JPH07223968A - 免疫抱合体 - Google Patents

免疫抱合体

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JPH07223968A
JPH07223968A JP6320978A JP32097894A JPH07223968A JP H07223968 A JPH07223968 A JP H07223968A JP 6320978 A JP6320978 A JP 6320978A JP 32097894 A JP32097894 A JP 32097894A JP H07223968 A JPH07223968 A JP H07223968A
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immunoconjugate
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tnfα
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Ilka Von Hoegen
フォン ヒョーゲン イルカ
Uwe Hofmann
ホフマン ウーヴェ
Carlota-Silvia Jaggle
イエークレ カールロタ−シルヴィア
Wolfgang Strittmatter
シュトリットマター ヴォルフガンク
Joerg Stadmueller
シュタートルミュラー イヨルク
Siegfried Matzku
マツク ジークフリート
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 生物活性を有するリガンドを特異的標的細胞
または組織に到達させるための、例えば腫瘍治療に用い
得る新たな融合タンパク質の免疫抱合体を提供する。 【構成】 融合タンパク質は、腫瘍関連標的エレメン
ト、好ましくは、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）
などのヒト腫瘍細胞上で優先的に表現される分子を認識
するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、およ
び増殖および／または分化因子などの生物活性を有する
リガンドからなる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、腫瘍関連標的エレメン
ト、最も好ましくは、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ
Ｒ）などのヒト腫瘍細胞上で優先的に発現される分子を
優先的に認識するモノクローナル抗体またはそのフラグ
メントおよび成長および／または分化因子のような生物
活性を有するリガンドからなる新規融合タンパク質に関
する。得られる融合タンパク質は、特異的標的細胞また
は組織に生物活性を有するリガンドを運ぶために用いる
ことができる。新規の免疫抱合体は腫瘍の治療に使用す
ることができる。
【０００２】
【従来の技術】多様な治療概念が癌患者の治療のために
用いられてきた。過去数年、悪性細胞上で発現される細
胞表面分子を特異的にまたは選択的に認識するモノクロ
ーナル抗体を用いて臨床試験が行われてきた。このアプ
ローチのねらいは、癌細胞を排除するために抗体依存性
細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体媒介細胞毒性
（ＣＤＣ）を誘導することである。第二のアプローチ
は、免疫応答のサイトカイン媒介活性化である。サイト
カイン誘導抗腫瘍活性は次のようなもので媒介され得
る。すなわち、 １）腫瘍増殖に対するサイトカインの直接的細胞毒性／
細胞制圧効果 ２）ＬＡＫ活性または単球／マクロファージ媒介細胞毒
性などの腫瘍−抗原−非特異的メカニズム ３）ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞によって媒介される
腫瘍−抗原−特異的免疫応答。この場合、腫瘍に対する
全身性免疫が動物モデルにおいて観察された。あいに
く、ＩＬ−２またはＴＮＦαなどのサイトカインの全身
性適用はそれらの毒性によって妨げられている（Ｒｕｂ
ｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．、１１、４６０−
４７２、１９９０；Ｂａｌｋｗｉｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ、
３６１、２０６−２０７、１９９３）。腫瘍部位におけ
る充分なサイトカイン濃度を確実にするためにはかなり
多量の投与が必要であるが、最大許容量は有効用量以下
である。したがって、サイトカインのマイナス効果は主
に全身的適用の結果もたらされるが、腫瘍治療における
それらの臨床的効果は疑いの余地がない。動物モデルに
おいて、腫瘍内注射またはトランスフェクトさせた腫瘍
細胞の分泌のいずれかによってサイトカインを腫瘍部位
に存在させることによって腫瘍を退行させ得ることが示
された（Ｈｏｃｋら、ＰＮＡＳ、９０、２７７４−２７
７８、１９９３；Ｃｏｌｏｍｂｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．、５２、４８５３−４８５７、１９９２；ＭｃＢ
ｒｉｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２，３９３１
−３９３７、１９９２；Ｔｅｐｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２５７、５４８−５５１、１９９２；Ｍｕｌｌｅｎ
ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２、６０２０−６０２
４、１９９２；Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．、１７３、１０４７−１０５２、１９９
１；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、
１７２、１２１７−１２２４、１９９０）。これらのシ
ステムでは、サイトカインは腫瘍の増殖は障害しない
が、迅速で有効な抗腫瘍反応を活性化することができ
る。したがって、エフェクター分子と標的エレメントと
の物理的組み合わせは、周辺部の存在を減らして生物活
性を有するリガンドの腫瘍内での利用を促進する。さら
に、単一腫瘍細胞またはミクロ転移もまた、これらの分
子の標的となり得る。
【０００３】抗体特異性標的のための生物活性を有する
リガンドは、直接的にまたは標的細胞に対する致死的環
境をつくり出すことによって標的細胞の破壊を誘導しな
ければならない。生物活性を有するリガンドとしては、
ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、
ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ、ＴＮＦαまたはＣＳ
Ｆなどのサイトカインがある。これらのサイトカイン
は、抗腫瘍効果を直接的にあるいは宿主の防護機構を活
性化するかのいずれかによって発揮することが示された
（Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１、７４
−７７、１９９３；Ｃｏｌｕｍｂｏら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．、５２、４８５３−４８５７、１９９２；Ｔｈ
ｏｍａｓおよびＢａｌｋｗｉｌｌ、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔ
ｈｅｒ．、５２、３０７−３３０、１９９１）。
【０００４】例えば、ＩＬ−２は免疫応答の中心メディ
エーターと考えられている。ＩＬ−２は、Ｔ細胞および
ＮＫ細胞の増殖を刺激することおよびリンホカイン活性
化キラー細胞（ＬＡＫ）を誘導することが示されてい
る。腫瘍浸潤Ｔリンパ球はＩＬ−２に応答して増殖す
る。さらに、ＩＬ−２はＴ細胞および単球の細胞毒性を
増強する。加えて、ＩＬ−２は、免疫応答をさらに増強
するＴ細胞、ＮＫ細胞および単球によって分泌されるサ
イトカインカスケードを誘導する。
【０００５】ＴＮＦαは、主にある種の腫瘍細胞に対す
るその直接的な細胞毒性および腫瘍の出血性退行の誘導
のために腫瘍治療における広範な適用が見出だされてい
る。加えて、ＴＮＦαは免疫応答を増強する。すなわ
ち、これはＴ細胞増殖に対して共刺激作用を有し、ＭＨ
ＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗原の発現およびマクロフ
ァージによるＴＮＦα、ＩＦＮおよびＩＬ−１の分泌を
誘導する。ＩＬ−４は、最初はＢ細胞増殖因子として記
述された。さらなる研究で、ＩＬ−４は抗原特異性細胞
毒性Ｔ細胞を刺激することおよびＮＫ細胞様ＬＡＫより
もむしろＴ細胞様ＬＡＫ細胞に特異的に作用することが
示された。ＩＬ−４は、ヒトメラノーマ細胞の成長を阻
害して、それらのＭＨＣクラスＩおよびＩＩの発現を促
進する。ＩＬ−４によるマクロファージ媒介抗腫瘍効果
の誘導についてはまだ議論の余地がある。
【０００６】ＩＬ−７は、ｐｒｅＢ細胞およびヒト末梢
ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖因子である。ＩＬ
−７は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞亜集団の細胞毒性を増強す
る。加えて、ＩＬ−７は、末梢単球によるＩＬ−１、Ｉ
Ｌ−６およびＴＮＦαの産生を誘導する。インビトロに
おいて、単球／マクロファージの腫瘍殺傷活性はＩＬ−
７によって刺激され、これはおそらくＴＮＦαなどのサ
イトカインによって媒介される。
【０００７】上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、表皮および上
皮細胞のミトゲンであるポリペプチドホルモンである。
ＥＧＦが感受性細胞と相互作用するときには、これは膜
受容体（ＥＧＦＲ）に結合する。ＥＧＦＲは、約１７０
ｋＤの貫膜糖タンパク質であって、ｃｅｒｂ−Ｂプロト
オンコジーン（癌原遺伝子）の遺伝子産物である。
【０００８】ネズミモノクローナル抗体ＭＡｂ４２５は
ヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣＣ ＲＬ１５５５）
に対してつくられたもので、ＥＧＦＲの外側ドメイン上
のポリペプチドエピトープに結合することが見出だされ
た。これはＥＧＦの結合を阻害し、インビトロで腫瘍細
胞毒性を媒介し、インビトロで上皮および結腸直腸癌腫
由来の細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制することが見出ださ
れた（Ｒｏｄｅｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４
７、３６９２、１９８７）。ＭＡｂ４２５のヒト化され
たキメラは、ＷＯ９２／１５６８３から公知である。
【０００９】活性タンパク質の指向的送達のための多様
な組み合わせの抗体−サイトカイン免疫抱合体について
は、既に記述がある。ＩＬ−２は、ヒト癌腫特異性抗体
Ｌ６（Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６、２
４４６−２４５２、１９９１、ＥＰ−ＯＳ−０４３９０
９５）と、または抗ガングリオシドＧＤ２抗体（Ｇｉｌ
ｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ、８９、１４２８−１４３２、１
９９２、ＷＯ９２／０８４９５）と組み合わされた。抗
ダンシル抗体およびＩＧＦ１からなる免疫抱合体はホル
モンの指向的送達のためにつくられた（Ｓｈｉｎおよび
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、ＰＮＡＳ、８７、５３２２−５３２
６、１９９０、ＷＯ９１／１４４３８）。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】このように、本発明の
目的は、（１）腫瘍細胞表面のＥＧＦＲ抗原特異性エピ
トープおよび（２）細胞毒性の誘導にきわめて有力な生
物活性を有するリガンドからなり、したがってその場で
の抗腫瘍効果を増強する抗体またはそのフラグメントを
つくり出すことであった。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、モノクローナ
ル抗体の部分、少なくとも抗原認識部位または完全なモ
ノクローナル抗体を生物活性を有するリガンドと組み合
わせる免疫抱合体に関する。これらの免疫抱合体をコー
ドする構築物は、組み換えＤＮＡ技術によって作出され
る。免疫抱合体は、抗体重鎖の可変部および定常部のＣ
Ｈ１ドメイン（抗体−ＣＨ２抱合体）、または定常部の
ＣＨ１およびＣＨ２ドメイン（抗体−ＣＨ２抱合体）、
または定常部のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン
（抗体−ＣＨ３抱合体）を生物活性を有するリガンドに
融合して含む。適当な軽鎖を加えることによって、抗体
保有細胞を標的にして、活性リガンドを生体の特定の部
位に送達するような免疫抱合体を作出することができる
（第１ａ〜ｃ図）。
【００１２】本発明の免疫抱合体を用いることによっ
て、メラノーマ、神経膠腫および癌腫などの腫瘍を検出
して治療することができる。
【００１３】このように、本発明の目的は、（１）上皮
増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の抗原エピトープを保有す
る腫瘍細胞に特異性のモノクローナル抗体またはそのフ
ラグメント、および（２）該抗体または抗体フラグメン
トに融合し、腫瘍細胞をとくにその場で溶解する細胞毒
性を有するかまたは腫瘍特異性免疫応答を誘導するよう
な生物活性を有するリガンド、好ましくはサイトカイン
からなる免疫抱合体を提供することである。
【００１４】本発明による好ましい実施態様において
は、サイトカインはＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−４およ
びＩＬ−７からなる群から選択される。
【００１５】本発明の他の好ましい実施態様において
は、抗体または抗体フラグメントはネズミ、ヒト化また
はキメラＭＡｂ４２５に由来する。
【００１６】本発明のさらなる好ましい実施態様におい
ては、免疫抱合体はＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＴＮＦα、
ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ
３−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２、ＭＡ
ｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ−２およびＭＡｂ４２５−ＣＨ
３−ＩＬ−２、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−７、ＭＡ
ｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ−７およびＭＡｂ４２５−ＣＨ
３−ＩＬ−７からなる群から選択される。
【００１７】さらに、本発明の目的は上記および請求の
範囲に定義した免疫抱合体の製造法を提供することであ
って、これは宿主生物を用いて、抗体または抗体フラグ
メントおよび生物活性を有するリガンドをコードするＤ
ＮＡ配列を互いに融合させて、得られる構築物を発現ベ
クターに導入して、これで該宿主生物を形質転換させ
て、この宿主細胞を栄養溶液中で培養して、融合タンパ
ク質を発現させることによって行われる。
【００１８】本発明による好ましい実施態様において
は、抗体または抗体フラグメントおよび生物活性を有す
るリガンドをコードするＤＮＡ配列を所望の融合ＤＮＡ
配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて一本鎖ＤＮ
Ａ上に融合させるという手法が用いられる。
【００１９】さらに、本発明の目的は、少なくとも上記
および請求の範囲に定義した免疫抱合体および生物学的
に容認し得る担体からなる薬剤組成物を提供することに
ある。
【００２０】最後に、本発明の目的は、上記および請求
の範囲に定義した免疫抱合体の腫瘍に向けた薬物の調製
のための使用である。
【００２１】とくに、例えばＭＡｂ４２５−ＣＨ２−Ｔ
ＮＦαおよびＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＴＮＦαなどの抗
体−ＣＨ２および抗体−ＣＨ３抱合体の場合、細胞性細
胞毒性の誘導はカップリングさせないＴＮＦαよりも優
れていた。これはおそらく、結合的性質およびモノクロ
ーナル抗体の定常部およびサイトカイン活性によるＡＤ
ＣＣの誘導に関する組み合わせによるものと考えられ
る。
【００２２】本発明による抗体−ＣＨ１抱合体は、小分
子であることおよび原核細胞における発現が可能である
という点で有利である。さらに、サイズが小さいことに
よって（腫瘍）組織への進入が促進される。
【００２３】本発明の免疫抱合体はさらに、好ましくは
ＭＡｂ４２５またはそのフラグメントなどのモノクロー
ナル抗体と比較して、良好な結合および増殖特性を示
す。 材料および方法 モノクローナル抗体 ＭＡｂ４２５は、ヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５５５）に対するＩｇＧ１ネズミモノクローナ
ル抗体である。ＭＡｂ４２５は、ヒトＥＧＦ受容体の外
側ドメインのポリペプチドエピトープと結合し、ＥＧＦ
の結合と競合する。ＭＡｂ４２５は、インビボで腫瘍細
胞毒性を媒介することおよびインビトロで類表皮腫およ
び結腸直腸癌腫由来細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制するこ
とが見出だされた（Ｒｏｄｅｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ、４７、３６９２、１９８７）。ヒト化およびキメ
ラ型ＭＡｂ４２５はＷＯ９２／１５６８３に開示されて
いる。 サイトカイン サイトカインをコードするｃＤＮＡは、Ｂｒｉｔｉｓｈ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｈｅｒ
ｒｍａｎｎ Ｂｉｅｒｍａｎｎ ＧＭＢＨ、Ｂａｄ Ｎａ
ｕｈｅｉｍ ＦＲＧ；ヒトＩＬ−２ ＢＢＧ３０、ヒトＩ
Ｌ−４ ＢＢＧ１５、ヒトＩＬ−７ ＢＢＧ４３、ヒトＴ
ＮＦα ＢＢＧ１８）から購入した。市販のｃＤＮＡ
は、タンパク質分泌に必要なシグナル配列を欠いてい
る。サイトカインをコードするｃＤＮＡは、サイトカイ
ン産生細胞から分離されるｍＲＮＡから作出することが
できる。 ベクター ｐＵＣ１９は一連の多重コピー数大腸菌プラスミドクロ
ーニングベクターの一部であって、ｐＢＲ３２２および
Ｍ１３ｍｐ１９の部分を含む。ｐＵＣ１９は、誘導性細
菌性ｌａｃプロモーター−オペレーターおよびそれに続
く多クローニング部位を含む（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒ
ｒｏｎら、Ｇｅｎｅ、３３、１０３−１０９、１９８
５）。ｐＵＣベクターは、市販されている（例えばＮｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓなど）。ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＫＳ／ＳＫ＋およびＫＳ／ＳＫ−ファー
ジミドベクターはｐＵＣ１９に由来する。これらベクタ
ーは市販されている（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。
【００２４】真核細胞発現ベクターｐＨＣＭＶ（Ｇｉｌ
ｌｉｅｓら、Ｃｅｌｌ、３３、７１７、１９８３）は、
シミアン（アカゲザル）ウイルス４０（ＳＶ４０）の複
製開始点およびヒトサイトメガロウイルスのプロモータ
ーおよびエンハンサー領域を含む。プロモーター／エン
ハンサー領域の後には、発現されるべき遺伝子導入のた
めの多クローニング部位（ｍｃｓ）が続く。このベクタ
ーにおいて、ＭＡｂ４２５重鎖可変部のキメラ型および
ΔＳａｃＩＩｃγ１領域とそれにＣＨ１、ＣＨ２または
ＣＨ３ドメインの末端でそれぞれ融合したエフェクター
分子とを組合わせてＭＡｂ４２５重鎖融合タンパク質が
つくり出された。この融合Ｉｇ鎖を適当な軽鎖と組み合
わせることによって一価の抗原結合領域を形成してこれ
を免疫抱合体に組み立てることができ、これを会合させ
て標的抗原に特異的な二価の免疫抱合体を産生するがで
きる（第１図）。重鎖および軽鎖構築物は、同一のまた
は別々のベクターに導入することができる。
【００２５】原核細胞発現ベクターはｐＳＷ１ベクター
（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４−５４
６、１９８９）に基づき、これはｐＵＣ１９ベクターに
由来する。ｐＳＷ１は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏ
ｖｏｒａからの細菌性ｐｅｌＢ遺伝子のリーダーペプチ
ドをコードする配列を含む（Ｌｅｉら、Ｊ．Ｂａｃ
ｔ．、１６９、４３７９−４３８３、１９８７）。外来
性ＤＮＡをｐｅｌＢリーダー配列の後に枠内に導入し
て、ペリプラズム中へのタンパク質発現を指示すること
ができる。 ［図面および表の簡単な説明］ ［表１］ ＭＡｂ４２５−サイトカイン融合タンパク質
の作出のために用いたＰＣＲプライマー（真核細胞発
現）* ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベ
クターＳＫ＋／−およびＫＳ＋／−とハイブリダイズす
る逆プライマー（市販物）** このプライマーは単一ＳａｃＩＩ部位を含むＣｇ１
定常部とハイブリダイズする。
【００２６】*** Ｍ１３由来のベクターとハイブリダ
イズする逆プライマー（市販物） ［表２］ ＭＡｂ４２５−サイトカイン融合タンパク質
の作出のために用いたＰＣＲプライマー（原核細胞発
現） ［図１］ 抗体−サイトカイン免疫抱合体のモデル図 Ｃ＝サイトカイン、ＶＨ＝重鎖可変部、ＶＬ＝軽鎖可変
部、ＣＨ＝重鎖定常部、ＣＬ＝軽鎖定常部； （ａ）抗
体−ＣＨ１抱合体、（ｂ）抗体−ＣＨ２抱合体、（ｃ）
抗体−ＣＨ３抱合体。
【００２７】［図２］ ＥＧＲ−Ｒ特異性ＥＬＩＳＡに
おける免疫抱合体のＥＧＦ−Ｒへの結合 過渡的にトランスフェクトさせたＣＯＳ−７細胞の上清
の免疫抱合体含量を調べた。縦軸：４９０ｎｍでの％吸
収、横軸：上清希釈（ｌｏｇ２）。黒丸：ＭＡｂ４２５
ＣＨ１−ＴＮＦα、黒四角：ＭＡｂ４２５ＣＨ２−ＴＮ
Ｆα、黒三角：ＭＡｂ４２５ＣＨ３−ＴＮＦα、黒菱：
ＭＡｂ４２５−対照、黒逆三角：ＭＡｂ４２５ＦＡｂ−
対照、黒六角：再成形したＭＡｂ４２５Ｆ（ａｂ′）2
（精製タンパク質）。
【００２８】［図３Ａ］ ＣＯＳ−７細胞において発現
されたＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体のＩ
Ｌ−２活性 ＣＴＬＬ−２細胞をインジケーター細胞系として用い
た。ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２を含む連続希釈し
たＣＯＳ上清の増殖活性を左図に示す（黒丸）。ＭＡｂ
４２５Ｆａｂ−対照を含むＣＯＳ上清を対照として用い
た（白丸）。組み換え市販ＩＬ−２タンパク質を伴うあ
るいはＩＬ−２を伴わない（ＫＯ）活性化時のＣＴＬＬ
−２細胞の増殖応答を右図に示した。
【００２９】［図３Ｂ］ 大腸菌において発現されたＭ
Ａｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体のＩＬ−２活
性 ＣＴＬＬ−２細胞をインジケーター細胞系として用い
た。大腸菌中で発現させて抗ＭＡｂ４２５イディオタイ
プカラム上でアフィニティークロマト精製したＭＡｂ４
２５−ＣＨ１−ＩＬ−２の連続希釈物の増殖活性を左図
に示す（黒三角）。ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−を含
むＣＯＳ上清を対照として用いた（黒丸）。透析緩衝液
（黒四角）。緩衝液がＩＬ−活性に影響しなかったこと
を確認するために、透析緩衝液を一定濃度のＩＬ−２
（１Ｕ／ｍｌ）の存在下で滴定した（逆黒三角）。組み
換え市販ＩＬ−２タンパク質を伴うあるいはＩＬ−２を
伴わない（ＫＯ）活性化時のＣＴＬＬ−２細胞の増殖応
答を右図に示した。
【００３０】［図３Ｃ］ ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ
−２免疫抱合体によるＴＩＬ増殖の誘導 メラノーマ腫瘍浸潤リンパ球を、ＭＡｂ４２５ーＣＨ１
−ＩＬ−２免疫抱合体を含む連続希釈したＣＯＳ上清の
存在下または非存在（ＫＯ）下で培養した（左図）。組
み換え市販ＩＬ−２を用いた活性化時のＴＩＬの増殖応
答を右図に示す。
【００３１】［図４］ ＭＡｂ４２５−ＩＬ−４免疫抱
合体によるＨＰＢＬ増殖の誘導 ＰＨＡ活性化ＨＰＢＬを、ＭＡｂ４２５ーＣＨ２−ＩＬ
−４（黒丸）、ＭＡｂ４３５−ＣＨ３−ＩＬ−４（黒三
角）融合タンパク質を含む連続希釈したＣＯＳ上清の存
在下で培養した。ＭＡｂ４２５（黒四角）、ＩＬ−４
（黒菱）およびベクター対照（黒逆三角）を含む上清を
対照として用いた。組み換え市販ＩＬ−４を伴うおよび
成長因子と伴わない（ＫＯ）活性化時のＨＰＢＬの増殖
応答を右図に示す。
【００３２】［図５］ ＷＥＨＩ１６４細胞に対するＭ
Ａｂ４２５−ＴＮＦα免疫抱合体細胞毒性 ＴＮＦα感受性ネズミ線維肉腫細胞系ＷＥＨＩ１６４
を、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＴＮＦα免疫抱合体（黒四
角）またはＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦα免疫抱合体
（黒三角）またはＭＡｂ４２５Ｆａｂ−対照（黒丸）を
含む連続希釈したＣＯＳ上清の存在下で４８時間培養し
た（左図）。市販の組み換えヒトＴＮＦαによって誘導
されるインジケーター細胞の増殖阻害を右図に示す。
【００３３】［図６］ ＰＢＭＣによるＭＡｂ４２５−
ＴＮＦα免疫抱合体媒介腫瘍細胞溶解 非活性化ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）をエフェクタ
ー細胞として用いて、異質遺伝子的ＥＧＦ−Ｒ陽性51Ｃ
ｒ標識Ｃ８１６１標的細胞とともにエフェクター／標的
細胞比３０：１の割合で共培養した。特異的溶解（％）
をＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＴＮＦα免疫抱合体を含む連
続希釈したＣＯＳ培養上清の非存在または存在下で１８
時間培養した後に調べる（細線棒）。組み換えＴＮＦα
（Ｇｅｎｚｙｍｅ）は３６ｋＤダイマーとして大腸菌中
で発現させた（細点棒）。
【００３４】
【実施例】本出願に記載の他の微生物、細胞系、プラス
ミド、プロモーター、耐性マーカー、複製開始点、制限
部位またはベクターの他のフラグメントは、市販されて
いるかまたは他の手段でふつうに入手が可能である。と
くに記載がない限り、これらは例として使用されている
もので、本発明に必須ではなく、他の適当な手段および
生物学的材料で置き換えることができる。
【００３５】本発明に必須の方法技術を、以下に詳細に
記述する。詳細な記述のない他の方法技術は、当業者に
公知の標準法であるかまたは引用参考文献および特許出
願または標準的文献（例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ、Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、Ｈａｒ
ｌｏｗ、Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ、１９８８）により詳細に記述されている。融合タンパク質の真核細胞における発現 Ｆａｂ４２５−サイトカイン融合タンパク質発現のため
の真核細胞発現ベクターの構築 ＭＡｂ４２５およびサイトカインのループアウト手法に
よる融合： ＴＮＦα構築物の作出 ΔＳａｃＩＩｃγ１クローンのＳａｃＩＩ／ＸｂａＩフ
ラグメントを、ＴＮＦαｃＤＮＡなどのサイトカインを
コードする配列を含むＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋に挿
入した。ＴＮＦαｃＤＮＡをＳｍａＩ部位とＥｃｏＲＩ
部位との間に導入した。得られる構築物を適当なヘルパ
ーファージを加えることによって一本鎖ＤＮＡに調製し
た。ＣＨ２またはＣＨ３ドメインをＴＮＦαコード配列
の５′末端と枠内で融合させた。下記のオリゴヌクレオ
チド、すなわち
【００３６】
【化１】 は、それぞれＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの
３′末端、およびＴＮＦαコード配列と一致する。一本
鎖ＤＮＡ配列をオリゴヌクレオチドによって一体にし
て、間の不要な配列を構築物から除去する。上方の鎖が
一本鎖ＤＮＡとして作出されたので、オリゴヌクレオチ
ドは逆配向を有している。
【００３７】ＤＮＡを配列合成酵素シクエナーゼポリメ
ラーゼによって二本鎖型に形成した。この酵素はＡｍｐ
ｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼのようにエラーを生じる
傾向にはないので、単離されたクローンの接合部のＤＮ
Ａ配列のみを決定した。正しい配列を有するこれらクロ
ーンを完全なＭＡｂ４２５融合タンパク質を作出するた
めに必要な配列と組み合わせて、真核細胞での発現のた
めにｐＨＣＭＶベクターにクローニングした。 ＩＬ−４構築物の作出：これらの構築のために、完全な
ΔＳａｃＩＩｃγ１クローンをＫｐｎＩ／ＳａｌＩフラ
グメントとしてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋に挿入し
た。ＩＬ−４をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメン
トとして同じベクターにクローニングした。融合を上記
のＴＮＦα構築物と同様にして下記のそれぞれＣＨ２お
よびＣＨ３ドメインの融合のためのオリゴヌクレオチ
ド、すなわち
【００３８】
【化２】 を用いて行った。
【００３９】正しい配列を有するこれらクローンを完全
なＭＡｂ４２５融合タンパク質を作出するために必要な
配列と組み合わせて、真核細胞での発現のためにｐＨＣ
ＭＶベクターにクローニングした。 ＰＣＲ手法によるＭＡｂ４２５とサイトカインとの融合 ＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼはエラーを生じが
ちであるので、エラーがなかったことを確認するために
ＰＣＲ手法によって増幅されたこれら配列を決定した。
これらの実験に用いたプライマーの概要を表１に示す。 ＣＨ１融合タンパク質の作出 ｐＵＨ５プラスミドは原核細胞発現のための重鎖ＦＡｂ
４２５フラグメントのてめの配列、それにＥｒｗｉｎｉ
ａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａに由来するタンパク質分泌を
確実にするＮ末端ｐｅｌＢリーダー配列（Ｌｅｉら、
Ｊ．Ｂａｃｔ．、１６９、４３７９−４３８３、１９８
７）を含む。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩフラグメントを
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋ベクターに再クローニング
した。サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−７をＰＣＲ手
法によって増幅して、５′Ｎｃｏｌおよび３′ＢａｍＨ
Ｉ制限部位をそれぞれ導入した。ＩＬ−２およびＴＮＦ
αは５′ＮｃｏＩおよび３′ＢａｍＨＩ制限部位を既に
含んでいる。すべてのサイトカインをＮｃｏＩ／Ｂａｍ
ＨＩフラグメントとしてＣＨ１ドメインの後にクローニ
ングした。これらの構築物において、サイトカイン配列
は枠内になかった。したがって、アダプター（５′ＴＣ
ＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧ３′）をＳａｌＩとＮｃｏＩ制限
部位間に導入した。その結果、得られる構築物において
は重鎖およびサイトカインはアダプター配列によって導
入された一つのアミノ酸（Ａｌａ）の追加された融合タ
ンパク質として発現される。ＤｒａＩＩＩ／ＢａｍＨＩ
フラグメントを、完全ＭＡｂ４２５重鎖ｃＤＮＡクロー
ンを含むｐＨＣＭＶ発現ベクターにクローニングした。
この構築物において、ｐｅｌＢリーダー配列はＭＡｂ４
２５重鎖ｃＤＮＡのリーダー配列に置き換えられた。 ＣＨ２およびＣＨ３融合タンパク質の作出 ΔＳａｃＩＩｃγ１ＤＮＡの増幅をＰＣＲ手法によっ
て、ＩＬ−２およびＩＬ−７などの対応するサイトカイ
ンの５′末端と枠内でオーバーラップするＣＨ２−３′
末端プライマーを用いる二つの別々の反応で行った。Ｉ
Ｌ−２およびＩＬ−７ｃＤＮＡクローンもまた、ＰＣＲ
によって増幅した。ＳＫ＋ベクターおよび続いてのｐＨ
ＣＭＶ発現ベクターへのサブクローニングを促進するた
めに、３′末端において、唯一のＮｏｔＩおよびＳａｌ
Ｉ部位をＩＬ−２構築物に、唯一のＸｂａＩ部位をＩＬ
−７構築物にそれぞれ導入した。ＩＬ−２およびＩＬ−
７ＰＣＲ産生物の完全ΔＳａｃＩＩｃγ１領域との融合
をＰＣＲ組み換えによって行った。得られるＢａｍＨＩ
／ＮｏｔＩΔＳａｃＩＩｃγ１ＣＨ２−ＩＬ−２フラグ
メントを、ＭＡｂ４２５重鎖可変部を含むＳＫ＋にサブ
クローニングした。ＳａｃＩＩ／ＸｂａＩΔＳａｃＩＩ
ｃγ１ＣＨ２−ＩＬ−７フラグメントを、ＭＡｂ４２５
重鎖可変部およびＳａｃＩＩ部位までのΔＳａｃＩＩｃ
γ１領域を含むＳＫ＋ベクターにサブクローニングし
た。この工程によって完全ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ
−２およびＩＬ−７融合遺伝子がそれぞれ作出された。
完全ＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ−２も同様にして作出
されるが、この場合はΔＳａｃＩＩｃγ１を５′末端と
して唯一ＳａｃＩＩ部位から増幅した。ＣＨ２ーＩＬ−
２融合物を含むＳＫ＋中のＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ
−２のＳａｃＩＩ／ＰｓｔＩフラグメントを、次いでＣ
Ｈ３−ＩＬ−２融合物を含むＳａｃＩＩ／ＰｓｔＩフラ
グメントに置き換えた。完全なＭＡｂ４２５融合遺伝子
を次いで真核細胞中における発現のためにｐＨＣＭＶベ
クターにクローニングした。 免疫抱合体の発現 ＣＨ１ドメインのみを含む一価の免疫抱合体またはＣＨ
２およびＣＨ２プラスＣＨ３ドメインを含む二価の免疫
抱合体の発現のためのベクター構築物の宿主細胞への導
入は、電気穿孔法、ＤＥＡＥデキストラン、燐酸カルシ
ウム、リポフェクチンまたはプロトプラスト融合によっ
て行うことができる。免疫抱合体および適当な軽鎖をコ
ードする組み換えＤＮＡ配列がその細胞において正しく
ｍＲＮＡに転写される限り、いかなる宿主細胞型を用い
てもよい。宿主細胞としては、免疫グロブリンを産生し
ないマウスミエローマ細胞、例えばＳｐ２／０−ＡＧ１
４（ＡＴＣＣ ＤＲＬ１５８１）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．
６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）またはハムスター
細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、
またはＣＨＯ／ｄｈＦｒ−（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９０９
６）、またはＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）が
用いられる。過渡的発現には、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６５０）またはＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６５１）が用いられる。 免疫抱合体の過渡的発現 発現ベクターｐＨＣＭＶは、アカゲザルウイルス４０
（ＳＶ４０）の複製開始点を含む。細胞系ＣＯＳ−７
は、開始点欠失ＳＶ４０ウイルスで形質転換されたアカ
ゲザル細胞系ＣＶ−１から誘導されたものである。した
がって、ＳＶ４０複製開始点を含むプラスミドは増幅さ
れて、免疫抱合体の産生が向上すると考えられる。上清
を７２時間後に集めて、ＥＧＦ−受容体結合およびサイ
トカイン濃度について調べた。 免疫抱合体の定常的発現 免疫抱合体の発現のための組み換え構築物を含むベクタ
ーを、適当な宿主細胞に導入する。重鎖および軽鎖構築
物を同一または別々のベクターに入れることができる。
後者の場合は、両ベクターはネオマイシン耐性またはｄ
ｈＦｒなどの同一の選択マーカーまたは二つの異なる選
択マーカーを両ベクターの選択検出のために含ませれば
よい。ｄｈＦｒマーカーの選択は、ＣＨＯ／ｄｈＦｒ−
などのｄｈＦｒ陰性細胞系においてのみ可能である。ク
ローンを免疫抱合体の発現についてＥＧＦ−受容体特異
性ＥＬＩＳＡを用いて分析する。選択されたクローンを
次いで限定希釈クローニングによってさらに精製する。 ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−サイトカイン融合タンパク質発
現のための原核細胞発現ベクターの構築 ＭＡｂ４２５軽鎖および重鎖のＦｄフラグメントをコー
ドするＤＮＡ配列を、ｐＳＷ１ベクターの多クローニン
グ部位に導入した。成熟軽鎖コード配列および成熟重鎖
コード配列は、細菌性ｐｅｌＢ遺伝子のリーダーペプチ
ドの先に位置する。重鎖コード配列は、３′ＮｃｏＩ部
位を含む。サイトカインをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ
によって修飾して、ＮｃｏＩ（５′末端）およびＮｏｔ
Ｉ（３′末端）制限部位を導入した。サイトカイン遺伝
子を枠内で重鎖のＣＨ１ドメインに直接に融合させた。
これらの実験に用いたプライマーを表２に要約する。
【００４０】
【表１】
【００４１】
【表２】 これらのベクターによって、機能的Ｆａｂ−サイトカイ
ン融合タンパク質の大腸菌における効率的な発現が可能
になる。軽鎖および重鎖サイトカイン融合タンパク質
は、誘導性ｌａｃプロモーターのコントロール下にある
ジシストロンメッセンジャーＲＮＡ（Ｓｋｅｒｒａおよ
びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、１
０３８−１０４、１９８８）上に位置される。したがっ
て、Ｆａｂ−融合タンパク質の発現は、培養条件の要求
に従って誘導することができる。両タンパク質のジシス
トロンメッセンジャーＲＮＡからの翻訳は等量のＦｄ−
ＩＬ−２融合タンパク質および軽鎖の合成に好都合であ
るので、その結果、機能性Ｆａｂ−融合タンパク質への
正しい組立のチャンスが高まる。二つのポリペプチドは
大腸菌のペリプラズム中に分泌され、ここで折り畳み、
ジスルフィド結合の形成および機能性ＦＡｂ４２５−Ｃ
Ｈ１融合タンパク質への組立がなされる。細菌培養の延
長下で、タンパク質は培養培地中に分泌される。 ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２融合タンパク質の大腸
菌における発現、および精製 タンパク質発現に適する大腸菌株を、発現プラスミドに
よって形質転換させた。細胞をＯＤ580０．５になるま
で増殖させて、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）で誘導した。細胞を
一晩増殖させて、上清および細胞を回収した。上清を抗
ＭＡｂ４２５抗イディオタイプカラムに供する。カラム
を０．５Ｍ ＮａＣｌ−燐酸塩緩衝溶液で洗浄して、結
合したタンパク質を１００ｍＭグリシン−０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ（ｐＨ２．５）で溶出した。溶出された液を２．
５Ｍトリス（ｐＨ８）で直ちに中和した。ＭＡｂ４２５
−ＣＨ１−ＩＬ−２を含むフラクションを集めて、濃縮
して、ＰＢＳに対して透析した。 ＭＡｂ４２５免疫抱合体の結合特性 ＭＡｂ４２５免疫抱合体の結合特性を、ＥＧＦ受容体特
異性ＥＬＩＳＡによって決定した。すなわち、マイクロ
タイタープレートを精製ＥＧＦ受容体を用いて４℃で一
晩被覆して、未結合タンパク質を洗浄除去した。プレー
トを、融合タンパク質を含む上清または非抱合ＭＡｂま
たはＦａｂフラグメントを含む上清または精製したかた
ちのタンパク質とともにインキュベートした。プレート
を洗浄して、ペルオキシダーゼと抱合したヤギ抗ヒトＩ
ｇＧおよびＩｇＭ（重鎖および軽鎖）とともにインキュ
ベートした。基質を加えて、結合したＥＧＦ受容体特異
性タンパク質の量を４５０ｎｍで測定して決定した（第
２図）。サイトカイン濃度はそれぞれのサイトカインに
特異的な市販のＥＬＩＳＡを用いて製造者の指示に従っ
て決定した（データ表示せず）。 白血球の増殖 腫瘍特異性エフェクター細胞 末梢血単核白血球およびメラノーマ患者から分離された
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、照射（３０Ｇｙ）した
同原性腫瘍細胞と培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ペニシ
リン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、２０ｍＭ
ヘペス、５０ｍＭβメルカプトエタノール、１０％胎児
ウシ血清、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、２０Ｕ／ｍｌのＩ
Ｌ−４）中で共培養した。応答細胞を同原性腫瘍細胞で
毎週刺激した。 増殖の測定 サイトカイン媒介増殖は次のような細胞を用いて測定す
ることができる。すなわち、 ａ）適当なインジケーター細胞系。ＩＬ−２の場合、Ｉ
Ｌ−２依存性マウス細胞系ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣＣ Ｔ
ＩＢ２４１）（第３Ａ図）または他のＩＬ−２依存性細
胞系を用いることができる。
【００４２】ｂ）インビトロ拡大腫瘍浸潤リンパ球（第
３Ｂ図） ｃ）ＰＨＡ−Ｍ（シグマ）によって前処理して新鮮分離
した血液単球細胞。この場合、実験はＭＡｂ４２５−Ｉ
Ｌ−４融合タンパク質を用いて行った（第４図）。
【００４３】健康な供血者またはメラノーマ患者から調
製した新鮮ヒト末梢血白血球またはメラノーマ患者から
分離したＴＩＬを、インビトロで増殖させた（上記を参
照されたい）。融合タンパク質を分析するために、白血
球を９６ウェル平底マイクロタイタープレート中で１ｘ
１０5細胞／ウェルの密度で最終容量２００μｌにして
培養した。細胞を、融合タンパク質を含む上清または非
抱合ＭＡｂを含む上清または非抱合サイトカインを含む
上清または精製タンパク質とともにインキュベートし
た。７２時間後、細胞を０．５μＣｉ3Ｈ−チミジンで
処理した。放射能の取り込みを一晩インキュベートした
後に液体シンチレーションβプレートカウンターを用い
て測定した。結果を平均ｃｐｍで表す。 ＭＡｂ４２５−ＴＮＦα免疫抱合体の細胞毒性の測定 ＴＮＦα媒介細胞毒性の測定 ＴＮＦαは種々の腫瘍細胞を含むある種の細胞には直接
的に細胞毒性を示すことが報告された。ＴＮＦαの直接
的細胞毒性はＬ９２９ネズミ線維芽細胞（ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ１）またはＷＥＨＩ１６４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７
５１）または他のＴＮＦα感受性細胞系（Ｆｌｉｃｋお
よびＧｉｆｆｏｒｄ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈ．、６８、１６７、１９８４）を用いて決定すること
ができる。第４図において、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−Ｔ
ＮＦαおよびＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦαの細胞毒
性はＷＥＨＩ１６４細胞をインジケーター細胞系として
示されている。 ＴＮＦα誘導細胞毒性の測定 高浸潤性で自然転移性のＥＧＦ受容体陽性細胞系Ｃ８１
６１（Ｗｅｌｃｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４
７、２２７、１９９１およびその引用文献）などのＥＧ
Ｆ受容体陽性細胞系を、同原性腫瘍浸潤リンパ球または
メラノーマ患者または健康な供血者から新鮮分離された
ヒト末梢血リンパ球による細胞溶解の標的細胞として使
用することができる。腫瘍細胞およびＴＩＬの培養条件
は前に記述がある（Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．、５１、６１５３、１９９１）。
【００４４】インビトロ細胞毒性アッセイを、51Ｃｒ−
標識腫瘍標的細胞を用いて行った。標的細胞を51Ｃｒ
（１００μＣｉ／１０7細胞）で１時間標識して、次い
で３回洗浄して過剰の51Ｃｒを除去した。２ｘ１０3標
識細胞／ウェルを、融合タンパク質を含む上清または非
抱合ＭＡｂを含む上清または非抱合サイトカインを含む
上清（対照）または精製タンパク質の存在下でエフェク
ター細胞と９６ウェルマイクロタイタープレート中で共
インキュベートした。上清または精製タンパク質を培養
培地で連続希釈して、アッセイは三重に行った。プレー
トを、３７℃で４時間１０％ＣＯ2雰囲気下でインキュ
ベートした。次いで細胞を遠心分離によって除去して、
上清中の放射能をγカウンターを用いて測定した。次の
計算式によって特異性51Ｃｒ放出（％）を算出した。 特異性51Ｃｒ放出（％）＝１００ｘ（実験的放出−自然
放出）／（最大放出−自然放出） 免疫抱合体の治療的使用 本発明の免疫抱合体は、治療のためにヒト患者に投与す
ることができる。したがって、本発明の目的は、上記お
よび請求項に記載の少なくとも一つの融合タンパク質を
活性組成分として、一つまたはそれ以上の薬剤学的に容
認し得る担体、賦形剤または希釈剤とともに含んでなる
薬物調製物を提供することにある。
【００４５】通常、本発明の免疫抱合体は静脈注射によ
ってまたは非経口的に投与される。一般に、免疫抱合体
の投与量は、所望の腫瘍抑制および腫瘍溶解効果が得ら
れる範囲の量である。投与量は、患者の年齢、状態、性
別、病気の程度によって異なり、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２
００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００
ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲で１日１回またはそれ以上を１
日または数日間投与することができる。
【００４６】非経口的投与のための調製物には、滅菌水
溶液または非水溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。
非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリ
エチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイ
ン酸エチルなどの注射可能な有機エステルおよびこれら
の目的に適した当業者に公知の他の溶媒があげられる。
本発明の免疫抱合体は、生理学的に容認し得る担体から
なる組成物において使用することができる。それら適当
な担体の例としては、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶
液または乳酸リンゲル溶液があげられる。保存剤および
他の添加剤、例えば抗生物質、抗酸化剤およびキレート
剤などを薬剤調製物に加えることも可能である。
【００４７】本発明の薬剤調製物は、メラノーマ、神経
膠腫および癌腫、さらに血液腫瘍および固形腫瘍を含む
あらゆる種類の腫瘍の治療に適している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 抗体−サイトカイン免疫抱合体のモデル図
【図２】 ＥＧＲ−Ｒ特異性ＥＬＩＳＡにおける免疫抱
合体のＥＧＦ−Ｒへの結合
【図３】 Ａは、ＣＯＳ−７細胞において発現されたＭ
Ａｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体のＩＬ−２活
性、Ｂは、大腸菌において発現されたＭＡｂ４２５−Ｃ
Ｈ１−ＩＬ−２免疫抱合体のＩＬ−２活性、Ｃは、ＭＡ
ｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体によるＴＩＬ増
殖の誘導
【図４】 ＭＡｂ４２５−ＩＬ−４免疫抱合体によるＨ
ＰＢＬ増殖の誘導
【図５】 ＷＥＨＩ１６４細胞に対するＭＡｂ４２５−
ＴＮＦα免疫抱合体細胞毒性
【図６】 ＰＢＭＣによるＭＡｂ４２５−ＴＮＦα免疫
抱合体媒介腫瘍細胞溶解
【符号の説明】
Ｃ＝サイトカイン、ＶＨ＝重鎖可変部、ＶＬ＝軽鎖可変
部、ＣＨ＝重鎖定常部、ＣＬ＝軽鎖定常部； （ａ）抗
体−ＣＨ１抱合体、（ｂ）抗体−ＣＨ２抱合体、（ｃ）
抗体−ＣＨ３抱合体。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9161−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 イルカ フォン ヒョーゲン ドイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタ ット フランクフルター シュトラーセ 250 エー．メルク内 (72)発明者 ウーヴェ ホフマン ドイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタ ット フランクフルター シュトラーセ 250 エー．メルク内 (72)発明者 カールロタ−シルヴィア イエークレ ドイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタ ット フランクフルター シュトラーセ 250 エー．メルク内 (72)発明者 ヴォルフガンク シュトリットマター ドイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタ ット フランクフルター シュトラーセ 250 エー．メルク内 (72)発明者 イヨルク シュタートルミュラー ドイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタ ット フランクフルター シュトラーセ 250 エー．メルク内 (72)発明者 ジークフリート マツク ドイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタ ット フランクフルター シュトラーセ 250 エー．メルク内

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （１）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）
    の抗原エピトープを有する腫瘍細胞に対するモノクロー
    ナル抗体またはそのフラグメントおよび（２）該抗体ま
    たは抗体フラグメントと融合し、腫瘍細胞をその場で特
    異的に溶解する細胞毒性を有するか腫瘍特異性免疫応答
    を誘導する生物活性を有するリガンドからなる免疫抱合
    体。
  2. 【請求項２】 生物活性を有するリガンドがサイトカイ
    ンである請求項１に記載の免疫抱合体。
  3. 【請求項３】 サイトカインがＴＮＦα、ＩＬ−２、Ｉ
    Ｌ−４またはＩＬ−７からなる群から選択される請求項
    ２に記載の免疫抱合体。
  4. 【請求項４】 該抗体が抗体重鎖の可変部、定常部のＣ
    Ｈ１ドメインおよび適当な軽鎖（抗体−ＣＨ１抱合体）
    から本質的になるＦａｂフラグメントまたはＦ（ａ
    ｂ′）２フラグメントである請求項１、２または３に記
    載の免疫抱合体。
  5. 【請求項５】 該抗体が抗体重鎖の可変部、定常部のＣ
    Ｈ１およびＣＨ２ドメインおよび適当な軽鎖（抗体−Ｃ
    Ｈ２抱合体）から本質的になる抗体フラグメントである
    請求項１、２または３に記載の免疫抱合体。
  6. 【請求項６】 該抗体が抗体重鎖の可変部、定常部のＣ
    Ｈ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインおよび適当な軽鎖
    （抗体−ＣＨ３抱合体）から本質的になる請求項１、２
    または３に記載の免疫抱合体。
  7. 【請求項７】 該抗体または抗体フラグメントがネズ
    ミ、ヒト化またはキメラＭＡｂ４２５に由来する請求項
    １〜５のいずれか１項に記載の免疫抱合体。
  8. 【請求項８】 ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＴＮＦα、ＭＡ
    ｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ３−
    ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ２、ＭＡｂ４２
    ５−ＣＨ２−ＩＬ２およびＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ
    ２からなる群から選択される免疫抱合体．
  9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の免
    疫抱合体の調製法であって、抗体または抗体フラグメン
    トおよび生物活性を有するリガンドをコードするＤＮＡ
    配列をともに融合して、得られる構築物を発現ベクター
    に導入してそれで宿主細胞を形質転換して、その宿主細
    胞を栄養溶液中で培養して、融合タンパク質を発現する
    ことからなる調製法。
  10. 【請求項１０】 抗体または抗体フラグメントおよび生
    物活性を有するリガンドをコードするＤＮＡ配列を、所
    望の融合ＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用
    いて一本鎖ＤＮＡ上に融合させることを特徴とする請求
    項９に記載の調製法。
  11. 【請求項１１】 大腸菌宿主における抗体−ＣＨ１抱合
    体の発現のための請求項９または１０に記載の調製法。
  12. 【請求項１２】 真核細胞宿主における抗体−ＣＨ２ま
    たは抗体−ＣＨ３抱合体の発現のための請求項９または
    １０に記載の調製法。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜８に記載の少なくとも一つ
    の免疫抱合体および生物学的に容認し得る担体からなる
    薬剤組成物。
  14. 【請求項１４】 腫瘍に向けた薬物の調製のための請求
    項１〜８項のいずれか１項に記載の免疫抱合体の使用。
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