JP2975679B2 - ヒト神経膠腫のｅｇｆ受容体遺伝子の構造変化 - Google Patents

ヒト神経膠腫のｅｇｆ受容体遺伝子の構造変化

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Description

【発明の詳細な説明】 本出願は1989年９月８日出願の米国特許第404,226号
の一部継続出願である。
本発明は国立保健研究所（National Institutes of
Health）の支援を受けて実施されたものである。合衆
国政府は本発明に一定の権利を有する。
発明の分野 本発明は上皮成長因子受容体（EGFR）の突然変異に関
係する腫瘍及び癌腫に関する。
技術の背景 ヒト及び動物の癌のより良好な診断と治療を助けるた
めの腫瘍特異的分子は前世紀から研究されている。分子
構造データに基づいて腫瘍特異的物質を確実に実証する
ことは、ウイルス誘導癌に基づく癌及びウイルスゲノム
によって指定される分子構造を含む癌以外の多くの種類
のヒト癌では困難であった。新規な分子構造に基づ腫瘍
特異的分子の例は極めて少なかった。例えば胸部癌腫、
その他のヒト癌腫のような、上皮成長因子受容体の増幅
及び変化に関係すると思われる悪性ヒト神経膠腫、その
他の腫瘍の場合には、特有の塩基配列を有する分子の構
造変化は今までに明確には実証されていない。
上皮成長因子受容体（EGFR）はプロトー癌遺伝子ｃ−
erbBの170キロダルトン膜糖蛋白質産物である。EGFR遺
伝子の塩基配列は公知である［ウルリッヒ（Ullrich）
等、1984］。EGFR遺伝子は鳥類の赤芽球症ウイルスで最
初に確認されたerbB癌遺伝子の細胞相同体（cellularho
molog）である［ダウンワード（Downward）等、1984;ウ
ルリッヒ等、1984］。遺伝子増幅は多様なヒト腫瘍にお
いて［ハーレイ（Haley）等、1987a］、特にグリア起源
のヒト腫瘍において［リバーマン（Libermann）等、198
5;ウオング（Wong）等、1987;ヤマザキ（Yamazaki）
等、1988;マルデン（Malden）等、1988］観察されてい
る。
ｖ−erbB癌遺伝子と正常なEGFR遺伝子との間の一つの
主要な差異はウイルス癌遺伝子が正常受容体のアミノ先
端切断形（amino−truncated version）である；これ
らは細胞質外ドメインの大部分を失っているが、トラン
スメンブランとチロシンキナーゼ ドメインとを保有す
る［フング（Fung）等、1984;ヤマモト（Yamamoto）
等、1983;ニルセン（Nilsen）等、1985;ガメット（Gamm
ett）等、1986］。これは上皮成長因子（EGF）と結合で
きないが、他の基質をまだリン酸化することができ［ギ
ルモア（Gilmore）等、1985;クリス（Kris）等、198
5］、キナーゼドメインが調節されていず、構造的に活
性であるので、ｖ−erbB蛋白質が腫瘍形成性であるとい
う推測に導いている［ダウンワード等、1984］。例え
ば、アミノ酸置換及び遺伝子のカルボキシ末端における
欠失のような、多様な遺伝子変化がウイルスerbB癌遺伝
子において生じうる。しかし、入手可能な証拠は、アミ
ノ先端切断（amino truncatino）が発癌に重要である
ことを示している。アミノ先端切断は、プロモーター挿
入又はレトロウイルス形質導入によって生ずるものを含
めて、全てのｖ−erbB癌遺伝子の特徴である［ニルセン
等、1985;ガメット等、1986］。
これに反して、カルボキシ末端欠失はレトロウイルス
形質導入を介して生ずる腫瘍にのみ関係すると思われ、
宿主域と腫瘍型特異性とを決定するように見える（ガメ
ット等、1986;ライネス等、1985）。アミノ先端切断鳥
類ｃ−erbB遺伝子又はキメラウイルス癌遺伝子−ヒトEG
F受容体を用いたトランスフェクション実験は、この欠
失が形質転換蛋白質を形成するために単独で充分である
ことを実証する［ペレイ（Pelley）等、1988;ウエルス
（Wells）等、1988］。
EGFR遺伝子の増幅は悪性ヒト神経膠腫の40％において
生ずる（リバーマン等、1985;ウオング等、1987）。遺
伝子増幅を有する腫瘍の多くでは受容体遺伝子の転位が
見られる。これらの構造変化は遺伝子の半体のアミノ末
端に選択的に影響を与えるように見えるが（ヤマザキ
等、1988;マルデン等、1988］、転位の性質はいずれの
腫瘍においても正確に特徴づけられていない。
幾つかのヒト癌におけるサイズ変異EGFR遺伝子と増幅
が報告されている［ハンフレイ（Humphrey）等、1988;
ビグナー（Bigner）等、1988;ウオング等、1987;ハンフ
レイ等、1989］。しかし、細胞中の変化EGFR分子の分子
規模の測定はなされていない。これらの腫瘍の原因とな
る遺伝子変化の測定はヒト癌腫の治療と診断における今
後の重要な段階であると考えられる。
神経膠腫EGFRに特有の遺伝子とペプチド塩基配列を得
ることが望ましい。突然変異EGFRに対して特異性を示す
モノクローナル及びポリクローナル抗体がそれに対して
生成される合成ペプチドを得ることも望ましい。
発明の概要 突然変異EGFR蛋白質に相当する、イントロンを含まな
いDNA分子及びペプチドを提供することが、本発明の目
的である。
正常なヒトEGFR又は他の組織に対して交差反応を殆ど
又は全く示さない、突然変異EGFR分子に特異的な抗体を
提供することが、本発明のもう一つの目的である。
神経膠腫を検出するための診断方法を提供すること
が、本発明の他の目的である。
神経膠腫の治療方法を提供することが本発明の他の目
的である。
上記その他の目的によると、本発明の１態様はEGFR突
然変異型Ｉ、II又はIIIペプチドをコードする、イント
ロンを含まないDNA分子を包含する。
もう一つの態様では、本発明は実質的に純粋なEGFR突
然変異型Ｉ、II又はIIIペプチドを包含する。本発明は
また、EGFR突然変異殆と特異的に反応するが、正常な無
傷のEGFRと交差反応しない抗体をも包含する。本発明の
さらに他の態様は突然変異EGFR蛋白質又はこれをコード
する遺伝子の存在を測定することによる神経膠腫の診断
に関する。
さらにもう一つの態様では、本発明はEGFR突然変異型
I,II又はIIIペプチドに対して特異的である抗体を用い
た神経膠腫の治療を包含する。
本発明は変化EGFR遺伝子に関係した腫瘍の診断と治療
における今後の重要な段階を提供する。これらの腫瘍は
増幅EGFR遺伝子の存在を今まで特徴としていた。本発明
の発見はこれらの増幅遺伝子における特異的欠失／転位
の存在に基づくものである。これらの変化遺伝子は特異
的抗体によって確認されうる突然変異EGFR蛋白質を産生
する。抗体に付着した種々な物質はこれらの欠失／転位
塩基配列を含む腫瘍の高度に特異的な診断及び治療を可
能にする。
図面の簡単な説明 図１は突然変異型Ｉ EGFRペプチドとその核酸塩基配
列の実例である。
図２は突然変異型II EGFRペプチドとその核酸塩基配
列の実例である。
図３は突然変異型III EGFRペプチドとその核酸塩基
配列の実例である。
図4A−ＣはヒトEGFR遺伝子のEcoR Iマップ；突然変異
EGFR型Ｉ〜III遺伝子の構造；及びサザンブロット ハ
イブリッド形成結果を示す。
図5A−ＥはIII型突然変異EGFR遺伝子の転位フラグメ
ントの特性を表す。
図6A−ＣはIII型突然変異EGFR転写体の特性を表す。
図7A−ＣはRNアーゼ保護による転写体分析を示す。
図8A−Ｃは突然変異型Ｉ〜IIIからの遺伝子産物の分
析結果を示す。
図９と10はII型突然変異EGFRペプチドに対して生じた
ポリクローナル抗体を示す。図９はELISAアッセイにお
ける融合ペプチドに対する３匹のウサギからの抗血清の
反応性を示す。遊離ペプチドはポリ塩化ビニルプレート
に結合した。図10左は突然変異EGFR蛋白質の免疫沈降を
示すが、抗ペプチド２抗体による無傷EGFRは示さない。
右では、A431−Ｘ、Ｄ−256MG−Ｘ及びＤ−270MG−Ｘか
らのEGFRのモノクローナル抗体528による免疫沈降を示
す。
図11は正常EGFRのcDNA塩基配列である。
発明の詳細な説明 本発明の予想外の発見の一つは異なる患者に生じた腫
瘍中に同じ欠失（遺伝子産物レベルにおいて）が観察さ
れたことである。神経膠腫の異種移植に関する以前の研
究は増幅EGFR遺伝子から表現される蛋白質が細胞表面に
存在することを示していた（ハムフレイ等、1988）。正
常細胞に存在しない、幾つかの欠失結合にアミノ酸が存
在することは、本発明の研究結果である。従って、腫瘍
特異的抗体が発生しうる、これらの腫瘍中には表面分子
が存在する。このような腫瘍−特異的抗体をこれらの広
まった神経膠腫に診断と治療に用いることができる。
［例えば、リンパ性白血病の治療への抗体の使用に関す
るジョンソン（Jonson）等（1989）を参照のこと］。
突然変異EGFR蛋白質は構造変化受容体を生ずる３種類
の欠失及び／又は転位の中の１種類以上を有する細胞中
に存在する。これらの３種類の変化受容体を生ずる突然
変異を図１〜３に説明する。この種類の欠失（Ｉ型、図
１）はトランスメンブラン ドメイン近くの細胞質外ド
メイン中に間隙を生ずる。第２型の欠失（II型、図２）
はEGFRの細胞質外ドメインの遠位部分の脱離を生ずる。
Ｉ型とII型のインーフレーム欠失（in−frame delecti
on）はアミノ酸塩基配列中に２個の新しい結合点を生ず
る。第３型の異常（III型、図３）は実質的にトランス
メンブラン部分と細胞質内ドメインとのみを残した、EG
FRの外部ドメインの大部分の欠失を特徴とする。
III型突然変異は細胞外蛋白質を殆ど又は全く残さな
い。抗体は細胞外塩基配列を検出することができるが、
III型突然変異を有する細胞を抗体への暴露前に洗剤中
に可溶性にすることが好ましい。
正常EGFRに一致するcDNA塩基配列はウルリッヒ等によ
ってネイチャー（Nature）、309:418−425（1984）に報
告されている。（図11）欠失突然変異EGFR Ｉ、II及び
III型をコードする、イントロンを含まないDNA塩基配列
はそれぞれ図１、２及び３に与えた情報から、正常受容
体の今までに開示された塩基配列を考慮して決定され
る。特に、欠失突然変異EGFR Ｉ型をコードする遺伝子
は図１に示すように共に結合した正常塩基配列の塩基番
号1817と2067に相当するDNAセグメントを含み、塩基番
号1818〜2066に相当するセグメントは欠失する。欠失突
然変異EGFR II型をコードする遺伝子は正常塩基配列の
塩基番号１〜274と1076〜端部に相当するDNAセグメント
を含み、塩基番号276〜1075に相当するセグメントは欠
失する。欠失突然変異EGFR III型をコードする遺伝子
は塩基番号1817〜端部に相当するDNAセグメントを含
み、塩基番号１〜1816に相当するセグメントは欠失す
る。同じアミノ酸塩基配列をコードする他のDNA塩基配
列は、遺伝コードの縮重のために、組換え体生物におけ
るEGFR突然変異ペプチドの形成に用いられる。イントロ
ンを含まないDNA分子は例えば逆転写酵素と、鋳型とし
てのEGFRmRNAとを用いて得られる。或いは、ここに開示
する塩基配列に従ってDNA分子を化学的に合成すること
ができる。このような分子は、分析と処置とを容易にす
るために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて増幅
することができる。
本発明のDNA塩基配列とDNA分子は（形質転換細胞を形
成するための）形質転換又はトランスフェクションによ
って宿主細胞に導入し、多様な宿主／ベクター組合せを
用いて表現することができる。例えば、有用なベクター
は染色体、非染色体DNA塩基配列［例えば、SV40の種々
の公知の誘導体及び公知の細菌プラスミド、例えば、co
lE1、pcR1、pBR322、pMB9及びRP4を含めた、大腸菌（E.
coli）からのプラスミド］もしくは合成DNA塩基配列の
セグメント、ファージ誘導体（例えば、NM989）と線状
一重鎖DNAファージを含めたファージDNA（M13）、酵母
に有用なベクター（例えば、２μプラスミド）、真核細
胞に有用なベクター（例えば、SV−40アデノウイルス及
びレトロウイルス誘導DNA塩基配列を含むような動物細
胞に有用なベクター）及び、プラスミドとファージDNA
との組合せから誘導されるベクター（例えばファージDN
Aを用いるように改質されたプラスミド）、又はこれら
の他の誘導体を含む。
このような表現ベクターは、クローン化DNA塩基配列
の表現を制御かつ調節するためにベクター中に挿入され
た突然変異EGFR DNA塩基配列に作用的に結合しうる少
なくとも一つの表現制御塩基配列をも特徴とする。有用
な表現制御塩基配列の例は、lac系、trp系、tac系、trc
系、ラムダファージの主要オペレーター及びプロモータ
ー部位（region）、fdコート蛋白質の制御部位（contro
l region）、酵母の解糖プロモーター（例えば、３−
ホスホグリセレート キナーゼに対するプロモータ
ー）、酵母酸性ホスファターゼ（例えば、Pho5）のプロ
モーター、酵母ａ−接合因子のプロモーター、ポリオー
マ、アデノウイルス、レトロウイルスもしくはサル ウ
イルス（例えば、SV40の初期及び後期プロモーター）か
ら誘導されるプロモーター、及び原核細胞もしくは真核
細胞及びこれらのウイルス又はこれらの組合せの遺伝子
の表現を制御することが公知の他の塩基配列である。
さらに、各特異的表現ベクター内では、本発明のDNA
塩基配列の挿入のために種々な座位（site）が選択され
る。これらの座位はこれらを切断する制限エンドヌクレ
アーゼによって通常名付けられる。これらの座位は当業
者によって充分に認識される。本発明に有用な表現ベク
ターが特定DNAフラグメントの挿入のために制限エンド
ヌクレアーゼ座位を有する必要がないことは、当然理解
される。この代わりに、代替え手段によってベクターを
フラグメントに結合させることができる。宿主細胞、表
現ベクター、及び特に、特定DNAフラグメントの挿入と
表現制御塩基配列へのその作用結合とのためにその中に
選択される座位は、多様な要素、例えば特定の制限酵素
に感受性である座位数、蛋白質サイズ、宿主細胞酵素に
よる蛋白分解に対するその感受性、精製中に除去が困難
な、宿主細胞蛋白質によって表現される蛋白質の汚染と
結合；ベクターに関する開始位置と停止コドンのような
表現特徴によって表現され、DNA塩基配列の挿入座位は
これらの要素の残部によって決定され、全ての選択が特
定の場合に必ずしも等しく有効であるとは限らない。
有用な表現宿主は周知の真核宿主及び原核宿主、例え
ば大腸菌の細胞株、例えば大腸菌SG−936、大腸菌HB10
1、大腸菌W3110、大腸菌X1776、大腸菌X2282、大腸菌DH
I及び大腸菌MRC1、シュードモナス属、例えば枯草菌の
ようなバチルス属、ストレプトマイセス属、酵母、他の
真菌類、例えばCOS細胞とCHO細胞のような動物細胞、及
び組織培養中のヒト細胞と植物細胞を含みうる。
当然、全ての宿主／表現ベクター組合せが本発明のDN
A塩基配列の表現と本発明のポリペプチド産生とにおい
て等しい効率を示して機能するとは限らない。しかし、
宿主／表現ベクター組合せの特定の選択は当業者によっ
て実施可能である。例えば、この選択は多くの要素の釣
り合いに基づいて行われるべきである。これらの要素に
は宿主とベクターとの適合性、DNA塩基配列によってコ
ードされる蛋白質の宿主に対する有害性、所望の蛋白質
の回収の容易さ、DNA塩基配列とそれらに作用的に結合
した表現制御配列との表現特徴、生体安全性、コスト及
び折り畳み（folding）、形状又は所望の蛋白質の必要
な表現後変性を含む。
本発明の欠失突然変異EGFR製剤（preparation）を得
るための好ましい１製造方法は、ここに数える塩基配列
を用いて技術上公知の標準方法に従ってこれらを合成す
ることである。もう一つの手段は図１又は図２又は図３
に一致するイントロンを含まないDNA分子を含む表現ベ
クターによってトランスフェクションした細胞を技術上
周知の培養条件を用いて培養することを含む。この細胞
を次に回収し、細胞膜画分を技術上周知の標準分離方
法、例えば示差遠心分離によって分離することができ
る。細胞膜画分を洗剤によって可溶性にすることによっ
て粗抽出物が得られる。
いったん欠失突然変異EGFRを含む粗抽出物が得られた
ならば、蛋白質精製分野において周知である技法によっ
て精製を行うことができる。例えば、種々の種類のクロ
マトグラフィーを用いることができる。使用可能なカラ
ムには、DEAEセルロースカラム、又は陰イオン交換カラ
ム並びにゲル透過カラムがある。
欠失突然変異EGFR蛋白質又はそのペプチドフラグメン
トはイムノアフィニティ方法を用いても精製することが
できる。この場合に、図１、２及び３に示したエピトー
プに対して特異的である抗体が形成されるので、Ｉ、II
又はIII型の突然変異体に相当するペプチドを多くの蛋
白質の混合物から明確に選択することができる。本発明
の蛋白質の精製への本発明の抗体の使用は、本発明の蛋
白質に非常に類似しているような蛋白質からの非常に良
好な分離を可能にする。或いは、本発明のペプチドは正
常EGFRに対する抗体、特に細胞質ドメイン上のエピトー
プに対する抗体を用いてイムノアフィニティによって精
製することができる。もちろん、他の精製方法も技術上
公知であり、本発明のペプチドの合成に用いることがで
きる。
当業者は上記方法から選択して、本発明の実質的に純
粋なペプチドを製造することができる。本発明の範囲内
の実質的に純粋な突然変異EGFRペプチドは、他のヒト蛋
白質を実質的に含まないものである。本発明によるペプ
チドは、正常細胞に検出されるEGFRの完全無傷塩基配列
を含まないアミノ酸の線状ポリマーである。典型的に、
これらは長さでは10アミノ酸よりも大きく、約50アミノ
酸よりも小さい。ペプチドが特有の抗体反応を誘発する
ほど長いが、無傷のEGFR蛋白質と免疫反応性であるよう
な抗体が誘発されないように短いことが望ましい。
本発明のDNA塩基配列によって形質転換された原核宿
主と真核宿主のペプチド産物は、抗体の産生に用いるこ
とができる。
図１、２及び３のヌクレオチド配列に相当するアミノ
酸配列を含むポリペプチドの実質的に純粋な調製物は、
技術上公知のいずれかの方法を用いて製造することがで
きる。例えば、メリフィールド（Merrifield）方法［ジ
ャーナル オブ アメリカン ケミカル ソシエティ
（Journal of American Chemical Society）、85
巻、2149−2154、1968］を用いることができる。実質的
に純粋とは、調製物の75％より多くがヒト細胞中に通常
見られる他の蛋白質を含まないことを意味する。調製物
の90％より多くが他の蛋白質を含まないことが好まし
い。ポリペプチドは長くても又は短くてもよく、又は欠
失突然変異EGFR上に見られるが正常な無傷EGFRには見ら
れないエピトープを変化させない、軽度のアミノ酸変化
を有することも可能である。哺乳動物を免疫化して抗体
を産生させる方法は、技術上周知である。既知抗原に対
する抗体の免疫反応性の試験方法も周知である。
本発明の実質的に純粋な調製物を用いて、欠失突然変
異EGFR蛋白質に特異的な抗体をアフィニティ精製するこ
とができる。さらに、本発明のポリペプチド調製物を用
いて、哺乳動物をこの調製物によって免疫化することに
よって、哺乳動物における抗体産生を刺激することがで
きる。このような免疫化を任意に利用して、例えばキー
ホール リムペット（keyhole limpet）ヘモシアニン
のような、大きい免疫原物質にポリペプチドを結合させ
ることができる。抗体のアフィニティ精製のために、ポ
リペプチドを例えばアガロースビーズのような、不活性
マトリックスに結合させることができる。このような結
合方法は技術上周知である。ポリペプチド調製物を用い
て、抗体調製物中の欠失突然変異EGFRに特異的な抗体を
定量することも可能である。このような場合に、合成ペ
プチドを通常、例えばウシ血清アルブミンのような、大
きな不活性な蛋白質様物質に結合させる。この場合に
も、ポリペプチドのこのような物質への結合方法は技術
上周知である。
上述したように、欠失突然変異EGFR蛋白質と免疫反応
性であるが正常な無傷EGFRとは免疫反応性でないという
ことで、欠失突然変異EGFR蛋白質に対して特異的である
抗体は、本発明の合成ポリペプチドを用いて製造するこ
とができる。ウサギ、マウス、ヤギ等のような哺乳動物
を免疫化して抗体を産生させることは技術上周知であ
る。このようなポリクローナル抗体調製物は、本発明の
合成ポリペプチドを用いるイムノアフィニティ方法によ
って精製することができる。このような精製方法は技術
上周知である。欠失突然変異EGFRエピトープに対して特
異的であるが正常EGFRとは交差反応しないモノクローナ
ル抗体を産生させることもできる。一般に、ラット又は
マウスは本発明の合成ポリペプチド（又は欠失突然変異
蛋白質）によって免疫化される。これらの齧歯動物を後
に殺して、脾臓細胞を骨髄腫細胞との融合のために摘出
した。技術上公知の方法に従って、ハイブリッド細胞を
選択することができ、例えば、各親細胞から１種づつの
２種の表現型の相補性を含む選択を行うことができる。
各ハイブリッド細胞のクローンによって産生される抗体
を個別に検査して、欠失突然変異EGFR上のエピトープに
は結合するが、正常な無傷のEGFRとは結合しない抗体を
選択することができる。
欠失突然変異EGFR遺伝子産物上に検出されるが正常な
EGFR上には検出されないエピトープに対して免疫反応性
である抗体を選別するために、簡単な一連のテストを実
施することができる。本発明による欠失突然変異EGFR蛋
白質の実質的に純粋な調製物又は例えばウシ血清アルブ
ミンのような大きい成分（moiety）と結合した、本発明
による欠失突然変異EGFR蛋白質フラグメントを用いて、
抗体を欠失突然変異EGFR蛋白質との免疫反応性に関して
テストすることができる。目的の特異的抗体はこれらの
テストの一方又は両方において陽性であるべきである。
抗体を正常な無傷のEGFRとの免疫反応性に関してもテス
トすべきであり、欠失突然変異EGFRに対して絶対的な特
異性を有する目的抗体はこのようなテストにおいて陰性
であるべきである。
正常EGFRに比べて欠失突然変異EGFRに対して相対的特
異性を有する抗体をこの一連のテストを用いて検出する
こともできる。すなわち、正常蛋白質に対するよりも欠
失突然変異蛋白質に対してより強く反応する、幾つかの
モノクローナル抗体を検出することができる。突然変異
EGFRに対して相対的特異性を有する、これらの抗体も有
用である。これらの使用手段を以下で考察する。
欠失突然変異EGFRとは反応性であるが正常EGFRとは反
応性でない単一特異性ポリクローナル抗体を精製するイ
ムノアフィニティ方法が使用可能である。モノクローナ
ル抗体に関して上述したテストと同様に、類似の結合性
が利用される。すなわち、欠失突然変異EGFRと免疫反応
する抗体が明確に選択され、正常なEGFRと免疫反応する
抗体は所望の抗体調製物から除去される。
正常EGFRに比べて欠失突然変異EGFRに対して相対的又
は優先的特異性を示す抗体を、免疫反応性を検定する条
件を変えることによって絶対的に特異性にすることがで
きる。変更可能な分析媒質中の条件を以下に挙げるが、
これに限定される訳ではない：イオン強度；洗剤濃度；
例えば、尿素、グアニジン及びチオシアン酸カリウムの
ようなカオトロピック剤の濃度；及びpH。これらの条件
を変えると、抗体−抗原結合に寄与する種々の結合力が
不安定になる。これらの条件の各々を変える試薬の滴定
は相対的又は優先的特異的抗体が欠失突然変異EGFRと免
疫反応するが正常EGFRとは免疫反応しないような、条件
セットの決定を可能にする。不安定化剤濃度を変えるべ
き適当な範囲を容易に決定することができる。例えば、
イオン強度を変えるために、塩化カリウムが約0.05M〜2
Mと滴定されることができる。イオン性又は非イオン性
のいずれかの洗剤は約0.05％〜２％と滴定されうる。カ
オトロピック剤は0.5M〜8Mと滴定されうる。pH範囲は約
２〜10と滴定されうる。このような条件は欠失突然変異
EGFRに対して免疫反応性であるモノクローナル抗体の検
査と、種々の生物学的ソース中の欠失突然変異EGFRの分
析との両方のために有用である。
Ｉ、II及びIII型の腫瘍と相関関係にあるEGFR疾患を
診断によって知ることは、腫瘍の正確な診断と分類のた
めの遺伝子又は抗体プローブの開発を可能にする。
本発明によって提供するヌクレオチド塩基配列を用い
て、いずれかの標準方法に従って遺伝子プローブを形成
することができる。本発明に用いるために考えられるDN
Aプローブはインビトロで増殖される細胞ライン又はイ
ンビボに維持される異種移植片からのDNAから誘導さ
れ、欠失座位のDNA走査を含む。DNAプローブのサイズは
約20ヌクレオチドから数百ヌックレオチドまで変動しう
る。DNAプローブは放射標識、蛍光物質等による標識さ
れることができる。DNAプローブの製造及び標識方法は
技術上周知である。
DNAプローブを用いる診断テストは神経膠腫の存在を
検査されるべき個体からの細胞サンプルを用いる。サン
プルは疑いのある組織から単離する。DNAは当業者に周
知の標準方法を用いて、細胞から回収する。次に、DNA
を、相同な塩基配列はハイブリッド形成するが、異なる
塩基配列はハイブリッド形成しないような条件でプロー
ブと共にインキュベートした後に、ハイブリッド形成を
検出する。欠失−特異的プローブに対するハイブリッド
形成は欠失の存在を示唆する。S1ヌクレアーゼのような
酵素を用いて、ハイブリッド形成しないDNA又はRNA分子
の一部を除去することができる。残留する二重鎖核酸の
サイズは標準手段によって測定することができる。プロ
ーブより短い二重鎖は欠失、転位又は他の不適正を示唆
する。従って、有用であるプローブは無傷の対立遺伝子
並びに突然変異対立遺伝子から誘導されうる。
本発明の抗体は突然変異EGFR蛋白質に結合することが
できるが、正常細胞からの無傷EGFR蛋白質には結合でき
ない。これらの抗体はまた、同位体、結合抗体又は他の
配位子によるイメージング分析（imaging analysis）
の使用を可能にする。適当なイメージング剤の例は、EG
FRの欠失突然変異体に特異的な抗体に結合した125I、
123I、131I又はインジウムーIIIである。
本発明の抗体は神経膠腫組織の組織学的切片中並びに
他の個体腫瘍中の欠失突然変異EGFRエピトープの検出に
用いられる。免疫学的検出の前に組織サンプルを洗剤で
可溶性にして、膜蛋白質を溶液中に放出させることが好
ましい。技術上公知の検出手段、例えばラジオイムノア
ッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ、補体結
合、比濁分析、免疫拡散分析及び免疫電気泳動分析によ
って、組織切片の抽出物への抗体結合を検出することが
できる。或いは、抗体を免疫組織化学的試薬として用い
て、組織切片中のEGFR突然変異蛋白質を明視化すること
ができる。
さらに、本発明の抗体をイメージング分析のために患
者に投与することができる。このような目的には、抗体
は典型的に例えば、125I、123I、131I又はインジウムー
IIIのようなイメージング剤に結合する。診断有効量
は、観察者に正常組織と突然変異型EGFR含有組織とを識
別させるような量である。このような量の測定は当該技
術分野の熟練の範囲内である。
酵素結合抗体分析に用いるために特に有用な染色はペ
ルオキシダーゼ、過酸化水素及び、例えばアミノエチル
カルバゾールのような、発色体物質を用いる。ペルオキ
シダーゼ（多くのソースから入手可能な周知酵素）は欠
失突然変異EGFRに特異的な抗体に結合することができ
る。又は１種以上の抗体を介してそれに単に錯化するこ
とができる。例えば、ヤギ抗ペルオキシダーゼ抗体と、
欠失突然変異EGFRに特異的なヤギ抗体とは抗ヤギIgGを
介して錯化することができる。このような方法は技術上
周知である。他の発色体物質と酵素も用いることができ
る。
放射標識抗体は欠失突然変異EGFRに対して又は、欠失
突然変異EGFRに対して特異的な抗体と免疫反応性である
第２抗体に対して特異的である。このような方法も周知
である。神経膠腫患者中の突然変異EGFRを検出する的確
な方法は本発明にとって重要ではない。免疫組織化学が
本発明の好ましい方法であるが、免疫組織化学を用いな
い生化学的又は免疫学的方法も現在使用可能である。
可溶性化サンプル中の欠失突然変異EGFR蛋白質の検出
及び／又は定量の好ましい１方法は、競合分析を用い
る。欠失突然変異EGFR上に検出されるが正常EGFR上には
検出されないエピトープと免疫反応性である抗体を例え
ばポリスチレン製マイクロタイターディッシュ又はニト
ロセルロースペーパーのような固体サポートに、技術上
公知の方法によって、取り付ける。固体サポートを、抗
体−抗原錯体が形成され、安定であるような条件下で、
被分析流体の存在下においてインキュベートする。流体
の過剰な、非結合成分を除去し、抗体−抗原錯体が固体
サポート上に保留されるように、固体サポートを洗浄す
る。次に、欠失突然変異EGFR上に検出されるが正常EGFR
上には検出されないエピトープを含むポリペプチドの一
定量を固体サポートと共にインキュベートする。ポリペ
プチドは、固体サポートに付着する突然変異EGFRと免疫
反応性である抗体に結合する。ポリペプチドは、例えば
ビオチン（biotin）、ペルオキシダーゼ、又は放射標識
のような検出可能な成分に、技術上周知の手段によって
結合されている。過剰な、非結合成分を除去し、固体サ
ポートを上述のように洗浄する。固体サポートに付着し
た検出可能な成分を定量する。欠失突然変異EGFRとポリ
ペプチドは同じ抗体結合座位に対して競合するので、被
分析流体中の可溶化突然変異EGFRは固体サポートに対す
るポリペプチド結合の減少から定量することができる。
この分析に用いられる抗体は欠失突然変異EGFRに対して
免疫反応性ではあるが、正常EGFRに対しては免疫反応性
ではない。或いは、正常EGFRとの免疫反応性を不安定化
するような条件下で、相対的に特異的抗体を用いること
ができる。欠失突然変異EGFR上のエピトープとは免疫反
応性であるが正常EGFR上のエピトープとは免疫反応性で
ない抗体種を含むポリクローナル抗体をも用いることが
できる。
III型神経膠腫を確認するための好ましい診断方法は
細胞質内ドメイン及び細胞質外ドメインの鑑別検出を含
む。この検出は遺伝子又はペプチドレベルである。遺伝
子レベルでは、細胞質内ドメイン（図11の塩基番号2192
−3720）と細胞質外ドメイン（塩基番号190−2122）と
に特異的であるヌクレオチドプローブを用いる。III型
神経膠腫から抽出されたDNAは細胞質内プローブとハイ
ブリッド形成するが、細胞質外プローブとはハイブリッ
ド形成しない。同様に、疑わしい組織サンプルからの洗
剤可溶化膜蛋白質を、細胞質内ドメイン及び細胞質外ド
メイン内に検出されるエピトープに対して特異的な抗体
を用いて、免疫学的にテストすることができる。上述し
たように、これらのドメインに対応する塩基配列から表
現されるペプチドによって哺乳動物を免疫化し、当業者
に周知である方法を用いて各ドメインに特異的な抗体を
選択することによって抗体を製造することができる。II
I型神経膠腫からの膜蛋白質画分は、EGFRの細胞質内ド
メインに対する抗体と反応するが、大抵の細胞質外ドメ
インに対する抗体とは反応しない。遺伝子プローブアッ
セイとイムノアッセイとの特別な方法は当業者に周知で
ある。同様に、III型EGFR突然変異蛋白質に特異的な抗
体は無傷EGFR上に存在しないエピトープと反応する。
治療は131Iを含む放射性同位体［ブラード（Bullar
d）等（1986）とリー（Lee）等（1988）］、又はこれら
の抗体に結合した適当な薬物を用いて行われる。モノク
ローナル及びポリクローナル抗体を用いた、多くの治療
プロトコールが、本発明に有用である癌治療法の分野に
おいて開発されている。これらのプロトコールの各々は
それらのそれぞれの腫瘍抗原に対する標的作用剤（targ
etting agent）として抗体の特異性に依存する：
（１）免疫系エフェクター細胞−−−内因性［シアーズ
（Sears）,1984と1985、結腸直腸癌（colorectal carc
inoma）；ミーカー（Meeker）、1985、Ｂリンパ球悪性
度（Ｂ lymphocyte malignancy）；ショーバル（Shou
val）、1987、肝癌（liver cancer）］又は患者から単
離して、再注入；［シアーズ、1982;ドウイラード（Dou
illard）、1986、結腸直腸癌］、（２）細胞毒性薬物；
（EPO 0153 144、リシン（ricin）］又は（３）放射性
同位体［カラスキロ（Carrasquillo）、1984、131Iを転
位黒色腫に導入］。各場合に、抗体の役割は、それぞれ
の抗体に対応する抗原をその表面に有する特定腫瘍細胞
に活性剤を導入することである。
治療は神経膠腫患者に突然変異EGFRに対して特異性で
あるが、正常EGFRとは反応しない抗体の有効量を投与す
ることを含む、前記抗体は放射性元う素によって任意に
標識されているか、又は細胞毒性薬物に結合している。
米国特許第4,454,106号と第4,472,509号を参照のこと、
これらの特許は参考分権としてここに明確に関係する。
治療のための抗体の適当なレベルは標準方法とルーチン
実験程度を用いて、各患者毎に算出することができる。
下記実施例は説明のために含めるものであり、本発明
の範囲の限定を意図するものではない。
実施例 実施例において、５つのヒトグリア腫瘍中のEGFR遺伝
子産物の構造に対する転位の効果を決定した。これらの
改変の各々の標的は細胞質外領域であった。改変転位体
の３つの型が同定された。
腫瘍材料源 本研究で使用された異種移植片は悪性ヒト神経膠腫の
手術的生検試料から誘導された。それらの確立法および
核型については以前に記載がある（Humphrey et al.,
1988）。EGFR cDNAプローブでのサザンブロッティング
実験は異種移植片の５つ（D245MG,D256MG,D270MG,D298M
GおよびD317MG）は転位された、および増幅されたEGFR
遺伝子を含んでいることを示した。同一の転位した断片
が本来の腫瘍生検試料中に検出された（Humphrey et
al.,1988）。
腫瘍移植片D320MGは検出可能な転位なしの増幅された
EGFR遺伝子を示した。腫瘍移植片D263およびD274はEGFR
遺伝子の増幅または転位を示さなかった。それ故、試験
された８つの神経膠腫異種移植片の５つは転位および増
幅EGFR遺伝子を含んでおり、それらはすべて最初の腫瘍
生検試料に存在していた。
EGFR受容体遺伝子のクローニングはヒトグリア腫瘍中の
内部欠失を示している 改変EGF受容体遺伝子の構造の分析のため遺伝子の地
図が作製された。ヒトグリア腫瘍異種移植片はサザンブ
ロットハイブリダイゼーション上、EGFR遺伝子の約10倍
の増幅を示すが検出可能な転位はなかった。ライブラリ
ーは5.5kb EGF受容体cDNAクローンからの断片（Ullric
h et al.,1984）でスクリーニングされた。
48のファージクローンが得られ、EGF受容体遺伝子のE
coR I地図の組立てに使用された（図4A）。クローンは
全遺伝子にまたがったが、ただし２つの少さなギャップ
があった。サザンブロットハイブリダイゼーション（種
々の酵素で消化したゲノムDNAを用いて）はクローンが
遺伝子内のすべてのEcoR I断片を同定していることを確
認した（ギャップを含んでいるものを含めて）。これら
の腫瘍由来ファージクローンを使用して演繹された地図
は正常ゲノムDNAと比較して転位されていなかった。
EGF受容体遺伝子の地図はHeley et al.により発表
されている（Haley et al.,1987b）。我々の地図はHa
ley et al.と一致しているがいくつかの断片の大きさ
が理由は不明であるが異なっている。さらに、我々の地
図には以前には含まれていなかった数個の小さなEcoR I
断片を含んでいる。細胞質外および膜透過領域は各々EG
FR遺伝子の塩基番号186−2121および塩基番号2122−219
1に位置している（図11）。
遺伝子の細胞質外領域に対応するクローンはEcoR I消
化腫瘍DNAのサザンブロットのハイブリダイゼーション
プローブとして使用された（図,4C）。各々のゲノムク
ローンは、EGFR cDNAプローブ（Humphrey et al.,19
88）を用いて転位が前に示されている５つの腫瘍の少く
とも１つに欠失および／または転位を示した。
ゲノムファージクローンをプローブとしたサザンブロ
ットから得られた情報に基づくと、各々の腫瘍のEGFR遺
伝子内の欠失の大体の範囲が演繹された（図4B）。これ
らの転位のどれもゲノムレベルでは同じではないが、D2
56MGおよびD298MG中の欠失は中心座位の近くであった。
そのゲノムがこの中心欠失を運んでいる腫瘍はタイプＩ
と称される。D270MGおよびD317MG中の欠失は遺伝子の
５′末端の座位の近辺を中心としていた。そのゲノムが
この末端欠失を運んでいる腫瘍はタイプIIと称される。
D245中の欠失は遺伝子の細胞質外部分の大部分を含んで
いるようである。そのゲノムがこの欠失を運んでいる腫
瘍はタイプIIIと称される。
EGFR突然変異体型分析の要約 ファージクローン40および24はタイプII腫瘍D270（図
4C,レーンＣ）およびD317（データは示されていない）
においては欠失および転位を示したがタイプＩ腫瘍D256
MGまたはD298MGにおいては示さなかった。逆に、クロー
ン26（図4C）および29（データは示されていない）は腫
瘍D256MG（図4C,レーンＢ）およびD298MG（レーンＥ）
において転位を示したが腫瘍D270またはD317では示さな
かった。腫瘍DNAをいくつかの他の酵素で消化した場合
も新しいバンドが観察されたので、異常に移動した断片
は制限酵素断片長多型（RFLP）の結果ではなさそうであ
った。
ファージクローン26のEcoR I副断片を用いると、タイ
プＩ腫瘍D256中の2.5kb断片（図4C,ファージクローン2
6,レーンＢ）は8.0kbおよび1.8kb断片に影響する転位に
よるものであることが示された。腫瘍D256中に正常サイ
ズの8.0kb断片がまだコピー数を増して存在していた事
は、染色体７の数個のコピーの存在によるものであろう
し、それはこの異種移植片からのメタフェーズ拡散にお
いて細胞遺伝学的に検出された（Bigneret al.,198
6）。染色体７のそのような数的増加はグリア腫瘍にお
いては一般的である。別の説明としては、D256中のいく
つかの増幅ユニットが正常8.0kb断片を含むいくつかの
ユニットおよび転位2.5kb断片を含む他のユニットに対
し異種性であるからであろう。
ファージクローンERG−9,40および24はタイプIII腫瘍
D245MGにおいて増幅を示さない（図4C,レーンＡ）。し
かしながら、正常DNA中に存在する７つのEcoR I断片に
ハイブリダイズするファージERG265プローブはこの腫瘍
中にただ２つだけの増幅された断片を示しただけであっ
た：正常サイズ8.0kb断片および異常に移動する1.7kb断
片。これらの結果はEGF受容体遺伝子の５′部分はD245M
Gにおいては欠失していたことを示唆している。
タイプIII転位の詳細な分析 腫瘍D245MG中のこの欠失／転位の性質をより理解する
ために腫瘍異種移植片からの仮定された転位を含む1.7k
b EcoR I断片（図4C,ファージクローン26,レーンＡ）
をクローン化し、続いて転位を起こす配列を単離するた
めにこのクローンを使用した。組換えの部位にまたがる
３つのファージクローンが図5Aに示されている。“FGF
R"と名前が付けられている配列は正常EGF受容体遺伝子
（Ullrich et al.,1984）に由来し、“D245"配列はD2
45MGの増幅単位に由来し、および“TEG"配列は正常座位
（先端を切ったEGF受容体に対しTEGとして示されてい
る）から誘導され、それはD245MG中の転位を起こすため
のEGFR遺伝子と組換えされている。交差ハイブリダイゼ
ーションおよび制限地図作製の結果はD245MGDNAからの
1.7kb EcoR I制限断片は、EGFR座からの1.8EcoR I断片
およびTEG座からの2.2kb EcoR I断片間の転位の生成物
であったことを示した。
３つの断片がプラスミドベクター内へサブクローン化
され、部分的に配列決定された。ヌクレオチド配列は図
5Bに与えられており、図5Cに図式化されている。この配
列のいくつかの特色が注目される：（ｉ）EGT受容体エ
クソンの上流のイントロン内に転位が起こっており、EG
FR cDNA配列のヌクレオチド1818から1908に対応してい
る；（ii）転位した断片中の切断点の付近に18ヌクレオ
チドのＡ−Ｔリッチモチーフが４回繰返されているが、
TEG断片の対応する部分ではただ１回だけであった；（i
ii）組換えの部位に７つの付加的ヌクレオチドが存在し
ていたがそれらはTEGまたはEGF受容体座に由来するもの
ではないようであった；および（iv）TEGおよびEGF受容
体由来断片の両方にAlu−型繰返しが存在したが、転位
を含むクローン中ではそのような繰返しは１つしか存在
していない。
TEG座の正常染色***置を決定するために、ヒト−マ
ウス体細胞ハイブリッドをTEG特異的プローブでスクリ
ーニングした。EGF受容体遺伝子同様にTEGが染色体７上
に位置していたことが示された。染色体７に種々の欠失
を含むハイブリッド（Bartels et al.,1986;Zergerli
ng et al.,1987）へのさらなるハイブリダイゼーショ
ンはTEGおよびEGF受容体の両方が7p12−7p14の同じ下部
染色体領域中に存在していたことを示した（図5D）。そ
れ故D245の転位は染色体内であった。切断点付近のAlu
配列の並置（図5C）はD245組換えのモデルがLDL受容体
に提案されたもの（Lehrman et al.,1985）に似てい
ることを示唆しており、Alu−型反復から成るヘアピン
ステムループ構造が鎖内組換えを仲介している（図5
E）。Ａ−Ｔリッチ反復の重要性は明らかではないが、
遺伝子増幅のマウスモデルにおける組換えのホットスポ
ットはＡ−Ｔリッチ領域およびAlu−型反復に関連して
発生している（Hyrien et al.,1987）。
D245MGで産生される蛋白質はｖ−erbBに類似している 遺伝子産物に対する先端切りとりの影響を決定するた
めに、D245MGの異種移植片からのポリＡ＋選択RNAを用
いるノーザンブロット分析を最初に実施した。EGF受容
体cDNAの３′側半分から誘導された配列をプローブとし
て用いると、正常胎盤は期待された10.0および5.5kb転
写体を示したが、腫瘍D245からのRNAでは9.0および4.8k
bの異常に移動したバンドが得られた（図6A）。EGF受容
体cDNAの５′側半分からのプローブでブロットをハイブ
リダイズさせた場合、胎盤においては同じ10.0および5.
5kbバンドが検出されたがD245MGからのRNAでは転写体は
観察されなかった（図6B）。このとはこの遺伝子の５′
末端に欠失が起こったことを示唆していたサザンブロッ
トおよびゲノムクローニングデータと一致していた。
D245細胞からの異常な転写体の性質を決定するため、
D245異種移植片からのポリＡ＋選択RNAを用いてcDNAラ
イブラリーを構築した。EGF受容体遺伝子のためのプロ
ーブで選択された17の異なったcDNAクローンの制限エン
ドヌクレアーゼ地図作製および部分配列分析を組合わせ
ると、それらは発表されているEGF受容体mRNAの配列と
ヌクレオチド885からコード領域の３′末端までは同一
であった（図6C）。D245 cDNAクローンの５′からヌク
レオチド885までの配列はEGF受容体cDNAと相同ではな
く、明らかに上流座位に由来するものであった。DNAデ
ータベース（Gen Bank,リリース 52.0）で検索すると
既知の配列にこの配列と有意な相同性を示すものではな
かった。ヌクレオチド885の上流の転写解読枠（ORF）分
析は３つの読み枠中の多数の停止コドンを示した。一つ
の長い転写解読枠はD245cDNAヌクレオチド955（図6C）
で始まっておりEGF受容体の天然の読み枠内へ続いてい
た。このORF内の最初のメチオニンコドン（GCCATGＡ）
を取り囲むヌクレオチドは規範内な開始配列とよく一致
していた（Kozak et al.,1987）。それ故、このRNAの
翻訳生成物がEGF受容体蛋白質のアミノ酸543に対応する
Ｎ−末端を持っており、長い５′非翻訳配列が転写解読
枠に先立っていることはありそうである。このmRNAの予
言される蛋白質生成物は644アミノ酸を含む正常受容体
の先端が切れたものであろうし、予言される分子量は72
kdであり、3N−結合グリコシル化部位が保持されたもの
である（Ullrich et al.,1984）。D245EGF受容体遺伝
子からの予言アミノ酸配列とｖ−erbB癌遺伝子（Fung
et al.,1984;Yamamoto et al.,1983;Nilsen et a
l.,1985;Gammett et al.,1986）を比較すると、腫瘍
の蛋白質生成物は前に記載した数種のトリレトロウイル
ス遺伝子産物に非常に類似している（および実際８アミ
ノ酸長いだけ）。
タイプＩおよびタイプII転写体の詳細な分析 EGFR転位を持つ４つの他の腫瘍からの転写体を分析す
るために最初にRNase保護を使用した。mRNA中の欠失を
検出できる他に、この技術は点突然変異の重要な分画を
示すことができる（Winter et al.,1985）。これらの
腫瘍からの全RNAを分析するのに使用されたプローブは
図7Aに示されている。プローブＩはcDNAの５′末端から
の910塩基対断片を含んでいた。それにより試験された
すべてのRNA試料から910bpの断片が得られた（図7C）；
転位を持つ腫瘍からのRNA試料中、正常のサイズの断片
は多分残りの正常EGFR遺伝子からの転写の結果であろ
う。以前の細胞遺伝子学的実験において、染色体７の少
くとも２つのコピーがこれらの４つの腫瘍の各々に残っ
ていることを我々は示している（Bigner et al.,198
6）。腫瘍D270（図7C,プローブ1,レーンＣ）およびD317
（レーンＦ）において検出された最も強い断片は約230b
pであった；これらの新規断片は、特にサイズの違いを
考えに入れた場合、正常サイズ910bp断片よりかなり高
い水準で発現されているように思われた。
プローブIIは腫瘍D270およびD317の210−215塩基対断
片並びに正常転位体に対応するより強度の弱い914塩基
対断片を表わした（図4C,プローブII,レーンＣおよび
Ｆ）。近くに移動する断片の一群は（単一バンドという
より）デュープレックスの不完全な切断によるものらし
い；類似のRNAプローブがクローン化ゲノム分画にハイ
ブリダイズされたRNase保護実験もまた一群の断片を産
生した。プローブＩおよびIIで得られたデータは、腫瘍
D270およびD317の欠失は転写体の５′末端近くの約800
塩基対欠失を生じるという仮説と一致した。ゲノム欠失
は同一ではないが（図４）、２つの腫瘍は類似のエクソ
ン配列を失っているようである。
プローブIIIはD270およびD317において正常970塩基対
を示したが（図7C,プローブIII,レーンＣおよびＦ）、4
50および250bp断片はD256およびD298（レーンＢおよび
Ｅ）で観察され、これら後者の２つの腫瘍の転写体内で
の約270塩基対欠失を示唆している。腫瘍D245はまた異
常RNase保護パターンを持っていた（図7C,プローブIII,
レーンＡ）;D245の495bp断片はcDNAクローンから決定さ
れた転写体中の切断点に対応していた。受容体の３′側
半分（チロシンキナーゼ領域および自己リン酸化部位を
含んでいる）に特異的なプローブは５つの腫瘍のどれに
対しても異常を示さず、この方法により検出可能な点突
然変異がなかったことを示している。
転位により読み枠内欠失が生じる RNase保護およびゲノムサザンブロットデータは欠失
の大まかな性質を提供するが、異常の正確な性質を決定
するのは困難であった。この目的のためのポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）が使用され、突然変異対立遺伝子からc
DNA断片を発生させた。RNase保護実験からのデータおよ
び正常EGFR cDNA配列についての公表されている情報を
プライマー選択の規準として使用した。cDNAは最初に
３′プライマーを全腫瘍RNAへアニーリングして発生さ
せ、次にMMLV逆転写酵素を用いて伸長させた。続いてKa
wasaki et al.（Kawasaki et al.,1988）により記
載されている方法と類似の方法を使用してPCRを実施し
た。腫瘍D270およびD317からのRNAが一組のプライマー
で分析された場合（図8A）、230塩基対の主断片が産生
された（図8A,レーンＡおよびＢ）、一方正常サイズ110
0塩基対断片はほんのわずかにしか見えず（示されてい
ない）、欠失のサイズはRNase保護実験により推論され
たものと一致した。別のグリア腫瘍異種移植片、D397は
EGFR cDNAをプローブとして用いる場合D270のサザンブ
ロットパターンと非常に似ていた。それはこのPCR実験
で分析され、D270およびD317からの断片と類似の断片を
産生した（図8A,レーンＣ）。第２の組のプライマーはD
320RNAで観察された正常サイズ440塩基対（レーンＦ）
の代わりに腫瘍D256およびD298において220塩基対の断
片（図8A,各々レーンＤおよびＥ）を表わした;220bp断
片サイズはRNase保護実験からのデータと一致した。
４つの腫瘍のPCR産物はサブクローン化され配列決定
された。腫瘍D270,D317およびD397からの配列はすべて
同一であり（図8B）、腫瘍D256から誘導された配列はD2
98からのものと同一であった（図8C）。すべての場合に
おいて欠失は読み枠を改変させず、欠失部位にグリシン
コドンを再構築した。
考察 ヒトグリア腫瘍中のEGFR受容体の転位は分子の細胞質
外領域の特異的欠失をしばしば生じることを示してき
た。この領域からコード化情報は失われたが、一方受容
体の読み枠はすべての例において正確に保存されてい
た。我々の結果はグリア腫瘍に対してサザンブロット検
定を用いて他の研究者によりなされた観測を確認し拡張
している。Libermann et al.（Libermannet et a
l.,1985）はDNA増幅を示す２つのグリア腫瘍は細胞質外
領域からのcDNAプローブで検出された明らかな転位を持
っていることに注目した。同様に、Yamazakiおよび共同
研究者（Yamazaki et al.,1988）およびMalden et
al.,（Malden et al.,1988）は２つのグリア腫瘍中に
転位を検出し、これらが異常に小さなサイズの蛋白質生
成物を産生することを観察した。最近、グリア腫瘍細胞
株から190kd蛋白質が単離されたが、それは全体の遺伝
学的転位の結果ではなさそうであり、ペプチド地図作製
は付加的な物質は細胞質外領域中への付加によるもので
あることを示唆していた（Stech et al.,1988）。
以前の発表において、我々はこれらの異種移植片中で
産生される蛋白質のサイズおよびEGF結合親和性に対す
るそれらの影響を試験した（Humphrey et al.,198
8）。ここに示されている配列データから予想されるで
あろうごとく、D245から単離された蛋白質はEGFに結合
することはできないが、自己リン酸化できる。受容体の
細胞質内領域に対する抗体で検出された主ポリペプチド
は77キロダルトンであり、脱グリコシル化されるとcDNA
配列から予言される72キロダルトンに一致する。腫瘍27
0および317MGから免疫沈降された蛋白質は150キロダル
トン（120,000の予言ポリペプチドサイズ）であって、D
298およびD256からのものは130キロダルトン（100,000
の予言ポリペプチドサイズ）であった。正常EGFR蛋白質
の予言分子量およびSDSゲル上のその移動度の間に類似
の相違であるごとく、cDNA配列から予言されたサイズか
らの相違はグリコシル化の程度を反映しているであろ
う。これらの腫瘍中のEGFに対する結合親和性は正常EGF
R遺伝子配列を持つ対照細胞株のそれよりも３倍未満の
低さであった。それ故、欠失はEGF結合に実質的に影響
しないようであるが、ただこれらの腫瘍中にまだ存在し
ている正常受容体がこの結論を込み入ったものにしてい
る。EGF結合に関与すると考えられている領域（Lax et
al.,1988）はD245MGを除いてどんな腫瘍にも検出され
ていない。
いくつかの事実は、ここで注目された改変がグリア腫
瘍の発達に重要な役割を果たしていることを示唆してい
る。第１に、ヒトにおいては遺伝子増幅は腫瘍細胞にお
いてのみ現われ（Alitalo et al.,1984）、およびＢ
およびＴリンパ球を除いて遺伝学的転位は疾病にのみ関
連してきた。第２に、グリア腫瘍におけるEGFR遺伝子増
幅はクローン様出来事である（すなわち、増幅された遺
伝子は腫瘍のほとんどすべての細胞中に存在しているよ
うである）（Wong et al.,1987）。第３に、ｖ−erbB
でのアミノ末端の切断はそれらの効果に対し決定的であ
ることが知られている；ここで研究された腫瘍のすべて
において、改変はアミノ末端領域に限られていた。１つ
の腫瘍において、ｖ−erbB癌遺伝子で観察された切断と
非常に類似した切断が欠失により生じている。
EGFが正常受容体に結合した場合、自己リン酸化およ
びキナーゼ領域の活性化が１分以内に起こり、エンドサ
イト−シスを通しての受容体ダウンレギュレーションお
よびリガンド受容体複合体の分解が１時間以内に完了す
る（Carpenter et al.,1987）。先端の切断によりキ
ナーゼ活性が本質的に活性であり制御されない蛋白質が
生じるのでｖ−erbB癌遺伝子の産物は癌性であると考え
られる（Downward et al.,1984）。D245MGに起こって
いる構造改変は受容体キナーゼの同様の活性化が生じる
であろうし、天然リガンドなしでも機能させるようにな
る。最近、EGF結合領域を欠く蛋白質の過剰発現がラッ
ト１細胞を形質転換させ、チロシンキナーゼを活性でき
ることが示された（Haley et al.,1989）。研究され
た他の腫瘍中の欠失は受容体の２つのシスティンリッチ
領域の１つ内で起こっていた。それ故、これらの改変は
またコンホメーションの変化を生じさせることができ、
受容体を異常に活性な非制御の状態にさせるであろう。
最後に、他の類似の腫瘍は増幅されているが他の点で
は明らかに正常な遺伝子を含んでいるのでいくつかの神
経膠腫の増幅された遺伝子中に転位がなぜ起こるかにつ
いて考えなくてはならない。１つの可能性は、グリア腫
瘍のある種のサブセットはEGF受容体の過剰発現に依存
していることであろう。この可能性を支持する証拠は、
EGF受容体の過剰発現によるNIH3T3細胞の形質転換はEGF
の存在を必要とし（Di Fiore et al.,1987;Riedel
et al.,1988;Velu et al.,1987）およびいくつかの
グリア細胞株はTGFアルファ転写体を含んでいることを
示した（Nister et al.,1988）最近のインビトロ実験
からきている。インビトロデータをインビボ状態に外挿
すると、正常受容体を高密度で含む腫瘍は腫瘍を囲みお
よび含む範囲に存在するEGFまたはTGF−アルファの限ら
れた量で活性化されるであろう。
腫瘍の第２のサブセットは常に活性であり、リガンド
により部分的にのみまたは少しも制御されない分子を生
じる構造の改変受容体を持っているであろう。正常信号
制御細胞増殖からのそのような独立が腫瘍化の本質であ
る。腫瘍タイプI,IIおよびIIIは第２のサブセットであ
ると思われる。
方法： DNAハイブリダイゼーション DNAはプロティナーゼＫ−SDSを用いて精製され、フェ
ノールおよびクロロホルムで抽出された（Vogelstein
et al.,1987）。DNA（４μｇ）を製造元により特定さ
れている緩衝液および条件を用いてEcoR I（BRL）で消
化し、１％アガロースゲルを通して電気泳動後、0.4N
NaOHを用いてナイロンメンブラン（Bio−Rad）へ移す
（Reed et al.,1985）。プリーハイブリダイゼーショ
ンおよびハイブリダイゼーションは前に記載したごとく
（Vogelstein いる al.,1987）行われた。プローブは
オリゴラベル化法を用いてｄ−32PdCTPで標識された（F
einbergおよびVogelstein,1984）。反復された配列はSe
aley et al.の前会合法により除去された（Sealey e
t al.,1985）。
ライブラリー構築 ゲノムライブラリーは以前に記載されているごとくし
て（Ruppert et al.,1988）、D320MGから構築され
た。部分Mbo I消化後、ショ糖密度勾配超遠心分離によ
りDNAをサイズで分画した。17から24キロベース断片を
含む分画をMbo I末端を部分的に満たした後ラムダフィ
ックス（Stratagene）のBamH I部位内へクローン化し
た。結合生成物はラムダファージ抽出物（Stratagene）
とパッケージングし、大腸菌C600細胞の感染に使用し
た。得られるプラークからのDNAをコロニー プラーク
スクリーン膜（Dupont,NEN Research Products）で
取り、EGF受容体cDNAプローブスクリーンした（Ullrich
et al.,1984;Merlino et al.,1985）。
1.7kb転位断片のクローン化のため、D245DNAをEcoR I
で消化し、１％アガロースゲル上の電気泳動によりサイ
ズで選択された。DNAをゲルから溶出し（Vogelstein e
t al.,1987）、gt10arms（Promega）に結合し、ラムダ
ファージ抽出物とパッケージングし、C600細胞の感染に
使用した。ライブラリーをEGFR cDNAプローブでスクリ
ーンし、1.7kb転位断片を含むクローンが同定された。T
EG座位のクローン化のため、D245MG DNAから全ゲノム
ライブラリーが最初に作製され、1.7kb転位EcoR I断片
でスクリーンされ、TEGおよびEGF受容体座間の転位を橋
かけしている1.5kbファージクローンを得る。このファ
ージクローンからの4.4kb断片が正常TEG座をクローンす
るためにD259（EGFR増幅または転位がないグリア腫瘍細
胞株）から作製されたゲノムライブラリーのスクリーン
に使用された。組換えに関与しているD245、EGFRおよび
TEGからの断片をpBluescript（Stratagene）内へサブク
ローン化した。配列決定のため、エキソヌクレアーゼII
Iおよびヤエナリヌクレアーゼを用いて存巣欠失を発生
させた（Henikof et al.,1984）。プラスミドはHB101
細胞（F+iiTu5）およびR408ヘルパーファージを用いて
調製された一本鎖DNA内へ形質転換された（Russel et
al.,1986）。ジ−デオキシ法による配列決定はT7ポリ
メラーゼの改良形（USB）を用いて実施された。
ノーザンブロッティングおよびcDNAライブラリーの構築 ノーザン分析のため、10μｇ全RNAからオリゴーdTセ
ルロース上の選択、1.5％MOPS/ホルムアルデヒドゲルを
通した電気泳動による分離および希アルカリ中ナイロン
（Bio−Rad）への運搬によりポリ（Ａ）＋RNAが単離さ
れた。cDNAライブラリーの構築のため、最初の鎖cDNAが
MMLV逆転写酵素（BRL）およびランダムヘキサマープラ
イマー（Pharmacia）を用いて調製された。第２の鎖はG
ublerおよびHoffmanの方法を用いて合成された（Gubler
et al.,1983）。得られたcDNAはEcoR Iメチラーゼで
メチル化され、EcoR Iリンカー（New England Biolab
s）に結合された。結合されたcDNAはEcoR Iで切断さ
れ、１％アガロースゲルを通す電気泳動の後＞1.0kb断
片が単離された。このcDNAはZAP（Stratagene）内へ結
合され、ファージ抽出物（Stratagene）とパッケージン
グされた。ライブリーはD245の1.7kb EcoR IのEGFR末
端（図5A参照）から誘導された0.7kb Taq I−EcoR I断
片でスクリーンされた。挿入物を含んでいるプラスミド
は製造元により推せんされている切り出し法を用いてフ
ァージプラークから誘導された。
リボヌクレアーゼ保護 全RNAはChomcynskiおよびSacchiにより記載されてい
る酸−グアニジウム抽出法により単離された（Chromczy
nski et al.,1987）。32P−標識RNA転写体はインビト
ロでT3またはT7RNAポリメラーゼを用いてEGFR cDNAの
サブクローンから発生させた。使用されたプローブは：
プローブＩ pE15の910bpSma I−Cla I断片（Merlino
et al.,1985）；プローブII pE7からの730bp EcoR I
−BamH I断片（Xu et al.,1984）；プローブIII pE7
からの970bp BamH I−EcoR I断片。リボヌクレアーゼ
保護は以下の変更を加えた記載されている方法（Winter
et al.,1985）で実施された：ハイブリダイゼーショ
ンは10μｌの最終容量で実施された;ml当り12.5μｇだ
けのRNaseAが使用された；およびRNaseAおよびプロティ
ナーゼＫ消化は室温で30分間実施された。
cDNA生成物のPCR増幅 第１の鎖cDNAを発生させるため、400μＭの各々のデ
オキシヌクレオチド、逆転写酵素緩衝液（BRL）、1Uの
胎盤RNase阻害剤（Promega）の存在下25μｌの総容量で
1/2時間以上かけて60℃から37℃に冷却することにより5
0pmolの３′プライマーを１μｇの全RNAへアニール化し
た。これに続いて20UのMMLV逆転写酵素（BRL）を添加し
37℃にて10分間インキュベーションを行った。試料を50
μｌに希釈し、最終MgCl2濃度を2.5mMに調整し、50pmol
の５′プライマーおよび2.5UのTaqポリメラーゼ（Cetn
s）を添加することによりPCRを実施した。熱サイクリン
グは93℃で１分間、40゜で２分間および72゜で２分間で
35サイクル行った。試料は次いで２％アガロースゲルで
の電気泳動にかけた。エチジウムブロミドによる染色に
続いて、バンドを切り出し、前に記載されているごとく
して（Vogelstein et al.,1987）DNAを溶出させ、配
列決定のためpBluescript（Stratagene）内へサブクロ
ーン化した。各々のPCR生成物に対し少くとも２つのク
ローンが配列決定され、いくつかの試料はWinshipの方
法（Winship et al.,1989）により直接配列決定され
た。腫瘍D270,D317およびD397に対しては、５′−AGTCG
GGCTCTGGAGGA−３′および５′−GACTGATGGAGGTGCAGT−
３′からなるプライマー組Ａが使用された。腫瘍D256お
よびD298に対しては５′−（CTG）CAGGTCTGCCATGCCTTG
−３′および５′−（GGT）ACCATCCCAGTGGCGATG−３′
からなるプライマー組Ｂが使用された。括弧に入れた配
列はEGFR配列には存在していないがPst IまたはKpn I制
限部位を完成させるために付加された。
図４−ヒト神経膠腫におけるEGF受容体遺伝子の欠失 図4AはヒトEGF受容体遺伝子のEcoR I地図である。断
片の大きさはキロ塩基で示されている。地図の組立てに
使用された代表的ファージクローンは以下に示されてい
る。
図4Bは５つの神経膠腫異種移植片の演繹されたEGFR遺
伝子構造である。左側の番号は本文中に記載されている
グリア腫瘍に対応している。直線は腫瘍中に存在する配
列を示しており、一方欠失の大体の地図がｘにより示さ
れている。
図4Cはファージクローンでハイブリダイゼーションし
たサザンブロットを表わしており、EGF受容体遺伝子中
の欠失を示している。ブロットは放射性標識ファージ挿
入物でハイブリダイズされ、各々のブロットの上の数字
はハイブリダイゼーションプローブとして使用されたフ
ァージクローンを示している。転位断片はアステリスク
（＊）で示されている。各々のオートラジオグラフの右
側の照合マークはマーカー断片のサイズをキロ塩基で示
してあり、それは一番右に与えてある。
レーンは以下のキーに従ったDNAを含んでいる： N:正常細胞からのDNA Ａ）D245 Ｂ）D256 Ｃ）D270 Ｄ）D320 Ｅ）D298 Ｆ）D370 図５−D245からの転位断片の特性付け 図5AはD245MGからの1.7kb転位断片およびEGF受容体遺
伝子からの対応する非転位断片およびTEG座を含むゲノ
ムクローンのEcoR I制限地図である。白ぬきわくはEGF
受容体遺伝子に由来する配列を示しており、影を付けた
わくはTEG座を表わしている。EcoR I断片の大きさを示
している数字はキロ塩基で表わされている。
図5Bは組換えの部位に側面を接する範囲の部分的ヌク
レオチド配列を示している。この配列に基づく他の特色
は図5Cに示されている。18ヌクレオチドＡ−Ｔリッチモ
チーフが転位D245断片中に４図反復されているが（rpt1
−rpt4）、TEG断片中ではただ１回である：整列を最適
化するため挿入がなされた。組換えの部位に（“切断
点”）７つのヌクレオチドが存在しており、それは組換
えパートナーのどちらとも配列することができない。TE
GおよびEGF受容体遺伝子中に存在するAlu反復の部分は
下線を付けてある：矢尻はDeininger et al（Deining
er et al.,1981）に従ったこれらの反復の配向を示し
ている。右側の数字はD245配列に関しての相対的ヌクレ
オチド位置である。
図5CはAlu反復（矢印）、Ａ−Ｔリッチモチーフ（AT
の名称が付けられている白ぬき枠）およびD245からの1.
7kb EcoR I転位断片中のEGF受容体からのエクソン（黒
ぬりの枠はEGFRnt1818−1908に対応する）およびEGF受
容体からの対応する非転位断片およびTEG座の存在を図
式的に示している。
図5DはTEG座の染色体局在を例示している。ヒト染色
体７の種々の欠失を含む（20−21）ヒト−マウス体細胞
ハイブリッドパネルをEcoR Iで消化しナイロン膜へブロ
ットした。最初にTEG座からの2.2kb EcoR I断片でハイ
ブリダイズされ（上）次にEGFR座からの1.9kb EcoR I
ゲノム断片でハイブリダイズされた（下）。
使用された体細胞ハイブリッドクローン（およびハイ
ブリッド内で欠失された領域）は次のものであった： レーン1:5387−3cl 10（無傷の染色体７） レーン2:It A9 ２−21−14（7p14−pter） レーン3:RuRag ６−19（7cen−pter） レーン4:2068 Rag 22−２（7q22−pter） レーン5:1059 Rag ５（7q22−q32） レーン6:7851 Rag 10−１（7q22−q32） レーン7:194 Rag ６−13−３（7q32−qter） レーン8:Rag （マウスDNAのみ） レーン9:4μｇの正常ヒトDNA 図5EはLehrman et al.（Lehrman et al.,1985）
により提案されたモデルに基づき、逆に対になったAlu
反復を含むD245中の鎖内組換えの可能な機構を説明して
いる。図5CからのTEGおよびEGF受容体断片の特色はここ
で再び再現されている。染色体7p上のEGF受容体遺伝子
およびTEG座中の逆に配向したAlu反復は塩基対でステム
ループ構造を形成できる。ステムでの組換えはD245に見
られる転位を生じるであろう。
図６−D245中の転写体の特徴付け 図6AはD245中の異常転写体サイズを示しているノーザ
ンブロットハイブリダイゼーションである。胎盤および
腫瘍D245からの2.5μｇのポリＡ＋選択RNAを1.5％ホル
ムアルデヒドゲル中で電気泳動しナイロン膜に移した。
ブロットはEGF受容体の細胞質内領域に特異的なプロー
ブでハイブリダイズされた。右および左側の数字はバン
ドの大きさをkbで示している。D245試料中の主たるバン
ドは4.8kbであり;5.5kbに不明確に逸脱したわずかなバ
ンドもあるが、図6Bに見られるごとく、それは細胞質外
領域プローブにハイブリダイズしないので、正常EGFR
mRNA由来のものではなかった。
図6Bは細胞質外領域からのプローブ（pE7の730bp Ec
oR I−BamH I断片）でハイブリダイズされた別のブロッ
トである。
図6CはD245からのEGF受容体関連mRNAのcDNA配列を示
している。呼称“D245"は腫瘍D245およびmRNAから誘導
されたクローンのヌクレオチド配列を指している。略号
“EGFR"は正常EGF受容体cDNA配列を指している。術語
“D245AA"は“D245"から演繹されたアミノ酸配列であ
り、それは“ｖ−erbB"の配列と並べてある（ｖ−erbB
癌蛋白質はウイルスおよびEGFR配列の間の融合蛋白質で
あり;EGFR関連配列のみが示されている）。腫瘍D245に
対し仮定された開始コドンに下線が引かれている。右側
の数字はD245配列に当てはまるものである。
図７−RNase保護による転写体の特徴付け 図7Aは使用されたプローブの模式的図である。5.5kb
EGF受容体とcDNAは前に図に示されている。しま模様
の枠はシグナルペプチドであり、細胞質外領域が続き、
それは示されているごときシスティンリッチ領域で４つ
の領域（１−４）に分割されている。黒ぬりのわくは膜
透過領域でありキナーゼ領域を含む細胞質内領域が続い
ている。細い線は非翻訳領域である。
図7BはRNase保護実験から演繹された転写体構造を表
わしている。記号は図4Bと同じである。
図7Cはグリア腫瘍異種移植片からのRNAを用いたRNase
保護実験を描いている。数字はＩ−IIIは図7Aのプロー
ブを指している。右側の数は保護された断片の大きさを
示している（本文参照）。
各レーンは:A）D245;B）D256;C）D270;D）D320;E）D2
98;F）D317;G）tRNA（陰性対照）；およびＨ）未消化プ
ローブからのRNAを含んでいる。
図８−改変領域からの遺伝子産物のPCR分析 図8Aはポリメラーゼ連鎖反応生成物のゲル電気泳動を
示している。ゲルは35サイクル後の反応液の1/10を示し
ている。
各レーンはＡ）270;B）317;C）397;D）256;E）298;
F）320からの生成物を含んでいる。D270,D317およびD39
7に対してはプライマー組Ａが使用され;D256;D298およ
びD320に対してはプライマー組Ｂが使用された（実験法
参照）。数字はマーカーの同時電気泳動から判断された
塩基対中の断片のサイズを示している。
図8Bは腫瘍D270,D317およびD397からのPCR生成物の配
列を示している。
図8CはD256およびD298からのPCR生成物の配列を例示
している。数字およびアステリスクは欠失範囲に接して
いるEGF受容体cDNAヌクレオチドを示している。図に示
された右や左への配列は正常GEFR cDNAのものと同じで
あった。
抗体産生 １マウス ハイブリドマ産生（後に骨髄腫内へ融合される）のた
めのマウスは下記のスケジュールに従って注射を受け
る。マウス個体群は各々の免疫処置アームにおいてタイ
プＩおよびタイプII EGFR欠失突然変異体の両方に対し
少くとも５および一般的には10までであった。
ハイブリドーマ上澄液が0.5μg/ウエルのpep−２を用
い、固相ラジオイムノアッセイを使用してスクリーンさ
れた。高度免疫血清pep−２特異性対pep−１免疫前血清
がベースライン対照物として使用された。
EGF受容体突然変異体ペプチド（クラスII）に対する
モノクローナル抗体を作製している25以上のマウスハイ
ブリドーマが単離された。
２ウサギ 免疫処置スケジュール ウサギには最初にキーホールリムペットヘモシアニン
に結合した欠失突然変異体の合成ペプチドを注射し、２
ケ月後から１ケ月間隔でさらに３回注射した。以下のス
ケジュールに従ってウサギに免疫処理パターンが実施さ
れた： 日−7 免疫前放血（ウサギ当り耳静脈から50ml） 日 0 250μｇペプチド−KLH複合体を1mlのリン酸緩
衝化塩溶液で；完全フロイントアジュバンド（1:1）を
ウサギ当り５つの異なった部位に200ラムダを皮下に注
射 日 30 1mlのリン酸緩衝化塩溶液中50μｇペプチド−K
LH複合体；不完全フロイントアジュバンド（1:1）をウ
サギ当り５つの異なった部位200ラムダを皮下に注射 日 39 ウサギ放血、血清採取、1mlづつ−135℃に貯
蔵。
別の実験においてはわずかに異なったスケジュールに
従った。
３羽のニュージーランド白色ウサギにKLHに結合させ
たペプチドだ免疫した。０日目の日にはリン酸緩衝化塩
溶液（PBS）および完全フロイントアジュバンドの1:1乳
化液1ml中の250μｇのKLH結合ペプチドを投与する皮下
の免疫処置を行った。各々のウサギは４つの異った部位
でこの用量を注射された。33日目に各々のウサギは1ml
の1:1PBSおよび不完全フロイントアジュバンドの乳化液
中の50μｇのKLH結合ペプチドで４つの異なった部位に
追加免疫された。日40および43に放血させて抗血清を得
た。
抗体の滴定 ペプチドに対する抗体力価はELISAで決定された。簡
単に記すと、ペプチドの濃縮液（1mg/1ml PBS）を10μ
g/mlに200mM NaHCO3緩衝液（pH9.2）で希釈し、50μｌ
をポリビニルクロリドの96−プレートウエル（Dynatec
h.Lanoratories,Inc.,Chantilly,VA）に加えた。ペプチ
ド溶液はプレートウエル中で一夜４℃でインキュベート
した。ペプチド溶液を捨て、プレートは0.05％のツィー
ン20（Sigma,St,Louls,MO）を含むハンクス緩衝化塩溶
液で３回洗浄した。次に200μｌの0.5％ウシ血清アルブ
ミンのPBS溶液で室温にて１時間非特異的結合がブロッ
クされた。プレートは上記のごとく洗浄した。免疫前ウ
サギ血清または抗血清（0.5％BSAを含むハンクス緩衝化
塩溶液希釈液100μｌ）を添加し、室温に２時間インキ
ュベート。プレートを洗浄し、50μｌのペルオキシダー
ゼ共役ヤギ抗ウサギIgG（Zymed Laboratories,Inc.,Sa
n Francisco,CA）を添加し、37℃にて１時間。プレー
トを洗浄し、100μの基質溶液を添加した。基質溶液は1
5mgのｏ−ファニレンジアミン（Sigma）を1mlのメタノ
ールに加え続いて49mlの脱イオン水および50μｌの過酸
化水素を添加することにより調製された。インキュベー
ションを室温にて15−20分行い、ウエルの吸光度を自動
プレート読み取り器（Titertek Multiskan MCC/340,F
low Laboratories,McLean,VA）中492nmで測定した。EL
ISAはまた精製抗ペプチド抗体で実施できた。この検定
における半最大力価は0.5μｇ抗ペプチドIgG/ml PBSで
あった。
ペプチド−KLH複合体で免疫した３羽のウサギすべて
がプレートに結合された非結合ペプチドに対してELISA
による評価で著しいIgG応答を示した（図９）。半最大
力価（最高吸光度の半分での抗血清希釈度）は1:6000か
ら1:50,000まで変化した。各々のウサギからの前免疫血
清は反応性がないので結合反応は特異的であった；非反
応性ベースラインはまた抗血清を異なった配列の第２の
14−アミノ酸配列（Pep−1:配列： Ｈ−Asn−Leu−Leu−Glu−Gyl−Cys−Thr−Gly−Pro
−Gly−Leu−Glu−Gly−Cys−OH） と反応させた場合にも得られた。
抗ペプチド抗体の精製および特性付け 抗ペプチド抗体はペプチド−セファロース アフィニ
ティカラムを酸性pHで溶出することにより抗血清から精
製された。アフィニティカラムはファルマシア（Pisata
way,N.J.）プロトコールに記載されているごとく、5mg
のペプチドをシアノーゲンブロミド−活性化セファロー
ス（Sigma）に結合させることにより調製した。ゲルにB
CA蛋白質検定（Pierce,Rockford,IL）の溶液をかぶせる
ことにより決定すると結合の程度は100％であった。ウ
サギ396（ペプチドに対する反応においてELISAで1:50,0
00の最高の半−最大力価を示したウサギ）からの抗血清
10ミリリットルをカラムを通過させて、カラムを500ml
のPBSでよく洗浄した。溶出は100mMグリシン緩衝液（pH
2.5）で行いただちに0.4Mヘペス緩衝液（pH7.4）に中和
された。ウサギ抗血清396（1:50,000の半−最大力価を
持つ抗血清）の10mlをスタート時に負荷すると6mgの純
粋なIgGが得られた。より低い半−最大力価の抗血清か
らの抗ペプチドIgGの精製ではより低い収率しか得られ
なかった。活性抗体の溶出はまた3.5M MgCl2（pH3.5ま
たはpH6.5）でも達成された。遊離のペプチドに対するE
LISAにより評価されたところ異なった条件下溶出された
抗体の活性は同じであった。
対照IgGウサギ前免疫血清からプロティンＡ−セファ
ロースアフィニティックロマトグラフィーにより精製さ
れた。精製された抗体のサイズおよび均質性は非変性条
件下サイズ排除HPLCによりおよび変性条件下SDS−PAGE
によりモニターされた。HPLCは検定された１×30cm Wa
ters300SWカラム（20,000−40,000ダルトンのMrのサイ
ズ範囲の標品で前もって検定されている）で実施され
た。蛋白質溶出は215nmで追った。SDS−PAGEはLaemmli
（Laemmli,Nature（1970）,270:680−688）のSDS−不連
続緩衝液系中10％可溶ゲルを利用した。蛋白質バンドは
クマッシーブルー染色で可視化した。溶出した抗体はサ
イズ排除HPLCカラムおよびSDSゲル（データは示してい
ない）上の明らかな分子量からIgGと同定された。純度
は98％を越えていた。
突然変異体EGFR発現の免疫細胞化学的検出 親和性で精製された抗体は前に記載されているごとく
して（Humphrey et al.,Cancer Res.（1988）,48:22
31−2238）、凍結組織切片およびアビジン−ビオチン複
合体法を用いて免疫細胞化学的に特性付けられた。試験
された組織は正常な胎児および成人組織、癌腫（前立
腺，膀胱，胸および肺），神経膠腫生検試料（−Bx）お
よびヌードマウス中の異種移植片形で増殖した神経膠腫
（−Ｘ）の範囲を含んでいた。正常組織、癌腫および神
経膠腫生検試料はDuke Unirersity Medical Center
Tissne Bankから得られた。神経膠腫異種移植片は前
に記載したごとくして増殖させた（Humphrey et al.,
Cancer Res,（1988）,48:2231−2238）。親和性で精製
した抗ペプチド抗体および精製された免疫前ウサギ対照
IgGは１−２μg/mlの濃度で使用された（最初の滴定実
験で決定された）。抗体は1:3000の免疫細胞化学的最適
力価の抗血清形で使用できた。正常ウサギIgGのＦ（a
b′）２断片および抗ペプチド抗体も神経膠腫Ｄ−270MG
−Ｘおよび皮膚上で免疫細胞化学的に試験された。Ｆ
（ab′）２断片は前記のごとく（Colapinto,et al.,Ca
ncer Res,（1988）48:5701−5707）発生させられ精製
された。免疫細胞化学でまた使用される神経膠腫生検試
料は無傷のEGFR（生成物番号:OA−11−852,Cambridge
Research Biochemicals,Valley Stream,New York）
と反応性のあるウサギ抗ペプチド抗体であった。この抗
血清は1:1000の希釈で使用された（最初の滴定実験で確
立されたごとく）。
凍結組織切片中の天然突然変異体EGFRと反応した抗ペ
プチドIgGはアセトンで簡単に固定された。抗体は突然
変異体神経膠腫EGFRのみを特異的に認識したが、無傷の
A431−Ｘ落屑性細胞癌腫EGFRは異種移植片（データは示
されていない）および生検試料組織（表１）の両方とも
認識しなかった。この突然変異体EGFRの免疫染色は特異
的であり（精製された免疫前IgGは反応活性ではなかっ
たので）、過剰のペプチドと抗ペプチドIgGの前もって
のインキュベーションは免疫細胞化学的染色を妨害し
た。神経膠腫の生検試料および異種移植片組織の両方に
おいて（抗ペプチド抗体を結合する）免疫染色は細胞質
および細胞表面に局在していた：事実上すべての腫瘍細
胞は免疫反応性を示した。
抗ペプチド抗体による免疫細胞化学的な正常および新
生物性組織のスクリーニングはグリア芽のサブセットの
み陽性を示した（表１）。免疫反応性突然変異体EGFRは
EGFR遺伝子を増幅し、突然変異体EGFR蛋白質を発現する
ことが知られている２つのヒト神経膠腫性検試料（Ｄ−
270MG−BxおよびＤ−317MG−Bx）および対応する異種移
植片（Ｄ−270MG−ＸおよびＤ−317MG−Ｘ）で同定され
た。４つの別のグリア芽生検試料が抗ペプチド抗体によ
る免疫染色を示した：これらの１つ（Ｄ−397MG−Bx）
は続いてRNAに基づいたPCR検定を用いて試験され、配列
決定により神経膠基Ｄ−270MG−BxおよびＤ−317MG−Bx
と同じ欠失突然変異を持っていることが示された。
この抗体の選択性に対するさらなる証拠は神経膠腫生
検試料のこのスクリーンで得られた。27中27の生検試料
が無傷のEGFRに対するウサギ抗ペプチド抗体と特異的に
反応したが：証明された（３例）または疑われた（３
例）欠失突然変異を持つような神経膠腫のみが抗融合接
合部ペプチド抗体と反応した。胎児および成人正常組織
および癌腫は本抗ペプチドとこの方法で評価する限り反
応しなかった。
無傷及び突然変異体EGFRを発現する腫瘍膜への135I−標
識抗ペプチドIgGの結合 上記したヨウ素法［Colapinto,et al.,Cancer Res.
（1988）,48:5701−5707］の変形を用いて、精製抗ペプ
チド抗体及び前−免疫（pre−immune）IgGをいずれも、
約1.6μCi/μｇの特異的活性で125I標識した。放射性ヨ
ウ素化タンパク質（22ng,50−70kcpm）を、0.1％ BSA
及び1mg/mlのミクロソーム膜懸濁液40μｌを含む20mM
Hepes（pH7.4）200μｌで、４℃で２時間、三重にイン
キュベーションした。試験した膜は、枠内（in−fram
e）削除突然変異体EGFRを発現するグリオーマ腫瘍であ
る、Ｄ−270 MG−X;無傷EGFRを過剰発現する鱗部（squ
amous）細胞カルシノマである、A431−X;及び細胞外ド
メインの大半を欠き、ネガティブな組織コントロールと
して作用するEGFR分子を含むか、或いは発現する腫瘍で
ある、D245 MG−Ｘから得たものであった。インキュベ
ーション期間に次いで、インキュベーションバッファー
1mlで２回洗浄した酢酸セルロース遠心フィルターユニ
ット（Spin−x,Costar,Cambridge,MA）0.22−μｍを用
いて、膜を非結合活性から分離した。フィルターは、あ
らかじめ室温で30分間インキュベーションし、バッファ
ーで３回洗浄することにより前処理しておいた。この手
法を用いると、フィルターに対する放射能活性の非特異
的結合は〈0.2％であった。自動ガンマカウンターを用
いて、同様のカウンティングジェオメトリー（counting
geometries）でフィルター及び洗液の125I活性をアッ
セイした。
Ｄ−270 MG−Ｘ突然変異体EGFRを発現する膜に対す
る放射性ヨウ素化抗ペプチドIgGの直接結合は、無傷EGF
R（A431−Ｘにおける）又はｖ−erbB様EGFR（Ｄ−245
MG−Ｘにおける）を発現する膜に対するものよりも有意
に高かった（表２）。125I−標識精製前−免疫IgGを用
いる非特異的結合の評価によって、抗ペプチド結合反応
の特異性を示した。抗ペプチド抗体の選択性は、特異的
結合値パーセントを比較することにより特記される；即
ち、Ｄ−270 MG−Ｘ膜における突然変異体EGFRに対す
る抗ペプチド抗体結合のレベルは、無傷EGFRとの低い反
応性よりもはるかに高く、これはネガティブな腫瘍膜コ
ントロールについてと同様である。
抗ペプチドIgGの、無傷EGFRではなく、突然変異体EGFR
との反応 抗ペプチドIgGの分子特異性を免疫沈殿（immunopreci
pitation）反応で試験した。この反応における結合性に
次いで、EGFR自動リン酸化、SDS−PAGE、及びオートラ
ジオグラフィーを本質的には前記したように実施した。
無傷及び突然変異体EGFRの両方と免疫沈殿を行うので、
モノクローナル抗体528（Ab−１、Oncogene Science,I
nc.,Manhasser,New York）をポジティブコントロール
として用いた。簡単に述べると、トリトンＸ−100界面
活性剤で可溶化した完全体A431−Ｘ EGFR及び突然変異
体Ｄ−246 MG−Ｘ及びＤ−270 MG−Ｘ EGFRを、モノ
クローナル抗体528又は精製抗ペプチド抗体で免疫沈殿
させた。32P−ATPで自動リン酸化した後、7.5％分解ゲ
ルでSDS−PAGEを行った。ゲルを固定して減圧下に乾燥
し、−70℃でＸ−線フィルムに露光した。抗ペプチド抗
体は、免疫沈殿反応のためにProtein Ａ−Sepharoseと
結合させるときに、精製IgG20μg,又は抗血清100μｌで
用いた。
抗ペプチド抗体を界面活性剤−可溶化状態で突然変異
体EGFRと反応させ、免疫沈殿と自動リン酸化及びSDS−P
AGEで判定した（図10）。ポジティブコントロール免疫
沈殿はモノクローナル抗体528で行い、これはEGFR外部
ドメインに対するものである。この抗体は無傷A431−Ｘ
及び突然変異体Ｄ−270 MG−Ｘ EGFRのいずれとも反
応した。これとは対照的に、抗ペプチド抗体は、グリオ
ーマＤ−270 MG−Ｘにおける145−kDaの突然変異体EGF
Rを特異的に免疫沈殿させたが、無傷A431−Ｘ EGFRを
免疫沈殿しなかった。精製前免疫IgGは、突然変異体EGF
Rを免疫沈殿しなかった。
突然変異体EGFRに対する125I−標識EGF結合、及び突然
変異体EGFRキナーゼ活性に対する抗ペプチドIgGの影響 125I−標識表面成長因子（New England Nuclear,Do
raville,GA）結合に対する精製抗体の影響を、Humphre
y,et al.,Cancer Res.（1988）,48:2232−2238に記載の
ようにミクロソーム膜と125I−標識EGFとの反応混合物
を用いて測定した。EGFRキナーゼに対する抗体の影響を
測定するためには、Davis and Czech,J.Biol.Chem.（19
85）260:2643−2651に記載のように、Ｄ−270 MG−Ｘ
及びA431−Ｘ膜におけるEGFRのリン酸化を実施した。簡
単に述べると、膜（５−10μｇ）,20−mM Hepes（pH7.
4）、4mM MnCl2、10mM MgCl2、１％DMSO、EGF±400n
g、±正常ウサギIgG、±抗ペプチド抗体を含む容量50μ
ｌ中でリン酸化を行った。混合物を室温で20分間インキ
ュベーションし、次いで４℃に冷却した。［γ−32P］
−ATP（1.5μM:10−15,000cpm/pmol）を加えて、３分後
にドデシル硫酸ナトリウム及びベータメルカプトエタノ
ールを含むサンプルバッファー25μｌを加えることによ
り、反応を停止した。サンプルを7.5％ポリアクリルア
ミドゲル上の電気泳動［Laemmli,Nature（1970）,270:6
80−688］に付し、リセプターのリン酸化程度をオート
ラジオグラフィーで検出した。
抗−合成ペプチド抗体は125I−標識EGFの突然変異体E
GFRに対する結合に影響を及ぼさなかったし、また基本
的、及びEGF−刺激化固有キナーゼ活性のいずれにも影
響を及ぼさなかった。125I−EGF結合の合計カウントか
ら非標識EGFの100倍過剰によって置換されないカウント
を引いたカウントとして定義される125I−標識EGFの特
異的結合性は、抗体添加によって変化しなかった（デー
タ表示せず）。これは恐らく、残基351−364におけるEG
F結合ドメインから離れた部位に融合結合が位置してい
るためであろう［Wu,et al.,J.Biol.Chem.（1989）,26
4:17469−17475］。SDS−ポリアクリルアミドゲルのオ
ートラジオグラフィーにおけるバンド強度で評価したと
ころ、突然変異体EGFRのキナーゼ活性は抗体の存在で変
化しなかった（データ表示せず）。
抗ペプチドIgGのインターナリゼーション 生腫瘍細胞に対する抗ペプチドIgGの結合性を免疫蛍
光アッセイによって測定した。Ｄ−270 MG−Ｘ又はA43
1−Ｘ細胞を、無感覚マウス中で皮下成長させた腫瘍異
種移植片からの解離によって調製した。簡単に述べる
と、マウスから皮下腫瘍を除去し、生存できる部分を壊
死領域から分離した。生存可能組織をハサミで細かく切
断し、トリプシン処理したフラスコを用い、37℃で0.8
％コラゲナーゼ中で１時間インキュベーションすること
によって単一細胞懸濁液へと解離した。１％正常ヤギ血
清を含む冷リヒター亜鉛−オプション培地で２回洗浄し
た。トリパンブルーで評価して百万個の生存可能細胞
を、非特異的結合をブロックするための亜鉛−オプショ
ン培地と10％正常ヤギ血清と共に、４℃で30分間インキ
ュベーションした。100μｌの抗ペプチド抗体（1ml当た
り20μｇ）又は前免疫IgGと共に細胞を４℃で30分間イ
ンキュベーションした。亜鉛−オプション培地と１％正
常ヤギ血清とを用いて３回洗浄した後、100μｌの蛍光
標識ヤギ抗ウサギIgGと共に４℃で30分間インキュベー
ションした。上記したように細胞を洗浄し、500μｌの
冷亜鉛−オプション培地と１％正常ヤギ血清中に再懸濁
した。100μｌを取り、10−60分間37℃に暖め、Zeiss蛍
光顕微鏡で観察した。
表面突然変異体EGFRに素早く結合する抗−合成ペプチ
ド抗体は、生きているグリオーマＤ−270 MG−Ｘ細胞
上で発現し、この結合は免疫蛍光二次抗体レベルの縁取
りパターンによって表された。インターナリゼーション
は斑点の入った細胞質内の形態によって容易に確認さ
れ、明らかにされた。末梢細胞質膜の縁取りの消失を伴
うインターナリゼーションは37℃、60分間で完了した。
EGFRの免疫沈殿 異種移植組織からのEGFRを、以下のように可溶化して
免疫沈殿を行った。凍結（−70℃）異種移植組織10mg
を、20mM酢酸ヨウ素、及び1mg/mlのアプロチニンからな
る氷冷可溶化バッファー1ml中にホモゲナイズした。４
℃で２時間後、調製物をBeckman卓上遠心器中、12,000x
g、４℃で15分間遠心した。上澄みをEGFR免疫沈殿に用
いた。免疫沈殿は、EGFRの正常外部ドメインと反応性で
ある、モノクローナル抗体Ab−１（clone528:Oncogene
science,Inc.）で実施した。
モノクローナル抗体Ab−１（528）は、EGFがそのリセ
プターと結合するのを阻害するIgG2aである。各反応混
合物について、モノクローナル抗体Ab−１（528）５μ
ｇ又はポリクローナル抗体を含む非希釈抗血清15ulを、
115mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.4中、室温で30分
間インキュベーションすることにより、Protein Ａ−S
epharose 4B 2mgと結合させた。抗体−Protein Ａ−
Sepharose複合体を115mMリン酸ナトリウムバッファーpH
7.4で３回洗浄し、可溶化異種移植組織500ul,115mMリン
酸ナトリウムバッファーpH7.4、及び抗体−Protein Ａ
−SepharoseペレットでEGFR免疫沈殿を実施した。
ペレットを再懸濁した後に、４℃で一夜インキュベー
ションをした。免疫沈殿物を可溶化バッファー1mlで３
回洗浄し、このペレットを自動リン酸化に用いた。
EGFRの自動リン酸化 免疫沈殿化EGFRの自動リン酸化を実施した。EGFR−Pr
otein Ａ−Sepharoseペレットを、可溶化バッファー30
ul及び2mM MnCl2と3uCiのガンマー［32P］ATP（New E
ngland Nuclear:2000−3000Ci/mmol）と共にインキュ
ベーションした。氷上、４℃で10分間反応させた後、2x
Laemmli SDS−PAGEサンプルバッファー30ul及び２％
Ｂ−メルカプトエタノールを加えて反応を停止した。サ
ンプルを３分間煮沸して遠心した。上澄みをSDS−ポリ
アクリルアミドゲルに用いた。
イムノブロット分析 グラファイト電極を有する半乾燥水平電気泳動移動シ
ステム（LKB Multiphor II Nova Blot System）を
用いて、ウェスタンイムノブロット分析を実施した。簡
単に述べると、凍結A431及びグリオーマ異種移植物をSD
S−ゲルサンプルバッファー中に可溶化し、煮沸して7.5
％SDS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。
タンパク質を150mA、２時間でニトロセルロースに移
し、抗体528、及びタイプIIペプチドに対するウサギno.
4からのポリクローナル抗血清を用いて、EGFRの免疫組
織化学的検出を行った。
タイプII突然変異体に対するポリクローナル抗体は本
試験の範囲内で組織特異的である。図９及び10を参照さ
れたい。
本明細書中に引用した特許及び文献は、参照すること
によりここに包含される。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ビグナー，ダレル アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，ロングウッ ド・ドライブ 210 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＢＩＯＳＩＳ) ＷＰＩ（ＢＩＯＳＩＳ) Ｒｅｇｉｓｔｒｙ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Asn−Leu−Leu−Glu−Gly−Cys−Thr−Gly
    −Pro−Gly及びLeu−Glu−Glu−Lys−Lys−Gly−Asn−T
    yr−Val−Val−Thrからなる群から選択されるEGFR突然
    変異体ペプチドをコードするDNA配列を含むイントロン
    なしのDNA分子。
  2. 【請求項２】AAG−CTT−CTG−GAG−GGA−TGC−ACT−GGG
    −CCA−GGT及びCTG−GAG−GAA−AAG−AAA−GGT−AAT−T
    AT−GTG−GTG−ACAからなる群から選択されるDNA配列を
    含むイントロンなしのDNA分子。
  3. 【請求項３】Ｎ−末端配列がMet−Asn−Ile−Thr−Cys
    −Thr−Gly−Arg−Gly−Pro−Asp−Asn−CysであるEGFR
    突然変異体ペプチドをコードするイントロンなしのDNA
    分子。
  4. 【請求項４】Asn−Leu−Leu−Glu−Gly−Cys−Thr−Gly
    −Pro−Gly及びLeu−Glu−Glu−Lys−Lys−Gly−Asn−T
    yr−Val−Val−Thrからなる群から選択されるアミノ酸
    配列を含み、その他のヒトタンパク質を含まないEGFR突
    然変異体ペプチド。
  5. 【請求項５】Ｎ−末端配列がMet−Asn−Ile−Thr−Cys
    −Thr−Gly−Arg−Gly−Pro−Asp−Asn−Cysであり、そ
    の他のヒトタンパク質を含まないEGFR突然変異体ペプチ
    ド。
  6. 【請求項６】請求の範囲第１項記載のDNA分子を含むベ
    クター。
  7. 【請求項７】請求の範囲第２項記載のDNA分子を含むベ
    クター。
  8. 【請求項８】請求の範囲第３項記載のDNA分子を含むベ
    クター。
  9. 【請求項９】請求の範囲第６項記載のベクターを含む形
    質転換細胞。
  10. 【請求項１０】請求の範囲第７項記載のベクターを含む
    形質転換細胞。
  11. 【請求項１１】請求の範囲第８項記載のベクターを含む
    形質転換細胞。
  12. 【請求項１２】Asn−Leu−Leu−Glu−Gly−Cys−Thr−G
    ly−Pro−Gly及びLeu−Glu−Glu−Lys−Lys−Gly−Asn
    −Tyr−Val−Val−Thrからなる群から選択されるアミノ
    酸配列を含むEGFR突然変異体と免疫反応性であるが、無
    傷EGFRとは免疫反応性ではない抗体調製物。
  13. 【請求項１３】ポリクローナルである請求の範囲第12項
    記載の抗体調製物。
  14. 【請求項１４】モノクローナルである請求の範囲第12項
    記載の抗体調製物。
  15. 【請求項１５】Ｎ−末端配列がMet−Asn−Ile−Thr−Cy
    s−Thr−Gly−Arg−Gly−Pro−Asp−Asn−CysであるEGF
    R突然変異体と免疫反応性であるが、無傷EGFRとは免疫
    反応性でない抗体調製物。
  16. 【請求項１６】ポリクローナルである請求の範囲第15項
    記載の抗体調製物。
  17. 【請求項１７】モノクローナルである請求の範囲第15項
    記載の抗体調製物。
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