KR101656382B1 - 피리미딘-2,4-디아민 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 의한 화합물은 역형성 림프종 키나아제(ALK) 활성을 억제하는 효과가 우수하므로 이에 따른 EML4-ALK, NPM-ALK 등의 역형성 림프종 키나아제(ALK) 융합 단백질을 가진 암세포에 대한 치료효과가 향상될 수 있으며, 암의 재발을 막는데 효과적일 것으로 예상되므로 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

피리미딘-2,4-디아민 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물{pyrimidine-2,4-diamine derivatives and pharmaceutical composition for anti cancer containing the same as an active ingredient}
본 발명은 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암이란 개체의 필요에 따라 규칙적이고 절제 있는 증식과 억제를 할 수 있는 정상세포와 달리 조직 내에서 필요한 상태를 무시하고 무제한의 증식을 하는 미분화 세포로 구성된 세포덩어리로서 종양이라고도 한다. 이러한 무제한의 증식을 하는 암 세포는 주위의 조직으로 침투하고 더 심각한 경우는 신체의 다른 기관으로 전이가 되어 심각한 고통을 수반하고 결국 죽음을 초래하는 난치병이다.
미국암협회(American Cancer Society) 자료에 따르면 2007년 한해 세계적으로 새로이 암 진단을 받은 환자는 1200만 명 이상이며 사망자는 760만 명으로 매일 약 2만 명씩 암으로 사망하는 것으로 보고되었다. 우리나라의 경우 2006년 통계청 보고에 따르면 암으로 인한 사망이 사망원인 1위를 차지하였다. 따라서, 암 발생 및 투병으로 인한 정신적, 육체적 고통의 감소와 삶의 질 향상을 위해 치료 효과가 우수한 종양 치료제의 개발이 절실히 요구된다.
그러나 많은 노력에도 아직까지 정상세포가 어떠한 기전을 거쳐 암 세포로 형질전환이 되는지에 대해서는 정확하게 규명되지는 않았으나, 환경요인, 화학물질, 방사선, 바이러스 등 외적 요인 및 유전 인자, 면역학적 요인 등의 내적 요인 등이 복잡하게 얽혀 결과적으로 암이 발생한다. 암의 발생에 관련되는 유전자에는 종양형성 유전자(oncogenes)와 종양억제 유전자(tumor suppressor genes)가 있는데, 이들 사이의 균형이 위에서 설명한 내적 혹은 외적 요인들에 의해 무너질 때 암이 발생하게 된다.
암은 혈액암과 고형암으로 크게 분류되며, 폐암, 위암, 유방암, 구강암, 간암, 자궁암, 식도암, 피부암 등 신체의 거의 모든 부위에서 발생하며, 이들의 치료방법으로 최근 글리벡 또는 허셉틴과 같은 소수의 표적치료제가 특정암의 치료에 이용되고 있으나 현재까지는 수술이나 방사선 요법 및 세포증식을 억제하는 화학요법제를 이용한 항암제 치료가 주된 방법이다. 그러나 표적치료제가 아니기 때문에 기존 화학요법제의 가장 큰 문제는 세포독성으로 인한 부작용과 약제 내성으로써, 항암제에 의한 초기의 성공적인 반응에도 불구하고 결국에는 치료가 실패하게 되는 주요 요인이다. 따라서, 이러한 화학요법제의 한계를 극복하기 위해서는 항암작용 기전이 명확한 표적 치료제 개발이 지속적으로 필요하다.
이에, 표적 치료제를 개발하기 위한 종양 형성에 관여하는 특정 분자생물학적 인자들에 관한 많은 연구가 진행되고 있으며, 특히, 분자생물학적 인자들은 암의 예후예측이나 화학요법 및 방사선치료 여부를 결정하는데 다양하게 이용되고 있다.
특정 분자생물학적 인자 중의 하나인 타이로신 키나아제 수용체를 저해하는 가장 대표적인 약물로는 글리벡을 들 수 있다. 상기 글리벡은 만성골수성백혈병에서 관찰되는 필라델피아 염색체에서 염색체 전좌에 의해 형성되는 Bcr-Abl 융합유전자의 작용을 억제하여 항암 작용을 하며, 타이로신 키나아제 저해제로써, 만성골수성백혈병 환자에 투여 시 만족할 만한 성과를 거두고 있다. 이 후, 타이로신 키나아제 저해제로 항암 효과를 나타내는 약물로는 비소세포성 폐암 치료제로 사용되는 EGFR(epidermal growth factor receptor) 타이로신 키나아제 억제제인 게피티닙(gefitinib)와 엘로티닙(erlotinib)가 있고, 신장 세포암종 치료제로 소라페닙(sorafenib)과 수니티닙(sunitinib)이 사용되고 있으나, 출혈, 심장마비, 심부전, 간부전 등의 부작용이 있는 것으로 알려진바 있다.
최근에는 역형성 림프종 키나아제(ALK, Anaplastic lymphoma kinase)가 인체 여러 종양에서 발견되어 표적치료의 목표물로 연구되고 있다.
역형성 림프종 키나아제(ALK)의 발암과정은 주로 역형성 큰세포 림프종에서 관찰되는 ALK-NPM(Nucleophosmin, 뉴클레오포스민)의 융합유전자인 것으로 알려져 있다. 유전자 융합에 의해 역형성 림프종 키나아제(ALK)가 활성화되면 역형성 림프종 키나아제(ALK)가 갖고 있는 타이로신 키나아제는 비정상적으로 행동하여 암을 유발하게 된다. 즉, 비정상적으로 활성화된 역형성 림프종 키나아제(ALK)는 세포의 증식을 유도하고 아포프토시스를 방해해 세포가 사멸되지 않게 하며 세포뼈대를 재배열시키며 세포 형태를 변형시킨다. 역형성 림프종 키나아제(ALK)의 암 유전자화는 역형성 림프종 키나아제(ALK)의 표적 물질인 하위 분자(downstream molecule)와의 상호작용에 의해 이루어지는데, 하위 분자는 세포내 신호전달을 매개하는 물질이다. 역형성 림프종 키나아제(ALK)는 정상이거나 암 유전자화한 다른 타이로신 키나아제와 연결되어 상호작용을 하거나 여러 종류의 다른 경로들을 활성화시킨다.
특히, 폐암 세포의 내부에서 역형성 림프종 키나아제(ALK) 유전자는 EML4(Echinoderm Microtubule-Associated Protein-Like 4) 유전자와 융합하여 활성형 티로신 인산화 효소(tyrosine kinase)인 EML4-ALK를 생산하고, 이때, EML4-역형성 림프종 키나아제(ALK)의 암화 능력이 효소활성에 의존적이라는 것이 알려진 바 있고, 또한, Mosse 등은 491개의 신경모세포종 검체에서 약 26 %의 역형성 림프종 키나아제(ALK) 유전자 증폭에 대하여 보고한 바 있다. 뿐만 아니라, 역형성 림프종 키나아제(ALK) 유전자는 대형 B-세포 림프종, 전신성 조식구증, 염증성 근섬유아세포성 육종, 식도 편평 세포암, 비소세포폐암, 횡문근육종, 근섬유모세포종, 유방암 및 흑색종 세포주 등 수많은 비조혈세포 종양에서 발현되는 것으로 밝혀졌고, 염증성 골수섬유모세포종양이라는 희귀한 질환의 경우 여러 종류의 역형성 림프종 키나아제(ALK) 융합 단백질이 흔히 발견되어 이러한 융합 단백질들이 종양의 발생에 깊이 관련된 것으로 여겨지고 있다.
이에, 역형성 림프종 키나아제(ALK)의 활성화 경로를 차단함으로써, 암 치료를 목적으로 하는 ALK-NPM를 대상으로 한 치료제가 개발되고 있다. 최근 화이자(Pfizer)에서 종양원성 변이에 대한 선택적 억제제로 개발한 약물로 소분자 타이로신 인산화효소 억제제의 하나인 크리조티닙(PF-02341066)이 ATP 경쟁성 c-Met/HGFR와 역형성 림프종 키나아제(ALK) 저해제로써, 비소세포폐암의 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 2011년 FDA에서 신약으로 허가를 받았다.
또한, 노바티스(Novartis)사의 NVP-TAE684, LDK-378과 쥬가이(Chugai)사의 CH5424802도 역형성 큰세포 림프종 세포주 이외에 신경모세포종 세포주에서도 종양의 크기를 감소시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
특허문헌 1 내지 3에서는, 종래 역형성 림프종 키나아제(ALK) 활성을 저해하기 위한 용도로 다양한 골격을 가진 치료후보 물질이 개발되고 있고, 피리미딘 유도체가 림프종 키나아제(ALK)를 선택적으로 저해하여 항암제로 개발될 수 있음을 개시하고 있다.
이에, 본 발명자들은 역형성 역형성 림프종 키나아제(ALK, Anaplastic lymphoma kinase) 활성억제 효과를 나타내는 화합물을 개발하기 위해 노력하던 중, 특정 구조의 피리미딘-2,4-디아민 유도체가 역형성 림프종 키나아제(ALK)의 활성억제 효과가 현저히 우수한 것을 알아내어, 암의 예방 또는 치료제로 유용할 수 있음을 밝히고 본 발명을 완성하였다.
WO 2009143389 A1 WO 2008051547 A1 WO 2004080980 A1
본 발명의 목적은 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 피리미딘-2,4-디아민 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 역형성 림프종 키나아제(ALK, Anaplastic Lymphoma Kinase) 과활성으로 인하여 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 역형성 림프종 키나아제(ALK)의 저해제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014019931035-pat00001
상기 화학식 1에서,
Figure 112014019931035-pat00002
는 단일결합 또는 이중결합이고;
Figure 112014019931035-pat00003
이 단일결합인 경우,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, 할로겐, 또는 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C1 -10 직쇄 알킬이고;
R4는 -H, 비치환 또는 하나 이상의 -OH기가 치환된 C1 -10 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 -C(=O)R5이고, 여기서 R5는 -H, -OH, 또는 C1 -10 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
Figure 112014019931035-pat00004
이 이중결합인 경우,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, 할로겐, 또는 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C1 -10 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
R4는 -H, 비치환 또는 하나 이상의 -OH기가 치환된 C1 -10 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 -C(=O)R5이고, 여기서 R5는 -H, -OH, 또는 C1 -10 직쇄 또는 측쇄 알킬이다.
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1에서 제조한 화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 2);를 포함하는 상기 피리미딘-2,4-디아민 유도체의 제조방법을 제공한다.
[반응식 1]
Figure 112014019931035-pat00005
(상기 반응식 1에서,
R1, R2, R3 및 R4는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 역형성 림프종 키나아제(ALK, Anaplastic Lymphoma Kinase) 과활성으로 인하여 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 역형성 림프종 키나아제(ALK)의 저해제를 제공한다.
본 발명에 의한 화합물은 역형성 림프종 키나아제(ALK) 활성을 억제하는 효과가 현저히 우수하므로 이에 따른 EML4-ALK, NPM-ALK 등의 역형성 림프종 키나아제(ALK) 융합 단백질을 가진 암세포에 대한 치료효과가 향상될 수 있으며, 암의 재발을 막는데 효과적일 것으로 예상되므로 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014019931035-pat00006
상기 화학식 1에서,
Figure 112014019931035-pat00007
는 단일결합 또는 이중결합이고;
Figure 112014019931035-pat00008
이 단일결합인 경우,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, 할로겐, 또는 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C1 -10 직쇄 알킬이고;
R4는 -H, 비치환 또는 하나 이상의 -OH기가 치환된 C1 -10 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 -C(=O)R5이고, 여기서 R5는 -H, -OH, 또는 C1 -10 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
Figure 112014019931035-pat00009
이 이중결합인 경우,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, 할로겐, 또는 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C1 -10 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
R4는 -H, 비치환 또는 하나 이상의 -OH기가 치환된 C1 -10 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 -C(=O)R5이고, 여기서 R5는 -H, -OH, 또는 C1 -10 직쇄 또는 측쇄 알킬이다
바람직하게는,
Figure 112014019931035-pat00010
이 단일결합인 경우,
상기 R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, 할로겐, 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C1 -5 직쇄 알킬이고;
R4는 -H, 비치환 또는 하나 이상의 -OH기가 치환된 C1 -5 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 -C(=O)R5이고, 여기서 R5는 -OH, 또는 C1 -5 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
Figure 112014019931035-pat00011
이 이중결합인 경우,
상기 R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, 할로겐, 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C1 -5 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
R4는 -H, 비치환 또는 하나 이상의 -OH기가 치환된 C1 -5 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 -C(=O)R5이고, 여기서 R5는 -OH, 또는 C1 -5 직쇄 또는 측쇄 알킬이다.
더욱 바람직하게는,
Figure 112014019931035-pat00012
이 단일결합인 경우,
상기 R1은 -Cl, 또는 -CF3이고;
R2는 -H, -CH3, 또는 -F이고;
R3는 -CH3, 또는 -CHF2이고;
R4는 -H, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2OH, -C(=O)CH3, 또는 -C(=O)OH이고;
Figure 112014019931035-pat00013
이 이중결합인 경우,
상기 R1은 -Cl, 또는 -CF3이고;
R2는 -H, -CH3, 또는 -F이고;
R3는 -CH3, -CH(CH3)2, 또는 -CHF2이고;
R4는 -H, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2OH, -C(=O)CH3, 또는 -C(=O)OH이다.
상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체의 바람직한 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다.
(1) 5-클로로-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
(2) 5-클로로-N2-(2-이소프로폭시-5-메틸-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
(3) 5-클로로-N2-(2-(디플루오로메톡시)-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)-N4-(2(이소프로필술포닐_페닐)피리미딘-2,4-디아민;
(4) 5-클로로-N2-(2-(디플루오로메톡시)-4-(피페리딘-4-일)페닐)-N4 (2(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
(5) 5-클로로-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(피페리딘-4-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
(6) N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민;
(7) N2-(2-이소프로폭시-5-메틸-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)-N4-(2(이소프로필술포닐)페닐)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민;
(8) N2-(2-(디플루오로메톡시)-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민;
(9) N2-(2-(디플루오로메톡시)-4-(피페리딘-4-일)페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민;
(10) 5-클로로-N2-(5-플루오로-2-메톡시-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
(11) 5-클로로-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-5-메틸-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
(12) 5-클로로-N2-(5-플루오로-2-메톡시-4-(피페리딘-4-일)페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
(13) 5-클로로-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-5-메틸-4-(피페리딘-4-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
(14) 5-클로로-N2-(4-(1-에틸-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)-2-메톡시페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
(15) 5-클로로-N2-(4-(1-에틸-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)-2-메톡시페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
(16) 1-(4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-3-메톡시페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-일)에탄온;
(17) 4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-3-메톡시페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카르복시산;
(18) 4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-3-메톡시페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-메틸.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산과 같은 유기산으로부터 얻었다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 피리미딘-2,4-디아민 유도체를 유기용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조하여 제조되거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조하거나 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 및 이의 약학적으로 허용하는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 이성질체 등을 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1에서 제조한 화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 2);를 포함하는 제1항의 피리미딘-2,4-디아민 유도체의 제조방법을 제공한다.
[반응식 1]
Figure 112014019931035-pat00014
상기 반응식 1에서, R1 내지 R4는 본 명세서에서 정의한 바와 같다.
이하, 본 발명에 따른 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계이다.
구체적으로, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물을 유기용매 및 염기 하에서 화학식 3으로 표시되는 화합물과 알킬화 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다.
이때, 사용가능한 용매는 테트라하이드로퓨란; 다이옥산; 에틸에테르, 1,2-다이메톡시에탄 등을 포함하는 에테르용매; 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 포함하는 저급 알코올; 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 아세토나젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시크레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
또한, 상기 염기는 피리딘, 트리에틸아민, N,N-다이이소프로필에틸아민(DIPEA), 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]-7-운테센(DBU) 등의 유기염기; 또는 소듐하이드록사이드, 소듐카보네이트, 포타슘카보네이트, 세슘카보네이트, 소듐하이드라이드 등의 무기염기를 당량 또는 과량으로 사용할 수 있으며, 반응온도는 50-200 ℃, 교반시간은 0.5-20 시간을 가진다.
상기 반응을 수행한 후, 유기용매로 추출, 건조, 여과 및 감압 증류하는 과정을 수행하고 추가적으로 칼럼크로마토그래피를 수행하여 상기 화학식 4로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 제조한 화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계이다.
구체적으로, 상기 화학식 4로 표시되는 화합물을 유기용매 및 염기 하에서 화학식 5로 표시되는 화합물과 알킬화 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다.
이때, 사용가능한 용매는 테트라하이드로퓨란; 다이옥산; 에틸에테르, 1,2-다이메톡시에탄 등을 포함하는 에테르용매; 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 포함하는 저급 알코올; 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO); 아세토나젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시크레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
또한, 상기 염기는 피리딘, 트리에틸아민, N,N-다이이소프로필에틸아민(DIPEA), 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]-7-운테센(DBU) 등의 유기염기; 또는 소듐하이드록사이드, 소듐카보네이트, 포타슘카보네이트, 세슘카보네이트, 소듐하이드라이드 등의 무기염기를 당량 또는 과량으로 사용할 수 있으며, 반응온도는 50-200 ℃, 교반시간은 0.5-20 시간을 가진다.
상기 반응을 수행한 후, 유기용매로 추출, 건조, 여과 및 감압 증류하는 과정을 수행하고 추가적으로 칼럼크로마토그래피를 수행하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 역형성 림프종 키나아제(ALK, Anaplastic Lymphoma Kinase) 과활성으로 인하여 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 역형성 림프종 키나아제(ALK, Anaplastic Lymphoma Kinase) 저해제를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물 및 저해제는 역형성 림프종 키나아제(ALK, Anaplastic Lymphoma Kinase)의 활성을 억제하여 암세포의 발현 및 성장을 억제하는 것을 특징으로 한다.
역형성 림프종 키나아제(ALK)는 암세포에 존재하는 암의 세포증식을 유도하는 유전자로써, 유전자 융합 과정에 의해 역형성 림프종 키나아제(ALK)가 활성화되고, 이때, 역형성 림프종 키나아제(ALK)가 가지고 있는 타이로신 키나아제가 비정상적으로 행동하여 세포의 증식을 유도하고, 아포프토시스를 방해해 세포가 사멸되지 않게 하며 세포뼈대를 재배열시키며 세포 형태를 변형시킬 뿐만 아니라, 역형성 림프종 키나아제(ALK)는 정상이거나 암 유전자화한 다른 타이로신 키나아제와 연결되어 상호작용을 하거나 여러 종류의 다른 경로들을 활성화시킨다.
이에, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체의 역형성 림프종 키나아제(ALK) 활성을 검증하기 위해, 본 발명에 따른 화합물들을 역형성 림프종 키나아제(ALK) 효소 및 여러 암세포에 처리한 후 IC50 및 GI50을 측정한 결과, 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 중 대부분의 화합물들이 대조군(크리조티닙 및 LDK-378) 화합물에 비하여 활성이 우수한 것으로 나타났다(실험예 1-4 참조).
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체들은 역형성 림프종 키나아제(ALK)의 활성을 억제하여 암을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 비소세포폐암, 신경모세포종, 염증성 골수섬유모세포종양, 종횡문근육종, 근섬유모세포종, 유방암, 위암, 폐암, 흑색종, 대형 B-세포 림프종, 전신성 조식구증, 염증성 근섬유아세포성 육종, 식도 편평 세포암, 자궁암, 전립선암 등에 유용할 수 있다.
본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예 : 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오즈 및/또는 글리신), 활택제(예 : 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체를 유효성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.
이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달리질 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 1000 mg/kg/일의 양으로 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격을 1일 수회, 바람직하게는 1일 1회 내지 3회로 분할하여 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여할 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체의 제조방법을 제조예 또는 실시예를 통해 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체를 제조하는 방법의 일례로서, 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 한정하지 않는다. 하기 실시예에 의해 설명되는 제조방법은 유기합성 분야에서 잘 알려진 합성조건, 적절한 시약 등을 사용하여 얻을 수 있다.
< 실시예 1> 5- 클로로 - N4 -(2-(이소프로필술포닐)페닐)- N2 -(2-메톡시-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민의 제조
단계 1 : tert -부틸 4-(4-((5- 클로로 -4-((2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )아미노)피리미딘-2-일)아미노)-3- 메톡시페닐 )-5,6- 디하이드로피리딘 -1(2H)-카복시레이트 의 제조
Figure 112014019931035-pat00015
2,5-디클로로-N-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-4-아민 1.6g(4.6mmol)을 THF 25ml에 녹인 후 tert-부틸 4-(4-아미노-3-메톡시페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 1.4g(4.6mmol)을 첨가하고, 잔트포스 266mg (0.46mmol), Cs2CO3 4.5g(13.8mmol)을 순서대로 첨가한 후, 질소를 충전하여 탈 가스 하였다. Pd(OAc)2 (51.6mg, 0.23mmol)를 첨가하고, 질소 충전 후 130℃에서 18시간 교반하였다. 반응 종료 후, EA/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조하여 필터 후 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(Hx:EA 4:1)를 이용하여 목적 화합물 330mg을 20%의 수율로 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 300MHz) δ 9.55(s,1H),8.58(d,J=8.4Hz,1H), 8.24(d,J=8.7Hz,1H),8.16(s,1H), 7.94(d,J=8.1Hz,1H),7.68(t,J=7.8Hz,1H), 7.59(s,1H), 6.92(s,2H),6.0-5.98(m,1H), 4.09(s,2H), 3.92(s,3H),3,65-3.63(m,2H),3.29-3.19(m,1H),2.53(s,2H),1.66(s,3H),1.49(s,9H), 1.32(d,J=6.9Hz,6H).
단계 2 : 5- 클로로 - N4 -(2-(이소프로필술포닐)페닐)- N2 -(2-메톡시-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00016
상기 단계 1에서 얻은 tert-부틸 4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-3-메톡시페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 화합물 1.13mg(1.84mmol)을 MeOH에 녹인 후, 4M HCl이 용해된 디옥산 6ml를 첨가한 후, 상온에서 0.5시간 교반하였다. 반응이 종료된 후, HCl을 제거하고 에테르로 디캔팅(decanting)하여 목적 화합물 300mg을 99%의 수율로 얻었다.
1H NMR (MeOH, 300MHz) δ 8.28(s,1H), 8.22-8.21(m,1H), 8.04(d,J=4.8Hz,1H), 7.75-7.56(m,1H),7.62-7.58(m,1H),7.51(d,J=5.1Hz,1H),7.20(s,1H),7.01-7.00(m,1H),6.24(s,1H),3.94(s,3H), 3.91(s,2H), 3.43-3.40(m,1H), 2.85(s,2H), 1.26(d,J=13.2,6Hz).
< 실시예 2> 5- 클로로 - N2 -(2- 이소프로폭시 -5- 메틸 -4-(1,2,3,6- 테트라하이드로피리딘 -4-일) 페닐 )- N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
단계 1 : tert -부틸 4-(4-((5- 클로로 -4-((2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )아미노)피리미딘-2-일)아미노)-5- 이소프로폭시 -2- 메틸페닐 )-5,6- 디하이드로피리딘 -1(2H)-카복시레이트의 제조
Figure 112014019931035-pat00017
2,5-디클로로-N-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-4-아민 1g(2.88 mmol)을 THF 20ml에 녹인 후 tert-부틸 4-(4-아미노-5-이소프로폭시-2-메틸페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 955mg(2.88 mmol)을 첨가하고, 잔트포스 167mg(0.288mmol) 및 Cs2CO3 2.8g(8.64mmol)을 순서대로 넣어 준 후 질소 충전시켜 준 후 탈 가스 하였다. Pd(OAc)2 (32mg,0.144mmol)를 첨가하고, 질소 충전 후 130℃에서 18시간 교반하였다. 반응 종료 후, EA/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조하여 필터 후 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(Hx:EA 4:1)를 이용하여 목적 화합물 642 mg을 34%의 수율로 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 300MHz) δ 9.49(s,1H), 8.57(d,J=8.4Hz,1H), 8.16(s,1H), 8.04(s,1H), 7.94(dd,J=0.9Hz, 1.2Hz,1H), 7.66-7.59(m,2H), 6.63(s,1H), 5.54(brs,1H), 4.58-4.54(m,1H), 4.04(s,2H), 3.63(t,J=5.4Hz,2H), 3.30-3.21(m,1H), 2.35-2.33(m,2H), 2.09(s,3H), 1.50(s,9H), 1.38(d,J=6.0Hz, 6H), 1.33(d,J=6.9Hz,6H).
단계 2 : 5- 클로로 - N2 -(2- 이소프로폭시 -5- 메틸 -4-(1,2,3,6- 테트라하이드로피리딘 -4-일) 페닐 )- N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00018
상기 단계 1에서 얻은 tert-부틸 4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-5-이소프로폭시-2-메틸페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 화합물 600mg(0.91mmol)을 MeOH에 녹인 후, 4M HCl이 용해된 디옥산 5ml를 첨가한 후, 상온에서 0.5시간 교반하였다. 반응이 종료된 후, HCl을 제거하고 에테르로 디캔팅(decanting)하여 목적 화합물 630 mg을 99%의 수율로 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 300MHz) δ 8.27(brs,2H), 8.04(d,J=7.5Hz,1H), 7.78-7.73(m,1H), 7.60-7.55(m,1H), 7.34(s,1H), 6.87(s,1H), 5.66(s,1H), 3.84(s,2H), 3.65(s,3H), 2.61(s,2H), 2.13(s,3H), 1.30(d,J=6Hz,6H), 1.26(d,J=6.9Hz,6H).
< 실시예 3> 5- 클로로 - N2 -(2-( 디플루오로메톡시 )-4-(1,2,3,6- 테트라하이드로피리딘 -4-일) 페닐 )- N4 -(2-( 이소프로필술포닐페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
단계 1 : tert -부틸 4-(4-((5- 클로로 -4-((2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )피리미딘-2-일)아미노)-3-( 디플루오로메톡시 ) 페닐 )-5,6- 디하이드로피리딘 -1(2H)- 카복시레이 트 의 제조
Figure 112014019931035-pat00019
2,5-디클로로-N-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-4-아민 200 mg(0.58 mmol)을 THF 5 ml에 녹인 후 tert-부틸 4-(4-아미노-3-(디플루오로메톡시)페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 195 mg(0.58 mmol)을 첨가해주고 잔트포스 33 mg (0.058 mmol), Cs2CO3 550 mg(1.74 mmol)을 순서대로 넣어 준 후 질소 충전시켜 준 후에 탈 가스 하였다. Pd(OAc)2를 첨가하고, 질소 충전 후 130℃에서 18시간 교반하였다. EA/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조하여 필터 후 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(Hx:EA 6:1)를 이용하여 목적 화합물 120 mg을 32%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.53(d, J=8.4Hz, 1H), 8.31(d, J=9.0Hz, 1H) , 8.18(s, 1H), 7.94(d, J=8.1Hz, 1H) 7.66(t, J=7.2, 1H) 7.33-7.29(m, 2H), 7.17(d, J=5.1Hz, 2H), 6.01(s, 1H), 4.08(s,2H) 3.66(t, J=5.4Hz, 2H), 3.26-3.21(m, 1H), 2.50(s, 2H), 1.49(s,9H), 1.33(d, J=6.6, 6H).
단계 2 : 5- 클로로 - N2 -(2-( 디플루오로메톡시 )-4-(1,2,3,6- 테트라하이드로피리딘 -4-일) 페닐 )- N4 -(2-( 이소프로필술포닐페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00020
상기 단계 1에서 얻은 tert-부틸 4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-2-일)아미노)-3-(디플루오로메톡시)페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 화합물 100 mg(0.154 mmol)을 MeOH에 녹인 후, 4M HCl이 용해된 디옥산 7 ml를 첨가한 후 , 상온에서 1시간 교반하였다. 반응이 종료된 후, HCl을 제거하고 에테르로 디캔팅(decanting)하여 목적 화합물(노란색 고체, 90mg)을 95%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300 MHz, MeOD) δ 8.31(s, 1H), 8.11-8.00(m, 1H), 8.00(d, J=10.8Hz, 1H), 7.62-7.55(m, 4H), 7.38(s,1H), 6.24(d, J=0.9Hz, 1H) 3.9(s, 2H), 3.50(s,2H), 2.82(s, 2H), 1.23(d, J=4.2Hz, 6H).
< 실시예 4> 5- 클로로 - N2 -(2-( 디플루오로메톡시 )-4-(피페리딘-4-일) 페닐 )- N4 -(2-(이 소프로필술 포닐) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
단계 1 : tert -부틸 4-(4-((5- 클로로 -4-((2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )아미노)피리미딘-2-일)아미노)-3-( 디플루오로메톡시 ) 페닐 )피페리딘-1- 카복시레이트의 제조
Figure 112014019931035-pat00021
2,5-디클로로-N-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-4-아민 87mg(0.25mmol)을 THF 3ml에 녹인 후 tert-부틸 4-(아미노-3-(디플루오로메톡시)페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 85mg(0.25mmol)을 첨가하고, 잔트포스 15mg(0.025mmol), Cs2CO3 244g(0.75mmol)을 순서대로 첨가한 후, 질소를 충전하여 탈 가스 하였다. Pd(OAc)2 (2.8mg,0.013mmol)를 첨가하고, 질소 충전 후 130℃에서 18시간 교반하였다. 반응 종료 후, EA/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조하여 필터 후 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(Hx:EA 4:1)를 이용하여 목적 화합물 25mg을 18%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300 MHz,CDCl3) δ 9.61(s, 1H), 8.53(d, J=8.4Hz, 1H), 8.22(t, J=8.1Hz, 2H), 7.93(d, J=7.8, 1H), 7.64(t, J=8.1, 1H), 7.28(d, J=7.5Hz, 2H), 7.01(d, J=8.7Hz, 2H), 4.28-4.24(m, 2H), 3.25-3.21(m, 1H), 2.84(t, J=12.9Hz, 2H) 2.67(t, J=12.3Hz, 1H), 2.17(s, 1H), 1.85(d, J=12.3Hz, 2H), 1.49(s,9H), 1.32(d, J=6.6Hz, 6H).
단계 2 : 5- 클로로 - N2 -(2-( 디플루오로메톡시 )-4-(피페리딘-4-일) 페닐 )- N4 -(2-(이 소프로필술 포닐) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00022
상기 단계 1에서 얻은 tert-부틸 4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-3-(디플루오로메톡시)페닐)피페리딘-1-카복시레이트 화합물 23mg(0.042mmol)을 MeOH에 녹인 후, 4M HCl이 용해된 디옥산 3ml를 첨가한 후, 상온에서 1시간 교반하였다. 반응이 종료된 후, HCl을 제거하고 에테르로 디캔팅(decanting)하여 목적 화합물(노란색 고체, 21mg)을 93%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300 MHz,MeOD) δ 8.26-8.25(m,1H), 8.16-8.14(m,1H) 7.95-7.94(m,1H) 7.68-7.48(m,2H), 7.24-7.07(m,1H), 3.64(s,1H), 3.57-3.51(m,1H), 1.28(d, J=19.8Hz, 6H).
< 실시예 5> 5- 클로로 - N4 -(2-(이소프로필술포닐)페닐)- N2 -(2-메톡시-4-(피페리딘-4-yl)페닐)피리미딘-2,4-디아민의 제조
단계 1 : tert -부틸 4-(4-((5- 클로로 -4-((2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )아미노)피리미딘-2-일)아미노)-3- 메톡시페닐 )피페리딘-1- 카복시레이트의 제조
Figure 112014019931035-pat00023
2,5-디클로로-N-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-4-아민 274g(0.79mmol)을 THF 20ml에 녹인 후 tert-부틸 4-(4-아미노-3-메톡시페닐)피페리딘-1-카복시레이트 243g(0.79mmol)을 첨가하고, 잔트포스 46mg (0.079mmol), Cs2CO3 772g(2.37mmol)을 순서대로 첨가한 후, 질소를 충전하여 탈 가스 하였다. Pd(OAc)2 (8.86mg,0.039mmol)를 첨가하고, 질소 충전 후 130℃에서 18시간 교반하였다. 반응 종료 후, EA/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조하여 필터 후 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(Hx:EA 4:1)를 이용하여 목적 화합물 180mg을 37%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9.54(s, 1H), 8.59(d, J=8.4Hz, 1H), 8.17(d, J=7.5Hz, 2H), 7.93-7.90(m,1H), 7.67-7.50(m,1H), 7.30(s,1H), 7.30-7.28(d, J=7.8Hz, 1H), 6.75-6.73(m,2H), 4.23(brs, 2H), 4.15-4.08(m, 1H), 3.8(s, 3H), 3.26-3.22(m,1H), 2.85-2.76(m,2H), 2.66-2.58(m,1H), 1.86-1.81(m,2H), 1.49(s, 9H), 1.32(d, J=6.6Hz, 6H).
단계 2 : 5- 클로로 - N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )- N2 -(2- 메톡시 -4-(피페리딘-4- yl ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00024
상기 단계 1에서 얻은 tert-부틸 4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-3-메톡시페닐)피페리딘-1-카복시레이트 화합물 170mg(0.28mmol)을 MeOH에 녹인 후, 4M HCl이 용해된 디옥산 3ml를 첨가한 후, 상온에서 0.5시간 교반하였다. 반응이 종료된 후, HCl을 제거하고 에테르로 디캔팅(decanting)하여 목적 화합물 150 mg을 99%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300 MHz, MeOD) δ 8.22(brs,1H), 8.01(d, J=5.7Hz , 1H) 7.75-7.73(m,1H), 7.59-7.57(m,1H), 7.38-7.36(m, 1H), 7.05(s,1H), 6.86-6.83(m, 1H), 3.89(s, 3H), 3.55-3.49(m,2H) 3.20-3.16(m, 2H), 3.01-2.94(m,1H), 2.11-1.95(m, 4H), 1.25(d, J=5.4Hz, 6H).
< 실시예 6> N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )- N2 -(2- 메톡시 -4-(1,2,3,6- 테트라하이드로피리딘 -4-일) 페닐 )-5-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
단계 1 : tert -부틸 4-(4-((4-((2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )아미노)-5-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-2-일)아미노)-3- 메톡시페닐 )-5,6- 디하이드로피리딘 -1(2H)-카복시레이트의 제조
Figure 112014019931035-pat00025
2-클로로-N-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-아민 100mg(0.26mmol)을 THF 2ml에 녹인 후 tert-부틸 4-(4-아미노-3-메톡시페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 160mg(0.53mmol)을 첨가하고, 잔트포스 15mg (0.026mmol), Cs2CO3 275g(0.79mmol)을 순서대로 첨가한 후, 질소를 충전하여 탈 가스 하였다. Pd(OAc)2 (3mg, 0.013mmol)를 첨가하고, 질소 충전 후 150℃에서 2시간 교반하였다. 반응 종료 후, EA/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조하여 필터 후 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(Hx:EA 4:1)를 이용하여 목적 화합물 15mg을 8.4%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300 MHz,CDCl3) δ 9.63(s,1H), 8.60(s,1H), 7.92(d,J=6Hz, 1H), 7.82(d,J=9Hz,1H), 7.14-7.06(m,3H), 6.98-6.88(m,1H), 6.19(s,1H),4.17(s,1H), 4.07(brs,1H), 3.90(s,1H), 3.73(s,1H), 3.64(s,3H), 3.17-3.13(m,1H). 2.62(s,1H), 2.51-2.49(m,1H), 2.2(s,1H), 1.49(s,9H), 1.27(d,J=5.7Hz,6H).
단계 2 : N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )- N2 -(2- 메톡시 -4-(1,2,3,6- 테트라하이드로피리딘 -4-일) 페닐 )-5-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00026
상기 단계 1에서 얻은 tert-부틸 4-(4-((4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일)아미노)-3-메톡시페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 14mg(0.021mmol)을 MeOH에 녹인 후, 4M HCl이 용해된 디옥산 2ml를 첨가한 후, 상온에서 0.5시간 교반하였다. 반응이 종료된 후, HCl을 제거하고 에테르로 디캔팅(decanting)하여 목적 화합물 14mg을 99%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300MHz,MeOD) δ 8.49-8.47?m,1H), 8.00(d,J=1.5Hz,2H), 7.77-7.76(m,1H),7.61-7.58(m,3H), 7.13-7.11(m,1H), 6.86-6.84(m,1H),6.18(s,1H), 3.9(s,3H), 3.88-3.86(m,2H), 3.50-3.47(m,2H), 2.82-2.79(m,2H), 1.22(d,J=3Hz, 6H).
< 실시예 7> N2 -(2- 이소프로폭시 -5- 메틸 -4-(1,2,3,6- 테트라하이드로피리딘 -4-일) 페닐 )- N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )-5-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
단계 1 : tert -부틸 4-(5- 이소프로폭시 -4-((4-((2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )아미노)-5-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-2-일)아미노)-2- 메틸페닐 )-5,6- 디하이드로피리딘 -1(2H)-카복시레이트 의 제조
Figure 112014019931035-pat00027
2-클로로-N-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-아민 5mg(0.58mmol)을 THF 2ml에 녹인 후 tert-부틸 4-(4-아미노-5-이소프로폭시-2-메틸페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 139mg(0.42mmol)을 첨가하고, 잔트포스 12mg (0.021mmol), Cs2CO3 205g(0.63mmol)을 순서대로 첨가한 후, 질소를 충전하여 탈 가스 하였다. Pd(OAc)2(3mg,0.0105mmol)를 첨가하고, 질소 충전 후 150℃에서 2시간 동안 가열하였다. 반응 종료 후, EA/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조하여 필터 후 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(Hx:EA 4:1)를 이용하여 목적 화합물 26mg을 17%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300 MHz,CDCl3) δ 9.12(s,1H), 8.41(s,1H), 8.31-8.28(m,1H), 7.97(d,J=7.8Hz,2H), 7.82(s,1H), 7.64-7.58(m,1H), 7.34-7.26(m,1H),6.63(s,1H), 5.54-5.53(m,1H), 4.59(t,J=6Hz,1H), 4.03(s,2H), 3.63-3.59(m,2H), 3.26-3.21(m,1H), 2.32(s,2H), 1.97(s,3H), 1.50(s,9H), 1.38(d,J=6.3Hz,6H), 1.31(d,J=6.9Hz,6H).
단계 2 : N2 -(2- 이소프로폭시 -5- 메틸 -4-(1,2,3,6- 테트라하이드로피리딘 -4-일) 페닐 )- N4 -(2-( 이소프로필술포닐 )페닐)-5-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00028
상기 단계 1에서 얻은 tert-부틸 4-(5-이소프로폭시-4-((4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일)아미노)-2-메틸페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 26mg(0.038mmol)을 MeOH에 녹인 후, 4M HCl이 용해된 디옥산 3ml를 첨가한 후, 상온에서 1시간 교반하였다. 반응이 종료된 후, HCl을 제거하고 에테르로 디캔팅(decanting)하여 목적 화합물 25mg을 99%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300 MHz,MeOD) δ 8.54-8.50(m,1H), 8.05(d,J=9Hz,1H), 7.80-7.75(m,1H), 7.63-7.58(m,1H),7.35(s,1H), 6.82(s,1H), 5.63(d,J=1.2Hz,1H), 4.66-4.62(m,1H), 3.83(s,2H), 3.74-3.72(m,1H), 3.59-3.57(m,1H), 2.58(s,2H), 2.03-2.01(s,3H), 1.32(d,J=6Hz,6H), 1.24(d,J=6.9Hz, 6H).
< 실시예 8> N2 -(2-( 디플루오로메톡시 )-4-(1,2,3,6- 테트라하이드로피리딘 -4-일) 페닐 )- N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )-5-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-2,4- 디아 민의 제조
단계 1 : tert -부틸 4-(3-( 디플루오로메톡시 )-4-((4-((2-( 이소프로필술포닐 )페닐)아미노)-5-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-2-일)아미노) 페닐 )-5,6- 디하이드로피리딘 -1(2H)-카복시레이트 의 제조
Figure 112014019931035-pat00029
2-클로로-N-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-아민 35mg(0.08mmol)을 THF 2ml에 녹인 후 tert-부틸 4-(4-아미노-3-(디플루오로메톡시)페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 54mg(0.16mmol)을 첨가하고, 잔트포스 5mg(0.008mmol), Cs2CO3 77mg(0.24mmol)을 순서대로 첨가한 후, 질소를 충전하여 탈 가스 하였다. Pd(OAc)2 (1mg, 0.004mmol)를 첨가하고, 질소 충전 후 150℃에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, EA/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조하여 필터 후 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(Hx:EA 4:1)를 이용하여 목적 화합물 3.5mg을 7%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9.25(s,1H), 8.43(s,1H), 8.30-8.27(m,1H), 8.23-8.20(m,1H),7.97-7.94(m,1H),7.65-7.59(m,1H), 7.54(s,1H), 7.37-7.32(m,1H), 7.16(s,1H), 7.11-7.08(m,1H), 6.03-6.00(m,1H), 4.10(s,2H), 3.66-3.63(m,2H), 3.25-3.16(m,1H), 2.49-2.48(m,2H), 2.04(s,3H), 1.49(s,9H), 1.31(d,J=6,9Hz,6H).
단계 2 : N2 -(2-( 디플루오로메톡시 )-4-(1,2,3,6- 테트라하이드로피리딘 -4-일)페닐)- N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )-5-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00030
상기 단계 1에서 얻은 tert-부틸 4-(3-(디플루오로메톡시)-4-((4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일)아미노)페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 3.5mg(3.53mmol)을 MeOH에 녹인 후, 4M HCl이 용해된 디옥산 1ml를 첨가한 후, 상온에서 0.5시간 교반하였다. 반응이 종료된 후, HCl을 제거하고 에테르로 디캔팅(decanting)하여 목적 화합물 7mg을 99%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300 MHz, MeOD) δ 8.51(s,1H), 7.99(d,J=4.5Hz,1H), 7.71(s,1H), 7.63(d,J=4.2Hz,1H), 7.58-7.55(m,1H), 7.33(s,1H), 7.20-7.18(m,1H), 6.21(s,1H), 3.90(s,2H), 3.51-3.50(m,3H), 2.81(s,2H), 1.22(d,J=3.9Hz,6H).
< 실시예 9> N2 -(2-( 디플루오로메톡시 )-4-(피페리딘-4-일) 페닐 )- N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )-5-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
단계 1 : tert -부틸 4-(3-( 디플루오로메톡시 )-4-((4-((2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )아미노)-5-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-2-일)아미노) 페닐 )피페리딘-1-카복시레이트 의 제조
Figure 112014019931035-pat00031
2-클로로-N-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-아민 60mg(0.16mmol)을 THF 3ml에 녹인 후 tert-부틸 4-(4-아미노-3-(디플루오로메톡시)페닐)피페리딘-1-카복시레이트 110mg(0.32mmol)을 첨가하고, 잔트포스 9mg (0.32mmol), Cs2CO3 156g(0.48mmol)을 순서대로 첨가한 후, 질소를 충전하여 탈 가스 하였다. Pd(OAc)2 (2mg, 0.008mmol)를 첨가하고, 질소 충전 후 130℃에서 18시간 교반하였다. 반응 종료 후, EA/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조하여 필터 후 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(Hx:EA 4:1)를 이용하여 목적 화합물 35mg을 32%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300 MHz,CDCl3), δ 9.43(s,1H), 8.38(s,1H), 8.19(d,J=8.4Hz,1H), 7.89(dd,J=7.8Hz,8.1Hz, 1H), 7.53-7.48(m,1H), 7.39(s,1H), 7.22(t,J=7.5Hz,1H), 7.11-7.08(m,1H), 7.04(s,1H), 4.29-4.23(m,2H), 3.29-3.20(m,1H), 2.86-2.77(m,1H), 2.72-2.63(m,1H), 2.17(s,1H), 2.04(s,1H), 1.87-1.83(m,4H),1.49(s,9H), 1.31(d,J=6.9Hz,6H).
단계 2 : N2 -(2-( 디플루오로메톡시 )-4-(피페리딘-4-일) 페닐 )- N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )-5-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00032
상기 단계 1에서 얻은 tert-부틸 4-(3-(디플루오로메톡시)-4-((4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일)아미노)페닐)피페리딘-1-카복시레이트 35mg(0.051mmol)을 MeOH에 녹인 후, 4M HCl이 용해된 디옥산 3ml를 첨가한 후, 상온에서 0.5시간 교반하였다. 반응이 종료된 후, HCl을 제거하고 에테르로 디캔팅(decanting)하여 목적 화합물 29mg을 99%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300 MHz, MeOD), δ 8.50(s,1H), 7.90-7.78(m,2H), 7.48-4.45(m,3H), 7.23-7.19(m,2H), 3.75-3.72(m,1H), 3.59-3.53(m,2H), 2.14-1.88(m,5H), 1.19-1.15(m,6H).
< 실시예 10> 5- 클로로 - N2 -(5- 플루오로 -2- 메톡시 -4-(1,2,3,6- 테트라하이드로피리딘 -4-일) 페닐 )- N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
단계 1 : tert -부틸 4-(4-((5- 클로로 -4-((2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2- 플루오로 -5- 메톡시페닐 )-5,6- 디하이드로피리딘 -1(2H)-카복시레이트 의 제조
Figure 112014019931035-pat00033
2,5-디클로로-N-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-4-아민 123mg (0.35mmol)을 THF 4ml에 녹인 후 tert-부틸 4-(4-아미노-2-플루오로-5-메톡시페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 115mg(0.35mmol)을 첨가하고, 잔트포스 20mg (0.033mmol), Cs2CO3 322mg(1mmol)을 순서대로 첨가한 후, 질소를 충전하여 탈 가스 하였다. Pd(OAc)2 (4mg, 0.033mmol)를 첨가하고, 질소 충전 후 130℃에서 8시간 교반하였다. 반응 종료 후, EA/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조하여 필터 후 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(Hx:EA 4:1)를 이용하여 목적 화합물 82mg을 37%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9.54(brs, 1H), 8.52-8.49(m, 1H), 8.19-8.12(m, 2H), 7.95-7,92(m,1H), 7.74-7.66(m,2H), 7.33-7.26(m, 2H), 6.72-6.69(m, 1H), 5.92-5.90(m, 1H) 4.08(s, 2H), 3.90(d, J=3.9Hz, 3H), 3.64-3.62(m, 2H), 3.24-3.22(m,1H), 2.52(brs,2H), 2.05(d, J=3.9Hz, 1H), 1.61(d, 4H), 1.51(d, J=3.9Hz, 9H) , 1.31-1.29(m, 6H).
단계 2 : 5- 클로로 - N2 -(5-플루오로-2-메톡시-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-2,4-디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00034
상기 단계 1에서 얻은 tert-부틸 4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2-플루오로-5-메톡시페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 70mg(0.11mmol)을 MeOH에 녹인 후, 4M HCl이 용해된 디옥산 3ml를 첨가한 후, 상온에서 0.5시간 교반하였다. 반응이 종료된 후, HCl을 제거하고 에테르로 디캔팅(decanting)하여 목적 화합물 77mg을 99%의 수율로 얻었다.
1H NMR (MeOD, 300MHz) δ 8.43(s, 1H), 8.17-8.11(m, 2H), 7.91-7.86(m,1H), 7.72-7.67(m,1H), 7.53(d, J=12.3Hz, 1H), 7.08(d, J=6.6Hz, 1H),6.12(s, 1H), 4.0(s, 3H), 3.81(d, J=5.1Hz, 1H), 3.67(d, J=3.4Hz, 1H), 3.53(m, 3H), 2.85(s, 2H), 1.32(d,J=6.6Hz, 6H).
< 실시예 11> 5- 클로로 - N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )- N2 -(2- 메톡시 -5- 메틸 -4-(1,2,3,6-테 트라하이 드로피리딘-4-일) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
단계 1 : tert -부틸 4-(4-((5- 클로로 -4-((2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )아미노)피리미딘-2-일)아미노)-5- 메톡시 -2- 메틸페닐 )-5,6- 디하이드로피리딘 -1(2H)-카복시레이트 의 제조
Figure 112014019931035-pat00035
2,5-디클로로-N-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-4-아민 107mg (0.31mmol)을 THF 4ml에 녹인 후 tert-부틸 4-(4-아미노-5-메톡시-2-메틸페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 100mg(0.31mmol)을 첨가하고, 잔트포스 18mg (0.31mmol), Cs2CO3 303mg(0.93mmol)을 순서대로 첨가한 후, 질소를 충전하여 탈 가스 하였다. Pd(OAc)2 (4mg, 0.015mmol)를 첨가하고, 질소 충전 후 130℃에서 18시간 교반하였다. 반응 종료 후, EA/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조하여 필터 후 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(Hx:EA 4:1)를 이용하여 목적 화합물 32mg을 17%의 수율로 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 300MHz) δ 9.5(s,1H), 8.57(d, J=8.4Hz, 1H), 8.16(s,1H), 7.94(dd, J=7.8, 8.1Hz , 1H), 7.66-7.60(m, 1H), 7.51(s,1H), 6.61(s,1H), 5.55(s,1H), 4.04(d, 2.4Hz, 2H), 3.87(s,3H), 3.64(t,J=5.4Hz), 3.27-3.23(m,1H), 2.34(d,J=0.9Hz), 2.12(s,3H), 1.50(s,9H), 1.32(d,J=6.9Hz).
단계 2 :5- 클로로 - N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )- N2 -(2- 메톡시 -5- 메틸 -4-(1,2,3,6-테 트라하이드 로피리딘-4-일) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00036
상기 단계 1에서 얻은 tert-부틸 4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-5-메톡시-2-메틸페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 27mg(0.04mmol)을 MeOH에 녹인 후, 4M HCl이 용해된 디옥산 3ml를 첨가한 후, 상온에서 1시간 교반하였다. 반응이 종료된 후, HCl을 제거하고 에테르로 디캔팅(decanting)하여 목적 화합물 30mg을 99%의 수율로 얻었다.
1H NMR (MeOD, 300MHz) δ 8.24(s,1H), 8.03(d,J=7.56Hz,1H), 6.52-6.46(m,1H), 6.34(t,J=7.5Hz, 1H), 7.31(s,1H), 6.88(s,1H), 5.67(s,1H), 3.85(s,3H), 3.75-3.71(m,1H), 3.59-3.57(m,1H), 2.62(s,2H), 2.14(s,3H), 1.26(d, J=6.3Hz, 6H).
< 실시예 12> 5- 클로로 - N2 -(5- 플루오로 -2- 메톡시 -4-(피페리딘-4-일) 페닐 )- N4 -(2-(이 소프로필술 포닐) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
단계 1 : tert -부틸 4-(4-((5- 클로로 -4-((2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2- 플루오로 -5- 메톡시페닐 )피페리딘-1-카복시레이트 의 제조
Figure 112014019931035-pat00037
2,5-디클로로-N-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-4-아민 97mg(0.28mmol)을 THF 5ml에 녹인 후 tert-부틸 4-(4-아미노-2-플루오로-5-메톡시페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복시레이트 90mg(0.28mmol)을 첨가하고, 잔트포스 17mg (0.03mmol), Cs2CO3 275mg(0.84mmol)을 순서대로 첨가한 후, 질소를 충전하여 탈 가스 하였다. Pd(OAc)2 (4mg, 0.05mmol)를 첨가하고, 질소 충전 후 120℃에서 18시간 교반하였다. 반응 종료 후, EA/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조하여 필터 후 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(Hx:EA 4:1)를 이용하여 목적 화합물 75.5mg을 42%의 수율로 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 300MHz) δ 9.5(s,1H), 8.51(d, J=8.4Hz,1H), 8.17(s,1H), 8.13(d, J=12.9Hz, 1H), 7.94(dd, J=8.1Hz,8.1Hz), 7.74-7.69(m, 1H), 7.60(s,1H),6.65(d, J=6.6Hz), 4.15-4.08(m,1H), 3.87(s,3H), 3.24-3.19(m,1H), 2.86(t,J=12.6Hz, 2H), 1.82(d,J=12.3Hz , 2H), 1.49(s,9H), 1.32(d,J=6.9Hz,1H).
단계 2 : 5- 클로로 - N2 -(5- 플루오로 -2- 메톡시 -4-(피페리딘-4-일) 페닐 )- N4 -(2-(이 소프로필술포닐 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00038
상기 단계 1에서 얻은 tert-부틸 4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2-플루오로-5-메톡시페닐)피페리딘-1-카복시레이트 75mg(0.048mmol)을 MeOH에 녹인 후, 4M HCl이 용해된 디옥산 3ml를 첨가한 후, 상온에서 1시간 교반하였다. 반응이 종료된 후, HCl을 제거하고 에테르로 디캔팅(decanting)하여 목적 화합물 65mg을 99%의 수율로 얻었다.
1H NMR (MeOD, 300MHz) δ 8.34(s, 1H), 8.12-8.09(m,1H), 8.04-8.02(d,J=7.8Hz,1H), 7.82-7.77(m,1H), 7.63-7.58(m,1H), 7.40(d,J=11.7Hz,1H), 6.96(d,J = 6.6Hz,1H), 3.91(s,3H),3.73(d,J=5.1Hz,1H),3.59(d,J=4.5Hz,2H),3.40-3.36(m,1H), 3.18-3.16(m,3H),1.24(d,J=6.6Hz, 6H).
< 실시예 13> 5- 클로로 - N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )- N2 -(2- 메톡시 -5- 메틸 -4-(피페리딘-4-일) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
단계 1 : tert -부틸 4-(4-((5- 클로로 -4-((2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )아미노)피리미딘-2-일)아미노)-5- 메톡시 -2- 메틸페닐 )피페리딘-1-카복시레이트 의 제조
Figure 112014019931035-pat00039
2,5-디클로로-N-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-4-아민 86mg(0.25mmol)을 THF 3ml에 녹인 후 tert-부틸 4-(4-아미노-5-메톡시-2-메틸페닐)피페리딘-1-카복시레이트 80mg(0.25mmol)을 첨가하고, 잔트포스 15mg (0.025mmol), Cs2CO3 244mg(0.75mmol)을 순서대로 첨가한 후, 질소를 충전하여 탈 가스 하였다. Pd(OAc)2 (3mg, 0.012mmol)를 첨가하고, 질소 충전 후 130℃에서 18시간 교반하였다. 반응 종료 후, EA/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조하여 필터 후 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(Hx:EA = 4:1)를 이용하여 목적 화합물 30mg을 20%의 수율로 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 300MHz) δ 9.51(s,1H), 8.59(d,J=8.4Hz,1H), 8.15(s,1H), 8.00(s,1H), 7.94(dd, J=12,8.1Hz, 1H), 7.65-7.59(m,1H), 7.47((s,1H), 6.69(s,1H), 4.29(d,J=20.1Hz,2H), 3.86(s,3H), 3.28-3.23(m,1H), 2.86-2.78(m,3H), 2.19(s,3H), 1.77-1.73(d, J=12.6Hz, 2H), 1.49(s,9H), 1.32(d,J=6.9Hz,6H).
단계 2 : 5- 클로로 - N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )- N2 -(2- 메톡시 -5- 메틸 -4-(피페리딘-4-일) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00040
상기 단계 1에서 얻은 tert-부틸 4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-5-메톡시-2-메틸페닐)피페리딘-1-카복시레이트 17mg(0.026mmol)을 MeOH에 녹인 후, 4M HCl이 용해된 디옥산 3ml를 첨가한 후, 상온에서 0.5시간 교반하였다. 반응이 종료된 후, HCl을 제거하고 에테르로 디캔팅(decanting)하여 목적 화합물 15mg을 99%의 수율로 얻었다.
1H NMR (MeOD, 300MHz) δ 8.27-8.23(m,1H), 8.01(d,J=7.5Hz,1H), 7.75-7.71(m,1H), 7.57-7.52(m,1H), 7.31(s,1H), 6.9(s,1H), 3.88(s,3H),3.73(d,J=5.1Hz,1H), 3.65(s,2H), 3.57-3.47(m,3H), 3.21-3.18(m,2H), 2.22(s,3H), 1.25(d,J=5.4Hz,6H).
< 실시예 14> 5- 클로로 - N2 -(4-(1-에틸-1,2,3,6- 테트라하이드로피리딘 -4-일)-2-메 톡시페 닐)- N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00041
상기 실시예 1에서 얻은 5-클로로-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민 50mg(0.097 mmol)을 EtOH 1ml에 넣어준 후 교반하면서 DIPEA(0.06ml,0.375mmol)을 첨가하였다. 아이오도에텐(0.016ml,0.15mmol)를 첨가하여주고 상온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, MC/H2O로 추출 후 유기층은 MgSO4로 건조한 뒤에 농축하여 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 목적 화합물 19.3mg을 얻었다.
1H-NMR (300MHz,CDCl3), δ 9.55(s,1H), 8.56(d,J=8.4Hz,1H), 8.25(d,J=9Hz,1H),8.16(s,1H), 7.94(dd,J=1.5,1.5Hz ,1H), 7.68-7.63(m,1H), 7.59(s,1H), 7.31-7.28(m,1H), 6.91-6.88(m,2H), 5.98(s,1H), 5.29(s,1H), 3.92(s,3H), 3.56(s,2H), 3.26-3.21(m,1H), 3.15-3.11(m,2H),2.99-2.92(m,2H), 2.83(s,2H), 1.42(t,J=7.2Hz,3H), 1.32(d,J=6.6Hz,6H).
< 실시예 15> 5- 클로로 - N2 -(4-(1-에틸-1,2,3,6- 테트라하이드로피리딘 -4-일)-2-메 톡시페 닐)- N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00042
상기 실시예 1에서 얻은 5-클로로-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민 40mg을 DMF 1mL에 녹여준 후 교반 하면서 CS2CO3(65mg,0.2mmol)을 첨가하였다. 브로모에탄올(0.01ml,0.12mmol)을 첨가하여주고 상온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, MC/H2O로 추출 후 유기층은 MgSO4로 건조한 뒤 농축하여 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 목적 화합물 12mg을 얻었다.
1H-NMR (300MHz,CDCl3), δ 9.55(s,1H),8.58(d,J=7.8Hz,1H), 8.25(d,J=9Hz,1H), 8.17(s,1H), 7.94-7.91(m,1H), 7.68-7.63(m,1H), 7.60(s,1H), 6.93(s,2H), 6.01(s,1H), 3.92(s,3H), 3.83-3.80(m,2H), 3.64(s,1H), 3.45(s,2H), 3.28-3.19(m,1H), 3.02-2.99(m,2H), 2.88-2.85(m,2H),2.71-2.70(m,2H),1.32(d,J=6.9Hz,6H).
< 실시예 16> 1-(4-(4-((5- 클로로 -4-((2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )아미노)피리미딘-2-일)아미노)-3- 메톡시페닐 )-5,6- 디하이드로피리딘 -1(2H)-일) 에탄온의 제조
Figure 112014019931035-pat00043
상기 실시예 1에서 얻은 5-클로로-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민 50mg(0.097 mmol)을 CH2Cl2 1ml에 넣어준 후 교반하며 Et3N(0.03ml,0.23mmol)을 첨가하였다. 아세트산무수물 (0.02ml,0.15mmol)을 첨가하여주고 상온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, MC/H2O로 추출 후 유기층은 MgSO4로 건조한 뒤 농축하여 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 목적 화합물 40mg을 얻었다.
1H-NMR (300MHz,CDCl3), δ 9.57(s,1H), 8.58(d,J=8.1Hz,1H), 8.23(dd,J=2.4,0.9Hz,1H),8.16(s,1H), 7.94(dd,J=1.5,1.5Hz,1H),7.67-7.62(m,2H),6.92-6.87(m,2H),6.03(d,16.5Hz,1H), 4.26(d,J=2.7Hz,1H),4.15(d,J=2.7Hz,1H),3.93(s,3H), 3.85(t,J=5.7Hz,1H), 3.70-3.66(m,1H), 3.28-3.19(m,1H), 2.60-2.55(m,2H), 2.18(d,J=8.7Hz,3H),1.32(d,J=6.9Hz,6H).
< 실시예 17> 4-(4-((5- 클로로 -4-((2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )아미노)피리미딘-2-일)아미노)-3- 메톡시페닐 )-5,6- 디하이드로피리딘 -1(2H)-카르복시산의 제조
Figure 112014019931035-pat00044
상기 실시예 1에서 얻은 5-클로로-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민 50mg(0.097 mmol)을 CH2Cl2 1ml에 녹여준 후 교반하며 Et3N 0.2ml를 첨가하였다. 글리콜산(0.01ml,0.15mmol), EDCI(24mg,0.15mmol), DMAP(20mg,0.15mmol)을 순서대로 첨가하여주고 상온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, MC/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조한 뒤 농축하여 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 목적 화합물 28.4mg을 얻었다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3), δ 9.57(s,1H), 8.58(d,J=8.7Hz,1H), 8.27(d,J=8.1Hz,1H),8.17(s,1H), 7.94(d,J=7.2Hz,1H), 7.68-7.60(m,1H), 7.31(d,J=8.1Hz,1H), 6.92-6.87(m,2H), 4.31-4.20(m,3H),3.96(s,3H), 3.68(s,1H), 3.52-3.49(m,1H), 3.26-3.19(m,1H), 2.60(s,2H), 1.32(d,J=6.9Hz,6H).
< 실시예 18> 5- 클로로 - N2 -(4-(1- 메틸 -1,2,3,6- 테트라하이드로피리딘 -4-일)-2-메 톡시페 닐)- N4 -(2-( 이소프로필술포닐 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민의 제조
Figure 112014019931035-pat00045
상기 실시예 1에서 얻은 5-클로로-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민 50mg(0.097 mmol)을 EtOH 1ml에 녹여준 후 교반하면서 DIPEA(0.08ml,0.45mmol)을 첨가하여준다. 메틸아이오다이드(0.01ml,0.15mmol) 첨가하여주고 상온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, MC/H2O로 추출한 후 유기층은 MgSO4로 건조한 뒤에 농축하여 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 목적 화합물 6.1mg을 얻었다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3), δ 9.56(s,1H), 8.55-8.53(m,1H), 8.29-8.26(m,1H),8.17(s,1H), 7.94(d,J=8.1Hz,1H),7.70-7.63(m,2H), 6.90(s,2H), 5.97(s,1H), 3.93(s,3H), 3.74(s,2H), 3.64(s,1H), 3.24-3.21(m,1H), 2.97-2.94(m,2H), 2.85(s,3H), 1.32(d,J=6.9Hz,6H).
하기 표 1에 실시예 1-18에서 제조한 화합물의 화학구조식을 정리하여 나타내었다.
실시예 화학구조식
1
Figure 112014019931035-pat00046
2
Figure 112014019931035-pat00047
3
Figure 112014019931035-pat00048
4
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5
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6
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7
Figure 112014019931035-pat00052
8
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9
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10
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11
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12
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13
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14
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15
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16
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17
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18
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< 실험예 1> 역형성 림프종 키나아제 ( ALK ) 억제활성 실험
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체의 림프종 키나아제(ALK)의 증식 억제 활성을 효소단계에서 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
역형성 림프종 키나아제(ALK)에 대한 저해활성을 측정하기 위하여 그레이너 96 웰 라운드 형 바닥 플레이트에 실시예 1 내지 18에서 제조된 화합물(2 ㎕)을 가하고, 역형성 림프종 키나아제(ALK) 효소(1 ㎕)와 바이오틴이 붙은 펩타이드 기질(2 ㎕)을 15분 동안 혼합하여 배양하였다. 여기에 ATP 용액(5 ㎕)을 가하여 상온에서 30분 동안 키나아제 반응을 수행하였다. 에틸렌다이아민테트라아세트산 용액에 녹은 스트렙트아비딘이 붙은 엑스엘(XL 665)(5 ㎕)와 유로피움(Eu3+)이 붙은 항-포스포타이로신 항체(5 ㎕)를 반응액에 첨가하여 반응을 중지시키고 1시간 동안 배양한 후, 시간분해형광도(Homogeneous Time-resolved fluorescence, HTRF, Cisbio)를 이용하여 분석하였다. 왈락 인비전 2103(Wallac Envision 2103) 기기로 615/665 nm의 파장 범위에서 판독하였다. 상기 실험을 수행한 시험화합물의 IC50은 프리즘(버전 5.01, 그래프패드) 소프트웨어를 이용하여 구현하였다.
역형성 림프종 키나아제(ALK) 효소활성 및 역형성 림프종 키나아제(ALK) 효소를 포함하고 있는 비소세포폐암세포인 L1196M의 세포활성을 50%로 감소시키는 상기 화합물의 IC50을 하기 표 2에 나타내었다.
실시예 ALK wt.
IC50 (uM)		 ALK L1196M
IC50 (uM)
대조군 1
(crizotinib)		 0.01 0.22
대조군 2
(LDK-378)_기준		 0.001 0.009
1 <0.001 <0.001
2 <0.001 <0.001
3 <0.001 <0.001
4 <0.001 <0.001
5 <0.001 <0.001
6 <0.001 <0.001
7 >0.001 >0.001
8 <0.001 <0.001
9 >0.001 >0.001
10 <0.001 <0.001
11 <0.001 <0.001
12 <0.001 <0.001
13 <0.001 <0.001
14 <0.001 <0.001
15 <0.001 <0.001
16 <0.001 <0.001
17 <0.001 <0.001
18 <0.001 <0.001
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예의 화합물들은 대부분이 대조군 1 및 2의 화합물에 비하여 활성이 우수한 것으로 나타났다.
구체적으로, 상기 실시예 1-18의 화합물은 모두 대조군 1인 크리조티닙(crizotinib)보다 활성이 우수한 것으로 나타났으며, 또한 상기 실시예 1-18중, 실시예 7 및 9를 제외한 나머지 화합물들은 대조군 2인 LDK-378보다 활성이 우수한 것으로 나타났다.
본 실험결과로부터 본 발명에 따른 피리미딘-2,4-디아민 유도체들이 낮은 농도에서도 효소단계에서의 역형성 림프종 키나아제(ALK)의 활성 억제 효과가 있으며, 특히 종래 역형성 림프종 키나아제(ALK) 활성을 억제함으로써, 비소세포폐암의 치료제로 이용되고 있는 크리조티닙(양성대조군)보다 우수한 저해 활성을 가진다는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 피리미딘-2,4-디아민 유도체는 역형성 림프종 키나아제(ALK)활성을 억제하는 효과가 우수하므로 비소세포폐암, 신경모세포종, 염증성 골수섬유모세포종양, 종횡문근육종, 근섬유모세포종, 유방암, 위암, 폐암, 흑색종 등의 암의 예방 또는 치료용 조성물뿐만 아니라, 역형성 림프종 키나아제(ALK) 활성 억제제로 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 2> 암세포 증식억제 실험
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체의 암세포 증식 억제능을 알아보기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<2-1> 실험 재료
시약
세포배양액인 RPMI 1640 배지, FBS(fetal bovine serum) 및 크립신은 Gibco사(Grand Island, NY)로부터 구입하였으며, 탄산수소나트륨, 암포테리신 B 및 겐타마이신은 시그마케미컬 제품을 사용하였다.
또한, 세포독성 측정 실험에 사용한 시약인 SRB(sulforhod아민) B, 트리스마 염기(trisma base), 트리클로로아세트산(TCA) 등의 시약은 시그마케미컬사로부터 구입하였다. MTS assay를 위해서는 CellTiter 96R Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay 제품을 프로메가(Promega)사로부터 구입하였다.
또한, 세포배양을 위해 사용한 T-25 배양용기, 96-웰(well) 플레이트 및 기타 세포배양에 사용한 일회용 초자류는 팔콘사(Lincoln Park, NJ) 제품을 사용하였다.
사용기기
세포독성 측정을 위한 엘라이자 리더기(microplate reader)는 Molecular Devices사(Sunnyvale, CA)의 E-max나 SpectraMax250 기종을 사용하였다.
<2-2> 실험방법
단계 1 : 세포 배양
최종 디메틸설폭사이드 농도는 0.5% 이하가 되도록 하였다.
실험에 사용한 암세포주는 모두 인체기원 암세포주들로서, 구체적으로는 비소세포폐암 세포주인 H2228, H3122를 사용하였다.
배양액으로는 10% FBS(fetal bovine serum)가 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃ 및 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하였고, 3 내지 4일에 한 번씩 계대 유지하였다.
단계 2 : 화합물 처리에 따른 증식억제 활성 평가
96 웰(well) 평평한 바닥 마이크로플레이트(flat-bottom microplate)의 각 웰(well)에 1 ×104 cells를 분주하고, 세포가 바닥면에 부착하도록 24시간 동안 배양한 후, 배양액을 제거하였다. 여기에 실시예 1 내지 18의 화합물이 각각 희석된 배양액을 가하고 72시간 동안 배양하였다. 상기 화합물과의 배양이 종료된 후, 세포독성의 측정은 단백질 염색 시약인 SRB를 이용하여 측정하거나 MTS assay법을 이용하여 측정하였다. 실시예 1 내지 18의 화합물과의 배양이 종료된 후, 배양액을 제거하고 각 웰(well)에 차가운 TCA 용액을 처리하고 4℃에서 1시간 동안 방치하여 세포들을 고정시켰다. 상기 TCA 용액을 제거하고 실온에서 건조시킨 후, 1% 아세트산 용액에 0.4% SRB를 녹인 염색용액을 가하여 실온에서 30분 동안 방치하여 세포를 염색하였다. 세포와 결합하지 않은 여분의 SRB를 1% 아세트산 용액으로 세척하여 제거하고, 염색된 세포들에 pH 10.3 내지 10.5의 10mM 트리스 완충용액(Trisma base; unbuffered)을 가하여 SRB를 용출시켰다. 각 웰(well)의 흡광도는 엘라이자 리더기(microplate reader)를 이용하여 520 mM의 파장 범위에서 측정하였다.
약물을 가하지 않은 웰(well)(C)과 약물을 가한 각 웰(well)(T) 및 약물을 처음 가할 때의 웰(well)(Tz)의 OD값으로부터,
Tz=T인 경우에는 [(T-Tz)/(C-Tz)]100의 수식에 의해; 또는
Tz＞T인 경우에는 [(T-Tz)/(Tz)]100 의 수식에 의해 약물의 세포독성을 계산하였다.
MTS assay 법을 이용한 암세포 증식억제 측정은 다음과 같이 실험하였다. 구체적으로, 실시예 1 내지 실시예 18에서 제조된 화합물과의 배양이 종료된 후, Promega사의 CellTiter 96R AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay 제품을 구성하고 있는 PMS 용액과 MTS 용액을 섞은 후 well당 20 L를 넣어주었다. 4시간 동안 배양기에 놓아둔 후 꺼내어 상온에서 10분간 방치하였다. Molecular Device사의 SpectraMax250 기종을 이용하여 490 nM에서의 흡광도를 측정한 후 증식억제 효과인 GI50(Growth Inhibition 50%)값을 계산하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
실시예 H2228
GI50 (uM)		 H3122
GI50 (uM)
대조군 1
(crizotinib)		 0.851 0.277
대조군 2
(LDK-378)_기준		 0.025 0.023
1 <0.01 <0.01
2 <0.01 <0.01
3 <0.01 <0.01
4 <0.01 >0.01
5 <0.01 <0.01
6 <0.01 <0.01
7 >0.01 >0.01
8 <0.01 >0.01
9 >0.01 >0.01
10 <0.01 <0.01
11 >0.01 <0.01
12 >0.01 <0.01
13 <0.01 <0.01
14 >0.01 <0.01
15 >0.01 <0.01
16 <0.01 <0.01
17 <0.01 <0.01
18 <0.01 <0.01
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 화합물들은 비소세포폐암 세포주인 H2228 및 H3122의 역형성 림프종 키나아제(ALK)를 억제함으로써 그 증식활성을 감소시키는 것으로 나타났다. 본 실험결과로부터 본 발명의 실시예 화합물들 대부분은 현재 비소세포폐암 치료제로 사용되고 있는 대조군 1 및 2의 화합물보다 우수한 증식억제효과가 있음을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 피리미딘-2,4-디아민 유도체는 역형성 림프종 키나아제(ALK)활성을 억제하는 효과가 우수하므로 비소세포폐암, 신경모세포종, 염증성 골수섬유모세포종양, 종횡문근육종, 근섬유모세포종, 유방암, 위암, 폐암, 흑색종 등의 암의 예방 또는 치료용 조성물뿐만 아니라, 역형성 림프종 키나아제(ALK) 활성 억제제로 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 3> EML4 - ALK 로 형질 감염된 BaF3 세포의 세포독성 평가
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체의 BaF3 EML4-ALK L1196M 및 BaF3 EML4-ALK WT 세포에 대한 세포독성을 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, BaF3세포에 EML4-ALK wt(wild-type) 유전자를 렌티바이러스(lentivirus)로 감염시켜 EML4-ALK wt가 안정적으로 발현하는 BaF3 EML4-ALK wt 세포주를 준비하였다. 또한, BaF3세포에 EML4-ALK L1196M 유전자를 렌티바이러스(lentivirus)로 감염시켜 EML4-ALK L1196M이 안정적으로 발현하는 BaF3 EML4-ALK L1196M 세포주를 준비하였다. 상기 두 개의 세포주의 세포 개수를 잘 측정한 다음 96 웰 플레이트(well plate)의 각 웰(well)에 4,000개씩 90㎕의 부피로 넣은 후, 상기 실시예에서 제조한 화합물의 농도를 10uM, 2uM, 0.4uM, 0.08uM, 0.016uM, 0.0032uM, 0.00064uM 및 0uM로 각 웰(well)에 첨가하고, 3일 동안 37℃의 세포배양기 안에 넣었다. 3일 후, 각 웰(well)에 WST-1 용액을 10㎕씩 첨가하고, 각 웰(well)의 용액의 색깔이 변하면 ELISA(제조사 : Molecular Devices, 모델명 : EMax Endpoint ELISA Microplate reader)를 이용하여 450nm에서 측정하였다. 측정된 값을 이용해서 세포의 양을 계산함으로써 각 화합물의 세포독성에서의 IC50를 계산하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
실시예 BaF3
EML4-ALK
L1196M (uM)		 BaF3
EML4-ALK
WT (uM)
대조군 1
(crizotinib)		 1.1 0.06
대조군 2
(LDK-378)_기준		 0.041 0.019
1 <0.01 <0.01
2 >0.01 <0.01
3 >0.01 <0.01
4 <0.01 <0.01
5 <0.01 <0.01
6 >0.01 <0.01
7 >0.01 >0.01
8 <0.01 <0.01
9 >0.01 >0.01
10 <0.01 <0.01
11 <0.01 <0.01
12 <0.01 <0.01
13 <0.01 <0.01
14 <0.01 <0.01
15 <0.01 <0.01
16 <0.01 <0.01
17 <0.01 <0.01
18 <0.01 <0.01
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 화합물들은 대부분이 BaF3 EML4-ALK WT(wild-type) 세포 및 크리조티닙(crizotinib)에 내성을 갖는 BaF3 EML4-ALK L1196M 세포에서 세포독성 IC50값이 대조군 1 및 2에 비하여 낮은 것으로 나타났다. 본 실험결과로부터 본 발명의 실시예 화합물들 대부분은 현재 비소세포폐암 치료제로 사용되고 있는 대조군 1 및 2의 화합물보다 우수한 ALK 억제활성이 있음을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 피리미딘-2,4-디아민 유도체는 역형성 림프종 키나아제(ALK) 활성을 억제하는 효과가 뛰어나므로, 비소세포폐암, 신경모세포종, 염증성 골수섬유모세포종양, 종횡문근육종, 근섬유모세포종, 유방암, 위암, 폐암, 흑색종 등의 암의 예방 또는 치료용 조성물뿐만 아니라, 역형성 림프종 키나아제(ALK)의 저해제로 유용하게 사용될 수 있다.
참조로 하기 표 5에, 실험예 1-3(표 2-4)에서 얻은 실험결과를 종합하여 나타내었다.
실시예 실험예 1 실험예 2 실험예 3
ALK wt.
IC50 (uM)		 ALK L1196M
IC50 (uM)		 H2228
GI50 (uM)		 H3122CP
GI50 (uM)		 BaF3
EML4-ALK
L1196M (uM)		 BaF3
EML4-ALK
WT (uM)
대조군 1
(crizotinib)		 0.01 0.22 0.851 0.277 1.1 0.06
대조군 2
(LDK-378)_기준		 0.001 0.009 0.025 0.023 0.041 0.019
1 <0.001 <0.001 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
2 <0.001 <0.001 <0.01 <0.01 >0.01 <0.01
3 <0.001 <0.001 <0.01 <0.01 >0.01 <0.01
4 <0.001 <0.001 <0.01 >0.01 <0.01 <0.01
5 <0.001 <0.001 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
6 <0.001 <0.001 <0.01 <0.01 >0.01 <0.01
7 >0.001 >0.001 >0.01 >0.01 >0.01 >0.01
8 <0.001 <0.001 <0.01 >0.01 <0.01 <0.01
9 >0.001 >0.001 >0.01 >0.01 >0.01 >0.01
10 <0.001 <0.001 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
11 <0.001 <0.001 >0.01 <0.01 <0.01 <0.01
12 <0.001 <0.001 >0.01 <0.01 <0.01 <0.01
13 <0.001 <0.001 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
14 <0.001 <0.001 >0.01 <0.01 <0.01 <0.01
15 <0.001 <0.001 >0.01 <0.01 <0.01 <0.01
16 <0.001 <0.001 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
17 <0.001 <0.001 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
18 <0.001 <0.001 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체는 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체를 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
< 제제예 1> 약학적 제제의 제조
1-1. 산제의 제조
화학식 1의 유도체 500 ㎎
유당 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 정제의 제조
화학식 1의 유도체 500 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1-3. 캅셀제의 제조
화학식 1의 유도체 500 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1-4. 주사제의 제조
화학식 1의 유도체 500 ㎎
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-5. 액제의 제조
화학식 1의 유도체 100 ㎎
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액체를 제조한다.

Claims (10)

  1. 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    (1) 5-클로로-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
    (2) 5-클로로-N2-(2-이소프로폭시-5-메틸-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
    (3) 5-클로로-N2-(2-(디플루오로메톡시)-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)-N4-(2(이소프로필술포닐_페닐)피리미딘-2,4-디아민;
    (4) 5-클로로-N2-(2-(디플루오로메톡시)-4-(피페리딘-4-일)페닐)-N4 (2(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
    (5) 5-클로로-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(피페리딘-4yl)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
    (6) N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민;
    (10) 5-클로로-N2-(5-플루오로-2-메톡시-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
    (11) 5-클로로-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-5-메틸-4-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
    (12) 5-클로로-N2-(5-플루오로-2-메톡시-4-(피페리딘-4-일)페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
    (13) 5-클로로-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-5-메틸-4-(피페리딘-4-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
    (14) 5-클로로-N2-(4-(1-에틸-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)-2-메톡시페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
    (15) 5-클로로-N2-(4-(1-에틸-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)-2-메톡시페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
    (16) 1-(4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-3-메톡시페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-일)에탄온;
    (17) 4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-3-메톡시페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카르복시산; 및
    (18) 4-(4-((5-클로로-4-((2-(이소프로필술포닐)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-3-메톡시페닐)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-메틸.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
    화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 1); 및
    상기 단계 1에서 제조한 화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 2);를 포함하는 제1항의 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물의 제조방법:

    [반응식 1]
    Figure 112016045339038-pat00072

    (상기 반응식 1에서,
    R1, R2, R3 및 R4는 제1항에 기재된 화합물들의 치환기 범위와 동일하다).
  6. 삭제
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