TW202328445A - 甲狀腺素運載蛋白（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 - Google Patents

甲狀腺素運載蛋白（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明係關於靶向含有甲狀腺素運載蛋白(TTR)基因之RNAi劑，例如，雙股RNA(dsRNA)劑。本發明亦關於使用此類RNAi劑來抑制TTR基因之表現的方法，並且關於預防及治療TTR相關疾患，例如，老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病及高甲狀腺素血症的方法。

Description

甲狀腺素運載蛋白(TTR)iRNA組成物及其使用方法 相關申請
本申請主張2021年8月3日遞交之美國臨時申請第63/228,830號之優先權權益，該臨時申請之整體內容藉由引用併入本文。
本案係關於iRNA組成物，尤係關於影響甲狀腺素運載蛋白(TTR)之iRNA劑。
甲狀腺素運載蛋白(TTR)(亦稱前白蛋白)係見於血清及腦脊液(CSF)中。TTR轉運視黃醇結合蛋白(RBP)及甲狀腺素(T4)，且亦透過其與血液及CSF中之RBP締合而充當視黃醇(維生素A)之運載蛋白。甲狀腺素運載蛋白係根據其轉運甲狀腺素及視黃醇而得名。TTR亦作為蛋白酶而發揮功能，且可裂解包括apoA-I(主要HDL脂蛋白元)、澱粉樣β-肽及神經肽Y在內的蛋白質。參見Liz,M.A.et al.(2010)IUBMB Life,62(6)：429-435。
TTR為四個富含β褶板結構的相同之127-胺基酸次單元(單體)的四聚物。各單體具有4股β褶板及長橢球之形狀。反平行β褶板交互作用將單 體鏈接為二聚物。來自各單體之短環圈形成主要的二聚物-二聚物交互作用。此等兩對環圈分隔二聚體的相對、凸面β褶板以形成內部通道。
肝臟為TTR表現之主要位點。其他顯著表現位點包括脈絡叢、視網膜(特定而言視網膜色素上皮細胞)及胰臟。
甲狀腺素運載蛋白為至少27種不同類型之蛋白質之一，其係澱粉樣纖絲之前驅物蛋白。參見，Guan,J.et al.(Nov.4,2011)Current perspectives on cardiac amyloidosis,Am J Physiol Heart Circ Physiol,doi：10.1152/ajpheait.00815.2011。澱粉樣纖絲於器官及組織中的細胞外沉積係澱粉樣變性病之標誌。澱粉樣纖絲由錯誤摺疊之蛋白質聚集體構成，其可由前驅物蛋白之過量產生或特異性突變所致。TTR的導致澱粉樣變性之潛能可能於其大量之β褶板結構有關；X射線晶體學研究指示，某些導致澱粉樣變性之突變使得該蛋白質之四聚物結構去安定化。參見，例如，Saraiva M.J.M.(2002)Expert Reviews in Molecular Medicine,4(12)：1-11。
澱粉樣變性病為以澱粉樣沉積為特徵的一組澱粉樣疾病的統稱。澱粉樣疾病係基於其前驅物蛋白歸類；例如，名稱以澱粉樣的「A」開始，後隨前驅物蛋白之縮寫，例如，ATTR為引起澱粉樣之甲狀腺素運載蛋白。出處同上。
有大量TTR相關疾病，其大多數為澱粉樣疾病。正常序列TTR與老年人中之心肌澱粉樣變性病相關，且稱為老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)(也稱老年性心肌澱粉樣變性病(SCA)或心肌澱粉樣變性病)。SSA往往伴隨有在眾多其他器官中之微觀沉積。TTR澱粉樣變性病表現為多種形式。當周圍神經系統受到更顯著之影響時，該疾病稱為家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)。當心臟主要受累但神經系統不受累時，該疾病稱為家族性澱粉樣變性心 肌病(FAC)。第三種主要類型的TTR澱粉樣變性為軟腦膜澱粉樣變性，亦稱為軟腦膜或腦膜血管澱粉樣變性、中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性或澱粉樣變性病VII形式。TTR中之突變亦可引起澱粉樣變性玻璃體渾濁、腕隧道症候群及甲狀腺機能正常的高甲狀腺素血症，其係非澱粉樣變性疾病，咸信係繼發於由於突變型TTR分子與甲狀腺素之親和力增加所致的甲狀腺素與TTR之關聯增加。參見，例如，Moses et al.(1982)J.Clin.Invest.,86,2025-2033。
異常TTR等位基因可係先天性的或透過體細胞突變獲得的。Guan,J.et al.(Nov.4,2011)Current perspectives on cardiac amyloidosis,Am J Physiol Heart Circ Physiol,doi：10.1152/ajpheart.00815.2011。甲狀腺素運載蛋白相關ATTR係遺傳性全身性澱粉樣變性病的最常見形式。Lobato,L.(2003)J.Nephrol.,16：438-442。TTR突變加速TTR澱粉樣形成之過程且係發展出ATTR的最重要之風險因素。超過85種導致澱粉樣變性之TTR變體係已知引起全身性家族性澱粉樣變性病。TTR突變往往引起全身性澱粉樣沉積，尤其累及周圍神經系統，但一些突變與心肌病或玻璃體渾濁相關。出處同上。
V30M突變為最盛行之TTR突變。參見，例如，Lobato,L.(2003)J Nephrol,16：438-442。V122I突變由3.9%的非洲裔美國人群體攜帶且為FAC之最常見原因。Jacobson,D.R.et al.(1997)N.Engl.J.Med.336(7)：466-73。估計SSA影響超過25%的年齡在80歲以上之群體。Westermark,P.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87(7)：2843-5。
其他TTR相關疾病包括眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病視網膜病變、年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及 濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病。
舉例而言，遺傳性眼睛疾患斯特格氏病(Stargardt’s dease)中之原發性病理性缺陷為細胞毒性脂褐素雙維他命A酸類(bisretinoid)在視網膜中之過量蓄積。脂褐素於視網膜色素上皮細胞(RPE)中之年齡依賴性蓄積與萎縮性(乾性)形式之年齡相關性黃斑部退化(AMD)之發病率的年齡相關性增加相匹配，並因此係有貢獻於AMD進展的關鍵致病因素。脂褐素雙維他命A酸類於視網膜中之合成取決於血清視黃醇從循環流入RPE中，且三級視黃醇結合蛋白4(RBP4)-甲狀腺素運載蛋白-視黃醇複合體於血清中之形成係為此流入所需。減弱TTR(其調節RBP4)之表現業經顯示導致RBP4量級及被遞送至標靶組織之視黃醇之量兩者的顯著下降，從而抑制脂褐素雙維他命A酸類之形成。
此外，多年前報導了第2型糖尿病患者中的升高之RBP4(Basualdo C,et al.,(1997).J.Am.Coll.Nutr.16,39-45；Abahusain et al.,(1999).Eur.J.Clin.Nutr.53,630-635)，並且RBP4的基因轉殖過表現或人類RBP4的注入在正常小鼠中顯示引起胰島素抗性。相比之下，RBP4的基因缺失或降低循環RBP4量級具有相反效應，且保護小鼠免於發展出胰島素抗性(Yang,Q.,et al.(2005).Nature 436,356-362)。此外，記錄了循環RBP4或RBP4表現量級與經確立之心血管疾病(CVD)風險因素的正相關，該等風險因素包括代謝症候群、總體/向心性肥胖、血脂異常、發炎標記及高血壓(Qi Q,et al.,J Clin Endocrinol Metab.2007；92：4827-4834；Ingelsson E,et al.,Atherosclerosis.2009；206：239-244)。如上所示，TTR調節RBP4，因此減少TTR從而導致RBP4減少。
用於TTR相關疾病諸如眼部疾病(例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病視網膜病變、年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)、代謝疾患(例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患)、與第II型糖尿病相關之胰島素抗性及心血管疾病)的任何可用之當前治療並不完全有效且可導致嚴重副作用，諸如結膜出血、眼壓升高、感染、視網膜脫落及眼睛發炎。同樣，當前用於代謝疾病之治療，包括飲食調節、運動及用藥以幫助控制血壓、膽固醇及血糖量級，並不總是有效的。
據此，本技術領域中存在用於TTR相關疾病之有效治療的需求。
本發明提供iRNA組成物，其影響編碼甲狀腺素運載蛋白(TTR)之基因之RNA轉錄本的RNA誘導型緘默化複合體(RISC)媒介之裂解。TTR基因可處於細胞內，例如受試者(諸如人類受試者)之細胞體內。本發明亦提供使用本發明之iRNA組成物用於抑制TTR基因之表現及/或用於治療將會受益於抑制或降低TTR基因表現之受試者的方法，該受試者例如罹患或易患TTR相關疾患的受試者，該TTR相關疾患例如老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病。
據此，一方面，本發明係提供一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其用於抑制甲狀腺素運載蛋白(TTR)在細胞中之表現，其中該dsRNA劑包含形成雙股區域之有義股及反義股，其中該有義股包含與5'-AGAGTAUUCCAUUUUUACU-3'之核苷酸序列相異不超過3個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸，且該反義股包含與5'-AGUAAAAAUGGAAUACUCUUG-3'之核苷酸序列相異不超過3個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20、21、22或23個接續核苷酸；其中該有義股之全部核苷酸及該反義股之全部核苷酸包含選自由2’-O-甲基修飾及2’-氟修飾所組成之群組的核苷酸修飾；其中該有義股包含至少2個2’-氟修飾；其中該反義股包含至少2個2’-氟修飾；其中該有義股包含兩個硫代磷酸酯(phosphorothioate)鏈結；其中該反義股包含四個硫代磷酸酯鏈結；並且其中至少一股係接合至配體。
於一個態樣中，該有義股包含2至6個2’-氟修飾。
於一個態樣中，該有義股包含4個2’-氟修飾。
於一個態樣中，該等4個2’-氟修飾位於從該有義股之5'-末端之位置7及9至11。
於一個態樣中，該有義股包含3個2’-氟修飾。
於一個態樣中，該等3個2’-氟修飾位於從該有義股之5'-末端之位置7至9。
於一個態樣中，該反義股包含2至6個2’-氟修飾。
於一個態樣中，該反義股包含4個2’-氟修飾。
於一個態樣中，該等4個2’-氟修飾位於從該反義股之5'-末端之位置2、6、14及16。
於一個態樣中，該反義股包含2個2’-氟修飾。
於一個態樣中，該等2個2’-氟修飾位於從該反義股之5'-末端之位置14及16。
於一態樣中，該有義股包含位於5'-末端三個端部核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，該反義股包含位於3'-末端三個端部核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結以及位於5'末端三個端部核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，該配體係接合至該dsRNA劑之有義股的3'末端。
於一個態樣中，該配體為N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
於一個態樣中，配體係透過單價、二價或三價分支鏈結基附接的一個或多個GalNAc衍生物。
於一個態樣中，該配體為
Figure 111128947-A0202-12-0007-131
於一個態樣中，該dsRNA劑係如下述式所示接合至配體
Figure 111128947-A0202-12-0008-132
以及，其中，X為O或S。
於一個態樣中，X為O。
於一個態樣中，該雙股區域係19至30個核苷酸之長度。
於一個態樣中，該雙股區域係19至25個核苷酸之長度。
於一個態樣中，該雙股區域係19至23個核苷酸之長度。
於一個態樣中，該雙股區域係23至27個核苷酸之長度。
於一個態樣中，該雙股區域係21至23個核苷酸之長度。
於一個態樣中，各股獨立地為不超過30個核苷酸之長度。
於一個態樣中，有義股係21個核苷酸之長度，且反義股係23個核苷酸之長度。
於一個態樣中，至少一股包含具有至少1個核苷酸的3'突出(overhang)。
於一個態樣中，至少一股包含具有至少2個核苷酸的3'突出。
於一個態樣中，該有義股包含核苷酸序列5'-CAAGAGUAUUCCAUUUUUACU-3'，且該反義股包含核苷酸序列5'-AGUAAAAAUGGAAUACUCUUGGU-3'。
於一個態樣中，該有義股包含核苷酸序列5'-CCAAGAGUAUUCCAUUUUUAU-3'，且該反義股包含核苷酸序列5'-AUAAAAAUGGAAUACUCUUGGUU-3'。
於一個態樣中，該有義股之核苷酸序列與核苷酸序列5'-csasagagUfaUfUfCfcauuuuuacu-3'相異不超過4個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與核苷酸序列5'-asGfsuaaAfaauggaaUfaCfucuugsgsu-3'相異不超過4個鹼基，其中，a、c、g及u分別為2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G及U；Af、Cf、Gf及Uf分別為2’-氟A、C、G及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
於一個態樣中，該有義股之核苷酸序列與5'-csasagagUfaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列相異不超過3個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asGfsuaaAfaauggaaUfaCfucuugsgsu-3'之核苷酸序列相異不超過3個鹼基。
於一個態樣中，該有義股之核苷酸序列與5'-csasagagUfaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列相異不超過2個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asGfsuaaAfaauggaaUfaCfucuugsgsu-3'之核苷酸序列相異不超過2個鹼基。
於一個態樣中，該有義股之核苷酸序列與5'-csasagagUfaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列相異不超過1個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asGfsuaaAfaauggaaUfaCfucuugsgsu-3'之核苷酸序列相異不超過1個鹼基。
於一個態樣中，該有義股包含5'-csasagagUfaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asGfsuaaAfaauggaaUfaCfucuugsgsu-3'之核苷酸序列。
於一個態樣中，該有義股由5'-csasagagUfaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列所組成，且該反義股由5'-asGfsuaaAfaauggaaUfaCfucuugsgsu-3'之核苷酸序列所組成。
於一個態樣中，該有義股包含5'-csasagagUfaUfUfCfcauuuuuacuL96-3'之核苷酸序列，並且該反義股包含5'-asGfsuaaAfaauggaaUfaCfucuugsgsu-3'之核苷酸序列，其中L96為N-[參(GalNAc-alkyl)醯胺基癸醯基)]-4-羥基脯胺醇。
於一個態樣中，該dsRNA劑係如下述式所示接合至配體
Figure 111128947-A0202-12-0010-133
，其中X為O。
於一個態樣中，該有義股之核苷酸序列與核苷酸序列5'-cscsaagaGfuAfUfUfccauuuuuau-3'相異不超過4個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與核苷酸序列5'-asUfsaaaAfauggaauAfcUfcuuggsusu-3'相異不超過4個鹼基，其中，a、c、g及u分別為2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G及U；Af、Cf、Gf及Uf分別為2’-氟A、C、G及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
於一個態樣中，該有義股之核苷酸序列與5'-cscsaagaGfuAfUfUfccauuuuuau-3'之核苷酸序列相異不超過3個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asUfsaaaAfauggaauAfcUfcuuggsusu-3'之核苷酸序列相異不超過3個鹼基。
於一個態樣中，該有義股之核苷酸序列與5'-cscsaagaGfuAfUfUfccauuuuuau-3'之核苷酸序列相異不超過2個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asUfsaaaAfauggaauAfcUfcuuggsusu-3'之核苷酸序列相異不超過2個鹼基。
於一個態樣中，該有義股之核苷酸序列與5'-cscsaagaGfuAfUfUfccauuuuuau-3'之核苷酸序列相異不超過1個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asUfsaaaAfauggaauAfcUfcuuggsusu-3'之核苷酸序列相異不超過1個鹼基。
於一個態樣中，該有義股包含5'-cscsaagaGfuAfUfUfccauuuuuau-3'之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asUfsaaaAfauggaauAfcUfcuuggsusu-3'之核苷酸序列。
於一個態樣中，該有義股由5'-cscsaagaGfuAfUfUfccauuuuuau-3'之核苷酸序列所組成，且該反義股由5'-asUfsaaaAfauggaauAfcUfcuuggsusu-3'之核苷酸序列所組成。
於一個態樣中，該有義股包含5'-cscsaagaGfuAfUfUfccauuuuuau-3'之核苷酸序列，並且該反義股包含5'-asUfsaaaAfauggaauAfcUfcuuggsusu-3'之核苷酸序列，其中L96為N-[參(GalNAc-alkyl)醯胺基癸醯基)]-4-羥基脯胺醇。
於一個態樣中，該dsRNA劑係如下述式所示接合至配體
Figure 111128947-A0202-12-0012-134
，其中X為O。
於一個態樣中，該有義股之核苷酸序列與核苷酸序列5'-asgsagdTaUfUfCfcauuuuuacu-3'相異不超過4個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與核苷酸序列5'-asdGsuadAadAauggaaUfaCfucususg-3'相異不超過4個鹼基，其中，a、c、g及u分別為2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G及U；Af、Cf、Gf及Uf分別為2’-氟A、C、G及U；dT為2’-去氧胸苷-3'-磷酸酯；dG為2’-去氧鳥苷-3'-磷酸酯；dA為2’-去氧腺苷-3'-磷酸酯；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
於一個態樣中，該有義股之核苷酸序列與5'-asgsagdTaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列相異不超過3個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asdGsuadAadAauggaaUfaCfucususg-3'之核苷酸序列相異不超過3個鹼基。
於一個態樣中，該有義股之核苷酸序列與5'-asgsagdTaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列相異不超過2個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asdGsuadAadAauggaaUfaCfucususg-3'之核苷酸序列相異不超過2個鹼基。
於一個態樣中，該有義股之核苷酸序列與5'-asgsagdTaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列相異不超過1個鹼基，且該反義股 之核苷酸序列與5'-asdGsuadAadAauggaaUfaCfucususg-3'之核苷酸序列相異不超過1個鹼基。
於一個態樣中，該有義股包含5'-asgsagdTaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列，且該反義股之核苷酸序列包含5'-asdGsuadAadAauggaaUfaCfucususg-3'之核苷酸序列。
於一個態樣中，該有義股由5'-asgsagdTaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列所組成，且該反義股之核苷酸序列由5'-asdGsuadAadAauggaaUfaCfucususg-3'之核苷酸序列所組成。
於一個態樣中，該有義股包含5'-asgsagdTaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列，並且該反義股之核苷酸序列包含5'-asdGsuadAadAauggaaUfaCfucususg-3'之核苷酸序列，其中L96為N-[參(GalNAc-烷基)醯胺基癸醯基)]-4-羥基脯胺醇。
於一個態樣中，該dsRNA劑結合係如下述式所示接合至配體
Figure 111128947-A0202-12-0013-135
，其中X為O。
本發明亦提供包含本發明之dsRNA劑的細胞及醫藥組成物，例如，其包含醫藥上可接受之載劑。
於一個態樣中，本發明之醫藥組成物包含非緩衝溶液，例如，鹽水或水。
於一個態樣中，本發明之醫藥組成物包含穿衝溶液，例如，包含醋酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任意組合的溶液。於一個態樣中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
一方面，本發明係提供一種抑制甲狀腺素運載蛋白(TTR)基因在細胞內之表現的方法。該方法係包括令細胞與本發明之dsRNA劑或本發明之醫藥組成物接觸，從而抑制TTR基因在細胞內之表現。
於一個態樣中，該細胞係處於受試者體內。
於一個態樣中，該受試者係人類。
於一個態樣中，該受試者係罹患TTR相關疾病之受試者。
於一個態樣中，該受試者係處於發展出TTR相關疾病風險之受試者。
於一個態樣中，該受試者攜帶TTR基因突變，該突變與TTR相關疾病之發展相關。
於一個態樣中，該TTR相關疾病係選自由以下所組成之群組：老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病。
於一個態樣中，該受試者患有TTR相關澱粉樣變性病，且該方法降低該受試者中之澱粉樣TTR沉積。
於一個態樣中，令該細胞與該dsRNA劑接觸將TTR之表現抑制至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
於一個態樣中，抑制TTR之表現係將該受試者血清中之TTR蛋白質量級降低至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
另一方面，本發明係提供一種治療罹患TTR相關疾病或處於發展出TTR相關疾病風險之受試者的方法。該方法包括向該受試者投予治療有效量或預防有效量的本發明之雙股RNAi劑或本發明之醫藥組成物，從而治療該受試者。
於一個態樣中，該受試者係人類。
於一個態樣中，該受試者係罹患TTR相關疾病之受試者。
於一個態樣中，該受試者係處於發展出TTR相關疾病風險之受試者。
於一個態樣中，該受試者攜帶TTR基因突變，該突變與TTR相關疾病之發展相關。
於一個態樣中，該TTR相關疾病係選自由以下所組成之群組：老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如， 乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病。
於一個態樣中，該受試者患有甲狀腺素運載蛋白媒介之澱粉樣變性病(ATTR澱粉樣變性病)，且該方法降低該受試者中之澱粉樣TTR沉積。
於一個態樣中，該ATTR為遺傳性ATTR(h-ATTR)。
於一個態樣中，該ATTR為非遺傳性ATTR(wt ATTR)。
於一個態樣中，向該受試者投予該dsRNA劑或醫藥組成物改善該受試者的神經功能受損、生活品質、持續性神經損傷或心血管受損之至少一個指數。
於一個態樣中，該雙股RNAi劑係經皮下投予或靜脈內投予而向該人類受試者投予。
於一個態樣中，該皮下投予係自我投予。
於一個態樣中，該自我投予係經由預填充之注射器或自動注射器進行。
於一個態樣中，該方法復包含評估來自該人類受試者之樣本中TTR mRNA表現或TTR蛋白質表現的量級。
一方面，本發明提供包含本發明之dsRNA劑或本發明之醫藥組成物以及視需要包含之使用說明的套組。
另一方面，本發明提供包含本發明之dsRNA劑或本發明之醫藥組成物的小瓶。
一方面，本發明提供包含本發明之dsRNA劑或本發明之醫藥組成物的注射器。
一方面，本發明提供一種RNA誘導型緘默化複合體(RISC)，其包含本發明之dsRNA劑的反義股。
第1圖係顯示下述者之圖：在第7天，經皮下投予單一1mg/kg劑量之所標註dsRNA雙鏈體的小鼠(每個群組，n=3)體內之人類TTR mRNA量級。人類TTR mRNA量級係相對於以PBS治療所偵測到之對照量級。
第2圖係顯示在非人類靈長動物中投予單次皮下0.5mg/kg劑量之AD-649263、AD-1134938、AD-649264、AD-1134966或AD-65496對於TTR mRNA量級之效應的圖。
本發明提供iRNA組成物，其影響甲狀腺素運載蛋白(TTR)基因之RNA轉錄本的RNA誘導型緘默化複合體(RISC)媒介之裂解。該基因可係處於細胞內，例如受試者(諸如人類)內之細胞內。此等iRNA之使用使得哺乳動物體內相對應基因(TTR)之mRNA的靶向退化成為可能。
本發明之iRNA業經設計為靶向人類甲狀腺素運載蛋白(TTR)基因，包括該基因在其他哺乳動物物種之TTR同源物中保有的部位。不試圖受限於理論，咸信，特異性標靶位點、特異性修飾及與此等iRNA中之配體附接的組合賦予本發明之iRNA以改善之功效、安定性、效力、持久性及安全性。本發明之iRNA劑的另一出乎意料且高度期望之特徵為其等展現出無或非常低之脫靶 活性。於本文所呈現之實施例中，發明人已經鑑定，本發明之dsRNA劑展現出迄今為止針對任何靶向任何基因之dsRNA劑所觀察到的最低之脫靶活性。
本發明亦提供用於治療或預防甲狀腺素運載蛋白(TTR)相關疾患之方法，該疾患例如：老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；或心血管疾病，該方法使用作用於RNA誘導型緘默化複合體(RISC)媒介的TTR基因之RNA轉錄本裂解的iRNA組成物。
本發明之iRNA包括RNA股(反義股)，其係至多約30個核苷酸或更短之長度，例如，19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22個核苷酸之長度，該區域實質上與TTR基因之mRNA轉錄本的至少一部分互補。
於某些態樣中，本發明之雙股RNAi劑之一股或兩股係最多66個核苷酸之長度，例如，36至66、26至36、25至36、31至60、22至43、27至53個核苷酸之長度，具有一個與TTR基因之mRNA轉錄本之至少一部分實質上互補的至少19個接續核苷酸之區域。於一些態樣中，此類具有長度較長之 反義股的iRNA劑可以，例如，包括一長度為20至60個核苷酸之第二RNA股(有義股)，其中該有義股與該反義股係形成18至30個接續核苷酸之雙鏈體。
本發明之iRNA的使用使得哺乳動物體內相對應基因(TTR基因)之mRNA的靶向降解成為可能。使用活體外檢定，本發明人等業經證明，靶向TTR基因之iRNA可有效地媒介RNAi，導致對TTR基因表現之顯著抑制。因此，包括此等iRNA之方法及組成物係有用於治療患有TTR相關疾患之受試者，該疾患例如：老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；或心血管疾病。
據此，本發明提供用於治療患有將會受益於抑制或降低TTR基因表現之疾患的受試者之方法及組合療法，該疾患例如：甲狀腺素運載蛋白(TTR)相關疾患，諸如老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病，該方法使用作用於RNA誘導型緘默化複合體(RISC)媒介的TTR基因之RNA轉錄本裂解的iRNA組成物。
本發明亦提供用於預防患有將會受益於抑制或降低TTR基因表現之疾患的受試者之至少一種症候之方法，該疾患例如：甲狀腺素運載蛋白(TTR)相關疾患，諸如老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病。
下述之詳細說明書揭露如何製作及使用含有用以抑制TTR基因表現之iRNA的組成物、用途、以及治療將會受益於TTR基因表現之抑制及/或降低之受試者的方法，該等受試者為例如易患或經診斷為患有TTR相關疾患之受試者。
I.定義
為了更容易地理解本發明，首先定義某些術語。此外，應注意，無論何時，當應用參數之數值或數值範圍，該等數值及處於該等所引用之數值中間的範圍亦作為本發明之一部分。
本文中使用之冠詞「一」指代該冠詞之語法賓語的一者或超過一者(亦即，至少一者)。舉例而言，「一要素」意指一個要素或超過一個要素，例如複數個要素。
本文中使用之術語「包括」意指「包括但不限於」，且與後者可互換地使用。
除非語境中明確排除，否則本文中使用之術語「或」意指「及/或」，且與後者可互換地使用。例如，「有義股或反義股」理解為「有義股或反義股或者有義股及反義股」。
本文中使用之術語「約」意指處於所屬技術領域中之公差範圍內。例如，「約」可理解為與平均值相差2標準差。於某些態樣中，約意指±10%。於某些態樣中，約意指±5%。當「約」存在於一系列數字或範圍之前時，理解為「約」可修飾該一系列或範圍中之每一個數字。
處於數字或一系列數字之前的術語「至少」、「不低於」或「或更多」理解為包括與該術語「至少」相鄰之數字，以及後面之全部數字或邏輯上可包括之整數，如從語境中明顯可知者。例如，核酸分子中之核苷酸的數目必需為整數。例如，「21個核苷酸之核酸分子的至少19個核苷酸」意指19、20或21個核苷酸具有所指示之特性。當「至少」存在於一系列數字或範圍之前時，理解為「至少」可修飾該一系列或範圍中之每一個數字。
如本文所用，「不超過」或「或更低」理解為與短語相鄰之數值以及邏輯上更低之數值或整數，如從語境中邏輯上推知者，到零為止。例如，具有「不超過2個核苷酸」之突出的雙鏈體具有2、1或0個核苷酸之突出。當「不超過」存在於一系列數字或範圍之前時，理解為「不超過」可修飾該一系列或範圍中之每一個數字。如本文中所用，範圍包括上限及下限兩者。
如本文所用，偵測方法可包括測定存在之分析物的量低於該方法之偵測量級。
在所指示之標靶位點與有義或反義股之核苷酸序列之間存在矛盾的情況下，以所指示之序列為準。
在序列與其在轉錄本或其他序列所指示之位點之間存在矛盾的情況下，以本說明書中敘述之核苷酸序列為準。
如本文所用，「甲狀腺素運載蛋白」(「TTR」)指代習知之基因及蛋白質。TTR亦稱為前白蛋白、HsT2651、PALB及TBPA。TTR發揮作為視黃醇結合蛋白(RBP)、甲狀腺素(T4)及視黃醇之運載蛋白的功能，且其亦用作蛋白酶。肝臟分泌TTR至血液中，且脈絡叢分泌TTR至腦脊液中。TTR亦在胰臟及視網膜色素上皮細胞中表現。TTR之最重大臨床相關性為正常(野生型)及突變型TTR蛋白質兩者皆可形成澱粉樣纖絲，該等澱粉樣纖絲聚集為細胞外沉積物，引起澱粉樣變性病。關於綜述，參見，例如，Saraiva M.J.M.(2002)Expert Reviews in Molecular Medicine,4(12)：1-11。大鼠甲狀腺素運載蛋白之分子選殖及核苷酸序列以及mRNA表現之分佈由Dickson,P.W.et al.(1985)J.Biol.Chem.260(13)8214-8219揭示。人類TTR之X射線晶體結構揭示於Blake,C.C.et al.(1974)J Mol Biol 88,1-12。
人類TTR mRNA轉錄本之序列可見於美國國家生物技術資訊中心(NCBI)RefSeq登錄號NM_000371.4(SEQ ID NO：1；反向互補序列，SEQ ID NO：5)。小鼠TTR mRNA之序列可見於RefSeq登錄號NM_013697.2(SEQ ID NO：2；反向互補序列，SEQ ID NO：6)。大鼠TTR mRNA之序列可見於RefSeq登錄號NM_012681.1(SEQ ID NO：3；反向互補序列SEQ ID NO：7)。食蟹獼猴(Macaca fascicularis)TTR mRNA之序列可見於RefSeq登錄號NM_001283593.1(SEQ ID NO：4；反向互補序列，SEQ ID NO：8)。恆河獼猴(Macaca mulatta)TTR mRNA之序列可見於RefSeq登錄號NM_001261679.1(SEQ ID NO：9；反向互補序列，SEQ ID NO：10)。
TTR mRNA序列之其他示例可透過公共資料庫輕易獲得，例如，GenBank、UniProt、OMIM以及獼猴基因組項目網站。
TTR之其他資訊可見於，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term=TTR。
自遞交本申請案之日起，前述GenBank登錄號及Gene資料庫號之各者的整體內容藉由引用併入本文。
如本文所用，術語TTR亦指代TTR基因之變異，包括SNP資料庫中提供之變體。TTR中之大量序列變異業經鑑定並可見於，例如，NCBI dbSNP及UniProt(參見，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/？term=TTR)，自本申請案遞交之日起，其整體內容藉由引用併入本文。
如本文中所用，「標靶序列」指代於TTR基因之轉錄過程中形成之mRNA分子之核苷酸序列的接續部分，包括作為初級轉錄產物之RNA加工產物的mRNA。於一態樣中，該序列之標靶部分將係至少長至足以用作iRNA引導之裂解的受質，該裂解係位於在TTR基因之轉錄過程中形成之mRNA分子的核苷酸序列的部分處或鄰近該處。
標靶序列可係約19至36個核苷酸之長度，例如，約19-30個核苷酸之長度。例如，標靶序列可係約19至30個核苷酸之長度，19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個核苷酸之長度。於某些態 樣中，標靶序列係19至23個核苷酸之長度，視需要21至23個核苷酸之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
如本文中所使用，術語「包含序列之股」指代包含核苷酸之鏈的寡核苷酸，其中該核苷酸藉由使用標準核苷酸命名法指代之序列而揭示。
「G」、「C」、「A」、「T」及「U」各自通常分別表示含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶作為鹼基之核苷酸。惟，應理解，術語「核糖核苷酸」或「核苷酸」亦可指代經修飾之核苷酸，如下文進一步揭示者，或替代替換部分(參見，例如，表1)。具有通常知識者熟知，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶可經由其他部分替換而不實質上改變包含承載此替換部分之核苷酸之寡核苷酸的鹼基配對特性。例如而不限於，包含肌苷作為其鹼基之核苷酸可與含有腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤之核苷酸進行鹼基配對。因此，於本發明提出之dsRNA之核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤之核苷酸可替換為含有例如肌苷之核苷酸。於另一實例中，寡核苷酸中任意位置之腺嘌呤及胞嘧啶可分別替換為鳥嘌呤及尿嘧啶，以與標靶mRNA形成G-U Wobble鹼基配對。含有此類替換部分之序列適用於本發明提出之組成物及方法。
如本文中可互換使用，術語「iRNA」、「RNAi劑」、「iRNA劑」、「RNA干擾劑」指代含有如本文中定義之術語的RNA，且其經由RNA誘導型緘默化複合體(RISC)途徑而媒介RNA轉錄本的靶向裂解。iRNA透過被稱為RNA干擾(RNAi)之進程而引導mRNA之序列特異性降解。iRNA調整例如抑制細胞例如受試者諸如哺乳動物受試者體內之肝臟細胞中TTR基因的表現。
於一個態樣中，本發明之RNAi劑包括單股RNA，其與標靶RNA序列例如TTR標靶mRNA相互作用，以引導標靶RNA之裂解。不欲受縛於理 論，咸信被引入細胞內之長雙股RNA藉由被稱為切丁酶(Dicer)之第III型核酸內切酶之作用而破碎為siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切丁酶，亦稱核酸酶III樣酶，將daRNA加工為19-23個鹼基對之短干擾RNA，該短干擾RNA之特徵為具有兩個鹼基之3'突出(Bemstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。隨後，siRNA被併入RNA誘導型緘默化複合體(RISC)內，於該處，一種或多種解旋酶令siRNA雙鏈體解捲曲，使得補體反義股能夠引導標靶識別(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。當結合至適宜之標靶mRNA時，RISC內之一種或多種核酸內切酶裂解標靶以誘導靜默(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。因此，於一方面，本發明係關於單股RNA(siRNA)，其於細胞內生成且促進RISC複合體之形成，以有效靜標默靶基因亦即TTR基因。據此，本文中，術語「siRNA」亦用以指代上揭之iRNA。
於某些態樣中，RNAi劑可係單股siRNA(ssRNAi)，其被引入細胞或有機體內以抑制標靶mRNA。單股RNAi劑結合至RISC核酸內切酶Argonaute 2，其隨後裂解標靶mRNA。該單股siRNA通常係15-30個核苷酸且經化學修飾。單股siRNA之設計及測試揭示於美國專利第8,101,348號及Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。本文中揭示之任意反義核苷酸序列可用作本文中揭示之單股siRNA或用作藉由Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中揭示之方法化學修飾者。
於某些態樣中，用於本發明之組成物、用途及方法中之「iRNA」係雙股RNA，且於本文中指代為「雙股RNA劑」、「雙股RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA劑」或「dsRNA」。術語「dsRNA」指代核糖核酸分子之複合體，其具有包含兩個反平行且實質上互補之核酸股的雙鏈體結構，該兩個核酸股指代為 具有相對於標靶RNA亦即TTR基因之「有義(或正義，sense)」取向及「反義(antisense)」取向。於本發明之一些態樣中，雙股RNA(dsRNA)透過轉錄後基因緘默化機制而觸發標靶RNA例如mRNA之降解，本文中，該機制指代為RNA干擾或RNAi。
通常，dsRNA分子之每一股之主要部分之核苷酸係核糖核苷酸，但如本文中所詳述，一股或兩股亦可包括一個或多個非核糖核苷酸，例如去氧核糖核苷酸或經修飾之核苷酸。此外，如本說明書中所用，「iRNA」可包括具有化學修飾之核糖核苷酸；iRNA可包括位於多個核苷酸處之實質性修飾。如本文中所用，術語「經修飾之核苷酸」指代獨立具有經修飾之糖部分、經修飾之核苷酸間鏈結、或經修飾之核酸鹼基或其任意組合的核苷酸。因此，術語「經修飾之核苷酸」涵蓋例如官能基或原子到核苷酸間鏈結、糖部分或核酸鹼基之置換、加成或移除。適用於本發明之劑中的修飾包括本文中所揭露或所屬技術領域中已知之全部類型的修飾。對於本說明書及申請專利範圍之目的，任何此類修飾，如在siRNA類型分子中所用者，為「iRNA」或「RNAi劑」所涵蓋。
於本揭露之某些態樣中，將去氧核苷酸(若存在)包合於RNAi劑中可被視為構建經修飾之核苷酸。
該雙鏈體區域可係允許所欲之標靶RNA透過RISC途徑而特異性降解的任意長度，且可係約19至36個鹼基對之長度範圍，如約19-30個鹼基對之長度，例如，約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36個鹼基對之長度，諸如約19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、 20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22個鹼基對之長度。於某些態樣中，雙鏈體區域係19至21個鹼基對之長度，例如，21個鹼基對之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
形成該雙鏈體結構之兩股可係一個較大RNA分子之不同部分，或它們可係獨立之RNA分子。若該兩股係一個較大分子之部分，且因此藉由界於一股之3'末端與形成該雙鏈體結構之相對另一股之5'末端之間的未中斷核苷酸鏈而連結，則該連結RNA鏈指代為「髮夾環圈」。髮夾環圈可包含至少一個未配對之核苷酸。於一些態樣中，髮夾環圈可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、23未配對之核苷酸。於一些態樣中，髮夾環圈可係10個或更少核苷酸。於一些態樣中，髮夾環圈可係8個或更少未配對之核苷酸。於一些態樣中，髮夾環圈可係4至10個未配對之核苷酸。於一些態樣中，髮夾環圈可係4至8個核苷酸。
若dsRNA之兩個實質上互補之股由獨立之RNA分子構成，則那些分子不必但可以共價連結。若兩股藉由除界於一股之3'-末端與形成雙鏈體結構之相對另一股之5'-末端之間的未中斷核苷酸鏈以外之手段共價連結，則該連結結構指代為「鏈結子」。RNA股可具有相同或相異數目之核苷酸。鹼基對之最大數目係dsRNA之最短鏈中之核苷酸數減去雙鏈體中存在之任意突出。RNAi除了包含雙鏈體結構外，亦可包含一個或多個核苷酸突出。於RNAi劑之一個態樣中，至少一股包含至少1個核苷酸的3'突出。於另一態樣中，至少一股包含一具有至少2個核苷酸，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸之3'突出。於其他態樣中，RNAi劑之至少一股包含一具有至少1 個核苷酸之5'突出。於某些態樣中，至少一股包含一具有至少2個核苷酸，例如2、5、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸之3'突出。於又其他態樣中，RNAi劑之一股的3'及5'末端包含一具有至少1個核苷酸之突出。
於某些態樣中，本發明之iRNA劑係dsRNA，其每一股包含19至23個核苷酸，其與標靶RNA序列例如TTR基因相互作用以引導標靶RNA之裂解。
於一些態樣中，本發明之iRNA劑係24-30個核苷酸之dsRNA，其與標靶RNA序列例如TTR基因相互作用以引導標靶RNA之裂解。
如本文中所用，術語「核苷酸突出(nucleotide overhang)」指代從雙股iRNA之雙鏈體結構凸出的至少一個未配對之核苷酸。舉例而言，當dsRNA之一股的3'-末端延伸超過另一股之5'-末端，或與之相反，則存在核苷酸突出。dsRNA可包含具有至少一個核苷酸之突出；或者該突出可包含至少兩個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、至少五個核苷酸或更多個。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，其中該核苷酸/核苷類似物包括去氧核苷酸/核苷。突出可位於有義股上、反義股上或其任意組合上。此外，突出之核苷酸可存在於dsRNA之反義股或有義股之5'-末端、3'-末端或兩端。
於一個態樣中，dsRNA之反義股具有突出在3'-末端或5'-末端之1至10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。於一個態樣中，dsRNA之有義股具有突出在3'-末端或5'-末端之1至10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。於另一態樣中，該突出中之一個或多個核苷酸被替換為核苷硫代磷酸酯。
於某些態樣中，該dsRNA之反義股具有突出在3'-末端或5'-末端之1至10個核苷酸，例如0至3、1至3、2至4、2至5、4至10、5至10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。於一個態樣中，dsRNA之有義股具有突出在3'-末端或5'-末端之1至10個核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。於另一態樣中，該突出中之一個或多個核苷酸被替換為核苷硫代磷酸酯。
於某些態樣中，dsRNA之反義股具有突出在3'-末端或5'-末端之1至10個核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。於某些態樣中，位於有義股或反義股或兩者上之突出可包括長於10個核苷酸之延伸長度，例如，1至30個核苷酸、2至30個核苷酸、10至30個核苷酸、10至25個核苷酸、10至20個核苷酸或10至15個核苷酸之長度。於某些態樣中，延伸之突出位於雙鏈體之有義股。於某些態樣中，延伸之突出存在於雙鏈體之有義股的3'末端。於某些態樣中，延伸之突出存在於雙鏈體之有義股的5'末端。於某些態樣中，延伸之突出位於雙鏈體之反義股。於某些態樣中，延伸之突出存在於雙鏈體之反義股的3'末端。於某些態樣中，延伸之突出存在於雙鏈體之反義股的5'末端。於某些態樣中，延伸之突出中之一個或多個核苷酸被替換為核苷硫代磷酸酯。於某些態樣中，突出包括自身互補之部分，使得該突出能夠形成在生理學條件下安定之髮夾結構。
「鈍(blunt)」或「鈍端(blunt end)」意指於雙股RNA劑之末端沒有未配對之核苷酸，亦即，沒有核苷酸突出。「鈍端之」雙股RNA劑於其整個長度上為雙股，亦即，於分子之每一端皆沒有核苷酸突出。本發明之RNAi劑包 括於一端沒有核苷酸突出(亦即，具有一個突出及一個鈍端之劑)或於每一端皆沒有核苷酸突出。最常見之此類分子將於其整個長度上為雙股。
術語「反義股」或「導引股」指代iRNA例如dsRNA之股，其包括與標靶序列例如TTR mRNA實質上互補之區域。
如本文中所用，術語「互補之區域」指代反義股之與本文中定義之序列如標靶序列例如TTR核苷酸序列實質上互補的區域。若互補之區域與標靶序列不完全互補，則誤配可存在於分子之中間區域或末端區域。通常，最能被容忍之誤配存在於末端區域內，例如iRNA之5'末端或3'末端之5、4或3個核苷酸內。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑包括位於反義股中之核苷酸誤配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑之反義股包括不超過4個與標靶mRNA之誤配，例如，反義股包括4、3、2、1或0個與標靶mRNA之誤配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑之反義股包括不超過4個與有義股之誤配，例如，反義股包括4、3、2、1或0個與有義股之誤配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑包括位於有義股中之核苷酸誤配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑之有義股包括不超過4個與反義股之誤配，例如，有義股包括4、3、2、1或0個與反義股之誤配。於一些態樣中，核苷酸誤配位於例如自iRNA之3'端計數之5、4、3個核苷酸內。於另一態樣中，核苷酸誤配係例如位於iRNA劑之3'-末端核苷酸中。於一些態樣中，誤配不處於種子區域中。
因此，本文中所揭示之RNAi劑可含有一個或多個與標靶序列之誤配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過3個誤配(亦即，3、2、1或0個誤配)。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過2個誤配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過1個誤配。於一個態樣 中，本文中所揭示之RNAi劑含有0個誤配。於某些態樣中，如果RNAi劑之反義股含有與標靶序列之誤配，則該誤配較佳可被限定在從互補區域之5'末端或3'末端計數之最末5個核苷酸內。例如，於此類態樣中，對於23個核苷酸之RNAi劑，與TTR基因互補區域之股通常不含位於中心13個核苷酸處之任意誤配。本文中揭示之方法或所屬技術領域中已知之方法可用以確定，含有與標靶序列之誤配的RNAi劑在抑制TTR基因之表現中是否有效。慮及具有誤配之RNAi劑在抑制TTR基因之表現中的效力係重要者，尤其若TTR基因中之特定互補區域係已知具有該種群內之多態性序列變異。
如本文中所用，術語「有義股」指代iRNA之股，其包括與如本文中定義之術語之反義股之區域實質上互補的區域。
如本文中所用，「實質上全部核苷酸係經修飾者」大多數並非全部經修飾，且可包括不超過5、4、3、2或1個未經修飾之核苷酸。
如本文中所用，術語「裂解區域」指代位於緊鄰裂解位點處之區域。裂解位點係標靶上之裂解出現處之位點。於一些態樣中，裂解區域包含位於裂解位點任一端且緊鄰該裂解位點的三個鹼基。於一些態樣中，裂解區域包含位於裂解位點任一端且緊鄰該裂解位點的兩個鹼基。於一些態樣中，裂解位點特異性地出現於反義股之藉由核苷酸10及11鍵結之位點，且裂解區域包含核苷酸11、12及13。
如本文中所用且除非明確排除，否則當術語「互補」用來揭示關於第二核苷酸序列之第一核苷酸序列時，指代包含該第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下與包含該第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸雜交且形成雙鏈體結構的能力，如具有通常知識者所理解者。舉例而言，此等條件 可係嚴苛條件，其中嚴苛條件可包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃、12至16小時，之後洗滌(參見，例如，《分子克隆：實驗室手冊》(“Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Sambrook,et al.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press))。可施加其他條件，諸如生理學相關條件，如可在有機體內部遭遇者。通常知識者將能夠根據所雜交之核苷酸的最終應用而確定最適用於兩個序列之互補性測試的條件集。
如本文中所述之iRNA如dsRNA內之互補序列包括包含第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸在一個或兩個核苷酸序列之整體長度上的鹼基配對。此類序列可指代為彼此「完全互補」。惟，本文中，若第一序列指代為與第二序列「實質上互補」，則當雜交形成多達30個鹼基對之雙鏈體時，兩個序列可係完全互補，或它們可形成一個或多個但通常不超過5、4、3、或2個誤配鹼基對，同時保留在最適於其最終應用之條件下雜交的能力，例如對基因表現的活體外或活體內抑制。惟，若兩個寡核苷酸設計為當雜交時形成一個或多個單股突出，則此類突出不應視為關於確定互補性之誤配。舉例而言，包含一個長度為21個核苷酸之寡核苷酸及另一個長度為23個核苷酸之寡核苷酸的dsRNA，其中該較長之核苷酸包含一個與該較短之核苷酸完全互補的21個核苷酸之序列，對於本文所揭示之目的，仍可指代為「完全互補」。
如本文中所用，「互補之」序列亦可包括非Watson-Crick鹼基對或從非天然核苷酸及經修飾之核苷酸形成的鹼基對，或完全由其形成，只要對其雜交能力之上述需求得以滿足即可。此類非Watson-Crick鹼基對包括但不限於，G：U Wobble鹼基配對或Hoogsteen鹼基配對。
本文中，術語「互補」、「完全互補」及「實質上互補」可關於dsRNA之有義股與反義股之間或兩個寡核苷酸或多核苷酸雙股RNA劑之反義股與標靶序列之間的鹼基配對而使用，如可從其用途之語境中理解者。
如本文中所用，與信使RNA(mRNA)之「至少一部分實質上互補」之多核苷酸指代與感興趣之mRNA(例如，編碼TTR之mRNA)之接續部分實質上互補之多核苷酸。舉例而言，如果序列與編碼TTR基因之mRNA之非中斷部分實質上互補，則該多核苷酸與TTR mRNA之至少一部分互補。
據此，於一些態樣中，本文中揭露之反義多核苷酸與標靶TTR序列完全互補。於其他態樣中，反義多核苷酸與標靶互補組分TTR序列實質互補，且包含一接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列在其整個長度上與SEQ ID NO：1、3、5、7或9中任一者或SEQ ID NO：1、3、5、7或9中任一者之片段的等效核苷酸序列區域為至少80%互補，諸如約85%、約86%、約87%、約88%、約85%、約90%、約%91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%互補。
於其他態樣中，本文揭露之反義多核苷酸與標靶TTR序列實質上互補，並且包含一接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列係在其整個長度上與表2至5、5及6任一者中之任一有義股核苷酸序列或表2、3、5及6任一者中之任一有義股核苷酸序列的片段為至少約80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約95%、約97%、約98%、約99%、或100%互補。
於一個態樣中，本揭露之RNAi劑包括一有義股，該有義股與反義多核苷酸實質上互補，該反義多核苷酸反而與標靶TTR序列相同，其中該有 義股多核苷酸係包含一接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列係在其整個長度上與SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12或者SEQ ID NO：2、4、6、8、10或10中任一者片段之等效核苷酸序列區域為至少約80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約95%、約97%、約98%、約99%、或100%互補。
於一些態樣中，本發明之iRNA包含有義股，該有義股與反義多核苷酸實質上互補，該反義多核苷酸反而與標靶TTR序列相同，其中該有義股多核苷酸包含一接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列係在其整個長度上與表2、表3、表5及表6任一者中之任一反義股核苷酸序列或表2、表3、表5及表6任一者中之任一反義股核苷酸序列的片段為至少約80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約95%、約97%、約98%、約99%、或100%互補。
通常，「iRNA」包括具有化學修飾之核糖核苷酸。此類修飾可包括本文中揭露或所屬技術領域中已知之全部類型之修飾。對於本說明書及申請專利範圍之目的，任何此類修飾，如在dsRNA分子中所用者，為「iRNA」所涵蓋。
於本揭露之某些態樣中，將去氧核苷酸(若存在)包合於RNAi劑中可被視為構建經修飾之核苷酸。
於本發明之一方面，用於本發明之方法及組成物中之劑係單股反義寡核苷酸分子，其經由反義抑制機制抑制標靶mRNA。單股反義寡核苷酸分子與標靶mRNA內之序列互補。單股反義寡核苷酸可藉由與mRNA進行鹼基配對並且物理地阻礙轉譯機制而以化學計量學方式抑制轉譯，參見，Dias,N.et al., (2002)Mol Cancer Ther 1：347-355。單股反義寡核苷酸分子可係約14至約30個核苷酸之長度，並且具有與標靶序列互補之序列。舉例而言，單股反義寡核苷酸分子可包含序列，該序列係來自本文所揭示之反義序列中任一者之至少約14、15、16、17、18、19、20或更多個接續核苷酸。
如本文中所用，短語「令細胞與iRNA接觸」包括藉由任意可能之手段接觸細胞。令細胞與iRNA接觸包括在活體外令細胞與iRNA接觸或在活體內令細胞與iRNA接觸。接觸可直接或間接進行。因此，舉例而言，iRNA可藉由單獨執行該方法而令其與細胞物理接觸，或作為另一種選擇，可將iRNA置於將允許或造成其後續與該細胞接觸之境地。
舉例而言，可藉由使用iRNA溫育細胞而令該細胞在活體外完成該接觸。舉例而言，可藉由將iRNA注射至細胞所處之組織內或鄰近該組織處，或藉由將iRNA注射至另一區域例如血流或皮下空間內而使得該劑將後續到達待接觸之細胞所處之組織，從而令該細胞在活體內完成該接觸。舉例而言，iRNA可含有引導iRNA至例如肝臟之感興趣部位之例如GalNAc支配體或與該配體偶聯。活體外接觸方法與活體內接觸方法之組合亦係可能者。舉例而言，細胞可在活體外與iRNA接觸，並隨後移植入受試者體內。
於某些態樣中，令細胞與iRNA接觸包括，藉由促進或影響至該細胞內之攝取或吸收而「將iRNA引入或遞送至細胞內」。iRNA之吸收或攝取可透過無輔助之擴散或活性細胞進程而進行，或藉由輔助劑或裝置而進行。將iRNA引入細胞內可係活體外或活體內進程。舉例而言，對於活體內進行之引入，可將iRNA注射至組織部位或全身性投予。在活體外進行之引入細胞內包括所屬 技術領域中已知之方法，例如電穿孔及脂質轉染。其他途徑揭示於下文中或係所屬技術領域中已知者。
術語「脂質奈米顆粒」或「LNP」係媒介，其包含脂質層，該脂質層封裝藥學活性分子，如核酸分子，如iRNA或iRNA自其轉錄之質體。LNP揭示於，舉例而言，美國專利第6,858,225號、第6,815,432號、第8,158,601號及第8,058,069號，該等專利之整體內容藉由引用而併入本文。
如本文中所用，「受試者」係動物諸如哺乳動物，包括靈長類(諸如人、非人靈長類例如猴及黑猩猩)、非靈長類(諸如牛、豬、馬、山羊、兔、綿羊、倉鼠、豚鼠、貓、狗、大鼠、或小鼠)或鳥類，其內源性地或異源性地表現標靶基因。
於一個態樣中，受試者係人，諸如正在進行對將會受益於TTR表現降低之疾病或疾患之治療或評估的人；處於將會受益於TTR表現降低之疾病或疾患風險的人；罹患將會受益於TTR表現降低之疾病或疾患的人；或正在進行對將會受益於TTR表現降低之疾病或疾患之治療的人，如本文中所述。於一些態樣中，受試者係女性。於一些態樣中，受試者係男性。於一個態樣中，受試者係成年受試者。於其他態樣中，受試者係小兒受試者。
於一些態樣中，該人類受試者罹患TTR相關疾病。於其他態樣中，該受試者係處於發展出TTR相關疾病風險之受試者，例如，具有與TTR相關疾病之發展相關聯之TTR基因突變的受試者、具有TTR相關疾病之家族病史的受試者、或具有表明TTR相關疾病之發展的徵象或症候但不符合TTR相關疾病之診斷標準的受試者。
如本文中所用，術語「治療」或「處理」指代有益或所欲之結果，諸如降低受試者體內TTR相關疾患之至少一種跡象或症候。治療亦包括降低一種或多種與不希望之TTR表現相關的跡象或症候；減輕不希望之TTR激活或安定化之程度；緩解或緩和不希望之TTR激活或安定化。「治療」亦可意指相對於在治療缺失情況下預期之生存期而延長生存期。
在受試者之TTR或疾病標記物或症候量級之情境中，術語「降低」指代此量級之統計學顯著之下降。該下降可係，舉例而言，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。於某些態樣中，下降係至少20%。於某些態樣中，下降係疾病標記物例如蛋白質或基因表現量級之至少50%。於受試者體內之TTR量級的情境中，「減少」為降低至如同不具此疾患之個體正常範圍內所接受的量級。於某些態樣中，「下降」係罹患疾病之受試者之標記或症候量級與受試者正常範圍內之接受量級之間的差異減少。術語「減少」也可與將疾病或病症之症候正常化關聯使用，亦即，將罹患TTR相關疾患之受試者體內的量級朝向未罹患TTR相關疾患之正常受試者體內的量級降低或降低至後者。如本文所用，如果疾病與升高之症候值相關聯，「正常」係視為正常之上限。如果疾病與降低之症候值相關聯，「正常」係視為正常之下限。
如本文所用，「預防」或「防止」當參考可藉由TTR基因表現降低而治療或減輕的疾病、疾患或其病症使用時，指代受試者將發展出與此疾病、疾患或病症相關之症候的可能性降低，例如，TTR相關疾患之症候，該疾患例如：老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌病(FAC)、軟腦膜/中 樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病及高甲狀腺素血症。沒有發展出疾病、病症或病況，或減小與此疾病、病症或病況相關之症狀的發展(例如，將該疾病或病症之臨床可接受規模上減小至少約10%)，或顯現症狀之延遲(例如，延遲幾天、幾週、幾個月或幾年)，係視為有效之預防。
如本文所用，「TTR相關疾病」旨在包括與TTR基因或蛋白質相關之任何疾病。此類疾病可以由，例如，TTR蛋白質之過量產生、TTR基因突變、TTR蛋白質之異常裂解、TTR四聚物之不安定性、TTR與其他蛋白質或其他內源性或外源性物質之間的異常相互作用所引起。「TTR相關疾病」包括任何類型的甲狀腺素運載蛋白媒介之澱粉樣變性病(ATTR澱粉樣變性病)，其中TTR於異常細胞外聚集或澱粉樣沉積中扮演角色，例如，遺傳性ATTR(h-ATTR)澱粉樣變性病或非遺傳性ATTR(ATTR)澱粉樣變性病。TTR相關相關疾病包括老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、澱粉樣變性玻璃體渾濁、腕管症候群、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病。TTR澱粉樣變性病之症候包括感覺神經病變(例如，感覺異常、遠端胺體感覺遲鈍)、自律性神經病變(例如，胃腸道機能障礙，諸如胃潰瘍起立性低血壓)、運動神經病變、猝發癲癇、失智症、脊髓病、多發性神經病變、腕管症候群、自律性機能不全、心肌病、玻璃體混濁、腎機能不全、腎病變、實質上降低之mBMI(改變之身體質量指數)、顱神經機能障礙及角膜格狀營養不良。
如本文中所用，「治療有效量」旨在包括RNAi劑之下述之量，當將該RNAi劑向患有TTR相關疾病之受試者投予時，其量足以有效治療該疾患(例如，藉由削弱、緩解或維持現有疾病或疾病之一種或多種症狀)。「治療有效量」可依據RNAi劑、該劑如何投予、疾病及其嚴重性及待治療之受試者的病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、先前治療或並行治療之類型(若存在)、以及其他個體特徵而變。
如本文中所用，「預防有效量」旨在包括RNAi劑之下述之量，當將該RNAi劑向患有TTR相關疾患之受試者投予時，其量足以預防或緩解該疾患或該疾患之一種或多種症狀。緩解該疾病包括減緩該疾病之進程或減輕後來發展之疾病的嚴重性。「預防有效量」可依據RNAi劑、該劑如何投予、疾病風險程度及待治療之患者的病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、先前治療或並行治療之類型(若存在)、以及其他個體特徵而變。
「治療有效量」或「預防有效量」亦包括以可用於任意治療之合理效益/風險比率產生一些所欲效果之RNAi劑的量。本發明方法中採用之iRNA可以足以產生可用於此治療之合理效益/風險比率的量投予。
本文中，短語「藥學上可接受」用以指代彼等化合物、材料、組成物或劑型，其處於適用於與人類受試者及動物受試者之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症之所謂醫療判斷之範疇內，與合理效益/風險比率相稱。
如本文中所用，短語「藥學上可接受之載劑」意指藥學上可接受之材料、組成物或媒介物，諸如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、製造助劑(例如，潤滑劑、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、或硬脂酸)、或溶劑封裝 材料，其牽涉入將受試化合物從一個器官或身體部分攜帶或運送至另一器官或身體部分。就與製劑之其他成分相容且不損害被治療之受試者而言，每一載劑必須係「可接受」者。此類載劑係所屬技術領域中已知者。藥學可接受之載劑包括用於藉由注射投予之載劑。
如本文中所用，術語「樣本」包括從受試者單離之相似體液、細胞或組織的集合，以及受試者體內存在之體液、細胞或組織。生物體液之實例包括血液、血清及漿膜液、血漿、腦脊液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。組織樣本可包括來自組織、器官或局部區域之樣本。舉例而言，樣本可源自特定之器官、器官之部分、或彼等器官內之體液或細胞。於某些態樣中，樣本可源自肝臟(例如，全肝或肝臟之某些區段或肝臟中某些類型之細胞，例如，肝細胞)。於一些態樣中，「源自受試者之樣本」指代從受試者獲得之尿液。「源自受試者之樣本」可指代來自受試者之血液或源自血液之血清或血漿。
II.本發明之iRNA
本發明提供抑制該TTR基因之表現的iRNA。於某些態樣中，該iRNA包括用於抑制TTR基因在細胞中之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)分子，該細胞諸如受試者體內的細胞，該受試者例如哺乳動物，諸如易於發展出TTR相關疾患之人類，該疾患例如老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族愛心澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉變性心肌病(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病及高甲狀腺素血症。該dsRNAi劑包括具有互補區域之反義股，該互補區域係與在TTR基因表現中所形成之mRNA的至少一部分互補。該互補區域係約19至30個核苷酸之長度(例如，約30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20或19個核苷酸之長度)。
當與表現TTR基因之細胞接觸時，該iRNA將TTR基因(例如，人類、靈長類、非靈長類或大鼠TTR基因)之表現抑制至少約50%，如藉由例如PCR或基於分支鏈DNA(bDNA)之方法所檢定，或藉由基於蛋白質之方法諸如藉由使用例如西方墨點法之免疫螢光分子或流式細胞術所檢定。於某些態樣中，表現之抑制係藉由本文之實施例中提供之qPCR方法測定，siRNA係例如10nM濃度，於該申請中提供之適宜生物體細胞株中進行。於某些態樣中，活體內表現之抑制係藉由敲除表現人類基因之囓齒動物(例如，表現人類標靶基因之小鼠或經AAV轉染之小鼠)體內之人類基因而測定，例如，當在RNA表現之最低點投予3mg/kg之單一劑量時。
dsRNA包括兩個RNA股，在該dsRNA將被使用之條件下，該兩股互補並雜交以形成雙鏈體結構。dsRNA之一股(反義股)包括一互補區域，該互補區域與標靶系列實質上互補且通常完全互補。標靶序列可源自在TTR基因表現過程中形成之mRNA序列。另一股(有義股)包括一區域，該區域與該反義股互補，使得當在適宜條件下組合時，兩股雜交並形成雙鏈體結構。如本文中他處所述，dsRNA之互補序列亦可作為單個核酸分子之自互補區域而保護，與作為獨立之寡核苷酸相反。
通常，該雙鏈體結構係15至30個鹼基對之長度，如15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、 20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個鹼基對之長度。於某些態樣中，雙鏈體結構係18至25個鹼基對之長度，例如，18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至25、21至24、21至23、21至22、22至25、22至24、22至23、23至25、23至24或24至25個鹼基對之長度，例如，19至21個鹼基對之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
類似地，與標靶序列互補之區域係15至30個核苷酸之長度，例如，15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個核苷酸之長度，例如，19至23個核苷酸之長度或21至23個核苷酸之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
於一些態樣中，該雙鏈體區域係19至30個鹼基對之長度。同樣，與標靶序列互補之區域係19至30個核苷酸之長度。
於一些態樣中，該dsRNA係約19至約23個核苷酸之長度，或約25至約30個核苷酸之長度。通常，該dsRNA足夠長，以用作切丁酶之受質。 舉例而言，本技術領域中習知，長度超過約21至23個核苷酸之dsRNA可用作切丁酶之受質。本技術領域中具有通常知識者亦應認知，作為裂解標靶之RNA區域最通常係較大RNA分子之一部分，一般為mRNA分子。若相關，則mRNA標靶之「一部分」係mRNA標靶之接續序列，其長度足以令其作為RNAi引導之裂解(亦即，透過RISC途徑裂解)的受質。
所屬技術領域中通常知識者亦應認知，雙鏈體區域係dsRNA之主要功能性部分，例如，約19至約30個鹼基對，例如，約19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個鹼基對之雙鏈體區域。因此，於一個態樣中，就其被加工為例如15至30個鹼基對之以用於裂解之所欲RNA為靶向之官能性雙鏈體的程度而言，具有超過30個鹼基對之RNA分子或RNA分子之複合體係dsRNA。因此，所屬技術領域中通常知識者將認知，於一個態樣中，miRNA為dsRNA。於另一態樣中，dsRNA不是天然出現之miRNA。於另一態樣中，可用於靶向TTR基因表現之iRNA劑並非藉由較大dsRNA之裂解而在標靶細胞內生成。
本文中所述之dsRNA可復包括一個或多個具有例如1至4、2至4、1至3、2至3、1、2、3或4個核苷酸之單股核苷酸突出。相對於其鈍端之對應物，具有至少一個核苷酸突出之dsRNA可具有傑出之抑制特性。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，其中該核苷酸/核苷類似物包括去氧核苷 酸/核苷。突出可位於有義股、反義股或其任意組合。此外，突出之核苷酸可存在於dsRNA之反義股或有義股之5'-末端、3'-末端或兩末端。
dsRNA可藉由所屬技術領域中已知之標準方法合成。本發明之雙股RNAi化合物可使用兩步之過程製備。首先，雙股RNA分子之個體股係單獨製備。隨後，將該等組分股黏著。該siRNA化合物之個體股可使用溶液相有機合成、固相有機合成或兩者製備。有機合成提供下述優點：包含非天然或經修飾之核苷酸的寡核苷酸股可輕易製備之。同樣，本發明之單股寡核苷酸可使用溶液相有機合成、固相有機合成或兩者製備。
一方面，本發明之dsRNA係包括至少兩個核苷酸序列：有義序列及反義序列。該有義股選自表2、表2、表5及表6之任一者中提供之序列所組成之群組，而該有義股之相應反義股序列係選自表2、表3、表5及表6中任一者之序列所組成之群組。於此方面，該兩個序列之一者與該兩個序列之另一者互補，且該等序列之一者係與在TTR基因之表現中生成之mRNA序列實質上互補。如是，於此方面，dsRNA將包括兩個寡核苷酸，其中一個寡核苷酸係揭示為表2、表3、表5及表6中任一者之有義股，而第二個寡核苷酸係揭示為表2、表3、表5及表6中任一者之有義股的對應反義股。
於某些態樣中，該dsRNA之實質上互補序列包含在獨立之寡核苷酸上。於其他態樣中，該dsRNA之實質上互補序列包含在單個寡核苷酸上。
應理解，舉例而言，儘管表2中之序列係揭示為經修飾或經接合之序列，但本發明之iRNA之RNA如本發明之dsRNA可包含表2、表3、表5及表6中任一者中詳述之任一序列，其係未經修飾、未經接合、或經不同於表中所述者之修飾或經不同於表中所述者之接合者。換言之，本發明涵蓋表2、表3、 表5及表6之dsRNA，其係未經修飾、未經符合、經修飾或經複核，如本文所揭示。
通常知識者應知悉，具有約20至23個鹼基對如21個鹼基對之雙鏈體結構的dsRNA業經被稱為在誘導RNA干擾中尤其有效(Elbashir et al.,EMBO2001,20：6877-6888)。惟，其他人業經發現，更短或更長之RNA雙鏈體結構亦可係有效者(Chu and Rana(2007)RNA 14：1714-1719；Kim et al.(2005)Nat Biotech23：222-226)。於上文揭示之態樣中，憑藉本文中提供之寡核苷酸序列之天性，表2、表3、表5及表6任一者中提供之dsRNA可包括至少一個長度為最少21個核苷酸之股。可合理地預期，僅在一端或兩端減去幾個核苷酸的具有表2、表3、表5及表6中任一者中之序列之較短雙鏈體可能具備與上述dsRNA類似之效果。因此，具有源自表2、表3、表5及表6任一者之任一序列之至少19、20或更多個接續核苷酸之序列且其抑制TTR基因表現之能力與包含全序列dsRNA相異不超過約5%、10%、15%、20%、25%或30%的dsRNA，係預期處於本發明之範疇內。
此外，表2、表3、表5及表6中提供之RNA鑑定對RISC中介之裂解敏感的TTR轉錄本中之位點。如是，本發明復提出以此等位點之一者為靶向之iRNA。如本文中所用，如果iRNA促進該特定位點內任意處之轉錄本的裂解，則稱該iRNA為以RNA轉錄本之特定位點內為靶向。此iRNA通常將包括來自表2、表3、表5及表6任一者所提供之任一序列的至少約19個接續核苷酸，該接續核苷酸係與取自TTR基因中所選擇序列之接續區域的另一核苷酸序列偶聯。
III.本發明之修飾iRNA
於某些態樣中，本發明之iRNA之RNA例如dsRNA未經修飾，且不包含例如所屬技術領域中已知及本文所述之化學修飾或接合。於其他態樣中，本發明之iRNA之RNA例如dsRNA經化學修飾以增強安定性或其他有益特徵。於本發明之某些態樣中，本發明之iRNA的實質上全部核苷酸係經修飾。於本發明之其他態樣中，iRNA之全部核苷酸或iRNA之實質上全部核苷酸係經修飾，亦即，不超過5、4、3、2或1個未經修飾之核苷酸存在於iRNA之股內。
本發明提出之核酸可藉由所屬技術領域中良好構建至方法合成或修飾，該方法係例如彼等於《現代核酸化學技術》(“Current protocols in nucleic acid chemistry,”Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA)中揭示者，該文獻藉由引用而併入本文。修飾包括，舉例而言，末端修飾，例如，5'-末端修飾(磷醯化、接合、反向鏈結)或3'-末端修飾(接合、DNA核苷酸、反向鏈結等)；鹼基修飾，例如，替換為安定化鹼基、去安定化鹼基、或與同伴之拓展物進行鹼基配對之鹼基，移除鹼基(無鹼基之核苷酸)，或接合鹼基；糖修飾(例如，在2’-位置或4'-位置)或糖之取代；或骨幹修飾，包括磷酸二酯類鏈結之修飾或取代。可用於本文所述態樣中之iRNA化合物之具體示例包括，但不限於，含有經修飾之骨幹或不含天然核苷酸間鏈結之RNA。具有經修飾之骨幹的RNA除此之外亦包括彼等在骨幹中不具有磷原子者。對於本說明書之目的，且如所屬技術領域中有時參照者，在其核苷酸間骨幹中不具有磷原子的經修飾之RNA亦可視為寡核苷酸。於一些態樣中，經修飾之RNA將在其核苷酸間骨幹中具有磷原子。
經修飾之RNA骨幹包括，舉例而言，具有正常3'-5'鏈結之硫代磷酸酯類、手性硫代磷酸酯類、二硫代磷酸酯類、磷酸三酯類、胺基烷基磷酸三酯類、包括3'-伸烷基膦酸酯類及手性膦酸酯類之甲基及其他烷基膦酸酯類(phosphonates)、次膦酸酯類(phosphinates)、包括3'-胺基磷酸醯胺及胺基烷基磷酸醯胺之磷酸醯胺(phosphoramidates)、硫羰基磷酸醯胺類、硫羰基烷基膦酸酯類、硫羰基烷基磷酸三酯類、以及硼磷酸酯類；此等之2’-5'鏈結類似物；以及彼等具有反向極性者，其中相鄰至核苷單元對係將3'-5'鏈接至5'-3'或將2’-5'鏈接至5'-2’。亦可包括多種鹽類、混合鹽類及游離酸形式。於本發明之一些態樣中，本發明之dsRNA劑可係游離酸形式。於本發明之其他態樣中，本發明之dsRNA劑可係鹽形式。於一個態樣中，本發明之dsRNA劑可係鈉鹽形式。於某些態樣中，當本發明之dsRNA劑係鈉鹽形式時，鈉離子可作為該劑中存在之實質上全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯基團之抗衡離子而存在於該劑中。其中實質上全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯類鏈結皆具有鈉抗衡離子之劑，包括不超過5、4、3、2或1個沒有鈉抗衡離子之磷酸二酯及/或硫代磷酸酯類鏈結。於一些態樣中，當本發明之dsRNA劑係鈉鹽形式時，鈉離子可作為該劑中存在之全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯基團之抗衡離子而存在於該劑中。
教示上述含磷鏈結之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第3,687,808號、第4,469,863號、第4,476,301號、第5,023,243號、第5,177,195號、第5,188,897號、第5,264,423號、第5,276,019號、第5,278,302號、第5,286,717號、第5,321,131號、第5,399,676號、第5,405,939號、第5,453,496號、第5,455,233號、第5,466,677號、第5,476,925號、第5,519,126號、第5,536,821號、第5,541,316號、第5,550,111號、第5,563,253號、第5,571,799號、第5,587,361 號、第5,625,050號、第6,028,188號、第6,124,445號、第6,160,109號、第6,169,170號、第6,172,209號、第6,239,265號、第6,277,603號、第6,326,199號、第6,346,614號、第6,444,423號、第6,531,590號、第6,534,639號、第6,608,035號、第6,683,167號、第6,858,715號、第6,867,294號、第6,878,805號、第7,015,315號、第7,041,816號、第7,273,933號、第7,321,029號、及美國再公告專利第39464號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
其內部不包括磷原子之經修飾之RNA骨幹具有藉由短鏈烷基或環烷基類核苷酸間鏈結、混合雜原子及烷基或環烷基核苷酸間鏈結、或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷酸間鏈結形成的骨幹。此等包括彼等具有N-嗎啉基鏈結(部分地由核苷之糖部分形成)；矽氧烷骨幹；硫醚、亞碸及碸骨幹；甲醯基及硫代甲醯基骨幹；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基骨幹；含有伸烷基之骨幹；胺基磺酸酯骨幹；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基骨幹；磺酸酯及磺醯胺骨幹；醯胺骨幹；以及其他具有混合之N、O、S及CH2組分部分者。
教示上述寡核苷酸之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,034,506號、第5,166,315號、第5,185,444號、第5,214,134號、第5,216,141號、第5,235,033號、第5,64,562號、第5,264,564號、第5,405,938號、第5,434,257號、第5,466,677號、第5,470,967號、第5,489,677號、第5,541,307號、第5,561,225號、第5,596,086號、第5,602,240號、第5,608,046號、第5,610,289號、第5,618,704號、第5,623,070號、第5,663,312號、第5,633,360號、第5,677,437號、及第5,677,439號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
適宜之RNA模擬物預期用於本文提供之iRNA中，其中核苷酸單元之糖及核苷酸間鏈結兩者亦即骨幹係替換為新穎基團。鹼基單元維持與適 宜之核酸標靶化合物雜交。一種此類寡聚化合物，其中業經顯示具有優異雜交特性之RNA模擬物指代為胜肽核酸(PNA)。於PNA化合物中，RNA之糖骨幹替換為含有醯胺之骨幹，尤其是胺基乙基甘油骨幹。核酸鹼基得以保留，且直接或間接地鍵結至骨幹之醯胺部分的氮雜氮原子。教示PNA化合物之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,539,082號、第5,714,331號、及第5,719,262號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。適用於本發明之iRNA中之額外之PNA化合物揭示於，舉例而言，Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500中。
本發明提出之一些態樣包括具有硫代磷酸酯骨幹之RNA以及具有雜原子管之寡核苷酸，尤其是上文引用之美國專利第5,489,677號的--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI骨幹]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及--N(CH3)--CH2--CH2--，以及上文引用之美國專利第5,602,240號的醯胺骨幹。於一些態樣中，本文提出之RNA具有上文引用之美國專利第5,034,506號的嗎啉基骨幹結構。天然磷酸二酯骨幹可以表示為O-P(O)(OH)-OCH2-。
經修飾之RNA亦可含有一個或多個經取代之糖部分。本文提出之iRNA如dsRNA可包括位於2’位置之下述之一者：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基及炔基可係經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。例示性之適宜修飾包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3,O(CH2)nONH2、及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n及m係從1至約10。於其他態樣中，dsRNA包括位於2’位置之下述之一者：C1至C10低級烷基、經取代之低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、 Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷基芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基團、保護基團、嵌入劑、用於改善iRNA之藥物動力學特性之基團、或用於改善iRNA之藥效動力學特性之基團、以及其他具有類似特性之取代基。於一些態樣中，該修飾包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3，亦稱為2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，亦即，烷氧基-烷氧基基團。另一例示性修飾為2’-二甲基胺基氧乙氧基，亦即，O(CH2)2ON(CH3)2基團，亦稱為2’-DMAOE，如下文實施例中所述；以及2’-二甲基胺基乙氧基乙氧基(本技術領域中亦稱為2’-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，亦即，2’-O--CH2--O--CH2--N(CH3)2。其他示例性修飾包括：5'-Me-2’-F核苷酸、5'-Me-2’-OMe核苷酸、5'-Me-2’去氧核苷酸(於此三組中，皆係R異構物與S異構物兩者)；2’-烷氧基烷基；以及2’-NMA(N-甲基乙醯胺)。
其他修飾包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-胺基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)及2’-氟(2’-F)。類似之修飾亦可在iRNA之RNA之其他位置作成，尤其是3'端核苷酸之糖的3'位置或2’-5'鏈結之dsRNA中以及5'端核苷酸之5'位置。iRNA亦可具有替代呋喃戊糖基糖的糖模擬物如環丁基部分。教示此類經修飾之糖結構之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第4,981,957號、第5,118,800號、第5,319,080號、第5,359,044號、第5,393,878號、第5,446,137號、第5,466,786、第5,514,785號、第5,519,134號、第5,567,811號、第5,576,427號、第5,591,722號、第5,597,909號、第5,610,300號、第5,627,053號、第5,639,873號、第5,646,265號、第5,658,873號、第5,670,633號及第 5,700,920號，其中某些為本申請所共同擁有者。前述者各自之整體內容藉由引用併入本文。
iRNA亦可包括核酸鹼基(所屬技術領域中一般簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文中所用，「未經修飾」或「天然」核酸鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核酸鹼基包括其他合成及天然核酸鹼基，諸如去氧胸苷(dT)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-胺基腺嘌呤；腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物；腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶；5-鹵尿嘧啶、5-鹵胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤；5-鹵，尤其是5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤；7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤；以及3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。其他核酸鹼基包括彼等揭露於美國專利第3,687,808號中者；彼等揭露於《生物化學、生物技術及醫藥中之經修飾之核苷酸》(Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008)中者；彼等揭露於《聚合物科學及工程之簡明百科》(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990)中者；此等由Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613揭露者；以及彼等由《dsRNA研究及應用》第15章第289至302頁(Sanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993)揭露者。此等核酸鹼基中之某些尤其可用於增加本發明提出之寡聚化合物的結合親和性。此等包括5-取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及O-6取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙基尿嘧啶及5-丙基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代業經顯示將核酸雙鏈體穩定性增加0.6至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)且係示例性之鹼基取代，尤其是當與2’-O-甲氧基乙基糖修飾合用時尤甚。
教示某些上述經修飾之核酸鹼基以及其他經修飾之核酸鹼基的代表性美國專利包括但不限於，上述之美國專利第3,687,808號、第4,845,205號、第5,130,30號、第5,134,066號、第5,175,273號、第5,367,066號、第5,432,272號、第5,457,187號、第5,459,255號、第5,484,908號、第5,502,177號、第5,525,711號、第5,552,540號、第5,587,469號、第5,594,121號、第5,596,091號、第5,614,617號、第5,681,941號、第5,750,692號、第6,015,886號、第6,147,200號、第6,166,197號、第6,222,025號、第6,235,887號、第6,380,368號、第6,528,640號、第6,639,062號、第6,617,438號、第7,045,610號、第7,427,672號、及第7,495,088號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
於一些態樣中，本揭露之RNAi劑亦可經修飾，以包括一個或多個雙環糖部分。「雙環糖」係以藉由將兩個或相鄰或非相鄰之碳橋接所形成之環修飾的呋喃糖基環。「雙環核苷」(「BNA」)係核苷，其具有包含藉由將糖環之兩個或相鄰或非相鄰之碳橋接所形成之環的糖部分，從而形成雙環系統。於某些態樣中，橋視需要經由2’非環氧原子連結糖環之4'碳與2’碳。因此，於一些態樣中，本發明之劑可包括一個或多個鎖定之核酸(LNA)。鎖定之核酸係具有經修 飾之核糖部分的核苷酸，其中該核糖部分包含連結2’碳與4'碳之外接橋。換言之，LNA係包含雙環糖部分之核苷酸，其中該雙環糖部分包含4'-CH2-O-2’橋。這一結構有效地將該核糖「鎖定」為3'-環內結構之構象。將鎖定之核酸加至siRNA中業經顯示增加血清中siRNA安定性，且降低脫靶效應(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。用於本發明之多核苷酸之雙環核苷的示例包括而不限於，包含位於4'核糖基環原子與2’核糖基環原子間之橋的核苷。於某些態樣中，本發明之反義多核苷酸劑包括一個或多個包含4'至2’橋之雙環核苷。
鎖定之核苷酸可以藉由以下結構表示(忽略立體化學)，
Figure 111128947-A0202-12-0053-136
其中，B為核鹼基或經修飾之核鹼基，並且L為將核糖環之2’-碳與4'-碳鏈接的鏈結基團。此類4'至2’橋接之雙環核苷的示例包括但不限於，4'-(CH2)-O-2’(LNA)；4'-(CH2)-S-2’；4'-(CH2)2-O-2’(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2’(亦指代為「約束之乙基(constrained ethyl)」或「cEt」)及4'-CH(CH2OCH3)-O-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第7,399,845號)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第8,278,283號)；4'-CH2-N(OCH3)-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第8,278,425號)；4'-CH2-O-N(CH3)-2’(參見，例如，美國專利公佈第2004/0171570號)；4'-CH2-N(R)-O-2’，其中R為 H、C1-C12烷基、或氮保護基團(參見，例如，美國專利第7,427,672號)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2’(參見，例如，Chattopadhyaya et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4'-CH2-C(=CH2)-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第8,278,426號)。前述者各自之整體內容藉由引用併入本文。
教示鎖定之核酸核苷酸之製備的其他代表性美國專利及美國專利公開包括但不限於下列者：美國專利第6,268,490號、第6,525,191號、第6,670,461號、第6,770,748號、第6,794,499號、第6,998,484號、第7,053,207號、第7,034,133號、第7,084,125號、第7,399,845號、第7,427,672號、第7,569,686號、第7,741,457號、第8,022,193號、第8,030,467號、第8,278,425號、第8,278,426號、第8,278,283號、美國專利公開案第2008/0039618號及第2009/0012281號，其各自之整體內容係藉由引用而併入本文。
前述雙環核苷之任意者可製備為具有一種或多種立體化學糖組態，包括，舉例而言，α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(參見，WO 99/14226)。
iRNA之RNA亦可經修飾，以包括一個或多個約束之乙基核苷酸。如本文中所用，「約束之乙基核苷酸」或「cEt」包含雙環糖部分之鎖定之核酸，其中該雙環糖部分包含4'-CH(CH3)-O-2’橋(亦即，前述結構中之L)。於一個態樣中，約束之乙基核苷酸係S構象，本文中指代為「S-cEt」。
本發明之iRNA亦可經修飾，以包括一個或多個「構象上受限之核苷酸(conformationally restricted nucleotides)」(「CRN」)。CRN係具有連結核糖之C2’碳與C4'碳或核糖之C3碳與C5'碳之鏈結子的核苷酸類似物。CRN將該核糖鎖定為穩定之構象，且增加其與mRNA之雜交親和性。該鏈接基足夠長，以將氧置於對於安定性及親和性為最優之位置，從而令核糖不易起皺。
教示上述CRN之製備的代表性專利公開包括但不限於，美國專利公開第第2013/0190383號及PCT公開第WO 2013/036868號，其各自之整體內容係藉由引用而併入本文。
於一些態樣中，本發明之iRNA包含一個或多個作為UNA(未鎖定之核酸)核苷酸之單體。UNA係未鎖定之非環狀核酸，其中該糖之任意鍵業經移除，形成未鎖定之「糖」殘基。於一實例中，UNA亦涵蓋其C1'-C4'鍵(亦即，位於C1'碳與C4'碳間之碳-氧-碳共價鍵)業經移除之單體。於另一示例中，糖之C2’-C3'鍵(亦即，位於C2’碳與C3'碳之間的碳-碳共價鍵)業經移除(參見，Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)及Fluiter et al.,Mol.Biosyst.,2009,10,1039，藉由引用併入本文)。
教示UNA之製備的代表性美國專利公開係包括但不限於，美國專利第8,314,227號及美國專利公開第2013/0096289號、第2013/0011922號、及第2011/0313020號，其各自之整體內容係藉由引用而併入本文。
對RNA分子之末端的潛在穩定化修飾可包括N-(乙醯基胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-(乙醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸腺嘧啶-2’-O-去氧胸腺嘧啶(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-二十二醯基-尿苷-3"-磷酸酯、反向鹼基dT(idT)等。這一修飾之揭露可見於PCT申請第WO 2011/005861號中。
本發明之iRNA之核苷酸的其他修飾包括5'磷酸酯或5'磷酸酯模擬物，如位於iRNA劑之反義股的5'端磷酸酯或磷酸酯模擬物。適宜之磷酸酯模擬物揭露於，舉例而言，美國專利公開第2012/0157511號中，其整體內容藉由引用而併入本文。
A.本發明之包含模體的經修飾之iRNA
於本發明之某些方面，本發明之雙股RNA劑包括具有如例如WO2013/075035中所揭露之化學修飾的劑，該申請各自之整體內容藉由引用而併入本文。如本文及WO 2013/075035中所示，可以將一個或多個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體引入dsRNAi劑之有義股或反義股中，尤其在裂解位點處或鄰近裂解位點處。於一些態樣中，dsRNAi劑之有義股及反義股可以其他方式完全修飾。此等模體之引入中斷有義股或反義股之修飾模式(若存在)。dsRNAi劑可視需要與GalNAc衍生物配體例如於有義股接合。
更具體而言，當雙股RNA劑之有義股及反義股經完全修飾以在dsRNAi劑之至少一股的裂解位點處或鄰近裂解位點處具有一個或多個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體時，觀察到了dsRNAi劑之基因緘默化活性。
據此，本發明係提供能在體內抑制標靶基因(亦即，TTR基因)之表現的雙股RNA劑。RNAi劑包含有義股及反義股。RNAi劑之每一股可係，例如，17至30個核苷酸之長度、25至30個核苷酸之長度、27至30個核苷酸之長度、19至25個核苷酸之長度、19至23個核苷酸之長度、19至21個核苷酸之長度、21至25個核苷酸之長度、或21至23個核苷酸之長度。
有義股及反義股典型地形成雙鏈體雙股RNA(「dsRNA」)，本文中亦指代為「dsRNAi劑」。dsRNAi劑之雙鏈體區域可係，舉例而言，雙鏈體區域可係27至30個核苷酸對之長度；19至25個核苷酸對之長度；19至23個核苷酸對之長度；19至21個核苷酸對之長度；21至25個核苷酸對之長度；或21至23個核苷酸對之長度。於另一示例中，該雙鏈體區域係選自19、20、21、22、23、24、25、26及27個核苷酸之長度。
於某些態樣中，dsRNAi劑可含有位於一股或兩股之3'-末端、5'-末端或兩末端的一個或多個突出區域或封端基團。突出可獨立為1至6個核苷酸之長度，例如，2至6個核苷酸之長度、1至5個核苷酸之長度、2至5個核苷酸之長度、1至4個核苷酸之長度、2至4個核苷酸之長度、1至3個核苷酸之長度、2至3個核苷酸之長度、或1至2個核苷酸之長度。於某些態樣中，突出區域可包括上文提供的延伸之突出區域。突出可係一股比另一股長之結果，或係相同長度之兩股交錯之結果。突出可形成與標靶mRNA之誤配，或其可與待作為標靶之基因序列互補或可係另一序列。第一股與第二股亦可藉由例如額外之鹼基結合以形成髮夾，或藉由其他非鹼基鏈結子接合。
於某些態樣中，dsRNAi劑之突出區域中之核苷酸可各自獨立為經修飾或未經修飾之核苷酸，包括但不限於，2’-糖修飾，諸如2’-F、2’-O-甲基胸苷(T)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2’-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)、及其任意組合。
舉例而言，TT可係任一股之任一端之突出序列。突出可形成與標靶mRNA之誤配，或其可與待作為標靶之基因序列互補或可係另一序列。
位於dsRNAi劑之有義股、反義股或兩個之5'-突出或3'-突出可經磷酸化。於一些態樣中，突出區域含有兩個核苷酸且在該兩個核苷酸之間具有硫代磷酸酯，其中，兩個核苷酸可係相同或相異。於一些態樣中，突出存在於有義股、反義股或兩股之3'-末端。於一些態樣中，這一3'-突出存在於反義股中。於一些態樣中，這一3'-突出存在於有義股中。
dsRNAi劑可僅含有單個突出，該突出可強化RNAi劑之干擾活性而不影響其整體安定性。舉例而言，單股突出可位於有義股之3'-末端，或者 位於反義股之3'-末端。該RNAi劑亦可具有鈍端，位於反義股之5'-末端(亦即，有義股之3'-末端)，反之亦然。通常，dsRNAi劑之反義股具有位於3'-末端之核苷酸突出，且5'-末端係鈍端。儘管不欲受縛於理論，但位於反義股5'-末端之不對稱鈍端以及反義股之3'-末端突出有助於將導引股加載至RISC製程中。
於某些態樣中，dsRNAi劑係19個核苷酸長度之雙鈍端者，其中，有義股含有至少一個位於從5'末端位置7、8、9之三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5'末端位置11、12及13之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的模體。
於其他態樣中，dsRNAi劑係20個核苷酸長度之雙鈍端者，其中，有義股含有至少一個位於從5'末端位置8、9及10之三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5'末端位置11、12及13之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的模體。
於又其他態樣中，dsRNAi劑係21個核苷酸長度之雙鈍端者，其中，有義股含有至少一個位於從5'末端位置9、10及11之三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5'末端位置11、12及13位置處之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的模體。
於某些態樣中，dsRNAi劑包含21個核苷酸之有義股及23個核苷酸之反義股，其中，有義股含有至少一個位於從5'末端位置9、10及11之三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體；反義股含有至少一個位於從5'末端位置11、12及13之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的模體，其中，RNAi劑之一端係鈍端而另一端包含具有2個核苷酸之突出。於一個態樣中，具有2個核苷酸之突出位於反義股之3'末端。
當具有2個核苷酸之突出位於反義股之3'末端時，在末端三個核苷酸之間可能存在兩個硫代硫酸酯核苷酸間鏈結，其中，該三個核苷酸中之兩者為突出核苷酸，且第三個核苷酸與緊鄰該突出核苷酸之下一個核苷酸配對。於一個態樣中，RNAi劑在有義股之5'末端及反義股之5'末端兩處額外具有位於末端三個核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。於某些態樣中，dsRNAi劑之有義股及反義股中之每一個核苷酸，包括作為模體之一部分的核苷酸，皆係經修飾之核苷酸。於某些態樣中，每一殘基獨立經2’-O-甲基或3'-氟以例如交替模體方式修飾。視需要，dsRNAi劑復包含配體(諸如GalNAc3)。
於某些態樣中，dsRNAi劑包含有義股及反義股，其中，有義股係25至30個核苷酸殘基之長度，其中，第一股之從5'端核苷酸(位置1)開始之位置1至23包含至少8個核糖核苷酸；反義股係36至66個核苷酸殘基之長度，且從3'端核苷酸開始，在與有義股之位置1至23配對以形成雙鏈體之位置中包含至少8個核糖核苷酸；其中，至少反義股之3'端核苷酸未與有義股配對，且至多6個接續之3'端核苷酸未與有義股配對，從而形成具有1至6個核苷酸之3'單股突出；其中，反義股之5'端包含10至30個為與有義股配對之接續核苷酸，從而形成具有10至30個核苷酸之單股5'突出；其中，當將有義股與反義股對準以進行最大互補時，至少有義股之5'端核苷酸及3'端核苷酸與反義股之核苷酸進行鹼基配對，從而在有義股與反義股之間形成實質上雙鏈體之區域；以及，反義股在沿著反義股長度之至少19個核苷酸與標靶RNA充分互補，以在當將雙股核酸引入哺乳動物細胞內時降低標靶基因之表現；以及，其中，有義股含有至少一個位於三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體，其中，模體之至少一者出現 在裂解位點或鄰近該裂解位點處。反義股含有至少一個位於裂解位點或鄰近該裂解位點處之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的模體。
於某些態樣中，dsRNAi劑包含有義股及反義股，其中，RNAi劑包含具有至少25個且至多29個核苷酸之長度的第一股，以及具有至多30個核苷酸之長度且具有至少一個位於從5'末端位置11、12、13之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾之模體的第二股；其中，第一股之3'末端及該第二股之5'末端形成鈍端，且第二股於其3'末端比第一股長1-4個核苷酸，其中，雙鏈體區域之長度係至少25個核苷酸，且第二股在沿著第二股長度之至少19個核苷酸上與標靶RNA充分互補，以在當將RNAi劑引入哺乳動物細胞內時降低標靶基因之表現，以及，其中，RNAi劑之切丁酶裂解優先得到包含第二股之3'末端的siRNA，從而降低哺乳動物體內之標靶基因的表現。視需要，dsRNAi劑復包含配體。
於某些態樣中，dsRNAi劑之有義股含有至少一個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體，其中，模體之一者出現在有義股之裂解位點處。
於某些態樣中，dsRNAi劑之反義股亦可含有至少一個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體，其中，模體之一者出現在反義股之裂解位點或鄰近該裂解位點處。
對於具有19至23個核苷酸之長度之雙鏈體區域的dsRNAi劑，反義股之裂解位點典型位於從5'末端位置10、11及12附近。因此，三個一致修飾之模體可出現在反義股之位置9、10、11，位置10、11、12，位置11、12、13，位置12、13、14，或位置13、14、15，從反義股之5'末端的第一個核苷酸 開始計數，或在雙鏈體區域內從反義股之5'末端的第一個配對核苷酸開始計數。反義股之裂解位點亦可根據dsRNAi之雙鏈體區域從5'末端計數的長度而改變。
dsRNAi劑之有義股可含有至少一個位於該股之裂解位點處之三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體；且反義股可具有至少一個位於該股之裂解位點或鄰近該裂解位點處之三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體。當有義股及反義股形成dsRNA雙鏈體時，有義股及反義股可經對準，使得位於有義股之一個三核苷酸模體與位於反義股之一個三核苷酸模體具有至少一個核苷酸重疊，亦即，有義股中模體之三個核苷酸之至少一者與反義股中模體之三個核苷酸之至少一者鹼基配對。或者，至少兩個核苷酸可重疊，或全部三個核苷酸可重疊。
於一些態樣中，dsRNAi劑之有義股可含有超過一個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體。第一模體可出現在該股之裂解位點或鄰近該裂解位點處，且其他模體可係側翼修飾。本文中，術語「側翼修飾」指代出現在該股之另一部位的與位於相同股之裂解位點或鄰近該裂解位點處之模體分隔開來的模體。側翼修飾或與第一模體相鄰或藉由至少一個或多個核苷酸與第一模體分隔開來。當模體彼此緊鄰時，則該等模體之化學性彼此截然不同；而當模體藉由一個或多個核苷酸分隔開來時，則該等化學性可相同或相異。可存在兩個或多個側翼修飾。例如，當存在兩個側翼修飾時，每一側翼修飾可出現在位於裂解位點或鄰近該裂解位點處之第一模體的一段，或出現在該前導模體之任一側。
與有義股相似，dsRNAi劑之反義股可含有超過一個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體，且模體之至少一者出現在該股之裂解位點或鄰近該裂解位點處。這一反義股亦可含有一個或多個側翼修飾，該側翼修飾之排列類似於可能存在於該有義股之側翼修飾。
於一些態樣中，dsRNAi劑之有義股或反義股之側翼修飾典型不包括位於該股之3'-末端、5'-末端或兩末端之最開始的一個或兩個末端核苷酸。
於其他態樣中，dsRNAi劑之有義股或反義股之側翼修飾典型不包括位於雙鏈體區域內該股之3'-末端、5'-末端或兩末端之最開始的一個或兩個配對核苷酸。
當dsRNAi劑之有義股及反義股各自含有至少一個側翼修飾時，該側翼修飾可落入雙鏈體區域之相同末端，且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊。
當dsRNAi劑之有義股及反義股各自含有至少兩個側翼修飾時，有義股與反義股可經對準而使得來自一股之兩個修飾之每一者落入雙鏈體區域之一端且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊；來自一股之兩個修飾之每一者落入雙鏈體區域之另一端且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊；一股之兩個修飾分別落入前導模體之兩端上且在雙鏈體區域內具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊。
於一些態樣中，dsRNAi劑之有義股及反義股中之每一個核苷酸，包括作為模體之一部分的核苷酸，可經修飾。每一核苷酸可藉由相同或相異之修飾而經修飾，該等修飾可包括非鏈結性磷酸酯氧之一者或兩者或鏈結性磷酸酯氧之一者或多者的一個或多個變更；核糖之構建的變更，如核糖之2’-羥基之變更；以「去磷」鏈結子進行之磷酸酯部分的整體替換；天然出現之鹼基的修飾或替換；以及核糖-磷酸酯骨幹的替換或修飾。
由於核酸係子單元之聚合物，多數修飾出現在核酸內重複之位置，如，鹼基、磷酸酯部分、或磷酸酯部分之非鏈結性O的修飾。於一些情形 中，該修飾將出現在該核酸之所有受試位置，但在多數情形中並非如此。舉例而言，修飾可僅出現在3'-或5'端位置，可僅出現在末端區域，例如，出現在末端核苷酸之位置或出現在一股之最末2、3、4、5或10個核苷酸內。修飾可出現在雙股區域內、單股區域內、或兩者內。修飾可僅出現在RNA之雙股區域內，或僅出現在RNA之單股區域內。例如，位於非鏈結性O位置之硫代磷酸酯修飾可僅出現在一端或兩端；可僅出現在末端區域，例如出現在末端核苷酸之位置或出現在一股之最末2、3、4、5或10個核苷酸內；或可出現在雙股區域及單股區域內，尤其是在末端。一個或多個5'-末端可經磷酸化。
下述係可能者，例如，提升安定性，在突出中包括特定之鹼基，或在單股突出例如5'突出或3'突出或兩者中包括經修飾之核苷酸或核苷酸替代品。例如，可能所欲者係在突出中包括嘌呤核苷酸。於一些態樣中，3'或5'突出中之全部或一些鹼基可經修飾，例如具有本文所述之修飾。修飾可包括，例如，使用在核糖之2’位置具有所屬技術領域中已知之修飾者，例如使用去氧核糖核苷酸，使用2’去氧-2’-氟(2’-F)或2’-O-甲基修飾者替代核酸鹼基之核糖，以及使用磷酸酯基團中之修飾例如硫代磷酸酯修飾。突出無需與標靶序列同源。
於一些態樣中，有義股及反義股之每一殘基獨立地經LNA、CRN、cET、UNA、HNA、CeNA、2’-己氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’去氧、2’-羥基或2’-氟修飾。該股可含有超過一個修飾。於一個態樣中，有義股及反義股之每一殘基獨立地經2’-O-甲基或2’-氟修飾。
至少兩個相異之修飾典型存在於有義股及反義股。彼等兩個修飾可以為2’-O-甲基或2’-氟修飾等。
於某些態樣中，Na或Nb包含交替模式之修飾。如本文中所用，術語「交替模體」指代具有一個或多個修飾之模體，每一修飾出現在一股之交替核苷酸上。交替核苷酸可指代每兩個核苷酸一個或每三個核苷酸一個或類似模式。例如，如果A、B及C各自表示一種類型之對核苷酸之修飾，則交替模體可係「ABABABABABAB…」、「AABBAABBAABB…」、「AABAABAABAAB…」、「AAABAAABAAAB…」、「AAABBBAAABBB…」或「ABCABCABCABC…」等。
交替模體中含有之修飾的類型可係相同或相異。例如，如果A、B、C、D各自表示一種類型之對核苷酸之修飾，則交替模體亦即每兩個核苷酸之修飾可係相同，但有義股或反義股可各自選自交替模體諸如「ABABAB…」、「ACACAC…」、「BDBDBD…」或「CDCDCD…」等中修飾之若干可能性。
於一些態樣中，本發明之dsRNAi劑包含，有義股之交替模體的修飾模式相對於反義股之交替模體的修飾模式位移。該位移可使得有義股之核苷酸的修飾基團與反義股之核苷酸的不同修飾基團相對應，反之亦然。例如，當有義股與反義股在dsRNA雙鏈體中鹼基配對時，在雙鏈體區域內，有義股之交替模體可始於該股之5'至3'之「ABABAB」，且反義股之交替模體可始於該股之5'至3'之「BABABA」。作為另一示例，在雙鏈體區域內，有義股中之交替模體可始於該股之5'至3'之「AABBAABB」，且反義股中之交替模體可始於該股之5'至3'之「BBAABBAA」，因此有義股與反義股之間存在修飾模式之完全或部分位移。
於一些態樣中，dsRNAi劑包含位於有義之2’-O-甲基修飾與2’-F修飾起始之交替模體之模式，該模式具有相對於位於反義股上之2’-O-甲基修 飾與2’-F修飾起始之交替模體之模式的位移，亦即，有義股鹼基對之2’-O-甲基修飾之核苷酸與反義股之2’-F修飾之核苷酸進行鹼基配對，反之亦然。有義股之1位置可始於該2’-F修飾，且反義股之1位置可始於該2’-O-甲基修飾。
將一個或多個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體引入有義股或反義股中，中斷有義股或反義股中存在之初始修飾模式。藉由將一個或多個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體引入有義股或反義股中而中斷有義股或反義股的修飾模式，可提升對於標靶基因之基因緘默化活性。
於一些態樣中，當將位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體引入任一股中時，位於模體之下一個核苷酸上的修飾係不同於該模體之修飾者。例如，含有該模體之序列部位為「…NaYYYNb…」，其中，「Y」表示位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體，且「Na」及「Nb」表示位於模體「YYY」之下一個核苷酸的不同於Y修飾之修飾，且其中Na與Nb可以為相同或相異之修飾。另選地，當存在側翼修飾時，Na或Nb可存在或不存在。
iRNA可復包含至少一個硫代磷酸酯類或甲基硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸間鏈結修飾可出現在有義股或反義股或兩股的位於該股任意位置之任意核苷酸。例如，核苷酸間鏈結修飾可出現在有義股或反義股之每一個核苷酸；每一核苷酸間鏈結修飾可以交替模式出現在有義股或反義股；或有義股或反義股可包含交替模式之兩種核苷酸間鏈結修飾。有義股之交替模式之核苷酸間鏈結修飾可與反義股相同或相異，其有義股之交替模式之核苷酸間鏈結修飾可具有相對於反義股之交替模式之核苷酸間鏈結修飾的位移。於一個態樣中，雙股RNAi劑包括6至8個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。於一些態樣中，反義股包括位於5'-末端之兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結以及位 於3'-末端之兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，且有義股包含位於5'-末端或3'-末端之至少兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
於一些態樣中，dsRNA劑包含位於突出區域內之硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結修飾。例如，突出區域可含有兩個核苷酸且在該兩個核苷酸間具有硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸間鏈結。核苷酸間鏈結修飾亦可作成以將突出核苷酸與雙鏈體區域內之末端配對核苷酸鏈結。例如，至少2、3、4或全部突出核苷酸可透過硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結而鏈結，且視需要，可存在將突出核苷酸與作為該突出核苷酸之下一個成對核苷酸鏈結的額外之硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。例如，在末端三個核苷酸之間可能存在至少兩個硫代硫酸酯核苷酸間鏈結，其中該三個核苷酸中之兩者為突出核苷酸，且第三個核苷酸為緊鄰該突出核苷酸之下一個配對核苷酸。此等末端核苷酸可位於反義股之3'末端、有義股之3'末端、反義股之5'末端或有義股之5'末端。
於一些態樣中，2個核苷酸之突出位於反義股之3'末端，且在末端三個核苷酸之間可能存在兩個硫代硫酸酯類核苷酸間鏈結，其中該三個核苷酸中之兩者係突出核苷酸，且第三個核苷酸與緊鄰該突出核苷酸之下一個核苷酸配對。視需要，dsRNAi劑可在有義股之5'末端及反義股之5'末端兩處額外具有位於末端三個核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，dsRNAi劑包含與標靶之誤配、雙鏈體中之誤配、或其組合。誤配可出現在突出區域內或雙鏈體區域內。基於鹼基對促進解離或熔融之傾向性(例如，基於特定配對之關聯或解離之自由能，自由能為基於個體配對檢查配對的最簡單之途徑，但亦可使用次近鄰分析及類似分析)，可將鹼基對 排名。就促進解離而言：A：U優於G：C；G：U優於G：C；且I：C優於G：C(I為肌苷)。誤配如非規範配對或除規範配對之外者(如本文中他處所揭示)優於規範(A：T、A：U、G：C)配對；且包括萬用鹼基之配對優於規範配對。
於某些態樣中，dsRNAi劑包含，位於雙鏈體區域內之反義股中從5'末端最前列之第1、2、3、4或5個鹼基對的至少一者選自下列所組成之群組：A：U、G：U、I：C、以及誤配例如非規範配對或除規範配對之外者或包括萬用鹼基之配對，以促進反義股於該雙鏈體之5'-末端的解離。
於某些態樣中，位於該雙鏈體區域內之反義股中從5'末端之1位置的核苷酸選自A、dA、dU、U及dT。另選地，位於雙鏈體區域內之反義股中從5'末端最前列之第1、2或3個鹼基對的至少一者係AU鹼基對。例如，位於雙鏈體區域內之反義股中從5'末端之第一個鹼基對係AU鹼基對。
於其他態樣中，位於有義股之3'末端之核苷酸係去氧胸苷(dT)，或位於反義股之3'末端之核苷酸為去氧胸苷(dT)。舉例而言，在有義股、反義股或兩股之3'末端上存在去氧胸苷核苷酸之短序列，例如，兩個dT核苷酸。
於某些態樣中，有義股序列可藉由式(I)表示：
5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' (I)
其中：
i及j各自獨立地為0或1；
p及q各自獨立地為0-6；
Na各自獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，每一序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
Nb各自獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
np與nq各自獨立地表示突出核苷酸；
其中，Nb及Y不具有相同之修飾；以及
XXX、YYY及ZZZ各自獨立地表示一個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體。於一個態樣中，YYY全部為2’-F修飾之核苷酸。
於一些態樣中，Na或Nb包含交替模式之修飾。
於一些態樣中，YYY模體出現於有義股之裂解位點處。例如，當dsRNAi劑具有長度為17至23個核苷酸之雙鏈體區域時，YYY模體出現於有義股之裂解位點處或其左近(例如，可出現於位置6、7、8；7、8、9；9、10、11；10、11、12；或11、12、13)，從5'末端之第1個核苷酸開始計數；或視需要，從5'末端之雙鏈體區域內第一個配對核苷酸開始計數。
於一個態樣中，i為1且j為0，或i為0且j為1，或i及j兩者皆為1。有義股可因此藉由下列式表示：
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib)；
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic)；或
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id)。
當有義股藉由式(Ib)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na可各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當有義股藉由式(Ic)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na可各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當有義股藉由式(Id)表示時，Nb各自獨立地表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。於一個態樣中，Nb為0、1、2、3、4、5或6。Na可各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y及Z各自可彼此相同或相異。
於其他態樣中，i為0且j為0，且有義股可藉由下式表示：
5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia)。
當有義股由式(Ia)表示時，Na各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
於一個態樣中，RNAi之反有義股序列可由式(II)表示：
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)
其中：
k及l各自獨立地為0或1；
p'及q'各自獨立地為0至6；
Na'各自獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，每一序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
Nb'各自獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
np'與nq'各自獨立地表示突出核苷酸；
其中，Nb'及Y'不具有相同之修飾；以及
X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立地表示一個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體。
於一些態樣中，Na'或Nb'包含交替模式之修飾。
於一個態樣中，Y'Y'Y'模體出現於反義股之裂解位點處。例如，當dsRNAi劑具有長度為17至23個核苷酸之雙鏈體區域時，Y'Y'Y'模體出現於該反義股之位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15，從5'末端之第1個核苷酸開始計數；或視需要，從5'末端之雙鏈體區域內第一個配對核苷酸開始計數。於一個態樣中，Y'Y'Y'模體出現於位置11、12、13。
於某些態樣中，Y'Y'Y'模體全部為2’-OMe修飾之核苷酸。
於某些態樣中，k為1且l為0，或k為0且l為1，或k及l兩者皆為1。
反義股可因此藉由下列式表示：
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np' 3' (IIb)；
5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (IIc)；或
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np' 3' (IId)。
當反義股藉由式(IIb)表示時，Nb'表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na'各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股表示為式(IIc)時，Nb'表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na'各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股表示為式(IId)時，Nb'各自獨立地表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na'各自獨立 地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。於一個態樣中，Nb為0、1、2、3、4、5或6。
於其他態樣中，k為0且l為0，且反義股可藉由下式表示：
5' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-na' 3' (Ia)。
當反義股表示為式(Ia)時，Na'各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
X'、Y'及Z'各自可彼此相同或相異。
有義股及反義股之每一核苷酸獨立經LNA、CRN、UNA、cET、HNA、CeNA、2’-己氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羥基或2’-氟修飾。例如，有義股及反義股之每一核苷酸獨立地經2’-O-甲基或2’-氟修飾。特別地，X、Y、Z、X'、Y'及Z'可各自表示2’-O-甲基修飾或2’-F修飾。
於一些態樣中，當雙鏈體區域係21 nt時，dsRNAi劑之有義股可含有出現在該股之9、10及11位置之YYY模體，從5'-末端之第一個核苷酸開始計數，或視需要，在雙鏈體區域內從5'-末端之第一個配對核苷酸開始計數；以及，Y表示2’-F修飾。有義股可額外含有XXX模體或ZZZ模體作為位於雙鏈體區域之相反末端的側翼修飾；以及，XXX與ZZZ各自獨立地表示2’-OMe修飾或2’-F修飾。
於一些態樣中，反義股可含有出現在該股之11、12及13位置之Y'Y'Y'模體，從5'-末端之第一個核苷酸開始計數，或視需要，在雙鏈體區域內從5'-末端之第一個配對核苷酸開始計數；以及，Y'表示2’-O-甲基修飾。反義股可額外含有X'X'X'模體或Z'Z'Z'模體作為位於雙鏈體區域之相反末端的側翼修飾；以及，X'X'X'與Z'Z'Z'各自獨立地表示2’-OMe修飾或2’-F修飾。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)及(Id)中任一者表示之有義股分別與由式(IIa)、(IIb)、(IIc)及(IId)中任一者表示之反義股形成雙鏈體。
據此，用於本發明之方法中的dsRNAi劑可包含有義股及反義股，每一股具有14至30個核苷酸，iRNA雙鏈體由式(III)表示：
有義：5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
反義：3' np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq ' 5' (III)
其中：
i、j、k及l各自獨立地為0或1；
p、p'、q及q'各自獨立地為0至6；
Na及Na'各自獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，每一序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
Nb與Nb'各自獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
np'、np、nq'及nq各自可存在或不存在，且各自獨立地表示突出核苷酸；以及
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立地表示一個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體。
於一個態樣中，i為0且j為0；或i為1且j為0；或i為0且j為1；或i及j兩者皆為0；或i及j兩者皆為1。於另一態樣中，k為0且l為0；或k為1且l為0；或k為0且l為1；或k及l兩者皆為0；或k及l兩者皆為1。
形成iRNA雙鏈體之有義股與反義股的示例性組合包括下述各式：
5' np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
3' np '-Na '-Y'Y'Y'-Na 'nq' 5' (IIIa)
5' np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3' np '-Na '-Y'Y'Y'-Nb '-Z'Z'Z'-Na 'nq ' 5' (IIIb)
5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3'
3' np '-Na '-X'X'X'-Nb '-Y'Y'Y'-Na '-nq ' 5' (IIIc)
5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3' np '-Na '-X'X'X'-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-Z'Z'Z'-Na-nq ' 5' (IIId)
當dsRNAi劑藉由式(IIIa)表示時，Na各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑藉由式(IIIb)表示時，Nb各自獨立地表示包含1至10、1至7、1至5或1至4個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑表示為式(IIIc)時，Nb、Nb'各自獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑表示為式(IIId)時，Nb、Nb'各自獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡 核苷酸序列。Na及Na'各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na'、Nb及Nb'各自獨立地包含交替模式之修飾。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)中之X、Y及Z各自可係彼此相同或相異。
當dsRNAi劑由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示時，Y核苷酸之至少一者可與Y'核苷酸之至少一者進行鹼基配對。或者，Y核苷酸之至少兩者與相應之Y'核苷酸進行鹼基配對；或Y核苷酸之全部三者與相應之Y'核苷酸進行鹼基配對。
當dsRNAi劑由式(IIIb)或(IIId)表示時，Z核苷酸之至少一者可與Z'核苷酸之至少一者進行鹼基配對。或者，Z核苷酸之至少兩者與相應之Z'核苷酸進行鹼基配對；或Z核苷酸之全部三者與相應之Z'核苷酸進行鹼基配對。
當dsRNAi劑由式(IIIc)或(IIId)表示時，X核苷酸之至少一者可與X'核苷酸之至少一者進行鹼基配對。或者，X核苷酸之至少兩者與相應之X'核苷酸進行鹼基配對；或X核苷酸之全部三者與相應之X'核苷酸進行鹼基配對。
於某些態樣中，Y核苷酸之修飾不同於Y'核苷酸之修飾，Z核苷酸之修飾不同於Z'核苷酸之修飾，或X核苷酸之修飾不同於X'核苷酸之修飾。
於某些態樣中，當dsRNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾係2'-O-甲基修飾或2'修飾。於其他態樣中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾係2’-O-甲基修飾或2’-氟修飾，且np'>0，以及，至少一個np'經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸。於再其他態樣中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾係2’-O-甲基修飾或2’-氟修飾，np'>0，且至少一個np'經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸，以及，有義股透過二價或三價分支鏈結子(下文揭示)接合至一個 多個GalNAc衍生物。於其他態樣中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾係2’-O-甲基修飾或2’-氟修飾，np'>0，且至少一個np'經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸，有義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，以及，有義股透過二價或三價分支鏈結子接合至一個多個GalNAc衍生物。
於一些態樣中，當RNAi劑由式(IIIa)表示時，Na修飾係2’-O-甲基修飾或2’-氟修飾，np'>0，且至少一個np'經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸，有義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，以及，有義股透過二價或三價分支鏈結子接合至一個多個GalNAc衍生物。
於一些態樣中，dsRNAi劑為含有至少兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙鏈體的多聚物，其中該等雙鏈體藉由鏈結子連結。鏈結子可以為可裂解者或不可裂解者。視需要，多聚物復包含配體。雙鏈體可各自靶向相同基因或兩個相異基因；或雙鏈體可各自靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於一些態樣中，dsRNAi劑為含有3、4、5、6或更多個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙鏈體的多聚物，其中雙鏈體藉由鏈結子連結。鏈結子可以為可裂解者或不可裂解者。視需要，多聚物復包含配體。雙鏈體可各自靶向相同基因或兩個相異基因；或雙鏈體可各自靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於一個態樣中，兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)之至少一者表示的dsRNAi劑在5'末端及一個或兩個3'末端彼此鏈結，且視需要接合至配體。該等劑可各自靶向相同基因或兩個相異基因；或該等劑可各自靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於某些態樣中，本發明之RNAi劑可含有低數量之含有2’-氟修飾的核苷酸，如10個或更少具有2’-氟修飾的核苷酸。例如，RNAi劑可含有10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0個具有2’-氟修飾的核苷酸。於具體態樣中，本發明之RNAi劑含有10個具有2’-氟修飾之核苷酸，例如，在有義股中含有4個具有2’-氟修飾之核苷酸且在反義股中含有6個具有2’-氟修飾之核苷酸。於另一具體態樣中，本發明之RNAi劑含有6個具有2’-氟修飾之核苷酸，例如，在有義股中含有4個具有2’-氟修飾之核苷酸且在反義股中含有2個具有2’-氟修飾之核苷酸。
於其他態樣中，本發明之RNAi劑可含有超低數量之含有2’-氟修飾的核苷酸，例如2個或更少含有2’-氟修飾的核苷酸。例如，RNAi劑可含有2、1或0個具有2’-氟修飾的核苷酸。於具體態樣中，RNAi劑可含有2個具有2’-氟修飾之核苷酸，例如，在有義股中含有0個具有2’-氟修飾之核苷酸且在反義股中含有2個具有2’-氟修飾之核苷酸。
多個出版物揭示可用於本發明之方法中的多聚iRNA。此類出版物包括WO2007/091269、美國專利第7,858,769號、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
於某些態樣中，本揭露之組成物及方法包括本文所揭示之RNAi劑的膦酸乙烯酯(VP)修飾。於示例性態樣中，本揭露之經5'-膦酸乙烯酯修飾之核苷酸具有結構：
Figure 111128947-A0202-12-0077-137
其中，X為O或S；
R為氫、羥基、氟或C1-20烷氧基(例如，甲氧基或正十六烷氧基)；
R5'為=C(H)-P(O)(OH)2，並且位於C5'碳與R5'之間的雙鍵為E或Z取向(例如，E取向)；並且
B為核鹼基或經修飾之核鹼基，視需要，其中B為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
本揭露之膦酸乙烯酯可附接至本揭露之dsRNA之反義股或有義股。於某些態樣中，本揭露之膦酸乙烯酯附接至dsRNA之反義股，視需要附接在dsRNA之反義股的5'末端。
膦酸乙烯酯修飾亦預期用於本揭露之組成物及方法中。一種示例性膦酸乙烯酯結構包括牽涉結構，其中R5'為=C(H)-OP(O)(OH)2，並且位於C5'碳與R5'之間的雙鍵為E或Z取向(例如，E取向)。
如下文中更詳細揭示，含有一個或多個碳水化合物部分與iRNA之接合的iRNA可優化該iRNA之一種或多種特性。於多種情形中，碳水化合物部分將附接至iRNA之經修飾之子單元。例如，iRNA之一個或多個核糖核苷酸子單元的核糖可替換為另一部分，例如，其上附接有碳水化合物配體之非碳水化合物(諸如環狀)載劑。本文中，其子單元之核糖業經如是替換的核糖核苷酸子單元指代為核糖替換修飾子單元(RRMS)。環狀載劑可係碳環系統，亦即，所有環 原子皆係碳原子；或係雜環系統，亦即，一個或多個環原子可係雜環如氮、氧、硫。環狀載劑可係單環系統，或可含有兩個或多個環如稠環。環狀載劑可係完全飽和之環系統，或其可含有一個或多個雙鍵。
配體可經由載劑附接至多核苷酸。載劑包括(i)至少一個「骨幹附接點」，諸如兩個「骨幹附接點」，以及(ii)至少一個「繫帶附接點」。如本文中所用，「骨幹附接點」指代官能基如羥基，或通常為鍵，其可用於且適用於將載劑併入核糖核酸之骨幹如磷酸酯或經修飾之磷酸酯如含硫之骨幹中。於一些態樣中，「繫帶附接點」(TAP)指代環狀載劑之構建環原子，例如，碳原子或雜原子(與提供骨幹附接點之原子不同)，其連結所選擇之部分。該部分可係例如碳水化合物，例如單醣、二醣、三醣、四醣、寡醣或多醣。視需要，所選擇之部分藉由媒介繫帶連結至所選擇之載劑。因此，環狀載劑一般將包括官能基例如胺基，或通常提供適用於將另一化學實體例如配體併入或繫帶至構建環的鍵。
iRNA可以經由載劑接合至配體，其中，該載劑可以為環狀基團或非環狀基團。於一個態樣中，該環狀基團可以選自吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧雜環戊烷基、噁唑啶基、異噁唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹噁啉基、嗒嗪酮基、四氫呋喃基及十氫萘。於一個態樣中，該非環狀基團係絲胺醇骨幹或二乙醇胺骨幹。
i.熱去安定化修飾
於某些態樣中，可以藉由將熱去安定化修飾併入反義股之種子區域內而優化dsRNA分子，以進行RNA干擾。如本文所用，「種子區域」意指位於所指股之5'末端的位置2至9處。例如，可以將熱去安定化修飾併入反義股之種子區域中以降低或抑制脫靶基因緘默化。
術語「熱去安定化修飾」包括將導致dsRNA具有比不具有此類修飾之dsRNA之Tm低的總體熔融溫度(Tm)的修飾。例如，熱去安定化修飾可以將dsRNA之Tm降低1-4℃，諸如1℃、2℃、3℃或4℃。並且，術語「熱去安定化核苷酸」指代含有一個或多個熱去安定化修飾之核苷酸。
已經發現，具有包含位於從反義股5'末端計數最先9個核苷酸內之雙鏈體之至少一個熱去安定化修飾之反義股的dsRNA，具有降低之脫靶基因緘默化活性。據此，於一些態樣中，反義股包含位於從反義股5'末端計數最先9個核苷酸內之雙鏈體的至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個)熱去安定化修飾。於一些態樣中，雙鏈體之一個或多個熱去安定化修飾係位於從反義股5'末端計數之位置2至9，諸如位置4至8。於又一些態樣中，雙鏈體之熱去安定化修飾係位於從反義股5'末端計數之位置6、7或8。於再一些態樣中，雙鏈體之熱去安定化修飾係位於從反義股5'末端計數之位置7處。於一些態樣中，雙鏈體之熱去安定化修飾係位於從反義股5'末端計數之位置2、3、4、5或9。
iRNA劑包含有義股及反義股，每一股具有14至40個核苷酸。RNAi劑可由式(L)表示：
Figure 111128947-A0202-12-0079-138
於時(L)中，B1、B2、B3、B1'、B2’、B3'及B4'各自獨立為含有選自下列所組成群組之修飾的核苷酸：2’-O-烷基、2’-取代之烷氧基、2’-取代之 烷基、2’-鹵、ENA、及BNA/LNA。於一個態樣中，B1、B2、B3、B1'、B2’、B3'及B4'各自含有2’-OMe修飾。於一個態樣中，B1、B2、B3、B1'、B2’、B3'及B4'各自含有2’-OMe修飾或2’-F修飾。於一個態樣中，B1、B2、B3、B1'、B2’、B3'及B4'之至少一者含有2’-O-N-甲基乙醯胺基(2’-O-NMA,2’O-CH2C(O)N(Me)H)修飾。
C1係置於與反義股之種子區域(亦即，反義股之5'-末端的位置2-8)相反位點之熱去安定化核苷酸。例如，C1位於有義股之與反義股之5'-末端的位置2至8之核苷酸配對的位置。於一個示例中，C1位於有義股之5'末端計數的位置15處。C1核苷酸承載可包括無鹼基修飾在內之熱學去安定化修飾；與雙鏈體中相反核苷酸之誤配；以及糖修飾如2’-去氧修飾或非環狀核苷酸如未鎖定之核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。於一個態樣中，C1具有選自下列所組成之群組的熱去安定化修飾：i)與反義股中相反核苷酸之誤配；ii)選自下列所組成之群組的無鹼基修飾：
Figure 111128947-A0202-12-0080-139
；以及iii)選自下列所 組成之群組的糖修飾：
Figure 111128947-A0202-12-0081-140
Figure 111128947-A0202-12-0081-141
，其中B係經修飾或未經修飾之核酸鹼基，R1與R2獨立為H、鹵 素、OR3、或烷基；以及R3係H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖。於一個態樣中，C1中之熱去安定化修飾係選自G：G、G：A、G：U、G：T、A：A、A：C、C：C、C：U、C：T、U：U、T：T、及U：T所組成之群組的誤配；且視需要，該誤配對中之至少一個核酸鹼基係2’-去氧核酸鹼基。於一個示例中，C1中之熱去 安定化修飾係GNA或
Figure 111128947-A0202-12-0081-142
。
T1、T1'、T2’及T3'各自獨立地表示包含修飾之核苷酸，該修飾向該核苷酸提供小於或等於2’-OMe修飾之位阻效應。位阻效應指代修飾之位阻效果的總和。確定核苷酸之修飾之位阻效果的方法係所屬技術領域技術人員所已知者。修飾可位於該核苷酸之核糖的2’位置，或係對非核糖核苷酸、非環狀核苷酸、或該核苷酸之骨幹的與該核糖之2’位置相似或等效的修飾，且向該核苷酸提供小於或等於2’-OMe修飾之位阻效應。例如，T1、T1'、T2’及T3'各自獨立選自DNA、RNA、LNA、2’-F、及2’-F-5'-甲基。於一個態樣中，T1為DNA。於一個態樣中，T1'為DNA、RNA或LNA。於一個態樣中，T2’為DNA或RNA。於一個態樣中，T3'為DNA或RNA。
n1、n3及q1獨立為4至15個核苷酸之長度。
n5、q3及q7獨立為1至6個核苷酸之長度。
n4、q2及q6獨立為1至3個核苷酸之長度；或者，n4為0。
q5獨立為0至10個核苷酸之長度。
n2及q4獨立為0至3個核苷酸之長度。
或者，n4係0至3個核苷酸之長度。
於一個態樣中，n4可係0。於一個態樣中，n4為0，且q2及q6為1。於另一示例中，n4為0，且q2及q6為1，具有位於該有義股之位置1至5中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5'-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5'末端計數)。
於一個態樣中，n4、q2及q6各自為1。
於一個態樣中，n2、n4、q2、q4及q6各自為1。
於一個態樣中，當有義股係19至22個核苷酸之長度時，C1位於有義股之5'-末端的位置14至17，且n4為1。於一個態樣中，C1位於有義股之5'-末端的位置15。
於一個態樣中，T3'始於反義股之5'末端的位置2。於一示例中，T3'始於反義股之5'末端的位置2，且q6等於1。
於一個態樣中，T1'始於反義股之5'末端的位置14。於一示例中，T1'始於反義股之5'末端的位置14，且q2等於1。
於例示性態樣中，T3'始於反義股之5'末端的位置2，且T1'始於反義股之5'末端的位置14。於一個示例中，T3'始於反義股之5'末端的位置2，且q6等於1；以及T1'始於反義股之5'末端的位置14，且q2等於1。
於一個態樣中，T1'與T3'藉由11個核苷酸之長度而分隔開來(亦即，T1'及T3'之核苷酸不計算在內)。
於一個態樣中，T1'位於自反義股之5'末端的位置14。於一個示例中，T1'位於自反義股之5'末端的位置14且q2等於1，以及，修飾位於非核糖、非環狀或骨幹之一個或多個2’位置且提供比2’-OMe核糖更低之位阻效應。
於一個態樣中，T3'位於自反義股之5'末端的位置2。於一個示例中，T3'位於自反義股之5'末端的位置2且q6等於1，以及，修飾位於非核糖、非環狀或骨幹之一個或多個2’位置且提供低於或等於2’-OMe核糖之位阻效應。
於一個態樣中，T1位於有義股之裂解位點。於一個態樣中，當有義股係19至22個核苷酸之長度時，T1位於有義股之5'末端計數的位置11，且n2為1。於例示性態樣中，當有義股係19中22個核苷酸之長度時，T1位於有義股之5'末端計數的位置11之裂解位點，且n2為1。
於一個態樣中，T2’始於自反義股之5'末端的位置6。於一示例中，T2’位於自反義股之5'末端的位置6至10，且q4為1。
於例示性態樣中，當有義股係19-22個核苷酸之長度時，T1位於有義股之裂解位點，例如，位於從有義股之5'末端的位置11，且n2為1；T1'位於從反義股之5'末端的位置14，且q2等於1，且T1'之修飾位於核糖之2’位或位於非核糖、非環狀或骨幹之多個位置且提供低於2’-OMe核糖之位阻效應；T2’位於從反義股之5'末端計數的位置6至10，且q4為1；以及，T3'位於從反義股 之5'末端計數的位置2，且q6等於1，以及，T3'之修飾位於核糖之2’位或位於非核糖、非環狀或骨幹之多個位置且提供低於或等於2’-OMe核糖之位阻效應。
於一個態樣中，T2’始於自反義股之5'末端的位置8。於一示例中，T2’始於自反義股之5'末端的位置8，且q4為2。
於一個態樣中，T2’始於自反義股之5'末端的位置9。於一示例中，T2’位於自反義股之5'末端的位置9，且q4為1。
於一個態樣中，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4、T2’為2’-F，q4為1，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。
於一個態樣中，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為1，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’- F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe、n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為6，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為7，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為6，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe、n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為7，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置 1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為1，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為5，T2’為2’-F，q4為1，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；視需要具有位於該反義股之3'末端的至少2個額外之TT。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’- F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為5，T2’為2’-F，q4為1，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；視需要具有位於該反義股之3'末端的至少2個額外之TT；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2硫代磷酸酯核苷酸間鏈結的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4 為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。
該RNAi劑可包含位於該有義股或反義股之5'末端的含磷基團。該5'-末端之含磷基團可係5'-末端磷酸酯(5'-P)、5'-末端硫代磷酸酯(5'-PS)、5'-末端二硫代磷酸酯(5'-PS2)、5'-末端乙烯基磷酸酯(5'-VP)、5'-末端甲基磷酸酯 (MePhos)、或5'-去氧-5'-C-丙二醯基(
Figure 111128947-A0202-12-0089-143
)。當該5'-末端之含磷基團 係5'-末端乙烯基磷酸酯(5'-VP)時，該5'-VP可係5'-E-VP異構物(亦即，反式-乙 烯基磷酸酯，
Figure 111128947-A0202-12-0089-144
)、5'-Z-VP異構物(亦即，反式-乙烯基磷酸酯，
Figure 111128947-A0202-12-0089-145
)、或其混合物。
於一個態樣中，RNAi劑包含位於有義股之5'-末端的含磷基團。於一個態樣中，RNAi劑包含位於反義股之5'-末端的含磷基團。
於一個態樣中，RNAi劑包含5'-P。於一個態樣中，RNAi劑包含位於反義股中之5'-P。
於一個態樣中，RNAi劑包含5'-PS。於一個態樣中，RNAi劑包含位於反義股中之5'-PS。
於一個態樣中，RNAi劑包含5'-VP。於一個態樣中，RNAi劑包含位於反義股中之5'-VP。於一個態樣中，RNAi劑包含位於反義股中之5'-E-VP。於一個態樣中，RNAi劑包含位於反義股中之5'-Z-VP。
於一個態樣中，RNAi劑包含5'-PS2。於一個態樣中，RNAi劑包含位於反義股中之5'-PS2。
於一個態樣中，RNAi劑包含5'-PS2。於一個態樣中，RNAi劑包含位於反義股中之5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-VP。5'-VP可係5'-E-VP、5'-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18 至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-VP。5'-VP可係5'-E-VP、5'-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’- F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1。該dsRNA劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-VP。5'-VP可係5'-E-VP、5'-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位 於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’末端計數)。RNAi劑亦包含5'-VP。5'-VP可係5'-E-VP、5'-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’末端計數)。RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4 為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-VP。5'-VP可係5'-E-VP、5'-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1。該dsRNAi RNA劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-VP。5'-VP可係5'-E-VP、5'-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為 1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為 2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-VP。5'-VP可係5'-E-VP、5'-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間 鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-VP。5'-VP可係5'-E-VP、5'-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7 為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。該RNAi劑亦包含5'-P及靶向配體。於一個態樣中，5'-P位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS及靶向配體。於一個態樣中，5'-PS位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置 1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP、或其組合)及靶向配體。
於一個態樣中，5'-VP位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS2及靶向配體。於一個態樣中，5'-PS2位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18 至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基及靶向配體。於一個態樣中，5'-去氧-5'-C-丙二醯基位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-P及靶向配體。於一個態樣中，5'-P位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS及靶向配體。於一個態樣中，5'-PS位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP、或其組合)及靶向配體。於一個態樣中，5'-VP位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS2及靶向配體。於一個態樣中，5'-PS2位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為 2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基及靶向配體。於一個態樣中，5'-去氧-5'-C-丙二醯基位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-P及靶向配體。於一個態樣中，5'-P位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸 酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS及靶向配體。於一個態樣中，5'-PS位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP、或其組合)及靶向配體。於一個態樣中，5'-VP位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至 23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS2及靶向配體。於一個態樣中，5'-PS2位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基及靶向配體。於一個態樣中，5'-去氧-5'-C-丙二醯基位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'- P及靶向配體。於一個態樣中，5'-P位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS及靶向配體。於一個態樣中，5'-PS位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP、或其組合)及靶向配體。於一個態樣中，5'-VP位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-PS2及靶向配體。於一個態樣中，5'-PS2位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1'為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1'為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3'為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3'為2’-F，q6為1，B4'為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5硫代磷酸酯核苷酸間鏈結中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基及靶向配體。於一個態樣中，5'-去氧-5'-C-丙二醯基位於反義股之5'-末端，且靶向配體位於有義股之3'-末端。
於特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3'-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈結子附接之三個GalNAc衍生物；以及
(iii)位於位置1、3、5、7、9至11、13、17、19及21之2’-F修飾，以及位於位置2、4、6、8、12、14至16、18及20之2’-OMe修飾(從5'末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、5、9、11至13、15、17、19、21及23之2’-OMe修飾，以及位於位置2、4、6、8、10、14、16、18、20及22之2’-F修飾(從5'末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置21與22之間以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
其中該dsRNA劑具有位於該反義股之3'-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5'-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3'-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈結子附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1、3、5、7、9至11、13、15、17、19及21之2’-F修飾，以及位於位置2、4、6、8、12、14、16、18及20之2’-OMe修飾(從5'末端計數)；以及
(iv)位於核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19及21至23之2’-OMe修飾，以及位於位置2、4、6、8、10、14、16、18及20之2’-F修飾(從5'末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5'-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3'-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈結子附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至6、8、10及12至21之2’-OMe修飾，位於位置7及9之2’-F修飾，以及位於位置11處之去氧核苷酸(例如，dT)(從5'末端計數)；以及
(iv)位於核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、7、9、11、13、15、17及19至23之2’-OMe修飾，以及位於位置2、4至6、8、10、12、14、16及18之2’-F修飾(從5'末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5'-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3'-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈結子附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至6、8、10、12、14及16至21之2’-OMe修飾，以及位於位置7、9、11、13及15之2’-F修飾；以及
(iv)位於核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、5、7、9、11、13、15、17、19及21至23之2’-OMe修飾，以及位於位置2至4、6、8、10、12、14、16、18及20之2’-F修飾(從5'末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5'-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3'-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈結子附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至9及12至21之2’-OMe修飾，以及位於位置10及11之2’-F修飾；以及
(iv)位於核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、5、9、11至13、15、17、19及21至23之2’-OMe修飾，以及位於位置2、4、6、8、10、14、16、18及20之2’-F修飾(從5'末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5'-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3'-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈結子附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1、3、5、7、9至11及13之2’-F修飾，以及位於位置2、4、6、8、12及14至21之2’-OMe修飾；以及
(iv)位於核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、5至7、9、11至13、15、17至19及21至23之2’-OMe修飾，以及位於位置2、4、8、10、14、16及20之2’-F修飾(從5'末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5'-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3'-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈結子附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1、2、4、6、8、12、14、15、17及19至21之2’-OMe修飾，以及位於位置3、5、7、9至11、13、16及18之2’-F修飾；以及
(iv)位於核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)25個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、4、6、7、9、11至13、15、17及19至23之2’-OMe修飾，以及位於位置2、3、5、8、10、14、16及18之2’-F修飾；以及位於位置24及25之去氧核苷酸(例如，dT)(從5'末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'-末端的具有四個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5'-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3'-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈結子附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至6、8及12至21之2’-OMe修飾，以及位於位置7及9至11之2’-F修飾；以及
(iv)位於核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3至5、7、8、10至13、15及17至23)之2’-OMe修飾，以及位於位置2、6、9、14及16之2’-F修飾(從5'末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5'-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3'-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈結子附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至6、8及12至21之2’-OMe修飾，以及位於位置7及9至11之2’-F修飾；以及
(iv)位於核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3至5、7、10至13、15及17至2之2’-OMe修飾，以及位於位置2、6、8、9、14及16之2’-F修飾(從5'末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5'-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑係包含：
(a)有義股，其具有：
(i)19個核苷酸之長度；
(ii)附接至3'-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈結子附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至4、6及10至19之2’-OMe修飾，以及位於位置5及7至9之2’-F修飾；以及
(iv)位於核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3至5、7、10至13、15及17至21之2’-OMe修飾，以及位於位置2、6、8、9、14及16之2’-F修飾(從5'末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置19與20之間、以及核苷酸位置20與21之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5'-末端的鈍端。
於某些態樣中，用於本發明之方法中的iRNA係選自表2、表3、表5或表6任一者中所列之劑。此等劑可復包含配體。
III.接合至配體之iRNA
本發明之iRNA之RNA的另一修飾牽涉將一個或多個增強該iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝取(例如，攝取到細胞內)之配體、部分或接合物化學鏈結至該iRNA。此等部分包括但不限於脂質部分諸如膽固醇部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86：6553-6556)。於其他態樣中，配體為膽酸(Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053-1060)、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306-309；Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765-2770)、硫代膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533-538、脂肪鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J,1991,10：1111-1118；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327-330；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49-54)、磷脂質例如二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-磷酸三乙銨(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777-3783)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969-973)、或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654)、棕櫚醯基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229-237)、或十八烷基胺或己基胺-羰氧基膽固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923-937)。
於某些態樣中，配體改變其所併入之iRNA劑的分佈、靶向或壽命。於一些態樣中，配體提供，例如，當與缺失此配體者相比時，增強的對於所選標靶例如分子、細胞或細胞類型、腔室例如細胞或器官之腔室、組織、器官或身體區域之親和性。於一些態樣中，配體不參與雙鏈體核酸中之雙鏈體配對。
配體可包括天然出現之物質，例如蛋白質(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、或球蛋白)；碳水化合物(例如，聚葡萄糖(dextran)、聚三葡萄糖(pullulan)、幾丁質、幾丁聚醣、菊糖、環糊精、N-乙醯基葡萄糖胺、N-乙醯基半乳糖胺或玻尿酸)；或脂質。配體亦可係重組分子或合成分子，諸如合成聚合物，例如合成聚胺基酸。聚胺基酸之示例包括聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-乳酸交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物、或聚磷嗪(polyphosphazine)。聚胺之示例包括：聚伸乙二胺、聚離胺酸(PLL)、精胺、精三胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模擬性聚胺、樹枝狀聚胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、聚胺之四級鹽、或α螺旋肽。
配體亦可包括靶向基團，例如細胞或組織靶向劑，例如凝集素、醣蛋白、脂質或蛋白質，例如抗體，其與特定之細胞類型諸如腎細胞結合。靶向基團可係促甲狀腺素、促黑素、凝集素、醣蛋白、界面活性劑蛋白A、黏蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺、多價甘露糖、多價果糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸酯、聚麩胺酸鹽、聚天冬胺酸鹽、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸、維生素B12、 維生素A、生物素、或RGD肽或RGD肽模擬物。於某些態樣中，配體係多價半乳糖，例如，N-乙醯基-半乳糖胺。
配體之其他示例包括染料；嵌入劑(例如，吖啶類)；交聯劑(例如，補骨脂素、絲裂黴素C)；卟啉類(TPPC4、特沙伏林(texaphyrin)、撒伏林(Sapphyrin))；多環芳烴(例如，啡嗪、二氫啡嗪)；人工核酸內切酶(例如，EDTA)；親脂性分子(例如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十六烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基、或啡噁嗪)；以及肽接合物(例如，觸角足突變肽、Tat肽)、烷基化劑、磷酸鹽、胺基、巰基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代之烷基、放射標記至標記物、酵素、半抗原(如，生物素)、轉運/吸收促進劑(例如，阿斯匹靈、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑接合物、四氮雜大環之Eu3+錯合物)、二硝基苯基、HRP、或AP。
配體可係蛋白質例如醣蛋白、或肽例如具有對於共配體之特異親和性的分子、或抗體例如結合至特定細胞類型諸如肝細胞之抗體。配體亦可包括激素及激素受體。它們亦可包括非肽類物質，例如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔助因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基半乳糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺、多價甘露糖、或多價果糖。配體可係，舉例而言，脂質多醣、p38 MAP激酶之活化劑、或NF-κB之活化劑。
配體可係例如藥物之物質，其可藉由例如擾亂細胞之細胞骨幹例如藉由擾亂細胞之微管、微絲或中間體絲而增加細胞對iRNA劑之攝取。該藥物 可係，舉例而言，泰素(taxol)、長春新鹼、長春鹼、細胞鬆弛素、諾考達唑(nocodazole)、促微絲聚合劑(japlakinolide)、紅海海綿蛋白A、鬼筆環肽(phalloidin)、海洋苔蘚素(swinholide)A、吲達諾欣(indanocine)、或邁爾素(myoservin)。
於一些態樣中，附接至本文中所述之iRNA的配體用作藥物動力學調節子(PK調節子)。PK調節子包括親脂質物、膽汁酸、類固醇、磷脂質類似物、肽、蛋白結合劑、PEG、維生素等。示例性PK調節子包括但不限於，膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂質、神經鞘脂質、萘普生、布洛芬、維生素E、生物素。包含大量硫代硫酸酯類鏈結之寡核苷酸亦已知結合至血清蛋白，因此在骨幹中包含多個硫代磷酸酯類鏈結之短寡核苷酸例如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基之寡核苷酸亦可作為配體(例如，作為PK調節配體)而遵循本發明。此外，於本文所揭示之態樣中，結合血清組分(例如，血清蛋白)之適配體亦適用於作為PK調節性配體而使用。
本發明之接合有配體之iRNA可藉由使用承載側鏈反應性官能度之寡核苷酸如衍生自將鏈結分子附接在寡核苷酸(揭示於下)者而合成。這一反應性寡核苷酸可直接與可商購之配體、合成為承載多種保護基團之任一者的配體、或具有附接於其之鏈結部分的配體反應。
於本發明之接合物中使用之寡核苷酸可透過習知之固相合成技術便利且常規性地合成。用於此合成之設備可由多個供應商販售，包括，舉例而言，Applied Biosystems®(Foster City,Calif.)。可額外地或作為另一種選擇地採用所屬技術領域中已知之用於此合成之任何其他方法。使用類似技術來製備其他寡核苷酸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物亦係已知者。
於本發明之接合有配體之iRNA及承載序列特異性鏈結之核苷的配體分子中，該寡核苷酸及寡核苷可在合適DNA合成器上使用標準核苷酸或核苷前驅物、或已經承載鏈結部分之核苷酸或核苷接合前驅物、已經承載配體分子之配體-核苷酸或核苷接合前驅物、或承載配體之非核苷酸構建模塊而組裝。
當使用已經承載鏈結部分之核苷酸接合前驅物時，典型係完成序列特異性鏈結之核苷的合成，隨後將該配體分子與該鏈結部分反應以形成接合有配體之寡核苷酸。於一些態樣中，本發明之寡核苷酸或經鏈結之核苷係藉由自動合成器使用衍生自配體-核苷接合物之除標準亞磷醯胺之外的亞磷醯胺及可商購且常規用於寡核苷酸合成中之非標準亞磷醯胺來合成。
A.脂質接合物
於某些態樣中，配體或接合物係脂質或基於脂質之分子。於一個態樣中，此類脂質或基於脂質之分子係結合血清蛋白如人血清白蛋白(HSA)。HSA結合配體允許該結合物分佈於標靶組織，例如非腎臟之身體標靶組織。舉例而言，標靶組織可係肝臟，包括肝臟之實質細胞。可與HSA結合之其他分子亦可用作配體。舉例而言，可使用萘普生或阿斯匹靈。脂質或基於脂質之配體可(a)增加對於接合物降解之抗性，(b)增加對標靶細胞或細胞膜之靶向或遞送，或(c)可用以調節與血清蛋白例如HSA之結合。
基於脂質之配體可用以抑制例如控制該接合物結合至標靶組織。舉例而言，與HSA之結合強度較高脂質或基於脂質之配體將更不可能靶向腎臟，並因此更不可能被從身體清除。與HSA之結合強度較低的脂質或基於脂質之配體可用來令結合物靶向腎臟。
於某些態樣中，基於脂質之配體結合HSA。於一個態樣中，其以足夠之親和性結合HSA，使得該接合物將分佈至非腎臟組織內。惟，較佳係該親和性之強度不足以造成該HSA-配體之結合係不可逆者。
於其他態樣中，基於脂質之配體與HSA之結合弱或根本不結合。於一個態樣中，該接合物將分佈至腎臟。靶向腎細胞之其他部分亦可用於替換該基於脂質之配體或與該基於脂質之配體同時使用。
於另一態樣中，該配體係被標靶細胞例如增殖細胞攝取之部分例如維生素。此等尤其可用於治療以例如惡性或非惡性細胞如癌細胞的非預期之細胞增殖為特徵的疾患。示例性維生素包括維生素A、維生素E及維生素K。其他示例性維生素包括B族維生素，例如葉酸、維生素B12、核黃素、生物素、吡哆醛、或其他被標靶細胞諸如肝臟細胞攝取之維生素或營養物質。亦包括者係HSA及低密度脂蛋白(LDL)。
B.細胞滲透劑
於另一方面，該配體係細胞滲透劑，諸如螺旋細胞滲透劑。於一態樣中，該劑為兩親性劑。示例性劑為肽，例如tat或觸角足突變肽。如果該劑為肽，其可經修飾，包括肽基模擬物、嵌入體、非肽或假肽類鏈結、以及D-胺基酸之使用。於一個態樣中，該螺旋劑為α-螺旋劑，其具有親脂相及疏脂相。
該配體可係肽或肽模擬物。肽模擬物(本文中亦指代為寡肽模擬物)為能折疊為所定義之類似於天然肽之三維結構的分子。肽及肽模擬物至iRNA劑之附接可影響iRNA之藥物動力學分佈，例如藉由提升細胞識別及吸收而影響。肽或肽模擬物部分可係5-50個胺基酸之長度，例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸之長度。
肽或肽模擬物可係，舉例而言，細胞滲透肽、陽離子肽、兩親性肽、或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe構成)。肽部分可係樹枝狀肽、受約束之肽或交聯之肽。於另一選擇中，肽部分可包括疏水性膜易位序列(MTS)。示例性之含有MTS的疏水性肽係具有下述胺基酸序列的RFGF：AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：14)。含有疏水性MTS之RFGF類似物(例如，胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：15))亦可係靶向部分。肽部分可係「遞送性」肽，其可攜帶包括肽、寡核苷酸、及蛋白質在內之極性大分子跨越細胞膜。舉例而言，業經發現，來自HIV Tat蛋白質之序列(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：16))及來自果蠅觸角足突變肽蛋白之序列(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：17))能起到遞送肽之功能。肽或肽模擬物可由DNA之隨機序列編碼，例如從噬菌體呈現庫或一珠一物(OBOC)組合庫鑑定之肽(Lam et al.,Nature,354：82-84,1991)。經由合併之單體單元繫帶至dsRNA劑之用於細胞靶向目的之肽或肽模擬物的示例係精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)肽或RGD模擬物。肽部分之長度範圍可係約5個胺基酸至約40個胺基酸。該等肽部分可具有結構性修飾，例如以增加穩定性或引導構象特性。可使用下文所述之任意結構性修飾。
用於本發明之組成物及方法的RGD肽可係線性或環狀，且可經修飾例如經糖基化或甲基化以促進對特定組織之靶向。含有RGD之肽及肽模擬物可包括D-胺基酸，以及合成RGD模擬物。除了RGD之外，亦可使用其他以整合素配體(例如，PECAM-1或VEGF)為標靶之部分。
「細胞滲透肽」能滲透細胞例如微生物細胞諸如細菌或真菌細胞，或哺乳動物細胞諸如人類細胞。微生物細胞滲透肽可係，舉例而言，α-螺 旋線性肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫鍵之肽(例如，α-防禦素、β-防禦素或抗菌肽(bactenecin))、或僅含有一個或兩個支配性胺基酸之肽(例如，PR-39或indolicidin)。細胞滲透肽亦可包括線性定位訊號(NLS)。舉例而言，細胞滲透肽可係雙向兩親性胜肽如MPG，其衍生自HIV-1 gp41之融合勝肽結構域及SV40的T抗原之NLS(Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
C.碳水化合物接合物
於本發明之組成物及方法的一些態樣中，iRNA復包含碳水化合物。接合有碳水化合物之iRNA對於核酸之活體內遞送具有優勢，且組成物係適用於活體內治療性用途，如本文中所揭示。如本文中所用，「碳水化合物」指代碳水化合物自身，其由一個或多個具有至少6個碳原子之單醣單元(其可係線性、分支鏈或環狀)與鍵結至每一碳原子之氧、氮或硫原子所組成；或係具有碳水化合物部分作為其一部分的化合物，該碳水化合物部分由一個或多個具有至少六個碳原子之單醣單元(其可係線性、分支鏈或環狀)與鍵結至每一碳原子之氧、氮或硫原子所組成。代表性碳水化合物包括糖類(單醣、二醣、三醣及含有約4、5、6、7、8、或9個單醣單元之寡醣)，以及多醣如澱粉、糖原、纖維素及多醣膠。具體之單醣包括C5糖類及上述(例如，C5、C6、C7或C8)糖類；二醣及三醣，其包括具有兩個或三個單醣單元(例如，C5、C6、C7或C8)之糖類。
於某些態樣中，用於本發明之組成物及方法中之碳水化合物接合物係單醣。
於某些態樣中，單醣係N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)。GalNAc接合物，其包含一種或多種N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)衍生物，係揭示於例如US 8,106,022中，該專利之整體內容藉由引用而併入本文。於一些態樣中，GalNAc 接合物用作配體，其令iRNA靶向具體細胞。於一些態樣中，GalNAc接合物令iRNA靶向肝臟細胞，例如，藉由用作肝臟細胞(例如，肝細胞)之去唾液酸糖蛋白受體配體。
於一些態樣中，碳水化合物接合物包含一個或多個GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可經由鏈結子例如二價或三價分支鏈結子附接。於一些態樣中，GalNAc接合物接合至有義股之3'末端。於一些態樣中，GalNAc接合物經由鏈結子例如本文所揭示之鏈結子接合至iRNA劑(例如，接合至有義股之3'末端)。於一些態樣中，GalNAc接合物係接合至有義股之5'末端。於一些態樣中，GalNAc接合物經由鏈結子例如本文所揭示之鏈結子接合至iRNA劑(例如，接合至有義股之5'末端)。
於本發明之某些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由單價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。於一些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由二價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。於本發明之又一些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由三價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。於本發明之其他態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由四價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。
於某些態樣中，本發明之雙股RNAi劑包含一個附接至該iRNA劑之GalNAc或GalNAc衍生物。於某些態樣中，本發明之雙股RNAi劑含複數(例如，2、3、4、5或6)個GalNAc或GalNAc衍生物，其透過複數個單價鏈結子而各自獨立附接至該雙股RNAi劑之複數個核苷酸。
於一些態樣中，舉例而言，當本發明之iRNA劑之兩股皆係一個更大分子之一部分且係藉由位於一股之3'末端與另一股之5'末端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環圈內之 每一個未配對核苷酸可獨立包含經由單價鏈結基附接之GalNAc或GalNAc衍生物。髮夾環圈亦可藉由雙鏈體之一股中的延伸突出形成。
於一些態樣中，舉例而言，當本發明之iRNA劑之兩股皆係一個更大分子之一部分且係藉由位於一股之3'末端與另一股之5'末端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環圈內之每一個未配對核苷酸可獨立包含經由單價鏈結基附接之GalNAc或GalNAc衍生物。髮夾環圈亦可藉由雙鏈體之一股中的延伸突出形成。
於一個態樣中，用於本發明之組成物及方法中之碳水化合物接合物選自由下列所組成之群組：
Figure 111128947-A0202-12-0130-18
Figure 111128947-A0202-12-0130-19
Figure 111128947-A0202-12-0131-20
Figure 111128947-A0202-12-0131-21
Figure 111128947-A0202-12-0131-22
Figure 111128947-A0202-12-0131-23
Figure 111128947-A0202-12-0131-24
Figure 111128947-A0202-12-0132-25
Figure 111128947-A0202-12-0132-26
Figure 111128947-A0202-12-0132-27
Figure 111128947-A0202-12-0132-28
Figure 111128947-A0202-12-0133-29
Figure 111128947-A0202-12-0133-30
Figure 111128947-A0202-12-0133-31
Figure 111128947-A0202-12-0133-32
Figure 111128947-A0202-12-0133-33
Figure 111128947-A0202-12-0133-34
Figure 111128947-A0202-12-0133-35
Figure 111128947-A0202-12-0134-40
Figure 111128947-A0202-12-0134-41
Figure 111128947-A0202-12-0134-38
Figure 111128947-A0202-12-0134-39
Figure 111128947-A0202-12-0134-42
，其中Y為O或S，且n為3至6(式XXIV)；
Figure 111128947-A0202-12-0135-43
，其中Y為O或S，且n為3至6(式XXV)；
Figure 111128947-A0202-12-0135-44
Figure 111128947-A0202-12-0135-45
，其中X為O或S(式XXVII)；
Figure 111128947-A0202-12-0136-46
Figure 111128947-A0202-12-0136-47
Figure 111128947-A0202-12-0137-49
Figure 111128947-A0202-12-0137-50
於另一態樣中，用於本發明之組成物及方法中之碳水化合物接合物係單醣。於一個態樣中，單醣係N-乙醯基半乳糖胺，例如
Figure 111128947-A0202-12-0138-52
於一些態樣中，RNAi劑經由下式所示之鏈結子附接至碳水化合物接合物，其中，X為O或S。
Figure 111128947-A0202-12-0138-53
於一些態樣中，RNAi劑附接至如表1中定義且如下所示之L96：
Figure 111128947-A0202-12-0138-54
用於本文所述之態樣中的另一代表性碳水化合物接合物包括但不限於，
Figure 111128947-A0202-12-0139-55
(式XXXVI)，其中，X或Y之一者為寡核苷酸，且另一者為氫。
於一些態樣中，合適之配體為WO2017/0340661中揭露之配體，該專利之整體內容藉由引用而併入本文。於一態樣中，配體包含以下結構：
Figure 111128947-A0202-12-0139-56
於本發明之某些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由單價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。於一些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由二價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。於本發明之又一些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由三價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。
於一態樣中，本發明之雙股RNAi劑包含一個或多個附接至該iRNA劑之GalNAc或GalNAc衍生物。GalNAc可經由鏈結子附接至有義股或反 義股上之任意核苷酸。GalNAc可附接至有義股之5'末端、有義股之3'末端、反義股之5'末端、或反義股之3'末端。於一態樣中，GalNAc經由三價鏈結子附接至有義股之3'末端。
於其他態樣中，本發明之雙股RNAi劑含複數(例如，2、3、4、5或6)個GalNAc或GalNAc衍生物，其透過複數個鏈結子例如單價鏈結子而各自獨立附接至該雙股RNAi劑之複數個核苷酸。
於一些態樣中，舉例而言，當本發明之iRNA劑之兩股皆係一個更大分子之一部分且藉由位於一股之3'末端與另一股之5'末端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環圈內之每一個未配對核苷酸可獨立包含經由單價鏈結子附接之GalNAc或GalNAc衍生物。
於一些態樣中，碳水化合物接合物復包含如上文所述的一個或多個另外配體，例如但不限於，PK調節子或細胞滲透肽。
適用於本發明之附加碳水化合物接合物及鏈結子包括彼等於PCT申請第WO 2014/179620號及第WO 2014/179627號中所揭示者，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
D.鏈結子
於一些態樣中，本文中揭示之接合物或配體可使用多種鏈結子附接至iRNA寡核苷酸，該鏈接基可係可裂解者或不可裂解者。
術語「鏈結子」或「鏈結基團」意指將化合物之兩個部分連結在一起，例如，將化合物之兩個部分共價附接的有機部分。鏈結子典型包含直接鍵結或原子如氧或硫，單元如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子之 鏈，例如但不限於，經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，其一個或多個亞甲基可由O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、或經取代或未經取代之雜環基中繼或終止；其中R8係氫、醯基、脂族或經取代之脂族。於一個態樣中，鏈結子係約1至24個原子、2至24個原子、3至24個原子、4至24個原子、5至24個原子、6至24個原子、6至18個原子、7至18個原子、8至18個原子、7至17個原子、8至17個原子、6至16個原子、7至17個原子、或8至16個原子。
可裂解之鏈結基團在細胞外足夠安定，但當進入標靶細胞時裂解以釋放被該鏈結子保持在一起之兩個部分。於示例性態樣中，可裂解之鏈結基團在標靶細胞內或在第一參考條件(其可係例如經選擇以模擬或呈現細胞內之條件)下之裂解比在受試者血液內或在第二參考條件(其可係例如經選擇以模擬或呈現見於血液或血清中之條件)下之裂解快至少約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更高、或至少100倍。
可裂解之鏈接基團係對於裂解劑例如pH、氧化還原電位或可降解分子之存在為敏感者。通常，與在血清或血液中相比，裂解劑在細胞內更為普遍或以更高量級或活性被發現。此類降解劑之示例包括：氧化還原劑，其係選擇用於特定之受質或其不具有受質特異性，包括例如細胞內存在之可降解氧化還原可藉由還原可裂解之鏈結基團的氧化酶、還原酶或還原劑如硫醇；酯酶；內切酶，或可創建酸性環境之劑如導致pH為5或更低之彼等；可藉由作為通用酸、肽酶(其可係受質特異性者)及磷酸酶作動而水解或降解酸可裂解之鏈結基團的酶。
可裂解之鏈結基團如二硫鍵可能對於pH敏感。人血清之pH為7.4，而細胞內平均pH略低，為7.1-7.3之範圍。胞內體具有酸性更強之pH，為5.5至6.0之範圍；而溶酶體甚至具有酸性更強之pH，約為5.0。一些鏈結子將具有可裂解之鏈結基團，該鏈結基團在選定之pH裂解，從而在細胞內將陽離子脂質從該配體釋放出來或將該陽離子脂質釋放如所欲之細胞腔室內。
鏈結子可包括可藉由特定酶裂解之可裂解之鏈結基團。併入鏈結子的可裂解之鏈結基團的類型可取決於待作為標靶之細胞。舉例而言，肝臟靶向配體可透過包括酯基之鏈結子而鏈結至鏈結子。肝細胞富含酯酶，因此鏈結子在肝細胞中將比在不富含酯酶之細胞類型內更有效地被裂解。其他富含酯酶之細胞類型包括肺、腎皮質及睪丸之細胞。
當靶向細胞類型係富含肽酶者如肝細胞及滑膜細胞時，可使用含有肽鍵之鏈結子。
通常，可藉由測試降解劑(或條件)裂解備選鏈結基團之能力而評估該備選之可裂解鏈結基團的適用性。亦所欲者係亦測試該備選可裂解鏈結基 團在血液中或當與其他非標靶組織接觸時之抵抗裂解的能力。因此，可測定第一條件與第二條件間之裂解相對敏感性，其中，該第一條件係選擇為標靶細胞內之裂解標誌物，且該第二條件係選擇為其他組織或生物流體如血液或血清中之裂解標誌物。該等評估可在無細胞之系統內、細胞內、細胞培養物內、器官或組織培養物內、或在整個動物體內進行。可能有用者係，在無細胞或培養條件下作成初始評估，並藉由在整體動物體內之進一步評估而證實之。於某些態樣中，可用之備選化合物在細胞內(或在選擇以模擬細胞內條件之活體外條件下)之裂解比在血液或血清中(或在選擇以模擬細胞外條件之體外條件下)快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
I.氧化還原可裂解之鏈結基團
於某些態樣中，可裂解之鏈結基團係氧化還原可裂解之鏈結基團，其當還原或氧化時被裂解。可經還原裂解之鏈結基團的實例係二硫鏈結基團(-S-S-)。為了確定備選可裂解鏈結基團是否係合適之「可還原裂解之鏈結基團」或例如是否適用於與特定iRNA部分及特定靶向劑合用，可查看本文中揭示之方法。舉例而言，可藉由以二硫蘇糖醇(DTT)或使用所屬技術領域中已知試劑之還原劑溫育來評估備選者，該溫育模擬在細胞例如標靶細胞內將會觀察到之裂解速率。該等備選物亦可在經選擇以模擬血液或血清條件之條件下評估之。於一個態樣中，備選化合物在血液中被裂解至多約10%。於其他態樣中，可用之備選化合物在細胞內(或在選擇以模擬細胞內條件之活體外條件下)之降解比在血液或血清中(或在選擇以模擬細胞外條件之活體外條件下)快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或約100倍。備選化合 物之裂解速率可使用標準酶動力學分析在經選擇以模擬細胞內介質之條件下測定，並將其與在經選擇以模擬細胞外介質之條件下所測者比較。
ii.基於磷酸酯之可裂解鏈結基團
於其他態樣中，可裂解之鏈結子包含基於磷酸酯之可裂解鏈結基團。基於磷酸酯之可裂解鏈結基團藉由降解或水解該磷酸酯基團之劑而裂解。在細胞內裂解磷酸酯基團之劑的實例係酶如細胞內之磷酸酶。磷酸酯系鏈結基團之示例係-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-，其中，Rk於每次出現時可獨立為C1-C20烷基、C1-C20鹵烷基、C6-C10芳基或C7-C12。示例性態樣包括-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-及-O-P(S)(H)-S-。於某些態樣中，磷酸酯系鏈結基團為-O-P(O)(OH)-O-。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
iii.酸可裂解之鏈結基團
於其他態樣中，可裂解之鏈結子包含酸可裂解之鏈結基團。酸可裂解之鏈結基團係在酸性條件下被裂解之鏈結基團。於某些態樣中，酸可裂解之鏈結基團係在pH為約6.5或更低(例如，約6.0、5.5、5.0或更低)之酸性環境中被裂解，或被劑諸如可用作通用酸之酶裂解。於細胞內，特異性低pH胞器如胞內體及溶酶體，可提供用於酸可裂解之鏈結基團的裂解環境。酸可裂解之鏈結基團之實例包括但不限於腙類、酯類、及胺基酸之酯類。酸可裂解之鏈結基團可具 有通式-C=NN-、C(O)O、或-OC(O)。示例性態樣係，當附接至酯之氧(烷氧基)的碳係芳基時，經取代之烷基、或四級烷基如二甲基戊基或第三丁基。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
iv.基於酯之鏈結基團
於其他態樣中，可裂解之鏈結子包含基於酯之可裂解鏈結基團。基於酯之可裂解鏈結基團由酶諸如酯酶或醯胺酶在細胞內裂解。基於酯之可裂解鏈結基團的示例包括但不限於伸烷基、伸烯基及伸炔基之酯類。酯可裂解之鏈結基團可具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
v.基於肽之裂解基團
於其他態樣中，可裂解之鏈結子包含基於肽之可裂解鏈結基團。基於肽之可裂解鏈結基團由酶諸如肽酶及蛋白酶在細胞內裂解。基於肽之可裂解基團在胺基酸間形成以獲得寡肽(例如，二肽、三肽等)及多肽之肽鍵。基於肽之可裂解基團不包括醯胺基團(-C(O)NH-)。醯胺基團可在任意伸烷基、伸烯基或伸炔基之間形成。肽鍵在胺基酸間形成以獲得肽及蛋白質之特異類型的醯胺鍵。基於肽之裂解基團通常限定為在胺基酸間形成而獲得肽及蛋白質的肽鍵(亦即，醯胺鍵)，且不包括該完整醯胺官能基。基於肽之可裂解鏈結基團具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA與RB係兩個相鄰胺基酸之R基團。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
於一些態樣中，本發明之iRNA透過鏈結子接合至碳水化合物。本發明之組成物及方法之具有鏈結子之iRNA碳水化合物接合體的非限制性示例包括，但不限於，
Figure 111128947-A0202-12-0146-57
Figure 111128947-A0202-12-0146-58
Figure 111128947-A0202-12-0146-59
Figure 111128947-A0202-12-0146-60
Figure 111128947-A0202-12-0146-61
 (式XLI)、
Figure 111128947-A0202-12-0147-62
Figure 111128947-A0202-12-0147-63
Figure 111128947-A0202-12-0147-64
(式XLIV)，其中，X或Y之一者係寡核苷酸，且另一者係氫。
於本發明之組成物及方法之某些態樣中，配體係一種或多種透過二價或三價分支鏈結子附接的GalNAc(N-乙醯基半乳糖胺)衍生物。
於一個態樣中，本發明之dsRNA接合至選自式(XLV)至(XLVIII)中任一者所示結構組成之群組的二價或三價分支鏈之鏈結基：
Figure 111128947-A0202-12-0148-65
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C於每次出現時獨立地表示0至20，其中，該重複單元可係相同或相異；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C於每次出現時獨立地為不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C於每次出現時獨立地為不存在、伸烷基、經取代之伸烷基(其中，一個或多個亞甲基可藉由O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R')=C(R")、C≡C或C(O)之一者或多者中斷或封端)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C於每次出現時獨立地為不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、 CO、CH=N-O、
Figure 111128947-A0202-12-0149-69
、
Figure 111128947-A0202-12-0149-71
、
Figure 111128947-A0202-12-0149-72
、
Figure 111128947-A0202-12-0149-73
、
Figure 111128947-A0202-12-0149-67
或雜環基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及L5C表示配體，亦即，於每次出現時各自獨立為單醣(諸如GalNAc)、二醣、三醣、四醣、寡醣、或多醣；且Ra為H或胺基酸側鏈。三價接合GalNAc衍生物尤其可與RNAi劑合用，以用於抑制標靶基因之表現，例如式(XLIX)之彼等：
Figure 111128947-A0202-12-0149-66
其中L5A、L5B及L5C表示單醣，諸如GalNAc衍生物。
合適之接合GalNAc衍生物之二價及三價分支鏈結子的示例包括但不限於，上文作為式II、VII、XI、X、及XIII而引用之結構。
教示RNA接合物之製備之代表性美國專利包括但不限於，美國專利第4,828,979號、第4,948,882號、第5,218,105號、第5,525,465號、第5,541,313號、第5,545,730號、第5,552,538號、第5,578,717號、第5,580,731號、第5,591,584號、第5,109,124號、第5,118,802號、第5,138,045號、第5,414,077號、第5,486,603號、第5,512,439號、第5,578,718號、第5,608,046號、第4,587,044號、第4,605,735號、第4,667,025號、第4,762,779號、第4,789,737號、第4,824,941號、第4,835,263號、第4,876,335號、第4,904,582號、第4,958,013號、第5,082,830 號、第5,112,963號、第5,214,136號、第5,082,830號、第5,112,963號、第5,214,136號、第5,245,022號、第5,254,469號、第5,258,506號、第5,262,536號、第5,272,250號、第5,292,873號、第5,317,098號、第5,371,241號、第5,391,723號、第5,416,203號、第5,451,463號、第5,510,475號、第5,512,667號、第5,514,785號、第5,565,552號、第5,567,810號、第5,574,142號、第5,585,481號、第5,587,371號、第5,595,726號、第5,597,696號、第5,599,923號、第5,599,928號、第5,688,941號、第6,294,664號、第6,320,017號、第6,576,752號、第6,783,931號、第6,900,297號、第7,037,646號、第8,106,022，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
給定化合物之所有位置經均勻修飾係不必要者，且事實上，超過一種前述修飾可併入單個化合物中或甚至併入iRNA之單個核苷處。本發明亦包括作為嵌合化合物之iRNA化合物。
於本發明之語境中，「嵌合」iRNA化合物或「嵌合體」係iRNA化合物，諸如dsRNAi劑，其含有兩個或更多個化學上截然不同之區域，各自由至少一個單體單元構成，亦即，在dsRNA化合物之情形中，該單體單元係核苷酸。此等iRNA典型含有至少一個區域，其中，該RNA經修飾以賦予該iRNA以增加之對核酸酶降解之抗性、增加之細胞攝取、或增加之與標靶核酸之結合親和性。iRNA之附加區域可用作能裂解RNA：DNA雜交體或RNA：RNA雜交體之酶的受質。舉例而言，RNase H係細胞之核酸內切酶，其裂解RNA：DNA雙鏈體之RNA股。因此，RNase H之激活導致RNA標靶之裂解，從而極大地提升對基因表現之iRNA抑制的效率。因此，當使用嵌合dsRNA時，使用較短之iRNA往往可獲得與使用雜交至相同標靶區域之硫代磷酸酯去氧dsRNA相當的結果。 RNA標靶之裂解可藉由凝膠電泳常規偵測之，且若需要，可將凝膠電泳與本技術領域中已知之相關核酸雜交技術合用。
於某些例子中，iRNA之RNA可藉由非配體基團予以修飾。大量非配體分子業經接合至iRNA以提升iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝取，且執行此類接合之過程可在科技文獻中獲得。此類非配體部分業經包括脂質部分，如膽固醇(Kubo,T.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1)：54-61；Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：65533)、膽酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4：1053)、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306；Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765)、硫代膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533)、脂肪鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10：111；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49)、磷脂質例如二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-磷酸三乙銨(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969)、或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedroh Lett.,1995,36：3651)、棕櫚醯基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229)、或十八烷基胺或己基胺-羰氧基膽固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923)。教示此類RNA接合物之製備的代表性美國專利列述於上文中。典型之接合策略牽涉在該序列之一個或多個位置承載胺基鏈結子之RNA的合成。胺基隨後與使用合適之偶聯劑或活化劑接合之分子 反應。接合反應可使用仍鍵結至固體支撐物之RNA執行，或在RNA於溶液相中裂解后執行。藉由HPLC進行之RNA接合物之純化典型提供純接合物。
IV.本發明之iRNA之輸送
可以多種不同方式達成本發明之iRNA向細胞之輸送，該細胞例如受試者諸如人類受試者(例如，有此需要之受試者，諸如易患或診斷為患有TTR相關疾患之受試者，該疾患諸如老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病)體內的細胞。舉例而言，可藉由將細胞與本發明之iRNA在活體外或活體內接觸而施行遞送。活體內遞送亦可藉由將包含iRNA如dsRNA之組成物投予至受試者而直接施行。或者，活體內遞送可藉由投予編碼並引導該iRNA之表現的一種或多種載體而間接施行。此等選擇於下文中進一步檢討。
通常，遞送核酸分子之任意方法(活體外或活體內)可適用於與本發明之iRNA合用(參見，例如，Akhtar S.and Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144及WO94/02595，其藉由引用而以其整體併入本文)。對於活體內遞送，為了遞送iRNA分子而慮及之因素包括，舉例而言，所遞送至分子的生物學穩定性、非特異性效應之預防、及所遞送之分子在標靶組織內之蓄積。RNA干擾亦業經顯示藉由直接注射進行之局部遞送的成功(Dorn,G.,et al.(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.,et al(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.,et al(2002) BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.,et al(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.,et al(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.,et al(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)。對RNA或醫藥載劑之修飾亦可允許該iRNA以標靶組織為靶向且避免非所欲之脫靶效應。iRNA分子可藉由化學接合至親脂性基團如膽固醇而修飾，以提升細胞攝取且防止降解。舉例而言，將接合至親脂性膽固醇部分之對抗ApoB的iRNA經全身注射至小鼠體內，導致肝臟及空腸兩處之apoB mRNA的敲除(Soutschek,J.et al.,(2004)Nature 432：173-178)。
於作為另一種選擇之態樣中，該iRNA可使用藥物遞送系統諸如奈米顆粒、樹枝狀聚合物、聚合物、脂質體、或陽離子遞送系統進行遞送。荷正電之陽離子遞送系統係促進iRNA分子(荷負電)之結合，亦提升在荷負電之細胞膜處的相互作用，以允許該細胞對iRNA之有效攝取。陽離子脂質、樹枝狀聚合物或聚合物可或結合至iRNA或被誘導以形成包合iRNA之泡囊或微胞(參見，例如，Kim SH.et al.,(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。媒介物或微胞之形成進一步防止當全身投予時該iRNA之降解。製作及投予陽離子-iRNA錯合物之方法完全處於所屬技術領域具有通常知識者之能力範圍內(參見，例如，Sorensen,DR.,et al.(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN.et al.,(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold,AS et al.(2007)J.Hypertens.25：197-205，其皆藉由引用而整體併入本文)。可用於iRNA之系統性遞送的藥物遞送系統之一些非限制性示例包括DOTAP(Sorensen,DR.,et al(2003)，同上；Verma,UN.et al.,(2003)，同上)、「固體核酸脂質顆粒」(Zimmermann,TS.et al.,(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien,PY.et al.,(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal, A.et al.,(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚乙亞胺(Bonnet ME.et al.,(2008)Pharm.Res.Aug 16電子優先公開；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)及聚醯胺基胺(Tomalia,DA.et al.,(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.et al.,(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。於一些態樣中，iRNA與環糊精形成用於全身性投予之錯合物。投予方法及iRNA與環糊精之醫藥組成物可見於美國專利第7,427,605號，其藉由引用而以其整體併入本文。本揭露之某些方面係關於降低細胞中TTR基因之表現的方法，包括令該細胞與本揭露之雙股RNAi劑接觸。於一態樣中，細胞係肝臟細胞，視需要係肝細胞。於一個態樣中，細胞係肝外細胞。
A.編碼本發明之iRNA的載體
靶向TTR基因之iRNA可從***DNA或RNA載體之轉錄單元表現(參見，例如，Couture,A,et al.,TIG.(1996),12：5-10；Skillern,A.,et al.，國際PCT公開第WO 00/22113號；Conrad，國際PCT公開第WO 00/22114號；以及Conrad，美國專利第6,054,299號)。表現可係瞬時者(幾小時至幾週之量級)或持續者(幾週至幾個月或更久)，取決於所使用之具體構造及標靶組織或細胞類型。此等基因轉殖可作為線性構造、環狀質體、或病毒載體而引入，其可係整合載體或非整合載體。基因轉殖亦可構造為允許其被作為粒線體外質體而被繼承(Gassmann,et al.,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1292)。
可與本文所述方法及組成物合用之病毒載體系統包括但不限於，(a)腺病毒載體；(b)逆轉錄病毒載體，包括但不限於慢病毒載體、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純皰疹病毒載體；(e)Sv40載體；(f)多瘤病毒載體；(g)乳頭狀瘤病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體，例 如天花例如牛痘病毒載體，或禽痘例如金絲雀痘或雞痘病毒載體；以及(j)幫手依賴性或裸腺病毒載體。複製缺陷病毒亦可係優勢者。不同之載體將變為或不變為併入該細胞之基因組內。若必要，該等構造可包括用於轉染之病毒序列。或者，該構造可併入能進行附加型複製(episomal replication)之載體例如EPV載體及EBV載體內。用於iRNA之重組表現之構造通常將會需要調節元素，例如啟動子、增強子等，以確保該iRNA在標靶細胞內之表現。對於載體及構造所慮及之其他方面係所屬技術領域中已知者。
V.本發明之醫藥組成物
本發明亦包括包括本發明之iRNA的醫藥組成物及製劑。於一態樣中，本文提供含有如本文所揭示之iRNA以及藥學可接受之載劑的醫藥組成物。含有該iRNA之醫藥組成物係有用於預防或治療TTR相關疾患，例如，老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌病(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病及高甲狀腺素血症。
此等醫藥組成物係基於遞送模式而配製。一個示例係將組成物配製為用於經由腸胃外遞送之系統性投予，例如，藉由皮下(subQ)遞送、肌肉內(IM)遞送或靜脈內(IV)遞送。本發明之醫藥組成物可以足以抑制TTR基因表現之劑量投予。
於一些態樣中，本發明之醫藥組成物係無菌者。於另一態樣中，本發明之醫藥組成物係無熱原者。
本發明之醫藥組成物可以足以抑制TTR基因表現之劑量投予。通常，本發明之iRNA的適當劑量將係約0.001至約200.0毫克每公斤接受者體 重每天的範圍內，通常係約1至50每公斤體重每天的範圍內。典型地，本發明之iRNA的適宜劑量將係約0.1mg/kg至約5.0mg/kg之範圍，諸如約0.3mg/kg及3.0mg/kg。重複劑量方案可包括規則地投予治療量之iRNA，諸如每個月一次，每3至6個月一次，或每年一次。於某些態樣中，iRNA係大約每個月投予一次至大約每六個月投予一次。
於初始之治療方案後，該治療之實施頻次可降低。治療之持續時間可基於疾病之嚴重程度而確定。
於其他態樣中，單一劑量之醫藥組成物可係長期持續者，使得劑量係以不超過1、2、3或4個月之間隔投予。於本發明之一些態樣中，單一劑量之本發明之醫藥組成物係約每個月投予一次。於本發明之其他態樣中，單一劑量之本發明之醫藥組成物係約每個季度(亦即，約每三個月)投予一次。於本發明之其他態樣中，單一劑量之本發明之醫藥組成物係約每年投予兩次(亦即，約每六個月投予一次)。
具有通常知識者應知悉，某些因素可影響有效治療受試者所需之劑量及時機，該等因素包括但不限於受試者體內存在之突變、先前之治療、受試者之一般健康情況或年齡、以及存在之其他疾病。此外，使用適宜的預防或治療有效量之組成物治療受試者可包括單一治療或一系列治療。
本揭露之醫藥組成物可經由大量路徑投予，取決於局部治療或系統性治療是否為所欲者，且取決於待治療之面積。投予可係外用(包括眼部投予、***投予、直腸投予、鼻腔內投予、透皮投予)、口服或腸胃外投予。腸胃外投予包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；真皮下投予，例如經由植入裝置；或顱內投予，例如藉由腦實質內投予、鞘內投予或腦室內投予。
iRNA可以靶向特定組織諸如肝臟之方式遞送。
用於外用投予之醫藥組成物及製劑可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳霜劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及粉末劑。傳統醫藥載劑、水性基質、粉末基質、油狀基質、增稠劑等可係必要者或所欲者。經塗覆之保險套、手套等亦可係有用者。適宜之外用製劑包括下述之彼等，其中本揭露所提出之RNAi劑與外用遞送劑如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑及界面活性劑混合。適宜之脂質及脂質體包括中性(例如，二油醯基磷脂DOPE乙醇胺、二肉豆蔻醯基卵磷脂DMPC、二硬脂醯基卵磷脂)、陰性(例如，二肉豆蔻醯基磷脂甘油DMPG)及陽離子性(例如，二油醯基四甲基胺基丙基DOTAP及二油醯基磷脂乙醇胺DOTMA)。本揭露提出之RNAi劑可封裝在脂質體內，或可與脂質體尤其是陽離子脂質體形成錯合物。另選地，RNAi劑可與脂質尤其是陽離子脂質錯合。適宜之脂肪酸及酯類包括但不限於花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、蘇子油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、甘油1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、或其C1-20烷基酯(例如，肉豆蔻酸異丙酯IPM)、單甘油酯、二甘油酯或藥學可接受之鹽。外用製劑詳細揭示於US 6,747,014中，其藉由引用而併入本文。
於一個態樣中，本發明之siRNA、雙股RNA劑係藉由外用投予途徑在醫藥組成物中投予至細胞。
於一個態樣中，該醫藥組成物可包括與外用輸送劑混合之siRNA化合物。該外用輸送劑可係複數個微小運載體。該等微小運載體可係脂質體。於一些態樣中，該等脂質體可係陽離子脂質體。
於另一態樣中，dsRNA劑係與外用滲透增強劑混合。於一個態樣中，該外用滲透增強劑為脂肪酸。脂肪酸可係花生四烯酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、蘇子油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、甘油1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、或其C1-10烷基酯、單甘油酯、二甘油酯或藥學可接受之鹽(例如，鈉鹽)。
於另一態樣中，該外用滲透增強劑為膽汁鹽。該膽汁鹽可係膽酸、去氫膽酸、去氧膽酸、麩胺膽酸(glucholic acid)、甘胺膽酸(glycholic acid)、甘胺去氧膽酸(glycodeoxycholic acid)、牛膽酸、鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid)、熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid)、牛-24,25-二氫-褐黴酸鈉、甘胺二氫褐黴酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚及其藥學可接受之鹽。
於另一態樣中，該滲透增強劑為螯合劑。該螯合劑可係EDTA、檸檬酸、柳酸鹽、膠原之N-乙醯基衍生物、laureth-9、β-二酮之N-胺基乙醯基衍生物及其混合物。
於另一態樣中，該滲透增強劑為界面活性劑，例如，離子性或非離子性界面活性劑。該界面活性劑可係月桂基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鯨臘基醚、全氟化學乳液或其混合物。
於另一態樣中，該滲透增強劑可係選自由下列所組成之群組：不飽和之環狀脲、1-烷基-烷酮類、1-烯基氮雜環烷基烷酮類、類固醇型抗炎藥及其混合物。於又一態樣中，該滲透增強劑可係二醇、吡咯、腙或萜烯類。
一方面，本發明提出一種可注射劑型的醫藥組成物，其包括siRNA化合物例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如，前驅物，例如， 可加工為ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物之DNA，例如，雙股siRNA化合物、或ssiRNA化合物或其前驅物)。於一個態樣中，該可注射劑型的醫藥組成物包括無菌水溶液或分散液或無菌粉末。於一些態樣中，該無菌溶液可包括稀釋劑諸如水；食鹽水溶液；不揮發油、聚乙二醇、甘油或丙二醇。
本發明之iRNA分子可併入醫藥組成物中。此類組成物典型包括一種或多種iRNA及藥學可接受之載劑。如本文所用，短語「藥學可接受之載劑」旨在包括與藥物投予例如至細胞例如肝臟細胞相容之任意及全部溶劑、分散介質、塗層、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑等。此類用於藥學活性物質之介質及劑的使用係所屬技術領域中習知者。除非任意傳統介質或劑與活性化合物不相容，否則預期其在組成物中之使用。補充活性化合物亦可併入組成物中。
本發明之醫藥組成物包括但不限於，溶液、乳液、及含脂質體之製劑。此等組成物可從多種組分生成，該等組分包括但不限於，預成形之液體、自乳化之固體及自乳化之半固體。製劑包括彼等靶向肝臟者。
可便利地以單位劑型存在的本發明之醫藥製劑，可根據醫藥工業中習知之傳統技術製備之。此類技術包括將活性成分與醫藥載劑或賦形劑帶至聯合之步驟。通常，藉由將活性成分與液體載劑均勻且緊密地帶至聯合而製備製劑。
A.其他製劑
i.乳液
本發明之組成物可製備且配製為乳液。乳液係一種液體以直徑通常超過0.1μm之液滴形式分散於另一種液體中之典型非均質系統(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335；Higuchi et al.,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常包含彼此緊密混合及分散之兩個不互混液體相之雙相系統。通常，乳液可係油包水(w/o)類或水包油(o/w)類。當水性相經精細切分為小液滴並分散於整塊油性相中時，所得組成物稱為油包水(w/o)乳液。或者，當油性相經精細切分為小液滴並分散於整塊水性相中時，所得組成物稱為水包油(o/w)乳液。乳液除了含有分散相及可作為水性相、油性相存在於溶液中或本身作為單獨一相的活性藥物之外，亦可含有額外之組分。如需要，醫藥賦形劑諸如乳化劑、穩定劑、染料及抗氧化劑亦可存在於乳液中。醫藥乳液亦可係由超過兩相構成之多乳液，舉例而言，油包水包油(o/w/o)乳液及水包油包水(w/o/w)乳液。此類復配製劑往往提供簡單雙相乳液所不具有之某些優點。 其中o/w乳液之個體油滴將小水滴容納在內之多乳液係構建w/o/w乳液。同樣，油滴被容納於穩定存在於油性連續相中之水球內的系統，係提供o/w/o乳液。
乳液之特徵在於熱力學穩定性小或沒有。一般情況下，乳液之分散相或不連續相良好地分散在外部相或連續相中，且透過乳化劑手段或形成黏度之手段維持其形式。其他穩定化乳液之手段需要使用可併入乳液之任一相中的乳化劑。廣義上，乳化劑可歸為四類：合成界面活性劑、天然界面活性劑、吸收基質、及精細分散之固體(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
合成界面活性劑，亦稱為表面活性劑，業經廣泛用於乳液製劑中且業經在文獻中回顧(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,volume 1,p.199)。界面活性劑典型係兩性者且包含親水性部分及疏水性部分。界面活性劑之親水性與疏水性之比率業經定義為親水/親脂平衡(HLB)，且係在製劑之製備中歸類及選擇界面活性劑之有價值的工具。基於其親水性基團之天性，界面活性劑可歸為不同之類別：非離子性、陰離子性、陽離子性及兩性(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第285頁)。
大量非乳化材料亦包括於乳液製劑中，且對乳液之特性有所貢獻。此等包括脂肪、油類、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑親水性膠體、防腐劑及抗氧化劑(Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第335頁；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第199頁)。
乳液製劑經由護膚途徑、口服途徑及腸胃外途徑之應用及其製造方法業經在文獻中回顧(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
ii.微乳液
於本發明之一個態樣中，iRNA及核酸之組成物經配製為微乳液。微乳液可定義為水、油及兩性之系統，其係單一光學各向同性且熱力學安定之溶液(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。典型地，微乳液係藉由下述製備之系統，首先，將油分散於界面活性劑水溶液中，隨和加入足量之第四成分，通常係中等鏈長之醇，以形成透明之系統。因此，微乳液亦業經揭示為兩種不互混液體的熱力學安定、各向同性之澄清分散液，該兩種液體藉由表面活性分子之界面膜予以安定化(Leung and Shah，在：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York，第185-215頁)。
iii.微粒
本發明之iRNA可併入顆粒例如微粒中。微粒可藉由噴霧乾燥生產，但亦可藉由其他方法生產，該等其他方法包括凍乾、蒸發、流動床乾燥、真空乾燥、或此等技術之組合。
iv.滲透增強劑
於一個態樣中，本發明採用多種滲透增強劑以實現核酸尤其是iRNA至動物皮膚之有效輸送。大多數藥物以經離子化及未經離子化兩種形式存在於溶液中。惟，一般僅脂溶性或親脂性藥物輕易地跨越細胞膜。業經發現，如果待被跨越之細胞膜經滲透增強劑處理，則即便是非親脂性藥物仍能夠跨越該細胞膜。滲透增強劑除了有助於非親脂性藥物跨越細胞膜之擴散之外，亦提升親水性藥物之滲透能力。
滲透增強劑可分類為屬於下述五大類之一：亦即，界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑、及非螯合非界面活性劑(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。 上文述及之類別的滲透增強劑各自及其在醫藥組成物之製造及藥劑之遞送中的用途係所屬技術領域中習知者。
v.賦形劑
與載劑化合物相比，「藥物載劑」或「賦形劑」係藥學可接受之溶劑、懸浮劑或其他用於將一種或多種核酸遞送至動物之藥學惰性媒介物。賦形劑可係液體或固體，且當與核酸及給定醫藥組成物之其他組分合併時，基於所考慮之計劃投予模式而選擇，以提供所欲之體積、一致性等。此類劑係所屬技術領域中習知者。
vi.其他組分
本發明之組成物可額外地含有常見於醫藥組成物中之其他輔助組分，用量為它們在所屬技術領域中常用的量級。因此，舉例而言，該等組成物可含有額外、可相容、藥學活性之材料如，舉例而言，止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或可含有可用於物理上配製多種類型之本發明之組成物的材料如染料、芳香劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑及安定劑。惟，當加入此類材料時，此類材料應不過度干擾本發明之組成物之組分的生物活性。該製劑可經無菌化，且(若需要)與不與該製劑之核酸進行有害反應的佐劑如潤滑劑、防腐劑、安定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽類、緩衝劑、著色劑、香味劑或芳香物質等混合。
水性懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，該物質包括，舉例而言，羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。懸浮液亦可含有穩定劑。
於一些態樣中，本發明提出之醫藥組成物包括(a)一種或多種iRNA及(b)一種或多種藉由非iRNA機制發揮作用且有用於治療TTR相關疾患 的藥劑，該疾患例如：老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病。
此類化合物之毒性及預防功效可藉由標準藥學過程在細胞培養物或實驗動物中測定，例如測定LD50(將群體之50%致死之劑量)及ED50(對群體之50%預防有效之劑量)。毒性與治療功效間之劑量比率係治療係數，且其可表現為LD50/ED50之比率。顯現高治療係數之化合物係較佳者。
從細胞培養檢定及動物研究中獲得之資料可用於配製在人體內使用之劑量範圍。本發明中本文提出之組成物的劑量通常處於包括ED50，諸如ED80或ED90在內之具低毒性或無毒性之循環濃度範圍。劑量可依據所採用之劑型及所使用之投予途徑而在此範圍內變動。對於在本發明提出之方法中使用的任意化合物，最初可從細胞培養物檢定中構建預防有效之劑量。劑量可在動物模型中配製為達成該化合物或(當適宜時)標靶序列之多肽產物的循環血漿濃度範圍(例如，達成多肽之降低之濃度)，該範圍包括如在細胞培養物中測定之IC50(亦即，達成對症候之半最大抑制時該測試化合物之濃度)或更高量級之抑制。此資訊可用來更準確地確定可用於人體之劑量。舉例而言，可藉由高效液相色層分析術量測血漿中之量級。
除了其等之投予外，如上文所檢討，本發明提出之iRNA可以與其他藥劑組合投予，用於預防或治療TTR相關疾患，例如，老年性全身性澱粉 樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌病(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性及高甲狀腺素血症。在任何情況下，主治醫生皆可基於本技術領域中已知或本文所述之標準功效測量方法觀察之結果而確定iRNA投予之量及時機。
VI.抑制TTR表現之方法
本發明亦提供抑制TTR基因在細胞內之表現的方法。該方法包括令細胞與其量足以抑制該細胞內TTR之表現的RNAi劑例如雙股RNA劑接觸，從而抑制該細胞內TTR之表現。於本揭露之一些態樣中，TTR基因之表現優先在肝臟(例如，肝細胞)中經抑制。
細胞與iRNA例如雙股RNA劑之接觸可於活體外或活體內進行。令細胞與iRNA於活體內接觸包括令受試者例如人類受試者體內之細胞或細胞群組與iRNA接觸。活體外接觸細胞之方法與活體內接觸細胞之方法的組合亦係可能者。與細胞揭示可係直接或間接者，如上文檢討。此外，與細胞之接觸可經由靶向配體施行，該配體包括本文所揭示或所屬技術領域中已知之任意配體。於一些態樣中，靶向配體為碳水化合物部分，例如，GalNAc3配體，或將RNAi靶向至所關注之位點的任何其他配體。
如本文中所用，術語「抑制」與「減輕」、「緘默化」、「下調」、「阻抑」及其他類似術語可互換使用，且包括任意量級之抑制。
如本文中所用，短語「抑制TTR之表現」旨在指代抑制任意TTR基因(例如，小鼠TTR基因、大鼠TTR基因、猴TTR基因、或人TTR基因)以及編碼TTR基因之變體或突變體的表現。因此，於經基因操縱之細胞、細胞群 組或生物體之語境中，TTR基因可係野生型TTR基因、突變TTR基因或基因轉殖TTR基因。
「抑制TTR基因之表現」包括對TTR基因之任意量級之抑制，例如，對TTR基因之表現的至少部分的阻抑。TTR基因之表現可介於任何與TTR基因表現相關之變量的量級或量級之改變來評估，例如，TTR mRNA量級或TTR蛋白質量級。此量級可在個別細胞或一組細胞中評估，包括，例如，源自受試者之樣本。
抑制可藉由與TTR表現相關之一個或多個變項之絕對或相對量級與對照量級相比的下降而評估。對照量級可係所屬技術領域中使用之任意類型之對照量級，例如投藥前之基線量級，或自未治療或經對照物(例如，僅含緩衝劑之對照物或非活性劑之對照物)治療之類似受試者、細胞或樣本測得之量級。
於本發明之方法的一些態樣中，TTR基因之表現被抑制至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%，或被抑制到低於該檢定之偵測量級。於較佳之態樣中，TTR基因之表現被抑制至少50%。復應理解，抑制某些組織例如肝臟中之TTR表現而不顯著抑制其在其他組織例如腦中之抑制可能係所欲者。於一些態樣中，使用實施例2中提供之方法使用10nM siRNA濃度於適宜物種匹配細胞系中測定表現量級。
於某些態樣中，活體內表現之抑制係藉由敲除表現人類基因之囓齒動物(例如，表現人類標靶基因(亦即，TTR)之經AAV轉染之小鼠)體內之人類基因而測定，例如，當在RNA表現之最低點投予3mg/kg之單一劑量時。模型動物系統中外源性基因表現之敲除亦可例如在RNA表現之最低點投予3mg/kg之單一劑量之後測定。當人類假基因之核酸序列與模型動物基因足夠接近而使 得人類iRNA提供模型動物基因之有效敲除時，此類系統係可用者。肝臟中之RNA表現係使用實施例2中提供之PCR方法測定。
對於TTR基因之表現的抑制可體現為由第一細胞或細胞群組(此類細胞可能存在於，舉例而言，源自受試者之樣品中)所表現的mRNA之量降低，TTR基因係於該細胞中轉錄，且該細胞已經過治療(例如，藉由使該細胞或細胞群組與本發明之iRNA接觸，或藉由向其體內存在該等細胞之受試者投予本發明之iRNA)，使得相較於第二細胞或細胞群組，TTR基因係經抑制，該第二細胞或細胞群組實質上與第一細胞或細胞群組相同但未經如此治療(未用iRNA治療或未用靶向所關注之基因的iRNA治療的對照細胞)。於一些態樣中，抑制係藉由實施例2中提供的方法使用10nM siRNA濃度在物種匹配細胞株內評估，且經治療之細胞內的mRNA含量係保險為相對於對照細胞內之mRNA的百分比，使用以下公式：
Figure 111128947-A0202-12-0168-74
於其他態樣中，對於TTR基因之表現的抑制可在與TTR基因表現功能性地關聯之參數(例如，來自受試者之血液或血清中的TTR蛋白含量)降低方面評估。TTR基因緘默化可以在任意表現TTR之細胞內且藉由所屬技術領域中已知的任意檢定確定，該細胞與表現構建體或為內源性或為異源性。
對於TTTR蛋白之表現的抑制可體現為由受試者樣品中細胞或細胞群組所表現之TTR蛋白含量(例如，源自受試者之血液樣品中的蛋白質含量)降低。如上所述，為了評估mRNA阻抑，經治療之細胞或細胞群組中之蛋白質 表現量級的抑制可類似地表現為相對於對照細胞或細胞群組內蛋白質含量的百分比，或表現為受試者樣品例如源自其的血液或血漿中蛋白質含量的變化。
可用於評估對於TTR基因之表現的抑制的對照細胞、細胞群組或受試者樣品包括尚未與本發明之RNAi劑接觸的細胞、細胞群組或受試者樣品。舉例而言，對照細胞、細胞群組或受試者樣品可在用RNAi劑治療受試者(例如，人類或動物受試者)之前源自該受試者或源自經適宜匹配之群體對照。
由細胞或細胞群組表現的TTR mRNA含量可使用所屬技術領域中已知用於評估mRNA表現的任何方法測定。於一個態樣中，樣品中TTR表現量級係藉由偵測經轉錄之多核苷酸或其部分(例如，TTR基因之mRNA)來測定。RNA可使用RNA提取技術從細胞提取，該等技術包括，舉例而言，使用酸苯酚/異硫氰酸胍提取(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasyTM RNA製備套組(Qiagen®)或PAXgeneTM(PreAnalytixTM,Switzerland)。採用核糖核酸雜交之典型檢定型式包括核連綴檢定、RT-PCR、RNase保護檢定、北方印漬術、原位雜交及微陣列分析。
於一些態樣中，使用核酸探針確定TTR之表現量級。如本文所用，術語「探針」指代能夠選擇性地結合至特異性TTR的任意分子。探針可由所屬技術領域具有通常知識者合成，或來源於適宜之生物學製劑。探針可特異性地設計為待標記。可用作探針之分子的實例包括但不限於RNA、DNA、蛋白質、抗體及有機分子。
單離之mRNA可用於雜交或擴增檢定中，該檢定包括但不限於，南方或北方印漬分析、聚合酶連鎖反應(PCR)分析及探針陣列。一種用於測定mRNA量級之方法包括令單離之mRNA與可雜交至TTR mRNA之核酸分子(探針)接觸。於一個態樣中，例如，藉由令單離之mRNA於瓊脂糖凝膠上電泳並將 mRNA從該凝膠轉移至膜諸如硝基纖維素膜上，從而將mRNA固定於固體表面上並令其與探針接觸。於替代之態樣中，例如，於Affymetrix®基因晶片陣列中，將探針固定於固體表面上並令mRNA與該探針接觸。具有通常知識者可輕易地調整已知之mRNA偵測方法以用於測定TTR mRNA之量級。
用於測定樣本中TTR表現量級之方法包括例如樣本中之mRNA的核酸擴增或逆轉錄(以製備cDNA)之製程，該製程係例如藉由RT-PCR(Mullis於1987年於美國專利4,683,202中詳述之實驗性態樣)、連接酶連鎖反應(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自我持續之序列複製(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β複製酶(Lizardi et al.(1988)Bio/Technology 6：1197)、滾環式複製(Lizardi et al.,US Patent No.5,854,033)或任意其他核酸擴增方法進行，之後使用所屬技術領域彼等具有通常知識者習知之技術偵測所擴增之分子。如果核酸分子以非常低之數量存在，則此等偵測方法尤其有用於偵測此類分子。於本發明之具體方面中，TTR表現之量級係藉由定量螢光RT-PCR(亦即，TaqManTM系統)測定。於一些態樣中，使用實施例2中提供之方法使用例如10nM siRNA濃度於物種匹配細胞系中測定表現量級。
可使用膜墨點(諸如雜交分析中所用者，諸如北方墨點、南方墨點、點等)或微孔、樣本管、凝膠、珠粒或纖維(或包含經結合之核酸的任意固體支撐物)監控TTR mRNA之表現量級。參見，美國專利第5,770,722號、第5,874,219號、第5,744,305號、第5,677,195號及第5,445,934號，該等專利藉由引用併入本文。TTR表現量級之測定亦可包含包含處於溶液中之核酸探針。
於一些態樣態樣中，使用分支DNA(bDNA)檢定或實時PCR(qPCR)評估mRNA表現之水平。此等方法之用途揭示且例示於本文之實施例中。於一些態樣中，表現量級係藉由實施例2中提供之方法使用10nM siRNA濃度在物種匹配細胞株中測定。
TTR蛋白表現之量級可使用本技術領域中已知用於量測蛋白質量級之任意方法測定。此類方法包括，例如，電泳、毛細管電泳、高效液相層析術(HPLC)、薄層層析術(TLC)、超擴散層析術、流體或凝膠沈澱素反應、吸收光譜、比色檢定、分光光度檢定、流式細胞術、免疫擴散(單或雙)、免疫電泳、西方墨點術、放射免疫檢定(RIA)、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、免疫螢光檢定、電化學發光檢定等。
於一些態樣中，本發明之方法的效力藉由TTR mRNA或蛋白質量級之降低(例如，於肝臟生檢樣本中)評估。
於一些態樣中，本發明之方法的功效可藉由偵測或監測TTR相關疾患之症候的降低而監測至，該降低例如感覺神經病變(例如，感覺異常、遠端肢體感覺遲鈍)、自律性神經病變(例如，胃腸道機能障礙，諸如胃潰瘍起立性低血壓)、運動神經病變、猝發癲癇、失智症、脊髓病、多發性神經病變、腕管症候群、自律性機能不全、心肌病、玻璃體混濁、腎機能不全、腎病變、實質上降低之mBMI(改變之身體質量指數)、顱神經機能障礙及角膜格狀營養不良中之降低。藉由量測此類參數之任一者或參數之任意組合而監控該等方法之效力，完全處於熟悉所屬技術領域之人士的能力範圍內。
於本發明之方法的一些態樣中，將iRNA投予至受試者，使得iRNA被遞送至該受試者體內之具體位點。TTR表現之抑制可使用來源於來自該 受試者特定位點(例如，肝臟或血液)之體液或組織的樣本中TTR mRNA或TTR蛋白質之量級或量級改變的量測值進行評估。
如本文中所用，術語偵測或確定分析物之量級係理解為意指執行該等步驟以確定材料例如蛋白質、RNA是否存在。如本文中所用，偵測或確定方法包括偵測或確定低於所使用方法之偵測量級的分析物量級。
VII.本發明之預防及治療方法
本發明亦提供使用本發明之iRNA或含有本發明之iRNA的組成物來抑制TTR之表現，從而預防或治療TTR相關疾患之方法，該疾患例如：甲狀腺素運載蛋白(TTR)相關疾患，例如，老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病。於本發明之方法中，細胞可在活體內或或體外與siRNA接觸，亦即，細胞可處於受試者體內。
適用於使用本發明之方法治療的細胞可係表現TTR基因之任何細胞，例如，肝臟細胞。適用於在本發明之方法中使用的細胞可係哺乳動物細胞，例如，靈長動物細胞(諸如人類細胞，包括嵌合非人動物內之人類細胞，或非人類靈長動物細胞例如猴細胞或黑猩猩細胞)或非靈長動物細胞。於某些態樣中，該細胞為人類細胞，例如人類肝細胞。於本發明之方法中，細胞中之TTR表現 被抑制至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%，或被抑制到低於該檢定之偵測量級。
本發明之活體內方法可包括向受試者投予含有iRNA之組成物，其中該iRNA包括與待投予該RNAi劑之哺乳動物的TTR基因之RNA轉錄本之至少一部分互補的核苷酸序列。該組成物可藉由所屬技術領域已知之任何手段投予，包括但不限於，口服、腹腔內或腸胃外途徑，包括顱內(例如，腦室內、腦實質內及鞘內)、靜脈內、肌肉內、皮下、透皮、呼吸道(噴霧劑)、鼻、直腸、眼內(例如，眼周、結合膜、筋膜下、前房內、玻璃體內、眼內、鞏膜前或鞏膜後、視網膜下、結合膜下、眼球後或小管內注射)、靜脈內、肌肉內、皮下、透皮、呼吸道(噴霧器)及外用(包括口頰及舌下)投予。
於某些態樣中，該組成物係藉由靜脈內輸液或注射而投予。於某些態樣中，該組成物係藉由皮下注射而投予。於某些態樣中，該組成物係藉由肌肉內注射而投予。
可基於局部治療或系統性治療是否係所欲者並基於待治療之面積而選擇投予模式。可選擇投予之途徑及位點以增強靶向性。
一方面，本發明亦提供抑制TTR基因在哺乳動物體內之表現的方法。該方法包括向哺乳動物投予包含靶向哺乳動物細胞內TTR基因之dsRNA的組成物，並將該哺乳動物維持足以獲得TTR基因之mRNA轉錄本降解的時間，從而抑制該TTR基因在細胞中的表現。基因表現之降低可藉由所屬技術領域中已知之任意方法及藉由本文中例如實施例2中揭示之方法例如qRT-PCR評估。蛋白質生產之降低可藉由所屬技術領域中已知之任意方法例如ELISA評估。於某些態樣中，穿刺肝臟生檢樣本用作組織材料來監測TTR基因或蛋白質表現 之降低。於其他態樣中，血液樣本用作受試者樣本來監測TTR蛋白質表現之降低。
本發明復提供治療有此需要之受試者，例如，經診斷為患有TTR相關疾患之受試者的方法，該疾患諸如：老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病。
本發明復提供預防有此需要之受試者的方法。本發明之治療方法包括向受試者(例如，將會受益於TTR表現降低之受試者)投予本發明之dsiRNA，係投予預防有效量之靶向TTR基因之dsRNA或投予包含靶向TTR基因之dsRNA的組成物。
一方面，本發明提供治療患有將會受益於降低TTR表現之疾患的受試者之方法，該疾患例如：TTR相關疾患，諸如老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病。
對將會受益於TTR基因表現降低及/或抑制之受試者的治療包括治療性治療(例如，患者正患有TTR相關疾患)及預防性治療(例如，患者目前未患有TTR相關疾患或患者可能處於發展出TTR相關疾患的風險下)。
於一些態樣中，該TTR相關疾患係選自由以下所組成之群組：老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病。
於一個態樣中，該受試者罹患家族性澱粉樣變性心肌病(FAC)。於另一態樣中，該受試者罹患具有混合表型之FAC，亦即，受試者具有心肌受損及神經系統受損兩者。於又一態樣中，該受試者罹患具有混合表型之FAP，亦即，受試者具有神經系統受損及心肌受損兩者。於一個態樣中，該受試者罹患已經用正位肝移植(OLT)治療的FAP。
於另一態樣中，該受試者罹患老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)。於本發明之方法的其他態樣中，該受試者罹患家族性澱粉樣心肌病(FAC)及老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)。正常序列TTR在老齡人群中引起心肌澱粉樣變性，並且成為老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)(也稱為老年性心肌澱粉樣變性病(SCA)或心肌澱粉樣變性病)。SSA往往伴隨有在眾多其他器官中之微觀沉積。TTR突變加速TTR澱粉樣形成之過程，並且係發展出臨床顯著之TTR澱粉樣變 性病(亦稱為ATTR(澱粉樣變性病-甲狀腺素運載蛋白型))的最重要風險因素。超過85種導致澱粉樣變性之TTR變體已知引起全身性家族性澱粉樣變性病。
於本發明之方法的一些態樣中，該受試者罹患甲狀腺素運載蛋白(TTR)相關家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)。此類受試者可罹患眼部表現，諸如玻璃體混濁及青光眼。所屬技術領域具有通常知識者已知，由視網膜色素上皮細胞(RPE)合成的導致澱粉樣變性之甲狀腺素運載蛋白(ATTR)在眼部澱粉樣變性病中扮演重要角色。先前研究已經證明，全視網膜雷射光凝(其降低RPE細胞)阻止玻璃體中澱粉樣沉積之進展，指示對RPE中之ATTR表現的有效阻遏可變為用於眼部澱粉樣變性病的新型療法(參見，例如，Kawaji,T.,et al.,Ophthalmology.(2010)117：552-555)。另一種TTR相關疾病為高甲狀腺素血症，亦稱為「甲狀腺素運載蛋白機能障礙性高甲狀腺素血症(dystransthyretinemic hyperthyroxinemia)」或「前白蛋白機能障礙性高甲狀腺素血症(dysprealbuminemic hyperthyroxinemia)」。此類型之高甲狀腺素血症可繼發於由於與甲狀腺素之親和力增加之突變型TTR分子所致的甲狀腺素與TTR之締合增加。參見，例如，Moses et al.(1982)J.Clin.Invest.,86,2025-2033。
於一些態樣中，TTR相關疾患為眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病視網膜病變、年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)、裂虹膜、粉刺原性粉刺症候群、小眼畸形、基底膜隱結(basal laminar drusen)、糖尿病性黃斑部水腫或視網膜靜脈阻塞。於一些態樣中，RBP4相關疾患為代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性，或心血管疾病。
如本文所用，術語「斯特格氏病(Stargardt’s dease)」指代引起視網膜退化及視力喪失的遺傳性眼睛疾患。斯特格氏病(Stargardt’s dease)為黃斑部退化之一種形式，亦稱為「青少年黃斑部退化」或「Stargardt氏黃斑部退化」。斯特格氏病(Stargardt’s dease)為最常見形式的先天性黃斑部退化，在美國影響大約30,000人。與斯特格氏病(Stargardt’s dease)相關的進行性視力喪失由稱為黃斑部的視網膜中央部分中的光受器細胞之退化引起。黃斑部為敏銳之中心視力的原因，其為閱讀、駕駛及辨識人臉之類的詳細任務所需。在大多數患有斯特格氏病(Stargardt’s dease)的人中，脂肪黃色色素(脂褐素)在黃斑部下方的細胞內堆積。隨時間推移，該物質之異常蓄積可損害對於清晰的中心視力而言至關重要的細胞。除了中心視力喪失之外，患有斯特格氏病(Stargardt’s dease)的人具有夜視問題，可能使得難以在低光線下導航。一些受影響之個體亦具有受損之色覺。斯特格氏病(Stargardt’s dease)之徵象及症候典型在兒童期的晚期到成年期的早期出現並且隨時間推移而惡化。
在斯特格氏病(Stargardt’s dease)的小鼠模型(Abca4-/-)中，顯示了細胞毒性脂褐素(例如，脂質-蛋白質-維他命A酸類聚集體)之合成增加及在RPE中過量蓄積。RPE脂褐素之主要細胞毒成分為雙維他命A酸類。脂褐素於視網膜中之合成取決於血清視黃醇從循環流入RPE中，且三級RBP4/TTR/視黃醇複合體於血清中之形成係為此流入所需。如由Racz等人所證明，向Abca4-/-小鼠投予非維他命A酸類RBP4拮抗劑顯著降低血清RBP4水化並且抑制維他命A酸類合成(Racz et al.J Biol Chem.2018,20；293(29)：11574-11588)，這代表用於斯特格氏病(Stargardt’s dease)及其他以脂褐素之過濾蓄積為特徵之疾患的潛在治療策略。
如本文所用，術語「年齡相關性黃斑部退化」(「AMD」)或「黃斑部退化」指代在年齡超過55歲之人群中，黃斑部(亦即，視網膜之中心部分)之進行性退化。在全世界範圍內，AMD佔全部致盲的8.7%。AMD以在視網膜下之大隱結沉積物(含有脂質及蛋白質之沉積物)為特徵。當AMD損害黃斑部時，人視力之中心部分可變得模糊或扭曲，且可能發展出盲點。AMD可快速或緩慢地引起視力喪失，並且可使得難以完成需要敏銳視力的事，諸如閱讀、縫紉、烹飪或駕駛，其亦可使得難以在昏暗光線下視物。存在兩種類型之AMD，指代為濕性AMD及乾性AMD。
黃斑部退化藉由毒性維生素A衍生物在視網膜色素上皮細胞(RPE)中之蓄積啟動並持續。在黃斑部退化之動物模型中，對RPE中之維生素A輸送或代謝進行藥理學抑制可顯著減緩並降低視力喪失。阻斷RBP4與其受體之間相互作用的抑制性肽，STRA6，顯示降低維生素A輸送至RPE，並且可用作基礎來研發治療劑以治療黃斑部退化(Farjo,et al.,2013,ARVO Annual Meeting,54(15),1702)。
「濕性AMD」，亦稱為「新血管AMD」或「濕性黃斑部退化」，以從從脈絡膜到視網膜內的病理性血管生長(脈絡膜新生血管)為特徵，很大程度上受到由視網膜色素上皮細胞(RPE)之過量血管內皮生長因子(VEGF)產生的驅動。
「乾性AMD」，亦稱為「地理性萎縮」或「乾性黃斑部退化」，由RPE細胞死亡及光受器退化引，導致視力喪失。
如本文所用，術語「糖尿病視網膜病變」(「DR」)指代在患有糖尿病的人群中可引起視力喪失及致盲的眼睛病症。其藉由損害眼睛後部處之光 敏組織(視網膜)處的血管而引起。首先，糖尿病視網膜病變可不引起症候或僅引起輕度視力問題。最終，其可能致盲。儘管加強了血糖看著，但80%的第2型糖尿病患者將會在疾病發病後15年內進展為DR。此外，糖尿病視網膜病變在70%至100%的患有第1型糖尿病之個體中出現。在早期，患者可能呈現為眼底中的小動脈瘤、硬滲出物、出血及棉毛斑點。隨著疾病進展，新血管可能由於局部缺血而生長，但它們很脆，可能引起出血並最終摧毀視網膜。DR的管理圍繞用於增殖性疾病的全視網膜雷射光凝進行，而糖尿病黃斑部量級係藉由局部或格柵雷射治療以及眼內抗VEGF劑及類固醇進行治療。當前之DR療法與不便利之輸送(雷射受試、頻繁的眼內注射)及令人不快之副作用(類固醇誘導型青光眼及白內障)相關聯。最近之研究業經顯示，在患有第2型糖尿病之患者中，RBP4血漿量級與糖尿病視網膜病變相關聯，並且具有較高量級之RBP4的患者發展出糖尿病視網膜病變的風險較大(Li et al.,Biosci Rep.2018 Oct 31；38(5)：BSR20181100)，表明RBP4在DR併發症之發病機制中的可能角色。
如本文所用，術語「糖尿病黃斑部水腫」(「DME」)指代糖尿病視網膜病變(DR)之一種形式，其中視網膜中之病變血管將來自循環之流體滲析到黃斑部中，導致嚴重的視力喪失。
如本文所用，術語「基底膜隱結」(「BLD」)亦稱為「角質層隱結」或「早期成年發病，成組隱結」，指代一種病症，其中小隱結隨機沉積在黃斑部中。在完全，此等隱結變得更多且散佈在整個視網膜中，其可能最終導致黃斑部中嚴重的色素上皮細胞脫落並導致視力喪失。隱結沉積物往往是自體螢光的。
如本文所用，術語「視網膜靜脈阻塞」(「RVO」)指代攜帶血液遠離視網膜之小靜脈的阻斷，其可以細分為中心及分支RVO。中心RVO由從中心視網膜靜脈的外流受損引起，而分支RVO在當中心靜脈之分支被阻塞時發生。由於該阻塞，視網膜可能發展為局部缺血，導致VEGF及發炎性蛋白質之增加，這可能驅動黃斑部水腫、新生血管、青光眼之發展，並且如果不進行治療，最終致盲。RVO之阻塞無法治療，但併發症可以藉由諸如對黃斑部水腫進行聚焦雷射治療或對新生血管進行抗VEGF治療之類的方法來管理。
「TTR相關眼疾患」包括任何與眼睛內TTR和/或RBP4基因或蛋白質相關的眼部疾病，其將會受益於降低TTR表現。此類TTR相關眼部疾病以例如下列者為特徵：脂褐素色素之蓄積(斯特格氏病(Stargardt’s dease))；眼細胞代謝之副產物在黃斑部中的沉積物，稱為隱結(AMD及BLD)；或脈絡膜或視網膜中之新生血管(AMD、DR、DME、RVO)，該新生血管蓄積並導致光投射之阻塞、組織損傷及視力機能低下或喪失。
TTR相關眼部疾病之其他症候包括，舉例而言，難以看清閱讀、縫紉、烹飪、看臉及駕駛所需的視覺中心，在昏暗光線下看不清，偵測到小盲點，視力模糊及扭曲，黑暗適應能力、光敏感性下降，色覺差，或浮點或暗線。關於各種疾病或病況之徵象及症候的進一步細節提供於本文中並且係所屬技術領域中習知者。
除眼部疾病之外，TTR進一步參與到多種人類代謝疾患(諸如葡萄糖及脂質恆定之疾患)以及心血管疾病中。
如本文所用，「代謝疾患」指代打斷將在細胞層面將食物轉化為能量的正常代謝之任何疾病或疾患。代謝疾患影響細胞執行關鍵生化反應的能 力，該等生化反應涉及蛋白質(胺基酸)、碳水化合物(糖及澱粉)或脂質(脂肪酸)的加工或轉運。於一些態樣中，RBP4相關疾患為代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，或心血管疾病。
如本文所用，「葡萄糖及脂質恆定之疾患」指代打斷正常葡萄糖及/或脂質代謝的任何疾病或疾患。葡萄糖及脂質恆定之疾患的示例包括但不限於，糖尿病、第I型糖尿病、第II型糖尿病、半乳糖血症、遺傳性果糖不耐受、果糖1,6-二磷酸酶缺乏症、肝醣儲存疾患、先天性醣基化疾患、胰島素抗性、胰島素機能不全、高胰島素血症、受損之葡萄糖耐受(IGT)、動脈粥樣硬化、異常血脂症、高三酸甘油酯血症(包括藥物誘發的高三酸甘油酯血症、利尿劑誘發的高三酸甘油酯血症、酒精誘發的高三酸甘油酯血症、β-腎上腺素阻斷劑誘發的高三酸甘油酯血症、***誘發的高三酸甘油酯血症、糖皮質素誘發的高三酸甘油酯血症、類視色素誘發的高三酸甘油酯血症、希美替定誘發的高三酸甘油酯血症及家族性高三酸甘油酯血症)、與高三酸甘油酯血症相關的急性胰臟炎、乳糜微粒症候群、家族性乳糜微粒血症、Apo-E缺乏症或抗性、LPL缺乏症或低活性、高脂血症(包括家族性混合型高脂血症)、高膽固醇血症、與高膽固醇血症相關之痛風、黃瘤病(皮下膽固醇沉積)、與異質性LPL缺乏症相關之高脂血症、與高LDL及異質性LPL缺乏症相關之高脂血症、脂肪肝病或非酒精性脂肪肝炎(NASH)。
如本文所用，術語「糖尿病」指代一組代謝疾病，其以由胰島素分泌或作動或兩者中之缺陷所致的高血糖(葡萄糖)含量為特徵。存在兩種最常見類型的糖尿病，即第1型糖尿病及第2型糖尿病，兩者皆由身體失去調節胰島素 之能力所致。胰島素為由胰臟因應於血液中血糖(葡萄糖)之含量增加而釋放的激素。
如本文所用，術語「第I型糖尿病」指代一種慢性病，其在當胰臟產生過少之胰島素以至於不能適當地調節血糖含量時發生。第I型糖尿病亦指代為胰島素依賴性糖尿病IDDM及青少年發病糖尿病。患有第I型糖尿病(胰島素依賴性糖尿病)之人產生極少的胰島素或根本不產生胰島素。儘管約6%的美國人患有一些形式的糖尿病，但全部糖尿病患者中僅約10%患有第I型疾患。大多數患有第I型糖尿病的人在30歲之前發展出疾患。第1型糖尿病表示胰臟β細胞之進行性自體免疫破壞及後續胰島素缺乏症的結果。超過90%的胰臟產胰島素細胞(β細胞)被永久地摧毀。所得胰島素缺乏症是嚴重的，且為了生存，患有第I型糖尿病的人必須定期注射胰島素。
在第II型糖尿病(亦指代為非胰島素依賴性糖尿病，NDDM)中，胰臟繼續製造胰島素，有時甚至以高於正常量級製造。惟，身體發展出胰島素抗性及失調之胰島素分泌。第II型糖尿病可能在兒童及少年中發生，但一般在30後開始出現且隨著年齡增加而變得愈來愈常見：超過70歲的人中約15%患有第II型糖尿病。肥胖為第II型糖尿病的風險因素，且患有該疾患的人中的80%至90%係肥胖者。於一些態樣中，糖尿病包括前期糖尿病。「前期糖尿病」指代一種或多種早期糖尿病病症，包括葡萄糖利用受損、空腹血糖濃度異常或受損、葡萄糖耐受受損、胰島素敏感性受損及胰島素抗性。前期糖尿病為第2型糖尿病、心血管疾病及死亡之發展的主要風險因素。更多關注給到發展治療性干預，該等治療性干預藉由有效地治療前期糖尿病來組織第2型糖尿病的發展。
糖尿病可藉由施予葡萄糖耐受測試來診斷。臨床上，糖尿病一般分為幾個基本類別。此等類別之原發性示例包括，自體免疫糖尿病、非胰島素依賴性糖尿病(第1型NDDM)、胰島素依賴性糖尿病(第2型IDDM)、非自體免疫糖尿病、非胰島素依賴性糖尿病(第2型NIDDM)及年輕的成年發病糖尿病(MODY)。另一類別，一般指代為繼發性，指代由一些可檢定之病症帶來的糖尿病，該等病症引起或允許糖尿病症狀發展。繼發性類別之示例包括，由胰臟疾病引起之糖尿病、激素異常、藥物或化學品引起的糖尿病、由胰島素受體異常引起的糖尿病、與遺傳病症相關的糖尿病及其他原因的糖尿病。(參見例如，Harrison's(1996)14th ed.,New York,McGraw-Hill)。
如本文所定義，心血管疾病亦視為「代謝疾患」。此等疾病可包括冠狀動脈疾病(亦稱為缺血性心臟病)、與冠狀動脈疾病相關之發炎、再狹窄、周圍血管疾病及中風。
如本文所定義，與體重相關之疾患亦視為「代謝疾患」。此類疾患可包括肥胖；代謝症候群，包括代謝症候群之獨立組成部分(例如，向心性肥胖、FBG/前期糖尿病/糖尿病、高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症及高血壓)；甲狀腺機能低下；***；及與體重增加(包括體重快速增加)、減重、維持減重、或減重後體重重新增加之風險相關的病症。
於一些態樣，該RNAi劑係以有效抑制受試者體內細胞中之TTR表現的量向該受試者投予。可使用上文檢討之方法來評估已知TTR在受試者體內之細胞中之表現的有效量，包括牽涉評估對TTR mRNA、TTR蛋白質或相關變量之抑制，該等變量諸如感覺神經病變(例如，感覺異常、遠端肢體感覺遲鈍)、自律性神經病變(例如，胃腸道機能障礙，諸如胃潰瘍起立性低血壓)、運動神經 病變、猝發癲癇、失智症、脊髓病、多發性神經病變、腕管症候群、自律性機能不全、心肌病、玻璃體混濁、腎機能不全、腎病變、實質上降低之mBMI(改變之身體質量指數)、顱神經機能障礙及角膜格狀營養不良中之降低。
本發明之iRNA可作為「自由iRNA」投予。自由iRNA係於醫藥組成物之不存在下投予。裸iRNA可處於合適之緩衝溶液中。緩衝溶液可包含醋酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任意組合。於一個態樣中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。含有iRNA之緩衝溶液之pH及滲透壓可經調節，使得其係適用於投予至受試者。
或者，本發明之iRNA可作為醫藥組成物投予，例如作為dsRNA脂質體製劑投予。
將會受益於抑制TTR基因表現之受試者為被懷疑或經診斷為患有TTR相關疾患的受試者，該疾患諸如老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病。於一個態樣中，該方法包括投予本文提出之組成物，使得標靶TTR基因之表現得以降低，例如每劑量造成之降低約持續1、2、3、4、5、6、1至6、1至3或3至6個月。於某些態樣中，組成物係每3至6個月投予一次。
於一個態樣中，可用於本文中提出之方法及組成物之iRNA特異性地靶向標靶TTR基因的RNA(原代或經處理者)。使用iRNA抑制此等基因之表現的組成物及方法可如本文中所揭示者製備及實施。
根據本發明之方法投予iRNA可導致對TTR相關疾患之預防或治療，該疾患例如：老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病、高甲狀腺素血症；眼部疾病，例如，斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)(例如，乾性AMD及濕性AMD)；代謝疾患，例如，葡萄糖及脂質恆定之疾患，例如，與第II型糖尿病相關之胰島素抗性；及心血管疾病。受試者可經投予治療量之iRNA，諸如約0.01mg/kg至約200mg/kg。
於一個態樣中，該iRNA係經皮下給藥，亦即，藉由皮下注射給藥。一次或多次注射可用來將所欲之劑量的iRNA遞送至受試者。該注射可在一段時間內重複實施。
該投予可定期重複實施。於某些態樣中，於初始之治療方案後，該治療之實施頻次可降低。重複劑量方案可包括規則地投予治療量之iRNA，諸如每個月一次至每年一次。於某些態樣中，iRNA係約每個月投予一次至每三個月投予一次，或約每三個月投予一次至約每六個月投予一次。
本發明復提供使用本發明之iRNA劑及其醫藥組成物用於治療將會受益於減低及/或抑制TTR基因表現之受試者的方法及用途，該受試者係例如患有TTR相關疾患之受試者，該方法及用途係與其他藥品及/或其他治療方法 合用，例如，與已知之藥品及/或已知之治療方法例如彼等當下用於治療此等疾患者合用。
據此，於本發明之一些方面，包括投予本發明之iRNA劑之方法復包括向受試者投予一種或多種額外治療劑。舉例而言，於某些態樣中，靶向TTR之iRNA劑係與例如可用於靶向TTR相關疾患之藥劑組合。用於治療TTR相關疾患的示例性額外治療劑及治療手段包括TTR穩定劑及非類固醇抗炎藥(NSAIDS)，例如，二氟尼柳(diflunisal)及利尿劑，及前述者之任意組合。
「穩定TTR之治療劑」或「穩定TTR四聚物者」為一種藥劑，其降低或阻止TTR四聚物之次單元解離，例如，解離為單體。於一些態樣中，該藥劑降低TTR澱粉樣斑塊之形成，例如，藉由降低TTR單體或形成TTR澱粉樣斑塊的TTR單體之蛋白水解片段的量級。此類藥劑包括但不限於，氯苯唑酸(tafamidis)、二氟尼柳及AG10。
該iRNA及額外治療劑可同時投予及/或在同一組合中投予，例如腸胃外投予，或該額外治療劑可作為獨立組成物之一部分或在獨立之時間及/或藉由所屬技術領域中已知或本文中揭示之另一方法投予。
該iRNA劑及額外治療劑及/或治療可同時投予及/或在同一組合中投予，例如腸胃外投予，或該額外治療劑可作為獨立組成物之一部分或在獨立之時間及/或藉由所屬技術領域中已知或本文中揭示之另一方法投予。
VIII.套組
於某些方面，本揭露提供包括合適容器之套組，該容器含有siRNA化合物例如雙股siRNA化合物或siRNA化合物(例如，前驅物，例如，可 加工為siRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物之DNA，例如，雙股siRNA化合物、或ssiRNA化合物或其前驅物)。
此類套組包括一種或多種dsRNA劑及使用說明，例如，用於投予預防或治療有效量之dsRNA劑的使用說明書。dsRNA劑可處於小瓶內或預填充之注射器內。套組可視需要復包含用於投予dsRNA劑之機構(例如，注射裝置，諸如預填充之注射器或自動注射器裝置)或用於量測對TTR之抑制的機構(例如，用於量測對TTR mRNA、TTR蛋白質及/或TTR活性之抑制的機構)。此類用於量測對TTR之抑制的裝置可包含用於從受試者獲得樣本如血漿樣本的裝置。本發明之套組可視需要復包含用於測定治療有效量或預防有效量的裝置。
於某些態樣中，醫藥製劑之個體組分可提供於一個容器例如小瓶或預填充之注射器內。另選地，可能所欲者係將醫藥製劑之組分單獨提供於兩個或更多個容器中，例如，一個用於siRNA化合物製備的容器以及至少另一個用於載劑化合物的容器。套組可包裝成多種不同組態，諸如一個盒子中之一個或多個容器。不同組分可組合，例如，根據套組提供之使用說明書組合。組分可根據本文所揭示之方法組合，例如以製備並投予一種醫藥組成物。套組亦可包括遞送裝置。
本發明藉由下述實施例進一步示例性說明，該等實施例不應視為限制性。本說明書通篇所引用之全部參考文獻、專利及公佈專利申請之整體內容以及非正式序列表及圖示藉由引用而併入本文。
實施例
實施例1：iRNA合成
試劑之來源
若本文中未具體給出試劑之來源，則測量試劑可從任何分子生物學用試劑供應商以用於分子生物學應用之品質/純度標準獲得。
siRNA設計
使用訂製之R及Python腳本設計靶向人類甲狀腺素運載蛋白(TTR)基因(人類：NCBI refseqID NM_000371.4，NCBI GeneID：7276)的siRNA。人類NM_000505.4 REFSEQ mRNA之長度為616個鹼基。
未修飾之TTR有義股及反義股核苷酸序列的詳細列述顯示於表2中。經修飾之TTR有義股及反義股核苷酸序列的詳細列述顯示於表3中。
應理解，本申請通篇中，不具小數之雙鏈體名稱等同於具有小數之雙鏈體名稱，其僅指代該雙鏈體之批號。例如，AD-959917等同於AD-959917.1。
siRNA合成
siRNA係使用所屬技術領域已知之方法設計、合成及製備。
簡而言之，使用Mermade 192合成儀(BioAutomation)，於固體支撐物上使用亞磷酸醯胺(phosphoramidite)化學作用，以1μmol規格合成siRNA序列。固體支撐物係負載有訂製GalNAc配體(3'-GalNAc接合物)的受控之多孔玻璃(500-1000Å)、通用固體支撐物(AM Chemicals)或感興趣之第一核苷酸。輔助合成試劑及標準2-氰基乙基亞磷酸醯胺單體(2’-去氧-2’-氟、2’-O-甲基、RNA、DNA)係獲自Thermo-Fisher(Milwaukee,WI)、Hongene(China)或Chemgenes (Wilmington,MA,USA)。另外之亞磷酸醯胺單體係自供應商處購得、於現場製備、或使用來自各種CMO之訂製合成獲得。亞磷酸醯胺以100mM之濃度於乙腈或9：1乙腈：DMF中製備，並使用5-乙硫基-1H-四唑(ETT，於乙腈中之0.25M溶液)偶聯，反應時間為400秒。亞磷酸醯胺鏈結使用3-((二甲胺基-亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT，獲自Chemgenes(Wilmington,MA,USA))之100mM溶液於無水乙腈/吡啶(9：1 v/v)中生成。氧化時間係5分鐘。全部序列皆合成為最終去除DMT(「DMT-off」)。
一旦固相合成完成，即將固體支撐之寡核苷酸以300μL之甲胺(40%水溶液)於室溫在96孔板中處理大約2小時，以造成從固體支撐物裂解以及後續之全部另外之鹼不穩定保護基團的去除。對於含有經第三丁基二甲基矽烷基(TBDMS)基團保護之任意天然核糖核苷酸鏈結(2’-OH)的序列，係使用TEA.3HF(三乙胺三氫氟酸鹽)執行第二去保護步驟。向每一種於甲胺水溶液中之寡核苷酸溶液中加入200μL之二甲基亞碸(DMSO)及300μL TEA.3HF，並將該溶液於60℃溫育大約30分鐘。溫育之後，使板來至室溫，藉由加入1mL之9：1乙腈：乙醇或1：1乙醇：異丙醇而將粗製寡核苷酸沉澱。然後將板於4℃離心45分鐘，在多通道滴管之輔助下小心地傾倒上清液。將寡核苷酸沉澱物重新懸浮於20mM NaOAc中，接著，於配備自動採樣器、UV偵測器、電導計及級分收集器之Agilent LC系統上使用HiTrap尺寸排阻管柱(5mL，GE Healthcare)來進行脫鹽。經脫鹽之樣本係收集於96孔板中，然後藉由LC-MS及UV分光光度計分析以分別證實材料之身份並定量。
於Tecan液體操作機器人上執行單一股之雙鏈體化。於96孔板中，將有義及反義單一股以等莫耳比率於1x PBS中合併至10μM之最終濃度， 將板密封，於100℃溫育10分鐘，之後令其在2至3小時之時間段內緩慢回至室溫。證實了每種雙鏈體之濃度及身份，然後將其用於活體外篩查檢定中。
實施例2：活體外篩查方法
細胞培養及384孔轉染
令Hep3b細胞(ATCC,Manassas,VA)，於藉由胰蛋白酶化而自板釋放之前，在補充有10% FBS(ATCC)的Eagle Minimum Essential Medium(Gibco)、37℃、5% CO2氣氛下生長至接近融合(confluence)。藉由下述者轉染細胞：於384孔板之每一孔中，將每孔7.5μl之Opti-MEM加上0.1μl之Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen，Carlsbad CA目錄# 13778-150)加入2.5μl之各siRNA雙鏈體中。然後將混合物於室溫下溫育15分鐘。隨後，將含有~1.5x104個細胞之40μl的無抗生素培養基加至siRNA混合物中。在RNA純化之前，將細胞溫育24小時。以10nM、1nM及0.1nM之最終雙鏈體濃度，執行單劑量實驗。
使用DYNABEADS mRNA單離套組進行之總RNA單離：(Invitrogen TM ，part#：610-12)
於每一孔中，將細胞於含有3μL珠粒的75μl之裂解/結合緩衝液(Lysis/Binding Buffer)中裂解，並於靜電振蕩器上混合10分鐘。使用磁性板支撐物，於Biotek EL406上自動執行洗滌步驟。珠粒於緩衝液A中洗滌(在90μL中)一次，在緩衝液B中洗滌一次，並且在緩衝液E中洗滌兩次，每兩次洗滌之間執行抽吸步驟。最後一次抽吸之後，將完整的10μL RT混合物添加到每一孔中，如下所揭示。
使用高能cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems,Foster City,CA,Cat #4368813)之cDNA合成
於每一反應中，將1μl 10X緩衝液、0.4μl 25X dNTP、1μl隨機引子、0.5μl逆轉錄酶、0.5μl RNase抑制劑及6.6μl之H2O的預混液添加到每孔中。將板密封，於靜電振蕩器上攪動10分鐘，隨後於37℃溫育2小時。此後，將板於80℃攪動8分鐘。
實時PCR
於384孔板(Roche目錄號04887301001)之每孔中，將2微升(μl)之cDNA加入含有0.5μl人類GAPDH TaqMan探針(4326317E)、0.5μl人類TTR、2μl無核酸酶水及5μl Lightcycler 480探針預混液(Roche Cat# 04887301001)的預混液中。實時PCR係於LightCycler480 Real PCR系統(Roche)中進行。
為了計算相對倍數改變，使用△△Ct方法分析資料並將該資料標準化至使用以10nM AD-1955轉染或模擬轉染之細胞實施的檢定。使用以XLFit進行之4參數擬合模型計算IC50，並標準化至以AD-1955轉染或模擬轉染之細胞。AD-1955之有義及反義序列為：有義cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT及反義UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT。
於食蟹獼猴(Cynomolgus)肝細胞中進行之表2及表3所列之雙鏈體的單劑量篩查結果提供於表4中。
表1.核苷酸序列呈現中使用之核苷酸單體的縮寫。應理解，當此等單體存在於寡核苷酸中，其係藉由5'-3'-磷酸二酯鍵而相互鏈結；並且應理解，當核苷酸含有2’-氟修飾時，則該氟替換位於其母體核苷酸中該位置處之羥基(亦即，其係2’-去氧-2’-氟核苷酸)。
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表2. TTR dsRNA劑之未經修飾的有義股序列及反義股序列
Figure 111128947-A0202-12-0195-149
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表3. TTR dsRNA劑之經修飾的有義股序列及反義股序列
Figure 111128947-A0202-12-0202-150
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表4.於原代食蟹獼猴肝細胞中之單劑量活體外篩查
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實施例3：所關注之dsRNA劑的結構活性關係(SAR)
執行了在實施例2中鑑定的所關注之dsRNA劑的結構活性關係。如實施例中所揭示設計並合成藥劑。如實施例2中所揭示，在Hep3B細胞中進行單劑量篩查。
本實施例中之藥劑的未經修飾之核苷酸序列顯示於表5中。本實施例中之藥劑的經修飾之核苷酸序列顯示於表6中。單劑量篩查的結果提供於表7中。
表5. TTR dsRNA劑之未經修飾的有義股序列及反義股序列
Figure 111128947-A0202-12-0216-152
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表6. TTR dsRNA劑之經修飾的有義股序列及反義股序列
Figure 111128947-A0202-12-0219-154
Figure 111128947-A0202-12-0220-105
Figure 111128947-A0202-12-0221-107
Figure 111128947-A0202-12-0222-108
Figure 111128947-A0202-12-0223-109
Figure 111128947-A0202-12-0224-110
表7.於Hep3B細胞中之單劑量活體外篩查
Figure 111128947-A0202-12-0225-111
Figure 111128947-A0202-12-0226-112
Figure 111128947-A0202-12-0227-113
實施例4：dsRNA雙鏈體於小鼠中之體內篩查
對感興趣之從上述活體外研究鑑定之雙鏈體進行活體內評估。特定而言，於投藥前第-14天，藉由靜脈內投予2 x 1011編碼人類TTR之腺相關病毒8(AAV8)載體的病毒顆粒，以轉導野生型小鼠(C57BL/6)。特定而言，向小鼠投予編碼人類TTR之AAV8。
於第0天，對三個小鼠之群組經皮下投予1mg/kg單次劑量的感興趣之劑或PBS對照物。於給藥後第7天犧牲動物，收集肝臟樣本並於液氮中速凍。提取組織mRNA並藉由RT-QPCR方法分析。
將人類TTR mRNA量級與管家基因GAPDH比較。隨後將該值標準化至PBS媒介物對照群組之平均值。資料係表現為相對於基線值之百分比，並呈現為均值加上標準差。顯示於第1圖中之結果表明，所測試之示例性雙鏈體劑於活體內有效地降低了人類TTR信使RNA之量級。
實施例5：dsRNA雙鏈體於食蟹獼猴中之活體內篩查
在食蟹獼猴中評估從上述小鼠研究鑑定的所關注之雙鏈體。在第1天，動物(N=3每組)接受單次0.5mg/kg皮下劑量的dsRNA劑(AD-649263、AD-1134938、AD-649264、AD-1134966或AD-65496)。
使用AD-65496作為對比物，其先前經鑑定為有效且持久地抑制人類TTR mRNA的dsRNA劑。AD-65496之有義股的經修飾之核苷酸序列為5'- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'，且AD-65496之反義股的經修飾之核苷酸序列為5'-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3'。
在給藥後第-8、0、8、15、20、29、36、43、50、64、78及92天獲取血液。如上文所揭示，測定TTR mRNA量級。資料係表現為相對於基線值之百分比，並呈現為均值加/減標準差。結果顯示於第2圖中。
數據表明，皮下投予單次0.5mg/kg劑量之AD-649263、AD-1134938、AD-649264、AD-1134966或AD-65496有效且持久地抑制TTR mRNA。數據亦表明，在皮下投予單次0.5mg/kg劑量之AD-1134966或AD-649264後的TTR mRNA減弱係類似於使用先前評估之雙鏈體AD-65496時觀察到的TTR減弱及持久減弱。此外，資料表明，在皮下投予單次0.5mg/kg劑量之AD-1134938或AD-1134966後的TTR mRNA減弱係類似於使用各相應親本雙鏈體(AD-649263或AD-649264)時觀察到的減弱。資料亦表明，AD-649264在活體內比AD-649263有效，概述在實施例4中揭示之AAV實驗中獲得的資料。
等效物
所屬技術領域中具有通常知識者將知悉或能夠探明僅使用常規實驗來本文所揭示之具體態樣及方法的多種等效物。此類等效物擬涵蓋於下列申請專利範圍之範疇內。
非正式序列表
SEQ ID NO：1
>NM_000371.4智人(Homo sapiens)甲狀腺素運載蛋白(TTR)，mRNA
Figure 111128947-A0202-12-0228-114
Figure 111128947-A0202-12-0229-115
SEQ ID NO：2
>NM_013697.2家鼷鼠(Mus musculus)甲狀腺素運載蛋白(Ttr)，mRNA
Figure 111128947-A0202-12-0229-116
SEQ ID NO：3
>NM_013697.2溝鼠(Rattus norvegicus)甲狀腺素運載蛋白(Ttr)，mRNA
SEQ ID NO：4
>NM_000371.4食蟹獼猴(Macaca fascicularis)甲狀腺素運載蛋白(TTR)，mRNA
Figure 111128947-A0202-12-0229-117
SEQ ID NO：5
>NM_000371.4恆河獼猴(Macaca mulatta)甲狀腺素運載蛋白(TTR)，mRNA
Figure 111128947-A0202-12-0230-118
SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：1之反向互補序列
Figure 111128947-A0202-12-0230-119
SEQ ID NO：7
SEQ ID NO：2之反向互補序列
Figure 111128947-A0202-12-0230-120
SEQ ID NO：8
SEQ ID NO：3之反向互補序列
Figure 111128947-A0202-12-0231-121
SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：4之反向互補序列
Figure 111128947-A0202-12-0231-122
SEQ ID NO：10
SEQ ID NO：5之反向互補序列
Figure 111128947-A0202-12-0231-123
TW202328445A_111128947_SEQL.xml

Claims (102)

  1. 一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，係用於抑制甲狀腺素運載蛋白(TTR)在細胞中之表現，
    其中，該dsRNA劑包含形成雙股區域之有義股及反義股，
    其中，該有義股係包含與5'-AGAGTAUUCCAUUUUUACU-3'之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸之至少15個接續核苷酸，且該反義股係包含與5'-AGUAAAAAUGGAAUACUCUUG-3'之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸之至少15個接續核苷酸，以及
    其中，該有義股之全部核苷酸及該反義股之全部核苷酸包含選自由2’-O-甲基修飾、2’-氟修飾及去氧-核苷酸所組成之群組之核苷酸修飾；
    其中，該有義股包含至少2個2’-氟修飾；以及
    其中，該反義股包含至少2個2’-氟修飾；以及
    其中，該有義股包含兩個硫代磷酸酯類鏈結；
    其中，該反義股包含四個硫代磷酸酯類鏈結；以及
    其中，至少一股係接合至配體。
  2. 如請求項1所述之dsRNA劑，其中，該有義股包含2至6個2’-氟修飾。
  3. 如請求項1或2所述之dsRNA劑，其中，該有義股包含4個2’-氟修飾。
  4. 如請求項3所述之dsRNA劑，其中，該等4個2’-氟修飾位於從該有義股之5'-末端之位置7及9至11。
  5. 如請求項1所述之dsRNA劑，其中，該有義股包含3個2’-氟修飾。
  6. 如請求項3所述之dsRNA劑，其中，該等3個2’-氟修飾位於從該有義股之5'-末端之位置7至9。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之dsRNA劑，其中，該反義股包含2至6個2’-氟修飾。
  8. 如請求項7所述之dsRNA劑，其中，該反義股包含4個2’-氟修飾。
  9. 如請求項8所述之dsRNA劑，其中，該等4個2’-氟修飾位於從該反義股之5'-末端之位置2、6、14及16。
  10. 如請求項7所述之dsRNA劑，其中，該反義股包含2個2’-氟修飾。
  11. 如請求項10所述之dsRNA劑，其中，該等2個2’-氟修飾位於從該反義股之5'-末端之位置14及16。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股包含位於5'末端三個端部核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之dsRNA劑，其中，該反義股包含位於3'-末端三個端部核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結以及位於5'末端三個端部核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之dsRNA劑，其中，該配體係接合至該dsRNA劑之有義股的3'末端。
  15. 如請求項1至14中任一項所述之dsRNA劑，其中，該配體為N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
  16. 如請求項1至15中任一項所述之dsRNA劑，其中，該配體係透過單價、二價或三價分支鏈結基附接的一個或多個GalNAc衍生物。
  17. 如請求項15或16所述之dsRNA劑，其中，該配體為
    Figure 111128947-A0202-13-0003-124
  18. 如請求項17所述之dsRNA劑，其中，該dsRNA劑係如下述式所示接合至配體
    Figure 111128947-A0202-13-0003-125
    以及，其中，X為O或S。
  19. 如請求項18所述之dsRNA劑，其中，X為O。
  20. 如請求項1至19中任一項所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係19至30個核苷酸對之長度。
  21. 如請求項20所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係19至25個核苷酸對之長度。
  22. 如請求項20所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係19至23個核苷酸對之長度。
  23. 如請求項20所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係23至27個核苷酸對之長度。
  24. 如請求項20所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係21至23個核苷酸對之長度。
  25. 如請求項1至24中任一項所述之dsRNA劑，其中，每一股獨立地為不超過30個核苷酸之長度。
  26. 如請求項1至25任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股係21個核苷酸之長度，以及該反義股係23個核苷酸之長度。
  27. 如請求項1至26中任一項所述之dsRNA劑，其中，至少一股包含具有至少1個核苷酸的3'突出。
  28. 如請求項1至26中任一項所述之dsRNA劑，其中，至少一股包含具有至少2個核苷酸的3'突出。
  29. 如請求項1至28中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股包含核苷酸序列5'-CAAGAGUAUUCCAUUUUUACU-3'，且該
    該反義股包含核苷酸序列5'-AGUAAAAAUGGAAUACUCUUGGU-3'。
  30. 如請求項1至28中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股包含核苷酸序列5'-CCAAGAGUAUUCCAUUUUUAU-3'，且該
    該反義股包含核苷酸序列5'-AUAAAAAUGGAAUACUCUUGGUU-3'。
  31. 如請求項1至28中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股包含核苷酸序列5'-AGAGTAUUCCAUUUUUACU-3'，且該
    該反義股包含核苷酸序列5'-AGUAAAAAUGGAAUACUCUUG-3'。
  32. 如請求項1至29中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股之核苷酸序列與5'-csasagagUfaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列相異不超過4個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asGfsuaaAfaauggaaUfaCfucuugsgsu-3'之核苷酸序列相異不超過4個鹼基，
    其中，a、c、g及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G及U；Af、Cf、Gf及Uf為2’-氟A、C、G及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
  33. 如請求項32所述之dsRNA劑，其中，該有義股之核苷酸序列與5'-csasagagUfaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列相異不超過3個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asGfsuaaAfaauggaaUfaCfucuugsgsu-3'之核苷酸序列相異不超過3個鹼基。
  34. 如請求項33所述之dsRNA劑，其中，該有義股之核苷酸序列與5'-csasagagUfaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列相異不超過2個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asGfsuaaAfaauggaaUfaCfucuugsgsu-3'之核苷酸序列相異不超過2個鹼基。
  35. 如請求項34所述之dsRNA劑，其中，該有義股之核苷酸序列與5'-csasagagUfaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列相異不超過1個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asGfsuaaAfaauggaaUfaCfucuugsgsu-3'之核苷酸序列相異不超過1個鹼基。
  36. 如請求項35所述之dsRNA劑，其中，該有義股包含5'-csasagagUfaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列，並且該反義股包含5'-asGfsuaaAfaauggaaUfaCfucuugsgsu-3'之核苷酸序列。
  37. 如請求項36所述之dsRNA劑，其中，該有義股由5'-csasagagUfaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列所組成，並且該反義股由5'-asGfsuaaAfaauggaaUfaCfucuugsgsu-3'之核苷酸序列所組成。
  38. 如請求項36中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股包含5'-csasagagUfaUfUfCfcauuuuuacuL96-3'之核苷酸序列，並且該反義股包含5'-asGfsuaaAfaauggaaUfaCfucuugsgsu-3'之核苷酸序列，其中L96為N-[參(GalNAc-alkyl)醯胺基癸醯基)]-4-羥基脯胺醇。
  39. 如請求項32至38中任一項所述之dsRNA劑，其中，該dsRNA劑係如下述式所示接合至配體
    Figure 111128947-A0202-13-0006-126
    ，其中X為O。
  40. 如請求項1至22及30中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股之核苷酸序列與5'-cscsaagaGfuAfUfUfccauuuuuau-3'之核苷酸序列相異不超過4個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asUfsaaaAfauggaauAfcUfcuuggsusu-3'之核苷酸序列相異不超過4個鹼基，
    其中，a、c、g及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G及U；Af、Cf、Gf及Uf為2’-氟A、C、G及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
  41. 如請求項40所述之dsRNA劑，其中，該有義股之核苷酸序列與5'-cscsaagaGfuAfUfUfccauuuuuau-3'之核苷酸序列相異不超過3個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asUfsaaaAfauggaauAfcUfcuuggsusu-3'之核苷酸序列相異不超過3個鹼基。
  42. 如請求項41所述之dsRNA劑，其中，該有義股之核苷酸序列與5'-cscsaagaGfuAfUfUfccauuuuuau-3'之核苷酸序列相異不超過2個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asUfsaaaAfauggaauAfcUfcuuggsusu-3'之核苷酸序列相異不超過2個鹼基。
  43. 如請求項42所述之dsRNA劑，其中，該有義股之核苷酸序列與5'-cscsaagaGfuAfUfUfccauuuuuau-3'之核苷酸序列相異不超過1個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asUfsaaaAfauggaauAfcUfcuuggsusu-3'之核苷酸序列相異不超過1個鹼基。
  44. 如請求項43所述之dsRNA劑，其中，該有義股包含5'-cscsaagaGfuAfUfUfccauuuuuau-3'之核苷酸序列，並且該反義股包含5'-asUfsaaaAfauggaauAfcUfcuuggsusu-3'之核苷酸序列。
  45. 如請求項44所述之dsRNA劑，其中，該有義股由5'-cscsaagaGfuAfUfUfccauuuuuau-3'之核苷酸序列所組成，並且該反義股由5'-asUfsaaaAfauggaauAfcUfcuuggsusu-3'之核苷酸序列所組成。
  46. 如請求項44所述之dsRNA劑，其中，該有義股包含5'-cscsaagaGfuAfUfUfccauuuuuau-3'之核苷酸序列，並且該反義股包含5'- asUfsaaaAfauggaauAfcUfcuuggsusu-3'之核苷酸序列，其中L96為N-[參(GalNAc-alkyl)醯胺基癸醯基)]-4-羥基脯胺醇。
  47. 如請求項40至46中任一項所述之dsRNA劑，其中，該dsRNA劑係如下述式所示接合至配體
    Figure 111128947-A0202-13-0008-127
    ，其中X為O。
  48. 如請求項1至22及31中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股之核苷酸序列與5'-asgsagdTaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列相異不超過4個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asdGsuadAadAauggaaUfaCfucususg-3'之核苷酸序列相異不超過4個鹼基，
    其中，a、c、g及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G及U；Af、Cf、Gf及Uf為2’-氟A、C、G及U；dT為2’-去氧胸苷-3'-磷酸酯；dG為2’-去氧鳥苷-3'-磷酸酯；dA為2’-去氧腺苷-3'-磷酸酯；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
  49. 如請求項48所述之dsRNA劑，其中，該有義股之核苷酸序列與5'-asgsagdTaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列相異不超過3個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asdGsuadAadAauggaaUfaCfucususg-3'之核苷酸序列相異不超過3個鹼基。
  50. 如請求項49所述之dsRNA劑，其中，該有義股之核苷酸序列與5'-asgsagdTaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列相異不超過2個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asdGsuadAadAauggaaUfaCfucususg-3'之核苷酸序列相異不超過2個鹼基。
  51. 如請求項50所述之dsRNA劑，其中，該有義股之核苷酸序列與5'-asgsagdTaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列相異不超過1個鹼基，且該反義股之核苷酸序列與5'-asdGsuadAadAauggaaUfaCfucususg-3'之核苷酸序列相異不超過1個鹼基。
  52. 如請求項51所述之dsRNA劑，其中，該有義股包含5'-asgsagdTaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列，並且該反義股之核苷酸序列包含5'-asdGsuadAadAauggaaUfaCfucususg-3'之核苷酸序列。
  53. 如請求項52所述之dsRNA劑，其中，該有義股由5'-asgsagdTaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列所組成，並且該反義股之核苷酸序列由5'-asdGsuadAadAauggaaUfaCfucususg-3'之核苷酸序列所組成。
  54. 如請求項52所述之dsRNA劑，其中，該有義股包含5'-asgsagdTaUfUfCfcauuuuuacu-3'之核苷酸序列，並且該反義股之核苷酸序列包含5'-asdGsuadAadAauggaaUfaCfucususg-3'之核苷酸序列，其中L96為N-[參(GalNAc-alkyl)醯胺基癸醯基)]-4-羥基脯胺醇。
  55. 如請求項48至54中任一項所述之dsRNA劑，其中，該dsRNA劑係如下述式所示接合至配體
    Figure 111128947-A0202-13-0010-128
    ，其中X為O。
  56. 一種細胞，其含有如請求項1至55中任一項所述之dsRNA劑。
  57. 一種用於抑制編碼甲狀腺素運載蛋白(TTR)之基因表現的醫藥組成物，其包含如請求項1至55中任一項所述之dsRNA劑及醫藥上可接受之載劑。
  58. 如請求項57所述之醫藥組成物，其中，該dsRNA劑係處於非緩衝溶液中。
  59. 如請求項58所述之醫藥組成物，其中，該非緩衝溶液係鹽水或水。
  60. 如請求項57所述之醫藥組成物，其中，該dsRNA劑係處於緩衝溶液中。
  61. 如請求項60所述之醫藥組成物，其中，該緩衝溶液包含醋酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其組合。
  62. 如請求項60所述之醫藥組成物，其中，該緩衝溶液係磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
  63. 一種抑制甲狀腺素運載蛋白(TTR)基因在細胞中之表現的方法，該方法包括令該細胞與如請求項1至55中任一項所述之dsRNA劑接觸，或與如請求項57至62中任一項所述之醫藥組成物接觸，從而抑制TTR在細胞中之表現。
  64. 如請求項63所述之方法，其中，該細胞係位於受試者體內。
  65. 如請求項64所述之方法，其中，該受試者係人類。
  66. 如請求項65所述之方法，其中，該受試者罹患TTR相關疾病。
  67. 如請求項65所述之方法，其中，該受試者處於發展出TTR相關疾病之風險。
  68. 如請求項63至67中任一項所述之方法，其中，該受試者攜帶TTR基因突變，該突變與TTR相關疾病之發展相關。
  69. 如請求項66至68中任一項所述之方法，其中該TTR相關疾病係選自由以下所組成之群組：老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病及高甲狀腺素血症。
  70. 如請求項66至68中任一項所述之方法，其中，該TTR相關疾病為眼部疾病。
  71. 如請求項70所述之方法，其中，該眼部疾病為斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)。
  72. 如請求項66至68中任一項所述之方法，其中，該TTR相關疾病為代謝疾患。
  73. 如請求項72所述之方法，其中，該代謝疾患為葡萄糖及脂質恆定之疾患。
  74. 如請求項73所述之方法，其中，該葡萄糖及脂質恆定之疾患為與第II型糖尿病相關之胰島素抗性。
  75. 如請求項66至68中任一項所述之方法，其中，該TTR相關疾病為心血管疾病。
  76. 如請求項63至75中任一項所述之方法，其中，該受試者患有TTR相關澱粉樣變性病，且該方法降低該受試者中之澱粉樣TTR沉積。
  77. 如請求項63至76中任一項所述之方法，其中，令該細胞與該TTR劑接觸將PNPLA3之表現抑制至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
  78. 如請求項63至77中任一項所述之方法，其中，抑制TTR之表現將該受試者血清中之TTR蛋白質量級降低至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
  79. 一種治療患有TTR相關疾病或處於發展出TTR相關疾病風險下之受試者的方法，該方法包含向該受試者投予治療有效量或預防有效量之如請求項1至55中任一項所述之雙股RNAi劑或如請求項57至62中任一項所述之醫藥組成物，從而治療該受試者。
  80. 如請求項73所述之方法，其中，該受試者係人類。
  81. 如請求項79或80所述之方法，其中，該受試者罹患TTR相關疾病。
  82. 如請求項79或80所述之方法，其中，該受試者處於發展出TTR相關疾病之風險。
  83. 如請求項79至82中任一項所述之方法，其中，該受試者攜帶TTR基因突變，該突變與TTR相關疾病之發展相關。
  84. 如請求項79至83中任一項所述之方法，其中該TTR相關疾病係選自由以下所組成之群組：老年性全身性澱粉樣變性病(SSA)、全身性家族性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣變性多發性神經病變(FAP)、家族性澱粉樣變性心肌症(FAC)、軟腦膜/中樞神經系統(CNS)澱粉樣變性病及高甲狀腺素血症。
  85. 如請求項79至83中任一項所述之方法，其中，該TTR相關疾病為眼部疾病。
  86. 如請求項85所述之方法，其中，該眼部疾病為斯特格氏病(Stargardt’s dease)、糖尿病性視網膜病或年齡相關性黃斑部退化(AMD)。
  87. 如請求項79至83中任一項所述之方法，其中，該TTR相關疾病為代謝疾患。
  88. 如請求項87所述之方法，其中，該代謝疾患為葡萄糖及脂質恆定之疾患。
  89. 如請求項88所述之方法，其中，該葡萄糖及脂質恆定之疾患為與第II型糖尿病相關之胰島素抗性。
  90. 如請求項79至83中任一項所述之方法，其中，該TTR相關疾病為心血管疾病。
  91. 如請求項79至90中任一項所述之方法，其中，該受試者患有甲狀腺素運載蛋白媒介之澱粉樣變性病(ATTR澱粉樣變性病)，且該方法降低該受試者中之澱粉樣TTR沉積。
  92. 如請求項91所述之用途，其中，該ATTR為遺傳性ATTR(h-ATTR)。
  93. 如請求項91所述之用途，其中，該ATTR為非遺傳性ATTR(wt ATTR)。
  94. 如請求項79至93中任一項所述之方法，其中，向該受試者投予該dsRNA劑或醫藥組成物改善該受試者的神經功能受損、生活品質、持續性神經損傷或心血管受損之至少一個指數。
  95. 如請求項79至94中任一項之用途，其中，該雙股RNAi劑係經皮下投予或靜脈內投予而向該人類受試者投予。
  96. 如請求項95所述之方法，其中，該皮下投予係自我投予。
  97. 如請求項96所述之用途，其中，該自我投予係經由預填充之注射器或自動注射器進行。
  98. 如請求項79至97中任一項所述之方法，復包含評估來自該人類受試者之樣本中TTR mRNA表現或TTR蛋白質表現的量級。
  99. 一種套組，其包含如請求項1至55中任一項所述之dsRNA劑或如請求項57至62中任一項所述之醫藥組成物。
  100. 一種小瓶，其包含如請求項1至55中任一項所述之dsRNA劑或如請求項57至62中任一項所述之醫藥組成物。
  101. 一種注射器，其包含如請求項1至55中任一項所述之dsRNA劑或如請求項57至62中任一項所述之醫藥組成物。
  102. 一種RNA誘導型緘默化複合體(RISC)，其包含如請求項1至55中任一項所述之反義股。
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