scFv 1.37 × 10-2
VH1A11 2SD4 VL scFv 1.34 × 10-2
VH1B12 2SD4 VL scFv 1.01 × 10-2
VH1B11 2SD4 VL scFv 9.8 × 10-3
VH1E4 2SD4 VL scFv 1.59 × 10-2
VH1F6 2SD4 VL scFv 2.29 × 10-2
VH1D8 2SD4 VL scFv 9.5 × 10-3
VH1G1 2SD4 VL scFv 2.14 × 10-2
S2D4 VH EP B12 scFv 6.7 × 10-3
S2D4 VH VL10E4 scFv 9.6 × 10-3
S2D4 VH VL100A9 scFv 1.33 × 10-2
S2D4 VH VL100D2 scFv 1.41 × 10-2
S2D4 VH VL10F4 scFv 1.11 × 10-2
S2D4 VH VLLOE5 scFv 1.16 × 10-2
S2D4 VH VLL0F9 scFv 6.09 × 10-3
S2D4 VH VLLOF10 scFv 1.34 × 10-2
S2D4 VH VLLOG7 scFv 1.56 × 10-2
S2D4 VH VLLOG9 scFv 1.46 × 10-2
S2D4 VH VLLOH1 scFv 1.17 × 10-2
S2D4 VH VLLOH10 scFv 1.12 × 10-2
S2D4 VH VL1B7 scFv 1.3 × 10-2
S2D4 VH VL1C1 scFv 1.36 × 10-2
S2D4 VH VL1C7 scFv 2.0 × 10-2
S2D4 VH VL0.1F4 scFv 1.76 × 10-2
S2D4 VH VLO.1H8 scFv 1.14 × 10-2
D2E7, LOE7, LOE7.T 및 LOE7.A로부터 선택된 VL를 갖고 9번 위치에서 트레오닌 또는 알라닌을 갖는 온길이 항체(즉, IgG 포맷)에 대한 느린 오프 속도(즉, 1 x 10-4sec-1이하의 Koff)는 D2E7 VL CDR3의 9번 위치가 Koff에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 이들 2개의 잔기에 의해 점유될 수 있음을 나타낸다. 따라서, D2E7 VL CDR3에 대한 컨센서스 모티프는 아미노산 서열 Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(서열번호 3)을 포함한다. 더욱이, D2E7, VH1-D2.N 및 VH1-D2.Y로부터 선택된 VH를 갖고 12번 위치에 티로신 또는 아스파라긴을 갖는 항체에 대한 느린 오프 속도(즉, 1 × 10-4sec-1)는 D2E7 VH CDR3의 12번 위치가 Koff에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 이들 2개의 잔기에 의해 점유될 수 있음을 나타낸다. 따라서, D2E7 VH CDR3의 컨센서스 모티프는 아미노산 잔기 V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N)(서열번호 4)를 포함한다.
표 6에 나타난 결과는 scFv 포맷의 경우 2SD4 VL 또는 VH CDR3 영역을 함유하는 항체는 D2E7 VL 또는 VH CDR3 영역을 함유하는 항체와 비교해 볼때 보다 빠른 Koff(즉, 1 x 10 이상의 Koff)를 나타냄을 입증한다. VL CDR3 내에서, 2SD4는 2, 5 및 9번 위치에서 D2E7과 차이가 있다. 그러나, 앞서 논의된 바와 같이, 9번 위치는 K에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 Ala(2SD4에서의) 또는 Thr(D2E7에서의)에 의해 점유될 수 있다. 따라서, 2SD4 및 D2E7를 비교해 볼때, D2E7 VL CDR3의 2 및 5번 위치(둘 모두 아르기닌)는 hTNFα와 항체의 결합에 중요한 것으로 확인될 수 있다. 이들 잔기는 항체 결합 부위에서 접촉 잔기로서 직접적으로 관여할 수 있거나, 이러한 영역에서의 항체 분자의 골격 구조를 유지시키는 데에 중요하게 기여할 수 있다. 2번 위치의 중요성에 관하여, Lys(EP B 12 에서의) 대신 Arg(D2E7와 동일한 VL CDR3를 갖는 LOE7 에서의)이 치환되면 2개의 인자 중의 하나에 의해 오프 속도가 2배 빨라진다. 5번 위치의 중요성에 관하여, 실시예 2에 기술된 바와 같이, Ala(LD2E7*.A5에서의) 대신 Arg(D2E7에서의)로 치환되면 또한 오프 속도가 2배 빨라진다. 더욱이, 2 및 5번 위치에 Arg(2SD4에서의)가 없는 경우, 오프 속도는 5배 빨라진다. 그러나, 5번 위치가 hTNFα와의 개선된 결합에 중요하다고 하더라도, 이 위치의 변화는 VLLOE4, VLLOH1 또는 VL0.1H8에서 나타난 바와 같이, 그 외의 위치에서의 변화에 의해 무효화될 수 있음을 인식해야 한다.
VH CDR3 내에서, 2SD4는 1, 7 및 12번 위치에서 D2E7과 차이가 있다. 그러나, 앞서 논의된 바와 같이, 12번 위치는 Koff에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 Asn(2SD4에서의) 또는 Tyr(D2E7에서의)에 의해 점유될 수 있다. 따라서, 2SD4 및 D2E7을 비교해 볼때, D2E7 VH CDR3의 1 및 7번 위치는 hTNFα와의 결합에 중요한 것으로 확인될 수 있다. 앞서 논의된 바와 같이, 이들 잔기는 항체 결합 부위에서 접촉 잔기로서 직접적으로 관여할 수 있거나, 이러한 영역에서의 항체 분자의 골격 구조를 유지시키는 데에 중요하게 기여할 수 있다. 이들 두 위치가 hTNFα와의 결합에 중요한 이유는, 3C-H2 VH CDR3(D2E7 VH CDR3에 대해 1번 위치에서 알라닌 변화 대신 발린을 가짐)을 사용하면 scFv는 D2E7 VH CDR3를 사용할 때 보다 3배 빠른 오프 속도를 가지지만, 이러한 오프 속도는 2SD4 VH CDR3(D2E7 VH CDR3에 대해 1 및 7번 위치 둘 모두에서 변화를 가짐)를 사용할 때 보다 여전히 4배가 느리기 때문이다.
실시예 4 : D2E7의 작용 활성
D2E7의 작용 활성을 조사하기 위해, 시험관내 또는 생체내에서 hTNFα 활성을 억제하는 항체의 기능을 측정하는 여러가지 검정법에서 항체를 사용한다.
A. L929 세포에서의 TNFα 유도된 세포독성의 중화
사람 재조합 TNFα(rhTNFα)는 18 내지 24시간의 인큐베이션후에 쥐과 동물 L929 세포에 대해 세포독성을 일으킨다. 사람 항-hTNFα 항체는 다음과 같이 rhTNFα와 세포를 항체와 동시인큐베이션하여 L929 검정법에서 평가하였다. 100㎕의 항-hTNFα Abs를 함유하는 96-웰 미량역가 플레이트를 10% 우태아혈청(FBS)을 함유하는 RPMI 배지를 사용하여 중복적으로 플레이트의 1/3 아래까지 연속 희석시켰다. 50㎕의 rhTNFα를 각각의 샘플 웰 중의 50pg/ml의 최종 농도를 위해 첨가하였다. 그런 다음, 플레이트를 실온에서 30분간 인큐베이션시켰다. 그후, 1㎍/ml 악티노마이신(Actinomycin)-D를 포함하는 50㎕의 TNFα 감수성 L929 마우스 섬유아세포를 웰 당 5 x 104개의 세포의 최종 농도를 위해 첨가하였다. 대조구는 배지+세포 및 rhTNFα+세포를 포함하였다. 이들 대조구, 및 2ng/ml 내지 8.2pg/ml의 TNFα 표준 곡선을 사용하여 검정의 질을 결정하고 중화의 윈도우를 제공하였다. 그런 다음, 플레이트를 5% CO2중에서 37℃에서 하룻밤 동안(18 내지 24시간) 인큐베이션시켰다.
100㎕의 배지를 각각의 웰로부터 분리시키고, PBS중의 50㎕의 5mg/ml 6,(4,4-디메틸티아졸-2-yl)5,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드(MTT; 시그마 케미칼사에 의해 시판됨(Sigma Chemical Co., St.Louis, MO))을 첨가하였다. 그런 다음, 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 그후, 50㎕의 20% 황산 도데실 나트륨(SDS)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션시켰다. 570/630 nm에서 광학 밀도를 측정하고, 각각의 샘플에 대한 커브를 플롯팅하고, 표준 방법에 의해 IC50을 측정하였다.
쥐과 동물 MAK 195 mAbs와 비교한 다양한 VL 및 VH 쌍을 갖는 사람 항체에 대한 대표적인 결과는 하기의 도 3 및 표 7에 나타난다.
TNFα 유도된 L929 세포독성의 중화
VH VL 구조 IC50, M
D2E7 D2E7 scFv 1.1 × 10-10
D2E7 D2E7 IgG4 4.7 × 10-11
2SD4 2SD4 scFv/IgG1/IgG4 3.0 × 10-7
2SD4 LOE7 scFv 4.3 × 10-8
VH1-D2 2SD4 scFv 1.0 × 10-8
VH1-D2 LOE7 scFv/IgG1/IgG4 3.4 × 10-10
VH1-D2.Y LOE7.T IgG4 8.1 × 10-11
VH1-D2.N LOE7.T IgG4 1.3 × 10-10
VH1-D2.Y LOE7.A IgG4 2.8 × 10-11
VH1-D2.N LOE7.A IgG4 6.2 × 10-11
MAK 195 MAK 195 scFv 1.9 × 10-8
MAK 195 MAK 195 F(ab')2 6.2 × 10-11
도 3 및 표 7에서의 결과는 D2E7 사람 항-hTNFα 항체, 및 다양한 D2E7 관련된 항체가 쥐과 동물 항-hTNFα mAb MAK 195의 것과 거의 동등한 기능으로 TNFα 유도된 L929 세포독성을 중화시킴을 입증한다.
또 다른 일련의 실험의 경우, TNFα 유도된 L929 세포독성을 중화시키는 D2E7의 IgG1형의 기능은 전술한 바와 같이 조사하였다. 3가지 독립적인 실험으로부터의 결과, 및 이들의 평균은 하기의 표 8에 요약되어 있다.
D2E7 IgG1에 의한 TNFα 유도된 L929 세포독성의 중화
실험 IC50[M]
1 1.26 × 10-10
2 1.33 × 10-10
3 1.15 × 10-10
평균 1.25±0.01 × 10-10
이러한 일련의 실험은 온길이 IgG1형의 D2E7이 1.25±0.01x10-10의 평균 IC50[M]로 TNFα 유도된 L929 세포독성을 중화시킴을 확인하였다.
B.U-937 세포 상에서 TNFα 수용체와 TNFα의 결합의 억제
세포 표면 상에서 hTNFα 수용체에 hTNFα가 결합하는 것을 억제하는 사람 항-hTNFα 항체의 기능은 U-937 세포계열(ATCC No. CRL 1593)(hTNFα 수용체를 발현시키는 사람 조직구)을 사용하여 조사하였다. U-937 세포는 10% 우태아혈청(Hyclone A-1111, Hyclone Laboratories, Logan, UT), L-글루타민(4nM), HEPES 완충 용액(10mM), 페니실린(100㎕/ml) 및 스트렙토마이신(100㎕/ml)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 성장시켰다. 온길이 IgG 항체의 활성을 조사하기 위해, U-937 세포를 얼음상에서 45분간 1mg/ml의 사람 IgG(Sigma I-4506, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)가 보충된 PBS와 예비인큐베이션시킨후, 세포를 결합 버퍼로 3회 세척하였다. 수용체 결합 검정을 위해, U-937 세포(5 x 106개 세포/웰)를 항-hTNFα 항체가 있거나 없이,125I-표지화된 rhTNFα(3 x 10M; 25μCi/ml; 구입처: NEN Research Products, Wilmington, DE)와 함께 96-웰 미량역가 플레이트(Costar 3799, Costar Corp., Cambridge, MA) 중의 결합 버퍼(0.2% 우혈청알부민이 보충된 PBS) 중에서 0.2ml의 전체 부피로 인큐베이션시켰다. 플레이트를 얼음상에서 1시간 30분간 인큐베이션시켰다. 그런 다음, 75㎕의 각각의 샘플을 디부틸프탈레이트(Sigma D-2270, Sigma Chemical Co., St.Louis, MO) 및 디노닐프탈레이트(ICN 210733, ICN, Irvine, CA)을 함유하는 1.0ml 시험관(Sarstedt 72.700, Sarstedt Corp., Princeton, NJ)로 옮겼다. 시험관은 각각 디부틸프탈레이트 및 디노닐프탈레이트의 혼합물을 2:1의 부피비로 함유하였다. 5분간 마이크로원심분리하여 유리(즉, 결합되지 않은)125I-표지화된 rhTNFα를 분리하였다. 그런 다음, 세포 펠릿을 함유하는 각각의 시험관 말단을 마이크로튜브 시저(Bel-Art 210180001, Bel-Art Products, Pequannock, NJ)로 절단하였다. 세포 펠릿은 p60 또는 p80 TNFα 수용체에 결합된125I-표지화된 rhTNFα를 함유하지만, 오일 혼합물 위의 수성상은 과량의 유리 I-표지화된 rhTNFα를 함유한다. 모든 세포 펠릿을 계수관(Falcon 2052, Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ)에 수집하고, 섬광계수기내에서 계수하였다.
대표적인 결과는 도 4에 도시된다. U-937 세포 상에서 hTNFα 수용체에 대한 hTNFα 결합의 D2E7 억제에 대한 IC50값은 이들 실험의 경우 약 3 x 10-10M 이다. 이러한 결과는 D2E7 사람 항-hTNFα 항체가 U-937 세포상에서 hTNFα 수용체에 대한 rhTNFα 결합을 쥐과 동물 항-hTNFα mAb MAK 195의 것과 거의 동등한 농도로 억제함을 입증한다.
또 다른 일련의 실험에서, U-937 세포상에서 hTNFα 수용체에 대한 rhTNFα 결합을 억제하는 D2E7의 IgG1형의 기능을 전술한 바와 같이 조사하였다. 3가지 독립적인 실험에서 생성된 결과, 및 이들의 평균은 하기의 표 9에 요약되어 있다:
D2E7 IgG1에 의한 U-937 상에서의 TNF 수용체 결합의 억제
실험 `IC50[M]
1 1.70 × 10-10
2 1.49 × 10-10
3 1.50 × 10-10
평균 1.56±0.12 × 10-10
이러한 일련의 실험은 온길이 IgG1형의 D2E7이 1.56±0.12x1010의 평균 IC50[M]로 U-937 세포 상에서 TNF 수용체 결합을 억제함을 확인하였다.
개별적인 p55 및 p75 수용체와 결합하는125I-rhTNF의 결합에서 D2E7의 잠재력을 조사하기 위해, 고체상 방사면역검정을 수행하였다. 개별 TNF 수용체에 대한 D2E7의 IC50값을 측정하기 위해, 다양한 농도의 항체를 3x10 농도의 I-rhTNF와 함께 인큐베이션시켰다. 그런 다음, 혼합물을 p55 또는 p75 TNF 수용체를 함유하는 개별적인 플레이트 상에서 용량 의존 방식으로 시험하였다. 결과는 하기의 표 10에 요약되어 있다:
D2E7 IgG1에 의한 p55 및 p75 TNFR로의 TNF 수용체 결합의 억제
IC50[M]
시제 p55 TNFR p75 TNFR
D2E7 1.47 × 10-9 1.26 × 10-9
rhTNF 2.31 × 10-9 2.70 × 10-9
D2E7에 의한 U937 세포상에서의 p55 및 p75 TNF 수용체와 I-rhTNF의 결합의 억제는 간단한 S자 곡선을 이루며, 이는 각각의 수용체에 대한 유사한 IC50값을 나타낸다. 재조합 TNF 수용체에 의한 고체상 방사면역검정(RIA) 실험에 있어서, D2E7에 의한 p55 및 p75 수용체와125I-rhTNF의 결합의 억제에 대한 IC50값은 각각 1.47 x 10-9및 1.26 x 10-9M로 계산되었다. 고체상에서의 IC50값의 감소는 표지화되지 않은 rhTNF도 유사한 IC50값으로 억제하기 때문에 RIA 포맷에서의 수용체의 고밀도에 기인하였을 것이다. 표지화되지 않은 rhTNF에 의한 p55 및 p75와 I-rhTNF와의 결합의 억제에 대한 IC값은 각각 2.31 x 10-9및 2.70 x 10-9M 이다.
C.HUVEC 상에서의 ELAM-1 발현의 억제
사람 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC)를 rhTNFα로 처리하여 이들의 세포-표면 상에서 상피세포 백혈구 부착 분자 1(ELAM-1)를 발현시키도록 유도시킬 수 있으며, 이는 rhTNFα 처리된 HUVEC를 마우스 항-사람 ELAM-1 항체와 반응시켜 검출할 수 있다. HUVEC 상에서 ELAM-1의 이러한 TNFα 유도된 발현을 억제하는 사람 항-hTNFα 항체의 기능을 다음과 같이 조사하였다: HUVEC(ATCC No. CRL 1730)을 96-웰 플레이트(5 x 104개 세포/웰)에 플레이팅하고, 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션시켰다. 다음날, 사람 항-hTNFα 항체의 연속 희석물(1:10)을 20 내지 100㎍/ml의 항체로 출발하여 미량역가 플레이트에서 제조하였다. rhTNFα 원액을 4.5ng/ml로 제조하고, rhTNFα의 분액을 각각의 항체 함유 웰에 첨가하고, 내용물을 잘 혼합시켰다. 대조구는 배지만을, 배지+항-hTNFα 항체를 및 배지+rhTNFα를 포함하였다. HUVEC 플레이트를 이들의 37℃ 하룻밤 인큐베이션물로부터 분리시키고, 배지를 각각의 웰로부터 천천히 빨아내었다. 200㎕의 항체-rhTNFα 혼합물을 HUVEC 플레이트의 각각의 웰에 옮겼다. 그런 다음, HUVEC 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 그후, 쥐과 동물 항-ELAM-1 항체 원액을 RPMI에서 1:1000의 비로 희석시켰다. HUVEC 플레이트의 각각의 웰 중의 배지를 천천히 빨아내고, 50㎕/웰의 항-ELAM-1 항체 용액을 첨가하고, HUVEC 플레이트를 실온에서 60분간 인큐베이션시켰다.125I-표지화된 항-마우스 Ig 항체 용액을 RPMI중에서 제조하였다(약 50㎕중의 50,000 cpm). HUVEC 플레이트의 각각의 웰 중의 배지를 천천히 빨아내고, 웰을 RPMI로 2회 세척하고, 50㎕의125I-표지화된 항-마우스 Ig 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨후, 각각의 웰을 RPMI로 3회 세척하였다. 180㎕의 5% SDS를 각각의 웰에 첨가하여 세포를 용해시켰다. 그런 다음, 각각의 웰로부터의 세포 용해물을 시험관에 옮기고, 섬광계수기에서 계수하였다.
대표적인 결과는 도 5에 도시된다. 이들 실험의 경우, HUVEC 상에서의 ELAM-1의 hTNFα 유도된 발현의 D2E7 억제는 약 6 x 10-11M 이다. 이러한 결과는 D2E7 사람 항-hTNFα 항체가 쥐과 동물 항-hTNFα mAb MAK 195의 것과 거의 동등한 농도로 HUVEC 상에서의 ELAM-1의 hTNFα 유도된 발현을 억제함을 입증한다.
또 다른 일련의 실험의 경우, HUVEC 상에서의 ELAM-1의 hTNFα 유도된 발현을 억제하는 D2E7의 IgG1형의 기능은 전술한 바와 같이 조사하였다. 3가지 독립적인 실험에서 생성된 결과, 및 이들의 평균은 하기의 표 11에 요약되어 있다:
D2E7 IgG1 수용체에 의한 TNFα 유도된 ELAM-1 발현의 억제
실험 `IC50[M]
1 1.95 × 10-10
2 1.69 × 10-10
3 1.90 × 10-10
평균 1.85±0.14 × 10-10
이러한 일련의 실험은 온길이 IgG1형의 D2E7이 1.85±0.14 x 10-10의 평균 IC50[M]으로 HUVEC 상에서의 TNFα 유도된 ELAM-1 발현을 억제함을 확인하였다.
D2E7 IgG1의 중화 잠재력은 또한 2개의 서로 다른 부착 분자, ICAM-1 및 VCAM-1의 rhTNFα 유도된 발현에 대해 조사하였다. 16시간 째의 ICAM-1 발현에 대한 rhTNF 역가 곡선은 ELAM-1 발현의 곡선과 매우 유사하기 때문에, 동일한 농도의 rhTNF을 항체 중화 실험에서 사용하였다. HUVEC는 37℃ CO2인큐베이터에서 16시간 동안 다양한 농도의 D2E7의 존재하에서 rhTNF와 함께 인큐베이션하고, ICAM-1 발현은 마우스 항-ICAM-1 항체로 측정한후, I-표지화된 양 항-마우스 항체로 측정하였다. 2개의 독립적인 실험을 수행하고, IC50값을 계산하였다. 관련없는 사람 IgG1 항체는 ICAM-1 발현을 억제하지 않았다.
VCAM-1 발현의 시험 억제에 대한 실험 과정은 ELAM-1 발현에 대한 과정과 동일하였지만, 항-ELAM-1 Mab 대신에 항-VCAM-1 MAb를 사용하였다. 3가지 독립적인 실험을 수행하고, IC50값을 계산하였다. 관련없는 사람 IgG1 항체는 VCAM-1 발현을 억제하지 않았다.
결과는 하기의 표 12에 요약되어 있다:
D2E7 IgG1에 의한 ICAM-1 및 VCAM-1 발현의 억제
ICAM-1 억제 IC50[M]
실험 IC50[M] 실험 IC50[M]
1 1.84 × 10-10 1 1.03 × 10-10
2 2.49 × 10-10 2 9.26 × 10-11
1.06 × 10-10
평균 2.17±0.46 × 10-10 평균 1.01±0.01 × 10-10
이들 실험은 rhTNF로 1차 사람 배꼽 정맥 내피 세포의 처리가 부착 분자의 최적 발현을 유도시킴을 입증한다: ELAM-1 및 VCAM-1을 4시간 째에 일어났고, ICAM-1의 최대 상향조절 발현은 16시간 째에 일어났다. D2E7은 3개의 부착 분자의 발현을 용량 의존 방식으로 억제할 수 있었다. ELAM-1, ICAM-1 및 VCAM-1의 억제에 대한 IC50값은 각각 1.85 x 10-10, 2.17 x 10-10및 1.01 x 10-10M 였다. 이들 값은 매우 유사한데, 이는 ELAM-1, ICAM-1 및 VCAM-1 발현을 유도하는 rhTNF 활성화 신호의 용량 요구가 유사함을 나타낸다. 흥미롭게도, D2E7은 ICAM-1 발현의 장기 억제 검정에서 유사하게 유효하였다. ICAM-1 억제 검정은 ELAM-1 및 VCAM-1 억제 검정에 필요한 4시간과는 대조적으로 16시간의 HUVEC와 rhTNF 및 D2E7의 동시인큐베이션이 필요하였다. D2E7가 rhTNF에 대해 느린 오프 속도를 갖기 때문에, 16시간 동시인큐베이션 동안 HUVEC 상에서의 TNF 수용체에 의한 유의할 정도의 경합이 없음을 예측할 수 있다.
D.hTNFα의 생체내 중화
3개의 서로 다른 생체내 시스템을 사용하여 D2E7이 생체내에서 hTNFα 활성을 억제하는 데에 효율적임을 입증하였다.
I.D-갈락토사민-감작성 마우스에서의 TNF 유도된 치사작용의 억제
재조합 사람 TNFα(rhTNFα)를 D-갈락토사민 감작성 마우스에게 주입하면 24시간 이내에 치사작용을 일으킨다. TNFα 중화제는 이러한 모형에서 치사작용을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 모형에서 생체내 hTNFα를 중화시키는 사람 항-hTNFα 항체의 기능을 조사하기 위해, C57Bl/6 마우스에 PBS중의 다양한 농도의 D2E7-IgG1 또는 대조구 단백질을 복막내로(i.p.) 주사하였다. 30분후 마우스에 PBS중의 1㎍의 TNFα 및 20mg의 D-갈락토사민을 복막내로 시험주사하였고, 24시간 후에 관찰하였다. rhTNFα 및 D-갈락토사민의 상기의 양은 이들 마우스에서 80 내지 90% 치사작용을 달성하기 위해 미리 결정하였다.
대표적인 결과는 도 6에 생존 % 대 항체 농도의 막대 그래프로 도시되어 있다. 검은색 막대는 D2E7을 나타내는 반면에, 마름모 막대는 MAK 195를 나타낸다. 마우스 당 2.5 내지 25㎍의 D2E7 항체를 주사한 경우 TNFα 유도된 치사작용으로부터 마우스를 보호하였다. ED50값은 약 1 내지 2.5㎍/마우스 였다. 양성 대조구 항체인 MAK 195는 보호 기능면에서 유사하였다. rhTNFα 없이 D2E7을 주사한 경우 마우스에 대해 아무런 유해한 효과를 갖지 않았다. 비특이적인 사람 IgG1 항체를 주사한 경우 TNFα 유도된 치사작용으로부터 보호하지 못하였다.
제 2 실험에 있어서, 49마리의 마우스를 7개의 균등한 그룹으로 나누었다. 각각의 그룹에 LD80용량의 rhTNF/D-갈락토사민 혼합물(마우스 당 1.0㎍ rhTNF 및 20mg D-갈락토사민)을 투여하기 30분 전에 다양한 용량의 D2E7를 투여하였다. 대조구 그룹 7에 25㎍/마우스 용량으로 정상 사람 IgG1 κ 항체를 투여하였다. 마우스를 24시간 후에 조사하였다. 각각의 그룹에 대한 생존률은 하기의 표 13에 용약되어 있다.
D2E7로 처리한후 24시간 생존률
그룹 생존갯수(생존수/전체) 생존률(%)
1 (항체 없음) 0/7 0
2 (1㎍) 1/7 14
3 (2.6㎍) 5/7 71
4 (5.2㎍) 6/7 86
5 (26㎍) 6/7 86
6 (26㎍; rhTNF 없음) 7/7 100
7 (25㎍ Hu IgG1) 1/7 14
II.TNF 유도된 토끼 발열의 억제
토끼에서의 rhTNF 유도된 발열 반응을 억제하는 D2E7의 효능을 조사하였다. 중량이 각각 약 2.5kg인 3마리 NZW 암컷 토끼의 그룹에 D2E7, rhTNF 및 D2E7과 rhTNF의 면역복합체를 정맥내로 주사하였다. 직장 온도를 약 4시간 동안 매분마다 카예(Kaye) 열 기록기상의 더미스터 프로브에 의해 측정하였다. 5㎍/kg으로 주사한 식염수중의 재조합 사람 TNF는 주사한후 약 45분 째에 0.4℃ 이상의 온도 상승을 유도하였다. 138㎍/kg의 용량의 식염수중의 항체 제조물 그 자체는 투여한후 140분 째까지 토끼에서의 온도 상승을 유도하지 못했다. 또 다른 모든 실험에 있어서, D2E7 또는 대조구 시약(사람 IgG1 또는 식염수 비히클)을 토끼에게 정맥내 주사한후, 15분후에 식염수중의 rhTNF를 5㎍/kg으로 정맥내 주사하였다. 여러가지 실험의 대표적인 결과는 하기의 표 14에 요약되어 있다:
래트에서의 D2E7에 의한 rhTNF 유도된 발열의 억제
온도 상승*(℃) 몰비 피크 온도
D2E7 용량(㎍/kg) rhTNF rhTNF + D2E7 억제율**(%) D2E7:rhTNF rhTNF 후의 분(minutes)
14 0.53 0.25 53 1 60
24 0.43 0.13 70 1.6 40
48 0.53 0.03 94 3.3 50
137 0.53 0.00 100 9.5 60
792 0.80 0.00 100 55 60
*= 피크 온도
**= % 억제율 = (1-{rhTNF & D2E7에 의한 온도상승/rhTNF만에 의한 온도상승})×100
14㎍/kg 용량의 D2E7에 의한 정맥내 전처리는 식염수만으로 전처리한 토끼와 비교해 볼때 고열 반응을 부분적으로 억제하였다. 137㎍/kg으로 투여된 D2E7은 동일한 실험에서 rhTNF의 고열 반응을 완전하게 억제하였다. 제 2 실험에 있어서, 24㎍/kg으로 투여된 D2E7는 식염수만으로 전처리한 토끼와 비교해 볼때 또한 고열 반응을 부분적으로 억제하였다. 이러한 실험에서 D2E7 대 rhTNF의 몰비는 1/6:1 이었다. 제 3 실험에 있어서, 48㎍/kg로 정맥 주사된 D2E7(D2E7:rhTNF의 몰비는 3.3:1임)는 30㎍/kg의 식염수중의 대조구 사람 IgG1로 전처리한 토끼와 비교해 볼때 고열 반응을 완전하게 억제하였다. 최종 실험에 있어서, 매우 높은 몰비(55:1)의 D2E7(792㎍/kg) 대 rhTNF로 전처리한 토끼는 관찰 4시간 째까지 계속 온도 상승을 나타내지 않았다. 추가로 rhTNF를 투여하지 않고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 D2E7 및 rhTNF의 혼합물(몰비는 55:1)로부터 생성시킨 면역복합체로 토끼를 처리한 경우 또한 동일한 실험에서 온도 상승을 유도시키지 않았다.
III.Tg197 트랜스유전자를 갖는 마우스에서의 다발성관절염의 예방
질병 발달에 관한 D2E7의 효과는 관절염에 걸린 트랜스유전자를 갖는 쥐과 동물 모형에서 조사하였다. 트랜스유전자를 갖는 마우스(Tg197)를 발생시켰고, 이들 마우스는 사람 야생형 TNF(코딩 서열을 지나 3' 영역에서 변형된)를 발현하며, 생후 4 내지 7주 째에 100% 발생률로 만성 다발성관절염을 발병시켰다(다발성관절염의 Tg197 모형의 추가 설명을 위한 참고문헌:EMBO J(1991)10:4025-4031).
트랜스유전자를 갖는 동물은 생후 3일 째에 PCR에 의해 확인하였다. 트랜스유전자를 갖는 마우스의 한배새끼를 6개 그룹으로 나누었다. 트랜스유전자를 갖는 마우스는 생후 15일 째에 슬롯-블롯 하이브리드형성 분석법에 의해 확인하였다. 6개 그룹에 대한 처리 프로토콜은 다음과 같았다: 그룹 1 = 처리 안함; 그룹 2: 식염수(비히클); 그룹 3 = D2E7(1.5㎍/g); 그룹 4 = D2E7(15㎍/g); 그룹 5 = D2E7(30㎍/g); 및 그룹 6 = IgG1 이소타입 대조구(30㎍/g). 비트랜스유전자를 갖는 마우스의 하나의 한배새끼를 또한 대조구(그룹 7 -비트랜스유전자를 가짐; 처리 안함)로서 실험에 포함시켰다. 각각의 그룹에 지시된 처리의 주 마다 3회 정맥 주사하였다. 주사는 10주간 이어졌다. 매주 마다, 관절 형태의 육안적 변화를 각각의 동물에 대해 기록하였다. 10주 째에, 모두 마우스를 도살시키고, 마우스 조직을 포르말린 중에 수집하였다. 조직의 현미경 조사를 수행하였다.
매주 초에 각각의 마우스에 대해 중량을 달았다. 동시에, 관절 크기(mm)를 병세 측정으로서 또한 측정하였다. 관절 크기는 측미계 기기를 사용하여 우측 후발목관절(hind right ankle) 에 대한 3회 측정치의 평균으로서 확정하였다. 관절염 스코어는 매주 다음과 같이 기록되었다: 0 = 관절염 없음, (정상적인 양상 및 굴곡작용); + = 미약한 관절염(관절 만곡); ++ = 통상 관절염(팽창, 관절 변형) 및 +++ = 중증 관절염(굴곡작용에서 검출된 관절경직 및 심하게 손상된 동작). 관절 절편의 해마톡실린/에오신 염색을 기초로 한 조직병리학적 스코어링은 다음을 기초로 하였다; 0 = 검출가능한 질병 없음; 1 = 활액막의 증식; 2 = 심한 활액 점도증가; 3 = 연골 파괴 및 골 침식증.
Tg197 트랜스유전자를 갖는 관절염에 걸린 마우스의 평균 관절 크기에 대한 D2E7 처리의 효과는 도 9에 그래프로 도시되어 있다. Tg197 트랜스유전자를 갖는 생후 11주된 마우스의 조직병리학적 및 관절염 스코어링은 하기의 표 15에 요약되어 있다:
Tg 197 마우스에서의 조직병리학 및 관절염 스코어에 대한 D2E7의 효과
그룹 처리 조직병리학적 스코어 관절염 스코어
1 없음 3(7/7) +++(7/7)
2 식염수 3(8/8) +++(8/8)
6 IgG1 대조구 3(9/9) +++(7/9)
3 D2E7(1.5㎍/g) 0(6/8) 0(8/8)
4 D2E7(15㎍/g) 0(7/8) 0(8/8)
5 D2E7(30㎍/g) 0(8/8) 0(8/8)
이러한 실험은 D2E7 항체가 실험 기간 후에도 명백한 관절염 없이 야생형 사람 TNF(Tg197)을 발현하는 트랜스유전자를 갖는 마우스에 대해 일정한 유리한 효과를 가짐을 입증하였다.
E.그 밖의 종으로부터의 TNFαs의 D2E7 중화
D2E7의 결합 특이성은 L929 세포독성 검정법(상기의 실시예 4의 A절에 기술된 바와 같은)을 이용하여 다양한 영장류 종 및 마우스로부터의 종양 괴사 인자를 중화시키는 기능을 측정함으로써 조사하였다. 결과는 하기의 표 16에 요약되어 있다:
L929 검정법에서 서로 다른 종으로부터 TNF를 중화시키는 D2E7의 기능
TNFα* 공급원 D2E7 중화에 대한 IC50(M)**
사람 재조합체 7.8 × 10-11
침팬지 LPS-자극된 PBMC 5.5 × 10-11
개코원숭이 재조합체 6.0 × 10-11
명주원숭이 LPS-자극된 PBMC 4.0 × 10-10
게잡이원숭이 LPS-자극된 PBMC 8.0 × 10-11
붉은털원숭이 LPS-자극된 PBMC 3.0 × 10-11
개과 동물 LPS-자극된 WBC 2.2 × 10-10
돼지 재조합체 1.0 × 10-7
쥐과 동물 재조합체 >1.0 × 10-7
표 16의 결과는 D2E7가 사람 TNFα와 거의 동등한 5종의 영장류 동물 TNFαs의 활성을 중화시키고, 더욱이 개과 동물 TNFα(사람 TNFα 보다 약 10배 이상 적음) 및 돼지 및 마우스 TNFα(사람 TNFα 보다 약 1000배 이상 적음)의 활성을 중화시킬 수 있음을 입증한다. 더욱이, 용액상 rhTNFα와 D2E7의 결합은 림프독소(TNFβ), IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IFNγ 및 TGFβ와 같은 서로 다른 시토카인에 의해 억제되지 않는데, 이는 D2E7이 이것의 리간드 TNFα에 매우 특이적임을 나타낸다.
F.D2E7와 함께 인큐베이션시킨 사람 전혈에 의한 시토카인 방출의 결핍
본 실시예에서, 자체적으로 정상 사람 혈액 세포를 유도시켜 시토카인 또는 쉐드 세포 표면 분자를 분비시키는 D2E7의 기능을 조사하였다. D2E7은 3명의 서로 다른 정상 혈액제공자로부터의 희석된 전혈과 함께 다양한 농도로 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 동시에 LPS 양성 대조구를 면역수용능력이 있는 혈액 세포를 자극하여 시토카인을 분비시키도록 미리 결정된 농도에서 인큐베이션시켰다. 상층액을 취하고, 10개의 용해성 시토카인, 수용체 및 부착 분자 ELISA 키트의 패널에서 시험하였다: IL-1α, IL-1β, IL-1 수용체 길항물질, IL-6, IL-8, TNFα, 용해성 TNF 수용체, 용해성 TNF 수용체 II, 용해성 ICAM-1 및 용해성 E-셀렉틴. 시토카인 또는 쉐드 세포 표면 분자는 343㎍/㎖ 이하의 농도에서 D2E7 항체 동시인큐베이션의 결과 유의할 정도로 측정되지 않았다. 항체를 첨가하지 않은 대조구 배양물은 측정가능한 양의 시토카인을 생성시키지 않은 반면에, LPS 동시배양물 대조구는 높은 피코그램에서 낮은 나노그램 범위의 상승된 값을 생성시켰다. 이들 결과는 D2E7이 생체밖의 배양물의 정상 농도를 초과하여 시토카인 또는 쉐드 세포 표면 단백질을 분비시키도록 전혈 세포를 유도시키지 않았음을 나타낸다.
본 명세서의 구성부분은 첨부된 서열표이며, 이는 하기의 표에 요약되어 있다:
서열번호 항체 사슬 영역 서열의 타입
1 D2E7 VL 아미노산
2 D2E7 VH 아미노산
3 D2E7 VL CDR3 아미노산
4 D2E7 VH CDR3 아미노산
5 D2E7 VL CDR2 아미노산
6 D2E7 VH CDR2 아미노산
7 D2E7 VL CDR1 아미노산
8 D2E7 VH CDR1 아미노산
9 2SD4 VL 아미노산
10 2SD4 VH 아미노산
11 2SD4 VL CDR3 아미노산
12 EP B12 VL CDR3 아미노산
13 VL10E4 VL CDR3 아미노산
14 VL100A9 VL CDR3 아미노산
15 VLL100D2 VL CDR3 아미노산
16 VLL0F4 VL CDR3 아미노산
17 LOE5 VL CDR3 아미노산
18 VLLOG7 VL CDR3 아미노산
19 VLLOG9 VL CDR3 아미노산
20 VLLOH1 VL CDR3 아미노산
21 VLLOH10 VL CDR3 아미노산
22 VL1B7 VL CDR3 아미노산
23 VL1C1 VL CDR3 아미노산
24 VL0.1F4 VL CDR3 아미노산
25 VLO.1H8 VL CDR3 아미노산
26 LOE7.A VL CDR3 아미노산
27 2SD4 VH CDR3 아미노산
28 VH1B11 VH CDR3 아미노산
29 VH1D8 VH CDR3 아미노산
30 VH1A11 VH CDR3 아미노산
31 VH1B12 VH CDR3 아미노산
32 VH1E4 VH CDR3 아미노산
33 VH1F6 VH CDR3 아미노산
34 3C-H2 VH CDR3 아미노산
35 VH1-D2.N VH CDR3 아미노산
36 D2E7 VL 핵산
37 D2E7 VH 핵산
균등물
당업자라면 여기에 기술된 본 발명의 특정 구체예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 통상적인 실험을 이용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기의 청구의범위에 포함시키고자 한다.
(1) 일반적 사항
(i) 출원인:
(A) 성명: 바스프 악티엔게젤샤프트
(B) 스트리트: 카를-보쉬 슈트라쎄 38
(C) 시티: 67056 루드빅샤펜
(D) 주: 레인랜드-팔츠
(E) 국가: 독일
(ii) 발명의 명칭: 사람 TNFα와 결합하는 사람 항체
(iii) 서열의 수: 37
(iv) 연락처:
(A) 수신인: 라히시브 & 칵필드
(B) 스트리트: 60 스테이트 스트리트, 슈트 510
(C) 시티: 보스톤
(D) 주: 매사추세츠
(E) 국가: 미국
(F) 우편 번호: 02109-1875
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작업 시스템: PC-DOS / MS-DOS
(D)소프트웨어: Patentin Release #1.0, 버전 # 1.25
(vi) 현재 출원 상황:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(vii) 우선 출원 상황:
(A) 출원 번호: US 08/599,226
(B) 출원일: 1996년 2월 9일
(C) 분류:
(vii) 우선 출원 상황:
(A) 출원 번호: US 60/031,476
(B) 출원일: 1996년 11월 25일
(C) 분류:
(viii) 변리사/대리인 상황
(A) 성명: 데콘티, 지울리오 에이., 쥬니어
(B) 등록 번호: 31,503
(C) 참고/서류 번호: BBI-043CPPC
(ix) 통신처
(A) 전화: (617) 227-7400
(B) 팩스: (617) 227-5941
(2) 서열 번호 1에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 107
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(V) 단편형: 중간 단편
(2) 서열번호 2에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 121
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 3에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(ix) 서열의 특징:
(A) 특징을 나타내는 기호: Modified-site
(B) 존재위치: 9
(D) 기타 정보: /note = "Xaa = Thr 또는 Ala"
(2) 서열 번호 4에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 12
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(ix) 서열의 특징:
(A) 특징을 나타내는 기호: Modified-site
(B) 존재위치: 12
(D) 기타 정보: /note = "Xaa = Tyr 또는 Asn"
(2) 서열 번호 5에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 7
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 6에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 17
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 7에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 11
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 8에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 5
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 9에 대한 사항
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 107
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 10에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 121
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 11에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 12에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 13에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 14에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 15에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 16에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 17에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 18에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 19에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 20에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 21에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 22에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 23에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 24에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 25에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 26에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 27에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 12
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 28에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 12
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 29에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 12
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 30에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 12
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 31에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 12
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 32에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 12
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 33에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 12
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 34에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 12
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 35에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 12
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(v) 단편형: 중간 단편
(2) 서열 번호 36에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 321
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(2) 서열 번호 37에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 363
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA

Claims (73)

1 x 10-8M 이하의 Kd및 1 x 10-3s-1이하의 Koff속도 상수 (두 값은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정됨)로 사람 TNFα로부터 해리되고, 표준 시험관내 L929 검정법에서 1 x 10-7M 이하의 IC50으로 사람 TNFα 세포독성을 중화시키는, 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 1항에 있어서, 5 x 10-4s-1이하의 Koff속도 상수로 TNFα로부터 해리됨을 특징으로 하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 1항에 있어서, 1 x 10-4s-1이하의 Koff속도 상수로 TNFα로부터 해리됨을 특징으로 하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 1항에 있어서, 표준 시험관내 L929 검정법에서 1 x 10-8M 이하의 IC50으로 사람 TNFα 세포독성을 중화시킴을 특징으로 하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 1항에 있어서, 표준 시험관내 L929 검정법에서 1 x 10-9M 이하의 IC50으로 사람 TNFα 세포독성을 중화시킴을 특징으로 하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 1항에 있어서, 표준 시험관내 L929 검정법에서 5 x 10-10M 이하의 IC50으로 사람 TNFα 세포독성을 중화시킴을 특징으로 하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 1항에 있어서, 재조합 항체 또는 이것의 항원 결합 부분임을 특징으로 하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 1항에 있어서, 사람 배꼽 정맥 내피 세포 상에서의 ELAM-1의 사람 TNFα-유도 발현을 억제함을 특징으로 하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
a) 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 1 x 10-3s-1이하의 Koff속도 상수로 사람 TNFα로부터 해리되고;
b) 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 1, 4, 5, 7 또는 8번 위치에서의 단일 알라닌 치환 또는 1, 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9번 위치에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 3으로부터 변형된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 도메인을 지니며;
c) 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번 위치에서의 단일 알라닌 치환 또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및/또는 12번 위치에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 4로부터 변형된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 도메인을 지님을 특징으로 하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 9항에 있어서, 5 x 10-4s-1이하의 Koff속도 상수로 사람 TNFα로부터 해리됨을 특징으로 하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 9항에 있어서, 1 x 10-4s-1이하의 Koff속도 상수로 사람 TNFα로부터 해리됨을 특징으로 하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 1, 4, 5, 7 또는 8번 위치에서의 단일 알라닌 치환에 의해 서열번호 3으로부터 변형된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR), 및 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번 위치에서의 단일 알라닌 치환에 의해 서열번호 4로부터 변형된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 지닌, 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 12항에 있어서, LCVR이 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인을 더 갖고, HCVR이 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인을 더 가짐을 특징으로 하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 13항에 있어서, LCVR이 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 더 갖고, HCVR이 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 가짐을 특징으로 하는 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 지닌, 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 15항에 있어서, IgG1 중쇄 불변 영역을 가짐을 특징으로 하는 단리된 사람 항체.
제 15항에 있어서, IgG4 중쇄 불변 영역을 가짐을 특징으로 하는 단리된 사람 항체.
제 15항에 있어서, Fab 단편임을 특징으로 하는 단리된 사람 항체.
제 15항에 있어서, 단일 사슬 Fv 단편임을 특징으로 하는 단리된 사람 항체.
서열번호 3, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR), 및 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 지닌, 단리된 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
사람 TNFβ가 아닌 사람 TNFα의 활성을 중화시키는 재조합 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 21항에 있어서, 침팬지 TNFα, 및 개코원숭이 TNFα, 명주원숭이 TNFα, 게잡이원숭이 TNFα 및 붉은털원숭이 TNFα로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추가의 영장류 TNFα의 활성을 또한 중화시킴을 특징으로 하는 재조합 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 22항에 있어서, 개과 동물 TNFα의 활성을 또한 중화시킴을 특징으로 하는 재조합 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
제 22항에 있어서, 돼지 TNFα의 활성을 또한 중화시킴을 특징으로 하는 재조합 사람 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 1, 4, 5, 7 또는 8번 위치에서의 단일 알라닌 치환 또는 1, 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9번 위치에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 3으로부터 변형된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 도메인을 코드화하는 단리된 핵산.
제 25항에 있어서, 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)을 코드화함을 특징으로 하는 단리된 핵산.
제 26항에 있어서, 항체 LCVR의 CDR2 도메인이 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산.
제 27항에 있어서, 항체 LCVR의 CDR1 도메인이 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산.
서열번호 4의 아미노산 서열, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번 위치에서의 단일 알라닌 치환 또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및/또는 12번 위치에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 4로부터 변형된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 도메인을 코드화하는 단리된 핵산.
제 29항에 있어서, 항체 중쇄 가변 영역(HCVR)을 코드화함을 특징으로 하는 단리된 핵산.
제 30항에 있어서, 항체 HCVR의 CDR1 도메인이 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산.
제 31항에 있어서, 항체 HCVR의 CDR1 도메인이 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 핵산.
다음의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 코드화하는 단리된 핵산:
서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34.
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 코드화하는 단리된 핵산.
제 34항에 있어서, 항체 경쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 불변 영역을 코드화함을 특징으로 하는 단리된 핵산.
제 35항에 있어서, 재조합 발현 벡터 내에 들어있는 단리된 핵산.
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역을 코드화하는 단리된 핵산.
제 37항에 있어서, 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 중쇄 불변 영역을 코드화하는 단리된 핵산.
제 38항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역이 IgG4 불변 영역임을 특징으로 하는 단리된 핵산.
제 38항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역이 IgG4 불변 영역임을 특징으로 하는 단리된 핵산.
제 38항에 있어서, 재조합 발현 벡터 내에 들어있는 단리된 핵산.
a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체 경쇄; 및
b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체 중쇄를 코드화하는 재조합 발현 벡터.
제 42항에 따른 재조합 발현 벡터를 도입시킨 숙주 세포.
제 43항에 따른 숙주 세포를 사람 TNFα와 결합하는 사람 항체가 세포에 의해 합성될 때까지 배양기에서 배양하는 것을 포함하는, 사람 TNFα와 결합하는 사람 항체의 합성 방법.
제 1항 내지 제 24항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 부분 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제 45항에 있어서, TNFα 활성이 유해한 질환을 치료하기 위해 하나 이상의 추가의 치료제를 더 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
사람 TNFα를 제 1항 내지 제 24항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 부분과 접촉시켜 사람 TNFα 활성을 억제시키는 것을 포함하는 사람 TNFα 활성을 억제시키는 방법.
사람 환자에게 제 1항 내지 제 24항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 부분을 투여하여 사람 환자 내의 사람 TNFα 활성을 억제시키는 것을 포함하는, TNFα 활성이 유해한 질환에 걸린 사람 환자 내의 사람 TNFα 활성을 억제시키는 방법.
제 48항에 있어서, 질환이 패혈증임을 특징으로 하는 방법.
제 49항에 있어서, 항체가 시토카인인 인터루킨-6(IL-6)과 함께 사람 환자에게 투여되거나, 500 pg/ml를 초과하는 IL-6의 혈청 또는 혈장 농도로 사람 환자에게 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 48항에 있어서, 질환이 자가면역 질환임을 특징으로 하는 방법.
제 51항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스성 관절염, 류마티스성 척추염, 골관절염 및 통풍성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 51항에 있어서, 자가면역 질환이 알레르기, 다발성 경화증, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염 및 신증으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 48항에 있어서, 질환이 감염성 질환임을 특징으로 하는 방법.
제 48항에 있어서, 질환이 이식편 거부반응 또는 이식편대숙주 질환임을 특징으로 하는 방법.
제 48항에 있어서, 질환이 악성종양임을 특징으로 하는 방법.
제 48항에 있어서, 질환이 염증성 질환임을 특징으로 하는 방법.
제 48항에 있어서, 질환이 장 질환임을 특징으로 하는 방법.
제 48항에 있어서, 질환이 심장 질환임을 특징으로 하는 방법.
제 48항에 있어서, 질환이 염증성 골 질환, 골흡수 질환, 알코올성 간염, 바이러스성 간염, 격증 간염, 응고 장애, 화상, 재환류 손상, 켈로이드 형성, 반흔 조직 형성, 발열, 치주 질환, 비만 및 방사선 독성으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
TNFα 활성이 유해한 질환의 치료를 위한 약제 제조에 제 1항 내지 제 24항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 사용하는 방법.
제 61항에 있어서, 질환이 패혈증임을 특징으로 하는 방법.
제 62항에 있어서, 항체가 시토카인인 인터루킨-6(IL-6)과 함께 사람 환자에게 투여되거나, 500 pg/ml을 초과하는 혈청 또는 혈장 농도로 사람 환자에게 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 61항에 있어서, 질환이 자가면역 질환임을 특징으로 하는 방법.
제 64항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스성 관절염, 류마티스성 척추염, 골 관절염 및 통풍성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 64항에 있어서, 자가면역 질환이 알레르기, 다발성 경화증, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염 및 신증으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 61항에 있어서, 질환이 감염성 질환임을 특징으로 하는 방법.
제 61항에 있어서, 질환이 이식편 거부반응 또는 이식편대숙주 질환임을 특징으로 하는 방법.
제 61항에 있어서, 질환이 악성종양임을 특징으로 하는 방법.
제 61항에 있어서, 질환이 염증성 질환임을 특징으로 하는 방법.
제 61항에 있어서, 질환이 장 질환임을 특징으로 하는 방법.
제 61항에 있어서, 질환이 심장 질환임을 특징으로 하는 방법.
제 61항에 있어서, 질환이 염증성 골 질환, 골흡수 질환, 알코올성 간염, 바이러스성 간염, 격증 간염, 응고 장애, 화상, 재환류 손상, 켈로이드 형성, 반흔 조직 형성, 발열, 치주 질환, 비만 및 방사선 독성으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
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