CN111777592B - 一种n4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向ddr1抑制剂及其制备和应用 - Google Patents

一种n4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向ddr1抑制剂及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种N4‑(2,5‑二甲氧基苯基)‑嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂及其制备方法与应用。本发明的N4‑(2,5‑二甲氧基苯基)‑嘧啶二胺类化合物表现出对3株DDR1高表达的细胞具有一定的抗肿瘤活性。根据抗肿瘤活性测试结果，化合物X 06在A549、A431和HCT116细胞中表现了优于先导药Yfq07的生物活性(IC50＝0.81～3.73μM)；DDR1激酶测试结果显示，在10μM浓度下X 06的DDR1激酶抑制率达64.6％，选择性较先导化合物Yfq07高出近3倍。

Description

一种N4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂及 其制备和应用
技术领域
本发明涉及医药化学技术领域，尤其涉及一种N4-(2,5-二甲氧基苯基)-N6-取代嘧啶-4,6-二胺类可靶向DDR1的化合物及其制备方法与抗肿瘤活性的应用。
背景技术
盘状结构域受体(DDR)是1990年代初发现的跨膜受体酪氨酸激酶(RTK)超家族的成员，由于它们在细胞外结构域中存在着盘状蛋白基序，从而与其他RTK区别开来。目前，典型的RTK使用类似肽的生长因子作为配体，但DDR能被细胞外基质(ECM)最丰富的成分——胶原蛋白激活。研究人员已经鉴定了两种类型的DDR，包括DDR1和DDR2。其中，DDR1可以与迄今报道的几乎所有类型的胶原蛋白结合；同时DDR1在肺、肾、结肠和大脑的上皮细胞中有广泛表达；在基本细胞过程的调节中发挥重要作用，包括增殖，存活，分化，粘附和基质重塑，并与许多人类疾病密切相关，包括各种癌症、纤维化疾病和动脉粥样硬化等。
化合物Yfq07是本单位早期自主研发，设计合成的靶向EGFR的小分子抑制剂。在对其随后的生物活性进一步研究过程中，通过蛋白组学实验(如图1)发现在吉非替尼耐药的PC-9G细胞中，EGFR的表达水平显著降低，而DDR1的表达水平异常升高，在加入了化合物Yfq07的耐药细胞中DDR1的表达被明显抑制。因此，我们推测在吉非替尼耐药的PC-9G细胞中EGFR通路被阻断的同时，可能发生了DDR1旁路信号通路的激活。而化合物Yfq07能够明显降低DDR1的表达，进而对PC-9G细胞产生一定的抑制作用。大量的文献查询后，发现DDR1作为吉非替尼耐药的旁路信号激活在非小细胞肺癌中，罕有报道。因此，为进一步验证此新发现，我们选择以Yfq07为先导进行结构修饰，以求获得靶向DDR1选择性更高、活性更好的抗肿瘤药物。
Figure BDA0002551252070000021
发明内容
本发明提供了一种N4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂及其制备和应用，该N4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂相比于现有技术，具有更优异的抗癌活性。
本发明的技术方案如下：
一种N4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂，结构式如下：
Figure BDA0002551252070000022
其中，R为取代或者未取代的苯环或杂芳环；
所述的苯环或杂芳环上的取代基为卤素、甲基、甲氧基、硝基中的一种或者多种。
进一步的，优选为化合物X 01～X 28、化合物Z 01～10中的一种，其中化合物X 01～X 28、化合物Z 01～10中R的取代基如下表1：
Figure BDA0002551252070000023
Figure BDA0002551252070000031
作为最优选，为化合物X 06，具体结构如下：
化合物N4-(2,5-二甲氧基苯基)-N6-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)嘧啶-4,6-二胺(X 06)，化学结构如下：
Figure BDA0002551252070000041
本发明还提供了一种所述的N4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)4,6-二氯嘧啶和2,5-二甲氧基苯胺在DIPEA的作用下进行反应，得到中间体6-氯-N-(2,5-二甲氧基苯基)嘧啶-4-胺；
(2)中间体6-氯-N-(2,5-二甲氧基苯基)嘧啶-4-胺与4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯胺在钯催化剂、配体和碱的作用下进行反应，得到所述的N4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂。
具体制备方法如下：
(1)称取原料4,6-二氯嘧啶(1.45g,9.8mmol)及2,5-二甲氧基苯胺(1g,6.5mmol)，加入到100mL单口圆底烧瓶中，溶解于20mL无水乙醇中。超声待其充分溶解后，滴加DIPEA(1.3mL,7.85mmol),于80℃下加热回流8～12h，以TLC法监测反应进程。反应结束后，加入适量柱层析硅胶，旋干制砂，经柱层析色谱法分离提纯，干燥称量，得中间体6-氯-N-(2,5-二甲氧基苯基)嘧啶-4-胺1.3g，产率为75.4％，熔点为167.4～170.1℃；
(2)取一100mL三颈圆底烧瓶，分别依次加入中间体6-氯-N-(2,5-二甲氧基苯基)嘧啶-4-胺(320mg,1.2mmol)、4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯胺(273mg,1mmol)、碳酸铯(490mg,1.5mmol)、Xantphos(25mg,0.04mmol)、Pd2(dba)3(20mg,0.02mmol)。在氮气保护下，加入20mL无水二氧六环，于95℃下加热回流12～24h，以TLC法监测反应进程。反应结束后，加入适量柱层析硅胶，减压浓缩反应液，旋干制砂，经柱层析色谱法分离提纯，干燥称量，经ESI-HRMS,1H-NMR,13C-NMR,UPLC鉴定结果；得目标化合物，熔点240.2～245.0℃，产率20.84％；
本发明还提供了一种所述的N4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的抗肿瘤药物用于治疗癌症。
作为优选，所述的癌症为肺癌；作为进一步的优选，所述的肺癌为非小细胞肺癌。
本发明的N4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类表现出一定的抗肿瘤活性。根据抗肿瘤活性测试结果，化合物X 06表现出了相当于甚至优于先导药Yfq07的生物活性；对DDR1高表达的A549,A431和HCT116都表现出了优秀的活性(IC50＝0.81～3.73μM)；而对DDR1激酶测试活性，也表现出了较高的选择性，在10μM浓度下，激酶抑制率为64.6％。
附图说明
图1为差异蛋白磷酸化位点定量信息；
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实施例1化合物的合成
1.1化合物的具体合成路线如下所示:
Figure BDA0002551252070000051
化合物X 01～28，Z 01～06，Z 08～10的合成路线：a:CH3CH2OH,DIPEA,80℃,8～12h；b:1,4-Dioxane,Cs2CO3,Pd2(dba)3,Xantphos,95℃,N2,12-24h；
1.2合成步骤
化合物X 01～28，Z 01～06，Z 08～10的合成
a.称取原料4,6-二氯嘧啶(1.45g,9.8mmol)及2,5-二甲氧基苯胺(1g,6.5mmol)，加入到100mL单口圆底烧瓶中，溶解于20mL无水乙醇中。超声待其充分溶解后，滴加DIPEA(1.3mL,7.85mmol),于80℃下加热回流8～12h，以TLC法监测反应进程。反应结束后，加入适量柱层析硅胶，旋干制砂，经柱层析色谱法分离提纯，干燥称量，得中间体6-氯-N-(2,5-二甲氧基苯基)嘧啶-4-胺1.3g，产率为75.4％，熔点为167.4～170.1℃；
b.取一100mL三颈圆底烧瓶，分别依次加入中间体6-氯-N-(2,5-二甲氧基苯基)嘧啶-4-胺(320mg,1.2mmol)、4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯胺(273mg,1mmol)、碳酸铯(490mg,1.5mmol)、Xantphos(25mg,0.04mmol)、Pd2(dba)3(20mg,0.02mmol)。在氮气保护下，加入20mL无水二氧六环，于95℃下加热回流12～24h，以TLC法监测反应进程。反应结束后，加入适量柱层析硅胶，减压浓缩反应液，旋干制砂，经柱层析色谱法分离提纯，干燥称量，经ESI-HRMS,1H-NMR,13C-NMR,UPLC鉴定结果；得目标化合物，熔点240.2～245.0℃，产率20.84％；
1.3实验结果
合成的所有目标化合物结构如上表1所示；合成的包括活性化合物在内的部分目标化合物的ESI-HRMS,1H-NMR,13C-NMR,UPLC等理化数据如下：
N4-(2,5-dimethoxyphenyl)-N6-(quinoxalin-6-yl)pyrimidine-4,6-diamine(X02)
Figure BDA0002551252070000061
Chemical Formula:C20H18N6O2；Yield/％:77.14％；MP:222.6～225.9℃；UPLC:Purity:100.0％；HRMS(ESI)for C20H18N6O2[M+H]+，calcd:374.1573.Found:374.1568.；1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.74(s,1H,Ar-H),8.82(s,1H,-NH-),8.72(s,1H,Ar-H),8.55(d,2H,J＝9.0Hz,Ph-H),8.39(s,1H,Ar-H),7.97(m,2H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH-),6.99(d,1H,J＝9.0Hz,Ar-H),6.66(d,1H,J＝7.5Hz,Ar-H),6.33(s,1H,Ar-H),3.79(s,3H,-OCH3),3.72(s,3H,-OCH3)；13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6):161.1,160.0,157.5,153.1,145.6,145.4,143.5,142.8,142.2,138.4,129.2,129.0,124.5,113.7,112.3,110.1,108.0,88.0,56.2,55.4；
N4-(2,5-dimethoxyphenyl)-N6-(4-((4-methylpiperazin-1-yl)methyl)-3-(trifluoromethyl)phenyl)pyrimidine-4,6-diamine(X 06)
Figure BDA0002551252070000071
Chemical Formula:C25H29F3N6O2；Yield/％:20.84％；MP:240.2～245.0℃；UPLC:Purity:100.0％；HRMS(ESI)for C25H29F3N6O2[M+H]+，calcd:502.2337.Found:502.2331.；1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.41(s,1H,Ar-H),8.40(s,1H,Ph-H),8.28(s,1H,Ph-H),8.01(s,1H,-NH-),7.83(d,1H,J＝8.5 Hz,Ph-H),7.59(d,1H,J＝8.5 Hz,Ph-H),7.45(d,1H,J＝2.4 Hz,Ar-H),6.97(d,1H,J＝9.0 Hz,Ph-H),6.64(dd,1H,J1＝2.8 Hz,J2＝8.9Hz,-NH-),6.18(s,1H,Ar-H),3.77(s,3H,-OCH3),3.71(s,3H,-OCH3),3.52(s,2H,-CH2-),3.27(br s,8H),2.16(s,3H,-CH3)；13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6):160.9,160.2,157.4,153.1,145.2,139.8,131.2,129.2,129.1,122.3,112.3,109.9,107.7,87.2,57.4,56.1,55.3,54.7,52.6,52.5,45.6；
N4-(benzo[d]oxazol-2-yl)-N6-(2,5-dimethoxyphenyl)pyrimidine-4,6-diamine(X 10)
Figure BDA0002551252070000081
Chemical Formula:C19H17N5O3；Yield/％:48.84％；MP:200.5～204.5℃；UPLC:Purity:86.8％；HRMS(ESI)for C19H17N5O3[M+H]+,calcd:363.1395.Found:363.1386.；1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.38(s,1H,-NH-),8.91(s,1H,Ar-H),8.35(s,1H,-NH-),7.69(s,1H,Ar-H),7.55(m,2H,Ar-H),7.48(d,1H,J＝7.5 Hz,Ar-H),7.28(t,1H,J＝7.5Hz,Ar-H),7.21(t,1H,J＝7.5 Hz,Ar-H),7.00(d,1H,J＝9.0 Hz,Ph-H),6.67(dd,1H,J1＝2.5 Hz,J2＝8.5 Hz,Ar-H),3.79(s,3H,-OCH3),3.73(s,3H,-OCH3)；13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6):161.8,157.3,153.0,145.3,141.6,128.8,124.3,122.6,117.1,112.3,110.0,109.4,90.7,56.1,55.4；
N4-(2,5-dimethoxyphenyl)-N6-(2,3-dimethyl-2H-indazol-6-yl)pyrimidine-4,6-diamine(X 14)
Figure BDA0002551252070000082
Chemical Formula:C21H22N6O2；Yield/％:55.18％；MP:219.2～221.7℃；UPLC:Purity:91.7％；HRMS(ESI)for C21H22N6O2[M+H]+,calcd:390.1827.Found:390.1817.；1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.05(s,1H,-NH-),8.31(d,1H,J＝7.5 Hz,Ar-H),8.26(s,1H,Ar-H),7.79(s,1H,Ar-H),7.54(d,1H,J＝9.0 Hz,Ar-H),6.99(d,1H,J＝9.0 Hz,Ph-H),6.95(d,1H,J＝9.0 Hz,Ph-H),6.64(s,1H,-NH-),6.59(dd,1H,J1＝3.0 Hz,J2＝9.0 Hz,Ph-H),6.29(s,1H,Ar-H),3.99(s,3H,-OCH3),3.78(s,3H,-OCH3),3.71(s,3H,-OCH3),2.56(s,3H,-OCH3)；13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6):161.1,160.7,157.4,153.1,153.0,147.4,144.9,137.6,131.3,129.1,120.1,117.2,112.1,109.4,103.9,86.5,56.2,55.3,55.2,9.3；
N4-([1,1'-biphenyl]-4-yl)-N6-(2,5-dimethoxyphenyl)pyrimidine-4,6-diamine(X 18)
Figure BDA0002551252070000091
Chemical Formula:C24H22N4O2；Yield/％:79.18％；MP:224.4～225.6℃；UPLC:Purity:97.4％；HRMS(ESI)for C24H22N4O2[M+H]+,calcd:398.1783.Found:398.1775.；1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.24(s,1H,-NH-),8.34(s,1H,Ar-H),8.28(s,1H,-NH-),7.64(m,6H,Ph-H),7.51(d,1H,J＝2.5 Hz,Ph-H),7.44(t,2H,J＝7.5 Hz,Ph-H),7.31(t,1H,J＝7.5 Hz,Ph-H),6.97(d,1H,J＝9.0 Hz,Ph-H),6.62(dd,1H,J1＝3.0 Hz,J2＝9.0 Hz,Ph-H),6.25(s,1H,Ar-H),3.78(s,3H,-OCH3),3.72(s,3H,-OCH3)；13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6):160.9,160.4,157.5,153.1,145.0,140.1,139.9,133.2,129.3,128.8,126.8,126.7,126.0,119.9,112.2,109.7,107.4,86.8,56.2,55.3；
N4-(2,5-dimethoxyphenyl)-N6-(4-(piperidin-1-ylmethyl)phenyl)pyrimidine-4,6-diamine(X 22)
Figure BDA0002551252070000101
Chemical Formula:C24H29N5O2；Yield/％:49.88％；MP:207.8～208.9℃；UPLC:Purity:97.3％；HRMS(ESI)for C24H29N5O2[M+H]+,calcd:419.2352.Found:419.2345.；1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.98(s,1H,-NH-),8.26(s,1H,Ar-H),8.11(s,1H,-NH-),7.60(d,1H,J＝2.5 Hz,Ph-H),7.35(d,2H,J＝9.0 Hz,Ph-H),7.12(d,2H,J＝9.0 Hz,Ph-H),6.93(d,1H,J＝9.0 Hz,Ph-H),6.50(dd,1H,J1＝3.0 Hz,J2＝9.0 Hz,Ph-H),6.23(s,1H,Ar-H),3.83(s,3H,-OCH3),3.77(s,3H,-OCH3),3.58(s,2H,-CH2-),3.16(t,4H,J＝4.0 Hz,-N-(CH2)2-),1.83(m,4H,-(CH2)2-CH2),1.60(m,4H,-(CH2)2-CH2)；13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6):160.8,160.1,157.7,154.0,148.1,145.2,132.0,130.4,116.9,111.5,107.8,107.2,86.0,64.7,56.7,55.5,51.0,25.9,24.5；
N4-(3-(benzyloxy)phenyl)-N6-(2,5-dimethoxyphenyl)pyrimidine-4,6-diamine(X 26)
Figure BDA0002551252070000111
Chemical Formula:C25H24N4O3；Yield/％:66.75％；MP:210.0～213.1℃；UPLC:Purity:97.7％；HRMS(ESI)for C25H24N4O3[M+H]+,calcd:428.1824.Found:428.1819.；1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.14(s,1H,-NH-),8.36(s,1H,Ar-H),8.29(s,1H,-NH-),7.51(m,3H,Ph-H),7.45(t,2H,J＝7.5 Hz,Ph-H),7.38(m,2H,Ph-H),7.22(t,1H,J＝8.0Hz,Ph-H),7.12(d,1H,J＝8.0 Hz,Ph-H),7.00(d,1H,J＝9.0 Hz,Ph-H),6.66(m,2H,Ph-H+Ar-H),6.25(s,1H,Ar-H),5.12(s,2H,-CH2-),3.81(s,3H,-OCH3),3.75(s,3H,-OCH3)；13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6):160.8,160.4,158.8,157.4,153.1,145.1,141.7,137.2,129.4,129.3,128.4,127.7,127.6,112.2,109.7,107.7,107.5,106.4,86.7,69.2,56.2,55.3；
N4-(2,5-dimethoxyphenyl)-N6-(5-methoxypyridin-3-yl)pyrimidine-4,6-diamine(Z 02)
Figure BDA0002551252070000112
Chemical Formula:C18H19N5O3；Yield/％:83.52％；MP:197.6～210.2℃；UPLC:Purity:99.1％；HRMS(ESI)for C18H19N5O3[M+H]+,calcd:353.1562.Found:353.1553.；1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.32(s,1H,-NH-),8.43(s,1H,Ar-H),8.33(s,1H,Ar-H),8.29(s,1H,Ar-H),7.90(d,1H,J＝2.5 Hz,Ar-H),7.78(s,1H,-NH-),7.47(d,1H,J＝2.5Hz,Ar-H),6.97(d,1H,J＝9.0 Hz,Ph-H),6.64(dd,1H,J1＝3.0 Hz,J2＝9.0 Hz,Ph-H),6.22(s,1H,Ar-H),3.82(s,3H,-OCH3),3.77(s,3H,-OCH3),3.71(s,3H,-OCH3)；13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6):162.3,161.9,158.7,157.2,153.2,152.3,146.6,140.2,128.7,112.7,111.4,109.1,104.2,101.2,88.3,56.1,55.4,52.9；
N4-(2,5-dimethoxyphenyl)-N6-(2-methoxypyrimidin-4-yl)pyrimidine-4,6-diamine(Z 06)
Figure BDA0002551252070000121
Chemical Formula:C17H18N6O3；Yield/％:82.28％；MP:203.4～205.2℃；UPLC:Purity:100.0％；HRMS(ESI)for C17H18N6O3[M+H]+,calcd:354.1472.Found:354.1465.；1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.24(s,1H,-NH-),8.72(s,1H,-NH-),8.36(s,1H,Ar-H),8.27(d,1H,J＝5.5 Hz,Ar-H),7.35(d,1H,J＝2.0 Hz,Ph-H),7.30(s,1H,Ph-H),7.14(d,1H,J＝5.5 Hz,Ph-H),7.04(d,1H,J＝9.0 Hz,Ar-H),6.75(dd,1H,J1＝3.0 Hz,J2＝9.0Hz,Ph-H),3.80(s,3H,-OCH3),3.77(s,3H,-OCH3),3.76(s,3H,-OCH3)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):164.6,161.9,161.1,158.0,157.9,157.3,153.1,146.2,128.5,112.5,111.0,109.0,102.8,91.0,56.1,55.4,54.0；
N4-(2,5-dimethoxyphenyl)-N6-(3-methoxy-5-(trifluoromethyl)phenyl)pyrimidine-4,6-di amine(Z 10)
Figure BDA0002551252070000131
Chemical Formula:C20H19F3N4O3；Yield/％:85.33％；MP:199.3～201.2℃；UPLC:Purity:100.0％；HRMS(ESI)for C20H19F3N4O3[M+H]+,calcd:420.1483.Found:420.1477.；1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.44(s,1H,-NH-),8.46(s,1H,Ar-H),8.31(s,1H,Ph-H),7.63(s,1H,Ph-H),7.54(s,1H,Ph-H),7.43(d,1H,J＝3.0Hz,Ph-H),6.98(d,1H,J＝9.0Hz,Ph-H),6.79(s,1H,-NH-),6.65(dd,1H,J1＝3.0Hz,J2＝9.0Hz,Ph-H),6.18(s,1H,Ar-H),3.81(s,3H,-OCH3),3.77(s,3H,-OCH3),3.71(s,3H,-OCH3)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):161.0,160.1,160.0,157.4,153.1,145.4,142.9,129.0,125.1,123.0,112.3,110.2,108.0,107.9,107.7,102.7,87.5,56.2,55.5,55.3；
本发明所合成目标化合物的性状及其溶解性如下：
目标化合物的产率都比较理想，大部分能达到60～90％，个别化合物如：X 06、X24产率只有20～30％；颜色主要为白色或淡黄色。化合物极性普遍较大，所有化合物均不溶于石油醚、正己烷等极性小的溶剂，部分可微溶于乙酸乙酯；除X 04、X 20、Z 08等难溶于DMSO、DCM、MeOH外，其余目标化合物均可溶于DMSO、DCM等。
本发明合成的目标化合物，质谱结果：所有化合物可见[M+H]+分子离子峰，其中大部分化合物除[M+H]+的分子离子峰外，还可见丰度更高的1/2[M+H]+离子峰；1H-NMR谱图结果，所有化合物氢数及相应化学位移，耦合常数等皆可与相应化合物理论值相符；13C-NMR谱图结果，所有化合物碳峰位移及数目皆与理论数据相符；
实施例2化合物抗肿瘤细胞活性
2.1MTT法测试化合物抗肿瘤活性
本实验通过MTT法对非小细胞肺癌细胞A549、人表皮癌细胞A431和结肠癌细胞HCT-116，进行细胞存活率的检测。将处于对数生长期的各肿瘤细胞(A549、A431和HCT-116)分别培养于96孔板中，铺板浓度在每孔约5×103个细胞，在充满5.0％CO2的37℃恒温条件下培养24h；显微镜下观察，待细胞贴壁后给予以DMSO溶解的终浓度为：不同浓度的先导化合物Yfq07及活性较好的目标化合物X 06溶液1μL。待给药培养48h后，向每孔中加入20μL以PBS溶解为5mg/mL的MTT溶液并继续培养4h，观察发现形成肉眼可见的甲瓒沉淀；小心弃去每孔中的溶液，并向每孔中加入150μL DMSO，用于溶解甲瓒晶体，并在振荡器上均匀振荡10min；最后用酶标仪检测每孔在490nm处紫外吸收波长的吸光值，并通过换算，计算出相应的细胞存活率，抑制率及IC50值。本实验需进行至少三次重复实验。
2.2实验结果
通过MTT法对筛选出的活性化合物X 06和先导药Yfq07在DDR1高表达的非小细胞肺癌细胞A549、人表皮癌细胞A431和结肠癌细胞HCT-116进行了IC50值的测定，相应的实验结果见表2
表2：活性化合物X 06的IC50(μM)
Figure BDA0002551252070000141
结果表明：化合物X 06在A549、A431、HCT116细胞中均表现出较好的抑制效果，IC50值在0.81～3.73μM之间，抗肿瘤活性要优于先导Yfq07。
实施例3化合物对DDR1激酶抑制活性
3.1DDR1激酶实验
本实验通过使用LanthaScreen Eu激酶活性测定技术，在10μL的小体积384孔板中进行激酶反应来评估目标化合物对DDR1激酶的抑制作用。反应缓冲液中的激酶由50mMHEPES pH 7.5、0.01％BRIJ-35、10mM MgCl2和1mM EGTA组成，测定中荧光素-聚GAT底物(Invitrogen，美国)的浓度为100nM。在一系列稀释液的存在下，添加100nM ATP引发激酶反应。使反应在室温下进行1小时，然后加入10μL EDTA(20mM)和TR-FRET稀释缓冲液中的Eu标记抗体(4nM)。测定孔中抗体的终浓度为2nM，EDTA终浓度为10mM。将该板在室温下再孵育一小时，然后在PerkinElmer EnVision多标记阅读器(Perkin-Elmer，Inc.)上获得665nm/340nm的TR-FRET发射比。使用GraphPad Prism4软件进行曲线拟合和数据分析。试验结果见表3：
表3 DDR1激酶实验结果
Figure BDA0002551252070000151
注：Yfq07为先导化合物。所有化合物测试浓度均为10μM，每个化合物至少进行三次实验。
结果表明：(1)先导化合物Yfq07的DDR1激酶抑制率为22.1％；(2)在目标化合物中，化合物X 02、X 05、X 06、X 09、X 16、X 17、X 21、X 24、Z 01、Z 05、Z 06对DDR1激酶抑制率优于先导化合物Yfq07；(3)化合物X 06、X 24对DDR1激酶抑制率超过50％，其中化合物X06是所有目标化合物中激酶活性最好的，对DDR1激酶的抑制率达到64.6％。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种N 4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂，其特征在于，结构通式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
R的取代如下表所示：
化合物 R X 02 （喹喔啉-6-基） X 05 （3-（4-甲基-1H-咪唑-1-基）-5-（三氟甲基）-苯基） X 06 （4-（（4-甲基哌嗪-1-基）甲基）-3-（三氟甲基）苯基） X 09 （喹啉-2-基） X 16 （2-氯-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基） X 17 （3-（叔丁基）-1-（对甲苯基）-1H-吡唑-5-基） X 21 （4-（哌啶-1-基）苯基） X 23 （4-（吗啉甲基）苯基） X 24 （4-（（4-甲基哌嗪-1-基）甲基）苯基） Z 01 （4-甲氧基吡啶-2-基） Z 05 （6-甲氧基嘧啶-4-基） Z 06 （2-甲氧基嘧啶-4-基）
。
2.根据权利要求1所述的N 4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂，其特征在于，为化合物X 06，结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
3.一种如权利要求2所述的N 4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）4,6-二氯嘧啶和2,5-二甲氧基苯胺在DIPEA的作用下进行反应，得到中间体6-氯-N-(2,5-二甲氧基苯基)嘧啶-4-胺；
（2）中间体6-氯-N-(2,5-二甲氧基苯基)嘧啶-4-胺与4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯胺在钯催化剂、配体和碱的作用下进行反应，得到所述的N 4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂。
4.一种如权利要求1~2任一项所述的N 4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于治疗癌症。
5.根据权利要求4所述的N 4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的癌症为肺癌。
6.根据权利要求5所述的N 4-(2,5-二甲氧基苯基)-嘧啶二胺类靶向DDR1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肺癌为非小细胞肺癌。
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