MXPA05007019A

MXPA05007019A - Terapia de combinacion con factores co-estimuladores.

Info

Publication number: MXPA05007019A
Application number: MXPA05007019A
Authority: MX
Inventors: Deep Khare Sanjay
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2002-12-30
Filing date: 2003-12-24
Publication date: 2005-08-18
Also published as: PL378879A1; AU2003299971A1; EP1578782A4; US7928074B2; WO2004060911A3; JP2006517191A; WO2004060911A2; US20080279862A1; EP1578782A2; CA2511823A1; US20040208874A1

Abstract

Se describen metodos para tratar una condicion inflamatoria o autoinmunitaria. Se describen metodos para tratar una condicion inflamatoria o autoinmunitaria con inhibidores de IL-1 y un inhibidor de la activacion de celulas B o celulas T. Se describen metodos para tratar una condicion inflamatoria o autoinmunitaria con inhibidores de TNF y un inhibidor de la activacion de celulas B o celulas T.

Description

TERAPIA DE COMBINACION CON FACTORES CO-ESTIMULADORES Campo de la Invención La presente invención se refiere a polipéptidos comprendidos en la regulación de la inflamación y respuesta inmunitaria. La invención también se refiere a la terapia de combinación que usa moléculas comprendidas en la estimulación de células B y células T con antagonistas de citocina. Antecedentes de la Invención Las enfermedades autoinmunitarias inflamatorias comprenden típicamente una desregulación compleja del sistema biológico. Al comienzo de las enfermedades autoinmunitarias, en ciertos casos, se elevan los niveles de ciertas citocinas proinflamatorias tal como TNF e IL-1. Además, en ciertos casos, las células T y las células B inmunitarias también pueden jugar un papel al producir citocinas, quimiocinas y auto-anticuerpos . La activación del sistema inmunitario a las moléculas mismas del cuerpo conduce a la auto-inmunidad. Ciertas enfermedades autoinmunitarias inflamatorias son el resultado de las interacciones que se presentan entre las células que presentan el antígeno (APC) y las células T, y entre células T y B. Ciertas enfermedades autoinmunitarias inflamatorias también son el resultado de la activación de células B, además de la cascada pro-inflamatoria de las REF: 164047 citocinas. Durante una respuesta inmunitaria, se presentan péptidos antigénicos por las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) expresadas en las células que presentan el antígeno (APC) al receptor de células T expresados en células T. Este evento de reconocimiento no puede activar completamente las células T. En ciertos casos, se puede requerir una interacción de CD4 a la molécula de MHC y una "segunda o co-estimuladora" señal (durante la interacción similar de las APC y las células T) para la proliferación de células T, la producción de citocinas y los eventos de señalización intracelular . La interacción de las moléculas de CD28 y B7 se identificó como una segunda señal para activar células T. Esta ruta de co-estimulación inmunitaria tiene un regulador negativo, el CTLA4 , expresado en células T activadas . El tratamiento con una proteína recombinante de receptor soluble de CTLA-4 conduce a la inactivación de células T y B inmunitarias . En años recientes, muchas otras moléculas co-estimuladoras expresadas en células APC o T (CD40:CD40L, B7:CD28 y CTLA-4, 4-IBB : 4-1BBL, OX40L:OX40, B7RP1 : ICOS etc.) se han mostrado que están comprendidas en la activación de células T. Algunas de estas moléculas co-estimuladoras también están comprendidas en la activación de células B y la producción de anticuerpos.

Breve Descripción de la Invención En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar una enfermedad mediada por IL-1, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de IL-1 y al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar una enfermedad mediada por TNF-a, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de TNF- y al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar una condición inflamatoria o autoinmunitaria, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de IL-1 y al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar una condición inflamatoria o autoinmunitaria, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de TNF-a y al menos un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar una condición inflamatoria o autoinmunitaria, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de (i) al menos uno de un inhibidor de AGP3, un inhibidor de BAFFR, y un inhibidor de TACI, y (ii) al menos un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar una condición inflamatoria o autoinmunitaria, que 5 comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de IL-1, una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de TNF-a, y al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28. Breve Descripción de las Figuras 10 La Figura 1 muestra las puntuaciones promedio de artritis en animales con artritis inducida por colágeno (CIA) durante y después del tratamiento con un inhibidor de IL-1 (KIN2) (SEQ. ID. No.: 3), proteína de fusión CTLA -Fe murina, y una combinación de los mismos . La flecha indica que los 15 animales se administraron por inyección de 100 ^g de KIN2, 100 µ<3 de CTLA4 -Fe murina, o 100 µg cada uno de KIN2 y CTLA4- Fc murina en el día 0, +1, +2, +4, +6, +8 y +10 después del comienzo de la enfermedad. 100 /zg es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por kg de peso del animal (5 mg/kg) . Se 20 usó como control solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Las barras de error indican error estándar de la media . La Figura 2 muestra las puntuaciones promedio de artritis en animales con CIA durante y después del _-. tratamiento con un inhibidor de TNF-alfa (PEG sTNFR-1 2.6D), proteína de fusión CTLA4-FC murina, y una combinación de los mismos . La flecha indica que los animales se administraron por inyección de 100 /¿g de PEG sTNFR-1 2.6D 100 /xg de CTLA4-Fc murina, o 100 µg, cada uno de PEG sTNFR-1 2.6D y CTLA4-Fc murina en el día 0, +1, +2, +4, +6, +8 y +10 después del comienzo de la enfermedad. 100 ¿íg es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por kg de peso del animal (5 mg/kg) . Se usaron como controles solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y Fe. Las Figuras 3A y 3B muestran los niveles de los anticuerpos específicos de colágeno tipo II (CII) presentes en las muestras séricas tomadas diez días después de la conclusión del experimento mostrado en la Figura 2. (A) Niveles de anticuerpo de IgGl; (B) niveles de anticuerpos IgG2b. Los anticuerpos se analizaron como se describe en el Ej emplo 2. La Figura 4 muestra las puntuaciones promedio de artritis en ratones B10.RIII machos con CIA, modificados con vectores que expresan IL-lra, s-TNFRI (SEQ. ID. No. : 4) y/o CTLA-4 SEQ. ID. No.: 2) . En el día 19 después de un refuerzo de colágeno tipo II porcino, los ratones se administraron con vectores virales que codifican para IL-lra, s-TNFRI, CTLA-4 o ß-galactosidasa como un control. Para la terapia de combinación, los ratones se administraron tanto con vectores de IL-lra y CTLA-4, vectores de s-TNFRI y CTLA-4, o vectores de IL-lra y s-TNFRI.

La Figura 5 muestra el por ciento de incidencia de artritis en los mismos grupos de ratones como en la Figura 4. La Figura 6 muestra niveles de anticuerpos específicos de colágeno tipo II (CII) presentes en las sangres de los mismos grupos de ratones como en la Figura 4. Se sangraron ratones varias semanas después del refuerzo de colágeno tipo II porcino y los anticuerpos se analizaron como se describe en el Ejemplo 3. La Figura 7 muestra el por ciento de supervivencia de ratones Fl (NZBx ZW) de seis meses de edad inyectados tres veces por semana durante dos meses con 100 /¿g del pepticuerpo AGP3 (una fusión de péptido dimérico-Fc en tándem de AGP3) ("AGP3 Pb") (SEQ. ID. No.: 12), 50 µ de CTLA4-FC murina, o una combinación de 100 jag de AGP3 Pb y 50 ^g de CTLA4-FC murina. 100 µ es equivalente a 4 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (4 mg/kg) . 50 g es equivalente a 2 mg del producto terapéutico por kg de peso de animal (2 mg/kg) . Se usaron Fe y PBS como controles. La Figura 8 muestra el por ciento de ratones en los grupos de tratamiento en la Figura 7 con niveles de proteinuria que exceden 300 mg/dl. Los ratones propensos a lupus se probaron para proteinuria cada 30 días usando el ensayo comercial AlbustixMR (Bayer AG) . Las Figuras 9A y 9B muestran el porcentaje de células B positivas a B220 en la sangre periférica de ratones en los grupos de tratamiento mostrados en la Figura 7. Se determinaron las células B positivas a B220 por tinción con FACS. (A) El por ciento de células B220+ en sangre periférica se determinó al final del periodo de tratamiento. (B) El por ciento de células B220+ en sangre periférica se determinó un mes después del final del periodo de tratamiento. La Figura 10 muestra los cambios en los niveles del ADN de doble hebra específico de IgG en suero recolectado a los 30, 60 y 90 días después del tratamiento inicial con ya sea AGP3 Pb (una fusión de péptido dimérico-Fc en tándem de AGP3) , CTLA4-FC murina o la combinación de los mismos. El cambio del nivel de anticuerpo de dsAHN se determinó al dividir los niveles de los anticuerpos en los días 30, 60 y 90 por sus niveles de anticuerpo de pre-tratamiento en el día 0 para los diez ratones (media +/- error estándar) . Se recolectó suero en aquellos días y se valoró para niveles de anticuerpo de dsADN usando técnicas de ELISA como se describe en el Ej emplo 4. La Figura 11 muestra el cambio en los niveles del ADN de doble hebra específico de IgM en suero recolectado a los 30, 60 y 90 días después del tratamiento inicial con ya sea AGP3 Pb (una fusión de péptido dimérico-Fc en tándem de AGP3) , CTLA4-Fc murina o una combinación de los mismos. Los niveles de dsADN y cambio en el nivel de anticuerpo de dsADN se determinó como se describe en la Figura 10 excepto que se detectó dsADN específico de IgM. La Figura 12 muestra las puntuaciones promedio de artritis en animales con CIA durante y después del 5 tratamiento con un inhibidor de TNF-alfa (PEG sTNFR-1 2.6D), AGP3 Pb (una fusión de péptido dimérico-Fc en tándem de AGP3) , y una combinación de los mismos. Los animales se administraron por inyección de 100 /¿g de PEG sTNFR-1 2.6D, 100 µg de AG 3 Pb, o 100 g cada uno de PEG sTNFR-1 2.6D y 10 AGP3 Pb en el día 0, +1, +2, +4, +6, +8 y +10 después del comienzo de la enfermedad. 100 /xg es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (5 mg/kg) . Se usó solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y Fe como controles . 15 La Figura 13 muestra las puntuaciones promedio de artritis en animales con CIA durante y después del tratamiento con un inhibidor de IL-1 (KIN2) , AGP3 Pb (una fusión de péptido dimérico-Fc en tándem de AGP3) , y una combinación de los mismos. Los animales se administraron por 20 inyección de 100 µg de KIN2 , 100 µg de AGP3 Pb, o 100 µg cada uno de KIN2 y AGP3 Pb en el día 0, +1, +2, +4, +6, +8 y +10 después del comienzo de la enfermedad. 100 g es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (5 mg/kg) . Se usaron solución salina amortiguada con fosfato QE- (PBS) y Fe como controles.

La Figura 14 muestra las puntuaciones promedio de artritis en animales con CIA durante y después del tratamiento con IN2, PEG sTNFR-1 2.6D, anticuerpo anti- OX40L, a una combinación de anticuerpos anti-OX40L y IN2, y 5 una combinación de anticuerpos anti-OX40L y PEG sTNFR-1 2.6D. Los animales se administraron por inyección de 100 jg de KIN2, 100 ^g de PEG sTNFR-1 2.6D, 100 µg de anticuerpo anti- OX40L, 100 g cada uno de KIN2 y anticuerpo anti-OX40L, o 100 /¿g cada uno de PEG sTNFR-1 2.6D y anticuerpo anti-OX40L en 10 el día 0, +1, +2, +4, +6, +8 y +10 después del comienzo de la enfermedad. 100 /xg es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (5 mg/kg) . Se usaron solución salina amortiguada con fosfato (PBS) e IgG de rata como controles . 15 La Figura 15 muestra el por ciento de supervivencia de ratones Fl (NZBxNZ ) de seis meses de edad pre-detectados para más de 100 mg/dl de proteína en la orina. Los ratones pre-detectados se inyectaron tres veces por semana durante 12 semanas con 100 µg de AGP3 Pb (una fusión de péptido 20 dimérico-Fc en tándem de AGP3) 50 ^g de CTLA4-Fc murina, o una combinación de 100 ¿¿g de AGP3 Pb y 100 ^g de CTLA4-Fc murina. 100 xg es equivalente a 4 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (4 mg/kg) . 50 µg es equivalente a 2 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (2 _ .. mg/kg) . Se usaron Fe y PBS como controles .

La Figura 16 muestra la severidad de la proteinuria en ratones Fl (NZBxNZ ) pre-detectados para más de 100 mg/dl de proteína en la orina. Los ratones pre-detectados se inyectaron tres veces por semana durante 12 semanas con 100 /¿g de AGP3 Pb (una fusión de péptido dimérico-Fc en tándem de AGP3) , 50 jug de CTLA4-Fe murina, o una combinación de 100 µg de AGP3 Pb y 50 jug de CTLA4-Fe murina. 100 µg es equivalente a 4 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (4 mg/kg) . 50 ig es equivalente a 2 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (2 mg/kg) . Se usaron Fe y PBS como controles . Los ratones se probaron para proteinuria cada semana usando el ensayo comercial Albustix"11 (Bayer AG) . La Figura 17 muestra el por ciento de supervivencia de ratones Fl (NZBxNZW) pre-detectados para más de 300 mg/dl de proteína en la orina. Los ratones pre-detectados se inyectaron tres veces por semana durante doce semanas con 100 /xg de AGP3 Pb (una fusión de péptido dimérico-Fc en tándem de AGP3) , 50 de CTLA4-FC murina, o una combinación de 100 µ<3 de AGP3 Pb y 50 f.g de CTLA4-Fe murina. 100 ^g es equivalente a 4 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (4 mg kg) · 50 µg es equivalente a 2 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (2 mg/kg) . Se usaron Fe y PBS como controles . La Figura 18 muestra la severidad de la proteinuria en ratones Fl (NZBxNZW) pre-detectados para más de 300 mg/dl de proteína en la orina. Los ratones pre-detectados se inyectaron tres veces por semana durante 36 semanas con 100 µg de AGP3 Pb (una fusión de péptido dimérico-Fc en tándem de AGP3) , 50 de CTLA4-Fc murina, o una combinación de 100 de AGP3 Pb y 50 de CTLA4-Fe murina. 100 /xg es equivalente a 4 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (4 mg/kg) . 50 /¿g es equivalente a 2 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (2 mg/kg) . Se usaron Fe y PBS como controles . Los ratones se trataron para proteinuria cada semana usando el ensayo comercial Albustix" (Bayer AG) . La Figura 19 muestra la secuencia de aminoácidos del pepticuerpo AGP-3 (SEQ. ID. No. : 1) . La Figura 20 muestra la secuencia de aminoácidos de CTLA -Fe humano. La Figura 21 muestra la secuencia de nucleótidos de KIN2 (FcIL-lra) (SEQ. ID. No . : 5) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ. ID. No.: 3). La Figura 22 muestra la secuencia de nucleótidos de sTNFR-1 (SEQ. ID. No.: 6) y la secuencia .de aminoácidos correspondiente (SEQ. ID. No.: 4). La Figura 23 muestra la secuencia de aminoácidos del receptor de IL-1 (SEQ. ID. No.: 7). La Figura 24 muestra la secuencia de aminoácidos de TNFR-I (SEQ. ID. No.: 8). La Figura 25 muestra la secuencia de aminoácidos de TNFR-II (SEQ. ID. No.: 9). La Figura 26 muestra la secuencia de aminoácidos de CD40 (SEQ . ID. No. : 10) . La Figura 27 muestra la secuencia de aminoácidos de CD30 (SEQ. ID. No.: 11). La Figura 28 muestra la secuencia de aminoácidos de ICOS (SEQ. ID. No. : 12) . La Figura 29 muestra la secuencia de aminoácidos de CD28 (SEQ. ID. No. : 12) . La Figura 30 muestra la secuencia de aminoácidos de OX40 (SEQ. ID. No. : 14) . La Figura 31 muestra la secuencia de aminoácidos de 4-1-BB (SEQ. ID. No.: 15). La Figura 32 muestra la secuencia de aminoácidos de CD27 (SEQ. ID. No. : 16) . La Figura 33 muestra la secuencia de aminoácidos del receptor de IL-18 (SEQ. ID. No. : 17) . La Figura 34 muestra la secuencia de aminoácidos de PD-1 (SEQ. ID. No. : 18) . La Figura 35 muestra la secuencia de aminoácidos de TNFR-I de rata (SEQ. ID. No.: 21). La Figura 36 muestra la secuencia de aminoácidos de CTLA4 murino (SEQ. ID. No.: 19). La Figura 37 muestra la secuencia de aminoácidos de TACI (SEQ. ID. No.: 27).

Descripción Detallada de Ciertas Modalidades Preferidas Los encabezados de las secciones usados en la presente son para propósitos organizativos únicamente y no se deben considerar como limitantes de la materia descrita. Todas las referencias o porciones de las referencias citadas en esta solicitud se incorporan expresamente por referencia en la presente para cualquier propósito. En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se señale específicamente lo contrario. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se señale lo contrario. Adicionalmente, el uso del término "que incluye", así como otras formas, tal como "incluye" e "incluido" no es limitante. También, los términos tal como "elemento" o "componente" abarca tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad a menos que se señale específicamente lo contrario. Se pueden usar técnicas normales para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos, y cultivo de tejido y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Se pueden realizar reacciones enzimáticas y técnicas de purificación de acuerdo a las especificaciones del fabricante o como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriores se pueden realizar en general de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y analizan a todo lo largo de la especificación. Ver, por ejemplo Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) ) , que se incorpora en la presente como referencia para cualquier propósito. A menos que se proporcionen definiciones especificas, las nomenclaturas utilizadas en unión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente son aquellas conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Las técnicas normales se pueden usar para síntesis química, análisis químico, preparación farmacéutica, formulación, y distribución, y el tratamiento de pacientes . Como se utiliza de acuerdo con la presente descripción, los siguientes términos, a menos que se indique de otro modo, se deben entender que tienen los siguientes significados: El término "polinucleótido aislado" como se usa en la presente debe significar un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, o de origen sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (1) no esté asociado con todo o una porción de un polinucleótido en el cual se encuentra en la naturaleza el "polinucleótido aislado", (2) está enlazado a un polinucleótido al cual no está enlazado en la naturaleza, o (3) no se presente en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. El término "proteína aislada" referido en la presente significa una proteína codificada por ADNc, AN recombinante, u origen sintético o alguna combinación de los mismos, que (1) está libre de al menos algunas proteínas con las cuales se encontraría de forma normal, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no se presenta en la naturaleza. El término "polipéptido" se usa en la presente como un término genérico para referirse a proteínas nativas, o secuencias que tienen supresiones, adiciones, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. El término "que se presenta de forma natural" como se usa en la presente como se aplica a un objeto se refiere al hecho que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio o de otro modo se presenta de forma natural . El término "enlazado de forma operable" como se usa en la presente se refiere a componentes que están en una relación que les permite funcionar de su manera propuesta. Por ejemplo, una secuencia de control "operablemente enlazada" a una secuencia de codificación está ligada de una manera tal que se logra la expresión de la secuencia de codificación bajo condiciones compatibles con las secuencias de control . El término "secuencia de control" como se usa en la presente se refiere a secuencias de polinucleótido que pueden afectar la expresión y procesamiento de la secuencia de codificación a las cuales están ligadas . La naturaleza de estas secuencias de control puede diferir dependiendo del organismo hospedador. De acuerdo a ciertas modalidades, las secuencias de control para procariotas pueden incluir promotor, sitio de unión ribosomal, y secuencia de terminación de trascripción. De acuerdo a ciertas modalidades, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores y secuencia de terminación de trascripción. En ciertas modalidades, "secuencias de control" pueden incluir secuencias guía y/o secuencias de compañero de fusión. El término "molécula soluble de receptor" se refiere a una molécula que comprende un fragmento de un receptor que permanece capaz de unirse a uno o más ligandos asociados con el receptor. En ciertas modalidades, un fragmento puede comprender el dominio extracelular completo de un receptor o un sub-fragmento del mismo. En ciertas modalidades, las moléculas solubles de receptor pueden estar enlazadas a otros grupos . En ciertas modalidades, el fragmento puede estar enlazado a aminoácidos adicionales del receptor, como en las variantes de empalme. En ciertas modalidades, las variantes de empalme pueden comprender aminoácidos del dominio intracelular o el dominio transmembrana, o aún de otra proteína natural . En ciertas modalidades, el fragmento puede estar enlazado a otra proteína o secuencia de fragmento de proteína, formando una proteína de fusión. En ciertas modalidades, el fragmento o proteína de compañero de fusión puede proporcionar mayor vida media a la molécula (por ejemplo, un dominio de Fe, albúmina o un dominio de cierre de leucina) . En ciertas modalidades, la proteína o fragmento de compañero de fusión también puede proporcionar una diferente funcionalidad (por ejemplo, ser capaz de la unión al mismo o diferente ligando), formando una molécula bifuncional. En ciertas modalidades, este compañero de fusión funcional puede ser otro fragmento del mismo receptor, formando de esta manera un dímero de unión al ligando. En ciertas modalidades, el fragmento se puede enlazar a una metionina N-terminal, que puede ser útil para permitir la expresión en células procarióticas tal como E. coli . En ciertas modalidades, el fragmento puede estar enlazado a grupos no proteinaceos . Estos grupos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, cadenas de carbohidratos N-enlazadas u O-enlazadas, polímeros solubles en agua tal como polietilenglicol (PEG) y derivados de los mismos (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,179,337). Otras modificaciones químicas dentro del significado de este término incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico y moléculas relacionadas . En ciertas modalidades , los polipéptidos se pueden modificar en posiciones aleatorias dentro de la molécula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir una, dos, tres o más porciones químicas unidas. En ciertas modalidades, también se pueden modificar los polipéptidos en posiciones predeterminadas en el polipéptido, tal como en el término amino, o en un residuo seleccionado de lisina o arginina dentro del polipéptido. Otras modificaciones químicas incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, una marca detectable tal como una marca enzimática, fluorescente, isotópica o de afinidad para permitir la detección y aislamiento de la proteína. El término "proteína" se refiere a polipéptidos a pesar de la longitud u origen, que comprende moléculas que se producen de forma recombinante o que se presentan de forma natural, de longitud completa o truncadas, que tienen una secuencia natural o secuencia mutada, con o sin modificación post-transduccional, ya sea producidas en células de mamífero, células bacterianas, u otro sistema de expresión. El término "compañero de unión específica" se refiere a cualquier molécula que se una de manera preferencial a una proteína de interés, a pesar de la actividad antagonística o agonística de la molécula hacia la proteína de interés . Los compañeros de unión específica de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, anticuerpos, receptores solubilizados , péptidos, péptidos modificados y moléculas relacionadas. El término "vehículo" se refiere a una molécula que impide la degradación y/o incrementa la vida media, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad, o incrementa la actividad biológica de una proteína terapéutica. En ciertas modalidades, los vehículos incluyen un dominio de Fe, así como un polímero lineal (por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , polilisina, dextrano, etc.); un polímero de cadena ramificada (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,289,872 de Denkenwalter et al., emitida el 15 de septiembre de 1981; 5,229,490 de Tam, emitida el 20 de julio de 1993; la WO 93/21259 de Frechet et al., publicada el 28 de octubre de 1993) ; un lípido; un grupo de colesterol (tal como esteroide) ; un carbohidrato u oligosacárido; y cualquier proteína natural o sintética, polipéptido o péptido que se una a un receptor de salvamento. El término "Fe nativo" se refiere a una molécula o secuencia que comprende las secuencias de un fragmento de no unión al antígeno que resulta de la digestión del anticuerpo entero, ya sea en forma monomérica o multimérica. En ciertas modalidades, la fuente original de monoglobulina del Fe nativo es de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas , incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, IgGl e IgG2. Los Fe nativos están constituidos típicamente de polipéptidos monoméricos que pueden estar enlazados en formas diméricas o multiméricas por asociación covalente (es decir, enlaces de disulfuro) y no covalente. En ciertas modalidades, el número de enlaces intermoleculares de disulfuro entre las subunidades monoméricas de las moléculas de Fe nativo varía de 1 a 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, igG, igA, IgE) o de la subclase (por ejemplo IgGl, IgG2, lgG3 , IgAl, IgGA2) . En ciertas modalidades, un Fe nativo es un dímero unido a disulfuro que resulta de la digestión con papaína de una IgG (ver, Ellison et al., (1982), Nucleic Acids Res. 10:4071-9). El término "Fe nativo" como se usa en la presente es genérico a las formas monomérica, dimérica y multimérica. El término "variante de Fe" se refiere a una molécula o secuencia que se modifica de un Fe nativo pero comprende aún un sitio de unión para el receptor de salvamento, FcRn. Las solicitudes internacionales O 97/34531 (publicada el 25 de septiembre de 1997) y la WO 96/32478 describen variantes de Fe de ejemplo, así como la interacción con el receptor de salvamento, y se incorporan de este modo como referencia en su totalidad para cualquier propósito. En ciertas modalidades, el término "variante de Fe" comprende una molécula o secuencia que está humanizada de un Fe nativo no humano. En ciertas modalidades, un Fe nativo comprende sitios que se puedan remover debido a que proporcionan características estructurales o actividad biológica que no se requiere por las moléculas de fusión de la presente invención. En ciertas modalidades, el término "variante de Fe" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o residuos de Fe nativo que afectan, o están comprendidos en, (1) formación de enlace de disulfuro, (2) incompatibilidad con una célula hospedadora seleccionada, (3) heterogeneidad N-terminal en la expresión en una célula hospedadora seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con complemento, (6) unión a un receptor de Fe diferente de un receptor de salvamento, o (7) citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Ciertas variantes de Fe se describen en detalle adicional en la WO 00/24782, publicada el 4 de mayo del 2000, que se incorpora de este modo como referencia en su totalidad para cualquier propósito. El término "dominio de Fe" abarca Fe nativo y moléculas y secuencias variantes de Fe como se define anteriormente. Como con las variantes de Fe y los Fe nativos, el término "dominio de Fe" incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, ya sea digeridas del anticuerpo entero o producidas por otro medio. El término "multlmero" como se aplica a los dominios de Fe o moléculas que comprenden dominios de Fe se refiere a moléculas que tienen dos o más cadenas de polipéptido asociadas de forma covalente, no covalente, o tanto por interacciones covalentes como no covalentes . Las moléculas de IgG forman típicamente dimeros ; IgM, pentámeros, IgD, dimeros; e igA, monómeros, dimeros, trímeros o tetrámeros. En ciertas modalidades, se puede formar multímeros al explotar la secuencia y la actividad resultante de la fuente de Ig nativa del Fe o al derivatizar (como se define posteriormente) este Fe nativo. El término "dímero" como se aplica a dominios de Fe o moléculas que comprenden dominios de Fe se refiere a moléculas que tienen dos cadenas de polipéptido asociadas de forma covalente o no covalente. Los términos "que derivatiza" y "derivatizado" o "derivatizado" comprenden procesos y compuestos resultantes respectivamente en los cuales está presente al menos uno de los siguientes: (1) el compuesto tiene una porción cíclica; por ejemplo, reticulación' entre residuos de cisteinilo dentro del compuesto; (2) el compuesto está reticulado o tiene un sitio de reticulación; por ejemplo, el compuesto tiene un residuo de cisteinilo y forma de esta manera dímeros reticulados sin cultivo o in vivo; (3) uno o más enlaces de peptxdilo se reemplazan por un enlace no de peptidilo; (4) el N-término se reemplaza por -NRR1, NRCÍOjR1, -NRCfC OR1, NRS(0)2 a, -NHC(0)NHR, un grupo de succinimida, o un benciloxicarbonil-NH-sustituido o insustituido, en donde R y R1 y los sustituyentes del anillo son como se definen posteriormente en la presente; (5) el C-término se reemplaza por C(0)R2 o -NR3R4 en donde R2, R3 y R4 son como se definen posteriormente en la presente; y (6) un compuesto en el cual las porciones individuales de aminoácidos se modifican a través de un tratamiento con agentes capaces de reaccionar con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados . El término "péptido" se refiere a moléculas de 2 a 40 aminoácidos, incluyendo, de manera enunciativa y sin 4 limitación, moléculas de 3 a 20 aminoácidos y moléculas de 6 ¿..a. 15 aminoácidos . En ciertas modalidades , los péptidos se pueden generar de forma aleatoria por cualquiera de los métodos citados en la presente, transportados en una biblioteca peptídica (por ejemplo, una biblioteca de visualización de fagos) , o derivados por digestión de proteínas . El término "aleatorizado" , como se usa para referirse a secuencias peptídicas, se refiere a secuencias completamente aleatorias (por ejemplo, seleccionadas por métodos de exhibición de fago) y secuencias en las cuales se reemplazan uno o más residuos de una molécula que se presenta de forma natural por un residuo de aminoácido que no aparece en esa posición de la molécula que se presenta de forma natural. Los métodos de ejemplo para identificar secuencias peptxdicas incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, visualización de fago, visualización de E. coli, visualización de ribosoma, detección basada en levadura, detección de ARN-péptido, detección química, diseño racional, análisis estructural de proteínas y similares. Ciertos péptidos aleatorizados y ciertos métodos para generarlos aparecen por ejemplo en WO 00/24782, publicada el 4 de mayo del 2000, que se incorpora de este modo como referencia en su totalidad para cualquier propósito. El término "farmacológicamente activo" significa que una sustancia descrita de este modo se determina que tiene actividad que afecta un parámetro médico (por ejemplo, proliferación de células T) o estado de enfermedad (por ejemplo, cáncer, trastornos autoinmunitarros) . En ciertas modalidades, los compuestos farmacológicamente activos comprenden compuestos agonísticos o miméticos y antagonísticos como se define posteriormente. El término "agente farmacéutico o fármaco" como se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente. El término "muestra biológica" , como se usa en la presente, incluye, de manera enunciativa y sin limitación, cualquier cantidad de una sustancia de una cosa viva o cosa anteriormente viva. Estas cosas vivas incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, humanos, ratones, monos, ratas, conejos y otros animales. Estas sustancias incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, sangre, suero, orina células, órganos, tejidos, hueso, médula ósea, nodulos linfáticos y piel. Como se usa en la presente, "sustancialmente puro" significa una especie que es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) . En ciertas modalidades, una fracción sustancialmente purificada es una composición, en donde la especie comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes . En ciertas modalidades, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de todas las especies macromolares presentes en la composición. En ciertas modalidades, la especie se purifica a homogeneidad esencial (no se pueden detectar especies contaminantes en la composición por los métodos convencionales de detección) en donde la composición consiste esencialmente de una especie macromolecular individual . El término "paciente" incluye sujetos humanos y animales . El término "agente" se usa en la presente para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto elaborado de materiales biológicos . Como se usa en la presente, los términos "marca" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, por incorporación de un aminoácido radiomarcado o unión a un polipéptido de porciones de biotina que se puede detectar por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzim tica que se puede detectar por métodos ópticos o colorimétricos) . En ciertas modalidades, la marca o marcador también puede ser terapéutico. Se conocen en la técnica y se pueden usar varios métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas . Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, lo siguiente: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3 H, 14 C, 15 N, 35 S, 90 Y, 99 Te, 111 In, 125 I, 131 I) , marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos) , marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) , quimioluminiscentes , grupos de biotinilo, epltopes de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cierre de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcas de epítopes) . En ciertas modalidades, las marcas se unen por brazos separadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial . Los términos "antagonistas" o "inhibidor" se refieren a una molécula que bloquea o de algún modo interfiere con la actividad biológica de la proteína asociada de interés, o tiene actividad biológica comparable a un antagonista o inhibidor conocido de la proteína asociada de interés . Adicionalmente, las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de esta invención también se abarcan en la presente. Por "sales fisiológicamente aceptables" se quiere decir cualquier sal que se conozca o descubra posteriormente que sea farmacéuticamente aceptable. Ciertos ejemplos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, acetato; trifluoroacetato; hidrohaluros , tal como clorhidrato o bromhidrato; sulfato; citrato; tartrato; glicolato; y oxalato. El término "polinucleótido" como se refiere en la presente significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud. En ciertas modalidades, las bases pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de hebra individual y doble de ADN. El término "oligonucleótido" como se refiere en la presente incluye nucleótidos que se presentan de forma natural, y nucleótidos modificados enlazados conjuntamente por enlaces de oligonucleótido que se presentan de forma natural, y/o que no se presentan de forma natural. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que comprenden en general una longitud de 200 bases o menos. En ciertas modalidades, los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud. En ciertas modalidades, los oligonucleótidos son de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser de hebra individual o de doble hebra, por ejemplo, para el uso en la construcción de un mutante génico. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos homosentido o antisentido. El término "nucleótidos que se presentan de forma natural" incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos . El término "nucleótidos modificados" incluye nucleótidos con grupos de azúcares modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces de oligonucleótidos" incluye enlaces de oligonucleótidos tal como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoseleneoato, fosforodiselenoato; fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y similares. Ver, por ejemplo, LaPlanche et al., Nucí. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucí. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed. , Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,151,510 ; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), las descripciones de las cuales se incorporan de este modo como referencia para cualquier propósito. Un oligonucleótido puede incluir una marca para detección. Se puede calcular fácilmente, por métodos conocidos, la identidad y similitud de los polipéptidos relacionados. Estos métodos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. , ed. , Oxford üniversity Press, New York (1988) Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. , ed. , Academia Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data-, Part 1, Griffin, A.M. , and Griffin, H.G., eds . , Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academia Press (1987) ; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds., M. Stockton Press, Newy York (1991); y Carrillo et al., SIAM J. Applied Math. , 48:1073 (1988). Ciertos métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar la correspondencia más grande entre las secuencias probadas . Los métodos para determinar la identidad se describen en programas de computadora públicamente disponibles . Ciertos métodos de programas de computadora para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, el paquete del programa GCG, que incluye GAP (Devereux et al., Nucí. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, Üniversity of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. , 215:403-410 (1990)). El programa BLASTX está públicamente disponible de Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI) and other sources (BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894, Altschul et al., supra (1990). También se puede usar, para determinar la identidad, el algoritmo bien conocido de Smith- aterman. Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar por resultado la correspondencia de solo una región corta de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener muy alta identidad de secuencia aunque no haya relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, en ciertas modalidades, el método seleccionado de alineación (programa GAP) dará por resultado una alineación que abarca al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido objetivo. Por ejemplo, usando el algoritmo de computadora GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) , se alinean dos polipéptidos para los cuales se va a determinar el por ciento de identidad de secuencia para la correspondencia óptima de sus respectivos aminoácidos (el "intervalo correspondido", como se determina por el algoritmo) . En ciertas modalidades, se usan una penalidad de abertura de separación (que se calcula como 3X la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se usa; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada correspondencia perfecta de aminoácido por la matriz particular de comparación) y una penalidad de extensión de separación (que es usualmente 1/10 veces la penalidad de abertura de separación) , así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 en unión con el algoritmo. En ciertas modalidades, también se usa por el algoritmo una matriz normal de comparación (ver Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3) (1978) para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 89:10915-10919 (1992) para la matriz de comparación BLOSUM 62) . En ciertas modalidades, los parámetros para una comparación de secuencias de polipéptido incluyen lo siguiente .· Algoritmo: Needleman et al., J". Mal. Biol. , 48:443-453 (1970) ; Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al . , supra (1992) ; Penalidad de Separación: 12 Penalidad de Longitud de Separación: 4 Umbral de Similitud: 0 El programa GAP puede ser útil con los parámetros anteriores. En ciertas modalidades, los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por omisión para las comparaciones de polipéptidos (junto con ninguna penalidad para las separaciones terminales) usando el algoritmo de GAP.

Como se usa en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaciones siguen el uso convencional. Ver Immunology-A Synthesis (2nd Edition, ?. S. Golub and D. R. Gren, Eds . , Sinauer Associates, Sunderland, Mass (1991) ) , que se incorpora en la presente como referencia para cualquier propósito. Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tal como aminoácidos a-, a-disustituidos , aminoácidos de N-alquilo, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?,?,?-trimetilsilina, e-?-acetillisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-?-metilarginina, y otros aminoácidos similares e imino-ácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la anotación de los polipéptidos usada en la presente, la dirección izquierda es la dirección amino-terminal y la dirección derecha es la dirección carboxi-terminal, de acuerdo con la convención y uso normal. De manera similar, a menos que se especifique de otro modo, el extremo izquierdo de las secuencias de polinucleótido de hebra individual es el extremo 5 ' ; la dirección de izquierda de las secuencias de polinucleótido de doble hebra se refiere como la dirección 5' . La dirección de la adición de 5 ' a 3 ' de los transcriptos de ARN nacientes se refiere como la dirección de trascripción; las regiones de la secuencia en la hebra de ADN que tiene la misma secuencia como el ARN y que están 5' al extremo 5' del trascripto de ARN se refieren como "secuencias en la dirección 5'"; las regiones de la secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia como el ARN y que están 3' al extremo 3' del trascripto de ARN se refieren como "secuencias en la dirección 3'". El término "modulador" como se usa en la presente, es un compuesto que cambia o altera la actividad o función de una molécula. Por ejemplo, un modulador puede provocar un incremento de disminución en la magnitud de una cierta actividad o función de una molécula en comparación a la magnitud de la actividad o función observada en la ausencia del modulador. En ciertas modalidades, un modulador es un inhibidor, que disminuye la magnitud de al menos una actividad o función de una molécula. Ciertas actividades y funciones de ejemplo de una molécula incluyen de manera enunciativa y sin limitación, afinidad de unión, actividad enzimática, y transducción de señal. Ciertos inhibidores de ejemplo incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos, carbohidratos o moléculas orgánicas pequeñas. Los pepticuerpos se describen, por ejemplo, en la WO 01/83525. Cualquier número de moléculas puede servir como los compañeros de unión específica dentro de la presente invención. Las moléculas de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, anticuerpos, péptidos y moléculas de fusión de Fc-péptido. "Anticuerpo" o "péptido(s) de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión del mismo que compite con el anticuerpo intacto para la unión específica. En ciertas modalidades, los fragmentos de unión se producen por técnicas de ADN recombinante. En ciertas modalidades, se producen fragmentos de unión por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, Fab, Fab' , F(ab')2, Fv y anticuerpos de cadena individual. En ciertas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo o dominio de unión al antígeno del mismo, o un fragmento, variante o derivado del mismo, que se une a un epítope en cualquiera de las moléculas objetivo y tiene actividad antagonista parcial o completa. En ciertas modalidades, la molécula objetivo es de mamífero, tal como de humano, y puede estar en forma solubles o asociadas a la superficie celular, o fragmentos, derivados y variantes de la misma. En la técnica se conocen varios métodos para la generación de anticuerpos . Estos métodos son útiles en la ...generación de moléculas útiles de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención. En ciertas modalidades, se puede preparar un anticuerpo al inmunizar un animal con la molécula objetivo (por ejemplo, BCMA o TACI murino o humano) o con un fragmento inmunogénico, derivado o variante del mismo. En ciertas modalidades, se puede inmunizar un animal con células transíectadas con un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica para la molécula objetivo tal que la molécula objetivo se exprese y asocie con la superficie de las células transíectadas . En ciertas modalidades, los compañeros de unión específica que son anticuerpos se pueden obtener al detectar una biblioteca que comprende secuencias de anticuerpo o de dominio de unión al antígeno para la unión a la molécula objetivo. En ciertas modalidades, se puede preparar una biblioteca en bacteriófago como fusiones de proteína o péptido a una protelna de revestimiento de bacteriófago que se expresen en la superficie de las partículas montadas de fago y las secuencias de ADN de codificación contenidas dentro de las partículas de fago (llamada "biblioteca de exhibición de fago"). En ciertas modalidades, una biblioteca de exhibición de fago contiene secuencias de ADN que codifican para anticuerpos humanos, tal como cadenas ligeras y pesadas, variables. En ciertas modalidades, se pueden desarrollar adicionalmente secuencias que se unen a la molécula objetivo por rondas múltiples de mutagénesis y detección. En ciertas modalidades, los compañeros de unión específica que son anticuerpos o dominios de unión al antígeno pueden ser glicoprotelnas tetraméricas similares a los anticuerpos nativos, o pueden ser anticuerpos de cadena individual; por ejemplo fragmentos de Fv, Fab, Fab' o F(ab)', anticuerpos biespecífieos, heteroanticuerpos, u otros fragmentos, variantes o derivados de los mismos, que son capaces de la unión a la molécula objetivo y que neutralizan de forma parcial o completa la actividad de la molécula objetivo. En ciertas modalidades, los anticuerpos o dominios de unión al antígeno se pueden producir en líneas de células de hibridoma (células que producen, anticuerpos tal como células de bazo fusionadas a células de mieloma de ratón, a manera de ejemplo) o se pueden producir en líneas de células heterólogas transfectadas con moléculas de ácido nucleico que codifican para el anticuerpo o dominio de unión al antígeno. Los anticuerpos de ejemplo incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, anticuerpos policlonales, policlonales monoespecíficos, monoclonales, recombinantes , quiméricos, humanizados, completamente humanos, de cadena individual y/o biespecíficos . En ciertas modalidades, los fragmentos de anticuerpo incluyen aquellas porciones de un anticuerpo que se unen a un epítope en una molécula objetivo.

Los ejemplos de estos fragmentos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación los fragmentos Fab F(ab')/ F(ab)', Fv, y sFv. En ciertas modalidades, se puede generar anticuerpos por escisión enzimática de anticuerpos de longitud completa o por técnicas de ADN recombinantes, tal como expresión de plásmidos recombinantes que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican para las regiones variables del anticuerpo. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antigeno. En ciertas modalidades, un antígeno es una molécula o una porción de una molécula capaz de ser unida por un anticuerpo que adicionalmente es capaz de inducir a un animal para producir el anticuerpo capaz de la unión a un epítope de ese antígeno. Un antigeno puede tener uno o más epítopes . Una reacción que comprende un antígeno significa que un antígeno reaccionará, de manera selectiva, con su anticuerpo correspondiente y no con una multitud de otros anticuerpos que se pueden provocar por otros antígenos . En ciertas modalidades, los anticuerpos policlonales dirigidos hacia una molécula objetivo se formulan en general en animales (por ejemplo, conejos o ratones) por múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales de la molécula objetivo y un adyuvante. En ciertas modalidades, la molécula objetivo, o una variante, fragmento o derivado del mismo se conjuga a una molécula portadora que es inmunogénica en las especies que se van a inmunizar, tal como en ciertas modalidades, hemocianina de lapa, suero, albúmina, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soya. En ciertas modalidades, se pueden usar agentes de agregación tal como alum para mejorar la respuesta inmunitaria. En ciertas modalidades, después de la inmunización, los animales se pueden sangrar y el suero se analiza para el título de anticuerpo anti-objetivo. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) contienen una población sustancialmente homogénea de anticuerpos que contienen sitios sustancialmente similares de unión al epítope. Estos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación IgG, IgM, IgE, igA, IgD y cualquier sub-clase de las mismas. En ciertas modalidades, se puede cultivar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de la presente invención in vitro, in situ o in vivo. En ciertas modalidades, se producen altos títulos in vivo o in situ. Los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia la molécula obj etivo se producen típicamente usando cualquier método que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Los métodos de ejemplo para preparar anticuerpos monoclonales incluyen de manera enunciativa y sin limitación, los métodos de hibridoma de Kohler et al., Nature 256, 495-497 (1975), y el método de hibridoma humano de células B, Kozbor, J". Imm nol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., onoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Harlow y Lañe, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ; los contenidos de la cual se incorporan en la presente como referencia en su totalidad para cualquier propósito. En ciertas modalidades, los compañeros de unión específica incluyen anticuerpos monoclonales que inhibirán de forma parcial o completa la unión de la molécula objetivo humana a su ligando o receptor similar o un anticuerpo que tiene sustancialmente las mismas características de unión especifica, así como fragmentos y regiones de la misma. Se pueden encontrar ciertos métodos para determinar la especificidad del anticuerpo monoclonal y la afinidad por inhibición competitiva, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Col. Spring Harbor, N.Y. , 1988), Colligan et al., eds., Current Protocols in immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y. , (1992, 1993), y Muller, Meth, Enzymol., 92:589-601 (1983). Cada una de estas referencias se incorpora en la presente como referencia en su totalidad para cualquier propósito. En ciertas modalidades, las lineas de células de hibridoma producen anticuerpos monoclonales reactivos con polipéptidos objetivo. Los anticuerpos quiméricos son moléculas en las cuales se derivan diferentes porciones de diferentes especies animales, tal como aquellas que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. En ciertas modalidades, se pueden usar anticuerpos quiméricos para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y para incrementar los rendimientos en la producción. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales murinos tienen mayores rendimientos de hibridomas pero mayor inmunogenicidad en humanos, tal que se pueden usar anticuerpos monoclonales quiméricos humanos/murinos . Se conocen en la técnica ciertos anticuerpos quiméricos y ciertos métodos para su producción. Ver, por ejemplo, Cabilly et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., tature, 312:643-646 (1984); Neuberger et al., Nature, 314:268-270 (1985); Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84:3439-3443 (1987); and Harlow and Lañe Antibodies : A Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory (1988) . Esta referencia se incorpora en la presente como referencia en su totalidad para cualquier propósito. En ciertas modalidades, se puede usar un anticuerpo monoclonal quimérico como un agente terapéutico. En ciertas modalidades, una porción de la cadena pesada y/o ligera puede ser idéntica con, u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que corresponde a una clase o subclase de anticuerpo particular, en tanto que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico con, u homologo a, la secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados de otras especies, o que corresponden a otra clase u sub-clase de anticuerpo, asi como los fragmentos de estos anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci . , 81, 6851-6855 (1985) . Como se usa en la presente, el término "anticuerpo quimérico" incluye inmunoglobulinas monovalentes, divalentes o polivalentes . Un anticuerpo quimérico monovalente es un dxmero (HL) formado por una cadena H quimérica asociada a través de puentes de disulfuro con una cadena L quimérica. Un anticuerpo quimérico divalente es un tetrámero (H2L2) formado por dos dímeros HL asociados a través de al menos un puente de disulfuro. En ciertas modalidades, se puede producir, por ejemplo, un anticuerpo quimérico polivalente, al emplear una región CH que se agrega (por ejemplo, de una ^cadena H de IgM o una cadena µ) . En ciertas modalidades, los anticuerpos murinos y quiméricos, .fragmentos y regiones pueden comprender cadenas individuales, pesadas (H) y/o ligeras (L) de inmunoglobulina. En ciertas modalidades, una cadena H quimérica comprende una región de unión al antígeno derivada de la cadena H de un anticuerpos no humano específico para la molécula objetivo, que está enlazada a al menos una porción de una región C de la cadena H humana (CH) , tal como C¾ o C¾. En ciertas modalidades, una cadena L quimérica comprende una región de unión al antígeno derivada de la cadena L de un anticuerpo no humano específico para la molécula objetivo, enlazada a al menos una porción de una región C (CL) de cadena L humana. En ciertas modalidades, los compañeros de unión específica, tal como anticuerpos, fragmentos, o derivados, que tienen cadenas H quiméricas y cadenas L quiméricas de la misma o diferente especificidad de unión de región variable, también se pueden preparar por asociación apropiada de las cadenas polipeptídicas individuales, de acuerdo a los pasos del método, conocidos, por ejemplo, de acuerdo a Ausubel et al., eds . Current Protocols in Molecular Biology, iley Interscience, N.Y. (1933), and Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988) . Los contenidos de esta referencia se incorporan en la presente como referencia en su totalidad para cualquier propósito. En ciertas modalidades, los hospedadores que expresan cadenas H quiméricas (o sus derivados) se cultivan de manera separada a partir de hospedadores que expresan cadenas L quiméricas (o sus derivados) , y las cadenas de inmunoglobulina se recuperan de forma separada y entonces se asocian. En ciertas modalidades, los hospedadores se pueden co-cultivar y las cadenas se dejan asociar de forma espontánea en el medio de cultivo, seguido por recuperación de la inmunoglobulina montada, fragmento o derivado. En ciertas modalidades, la región de unión al antígeno del compañero de unión especifica (tal como un anticuerpo quimérico) de la presente invención se puede derivar de un anticuerpo no humano específico para el análogo humano de la molécula objetivo. En ciertas modalidades, las fuentes para el ADN que codifica para un anticuerpo no humano incluyen líneas celulares que producen anticuerpos, tal como líneas celulares híbridas conocidas comúnmente como hibridomas . En ciertas modalidades, ' la invención también proporciona fragmentos, variantes y derivados, y fusiones de anticuerpos anti-objetivo, en donde los términos "fragmentos", "variantes", "derivados" y "fusiones" se definen en la presente. En ciertas modalidades, la invención abarca fragmentos, variantes, derivados y fusiones de anticuerpos anti-objetivo que son funcionalmente similares al anticuerpo no modificado, es decir, que retienen al menos una de las actividades del anticuerpo no modificado. En ciertas modalidades, las modificaciones incluyen la adición de secuencias genéticas que codifican para las proteínas citotóxicas tal como toxinas vegetales y bacterianas . En ciertas modalidades, los fragmentos, variantes, derivados y fusiones de los anticuerpos se pueden producir de cualquier hospedador. El término "fragmento" se refiere a un péptido polipéptido que comprende menos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de una protelna. Este fragmento puede surgir, por ejemplo, de un truncamiento en el término amino, un truncamiento en el término carboxi, y/o una supresión interna de un (os) residuo (s) de la secuencia de aminoácidos . Los fragmentos pueden resultar del empalme de ARN alternativo o de una actividad in vivo de proteasa. El término "variante" se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una o más sustituciones , supresiones y/o adiciones de la secuencia de aminoácidos en comparación a una secuencia nativa o no modificada. Las variantes pueden ser variantes que se presentan de forma natural, tal como variantes alélicas o de empalme, o pueden ser construidas de forma artificial. Las variantes polipeptidicas se pueden preparar a partir de las moléculas correspondientes de ácido nucleico que codifican para estas variantes . El término "derivado" se refiere a un polipéptido o péptido, o una variante o fragmento del mismo, que se ha modificado de forma química. Los ejemplos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, unión covalente de uno o más polímeros, tal como polímeros solubles en agua, carbohidratos N-enlazados u O-enlazados, azúcares, fosfatos, y/o otras moléculas por el estilo. En ciertas modalidades, se modifican los derivados de una manera que es diferente del péptido o polipéptidos que se presentan de forma natural o de inicio, ya sea en el tipo o ubicación de las moléculas unidas. Los derivados de ejemplo incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, supresión de uno o más grupos químicos que se presentan de forma natural en el péptido. o polipéptido. El término "fusión" se refiere a la unión de un péptido o polipéptido, o fragmento, variante y/o derivado del mismo, con un péptido o polipéptido heterólogo. Los fragmentos adecuados incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, por ejemplo Fab, Fab' , F(ab')2/ Fv y scFv. Estos fragmentos carecen del fragmento Fe de un anticuerpo intacto, se depuran más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos unión no especifica al tej ido que un anticuerpo intacto . Ver Wahl et al . , J. Nucí . Med. , 24:316-325 (1983). En ciertas modalidades, los fragmentos se producen de anticuerpos intactos usando métodos bien conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, se producen fragmentos de anticuerpos intactos por escisión proteolitica con enzimas tal como papaína (para producir fragmentos de Fab) o pepsina (para producir fragmentos de F(ab')2). La identificación de estas regiones de unión al antígeno y/o epítopes reconocidos por anticuerpos monoclonales de la presente invención en ciertos casos proporcionan información necesaria para generar anticuerpos monoclonales adicionales con características similares de unión y utilidad terapéutica o de diagnostico que es paralelo con ciertas modalidades de esta invención. En ciertas modalidades, también se proporcionan variantes de compañeros de unión específica. En ciertas modalidades, las variantes de anticuerpos y dominios de unión al antígeno comprenden cambios en las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y/o pesada que se presentan de forma natural o se introducen por manejo in vitro de las secuencias nativas usando técnicas de ADN recombinante . En ciertas modalidades, las variantes que se presentan de forma natural incluyen variantes "somáticas" que se generan in vivo en las secuencias de nucleótidos en la línea germen correspondiente durante la generación de una respuesta de anticuerpos a un antígeno extraño. En ciertas modalidades, se pueden preparar variantes de anticuerpos y dominios de unión al antígeno por técnicas de mutagénesis conocidas. En ciertas modalidades, se pueden introducir cambios de aminoácidos al azar de principio a fin de una región de codificación de anticuerpo y las variantes resultantes se pueden detectar para una actividad deseada, tal como afinidad de unión para la molécula objetivo. En ciertas modalidades, se pueden introducir cambios de aminoácidos en las regiones seleccionadas de un anticuerpo, tal como en las CDR de cadena ligera y/o pesada, y regiones de estructura alterna, y los anticuerpos resultantes se pueden detectar para la unión a la molécula objetivo o alguna otra actividad. Los cambios de aminoácidos abarcan una o más instituciones de aminoácidos en una CDR, que varía de una diferencia de aminoácido individual a la introducción de todas las posibles permutaciones de aminoácidos dentro de una CDR dada, tal como CDR3. En ciertas modalidades, la contribución de cada residuo dentro de un CDR a la unión objetivo se puede valorar al sustituir al menos un residuo dentro de la CDR con alanina (Lewis et al. (1995), Mol. Immunol . 32: 1065-72). En ciertas modalidades, los residuos que no son óptimos para la unión a la molécula objetivo entonces se pueden cambiar a fin de determinar vina secuencia más óptima. En ciertas modalidades, .se pueden generar variantes por inserción de aminoácidos para incrementar el tamaño de una CDR, tal como CDR3. Por ejemplo, la mayoría de las secuencias de CDR3 de cadena ligera son de nueve aminoácidos de longitud. En ciertas modalidades, las secuencias de CDR3 de cadena ligera en un anticuerpo que son más cortas que los nueve residuos se pueden optimizar para la unión a la molécula objetivo por inserción de aminoácidos apropiados para incrementar la longitud de la CDR. En ciertas modalidades, las variantes de anticuerpo o del dominio de unión al antigeno comprenden uno o más cambios de aminoácidos en uno o más de CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena pesada o ligera y opcionalmente una o más de las regiones FR1, FR2 o FR3 de estructura alterna de cadena pesada o ligera. En ciertas modalidades, los cambios de aminoácidos comprenden sustituciones, supresiones y/o inserciones de residuos de aminoácido. En ciertas modalidades, se pueden preparar variantes por "redistribución de cadena" de ya sea cadenas ligeras o pesadas. Marks et al. (1992), Biotechnology 10: 779-83. En ciertas modalidades, se combina una cadena ligera (o pesada) individual con una biblioteca que tiene un repertorio de cadenas pesadas (o ligeras) y la población resultante se selecciona para una actividad deseada, tal como la unión a la molécula objetivo. Esta técnica puede permitir la detección de una muestra más grande de diferentes cadenas pesadas (o ligeras) en combinación con una cadena ligera (o pesada) individual que es posible con bibliotecas que comprenden repertorios tanto de cadenas pesadas como ligeras. En ciertas modalidades, los compañeros de unión específica de la invención pueden ser bi-específicos . Los compañeros bi-especificos de unión específica pueden ser de varias configuraciones. En ciertas modalidades, los anticuerpos bi-específicos se asemejan a anticuerpos individuales (o fragmentos de anticuerpo) pero tienen dos diferentes sitios de unión al antígeno (regiones variables) . En ciertas modalidades, se pueden producir anticuerpos bi-específicos por técnicas químicas (ver, por ejemplo Kranz et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 78:5807 (1981)), por técnicas de "polidoma" (ver Patente de los Estados Unidos No. 4,474,893 de Reading) o por técnicas de ADN recombinante . En ciertas modalidades, los compañeros de unión específica de la invención también pueden ser eteroanticuerpos . Los heteroanticuerpos son dos o más anticuerpos, o fragmentos de unión a anticuerpo (Fab) enlazados conjuntamente, cada anticuerpo o fragmento que tiene una diferente especificidad. En ciertas modalidades, se proporcionan anticuerpos "humanizados". En la técnica son bien conocidos los métodos para humanizar anticuerpos no humanos. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en un anticuerpo humano a partir de una fuente que no es humana. En general, los residuos no humanos estarán presentes en las CDR. En ciertas modalidades, se puede realizar la humanización siguiendo métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo Jones et al., .Wature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)), al sustituir regiones determinantes de complementariedad (CDR) de roedor para las regiones correspondientes de un anticuerpo humano . La capacidad para clonar y reconstruir sitios humanos de tamaño de megabase en cromosomas artificiales de levadura (YAC) y para introducirlos en la línea germinal de ratón proporciona un planteamiento para poner en claro los componentes funcionales de sitios muy grandes o correlacionados escabrosamente así como para generar -modelos útiles de la enfermedad humana. Adicionalmente, la utilización de esta tecnología para substitución de sitios de ratón con sus equivalentes humanos proporcionará comprensión única de la expresión de regulación de productos génicos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas, y su implicación en la inducción y progreso de la enfermedad.

Una aplicación práctica e importante de esta estrategia es la "humanización" del sistema inmunitario humoral de ratón. La introducción de sitios de inmunoglobulina (Ig) humana en ratones en los cuales se han inactivado los genes endógenos de Ig ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos que fundamentan la expresión programada y montaje de anticuerpos así como su papel en el desarrollo de células B. Administración, esta estrategia puede proporcionar una fuente para la producción de anticuerpos monoclonales ( Abs) completamente humanos. En ciertas modalidades, los anticuerpos completamente humanos se espera que reduzcan al mínimo las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a los MAbs de ratón o derivatizados de ratón, y de esta manera, en ciertas modalidades, incrementan la eficiencia y seguridad de los anticuerpos administrados. En ciertas modalidades, se pueden usar anticuerpos completamente humanos en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tal como osteoporosis, inflamación, autoinmunidad, y cáncer, que pueden comprender administraciones repetidas de anticuerpos . Se pueden manejar variedades de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con fragmentos grandes de los sitios de Ig humana en anticipación que estos ratones producirán anticuerpos humanos en la ausencia de anticuerpos de ratón. Los fragmentos grandes de Ig humana pueden conservar la gran diversidad génica variable así como la regulación apropiada de la producción y expresión de anticuerpos . Al explotar la maquinaria del ratón para la diversificación y selección de anticuerpos y la carencia de tolerancia inmunológica a proteínas humanas, el repertorio reproducido de anticuerpos humanos en estas variedades de ratón puede reproducir anticuerpos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluyendo antígenos humanos. Usando la tecnología de hibridoma, los MAbs específicos del antígeno con la especificidad deseada se pueden producir y seleccionar. En ciertas modalidades, los compañeros de unión específica incluyendo anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados, se pueden producir por métodos recombinantes conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, se introducen ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos en células hospedadoras y se expresan usando materiales y procedimientos descritos en la presente y conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, los anticuerpos se producen en células hospedadoras de mamífero, tal como células CHO. En ciertas modalidades, se pueden producir anticuerpos completamente humanos por expresión de ADN recombinante transfectado en células hospedadoras o por expresión en células de hibridoma como se describe anteriormente .

En ciertas modalidades, se proporcionan técnicas para crear versiones de ADN recombinante de las regiones de unión al antígeno de las moléculas de anticuerpo que derivan la generación de anticuerpos monoclonales . En ciertas modalidades, las moléculas de ARN mensajero específicas del anticuerpo se extraen de las células de sistema inmunitario tomadas de un animal inmunizado, y se transcriben en el ADN complementario (ADNc) . En ciertas modalidades, el ADNc entonces se clona en un sistema de expresión bacteriano. En ciertas modalidades, se puede usar un sistema de vector lambda de bacteriófago que tiene una secuencia guía que provoca que la proteína Fab expresada mide al espacio periplasmático (entre la membrana de la célula bacteriana y la pared celular) o se segregue. En ciertas modalidades, se pueden generar y detectar rápidamente grandes números de fragmentos Fab funcionales para aquellos que se unen al antígeno. Estos compañeros de unión específica a la molécula objetivo (fragmentos Fab con especificidad para la molécula objetivo) se abarcan de forma específica dentro del término "anticuerpo" como se define, en la lista y reivindica en la presente . En ciertas modalidades, se pueden producir anticuerpos quiméricos al empalmar los genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad de antígeno apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada, tal como la capacidad para activar el complemento humano y mediar la DACC. (Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci . , 81:6851 (1984); Neuberger et al., Nature, 312:604 (1984)). En ciertas modalidades, se puede reemplazar una región Fe con aquella de un diferente isotipo. Los compañeros de unión específica, tal como los anticuerpos producidos por esta técnica, están dentro del alcance de ciertas modalidades de la invención. En ciertas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos completamente humanos. En ciertas modalidades, los anticuerpos que se unen a las moléculas objetivo se codifican por secuencias de ácido nucleico que son variantes somáticas que se presentan de forma natural de la secuencia de ácido nucleico de inmunoglobulina humana de línea germinal, y los fragmentos, variantes sintéticas, derivados y fusiones de la misma. Estos anticuerpos se pueden producir por cualquier método conocido en la técnica. En ciertas modalidades, se pueden producir anticuerpos por inmunización con un antígeno objetivo (cualquier polipéptido objetivo capaz de producir una respuesta inmunitaria, y opcionalmente conjugado a un portador) de animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en la ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. Ver, por ejemplo Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 90, 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362, 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol. , 7, 33 (1993) . En ciertas modalidades, se pueden generar anticuerpos humanos a través de la detección in vitro de bibliotecas de anticuerpo de exhibición de fago. Ver Hoogenboom et al., <J. Mol. Biol., 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222, 581 (1991), incorporada en la presente como referencia. Se han descrito varias bibliotecas de exhibición de fago que contienen anticuerpos y se pueden preparar fácilmente por aquellos expertos en la técnica. En ciertas modalidades, las bibliotecas pueden contener una diversidad de secuencias de anticuerpos humanos, tal como los fragmentos Fab, Fv y scFv humanos, que se pueden detectar contra un objetivo apropiado. En ciertas modalidades, las bibliotecas de despliegue en fagos pueden comprender péptidos o proteínas diferentes de loa anticuerpos que se pueden detectar para identificar compañeros de unión específica de la molécula objetivo. Un anticuerpo anti-idiotípico (anti-ld) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos asociados en general con el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id se puede preparar al inmunizar un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, variedad de ratón) con la fuente del anticuerpo monoclonal con el anticuerpo monoclonal al cual se está preparando un anti-ld.

El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante al producir un anticuerpo a estos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-Id) . Ver, . por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,699,880, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad para cualquier propósito. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-Id también se puede usar como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmunitaria en aún otro animal, produciendo un llamado anticuerpo anti-anti-Id. En ciertas modalidades, el anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al anticuerpo monoclonal original que indujo el anti-Id. De esta manera, en ciertas modalidades, al usar anticuerpos a los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de idéntica especificidad. Las unidades estructurales de los anticuerpos que se presentan de forma natural comprenden típicamente un tetrámero. Cada tetr mero está compuesto típicamente de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada parte tiene una cadena "ligera" de longitud completa (en ciertas modalidades, de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" de longitud completa (en ciertas modalidades, de aproximadamente 50-70 kDa) . La porción amino-terminal de cada cadena incluye típicamente una región variable- de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos que son responsables típicamente del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define típicamente una región constante que puede ser responsable para la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican típicamente como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican típicamente como mu, delta, gamma, alfa, o epsilón, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tiene varias subclases, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación IgGl , IgG2 , IgG3 e IgG4. La IgM tiene subclases que incluyen de manera enunciativa y sin limitación IgMl e IgM2. La IgA se subdivide de manera similar en subclases incluyendo de manera enunciativa y sin limitación IgAl e IgA2. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, típicamente, las regiones variables y constantes se unen por una región KJ" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que incluye también una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Ver,- por ejemplo, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W. , ed. , 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporado como referencia en su totalidad para todos los propósitos) . Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman típicamente el sitio de unión al antígeno. Las regiones variables exhiben típicamente la misma estructura general de las regiones de estructura alterna (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables , también llamadas regiones de determinación de complementariedad, o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean típicamente por las regiones de estructura alterna, que pueden permitir la unión a un epítope específico. De N-terminal a C-terminal, tanto las regiones variables de cadena ligera como pesada comprenden típicamente los dominios FR1, CDR1, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 y FR . La asignación de aminoácidos a cada dominio es típicamente de acuerdo con las definiciones de abat Sequences of Proteins of Immunological Interest (Nacional Institutes of Health, bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989) . El término "cadena pesada" incluye cualquier polipéptido que tiene suficiente secuencia de región variable para conferir especificidad para un antígeno. El término "cadena ligera" incluye cualquier polipéptido que tiene suficiente secuencia de región variable para conferir especificidad para un antígeno. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable VH, y tres dominios de región constante, CHi, <¾ y CH3. El dominio VH está en el amino-término del polipéptido, y el dominio CH3 está en el carboxi-término . El término "cadena pesada", como se usa en la presente, abarca una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de la misma. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de región variable, VL, y un dominio de región constante, CL. Igual que la cadena pesada, el dominio de región variable de la cadena ligera está en el amino-término del polipéptido. El término "cadena ligera", como se usa en la presente, abarca una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de la misma. Un fragmento Fab está comprendido de una cadena ligera y CHi de regiones variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula de Fab no puede formar un enlace de disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un fragmento Fab' contiene una cadena ligera y una cadena pesada que contiene más de la región constante, entre los dominios CH1 y CH2, tal que un enlace de disulfuro inter-cadena se puede formar entre dos cadenas pesadas para formar una molécula F(ab')2. La región Fv comprende las regiones variables tanto de las cadenas pesadas como ligeras, pero carece de las regiones constantes. Los anticuerpos de cadena individual son moléculas de Fv en las cuales las regiones variables de las cadenas pesada y ligera se han conectado por un ligador flexible para formar una cadena individual de polipéptido que forma una región de unión al antxgeno. Los anticuerpos de cadena individual se analizan en detalle en la O 88/01649 y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,946,778 y 5,260,203.

Un anticuerpo bivalente diferente de un anticuerpo "multiespecífico" o "multifuncional" , en ciertas modalidades, se entiende típicamente que tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos . Un anticuerpo inhibe de forma sustancial la adhesión de un ligando a un receptor cuando un exceso del anticuerpo reduce la cantidad de receptor unido al contrareceptor por al menos aproximadamente 20%, 40%, 50%, 80%, 85% o más (como se mide en un ensayo de unión competitiva in vitro) . El término "epítope" incluye cualquier determinante de polipéptido capaz de la unión especifica a una inmunoglobulina o receptor de células T. En ciertas modalidades, los determinantes de epítope incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tal como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo, y sulfonilo, y en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales, tridimensionales, específicas, y/o características de cargas específicas . Un epítope es una región de un antígeno que está unida por un anticuerpo. En ciertas modalidades, un anticuerpo se dice que se une de manera específica a un antígeno cuando reconoce de manera preferencial su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas . En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une de manera específica a un antígeno cuando la constante de disociación es = 1 µ?, en ciertas modalidades, cuando la constante de disociación es menor = 100 nM, y en ciertas modalidades, cuando la constante de disociación es = 10 nM. La solicitud de patente WO 00/24782, publicada el 4 de mayo del 2000, describe en detalle varias técnicas de generación de péptidos . Esa solicitud de patente describe adicionalmente varios derivados y moléculas de fusión. En ciertas modalidades, un péptido usado como un compañero de unión específica puede estar comprendido dentro de una molécula de la fórmula en donde: F1 es un vehículo; X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente a partir de -(L^c-P1, - (L1) c-P1- (L2) C-P2, - (L1) c-P1- (L2) d-P2- (L3) e-P3, -(L1)c-P1-(L2)c-P2-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4 P1, P2, P3 y P4 son cada uno independientemente secuencias peptídicas, en donde al menos una es un compañero de unión específica; L1, L2, L3 y L4 son cada uno independientemente ligadores; y a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 o 1, con la condición que al menos uno de a y b es 1. En ciertas modalidades, una molécula comprende una estructura de la fórmula X2-Fa F1-X2 En ciertas modalidades, una molécula comprende una estructura de. la fórmula F1 -(L^e-P1 ó una estructura de la fórmula F1- (L^c-P1- (L2)d-P2 en donde P1 y/o P2 es un compañero de unión específica para una molécula objetivo. En ciertas modalidades, el vehículo es un dominio Fe. En ciertas modalidades, el dominio Fe puede ser Fe de IgG. En ciertas modalidades, el dominio Fe de IgG puede ser IgGl. Ciertos dominios Fe, ligadores, y procesos de preparación de las moléculas anteriores se describen, por ejemplo en la WO 00/24782, publicada el 4 de mayo del 2000. Otra clase de compañeros de unión específica son fragmentos solubles de receptor. Ciertos fragmentos solubles de receptor se identifican en las figuras: a. el receptor de IL-1 (SEQ. ID. No.: 7) b. TNFRI (SEQ. ID. No.: 8). C . TNFRII (SEQ. ID. No . : 9) d. CD40 (SEQ. ID. No.: 10). 4 e . CD30 (SEQ. ID. No. : 11) . f . ICOS (SEQ. ID. No. : 12) . g- CD28 (SEQ. ID. No. : 13) . h. OX40 (SEQ. ID. No. : 14) . i . 4-1-BB (SEQ. ID. No. : 15) j · CD27 (SEQ. ID. No. : 16) . k. el receptor de IL-18 (SEQ. ID. No. : 17) 1. PD-1 (SEQ. ID. NO. : 18) . Similar a los péptidos mencionados anteriormente, en ciertas modalidades, estos compañeros de unión específica se pueden estar enlazados covalentemente a un vehículo. En ciertas modalidades, estos compañeros de unión específica pueden estar enlazados covalentemente a un dominio Fe. En ciertas modalidades, las secuencias peptídicas y polipeptídicas pueden ser de modificaciones conservadoras y/o no conservadoras de las secuencias de aminoácidos de ciertas moléculas nativas . En ciertas modalidades, las modificaciones conservadoras pueden producir moléculas que tienen características funcionales y químicas similares a aquellas de la molécula de la cual se hacen estas modificaciones. En contraste, en ciertas modalidades, las modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de las moléculas se pueden lograr al seleccionar sustituciones en la secuencia de aminoácidos que difieren de 5 manera significativa en su efecto al mantener (a) la estructura del conjunto molecular en el área de la substitución, por ejemplo, en una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el tamaño de la molécula. Por ejemplo, en ciertas modalidades, una "substitución conservadora de aminoácidos" puede comprender una substitución de un residuo nativo de aminoácido con un residuo no nativo tal que haya poco o ningún efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Adicionalmente, en ciertas modalidades, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede estar sustituido con alanina, como se ha descrito de forma previa para "mutagénesis de exploración de alanina" (ver, por ejemplo MacLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35:1-24, que analiza la mutagénesis de exploración de alanina. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden abarcar residuos de aminoácidos que no se presentan de forma natural, que se incorporan típicamente por síntesis peptídica química en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas volteadas o invertidas de porciones de aminoácido. Las sustituciones deseadas de aminoácidos (ya sea conservadoras o no conservadoras) se pueden determinar por aquellos expertos en la técnica en el momento en que se deseen estas sustituciones. Por ejemplo, en ciertas modalidades, se pueden usar sustituciones de aminoácidos para identificar residuos importantes de la secuencia de la molécula, o para incrementar o disminuir la afinidad de las moléculas descritas en la presente. Los residuos que se presentan de forma natural se pueden dividir en clases en base a las propiedades comunes de la cadena lateral: 1) hidrófobos: norleucina, et, Ala, Val, Leu, lie; 2) hidrófilos neutrales: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) ácidos: Asp, Glu; 4) básicos: His, Lys, Arg; 5) residuos que tienen influencia en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Por ejemplo, las sustituciones no conservadoras pueden comprender el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Estos residuos sustituidos se pueden introducir en regiones del anticuerpo humano que son homologas con anticuerpos de humanos, o en las regiones no homologas de la molécula. Al hacer estos cambios , de acuerdo a ciertas modalidades, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos . Cada aminoácido se ha asignado a un índice hidropático en base a sus características de hidrofobicidad y carga. Estos son: isoleucina (+ 4.5); valina (+ 4.2); leucina (+ 3.8); fenilalanina (+ 2.8); cisteina/cistina (+ 2.5); metionina (+ 1.9); alanina (+ 1.8); glicina (- 0.4); treonina (- 0.7); serina (- 0.8); triptofan (- 0.9); tirosina (- 1.3); prolina (- 1.6); histidina (- 3.2); glutamato (-3.5) ; glutamina ( - 3.5); aspartato (- 3.5); asparagina ( -3.5); lisina (- 3.9); y arginina (- 4.5). La importancia de índice hidropático de los aminoácidos al conferir la función biológica interactiva en una proteína se entiende en la técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Se conoce que ciertos aminoácidos pueden estar sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y aún retengan una actividad biológica similar. Al hacer cambios en base al índice hidropático, en ciertas modalidades, se incluye la substitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de + 2. En ciertas modalidades, aquellos que están dentro de ± 1 se incluyen, y en ciertas modalidades, se incluyen aquellos dentro del ± 0.5. También se entiende en la técnica que la substitución de aminoácidos similares se puede realizar de forma efectiva en base a la hidrofilicidad, particularmente donde la proteína o péptido biológicamente funcional creado de esta manera se propone para el uso en modalidades inmunológicas , como en el presente caso. En ciertas modalidades, la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, como se gobierna por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína. Se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a estos residuos de aminoácidos: arginina (+ 3.0), lisina (+ 3.0); aspartato (+ 3.0 ± 1); glutamato (+ 3.0 + 1); serina (+ 0.3); asparagina (+ 0.2); glutamina (+ 0.2); glicina (0); treonina (- 0.4); prolina (- 0.5 + 1); alanina (- 0.5); histidina (- 0.5); cisteína (- 1.0); metionina (-1.3); valina (- 1.5); leucina (- 1.8); isoleucina (- 1.8); tirosina (- 2.3); fenilalanina (- 2.5) y triptofano (- 3.4). Al hacer cambios en base a los valores similares de hidrofilicidad, en ciertas modalidades, se incluye la substitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2, en ciertas modalidades, se incluyen aquellos que están dentro de + 1 y en ciertas modalidades, se incluyen aquellos que están dentro de + 0.5. También se pueden identificar epítopes a partir de secuencias primarias de aminoácidos en base a la hidrofilicidad. Estas regiones también se refieren como "regiones de núcleo epitópico" . Las sustituciones de ejemplo de aminoácidos se exponen en la Tabla 1.

Tabla 1 Sustituciones de Aminoácidos Residuos Sustituciones Sustituciones de ejemplo originales preferidas Ala Val, Leu, lie Val Arg Lys, Gln, Asn Lys Asn Gln Gln Asp Glu Glu Cys Ser, Ala Ser Gln Asn Asn Glu Asp Asp Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gln, Lys, Arg Arg Norleucina, Leu, Val, lie Leu Met, Ala, Phe Leu Norleucina, lie, Val, Met, lie Ala, Phe Arg, ácido 1,4 Diamino- Lys Arg butírico, Gln, Asn Met Leu, Phe, lie Leu Phe Leu, Val, lie, Ala, Tyr Leu Pro Ala, Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr, Phe, Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Norleucina lie, Met, Leu, Val Leu Phe, Ala Un experto en la técnica será capaz de determinar las variantes adecuadas del polipéptido como se expone en la presente usando técnicas bien conocidas . En ciertas modalidades, un experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de la molécula que se pueden cambiar sin destruir la actividad al seleccionar como objetivo regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. En ciertas modalidades, se pueden identificar residuos y porciones de las moléculas que se conserven entre los polipéptidos similares. En ciertas modalidades, aún áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura se pueden someter a sustituciones conservadoras de aminoácidos sin destruir la actividad biológica o sin afectar de forma adversa la estructura del polipéptido. Adicionalmente, un experto en la técnica puede revisar los estudios de estructura-función que identifican residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. En vista de esta comparación, se puede predecir la importancia de los residuos de aminoácido en una proteína que corresponda a residuos de aminoácido que son importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para estos importantes residuos previstos de aminoácidos.

Un experto en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos con relación a esa estructura en polipéptidos similares. En vista de esta información, un experto en la técnica puede predecir la alineación de los residuos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. En ciertas modalidades, un experto en la técnica puede elegir no hacer cambios radicales a los residuos de aminoácido que se prevé que estén en la superficie de la proteína, puesto que estos residuos pueden estar comprendidos en importantes interacciones con otras moléculas. Además, un experto en la técnica puede generar variantes de prueba que contienen una substitución única de aminoácido en cada residuo deseado de aminoácido. Las variantes entonces se pueden detectar usando ensayo de actividad conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estas variantes se pueden usar para obtener información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio a un residuo particular de aminoácido da por resultado actividad destruida, indeseablemente reducida o inadecuada, se pueden evitar las variantes con este cambio. En otras palabras, en base a la información obtenida de estos experimentos de rutina, un experto en la técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos donde se deban evitar sustituciones adicionales ya sea solas o en combinación con otras mutaciones.

Se han dedicado varias publicaciones científicas a la predicción de la estructura secundaria. Ver Moult J. , Curr. Op. in Biotech. , 7(4):422-427 (1996), Chou et al, Biochemistry, 13 (2) : 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113 (2) : 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem. , 47:251-276 y Chou et al., Biophys. <T. , 26:367-384 (1979). Además, actualmente están disponibles programas de computadora para ayudar con la predicción de la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en el modelado por homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia de más de 30%, o similitud mayor de 40% frecuentemente tienen similares topologías estructurales. El reciente crecimiento de la base de datos estructural de proteínas (PBD) ha proporcionado predictibilidad mejorada de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de pliegues dentro de la estructura de un polipéptido o proteína. Ver Holm et al., Nucí. Acid. Res., 27 (1) : 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)) que hay un número limitado de pliegues en una proteína o polipéptido dado y que una vez que se han resuelto un número crítico de estructuras, llegará a ser dramáticamente más exacta la predicción estructural.

Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen "enhebrado" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1):15-19 (1996)), "análisis de perfil" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzy . , 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci . , 84(13) :4355-4358 (1987)), y "enlace evolutivo" (ver Holm, supra (1999), y Brenner, supra (1997)). En ciertas modalidades, las variantes de anticuerpo incluyen variantes de glicosilación, en donde el número y/o tipo de sitio de glicosilación se ha alterado en comparación a las secuencia de aminoácidos de polipéptido de origen. En ciertas modalidades, las variantes de proteína comprenden un mayor o un menor número de sitios de glicosilación N-enlazados que la proteína nativa. Un sitio de glicosilación N-enlazado se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo de aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La substitución de los residuos de aminoácido para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena.de carbohidrato N-enlazada. De manera alternativa, las sustituciones que eliminan estas secuencias removerán una cadena de carbohidrato N-enlazada existente. También se proporciona un rearreglo de las cadenas de carbohidrato N-enlazadas en donde se eliminan uno o más sitios de glicosilación N-enlazados (típicamente aquellos que son los que se presentan de forma natural) y se crean uno o más nuevos sitios N-enlazados. Las variantes preferidas adicionales de anticuerpo incluyen variantes de cisteína en donde se suprimen uno o más residuos de cisteína o se sustituyen por otro aminoácido (por ejemplo, serina) en comparación a la secuencia de aminoácidos de origen. Las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando los anticuerpos se deben re-plegar en una conformación biológicamente activa tal como después del aislamiento de los anticuerpos insolubles de inclusión. Las variantes de cisteína tienen en general menos residuos de cisteína que la proteína nativa, y tienen típicamente el número par para reducir al mínimo las interacciones que resultan de las cisteínas no apareadas . De acuerdo a ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácidos son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) reducen la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades físico-químicas o funcionales en estos polipéptidos . De acuerdo a ciertas modalidades, se pueden hacer sustituciones individuales o múltiples de aminoácidos (en ciertas modalidades, sustituciones conservadoras de aminoácidos) en la secuencia que se presenta de forma natural (en ciertas modalidades, en la porción del polipéptido fuera del (los) dominio (s) que forman contactos intermoleculares) . En ciertas modalidades, una substitución conservadora de aminoácido no puede cambiar típicamente de forma sustancial las características estructurales de la secuencia de origen (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a descomponer una hélice que se presente en la secuencia de origen, o a perturbar otros tipos de la estructura secundaria que caracterizan la secuencia de origen) . Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptido reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed. , W. H. Freeman and Company, New York (1984) Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds . , Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thomton et al. tature 354:105 (1991) , que se incorporan cada uno como referencia en la presente . El término "fragmento polipeptídico" como se usa en la presente se refiere a un polipéptido que tiene una supresión amino-terminal y/o carbo i-terminal . En ciertas modalidades, los fragmentos son de al menos 5 a 467 aminoácidos de largo. Se apreciará que en ciertas modalidades, los fragmentos son de al menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450 aminoácidos de largo . Los análogos peptídicos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a aquellos del péptido de plantilla. Estos tipos de compuestos no peptídicos se llaman "peptidomiméticos" o "imitadores de péptxdos". Fauchere, J". Adv. Or g Res., 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985); y Evans et al., J. ed. Chem. 30:1229 (1987), que se incorporan en la presente como referencia para cualquier propósito. Estos compuestos se desarrollan frecuentemente con la ayuda de modelado molecular computarizado . Los peptidomiméticos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles se pueden usar para producir un efecto terapéutico o profiláctico similar. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o que tienen uno o más enlaces peptídicos reemplazados opcionalmente por un enlace seleccionado de: ~-CH2 NH--, --CH2 S--, --C¾ -C¾--, -~CH=CH-(cis y trans) , --C0CH2--, --CH (OH) C¾-- , y --CH2 S0--, por métodos bien conocidos en la técnica. La substitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se puede usar en ciertas modalidades para generar péptidos más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia de consenso o una variación sustancialmente idéntica de la secuencia de consenso se puede generar por métodos conocidos en la técnica (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 5 (1992) , incorporada en la presente como referencia para cualquier propósito) ; por ejemplo, al adicionar residuos internos de cisteína capaces de formar puentes intramoleculares de disulfuro que ciclisan el péptido. Están disponibles varios métodos biológicos o 0 químicos para producir un compañero proteinaceo de unión específica . En ciertas modalidades, se usan métodos biológicos para producir suficientes cantidades de un compañero de unión específica. En ciertas modalidades, son útiles técnicas 5 normales de ADN recombinante para la producción de anticuerpos y dominios de unión al antígeno. Se describen posteriormente ciertos vectores de expresión, células hospedadoras y métodos para la recuperación de los productos expresados . (-) En ciertas modalidades, se inserta una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo o dominio de unión al antígeno en un vector de expresión apropiado usando técnicas normales de ligación. En ciertas modalidades, el vector se puede seleccionar para que sea funcional en la C. célula hospedadora particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula hospedadora tal que pueda presentarse la amplificación del gen y/o y expresión del gen) . En ciertas modalidades, se puede amplificar/expresar una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo en células procarióticas, de levadura, de insecto (sistemas de baculovirus) y/o células hospedadoras eucarióticas . En ciertas modalidades, la selección de la célula hospedadora tomará en cuenta, en parte, si un anticuerpo se va a modificar de forma pos-transduccional (por ejemplo, glicosilar y/o fosforilar) . En ciertas modalidades, se seleccionan células hospedadoras de levadura, insecto o mamífero para facilitar las modificaciones pos-transduccionales . Para una revisión de los vectores de expresión, ver por ejemplo Meth. Enz . v. 185, (D. V. Goeddel, ed.), Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). En ciertas modalidades, los vectores de expresión usados en cualquier célula hospedadora contendrán uno o más de los siguientes componentes: un promotor, una o más secuencias intensificadoras , un origen de replicación, una secuencia de terminación trascripcional, una secuencia completa de intrón que contiene un donador y un sitio de empalme de aceptor y donador, una secuencia guia para secreción, un sitio de unión de ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región poliligadora para insertar el ácido nucleico que codifica para el polipéptido que se va a expresar, y un elemento marcador seleccionable . Estas secuencias se analizan en más detalle posteriormente. Los componentes de ejemplo del vector incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, secuencias homologas (es decir, de la misma especie y/o variedad como la célula hospedadora) , heterólogas (es decir, de una especie diferente de la especie o variedad de la célula hospedadora) , híbridas (es decir, una combinación de diferentes secuencias de más de una fuente) , sintéticas o nativas que funcionan normalmente para regular la expresión de la inmunoglobulina. En ciertas modalidades, una fuente de componentes de vector puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con la condición que los componentes sean funcionales en, y se puedan activar por, la maquinaria de la célula hospedadora. En ciertas modalidades, se selecciona un origen de replicación en base al tipo de la célula hospedadora que se usa para la expresión. En ciertas modalidades, el origen de replicación del plásmido pBR322 (Producto No. 303-3s, New England Biolabs, Berverly, MA) es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas en tanto que en ciertas modalidades, son útiles varios orígenes de SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatosis vesicular (VSV) o papilomavirus (tal como HPV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. En ciertas modalidades, el componente del origen de replicación no se necesita para vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, el origen de SV40 frecuentemente se usa sólo debido a que contiene el promotor temprano) . En ciertas modalidades, una secuencia de terminación de trascripción se puede localizar 3 ' en el extremo de un polipéptido que codifica para regiones y sirve para terminar la trascripción, En ciertas modalidades, una secuencia de terminación de trascripción en células procarióticas es un fragmento con alto contenido de G-C seguido por una secuencia poli T. en tanto que ciertas secuencias se pueden clonar fácilmente a partir de una biblioteca o aún comprar de forma comercial como parte de un vector, en ciertas modalidades, también se pueden sintetizar fácilmente secuencias usando métodos para la síntesis de ácidos nucleicos tal como aquellos descritos anteriormente. En ciertas modalidades, un elemento génico marcador seleccionable codifica para una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento de una célula hospedadora cultivada en un medio selectivo de cultivo. Los genes marcadores de selección de ejemplo, pero no limitantes, incluyen aquellos que codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, o canamicina para células hospedadoras procarióticas, (b) deficiencias auxotróficas de complemento de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles, del medio complejo. Los marcadores seleccionables de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, el gen de resistencia a canamicina, el gen de resistencia a ampicilina, y el gen de resistencia a tetraciclina. En ciertas modalidades, se puede usar un gen de resistencia a neomicina para la selección en células hospedadoras procarióticas y eucarióticas . En ciertas modalidades, se pueden usar otra selección de genes para amplificar el gen que se expresará. La amplificación es el proceso en donde los genes que están en mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de las generaciones sucesivas de las células recombinantes . En ciertas modalidades, los marcadores seleccionables para células de mamífero pueden ser dihidrofolato-reductasa (DHFR) y timidina-cinasa. En ciertas modalidades, los transformantes de células de mamífero se colocan bajo presión selectiva que sólo los transformantes se adaptan únicamente al sobrevivir en virtud del marcador presente en el vector. La presión de selección se impone al cultivar las células transformadas bajo condiciones en las cuales se cambia sucesivamente la concentración del compañero de selección en el medio, conduciendo de este modo la amplificación tanto del gen de selección como al ADN que codifica para un anticuerpo. En ciertas modalidades, las cantidades incrementadas de un anticuerpo se sintetizan a partir del ADN amplificado. ün sitio de unión a ribosoma se presenta típicamente para el inicio de traducción del A m y se caracteriza por una secuencia de Shine-Dalgamo (procariota) o secuencia Kozak (eucariota) . El elemento se localiza típicamente 3' al promotor y 5' a la secuencia de codificación del polipéptido que se va a expresar. La secuencia de Shine-Dalgamo se varía pero típicamente es una polipurina (es decir, que tiene un alto contenido de A-G) . Se han identificado muchas secuencias de Shine-Dalgamo, cada uno de los cuales se puede sintetizar fácilmente usando métodos expuestos anteriormente y usar en un vector procariótico. En ciertas modalidades, se puede usar una secuencia guía o de señal para dirigir la secreción de un polipéptido. En ciertas modalidades, se puede colocar una secuencia de señal dentro de, o directamente en el extremo 5' de, una región de codificación de polipéptido. Se han identificado muchas secuencias de señal y, en ciertas modalidades, se pueden seleccionar en base a la célula hospedadora usada para la expresión. En ciertas modalidades, una secuencia de señal puede ser homologa (que se presenta de forma natural) o heteróloga a una secuencia de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo o dominio de unión a antígeno. En ciertas modalidades, una secuencia de señal heteróloga seleccionada debe ser una que se reconozca y procese, es decir, se escinda por una peptidasa de señal, por la célula hospedadora. En ciertas modalidades que comprenden células hospedadoras procarióticas que no reconocen y procesan una secuencia de señal de inmunoglobulina reactiva, la secuencia de señal se puede sustituir con una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, de fosfatasa alcalina, penicilinasa, o guías de enterotoxinas II estables al calor. En ciertas modalidades, para la secreción en levadura, una secuencia de señal de inmunoglobulina nativa se puede sustituir por una secuencia guía de levadura. Las secuencias guía de levadura de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, invertasa de levadura, factor alfa, o guías de fosfatasa acida. En ciertas modalidades, puede ser satisf ctoria la expresión de células de mamífero usando la secuencia de señal nativa. En ciertas modalidades, pueden ser adecuadas otras secuencias de señal de mamífero. En ciertas modalidades , la secreción de un anticuerpo o dominio de unión a antígeno de una célula hospedadora dará por resultado la remoción del péptido de señal del anticuerpo. De esta manera, en estas modalidades, el anticuerpo maduro carecerá de cualquier secuencia guía o de señal . En ciertas modalidades, tal como donde se desea la glicosilación en un sistema de expresión de célula hospedadora eucariótica, se pueden manipular las varias pre-secuencias para mejorar la glicosilación o rendimiento. En ciertas modalidades, se puede alterar el sitio de escisión de peptidasa de un péptido de señal particular, o adicionar prosecuencias, que también pueden afectar la glicosilación. En ciertas modalidades, el producto final de proteína puede tener, en la posición -1 (con relación al primer aminoácido de la proteína madura) uno o más aminoácidos adicionales, incidentes a la expresión, que pueden no haberse removido totalmente. En ciertas modalidades, el producto final de proteína puede tener uno o dos aminoácidos encontrados en el sitio de escisión de peptidasa, unidos al N-término. En ciertas modalidades, el uso de algunos sitios de escisión enzimática puede dar por resultado una forma ligeramente truncada del polipéptido deseado, si la enzima corta en esta área dentro del polipéptido maduro. En ciertas modalidades, los vectores de expresión pueden contener un promotor que se reconoce por el organismo hospedador y está enlazado operablemente a una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo o dominio de unión a antígeno. En ciertas modalidades, se puede usar un promotor nativo o heterólogo dependiendo de la célula hospedadora usada para la expresión y el rendimiento deseado de la proteína. Los promotores de ejemplo para el uso con hospedadores procarióticos, incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa; fosfatasa alcalina; sistema promotor de triptof no (trp) ; y promotores híbridos tal como el promotor tac. En ciertas modalidades, se pueden usar otros promotores bacterianos conocidos . Las secuencias de los promotores bacterianos conocidos se han publicado, permitiendo de este modo que un experto en la técnica los ligue a la(s) secuencia (s) deseada (s) de ADN, usando ligadores o adaptadores como se necesite para suministrar cualquier sitio deseado de restricción. Los promotores adecuados para el uso con hospedadores de levadura también son bien conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, se usan de forma ventajosa intensificadores de levadura con los promotores de lavadura.

Son bien conocidos los promotores adecuados para el uso con células hospedadoras de mamífero. Los promotores de ejemplo para el uso con las células hospedadoras de mamífero incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, aquellos obtenidos de los genomas de virus tal como virus de polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2) , virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus , un retrovirus, virus de hepatitis B, y de manera más preferente "Virus Simiesco 40 (SV40) . Los promotores de mamífero de ejemplo incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, promotores heterólogos de mamífero. Los promotores heterólogos de mamífero de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, promotores de choque térmico y el promotor de actina. Los promotores de ejemplo que se pueden usar para expresar compañeros de unión específica incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, la región del promotor temprano de SV40 (Benoist y Chambón (1981), Nature, 290:304-310); el promotor CMV; el promotor contenido en la repetición terminal larga de 3 ' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al . (1980), Cell, 22: 787-97); el promotor de timidina-cinasa de herpes (Wagner et al (1981), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 78: 1444-5); las secuencias reguladoras del gen de metalotionina (Brinster et al. (1982)., Nature, 296: 39-42); vectores de expresión procarióticos tal como el promotor de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al. (1978), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. ., 75: 3727-31); y el promotor tac (DeBoer, et al. (1983), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-25). En ciertas modalidades, las regiones de control trascripcional animal, que exhiben especificidad de tejido, se pueden usar en animales transgénicos . Las regiones de control trascripcional de ejemplo para el uso con la expresión específica del tejido en animales transgénicos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación la región de control del gen de elastasa I que está activa en células acinar pancreáticas (Swift et al. (1984), Cell, 38: 639-46; Ornitz et al . (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald (1987), Hepatology, 7: :425~515); la región de control de gen de insulina que está activa en células beta pancreáticas (Hanahan (1985), Nature, 315: 11 5-122) ; la región de control de gen de inmunoglobulina que está activa en células linfoides (Grosschedl et al. (1984), Cell, 38: 647-58; Adames et al. (1985), Nature, 318: 533-8; Alexander et al. (1987), Mol. Cell. Biol., 7: 1436-44); la región de control de virus de tumor mamario de ratón que está activa en células testiculares, de mama, linfoides y cebadas (Leder et al. (1986), Cell, 45: 485-95); región de control de gen de albúmina que está activa en hígado (Pinkert et al. (1987), Genes and Devel., 1: 268-76); la región de control de gen de alfafetoproteína que está activa en hígado (Krumlauf et al. (1987), Mol. Cell. Biol., 5: 1639-48; Hammer et al. (1987), Science, 235: 53-58); la región de control de gen de alfa-1-antitripsina que está activa en el hígado (Kelsey et al. (1987). Genes and Devel, 1: 161-171); la región de control de gen de beta-globina que está activa en células mieloides (Mogram et al. (1985), Nature, 315: 338-340; Kollias et al. (1986), Cell, 46: 89-94); la región de control de gen de proteína básica de mielina que está activa en células oligodendrocíticas en el cerebro (Readhead et al. (1987), Cell. 48: 703-712); la región de control de gen de cadena-2 ligera de miosina que está activa en músculo esquelético (Sani (1985), Nature, 314: 283-286); y la región de control de gen de hormona de liberación gonadotrópica que está activa en el hipotálamo (Masón et al. (1986), Science, 234 : 1372-8) . En ciertas modalidades, se puede insertar una secuencia intensificadora en el vector para incrementar la trascripción en células hospedadoras eucarióticas . Las secuencias intensificadoras de ejemplo de genes de mamífero incluyen de manera enunciativa y sin limitación globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína, e insulina. En ciertas modalidades, se usará un intensificador de un virus. Las secuencias intensificadoras de ejemplo para la activación de promotores eucarióticos incluyen de manera enunciativa y sin limitación, el intensificador de SV40, el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador de polioma, y los intensificadores de adenovirus son elementos de ejemplo de intensificación. En ciertas modalidades, un intensificador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' a la región de codificación del polipéptido. En ciertas modalidades, el intensificador se localiza en un sitio 5' del promotor. En ciertas modalidades, los vectores son aquellos que son compatibles con al menos una de las células hospedadoras bacterianas, de insecto y de mamífero. Los vectores de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, pCRII, pCR3, and pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, CA) , pBSII (Stratagene Company, La Jolla, CA) , pET15 (Novagen, Madison, WI) , pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA) , pETL (BlueBacll; Invitrogen), pDSR-alpha (Publicación del PCT No. 090/14363) y pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, NY) . Los vectores de de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, cósmicos, plásmidos y virus modificados compatibles con la célula hospedadora seleccionada. En ciertas modalidades, los vectores pueden incluir plásmidos que incluyen de manera enunciativa y sin limitación, derivados de plásmido Bluescript" (un fagemid basado en ColEl de alto número de copia, Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla CA) , plásmidos de clonación de PCR diseñados para clonar productos de PCR Taq-amplificados (por ejemplo, el equipo de clonación TOPO1** TA Cloning" , derivados de plásmido PCR2.1®, Invitrogen, Carlsbad, CA) , y vectores de mamífero, levadura y virus tal como un sistema de expresión de baculovirus (derivados de plásmido pBacPAK, Clontech, Palo Alto, CA) . En ciertas modalidades, las moléculas recombinantes se pueden introducir en las células hospedadoras vía transformación, transfección, infección, electroporacion u otras técnicas conocidas. En ciertas modalidades, las células hospedadoras pueden ser células hospedadoras procarióticas (tal como E. coli) , o células hospedadoras eucarióticas (tal como una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de vertebrado) . En ciertas modalidades, las células hospedadoras procarióticas tal como E. coli producen protelna no glicosilada; por ejemplo shBC A no glicosilada y shTACI no glicosilada, que pueden poseer ventajas con respecto a las moléculas eucarióticas glicosiladas . En ciertas modalidades, la célula hospedadora, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, expresa un anticuerpo o dominio de unión a antígeno de la invención que se puede recolectar de manera subsiguiente en el medio de cultivo (si la célula hospedadora lo segrega en el medio) o directamente de la célula hospedadora que lo produce (si no lo segrega) . En ciertas modalidades, la selección de una célula hospedadora apropiada tomará en cuenta varios factores, tal como los niveles deseados de expresión, las modificaciones de polipéptido que son deseables o necesarias para la actividad, tal como glicosilación o fosforilación, y/o facilidad de plegado en una molécula biológicamente activa. Se conocen varias células hospedadoras adecuadas en la técnica y muchas están disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) , anassas, VA. Las células hospedadoras de ejemplo incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, células de mamífero, tal como células de ovario 1 de hámster chino (CHO) (ATCC No. CCL61) células CHO DHFR ..(Urlaub et al. (1980), Proc . Nati. Acad. Sci . USA 97,4216-20) , células 293 o 293T de riñon embriónico humano (HEK) (ATCC No. CRL1573), y células 3T3 (ATCC No. CCL92) . La selección de células hospedadoras de mamífero adecuadas y los métodos para la transformación, cultivo, amplificación, detección y producción y purificación del producto se conocen en la técnica. Las células hospedadoras de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, las líneas de células COS-1 (ATCC No. CRL1650) y COS-7 (ATCC No. CRL1651) de mono, y la línea de células CV-1 (ATCC No. CCL70) . Las células hospedadoras de mamífero de ejemplo incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, líneas de células de primate y líneas de células de roedor, incluyendo líneas de células transformadas. Las células hospedadoras de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, células diploide normales, variedades celulares derivadas del cultivo in vitro de tejido primario, y explantas primarias. En ciertas modalidades, las células candidatas pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección de acción dominante. Las células hospedadoras de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, células N2A de neuroblastoma de ratón, células HeLa, células L-929, líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-co NIH; líneas de células de hámster BHK o Ha , que están disponibles de la American Type Culture Collection, Manassas, VA. Cada una de estas líneas celulares se conoce y está disponible por aquellos expertos en la técnica de la expresión de proteínas . En ciertas modalidades, las células hospedadoras pueden ser células bacterianas. Las células hospedadoras bacterianas de ejemplo influyen de manera enunciativa y sin limitación, varias cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, (ATCC No. 33694) DH5a, DH10, y MC1061 (ATCC No. 53338)). Las células hospedadoras de ejemplo también incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, varias cepas de Pseudomonas spp., B. subtilis, otros Bacillus spp., Streptomyces spp. Muchas cepas de células de levadura conocidas por aquellos expertos en la técnica también están disponibles como células hospedadoras para la expresión de polipéptidos . En ciertas modalidades, la célula hospedadora puede ser Saccharomyces cerivisae . En ciertas modalidades, se pueden usar sistemas de células de insecto. Ciertos de estos sistemas se describen, por ejemplo, en Kitts et al. (1993), Biotechniques , 14: 810-7, Lucklow (1993), Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-72, y Lucklow et al. (1993), J. Virol . , 67: 4566-79. Las células de insecto de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, Sf-9 y Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . En ciertas modalidades, la transformación o transfección de una molécula de ácido nucleico que codifica para un compañero de unión específica en una célula hospedadora seleccionada se puede lograr por métodos bien conocidos incluyendo métodos tal como método de cloruro de calcio, de electroporación, de microinyección, de lipofección o el método de DEAD-dextrano. En ciertas modalidades, el método seleccionado será en parte una función del tipo de célula hospedadora que se va a usar. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, y se exponen por ejemplo, en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). En ciertas modalidades, se pueden usar animales transgénicos para expresar compañeros glicosilados de unión específica, tal como anticuerpos y el dominio de unión a antígeno. En ciertas modalidades, se puede usar un animal transgénico productor de leche (una vaca o cabra, a manera de ejemplo) y obtener compañeros glicosilados de unión en la leche del animal. En ciertas modalidades, se pueden usar plantas para producir compañeros glicosilados de unión específica. Las células hospedadoras que comprenden (como por transformación o transfección) un vector de expresión que codifica para un compañero de unión específica de la molécula objetivo se pueden cultivar usando medios normales bien conocidos por el experto en la técnica. En ciertas modalidades, los medios pueden contener todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y supervivencia de las células. En ciertas modalidades, se pueden cultivar células de E. coli en Caldo de Luria (LB) y/o Caldo Terrífico (TB) . Los medios de ejemplo para cultivar células eucarióticas incluyen, de manera enunciativa y sin limitación PMI 1640, MEM, DME , todos los cuales se pueden complementar con suero y/o factores de crecimiento de acuerdo a la línea celular particular que se cultive. En ciertas modalidades, se pueden cultivar células de insecto en el medio de Grace complementado con yeastolato, hidrolisato de lactalbúmina, y/o suero de becerro fetal . En ciertas modalidades, se adiciona un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de células transfectadas o transformadas como un complemento al medio. En ciertas modalidades, el compuesto que se va a usar se elige en vista del elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el cual se transformó la célula hospedadora. En ciertas modalidades, donde el elemento marcador seleccionable es resistencia a canamicina, el compuesto adicionado al medio de cultivo será canamicina. Los compuestos de ejemplo para crecimiento selectivo incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, ampicilina, tetraciclina, y neomicina.

En ciertas modalidades, la cantidad de un anticuerpo o dominio de unión a antígeno producida por una célula hospedadora se puede evaluar usando métodos normales conocidos en la técnica. Los métodos de ejemplo incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, análisis por transferencia Western, electrofóresis en gel de SDS-poliacrilamida, electrofóresis en gel no desnaturalizante, separación por HPLC, inmunoprecipitación, y ensayos de actividad. En ciertas modalidades, la purificación de un compañero de unión específica que se ha segregado en el medio celular se puede lograr usando una variedad de técnicas incluyendo cromatografía de afinidad, de inmunoafinidad o intercambio iónico, cromatografía por tamiz molecular, electrofóresis en gel preparativa o enfoque isoeléctrico, cromatoenfoque y cromatografía líquida de alta presión. En ciertas modalidades, se pueden purificar de manera conveniente anticuerpos que comprende una región Fe por cromatografía de afinidad con la Proteína A, que se une de forma selectiva a la región Fe. En ciertas modalidades, se pueden preparar formar modificadas de un anticuerpo o dominio de unión a antígeno con marcas de afinidad, tal como hexahistidina u otro péptido pequeño tal como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) o myc (Invitrogen) en ya sea el término carboxi o amino y purificado por una columna de afinidad de un paso. En ciertas modalidades, la polihistidina se une con mayor afinidad y especificidad a níquel, de esta manera se puede usar una columna de afinidad de níquel (tal como las columnas de níquel Qiagen") para la purificación de los compañeros de unión específica marcados con polihistidina. Ver, por ejemplo Ausubel et al., eds (1993), Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John iley & Sons, New York. En ciertas modalidades, se puede usar más de un paso de purificación. En ciertas modalidades, los compañeros de unión específica que se expresan en células hospedadoras procarióticas pueden estar presentes en forma soluble ya sea en el espacio periplasmatico o en el citoplasma o en una forma insoluble como parte de cuerpos intracelulares de inclusión. En ciertas modalidades, se pueden extraer los compañeros de unión específica a partir de la célula hospedadora usando cualquier técnica normal conocida por el experto. En ciertas modalidades, las células hospedadoras se pueden lisar para liberar los contenidos del periplasma/citoplasma por prensa Francesa, homogeneización, y/o tratamiento con sonido seguido por centrifugación. En ciertas modalidades, las formas solubles de un anticuerpo o dominio de unión a antígeno presentes ya sea en el citoplasma o liberado del espacio periplasmatico se puede purificar adicionalmente usando métodos conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, se liberan fragmentos Fab .del espacio periplasmatxco bacteriano por técnicas de choque osmótico . Si un anticuerpo o dominio de unión a antigeno ha formado cuerpos de inclusión, se pueden unir frecuentemente a las membranas celulares interiores y/o exteriores y de esta manera se encontrarán principalmente en el material sedimentado después de la centrifugación. En ciertas modalidades, el material sedimentado entonces se puede tratar a pH extremos o con un compañero cautrópico tal como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea, o derivados de urea en la presencia de un compañero de reducción tal como ditiotreitol a pH alcalino o tris-carboxietil-fosfina a pH ácido para liberar, separar y solubilizar los cuerpos de inclusión. En ciertas modalidades, el compañero soluble de unión especifica entonces se puede analizar usando electrofóresis en gel, inmunoprecipitación o similares. En ciertas modalidades, se puede aislar un anticuerpo solubilizado o dominio de unión a antígeno, usando métodos normales tal como aquellos expuestos posteriormente y en Marston et al. (1990), eth. Enz., 182: 264-75. En ciertas modalidades, un anticuerpo o dominio de unión a antígeno puede no ser biológicamente activo en el aislamiento. En ciertas modalidades, los métodos para "replegar" o convertir el polipéptido a su estructura terciaria en general enlaces de disulfuro, se pueden usar para restaurar . la actividad biológica. En ciertas modalidades, la actividad biológica se puede restaurar al exponer el péptido solubilizado a un pH usualmente por arriba de 7 en la presencia de una concentración particular de un caótropo. La selección del caótropo es muy similar a las elecciones usadas para la solubilización de cuerpos de inclusión, pero, en ciertas modalidades, el caótropo se usa a una menor concentración y no es necesariamente el mismos como los caótropos usados para la solubilización. En ciertas modalidades, la solución ' de replegado/oxidación también contendrá un compañero de reducción o el compañero de reducción más su forma oxidada en una relación específica para generar un potencial particular de reducción/oxidación que permita que se presente la redistribución de disulfuros en al formación del (los) puente (s) de cisteína de la proteina. Las parejas de ejemplo de reducción/oxidación incluyen de manera enunciativa y sin limitación, cisterina/cistamina, glutationa (GSH) /ditiobis , GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol (DTT) /ditiano DTT, y 2-mercaptoetanol (bME) /ditio-b (ME) . En ciertas modalidades, se puede usar un co-solvente o se puede necesitar para implementar la eficiencia del replegado y de los compañeros de ejemplo usados para este propósito incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, glicerol, polietilenglicol de varios pesos moleculares, arginina y moléculas relacionadas. En ciertas modalidades, se pueden preparar compañeros de unión específica por métodos de síntesis química. En ciertas modalidades, el método de síntesis química puede incorporar síntesis de péptidos en fase sólida. En ciertas modalidades, los métodos de síntesis química pueden usar técnicas conocidas tal como aquellas expuestas en Mernfield et al. (1963), J. Am. Chem. Soc . , 85: 2149; Houghten et al. (1985), Proc Nati Acad. Sci USA, 82: 5132; and Stewart and Young (1984) , Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. En ciertas modalidades, se pueden sintetizar polipéptidos con o sin una metionina en el término amino. En ciertas modalidades, los anticuerpos químicamente sintetizados y los dominios de unión a antígeno se pueden oxidar usado los métodos expuestos en estas referencias para formar puentes de disulfuro. En ciertas modalidades, los anticuerpos preparados de este modo retendrán al menos una actividad biológica asociada con un anticuerpo nativo o producir de manera recombinante o dominio de unión a antígeno. En ciertos casos, se ha usado exitosamente terapia anti-citocina individual o una combinación de terapias anti-citocina (inhibidores de TNF, IL-1, etc) , pero con algunas imitaciones debido a las células T y B inmunitarias . En ciertos casos, estas terapias también comprenden tratamiento regular durante el transcurso de enfermedades crónicas . Para repuestas autoinmmunitarias actuales, en ciertos casos, se han usado inhibidores que bloquean la activación de células T, en animales y en enfermedades 5 inflamatorias humanas con éxito limitado. Una de las razones para esta inflamación es el ambiente proinflamatorio de las citocinas en el sitio de la inflamación. Un buen ejemplo es la terapia de CTLA-4, que modula la artritis inducida por colágeno (CIA) cuando se tratan ratones de inducción de 10 artritis. Este tratamiento puede fallar si se inicia en el momento del comienzo de la enfermedad (o respuesta autoinmunitaria corriente) , sugiriendo que las citocinas proinflamatorias son más importantes que las células T en el momento de la inflamación. De manera alternativa, la 15 activación de células T no se puede bloquear en este momento por CTLA- . La interleucina-1 (IL-1) es una citocina anti- inflamatoria. En ciertos casos. La IL-1 es un mediador en muchas enfermedades y condiciones médicas. En ciertos casos, 20 la IL-1 se elabora por células de linaje de macrófagos/monolitos . En mucos casos, la IL-1 se produce en dos formas: IL- alfa (IL-lct) e IL-1 beta (IL-?ß) . Una enfermedad o condición médica se considera que es una "enfermedad mediada por interleucina-1" si la „.. enfermedad espontánea o experimental, o condición médica, 1 1 está asociada con niveles elevados de IL-1 en fluidos corporales, o tejido, y si las células o tejidos tomados del cuerpo producen niveles elevados de IL-1 en cultivo. En ciertas modalidades, estas enfermedades mediadas por interleucina-1 también se reconocen por las siguientes dos condiciones adicionales: (1) hallazgos patológicos asociados con la enfermedad o condición médica se puede imitar experimentalmente en animales mediante la administración de IL-1 o favoreciendo la expresión de IL-1; y (2) una patología inducida en modelos experimentales de animales de la enfermedad o condición médica se puede inhibir o abolir por tratamiento con agentes que inhiben la acción de IL-1. En ciertas modalidades, una o más de las condiciones anteriores se encuentran en una enfermedad mediada por IL-1. En ciertas modalidades, las tres condiciones se encuentran en una enfermedad mediada por IL-1. Las enfermedades mediadas por interleucina-1 (IL-1) agudas y sincrónicas incluyen de maneras enunciativa y sin limitación la siguiente: pancreatitis aguda; esclerosis lateral amiotrófica (ALS, o enfermedad de Lou Genrig) ; enfermedad de Alzherimer; caquexia/anorexia; incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, caquexia inducida por SIDA; asma y otras enfermedades pulmonares; aterosclerosis; vasculitis autoinmunitaria; síndrome de fatiga crónica; enfermedades asociadas a Clostridium, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación diarrea asociada a Clostridium .condiciones coronarias e indicaciones, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, falla cardiaca congestiva, restenosis coronaria, infarto al miocardio, disfunción de miocardio (por ejemplo relaciona a sepsis) , e injerto de derivación de arteria coronaria; cáncer, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, leucemias, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación leucemia de mieloma múltiple y mielogenosa (por ejemplo AML y CML) , y metástasis de tumor; diabetes (incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, diabetes dependiente de insulina) ; endometriosis; fiebre; fibromialgia; glomerulonefritis; enfermedad del injerto versus hospedador y/o rechazo de transplante; choque hemorrágico; hiperalgesia, enfermedad inflamatoria del intestino; condiciones inflamatorias de una articulación, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, osteoartritis , artritis psoriática, y artritis reumatoide; enfermedad inflamatoria del ojo, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, aquellas asociadas con por ejemplo, trasplante de cornea; isquemia, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, isquemia cerebral, (incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, lesión cerebral como resultado de por ejemplo, trauma, epilepsia, hemorragia o ataque, cada una de las cuales puede conducir a neurodegeneración) ; enfermedad de Kawasaki; daño de aprendizaje; enfermedades pulmonares (incluyendo de manera enunciativa y sin limitación síndrome de esfuerzo respiratorio agudo, o ARDS) ; esclerosis múltiple; miopatias (por ejemplo, metabolismo de proteína muscular, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, metabolismo de proteína muscular en sepsis) ; neurotoxicidad (incluyendo de manera enunciativa y sin limitación esta condición inducida por VIH) ; osteoporosis; dolor, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación dolor relacionado a cáncer; enfermedad de Parkinson; enfermedad periodontal; labor pre-término; psoriasis; lesión por reperfusión; choque séptico; efectos secundarios de terapia de radiación; enfermedad temporal de articulación mandibular; perturbación de sueño; uveítis; y una condición inflamatoria que resulta de por ejemplo, esfuerzo, torcedura, daño de cartílago, trauma, cirugía ortopédica, infección u otros procesos de enfermedad. En ciertas modalidades, un inhibidor de IL-1 puede ser cualquier proteína o molécula capaz de prevenir de forma específica la activación de receptores celulares a IL-1, que puede resultar de cualquier número de mecanismos. Los mecanismos de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, reducción de la producción de IL-1, unión a IL-1 libre, interferencia con IL-1 que se une a su receptor, interferencia con formación del complejo de receptor de IL-1 (es decir, asociación del receptor de IL-1 con proteína accesoria del receptor de IL-1) , e interferencia con modulación de la señalización de IL-1 después de la unión a su receptor. Ciertos inhibidores de interleucina-1 incluyen, de manera enunciativa y sin limitación antagonistas del receptor de IL-1, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, • MR ¦ Kxneret , IL-lra, variantes de IL-lra y derivados de IL-lra, que se llaman colectivamente "proteínas de IL-lra"; anticuerpos monoclonales anti-receptor de IL-1 (ver, por ejemplo EP 623674, que se incorpora de este modo como referencia para cualquier propósito) ; proteínas de unión a IL-1, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, receptores solubles de IL-1 (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos No. 5,492,888, patente de los Estados Unidos No. 5,488,032, y patente de los Estados Unidos No. 5,464,937, patente de los Estados Unidos No. 5,319,071, y patente de los Estados Unidos No. 5,180,812, que se incorporan de este modo como referencia para cualquier propósito; anticuerpos monoclonales anti-IL-1 (ver, por ejemplo WO 9501997, WO 9402627, WO 9006371, patente de los Estados Unidos No. 4;935,343, EP 364778, EP 26761 1 y EP 220063, que se incorporan de este modo como referencia para cualquier propósito) ; proteínas accesorias del receptor de IL-1 y anticuerpos a las mismas (ver, por ejemplo WO 96/23067 y WO 99/37773, que se incorporan de este modo como referencia para cualquier propósito; inhibidores de la enzima de conversión de interleucina-1 beta (ICE) o caspasa I (ver por ejemplo, WO 99/46248, WO 99/47545, y WO 99/47154, que se incorporan de este modo como referencia para cualquier propósito) , que se pueden usar para inhibir la producción de IL-1 beta y la secreción de la misma; inhibidores de interleucina-l-beta-proteasa; péptidos inhibitorios de IL-1 y estos péptidos enlazados a vehículos que extienden la vida media; que se describen en la WO 99/25044; y otros compuestos y proteínas que bloquean la síntesis in vivo o liberación extracelular de IL-1. Los inhibidores de IL-1 de ejemplo se describen por ejemplo en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,747,444; 5,359,032; 5,608,035; 5,843,905; 5,359,032; 5,866,576; 5,869,660; 5,869,315; 5,872,095; 5,955,480; 5,965,564; Solicitudes internacionales de patente (WO) 98/21957, 96/09323, 91/17184, 96/40907, 98/32733, 98/42325, 98/44940, 98/47892, 98/56377, 99/03837, 99/06426, 99/06042, 91/17249, 98/32733, 98/17661, 97/08174, 95/34326, 99/36426, 99/36415;. Solicitudes europeas de patente (EP) 534978 y 894795; y Solicitud de patente francesa FR 2762514. Las descripciones de todas estas referencias mencionadas anteriormente se incorporan de este modo como referencia para cualquier propósito . El antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-Ira) es una proteína humana que actúa como un inhibidor natural de la interleucina-1 y es un miembro de la familia de IL-1, que incluye IL-lcc e IL-?ß. Ciertos antagonistas del receptor, incluyendo IL-lra y variantes y derivados de los mismos, así como métodos para elaborarlos y usarlos, se describen en la patente de los Estados Unidos No. 5,075,222; WO91/08285: W091/17184; AU 9173636; W092/16221; W093/21946; WO 94/06457; W094/21275; FR2706772; W094/21235; DE 4219626, WO 94/20517; W096/22793 ; 097/28828 ; y W099/36541, que se incorporan en la presente como referencia para cualquier propósito. En ciertas modalidades, se puede glicosilar un antagonista del receptor de IL-1. En ciertas modalidades, un antagonista de receptor de IL-1 puede estar no glicosilado. Se describen tres formas de. IL-lra variantes de la mismas en la patente de los Estados Unidos No. 5,075,222 (la patente ¾222) . La primera forma, IL-lract (llamada "IL-li" en la patente *222), se caracteriza como una molécula de 22-23 kD en SDS-page con un punto isoeléctrico apropiado de 4.8, que eluye de una columna Mono Q FPLC en aproximadamente NaCl 52 mM en amortiguador Tris, pH 7.6. La segunda forma, IL-lrap se caracteriza como una proteína de 22-23 kD, que eluye de una columna Mono Q en NaCl 48 mM. Se glicosilan tanto IL-lraa como IL-lra . La tercera forma, IL-Irax, se caracteriza como una proteína de 20 kD, que eluye de una columna mono Q a NaCl 48 mM y no está glicosilada. La patente *222 también describe ciertos métodos para aislar genes que codifican para los inhibidores, para clonar estos genes en vectores adecuados, para transformar y transfectar estos genes en ciertos tipos celulares, para expresar estos genes para producir los inhibidores . KIN2 es una variante de IL-lra fusionada a una molécula de Fe. La secuencia de KIN2 se describe en SEQ ID NO 3. La información adicional de la expresión y purificación de KIN2 está en la patente de los Estados Unidos No. 6,294,170. En ciertas modalidades, se hacen supresiones, inserciones y/o sustituciones (de forma individual o colectiva referidas como "variante (s) " ) dentro de las secuencias de aminoácidos de IL-lra. En ciertas modalidades, una variante de IL-lra es biológicamente activa (por ejemplo, posee la capacidad para inhibir IL-1) . Ciertas enfermedades y condiciones médicas se median por TNF y se pueden categorizar como condiciones inflamatorias. Como se usa en la presente, una "enfermedad mediada por TNF" incluye de manera enunciativa y sin limitación, una enfermedad o condición médica que está asociada con niveles elevados de TNF en fluidos corporales o tejido y/o en las cuales las células o tejidos tomados del cuerpo producen niveles elevados de TNF en cultivo. En ciertas modalidades, una enfermedad es una enfermedad mediada por TNF si (1) los hallazgos patológicos asociados con la enfermedad o condición médica se pueden imitar .experimentalmente en animales mediante la administración o favorecimiento de la expresión de TNF y/o (2) una patología inducida en los modelos experimentales de animales de la enfermedad o condición médica se puede inhibir o abolir por tratamiento con agentes que inhiben la acción de TNF. Ciertas enfermedades agudas y crónicas mediadas por TNF incluyen de manera enunciativa y sin limitación: caquexia y anorexia; cáncer, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, leucemia; síndrome de fatiga crónica; condiciones coronarias y/o indicaciones, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, falla cardiaca congestiva, restenosis coronaria, infarto al miocardio, disfunción de miocardio (incluyendo de manera enunciativa y sin limitación condición relacionada a sepsis) , e injerto de derivación de arteria coronaria; depresión; diabetes, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación diabetes juvenil de comienzo Tipo 1, diabetes mellitas, y resistencia a insulina (incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, resistencia a insulina asociada con obesidad) ; endometriosis, endometritis , y condiciones relacionadas; fibromialgia y analgesia; rechazo de injerto versus hospedador; hiperalgesia; enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, enfermedad de Crohn y diarrea asociada a Clostridium difficile; isquemia, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, isquemia cerebral, que incluye de manera enunciativa y sin limitación, lesión cerebral como resultado del trauma, epilepsia, hemorragia y/o ataque; enfermedad pulmonar, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, síndrome de esfuerzo respiratorio en adulto, asma, y fibrosis pulmonar; esclerosis múltiple; enfermedades neuroinflamatorias ; enfermedades y condiciones oculares; incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, trasplante de córnea, degeneración ocular y uveítis; dolor, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, dolor relacionado a cáncer; pancreatitis; enfermedades periodontales ; Pitiriasis rubra pilaris (PRP) ; prostatitis, incluyendo prostatitis bacteriana y no bacteriana, y condiciones relacionadas; psoriasis y condiciones relacionadas; fibrosis pulmonar; lesión por reperfusión; enfermedades reumáticas, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, artritis reumatoide, osteoartritis , artritis juvenil (incluyendo de manera enunciativa y sin limitación artritis reumatoide juvenil) , poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, y artritis reactiva, enfermedad de Still, artritis psoriática, artritis enteropática, polimiositis , dermatomiositis , escleroderma, esclerosis sistémica, vasculitis (por ejemplo, enfermedad de Kawasaki) , vasculitis cerebral, enfermedad de Lyme, artritis inducida por estafilococos ("séptica"), síndrome de Sjógren's, fiebre reumática, policondritis y polimialgia reumática y arteritis de células gigantes; choque séptico; efectos secundarios de terapia en la radiación; lupus eritematoso sistémico (SLE) ; enfermedad temporal de articulación mandibular; tiroiditis; y transplante de tejido y/o una- condición inflamatoria, por ejemplo, que resulta de tensión, torcedura, daño de cartílago, trauma, cirugía, ortopédica, infección (por ejemplo, VIH, Clostridium difficile y especies relacionadas) y otros procesos de enfermedad. En ciertas modalidades, los inhibidores de TNF pueden actuar por al menos uno de reducción o inhibición de la producción de TNF, unión a TNF libre, interferencia con TNF que se une a su receptor, e interferencia con modulación de la señalización de TNF después de la unión a su receptor. El término "inhibidor de TNF", incluye, de manera enunciativa y sin limitación, los receptores solubilizados de TNF, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación el receptor soluble tipo I de factor de necrosis de tumor (sTNFR-I; también llamado el receptor p55) , receptor soluble tipo II de factor de necrosis de tumor (también llamado el receptor p55) , y EnbrelMR; anticuerpos a TNF, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación Ramicade" y D2E7 (ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos Números 6,090,382 y 6,258,562); anticuerpos al receptor de TNF; sTNFR-I (ver, por ej emplo WO 98/24463) , etanercept (enbrel"11) , Avakine1®,-inhibidores de enzima de conversión de TNF- (TACE) ; y otras moléculas que afectan la actividad de T F. Se describen inhibidores de TNF- de ejemplo por ejemplo en las solicitudes de Patente Europea EP 308 378; EP 422 339; EP 393 438; EP 398 327; EP 412 486; EP 418 014, EP 417 563, EP 433 900; EP 464 533; EP 512 528; EP 529 905; EP 568 928; EP 607 776, que describen el uso de leflunomida para la inhibición de TNF-OÍ; EP 663 210; EP 542 795; EP 818 439; EP 664 128; EP 542 795; EP 741 707; EP 874 819; EP 882 714; EP 880 970; EP 648 783; EP 731 791; EP 895 988; EP 550 376; EP 882 714; EP 853 083; EP 550 376; EP 943 616; EP 939 121; EP 614 984; EP 853 083; Patentes de los Estados Unidos Nos . 5, 136, 021; 5,929, 117; 5, 948, 38; 5, 807, 862; 5,95,953; 5,834,435; 5, 817, 822; 5830742, 5, 834, 435; 5, 851, 556; 5, 853, 977 ; 5,359, 037; 5,512,544; 5, 695, 953; 5, 811, 261; 5, 633, 145 ; 5,863, 926; 5, 866,616; 5,641,673; 5, 869,677; 5,869,511; 5, 872, 146; 5, 854, 003; 5, 856, 161; 5, 877, 222; 5, 877, 200; 5, 877, 151; 5, 886, 010; 5, 869, 660; 5, 859, 207; 5, 891, 883; 5, 877, 180; 5, 955, 80; 5, 955, 476; 5, 955, 435; 5, 994, 351; 5,990,1149; 5, 952,320; 5, 962, 481; Solicitudes Internacionales de Patente WO 90/13575, WO 91/03553, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, WO 93/07863, WO 91/03553, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, WO 93/07863, WO 93/21946, WO 93/19777, WO 95/34326, WO 96/28546, WO 98/27298, O 98/30541 WO 96/38150, WO 96/38150, WO 97/18207, WO 97/15561, WO 97/12902, WO 96/25861, WO 96/12735, WO 96/11209, WO 98/39326, WO 98/39316, WO 98/38859, WO 98/39315, WO 98/42659, WO 98/39329, WO 98/43959, WO 98/45268, WO 98/47863, WO 96/33172, WO 96/20926, WO 97/37974, WO 97/37973, WO 97/47599, WO 96/35711, WO 98/51665, WO 98/43946, WO 95/04045, WO 98/56377, WO 97/12244, WO 99/00364, WO 99/00363, WO 98/57936, WO 99/01449, WO 99/01139, WO 98/56788, WO 98/56756, WO 98/53842, WO 98/52948, WO 98/52937, WO 99/02510, WO 97/43250, WO 99/06410, WO 99/06042, WO 99/09022, WO 99/08688, WO 99/07679, WO 99/09965, WO 99/07704, WO 99/06041, WO 99/37818, WO 99/37625, WO 97/11668, WO 99/50238, WO 99/47672, WO 99/48491; Solicitudes de Patente Japonesa 10147531, 10231285, 10259140 y 101330149, 10316570, 11001481 y 127,800/1991; Solicitud Alemana No. 19731521; y Solicitudes Británicas Nos. 2 218 101, 2 326 881, 2 246 569. Las descripciones de todas las referencias mencionadas anteriormente se incorporan de este modo como referencia para cualquier propósito. La EP 393 438 y EP 422 339 describen las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico de un receptor tipo I soluble de TNF (también conocido como inhibidor de sTNFR-i O 30 kDa TNF) y un receptor tipo II soluble de TNF (también conocido como inhibidor sTNFR-II o 40 kDa TNF, que se llaman colectivamente "sTNFR" . La EP 393 438 y EP 422 339 describen también formas modificadas de sTNFR-I y sTNFR-II, que incluyen, de manera enunciativa y sin limitación fragmentos, derivados funcionales y variantes. Adicionalmente, EP 393 438 y EP 422 339 describen métodos p ra aislar genes que codifican para los inhibidores, para clonar los genes en vectores adecuados, para transformar o transfectar los genes en ciertos tipos celulares, y para expresar los genes para producir los inhibidores . sTNFR-I y sTNFR-II son miembros de la superfamilia del receptor del factor de crecimiento de nervios/TNF de receptores, que incluye el receptor del factor de crecimiento de nervios (NGF) , antigeno de células B CD40, 4-1BB, el antígeno de células T de rata MRC 0X40, el antigeno fas, y los antígenos CD27 y CD30 (Smith et al., (1990) Science, 248:1019-1023). Una característica conservada de este grupo de receptores de superficie celular es un dominio de unión a ligando extracelular con alto contenido de cisteína, que se puede dividir en cuatro porciones repetidas de aproximadamente cuarenta aminoácidos que contienen 4-6 residuos de cisterna en las posiciones que están bien conservadas (Smith et al. (1990), supra) . , La EP 393 438 enseña un inhibidor ? 51 de TNF de 40 kDa y un inhibidor ? 53 de TNF de 40 kDa, que son versiones truncadas de la proteína del inhibidor de TNF de 40 kDa recombinante de longitud completa. ? 51 y ? 53 tienen 51 o 53 aminoácidos, respectivamente, suprimidos del término ^carboxilo de la proteína madura. La solicitud PCT publicada No. WO 98/01555 describe formas truncadas de sTNFR-I y sTNFR-II que no contienen el cuarto dominio (los residuos de aminoácido Thr12 -Asn161 de sTNFR-I y los residuos de aminoácidos Pro141-Thr179 de sTNFR- II) ; una porción del tercer dominio (residuos de aminoácido) Asnli:L-Cys126 de sTNFR-I) ; y los residuos de aminoácidos Pro123Lys140 de sTNFR-II; y opcionalmente, no contienen una porción del primer dominio (residuos de aminoácidos Asp1-Cys19 de sTNFR-I y los residuos de aminoácido Leu^Cys32 de sTNFR- II) . En ciertas modalidades, los sTNFR truncados incluyen las proteínas representadas por la fórmula Rx- [Cys19-Cys103] -R2 y R4~ [Cys32-Cys115] -R5. Estas proteínas son formas truncadas de sTNFR-I y sTNFR-II, respectivamente. Como se usa en la presente "Ri- [Cys19-Cys103] -R2" representa una o mas proteínas en donde [Cys19-Cys103] son los residuos 19 hasta 103 de sTNFR-I, la secuencia de la cual se proporciona la Figura 1 de la WO 98/01555; en donde Ri representa un grupo metionilado o no metionilado de amina de Cys19 o uno o mas residuos amino-terminales de aminoácidos seleccionados de Cys18 a Asp1; y en donde R2 representa un grupo carboxi de Cys103 o uno o mas residuos carboxi- terminales de aminoácidos seleccionados de Phe104 a Leu110. Los sTNFR-I truncados de ejemplo de la presente invención incluyen de manera enunciativa y sin limitación STNFR-I 2.6 D/C105, sTNFR-I 2.6 D/C106, sTNFR-I 2.6 D/N105, sTNFR-I 2.3 D/d8, sTNFR-I 2.3 D/dl8, sTNFR-I 2.3 D/dl5, ya sea metionilados o no metionilados, y variantes y derivados de los mismos. Ciertos sTNFR-1 truncados de ejemplo se escriben, por ejemplo, en la Solicitud PCT publicada No. WO 98/01555. Como se usa en la presente WR3- [Cys32-Cys115] -R" representa una o mas porciones en donde [Cys32-Cys115] son residuos Cys32 hasta Cys115 de sTNFR-II, la secuencia de los cuales se proporciona en la Figura 8 de la WO 98/01555; en donde R3 representa un grupo metionilado o no metionilado de amina de Cys32 o uno o mas residuos amino-terminales de aminoácidos seleccionados de Cys31 a Leu1; y en donde R4 presenta un grupo carboxi de Cys115 o uno o mas residuos carboxi-terminales de aminoácidos seleccionados de Ala116 a Arg122. En ciertas modalidades, se puede pegilar sTNFR-1. Ciertas formas pegiladas, N-terminales de ejemplo de sTNFR-1 se describen, por ejemplo, en la solicitud PCT publicada No. WO 98/01555. Se nombraron originalmente interferones (IFN) por su capacidad para interferir con infección viral de células hospedadoras (Isaacs y Lindenman, 1957, Proc. R. Soc. 147:28-267) . Desde su descubrimiento, se han identificado varios miembros de la familia de interferones con varios papeles biológicos además de la defensa anti iral, incluyendo crecimiento celular e inmunidad celular. Los miembros de la familia de IFN se clasificaron originalmente en tres grupos de la célula o tejidos de origen; leucocito, fibroblasto e inmunitario. Posteriormente, estas especies de interferones llegaron a conocerse como IFN-OÍ, IFN-ß e IFN-?, respectivamente (Pestka et al., 1997, Semen. Oncol. 24 (suppl 9) : S9-4-SO-17) . Se han descubierto especies adicionales de IFN, y actualmente los interferones se dividen en dos clases en base a tipos comunes de receptor, el receptor tipo I de IFN o el receptor II de IFN (Haque y Williams, 1998, Semen. Oncol. 25 (suppl 1): 14-22; Aguet et al., 1984, Virology 132:211-216; Merlin et al., 1985, J. Gen. Virol. 66:1149-1152) . Los tipos de interferones IF N-a, IFN-ß e IFN-? e IFN-t se unen al receptor tipo I de IFN, en tanto que lFN-? se une al receptor II de IFN (Preffer et al., 1998, Cáncer Res. 58:2489-2499). Los IFN tipo I se producen por virtualmente cada tipo celular y se pueden inducir en la exposición a virus, ARN de doble hebra, polipéptidos y citocinas (Jonasch y Haluska, 2001, The Oncologist 6:34-55) . El IFN-? tipo Ii se produce principalmente en linfocitos T y células aniquiladoras naturales (NK) y se pueden inducir por varios estímulos inmunológicos (id) . La señalización de IFN-? depende de al menos cinco 7 proteínas distintas: IFNGR1 e IFNGR2 (subunidades del receptor de IFN-?) , Jakl, Jak2 y el factor de trascripción STATl (schindler y Damell, 1995, Annu. Rev. Biochem. 64:621-651; Bac et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15:563-591). Se encuentran receptores de IFN-? en la mayoría de los tipos celulares, excepto eritrocitos maduros (farrar y schreiber, 1993, Annu. Rev. Immunol. 11:571-611). Las proteínas Jakl, Jak2 y STATl medían-la señalización de IFN-?. IFN-? regula una variedad de funciones biológicas, tal como respuestas antivirales, crecimiento celular, y supresión de tumor. La actividad antibacteriana parece afectar todas las fases de la infección viral, incluyendo entrada, revestimiento, trascripción, estabilidad de AR , traducción, maduración y montaje y liberación (Id) . IF -? regula el crecimiento celular al inducir o inhibir la apopotosis, dependiendo del tipo celular. Por ejemplo, IFN-? induce a apoptosis de células pre-B murinas pero inhibe apoptosis de células de leucemia linfocítica crónica B (Grawunder et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23:544-551; Rojas et al., 1996, Leucemia 10:1782-1788; Buschle et al., 1993, «T. Exp. Med. 177:213-218). Dependiendo del crecimiento y otras condiciones, el IFN-? también promueve ya sea la proliferación o apoptosis celular en células T humanas malignas (Novelli et al., 1994, J. Immunol. 152:496-504). Una porción grande y creciente de la literatura apoya la hipótesis que IFN-? incrementado o sus moléculas infectoras contribuyen a la patología vista en trastornos auto inmunitarios humanos. Por ejemplo, hay evidencia que IFN-?, o moléculas cuya expresión se favorece por IFN-?, tal como IP-10, HLA-DQ, y neopterina están presentes a niveles incrementados en pacientes con lupus eritematoso sistémico (SLE) , particularmente aquellos con nefritis por lupus (Funauchi et al., 1991, Tohoku J. Exp. Med. 164:259-264; Yokohama et al., 1992, Kidney Int. 42:755-763; Al-Janadi et al., 1993, J. Clin. Immunology 13:58-67; Narumi et al., 2000, Cytokine 12:1561-1565; Lim et al., 1993, Ann. Rheum. Dis. 52:429-435; Samsonov et al., 1995, Lupus 4:29-32). Evidencia adicional viene de un análisis cistológico de tejidos de pacientes con nefritis de lupus, en los cuales se detectó la relación Thl:Th2 en la sangre periférica, y un número bastante incrementado de macrófagos e inmunorreactividad tipo IFN-? en biopsias renales de pacientes con WHO Clase IV en comparación a controles saludables (Masutani et al., 2001, Artritis and Rheumatism 44:2097-2106) . Otro eslabón viene de la identificación de polimorfismos en el receptor de IFN-? que están asociados con una mayor incidencia de SLE (Nakashimi et al., 1999, FEBS Letters 453:187-190). Varios modelos diferentes de animales de nefritis de lupus se han probado con reactivos que bloquean IF -?. Se puede encontrar una descripción comprensiva de estos modelos de animales en Theofilopoulos y Dixon (1985, Advances in Imunology 37:269-). Dos variedades/modelos de ratones considerados pertinentes a nefritis de lupus humano han mostrado ambos efectos benéficos del bloqueo de IFN-?. Estos dos modelos son la variedad de ratón NZB/NZW Fl (BWF1) y la variedad de ratón MRL-Fasi r. Ambas variedades de ratones desarrollaron de forma espontánea enfermedad y un reporte reciente ha identificado un gen inducible por interferón como un gen candidato comprendido en la predisposición a la enfermedad en la variedad NZB de ratones (Rozzo et al., 2001, Iwmunity 15:435-43). En ambas variedades de ratones, se ha realizado la modulación/bloqueo de IFN-? con una variedad de reactivos que incluyen anticuerpos a IFN-?, receptor soluble para IFN-? (tanto para proteína como para construcciones de ADN) , y supresiones génicas. Se han documentado de forma repetida efectos positivos como se mide por producción de auto-anticuerpos, proteinuria, histología y supervivencia (Theophilopoulos et al., 2001, Artritis Res. 3 :136-) . La actividad de IFN-? es esencial para la regulación apropiada de la respuesta inmunitaria. Sin embargo, la actividad incrementada de IF -? puede dar por resultado una condición patológica, tal como trastornos y enfermedades inflamtorias, infecciosas y autoinmunitarias . La inhibición de la actividad excesiva de IFN-? es una estrategia promisoria para tratar pacientes con enfermedades mediadas por IFN-?. IL-18 es una citosina pro-inflamatoria que se encontró que induce interferón-? y se nombró previamente factor de inducción de interferón-gamma (IGIF) . En ciertos casos, se ha mostrado que IL-1 favorece la producción de IL-18, e IL-18 induce producción de varias citosinas proinflamatorias, incluyendo IL-6 y MMP-1. Ver, por ejemplo, Dinarello et al., (1998), J. Leukocyte Biol. 63:658-64. En ciertos casos, la caspasa I también es importante para la producción de IL-18. Por sus experimentos también sugieren que TNF-a regula la producción de IL-18, y que la inhibición simultanea de TNF-a e IL-18 protege contra toxicidad hepática. Ver, por ejemplo Faggioni et al. (2000), PNAS 07:2367-72. IL-18 actúa in vivo a través de un sistema de receptor reminiscente del sistema de IL-1. La IL-18 interactúa con un receptor de la superficie celular (IL-18R) , que interactúa con una proteína accesoria (IL-18RAcP) . La señalización mediada por IL-18 prosigue en la formación del complejo de IL-18, IL-18R, e IL-18RAcP. Un inhibidor natural para IL-18 es IL-18bp. En ciertas modalidades, IL-18bp actúa como un "receptor de señuelo" por unión a moléculas de IL-18 al prevenir la interacción con IL-18R. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a terapias que comprenden al menos un inhibidor de IL-18 y un inhibidor de B7, un inhibidor de CD28, o ambos, y métodos de tratamiento que usan estas terapias . En ciertas modalidades, una terapia comprende un inhibidor de IL-18 de al menos una molécula adicional descrita en la presente. Las condiciones de ejemplo que se pueden tratar de acuerdo a ciertas modalidades incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, inflamación, enfermedades autoinmunitarias, y enfermedades mediadas por IL-1, y enfermedades mediadas por TNF. Las condiciones de ejemplo que se pueden tratar con al menos un inhibidor de IL-18 y al menos una molécula descrita en la presente de acuerdo a ciertas modalidades incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, artritis, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE) ; enfermedad del injerto versus hospedador (GvHD) ; hepatitis; sepsis; y la pérdida de hueso y cartílago que acompaña estas enfermedades. Los inhibidores de IL-18 de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, anticuerpos que se unen a IL-18; anticuerpos que se unen a IL-18R; anticuerpos que se unen a IL-18RAcp; IL-18bp; fragmentos de IL-18R (por ejemplo, un dominio extracelular solubilizado del receptor de IL-18) ; péptidos que se unen a IL-18 y reducen o previenen su interacción con IL-18R; péptidos que se unen a IL-18R y reducen o previenen su interacción con IL-18 o con IL-18RAcP; 2 péptidos que se unen IL-18RCaP y reducen o previenen su interacción con IL-18R; y moléculas pequeñas que reducen o previenen la producción de IL-18 por interacción entre cualquiera de IL-18, y IL-18R e IL-18RAcP. Se describen en ciertos inhibidores de IL-18 por ejemplo en la Patente de los Estados Unidos No. 5,912,324, emitida el 14 de julio de 1994; EP 0 962 531, publicada el 8 de diciembre de 1999; EP 712 931, publicada el 15 de noviembre de 1994; Patente de los Estados Unidos No. 5,914,253 emitida el 14 de julio de 1994; WO 97/24441, publicada el 10 de julio de 1997; Patente de los Estados Unidos No. 6,060,283, emitida el 9 de mayo de 2000; EP 850 952 publicada el 26 de diciembre de 1996; EP 864 585 publicada el 16 de septiembre de 1998; WO 98/41232 publicada el 24 de septiembre de 1998; Patente de los Estados Unidos No. 6,054,487 emitida el 25 de abril del 2000; WO 99/09063, publicada el 14 de agosto de 1997; WO 99/22760 publicada el 3 de noviembre de 1997; WO 99/37772 publicada el 23 de enero de 1998; WO 99/3773 publicada el 20 de marzo de 1998; EP 0 974 600 publicada el 26 de enero del 2000; WO 00/12555 publicada el 9 de marzo del 2000; publicación de patente japonesa JP 111,399/94, publicada el 31 de octubre de 1997; solicitud de patente israelí IL 121554 A0, publicada el 8 de febrero de 19998; que se incorporan en la presente como referencia para cualquier propósito.

B7 es un receptor que media la co- estimulación de células T. B7 se une a dos ligandos separados, el CD28 y el CTI-A.4. La interacción de B7 y CD28 activan las células T. El CTIA4 es un regulador negativo de esta activación. Hay al menos dos receptores de B7 , llamados B7.1 y B7.2. Como se usa en la presente, el término "B7" se refiere a B7.1, B7.2 o tanto a B7.1 como a B7.2. En ciertas modalidades, se pueden usar moléculas solubles de B7 para modular las rutas co- estimuladoras . En ciertas modalidades, las moléculas solubles de CTLA4 se pueden usar para modular las rutas co-estimuladoras . Ciertos moduladores de las rutas co-estimuladoras de células B-T incluyen de manera enunciativa y sin limitación, inhibidores de CD28, B7.1 y B7.2. Ciertos ejemplos incluyen de manera enunciativa y sin limitación, formas solubles de B7.1 o B7.2 y CTIA4. La secuencia B7.1 y ciertos inhibidores derivados de B7.1 de las rutas co-estimuladoras de células B-T se describen en Freeman et al., J. Imnunol. 143, 2714-2722 (1989). La secuencia B7.2 y ciertos inhibidores derivados de B7.2 de las rutas co-estimuladoras de células B-células T se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,942,607. Los receptores de B7 también se describen en la WO 92/00092 y WO 98/58965. La secuencia de CD28 se describe en Aruffo et al., Proc. Nati. Acac. Sci. USA 84, 8573,8579 (1987) . Las moléculas de CD28 también se describen en WO 90/05541, WO 93/19767, WO 94/28912 y EP 0 445 228. Hay una porción extensa de literatura que se refiere a la ruta co-estimuladora en células B/células T que comprende la interacción de CD28 con B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) y la regulación de esta interacción por CTLA4. Se expresan B7.1 y B7.2 en la superficie de linfocitos B activados (Linsley et al. J. Exp. Med. 173, 721-730 (1991); Freeman et al., Science 262, 909-911 (1993)). Tanto B7.1 como B7.2 son receptores para los dos ligandos, CD28 y CTLA4 , expresados en linfocitos T. CD28 se expresa de manera constitutiva en células T en reposo y se incrementa después de la activación en tanto que CTLA4 no se expresa en células T en reposo sino aparece después de la activación (Brunet et al. Nature 328, 267-270 (1987)). La interacción de CD28 con B7.1 y B7.2 proporciona una señal estimuladora para la activación de células T en tanto que CTLA4 se une a B7.1 y B7.2 atenúa la respuesta. Se han construido proteínas de fusión de CTLA4-Ig y se han usado para estudiar los efectos de CTLA4 que se une a B7.1 y B7.2 (ver, por ejemplo WO 93/00431 y WO 97/28267) . La ruta co-estimuladora de' B7 : CD28/CTLA4 se ha implicado en las respuestas inmunitarias mediadas por células T y la manipulación de la ruta es útil en la prevención y tratamiento de una variedad de trastornos, incluyendo artritis reumatoide, enfermedad de injerto versus hospedador, rechazo de injerto, lupus, esclerosis múltiple, psoriasis y otros, tal como trastornos mediados por IL-1 y TNF-alfa mencionados en la presente. Las respuestas inmunitarias mediadas por la ruta co-estimuladora de células B/T se pueden modular por inhibidores de la ruta de CD28/B7. Como se menciona anteriormente, un inhibidor CTLA4. En ciertas modalidades, el CTLA4 se fusiona a una región de inmunoglobulina humana ya sea de forma directa o a través de una o más porciones ligadoras. En ciertas modalidades, CTLA4 comprende aluminio extracelular de CTLA4 que se une a B7.1 y/o B7.2 y que inhibe de forma parcial o completa las respuestas inmunitarias mediadas por la ruta de CD28/B7. En ciertas modalidades, un dominio extracelular de CTLA4 comprende aproximadamente los residuos 1 (metionina) a 124 (antígeno aspártico) de aminoácidos como se muestra en SEQ. ID. No.: 2. Otros polipéptidos de CTLA4 de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, fragmentos que abarcan al menos una porción de un dominio extracelular de CTLA4, fragmentos que se unen a B7.1 y/o B7.2 y que inhiben parcial o completamente las respuestas inmunitarias mediadas por la ruta de CD28/B7. En ciertas modalidades, se puede fusionar un dominio extracelular de CTLA4 a una región de inmunoglobulina humana ya sea directamente o a través de una o más porciones ligadoras.

En ciertas modalidades, los polipéptidos de CTLA4 incluyen variantes que tienen una substitución, supresión o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia mostrada en SEQ. ID. No.: 2. Como se ejemplos no limitantes, una variante de CTLA4 puede tener una substitución de un diferente aminoácido para serina en la posición 25, alanina en la posición 29, treonina en la posición 30, leucina en la posición 104 y/o glicina en la posición 105. Ciertas variantes de CTLA4 no limitantes son como se describen en WO 02/02638. En ciertas modalidades, una variante de CTLA4 tiene una tirosina sustituida por una alanina en la posición 29 y un ácido glutámico sustituido por una leucina en la posición 104 de las secuencias mostradas en SEQ. ?). No.: 2. En ciertas modalidades, las variantes de CTLA4 mencionadas anteriormente están en el dominio extracelular de aproximadamente los residuos 1-124 fusionados a una región de inmunoglobulina humana. Los inhibidores de B7 y CD28 de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación CTLA , CTLA4-Fc, formas solubles de B7.1, formas solubles de B7.2, un anticuerpo de CD28 antagonista, y un anticuerpo de B7 antagonista. En ciertas modalidades, las terapias comprenden al menos uno de ICOS y B7RP1. Ciertos ej emplos incluyen de manera enunciativa y sin limitación, formas solubles de ICOS. Las secuencias de B7RP1 e ICOS se describen en la solicitud publicada de PCT No. WO 00/46240.

En ciertas modalidades, las terapias comprenden al menos uno de CD4P y CD40L. Ciertos ejemplos incluyen de manera enunciativa y sin limitación, formas solubles de CD40. La secuencia de CD40L se describe en la WO 93/08207 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,981,724. La secuencia de CD40 se describe en Stamenkovic et al. EMBO J. 8, 1403 (1989) . Se describen CD40 Abs (que incluyen Abs de antagonista) en la WO 95/09653. Los Abs de ligando de CD40 (incluyendo Abs) se describen en WO 96/40918. En ciertas modalidades, las terapias comprenden al menos uno de CD30 y CD30L. La secuencia de CD30 humano se describe en Durkop et al. Cell 68, 421 (1992) . La secuencia de ligandos de CD30 humano se describe en WO 93/24135. En ciertas modalidades, las terapias comprenden al menos uno de CD27 y CD27L. La secuencia de CD27 humano se describe en Camerini et al. J". -Dnuunol. 147, 3165 (1991) . La secuencia del ligando de CE27 humano se describe en la WO 94/05691. En ciertas modalidades, las terapias comprenden al menos uno de 0X40 y 0X40L. Ciertos ejemplos incluyen las formas solubles de 0X40. La secuencia del ligando de 0X40 humano se describe en Miura et al. Mol. Cell. Biol. 11, 1313 (1991) . En ciertas modalidades, las terapias comprenden al menos uno de 4-1-BB y ligando de 4-1-BB. Ciertos ejemplos incluyen formas solubles de 4-1-BB. Las estructuras de 4-1-BB y ligando de 4-1-BB y ciertos inhibidores de los mismos, se describen en WO 94/26290 y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,674,704 y 6,355,779. En ciertas modalidades, las terapias comprenden al menos uno de TACI, BAFFR y AGP3. Ciertos ejemplos incluyen de manera enunciativa y sin limitación las formas solubles de TACI, BAFFR, el pepticuerpo AGP3 (una fusión de péptido dimérico-Fc en tándem de AGP3) , un anticuerpo anti-BlyS. El pepticuerpo AGP3 se describe en la WO 02/92620. La información de AGP3, TACI y BAFFR está disponible en la WO 01/87977. La secuencia de TACI humano se describe en la WO 98/39361. El ligando para TACI y métodos para detectar inhibidores de la interacción de TACI con sus ligandos se describen en la WO 00/67034. El AGP-3, TACI y BAFFR, e inhibidores de los mismos se describen por ejemplo en la WO 00/47740, WO 01/ 85782, WO 02/15273, WO 98/39361, y von Bulow y Bram (1997) Science 278:138-140. Los inhibidores de TACI, BAFFR y AGP3 de ejemplo incluyen de manera enunciativa y sin limitación, formas solubles de TACI, formas solubles de BAFFR, el péptido cuerpo AGP3, anticuerpo anti-Blys, TACE-Fe, el anticuerpo anti-BLIS, BCMA-Fc y BAFFR-Fe . En ciertas modalidades, las terapias comprenden al menos uno de PD-1 y PD-1L. PD-1 se describe en la WO 93/08207, PD-1L se describe en WO 01/39722. En ciertas modalidades, las terapias comprenden un anticuerpo anti-CD20.

En ciertas modalidades, las terapias comprenden cualquiera de uno o más fármacos antirreumáticos de acción lenta (SAARD) o fármacos anti-reumáticos que modifican la enfermedad (DMARDS) , esteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de una condición inflamatoria o autoinmunitaria, como se define anteriormente, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, inflamación aguda y crónica tal como enfermedades reumáticas (por ejemplo, enfermedad de Lyme, artritis juvenil (reumatoide) , osteoartritis, artritis psoriática, artritis reumatoide y artritis inducida por estafilococos ("séptica"); y esclerosis múltiple. Los SAARD o DMARDS de ejemplo, esteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen de manera enunciativa y sin limitación, alocupreido sódico, auranofina, aurotioglucosa, aurotioglicanido, azatioprina, sodio brequinar, bucilamina, 3 -aurotio-2-propanol-l-sulfonato de calcio, clorambucilo, cloroquina, clobuzarit, cuproxolina, ciclofosfamida, ciclosforina, dapsona, 15-desoxiesoergualina, diacereina, glucosamina, sales de oro (por ejemplo, sale de oro de cicloquina, sodio-tiomalato de oro, sodio-tiosulfato de oro) , hidro ixloroquina, hudrohiurea, quebuzona, levamizol, lobenzarit, melitina, 6-mercaptoputina, metotrexato, mizoribina, micofenolato-mofetil, mioral, mostaza de nitrógeno, D-penicilina, piridol-imidazoles tal como SKNF86002 y SB203580, rapamicina, tioles, timopoyetina, y vincristina. En ciertas modalidades, los SAARD o D ARD estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y antiinflamatorias similares también se proponen para ser abarcados por este grupo. El metotrexato en un fármaco anti-metabolito e inmunosupresor . En ciertas modalidades, el metotrexato es un agente anti-inflamatorio efectivo con utilidad en el tratamiento de psoriasis severa e incapacitante y artritis reumatoide (Hoffmeister (1983) , The American Journal of Medicine, 30/.69-73 y Jaffe (1988), Arthritis and Rheumatism, 31:299). El metotrexato es ácido N- [4- [ (2, 4-diamino-6-pteridinil)metilamino]benzoil] -L-glutámico y tiene la fórmula estructural : HQ0C-" C~ CJ jCH-jCOOH H Las siguientes referencias describen: preparación de metotrexato (Seeger et al. (1949), J. Am. Chem. Soc. , 71:1753 metabolismo de metotrexato (Freeman (1958), J. Pharmacol. Exp. Ther, 122:154 y Henderson et al. (1965), Cáncer Res., 25:1008); toxicidad de metotrexato (Condit et al. (1960), Cáncer, 13:222-249; modelos farmacocinéticos de metotrexato (Bischoff et al. (1970), J. Pharm, Sci . , 59 : 1 9) ; metabolismo y farmacocinéticas de metotrexato (Evans (1980) , Appl, Pharmacokinet . , Williams et al. (eds.), pp. 518-548 (Appl. Ther. , Inc.); farmacología clínica de metotrexato (Bertino (1981), Cáncer Chemother., 3_:359-375 y Jolivet et al. (1983), N. Eng. J. Med., 309 : 1094-1104) ,· y experiencia clínica de metotrexato en artritis reumatoide (Weinblatt et al. (1985), N. Eng. J. Med., 312:818-822; Furst (1985), J. Rheumatol., 12 (12) : 1-14 : Williams et al. (1985), Arthritis R eum., 28_:721-730 y Seitz et al. (1995), British Journal of Rheumatology, 3_4: 502-609) . Adicionalmente, se han emitido numerosas patentes que describen el agente activo metotrexato y métodos para sintetizar metotrexato o compuestos intermedios potenciales en la síntesis de metotrextato: Patentes de los Estados Unidos Nos. 2,512,572, 3,892,801, 3,989,703, 4,057,548, 4,067,867, 4,079,056, 4,080,325, 4,136,101, 4,224,446, 4,306,064, 4,374,967, 4,421,913 y 4,767, 859. Las varias actividades del metotrexato se han demostrado, las cuales contribuyen probablemente a su eficiencia (Segal et al (1990) , Seminars in Arthritis and Rheumatism, 2_0: 190-198) . Se han postulado los siguientes mecanismos de acción para el metotrexato: inhibición de las rutas dependientes de foliado y metabolismo de proteínas metabolism (Morgan et al. (1987), Arthritis and Rheumatism, 3_0: 1348-1356) ; inhibición de la migración de neutrófilos en articulaciones artríticas (Van de Kerkhof et al. (1985), British Journal of Dermatology, 113 : 251-255 ; Ternowitz et al. (1987), Journal of Investigative Dermatology, 189:192-196 y Sperling (1 992), Arthritis and Rheumatism, 35 ¡376-384) ; actividad inhibitoria de IL-6 (Segal (1991) , Arthritis and Rheumatism, 34 (2) : 146-152) y efecto anti-proliferativo específico local de células comprendidas en artritis (Rodenhuis et al. (1987), Arthritis and Rheumatism, 30 ¡369-374) . Se ha mostrado que el metotrexato bloquea la ruta del receptor de interleucina-1 beta/interleucina-1 (Brody et al. (1993) : European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry, 31 (10) : 667-674) ; sin embargo, aunque el metotrexato puede inhibir los efectos . proliferativos de IL-1 y disminuir la producción del monolito IL-1 a corto plazo en ciertos pacientes, este efecto no se sostiene y es improbable explicar la eficiencia a largo plazo del metotrexato (Barrera et al. (1996), Seminars in Arthritis and Rheumatism, 25 (4) :234-253) . En ciertas modalidades, se administra metotrexato en combinación con uno o más compuestos, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación un inhibidor de IL-1, un inhibidor de TNF, un inhibidor de IFN-?, un inhibidor de IL-18, un inhibidor de la ruta de B7/CD28, un inhibidor de la ruta de IC0S/B7RP1, un inhibidor de la ruta de CD40, un inhibidor de la ruta de CD30, un inhibidor de la ruta de CD27, un inhibidor de la ruta de 0X40, un inhibidor de la ruta de 4-1-BB; un inhibidor de la ruta de TACI, BAFFR, AGP3 , un inhibidor de la ruta de PD-1, un inhibidor de la ruta de CD20, y otros compuestos que se pueden usar para tratar inflamación o una condición autoinmunitaria. En ciertas modalidades, se administra metotrexato de forma oral, intraperitoneal, de forma subcutánea, o intravenosa. Por ejemplo, en ciertas modalidades, se puede tratar un paciente humano con una combinación de metotrexato y CTLA4-FC u otro inhibidor de a ruta de B7/CD28. En ciertas modalidades, el paciente toma una tableta o cápsula del metotrexato tres veces por semana, a una dosis semanal total de 5 a 50 mg/semana. En ciertas modalidades por el estilo, el paciente se inyecta de forma intravenosa con CTLA4-FC a una dosis diaria entre 0.1 mg/kg y 100 mg/kg. En ciertas modalidades, las dosis de inicio de los compuestos particulares usados se reducen para un paciente quien exhibe una reacción adversa. En ciertas modalidades, se puede cambiar o reducir uno o más de los fármacos usados en la combinación, por ejemplo, dependiendo de las diferentes formulaciones, rutas, programas de dosis, u otras variables conocidas para aquellos expertos en la técnica, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, la tolerancia del paciente individual al fármaco, su eficiencia y toxicidad.

En ciertas modalidades, el paciente se trata con una dosis de inicio semanal de metotrexato entre 5 mg y 7.5 mg (de formas oral o intramuscular) , y una dosis diaria de CTLA4-Fe entre 0.1 mg/kg y 100 mg/kg de forma intravenosa. En ciertas modalidades, la dosis de metotrexato se incrementa por 5 mg cada dos a tres semanas. En ciertas modalidades, el nivel máximo de dosis se determina en un punto en el cual el paciente muestra mejoras, que en general es menor de aproximadamente 25 mg de metotrexato por semana, en ciertas modalidades, entre 5 a 25 mg de metotrexato por semana. En ciertas modalidades, al final del periodo de cinco días, el paciente se evalúa. En ciertas modalidades, la evaluación incluye examen físico y prueba extensa de laboratorio. En ciertas modalidades, las pruebas incluyen evaluación para toxicidad. En ciertas modalidades, el monitoreo adicional de laboratorio en el caso de metotrexato incluye una cuenta completa de células sanguíneas cada dos semanas durante los primeros tres meses y luego semanalmente de forma posterior. En ciertas modalidades, las precauciones adicionales incluyen valoraciones mensuales de los niveles de albúmina sérica, alanina-amino-transferasa, bilirrubina, creatinina, y nitrógeno de urea sanguínea. En ciertas modalidades, se realiza el urinálisis mensual. En ciertas modalidades, se proporcionan métodos para tratar enfermedades inflamatorias y/o autoinmunitarias .

E En " ciertas modalidades, se proporcionan composiciones farmacéuticas . En ciertas modalidades, los factores co-estimuladores se pueden usar en unión con inhibidores de citocina. Ciertos inhibidores de citocina de ejemplo de interés incluyen de manera enunciativa y sin limitación, inhibidores de IL-1 e inhibidores de TNF-a. En ciertas modalidades, se proporcionan métodos para tratar una enfermedad mediada por IL-1, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de IL-1 y un inhibidor de la activación de células T o células B. En ciertas modalidades, se proporcionan métodos para tratar una enfermedad mediada por TNF-a, el cual comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de TNF-ct y un inhibidor de la activación de células T o células B. En ciertas modalidades, se proporcionan métodos para tratar una condición inflamatoria o autoinmunitaria, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de IL-1, una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de TNF-ot, y un inhibidor de la activación de células T o células B. La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad de etiología desconocida que comprende varios componentes del proceso inflamatorio. Los estudios clínicos y experimentales han mostrado que las células inmunitarias (T y B) junto con las citocinas proinflamatorias crean un desequilibrio en el sistema biológico para provocar inflamación local en las articulaciones. La inhibición de IL-1 (por IL-IRa o Kineret") o TNF-a (por TNFRl soluble, TNFR2 o un anticuerpo anti-TNF-a) se ha mostrado que es benéfico en modelos experimentales de artritis y en pacientes con RA. También, los estudios clínicos experimentales han demostrado la presencia de células T y células B en el tejido afectado. Los inhibidores de células T y células B, tal como el CTLA4-Ig, ha mostrado eficiencia en modelos experimentales de animales cuando se usa de la inducción de artritis . Los estudios han mostrado que el CTLA-4-Ig no es eficaz en los modelos experimentales de animales (artritis inducida con colágeno) , cuando el tratamiento inicia de la evidencia, clínica de artritis inflamatoria. Un papel para la terapia de combinación que modula la función de células T o células B con medicamento anti-citocina proinflamatoria en un modelo de artritis experimental se analiza en los ejemplos 1 a 3. Como en la Artritis Reumatoide, las células T, las células B y las citocinas proinflamatorias están comprendidas en la artritis inducida por colágeno en ratones . En ciertas modalidades de la invención, se pueden tratar cualquiera o más de las siguientes condiciones: infecciones tal como infecciones bacterianas, fúngales, de protozoarios y virales; específicamente VIH-1 o VIH-2; diarrea; psoriasis; inflamación; alergias; dermatitis atópica, enfermedades alérgicas respiratorias tal como asma, renitos alérgica, enfermedad pulmonar de hipersensibilidad, pneumonitis de hipersensibilidad, pneumonía eosinófila (por ejemplo síndrome de Loeffler, neumonía eosinófila crónica, enfermedad intersticial pulmonar (ILD) , tal como fibrosis pulmonar idiomática o ILD asociada con artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, polimiositis o dermatomiositis) ; anafilaxis sistémica o respuestas de hipersensibilidad; alergia por fármacos; alergia por picadura de insecto; enfermedad inflamatoria del intestino, tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa; espondiloartropatia; escleroderma; psoriasis; dermatosis inflamatoria tal como dermatitis, eccema, dermatitis atópica, dermatitis alérgica por contacto, urticaria, vasculitis (por ejemplo, vasculitis necrotizante, cutánea y de hipersinsibilidad) , miositis eosinofílica y facilitis eosinofílica; enfermedades autoinmunitarias tal como artritis reumatoide, artritis psoriática, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, miastemia gravis, diabetes de comienzo juvenil, glomerulonefritis, tiroiditis autoinmunitaria y enfermedad de Behcet; rechazo de injerto incluyendo rechazo del in erto o enfermedad de injerto-versus-hospedador; cánceres con infiltración de leucocitos de la piel u órganos; lesión por reperfusión; aterosclerosis ; ciertas malignidades hematológicas ; choque, incluyendo choque térmico y choque endotóxico. En ciertas modalidades, se puede emplear terapia génica. En ciertas modalidades, un gen (por ejemplo ADN genómico, ADNc y/o ADN sintético) que codifica para un compañero de unión específica de una molécula objetivo, o un fragmento, variante o derivado del mismo, se puede enlazar operativamente a un promotor constitutivo o inducible para formar una "construcción de ADN de terapia génica" . En ciertas modalidades, el promotor puede ser homólogo o heterólogo al gen que codifica para el compañero de unión específica, con la condición que esté activo en la célula o tipo de tejido en el cual se insertará la construcción. Otros componentes de una construcción de ADN de terapia génica pueden incluir, de manera enunciativa y sin limitación, moléculas de ADN diseñadas para la integración específica al sitio (por ejemplo, secuencias de flanqueo endógenas útiles para la recombinación homologa) , promotor específico de tejido, intensificador (es) o lentificador (es) , moléculas de ADN capaces de proporcionar ventaja selectiva con respecto a la célula de origen, moléculas de ADN útiles como marcas para identificar células transformadas, sistemas de selección negativa, agentes de unión específica celular (tal como por ejemplo para objetivo celular) , factores de internalización específicos de la célula, y factores de trascripción para mejorar la expresión de un vector así como factores para permitir la elaboración del vector. En ciertas modalidades, se puede entonces introducir una construcción de ADN de terapia génica en las células de un paciente (ya sea ex vivo o in vivo) . En ciertas modalidades, la construcción de ADN de terapia génica se puede introducir vía vectores virales . Los vectores virales de ejemplo usados para la distribución de construcciones de ADN de terapia génica incluyen de manera enunciativa y sin limitación, adenovirus, virus adeno-asociados , virus de herpes simples, lentxvirus, virus del papiloma, y vectores de retrovirus . En ciertas modalidades, algunos de estos vectores, tal como vectores retrovirales, distribuirán la construcción de ADN de terapia génica al ADN cromosómico de las células del paciente, y la construcción de ADN de terapia génica puede integrarse en ADN cromosómico. En ciertas modalidades, otros vectores funcionarán como epitomas y la construcción de ADN de terapia génica permanecerá en el citoplasma. El uso de vectores de terapia génica se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos No. Nos. 5,672,344, 5,399,346. Los métodos de ejemplo para distribuir las construcciones de ADN de terapia génica a las células de un paciente sin el uso de vectores virales, incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, transferencia mediada por liposomas, inyecció directa de i¾DN desnudo, transferencia mediada por receptor (complejo ligando-ADN) , electroporación, precipitación con fosfato de calcio, y bombardeo con micropartículas (por ejemplo, "pistola génica" ) . Ver, por ejemplo las patentes de los Estados Unidos No. Nos. 4,970,154, O 96/40958, 5,679,559, 5,676,954, y 5,593,875. En ciertas modalidades, los niveles de expresión de un compañero de unión específica en una célula se pueden incrementar vía terapia génica por inserción de uno o más elementos intensificadores en el promotor. En ciertas modalidades, los elementos intensificadores usados se pueden seleccionar en base al tejido en el cual se desea activar los genes, y se seleccionarán los elementos intensificadores conocidos que se conoce que confieren activación del promotor en ese tejido. En ciertas modalidades, el elemento intensificador del promotor lck se puede usar para incrementar la expresión de un compañero de unión específica que se va a expresar en células T. En ciertas modalidades, la porción funcional del elemento trascripcional que se va a adicionar se puede insertar en un fragmento de ¾DN que contiene un promotor para un compañero de unión específica usando técnicas normales de clonación. Esta construcción, conocida como una "construcción de recombinación homologa" entonces se puede introducir en la célula deseada ya sea ex vivo o in vivo. En ciertas modalidades, se puede usar terapia génica para disminuir la expresión de moléculas objetivo al modificar la secuencia de nucleótidos en (los) promotor (es) endógeno (s). En ciertas modalidades, la modificación se puede lograr vía métodos de recombinación homologa. En ciertas modalidades, una molécula de ADN que contiene todo o una porción del promotor de un gen que codifica para una molécula objetivo se puede manejar para remover y/o reemplazar piezas de promotor que regula la trascripción. En ciertas modalidades, la secuencia TATA y/o el sitio de unión de un activador trascripcional del promotor se puede suprimir usando técnicas normales de biología molecular; esta supresión puede inhibir la actividad de promotor, reprimiendo de este modo la trascripción del gen correspondiente de la molécula objetivo. En ciertas modalidades, la supresión de la secuencia TATA o el sitio de unión al activador de transcriptasa en un promotor se puede lograr al genera una construcción de ADN que comprende todo o a la porción pertinente de un promotor en el cual uno o más de los nucleótidos de la secuencia TATA y/o o del sitio de unión al activador trascripcional se muten vía sustitución, supresión y/o inserción de uno o más nucleótidos tal que la secuencia TATA del sitio de unión al activador tenga actividad disminuida o se vuelva completamente inactiva. En ciertas modalidades, esta construcción puede contener al menos aproximadamente 500 bases del ADN que corresponde a las regiones de flanqueo 5' y 3' nativas (endógenas) del segmento del promotor que se ha modificado, y se pueden introducir en las células apropiadas (ya sea ex vivo o in vivo) , ya sea directamente o vía un vector viral como se describe anteriormente. En ciertas modalidades, la integración de la construcción en el ADN genómico de las células puede ser vía recombinación homologa, donde las secuencias de ADN de flanqueo de 5' y 3' en la construcción del promotor puede servir para ayudar a integrar la región modificada del promotor vía hibridación al ADN cromosómico endógeno. En ciertas modalidades, también se pueden emplear otros métodos de terapia génica donde es deseable inhibir una o más moléculas objetivo. En ciertas modalidades, se pueden introducir en la célula moléculas de ADN o ARN antisentido, que tienen una secuencia que es complementaria a al menos una porción de un gen seleccionado de la molécula objetivo. En ciertas modalidades, cada molécula antisentido será complementaria al sitio de inicio (extremo 5') de cada gen seleccionado de la molécula objetivo. Cuando la molécula antisentido entonces híbrida al ARNm correspondiente que codifica para una molécula objetivo, se previene la traducción de este ARNm. En ciertas modalidades, se puede emplear terapia génica para crear un inhibidor negativo a dominante de una o más moléculas objetivo. En ciertas modalidades, el ADN que codifica para un polipéptido mutante de longitud completa de truncado de cada molécula objetivo seleccionada se puede preparar al introducir unas células de un paciente usando ya sea métodos virales o no virales como se describe anteriormente. En ciertas modalidades, cada mutante se puede adicionar para competir con una molécula objetivo endógena en su papel biológico. En ciertas modalidades, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de ciertas moléculas particulares junto con un diluyente, portador, solubilizador, emulsionador, conservador y/o adyuvante farmacéuticamente aceptables . En ciertas modalidades, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden ciertas moléculas particulares, junto con un diluyente, portador, solubilizador, emulsionador, conservador y/o adyuvante farmacéuticamente aceptables. En ciertas modalidades, los materiales aceptables de la formulación son preferentemente no tóxicos a los receptores a las dosis y concentraciones empleadas . En ciertas modalidades, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. En ciertas modalidades, los materiales adecuados de formulación, incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, aminoácidos (tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina) ; antimicrobianos; antioxidantes (tal como ácido ascórbico, sulfito de sodio o sulfito ácido de sodio) ; amortiguadores (tal como borato, bicarbonato, tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos) ; agentes de volumen (tal como manitol o glicina) ; agentes quelantes (tal como ácido etilendiamina-tetraacético (EDTA) ) , agentes de formación de complejos (tal como cafeína polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina) ; agentes de relleno; monosacáridos ; disacáridos; y otros carbohidratos (tal como glucosa, mannosa o dextrinas) ; proteínas (tal como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulina) ; agentes colorantes, saborizantes, y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tal como polivinil-pirrolidona) ; polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones formadores de sal (tal como sodio) ; conservadores (tal como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, trimerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrogeno) ; solventes (tal como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol) ; alcoholes de azúcar tal como mannitol o sorbítol) ; agentes de suspensión; agentes tensioactivos o agentes humectantes (tal como pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polisorbatos tal como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal) ; agentes que mejoran la estabilidad (tal como sacarosa o sorbitol) ,· agentes mejoradores de tonicidad (tal como haluros de metales alcalinos, preferentemente cloruro de sodio o potasio, mannitol, sorbitol) ; vehículos de distribución; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed. , Mack Publishing Company (1990). En ciertas modalidades, una o más de las moléculas están enlazadas a un vehículo que extiende la vida media, conocido en la técnica. Estos vehículos incluyen, de manera enunciativa y sin imitación el dominio Fe, polietilenglicol, y dextrano. Estos vehículos se describen, por ejemplo en la solicitud PCT publicada No. O 00/24782, que se incorpora de este modo con la referencia para cualquier propósito. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica óptima se determinará por un experto en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la ruta propuesta de administración, el formato de distribución y la dosis deseada. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. En ciertas modalidades, estas composiciones 145 pueden tener influencia en el estado físico, estabilidad, velocidad y liberación in vivo y velocidad de depuración in vivo de los anticuerpos de la invención. En ciertas modalidades, el vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o fluido cerebroespinal, artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en las composiciones para la administración parenteral. En ciertas modalidades, la solución salina amortiguada neutral o solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos adicionales de ejemplo. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden amortiguador Tris de aproximadamente pH 7.0-8.5, amortiguador de acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5, se puede incluir adicionalmente sorbitol o un sustituto adecuado para el mismo. En ciertas modalidades, se puede preparar una composición que comprende ciertas moléculas particulares para el almacenamiento al mezclar la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes opcionales de formulación (Remington' s Pharmaceutical Sciences, supra) en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Adicionalmente en ciertas modalidades, se puede formular una composición que comprende ciertas moléculas particulares como un liofilizado usando excipientes apropiados, tal como sacarosa. En ciertas modalidades las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden seleccionar para la distribución parenteral. En ciertas modalidades, las composiciones se pueden seleccionar para inhalación o para distribución a través del tracto digestivo, tal como de forma oral. La preparación de estas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la habilidad de la técnica. En ciertas modalidades, los componentes de la formulación están presentes en concentraciones que son aceptables al sitio de administración. En ciertas modalidades, se usan amortiguadores para mantener la composición a pH fisiológico o un pH ligeramente menor, típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. En ciertas modalidades, cuando se contempla la administración parenteral, una composición terapéutica puede estar en la forma de una solución acuosa, parenteralmente aceptable libre de pirógenos que comprende las moléculas particulares deseadas en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, un vehículo para inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual se formulan ciertas moléculas particulares como una solución isotónica estéril, adecuadamente conservada. En ciertas modalidades, la preparación puede comprender la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, compuestos poliméricos (tal como ácido poliláctico o ácido poliglicólico) , cuentas o liposomas, que pueden proporcionarse para la liberación controlada o sostenida del producto que entonces se puede distribuir vía una inyección de deposito. En ciertas modalidades, también se puede usar ácido hialurónico, y puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. En ciertas modalidades, se pueden usar dispositivos implantables de distribución de fármacos para introducir la molécula deseada. En ciertas modalidades, se puede formular una composición farmacéutica para inhalación. En ciertas modalidades, se pueden formular ciertas moléculas particulares como un polvo seco para inhalación. En ciertas modalidades, una solución de inhalación que comprende ciertas -moléculas particulares se puede formular como un propulsor para la distribución por aerosol. En ciertas modalidades, se pueden nebulizar las soluciones . La administración pulmonar se describe adicionalmente en la solicitud PCT No. PCT/US94/001875, que describe la distribución pulmonar de proteínas químicamente modificadas. En ciertas modalidades, se contempla que las formulaciones se pueden administrar de forma oral. En ciertas modalidades, ciertas moléculas particulares que se administran de esta manera se pueden formular con o sin portadores habxtualmente usados en el mezclado de las formas sólidas de dosis tal como tabletas y cápsulas. En ciertas modalidades, se puede diseñar una cápsula para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal donde se aumente al máximo la bio-disponibilidad y se reduzca al mínimo la degradación pre-sistémica. En ciertas modalidades, se puede incluir al menos un agente adicional para facilitar la absorción de ciertas moléculas particulares. En ciertas modalidades, también se pueden emplear, diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión agentes de desintegración de la tableta, y aglutinantes . En ciertas modalidades, una composición farmacéutica puede comprender una cantidad efectiva de ciertas moléculas particulares en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la elaboración de tabletas . En ciertas modalidades, al disolver las tabletas en agua estéril, u otro vehículo apropiado, se pueden preparar soluciones en la forma de dosis unitaria. En ciertas modalidades, los excipientes adecuados incluyen de manera enunciativa y sin limitación, diluyentes inertes tal como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o sulfato de calcio; o agentes de unión, tal como almidón, gelatina o acacia; o agentes lubricantes tal como estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco. Las composiciones f rmacéuticas adicionales serán evidentes para aquellos expertos en la técnica incluyendo formulaciones que comprenden ciertas moléculas particulares en formulaciones de distribución sostenida o controlada. En ciertas modalidades, las técnicas para formular una variedad de otros medios de distribución controlada o sostenida tal como portadores de liposoma, micropartlculas bio-erosionables o cuentas porosas e inyecciones de depósito, se conocen también por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, la solicitud de PCT No. PCT/US93/00829 que describe la liberación controlada de micropartlculas polimericas porosas para la distribución de composiciones farmacéuticas. En ciertas modalidades, las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices polimericas semipermeables en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas o microcápsulas las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (U.S 3,773,919 y EP 058,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., J Biomed Mater. Res., 15:157-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), etileno-acetato de vinilo (Langer et al., supra) o ácido poli-D(-) -3-hidroxibutírico (EP 133,988). En ciertas modalidades, las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que se pueden preparar por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Eppstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036,676; EP 088,046 y EP 143,949. La composición farmacéutica que se va a usar para la administración in vivo es típicamente estéril en ciertas modalidades, esto se puede lograr con filtración a través de membranas estériles de filtración. En ciertas modalidades, donde la composición se liofiliza, la esterilización usando este método se puede llevar a cabo ya sea antes de o después de la liofilización y reconstitución. En ciertas modalidades, la composición para la administración parenteral se puede almacenar en forma liofilizada o en una solución. En ciertas modalidades, las composiciones parenterales se colocan en general en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja hipodérmica de inyección. En ciertas modalidades, una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, se debe almacenar en frascos estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o como un polvo deshidratado o liofilizado. En ciertas modalidades, estas formulaciones se pueden almacenar ya sea en una forma lista para usarse o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstruye antes de la administración. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a equipos para producir una unidad de administración de dosis única. En ciertas modalidades, los equipos pueden contener cada uno tanto un primer recipiente que tiene una proteína seca como un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. En ciertas modalidades de esta invención, se incluyen equipos que contienen jeringas pre-rellenas de cámara individual y de múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas de líquidos y lio-jeringas) . En ciertas modalidades, la cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende ciertas moléculas particulares que se van a emplear de manera terapéutica dependerá, por ejemplo, del contexto terapéutico y de los objetivos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles apropiados de dosis para el tratamiento, de acuerdo a ciertas modalidades, variarán de esta manera dependiendo, en parte de la molécula distribuida, la indicación para la cual se estén usando ciertas moléculas particulares, la ruta de administración y el tamaño (peso corporal, superficie del cuerpo o tamaño del órgano) y/o condición (la edad y salud general) del paciente. En ciertas modalidades, el facultativo puede titular la dosis y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. En ciertas modalidades, una dosis típica puede variar de aproximadamente 0.1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En ciertas modalidades, la dosis puede variar de 0.1 µ9/¾^ hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg, o 5 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg. En ciertas modalidades, la frecuencia de dosificación tomara en cuenta los parámetros farmacocinéticos de ciertas moléculas particulares en la formulación usada. En ciertas modalidades, un facultativo administrará la composición hasta que se alcance una dosis que logre el efecto deseado. En ciertas modalidades, la composición se puede administrar por lo tanto como una dosis individual, o como dos o más dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de la molécula deseada) durante el tiempo, o como una intuición continúa vía un dispositivo de implantación, o catéter. La refinación adicional de la dosis apropiada se hace por rutina por aquellos expertos en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas realizadas rutinariamente por los mismos. En ciertas modalidades, se pueden averiguar las dosis apropiadas a través del uso de datos apropiados de dosis-respuesta. En ciertas modalidades, la ruta de la administración de la composición farmacéutica está de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo, de forma oral, a través de inyección por rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-párenquimal) , intracerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial, intraportal, o intralesional; por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación. En ciertas modalidades, las composiciones se pueden administrar por inyección de bolo o de forma continúa por infusión, o por un dispositivo de implantación. En ciertas modalidades, la composición se puede administrar de manera local vía implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado en el cual se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. En ciertas modalidades, donde se usa un dispositivo de implantación el dispositivo se puede implantar en cualquier tejido u órgano adecuado, y la distribución de la molécula deseada puede ser vía infusión, bolo liberado de forma programada, o administración continúa. En ciertas modalidades, puede ser deseable usar una composición farmacéutica que comprende ciertas moléculas particulares de una manera ex vivo. En estos casos, las células, tejidos y/o órganos que se ha removido del paciente se exponen a una composición farmacéutica que comprende ciertas moléculas particulares después de las cuales las células, tejidos y/o órganos se implantan de manera subsiguiente de regreso en el paciente. En ciertas modalidades, ciertas moléculas particulares se pueden distribuir al implantar ciertas células que se han manejado genéticamente, usando métodos tal como aquellos descritos en la presente, para expresar y segregar los polipéptidos . En ciertas modalidades, estas células pueden ser células animales o humanas, o pueden ser autólogas, heterólogas, o xenogenéicas . En ciertas modalidades, las células se pueden inmortalizar. En ciertas modalidades, a fin de disminuir la oportunidad de una respuesta inmunológica, las células se pueden encapsular para evitar la infiltración de los tejidos circundantes. En ciertas modalidades, los materiales de encapsulación son típicamente biocompatibles, encierros o membranas poliméricas semipermeables que permiten la liberación del (los) producto (s) de proteína, pero impide la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.

Ejemplos Para los siguientes ejemplos, el CTLA -Fe murino se derivo de CTLA4 murino (SEQ ID NO.19) . Para los siguientes ejemplos, el Adyuvante Completo de Freund (CFA) se obtuvo de Difco (Detroit, MI) . Para los siguientes ejemplos, se compró colágeno porcino tipo II de grado de inmunización de Griffith's lab (University of Utah, Salt Lake City).

Ejemplo 1 Terapia de combinación que usa KIN2 y CTLA4-FC en ratones B10.RIII susceptibles a artritis El CTLA4 -Fe murino y KIN2 (SEQ ID NO 2) usados en el estudio se compraron de Amgen. A. Preparación de ejemplo de KIN2 Se puede producir KIN2 como se describe en general en la patente de los Estados Unidos No. 6,294,170 Bl (la patente ?70) . La proteína de fusión Fe-IL-lra analizada en la patente '170 de esa misma como KIN2 analizada en la presente . IL-lra humano recombinante de ejemplo en la patente '170 La patente '170 analiza un fragmento génico de IL-lra que se escinde enzimáticamente de otro vector de expresión y que se liga al vector de expresión pAMG21 (solicitud de patente Europea No. 96309363.8). La secuencia de aminoácidos de IL-lra es: MRPSGRKSSK MQAFRIWDVN QKTFYLRNNQ LVAGYLQGPN VNLEEKIDV PIEPHALFLG IHGGKMCLSC V SGDETRLQ LEAWITDLS EN KQD RF FIRSDSGPTT SFESAACPG FLCTA EADQ PVSLT MPDE GVMVTKFYF EDE (SEQ ID NO. 20) La patente '170 analiza que el plásmido resultante pAMG21-lL-lra se purificó y se confirmó por secuenciación la secuencia del gen de IL-lra. La patente '170 analiza que ese plásmido (pAMG21-IL-lra) (Solicitud de Patente Europea No. 96309363.8) se uso posteriormente para la clonación de la proteina rhuIL-lra-Fc . La patente ?170 señala que se construyo una proteina de fusión rhuIL-lra donde la región Fe de IgGl humana se fusionó en el N-termino del IL-lra humano.

La secuencia de Fe que se eligió para las fusiones en la patente x170 se muestra a continuación. Se presentan ocho residuos de aminoácido AAAEPKSS en el N-terminó de la región Fe funcional. Secuencia de aminoácidos de Fc3A C8S: AAAEPKSSDK THT.CPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKP DTLM ISRTPEVTCV WDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLOMG EYKC VSNKALPAPI EK ISKAKGO PREPQVYTL PSRDELTKNQ VSLTCLV GF YPSDIAVEWE SNGQPEMNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSV HEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO. 22 La secuencia subrayada se adiciono a la región Fe.

Descripción de ejemplo de cepa hospedadora de E. coli en la patente ''170 La patente 170 analiza que un derivado de E. coli 1485 (una cepa de K12) se obtuvo del E. coli Genetic Stock Center Yale üniversity, New Haven, CT (CGSC cepa #6159) . La cepa es prototrófica, no contiene prófago lambda y se ha curado en el factor sexual, F. La patente 1170 señala que la cepa #6159 de CGSC sea alterado al seleccionar para resistencia espontánea a cuatro diferentes fagos aislados de epidemias de fago que se presentaron tanto que se llevo a cabo la investigación en fermentación. La patente 1170 señala que una primera ronda del aislamiento de mutante resistente a fago, que confiere resistencia simultáneamente a dos de los cuatro fagos, se realizo. La patente 4170 señala que se diluyó una muestra de uno de los fagos y se mezcló con un cultivo de la cepa sensible y se incubo como un cultivo liquido a 37°C durante 16-24 horas para seleccionar los supervivientes resistentes a los fagos. La patente 170 señala que se aislaron candidatos de colonias individuales y se probaron para confirmar la resistencia a los fagos y la capacidad para crecer en medio mínimo. La patente *170 señala que la mutación obtenida en la primera ronda de selección exhibe ciertas características de una mutación tonA ya que la cepa adquirió simultáneamente resistencia a los fagos T5 y 080. La patente '170 señala que una segunda selección de resistencia a fagos, que confiere resistencia al tercer fago, se realizó el 15 de Mayo de 1984. La patente 170 señala que los mutantes espontáneos resistentes a los fagos se obtuvieron usando un método de placa. Las superficies de las bacterias sensibles se mancharon con una suspensión de fagos y se incubaron a 37°C durante dos días. Los supervivientes se aislaron de las colonias en la zona de lisis . Se probaron para el crecimiento en medio mínimo, eficiencia normal de transformación de plásmido, velocidad normal de crecimiento en medio complejo, y nivel normal de síntesis de producto. La patente '170 señala que se ha correlacionado la mutación que confiere resistencia a este fago en el sitio btu de E. coli. La patente '170 también analiza una tercera ronda de selección de resistencia a fagos realizado usando el método de placa descrito anteriormente. La patente '170 señala que el mutante purificado apareció normal por aquellos criterios resumidos anteriormente (crecimiento en medio mínimo y complejo, eficiencia de transformación y nivel de síntesis de productos) . Preparación de Ejemplo de Fc-rhuIL-lra en la Patente '170 La patente ?70 señala que el sitio SacII en la región Fe y el sitio SacI único en el gen de IL-lra se usaron para la clonación. El fragmento SacII-SacI se sintetizó usando tecnología normal de PCR. Las plantillas para las reacciones de PCR fueron preparaciones de plásmido (pAMG21-OPG-Fc y pAMG21-IL-lra) que contienen los genes objetivos. La patente ?70 señala que los oligos de traslape se diseñaron para combinar la porción C-terminal del gen Fe con la porción N-terminal del gen de IL-lra. La patente ?70 señala que este proceso permite la fusión de los dos genes de forma conjunta en el cuadro de lectura correcto después de que se han realizado las porciones apropiadas de PCR. Inicialmente, un oligo de "fusión" para cada gen, el Oligo # 1561-57 para Fe y # 1561-56 para IL-lra, se puso en una reacción de PCR con un cebador 5' al SacII en Fe (# 1561-55) o el sitio SacI en IL-lra (# 1561-58) . Al final de esta primera reacción de PCR, se obtuvieron dos productos separados, con cada gen individual que tiene presente el sitio de fusión. En la segunda ronda de PCR, los primeros dos productos de PCR se combinaron junto con los dos cebadores exteriores (# 1561-55 y 1561-58) y se produjo la secuencia de ADN de fusión de longitud completa. La patente '170 señala que los productos génicos finales de PCR se digirieron con las endonucleasas de restricción SacII y SacI, y se llevó a cabo una ligación de tres días con el fragmento Clal-SacII Fe con la secuencia parcial de pAMG21 aislada de pAMG21-Fc-OPG y el fragmento del vector Clal-SacI con la secuencia parcial de IL-lra aislada de pAMG21-IL-lra. La mezcla de ligación se transformó en un transformador E. coli por electroporación utilizando el protocolo del fabricante. La patente ' 170 señala que se detectaron clones para la capacidad para producir el Fc-rhuIL-lra recombinante y para poseer la fusión génica que tiene la secuencia correcta de nucleótidos . Se adicionó un residuo de metionina a la unión de la región Fe y el rhuIL-1ra, pero que no interfiere con la actividad de la proteína de fusión. La patente ¾170 señala que los siguientes cebadores se usaron para construir éste Fc-rhuIL-lra: 1 1651-55 CCA CGA AGA CCC TGA GGT C (SEQ ID NO. 23) 1561-56 GGG TAA AAT GCG ACC GTC CGG CCG TAA G (SEQ ID NO. 24) 1561-57 GGA CGG TCG CAT TTT ACC CGG GCT GAG C (SEQ ID NO. 25) 1661-58 CTG GTT GTT GCG CAG GTA G (SEQ ID NO. 26) Expresión de Ejemplo de Proteínas de Fusión Fc-IL-lra en E. coli en la Patente ?70 La patente 1170 señala que la secuencia de ADN que codifica para la proteína de fusión Fc-IL-lra se colocó bajo el control del promotor luxPR en pAMG21 (Patente de los Estados Unidos No. 5,169,318 para la descripción del sistema de expresión lux) . La Patente ?70 señala que los cultivos de pAMG21-Fc-IL-lra y el hospedador de E. coli se colocaron en medio de caldo Terrífico (Tartof. y Hobbs (1987), Bethesda Res. Lab. Focus, 9:12) que contiene 50 /t?1 de canamicina y se incubaron a 30 °C a una OD600 de aproximadamente 0.8 antes de la inducción. La inducción de la expresión del producto génico recombinante a partir del promotor luxPR del vector pAMG21 se logró después de la adición del autoinductor sintético, N- (3-oxohexanoil) -DL-homoserina-lactona al medio de cultivo a una concentración final de 30 ng/ml y con ¡incubación a.37°C durante 6 horas adicionales. Después de 6 horas, se agotaron los cultivos bacterianos por centrifugación. Los cultivos agotados se re-suspendieron, se lisaron por tratamiento con sonido, y las fracciones solubles e insolubles se separaron por centrifugación. El lisado celular completo y las fracciones solubles e insolubles se analizaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y por transferencia Western. La patente ¾170 señala que los cultivos inducidos a 37°C tienen cuerpos de inclusión, y más del 70 % del producto esta en la fracción insoluble. Purificación de Ejemplo de la proteína de fusión Fc-IL-lra Los cuerpos de inclusión (IB) se pueden mezclar a una concentración de 1:10 (peso/volumen) con una solución de clorhidrato de guanidina 8M, EDTA 3 mM, ditioeritritol 10 mM y ácido 2-n-ciclohexilamino-etanosulfónico 10 mM pH 9.3, y se agitaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Entonces se puede adicionar urea sólida para hacer la concentración final de urea a 4M. Adicionalmente se puede agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 40 minutos. Con la agitación, los cuerpos de inclusión solubilizados se pueden diluir lentamente, gota por gota, a una concentración de 1:20 (vol./vol.) en el amortiguador de replegado de 1,3-Dimetil-Urea 2.5 M a Arg 0.2 M, cisteína 4.5 mM y diclorhidrato de cistamina 1 mM, pH 8.8. La mezcla entonces se puede colocara 4°C durante la noche, sin agitación. La mezcla replegada se puede centrifugar durante 1 hora en una centrífuga J6-B. El sobrenadante resultante se puede concentrar 3 veces y el amortiguador se cambia en tris 25 mM pH 8.8 con un sistema de ultrafiltración. El producto retenido se puede titular por HCl 6M a pH 6.5. Se puede formar algo de precipitado a pH 6.5 y se puede descartar después de que se centrifugue durante 1 hora en la centrifuga J6-B. El sobrenadante de la ultrafiltración se puede hacer pasar a través de una columna de resina Q de Alto Desempeño (QHP) (15 g IB'/50 mi) (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) puesta en pre-equilibrio con amortiguador de ácido 2-n-morfolinoefano-sulfónico 20 mM pH 6.5. El flujo de la QHP (QFT) y las fracciones eluidas tempranamente de la columna QHP que contienen el producto, se pueden recolectar. Se puede adicionar sulfato de amonio sólido en la mezcla de Q-FT a una concentración de 0.7 M. La muestra entonces se puede cargar en una columna P enil-toyo (Toso Haas, Philadelphia, ??) (15 g IB's/15 mi resina) puesta en pre-equilibrio con sulfato de amonio 0.7 M en fosfato de sodio 20 mM, pH 7.0. Después del lavado con sulfato de amonio 0.7 M, la columna se puede eluir con un gradiente lineal de sulfato de amonio 0.7 M a sulfato de amonio 0.2 M en amortiguador de fosfato de sodio 20 mM, pH 7.0. Las fracciones que contienen el producto se pueden mezclar en base al análisis de SDS-PAGE. La mezcla de HIC se puede dializar en fosfato de sodio 25 mM pH 7.0. La muestra dializada se puede titular por ácido cítrico 2 M a pH 5.0, y luego se carga en una columna SOHO (15 g IB's/7 mi resina) puesta en pre-equilibrio con ácido cítrico 20 mM, pH 5.0. Después del lavado con amortiguador de ácido cítrico 25 mM, pH 5.0 y pH 6.0, la columna se puede eluir con un gradiente lineal desde 0 M a 0.7 M de NaCl en amortiguador de ácido cítrico 25 mM pH 6.0. Se pueden mezclar las fracciones que contienen el producto . B. Terapia en Ratones Se disolvió colágeno tipo II porcino en ácido acético 0.01 N a una concentración de 2 mg/ml y luego se emulsionó a una relación 1.· 1 con CFA (Difco) . Se inmunizaron ratones B10.RIII (?-2') susceptibles a artritis (de Jackson Lab, Bar harbor, Maine, EUA) con 100 µ? de emulsión de forma intradérmica en la base de la cola (Nabozny et al. Autoimmunity 20, 39-49 (1995)). Los ratones se monitorizaron una vez cada día para el desarrollo de artritis . Se determinó la severidad de la artritis usando un sistema gradiente (Khare et al. J. Immunol., 155: 3653-3659, 1995) para cada pata como sigue: 0: ninguna artritis; 1: flojees o hinchazón de 1-3 dedos; 2: hinchazón severa de pata; 3: anquilosis de articulación. La puntuación de cada extremidad se sumó, dando de esta manera un intervalo de severidad de 0 a 12 para cada animal . Las puntuaciones para los ratones se sumaron y se dividieron por el número total de ratones para generar una puntuación promedio de artritis . Conforme los ratones desarrollaron la enfermedad, se aleatorizaron para estudiar los grupos (9-10 ratones/grupo) y se inicio el tratamiento. Antes de las inyecciones, se dispersó KIN2 en A5S (amortiguador de A5S incluye Ácido Acético 10 mM y Sorbitol al 5 %, pH 5.0) y se dispersó CTLA4-FC murino en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Los ratones se trataron por inyección de 100 µg de KIN2, 100 g de CTLA4-FC murino, o 100 µg cada uno de KIN2 y CTLA4-FC murino en el día 0, +1, +2, +4, +6, +8, y +10 después del comienzo clínico de la enfermedad. 100 µg es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por Kg de peso de animal (5 mg/kg) . Los ratones se inyectaron en volúmenes de 100 µ?, excepto en el experimento de combinación, en donde los ratones recibieron dos inyecciones separadas de 100 µ? cada una. Se usaron inyecciones de PBS como un control. Se monitorizaron ratones una vez cada día y se calculó una puntuación promedio de artritis . KIN2 redujo la severidad de la artritis inducida por colágeno en ratones cuando se da solo en tanto que el CTLA4-Fe murino dado solo no tiene efecto en comparación al control con PBS . La combinación de IN2 y CTLA4-Fc murino redujo la artritis inducida por colágeno durante un -periodo prolongado de tiempo en comparación a IN2 solo, como se muestra en la Figura 1. Ejemplo 2 Terapia de combinación usando PEG-sTNFR-1 y CTLA4-FC en ratones B10.RIII susceptibles a artritis El PEG-sTNFR-1 2.6D, el CTLA4 -Fe murino, y Fe usado en el estudio se produjeron en Amgen. A. PEGilación de Ejemplo de sTNFR-l Se adicionó PEG a una molécula de sTNFR-l 2.6D a la construcción PEG sTNFR-l 2.6D. Las moléculas de sTNFR-l 2.6D, incluyen de manera enunciativa y sin limitación, sTNFR-l 2.6D/C105, STNFR-l 2.6D/C106, y STNFR-l 2.6D/N105 /SEQ ID NO. 4). Se puede adicionar PEG a una molécula de sTNFR-l 2.6D de una manera similar a como se puede adicionar PEG a sTNFR-l 2.6D/N105, como se describe en general en la solicitud PCT publicada No. WO 98/01555 (PCT ?555) . Preparación de Ejemplo de sTNFR-l 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) en la PCT '555 La PCT 555 señala que a una solución agitada, enfriada (4°C) de sTNFR-l 2.6D/N105 (SEQ ID NO. 4) (3.5 mg/ml) en acetato de sodio 50 mM, pH 4, se adiciona un exceso molar de 3 veces de t-BuPEG (mono-t-butoxi-polietilenglicol, MW promedio = 33kDa, Shearwater Polymers, Inc.). Se adicionó NaCNB¾ a una concentración final de 20 mM, y la mezcla de reacción se agitó a 7°C durante 18-24 horas. La PCT '555 señala que el grado de modificación de proteína durante el transcurso de la reacción se monitorizó por HPLC de SEC usando una columna TSKG3000swXi (Toso Haas, Montgomeryville, PA) fluyendo con amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M, pH 6.9, NaCl 0.5 M, y etanol al 10 % a 0.7 ml/min (Toso Haas, Montgomeryville, PA) . La PCT *555 señala que el pH de la mezcla de reacción se ajusta a aproximadamente 3.5 con HC1 1M, y la mezcla de reacción se diluye con agua a una concentración final de proteína de 1.5 mg/ml. La PCT ?555 señala que sTNFR-l 2.6D/N105-t- BuPEG (33kDa) se separa del exceso de t-BuPEG y otros sub-productos de reacción usando una cromatografía de intercambio iónico ?? Sepharose HP 16/10" (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) . La PCT *555 señala que la mezcla de reacción se carga en la columna y el t-BuPEG sin reaccionar se eluye con 3 volúmenes de columna del Amortiguador A de inicio (acetato de sodio 20 mM, pH 4.0). El sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) se eluye usando un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna de Amortiguador B de 0.30 % (NaCl 1M en acetato 20mM, pH 4.0). El eluyente se monitoriza a 280 nm. Cada fracción que contiene sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) se analiza por SDS-PAGE usando geles de gradiente prefijado de 4-20 % (Novex, San Diego, CA) . En base a los resultados del análisis de SDS-PAGE, las fracciones se mezclan, se concentran y se filtran estériles. Cada mezcla final de sTNFR-1 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) purificado se analiza nuevamente por SDS-PAGE y HPLC de SEC. Esta proteína se formula en fosfato de sodio 10 mM, pH 6.5 y NaCl 20 mM. Preparación de Ejemplo de sTNFR-l 2.6D/Nl05-33kDa (MePEG) en la PCT '555 La PCT '555 señala que a una solución agitada, enfriada (7°C) , de sTNFR-1 2.6D/N105 (4 mg/ml) se adiciona ácido acético al 10 % hasta que el pH sea 5.0. A esta solución se adiciona NaCNBH3 15 mM y un exceso molar de 2 veces de t-butoxi-PEG (t-butoxi-polietilenglicol, M promedio =33kDa, S earwater Polymers, Inc.). La mezcla de reacción se agita brevemente a la misma temperatura y luego se deja incubar durante aproximadamente 18 horas. La PCT ?555 señala que después de 18 horas, la concentración de la proteína en la mezcla de reacción se ajusta a pH 3.0 con ácido cítrico. La .PCT >555 señala que sTNFR-1 2.6D/N105-MePEG (33kDa) se separa del exceso de MePEG y otros subproductos de reacción por cromatografía de intercambio iónico usando una columna SP Sepharose HP1411 (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) .

La PCT "555 señala que la mezcla de reacción se carga (no más de 8 mg/ml de resina) en la columna y el MePEG sin reaccionar se eluye con 3 volúmenes de columna del amortiguador A de inicio (citrato de sodio 20 mM, pH 3.0). El sT F -l 2.6D/N105-MePEG(33kDa) se eluye usando un gradiente lineal de 16 volúmenes de columna de NaCl 0.1 - 0.5 M en citrato 20 mM, pH 3.0. El eluyente se monitorea a 280 nm. Cada fracción que contiene TNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33kDa) se analiza por SDS-PAGE usando geles de gradiente prefijado de 4-20 % (Novex, San Diego, CA) . En base a los resultados de análisis de SDS-PAGE, se mezclaron las fracciones, se concentraron y se filtraron estériles. Cada mezcla final de sTNFR-l 2.6D/N105-MePEG(33kDa) purificado se analizó nuevamente por SDS-PAGE. El sTNFR-l 2.6D/N105-MePEG (33kDa) purificado se concentra a 5 - 20 mg/mL y se formula ya sea en PBS, pH 6.5 (fosfato de sodio 10 mM , NaCl 35-100 mM) o acetato 20 mM, NaCl 100 mM, pH 5.0. B . Terapia en Ratones Se indujo artritis en ratones B10.RIII por inyección con colágeno tipo II porcino como se describe en el Ejemplo 1. Antes de las inyecciones, el CTLA4-Fc murino y el PEG-sTNFR-1 2.6D se suspendieron en PBS. Los ratones se administraron por inyección de 100 µg de PEG sTNFR-l 2.6D, 100 µg de CTLA4 -Fe, murino, o 100 µg cada uno de PEG-sTNFR-1 2.6D y CTLA4-FC murino en el día 0, +1, +2, +4, +6, +8, y +10 después del comienzo clínico de la enfermedad . 100 µg es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por Kg de peso de animal (5 mg/kg) . Se inyectaron ratones en volúmenes de 100 µ? . Se usaron como controles PBS e IgGl Fe humano (Protein Science, Amgen, Thousand Oaks, CA.) . Los ratones se evaluaron una vez al día para una puntuación artrítica promedio como se describe en el Ejemplo 1. El PEG-sT FR-l 2.6D redujo la severidad de la artritis inducida por colágeno en ratones cuando se da solo en tanto que el CI1A4-Fc murino dado solo no tiene efecto en comparación al control con PBS. La combinación de PEG-sUSlFR-l 2.6D y CILM-Fc murino redujo la artritis inducida por colágeno durante un periodo prolongado de tiempo en comparación a PEG-sTNFR-l 2-6D solo, como se muestra en la Figura 2 . Se tomaron muestras séricas diez días después de la conclusión del experimento mostrado en la Figura 2 y se analizaron para anticuerpos específicos al colágeno tipo II . De forma breve, el colágeno tipo II porcino a 2 µg/ml se revistió en placas de alta unión (Nalge Nunc Intl . , Dinamarca) durante la noche . Las placas se lavaron con PBS-Tween 20 y se bloquearon con albúmina de suero bovino al 1 % (BSA) en PBS . Se adicionaron muestras séricas a las placas a diluciones que varían de 1 : 100 a 1 : 6400 , y se incubaron durante tres horas a temperatura ambiente . Después de la incubación, se lavaron los sueros en exceso de las placas con PBS-Tween 20 . Los anticuerpos Anti-IgGl y anti-IgG2b (Southern Biotech, Birmingham, AL) Marcados con Peroxidasa de Rábano (HRP) se adicionaron a las placas y se incubaron durante 1 a 2 horas. Los reactivos en exceso se lavaron de las placas con PBS-Tween 20. La reacción se desarrolló usando una solución de 3 , 3 ' , 5 , 5 ' -Tetrametil-Benzidina (TMB) (Sigma, St . Louis, MO) y se midió la densidad óptica a 450 nm. Los valores de densidad óptica obtenidos se compararon con suero normal de ratones inmunizados con colágeno tipo II. El nivel de anticuerpos específicos al colágeno tipo II se redujo en animales inyectados con PEG-sTNFR-1 2.6D y CTLA4-Fe murino en comparación a animales inyectados con CTLA4-Fe murino solo como se mide por anticuerpos anti-IgGl, y como se muestra en la Figura 3A. El nivel de anticuerpos específicos al colágeno tipo II se redujo en animales inyectados con PEG-sTNFR-1 2.6D y CTLA4-FC murino en comparación a tanto animales inyectados con PEG-sTNFR-1 2.6D solo y animales inyectados con CTLA4-FC murino solo, como se mide por anticuerpos anti-IgG2b, y se muestra en la Figura 3B. Ejemplo 3 Terapia de combinación usando vectores virales que expresan IL-lra, sTNFR-I y/o CTLA4 Construcción de Vector Los vectores de clonación de virus adeno-asociado (AAV) se basaron en el vector SK II pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) . Un ligador de oligonucleótido que contiene un 17 sitio Bgl II (CGCGAGATCTTGCGCAAGATCT (SEQ ID NO. 28)) se insertó entre dos sitios BssH II de pBSSK II. Se insertó en el ligador el ADN genómico de AAV2 (disponible de American Type Culture Collection bajo el número de acceso 37215; ver también Laughlin et al. Gene 23, 65-73 (1983)) que tiene los sitios Bgl II de flanqueo. Se introdujeron un sitio NruI y un sitio Xhol por mutagénesis dirigida al sitio en las posiciones 145 y 4530, respectivamente de la secuencia de nucleótidos de AAV2 (Srivastava et. al. J. Virol. 45, 555-564 (1983) y NCB1 Acceso No. NC-001401) . La construcción resultante se digirió con NruI y Xhol y la secuencia de AAV2 del nucleótido 146 al nucleótido 4534 se removió. Un fragmento de ADN que comprende ya sea un promotor/intensificador génico temprano del citomegalovirus (CMV) (Invitrogen, Carlsbad, CA) o un promotor EFla (PEFlHisA, Invitrogen) seguido por un sitio de clonación múltiple derivado de PcDNA3.1 (Invitrogen) se insertó entre los nucleótidos 145 y 4535 restantes de la secuencia de AAV2. El sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina de pcDNA3.1 se insertó en la dirección del sitio de clonación múltiple. El ADNc que codifica ya sea para IL-lra humana (SEQ ID No. 20) , sTNFR-1 de rata, CTLA4 humano (SEQ ID NO. 2), o beta-galactosidasa (Herz et. al. Proc. Nati. Acad. Sci. 90, 2812-2816 (1993)) se clonó en los sitios Nhe I y Not I respectivamente usando procedimientos normales de clonación. El sTNFR-1 de rata se derivó de T FR-I de rata (SEQ ID NO. 21) . El plásmido de empaque p Trans se construyó usando el vector pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) . El fragmento genómico AAV2 que abarca los nucleótidos 191-4497 en el genoma de AAV2 se obtuvo por digestión con Cial y SnaBI y el fragmento se insertó en pBluescript SK+ digerido con Cial y EcoRV. La secuencia de nucleótidos de AAV2, 1849-2202 se insertó en la secuencia de nucleótidos de AAV2 en el nucleótido 320 usando métodos normales de clonación. Un plásmido auxiliar de adenovirus que contiene la secuencia E2a, E4orf 6 y VA de adenovirus 5 (Gomez-Foix et al. J. Biol . Chem. 267, 25129-25134 (1992)) se clonó en pBluescript SK+ usando procedimientos normales de clonación. Producción de virus adeno-asociado Se cultivaron monocapas de células 293T de riñon embriónico humano en C02 al 5 % a 37°C en el medio A (medio Eagle modificado de Dulbecco que contiene 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina) complementado con suero de becerro fetal al 10 % (v/v) . La co-transfección del vector de clonación de AAV, pTrans y el plásmido pAuxiliar en relación 1:1:3 se realizó usando un método de precipitación de fosfato de calcio (Sambrook et al. Molecular Cloning, supra) . Las células se recolectaron y se liberaron los virus al congelar y descongelar. Los virus se purificaron usando cromatografía de sulfato de heparina y se titularon usando un método de transferencia de punto descrito en Auricchiv et. al. Human Gene Therapy 12,71-76) . Administración a Animales Ratones B10.RIII de 6 - 8 semanas de edad, machos (Charles River, Wilmington, MA) se asignaron al azar a grupos de tratamiento (n=10) y se inyectaron vía la vena de la cola con 100 µg de colágeno tipo II porcino en lx CFA de forma intradérmica en la base de la cola. En el día 19, se inyectaron ratones de forma intravenosa con 100 µ? de PBS que contiene 7 x 1012 partículas de AAV recombinante que tiene ß-gal, IL-lra, sTNFR-1, CTLA-4 o una combinación como se indica. Se recolectó sangre de las venas de las colas para ELISA para cuantificar el nivel de expresión de la proteína. En el día 21, se reforzaron los ratones con 100 g de colágeno porcino II en lx CFA de forma intradérmica. La expresión de IL-lra humano, sTNFR-I de rata y CTLA4 humano redujo la incidencia y severidad de la artritis inducida por colágeno en ratones cuando los vectores se administraron de forma individual en comparación a un control con ß-galactosidasa. La combinación de la expresión de sTNFR-I y CTLA4 por co-administración de vectores redujo la severidad e incidencia de la artritis inducida por colágeno a un mayor grado que la expresión de estas proteínas de forma individual, como se muestra en las Figuras 4 y 5.

Las muestras séricas de los grupos de tratamiento de los ratones mostradas en la Figura 4 se tomaron varias semanas después del refuerzo de colágeno porcino tipo II y se valoraron los niveles de anticuerpos específicos a colágeno tipo II como se describe anteriormente en el Ejemplo 2, excepto que se usaron anticuerpos anti-IgG3. El nivel de anticuerpos específicos a colágeno tipo II se redujo en animales inyectados con vectores de sTNFR-1 y CTLA-4 en comparación a animales inyectados con un vector de sTNFR-1 solo como se mide por anticuerpos anti-IgG3, y como se muestra en la Figura 6. El nivel de anticuerpos específicos al colágeno tipo II se redujo en animales inyectados con ILl-ra y vectores de CTLA-4 en comparación a animales inyectados con el vector ILl-ra solo y animales inyectados con un vector de CTLA-4 solo, como se mide por los anticuerpos anti-IgG3 y se muestra en la Figura 6. Ejemplo 4 Terapia de combinación usando AGP3 Pb y CTLA4-Fc en ratones con lupus La proteína CTLA4-FC y el pepticuerpo AGP3 (una fusión de péptido mimético Fe en tándem de AGP3) ( "AGP3 Pb" ) (SEQ ID NO. 1) se produjeron en Amgen. A. Producción del ejemplo del pepticuerpo AGP3 Se puede preparar AGP3 Pb como se describe en general en la Solicitud PCT publicada No. WO 02/092620 (PCT '620) . La PCT '620 analiza que un AGP-3 Pb inhibitorio se construyó en el cual se fusionó en cuadro un dímero en tardem de un péptido a la región Fe de IgGl humana. La PCT '620 señala que se puede construir un pepticuerpo inhibitorio al fijar pares de oligonucleótido para generar un dúplex que codifica para el péptido y un ligador comprendido de 5 residuos de glicina y un residuo de valina como un fragmento de Ndel a Salí. La PCT '620 señala que estas moléculas dúplex se ligaron en un vector (pA G21-RANK-Fc, descrito en la PCT '620) que contiene el gen Fe humano, también digerido con Ndel y Salí. La PCT '620 señala que las mezclas resultantes de ligación se transformaron por electroporación en células 2596 de la cepa de E. coli (G 221, descrito en la PCT '620) . La PCT '620 señala que se detectaron clones para la capacidad para producir el producto de proteína recombinante y para poseer la fusión génica que tiene la secuencia correcta de nucleótidos . La PCT '620 señala que un clon individual se seleccionó para cada uno de los pepticuerpos . Las construcciones de fusión pAMG21. RANK-Fe se pueden expresar en E. coli como se describe en WO 02/092620. B . Terapia en Ratones Ratones (NZBxNZW) Fl desarrollaron espontáneamente síntomas tipo lupus a 6 a 9 meses de edad y usualmente murieron a los 10 a 12 meses de edad (Vyse et al. Ann Rev Jmmunol 16, 261-292 (1998)). Antes del tratamiento, los ratones se pre-detectaron para la proteína en la orina con tiras reactivas Albustix™1 (Bayer Corp. Elkhart, IN) y aquellos que tienen más de 100 mg/dl de proteína en la orina no se incluyeron en el experimento. Antes de las inyecciones, el CTLA4-Fc murino y el AGP3 Pb se suspendieron en PBS. Ratones (NZBx ZW) Fl de seis meses de edad se trataron de forma intraperitoneal 3 veces por semana durante 60 días con 100 µg (4 mg/kg) de AGP3 Pb, 50 µg (2 mg/kg) de CTLA4-Fe murino o una combinación de los mismos. 100 µg es equivalente a 4 mg de producto terapéutico por g de peso de animal (4 mg/kg) . 50 µg es equivalente a 2 mg de producto terapéutico por Kg de peso de animal (2 mg/kg) . Se administraron como controles 100 µg de proteína IgGl Fe humana o 100 µ? de PBS. La proteína en la orina se evaluó mensualmente de principio a fin de la vida del experimento. La combinación de AGP3 Pb y CTLA4-Fc murino mostró una mejora marcada en la supervivencia en comparación a AGP3 Pb o CTLA4-Fc murino solos, como se muestra en la Figura 7. Los ratones propensos a lupus en los grupos de tratamiento se valoraron para la proteinuria cada 30 días usando tiras reactivas Albustix"11 (Bayer Corp., Elkhart, IN) . La Figura 8 muestra el por ciento de ratones que tienen más de 300 mg/dl de proteinuria en varios momentos después del tratamiento inicial . El tratamiento de combinación de AGP3 Pb y CTLA -Fe murino redujo el grado que retrazó el comienzo de la proteinuria en comparación a la administración de AGP3 Pb o CTLA4-Fc murino solos, como se muestra en la Figura 8. Tres ratones elegidos aleatoriamente propensos a lupus de cada uno de los grupos de tratamiento mostrados en la Figura 7 se sangraron 60 días después del tratamiento inicial con AGP3 Pb, CTLA4-FC murino, o una combinación de los mismos, y las muestras de sangre se probaron para la presencia de células positivas a B220. El anticuerpo de B220 detecta células B. Las células sanguíneas rojas se lisaron y las células sanguíneas blancas se tiñeron con CD4 marcado con isotiocianato de fluoresceína (anti-CD4-FITC) , CD8 marcado con ficoeritrina (PE) (anti-CD8-PE) , y B220 marcado con cicromo (B220-cyc) , todos comprados de BD Pharmingen (San Diego, CA) a 4°C durante 30 minutos. Después de la incubación, se lavaron células de 2 a 3 veces con y se fijaron en amortiguador de FACS que contiene paraformaldehído . La tinción y análisis se realizó usando protocolos normales como se describe en Khare et al: J. Immunol 160, 101-108 (1998)). El por ciento de células positivas a B220 se redujo abruptamente en los ratones a los cuales se les administró tanto AGP3 Pb como CTLA4-FC murino, en comparación a la administración individual, como se muestra en la Figura 9A.

Adicionalmente, esta reducción persistió durante 30 días después de la última administración de AGP3 Pb y CTLA4-Fc murino, como se muestra en la Figura 9B. Las muestras séricas tomadas de los varios grupos de tratamiento de ratones en el día 0, 30, 60 y 90 se valoraron para la presencia de anticuerpos a ADN de doble hebra. Se revistieron placas adsorbentes durante la noche a 4°C, con 50 µ? de a solución 1:1 de 1 µg/ml de ADN de plásmido (Immunovision, Springdale, AZ) diluido en PBS con 1 mg/ml de albúmina de suero bovino metilada (BSA; Sigma, St, Louis, MO) disuelta en agua. Se lavaron suavemente placas tres veces con PBS/Tween 20 y se bloquearon con 75 µ?_ de BSA al 2 %/PBS durante hasta 2 horas. Se adicionaron 25 µ? de muestras diluidas a las placas para lograr factores finales de dilución de 100, 400, 1600 y 6400 veces. Se usaron como normas los sueros de ratones transgénicos TALL-1 (Khare et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 3370-3375 (2000)). Las muestras se dejaron incubar durante pocas horas o durante la noche después de lo cual las placas se lavaron nuevamente . Se diluyeron 1:2000 el IgG Anti-Ratón y el IgM anti-ratón (Southern Biotech, Birmingham, AL) marcados con HRP y se adicionaron a las placas . Los anticuerpos marcados con HRP se incubaron durante aproximadamente una hora. Después de la incubación, se lavaron las placas y se revelaron con solución de TMB y la densidad óptica a 450 nm se determinó.

A los 30 y 60 días después del tratamiento, se redujo el nivel de anticuerpos específicos a ADN de doble hebra en animales inyectados con mCTLA-4Fc y AGP3 Pb en comparación a los animales inyectados con AGP3 Pb solo como se mide por los anticuerpos anti-IgG, como se muestra en la Figura 10. El nivel de anticuerpos específicos a ADN de doble hebra como se mide por los anticuerpos anti-IgM se muestra en la Figura 11. Ejemplo 5 Terapia de combinación usando PEG sTNFR-1 y AGP3 pb en ratones B10.RIII susceptibles a artritis PEG sTNFR-1 2.6D, AGP3 Pb (una fusión de péptido dimérico-Fc en tándem de AGP3) , y Fe usados en el estudio se produjeron en Amgen. La producción de PEG-sTNFR-1 2.6D de ejemplo se describe en el Ejemplo 2. En el Ejemplo 4 se describe la producción de AGP3 Pb de ejemplo. Terapia en ratones Se indujo artritis en ratones B10.RIII por inyección con colágeno porcino tipo II como se describe en el Ej emplo 1. Antes de las inyecciones, el AGP3 Pb se suspensión en PBS y el sTNFR-1 2.6D se . suspendió en PBS. A los ratones se les administró por inyección de 100 µg de PEG-sTNFR-1 2.6D, 100 µg AGP3 Pb, o 100 µg cada uno de PEG sTNFR-1 2.6D y AGP3 Pb en el día O, +1, +2, +4, +6, +8 y +10 después del comienzo clínico de la enfermedad. 100 µg es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por Kg de peso de animal (5mg/Kg) . Se inyectaron ratones en volúmenes de 100 µ? . Se usaron PBS e IgGl Fe humana (Protein Science, Amgen, Thousand Oaks, CA) como controles . Los ratones se evaluaron una vez al día para una puntuación artrítica promedio como se describe en el ejemplo 1. La combinación de PEG-sTNFR-1.2D y AGP3 Pb redujo la artritis inducida por colágeno durante un periodo prolongado de tiempo en comparación a control con Fe, PEG sTNFR-1 2.6D solo, y AGP3 Pb solo, como se muestra en la Figura 12. Ejemplo 6 Terapia de combinación usando AGP3 Pb y KIN2 en ratones B10.RI1I susceptibles a artritis Se produjeron en Amgen AGP3 Pb (una fusión de péptido dimérico-Fc en tándem de AGP3 ) , y KIN2 usados en el estudio. La producción de KIN2 de ejemplo se describe en el Ejemplo 1. La producción de AGP3 Pb de ejemplo se describe en el Ejemplo 4. Terapia en Ratones Se indujo artritis en los ratones B10.RIII por inyección con colágeno porcino tipo II como se describe en el Ej emplo 1.

Antes de las inyecciones, el IN2 se suspendió en A5S y el AGP3 Pb se suspendió en PBS . Los ratones se trataron por inyección de 100 µg de KIN2, 100 µg de AGP3 Pb, o 100 µg cada uno de KIN2 y AGP3 Pb en el día 0, +1, +2, +4, +6, +8 y +10 después del comienzo clínico de la enfermedad. 100 µg es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por Kg de peso de animal (5mg/Kg) . Se inyectaron ratones en volúmenes de 100 µ?, excepto en el experimento de combinación, en donde los ratones recibieron dos inyecciones separadas de 100 µ? cada una. Se usaron como controles inyecciones de PBS y Fe. Los ratones se monitorizaron una vez cada día y se calculó una puntuación promedio de artritis como se describe en el Ejemplo 1. KIN2 redujo la severidad de la artritis inducida por colágeno en ratones cuando se dio solo, en tanto que AGP3 Pb dado solo tiene un efecto mínimo en comparación al control con PBS. La combinación de KIN2 y AGP3 Pb redujo la artritis inducida por colágeno durante un periodo prolongado de tiempo en comparación a KIN2 solo, como se muestra en la Figura 13. Ejemplo 7 Terapia de combinación usando KIN2 y anticuerpo anti-OX40L en ratones DBA/1- susceptibles a artritis KIN2 usado en el estudio se produjo en Amgen. La producción de KIN2 de ejemplo se describe en el ejemplo 1. El anticuerpo anti-OX40L (RM134L) usado en el estudio se compró de Pharmingen (San Diego, CA) . La generación de ejemplo de .anticuerpo anti-OX40L se resume en Akiba et al. (J Immnunol, 1999, 162: 7.058-7066) . Se compró IgG de rata de Sigma (St. Louis , MO) . Terapia en Ratones Ratones DBA/1 se inmunizaron con colágeno bovino tipo II emulsionado en adyuvante completo de Freunds IX. Tres semanas después, los ratones no artríticos se reforzaron con colágeno bovino tipo II emulsionado con adyuvante incompleto de Freunds . Los ratones se monitorizaron para el desarrollo de la artritis como se describe en el Ejemplo 1. Antes de las inyecciones, el KIN2 se suspendió en A5S y el anticuerpo anti-OX40L se suspendió en PBS. Los ratones se trataron por inyección de 100 µg de KIN2, 100 µg de anticuerpo anti-OX40L, o 100 g cada uno de KIN2 y anticuerpo anti-OX 0L, o 100 µg cada uno de KIN2 y anticuerpo anti-OX40L en el día 0, +1, +2, +4, +6, +8 y +10 después del comienzo clínico de la enfermedad. 100 g es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por Kg de peso de animal (5mg/Kg) . Se inyectaron ratones en volúmenes de 100 µ?, excepto en el experimento de combinación, en donde los ratones recibieron dos inyecciones separadas de 100 µ? cada una. Se usaron inyecciones de PBS e IgG de rata como controles. Se monitorizaron los ratones una vez cada día y se calculó una puntuación promedio de artritis como se describe en el Ejemplo 1. KIN2 redujo la severidad de la artritis inducida por colágeno en ratones cuando se vio solo, en tanto que el anticuerpo anti-OX40L dado solo tiene un efecto mínimo en comparación al control con PBS. La combinación de KIN2 y anticuerpo anti-OX40L redujo la artritis inducida por colágeno durante un periodo prolongado de tiempo en comparación a KIN2 solo, como se muestra en la Figura 14. Ej emplo 8 Terapia de combinación usando PEG sTNFR-1 y anticuerpo anti-0X4OL en ratones DBA/l susceptibles a artritis PEG sTNFR-1 2.6D y Fe usados en el estudio se produjeron en Amgen. La producción de PEG sTNFR-1 2.6D de ejemplo se describe en el Ejemplo 2. El anticuerpo anti-OX40L se compró de Pharmingen. Se compró IgG de rata de Sigma. Terapia en ratones Se indujo artritis en ratones DBA/l por inyección con colágeno bovino tipo II como se describe en el Ejemplo 7. Antes de las inyecciones, el anticuerpo anti-0X4OL se suspendió en PBS y PEG sTNFR-1 2.6D se suspendió en PBS. Los ratones se administraron por inyección de 100 µg de PEG sTNFR-1 2.6D, 100 µg de anticuerpo anti-OX40L, o 100 µg cada uno de PEG sTNFR-1 2.6D y anticuerpo anti-OX40L en el día 0, +1, +2, +4, +6, +8 y +10 después del comienzo clínico de la enfermedad. 100 µg es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por Kg de peso de animal (5mg/Kg) . Se inyectaron ratones en volúmenes de 100 µ?. Se usaron inyecciones de PBS e IgG de rata como controles . Los ratones se evaluaron una vez al día para una puntuación artrítica promedio como se describe en el Ejemplo 1. El PEG sTNFR-1 2.6? redujo la severidad de la artritis inducida por colágeno en ratones cuando se da solo, en tanto que el anticuerpo anti-OX40L dado solo tiene un efecto mínimo en comparación al control con PBS. La combinación de PEG sTNFR-1 2.6D y anticuerpo anti-OX40L redujo la artritis inducida por colágeno durante un periodo prolongado de tiempo en comparación al PEG sTNFR-1 2.6D solo, como se muestra en la Figura 1 . Ejemplo 9 Terapia de combinación usando AGP3 Pb y CTLA4-Fc en ratones que tienen más de 100 mg/dl de proteína en la orina La proteína CTLA4-Fc y AGP3 Pb (una fusión de péptido dimérico-Fc en tándem de AGP3 ) , usados en el estudio se produjeron en Amgen. La producción de AGP3 Pb de ejemplo se describe en el Ejemplo 4. Terapia en Ratones Ratones (NZB x NZW) Fl se dejaron desarrollar síntomas tipo lupus como se describe en el Ejemplo 4. Antes del tratamiento, los ratones se pre-detectaron para proteína en la orina con tiras reactivas 18 Albustix" (Bayer Corp., Elkhart, IN) , y aquellos que tienen más de 100 mg/dl de proteína en orina se incluyeron en el experimento. Antes de las inyecciones, se suspendió CTLA4-Fc murino en PBS y AGP3 Pb se suspendió en PBS. Ratones (NZB x NZW) Fl de seis meses de edad se trataron de forma intraperitoneal tres veces por semana durante 12 semanas con 100 µg (4mg/kg) de AGP3 Pb, 50 µg (2mg/kg) de CTLA4-FC murino, o una combinación de 100 µg (4mg/kg) de AGP3 Pb y 50 µg (2mg/kg) de CTLA4-FC murino. 100 g es equivalente a 4 mg de producto terapéutico por Kg de peso de animal (4mg/kg) . 50 µg es equivalente a 2 mg de producto terapéutico por Kg de peso de animal (2mg/kg) . Se administraron 100 µg de proteína de IgGl Fe humana o 100 µ? de PBS como controles. Se evaluó la proteína en la orina semanalmente de principio a fin del experimento usando tiras reactivas Albustix" (Bayer Corp., Elkhart, IN) . La combinación de AGP3 Pb y CTLA -Fe murino mostró una mejora marcada en la supervivencia en comparación a AGP3 Pb o CTLA4-Fe solo, como se muestra en la Figura 15. Los ratones seleccionados en los grupos de tratamiento se valoraron para proteinuria cada semana usando tiras reactivas Albustix™1 (Bayer Corp., Elkhart, IN) . Cada semana, a los ratones se les dio una puntuación de +1 si su proteinuria llegó a ser peor (de >100 mg/dl a > 300 mg/dl) , una puntuación de 0 si su proteinuria permaneció igual y una puntuación de -1 si su proteinuria mejoró (<100 mg/dl) . La puntuación promedio para el grupo de 14 ratones se gráfica en la Figura 16. La Figura 16 muestra la severidad de la proteinuria durante el transcurso de 41 semanas. El tratamiento de combinación de AGP3 Pb y CTLA4-Fe murino redujo la severidad de la proteinuria en comparación a la administración de AGP3 Pb o CLTA4-Fc murino solos, como se muestra en la Figura 16. Ejemplo 10 Terapia de combinación usando AGP3 Pb y CTLA4-Fc en ratones que tienen más de 300 mg/dl de protelna en la orina La proteína CTLA4-FC y AGP3 Pb (una fusión de péptido dimérico-Fc en tándem de AGP3) , se produjeron en Amgen. La producción de AGP3 Pb se describe en el Ejemplo 4. Terapia en Ratones Ratones (NZB x NZW) Fl se dejaron desarrollar síntomas tipo lupus como se describe en el Ejemplo 4. Antes del tratamiento, los ratones se pre-detectaron para proteína en la orina con tiras reactivas Albustix"11 (Bayer Corp., Elkhart, IN) , y aquellos que tienen más de 100 mg/dl de proteína en orina se incluyeron en el experimento. Antes de las inyecciones, se suspendió CTLA4-Fc murino en PBS y AGP3 Pb se suspendió en PBS. Ratones (NZB x NZW) Fl de seis meses de edad se trataron de forma intraperitoneal tres veces por semana durante 12 semanas con 100 µg (4mg/kg) de AGP3 Pb, 50 µg (2mg/kg) de CTLA4-Fe murino, o una combinación de 100 µg (4mg/kg) de AGP3 Pb y 50 µg (2mg/kg) de CTLA4-Fc murino. 100 µg es equivalente a 4 mg de producto terapéutico por Kg de peso de animal (4mg/kg) . 50 µg es equivalente a 2 mg de producto terapéutico por Kg de peso de animal (2mg/kg) . Se administraron 100 µg de proteína de IgGl Fe humana o 100 µ? de PBS como controles. Se evaluó la proteína en la orina semanalmente de principio a fin del experimento usando tiras reactivas Albustix*1 (Bayer Corp., Elkhart, IN) . La combinación de AGP3 Pb y CTLA4-Fc murino mostraron una mejora marcada en la supervivencia en comparación a AGP3 Pb o OTLM-Fc solos, como se muestra en la Figura 17. Los ratones seleccionados en los grupos de tratamiento se valoraron para proteinuria cada semana usando tiras reactivas AlbustixMR (Bayer Corp., Elkhart, IN) . Cada semana, a los ratones se les dio una puntuación de +2 si murieron, una puntuación de +1 si su proteinuria empeoró (> 2000 mg/dl) , una puntuación de 0 si su proteinuria permaneció igual (300 mg/dl a 2000 mg/dl) , una puntuación de -1 si su proteinuria mejoró (<300 mg/dl a 100 mg/dl) , y una puntuación de -2 si su proteinuria mejoró dramáticamente (<100 mg/dl) . La puntuación promedio para el grupo de 13 ratones se gráfica en la Figura 18. La Figura 18 muestra la severidad de la proteinuria durante el transcurso de 20 semanas. El tratamiento de combinación de AGP3 Pb y CTLA4-Fe murino redujo la severidad de la proteinuria en comparación a la administración de AGP3 Pb o CTLA4-FC murino solos, como se muestra en la Figura 18. .Ejemplo 11 Terapia de combinación intermitente usando CTLA4-Fe y KIN2 en ratones B10.RIII susceptibles a artritis 5 Los siguiente es un ejemplo profético en donde el tratamiento intermitente con la combinación de KIN2 y CTLA4- Fc reduce la artritis inducida por colágeno durante un periodo prolongado de tiempo en comparación a CHA4-Fc solo y DI2 solo. Terapia en ratones 0 Se induce artritis en ratones B10.RIII por inyección con colágeno porcino tipo II como se describe en el ejemplo 1. Los ratones se separan en dos grupos . En el primer grupo, antes de la inyección, KIN2 se suspende en A5S y CTLA4-FC se suspenden PBS. Los ratones se administran por 5 inyección de 100 ug de KIN2, 100 u_g de CTLA4-FC o 100 u_g cada uno de KIN2 y CTLA4-Fe en los días 0 a +9 después del comienzo clínico de la enfermedad. 100 ug es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (5mg/kg) . Los ratones se inyectan en volúmenes de 100 ul excepto en el <3 experimento de combinación, en donde los ratones reciben 2 inyecciones separadas de 100 ul cada una. Se usan como controles inyecciones de PBS y Fe . Los ratones se monitorizan una vez cada día y se calcula una puntuación promedio de artritis como se describe en el ejemplo 1. I- Aquellos ratones que tuvieron puntuación por arriba de uno en la puntuación promedio de artritis se tratan una segunda vez por inyección de 100 ucj de KIN2, 100 ug de CTLA4-Fc, o 100 ug cada uno de KIN2 y CTLA4-Fe durante tres días adicionales. Después del segundo tratamiento, el tratamiento de tres días se repite cuando quiera que un ratón tenga una puntuación promedio de artritis por arriba de 1. El tratamiento se repite tan frecuentemente como sea necesario durante el transcurso del experimento. En el segundo grupo, antes de la inyección, KIN2 se suspende en A5S y CTLA -Fe se suspende en PBS. Los ratones se tratan por inyección de 100 ug de KIN2, 100 ug de CTLA4-Fc, o 100 ug cada uno de KIN2 y CTLA4-Fe en los días 0 a +2 después del comienzo clínico de la enfermedad. 100 ug es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (5 mg/kg) . Los ratones se inyectan en volúmenes de 100 ul excepto en el experimento de combinación, en donde los ratones reciben 2 inyecciones separadas de 100 l cada una. Se usan inyecciones de PBS y Fe como controles . Después del tratamiento los ratones se valúan diariamente y se les da una puntuación por medio de artritis como se describe en el ejemplo 1. Aquellos ratones que tienen puntuación por arriba de 1 en la puntuación promedio de artritis se trata de una segunda vez por inyección de una dosis de mantenimiento de 100 ug de KIN2 100 ug de CTLA4-Fc, o 100 g cada uno de KIN2 y CTLA4-Fc durante tres dias adicionales. Después del segundo tratamiento, el tratamiento de dosis de mantenimiento de tres días se repite cuando quiera que un ratón tenga una puntuación promedio de artritis por arriba de 1. El tratamiento de dosis de mantenimiento se repite tan frecuentemente como sea necesario durante el transcurso del experimento . El experimento continúa durante dos meses . Ejemplo 12 Terapia de combinación intermitente usando PEG sTNFR-l en ratones B10.RIII susceptibles a artritis Lo siguiente es un ejemplo profético en donde el tratamiento intermitente con la combinación de PEG sTNFR-l 2.6 y CTLA -Fe reduce la artritis inducida por colágeno durante un periodo prolongado de tiempo en comparación a CTLA4-Fe solo y PEG sTNFR-l 2.6D solo. Terapia en ratones Se induce a artritis en ratones B10.RIII por inyección con colágeno porcino tipo II como se describe en el ejemplo 1. Los ratones se separan en dos grupos . En el primer grupo, antes de la inyección, se suspende PEG sTNFR-l 2.6D en PBS y el CTLA4-Fc se suspende en PBS. Los ratones se tratan por inyección de 100 ug de PEG sTNFR-l 2.6D, 100 ug, de CTLA4-Fc o 100 ug de cada uno de PEG sTNFR.l 2.6D Y CTLA -Fe en los días 0 a +9 después del comienzo clínico de la enfermedad. 100 µg es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por Kg de peso de animal (5 mg/kg) . Se inyectan ratones en volúmenes de 100 µ?. Las inyecciones de PBS y Fe se usan como controles . S e monitorizan ratones una vez cada día y se calcula una puntuación promedio de artritis como se describe en el ejemplo 1. Aquellos ratones que tienen puntuación por arriba de 1 en la puntuación promedio de artritis se tratan una senda vez por inyección de una dosis de mantenimiento de 100 ug de PEG sTNFR-l 2.6D, 100 ug de CTLA4-Fc o 100 ug cada uno de PEG sTNFR-l 2.6D y CTLA4-Fc durante tres días adicionales. Después del segundo tratamiento, el tratamiento de dosis de mantenimiento de tres días se repite cuando quiera que un ratón tenga una puntuación promedio de artritis por arriba de 1. El tratamiento de dosis de mantenimiento se repite tan frecuentemente como sea necesario durante el transcurso del experimento . En el segundo grupo, antes de la inyección, PEG sTNFR-l 2.6D se suspende en PBS Y CTLA4-FC se suspende en PBS. Los ratones se tratan por inyección de 100 ug PEG sTNFR-1 2.6D, 100 ug de CTLA4-FC, o 100 ug cada uno de PEG sTNFR-l 2.6D y CTLA4-Fc en los días 0 a +2 después del comienzo clínico de la enfermedad. 100 g es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (5 mg/kg) . Los ratones se inyectan en volúmenes de 100 ul. Se usan como controles e inyecciones de PBS y Fe. Los ratones se monitorizan una vez cada dia y se calcula una puntuación promedio de artritis como se escribe en el ejemplo 1. Aquellos ratones que tienen puntuación por arriba de 1 en la puntuación promedio de artritis se tratan una segunda vez por inyección de una dosis de mantenimiento de 100 ug de PEG sTNFR-1 2.6D, 100 ug de CTLA4-Fc o 100 ug cada uno de PEG sTNFR-1 2.6D y CTLA4-Fc durante tres días adicionales. Después del segundo tratamiento, el tratamiento de dosis de mantenimiento de tres días se repite cuando quiera que un ratón tenga una puntuación promedio de artritis por arriba de 1. El tratamiento de dosis de mantenimiento se repite tan frecuentemente como sea necesario durante el transcurso del experimento. El experimento continúa durante dos meses . Ejemplo 13 Terapia de combinación usando Etanercept y CTLA4-Fc en ratones B10.III susceptibles a artritis Lo siguiente en un ejemplo profético en donde el tratamiento con la combinación de Etanercept y CTLA4-FC reduce la artritis inducida por colágeno durante un periodo prolongado de tiempo en comparación a CTLA4-Fc solo y Etanercept. El Etanercept se vende comercialmente bajo el nombre comercial Bribre!*". 4 Terapia en ratones Se induce la artritis en ratones B10.RIII por inyección de colágeno porcino tipo II como se describe en el ejemplo 1. Antes de las inyecciones, se suspende CTLA4-Fc murino en PBS y se suspende Etanercept en PBS . Los ratones se administran por inyección de 100 ug de Etanercept, 100 ug de CTLA4-Fe murino, o 100 g cada uno de Etanercept y CTLA4-Fc murino en el día 0, +1, +2, +4, +6, +8 y +10 después del comienzo clínico de la enfermedad. 100 g es equivalente a 5 mg de producto terapéutico por kg de peso de animal (5mg/kg) . Se inyectan ratones en volúmenes 100 ul . Se usan PBS e IgGl Fe humano (Protein Science, Amgen, Thousand Oaks, CA) se usan como controles . Los ratones se evalúan una ves al día para una puntuación artrítica por medio como se describe en el ejemplo 1. El experimento continúa durante 40 días después del comienzo clínico de la enfermedad. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 5 1. Un método para tratar una enfermedad mediada por IL-1, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de IL-1 y al menos un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28. 2. El método de conformidad con la reivindicación 0 I, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un polipéptido de IL-lra. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un polipéptido de IL-lra fusionado a una región constante de 5 inmunoglobulina humana. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un anticuerpo para el receptor de IL-1. 5. El método de conformidad con la reivindicación 0 i, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un anticuerpo para el receptor IL-1 ß. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende Fe XL-lra. 7. El método de conformidad con la reivindicación I- 1, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ . ID . No . : 3. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue el inhibidor de ?L-1 comprende anaquinra. 9. El método de conformidad con cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el inhibidor de B7 impide la unión de B7 a CD28. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , caracterizado porque el inhibidor de CD28 impide la unión de B7 a CD28. 0 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de B7 y el inhibidor de CD28 se selecciona de al menos uno de CTLA4, CTLA4-Fc, un anticuerpo de CD28 antagonista, un anticuerpo de B7 antagonista. 5 12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de B7 y el inhibidor de CD28 comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 2. 13. El método de conformidad con la reivindicación 0 1, caracterizado porque la enfermedad mediada por IL-1 se selecciona de artritis reumatoide, artritis psoriática, lupus eritematoso sistémico, rechazo de injerto, psoriasis, y enfermedad inflamatoria del intestino. 1 . El método de conformidad con la reivindicación <- 1, caracterizado porque la administración se discontinúa durante al menos un día y luego se reanuda. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la adnünistración se reanuda para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria recurrente. 16. Un método para tratar una enfermedad mediada por TNF- , caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de TNF-a y al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a se selecciona de al menos "uno de sTNFR-I enlazado a una región Fe, sTNFR-II enlazado a una región Fe, y un fragmento de sTNFR-1 o sTNFR-II enlazado a una región Fe . 18. El método de conformidad con la reivindicáción 16, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende sTNFR-I de PEG de 30 kD. 19. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende un fragmento de sTNFR-I de 2.6 D. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el fragmento de sTNFR-I de 2.6 D comprende PEG de 30 kD. 21. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende sTNFR-II enlazado a una región Fe. 22. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a se selecciona de al menos uno de etanercept, infleximab y D2E7. 23. El método de conformidad con la reivindicación 5 16, caracterizado porque el inhibidor de TNF-ct comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 4. 2 . El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el inhibidor de TNF-OÍ comprende sTNFR-1 de PEG. 0 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, caracterizado porque el inhibidor de B7 previene la unión de B7 a CD28. 26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, caracterizado porque el inhibidor 5 de CD28 previene la unión de B7 a CD28. 27. El método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de B7 y el inhibidor de CD28 se selecciona de al menos uno de CTLA4 , CTLA4-FC, un anticuerpo de CD28 0 antagonista, y un anticuerpo de B7 antagonista. 28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de B7 y el inhibidor de CD28 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 2. ir 29. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la enfermedad mediada por TNF-a tratada se selecciona de artritis reumatoide, artritis psoriática, lupus eritematoso sistémico, rechazo de injerto, psoriasis, y enfermedad inflamatoria del intestino. 30. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la administración se descontinúa durante al menos un día y luego se reanuda. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la adndnistración se reanuda para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria recurrente. 32. Un método para tratar una condición inflamatoria o autoinmunitaria, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de IL-1 al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un polipéptido de IL-lra. 34. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un polipéptido de IL-lra fusionado a una región constante de inmunoglobulina humana. 35. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un anticuerpo para el receptor de IL-1. 36. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un anticuerpo para el IL-1 ß. 37. El método de conformidad con la reivindicación 32, 5 caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende Fe e IL-lra. 38. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 3. 39. El método de conformidad con la reivindicación 32, 10 caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende anaquinra. 40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 39, caracterizado porque el inhibidor de B7 impide la unión de B7 a CD28. 41. El método de conformidad con cualquiera de las 15 reivindicaciones 32 a 39, caracterizado porque el inhibidor de CD28 impide la unión de B7 a CD28. 42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 39, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de B7 y el inhibidor de CD28 se seleccionan de 20 al menos uno de CTLA4, CTLA4-Fe, un anticuerpo de CD28 antagonista, y un anticuerpo de B7 antagonista. 43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 39, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de B7 y el inhibidor de CD28 comprenden la „ secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 2. 44 . El método de conformidad con la reivindicación 32 , caracterizado porque la condición tratada se selecciona de artritis reumatoide , artritis psoriática, lupus eritematoso sistémico , rechazo de inj erto , psoriasis , y enfermedad inf lamatoria del intestino . 45 . El método de conformidad con la reivindicación 32 , caracterizado porque la administración se discontinúa durante al menos un día y luego se reanuda . 46 . El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la adnmiistración se reanuda para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria recurrente . 47. Un método para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria, caracterizado porque comprende adndnistrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de TNF- y al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el inhibidor de T F-OÍ se selecciona de al menos uno de sT FR-I enlazado a una región Fe, sT FR-II enlazado a una región Fe, y un fragmento de sTNFR-1 o sTNFR-II enlazado a una región Fe . 49 . El método de conformidad con la reivindicación 47 , caracterizado porque el inhibidor de TNF-OÍ comprende sTNFR- I de PEG de 30 kD . 50 . El método de conformidad con la reivindicación 47 , caracterizado porque el inhibidor de TNF- OÍ comprende un fragmento de sTNFR- I de 2 . 6 D . 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el fragmento de sTNFR-I de 2.6 D comprende PEG de 30 kD. 52. El método de conformidad con la reivindicación 5 47, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende sT FR-Il enlazado a una región Fe. 53. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a se selecciona de al menos uno de etanercept, infleximab y D2E7. 10 54. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 4. 55. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el inhibidor de TNF- comprende 15 sTNFR-1 de PEG. 56. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 55, caracterizado porque el inhibidor de B7 impide la unión de B7 a CD28. 57. El método de conformidad con cualquiera de las 20 reivindicaciones 47 a 55, caracterizado porque el inhibidor de CD28 impide la unión de B7 a CD28. 58. El método según cualquiera de las reivindicaciones 47 a 55, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de B7 y el inhibidor de CD28 se seleccionan de oc- al menos uno de CTLA4 , CTLA4-Fc, un anticuerpo de CD28 antagonista, y un anticuerpo de B7 antagonista. 59. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 55, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de B7 y el inhibidor de CD28 comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 2. 60. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la condición tratada se selecciona de artritis reumatoide, artritis psoriática, lupus eritematoso sistémico, rechazo de injerto, psoriasis y enfermedad inflamatoria del intestino. 61. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la administración se descontinúa durante al menos un día y luego se reanuda. 62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la administración se reanuda para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria recurrente . 63. Un método para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un (i) al menos uno de un inhibidor de AGP3 , un inhibidor de BAFFR, y un inhibidor de TACI, y (ii) al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28. 64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el inhibidor de AGP3 impide la unión de AGP3 a BAFFR y TACI. 65. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque comprende un inhibidor de BAFFR y un inhibidor de TACI, en donde el inhibidor de BAFFR y el inhibidor de TACI impide la unión de AGP3 a BAFFR y TACI . 66. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de AGP3 , el inhibidor de BAFFR, y el inhibidor de TACI comprenden una molécula de receptor soluble de TACI . 67. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de AGP3 , el inhibidor de BAFFR, y el inhibidor de TACI comprenden un inhibidor peptídico de AGP3. 68. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de AGP3 , el inhibidor de BAFFR, y el inhibidor de TACI comprenden un pepticuerpo AGP3. 69. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de AGP3 , el inhibidor de BAFFR, y el inhibidor de TACI comprenden una proteina codificada por SEQ. ID. No.: 1. 70. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 63 a 69, caracterizado porque el inhibidor de B7 impide la unión de B7 a CD28. 71. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 63 a 69, caracterizado porque el inhibidor de CD28 impide la unión de B7 a CD28 72. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 63 a 69, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de B7 y el inhibidor de CD28 se seleccionan de al menos uno de CTLA4, CTLA4-Fc, un anticuerpo de CD28 antagonista, y un anticuerpo de B7 antagonista. 73. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 63 a 69, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de B7 y el inhibidor de CD28 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 2. 74. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque la condición tratada se selecciona de artritis reumatoide, artritis psori tica, lupus eritematoso sistémico, rechazo de injerto, psoriasis, y enfermedad inflamatoria del intestino. 75. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque la administración se discontinúa durante al menos un día y luego se reanuda. 76. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque la administración se reanuda para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria recurrente . 77. Un método para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de IL-1 una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de TNF-OÍ, y al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28. 5 78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende al menos uno de sTNFR-I, sTNFR-11, y un fragmento de sTNFR, y sTNFR-Fc. 79. El método de conformidad con la reivindicación 0 77, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende STNFR-I de PEG de 30 kD. 80. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende un fragmento de sTNFR-I de 2.6 D. 5 81. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el fragmento de sTNFR-I de 2.6 D comprende PEG de 30 kD. 82. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende 0 sTNFR-II enlazado a una región Fe. 83. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a se selecciona de etanercept, infleximab y D2E7. 84. El método de conformidad con la reivindicación C- 77, caracterizado porque la condición tratada se selecciona de artritis reumatoide, artritis psoriática, lupus ;^ritematoso sistémico, rechazo de injerto, psoriasis y enfermedad inflamatoria del intestino. 85. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la administración se discontinúa durante al menos un día y luego se reanuda. 86. El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque la administración se reanuda para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria recurrente. 87. ün método para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de (i) al menos un inhibidor de AGP3 , un inhibidor de BAFFR, y un inhibidor de TACI, y (ii) un inhibidor de IL-1. 88. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un polipéptido de IL-lra. 89. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un polipéptido de IL-lra fusionado a una región constante de inmunoglobulina humana. 90. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un anticuerpo para el receptor de IL-1. 91. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un anticuerpo para el receptor de IL-1 ß. 92. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende Fe e IL-lra. 93. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el inhibidor de IL-l comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 3. 94. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende anaquinra. 95. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 87 a 94, caracterizado porque el inhibidor de AGP3 impiden la unión de AGP3 a BAFFR y TACI. 96. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 87 a 94, caracterizado porque comprende un inhibidor de BAFFR y un inhibidor de TACI, en donde el inhibidor de BAFFR y el inhibidor de TACI impide la unión de AGP3 a BAFFR y TACI. 97. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 87 a 94, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de AGP3 , el inhibidor de BAFFR, y el inhibidor de TACI comprenden una molécula de receptor soluble de TACI. 98. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 87 a 94, caracterizado porgue al menos uno del inhibidor de AGP3 , el inhibidor de BAFFR, y el inhibidor de TACI comprenden un inhibidor peptidico de AGP3. ' 99. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 87 a 94, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de AGP3 , el inhibidor de BAFFR, y el inhibidor de TACI comprenden un pepticuerpo AGP3. 100. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 87 a 94, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de AGP3 , el inhibidor de BAFFR, y el inhibidor de TACI comprenden una proteína codificada por SEQ. ID. No. : 1. 101. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque la condición tratada se selecciona de artritis reumatoide, artritis psoriática, lupus eritematoso sistémico, rechazo de injerto, psoriasis, y enfermedad inflamatoria del intestino. 102. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque la administración se discontinúa durante al menos un día y luego se reanuda. 103. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque la administración se reanuda para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria recurrente . 104. Un método para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de (i) al menos uno de un inhibidor de AGP3 , un inhibidor de BAFFR, y un inhibidor de TACI, y (ii) un inhibidor de T F-a. 105. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a se selecciona de al menos uno de sTNFR-I enlazado a una región Fe, sTNFR-II enlazado a una región Fe, y un fragmento de sTNFR-I o sTNFR-II enlazados a una región Fe. 106. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el inhibidor de TNF-ot comprende sTNFR-I de PEG de 30 kD. 107. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende un fragmento de sTNFR-I de 2.6 D. 108. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el fragmento de sTNFR-I de 2.6 D comprende PEG de 30 kD. 109. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende sTNFR-II enlazado a una región Fe. 110. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a se selecciona de al menos uno de etanercept, infleximab y D2E7. 111. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el inhibidor de TNF-ot comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 4. 112. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende sTNFR-1 de PEG. 113. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 104 a 112, caracterizado porque el inhibidor de AGP3 impide la unión de AGP3 a BAFFR y TACI. 11 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 104 a 112, caracterizado porque comprende un inhibidor de BAFFR y un inhibidor de TACI, en donde el inhibidor de BAFFR y el inhibidor de TACI impiden la unión de AGP3 a BAFFR y TACI. 115. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 104 a 112, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de AGP3, el inhibidor de BAFFR, y el inhibidor de TACI comprenden una molécula de receptor soluble de TACI. 116. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 104 a 112, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de AGP3 , el inhibidor de BAFFR, y el inhibidor de TACI comprenden un inhibidor peptidico de AGP3. 117. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 104 a 112, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de AGP3, el inhibidor de BAFFR, y el inhibidor de TACI comprenden un pepticuerpo AGP3. 118. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 104 a 112, caracterizado porque al menos uno del inhibidor de AGP3 , el inhibidor de BAFF , y el inhibidor de TACI comprende una proteína codificada por SEQ. ID. No. : 1. 119. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la condición tratada se selecciona de artritis reumatoide, artritis psoriática, lupus eritematoso sistémico, rechazo de injerto, psoriasis, y enfermedad inflamatoria del intestino. 120. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la administración se discontinúa durante al menos un día y luego se reanuda. 121. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque la administración se reanuda para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria recurrente . 122. Un método para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de TNF-a y un inhibidor del ligando 0X40. 123. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a se selecciona de al menos uno de sTNFR-I enlazado a una región Fe, sTNFR-II enlazado a una región Fe, y un fragmento de sTNFR-l o sTNFR-JI enlazado a una región Fe . 12 . El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende sTNFR-I de PEG de 30 kD. 125. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende un fragmento de sTNFR-I de 2.6 D. 126. El método de conformidad con la reivindicación 125, caracterizado porque el fragmento de sTNFR-I de 2.6 D comprende PEG de 30 kD. 127. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende sTNFR-II enlazado a una región Fe. 128. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a se selecciona de al menos uno de etanercept, infleximab y D2E7. 129. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 4. 130. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende sTNFR-l de PEG. 131. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 122 a 130, caracterizado porque el inhibidor de ligando 0X40 es un anticuerpo anti-ligando OX40. 132. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque la condición tratada se selecciona de artritis reumatoide, artritis psoriática,, lupus eritematoso sistémico, rechazo de injerto, psoriasis, y enfermedad inflamatoria del intestino. 133. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque la administración se discontinúa durante al menos un día y luego se reanuda. 134. El método de conformidad con la reivindicación 133 , caracterizado porque la administración se reanuda para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria recurrente . 135. Un método para tratar una condición inflamatoria o autoinmunitaria, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de IL-1 y un inhibidor de ligando OX40. 136. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un polipéptido de IL-lra. 137. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un polipéptido de IL-lra fusionado a una región constante de inmunoglobulina humana. 138. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un anticuerpo para el receptor de IL-1. 139. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende un anticuerpo para el receptor IL-1 ß. 140. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende Fe IL-lra. 141. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 3. 142. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 comprende anaquinra . 143. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 135 a 143, caracterizado porque el inhibidor de ligando OX40 es un anticuerpo anti-ligando OX40. 144. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque la condición tratada se selecciona de artritis reumatoide, artritis psoriática, lupus eritematoso sistémico, rechazo de injerto, psoriasis, y enfermedad inflamatoria del intestino. 145. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque la administración se discontinúa durante al menos un día y luego se reanuda. 146. El método de conformidad con la reivindicación 145, caracterizado porque la administración se reanuda para tratar una condición autoinmunitaria o inflamatoria recurrente . 5 147. Un método para tratar una enfermedad mediada por IL-1, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de IL-1 y al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28, en donde el inhibidor de IL-1 y al menos uno de un 0 inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28 se administran en una dosis inicial dada al inicio del tratamiento durante un periodo de 1-10 días, y en una o más dosis de mantenimiento dadas durante un periodo de 1-10, en donde (a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es 5 mayor que aproximadamente una semana, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente una semana, o (c) tanto un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente una semana y un intervalo entre 0 cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente una semana. 148. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque cualquiera de (a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es R mayor que aproximadamente dos semanas, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente dos semanas , o (c) tanto un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente dos semanas y un intervalo entre dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos semanas . 149. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque cualquiera de (a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente un mes, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente un mes , o ( c ) tanto un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente un mes y un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente un mes . 150 . El método de conformidad con la reivindicación 147 , caracterizado porque ya sea ( a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente dos meses, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente dos dosis, o ( c) tanto un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente dos meses y un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos meses . 151 . El método de conformidad con la reivindicación 147 , caracterizado porque cualquiera de (a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente tres meses, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente tres meses, o (c) tanto un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente tres meses y un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente tres meses . 152. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque el inhibidor de IL-1 es ?G?2 y el inhibidor de B7 comprenden CTLA4-Fc. 153. Un método para tratar una enfermedad mediada por TNF, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de TNF-a y al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28. en donde el inhibidor de TNF-a y al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28 se administran en una dosis inicial dada al inicio del tratamiento durante un periodo de 1-10 días y en una o más dosis de mantenimiento dadas durante un periodo de 1-10 dias, en donde (a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente una semana, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente una semana, o (c) tanto un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente una semana y un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente una semana. 15 . El método de conformidad con la reivindicación 153 , caracterizado porque cualquiera de (a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos semanas, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos semanas, o (c) tanto un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor que aproximadamente dos semanas en un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos semanas. 155. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque cualquiera de (a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente un mes, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente un mes, o (c) tanto un intervalo entre la dosis inicial como la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente un mes y un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente un mes . 156. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque cualquiera de (a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos meses, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos meses, o (c) tanto un intervalo entre la dosis inicial como la primera dosis de mantenimiento es mayor de 5 aproximadamente dos meses y un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos meses. 157. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque cualquiera de (a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de 0 aproximadamente tres meses, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente tres meses, o (c) tanto un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente tres meses y un intervalo entre cualquiera de dos dosis de 5 mantenimiento es mayor de aproximadamente tres meses . 158. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende PEG-sTNFRI 2.6 y al menos uno del inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28 comprenden CTLA-4 Fe. 0 159. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el inhibidor de TNF-a comprende etanercept, y al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28 comprenden CTLA-4 Fe. 160. Un método para tratar una condición C- autoinmunitaria o inflamatoria, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de (i) al menos uno de un inhibidor de AGP3, un inhibidor de BAFFR, y un inhibidor de TACI, y (ii) al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28 , en donde al menos uno de un inhibidor de AGP3, un inhibidor de BAFFR, y un inhibidor de TACI y al menos uno de un. inhibidor de B7 y un inhibidor de CD28 se administran en una dosis inicial dada al inicio del tratamiento durante un periodo de 1-10 días, y en una o más dosis de mantenimiento dadas durante un periodo de 1-10, en donde (a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente una semana, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente una semana, o (c) tanto un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente una semana y un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente una semana. 161. El método de conformidad con la reivindicación 160, caracterizado porque cualquiera de (a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos semanas, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos semanas, o (c) tanto un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos semanas y un intervalo entre cualquiera dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos semanas . 162. El método de conformidad con la reivindicación 160, caracterizado porque cualquiera de (a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente un mes, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente un mes, o (c) tanto un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente un mes y un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente un mes. 163. El método de conformidad con la reivindicación 160, caracterizado porque cualquiera de (a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos meses, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos meses, o (c) tanto un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos meses y un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente dos meses . 164. El método de conformidad con la reivindicación 160, caracterizado porque cualquiera de (a) un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente tres meses, (b) un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente tres meses, o (c) tanto un intervalo entre la dosis inicial y la primera dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente tres meses y un intervalo entre cualquiera de dos dosis de mantenimiento es mayor de aproximadamente tres meses . 165. El método de conformidad con la reivindicación 160, caracterizado porque al menos uno de un inhibidor de AGP3 un inhibidor de BAFFR, y un inhibidor de TACI comprenden un inhibidor de AGP3 y al menos uno de un inhibidor de B7 y un inhibidor CD28 comprenden CTLA-4 Fe.