JPH05504552A - ２’位が改変されたオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２′１が改′　されたオリゴヌクレオチド１人立互 本発明は、薬剤送達用あるいは核酸活性を直接阻害するためのオリゴマー配列の 相補性あるいは特異性に基づく技術に有用な、改変されたオリゴヌクレオチドに 関する。さらに詳細には、本発明は、ヌクレアーゼ活性に対して安定な、２°位 で改変されたオリゴマーに関する。

１人！見 近年、診断用あるいは治療用の手段としての核酸の設計に関するかなりの活動が ある。この設計の一面は、疾患あるいは腫瘍を媒介する核酸物質に対するある種 のオリゴマー配列のインビボでの特異的な親和力に基づく。この一般的なアプロ ーチはしばしば「アンチセンス」テクノロジーと称されている。簡略化されすぎ ている一般的な前提は、感染性生物の繁殖あるいは悪性腫瘍のような細胞の状態 に関連し、そして重要であるＤＮＡあるいはＲＮＡに対して、投与されるオリゴ マーが相補性であることである。この前提は、その相補性がオリゴマーを標的の 核酸に結合させ、従ってその正規の機能がなんであろうと、これを不活性化する ことである。

簡単な例は、感染の進行に必要なタンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的なり ＮＡオリゴマーの投与である。この投与されるＤＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳を不活 性化し、従って、タンパク質の形成を阻害する。多分、このＤＮＡは、直接投与 され得るか、あるいはインサイチュでの標的のｍＲＮＡに相補的なｍＲＮＡを生 成するために使用され得る。現在、この一般的なアプローチに関する文献が大量 にあり、標的のＲＮＡあるいはＤＮＡ配列に相補的なこのタイプのオリコマ−を 用いる方法は明らかになっている。

例えば、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ、Ａ、Ｒ，ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ 　（１９８８）　ｉ：９５８−９７６；　５ｔｅｉｎ、Ｃ，Ａ、ら、Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８ｇ）　４８：２６５９−２６６８；　１ｚａｎ ｔ、　Ｊ、Ｇ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　２２９：３４５−３５２； およびＺｏｎ、　Ｇ、、　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 （１９８ｇ）　５：５３９−５４９゜これら全ては参考として本明細書に援用さ れている。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する文献の目録は、Ｄ ｒ。

Ｌｅｏ　Ｌｅｅにより、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 　Ｆａｃｉｌｉｔｙ　ｉｎ　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、　ＭＤに作成されている。

インビトロでの核酸の機能性を阻害するために相補性を用いる一般的な構想に２ つの概念的な追加がある。これらのうちの最初の１つは、古典的な塩基対センス の厳密な相補性が、ある種のオリゴヌクレオチド配列が二重螺旋のＤＮＡ中の配 列を認識しそして結合する特異的な能力、およびこの複合体の大溝（＋ａｊｏｒ 　ｇｒｏｏｖｅ）にそれ自身を挿入する特異的な能力により補足され得ることで ある。最近の最も確実な報告書では、このような特異性に対する新しい法則が説 明されている。これらの文献は、最も初期の研究、例えば、二重鎖ｐｏ　１ｙ− ｄＴ／ｐ。

ｌ　ｙ−ｄＡ　／ｐｏ　１ｙ−ｄ　Ｔとしての結合の一般的な原理を示している Ａｒｎｏｔｔ、　ｓ、ら、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９７４）■、５０９−５ ２１による研究；および、ｐｏｌｙ−ｄＣを含有する対応のアナログ三重鎖につ いてまとめられているＭｏ５ｅｒ、　Ｈ，Ｅ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８７ ）　２３８：６４５−６５０を考慮に入れる。さらに最近の研究では、先の法則 （ホモピリミジンンオリゴマーによって、二重螺旋中にあるホモプリン／ホモピ リミジンに対する認識は達成され得る）は、混合配列がさらに認識され得るパタ ーンに拡張され得た（Ｇｒｊｆｆｉｎ、　Ｌ、Ｃ０ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９ ８９）　２４５：９０７−９７１）。さらに、これらの現象のまとめは、例えば 、Ｍａｈｅｒ　ＩＩＩ、　Ｌ、Ｊ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８９）　２４５ ニア２５−７３０の概説にある。さらに三重螺旋形成関連の開示は、Ｃｏｏｎｅ ｙ、Ｍ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）　２４ユニ４５６−４５９；　Ｆｒ ａｎｃｏｉｓ、　Ｊ、−Ｃ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８ ８）　１６：１１４３１−１１４４０；および５ｔｒｏｂｅｌ、Ｓ、Ａ、ら、Ｊ 　Ａｉ＋　Ｃｈｅｗ　Ｓｏｃ　（１９８８＞　１１０ニア９２７−７９２９にあ る。この内容に関して、正確な配列の特異性の研究を提供するためにさらに詳細 な説明が必要とされるが、二重螺旋の大溝に特異的にはめこむこのセンスの「相 補性」に対する法則が早く浮かびあがることは明確である。

第２の局面は、天然のオリゴヌクレオチドでの塩基対の相補性の単純な概念から 逸脱したアンチセンステクノロジーは、オリゴヌクレオチド、特にＲＮＡが生物 学的な系中でのヌクレアーゼ開裂を高度に受け易いという初期の認識から得られ る。

これらの物質に活性薬剤を残存させるために、投与されるオリゴヌクレオチドを この分解に対して安定にする必要がある。

これまで用いられてきたアプローチは、これらの酵素による攻撃に対して耐性に なるようにホスホジエステル結合を改変することであった。特に、このホスホノ エステエル結合は、ホスホルアミデート結合、メチルホスホネート結合、および ホスホロチオエート結合で置換されていた。これらのアプローチは、完全には満 足されないが、立体異性および標的配列へのハイブリダイゼーションに対する関 連の影響に関わるある程度の結果を宵する。他のアプローチは、２−０−メチル リボースあるいは従来のヌクレオシド残基のαアノマーを用いてヌクレオシドを 改変することである。さらに、２°アミノ基を有するオリゴマーは、それらのト リホスフェートアナログにより調製され、そしてＨｏｂｂｓ、　Ｊ、ら、Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓ工ｒｌ（１９７３）　１２：５１３ｇ−５１４５による酵素触媒に より重合される。これらのアプローチは、前述の章に掲載されているＺｏｎの概 説にまとめられている。

本発明は、さらに、この技術において有用なオリゴマーに包含されるための、２ °位が置換されたペントース部分を提供する。これは、ヌクレアーゼ活性に対し て耐性であり、そして、さらに必要に応じて上述したさらなる改変と組み合わせ られ得る。

全日の−な２日 本発明は、下記式のヌクレオシドおよびヌクレオチドに向ここで、 Ｂがプリンあるいはピリミジン残基、あるいはそれらのアナログであり； ＷｌがＨＳ　ｍが１から３の整数である（ＰＯ３）ｌ−２、保護基、あるいは結 合水酸基に反応する基であり；Ｗ２がＨ，ＰＯａ−２、保護基、あるいは結合水 酸基に反応する基であり； ＸがＯ，Ｓ、　それぞれのＲが独立してＨあるいはアルキル（１−６Ｃ）である ＮＲあるいはＣＲ２であり；Ｙがリンカ一部分、必要に応じてリンカ一部分を介 して結合された薬剤残基、必要に応じてリンカ一部分を介して結合されたラベル 、あるいは必要に応じてリンカ一部分を介して結合された特性に影響する残基で あって、ここで、該Ｘ−Ｙ置換基が、該（１）式のヌクレオシドあるいはヌクレ オチドを含有するオリゴマーを、２位に−Ｈ２あるいは−ＨＯＨを有する対応の ヌクレオチドを取り込んだ該オリゴマーよりもヌクレアーゼ処理に対してより安 定にする。

これらの物質は、本発明のオリゴマーの合成における中間生成物として有用であ り、これは下記の式のオリゴマーである。

（以下余白） それぞれのＢが、独立して、プリンあるいはピリミジン残基、あるいはそれらの アナログであり；Ｗ３およびＷ４が、それぞれ独立してＨ，ＰＯ３−２、保護基 、あるいは結合水酸基に反応する基であり；ｎが１から２００の整数であり； それぞれの２が、独立して、その続きのヌクレオチド残基の水酸基に共有結合す るヌクレオチド結合残基であり；それぞれのＡが、独立して、Ｈ，ＯＨ，あるい は保護基に誘導化したＯＨ１およびｘ−Ｙからなる群から選択され、ここに、 ＸがＯＳＳ、　ＮＲ，あるいはＲが独立してＨあるいはアルキル（１−６Ｃ）で あるＣＲ２であり；およびＹが、リンカ一部分、必要に応じてリンカ一部分を介 して結合された薬剤残基、必要に応じてリンカ一部分を介して結合されたラベル 、あるいは必要に応じてリンカ一部分を介して結合された、特性に影響する残基 であって：ここで、少なくとも１つのＡがＸ−Ｙであり；そして、ここで、該オ リゴマーが、すべてのＡがＨあるいはＯＨであるこれに対応するオリゴマーより も、ヌクレアーゼに対して安定である。

式（２）のオリゴマー物質は、病状に関連する特定のＤＩＪＡおよび／またはｌ １ＮＡを標的することによって、感染症あるいは悪性腫瘍に対して向けられたプ ロトコール、並びに診断の応用における、治療剤あるいは予防剤として有用であ る。

日を　するための≦態 Ａ、１爽 本発明のオリゴマーは、少な（とも１つの式（１）のヌクレオチドの残基を含む 。この式において、およびオリゴマーにおいて、Ｂは、アテ゛ニン（Ａ）、チア ミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはウランル（Ｕ）、または これらの保護形態などの、従来のプリン塩基またはピリミジン塩基を表す。適切 な保護基としては、アフル、イソブチリル、ベンゾイルなどが含まれる。しかし 、Ｂはまた、これらの従来生じている塩基の、改変されたまたは保護された形態 、もしくは関連する誘導体、すなわち「類似化合物」をも表わし得る。広範囲に わたるこれら類似複素環塩基が当該分野で既知である。例えば、このような類似 化合物の中で通常みられるものには以下のものが含まれる。５−フルオロウラシ ル、５〜ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−イオドゥラ／ル、ヒポキサ ンチン、キサニ／チン、４−アセチル／ドシン、５−（カルポキンヒドロキシル メチル）ウランル、５−カルボキシメチルアミンメチル−２−チオリ７ン、５− カルボキンメチルアミンメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ヘーターＤ−ガラ クトシルキューオシン、イノノン、Ｒ６−イソペンテニルアデニン、１−メチル アデニン、■−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノ ンン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、 ３−メチルシト７ン、５−メチルシトシン、Ｒ６−メチルアデニン、７−メチル グアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２− チオウラシル、ベーターＤ−マンノンル牛ユーオシン、５−メトキシカルボニル メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｒ６−イソベンテニ ルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ 酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオンン、２−チオシ トシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラノル、４−チオウラシル 、５−メチルウラノル、ウランルー５−オキ／酢酸メチルエステル、ウランルー ５−オキシ酢酸（Ｖ）、ワイブトキソ７ン、プソイドウラシル、キ二−オンン、 ２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、３−（ ３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｅｐ３顧　およ び２．６−ジアミツプリン。

これら塩基の改変は、得られるオリコマ−の安定性および配列のハイブリッド形 成能力の両方に影響を与えるため、多くの場合、特定のオリゴマーにおいてこの ような置換は限られた数だけ行うことが望ましい。しがし、１つのオリゴマー全 体が、類似化合物を含むヌクレオチド残基よりなり得るような場合がある。例え ば、ウリジンのＤＮＡポリマーおよび５−ブロモウリジンのオリゴマー、ならび に５−メチルンチジンは、治療および診断において有用であることが示されてい る。

当該分野の従事者には明らかなように、従来のまたは改変された塩基形態のいず れがを含有するオリゴマーの設計は、得られるモノマーの特性が所望の範囲内と なるように実際的なアプローチにより行わねばならない。従って、ある場合には 、式（２）の配列のｒＢＪとして示される塩基のうち類似化合物塩基により置換 されるのは、１０％以下、好ましくは５％以下、さらに好ましくは１％以下であ り、また最も好ましいのは全く置換されないことである。しがし、他の場合には 、類似化合物により完全に置換されるのが望ましい。

同じことが、アルキルまたはアリル非複素環などの非官能置換基の塩基への置換 にも適用される。しがし、このような置換の許容範囲は、例えば、オリゴマーの 官能性を実際に破壊せずに、塩基約２０に対して１つの残基など、非常に限定さ れ得る。このような置換を行うことに特別の利点があるようにはみえない。また この置換は、単に、置換しても分子の残りの官能性により圧倒され得るがゆえに 許容される。

’＋Ｖ＋　ＷａＴ’示される置換基ハＨ，ＰＯ３−２、（ＰＯ３）、−２、保護 基、または結合水酸基に反応する基であり得る。

Ｗの前後関係における「保護基」は、化学反応、典型的には連続した結合ヌクレ オチドへの反応において結合する一〇Ｈの反応性を妨げ、また反応が完了すると 除去され得る置換基である。本発明の化合物の典型的な保護基としては、４．４ ゛−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）　、４−モノメトキシトリチル、およびトリ チルが含まれる。

「結合ヒドロキシルに反応する基」は５°および３°ヒドロキシルの間のインタ ーヌクレオチド結合の形成における中間的な残基である。従って、該基が隣接し たヌクレオチドの適切な−ＯＨと反応すると、ヌクレオチド結合残基Ｚが得られ る。

Ｚにより表される結合残基は、典型的には自然に生じるオリゴヌクレオチドにお けるＰ（０）Ｏ−であるが、またＰ（０）Ｓ、　Ｐ（０）ＮＲ２、Ｐ（０）Ｌ　 またはＰ　（０）　ＯＲ’であり得、もしくはＣＯまたはＣＮ［１２であり得る 。ここで、ＲはＨまたはアルキル（１−６Ｃ）、およびＲｏはアルキル（１−６ Ｃ）であり、または−ＣＸ２−であり得る。ここで各Ｘは個別に電子吸引置換基 である。これは本出願と同日に提出され同譲受人に譲渡された同時継続出願、代 理人参照番号第４６１０−０００５号にて述べられており、該出願は本明細書に おいて参考として援用されている。一般に、Ｚはヌクレオチド残基と共役してオ リゴヌクレオチドを形成するために従来使用されるヌクレオチド結合部分であり 得る。

Ｙ（追加置換基に共有結合されるときはＹ’）により表されるリンカ一部分は、 所望する置換基をモノマーまたはオリゴマーに接着させるために使用される二価 架橋残基である。１ノンカーは単に結合メチレン基、すなわち−（ＣＨ２）ｎ− であり得、またはへテロ原子および官能基、例えば−ＣＨ２０Ｃ１（２ＣＨ２０ −１または−ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−１または−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２０− であり得る。ｌノンカー残基はまた、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ｌＬ、！こより市販されているヘテロおよびホモ三官能 性リンカ−などの市販の二官能性リンカ−由来の残基でもあり得る。

Ｙにより表される「薬剤残基」は、ＤＮＡ−ＤＮＡまた（′！ＤＮＡ−ＲＮＡ２ 重らせんの小溝へのインターカレーシコンすなわち挿入が可能な、またはオリゴ ヌクレオチド開裂を行い得る薬剤などの、オリゴマーとの共役にお（Ｘで有用な 薬剤の接着部位である。このような薬剤の例は以下（こ示される。

「ラベル残基」とは、放射性同位体、蛍光体、発色団、酵素などを含有する部分 などのラベルの接着部位である。このようなラベルは、このオリゴマーを診断に て使用する場合（こは望ましいものであり得る。

「特性に影響を与える」残基とは、その存在により第１ノゴマーの特性が変化す る残基である。このような特性の変イヒ（こは、細胞浸透特性の向上、オリゴマ ーがオリコ′ヌクレオチド配列ヘハイブリダイゼー／：Ｉン化、さもな（ｉｆこ れに結合する能力の向上、およびヌクレアーゼへの安定性の向上刃ぐ含まれるが 、これらに限定されない。

ｐｌ＋が中性のとき負に帯電する基を含有する本発明の化合物はその塩として調 製され得る。塩は、ＮａＯＨ，ＫＯＨｌまたはＣａ（ＯＨ）２などの無機塩基、 またはカフェイン、様々なアルキルアミン、ＴＥＡ、およびＤＢＵなどの有機塩 基から形成される。

ｐＨが中性のとき正に蓄電する基を含有する本発明の化合物はＨＣＩ、Ｈ２ＳＯ ４、またＨ３ＳＯａなどの無機酸から、または酢酸、琥珀酸、くえん酸などの有 機酸から形成される酸添加の塩として調製され得る。

従って、ヌクレオチドおよびこれに対応するオリゴヌクレオチドは、これらが存 在するときのｐＨまたは調製されるときのｐ）Ｉにより塩として存在し得る。こ れらの分子に関連するホスフェートおよびホスホジエステル部分においては、ナ トリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオンなどの無機イオンである が、特にカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンなどの２価イオンから形成 されるものなどの塩基性塩の形成が可能である。これらの物質の塩を、有機アミ ンまたは複素環などの有機塩基と共に形成することは可能であるが一般的ではな い。

本発明の化合物が従来の化合物と異なる点は、２°部位において、いずれかのキ ラリティーで、ヌクレアーゼに安定性を与え、必要に応じて、薬剤、例えば、小 溝において２本鎖ＤＮＡと相互作用するのに効果的である試薬を送達する能力を 提供し、ラベルを提供し、またはいくらかの付加特性を提供する置換基を持つこ とである。式（２）の分子の残りは便宜上、元のオリゴヌクレオチドの特徴を持 つものとして示されることがあり、実際、これが最も好適な実施態様であること が多い一方で、本発明の２°延長部分と置換基を含有するが、またホスホジエス テル結合の１つまたはそれ以上が、例えばホスホロチオエートまたはメチルホス ホネート結合、およびモルホリゾートなどの有機アミ／置換基を含有するものを 含むホスホールアミデート結合に置換すること、すべてのベータアノマーがアル ファーアノマーにより置換されること、および５°および３°末端で保護基また はホスフェート残基の有無などの付加的な改変をも包含する分子もまた本発明の 範囲内に含まれる。

本発明は、２°部位におけるいくつかの一般的なカテゴリーの置換基を開示する 。これらの置換基は、０、Ｓ、Ｒ１およびＣＲ２から選択される置換基を通して ２°炭素へ結合するタイプが共通である。ここで各Ｒは個別に選択される。すべ ての実施態様において、Ｘ−Ｙはヌクレアーゼによりオリゴマー中に含まれる置 換基であり、この存在により、該オリゴマーの開裂を阻害し得る置換基を表す。

本発明のオリゴマー中スべてはヌクレアーゼに対して比較的安定している。

ヌクレアーゼに対するオリゴマーの安定性の測定には、便利ないかなるアッセイ 検定法をも使用し得るが、以下に示すヘビ毒検定法を使用して評価すると便利で ある。このアッセイ検定法は次のように行われる。アッセイバッファーは１１０ ０ｕ／ＭｇＣ１ｚを含有するｐＨ８，０，０，５ＭのＴｒｉｓ　）ＩｃＩである 。Ｃｒｏａｔａｌｕｓ　ｄｕｒｉｓｓｕｓから単離される市販のホスホジェステ ラーゼは、比活性が約１．２Ｕ／＋ｇでｐＨ６のグリセロール中の５０％（ｖ／ ｖ）溶液としてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手される。ホス ホジェステラーゼ含有溶液Ｌｕｌを１００　ｕｌバ・ノファーに添加して、オリ ゴマー０．１５０Ｄを上述のように調製された１００　ｕｌのバッファー／ヘビ 毒溶液内で元に戻すことによりオリゴマーの試験を行う。ＨＰＬＣにおけるその 特性保持時間でのオリゴマーの２６０　ｎｍ吸収が消滅するのを観察し、また分 解生成物の出現を測定することにより分解が監視される。

２°置換基を含有する少なくとも１つのヌクレオチド残基を含有する本発明のオ リゴマーは、本発明の化合物の置換部位の代わりに、非置換の２°位置を含有す る対応するオリゴマーより、前述のアッセイ検定法による判定によれば、ヌクレ アーゼに対してより安定している。ヘビ毒アッセイ検定法における本発明の化合 物との加水分解の速度を、２°部位において誘導体化されない対応するオリゴマ ーの速度と比較することにより、２゛置換基の存在がヌクレアーゼによる開裂に 対してオリゴマーを安定化したかどうかが評価され得る。

Ｙの典型的な実施態様は、その唯一の機能がオリゴマーの特性を変えることであ るとき、−０Ｈ１−〇、カルボキシル基、ハロ基、アミ７基などのような非干渉 置換基により置換され得、またはされ得ないアルキルまたはアルケニル（２−２ ０Ｃ）、好ましくは２−６Ｃ，アリルまたは置換アリル（６−２０Ｃ）、式５ｉ Ｒ３（各Ｒは２−６Ｃのアルキル）の様々なアルキルノリル誘導体、およびヘテ ロ原子を同様に含有する類似の置換基を含有する。Ｙがリンカ一部分を含有する 場合は、Ｙ　（Ｙ’）のこの部分は付加物質に共役するための官能基を提供する 。例えば、１−２０ＣのＹｏの実施態様は、水酸基、アミ７基、メルカプチル基 、カルボキン基、ケト基、または池の官能基またはこれらのいくつかの組合せを 含有する。典型的な例としては、−ＣＨ２ＣＯＯＨ，−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−Ｃ ＨｚＣＯＯＥｔ、−ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２などが含まれる。

リンカ一部分はヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴマー内の残基を、２ 本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡの小溝と相互作用するものとして知られる薬剤 などの試薬または薬剤に結合させるために利用され得る。これらの試薬および物 質は幅広い種類が知られており、インビボにおける機能は一般には、これら試薬 が相互作用するＤＮＡ２本鎖を不活性にすることである。このような試薬の典型 的な例としては、ネトロブンンおよびその誘導体、アントラマイシン、牛ノクサ リン抗生物質、アントラマイシン、ピロロ（１−４）ベンゾジアゼピン誘導体お よびインターカレーティング剤が含まれる。

小溝を捜す薬剤以外の池の薬剤もまた使用され得る。インターカレーター、ト牛 シン、分解誘導物質などもまた使用され得る。さらに、薬剤はリンカ一部分を通 して結合される必要はなく、特定の薬剤の化学的性質により置換基Ｘに直接結合 され得る。

Ｙの別の実施態様はラベルを表す。これは、必要に応じてリンカ一部分を通して Ｘに結合されるが、これもまた特定の場合には同様に化学的性質により直接接着 され得る。適切なラヘルトシては、放射性同位体、フルオロセイン（ｆｌｕｏｒ ｏｓｃｅｉｎ）およびダンノル（ｄａｎｓｙｌ）などの蛍光標識、発色団、酵素 などが含まれる。幅広い種類のラベルが知られており、本発明のオリゴマーがプ ローブとして、または他の特定の結合診断アッセイ検定法において使用されると き、探知可能性を提供するために使用され得る。

最後に、Ｙは、オリゴマーの特性を変更させる置換基であり得る。薬剤およびラ ベルを含む置換基のすべてがヌクレアーゼの安定性を高めることはすでに述べた 。しかし、付加特性もまた影響を受け得る。例えば、結合したヌクレオチド鎖を 開裂する媒介物が接着され得る。置換基により細胞浸透が増大し得る。または、 Ｙはオリゴマーの相補オリゴヌクレオチドへのまたはＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤ　 Ｎ　Ａ／ＲＮ　Ａらせんへのハイブリダイゼーション化を高め得る。前述のＹの 実施態様すべてにおけるように、活性または特性を変える置換基はＸに直接結合 され得、またはリンカ一部分を通して共役され得る。

Ｂ−ｆＬ！１ｉｊ−１惣１」１毀 ヌクレオシドまたはヌクレオチドである本発明の化合物のいくつかは、２゛部位 にＯＨを持つ対応するヌクレオチドまたはヌクレオシドを、適切な試薬と反応さ せて置換された形帖に変換させることにより調製される。ある場合には、２°置 換基はヌクレオシドまたはヌクレオチドの環状形態に由来し得る。オリゴマーに 封入するためヌクレオチドまたはヌクレオシドを活性化するには、以下に示すよ うに、さらに変換を必要とし得る。これら変換の技法は、当該分野では一般に、 オリゴマーの連続合成の技法として理解されている。

特に、ヌクレアーゼの活性に及ぼす２゛置換基の効果を評価するために、ダイマ ーが合成され得る。ダイマーの形成において、５°部位で保護され、３′部位で 結合水酸基に反応する基を含有する本発明の変換ヌクレオシドまたはヌクレオチ ドは、例えば、３′部位で固形支持体に結合したチミジンまたはシチジンと反応 し、得られるダイマーは支持体から開裂され非保護状態となる。

前述のすべての場合において、２゛置換基の官能性および特質を変える変換は、 モノマーまたはオリゴマーのレベルのいずれかで行われ得る。従って、Ｘ−Ｙの 式０ＣＨ２ＣＯＯＥｔを持つ２゛置換基は、エステルが単一のヌクレオノドまた はヌクレオチドの、ダイマーの、またはオリゴマー鎖に含まれる置換基のいずれ かであるとき、置換基は遊離酸またはアミドである実施態様に変換され得る。

オリゴマーである本発明の化合物は、誘導体化ヌクレオチドまたはヌクレオシド を、標準固相オリゴヌクレオチド合成技法を使用してオリゴマーに封入すること により得られるＯこのような技法は、標準ホスホジエステル結合、および上述の 従来め置換結合の両方の形成に対して商業用に利用可能である。

Ｃ９塾月」１」ｄえ昼 本発明の化合物はヌクレアーゼ阻害の、特異的に相補または結合するオリゴマー に対して、当該分野で既知の方法で利用される。上述のように、これらの化合物 を利用する一般的な方法は既知であり、特定の病気または状態への適用は、適切 な結合特異性を突きとめることに依存する。この結合特異性の決定は、本発明の 改変化合物の調製または適用の方法に影響を与えない。

従って、本発明の改変オリゴマーは治療、診断および研究の関係において有用で ある。治療への適用においては、オリゴマーは一般に、アンチセンス治療に対し て適切な方法で利用される。上述のように、本明細書にて使用されるアンチセン ス治療とは、相補を通じて、または例えばＤＮＡ２重らせんの大溝の配列特異的 な配向などの他の特異的な結合手段、または他の特異的な結合モードを通じて特 定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列をターゲットとすることを含む。このような治療の 場合は、本発明のオリゴマーは、全身投与および部分的すなわち局部投与を含む 様々な投与モードに対して処方され得る。技法および処方については一般に、Ｒ ｅｍ１ｎ　ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　 Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ最新版にて見 いだされ得る。

全身投与の場合、筋肉、静脈、１夏腔、および皮下を含む注射が好適である。注 射の場合、本発明のオリゴマーは溶液で、好ましくは、ハング氏液（Ｈａｎｋ’ ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）またはリンガ−氏族などの生理的に適合性のあるバッフ ァーで処方される。

さらに、オリゴマーは固体の影響で処方され得、使用直前に再溶解またはり濁さ れ得る。凍結乾燥形態もまた含まれる。

全身投与はまた経粘膜または経皮手段によっても行われ得る。または化合物は経 口投与され得る。経粘膜または経皮投与の場合は、浸透すべきバリヤーに適した 浸透剤が処方に使用される。このような浸透剤は一般に当該分野において既知で あり、例えば、経粘膜投与の場合は胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。さ らに、浸透を容易にするために、洗浄剤を使用し得る。経粘膜投与は、例えば鼻 からのスプレーを通して、または座薬を使用して行われ得る。経口投与の場合は 、オリゴマーは、カプセル、錠剤、および強壮剤などの従来の経口投与の形態へ と処方される。

局部投与の場合は、本発明のオリゴマーは、一般に当該分野において既知の、軟 膏、膏薬、ゲル、またはクリームに処方される。

治療用途に加えて、本発明のオリゴマーは、特異的に結合する夕・−ゲットＤＮ ＡまたはＲＮＡ配列の有無を検出する診断試薬として使用され得る。このような 診断試験は、次に従来の手段により検出される塩基十目補性または３重らせん形 成を介するハイブリタイゼーションにより行われる。例えば、オリゴマーは放射 線、蛍光または色素ラベルを使用してラベル化され、固体支持体に結合したラベ ルの存在が検出され得る。もしくは、２重または３重らせんの存在は、これらの 形態を特異的に認識する抗体により検出され得る。このようなオリゴマーをプロ ーブとして使用してアッセイ検定法を行う手段は一般的に既知である。

上述の用途に加えて、遺伝子発現を阻害するオリゴマーの能力は、組替えシステ ムにおける発現レベルを測定することにより、インビトロのシステムにおいて立 証され得る。

本発明の特異的に結合するオリゴマーがターゲラ）ＲＮＡまたはＤＮＡの活性と 干渉しまたはこれを阻害するメカニズムはいつでも確立されるわけではなく、ま た本発明の一部ではない。例えば、オリゴマーがターゲットｍＲＮＡを捜す場合 は、翻訳は阻害され得る。さらに、ターゲットを結合することにより、ｍＲＮＡ メツセージの分解が高まる。またはＲＮＡの次のプロセッシングが阻害され得る 。３重らせんの形成により、対象ＤＮＡの転写または複製が阻害され得、さらに 、感染性ＲＮＡの逆転写または感染ＤＮＡの複製が干渉される。また、免疫機能 が、例えば「アムプリゲン（ａａ＋ｐｌｉｇｅｎ）」システムにより例証される ような２本鎖ＲＮＡにより誘導されるものに類似した、または全身性紅斑性狼癒 を抑制するために使用されるものに類似した生理的メカニズムを通して調節され 得ると考えられる。本発明のオリゴマーの特徴は、ターゲットするメカニズムま たはその効果のメカニズムに関係なく、特定のオリゴヌクレオチド配列をターゲ ットする能力である。

最後に、オリゴヌクレオチドは、インターカレーター、キレート化剤、脂肪親和 基、ラベル、または基幹のオリゴマー的特質を改変はするが著しく破壊すること はない他の置換基を含む様々な部分に改変され得る。

以下の実施例は本発明を説明するものであって、これを制限するためのものでは ない。すべての合成反応において、乾燥アルゴン雰囲気が使用された。

（以下余白） 実施例１ ヌクレオチドおよびオリゴマーの調製 （Ａ＝ＮＨＡｃ） 以下のように、２°−Ｎ−アセトアミノウリジンを５−位において保護し、オリ ゴマー中の残基を共役させるポスポジエステルリンケージを形成するために、３ −位を反応性とした。

１’−Ｎ−７＞ｔｌｔ７　ｉ　／　’７　’Ｊ　’；ヱ、２５１のＭｅＯＨ中ノ １５２ｍｇノ２−Ｎ−アシルアミノ−３°、５−ｏ−ジアシルウリジン（Ｖｅｒ ｈｅｙｄｅｎｓ　Ｊ、Ｐ、Ｈら、Ｏｒｇ　Ｃｈｅｗ　（１９７１）　３５：２５ ０−２５４）（０，４１１ｍｍｏｌ）に、ＫＣＮをその触媒作用が得られる量だ け加えた。１５時間後に、１、　ＯＯｇのシリカゲルを加えて、反応物を濃縮し た。ＣＨｓ　ＣＮ９０５％（７）Ｈ２Ｏで平衡状態とした２ｈａ＋のシリカゲル のカラムノ上端に、この粉末を加えた。標準フラッシュクロマトグラフィー条件 （Ｓｔｉｌｌ、　Ｗ、Ｃ，ら、Ｌ虹り堕競（１９７ｇ）　４３：２９２３−２９ ２５）を用いて、カラムをＣＨ３ＣＮ中の５％のＨ２０で溶出した。

この生成物を単離し、濃縮することによって、５９．５＋ｓｇ（収量５０．８％ ）の生成物を得た。

２−Ｎ−アシルアミ７−５−ｏ−４４−ジメトキントリチルーウリジン、２．５ ｍｌの乾燥ピリジン（乾燥ピリジンがら最初に濃縮）中の５９．５ｏ＋ｇ（７） ２−Ｎ−７シルア　ミ／　ウ’）シフ　（０，２０８ｍｍ。

１）ニ、７７、６＋ｓｇ　（０，２２９ｇｍｏｌ、１．１０当量）の４．４−ジ メトキシトリチルクロライドを加えた。反応物を室温で１５時間攪拌した後に、 ３．０ｍｌのＨ２Ｏで希釈した。この混合物をＨ２ＯおよびＥｔ２０に分配し、 振り混ぜて、分離した。水性層をＥｔ２０で抽出し、混合有機物を１％の水性Ｎ ａＨＣＯａで洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯａ）Ｌ、濾過し、そして濃縮した。残留 物を２０ｍｍのカラム上でフラッシュクロマトグラフイーにより精製した。

その際には、最初に１カラム量のＣＨ２Ｃｌ２を、次に８％ＭｅＯＨジクロロメ タン（ＣＨ２Ｃ１２）溶液を溶離剤として使用した。単離および濃縮を行うこと によって、７０．７ｍｇの生成物（収量５６．６％）を無色泡沫として得た。

２−Ｎ−アシルアミノ−５゛−〇−（４，４−ジメトキシトリチル−ウリジン− ３−イルーヒドロゲンホスホネートトリエチルアンモニウム塩、２．４０ｍ１の 乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中に溶解した１３２ＩＩ＋ｇの１、２．４−１−リアゾール（ １，９１ｍｍｏｌ）と０．４７６ｍ１の無水４−メチルモルホリン（４，３３＋ ｇｍｏｌ）との混合物に、０．２３６ｍ１の２．０ＭのＰｃｔ３ジクｏｏメタン （ＣＨ２Ｃ１２）溶液（０，４７２ｍｍｏｌ）を加えた。

次いでこの混合物を氷−水浴上で３０分間冷却した。この混合物に、０．５２３ ａ＋１の乾燥ピリジン中に７０．７ｍｇの２゛−Ｎ−アシルアミノ−５−０−（ ４，４−ジメトキシトリチル）−ウリジン（０，１８８＋ａｍｏｌ、乾燥ピリジ ノから予め濃縮）を溶解した溶液を、数分間に渡って適加した。この反応物を２ ０分間攪拌した後に、１６．８ｍｌのＩＭの低温水性トリエチルアンモニウムバ イカーボネート（ＴＥＡＢ、ｐＨ＝９．０）上に流し込んだ。この混合物を１５ 分間急速に撹拌した後に、２　ｘ　１７　ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。この 混合有機物を１１．７ｍｌのＩＭの水性ＴＥＡＢで洗浄し、乾燥しくＮａ２５Ｏ ４）、濾過し、そして濃縮した。残留物を２０ｍｍのカラム上でフラノンニクロ マトグラフイーによって精特表平５−５０４５５２　（９） 製した。その際には、１カラム量の１％ＴＥＡジクロロメタン（ＣＨ２Ｃ１２） 溶液、１カラム量の１％Ｔ　Ｅ　Ａおよび２．５％ＭｅＯＨジクｏｏｊ９ン（Ｃ Ｈ２Ｃ１２）溶液、並びに１％ＴＥＡおよび１０％ＭｅＯＨジクロロメタン（Ｃ Ｈ２Ｃ１２）溶液を、順に使用した。生成物を単離し、濃縮した。残留物をＣＨ ２Ｃｌ　２およびＩＭの水性ＴＥＡＢに分配し、振り混ぜて、分離した。

有機物層を乾燥しくＮ　ａ　２Ｓ　Ｏａ）、濾過し、そして濃縮した。

生成物を乾燥ＣＨａＣＮから濃縮して、４１．９ｍｇ（収量４３．６％）の生成 物をやや黄色を帯びた泡沫として得た。

得られた表題の化合物を、Ｐｒｏｅｈ　ｌｅｒ、　Ｂ、　Ｃ，らのＮｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｅｉｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８６）　１４．５３９９−５４０７に記載の方 法を用いてオリゴマー中に連結させた。

夾ｌ五主 ２．２゛−アンハイドロ−（１−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）シトシン−ＨＣ Ｉ（環式ヌクレオシド）から、チオフェノールを用いて適切な処理をすることに よって、２’−３−フェニルシチジンを調製した。以下のように、シトシンの− ＮＨ２および５′−ヒドロキシを保護し、３−ＯＨを活性化した。

２°−８−フェニルチオシチジン、５ｏＩＩｌｌの乾燥ＤＭＦおよび１゜８６＋ ａｌの乾燥Ｔ　Ｅ　Ａ　（１３，３ｍｍｏｌ）中に５００ｍｇ　（１，９１ｍｍ ｏｌ）の２．２°−アンハイドロ−（１−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）−シト シン塩酸塩（Ｓｉｇｍａより購入）を溶解した溶液に、０．９８０ｍ１　（９， ５４１１１＋ａｏ１．５．０当量）のチオフェノール（ｔｈｉｐｈｅｎｏ　ｌ） を加えた。反応物を５時間攪拌した後に、濃縮した。残留物をＭｅＯＨから２． ＯＱｇのシリカゲル上に濃縮した。粉末を、ＣＨ２Ｃｌ２で平衡状態にした３０ ｍｍのシリカゲルのカラムの上端に加えた。次いで、１カラム量のＣＨ２Ｃｌ２ ．１カラム量の６．２５％Ｍ　ｅ　ＯＨジクｏｏメタ７（ＣＨ２Ｃ１２）溶液、 １カラム量の１２．５％Ｍｅ○Ｈジクｏｏメタン（ＣＨ２Ｃ１２）溶液、および ２５％Ｍ　ｅ　ＯＨジクロロメタン（ＣＨ２ＣＩ２）溶液を順に用いてカラムを 溶出した。生成物画分を濃縮することによって、５２９ｍｇ　（収量８２．５％ ）の生成物を無色に近いオイルとして得た。

Ｎ４−ベンゾイル−２−Ｓ−フェニルチオシチジン　ｈｅｌｔｈｌＯ勉」オ且ｙ Ｄ−，過渡保護の方法（Ｔｉ、　Ｇ、Ｓ、ら、Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｗ　５ｏｃ（１ ９８２）　１０４：１３１５−１３１９）を用いて、表題の化合物を調製した。

１２１ｍ１の乾燥ピリジン中の４２９ｍｇ　（１，２３ｍｍｏｌ）の２−３−フ ェニルチオシチジン（乾燥ピリジンから最初に濃縮）を氷−水浴上で冷却してお いて、これに０．８３２ｍ１　（６，５６ｍｍｏｌ）のりｏｏトリメチル／う７ 　（ｃｈｌｏｒｏｔｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ）を加えた。反応物を１５分間 撹拌し、次いで０．７６７ｍ１　（６，６１ｍｍｏｌ）の塩化ベンゾイルを加え た。水浴を除去して、撹拌を２５時間続けた。反応物を再び水−水浴上で冷却し 、２．５６ｍ１のＩ２０を加えた。反応物を５分間撹拌し、次いで２．５６ｍ１ の濃縮した水性Ｎ　Ｈａ　ＯＨを加えた。攪拌を３０分間続けた後に、混合物を Ｅ　ｔＯＡｃおよびＩ２０に分配し、振り混ぜて、分離した。水性層をＥｔＯＡ ｃで抽出して、混合有機物をＩ２０で洗浄し、乾燥しくＮａ２Ｓ０４）、濾過し 、そして濃縮した。残留物を３０＋ａｍのカラム上でフラッシュクロマトグラフ ィーによって精製した。その際には、１カラム量のＣＨ２Ｃｌ２を、次に５％Ｍ ｅＯＨジクロロメタン（ＣＨ２Ｃ１２）溶液を溶離剤として使用した。生成物画 分を濃縮することによって１３８ｍｇ　（収量３２．２％）の生成物をオシチジ ン、２．００ｍ１の乾燥ピリジン中の１３８ｍｇ　（０，３１４ｍｍｏｌ）のＮ ４−ベンゾイル−２−Ｓ−フェニルチオシチジン（乾燥ピリジンから最初に濃縮 ）に、１２８ｍｇ（０，３７７ｍｍｏｌ、１．２当量）の４，４°−ジメトキシ トリチルクロライドを加えた。反応物を室温で１８時間攪拌し、その後に２．　 （ｌｏｍｌのＩ２０で希釈した。混合物をＥｔ２ｏおよびＩ２０に分配し、振り 混ぜて分離した。水性層をＥｔ２ｏで抽出し、混合有機物を１％の水性Ｎ　ａ　 ＨＣＯ３で洗浄し、乾燥しくＮａ２Ｓ○４）、濾過し、そして濃縮した。粗生成 物を３０ｍｏ＋のカラム上でフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。

その際には、１カラム量のＣＨ２Ｃｌ２．２．５％ＭｅＯＨジクｏｏメタン（Ｃ Ｈ２Ｃ１２）溶液、および５％ＭｅＯＨジクロロメタン（ＣＨ２ＣＩ２）溶液を 、溶離剤として順に使用した。生成物画分を濃縮することによって、２０６ＩＩ １ｇ（収量８８．４％）の生成物を得た。

５°−〇−４４−ジメトキシトリチル　Ｄｉｍｅｊｈ　ＯＸ　ｔｒｉｔ　１−２ ’−３−フェニルチオ／チジンー３−イルーヒドロゲンホスホ不−トトリエチル アンモニウム塩、このヒドロゲンホスホ不一トの１Ｍ製は、２０ｆｌ＋ｓｇ（０ ，２７８＋＊＋ｍｏｌ）の５−０−　（４，４°−ジメトキシトリチル）−２− Ｓ−フェニルチオシチジンを使用したこと、および各試薬を０．２７８ｍ１ｏｌ を基準に調整したこと以外は、上記と同じ方法で行った。ＴＥＡＢを用いた処理 の後に、有機物を１Ｍの水性ＴＥＡＢで洗浄し、乾燥しくＮａ２Ｓ○４）、濾過 し、そして濃縮した。残留物を３０ｗｍのカラム上で精製した。

その際には、１カラム量の２％Ｔ　Ｅ　Ａジクロロメタン（ＣＨ２Ｃ１２）溶液 、２％ＴＥＡおよび５％ＭｅＯＨジクｏｏメタン（ＣＨ２Ｃ１２）溶液、並びに ２％ＴＥＡおよび１０％ＭｅＯＨジクｏｏメタン（ＣＨ２Ｃ１２）溶液を、溶離 剤として順に使用した。生成物画分を濃縮して泡沫とし、この泡沫をＣＨ２Ｃｌ ２およびＩＭの水性ＴＥＡＢに分配し、振り混ぜて、分離した。有機物層を乾燥 しくＮａ２５Ｏｉ）、濾過し、そして濃縮した。生成物を乾燥ＣＨ３ＣＮから濃 縮して、１６５＊ｇ　（収ｊｉ６５．５％）の生成物を泡沫として得た。

ｉｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８６）　＋４：５３９９−５４０７に記載の方法を用い てオリゴマー中に連結した。

Ｋ立五立 ヌクレオチドおよびオリゴマーの−１ Ａ、Ａノ二−９工」ムゴ］と立Ｅｔと ２−誘導化されたヌクレオチドを、Ｎ４−ベンゾイル−３°、５−０−（テトラ イソプロピルジシロキサン−１，３−’；イル）−シチジンから、エチルヨード アセテートとの反応並びに２°および５゜ヒドロキシルの脱保護によって調製し た。５゛位を保護し、３゜位を結合水酸基に対して反応性を有する基に転換した 。

ＮＪ−ベンゾイル−２’−０−（エトキンカルボニルメチル　ｅｔ胚■」二二■ Ｕ止ユとニー辷匹ヨユヱユｊヱ工ユ○Ｌ肛乞Ｚヱ旦牛サン−１３−ジイル　−シ チジン、この化合物の調製では、２゜−ＯＭｅ　（Ｉｎｏｕｅ、Ｈら、Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃｉ　ｓ　Ｒｅｓ　（１９８７）　１５：６１３１−６１４９）の調 製に用いられる反応と類似の反応を使用した。２５０ｍｇのＮ４−ベンゾイル− ３°、５’−０−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−シチ ジン（ＭａｒｋｉｅｖｉｃｚＳＷ、Ｊ、、ム江ｅｍ　Ｒｅｓ　（１９７９）　１ ８１−１９６）　（０，４２４ａ＋ｌｌ１ｏｌ；ベンゼンから最初に濃縮）に、 １．ＯＯ＋１　（８，４５ｍｍｏｌ、　１９．ｇ当１りのエチルヨードアセテー トを加え、次いで２９４ｍｇのＡｇ２０（１，２７ｍｍｏＬ　２．９ｇ当量）を 加えた。混合物を急速に攪拌し、４２℃で３２時間加熱し、次いでこれを濾過し 、濃縮した。残留物をＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、Ｈ２Ｓで処理し、そして濃縮し た。暗色の残留物を２５ｍｍのカラム上でフラッシュクロマトグラフィーによっ て精製した。その際には、１カラム量のＣＨ２Ｃｌ２．１カラム量の２゜５％Ｍ 　ｅ　ＯＨジクｏｏメタン（ＣＨ２Ｃ１２）溶液、およびＳ％ＭｅＯＨジクロロ メタン（ＣＨ２ＣＩ２）溶液を、順に溶離剤として使用した。生成物画分を濃縮 することにより、２７０ｍｇ　（収量９４．４％）の生成物を泡沫として得た。

Ｎ４−ベンゾイル−２°−〇−エトキシカルボニルメチル　−シチジン、１．７ （１ｍｌのＴ）（Ｆ中の１７０ｍｇのＮ４−ベンゾイル−２゛−○−（エトキシ カルボニルメチル）　−３゛、ｓ−ｏ　−（テトライソプロｔ”ルシシｏ＋＋ン ー１．３−ジイル）−シチジ７　（０，２５２ｍｍｏｌ）に、０、１２６ｍ１の 、テトラブチルアンモニウムフルオライドの１．ＯＭのＴ　ＨＦ　（０，１２６ ｍｍｏｌ、０．５０当量）溶液を加えた。反応物を室温で７０分間攪拌した。次 いで、ピリジン／　Ｅ　ｔ　ＯＨ／　Ｈ２０を３　／　１　／　１　（ｖ　／　 ｖ　／　ｖ　）の割合で混合した３、　４ｍｌの溶液を加えて、５分間攪拌を続 けた。その後に、約１０１１１１のアン／　（−リストＡ−２１（Ａｍｂｅｒｌ ｙｓｔ　Ａ−２１）イオン交換樹脂（ピリジニウム形）を加え、５分間攪拌を続 けた。混合物を濾過し、樹脂をＥｔＯＨで洗浄した。混合濾液を濃縮した。次い で残留物をＥｔＯＨから１．００ｇのンリカゲル上に濃縮した。この粉末を、Ｃ Ｈ２Ｃｌ２と平衡状態にした２５１ＩＩｌのシリカゲルのカラム上に載置した。

１カラム量のＣＨ２Ｃｌ２．１カラム量の２．５％ＭｅＯＨジクロロメタン（Ｃ Ｈ２Ｃ１２）溶液、および５％ＭｅＯＨジクロロメタン（ＣＨ２Ｃ１２）溶液を 順に使用してカラムを溶出した。生成物画分を濃縮することによって、４０．１ ｒｒｒｇ　（収量３７６％）の生成物をオイルとして得た。

Ｎ′−ベンゾイル−５°−○−４４°−ジメトキシトリチル　−２−０−（エト キンカルボニルメチル）−シチジン、１．００ｍ１の乾燥ピリジン中の４０．７ ＢのＮ４−ベンゾイル−２−０−（エトキシカルボニルメチル）−シチジン（０ ，０９３９■ｏｌ、乾燥ピリジンから最初に濃縮）に、３８．３ｍｇの４．４゛ −ジメトキシトリチルクロライド（０，１１３＋ｉｍｏｌ、１．２当量）を加え た。反応物を室温で２０時間攪拌し、次いで０．５０＋ｘｌの８２０で希釈した 。混合物をＥｔ２０およびＨ２Ｏに分配し、振り混ぜて、分離した。水性層をＥ ｔ２○で抽出した。混合有機物を１％の水性ＮａＨＣＯ３で洗浄し、乾燥しくＮ ａ２Ｓ○４）、濾過し、そして濃縮した。残留物を２０ＩＩ１ｍのカラム上でフ ラッシュクロマトグラフィーによって精製した。その際には、１カラム貢のＣＨ ２Ｃｌ２．２．５％ＭｅＯＨジクｃｏメタ７（ＣＨ２ＣＩ２）溶液、および５， ０％Ｍ　ｅ　ＯＨジクロロメタン（ＣＨ２ＣＩ２）溶液を順に溶離剤として使用 した。生成物画分を濃縮することにより、５５．２ｍｇ（収ｊ１７９．９％）の 生成物を得た。

Ｎ′−ベンゾイル−５−０−（５，５’−ジメトキシトリチル　−２゛−０−エ トキンカルボニルメチル　−フチジン−３°−イルーヒドロゲンホスホネートト リエチルアンモニウム　、この化合物の調製は、５５．２ｍｇ　（０，０７５０ ｍｍｏｌ）のＮ４−ベンゾイル−５°−０−（４，４−ジメトキシトリチル）− ２’−０−（エトキシカルボニルメチル）−シチジンを使用したこと、および各 試薬を０．０７５０ｍｍｏｌを基準に調整したこと以外は、上記のヒドロゲンホ スホネートの調製と同じ方法で行った。ＴＥＡＢを用いた処理の後に、有機物層 をＩＭの水性ＴＥＡＢで洗浄し、乾燥しくＮａ２５Ｏ４）、濾過し、そして濃縮 した。残留物を２５℃１ｍｌのカラム上でフラッシュクロマトグラフィーによっ て精製した。その際には、１カラム量の１ｚＴＥＡアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ ）溶液、１カラム量の１％ＴＥＡおよび５％Ｈ２０アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ ）溶液、並びに１％ＴＥＡおよび１０％Ｈ２０アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）溶 液を順に使用した。生成物画分を濃縮することによって泡沫を得た。泡沫をＣＨ ２Ｃｌ２および１Ｍの水性ＴＥＡＢに分配し、振り混ぜて、分離した。有機物を 乾燥しくＮａ２Ｓ○４）、濾過し、そして濃縮した。生成物を乾燥ＣＨ３ＣＮか ら濃縮することによって、２３．８＋ａｇ（収１３５．２％）の生成物を得た。

上記で得られた誘導化された化合物を、上述のようにオリゴマー中に含有させた 。

Ｂ、工人二立旦工Ｌ Ｎａ−ベンゾイル−２゛−〇−エチルー３°５゛−○−テトライソプロピルジシ ロキサン−１，３−ジイル）−シチジンを、エチルヨードアセテートの代わりに ヨードエタンを使用したこと以外はＮａ−ベンゾイル−２−〇−（エトキシカル ボニルメチル）　−３’、５°−〇−（テトライソプロピルジシロキサン（ｔｅ ｔｒａｉｓｏｐｒｏｙｌｄｉｓｉｌｏｘａｎｅ）−１，３−ジイル）−シチジン の場合と同様にして調製した。

次に、表題の化合物をＮａ−ベンゾイル−５−０−（４，４’−ジメトキシトリ チル）−２−０−エチル−／チジンー３−イルーヒドロゲンホスホネートトリエ チルアンモニウム塩に転換した。転換の際ニは、２−０−（エトキシカルボニル メチル）−化合物の場合と同じ工程順序を用いた。さらにこれを上記のようにオ リゴマー中に含有させた。

Ｃ，Ａ＝ＯＣＨＣＨＣＨＣＨ Ｎ４−ベンゾイル−２−０−ブチル−３°、５−０−（テトライソプロピルジシ ロキサン−１３−ジイル　−シチジンを、エチルヨードアセテートの代わりにヨ ードブタンを使用したこと以外はＮａ−ベンゾイル−２−０−（エトキシカルボ ニルメチル）−３°、５°−０−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３− ジイル）−シチジンの場合と同様にして調製した。次いで表題の化合物をＮａ− ベンゾイル−５−０−（４，４−ジメトキシトリチル）−２°−０−ブチル−シ チジン−３−イルーヒドロゲンホスホ不−トトリエチルアンモニウム塩に転換し た。転換の際には、２−０−（エトキシカルボニルメチル）−化合物の場合と同 じ工程順序を用いた。

さらにこれを上記のようにオリゴマー中に含有させた。

チルシリルウリジン−３−イルーヒドロゲンホスホネートＤＢＵ塩、この化合物 は、文献に記載のものとは異なる方法で調製した。この化合物の調製は、４００ ＋ａｇ　（０，６０６ｍｍｏｌ）の５−０−（４，４−ジメトキシトリチル）− ２°−０−１−ブチルジメチルシリルウリジン（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｓ より購入）を使用したこと、および他の条件を０．６０６ｎｍｏｌを基準に調整 したこと以外は上記化合物の場合と同じ方法で行った。ＴＥＡＢを用いた処理の 後に、有機物層を乾燥しくＮａ２５Ｏ４）、濾過し、そして濃縮した。

残留物を３５ｎ＋＋ｓのカラム上でフラッシュクロマトグラフィーによって精製 した。その際には、１カラム量の１％ＴＥＡジクロｏ）９７　（ＣＨ２ＣＩ２） 溶液、１カラム量（７）１％ＴＥＡおよび４％ＭｅＯＨジクｏｏメタン（ＣＨ２ ＣＩ２）溶液、並びに１％ＴＥＡおよび８％Ｍ　ｅ　ＯＨジクロｏメタ７（ＣＨ ２Ｃ１２）溶液を、順に溶離剤として使用した。生成物を単離し、濃縮した。泡 沫をＣＨ２Ｃｌ２およびＩＭの水性１．８−ジアザビンクロ［５，４，０］ウン デク−７−ニンバイカーボネート（ＤＢＵバイカーボネート、ｐＨ＝９．０）に 分配し、振り混ぜて、分離した。再び有機物層をＳＯｍＬのＩＭの水性ＤＢＵバ イカーボネートで洗浄し、乾燥しくＮａ２５Ｏ４）、濾過し、そして濃縮した。

生成物を乾燥ＣＨ３ＣＮから濃縮することによって、４３５ｍｇ　（収ｆｉ８１ ．９％）の生成物をオイルとして得た。得られた誘導体を、標準的方法で合成し たオリゴマー中に含有させた。

Ｋ亘五土 オリゴマー　の２°　基の転 Ａ＝ＯＣＨ２ＣＯＯＥ　ｔ　−０ＣＨ２ＣＯＯＨ＝　０ＣＨ２ＣＯＮＨ２ →ＯＣＨ２Ｃ０ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２Ｎ４−ベンゾイル−５−０−（４，４− ジメトキシトリチル）−２−０−（エトキンカルボニルメチル）−シチジン−３ ゛−イルーヒドロゲンホスホネートトリエチルアンモニウム塩を、ヒドロゲンホ スホ不−ト法を用いてオリゴヌクレオチド中に連結した。

２−ＯＣＨ２Ｃ０２Ｈを生成するために、オリゴを脱保護し、担体から開裂し、 Ｏ，１Ｍ水性ＮａＯＨを用いて４５℃で４５時間に渡って２−○ＣＨ２Ｃ○２Ｅ ｔを加水分解することにより２−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈを形成した。

２−ＯＣＨ２ＣＯＮ　Ｈ２を生成すルタメニ、２°−０ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔを含有 する上記オリゴを脱保護し、担体から開裂し、ＮＨ３のＭｅＯＨ溶液を用いて４ ５°Ｃで２９時間かけて２−ＯＣＨ２Ｃ０２Ｅ　ｔを２−ＯＣＨ２ＣＯＮ　Ｈ２ に転換した。式−０ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２の対応するアミドを同様 にして調整した。

Ｋ１旦ｌ 木全日の化合物のヌクレアーゼ活性に・する、性実施例１で合成した化合物の２ 量体の、ヌクレアーゼ活性に抵抗する能力を測定した。図示した式１の化合物を 、改変されていない付加のチミジンに、標準的な処理手順を用いて連結すること によって、次式の化合物を得た。

Ｈ 得られた２ｆｆｉ体化合物の、ヘビの毒液からのヌクレアーゼに対する安定性を 上記のように調べた。その結果を表１に示す。

（以下余白） Ｌ 二１夜 −Ｘ−Ｙ−Ｚ　Ｓ　後の２　体く％）１００％　解に　した　−−ＯＣＨ２ＣＯ ２Ｈ４０％　４６分 −０ＣＨ２ＣＯＮＨ２５１％　〉４２分−○ＴＢＳ　＞９９％　＞＞１４０分 （１４０分後に７７％の２量体） −ＯＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２１００％　＞＞１４０分（１４０分後に 〉９９％の２量体） 表１に示すように、２−位に置換基を添加すると、得られる２量体のヌクレアー ゼ開裂に対する安定性が大幅に向上する。

国際調査報告

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の式のモノマーであって； ▲数式、化学式、表等があります▼（１）ここで、 Ｂがプリンあるいはピリミジン残基、あるいはそれらのアナログであり； Ｗ１がＨ、ｍが１から３の整数である（ＰＯ３）ｍ−２、保護基、あるいは結合 水酸基に反応する基であり；Ｗ２がＨ、ＰＯ３−２、保護基、あるいは結合水酸 基に反応する基であり； ＸがＯ、Ｓ、それぞれのＲが独立してＨあるいはアルキル（１−６Ｃ）であるＮ ＲあるいはＣＲ２であり；Ｙがリンカー部分、必要に応じてリンカー部分を介し て結合された薬剤残基、必要に応じてリンカー部分を介して結合されたラベル、 あるいは必要に応じてリンカー部分を介して結合された、特性に影響する残基で あって、ここで、該Ｘ−Ｙ置換基が、該（Ｉ）式のモノマーを含有するオリゴマ ーを２位に−Ｈ２あるいは−ＨＯＨを有する対応のヌクレオチドを取り込んだ該 オリゴマーよりもヌクレアーゼ処理に対してより安定にする、モノマー。
2. ２．ＸがＯあるいはＳである、請求項１に記載のモノマー。
3. ３．ＸがＮＲである、請求項１に記載のモノマー。
4. ４．ＸがＣＲ２である、請求項１に記載のモノマー。
5. ５．Ｙが、置換されたあるいは置換されていないアルキル（２−６Ｃ）、および 置換されたあるいは置換されていないアリル（６−２０Ｃ）からなる群から選択 される、ヌクレアーゼを阻害する置換基である、請求項１に記載のモノマー。
6. ６．Ｙが、置換されたあるいは置換されていないアルキル（２−６Ｃ）、および 置換されたあるいは置換されていないアリル（６−２０Ｃ）からなる群から選択 される、ヌクレアーゼを阻害する置換基である、請求項２に記載のモノマー。
7. ７．Ｙが、置換されたあるいは置換されていないアルキル（２−６Ｃ）、および 置換されたあるいは置換されていないアリル（６−２０Ｃ）からなる群から選択 される、ヌクレアーゼを阻害する置換基である、請求項３に記載のモノマー。
8. ８．Ｙが、置換されたあるいは置換されていないアルキル（２−６Ｃ）、および 置換されたあるいは置換されていないアリル（５−２０Ｃ）からなる群から選択 される、ヌクレアーゼを阻害する置換基である、請求項４に記載のモノマー。
9. ９．Ｙが、−ＣＨ２ＣＯＯＥｔ；−ＣＨ２ＣＯＯＨ；−ＣＨ２ＣＯＮＨ２；およ び−ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２からなる群から選択される、請求項１に 記載のモノマー。
10. １０．Ｙが、必要に応じてリンカー部分を介して結合された薬剤残基である、請 求項１に記載のモノマー。
11. １１．Ｙが、必要に応じてリンカー部分を介して結合された、ネトロプシンおよ びその誘導体、アントラマイシン、キノキサリン抗生物質、アクチノマイシン、 およびピルロロ（１−４）ベンゾジアゼピン誘導体からなる群から選択される、 請求項１０に記載のモノマー。
12. １２．Ｙが、必要に応じてリンカー部分を介して結合されたラベルである、請求 項１に記載のモノマー。
13. １３．Ｙが、必要に応じてリンカー部分を介して結合された、特性に影響する残 基である、請求項１に記載のモノマー。
14. １４．Ｂが、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、およびＵおよびその保護された形態からなる群か ら選択される、請求項１に記載のモノマー。
15. １５．Ｗ２がホスホネート残基である、請求項１に記載のモノマー。
16. １６．Ｗ１が保護基である、請求項１に記載のモノマー。
17. １７．Ｎ４−ベンゾイル−５′−Ｏ−（４．４−ジメトキシトリチル）−２′− Ｏ−（エトキシカルボニルメチル）−シチジン−３′−イル−ヒドロゲンホスホ ネートの塩である、請求項１に記載のモノマー。
18. １８．５′−Ｏ−（４．４′−ジメトキシトリチル）−２′−Ｏ−（エトキシカ ルボニルメチル）−ウリジン−３′−イル−ヒドロゲンホスホネートの塩である 、請求項１に記載のモノマー。
19. １９．Ｎ６−ベンゾイル−５′−Ｏ−（４．４′−ジメトキシトリチル）−２′ −Ｏ−（エトキシカルボニルメチル）−アデニン−３′−イル−ヒドロゲンホス ホネートの塩である、請求項１に記載のモノマー。
20. ２０．Ｎ２−イソブチリル−５′−Ｏ−（４．４′−ジメトキシトリチル）−２ ′−Ｏ−（エトキシカルボニルメチル）−グアノシン−３′−イル−ヒドロゲン ホスホネートの塩である、請求項１に記載のモノマー。
21. ２１．５−メチル−５′−Ｏ−（４．４′−ジメトキシトリチル）−２′−Ｏ− （エトキシカルボニルメチル）−ウリジン−３′−イル−ヒドロゲンホスホネー トの塩である、請求項１に記載のモノマー。
22. ２２．５−ブロモ−５′−Ｏ−（４．４′−ジメトキシトリチル）−２′−Ｏ− （エトキシカルボニルメチル）−ウリジン−３′−イル−ヒドロゲンホスホネー トの塩である、請求項１に記載のモノマー。
23. ２３．５−メチル−Ｎ４−ベンゾイル−５′−Ｏ−（４．４′−ジメトキシトリ チル）−２′−Ｏ−（エトキシカルボニルメチル）−シチジン−３′−イル−ヒ ドロゲンホスホネートの塩である、請求項１に記載のモノマー。
24. ２４．２′−Ｎ−アシルアミノ−５′−Ｏ−（４．４′−ジメトキシトリチル） −ウリジン−３′−イル−ヒドロゲンホスホネートの塩である、請求項１に記載 のモノマー。
25. ２５．トリエチルアンモニウム塩である、請求項１７から２４に記載のモノマー 。
26. ２６．下記の式のオリゴマーであって；▲数式、化学式、表等があります▼（２ ）ここで、 それぞれのＢが、独立して、プリンあるいはピリミジン残基、あるいはそれらの アナログであり；Ｗ３およびＷ４が、それぞれ独立してＨ、ＰＯ３−２、保護基 、あるいは結合水酸基に反応する基であり；ｎが１から２００の整数であり； それぞれのＺが、独立して、その続きのヌクレオチド残基の水酸基に共有結合す るヌクレオチド結合残基であり；それぞれのＡが、独立して、Ｈ、ＯＨ、あるい は保護基に誘導体化したＯＨ、およびＸ−Ｙからなる群から選択され、ここに、 ＸがＯ、Ｓ、ＮＲ、あるいはそれぞれのＲが独立してＨあるいはアルキル（１− ６Ｃ）であるＣＲ２であり；およびＹが、リンカー部分、必要に応じてリンカー 部分を介して結合された薬剤残基、必要に応じてリンカー部分を介して結合され たラベル、あるいは必要に応じてリンカー部分を介して結合された、特性に影響 する残基であって；ここで、少なくとも１つのＡがＸ−Ｙであり；そして、ここ で、該オリゴマーが、すべてのＡがＨあるいはＯＨであるこれに対応するオリゴ マーよりも、ヌクレアーゼに対して安定である、オリゴマー。
27. ２７．ダイマーあるいはトリマーである、請求項２に記載のオリゴマー。
28. ２８．Ｚが、Ｐ（Ｏ）Ｏ、Ｐ（Ｏ）Ｓ、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２、Ｐ（Ｏ）Ｒ、ＣＯ、Ｃ ＮＲ２からなる群から選択され、ここで、ＲがＨあるいはアルキル（１−６）、 Ｐ（Ｏ）ＯＲ′であり、ここでＲ′がアルキル（１−６Ｃ）およびＣＸ２′であ り、ここで、それぞれのＸ′が、独立して電子求引性置換基である、請求項２６ に記載のオリゴマー。
29. ２９．全てのＡが前記の式Ｘ−Ｙである、請求項２６に記載のオリゴマー。
30. ３０．少なくとも１つのＡが、前記の式Ｘ−Ｙを有し、そして残りの全てのＡが ＨあるいはＯＨ、あるいはそれらのリン酸化された形態である、請求項２６に記 載のオリゴマー。
31. ３１．ＸがＯあるいはＳである、請求項２６に記載のオリゴマー。
32. ３２．ＸがＮＲである、請求項２６に記載のオリゴマー。
33. ３３．ＸがＣＲ２である、請求項２６に記載のオリゴマー。
34. ３４．Ｙが、置換されたあるいは置換されていないアルキル（２−６Ｃ）および 置換されたあるいは置換されていないアリル（６−２０Ｃ）からなる群から選択 される、ヌクレアーゼを阻害する置換基である、請求項２６に記載のオリゴマー 。
35. ３５．Ｙが、置換されたあるいは置換されていないアルキル（２−６Ｃ）および 置換されたあるいは置換されていないアリル（６−２０Ｃ）からなる群から選択 される、ヌクレアーゼを阻害する置換基である、請求項３１に記載のオリゴマー 。
36. ３６．Ｙが、置換されたあるいは置換されていないアルキル（２−６Ｃ）および 置換されたあるいは置換されていないアリル（６−２０Ｃ）からなる群から選択 される、ヌクレアーゼを阻害する置換基である、請求項３２に記載のオリゴマー 。
37. ３７．Ｙが、置換されたあるいは置換されていないアルキル（２−６Ｃ）および 置換されたあるいは置換されていないアリル（６−２０Ｃ）からなる群から選択 される、ヌクレアーゼを阻害する置換基である、請求項３３に記載のオリゴマー 。
38. ３８．Ｙが、必要に応じてリンカー部分を介して結合された薬剤残基である、請 求項２６に記載のオリゴマー。
39. ３９．Ｙが、必要に応してリンカー部分を介して結合された、ネトロプシンおよ びその誘導体、アントラマイシン、キノザリン抗生物質、アクチノマイシン、お よびピルロロ（１−４）ベンゾジアゼピン誘導体からなる群から選択される、請 求項３８に記載のオリゴマー。
40. ４０．Ｙが、必要に応じてリンカー部分を介して結合されたラベルである、請求 項２６に記載のオリゴマー。
41. ４１．Ｙが、必要に応じてリンカー部分を介して結合された、特性に影響する残 基である、請求項２６に記載のオリゴマー。
42. ４２．それぞれのＢが独立して、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＵ、およびそれらの保護 された形態からなる群から選択される、請求項２６に記載のオリゴマー。
43. ４３．２′−Ｓ−フェニルチオシチジルイル−（３′→５′）−チミジンである 、請求項２６に記載のオリゴマー。
44. ４４．２′−Ｏ−（エトキシカルボニルメチル）−シチジルイル−（３′→５′ ）−チミジンである、請求項２６に記載のオリゴマー。
45. ４５．２′−Ｏ−アミノカルボニルメチル−（３′→５′）−チミジンである、 請求項２６に記載のオリゴマー。
46. ４６．２′−Ｏ−（ヒドロキシカルボニルメチル）−シチジルイル−（３′→５ ′）−チミジンである、請求項２６に記載のオリゴマー。
47. ４７．２′−Ｏ−［（２−アミノエチル）−アミノカルボニルメチル］−シチジ ルイル−（３′→５′）−チミジンである、請求項２６に記載のオリゴマー。
48. ４８．２′−Ｎ−アシルアミノ−２′−デオキシウリジルイル−（３′→５′） −チミジンである、請求項２６に記載のオリゴマー。
49. ４９．ヌクレオチド配列の存在に媒介される疾患を治療する方法であって、該ヌ クレオチド配列を不活性化するのに有効な量の、該ヌクレオチド配列に特異的に 結合し得る、請求項２６に記載の改変されたオリゴマーを、このような治療を必 要とする被験体に投与することを包含する、方法。