CN101766602B - 取代芳香基腙类化合物在作为肿瘤坏死因子抑制剂药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及取代芳香基腙类化合物及其衍生物作为抗肿瘤坏死因子抑制剂在临床上的应用。该化合物在动物体内试验结果显示具有较低的细胞毒性，因此，该药物化合物有望作为抗TNF-a和TNF-β抑制剂在临床上推广应用，主要用于治疗一些TNF相关的免疫性疾病，如风湿性关节炎、炎性肠道疾病、糖尿病、败血病、银屑病、强直性脊柱炎以及包括HIV在内的其他一些传染性疾病，目前的TNF相关的研究进展还提示，该药物化合物还可用于临床血液及实体肿瘤(如骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化症、急性骨髓细胞白血病以及急性/慢性移植物抗宿主反应、卵巢癌、肾细胞癌等疾病)的治疗。

Description

取代芳香基腙类化合物在作为肿瘤坏死因子抑制剂药物方面的应用

技术领域

本发明属于药物合成技术领域，涉及取代芳香基腙类化合物、衍生物及其盐作为抗肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)TNF-a和TNF-β抑制剂在临床上的应用。

背景技术

免疫***是人体内最重要的防御***，正常的免疫应答赋予人体抗感染，识别自我与非我，及时清除体内衰老、病变的细胞的能力。但是，免疫反应异常也有引发疾病的可能性，即生理反应向病理反应的转变。研究表明：机体针对抗原的免疫反应的过程中可释放大量炎性因子，如白介素1、白介素6、肿瘤坏死因子等，可使局部组织器官损伤。临床常见的类风湿性关节炎、炎性肠炎、慢性肾小球肾炎、***性红斑狼疮等都与免疫炎症损伤有关，因此可以说免疫反应是生命的双刃剑，如何利用各种手段，促进其生理反应而抑制其病理作用，趋利避害，是免疫治疗学的重要任务。

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)主要有TNF-α和TNF-β两种类型，其中TNF-α主要由单核-巨噬细胞分泌；TNF-β主要由活化的T淋巴细胞分泌。TNF-α与TNF-β的生物学作用极为相似，在体内外均能刺激IL-1的产生，均能杀死某些肿瘤细胞(cytolyticaction)，或抑制增殖作用(cytostaticaction)，这可能与分子结构的相似性和受体的同一性有关。TNF-α和β发挥生物学效应的天然形式是同源的三聚体。TNF受体(TNF-R)可分为两型：I型TNF-R(55kDa，CD120a，439氨基酸残基)，此型受体可能在溶细胞活性上起主要作用；II型TNF-R(75kDa，CD120b，426氨基酸残基)，此型受体可能与信号传递和T细胞增殖有关。TNF杀伤肿瘤的机理不同于补体或穿孔素(perforin)杀伤细胞，TNF杀伤细胞没有穿孔现象，而且杀伤过程相对比较缓慢。TNF-R属于神经生长因子受体(NGFR)超家族，存在于多种正常及肿瘤细胞表面，一般每个细胞受体数目有10³～10⁴，不同细胞表面TNFR的数目和亲和力与细胞对TNF的敏感性并不平行。TNF与相应受体结合后信号传递可能与活化蛋白激酶C(PKC)，催化受体蛋白磷酸化有关。用放线菌素D、丝裂霉素C、放线菌酮等处理肿瘤细胞(如小鼠成纤维细胞株L929)可明显增强TNF杀伤肿瘤细胞活性。

TNFα在TNF的免疫调节功能中占主导作用，且是一种较早进行临床试验的细胞因子，向上可以追溯到20世纪70年代，但由于其的毒副作用较为严重，且不可控制，所以一直未能在临床上推广使用。随着近些年来对TNF的认识的逐步深入，人们普遍认为该细胞因子是一把“三刃剑”，即是低浓度TNF的免疫调节作用是主导作用，它可以活化中性粒细胞，刺激单核细胞，激活巨噬细胞，还可通过T、B淋巴细胞的调节来影响特异和非特异性免疫功能；高浓度TNF的细胞毒毒性成为主导作用，一方面它能杀伤某些肿瘤细胞或使体内肿瘤组织发生出血坏死，另一方面它又是一种较强的内源性炎症介质，过量的TNF可以引起组织损伤、重症感染性休克、自身免疫性疾病、器官移植后免疫排斥反应等，导致机体生理功能紊乱，往往症状凶险，治疗困难。因此，阻断TNFα能显著的改善这些疾病的症状，并已成为治疗上述免疫性疾病的重要策略。目前，国际上用于抗TNFα治疗用药物主要有infliximab，CDP571，etanercept，onercept，adalimumab(D2E7)，CDP870(见表1)，就目前已发表的资料来看，这类生物大分子药物(绝大多数是抗TNFα的抗体)对类风湿关节炎、僵直性脊椎炎及干癣性关节炎的疗效显著(80％)且快速，可以在两周左右有明显进步。其中，尤其值得一提的是infliximab，自1998年被FDA批准应用于临床以来，已经成为治疗风湿性关节炎等炎性疾病的首选药物，且经济效益显著(见表2)。另外还有大量的研究结果显示抗TNFα疗法成功地治疗了葡萄膜炎、血管炎、史底耳氏病、炎性肠病、皮肌炎等免疫性疾病，使得特异性抗TNFα制剂逐渐成为当前治疗自身免疫性疾病最有潜力的免疫抑制剂之一。近些年来，围绕TNF-a与肿瘤的发生、发展的研究又成为一个新的研究热点，已有的研究结果表明TNF-a与肿瘤血管新生、耐药以及肿瘤的发生和转移有关。因此，阻断TNFα既能显著的改善上述免疫性疾病的症状，又能抑制肿瘤的发生、生长和转移。目前，TNF-a的抑制剂已被用于临床治疗一些血液及实体肿瘤，如骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化症、急性髓系白血病以及急性/慢性移植物抗宿主反应、卵巢癌、肾细胞癌等，并取得了安全有效的结果。

当前的TNFα制剂多为生物大分子药物，它们一方面具有特异性好、结合能力强的特点，但一方面稳定性较差，在患者体内易降解，且长期使用免疫源性强的生物大分子将会导致患者对其的免疫耐受，而这尤其对于自身免疫性疾病患者来说是不利的，因为这类患者是需要长期、反复使用免疫抑制药物，因此，探索新的免疫抑制剂研究策略来研制靶向抗TNFα的小分子药物，克服上述大分子药物的缺点，已成为国内当前临床免疫治疗急需解决的难题之一。

表1.TNF-a抑制剂

表2.2006年全球销售额最高的12种生物技术药物

毫无疑问，近十多年来，随着功能基因组时代的到来和蛋白质组学的高速发展，以及一些相关的新理论和新技术的大量涌现和广泛应用，尤其是多种核磁共振(NMR)技术和计算机辅助药物设计(computer-aided drug design，CADD)的串联应用，以及蛋白数据库(PDB)的不断扩大和分子模拟软件的不断更新，为解决上述难题提供了契机，并使得“订单式”设计和筛选小分子靶向药物正在成为可能。简单来说，这种新型药物研发战略分为六步：

1.从PDB文库中搜索靶蛋白与其受体或配体的复合晶体结构(TNF-β与其受体P55蛋白结合的复合晶体结构)，并将相关数据下载到计算机图形工作站，并分析两者结合部位的的详细结构性质，如静电作用、疏水作用和氢键结合等区域的分布，以及氨基酸残基的组成；

2.在计算机图形工作站上将上述受体与配体结合处的所有氨基酸残基或部分肽段作为一个整体剥离出来，并维持它们的三维空间构象不变，然后在SGI02(R12000)图形工作站上用InsightII软件分析和确定结合区配体或受体部分的核心结构及影响其亲合力的关键性氨基酸残基(受体P55蛋白第二结构域的第二loop环中一7肽片段(RKEMGQV，No.77-83))，最后以上述关键性氨基酸残基为不变的“锚点”，去除所有的水分子、杂原子等，经SYBYL模拟已归属力场后，供对接使用。受体或配体分子表面由DMS程序生成，然后基于上述“锚点”，用SPHGEN程序填充不同大小的刚性小球法来描述受体与配体结合时的结合腔穴的立体特征，取出分布不合理的圆球位点，得到由32个圆球堆积成的结合区负像，代表结合区特征，然后，编写输入文件dock.in，确定各个参数文件的位置，包括处理好的受体结构数据文件、活性位点负像数据文件、评分网格数据文件和配体结构数据文件及DOCK筛选时所需参数；

3.将specs等公司实物化合物小分子库进行搜集整理，形成二维SDF文件。利用Tripos公司SYBYL6.7软件包中的spl编程语言结合其他自行研究的辅助程序，在Unix和Linux***下，将收集的Specs化合物二位数据库文件自动转换为三维mol2格式的文件，其中包括加氢、加电荷和500步POWLL力场能量优化，然后在Linux下运行DOCK模拟和筛选，用锚点搜索(achor-first search)方法搜索上述数据库中小分子化合物与上述步骤2中结合区负像docking的可能的最好构象，再根据能量打分结果排列数据。

4.选择能量打分较低的500-1000个化合物，通过主要官能团相似性的聚类分析按照骨架结构将其分类，综合分析后最终选择并购买(或合成)50-100个代表性化合物做进一步生物活性测定；

5.生物学活性测定，包括体外细胞系或原代细胞上的活性实验和动物体内试验，如诱导或抑制细胞凋亡、促进或阻断细胞迁移、抑制或促进血管新生和对细胞周期影响等；

6.综合分析筛选出的小分子化合物，确定候选先导化合物，用以以后进一步的深入研究。

本研究即是基于生物大分子晶体结构、计算机虚拟筛选和细胞活性筛选技术，从已有的小分子化合物的实物库中筛选TNF-β和TNF-a的抑制剂。最终首次发现，本发明的取代芳香基腙类化合物能直接与TNF-a结合；能显著抑制TNF-β和TNF-a对L929细胞毒作用；能在体外抑制TNF-β和TNF-a诱导的L929细胞凋亡，显示出有效的药理活性。该化合物的研究及其研究过程中运用的方法将为今后研制靶向TNF分子的化学药物奠定理论和实验基础。在往后几年中，随着上述串联技术的日臻完善，大量的受体与配体结合处的精细结构性质将会被破译，也使得“订单式”研制精确靶向配体或受体的小分子药物成为可能，这将为免疫治疗学的发展提供了前所未有的机遇和挑战。在本发明以前，未见芳香基腙类化合物作为直接与TNF-β和TNF-a结合，抑制TNF-β和TNF-a的生物学活性的抑制剂的相关报道和专利申请。

发明内容

本发明的第一个目的在于公开了取代芳香基腙类化合物、衍生物及其盐在制备肿瘤坏死因子(TNF-a和TNF-β)抑制剂药物方面的应用。

本发明另一个目的是公开了取代芳香基腙类化合物、衍生物及其盐在制备治疗一些TNF相关的免疫性疾病，如风湿性关节炎、炎性肠道疾病、糖尿病、败血病、银屑病、强直性脊柱炎以及包括HIV在内的其他一些传染性疾病的药物方面的应用。

本发明还有一个目的是公开了取代芳香基腙类化合物、衍生物及其盐在制备治疗一些血液肿瘤，如骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化症、急性骨髓细胞白血病以及急性/慢性移植物抗宿主反应的药物方面的应用。

本发明再一个目的是公开了取代芳香基腙类化合物、衍生物及其盐在制备治疗一些实体肿瘤，如卵巢癌、肾细胞癌等疾病的药物方面的应用。

本发明的最后一个目的是在于提供用于治疗自身免疫性疾病和肿瘤的药物组合物，它包含取代芳香基腙类化合物、衍生物及其盐与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合。

本发明提供了如下的技术方案：

具有如下结构通式C的取代芳香基腙类化合物、衍生物及其盐作为抗肿瘤坏死因子抑制剂在临床上的应用

其中：

X₁为苯基、取代的苯基、杂环、取代的杂环；

X₂为苯基、取代的苯基、卤素、NO₂、H、OH、NH2、HSO3、直链或支链烷基；

X₃为苯基、取代的苯基；

X₁或/和X₂或/和X₃可以是含有单个或多个取代基，且分别处在芳香环或杂环的对位或/和邻位或/和间位。

本发明所述的X₁或/和X₂或/和X₃含有的取代基可以是C₁-C₆的直链或支链烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄全氟烷基、C₁-C₄酯基、取代芳基、卤素、NO₂、H、OH、NH₂、HSO₃、CH₃S。

通式C化合物药学上可接受的盐系指：本发明化合物与无机酸、有机酸成盐，特别优选的盐是：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、牛磺酸盐等等。作为所述的盐，它们还可以是与常规碱形成的盐，例如碱金属盐。

本发明所述的C₁-C₆直链或支链烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基等等。所述的C₁-C₃烷基或氯、氟取代C₁-C₃烷基，可以是甲基、乙基、丙基、氯乙基、氟乙基；C₁-C₄烷氧基或氯、氟单或双取代的C₁-C₃烷氧基；C₁-C₆烷氧基可以是甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、异丁氧基、氯乙氧基、氯丙氧基、1，1-二氯丙氧基、1-氟-2-氯丙氧基等等。

本发明优选所述的有药理活性的化合物选自如下的化合物。

实验编号C-12

3-苯-1-(4-苯-1，3-噻唑-2-yl)-1氢-吡唑-4，5-二酮-4-({4-氯-3-硝基苯}腙)结构式如下：

本发明与实验编号C-12有着相似功能的化合物如下：

3-苯-1-(4-苯-1，3-噻唑-2-yl)-1氢-吡唑-4，5-二酮-4-({4-氯-3-硝基苯}腙)；

(反式)-4-(2-(4-(2，4-二氯苄氧(基)苯亚甲基)肼基-N-(2，3-二甲基苯基)-6-(4-甲基哌啶-1-yl)-1，3，5-三嗪-2-胺；

(反式)-5-(6-(2-(2-苄氧基-3，5-二溴苯亚甲基)肼基)-[1，2，5]噁二唑[3，4-b]吡嗪-5-基氨基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮；

(反式)-2-(5-((2-(3-氰基-4-甲氧甲基-6-甲基吡啶-2-yl)亚肼)甲基)呋喃-2-yl)苯甲酸；

(反式)-N’-((2-(3-溴苄氧基)萘亚甲基-1-yl)亚甲基)-2-(3-氯苯基)丙基肼；

(反式)-2-(2-(4-甲氧基)-3-(2-硝基苄氧基)肼基)-4，6-二(哌啶-1-yl)-1，3，5-三嗪；

(顺式)-2-(2-((2-(2-(1-(4-氯苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-硫基)乙酰)亚肼)甲基)苯氧)乙酸。

2-羟基-3，5-二硝基苯甲醛[4-(苄胺基)-6-(二甲氨基)-1，3，5-三嗪-2-yl]腙

2-羟基-5-甲氧基苯甲醛[4-苯胺-6-(3，5-二甲基吡-1氢-吡唑-1-yl)-1，3，5-三嗪苯酰胺-2-yl]腙

本发明进一步公开了取代芳香基腙类化合物作为肿瘤坏死因子抑制剂的药物组合物，它含有取代芳香基腙类化合物以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

本发明所述化合物的药物组合物制备如下：

使用标准和常规的技术，使本发明化合物与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成微粒或微球。固体剂型包括片剂、分散颗粒、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、聚山梨酯80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。

药物组合物以及单元剂型中含有的活性成份(本发明化合物)的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定的加以应用，所用的化合物的量或浓度在一个较宽的范围内调节，通常，活性化合物的量范围为组合物的0.5％～90％(重量)。另一优选的范围为0.5％-70％。

本发明基于生物大分子晶体结构、计算机虚拟筛选和细胞活性筛选技术，从已有的小分子化合物的实物库中筛选TNF-β和TNF-a的抑制剂。实验中，我们用锚点搜索(achor-first search)方法搜索数据库中近10万个小分子化合物与配体结合区负像docking的可能的最好构象，DOCK程序会自动根据能量打分结果按照由高到低排列数据，再通过综合分析打分靠前的1000个化合物，选取其中有代表性的50个化合物进行生物学活性实验。下面将选购的前50个化合物中含腙结构的化合物选出，并将相对应的能量打分列表1。

表1.前50个化合物中部分含腙结构的化合物的化学结构式和能量打分值。

实验结果显示：上述的化合物不同程度的能抑制TNF-β和TNF-a对L929细胞毒作用，其中取代芳香基-腙类小分子化合物(C-12)具有明显的抑制TNF-β和TNF-a对L929细胞毒作用，显示出有效的药理活性。

附图说明：

图1.在SGI计算机工作站上图示TNF-α以及TNF-β晶体结构。TNF-α分子数据来自PDB中1TNF.pdb；TNF-β的来自1TNR.pdb；

图2.TNF-β与其受体P55蛋白结合的晶体结构(1TNR)及用于分子对接(docking)的配体模板的确定。TNF-β与其受体P55蛋白结合的晶体结构数据来自PDB中1TNR.pdb。

图3.Dock后965个化合物相互作用的能量分布图；

图4.化合物对TNF-a和TNF-β介导的L929细胞毒的抑制作用，包括图4-1，图4-2，图4-3，图4-4。

图5.C-12号化合物对TNF-a和TNF-β介导的细胞毒作用的抑制，包括图5-1，5-2。

图6.C-12号化合物直接抑制TNF-a与其受体的结合A和C分别表示空白和阴性对照(量子点标记的非相关蛋白*)，B、D和E为实验组。

图7.C-12号化合物的细胞毒性及其对TNF-a介导的细胞凋亡作用的抑制；A、B、C和D为C-12号化合物对TNF-a介导的细胞凋亡作用的抑制结果；E和F为该化合物的细胞毒性结果。所有反应体系中均加有1ug/ml放线菌素D。

图8.图像分析TNF-β与其受体P55蛋白第二结构域的第二loop环中9肽片段(No.75-83)以及小分子化合物C-12结合模式。结果显示TNF-β分子与9肽片段之间形成8个氢键(A)；与C-12形成4个氢键(B)。氢键以蓝色线条显示；TNF-β分子部分以细黑线条表示；配体分子和小分子化合物以粗线条表示。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围，本发明的化合物均采用常规方法制备或可以购买。为了表明目标小分子化合物的实用性，下面通过药效学实验进一步说明本发明化合物的作用。以典型的C-12号为例：3-苯-1-(4-苯-1，3-噻唑-2-yl)-1氢-吡唑-4，5-二酮-4-({4-氯-3-硝基苯}腙)，进一步的加以说明。

实验一.TNF-β与其受体P55蛋白结合的晶体结构(1TNR)及用于分子对接(docking)的配体模板的确定以及虚拟筛选候选化合物分子的过程。

原理：蛋白的晶体复合结构能准确的反映自然状态下受体和配体结合时各蛋白的空间构象，尤其是两种蛋白结合处的嵌合结构，为准确寻找蛋白的活性部位提供可能。计算机虚拟筛选就是基于蛋白的晶体结构发展来的一种药物筛选模式，简而言之，步骤如下：首先在计算机图形工作站上将受体与配体结合处的所有氨基酸残基作为一个整体剥离出来，并维持它们的三维空间构象不变，然后，确定结合区配体或受体部分的核心结构及影响其亲合力的关键性氨基酸残基，接着以上述关键性氨基酸残基为不变的“锚点”去除所有的水分子、杂原子等，经SYBYL模拟已归属力场后，再用SPHGEN程序填充不同大小的刚性小球法来描述受体与配体结合时的结合腔穴的立体特征，最后基于上述获得的腔穴的结构数据，与三维化的化学小分子进行docking，以寻找候选化合物分子。

实验方法：

1.三维化学信息学结构数据库的构建

将specs等公司实物化合物小分子库进行搜集整理，形成二维SDF文件。利用Tripos公司SYBYL6.7软件包中的spl编程语言结合其他自行研究的辅助程序，在Unix和Linux***下，将收集的Specs化合物二位数据库文件自动转换为三维mol2格式的文件，其中包括加氢、加电荷和500步POWLL力场能量优化。

2.计算机虚拟筛选的配体模板的选择

TNF-α分子数据来自PDB中1TNF.pdb；TNF-β与其受体P55蛋白结合的复合晶体结构来自1TNR.pdb。基于TNF-β与其受体P55蛋白结合的晶体结构，在INSIGHT II平台上选择配体P55上和TNF-α外表面空穴结构嵌合的一段突出环结构作为受体模板。

3.受体结构数据准备及负像生成

从蛋白质数据库(PDB)晶体结构数据库中下载肿瘤坏死因子β(TNF-β，LT)与其受体TNFR1(p55，55kDa)的复合晶体数据结构(1TNR.pdb)，去除所有的水分子、杂原子等，经SYBYL模拟已归属力场后，供对接使用。受体分子表面由DMS程序生成，然后用SPHGEN程序填充不同大小的小球法来描述在受体与配体结合时的结合腔穴的立体特征，取出分布不合理的圆球位点，得到由32个圆球堆积成的结合区负像，代表结合区特征。

4.对接与评分

编写输入文件dock.in，确定各个参数文件的位置，包括处理好的受体结构数据文件、活性位点负像数据文件、评分网格数据文件和配体结构数据文件及DOCK筛选时所需参数，然后在Linux下运行DOCK模拟和筛选。用锚点搜索(achor-first search)方法搜索上述数据库中配体可能的最好构象，根据能量打分结果排列数据。

实验结果：确定了用于计算机虚拟筛选TNF-α小分子抑制剂的的配体模板。

TNF-α分子和配体结合的晶体结构数据至今仍然未能获得，因此，本实验基于TNF-α以及TNF-β与其受体P55蛋白结合的晶体结构，以及TNF-a和TNF-β具有高度相似的空间结构及相同的受体(见图1)，采用计算机辅助设计确定用于分子对接(docking)的配体模板。通过比较分析上述蛋白晶体结构后，确定受体P55蛋白第二结构域的第二loop环中一7肽片段(RKEMGQV，No.77-83)作为docking的配体模板(见图2)。

基于上述配体模板的三维结构，用docking方法对Specs(含有约9万个小分子)三维数据库进行虚拟筛选后得到965种结构相似的化合物，然后从这965种化合物中选择能量打分最低的300种化合物(见图3)，通过主要官能团相似性的聚类分析按照骨架结构将其划分为48个大类然后遵循类药性和结构多样性的原则，总中挑选出有代表性的化合物，最后从Specs公司购买得到50个化合物进行活性筛选。

实验二.候选化合物对TNF-β和TNF-a介导的细胞毒的抑制作用。

原理：TNF-α主要由单核-巨噬细胞分泌；TNF-β主要由活化的T淋巴细胞分泌，两者均能体内外均能刺激IL-1的产生。TNF-α与TNF-β的生物学作用极为相似，在体内、体外均能杀死某些肿瘤细胞(cytolyticaction)，或抑制增殖作用(cytostaticaction)，这可能与分子结构的相似性和受体的同一性有关。TNF杀伤肿瘤的机理与补体或穿孔素(perforin)杀伤细胞相比有所不同，TNF杀伤细胞没有穿孔现象，而且杀伤过程相对比较缓慢。用放线菌素D、丝裂霉素C、放线菌酮等处理肿瘤细胞(如小鼠成纤维细胞株L929)可明显增强TNF-α与TNF-β杀伤肿瘤细胞活性。阻断TNF与其受体接合的拮抗剂能抑制上述TNF杀伤细胞的作用。

实验方法：

取处于对数生长期的小鼠成纤维细胞系L929细胞，以2×104个/孔的密度加入到96孔培养板中，每孔100ul RPMI1640培养液(10％胎牛血清)，并于37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时。在1640培养液中加入终浓度为1ug/ml ActD以及1.0ng/mlTNF-a，按100ul/孔加入到96孔板中，同时加入候选化合物，并设不同浓度孔。放入培养箱培养20小时后，每孔加入20ulMTT(5mg/ml)继续作用4小时。弃上清，按100ul/孔加入DMSO，震荡1min使沉淀充分溶解，在酶标仪上测定波长546nm时的OD值。按照以下公式计算细胞毒抑制率：[(ODactD+TNFa+compound-ODactD+TNFa)/(ODactD-ODactD+TNFa)]×100％

实验结果：用MTT的方法检测50个化合物对细胞毒的抑制作用(图4)，分别设20uM和4uM两个化合物浓度以及阴性对照组。其中C-12化合物对TNF-a与TNF-β介导的细胞毒有明显的抑制作用。

实验三.C-12号化合物抑制TNF-β和TNF-a对L929细胞毒作用实验。

原理：同上

实验方法：同上

实验结果：用MTT的方法检测C-12号化合物作用24h后对TNF-a细胞毒性的抑制(图5)。分别设7个浓度以及无效化合物(C-17)对照组。从图中可以看出，C-12号化合物对TNF-a(1.0ng/ml)与TNF-β(1.0ng/ml)的抑制呈浓度依赖型，而对照组无此抑制作用，两者间有显著性差异[(P＝0.0106)；(P＝0.0014)]。计算半数抑制浓度(half-maximum inhibition concentration，IC50)分别为10umol/L和19.8umol/L。

实验四.C-12号化合物对量子点标记TNF-a结合受体的抑制作用。

原理：量子点(Quantum Dots)，又叫做无机纳米晶体，具有独特的光学和电学性质。量子点可以作为荧光探针用于生物标记、生物检测和生物成像等方面。与有机荧光分子相比，量子点具有许多独特的光学特性：其发射峰波长可由组成材料和粒径大小来调节，其激发光波长范围很宽，此外，量子点具有良好的光化学稳定性，可以耐受更强的激发光和更长的光发射周期。量子点在偶联剂存在的反应体系中可与蛋白分子中的氨基、羟基、巯基等基团反应，从而被标记到蛋白分子上，作为指示荧光标记。被标记的蛋白与细胞结合后可以在流式细胞仪和荧光共聚焦显微镜上特征性的检出。

实验方法：

1.TNF-a与EviTag Quantum Dots的偶联

选用PBS(0.01mol/L，pH7.2)溶液为量子点、TNF-a的偶联缓冲液，按照1∶15∶4000的摩尔比加入水溶性量子点、TNF-a(约100ug)和EDC偶联剂，用NaOH调整pH至7.5，室温轻摇孵育2h。标记后的量子点-TNF-a复合物经高速离心分离纯化后溶解分散在1ml的PBS(0.01mol/L，pH7.2，0.5％BSA)中。

2.小分子化合物抑制量子点(Quantum Dots)标记的TNF-a与受体结合实验

取处于对数生长期的小鼠成纤维细胞系L929细胞6×105个加入流式管中，用PBS洗涤细胞两次备用。实验设3个不同的化合物浓度组，同时设非相关标记蛋白对照组和空白对照组。实验时向上述细胞管中每管中加入40ul量子点标记的TNF-a，并同时加入无关蛋白及不同浓度C-12号化合物。4℃孵育30min。用冷的PBS充分洗涤细胞3次，尔后每管加入400ulPBS，混匀，立即进行流式细胞仪检测。

实验结果：

小分子化合物C-12能够竞争性的抑制量子点标记的TNF-a与L929细胞表面受体的结合。从结果可以看出，C-12号化合物对TNF-a结合受体有明显的抑制，小分子化合物浓度为0.5mM和0.25mM时抑制率分别为25.4％和10.3％，呈浓度依赖性关系(见图6)。

实验五.C-12号化合物的细胞毒性及其对TNF-β和TNF-a介导的L929细胞凋亡的抑制作用。

原理：TNF-β和TNF-a通过与其受体结合，能介导对靶细胞的杀伤作用。细胞凋亡是细胞死亡的基本方式之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着重要作用。Annexin V是一种Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸发生特异性结合。以标记了FITC的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。Propidium iodide(PI)是-种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死亡的细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。将Annexin V和PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。

实验方法：取处于对数生长期的小鼠成纤维细胞系L929细胞，以6×105个/孔的密度加入到12孔培养板中，每孔1ml RPMI1640培养液(10％胎牛血清)，并于37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时。在1640培养液中加入终浓度为1ug/ml ActD以及5.0ng/mlTNF-a，按1ml/孔加入到96孔板中，同时加入目标化合物，并设不同浓度以及无TNF-a、无化合物对照孔，放入培养箱培养24小时。弃上清，0.25％胰酶消化3mins，用冷的PBS洗涤细胞2次，1×binding buffer将细胞稀释为1×106个/ml。取100ul细胞悬液(1×105个)至5ml流式管，加入5ul Annexin V-FITC及5ul PI，混匀，室温避光放置15mins。每个流式管中加入400ul 1×binding buffer，混匀，立即进行流式细胞仪检测。

实验结果：

TNF-a通过TNFR介导了caspase偶联的细胞凋亡信号通路。用TNF-a作用L929细胞，同时加入浓度分别为50uM和12.5uM的C-12号化合物，培养24h，并设PBS、单加小分子化合物以及无关小分子化合物对照组。结果表明：C-12号化合物对TNF-a诱导的细胞凋亡有明显的抑制作用，化合物浓度为50uM时凋亡抑制率为35.8％；12.5uM时为24.5％，呈浓度依赖关系(见图7)。单独加化合物对照组结果可以看出，C-12化合物自身对细胞的细胞毒毒性较低。

实验六.分子图像学比较分析筛选出的小分子化合物与P55受体的结合。

原理：同方法一。

实验方法：同方法一。

实验结果：

基于Chimera V.1.0软件分析结果显示：1TNR晶体结构中P55蛋白No.75-83肽段形成一个loop环，深嵌入配体的腔穴中，两者间通过8个氢键形成一个稳定的复合结构；C-12小分子能深入到配体的腔穴中，其中一个苯香环延伸到腔穴中心，该化合物能与配体形成5个氢键，其中有三个氢键形成位(Ser(No.82)、Lys(No.84)和Pro(No.155))与上述天然晶体复合物中相同，从而能占据受体与配体的结合位，阻断肿瘤坏死因子受体P55与其天然配体的结合(见图8)。

资料1.取代芳香基-腙类化合物(C-12)的动物体内毒性实验结果。

分析指标为LD50、半数致死剂量(Median Lethal Dose，LD50)：在一定时间内(通常为2周)经口或经皮给予受试样品后，使受试动物发生死亡概率为50％的剂量。以单位体重接受受试样品的质量(mg/kg bw或g/kg bw)来表示。

最低可见有害作用水平(Lowest Observed Adverse Effect Level，LOAEL)：在规定的试验条件下，受试样品引起实验动物形态、功能、生长发育等发生有害改变的最低染毒剂量或浓度。

综上所述，通过药理实验和结果分析进一步证明：本发明取代芳香基腙类化合物(C-12)可直接与TNF-a结合；能抑制TNF-β和TNF-a的生物学活性，并能在体外显著抑制TNF-a诱导的L929细胞凋亡，显示出有效的药理活性；同时具有低毒的特点，因此，有望作为抗TNF-a和TNF-β抑制剂在临床上推广应用，主要用于治疗一些TNF相关的免疫性疾病，如风湿性关节炎、炎性肠道疾病、糖尿病、败血病、银屑病、强直性脊柱炎以及包括HIV在内的其他一些传染性疾病，目前的TNF相关的研究进展还提示，该药物化合物还可能用于临床治疗一些血液及实体肿瘤，如骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化症、急性骨髓细胞白血病以及急性/慢性移植物抗宿主反应、卵巢癌、肾细胞癌等疾病。

制剂实施例1

每片含100mg活性成分的片剂制备：

将活性成分，乳糖、淀粉、微晶纤维素过100目筛，并充分混匀，将2％羟甲纤维素水溶液加入到上述混合粉末中混合，过20目筛制软材，制得湿颗粒于45-55℃干燥，将羧甲淀粉钠、硬脂酸镁加入到上述的干燥颗粒中压片。

制剂实施例2

每囊含100mg活性成分的胶囊的制备如下：

制剂实施例3

注射剂的制备

使pH值为7.0-7.5过滤滤液浓度为3毫克/毫升，按每安瓶2毫升分装，冷冻干燥后即得注射剂。

Claims (1)

1.3-苯-1-(4-苯-1，3-噻唑-2-yl)-1氢-吡唑-4，5-二酮-4-({4-氯-3-硝基苯}腙)作为肿瘤坏死因子抑制剂在制备抗风湿性关节炎、炎性肠道疾病、糖尿病、败血病、银屑病或强直性脊柱炎药物中的应用。

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