TW201536329A - 用於調節失養性肌強直蛋白質激酶(dmpk)表現之化合物及方法 - Google Patents

用於調節失養性肌強直蛋白質激酶(dmpk)表現之化合物及方法 Download PDF

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Eric E Swayze
C Frank Bennett
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Abstract

本文提供用於降低動物中之DMPK mRNA及蛋白質之表現的方法、化合物及組合物。本文亦提供用於在動物中優先降低CUGexp DMPK RNA、減輕肌強直或減輕拼接病變之方法、化合物及組合物。此等方法、化合物及組合物適用於治療、預防、延遲或改善1型肌強直性營養不良或其症狀。

Description

用於調節失養性肌強直蛋白質激酶(DMPK)表現之化合物及方法 【序列表】
本申請案正連同呈電子格式之序列表一起申請。序列表係提供為XXXX建立之大小為約XXX Kb之題為XXXX的檔案。電子格式之序列表中之資訊以全文引用的方式併入本文中。
本文提供用於降低動物中之DMPK mRNA及蛋白質之表現的方法、化合物及組合物。此外，本文提供用於在動物中優先降低CUGexp DMPK RNA、減輕肌強直或減輕拼接病變之包含DMPK抑制劑之方法、化合物及組合物。此等方法、化合物及組合物例如適用於治療、預防或改善動物之1型肌強直性營養不良(DM1)。
1型肌強直性營養不良(DM1)為成人肌肉營養不良之最常見形式，其中估計頻率為7,500分之1(Harper PS.,Myotonic Dystrophy.London：W.B.Saunders公司；2001)。DM1為一種由DMPK1中之非編碼CTG重複序列之擴增引起的體染色體顯性病症。DMPK1為一種編碼胞質液絲胺酸/酥胺酸激酶之基因(Brook JD等人，Cell.,1992,68(4)：799-808)。此激酶之生理功能及受質尚未充分確定。擴增之CTG重複序列位於DMPK1之3'未轉譯區域(UTR)中。此突變導致RNA顯性(RNA dominance)，即含有擴增之CUG重複序列(CUGexp)之RNA之表現會誘導細胞功能障礙的過程(Osborne RJ及Thornton CA.,Human Molecular Genetics.,2006,15(2)：R162-R169)。
DMPK基因通常在3’未轉譯區域中具有5-37個CTG重複 序列。在I型肌強直性營養不良中，此數目顯著擴大且例如在50至大於3,500之範圍內(Harper,Myotonic Dystrophy(Saunders,London，第3版，2001)；Annu.Rev.Neurosci.29：259,2006；EMBO J.19：4439,2000；Curr Opin Neurol.20：572,2007)。
CUGexp束與包括作為拼接因子之盲肌樣(MBNL)蛋白之RNA結合蛋白相互作用，且導致突變轉錄物保留在核灶中。此RNA之毒性歸因於RNA結合蛋白之螯合及信號傳導路徑之活化。在動物模型中之研究已顯示若CUGexp RNA之毒性降低，則可逆轉DM1之表型(Wheeler TM等人，Science.,2009,325(5938)：336-339；Mulders SA等人，Proc Natl Acad Sci U S A.,2009,106(33)：13915-13920)。
在DM1中，骨骼肌為受影響最嚴重之組織，但該疾病亦對心肌及平滑肌、眼晶狀體以及腦具有重要影響。顱、遠端肢體及橫隔膜肌肉優先受影響。手靈巧性在早期受損害，此會導致數十年之重度失能。死亡時之中值年齡為55歲，通常死於呼吸衰竭(de Die-Smulders CE等人，Brain.,1998,121(Pt 8)：1557-1563)。
反義技術正作為一種有效用於調節某些基因產物之表現之手段而出現且因此可證明獨特適用於許多治療、診斷及研究應用中以調節DMPK1。肌肉內注射靶向CAG重複序列之經充分修飾寡核苷酸在小鼠中顯示會阻斷CUGexp-MBNL1複合物之形成，分散CUGexp轉錄物之核灶，增強CUGexp轉錄物之核質轉運及轉譯，釋放MBNL蛋白至核質，使MBNL依賴性外顯子之替代性拼接正常化，以及消除CUGexp表現性轉殖基因小鼠之肌強直(Wheeler TM等人，Science.,2009,325(5938)：336-339；WO2008/036406)。
目前不存在可改變DM1之病程之治療劑。因此，疾病負擔為重大的。因此，本文之一目標在於提供用於治療DM1之化合物、組合物及方法。
本文提供用於抑制DMPK之表現以及治療、預防、延遲或改善DMPK相關疾病及/或其症狀之方法、化合物及組合物。在某些實施例 中，本文揭露之化合物及組合物抑制突變DMPK或CUGexp DMPK。
某些實施例提供一種降低動物中之DMPK表現之方法，其包含向該動物投與包含如本文進一步所述之靶向DMPK之經修飾寡核苷酸的化合物。
某些實施例提供一種在動物中相對於野生型DMPK優先降低CUGexp DMPK、減輕肌強直或減輕拼接病變之方法，其包含向該動物投與包含如本文進一步所述之靶向CUGexp DMPK之經修飾寡核苷酸的化合物。在某些情況下，咸信CUGexp DMPK轉錄物由於在核中之滯留時間較長而對經由核核糖核酸酶(諸如核糖核酸酶H)達成之反義敲低特別敏感，且此敏感性被認為允許有效反義抑制諸如肌肉之相關組織中之CUGexp DMPK轉錄物，儘管存在組織攝取反義寡核苷酸之生物分佈障壁。不經由核核糖核酸酶引發裂解之反義機制，諸如在例如Wheeler TM等人，Science.,2009,325(5938)：336-339及WO2008/036406中所述之CAG重複序列ASO提供相同治療優勢。
某些實施例提供一種治療患有1型肌強直性營養不良之動物之方法。在某些實施例中，方法包括向動物投與治療有效量之包含如本文進一步所述之靶向DMPK之經修飾寡核苷酸的化合物。在某些實施例中，方法包括鑑別患有1型肌強直性營養不良之動物。
某些實施例提供一種治療、預防、延遲或改善與DM1之進展相關之症狀及結果的方法，該等症狀及結果包括肌肉僵硬、肌強直、失能性遠端無力、面部及顎肌肉無力、吞咽困難、眼瞼下垂(下垂)、頸部肌肉無力、手臂及腿肌肉無力、持續性肌肉疼痛、嗜睡、肌肉損耗、嚥物困難、呼吸功能不全、心跳不齊、心肌破壞、冷漠、胰島素抗性及白內障。某些實施例提供一種治療、預防、延遲或改善兒童之與DM1之進展相關之症狀及結果的方法，該等症狀及結果包括發育延遲、學習問題、語言及言語問題、以及人格發展問題。
某些實施例提供一種投與反義寡核苷酸以藉由引導病原性轉錄物之裂解來抵抗RNA顯性之方法。
在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號 NM_001081560.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：1併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有自核苷酸18540696至18555106截短之如GenBank登錄號NT_011109.15中闡述之序列(作為SEQ ID NO：2併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有自核苷酸16666001至16681000截短之如GenBank登錄號NT_039413.7中闡述之序列(作為SEQ ID NO：3併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號NM_032418.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：4併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號AI007148.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：5併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號AI304033.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：6併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號BC024150.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：7併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號BC056615.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：8併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號BC075715.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：9併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號BU519245.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：10併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號CB247909.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：11併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號CX208906.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：12併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號CX732022.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：13併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號S60315.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：14併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號S60316.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：15併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號NM_001081562.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：16併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號NM_001100.3中闡述之序列(作為SEQ ID NO：17併入本文中)。
本揭露內容提供以下非限制性編號之實施例：
實施例1. 一種包含由10-30個連接之核苷組成且具有一核苷鹼基序列之經修飾寡核苷酸的化合物，該核苷鹼基序列包含含有至少8 個互補於DMPK核酸之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基之互補區域。
實施例2. 如實施例1之化合物，其中該經修飾寡核苷酸之至少一個核苷包含選自以下之中之雙環糖：cEt、LNA、α-L-LNA、ENA及2’-硫代LNA。
實施例3. 如實施例1至2中任一者之化合物，其中該靶區域為DMPK核酸之外顯子9。
實施例4. 如實施例1至3中任一者之化合物，其中該互補區域包含至少10個互補於DMPK轉錄物之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基。
實施例5. 如實施例1至3中任一者之化合物，其中該互補區域包含至少12個互補於DMPK核酸之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基。
實施例6. 如實施例1至3中任一者之化合物，其中該互補區域包含至少14個互補於DMPK核酸之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基。
實施例7. 如實施例1至3中任一者之化合物，其中該互補區域包含至少16個互補於DMPK核酸之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基。
實施例8. 如實施例1至7中任一者之化合物，其中該DMPK核酸為DMPK前mRNA
實施例9. 如實施例1至7中任一者之化合物，其中該DMPK核酸為DMPK mRNA。
實施例10. 如實施例1至9中任一者之化合物，其中該DMPK核酸具有選自以下之中之核苷鹼基序列：SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2。
實施例11. 如實施例1至10中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含含有至少10個互補於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基之互補區域的核苷鹼基序列。
實施例12. 如實施例1至10之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含含有至少12個互補於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基之互補區域的核苷鹼基序列。
實施例13. 如實施例1至10之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含含有至少14個互補於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基之互補區域的核苷鹼基序列。
實施例14. 如實施例1至10之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含含有至少16個互補於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基之互補區域的核苷鹼基序列。
實施例15. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：1之核苷鹼基1343至核苷鹼基1368。
實施例16. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：1之核苷鹼基1317至核苷鹼基1366。
實施例17. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：1之核苷鹼基2748至核苷鹼基2791。
實施例18. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：1之核苷鹼基730至核苷鹼基748。
實施例19. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：2之核苷鹼基10195至核苷鹼基10294。
實施例20. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：2之核苷鹼基10195至核苷鹼基10294。
實施例21. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：2之核苷鹼基10201至核苷鹼基10216。
實施例22. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：2之核苷鹼基10202至核苷鹼基10218。
實施例23. 如實施例1至22中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有歷經該寡核苷酸之整個長度至少80%互補於該靶區域的核苷鹼基序列。
實施例24. 如實施例1至22中任一者之化合物，其中該經 修飾寡核苷酸具有歷經該寡核苷酸之整個長度至少90%互補於該靶區域的核苷鹼基序列。
實施例25. 如實施例1至22中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有歷經該寡核苷酸之整個長度至少100%互補於該靶區域的核苷鹼基序列。
實施例26. 如實施例1至25中任一者之化合物，其具有包含在SEQ ID NO：23-874之任一者中敘述之序列的至少8個連續核苷鹼基之核苷鹼基序列。
實施例27. 如實施例1至25中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23-32中敘述之序列之至少10個連續核苷鹼基的核苷鹼基序列。
實施例28. 如實施例1至25中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23-32中敘述之序列之至少12個連續核苷鹼基的核苷鹼基序列。
實施例29. 如實施例1至25中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23-32中敘述之序列之至少14個連續核苷鹼基的核苷鹼基序列。
實施例30. 如實施例1至25中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23-32中敘述之序列之至少16個連續核苷鹼基的核苷鹼基序列。
實施例31. 如實施例1至30中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：23中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
實施例32. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：25中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
實施例33. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：26中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
實施例34. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：27中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
實施例35. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該經 修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：28中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
實施例36. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：29中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
實施例37. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：30中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
實施例38. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：31中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
實施例39. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：32中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
實施例40. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31或32中敘述之序列之核苷鹼基序列。
實施例41. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23、25、26、27、28、29、30、31或32中敘述之序列之核苷鹼基序列。
實施例42. 如實施例1至14中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：33-874中敘述之序列之核苷鹼基序列。
實施例43. 如實施例1至42中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸之該核苷鹼基序列至少90%互補於SEQ ID NO：1-19。
實施例44. 如實施例1至34中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸之該核苷鹼基序列100%互補於SEQ ID NO：1-19。
實施例45. 如實施例1至30中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成。
實施例46. 如實施例1至30中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成。
實施例47. 如實施例1至30中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由18個連接之核苷組成。
實施例48. 如實施例1至30中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由19個連接之核苷組成。
實施例49. 如實施例1至30中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由20個連接之核苷組成。
實施例50. 如實施例1至49中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸為單股寡核苷酸。
實施例51. 如實施例1至50中任一者之化合物，其中至少一個核苷包含經修飾糖。
實施例52. 如實施例1至51中任一者之化合物，其中至少兩個核苷包含經修飾糖。
實施例53. 如實施例52之化合物，其中該等經修飾糖各自具有相同修飾。
實施例54. 如實施例52之化合物，其中該等經修飾糖之至少一者具有不同修飾。
實施例55. 如實施例51至54中任一者之化合物，其中至少一個經修飾糖為雙環糖。
實施例56. 如實施例55之化合物，其中該雙環糖選自以下之中：cEt、LNA、α-L-LNA、ENA及2’-硫代LNA。
實施例57. 如實施例56之化合物，其中該雙環糖包含cEt。
實施例58. 如實施例56之化合物，其中該雙環糖包含LNA。
實施例59. 如實施例56之化合物，其中該雙環糖包含α-L-LNA。
實施例60. 如實施例56之化合物，其中該雙環糖包含ENA。
實施例61. 如實施例56之化合物，其中該雙環糖包含2’-硫代LNA。
實施例62. 如實施例1至61中任一者之化合物，其中至少一個經修飾糖包含2’-取代之核苷。
實施例63. 如實施例62之化合物，其中該2’-取代之核苷選自以下之中：2’-OCH3、2’-F及2’-O-甲氧基乙基。
實施例64. 如實施例1至63中任一者之化合物，其中至少一個經修飾糖包含2’-O-甲氧基乙基。
實施例65. 如實施例1至64中任一者之化合物，其中至少一個核苷包含經修飾核苷鹼基。
實施例66. 如實施例65之化合物，其中該經修飾核苷鹼基為5-甲基胞嘧啶。
實施例67. 如實施例1至67中任一者之化合物，其中各胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶。
實施例68. 如實施例1至67中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸包含：a.由連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由連接之核苷組成之5’翼段；c.由連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間且其中各翼段之各核苷包含經修飾糖。
實施例69. 如實施例68之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成。
實施例70. 如實施例68之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成。
實施例71. 如實施例68之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由18個連接之核苷組成。
實施例72. 如實施例68之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由19個連接之核苷組成。
實施例73. 如實施例68之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由20個連接之核苷組成。
實施例74. 如實施例68至73中任一者之化合物，其中該5’翼段由兩個連接之核苷組成。
實施例75. 如實施例68至73中任一者之化合物，其中該5’翼段由三個連接之核苷組成。
實施例76. 如實施例68至73中任一者之化合物，其中該5’翼段由四個連接之核苷組成。
實施例77. 如實施例68至73中任一者之化合物，其中該5’翼段由五個連接之核苷組成。
實施例78. 如實施例68至73中任一者之化合物，其中該5’翼段由六個連接之核苷組成。
實施例79. 如實施例68至78中任一者之化合物，其中該3’翼段由兩個連接之核苷組成。
實施例80. 如實施例68至78中任一者之化合物，其中該3’翼段由三個連接之核苷組成。
實施例81. 如實施例68至78中任一者之化合物，其中該3’翼段由四個連接之核苷組成。
實施例82. 如實施例68至78中任一者之化合物，其中該3’翼段由五個連接之核苷組成。
實施例83. 如實施例68至78中任一者之化合物，其中該3’翼段由六個連接之核苷組成。
實施例84. 如實施例68至83中任一者之化合物，其中該間隔段由六個連接之去氧核苷組成。
實施例85. 如實施例68至83中任一者之化合物，其中該間隔段由七個連接之去氧核苷組成。
實施例86. 如實施例68至83中任一者之化合物，其中該間隔段由八個連接之去氧核苷組成。
實施例87. 如實施例68至83中任一者之化合物，其中該間隔段由九個連接之去氧核苷組成。
實施例88. 如實施例68至83中任一者之化合物，其中該間隔段由十個連接之去氧核苷組成。
實施例89. 如實施例1至31、34、37至45或53至88中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由三個連接之核苷組成之5’翼段；c.由三個連接之核苷組成之3’翼段； d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各翼段之各核苷包含雙環糖。
實施例90. 如實施例1至31、34、37至45或53至88中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由八個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由四個連接之核苷組成且具有AABB 5’翼基元之5’翼段；c.由四個連接之核苷組成且具有BBAA 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間。
實施例91. 如實施例1至30、35、36、46或50至88中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成且包含：a.由七個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由五個連接之核苷組成且具有AAABB 5’翼基元之5’翼段；c.由五個連接之核苷組成且具有BBAAA 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間。
實施例92. 如實施例1至31、34、37至45或53至88中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由八個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由四個連接之核苷組成且具有E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c.由四個連接之核苷組成且具有K-K-E-E 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖。
實施例93. 如實施例1至30、35、36、46或50至88中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成且包含：a.由七個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由五個連接之核苷組成且具有E-E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c.由五個連接之核苷組成且具有K-K-E-E-E 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖。
實施例94. 如實施例1至30、32、33或49至88中任一者 之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由20個連接之核苷組成且包含：a.由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由五個連接之核苷組成之5’翼段；c.由五個連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各翼段之各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖。
實施例95. 如實施例1至31、34、37至45或53至88中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由三個連接之核苷組成之5’翼段；c.由三個連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各翼段之各核苷包含cEt糖。
實施例96. 如實施例1至67中任一者之化合物，其中該經修飾寡核苷酸包含至少8個互補於SEQ ID NO.：1之核苷鹼基1343及核苷鹼基1368內之靶區域的連續核苷鹼基，且其中該經修飾寡核苷酸包含：a.由連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由連接之核苷組成之5’翼段；c.由連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間且其中各翼段之各核苷包含經修飾糖。
實施例97. 如實施例96之化合物，其中該5’翼段中之各經修飾糖具有相同修飾。
實施例98. 如實施例96之化合物，其中該5’翼段中之至少兩個經修飾糖具有不同修飾。
實施例99. 如實施例96至98中任一者之化合物，其中該3’翼段中之各經修飾糖具有相同修飾。
實施例100. 如實施例96至98中任一者之化合物，其中該3’翼段中之至少兩個經修飾糖具有不同修飾。
實施例101. 如實施例96之化合物，其中至少一個經修飾糖為選自以下之中之雙環糖：cEt、LNA、α-L-LNA、ENA及2’-硫代LNA。
實施例102. 如實施例90至91之化合物，其中各B表示選自以下之中之雙環糖：cEt、LNA、α-L-LNA、ENA及2’-硫代LNA。
實施例103. 如實施例102之化合物，其中該雙環糖包含BNA。
實施例104. 如實施例102之化合物，其中該雙環糖包含cEt。
實施例105. 如實施例102之化合物，其中該雙環糖包含LNA。
實施例106. 如實施例102之化合物，其中該雙環糖包含α-L-LNA。
實施例107. 如實施例102之化合物，其中該雙環糖包含ENA。
實施例108. 如實施例102之化合物，其中該雙環糖包含2’-硫代LNA。
實施例109. 如實施例90或91之化合物，其中各A表示選自以下之中之2’-取代之核苷：2’-OCH3、2’-F和2’-O-甲氧基乙基。
實施例110. 如實施例109之化合物，其中該2’-取代之核苷包含2’-O-甲氧基乙基。
實施例111. 如實施例1至111中任一者之化合物，其中至少一個核苷間鍵聯為經修飾核苷間鍵聯。
實施例112. 如實施例1至111中任一者之化合物，其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
實施例113. 一種化合物，其由ISIS 486178組成。
實施例114. 一種化合物，其由ISIS 512497組成。
實施例115. 一種化合物，其由ISIS 598768組成。
實施例116. 一種化合物，其由ISIS 594300組成。
實施例117. 一種化合物，其由ISIS 594292組成。
實施例118. 一種化合物，其由ISIS 569473組成。
實施例119. 一種化合物，其由ISIS 598769組成。
實施例120. 一種化合物，其由ISIS 570808組成。
實施例121. 一種化合物，其由ISIS 598777組成。
實施例122. 一種具有如SEQ ID NO：23中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由三個連接之核苷組成之5’翼段；c.由三個連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各翼段之各核苷包含雙環糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
實施例123. 一種具有如SEQ ID NO：29中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由三個連接之核苷組成之5’翼段；c.由三個連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各翼段之各核苷包含雙環糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
實施例124. 一種具有如SEQ ID NO：31中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由三個連接之核苷組成之5’翼段；c.由三個連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各翼段之各核苷包含雙環糖； f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
實施例125. 一種具有如SEQ ID NO：26中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由八個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由四個連接之核苷組成且具有E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c.由四個連接之核苷組成且具有K-K-E-E 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
實施例126. 一種具有如SEQ ID NO：30中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由八個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由四個連接之核苷組成且具有E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c.由四個連接之核苷組成且具有K-K-E-E 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
實施例127. 一種具有如SEQ ID NO：32中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由八個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由四個連接之核苷組成且具有E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c.由四個連接之核苷組成且具有K-K-E-E 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
實施例128. 一種具有如SEQ ID NO：27中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成且包含：a.由七個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由五個連接之核苷組成且具有E-E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c.由五個連接之核苷組成且具有K-K-E-E-E 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
實施例129. 一種具有如SEQ ID NO：28中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成且包含：a.由七個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由五個連接之核苷組成且具有E-E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c.由五個連接之核苷組成且具有K-K-E-E-E 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
實施例130. 一種具有如SEQ ID NO：25中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由20個連接之核苷組成且包含：a.由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由五個連接之核苷組成之5’翼段；c.由五個連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各翼段之各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
實施例131. 如實施例1至130中任一者之化合物，其包含共軛物。
實施例132. 一種組合物，其包含如實施例1至131中任一者之化合物及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
實施例133. 一種治療動物之DM1之方法，其包含向有需要的動物投與如實施例1至130中任一者之化合物或如實施例132之組合物。
實施例134. 如實施例133之方法，其中該化合物降低DMPK mRNA含量。
實施例135. 如實施例133之方法，其中該化合物降低DMPK蛋白表現。
實施例136. 如實施例133之方法，其中該化合物降低CUGexp DMPK。
實施例137. 如實施例133之方法，其中該化合物優先降低CUGexp DMPK。
實施例138. 如實施例133之方法，其中該化合物降低CUGexp DMPK mRNA。
實施例139. 如實施例133之方法，其中該化合物優先降低CUGexp DMPK mRNA。
實施例140. 如實施例138或139之方法，其中CUGexp之該優先降低係在肌肉組織中。
實施例141. 一種減輕動物之肌強直之方法，其包含向有需要的動物投與如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之組合物。
實施例142. 一種減輕動物之MBLN依賴性拼接病變之方法，其包含向有需要的動物投與如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之組合物。
實施例143. 如實施例138之方法，其中Serca1、m-Titin、Clcn1及Zasp之任一者之拼接得以矯正。
實施例144. 如實施例133至143中任一者之方法，其中該投藥為全身性投藥。
實施例145. 如實施例133至143中任一者之方法，其中該投藥為非經腸投藥。
實施例146. 如實施例144之方法，其中該全身性投藥為皮下投藥、靜脈內投藥、腦室內投藥及鞘內投藥之任一者。
實施例147. 如實施例133至143中任一者之方法，其中該投藥不為肌肉內投藥。
實施例148. 如實施例133至143中任一者之方法，其中該動物為人類。
實施例149. 一種減輕有需要的動物之Serca1之拼接病變的方法，其係藉由投與如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之組合物，且藉此導致包括Serca1外顯子22來達成。
實施例150. 一種減輕有需要的動物之m-Titin之拼接病變的方法，其係藉由投與如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之組合物，且藉此導致包括m-Titin外顯子5來達成。
實施例151. 一種減輕有需要的動物之Clcn1之拼接病變的方法，其係藉由投與如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之組合物，且藉此導致包括Clcn1外顯子7a來達成。
實施例152. 一種減輕有需要的動物之Zasp之拼接病變的方法，其係藉由投與如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之組合物，且藉此導致包括Zasp外顯子11來達成。
實施例153. 一種降低細胞中之DMPK mRNA之方法，其包含使細胞與如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之組合物接觸。
實施例154. 一種降低細胞中之DMPK蛋白之方法，其包含使細胞與如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之組合物接觸。
實施例155. 一種降低細胞中之CUGexp mRNA之方法，其包含使細胞與如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之組合物接觸。
實施例156. 如實施例149至151中任一者之方法，其中該細胞係在動物中。
實施例157. 如實施例156之方法，其中該動物為人類。
實施例158. 一種達成CUGexp DMPK RNA之優先降低之方法，其包含：a.選擇患有1型肌強直性營養不良或具有CUGexp DMPK RNA之受試者；以及b.向該受試者投與如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之組合物；其中如實施例1至131中任一者之該化合物或如實施例132之組合物在結合該CUGexp DMPK RNA時活化核糖核酸酶，藉此達成該CUGexp DMPK RNA之優先降低。
實施例159. 一種達成CUGexp DMPK RNA之優先降低之方法，其包含：a.選擇患有1型肌強直性營養不良或具有CUGexp DMPK RNA之受試者；以及b.向該受試者全身性投與如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之組合物；其中該化學修飾之反義寡核苷酸在結合該CUGexp DMPK RNA時達成該CUGexp DMPK RNA之優先降低。
實施例160. 一種減輕懷疑患有1型肌強直性營養不良或具有核保留之CUGexp DMPK RNA之受試者之拼接病變的方法，其包含：向該受試者投與如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之組合物，其中如實施例1至131中任一者之該化合物或如實施例132之組合物在結合該突變DMPK RNA時活化核糖核酸酶，藉此減輕拼接病變。
實施例161. 一種在動物中優先降低CUGexp DMPK RNA、減輕肌強直或減輕拼接病變之方法，其包含向該動物投與如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之醫藥組合物，其中該化合物降 低該動物中之DMPK表現，藉此在該動物中優先降低CUGexp DMPK RNA、減輕肌強直或減輕拼接病變。
實施例162. 一種用於治療患有1型肌強直性營養不良之動物之方法，其包含鑑別患有1型肌強直性營養不良之該動物，向該動物投與治療有效量的如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之醫藥組合物，其中患有1型肌強直性營養不良之該動物得以治療。
實施例163. 一種降低DMPK表現之方法，其包含向動物投與如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之醫藥組合物，其中DMPK之表現得以降低。
實施例164. 如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之醫藥組合物，其係用於治療動物之DM1。
實施例165. 如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之醫藥組合物，其係用於減輕動物之肌強直。
實施例166. 如實施例1至131中任一者之化合物或如實施例132之醫藥組合物，其係用於減輕動物之MBLN依賴性拼接病變。
應瞭解上文一般性描述及下文詳細描述僅具有示範性及說明性且不限制如所主張之本發明。除非另外明確陳述，否則在本文中，單數之使用包括複數。在本文中，除非另外陳述，否則使用「或」意謂「及/或」。此外，術語「包括(including)」以及其他形式(諸如「包括(includes)」及「包括(included)」)之使用不具有限制性。此外，除非另外明確陳述，否則諸如「要素」或「組分」之術語涵蓋包含一個單元之要素及組分與包含一個以上次單元之要素及組分兩者。
本文所用之章節標題僅出於組織目的且不應解釋為限制所述標的物。本申請案中引用之所有文獻或文獻之部分(包括但不限於專利、 專利申請案、文章、書籍及論文)據此關於本文論述之文獻之部分以引用的方式明確併入本文中以及以全文引用的方式併入本文中。
定義
除非提供明確定義，否則關聯本文所述之分析化學、合成有機化學以及醫學及醫藥化學使用之命名法及本文所述之分析化學、合成有機化學以及醫學及醫藥化學之程序及技術為此項技術中熟知且通常使用者。標準技術可用於化學合成及化學分析。當允許時，貫穿本文揭露內容中提及之所有專利、申請案、公開申請案及其他公開案、可經由資料庫(諸如美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)獲得的GENBANK登錄號及相關序列資訊以及其他資料關於本文論述之文獻之部分以引用的方式併入本文中以及以全文引用的方式併入本文中。
除非另外指示，否則以下術語具有以下含義：「2’-O-甲氧基乙基」(亦為2’-MOE及2’-O(CH2)2-OCH3)係指對呋喃糖基環之2’位之O-甲氧基-乙基修飾。2’-O-甲氧基乙基修飾之糖為經修飾糖。
「2’-O-甲氧基乙基核苷酸」意謂包含2’-O-甲氧基乙基修飾之糖部分之核苷酸。
「5-甲基胞嘧啶」意謂用連接於5位之甲基修飾之胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶為經修飾核苷鹼基。
「約」意謂在某一值之±7%內。舉例而言，若陳述「化合物實現對DMPK之至少約70%抑制」，則暗示在63%及77%之範圍內的DMPK含量受抑制。
「活性醫藥藥劑」意謂醫藥組合物中之一或多種在向動物投與時提供治療益處之物質。舉例而言，在某些實施例中，靶向DMPK之反義寡核苷酸為活性醫藥藥劑。
「活性靶區域」或「靶區域」意謂一或多種活性反義化合物所靶向之區域。「活性反義化合物」意謂降低目標核酸含量或蛋白質含量之反義化合物。
「伴隨性投與」係指兩種藥劑以其兩者之藥理學作用在患者中同時顯現之任何方式共同投與。伴隨性投與不需要兩種藥劑於單一醫藥組合物中、以相同劑型或藉由相同投藥途徑投與。兩種藥劑之作用本身無需同時顯現。該等作用僅需重疊一段時間而無需共同延長。
「投與」意謂向動物提供藥劑，且包括但不限於由醫學專業人員投與及自行投與。
「藥劑」意謂在向動物投與時可提供治療益處之活性物質。「第一藥劑」意謂本發明之治療性化合物。舉例而言，第一藥劑可為靶向DMPK之反義寡核苷酸。「第二藥劑」意謂本發明之第二治療性化合物(例如靶向DMPK之第二反義寡核苷酸)及/或非DMPK治療性化合物。
「改善」係指減輕相關疾病、病症或病狀之至少一種指標、徵象或症狀。指標之嚴重性可藉由熟習此項技術者已知之主觀或客觀量度來確定。
「動物」係指人類或非人類動物，包括但不限於小鼠、大鼠、家兔、狗、貓、豬，及非人類靈長類動物，包括但不限於猴及黑猩猩。
「反義活性」意謂可歸於反義化合物與其目標核酸雜交之任何可偵測或可量測活性。在某些實施例中，反義活性為目標核酸或由該目標核酸編碼之蛋白質的量或表現減少。
「反義化合物」意謂能夠與目標核酸經由氫鍵鍵結進行雜交的寡聚化合物。反義化合物之實例包括單股及雙股化合物，諸如反義寡核苷酸、siRNA、shRNA、snoRNA、miRNA及衛星重複序列。
「反義抑制」意謂在與目標核酸互補之反義化合物存在下目標核酸含量或目標蛋白質含量相較於在不存在反義化合物下之目標核酸含量或目標蛋白質含量有所減少。
「反義寡核苷酸」意謂具有允許與目標核酸之相應區域或區段雜交之核苷鹼基序列的單股寡核苷酸。
「雙環糖」意謂由兩個非孿位碳環原子橋連修飾之呋喃糖基環。雙環糖為經修飾糖。
「雙環核酸」或「RNA」係指其中核苷或核苷酸之呋喃糖 部分包括連接呋喃糖環上兩個碳原子之橋，藉此形成雙環系統的核苷或核苷酸。
「帽結構」或「末端帽部分」意謂已併入於反義化合物任一末端處之化學修飾。
「化學相異區」係指反義化合物中以某種方式在化學上不同於同一反義化合物之另一區的區域。舉例而言，具有2’-O-甲氧基乙基核苷酸之區域在化學上與具有無2’-O-甲氧基乙基修飾之核苷酸的區域不同。
「嵌合反義化合物」意謂具有至少2個化學相異區之反義化合物。
「共同投與」意謂向個體投與兩種或兩種以上藥劑。兩種或兩種以上藥劑可在單個醫藥組合物中，或可在各別醫藥組合物中。兩種或兩種以上藥劑可各自經由相同或不同投藥途徑投與。共同投與涵蓋同時或依序投與。
「互補性」意謂第一核酸與第二核酸之核苷鹼基之間配對的能力。
「連續核苷鹼基」意謂彼此緊鄰之核苷鹼基。
「CUGexp DMPK」意謂含有擴增之CUG重複序列(CUGexp)之突變DMPK RNA。野生型DMPK基因在3’未轉譯區域中具有5-37個CTG重複序列。在「CUGexp DMPK」中(諸如在I型肌強直性營養不良患者中)，此數目顯著擴大且例如在50至大於3,500之範圍內(Harper,Myotonic Dystrophy(Saunders,London，第3版，2001)；Annu.Rev.Neurosci.29：259,2006；EMBO J.19：4439,2000；Curr Opin Neurol.20：572,2007)。
「稀釋劑」意謂組合物中缺乏藥理學活性，但為醫藥學上必需或所需之成分。舉例而言，注射組合物中之稀釋劑可為液體，例如生理食鹽水溶液。
「DMPK」意謂失養性肌強直蛋白質激酶之任何核酸或蛋白質。DMPK可為包括CUGexp DMPK核酸之突變DMPK。
「DMPK表現量」意謂自編碼DMPK之基因轉錄之mRNA的含量或自mRNA轉譯之蛋白質的含量。DMPK表現量可藉由此項技術已 知之方法，諸如北方或西方墨點術來測定。
「DMPK核酸」意謂編碼DMPK之任何核酸。舉例而言，在某些實施例中，DMPK核酸包括編碼DMPK之DNA序列、自編碼DMPK之DNA(包括包含內含子及外顯子之基因組DNA)轉錄之RNA序列、及編碼DMPK之mRNA或前mRNA序列。「DMPK mRNA」意謂編碼DMPK蛋白之mRNA。
「劑量」意謂單次投藥中或指定時段內提供之醫藥藥劑的指定量。在某些實施例中，可以一次、兩次或兩次以上團式注射(bolus)、錠劑或注射投與劑量。舉例而言，在某些實施例中，在需要皮下投與時，所需劑量需要不易由單次注射提供之體積，因此，可使用兩次或兩次以上注射來達成所需劑量。在某些實施例中，醫藥藥劑藉由經長時段或連續輸注來投與。劑量可規定為每小時、每天、每週或每個月之醫藥藥劑量。
「有效量」或「治療有效量」意謂活性醫藥藥劑足以在需要該藥劑之個體中實現所要生理結果的量。在個體之中，有效量可視以下因素而變化：所治療個體之健康及身體狀況、所治療個體之分類學群組、組合物之調配物、個體之醫學病狀之評估及其他相關因素。
「完全互補」或「100%互補」意謂第一核酸之核苷鹼基序列之各核苷鹼基在第二核酸之第二核苷鹼基序列中皆具有互補核苷鹼基。在某些實施例中，第一核酸為反義化合物且目標核酸為第二核酸。
「間隔體(gapmer)」意謂具有複數個有利於核糖核酸酶H裂解之核苷的內部區域位於具有一或多個核苷之外部區域之間的嵌合反義化合物，其中構成內部區域之核苷在化學上與構成外部區域之核苷不同。內部區域可稱為「間隔段」且外部區域可稱為「翼段」。
「間隔加寬」意謂嵌合反義化合物具有位於具有1至6個核苷之5'與3'翼段之間且緊密鄰近於5'及3'翼段的具有12個或超過12個連續2'-去氧核糖核苷的間隔段。
「雜交」意謂互補核酸分子黏接。在某些實施例中，互補核酸分子包括反義化合物與目標核酸。
「鑑別患有1型肌強直性營養不良之動物」意謂鑑別已診斷 有1型肌強直性營養不良、病症或病狀之動物或鑑別傾向於顯現1型肌強直性營養不良、病症或病狀之動物。舉例而言，具有家族史之個體可易患1型肌強直性營養不良、病症或病狀。此鑑別可藉由任何方法，包括評估個體之醫學史以及標準臨床測試或評估來達成。
「緊密鄰近」意謂緊鄰元件之間不存在介入元件。
「個體」意謂選用於治療或療法之人類或非人類動物。
「核苷間鍵聯」係指核苷之間的化學鍵。
「連接之核苷」意謂由核苷間鍵聯鍵結或連接在一起之相鄰核苷。
「錯配」或「非互補核苷鹼基」係指第一核酸之核苷鹼基不能與第二或目標核酸之相應核苷鹼基配對的狀況。
「經修飾核苷間鍵聯」係指與天然存在之核苷間鍵(亦即磷酸二酯核苷間鍵)相比存在取代或任何變化。
「經修飾核苷鹼基」係指任何除腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸苷或尿嘧啶以外的核苷鹼基。「未修飾核苷鹼基」意謂嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。
「經修飾核苷酸」意謂獨立地具有經修飾糖部分、經修飾核苷間鍵聯或經修飾核苷鹼基的核苷酸。「經修飾核苷」意謂獨立地具有經修飾糖部分或經修飾核苷鹼基之核苷。
「經修飾寡核苷酸」意謂包含至少一個經修飾核苷及/或經修飾核苷間鍵聯之寡核苷酸。
「經修飾糖」係指自天然糖部分之取代或變化。經修飾糖包括取代之糖部分及替代糖部分。
「基元」意謂反義化合物中之化學相異區之樣式。
「肌強直」意謂在自願收縮或電刺激之後，肌肉之鬆弛異常緩慢。
「核核糖核酸酶」意謂見於核中之核糖核酸酶。核核糖核酸酶包括但不限於核糖核酸酶H(包括核糖核酸酶H1及核糖核酸酶H2)、雙股核糖核酸酶drosha及其他雙股核糖核酸酶。
「天然存在之核苷間鍵聯」意謂3’至5’磷酸二酯鍵聯。
「天然糖部分」意謂見於DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中之糖。
「核酸」係指由單體核苷酸構成的分子。核酸包括核糖核酸(RNA)、去氧核糖核酸(DNA)、單股核酸、雙股核酸、小干擾核糖核酸(siRNA)及微小RNA(miRNA)。核酸亦可包含此等要素在單一分子中之組合。
「核苷鹼基」意謂能夠與另一核酸之鹼基配對的雜環部分。
「核苷鹼基序列」意謂連續核苷鹼基之次序，而與任何糖、鍵聯或核苷鹼基修飾無關。
「核苷」意謂核苷鹼基連接於糖。在某些實施例中，核苷連接於磷酸基團。
「核苷模擬物」包括用於在寡聚化合物之一或多個位置上置換糖或糖及鹼基且未必替換鍵聯的彼等結構，諸如具有N-嗎啉基、環己烯基、環己基、四氫哌喃基、雙環或三環糖模擬物，例如非呋喃糖糖單元的核苷模擬物。
「核苷酸」意謂具有共價連接至核苷之糖部分之磷酸酯基的核苷。
「核苷酸模擬物」包括用於置換在寡聚化合物之一或多個位置處之核苷及鍵聯的彼等結構，諸如肽核酸或N-嗎啉基(由-N(H)-C(=O)-O-或其他非磷酸二酯鍵聯連接之N-嗎啉基)。
「寡聚化合物」或「寡聚物」意謂具有連接之單體次單元且能夠與核酸分子之至少一個區域雜交的聚合物。
「寡核苷酸」意謂連接之核苷之聚合物，其中各核苷及各核苷間鍵聯可獨立於彼此經修飾或未修飾。
「非經腸投藥」意謂經由注射或輸注投藥。非經腸投藥包括皮下投藥、靜脈內投藥、肌肉內投藥、動脈內投藥、腹膜內投藥或顱內投藥，例如鞘內或腦室內投藥。投藥可為連續的或長期的或短暫的或間斷的。
「肽」意謂由至少兩個胺基酸由醯胺鍵連接而形成的分子。肽係指多肽及蛋白質。
「醫藥組合物」意謂適於向個體投與之物質之混合物。舉例 而言，醫藥組合物可包含一或多種活性劑及無菌水溶液。
「醫藥學上可接受之鹽」意謂反義化合物之生理學上及醫藥學上可接受之鹽，亦即保持母體寡核苷酸之所需生物活性且不賦予其不合需要之毒理學作用的鹽。
「硫代磷酸酯鍵聯」意謂核苷之間的鍵聯，其中磷酸二酯鍵係藉由一個非橋連氧原子經硫原子置換而修飾。硫代磷酸酯鍵聯為經修飾核苷間鍵聯。
「部分」意謂核酸中確定數目之連續(亦即連接)核苷鹼基。在某些實施例中，部分為目標核酸中確定數目之連續核苷鹼基。在某些實施例中，部分為反義化合物中確定數目之連續核苷鹼基。
「優先降低CUG exp DMPK RNA」係指相對於來自正常DMPK對偶基因之RNA轉錄物，優先降低來自CUGexp DMPK對偶基因之RNA轉錄物。
「預防」係指延遲或預先阻止疾病、病症或病狀發作或產生達數分鐘至無限期之時段。預防亦意謂降低顯現疾病、病症或病狀之風險。
「前藥」意謂以非活性形式製備且在身體或其細胞內在內源酶或其他化學物質或條件作用下轉化成活性形式的治療劑。
「副作用」意謂除所需作用以外的可歸因於治療之生理反應。在某些實施例中，副作用包括注射部位反應、肝功能測試異常、腎功能異常、肝中毒、腎中毒、中樞神經系統異常、肌病及不適。舉例而言，血清中之轉胺酶含量增加可指示肝毒性或肝功能異常。舉例而言，膽紅素增加可指示肝毒性或肝功能異常。
「單股寡核苷酸」意謂未與互補股雜交之寡核苷酸。
「可特異性雜交」係指反義化合物在反義寡核苷酸與目標核酸之間具有足夠之互補度以在需要特異性結合的條件下，亦即在活體內分析及治療性處理的狀況下於生理條件下誘導所需作用，而對非目標核酸展現極小之影響或無影響。
「拼接病變」意謂一或多種RNA之替代性拼接之導致在特定組織中表現改變拼接產物的變化。
「皮下投藥」意謂僅在皮膚以下投藥。
「取代之糖部分」意謂除RNA或DNA之天然糖以外之呋喃糖基。
「糖」或「糖部分」意謂天然糖部分或經修飾糖。
「糖替代物」與略微更廣泛之術語「核苷模擬物」相一致，但意欲指示僅置換糖單位(呋喃糖環)。糖替代物能夠置換核苷之天然存在之糖部分，以使所得核苷次單元能夠連接在一起及/或連接於其他核苷以形成能夠與互補寡聚化合物雜交之寡聚化合物。此等結構包括包含不同於呋喃糖基之原子數之環(例如4、6或7員環)；用非氧原子(例如碳、硫或氮)置換呋喃糖基之氧；或原子數之變化與氧之置換兩者。此等結構亦可包含對應於對於取代之糖部分所述之取代的取代(例如視情況包含其他取代基之6員碳環雙環糖替代物)。糖替代物亦包括更複雜之糖置換(例如肽核酸之非環系統)。糖替代物不加限制地包括N-嗎啉基、環己烯基及環已六醇。
「靶向(Targeting)」或「靶向(targeted)」意謂設計及選擇將與目標核酸特異性雜交且誘導所需作用之反義化合物的方法。
「目標核酸」、「目標RNA」及「目標RNA轉錄物」皆指能夠由反義化合物靶向之核酸。在某些實施例中，目標核酸包含DMPK核酸之區域。
「目標段」意謂目標核酸中由反義化合物所靶向之核苷酸序列。「5'目標位點」係指目標段之5'最末端核苷酸。「3'目標位點」係指目標段之3'最末端核苷酸。
「治療有效量」意謂藥劑向個體提供治療益處之量。
「治療」係指投與組合物以實現疾病、病症或病狀之改善或改進。
「1型肌強直性營養不良」或「DM1」意謂由DMPK中之非編碼CTG重複序列之擴增引起的體染色體顯性病症。此突變導致RNA顯性，即含有擴增之CUG重複序列(CUGexp)之RNA之表現誘導細胞功能障礙的過程。CUGexp束與RNA結合蛋白相互作用且導致突變轉錄物保留在核灶中。此RNA之毒性歸因於RNA結合蛋白之螯合及信號傳導路徑之 活化。
「未修飾核苷酸」意謂由天然存在之核苷鹼基、糖部分及核苷間鍵聯構成的核苷酸。在某些實施例中，未修飾核苷酸為RNA核苷酸(亦即β-D-核糖核苷)或DNA核苷酸(亦即β-D-去氧核糖核苷)。
某些實施例
某些實施例提供用於抑制DMPK表現之方法、化合物及組合物。
某些實施例提供一種降低動物中之DMPK表現之方法，其包含向該動物投與包含靶向DMPK之經修飾寡核苷酸的化合物。
某些實施例提供一種在動物中優先降低CUGexp DMPK RNA、減輕肌強直或減輕拼接病變之方法，其包含向該動物投與包含靶向DMPK之經修飾寡核苷酸之化合物，其中該經修飾寡核苷酸在該動物中優先降低CUGexp DMPK RNA、減輕肌強直或減輕拼接病變。
某些實施例提供一種投與反義寡核苷酸以藉由引導病原性轉錄物之裂解來抵抗RNA顯性之方法。
某些實施例提供一種減輕Serca1之拼接病變之方法。在某些實施例中，本文提供之方法導致包括外顯子22。在某些實施例中，矯正性拼接發生在脛骨前肌、腓腸肌及四頭肌中。
某些實施例提供一種減輕m-Titin之拼接病變之方法。在某些實施例中，本文提供之方法導致包括外顯子5。在某些實施例中，矯正性拼接發生在脛骨前肌、腓腸肌及四頭肌中。
某些實施例提供一種減輕Clcn1之拼接病變之方法。在某些實施例中，本文提供之方法導致包括外顯子7a。在某些實施例中，矯正性拼接發生在脛骨前肌、腓腸肌及四頭肌中。
某些實施例提供一種減輕Zasp之拼接病變之方法。在某些實施例中，本文提供之方法導致包括外顯子11。在某些實施例中，矯正性拼接發生在脛骨前肌、腓腸肌及四頭肌中。
某些實施例提供一種用於治療患有1型肌強直性營養不良之動物之方法，其包含：a)鑑別患有1型肌強直性營養不良之該動物，以及 b)向該動物投與治療有效量的包含靶向DMPK之經修飾寡核苷酸之化合物。在某些實施例中，向動物投與之治療有效量之化合物在動物中優先降低CUGexp DMPK RNA、減輕肌強直或減輕拼接病變。
某些實施例提供一種達成優先降低CUGexp DMPK RNA之方法，其包括向懷疑患有1型肌強直性營養不良或具有CUGexp DMPK RNA之受試者投與互補於該CUGexp DMPK RNA之非重複區域的經修飾反義寡核苷酸。經修飾反義寡核苷酸在結合該CUGexp DMPK RNA時達成優先降低CUGexp DMPK RNA。
某些實施例提供一種達成優先降低CUGexp DMPK RNA之方法，其包括選擇患有1型肌強直性營養不良或具有CUGexp DMPK RNA之受試者以及向該受試者投與互補於該CUGexp DMPK RNA之非重複區域的經修飾反義寡核苷酸。經修飾反義寡核苷酸在結合CUGexp DMPK RNA時活化核糖核酸酶或核核糖核酸酶，藉此達成優先降低核中之CUGexp DMPK RNA。
某些實施例提供一種達成優先降低CUGexp DMPK RNA之方法，其包括選擇患有1型肌強直性營養不良或具有突變或CUGexp DMPK RNA之受試者以及向該受試者全身性投與互補於該CUGexp DMPK RNA之非重複區域的經修飾反義寡核苷酸。經修飾反義寡核苷酸在結合突變或CUGexp DMPK RNA時達成優先降低突變或CUGexp DMPK RNA。
某些實施例提供一種減輕有需要的受試者之肌強直之方法。該方法包括向該受試者投與互補於DMPK RNA之非重複區域的經修飾反義寡核苷酸，其中該經修飾反義寡核苷酸在結合該DMPK RNA時活化核糖核酸酶或核核糖核酸酶，藉此減輕肌強直。在某些實施例中，受試者患有或懷疑患有1型肌強直性營養不良或具有突變DMPK RNA或CUGexp DMPK RNA。在某些實施例中，DMPK RNA被核保留。
某些實施例提供一種有需要的受試者之減輕拼接病變之方法。該方法包括向受試者投與互補於DMPK RNA之非重複區域的經修飾反義寡核苷酸，其中該經修飾反義寡核苷酸在結合該DMPK RNA時活化核糖核酸酶或核核糖核酸酶，藉此減輕拼接病變。在某些實施例中，受試者患 有或懷疑患有1型肌強直性營養不良或具有核保留之CUGexp DMPK RNA。在某些實施例中，DMPK RNA被核保留。在某些實施例中，拼接病變為MBNL依賴性拼接病變。
在某些實施例中，方法之經修飾反義寡核苷酸為嵌合物。在某些實施例中，方法之經修飾反義寡核苷酸為間隔體。
在本文提供之方法之某些實施例中，投藥為皮下投藥。在某些實施例中，投藥為靜脈內投藥。
在某些實施例中，方法之經修飾反義寡核苷酸靶向DMPK RNA之非重複區域內之非編碼序列。在某些實施例中，寡核苷酸靶向突變DMPK RNA之編碼區域、內含子、5’UTR或3’UTR。
在本文提供之方法之某些實施例中，核核糖核酸酶為核糖核酸酶H1。
在方法之某些實施例中，肌肉組織中之DMPK RNA得以降低。在某些實施例中，突變DMPK RNA CUGexp DMPK RNA得以優先降低。
在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號NM_001081560.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：1併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有自核苷酸18540696至18555106截短之如GenBank登錄號NT_011109.15中闡述之序列(作為SEQ ID NO：2併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有自核苷酸16666001至16681000截短之如GenBank登錄號NT_039413.7中闡述之序列(作為SEQ ID NO：3併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號NM_032418.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：4併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號AI007148.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：5併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號AI304033.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：6併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號BC024150.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：7併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號BC056615.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：8併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號 BC075715.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：9併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號BU519245.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：10併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號CB247909.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：11併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號CX208906.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：12併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號CX732022.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：13併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號S60315.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：14併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號S60316.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：15併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號NM_001081562.1中闡述之序列(作為SEQ ID NO：16併入本文中)。在某些實施例中，DMPK具有如GenBank登錄號NM_001100.3中闡述之序列(作為SEQ ID NO：17併入本文中)。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33-874之任一者中敘述之核苷鹼基序列的至少8個連續核苷鹼基之核苷鹼基序列。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33-874之任一者中敘述之核苷鹼基序列的至少9、至少10或至少11個連續核苷鹼基之核苷鹼基序列。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33-874之任一者中敘述之核苷鹼基序列的至少12個連續核苷鹼基之核苷鹼基序列。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33-874之任一者中敘述之核苷鹼基序列的至少13或至少14個連續核苷鹼基之核苷鹼基序列。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33-874之任一者中敘述之核苷鹼基序列的至少15個連續核苷鹼基之核苷鹼基序列。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32或33-874之任一者中敘述之核苷鹼基序列的至少16個連續核苷鹼基之核苷鹼基序列。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：24、25、27或28之任一者中敘述之核苷鹼基序列的至少17個連續核苷鹼基之核苷鹼基序列。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：24或25之任一者中敘述之核苷鹼基序列的至少18個連續核苷鹼基之核苷鹼基序列。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：24或25之任一者中敘述之核苷鹼基序列的至少19個連續核苷鹼基之核苷鹼基序列。
在某些實施例中，使本文提供之經修飾寡核苷酸靶向SEQ ID NO：1之任一以下區域：1343-1368、1317-1366、2748-2791、2155-2208、2748-2791、730-748、528-547、531-567、636-697、1311-1331、1314-1339、1446-1475、1635-1670、1610-1638、1457-1486、2773-1788、931-948、934-949、937-952、942-957、937-957、943-958、937-953、1346-1363、1346-1361、1347-1363、2162-2179、2492-2508、2696-2717、及2683-2703。在某些實施例中，使本文提供之經修飾寡核苷酸靶向SEQ ID NO：1之任一以下區域：2773-2788、1343-1358、及1344-1359。
在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少8個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少8個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：1之核苷鹼基1343-1368、1317-1366、2748-2791、2155-2208、2748-2791、730-748、528-547、531-567、636-697、1311-1331、1314-1339、1446-1475、1635-1670、1610-1638、1457-1486、2773-1788、931-948、934-949、937-952、942-957、937-957、943-958、937-953、1346-1363、1346-1361、1347-1363、2162-2179、2492-2508、2696-2717或2683-2703。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少8個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：1之核苷鹼基2773-2788、1343-1358或1344-1359。
在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少10個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少10個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：1之核苷鹼基1343-1368、1317-1366、2748-2791、2155-2208、2748-2791、730-748、528-547、531-567、636-697、1311-1331、1314-1339、1446-1475、1635-1670、1610-1638、1457-1486、2773-1788、931-948、934-949、937-952、942-957、937-957、943-958、937-953、1346-1363、1346-1361、1347-1363、2162-2179、2492-2508、2696-2717或2683-2703。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少10個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：1之核苷鹼基2773-2788、1343-1358或1344-1359。
在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少12個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少12個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：1之核苷鹼基1343-1368、1317-1366、2748-2791、2155-2208、2748-2791、730-748、528-547、531-567、636-697、1311-1331、1314-1339、1446-1475、1635-1670、1610-1638、1457-1486、2773-1788、931-948、934-949、937-952、942-957、937-957、943-958、937-953、1346-1363、1346-1361、1347-1363、2162-2179、2492-2508、2696-2717或2683-2703。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少12個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：1之核苷鹼基2773-2788、1343-1358或1344-1359。
在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少14個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少14個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向 SEQ ID NO：1之核苷鹼基1343-1368、1317-1366、2748-2791、2155-2208、2748-2791、730-748、528-547、531-567、636-697、1311-1331、1314-1339、1446-1475、1635-1670、1610-1638、1457-1486、2773-1788、931-948、934-949、937-952、942-957、937-957、943-958、937-953、1346-1363、1346-1361、1347-1363、2162-2179、2492-2508、2696-2717或2683-2703。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少14個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：1之核苷鹼基2773-2788、1343-1358或1344-1359。
在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少16個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少16個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：1之核苷鹼基1343-1368、1317-1366、2748-2791、2155-2208、2748-2791、730-748、528-547、531-567、636-697、1311-1331、1314-1339、1446-1475、1635-1670、1610-1638、1457-1486、2773-1788、931-948、934-949、937-952、942-957、937-957、943-958、937-953、1346-1363、1346-1361、1347-1363、2162-2179、2492-2508、2696-2717或2683-2703。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少16個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：1之核苷鹼基2773-2788、1343-1358或1344-1359。
在某些實施例中，使本文提供之經修飾寡核苷酸靶向SEQ ID NO：2之任一以下區域：10195-10294、13553-13572、13748-13767、13455-13475、13628-13657、13735-13760、13746-13905、13836-13851、13553-13568、13563-13578、13624-13639、13686-13701、13760-13775、13763-13779、13765-13780、2580-2595、6446-6461、11099-11115、11082-11099、1974-1993、4435-4456、6035-6052、6360-6385、6445-6468、6807-6824、6789-6806、及6596-6615。在某些實施例中，使本文提供之經修飾寡核苷酸靶向SEQ ID NO：2之任一以下區域：13836-13831、8603-8618及8604-8619。
在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少8個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少8個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：2之核苷鹼基10195-10294、13553-13572、13748-13767、13455-13475、13628-13657、13735-13760、13746-13905、13836-13851、13553-13568、13563-13578、13624-13639、13686-13701、13760-13775、13763-13779、13765-13780、2580-2595、6446-6461、11099-11115、11082-11099、1974-1993、4435-4456、6035-6052、6360-6385、6445-6468、6807-6824、6789-6806或6596-6615。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少8個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：2之核苷鹼基13836-13831、8603-8618或8604-8619。
在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少10個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少10個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：2之核苷鹼基10195-10294、13553-13572、13748-13767、13455-13475、13628-13657、13735-13760、13746-13905、13836-13851、13553-13568、13563-13578、13624-13639、13686-13701、13760-13775、13763-13779、13765-13780、2580-2595、6446-6461、11099-11115、11082-11099、1974-1993、4435-4456、6035-6052、6360-6385、6445-6468、6807-6824、6789-6806或6596-6615。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少10個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：2之核苷鹼基13836-13831、8603-8618或8604-8619。
在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少12個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少12個互補於靶 區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：2之核苷鹼基10195-10294、13553-13572、13748-13767、13455-13475、13628-13657、13735-13760、13746-13905、13836-13851、13553-13568、13563-13578、13624-13639、13686-13701、13760-13775、13763-13779、13765-13780、2580-2595、6446-6461、11099-11115、11082-11099、1974-1993、4435-4456、6035-6052、6360-6385、6445-6468、6807-6824、6789-6806或6596-6615。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少12個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：2之核苷鹼基13836-13831、8603-8618或8604-8619。
在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少14個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少14個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：2之核苷鹼基10195-10294、13553-13572、13748-13767、13455-13475、13628-13657、13735-13760、13746-13905、13836-13851、13553-13568、13563-13578、13624-13639、13686-13701、13760-13775、13763-13779、13765-13780、2580-2595、6446-6461、11099-11115、11082-11099、1974-1993、4435-4456、6035-6052、6360-6385、6445-6468、6807-6824、6789-6806或6596-6615。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少14個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：2之核苷鹼基13836-13831、8603-8618或8604-8619。
在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少16個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少16個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：2之核苷鹼基10195-10294、13553-13572、13748-13767、13455-13475、13628-13657、13735-13760、13746-13905、13836-13851、 13553-13568、13563-13578、13624-13639、13686-13701、13760-13775、13763-13779、13765-13780、2580-2595、6446-6461、11099-11115、11082-11099、1974-1993、4435-4456、6035-6052、6360-6385、6445-6468、6807-6824、6789-6806或6596-6615。在某些實施例中，本文提供之經修飾寡核苷酸具有包含含有至少16個互補於靶區域之連續核苷鹼基的互補區域之核苷鹼基序列，其中使該靶區域靶向SEQ ID NO：2之核苷鹼基13836-13831、8603-8618或8604-8619。
在某些實施例中，動物為人類。
在某些實施例中，本發明之化合物或組合物經指定為第一藥劑且本發明之方法進一步包含投與第二藥劑。在某些實施例中，第一藥劑與第二藥劑係共同投與。在某些實施例中，第一藥劑與第二藥劑係依序或伴隨性共同投與。
在某些實施例中，投藥包含非經腸投藥。
在某些實施例中，化合物為單股經修飾寡核苷酸。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列至少95%互補於SEQ ID NO：1-19之任一者，如歷經該經修飾寡核苷酸之全部所量測。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列100%互補於SEQ ID NO：1-19之任一者，如歷經該經修飾寡核苷酸之全部所量測。在某些實施例中，化合物為單股經修飾寡核苷酸。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列至少95%互補於SEQ ID NO：1之任一者，如歷經該經修飾寡核苷酸之全部所量測。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列100%互補於SEQ ID NO：1之任一者，如歷經該經修飾寡核苷酸之全部所量測。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列至少90%互補於SEQ ID NO：1之任一者，如歷經該經修飾寡核苷酸之全部所量測。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列85%互補於SEQ ID NO：1之任一者，如歷經該經修飾寡核苷酸之全部所量測。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列至少90%互補於SEQ ID NO：2之任一者，如歷經該經修飾寡核苷酸之全部所量測。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列85%互補於SEQ ID NO： 2之任一者，如歷經該經修飾寡核苷酸之全部所量測。
在某些實施例中，該經修飾寡核苷酸之至少一個核苷間鍵聯為經修飾核苷間鍵聯。在某些實施例中，各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
在某些實施例中，該經修飾寡核苷酸之至少一個核苷包含經修飾糖。在某些實施例中，至少一個經修飾糖為雙環糖。在某些實施例中，其中至少一個經修飾糖包含2’-O-甲氧基乙基或4’-(CH2)n-O-2’橋，其中n為1或2。
在某些實施例中，該經修飾寡核苷酸之至少一個核苷包含經修飾核苷鹼基。在某些實施例中，經修飾核苷鹼基為5-甲基胞嘧啶。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含：a)由連接之去氧核苷組成之間隔段；b)由連接之核苷組成之5’翼段；及c)由連接之核苷組成之3’翼段。間隔段位於5’翼段與3’翼段之間且各翼段之各核苷包含經修飾糖。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含：a)由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b)由五個連接之核苷組成之5’翼段；及c)由五個連接之核苷組成之3’翼段。間隔段位於5’翼段與3’翼段之間，各翼段之各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，該經修飾寡核苷酸之各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯，且該經修飾寡核苷酸中之各胞嘧啶為5’-甲基胞嘧啶。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸由20個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸由19個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸由18個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成。
某些實施例提供一種在動物中優先降低CUGexp DMPK RNA、減輕肌強直或減輕拼接病變之方法，其包含向該動物投與包含經修飾寡核苷酸之化合物，該經修飾寡核苷酸具有由十個連接之去氧核苷組成之間隔段、由五個連接之核苷組成之5’翼段及由五個連接之核苷組成之3’翼段。間隔段位於5’翼段與3’翼段之間，各翼段之各核苷包含2’-O-甲氧基 乙基糖，該經修飾寡核苷酸之各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯，該經修飾寡核苷酸中之各胞嘧啶為5’-甲基胞嘧啶。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含：a)由八個連接之去氧核苷組成之間隔段；b)由四個連接之核苷組成且具有E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c)由四個連接之核苷組成且具有K-K-E-E 3’翼基元之3’翼段；及d)其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含：a)由七個連接之去氧核苷組成之間隔段；b)由五個連接之核苷組成且具有E-E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c)由五個連接之核苷組成且具有K-K-E-E-E 3’翼基元之3’翼段；及d)其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含：a)由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b)由五個連接之核苷組成之5’翼段；c)由五個連接之核苷組成之3’翼段；及d)其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各翼段之各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含：a)由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b)由三個連接之核苷組成之5’翼段；c)由三個連接之核苷組成之3’翼段；及d)其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各翼段之各核苷包含cEt糖。
某些實施例提供一種在動物中優先降低CUGexp DMPK RNA、減輕肌強直或減輕拼接病變之方法，其包含向該動物投與包含經修飾寡核苷酸之化合物，該經修飾寡核苷酸具有：a)由八個連接之去氧核苷組成之間隔段；b)由四個連接之核苷組成且具有E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c)由四個連接之核苷組成且具有K-K-E-E 3’翼基元之3’翼段；及d)其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖。
某些實施例提供一種在動物中優先降低CUGexp DMPK RNA、減輕肌強直或減輕拼接病變之方法，其包含向該動物投與包含經修 飾寡核苷酸之化合物，該經修飾寡核苷酸具有：a)由七個連接之去氧核苷組成之間隔段；b)由五個連接之核苷組成且具有E-E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c)由五個連接之核苷組成且具有K-K-E-E-E 3’翼基元之3’翼段；及d)其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖。
某些實施例提供一種在動物中優先降低CUGexp DMPK RNA、減輕肌強直或減輕拼接病變之方法，其包含向該動物投與包含經修飾寡核苷酸之化合物，該經修飾寡核苷酸具有：a)由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b)由五個連接之核苷組成之5’翼段；c)由五個連接之核苷組成之3’翼段；及d)其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各翼段之各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖。
某些實施例提供一種在動物中優先降低CUGexp DMPK RNA、減輕肌強直或減輕拼接病變之方法，其包含向該動物投與包含經修飾寡核苷酸之化合物，該經修飾寡核苷酸具有：a)由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b)由三個連接之核苷組成之5’翼段；c)由三個連接之核苷組成之3’翼段；及d)其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各翼段之各核苷包含cEt糖。
某些實施例提供如本文所述之任何化合物製造用於本文所述之任何治療方法中之藥劑的用途。舉例而言，某些實施例提供如本文所述之化合物製造用於治療、改善或預防1型肌強直性營養不良之藥劑的用途。某些實施例提供如本文所述之化合物製造用於抑制DMPK之表現以及治療、預防、延遲或改善DMPK相關疾病及/或其症狀之藥劑的用途。某些實施例提供如本文所述之化合物製造用於降低動物中之DMPK表現之藥劑的用途。某些實施例提供如本文所述之化合物製造用於在動物中優先降低CUGexp DMPK、減輕肌強直或減輕拼接病變之藥劑的用途。某些實施例提供如本文所述之化合物製造用於治療患有1型肌強直性營養不良之動物之藥劑的用途。某些實施例提供如本文所述之化合物製造用於治療、預防、延遲或改善與DM1之進展相關之症狀及結果之藥劑的用途，該等症狀及結果包括肌肉僵硬、肌強直、失能性遠端無力、面部及顎肌肉無力、吞咽困 難、眼瞼下垂(下垂)、頸部肌肉無力、手臂及腿肌肉無力、持續性肌肉疼痛、嗜睡、肌肉損耗、嚥物困難、呼吸功能不全、心跳不齊、心肌破壞、冷漠、胰島素抗性及白內障。某些實施例提供如本文所述之化合物製造用於藉由引導病原性轉錄物之裂解來抵抗RNA顯性之藥劑的用途。
某些實施例提供一種用於治療、預防或改善如本文所述之1型肌強直性營養不良之套組，其中該套組包含：a)如本文所述之化合物；及視情況b)如本文所述之另一藥劑或療法。套組可進一步包括用於使用套組治療、預防或改善1型肌強直性營養不良之說明書或標籤。
某些實施例提供用於本文所述之任何治療方法中之如本文所述之任何化合物或組合物。舉例而言，某些實施例提供一種用於抑制DMPK之表現及治療、預防、延遲或改善DMPK相關疾病及/或其症狀的如本文所述之化合物或組合物。某些實施例提供一種用於降低動物中之DMPK表現的如本文所述之化合物或組合物。某些實施例提供一種用於在動物中優先降低CUGexp DMPK、減輕肌強直或減輕拼接病變的如本文所述之化合物或組合物。某些實施例提供一種用於治療患有1型肌強直性營養不良之動物的如本文所述之化合物或組合物。某些實施例提供一種用於治療、預防、延遲或改善與DM1之進展相關之症狀及結果的如本文所述之化合物或組合物，該等症狀及結果包括肌肉僵硬、肌強直、失能性遠端無力、面部及顎肌肉無力、吞咽困難、眼瞼下垂(下垂)、頸部肌肉無力、手臂及腿肌肉無力、持續性肌肉疼痛、嗜睡、肌肉損耗、嚥物困難、呼吸功能不全、心跳不齊、心肌破壞、冷漠、胰島素抗性及白內障。某些實施例提供一種用於藉由引導病原性轉錄物之裂解來抵抗RNA顯性的如本文所述之化合物或組合物。某些實施例提供包含由12至30個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸之化合物，該經修飾寡核苷酸具有包含核苷鹼基序列SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33-874之任一者之至少12個連續核苷鹼基的核苷鹼基序列。
亦提供可用於本文所述之方法中之其他化合物。
舉例而言，某些實施例提供包含由10至80、12至50、12至30、15至30、18至24、19至22或20個連接之核苷組成之經修飾寡核 苷酸的化合物，該經修飾寡核苷酸具有包含核苷鹼基序列SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33-874之任一者之至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18或至少19個連續核苷鹼基的核苷鹼基序列。
某些實施例提供包含由10至80、12至50、12至30、15至30、18至24、19至22或20個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物，該經修飾寡核苷酸具有包含核苷鹼基序列SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33-874之任一者之至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19個連續核苷鹼基的核苷鹼基序列。
某些實施例提供包含由10至80、12至50、12至30、15至30或15至17個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物，該經修飾寡核苷酸具有包含至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18或至少19個或19個以上連續核苷鹼基之一部分的核苷鹼基序列，該部分互補於SEQ ID NO：1之核苷鹼基1343-1368、1317-1366、2748-2791、2155-2208、2748-2791、730-748、528-547、531-567、636-697、1311-1331、1314-1339、1446-1475、1635-1670、1610-1638、1457-1486、2773-1788、931-948、934-949、937-952、942-957、937-957、943-958、937-953、1346-1363、1346-1361、1347-1363、2162-2179、2492-2508、2696-2717或2683-2703之相等長度部分。
某些實施例提供包含由10至80、12至50、12至30、15至30、18至24、19至22或20個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物，該經修飾寡核苷酸具有包含至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18或至少19個或19個以上連續核苷鹼基之一部分的核苷鹼基序列，該部分互補於SEQ ID NO：2之核苷鹼基10195-10294、13553-13572、13748-13767、13455-13475、13628-13657、13735-13760、13746-13905、13836-13851、13553-13568、13563-13578、13624-13639、13686-13701、13760-13775、13763-13779、13765-13780、2580-2595、6446-6461、11099-11115、 11082-11099、1974-1993、4435-4456、6035-6052、6360-6385、6445-6468、6807-6824、6789-6806或6596-6615之相等長度部分。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸為單股寡核苷酸。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%互補於SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33-874之任一者。
在某些實施例中，至少一個核苷間鍵聯為經修飾核苷間鍵聯。
在某些實施例中，各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
在某些實施例中，至少一個核苷包含經修飾糖。
在某些實施例中，至少一個經修飾糖為雙環糖。
在某些實施例中，至少一個經修飾糖為cEt。
在某些實施例中，至少一個經修飾糖包含2’-O-甲氧基乙基。
在某些實施例中，至少一個核苷包含經修飾核苷鹼基。
在某些實施例中，經修飾核苷鹼基為5-甲基胞嘧啶。在某些實施例中，各胞嘧啶殘基包含5-甲基胞嘧啶。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸由20個連接之核苷組成。
反義化合物
寡聚化合物包括但不限於寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸類似物、寡核苷酸模擬物、反義化合物、反義寡核苷酸及siRNA。寡聚化合物相對於目標核酸可為「反義」，意謂能夠經由氫鍵結與目標核酸雜交。
在某些實施例中，反義化合物具有在按5'至3'方向書寫時包含其所靶向之目標核酸之目標段之反向互補序列的核苷鹼基序列。在某些此等實施例中，反義寡核苷酸具有在按5'至3'方向書寫時包含其所靶向之目標核酸之目標段之反向互補序列的核苷鹼基序列。
在某些實施例中，如本文所述之靶向DMPK之反義化合物 之長度為10至30個核苷酸。換言之，在一些實施例中，反義化合物為10至30個連接之核苷鹼基。在其他實施例中，反義化合物包含由8至80、10至80、12至30、12至50、15至30、15至18、15至17、16至16、18至24、19至22或20個連接之核苷鹼基組成之經修飾寡核苷酸。在某些此等實施例中，反義化合物包含由長度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80或由任何兩個以上值限定之範圍的連接之核苷鹼基組成之經修飾寡核苷酸。在某些實施例中，任何此等長度之反義化合物皆含有本文所述之任何示範性反義化合物之核苷鹼基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18或至少19個連續核苷鹼基(例如SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33-874之任一者中敘述之核苷鹼基序列的至少8個連續核苷鹼基)。
在某些實施例中，反義化合物包含縮短或截短之經修飾寡核苷酸。縮短或截短之經修飾寡核苷酸可自5’末端(5’截短)或者自3’末端(3’截短)缺失單一核苷。縮短或截短之寡核苷酸可自5’末端缺失兩個核苷，或者可自3’末端缺失兩個次單元。或者，缺失之核苷可分散在整個經修飾寡核苷酸中，例如在自5’末端缺失一個核苷及自3’末端缺失一個核苷之反義化合物中。
當單一額外核苷存在於延長之寡核苷酸中時，該額外核苷可位於寡核苷酸之5’末端或3’末端上。當存在兩個或兩個以上額外核苷時，所添加之核苷可彼此鄰近，例如在寡核苷酸之5’末端上添加有兩個核苷(5'添加)或3’末端上添加有兩個核苷(3'添加)的反義化合物中。或者，所添加之核苷可分散在整個反義化合物中，例如在5’末端上添加有一個核苷且3’末端上添加有一個核苷的寡核苷酸中。
有可能增加或減少反義化合物(諸如反義寡核苷酸)之長度及/或引入錯配鹼基而不消除活性。舉例而言，在Woolf等人 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7305-7309,1992)中，測試長度為13至25個核苷鹼基之一系列反義寡核苷酸在卵母細胞注射模型中誘導目標RNA裂解的能力。長度為25個核苷鹼基且在接近反義寡核苷酸之末端處具有8或11個錯配鹼基的反義寡核苷酸能夠導引目標mRNA特異性裂解，但程度低於不含錯配之反義寡核苷酸。同樣，標靶特異性裂解可使用具有13個核苷鹼基之反義寡核苷酸(包括具有1或3個錯配者)達成。
Gautschi等人(J.Natl.Cancer Inst.93：463-471,2001年3月)表明與bcl-2 mRNA具有100%互補性且與bcl-xL mRNA具有3個錯配之寡核苷酸在活體外及活體內減少bcl-2及bcl-xL兩者表現之能力。此外，此寡核苷酸展現有效之活體內抗腫瘤活性。
Maher及Dolnick(Nuc.Acid.Res.16：3341-3358,1988)分別測試一系列具有14個核苷鹼基之串聯反義寡核苷酸以及包含該等串聯反義寡核苷酸中之兩者或三者之序列的具有28個及42個核苷鹼基之反義寡核苷酸在家兔網狀紅血球分析中阻止人類DHFR轉譯的能力。3個具有14個核苷鹼基之反義寡核苷酸各自單獨能夠抑制轉譯，但程度相較於具有28個或42個核苷鹼基之反義寡核苷酸而言較適中。
目標核酸、靶區域及核苷酸序列
編碼DMPK之核苷酸序列不加限制地包括如以下中闡述之以下序列：GenBank登錄號NM_001081560.1(作為SEQ ID NO：1併入本文中)、自核苷酸18540696至18555106截短之GenBank登錄號NT_011109.15(作為SEQ ID NO：2併入本文中)、自核苷酸16666001至16681000截短之GenBank登錄號NT_039413.7(作為SEQ ID NO：3併入本文中)、GenBank登錄號NM032418.1(作為SEQ ID NO：4併入本文中)、GenBank登錄號AI007148.1(作為SEQ ID NO：5併入本文中)、GenBank登錄號AI304033.1(作為SEQ ID NO：6併入本文中)、GenBank登錄號BC024150.1(作為SEQ ID NO：7併入本文中)、GenBank登錄號BC056615.1(作為SEQ ID NO：8併入本文中)、GenBank登錄號BC075715.1(作為SEQ ID NO：9併入本文中)、GenBank登錄號BU519245.1(作為SEQ ID NO：10併入本文中)、GenBank登錄號CB247909.1(作為SEQ ID NO：11併入本文 中)、GenBank登錄號CX208906.1(作為SEQ ID NO：12併入本文中)、GenBank登錄號CX732022.1(作為SEQ ID NO：13併入本文中)、GenBank登錄號S60315.1(作為SEQ ID NO：14併入本文中)、GenBank登錄號S60316.1(作為SEQ ID NO：15併入本文中)、GenBank登錄號NM_001081562.1(作為SEQ ID NO：16併入本文中)、及GenBank登錄號NM_001100.3(作為SEQ ID NO：17併入本文中)。應瞭解，本文含有之實例中之各SEQ ID NO中闡述之序列與糖部分、核苷間鍵聯或核苷鹼基之任何修飾無關。因而，由SEQ ID NO定義之反義化合物可獨立地包含糖部分、核苷間鍵聯或核苷鹼基之一或多處修飾。由Isis編號(Isis No)所述之反義化合物指示核苷鹼基序列與基元之組合。
在某些實施例中，靶區域為目標核酸之結構明確之區。舉例而言，靶區域可涵蓋3' UTR、5' UTR、外顯子、內含子、外顯子/內含子接合點、編碼區、轉譯起始區、轉譯終止區或其他明確之核酸區。DMPK之結構明確之區可由來自序列資料庫(諸如NCBI)之寄存編號獲得，且該資訊以引用方式併入本文中。在某些實施例中，靶區域可涵蓋自該靶區域內之一個目標段之5'目標位點至靶區域內之另一目標段之3'目標位點的序列。
靶向包括確定至少一個與反義化合物雜交，從而出現所需作用的目標段。在某些實施例中，所需作用為mRNA目標核酸含量降低。在某些實施例中，所需作用為由目標核酸編碼之蛋白質含量降低或與目標核酸有關之表型改變。
靶區域可含有一或多個目標段。靶區域內之多個目標段可重疊。或者，其可不相重疊。在某些實施例中，靶區域內之目標段相隔至多約300個核苷酸。在某些實施例中，靶區域內之目標段相隔目標核酸上一定數目之核苷酸，該數目為、為約、為至多、為至多約250個、200個、150個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、40個、30個、20個或10個核苷酸，或為由前述任何兩個值限定之範圍。在某些實施例中，靶區域內之目標段相隔目標核酸上之至多或至多約5個核苷酸。在某些實施例中，目標段為連續的。涵蓋由具有為本文所列之5'目標位點或3'目標位點中之任一者之起始核酸的範圍所界定之靶區域。
適合之目標段可存在於5' UTR、編碼區、3' UTR、內含子、外顯子或外顯子/內含子接合點內。含有起始密碼子或終止密碼子之目標段亦為適合之目標段。適合之目標段可尤其排除某一結構明確之區，諸如起始密碼子或終止密碼子。
確定適合之目標段可包括將目標核酸之序列與整個基因組中之其他序列比較。舉例而言，可使用BLAST演算法來鑑別不同核酸當中具相似性之區域。此比較可防止選擇可能以非特異性方式與除所選目標核酸以外之序列(亦即非目標或脫靶序列)雜交的反義化合物序列。
反義化合物在活性靶區域內之活性(例如如由目標核酸含量降低百分比所定義)可能不同。在某些實施例中，DMPK mRNA含量降低可指示對DMPK蛋白表現之抑制作用。DMPK蛋白含量降低亦可指示對目標mRNA表現之抑制作用。此外，諸如減輕肌強直或減輕拼接病變之表型變化可指示對DMPK mRNA及/或蛋白表現之抑制作用。
雜交
在一些實施例中，本文揭露之反義化合物與DMPK核酸之間進行雜交。雜交之最常見機制涉及核酸分子之互補核苷鹼基之間的氫鍵鍵結(例如沃森-克里克、霍氏或反霍氏氫鍵鍵結)。
雜交可在不同條件下進行。嚴格條件具序列依賴性且由欲雜交之核酸分子之性質及組成決定。
確定序列是否可與目標核酸特異性雜交的方法在此項技術中為熟知的(Sambrooke及Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，2001)。在某些實施例中，本文提供之反義化合物可與DMPK核酸特異性雜交。
互補性
當反義化合物中足夠數目之核苷鹼基可與目標核酸中之相應核苷鹼基進行氫鍵鍵結，從而出現所需作用(例如對目標核酸(諸如DMPK核酸)之反義抑制作用)時，反義化合物與目標核酸彼此互補。
反義化合物可在DMPK核酸之一或多個區段上雜交，因此介入或相鄰區段不涉及雜交事件(例如環結構、錯配或髮夾結構)。
在某些實施例中，本文提供之反義化合物或其指定部分(或至少)70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補於DMPK核酸、其靶區域、目標段或指定部分。在某些實施例中，反義化合物至少70%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%互補於DMPK核酸、其靶區域、目標段或指定部分，且含有本文所述之任何示範性反義化合物之核苷鹼基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18或至少19個連續核苷鹼基(例如SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33-874之任一者中敘述之核苷鹼基序列的至少8個連續核苷鹼基)。反義化合物與目標核酸之互補性百分比可使用常規方法加以確定且係歷經反義化合物之全部加以量測。
舉例而言，反義化合物中反義化合物之20個核苷鹼基中有18個核苷鹼基與靶區域互補且因此特異性雜交將表示90%互補性。在此實例中，其餘非互補核苷鹼基可與互補核苷鹼基叢集或交替且不需要彼此相鄰或與互補核苷鹼基相鄰。因而，長度為18個核苷鹼基並具有4(四)個非互補核苷鹼基且該等非互補核苷鹼基由與目標核酸完全互補之兩個區側接的反義化合物與目標核酸應具有77.8%總體互補性且因而屬於本發明範疇內。反義化合物與目標核酸之區的互補性百分比可常規地使用此項技術中已知之BLAST程式(基本局部比對搜尋工具(basic local alignment search tool))及PowerBLAST程式來測定(Altschul等人，J.Mol.Biol.,1990,215,403 410；Zhang及Madden,Genome Res.,1997,7,649656)。同源性、序列一致性或互補性百分比可藉由例如使用Smith及Waterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482489)之演算法的Gap程式(威斯康星序列分析套件(Wisconsin Sequence Analysis Package)，用於Unix之版本8，Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)使用預設設置來測定。
在某些實施例中，本文提供之反義化合物或其指定部分與目標核酸或其指定部分完全互補(亦即100%互補)。舉例而言，反義化合物可 與DMPK核酸或其靶區域或目標段或目標序列完全互補。如本文所用之「完全互補」意謂反義化合物之各核苷鹼基皆能夠與目標核酸之相應核苷鹼基進行準確鹼基配對。舉例而言，具有20個核苷鹼基之反義化合物與長度為400個核苷鹼基之目標序列完全互補，只要目標核酸中有具有20個核苷鹼基之相應部分與反義化合物完全互補即可。完全互補亦可對於第一及/或第二核酸之指定部分來使用。舉例而言，具有30個核苷鹼基之反義化合物中具有20個核苷鹼基之部分可與長度為400個核苷鹼基之目標序列「完全互補」。具有30個核苷鹼基之寡核苷酸中具有20個核苷鹼基之部分在目標序列具有含20個核苷鹼基且各核苷鹼基與反義化合物中該具有20個核苷鹼基之部分互補之相應部分的情況下與目標序列完全互補。同時，整個具有30個核苷鹼基之反義化合物與目標序列可完全互補，視反義化合物之其餘10個核苷鹼基是否亦與目標序列互補而定。
非互補核苷鹼基之位置可處於反義化合物之5’末端或3’末端處。或者，該或該等非互補核苷鹼基可處於反義化合物之內部位置上。當存在兩個或兩個以上非互補核苷鹼基時，其可為連續(亦即連接)或不連續的。在一個實施例中，非互補核苷鹼基位於間隔體反義寡核苷酸之翼段中。
在某些實施例中，長度為或為至多10個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個核苷鹼基的反義化合物相對於目標核酸(諸如DMPK核酸)或其指定部分包含至多4個、至多3個、至多2個或至多1個非互補核苷鹼基。
在某些實施例中，長度為或為至多10個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個核苷鹼基的反義化合物相對於目標核酸(諸如DMPK核酸)或其指定部分包含至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個或至多1個非互補核苷鹼基。
本文提供之反義化合物亦包括與目標核酸之一部分互補的反義化合物。如本文所用之「部分」係指目標核酸之區或區段內確定數目之連續(亦即連接)核苷鹼基。「部分」亦可指反義化合物中確定數目之連續核苷鹼基。在某些實施例中，反義化合物與目標段中具有至少8個核苷鹼 基之部分互補。在某些實施例中，反義化合物與目標段中具有至少10個核苷鹼基之部分互補。在某些實施例中，反義化合物與目標段中具有至少15個核苷鹼基之部分互補。亦涵蓋與目標段中具有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20個或20個以上(或由任何兩個此等值限定之範圍)核苷鹼基之部分互補的反義化合物。
一致性
本文提供之反義化合物亦可與特定核苷酸序列SEQ ID NO或由特定Isis編號表示之化合物或其部分具有確定之一致性百分比。如本文所用，若反義化合物具有相同核苷鹼基配對能力，則其與本文揭露之序列一致。舉例而言，在所揭露之DNA序列中含有尿嘧啶而非胸苷的RNA將視作與DNA序列一致，因為尿嘧啶及胸苷皆與腺嘌呤配對。亦涵蓋本文所述之反義化合物之縮短及延長型式以及相對於本文提供之反義化合物具有不一致鹼基的化合物。不一致鹼基可彼此相鄰或散佈於整個反義化合物中。反義化合物之一致性百分比係根據相對於與其比較之序列具有一致鹼基配對之鹼基的數目來計算。
在某些實施例中，反義化合物或其部分與本文揭露之一或多種示範性反義化合物或SEQ ID NO或其部分具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性。
修飾
核苷為鹼基-糖組合。核苷之核苷鹼基(亦稱為鹼基)部分通常為雜環鹼基部分。核苷酸為進一步包括共價連接至核苷之糖部分之磷酸酯基的核苷。對於包括戊呋喃糖基糖之彼等核苷，磷酸酯基可連接至糖之2'、3'或5'羥基部分。寡核苷酸係經由相鄰核苷彼此共價鍵聯形成線性聚合寡核苷酸而形成。在寡核苷酸結構內，磷酸酯基通常視作形成寡核苷酸之核苷間鍵聯。
反義化合物之修飾涵蓋核苷間鍵聯、糖部分或核苷鹼基之取代或改變。經修飾反義化合物常因具有諸如以下之所需特性而優於原生形 式：細胞吸收增強、對核酸標靶之親和力增強、在核酸酶存在下之穩定性增強或抑制活性增強。
經化學修飾之核苷亦可用於增強縮短或截短型反義寡核苷酸對其目標核酸之結合親和力。因此，常可以具有該等經化學修飾之核苷的較短反義化合物獲得類似結果。
經修飾核苷間鍵聯
RNA及DNA之天然存在之核苷間鍵聯為3'至5'磷酸二酯鍵聯。相較於具有天然存在之核苷間鍵聯之反義化合物，具有一或多個經修飾(亦即非天然存在)之核苷間鍵聯的反義化合物常會因具有所需特性(諸如細胞吸收增強、對目標核酸之親和力增強及在核酸酶存在下之穩定性增強)而被優先選擇。
具有經修飾核苷間鍵聯的寡核苷酸包括保留磷原子之核苷間鍵聯以及不具磷原子之核苷間鍵聯。代表性含磷核苷間鍵聯包括但不限於磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、胺基磷酸酯及硫代磷酸酯。製備含磷鍵聯及不含磷鍵聯之方法為熟知的。
在某些實施例中，靶向DMPK核酸之反義化合物包含一或多個經修飾核苷間鍵聯。在某些實施例中，經修飾核苷間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。在某些實施例中，反義化合物之各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
經修飾糖部分
本發明之反義化合物可視情況含有糖基已經修飾一或多個核苷。此等糖經修飾核苷可賦予反義化合物以增強之核酸酶穩定性、增強之結合親和力或某種其他有利生物特性。在某些實施例中，核苷包含經化學修飾之呋喃核糖環部分。經化學修飾之呋喃核糖環之實例不加限制地包括添加取代基(包括5'及2'取代基)；非偕位環原子橋連形成雙環核酸(BNA)；核糖基環氧原子經S、N(R)或C(R1)(R2)(R、R1及R2各自獨立地為H、C1-C12烷基或保護基)置換)；及其組合。經化學修飾之糖的實例包括2'-F-5'-甲基取代之核苷(關於其他所揭露之5',2'位上經雙取代之核苷，參見08年8月21日公開之PCT國際申請案WO 2008/101157)；或核糖基環氧原 子經S置換且2'位上經進一步取代(參見2005年6月16日公開之公開美國專利申請案US2005/0130923)；或BNA之5'位上之取代(參見07年11月22日公開之PCT國際申請案WO 2007/134181，其中LNA經例如5'-甲基或5'-乙烯基取代)。
具有經修飾糖部分的核苷之實例不加限制地包括包含5'-乙烯基、5'-甲基(R型或S型)、4'-S、2'-F、2'-OCH3、2’-OCH2CH3、2’-OCH2CH2F及2'-O(CH2)2OCH3取代基之核苷。2'位上之取代基亦可選自烯丙基、胺基、疊氮基、硫基、O-烷基、O-C1-C10烷基、OCF3、OCH2F、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)及O-CH2-C(=O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)，其中各Rl、Rm及Rn獨立地為H或經取代或未經取代之C1-C10烷基。
如本文所用之「雙環核苷」係指包含雙環糖部分之經修飾核苷。雙環核酸(BNA)之實例不加限制地包括在4'與2'核糖基環原子之間包含橋的核苷。在某些實施例中，本文提供之反義化合物包括一或多個BNA核苷，其中橋包含下式之一：4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'及4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(及其類似物，參見2008年7月15日頒佈之美國專利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(及其類似物，參見2009年1月8日公開之公開為WO/2009/006478之PCT/US2008/068922)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(及其類似物，參見2008年12月11日公開為WO/2008/150729之PCT/US2008/064591)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(參見2004年9月2日公開之公開美國專利申請案US2004-0171570)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R為H、C1-C12烷基或保護基(參見2008年9月23日頒佈之美國專利7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(參見Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；及4'-CH2-C(=CH2)-2'(及其類似物，參見2008年12月8日公開為WO 2008/154401之PCT/US2008/066154)。
其他雙環核苷已在公開文獻中加以報導(參見例如：Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Frieden等人，Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372；Elayadi等人，Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等人，Chem.Biol.,2001,8,1-7；Orum 等人，Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Singh等人，Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人，Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；美國專利號：7,399,845；7,053,207；7,034,133；6,794,499；6,770,748；6,670,461；6,525,191；6,268,490；美國專利公開案號：US2008-0039618；US2007-0287831；US2004-0171570；美國專利申請案號：12/129,154；61/099,844；61/097,787；61/086,231；61/056,564；61/026,998；61/026,995；60/989,574；國際申請案WO 2007/134181；WO 2005/021570；WO 2004/106356；WO 94/14226；及PCT國際申請案號：PCT/US2008/068922；PCT/US2008/066154；及PCT/US2008/064591)。前述各雙環核苷可經製備而具有一或多種立體化學糖組態，包括例如α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(參見1999年3月25日公開為WO 99/14226之PCT國際申請案PCT/DK98/00393)。
在某些實施例中，雙環核苷在戊呋喃糖基糖部分之4'碳原子與2'碳原子之間包含橋，不加限制地包括包含1或1至4個獨立地選自以下之連接之基團的橋：-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-C(=NRa)-、-C(=O)-、-C(=S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(=O)x-及-N(Ra)-；其中：x為0、1或2；n為1、2、3或4；各Ra及Rb獨立地為H、保護基、羥基、C1-C12烷基、經取代之C1-C12烷基、C2-C12烯基、經取代之C2-C12烯基、C2-C12炔基、經取代之C2-C12炔基、C5-C20芳基、經取代之C5-C20芳基、雜環基、經取代之雜環基、雜芳基、經取代之雜芳基、C5-C7脂環基、經取代之C5-C7脂環基、鹵素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、醯基(C(=O)-H)、經取代之醯基、CN、磺醯基(S(=O)2-J1)或亞磺醯基(S(=O)-J1)；且各J1及J2獨立地為H、C1-C12烷基、經取代之C1-C12烷基、C2-C12烯基、經取代之C2-C12烯基、C2-C12炔基、經取代之C2-C12炔基、C5-C20芳基、經取代之C5-C20芳基、醯基(C(=O)-H)、經取代之醯基、雜環基、經取代之雜環基、C1-C12胺基烷基、經取代之C1-C12胺基烷基或保護基。
在某些實施例中，雙環糖部分之橋基為-[C(Ra)(Rb)]n-、 -[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或-C(RaRb)-O-N(R)-。在某些實施例中，橋基為4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'及4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中各R獨立地為H、保護基或C1-C12烷基。
在某些實施例中，雙環核苷進一步由異構組態定義。舉例而言，包含4'-(CH2)-O-2'橋基之核苷可呈α-L組態或β-D組態。α-L-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')BNA先前已併入展示反義活性之反義寡核苷酸中(Frieden等人，Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。
在某些實施例中，雙環核苷包括具有4'至2'橋之核苷，其中此等橋不加限制地包括α-L-4'-(CH2)-O-2'、β-D-4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'、4'-CH2-N(R)-O-2'、4'-CH(CH3)-O-2'、4'-CH2-S-2'、4'-CH2-N(R)-2'、4'-CH2-CH(CH3)-2'及4'-(CH2)3-2'，其中R為H、保護基或C1-C12烷基。
在某些實施例中，雙環核苷具有式：
其中：Bx為雜環鹼基部分；-Qa-Qb-Qc-為-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(=O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-或-N(Rc)-O-CH2；Rc為C1-C12烷基或胺基保護基；且Ta及Tb各自獨立地為H、羥基保護基、結合基團、反應性磷基、磷部分或與支撐介質之共價連接基。
在某些實施例中，雙環核苷具有式：
其中： Bx為雜環鹼基部分；Ta及Tb各自獨立地為H、羥基保護基、結合基團、反應性磷基、磷部分或與支撐介質之共價連接基；Za為C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、經取代之C1-C6烷基、經取代之C2-C6烯基、經取代之C2-C6炔基、醯基、經取代之醯基、經取代之醯胺、硫醇或經取代之硫基。
在一個實施例中，各經取代之基團獨立地經獨立地選自以下之取代基單取代或多取代：鹵素、側氧基、羥基、OJc、NJcJd、SJc、N3、OC(=X)Jc及NJeC(=X)NJcJd，其中各Jc、Jd及Je獨立地為H、C1-C6烷基或經取代之C1-C6烷基且X為O或NJc。
在某些實施例中，雙環核苷具有式：
其中：Bx為雜環鹼基部分；Ta及Tb各自獨立地為H、羥基保護基、結合基團、反應性磷基、磷部分或與支撐介質之共價連接基；Zb為C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、經取代之C1-C6烷基、經取代之C2-C6烯基、經取代之C2-C6炔基或經取代之醯基(C(=O)-)。
在某些實施例中，雙環核苷具有式：
其中：Bx為雜環鹼基部分； Ta及Tb各自獨立地為H、羥基保護基、結合基團、反應性磷基、磷部分或與支撐介質之共價連接基；Rd為C1-C6烷基、經取代之C1-C6烷基、C2-C6烯基、經取代之C2-C6烯基、C2-C6炔基或經取代之C2-C6炔基；各qa、qb、qc及qd獨立地為H、鹵素、C1-C6烷基、經取代之C1-C6烷基、C2-C6烯基、經取代之C2-C6烯基、C2-C6炔基或經取代之C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、經取代之C1-C6烷氧基、醯基、經取代之醯基、C1-C6胺基烷基或經取代之C1-C6胺基烷基。
在某些實施例中，雙環核苷具有式：
其中：Bx為雜環鹼基部分；Ta及Tb各自獨立地為H、羥基保護基、結合基團、反應性磷基、磷部分或與支撐介質之共價連接基；qa、qb、qe及qf各自獨立地為氫、鹵素、C1-C12烷基、經取代之C1-C12烷基、C2-C12烯基、經取代之C2-C12烯基、C2-C12炔基、經取代之C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、經取代之C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O-C(=O)NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJk或N(H)C(=S)NJjJk；或qe連同qf一起為=C(qg)(qh)；qg及qh各自獨立地為H、鹵素、C1-C12烷基或經取代之C1-C12烷基。
具有4'-CH2-O-2'橋之腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶雙環核苷之合成及製備以及其寡聚及核酸識別特性已有所描述(Koshkin等人，Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。雙環核苷之合成亦已描述於WO 98/39352及WO 99/14226中。
具有諸如4'-CH2-O-2'及4'-CH2-S-2'之4'至2'橋連基團之各種 雙環核苷的類似物亦已經製備(Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。用作核酸聚合酶之受質的包含雙環核苷之寡去氧核糖核苷酸雙鏈體之製備亦已有所描述(Wengel等人，WO 99/14226)。此外，2'-胺基-BNA(一種新穎之構形受限之高親和力寡核苷酸類似物)之合成在此項技術中已有所描述(Singh等人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。另外，2'-胺基-BNA及2'-甲基胺基-BNA已經製備且其與互補RNA及DNA股之雙鏈體的熱穩定性先前已有所報導。
在某些實施例中，雙環核苷具有式：
其中：Bx為雜環鹼基部分；Ta及Tb各自獨立地為H、羥基保護基、結合基團、反應性磷基、磷部分或與支撐介質之共價連接基；各qi、qj、qk及ql獨立地為H、鹵素、C1-C12烷基、經取代之C1-C12烷基、C2-C12烯基、經取代之C2-C12烯基、C2-C12炔基、經取代之C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、經取代之C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O-C(=O)NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJk或N(H)C(=S)NJjJk；且qi連同qj或ql連同qk一起為=C(qg)(qh)，其中qg及qh各自獨立地為H、鹵素、C1-C12烷基或經取代之C1-C12烷基。
一種具有4'-(CH2)3-2'橋及烯基類似物橋4'-CH=CH-CH2-2'之碳環雙環核苷已有所描述(Frier等人，Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443以及Albaek等人，J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。碳環雙環核苷之合成及製備以及其寡聚及生物化學研究亦已有所描述(Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
在某些實施例中，雙環核苷包括但不限於(A)α-L-亞甲氧基 (4’-CH2-O-2’)BNA，(B)β-D-亞甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA，(C)伸乙氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA，(D)胺氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA，(E)氧胺基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA，(F)甲基(亞甲氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA(亦稱為約束乙基或cEt)，(G)亞甲基-硫基(4’-CH2-S-2’)BNA，(H)亞甲基-胺基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA，(I)甲基碳環(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA，(J)伸丙基碳環(4’-(CH2)3-2’)BNA及(K)乙烯基BNA，如下文所描繪。
其中Bx為鹼基部分且R獨立地為H、保護基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基。
在某些實施例中，核苷係藉由用糖替代物置換核糖基環加以修飾。此修飾不加限制地包括用替代環系統(有時稱為DNA類似物)置換核糖基環，該替代環系統諸如N-嗎啉基環、環己烯基環、環己基環或四氫哌喃基環，諸如具有下式之一者：
在某些實施例中，選擇具有下式之糖替代物：
其中：Bx為雜環鹼基部分；T3及T4各自獨立地為將四氫哌喃核苷類似物連接至寡聚化合物之核苷間鍵聯基團，或T3及T4中之一者為將四氫哌喃核苷類似物連接至寡聚化合物或寡核苷酸之核苷間鍵聯基團且T3及T4中之另一者為H、羥基保護基、連接之結合基團或5'或3’末端基；q1、q2、q3、q4、q5、q6及q7各自獨立地為H、C1-C6烷基、經取代之C1-C6烷基、C2-C6烯基、經取代之C2-C6烯基、C2-C6炔基或經取代之C2-C6炔基；且R1及R2中之一者為氫且另一者選自鹵素、經取代或未經取代之烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2及CN，其中X為O、S或NJ1，且各J1、J2及J3獨立地為H或C1-C6烷基。
在某些實施例中，q1、q2、q3、q4、q5、q6及q7各自為H。在某些實施例中，q1、q2、q3、q4、q5、q6及q7中之至少一者不為H。在某些實施例中，q1、q2、q3、q4、q5、q6及q7中之至少一者為甲基。在某些實施例中，提供THP核苷，其中R1及R2中之一者為F。在某些實施例中，R1為氟且R2為H；R1為甲氧基且R2為H，及R1為甲氧基乙氧基且R2為H。
此等糖替代物包括但不限於在此項技術中稱為己糖醇核酸(HNA)、阿卓糖醇核酸(ANA)及甘露糖醇核酸(MNA)之糖替代物(參見Leumann,C.J.,Bioorg.& Med.Chem.,2002,10,841-854)。
在某些實施例中，糖替代物包含具有5個以上原子及一個以上雜原子之環。舉例而言，包含N-嗎啉基糖部分之核苷及其在寡聚化合物中之使用已經報導(參見例如：Braasch等人，Biochemistry,2002,41,4503-4510；以及美國專利5,698,685；5,166,315；5,185,444；及5,034,506)。
如此處所用，術語「N-嗎啉基」意謂具有以下結構之糖替代物：
在某些實施例中，N-嗎啉基可例如藉由添加或改變來自以上N-嗎啉基結構之各種取代基來加以修飾。此等糖替代物在本文中稱為「經修飾N-嗎啉基」。
在某些實施例中，反義化合物包含一或多個經修飾環己烯基核苷，其為具有6員環己烯基而非天然存在之核苷中之戊呋喃糖基殘基的核苷。經修飾環己烯基核苷包括但不限於此項技術中所述者(參見例如2010年4月10日公開之共同擁有之公開PCT申請案WO 2010/036696；Robeyns等人，J.Am.Chem.Soc.,2008,130(6),1979-1984；Horváth等人，Tetrahedron Letters,2007,48,3621-3623；Nauwelaerts等人，J.Am.Chem.Soc.,2007,129(30),9340-9348；Gu等人，，Nucleosides,Nucleotides & Nucleic Acids,2005,24(5-7),993-998；Nauwelaerts等人，Nucleic Acids Research,2005,33(8),2452-2463；Robeyns等人，Acta Crystallographica,Section F：Structural Biology and Crystallization Communications,2005,F61(6),585-586；Gu等人，Tetrahedron,2004,60(9),2111-2123；Gu等人，Oligonucleotides,2003,13(6),479-489；Wang等人，J.Org.Chem.,2003,68,4499-4505；Verbeure等人，Nucleic Acids Research,2001,29(24),4941-4947；Wang等人，J.Org.Chem.,2001,66,8478-82；Wang等人，Nucleosides,Nucleotides & Nucleic Acids,2001,20(4-7),785-788；Wang等人，J.Am.Chem.,2000,122,8595-8602；公開PCT申請案WO 06/047842；以及公開PCT申請案WO 01/049687；各者之文本以全文引用的方式併入本文中)。某些經修飾環己烯基核苷具有式：
其中：Bx為雜環鹼基部分；T3及T4各自獨立地為將環己烯基核苷類似物連接至反義化合物之核苷間鍵聯基團，或T3及T4中之一者為將四氫哌喃核苷類似物連接至反義化合物之核苷間鍵聯基團且T3及T4中之另一者為H、羥基保護基、連接之結合基團或5'或3'末端基；且q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8及q9各自獨立地為H、C1-C6烷基、經取代之C1-C6烷基、C2-C6烯基、經取代之C2-C6烯基、C2-C6炔基、經取代之C2-C6炔基或其他糖取代基。
許多其他雙環及三環糖替代物環系統在此項技術中亦為已知的，其可用於修飾併入反義化合物中之核苷(參見例如評述文章：Leumann,Christian J.,Bioorg.& Med.Chem.,2002,10,841-854)。可對此等環系統進行各種其他取代以增強活性。
製備經修飾糖之方法為熟習此項技術者所熟知。教示此等經修飾糖之製備之一些代表性美國專利不加限制地包括U.S.：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,670,633；5,700,920；5,792,847及6,600,032以及2005年6月2日申請且在2005年12月22日公開為WO 2005/121371之國際申請案PCT/US2005/019219，且其各自以全文引用的方式併入本文中。
在具有經修飾糖部分的核苷酸中，核苷鹼基部分(天然、經修飾或其組合)維持可與適當核酸標靶雜交。
在某些實施例中，靶向DMPK核酸之反義化合物包含一或多個具有經修飾糖部分的核苷酸。在某些實施例中，經修飾糖部分為2'-MOE。在某些實施例中，2'-MOE修飾之核苷酸排列於間隔體基元中。
經修飾核苷鹼基
核苷鹼基(或鹼基)修飾或取代在結構上可與天然存在或合成之未經修飾核苷鹼基區分，但在功能上可與天然存在或合成之未經修飾核苷鹼基互換。天然核苷鹼基與經修飾核苷鹼基兩者均能夠參與氫鍵結。此等核苷鹼基修飾可對反義化合物賦予核酸酶穩定性、結合親和力或一些其他有益生物學性質。經修飾核苷鹼基包括合成及天然核苷鹼基，諸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)。包括5-甲基胞嘧啶取代之某些核苷鹼基取代特別適用於增加反義化合物對目標核酸之結合親和力。舉例而言，5-甲基胞嘧啶取代已顯示會使核酸雙鏈體穩定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.及Lebleu,B.，編，Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993，第276-278頁)。
其他未經修飾核苷鹼基包括5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧碇及2-硫代胞嘧啶、5-鹵基尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶及胞嘧啶以及嘧啶鹼基之其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基(特別是5-溴、5-三氟甲基)及其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-胺基-腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤及7-去氮雜腺嘌呤及3-去氮雜鳥嘌呤及3-去氮雜腺嘌呤。
雜環鹼基部分亦可包括其中嘌呤或嘧啶鹼基經其他雜環，例如7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜鳥苷、2-胺基吡啶及2-吡啶酮置換之雜環鹼基部分。特別適用於增加反義化合物之結合親和力之核苷鹼基包括5-取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及O-6取代之嘌呤(包括2胺基丙基腺嘌呤)、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。
在某些實施例中，靶向DMPK核酸之反義化合物包含一或多個經修飾核苷鹼基。在某些實施例中，靶向DMPK核酸之間隔加寬之反義寡核苷酸包含一或多個經修飾核苷鹼基。在某些實施例中，經修飾核苷 鹼基為5-甲基胞嘧啶。在某些實施例中，各胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶。
某些反義化合物基元
在某些實施例中，靶向DMPK核酸之反義化合物具有排列成一定型態或基元之經化學修飾之次單元，以賦予反義化合物以諸如抑制活性增強、對目標核酸之結合親和力增強或對由活體內核酸酶引起之降解具抗性的特性。
嵌合反義化合物通常含有至少一個經修飾以賦予增強之核酸酶降解抗性、增加之細胞吸收、增強之對目標核酸之結合親和力及/或增強之抑制活性的區。嵌合反義化合物之第二區可視情況用作細胞核酸內切酶核糖核酸酶H之受質，該酶裂解RNA：DNA雙鏈體之RNA股。
具有間隔體基元之反義化合物被認為是嵌合反義化合物。在間隔體中，具有複數個有利於核糖核酸酶H裂解之核苷酸的內部區域位於具有複數個在化學上與內部區域之核苷不同之核苷酸的外部區域之間。在具有間隔體基元之反義寡核苷酸的狀況下，間隔段一般用作核酸內切酶裂解之受質，而翼段包含經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之各區由構成各相異區之糖部分的類型來區分。用於區分間隔體之各區的糖部分之類型在一些實施例中可包括β-D-核糖核苷、β-D-去氧核糖核苷、2'位上經修飾核苷(該等2'位上經修飾核苷可尤其包括2'-MOE及2'-O-CH3)，以及雙環糖修飾之核苷(此等雙環糖修飾之核苷可包括具有4’-(CH2)n-O-2’橋，其中n=1或n=2)。翼區-間隔區-翼區基元常描述為「X-Y-Z」，其中「X」表示5'翼區之長度，「Y」表示間隔區之長度，且「Z」表示3'翼區之長度。如本文所用，描述為「X-Y-Z」之間隔體具有一定組態以使間隔段經安置而與5'翼段及3'翼段中之每一者緊鄰。因此，在5'翼段與間隔段之間，或間隔段與3'翼段之間不存在介入之核苷酸。本文所述之任何反義化合物可具有間隔體基元。在一些實施例中，X與Z相同；在其他實施例中，其不同。在一較佳實施例中，Y為8個與15個之間的核苷酸。X、Y或Z可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30個或30個以上核苷酸之任一者。因此，間隔體包括但不限於例如5-10-5、4-8-4、4-12-3、4-12-4、3-14-3、2-13-5、2-16-2、1-18-1、3-10-3、2-10-2、1-10-1、 2-8-2、6-8-6、5-8-5、5-7-5、1-8-1或2-6-2。
在某些實施例中，反義化合物為「翼體」基元，具有翼區-間隔區或間隔區-翼區組態，亦即如上對於間隔體組態所述之X-Y或Y-Z組態。因此，翼體組態包括但不限於例如5-10、8-4、4-12、12-4、3-14、16-2、18-1、10-3、2-10、1-10、8-2、2-13或5-13。
在某些實施例中，靶向DMPK核酸之反義化合物具有5-10-5間隔體基元。在某些實施例中，靶向DMPK核酸之反義化合物具有5-7-5間隔體基元。在某些實施例中，靶向DMPK核酸之反義化合物具有3-10-3間隔體基元。在某些實施例中，靶向DMPK核酸之反義化合物具有4-8-4間隔體基元。
在某些實施例中，靶向DMPK核酸之反義化合物具有間隔加寬之基元。
在某些實施例中，具有任何此等間隔體或翼體基元之反義化合物皆含有本文所述之任何示範性反義化合物之核苷鹼基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18或至少19個連續核苷鹼基(例如SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33-874之任一者中敘述之核苷鹼基序列的至少8個連續核苷鹼基)。
在某些實施例中，本發明提供包含寡核苷酸之寡聚化合物。在某些實施例中，此等寡核苷酸包含一或多個化學修飾。在某些實施例中，經化學修飾寡核苷酸包含一或多個經修飾糖。在某些實施例中，經化學修飾寡核苷酸包含一或多個經修飾核苷鹼基。在某些實施例中，經化學修飾寡核苷酸包含一或多個經修飾核苷間鍵聯。在某些實施例中，化學修飾(糖修飾、核苷鹼基修飾及/或鍵聯修飾)限定某一樣式或基元。在某些實施例中，糖部分、核苷間鍵聯及核苷鹼基之化學修飾之樣式各自獨立於彼此。因此，寡核苷酸可藉由其糖修飾基元、核苷間鍵聯基元及/或核苷鹼基修飾基元(如本文所用，核苷鹼基修飾基元描述獨立於核苷鹼基之序列對核苷鹼基進行之化學修飾)加以描述。
某些糖基元
在某些實施例中，寡核苷酸包含一或多種類型之以確定樣式或糖修飾基元形式沿寡核苷酸或其區域排列的經修飾糖部分及/或天然存在之糖部分。此等基元可包括本文論述之任何糖修飾及/或其他已知糖修飾。
在某些實施例中，寡核苷酸包含以下區域或由以下區域組成：具有包含兩個外部區域或「翼區」及內部區域或「間隔區」之間隔體糖修飾基元之區域。間隔體基元之三個區域(5’翼區、間隔區及3’翼區)形成連續核苷序列，其中各翼區之核苷之至少一些糖部分不同於間隔區之核苷之至少一些糖部分。詳言之，至少各翼區之最靠近間隔區之核苷(5’翼區之3’最近核苷及3’翼區之5’最近核苷)的糖部分不同於相鄰間隔區核苷之糖部分，由此界定翼區與間隔區之間的邊界。在某些實施例中，間隔區內之糖部分彼此相同。在某些實施例中，間隔區包括一或多個具有不同於間隔區之一或多個其他核苷之糖部分的糖部分之核苷。在某些實施例中，兩個翼區之糖修飾基元彼此相同(對稱間隔體)。在某些實施例中，5’翼區之糖修飾基元不同於3’翼區之糖修飾基元(不對稱間隔體)。
某些5’翼區
在某些實施例中，間隔體之5’翼區由1至5個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之5’翼區由2至5個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之5’翼區由3至5個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之5’翼區由4或5個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之5’翼區由1至4個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之5’翼區由1至3個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之5’翼區由1或2個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之5’翼區由2至4個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之5’翼區由2或3個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之5’翼區由3或4個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之5’翼區由1個核苷組成。在某些實施例中，間隔體之5’翼區由2個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之5’翼區由3個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之5’翼區由4個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之5’翼區由5個連接之核苷組成。
在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個雙環核苷。 在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少兩個雙環核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少三個雙環核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少四個雙環核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個約束乙基核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個LNA核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區之各核苷為雙環核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區之各核苷為約束乙基核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區之各核苷為LNA核苷。
在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個2’-取代之核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區之各核苷為非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區之各核苷為2’-取代之核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區之各核苷為2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區之各核苷為2’-OMe核苷。
在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個雙環核苷及至少一個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個雙環核苷及至少一個2’-取代之核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個雙環核苷及至少一個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個雙環核苷及至少一個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個雙環核苷及至少一個2’-去氧核苷。
在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個約束乙基核苷及至少一個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個約束乙基核苷及至少一個2’-取代之核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個約束乙基核苷及至少一個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個約束乙基核苷及至少一個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個約束乙基核苷及至少一個2’-去氧核苷。
在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個LNA核苷 及至少一個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個LNA核苷及至少一個2’-取代之核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個LNA核苷及至少一個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個LNA核苷及至少一個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含至少一個LNA核苷及至少一個2’-去氧核苷。
在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含三個約束乙基核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個雙環核苷及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個約束乙基核苷及兩個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個雙環核苷及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個約束乙基核苷及兩個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個約束乙基核苷及三個2’-MOE核苷。
在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含三個LNA核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個LNA核苷及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個LNA核苷及兩個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個LNA及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個LNA核苷及兩個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個LNA核苷及三個2’-MOE核苷。
在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含三個約束乙基核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個雙環核苷及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個約束乙基核苷及兩個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個雙環核苷及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個約束乙基核苷及兩個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個約束乙基核苷及三個2’-OMe核苷。
在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含三個LNA核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個LNA核苷及兩個非雙環經修飾核 苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個LNA核苷及兩個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個LNA及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個LNA核苷及兩個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個LNA核苷及三個2’-OMe核苷。
在某些實施例中，間隔體之5’翼區具有AABB基元，其中各A選自以下之中：2’-MOE核苷及2’OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區具有AABB基元，其中各B選自以下之中：cEt、LNA、α-L-LNA、ENA及2’-硫代LNA核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區具有AABB基元，其中各A表示2’-MOE核苷且各B表示約束乙基核苷。
在某些實施例中，間隔體之5’翼區具有AAABB基元，其中各A選自以下之中：2’-MOE核苷及2’OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區具有AABB基元，其中各B選自以下之中：cEt、LNA、α-L-LNA、ENA及2’-硫代LNA核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區具有AABB基元，其中各A表示2’-MOE核苷且各B表示約束乙基核苷。
某些3’翼區
在某些實施例中，間隔體之3’翼區由1至5個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之3’翼區由2至5個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之3’翼區由3至5個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之3’翼區由4或5個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之3’翼區由1至4個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之3’翼區由1至3個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之3’翼區由1或2個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之3’翼區由2至4個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之3’翼區由2或3個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之3’翼區由3或4個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之3’翼區由1個核苷組成。在某些實施例中，間隔體之3’翼區由2個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之3’翼區由3個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之3’翼區由4個連接之核苷組成。在某些實施例中，間隔體之3’翼區由5個連接之核苷組成。
在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個雙環核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個約束乙基核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個LNA核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區之各核苷為雙環核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區之各核苷為約束乙基核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區之各核苷為LNA核苷。
在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少三個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少四個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個2’-取代之核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區之各核苷為非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區之各核苷為2’-取代之核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區之各核苷為2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區之各核苷為2’-OMe核苷。
在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個雙環核苷及至少一個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個雙環核苷及至少一個2’-取代之核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個雙環核苷及至少一個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個雙環核苷及至少一個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個雙環核苷及至少一個2’-去氧核苷。
在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個約束乙基核苷及至少一個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個約束乙基核苷及至少一個2’-取代之核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個約束乙基核苷及至少一個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個約束乙基核苷及至少一個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個約束乙基核苷及至少一個2’-去氧核苷。
在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個LNA核苷及至少一個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個LNA核苷及至少一個2’-取代之核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個LNA核苷及至少一個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個LNA核苷及至少一個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含至少一個LNA核苷及至少一個2’-去氧核苷。
在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含三個約束乙基核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個雙環核苷及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個約束乙基核苷及兩個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個雙環核苷及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個約束乙基核苷及兩個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之5’翼區包含兩個約束乙基核苷及三個2’-MOE核苷。
在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含三個LNA核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個LNA核苷及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個LNA核苷及兩個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個LNA及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個LNA核苷及兩個2’-MOE核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個LNA核苷及三個2’-MOE核苷。
在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含三個約束乙基核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個雙環核苷及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個約束乙基核苷及兩個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個雙環核苷及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個約束乙基核苷及兩個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個約束乙基核苷及三個2’-OMe核苷。
在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含三個LNA核苷。在 某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個LNA核苷及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個LNA核苷及兩個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個LNA及兩個非雙環經修飾核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個LNA核苷及兩個2’-OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區包含兩個LNA核苷及三個2’-OMe核苷。
在某些實施例中，間隔體之3’翼區具有BBAA基元，其中各A選自以下之中：2’-MOE核苷及2’OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區具有BBAA基元，其中各B選自以下之中：cEt、LNA、α-L-LNA、ENA及2’-硫代LNA核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區具有BBAA基元，其中各A表示2’-MOE核苷且各B表示約束乙基核苷。
在某些實施例中，間隔體之3’翼區具有BBAAA基元，其中各A選自以下之中：2’-MOE核苷及2’OMe核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區具有BBAA基元，其中各B選自以下之中：cEt、LNA、α-L-LNA、ENA及2’-硫代LNA核苷。在某些實施例中，間隔體之3’翼區具有BBAA基元，其中各A表示2’-MOE核苷且各B表示約束乙基核苷。
組合物及調配醫藥組合物之方法
反義寡核苷酸可與醫藥學上可接受之活性或惰性物質混合以製備醫藥組合物或調配物。組合物及調配醫藥組合物之方法視許多準則而定，包括但不限於投藥途徑、疾病程度或所投與之劑量。
靶向DMPK核酸之反義化合物可藉由將反義化合物與適合之醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑組合而用於醫藥組合物中。醫藥學上可接受之稀釋劑包括磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。PBS為適用於非經腸傳遞之組合物中的稀釋劑。因此，在一個實施例中，在本文所述之方法中使用包含靶向DMPK核酸之反義化合物及醫藥學上可接受之稀釋劑的醫藥組合物。在某些實施例中，醫藥學上可接受之稀釋劑為PBS。在某些實施例中，反義化合物為反義寡核苷酸。
包含反義化合物之醫藥組合物涵蓋在投與動物(包括人類)時能夠提供(直接或間接)其生物活性代謝物或殘餘物的任何醫藥學上可接 受之鹽、酯或該等酯之鹽，或任何其他寡核苷酸。因此，例如，亦揭露反義化合物之醫藥學上可接受之鹽、前藥、該等前藥之醫藥學上可接受之鹽，及其他生物等效物。適合之醫藥學上可接受之鹽包括但不限於鈉鹽及鉀鹽。
前藥可包括在反義化合物之一端或兩端上併入可由體內內源性核酸酶裂解而形成活性反義化合物的額外核苷。
結合之反義化合物
反義化合物可共價連接至一或多個增強所得反義寡核苷酸之活性、細胞分佈或細胞吸收的部分或共軛物。典型結合基團包括膽固醇部分及脂質部分。其他結合基團包括碳水化合物、磷脂、生物素、啡嗪、葉酸鹽、啡啶、蒽醌、吖啶、螢光素、若丹明(rhodamine)、香豆素及染料。
反義化合物亦可經修飾而具有一或多個穩定化基團，該一或多個穩定化基團一般連接至反義化合物之一端或兩端以增強諸如核酸酶穩定性之特性。在穩定化基團中包括帽結構。此等末端修飾保護具有末端核酸之反義化合物免遭核酸外切酶降解，且可有助於傳遞及/或定位於細胞內。帽可存在於5’末端(5'帽)或3’末端(3'帽)上，或可存在於兩端上。帽結構在此項技術中為熟知的且包括例如反轉去氧無鹼基帽。其他可用於對反義化合物之一端或兩端進行封端以賦予核酸酶穩定性的3'及5'穩定化基團包括2003年1月16日公開之WO 03/004602中所揭露者。
細胞培養及反義化合物處理
可在多種細胞類型中活體外測試反義化合物對DMPK核酸之含量、活性或表現的作用。用於此等分析之細胞類型可獲自商業供應商(例如American Type Culture Collection,Manassus,VA；Zen-Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC；Clonetics Corporation,Walkersville,MD)且根據供應商之說明書使用市售可得之試劑(例如Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)培養細胞。說明性細胞類型包括但不限於HepG2細胞、Hep3B細胞、初生肝細胞、A549細胞、GM04281纖維母細胞及LLC-MK2細胞。
活體外測試反義寡核苷酸
本文描述用反義寡核苷酸處理細胞之方法，該等方法可經適當修改以用於用其他反義化合物進行之處理。
一般而言，當細胞在培養中達到約60%至80%匯合度時，用反義寡核苷酸處理細胞。
一種常用於將反義寡核苷酸引入培養細胞中之試劑包括陽離子型脂質轉染試劑LIPOFECTIN®(Invitrogen,Carlsbad,CA)。可將反義寡核苷酸與LIPOFECTIN®在OPTI-MEM® 1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以達成反義寡核苷酸之所需最終濃度及通常在每100nM反義寡核苷酸2至12ug/mL範圍內之LIPOFECTIN®濃度。
另一用於將反義寡核苷酸引入培養細胞中之試劑包括LIPOFECTAMINE 2000®(Invitrogen,Carlsbad,CA)。可將反義寡核苷酸與LIPOFECTAMINE 2000®在OPTI-MEM® 1血清減少型培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以達成反義寡核苷酸之所需濃度及通常在每100nM反義寡核苷酸2至12ug/mL範圍內之LIPOFECTAMINE®濃度。
另一用於將反義寡核苷酸引入培養細胞中之試劑包括Cytofectin®(Invitrogen,Carlsbad,CA)。可將反義寡核苷酸與Cytofectin®在OPTI-MEM® 1血清減少型培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以達成反義寡核苷酸之所需濃度及通常在每100nM反義寡核苷酸2至12ug/mL範圍內之Cytofectin®濃度。
另一用於將反義寡核苷酸引入培養細胞中之技術包括電穿孔。
藉由常規方法用反義寡核苷酸處理細胞。通常在反義寡核苷酸處理後16至24小時收集細胞，此時藉由此項技術中已知及本文所述之方法量測目標核酸之RNA或蛋白含量。一般而言，當在多次重複實驗中進行處理時，資料係呈現為重複處理之平均值。
所用之反義寡核苷酸濃度在細胞株之間有所不同。確定最佳用於特定細胞株之反義寡核苷酸濃度的方法在此項技術中為熟知的。當用LIPOFECTAMINE2000®、Lipofectin或Cytofectin轉染時，通常使用濃度在1nM至300nM範圍內之反義寡核苷酸。當使用電穿孔進行轉染時，使用625nM至20,000nM範圍內之較高濃度的反義寡核苷酸。
RNA分離
可對總細胞RNA或聚(腺苷酸)+mRNA進行RNA分析。RNA分離之方法在此項技術中為熟知的。RNA係使用此項技術中熟知之方法，例如使用TRIZOL®試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)，根據製造商推薦之方案來製備。
分析對標靶含量或表現之抑制作用
對DMPK核酸之含量或表現的抑制作用可以此項技術中已知之多種方式來分析。舉例而言，目標核酸含量可藉由例如北方墨點分析、競爭聚合酶鏈反應(PCR)或定量即時PCR來定量。可對總細胞RNA或聚(腺苷酸)+mRNA進行RNA分析。RNA分離之方法在此項技術中為熟知的。北方墨點分析在此項技術中亦為常規的。定量即時PCR宜使用市售可得之ABI PRISM® 7600、7700或7900序列偵測系統(可獲自PE-Applied Biosystems,Foster City,CA且根據製造商說明書來使用)完成。
對目標RNA含量之定量即時PCR分析
可藉由定量即時PCR，使用ABI PRISM® 7600、7700或7900序列偵測系統(PE-Applied Biosystems,Foster City,CA)根據製造商說明書來對目標RNA含量進行定量。定量即時PCR之方法在此項技術中為熟知的。
在即時PCR之前，使分離之RNA進行逆轉錄酶(RT)反應，產生互補DNA(cDNA)，其接著用作即時PCR擴增之受質。在同一樣品孔中依序進行RT及即時PCR反應。RT及即時PCR試劑獲自Invitrogen(Carlsbad,CA)。RT，即時PCR反應係藉由為熟習此項技術者熟知之方法進行。
藉由即時PCR獲得之基因(或RNA)標靶量係使用表現恆定之基因(諸如親環素A(cyclophilin A))之表現含量或藉由使用RIBOGREEN®(Invitrogen,Inc.Carlsbad,CA)定量總RNA來校正。親環素A表現係藉由即時PCR，藉由與標靶同時操作、複合操作或分開操作來定量。總RNA係使用RIBOGREEN® RNA定量試劑(Invitrogen,Inc.Eugene,OR)來定量。藉由RIBOGREEN®定量RNA之方法係教示於Jones,L.J.等人(Analytical Biochemistry,1998,265,368-374)中。使用CYTOFLUOR® 4000儀器(PE Applied Biosystems)量測RIBOGREEN®螢光。
探針及引子經設計以與DMPK核酸雜交。設計即時PCR探針及引子之方法在此項技術中為熟知的，且可包括使用軟體，諸如PRIMER EXPRESS®軟體(Applied Biosystems,Foster City,CA)。
分析蛋白含量
對DMPK核酸之反義抑制作用可藉由量測DMPK蛋白含量來評估。DMPK之蛋白含量可以此項技術中熟知之多種方式來評估或定量，諸如免測沈澱法、西方墨點分析(免疫墨點法)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、定量蛋白質分析、蛋白質活性分析(例如卡斯蛋白酶活性分析)、免疫組織化學、免疫細胞化學或螢光活化細胞分選法(FACS)。針對標靶之抗體可經鑑別且獲自多種來源，諸如MSRS抗體目錄(Aerie Corporation,Birmingham,MI)，或可經由此項技術中熟知之習知單株或多株抗體產生方法來製備。
活體內測試反義化合物
在動物中測試例如反義寡核苷酸之反義化合物以評估其抑制DMPK表現且產生表型變化之能力。測試可在正常動物中或在實驗疾病模型，例如肌強直性營養不良(DM1)之HSALR小鼠模型中進行。
HSALR小鼠模型為一種建立之DM1模型(Mankodi,A.等人Science.289：1769,2000)。小鼠攜帶220個CTG重複序列***基因之3’UTR中之人類骨骼肌動蛋白(hACTA1)轉殖基因。hACTA1-CUGexp轉錄物累積在骨骼肌中之核灶中且導致與人類DM1中之肌強直類似之肌強直(Mankodi,A.等人Mol.Cell 10：35,2002；Lin,X.等人Hum.Mol.Genet.15：2087,2006)。因此，預期藉由反義抑制hACTA1轉殖基因來改善HSALR小鼠之DM1症狀將預示人類患者之類似症狀會藉由反義抑制DMPK轉錄物而得以改善。
CUGexp RNA在小鼠中之表現導致肌肉轉錄組之廣泛重塑，其中許多重塑係藉由切除MBNL1而得以重現。因此，預期使HSALR小鼠中之轉錄組正常化將預示DM1患者中之人類轉錄組會藉由反義抑制DMPK轉錄物而得以正常化。
對於向動物投藥，於醫藥學上可接受之稀釋劑，諸磷酸鹽緩 衝生理食鹽水中調配反義寡核苷酸。投藥包括非經腸投藥途徑。在用反義寡核苷酸治療一段時期之後，自組織分離RNA且量測DMPK核酸表現之變化。亦量測DMPK蛋白含量之變化。
拼接
肌強直性營養不良(DM1)係由DMPK基因之3’未轉譯區域中之CTG重複序列擴增所引起(Brook,J.D.等人Cell.68：799,1992)。此突變導致RNA顯性，即含有擴增之CUG重複序列(CUGexp)之RNA之表現會誘導細胞功能障礙的過程(Osborne RJ及Thornton CA.,Human Molecular Genetics.,2006,15(2)：R162-R169)。此CUGexp保留在骨骼肌之核灶中(Davis,B.M.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：7388,1997)。CUGexp在核灶中之累積導致諸如盲肌樣1(MBLN1)蛋白之聚(CUG)結合蛋白之螯合(Miller,J.W.等人EMBO J.19：4439,2000)。MBLN1為一種拼接因子且調控諸如Serca1、CIC-1、Titin及Zasp之基因之拼接。因此，由CUGexp螯合MBLN1會觸發對基因之外顯子之錯誤調控的替代性拼接，該拼接通常由MBLN1控制(Lin,X.等人Hum.Mol.Genet.15：2087,2006)。顯示此調控異常之動物中，諸如在DM1患者及HSALR小鼠模型中之替代性拼接之矯正為治療(包括用反義寡核苷酸之治療)之功效的適用指示。
某些反義機制
肌強直性營養不良(DM1)係由DMPK基因之3’未轉譯區域中之CTG重複序列擴增所引起。在某些實施例中，在DMPK基因之3’未轉譯區域中之擴增導致轉錄含有擴增之CUG重複序列之RNA，且含有擴增之CUG重複序列(CUGexp)之RNA保留在骨骼肌之核灶中。在某些情況下，負責將mRNA自核輸出至細胞質中之細胞機構不將含有擴增之CUG重複序列之RNA自核輸出或以較低效率進行此舉。在某些實施例中，細胞不將DMPK CUGexp mRNA自核輸出或降低此輸出。因此，在某些實施例中，DMPK CUGexp mRNA累積在核中。在某些實施例中，細胞之核中存在之DMPK CUGexp mRNA的複本多於正常輸出之野生型DMPK mRNA之複本。在此等實施例中，由於突變DMPK CUGexp mRNA在核中相對豐富，所以相對於野生型DMPK mRNA，降低核中之目標物之反義化合物將優先 降低突變DMPK CUGexp CUGexp mRNA，即使反義化合物不另外區分突變與野生型。因為核糖核酸酶H依賴性反義化合物在核中具有活性，所以此等化合物特別適於此用途。
在某些情況下，預期野生型DMPK前mRNA及突變CUGexp DMPK前mRNA會在類似速率下經加工成mRNA。因此，預期在細胞之核中存在近似相同量之野生型DMPK前mRNA及突變CUGexp DMPK前mRNA。然而，在加工之後，野生型DMPK mRNA相對快速地自核輸出，且突變CUGexp DMPK mRNA緩慢輸出或完全不輸出。在某些此等實施例中，突變CUGexp DMPK mRNA累積在核中之量大於野生型DMPK mRNA。在某些此等實施例中，相較於野生型DMPK mRNA，靶向mRNA之反義寡核苷酸將優先降低突變CUGexp DMPK mRNA之表現，因為在細胞之核中存在突變CUGexp DMPK mRNA之更多複本。在某些實施例中，預期相對於野生型，靶向前mRNA而非mRNA(例如靶向內含子)之反義化合物不優先降低突變DMPK，因為兩種前mRNA之核豐度可能類似。在某些實施例中，本文所述之反義化合物不靶向DMPK前mRNA之內含子。在某些實施例中，使本文所述之反義化合物靶向DMPK mRNA中存在之外顯子或外顯子-外顯子接合點。在某些實施例中，因此，使用反義寡核苷酸靶向mRNA係較佳的，因為具有一或多種本文所述之特徵之反義寡核苷酸(i)在細胞之核中具有活性且(2)相較於野生型DMPK mRNA，將優先降低突變CUGexp DMPK mRNA。
某些生物標記
至少部分地根據CUGexp轉錄物在核或核灶中之累積程度來確定小鼠模型中之DM1嚴重性。DM1嚴重性之一適用生理標記為顯現高頻次之非自願動作電位(肌強直)。
某些適應症
在某些實施例中，本文提供治療個體之方法，其包含投與一或多種如本文所述之藥物組合物。在某些實施例中，個體患有1型肌強直性營養不良(DM1)。
因此，本文提供用於改善與有需要的受試者之1型肌強直性 營養不良相關之症狀的方法。在某些實施例中，提供一種用於降低與1型肌強直性營養不良相關之症狀之發作率的方法。在某些實施例中，提供一種用於降低與1型肌強直性營養不良相關之症狀之嚴重性的方法。在某些實施例中，與DM1相關之症狀包括肌肉僵硬、肌強直、失能性遠端無力、面部及顎肌肉無力、吞咽困難、眼瞼下垂(下垂)、頸部肌肉無力、手臂及腿肌肉無力、持續性肌肉疼痛、嗜睡、肌肉損耗、嚥物困難、呼吸功能不全、心跳不齊、心肌破壞、冷漠、胰島素抗性及白內障。在兒童中，症狀亦可為發育延遲、學習問題、語言及言語問題、以及人格發展問題。
在某些實施例中，方法包含向有需要的個體投與治療有效量的靶向DMPK核酸之化合物。
在某些實施例中，投與靶向DMPK核酸之反義化合物導致DMPK表現降低至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%或由任何兩個此等值限定之範圍。
在某些實施例中，包含靶向DMPK之反義化合物之醫藥組合物用於製備用於治療罹患或易患1型肌強直性營養不良之患者的藥劑。
在某些實施例中，本文所述之方法包括投與包含經修飾寡核苷酸之化合物，該經修飾寡核苷酸具有SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33-874中敘述之序列之如本文所述的連續核苷鹼基部分。
投藥
在某些實施例中，如本文所述之化合物及組合物係非經腸投與。
在某些實施例中，非經腸投藥係藉由輸注達成。輸注可為長期的或連續的或短暫的或間斷的。在某些實施例中，輸注之醫藥藥劑係用泵傳遞。在某些實施例中，非經腸投藥係藉由注射(例如團式注射)達成。注射液可用注射器傳遞。
非經腸投藥包括皮下投藥、靜脈內投藥、肌肉內投藥、動脈 內投藥、、腹膜內投藥或顱內投藥，例如鞘內或腦室內投藥。投藥可為連續的或長期的或短暫的或間斷的。
在某些實施例中，投藥為產生寡核苷酸之全身性效應(全身性投藥之特徵在於全身性效應，亦即在一個以上組織中具有效應)或導致向CNS或CSF傳遞之皮下、靜脈內、腦內、腦室內、鞘內投藥或另一投藥。
在包括四頭肌、腓腸肌及脛骨前肌之肌肉組織中，如藉由在DM1之HSALR小鼠模型中對α1肌動蛋白之抑制及肌強直之減輕所量度之作用的持續時間得以延長(參見以下實例)。皮下注射反義寡核苷酸4週導致HSALR小鼠中之四頭肌、腓腸肌及脛骨前肌中之α1肌動蛋白受抑制至少70%持續終止給藥之後至少11週(77天)。皮下注射反義寡核苷酸4週導致HSALR小鼠中之四頭肌、腓腸肌及脛骨前肌中之肌強直消除持續終止給藥之後至少11週(77天)。
在某些實施例中，傳遞如本文所述之組合物之化合物導致目標mRNA及/或目標蛋白質下調至少70%持續至少77天。在某些實施例中，傳遞如本文所述之化合物或組合物導致目標mRNA及/或目標蛋白質下調50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%持續至少30天、至少35天、至少40天、至少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65天、至少70天、至少75天、至少76天、至少77天、至少78天、至少79天、至少80天、至少85天、至少90天、至少95天、至少100天、至少105天、至少110天、至少115天、至少120天、至少1年。
在某些實施例中，反義寡核苷酸係藉由每77天注射或輸注一次來傳遞。在某些實施例中，反義寡核苷酸係藉由每個月、每兩個月、每三個月、每6個月一次、一年兩次或一年一次進行注射或輸注來傳遞。
某些組合療法
在某些實施例中，包含本發明之經修飾寡核苷酸之第一藥劑係與一或多種第二藥劑共同投與。在某些實施例中，此等第二藥劑經設計以與本文所述之第一藥劑治療相同1型肌強直性營養不良。在某些實施例中，此等第二藥劑經設計以與本文所述之第一藥劑治療不同疾病、病症或 病狀。在某些實施例中，此等第二藥劑經設計以處理一或多種如本文所述之醫藥組合物之非所要副作用。在某些實施例中，第二藥劑係與第一藥劑共同投與以處理第一藥劑之非所要作用。在某些實施例中，第二藥劑係與第一藥劑共同投與以產生組合效應。在某些實施例中，第二藥劑係與第一藥劑共同投與以產生協同效應。
在某些實施例中，第一藥劑與一或多種第二藥劑係同時投與。在某些實施例中，第一藥劑與一或多種第二藥劑係在不同時間投與。在某些實施例中，第一藥劑與一或多種第二藥劑係以單一醫藥製劑形式一起製備。在某些實施例中，第一藥劑與一或多種第二藥劑係分別製備。
某些比較化合物
在某些實施例中，本文揭露之化合物受益於一或多種相對於適當比較化合物改良之體外及/或體內性質。
在某些實施例中，5-10-5 MOE間隔體ISIS 445569為一種比較化合物，其具有序列(自5’至3’)CGGAGCGGTTGTGAACTGGC(作為SEQ ID NO：24併入本文中)，其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯，各胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶，且核苷1-5及16-20各自包含先前描述於WO 2012/012443中之2’-O-甲氧基乙基部分，該專利以引用的方式併入本文中。
ISIS 445569為一種適當代表性比較化合物，因為ISIS 445569顯示活體外人類DMPK統計顯著降低，如使用複數組引子探針所量測(參見例如WO 2012/012443之實例1及實例2)。另外，ISIS 445569顯示活體外統計顯著劑量依賴性抑制人類骨骼肌細胞與DM1纖維母細胞兩者中之人類DMPK(參見例如WO 2012/012443之實例4及實例5以及WO 2012/012467之實例28)。ISIS 445569亦降低轉殖基因小鼠中之人類DMPK轉錄物表現(WO 2012/012443之實例23及24以及WO 2012/012467之實例29及30)。ISIS 445569為WO 2012/012443及WO 2012/012467中之較佳人類DMPK反義化合物。
某些化合物
在某些實施例中，本文揭露之化合物受益於相對於適當比較化合物(諸如ISIS 445569)改良之活性及/或改良之可耐受性。舉例而言，在 某些實施例中，ISIS 598769、ISIS 598768及/或ISIS 486178具有比適當比較化合物(諸如ISIS 445569)更大之活性及/或可耐受性。
在某些實施例中，本文揭露之化合物比適當比較化合物(諸如ISIS 445569)更強力。舉例而言，如實例10(本文所述)中所提供，當使用電穿孔轉染時，在培養之HepG2細胞中，根據6點劑量反應曲線(61.7nM、185.2nM、555.6nM、1666.7nM、5000.0nM及15000.0nM)，ISIS 598769達成IC50 1.9μM，ISIS 598768達成IC50 1.2μM，且ISIS 486178達成IC50 0.7μM，而ISIS 445569達成IC50 2.3μM。因此，ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178比比較化合物ISIS 445569更強力。
在某些實施例中，在跨越多個不同肌肉組織達成劑量依賴性抑制DMPK方面，本文揭露之化合物具有比適當比較化合物(諸如ISIS 445569)更大之活性。在另一實例中，如實例16(本文所述)中所提供，當一週兩次持續4週以25mg/kg/週、50mg/kg/週或100mg/kg/週向DMSXL轉殖基因小鼠皮下投與時，ISIS 598768及ISIS 598769跨越若干不同肌肉組織達成比比較化合物ISIS 445569更大之劑量依賴性抑制。在一些肌肉組織中，例如在脛骨前肌中，ISIS 598768與ISIS 598769兩者在25、50及100mg/kg/週下均達成比ISIS 445569在200mg/kg/週下達成之抑制更大的對DMPK之抑制。在四頭肌及腓腸肌中，ISIS 598768與ISIS 598769兩者在50mg/kg/週下均達成與ISIS 445569在100或200mg/kg/週下達成之抑制相等或比其更大的對DMPK之抑制。因此，在跨越多個不同肌肉組織達成劑量依賴性抑制DMPK方面，ISIS 598768及ISIS 598769具有比ISIS 445569更大之活性。
在某些實施例中，當向CD-1小鼠投與時，本文揭露之化合物比適當比較化合物(諸如ISIS 445569)更可耐受。在另一實例中，如實例17(本文所述)中所提供，當向CD-1小鼠投與時，ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178展現比ISIS 445569更有利之可耐受性標記。ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178係在50mg/kg/週下一週兩次持續6週皮下投與。ISIS 445569係在100mg/kg/週下一週兩次持續6週皮下投與。在治療之後，ISIS 486178及ISIS 598768治療之小鼠中之ALT、AST及BUN含量低於ISIS 445569治療之小鼠中之含量。在治療之後，ISIS 598769治療之小鼠中之ALT及AST含量低於ISIS 445569治療之小鼠中之含量。因此，在CD-1小鼠中，ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178比比較化合物ISIS 445569更可耐受。
在某些實施例中，當向Sprague-Dawley大鼠投與時，本文揭露之化合物比適當比較化合物(諸如ISIS 445569)更可耐受。在另一實例中，如實例18(本文所述)中所提供，當向Sprague-Dawley大鼠投與時，ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178展現比ISIS 445569更有利之可耐受性標記。ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178係在50mg/kg/週下一週兩次持續6週皮下投與。ISIS 445569係在100mg/kg/週下一週兩次持續6週皮下投與。在治療之後，ISIS 486178、ISIS 598769及ISIS 598768治療之小鼠中之ALT及AST含量低於ISIS 445569治療之小鼠中之含量。因此，在Sprague-Dawley大鼠中，ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178比比較化合物ISIS 445569更可耐受。
在某些實施例中，在食蟹獼猴中，本文揭露之化合物展現比適當比較化合物(諸如ISIS 445569)更有利之可耐受性標記。在另一實例中，如實例19(本文所述)中所提供，ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178在食蟹獼猴中展現更有利可耐受性標記，包括丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、乳酸去氫酶(LDH)及肌酸激酶(CK)評估結果。在某些實施例中，ALT及AST含量用作肝細胞毒性之指標。舉例而言，在某些實施例中，ALT及AST含量升高指示對肝細胞之創傷。在某些實施例中，CK含量升高與對肌肉組織中之細胞之損害相關。在某些實施例中，LDH含量升高與細胞組織損害相關。
在某些實施例中，當向食蟹獼猴投與時，本文揭露之化合物比適當比較化合物(諸如ISIS 445569)更可耐受。如實例19中所提供，各組食蟹獼猴用40mg/kg/週之ISIS 598769、ISIS 598768、ISIS 486178及ISIS 445569治療。在治療之93天，用ISIS 445569治療導致ALT及AST含量升高。相較於ISIS 445569，在治療之58及93天，用ISIS 598768及ISIS 486178治療導致ALT及AST含量更低。相較於ISIS 445569，在治療之58 及93天，用ISIS 598769治療導致AST含量更低，且在治療之93天，ALT含量更低。此外，接受各劑量之ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178之猴的ALT及AST含量與給與生理食鹽水之猴的ALT及AST含量一致。在治療之93天，相較於在給與ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178之動物中量測之LDH含量，用ISIS 445569治療導致LDH含量升高。另外，在治療之93天，相較於在給與ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178之動物中量測之CK含量，用ISIS 445569治療導致CK含量升高。因此，ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178比比較化合物ISIS 445569更可耐受。
如以上論述之資料所證明，相較於比較化合物ISIS 445569，ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178具有的ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178具有活性所處之良好耐受劑量之範圍更寬。另外，本文實例中呈現及以上論述之資料總體證明ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178各自具有超過比較化合物ISIS 445569之許多安全性及活性優勢。換言之，在人類中，ISIS 598769、ISIS 598768及ISIS 486178各自可能為比ISIS 445569更安全且更具活性之藥物。
在某些實施例中，在人類中，ISIS 445569可能為比WO 2012/012443及/或WO 2012/012467中揭露之其他化合物更安全且更具活性用於降低CUGexp DMPK mRNA及\或治療與患有1型肌強直性營養不良相關之病狀或症狀的藥物。
在某些實施例中，ISIS 512497在靈長類動物及CD-1小鼠中具有比ISIS 445569更佳之安全性概況。在某些實施例中，當在相同劑量下及在較低劑量下投與時，ISIS 512497達成比ISIS 445569更大的對多個肌肉組織中之人類DMPK核酸之敲低。
在某些實施例中，ISIS 486178在小鼠、大鼠及靈長類動物中具有比ISIS 445569更佳之安全性概況。在某些實施例中，當在相同劑量下及在較低劑量下投與時，ISIS 486178達成比ISIS 445569更大的對一或多種肌肉組織中之人類DMPK核酸之敲低。
在某些實施例中，當在相同劑量下及在較低劑量下投與時，ISIS 570808達成比ISIS 445569大得多的對至少五種不同肌肉組織中之人 類DMPK核酸之敲低。
在某些實施例中，當在與ISIS 445569相同之劑量下投與時，ISIS 594292達成更大的對一或多種肌肉組織中之人類DMPK核酸之敲低。在某些實施例中，ISIS 486178在靈長類動物中具有比ISIS 445569更佳之安全性概況。
在某些實施例中，當在與ISIS 445569相同之劑量下投與時，ISIS 569473達成更大的對一或多種肌肉組織中之人類DMPK核酸之敲低。在某些實施例中，ISIS 569473在靈長類動物中具有比ISIS 445569更佳之安全性概況。
在某些實施例中，當在與ISIS 445569相同之劑量下投與時，ISIS 594300達成更大的對一或多種肌肉組織中之人類DMPK核酸之敲低。在某些實施例中，ISIS 594300在靈長類動物中具有比ISIS 445569更佳之安全性概況。
在某些實施例中，當在與ISIS 445569相同之劑量下投與時，ISIS 598777達成更大的對一或多種肌肉組織中之人類DMPK核酸之敲低。在某些實施例中，ISIS 598777在靈長類動物中具有比ISIS 445569更佳之安全性概況。
在某些實施例中，當在與ISIS 445569相同之劑量下投與時，ISIS 598768達成更大的對一或多種肌肉組織中之人類DMPK核酸之敲低。在某些實施例中，ISIS 598768在靈長類動物中具有比ISIS 445569更佳之安全性概況。
在某些實施例中，當在與ISIS 445569相同之劑量下投與時，ISIS 598769達成更大的對一或多種肌肉組織中之人類DMPK核酸之敲低。在某些實施例中，ISIS 598769在靈長類動物中具有比ISIS 445569更佳之安全性概況。
非限制性揭露及以引用的方式併入
儘管本文所述之某些化合物、組合物及方法已根據某些實施例特地描述，但以下實例僅用於說明本文所述之化合物且不意欲限制本文所述之化合物。本申請案中敘述之參考文獻、GenBank登錄號及其類似物 各自以全文引用的方式併入本文中。
儘管隨附於此申請之序列表根據需要將各序列鑑別為「RNA」或「DNA」，但實際上，彼等序列可用任何化學修飾組合修飾。熟習此項技術者將易於瞭解諸如「RNA」或「DNA」之用以描經修飾寡核苷酸之名稱在某些情況下為隨意的。舉例而言，包含含有2’-OH糖部分及胸腺嘧啶鹼基之核苷之寡核苷酸可描述為具有經修飾糖(2’-OH針對DNA之天然2’-H)之DNA或具有經修飾鹼基(胸腺嘧啶(甲基化尿嘧啶)針對RNA之天然尿嘧啶)之RNA。
因此，本文提供之核酸序列(包括但不限於序列表中之核酸序列)意欲涵蓋含有天然或經修飾RNA及/或DNA之任何組合之核酸，包括但不限於具有經修飾核苷鹼基之此等核酸。進一步舉例且不加限制而言，具有核苷鹼基序列「ATCGATCG」之寡聚化合物涵蓋具有此核苷鹼基序列(無論經修飾或未經修飾)之任何寡聚化合物，包括但不限於包含RNA鹼基之此等化合物，諸如具有序列「AUCGAUCG」者及具有一些DNA鹼基及一些RNA鹼基者(諸如「AUCGATCG」)及具有其他經修飾或天然存在之鹼基之寡聚化合物，諸如「ATmeCGAUCG」，其中meC指示在5位處包含甲基之胞嘧啶鹼基。
實例 非限制性揭露及以引用的方式併入
儘管本文所述之某些化合物、組合物及方法已根據某些實施例特地描述，但以下實例僅用於說明本文所述之化合物且不意欲限制本文所述之化合物。本申請案中敘述之參考文獻各自以全文引用的方式併入本文中。
實例1：設計靶向人類失養性肌強直蛋白質激酶(hDMPK)之反義寡核苷酸
一系列反義寡核苷酸(ASO)經設計以靶向hDMPK。新設計之ASO係使用此項技術中熟知之標準寡核苷酸合成法製備且描述於下表1及2中。下標「s」指示硫代磷酸酯核苷間鍵聯；下標「k」指示6’-(S)-CH3雙環核苷(cEt)；下標「e」指示2’-O-甲氧基乙基(MOE)修飾之核苷；且下標「d」指示β-D-2’-去氧核糖核苷。「mC」指示5-甲基胞嘧啶核苷。
使反義寡核苷酸靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登錄號NM_001081560.1)及/或SEQ ID NO：2(自核苷酸18540696至18555106截短之GENBANK登錄號NT_011109.15之互補序列)。「起始位點」指示人類基因序列中由間隔體所靶向之5’最近核苷。「終止位點」指示人類基因序列中由間隔體所靶向之3’最近核苷。
實例2：對人類骨骼肌細胞(hSKMc)中之人類DMPK之反義抑制
測試靶向人類DMPK核酸之反義寡核苷酸在活體外對DMPK RNA轉錄物之影響。使用電穿孔，用10,000nM反義寡核苷酸轉染處於每孔20,000個細胞之密度下之培養的hSKMc細胞。在約24小時之後，自細胞分離RNA且藉由定量即時PCR量測DMPK轉錄物含量。根據如藉由RIBOGREEN®量測之總RNA含量調整DMPK RNA轉錄物含量。結果呈現為相對於未處理對照細胞之DMPK表現百分比。
表3、4、5及6中之反義寡核苷酸為5-10-5間隔體，其中間隔段包含十個2’-去氧核苷且各翼段包含五個2’-MOE核苷。在整個各間隔體中之核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯(P=S)鍵聯。在整個各間隔體中之所有胞嘧啶殘基皆為5-甲基胞嘧啶。『目標起始位點』指示人類基因組基因序列中由反義寡核苷酸所靶向之5’最近核苷。『目標終止位點』指示人類基因組序列中由反義寡核苷酸所靶向之3’最近核苷。表3、4或5中所列之所有反義寡核苷酸皆靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登錄號NM_001081560.1)。表6中所列之所有反義寡核苷酸皆靶向SEQ ID NO：2(自核苷酸18540696至18555106截短之GENBANK登錄號NT_011109.15之互補序列)。
表2、3、4及5中之若干反義寡核苷酸顯示在以上指定條件下顯著抑制DMPK mRNA含量。
表3由靶向SEQ ID NO：1之5-10-5間隔體對hSKMc中之人類DMPK RNA轉錄物之抑制
表4由靶向SEQ ID NO：1之5-10-5間隔體對hSKMc中之人類DMPK RNA轉錄物之抑制
表5由靶向SEQ ID NO：1之5-10-5間隔體對hSKMc中之人類DMPK RNA轉錄物之抑制
表6由靶向SEQ ID NO：2之5-10-5間隔體對hSKMc中之人類DMPK RNA轉錄物之抑制
實例3：設計靶向人類失養性肌強直蛋白質激酶(hDMPK)之反義寡核苷酸
一系列反義寡核苷酸(ASO)經設計以靶向hDMPK。新設計之ASO係使用此項技術中熟知之標準寡核苷酸合成法製備且描述於下表7中。下標「s」指示硫代磷酸酯核苷間鍵聯；下標「k」指示6’-(S)-CH3雙環 核苷(cEt)；下標「e」指示2’-O-甲氧基乙基(MOE)修飾之核苷；且下標「d」指示β-D-2’-去氧核糖核苷。「mC」指示5-甲基胞嘧啶核苷。
測試靶向人類DMPK核酸之反義寡核苷酸在活體外對DMPK RNA轉錄物之影響。使用電穿孔，用4,500nM反義寡核苷酸轉染處於每孔20,000個細胞之密度下之培養的HepG2細胞。在約24小時之後，自細胞分離RNA且藉由定量即時PCR量測DMPK轉錄物含量。根據如藉由RIBOGREEN®量測之總RNA含量調整DMPK RNA轉錄物含量。結果呈現為相對於未處理對照細胞之DMPK表現百分比。
『目標起始位點』指示人類基因組基因序列中由反義寡核苷酸所靶向之5’最近核苷。『目標終止位點』指示人類基因組序列中由反義寡核苷酸所靶向之3’最近核苷。表7中所列之所有反義寡核苷酸皆靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登錄號NM_001081560.1)。
若干反義寡核苷酸顯示在以上指定條件下顯著抑制DMPK mRNA含量。
實例4：設計靶向人類失養性肌強直蛋白質激酶(hDMPK)之反義寡核苷酸劑量反應HepG2
一系列反義寡核苷酸(ASO)經設計以靶向hDMPK。新設計之ASO係使用此項技術中熟知之標準寡核苷酸合成法製備且描述於下表8中。下標「s」指示硫代磷酸酯核苷間鍵聯；下標「k」指示6’-(S)-CH3雙環核苷(cEt)；下標「e」指示2’-O-甲氧基乙基(MOE)修飾之核苷；且下標「d」指示β-D-2’-去氧核糖核苷。「mC」指示5-甲基胞嘧啶核苷。
使反義寡核苷酸靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登錄號 NM_001081560.1)。「起始位點」指示人類基因序列中由間隔體所靶向之5’最近核苷。「終止位點」指示人類基因序列中由間隔體所靶向之3’最近核苷。
實例5：劑量反應HepG2
測試靶向人類DMPK核酸之反義寡核苷酸在活體外對人類DMPK RNA轉錄物之影響。使用電穿孔，用625nM、1250nM、2500nM、5000nM及10000.0nM濃度之各反義寡核苷酸轉染處於每孔20,000個細胞之密度下之培養的HepG2細胞。在約24小時之後，自細胞分離RNA且藉由使用引子探針組RTS3164(正向序列AGCCTGAGCCGGGAGATG，在本文中指定為SEQ ID NO：20；逆向序列GCGTAGTTGACTGGCGAAGTT， 在本文中指定為SEQ ID NO：21；探針序列AGGCCATCCGCACGGACAACCX，在本文中指定為SEQ ID NO：22)進行定量即時PCR來量測DMPK RNA轉錄物含量。根據如藉由RIBOGREEN®量測之總RNA含量調整人類DMPK RNA轉錄物含量。結果在下表中呈現為相對於未處理對照(UTC)細胞之人類DMPK表現百分比。測試之反義寡核苷酸序列顯示在以上指定條件下劑量依賴性抑制人類DMPK mRNA含量。
實例6：設計靶向人類失養性肌強直蛋白質激酶(hDMPK)之反義寡核苷酸
一系列反義寡核苷酸(ASO)經設計以靶向hDMPK。新設計之ASO係使用此項技術中熟知之標準寡核苷酸合成法製備且描述於下表10 中。下標「s」指示硫代磷酸酯核苷間鍵聯；下標「k」指示6’-(S)-CH3雙環核苷(cEt)；下標「e」指示2’-O-甲氧基乙基(MOE)修飾之核苷；且下標「d」指示β-D-2’-去氧核糖核苷。「mC」指示5-甲基胞嘧啶核苷。
使反義寡核苷酸靶向SEQ ID NO：2(自核苷酸18540696至18555106截短之GENBANK登錄號NT_011109.15之互補序列)。「起始位點」指示人類基因序列中由間隔體所靶向之5’最近核苷。「終止位點」指示人類基因序列中由間隔體所靶向之3’最近核苷。
實例7：靶向HepG2細胞中之人類DMPK RNA轉錄物之ASO的劑量反應
測試靶向人類DMPK核酸之反義寡核苷酸在活體外對人類DMPK RNA轉錄物之影響。使用電穿孔，用625nM、1250nM、2500nM、5000nM及10000.0nM濃度之各反義寡核苷酸轉染處於每孔20,000個細胞之密度下之培養的HepG2細胞。在約24小時之後，自細胞分離RNA且藉由使用引子探針組RTS3164(正向序列AGCCTGAGCCGGGAGATG，在本文中指定為SEQ ID NO：20；逆向序列GCGTAGTTGACTGGCGAAGTT，在本文中指定為SEQ ID NO：21；探針序列AGGCCATCCGCACGGACAACCX，在本文中指定為SEQ ID NO：22)進行定量即時PCR來量測DMPK RNA轉錄物含量。根據如藉由RIBOGREEN®量測之總RNA含量調整人類DMPK RNA轉錄物含量。結果呈現為相對於未處理對照(UTC)細胞之人類DMPK表現百分比且顯示於下表中。測試之反義寡核苷酸序列顯示在以上指定條件下劑量依賴性抑制人類DMPK mRNA含量。
實例8：經設計以靶向人類DMPK RNA轉錄物之ASO
一系列反義寡核苷酸(ASO)經設計以靶向hDMPK。新設計之ASO係使用此項技術中熟知之標準寡核苷酸合成法製備且描述於下表12中。下標「s」指示硫代磷酸酯核苷間鍵聯；下標「k」指示6’-(S)-CH3雙環核苷(cEt)；下標「e」指示2’-O-甲氧基乙基(MOE)修飾之核苷；且下標「d」指示β-D-2’-去氧核糖核苷。「mC」指示5-甲基胞嘧啶核苷。
測試靶向人類DMPK核酸之反義寡核苷酸在活體外對DMPK RNA轉錄物之影響。使用電穿孔，用800nM反義寡核苷酸轉染處於每孔20,000個細胞之密度下之培養的hSKMC細胞。在約24小時之後，自細胞分離RNA且藉由定量即時PCR量測DMPK轉錄物含量。根據如藉由RIBOGREEN®量測之總RNA含量調整DMPK RNA轉錄物含量。結果呈現為相對於未處理對照細胞之DMPK表現百分比。
『目標起始位點』指示人類基因組基因序列中由反義寡核苷酸所靶向之5’最近核苷。『目標終止位點』指示人類基因組序列中由反義寡核苷酸所靶向之3’最近核苷。表12中所列之所有反義寡核苷酸皆靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登錄號NM_001081560.1)。
若干反義寡核苷酸顯示在以上指定條件下顯著抑制DMPK mRNA含量。
實例9：經設計以靶向人類DMPK RNA轉錄物之ASO
一系列反義寡核苷酸(ASO)經設計以靶向hDMPK。新設計之ASO係使用此項技術中熟知之標準寡核苷酸合成法製備且描述於下表13至18中。下標「s」指示硫代磷酸酯核苷間鍵聯；下標「k」指示6’-(S)-CH3雙環核苷(cEt)；下標「e」指示2’-O-甲氧基乙基(MOE)修飾之核苷；且下標「d」指示β-D-2’-去氧核糖核苷。「mC」指示5-甲基胞嘧啶核苷。
測試靶向人類DMPK核酸之反義寡核苷酸在活體外對DMPK RNA轉錄物之影響。使用電穿孔，用4,500nM反義寡核苷酸轉染處於每孔20,000個細胞之密度下之培養的HepG2細胞。在約24小時之後，自細胞分離RNA且藉由定量即時PCR量測DMPK轉錄物含量。根據如藉由RIBOGREEN®量測之總RNA含量調整DMPK RNA轉錄物含量。結果呈現為相對於未處理對照細胞之DMPK表現百分比，其中「目標表現%」表示相對於未處理對照細胞之DMPK表現百分比。
表13中所列之所有反義寡核苷酸皆靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登錄號NM_001081560.1)。表14至18中所列之所有反義寡核苷酸皆靶向SEQ ID NO：2(自核苷酸18540696至18555106截短之GENBANK登錄號NT_011109.15之互補序列)。『目標起始位點』指示人類基因組基因序列中由反義寡核苷酸所靶向之5’最近核苷。『目標終止位點』指示人類基因組序列中由反義寡核苷酸所靶向之3’最近核苷。
實例10：用靶向HepG2細胞中之人類失養性肌強直蛋白質激酶(DMPK)之反義寡核苷酸進行的劑量反應研究
測試靶向人類DMPK核酸之反義寡核苷酸在活體外對人類DMPK RNA轉錄物之影響。使用電穿孔，用61.7nM、185.2nM、555.6nM、1666.7nM、5000.0nM及15000.0nM濃度之各反義寡核苷酸轉染處於每孔20,000個細胞之密度下之培養的HepG2細胞。在約24小時之後，自細胞分離RNA且藉由使用引子探針組RTS3164(正向序列AGCCTGAGCCGGGAGATG，在本文中指定為SEQ ID NO：20；逆向序列GCGTAGTTGACTGGCGAAGTT，在本文中指定為SEQ ID NO：21；探針序列AGGCCATCCGCACGGACAACCX，在本文中指定為SEQ ID NO：22)進行定量即時PCR來量測DMPK RNA轉錄物含量。根據如藉由RIBOGREEN®量測之總RNA含量調整人類DMPK RNA轉錄物含量。結果呈現為相對於未處理對照(UTC)細胞之人類DMPK表現百分比。舉例而言，若UTC為100且5000nM劑量之ISIS編號445569產生人類DMPK表現% 35，則相對於UTC，5000nM劑量之ISIS使人類DMPK表現降低65%。各寡核苷酸之半數最大抑制性濃度(IC50)呈現於下表中且係藉由相對於在各濃度下達成之人類DMPK mRNA表現抑制百分比繪製所用寡核苷酸之濃度，且指示相較於對照，達成對人類DMPK mRNA表現之50%抑制所處的寡核苷酸濃度來計算。結果呈現於表19中。
測試之反義寡核苷酸序列顯示在以上指定條件下劑量依賴性抑制人類DMPK mRNA含量。
實例11：用靶向斯泰奈特(Steinert)DM1肌母細胞中之人類失養性肌強直蛋白質激酶(hDMPK)之反義寡核苷酸進行的劑量反應研究
測試靶向人類DMPK核酸之反義寡核苷酸在活體外對人類DMPK RNA轉錄物之影響。使用電穿孔，用61.7nM、185.2nM、555.6nM、1666.7nM、5000.0nM及15000.0nM濃度之各反義寡核苷酸轉染處於每孔20,000個細胞之密度下之培養的斯泰奈特DM1肌母細胞。在約24小時之後，自細胞分離RNA且藉由使用上述引子探針組RTS3164進行定量即時PCR來量測DMPK RNA轉錄物含量。根據如藉由RIBOGREEN®量測之總RNA含量調整人類DMPK RNA轉錄物含量。結果呈現為相對於未處理對照(UTC)細胞之人類DMPK表現百分比(%)。各寡核苷酸之半數最大抑制性濃度(IC50)呈現於下表中且係藉由相對於在各濃度下達成之人類DMPK mRNA表現抑制百分比繪製所用寡核苷酸之濃度，且指示相較於對照，達成對人類DMPK mRNA表現之50%抑制所處的寡核苷酸濃度來計算。結果呈現於表20中。
測試之反義寡核苷酸序列顯示在以上指定條件下劑量依賴性抑制人類DMPK mRNA含量。
實例12：用靶向食蟹獼猴初生肝細胞中之恆河猴失養性肌強直蛋白質激酶 (DMPK)之反義寡核苷酸進行的劑量反應研究
測試靶向恆河猴DMPK核酸之反義寡核苷酸在活體外對恆河猴DMPK RNA轉錄物之影響。使用電穿孔，用61.7nM、185.2nM、555.6nM、1666.7nM、5000.0nM及15000.0nM濃度之各反義寡核苷酸轉染處於每孔20,000個細胞之密度下之培養的食蟹獼猴初生肝細胞。在約24小時之後，自細胞分離RNA且藉由使用上述引子探針組RTS3164進行定量即時PCR來量測DMPK RNA轉錄物含量。根據如藉由RIBOGREEN®量測之總RNA含量調整恆河猴DMPK RNA轉錄物含量。結果呈現為相對於未處理對照(UTC)細胞之恆河猴DMPK表現百分比(%)。各寡核苷酸之半數最大抑制性濃度(IC50)呈現於下表中且係藉由相對於在各濃度下達成之恆河猴DMPK mRNA表現抑制百分比繪製所用寡核苷酸之濃度，且指示相較於對照，達成對恆河猴DMPK mRNA表現之50%抑制所處的寡核苷酸濃度來計算。
測試之反義寡核苷酸序列顯示在以上指定條件下劑量依賴性抑制恆河猴DMPK mRNA含量。
實例13：活體內反義抑制DMSXL轉殖基因小鼠中之hDMPK
為測試反義抑制治療1型肌強直性營養不良(DM1)之效應，需要適當小鼠模型。產生攜帶具有超過1000個CTG重複序列之大型擴增 部分之hDMPK基因的轉殖基因小鼠模型DMSXL(Huguet等人，PLOS Genetics,2012,8(11),e1003034-e1003043)。此等DMSXL小鼠表現突變hDMPK對偶基因且顯示與在DM1患者中所見之肌肉無力表型類似之肌肉無力表型。
選擇來自表1之ISIS 486178且測試其對hDMPK轉錄物之活體內反義抑制。ISIS 445569包括在研究中以用於比較。
治療
DMSXL小鼠係根據12小時光照/黑暗循環加以維持且隨意餵食正常Purina小鼠食物。在啟始實驗之前，在研究設施中馴化動物至少7天。於PBS中製備反義寡核苷酸(ASO)且藉由經0.2微米過濾器過濾來滅菌。將ASO溶解於0.9% PBS中以供注射。
DMSXL小鼠每週兩次持續4週接受皮下注射ISIS 445569(在50mg/kg下)或ISIS 486178(在25mg/kg下)。對照組每週兩次持續4週接受皮下注射PBS。各治療組由4個動物組成。
抑制hDMPK mRNA含量
在末次劑量之後24小時，處死小鼠且收集組織。分離mRNA以對hDMPK進行即時PCR分析且相對於18s RNA加以校正。人類引子探針組RTS3164用於量測mRNA含量。結果表示為各治療組相對於PBS對照之hDMPK mRNA含量平均百分比。
人類引子探針組RTS3164(正向序列AGCCTGAGCCGGGAGATG，在本文中指定為SEQ ID NO：20；逆向序列GCGTAGTTGACTGGCGAAGTT，在本文中指定為SEQ ID NO：21；探針序列AGGCCATCCGCACGGACAACCX，在本文中指定為SEQ ID NO：22)。
如下表22中所呈現，用反義寡核苷酸治療使hDMPK轉錄物表現降低。結果指示用ISIS 445569及486178治療導致DMSXL小鼠中之hDMPK mRNA含量降低。
實例14：在靶向hDMPK下ASO治療對DMSXL小鼠之肌肉強度之影響 抓握測試
使用如文獻中所述之商品化抓握強度測力計評估小鼠之野生型(WT)及DMSXL前肢的抓握強度表現(Huguet等人，PLOS Genetics,2012,8(11),e1003034-e1003043)。
DMSXL小鼠每週兩次持續4週接受皮下注射ISIS 486178(在25mg/kg下)或ISIS 445569(在50mg/kg下)。對照DMSXL組每週兩次持續4週接受皮下注射PBS。各治療組由4個動物組成。在第0、30及60天使用抓握測試量測各治療組及WT之前肢力量。藉由量測第60天與第0天之間的力量差異來確定抓握強度表現。結果呈現為各組之平均前肢力量。
如下表23中所說明，相較於未治療對照，用靶向hDMPK之ASO治療使DMSXL小鼠之肌肉強度得以改良。相較於具有MOE修飾之ISIS 445569(+0.38)，ISIS 486178(一種具有cEt修飾之ASO)顯示使前肢強度實質性改良(+3.4)。
表23在靶向hDMPK下ASO治療對DMSXL小鼠之肌肉強度之影響
實例15：在靶向hDMPK下ASO治療對DMSXL小鼠之肌肉纖維分佈之影響
亦評估在靶向hDMPK下在存在及不存在ISIS 445569及486178下，DMSXL小鼠中之肌肉纖維分佈。兩種ASO均先前描述於上表1中。
DMSXL小鼠每週兩次持續4週接受皮下注射ISIS 486178(在25mg/kg下)或ISIS 445569(在50mg/kg下)。對照DMSXL組每週兩次持續4週接受皮下注射PBS。各治療組由4個動物組成。評估肌肉纖維分佈且結果呈現於下表44中。
如所說明，相較於未治療對照，用靶向hDMPK之ASO治療使DMSXL小鼠之脛骨前肌(TA)中之DM1相關2c型肌肉纖維的分佈降低。結果證明可用ASO治療恢復骨骼肌中之正常纖維分佈樣式。相較於未治療對照，ISIS 445569顯示使肌肉纖維分佈改良；然而，ISIS 486178(一種具有cEt修飾之ASO)顯示肌肉纖維分佈與野生型小鼠中所見之肌肉纖維分佈更一致。
實例16：對DMSXL轉殖基因小鼠中之hDMPK之劑量依賴性反義抑制
在劑量-反應研究中進一步評估來自上表1之新設計之ASO在活體內對hDMPK轉錄物之反義抑制。ISIS 445569包括在研究中以用於比較。
治療
DMSXL小鼠係根據12小時光照/黑暗循環加以維持且隨意餵食正常Purina小鼠食物。在啟始實驗之前，在研究設施中馴化動物至少7天。於PBS中製備反義寡核苷酸(ASO)且藉由經0.2微米過濾器過濾來滅菌。將ASO溶解於0.9% PBS中以供注射。
DMSXL小鼠接受皮下注射PBS或來自上表1之靶向hDMPK之ASO。在下表25中之指示劑量下每週兩次持續4週用ASO給藥。對照組每週兩次持續4週接受皮下注射PBS。各治療組由4個動物組成。
抑制hDMPK mRNA含量
在末次劑量之後48小時，處死小鼠且分離來自脛骨前肌、四頭肌(左)、腓腸肌、心臟及橫隔膜之組織。分離mRNA以對hDMPK進行即時PCR分析且相對於RIBOGREEN®加以校正。人類引子探針組RTS3164用於量測mRNA含量。概述於下下表25中之結果係自各種劑量-反應研究獨立產生。結果呈現為各治療組相對於PBS對照之hDMPK mRNA表現量平均百分比。
如所呈現，用反義寡核苷酸治療以劑量依賴性方式降低hDMPK轉錄物表現。
TA=脛骨前肌；Quad=四頭肌；Gastroc=腓腸肌
實例17：在CD-1小鼠中進行之六週活體內可耐受性研究
在6週研究中進一步評估來自上表1之新設計之ASO以評估血漿化學、身體/器官重量及組織學組織學。向各組CD-1小鼠投與100mg/kg/週之ISIS 445569或ISIS 512497。向其他各組CD-1小鼠投與50mg/kg/週之ISIS 486178、ISIS 570808、ISIS 594292、ISIS 598768、ISIS 598769、ISIS 569473、ISIS 594300及ISIS 598777。在各組小鼠接受末次劑量之後六週及兩天之後，處死小鼠且收集組織以進行分析。對於各組小鼠，量測用以量測丙胺酸轉胺酶含量、天冬胺酸轉胺酶含量、血液尿素氮(BUN)含量、白蛋白含量、總膽紅素及肌酸含量之分析。另外，亦量測器官重量，其結果呈現於下表中。
實例18：在Sprague-Dawley大鼠中進行之六週活體內可耐受性研究
在6週研究中進一步評估來自上表1之新設計之ASO以評估血漿化學、身體/器官重量及組織學組織學。向各組Sprague-Dawley大鼠投與100mpk/週之ISIS 445569或ISIS 512497。向其他各組Sprague-Dawley大鼠投與50mpk/週之ISIS 486178,ISIS 570808,ISIS 594292,ISIS 598768,ISIS 598769,ISIS 569473,ISIS 594300及ISIS 598777。在各組小鼠接受末次劑量之後六週及兩天之後，處死小鼠且收集組織以進行分析。對於各組小鼠，量測用以量測丙胺酸轉胺酶含量、天冬胺酸轉胺酶含量、血液尿素氮(BUN)含量、白蛋白含量、總膽紅素、及肌酸含量及尿肌酸含量之分析。另外，亦量測器官重量，其結果呈現於下表中。
實例19：在食蟹獼猴中進行之十三(13)週活體內研究
經由皮下注射向各組4只雄性食蟹獼猴投與40mg/kg/週之ISIS 445569、ISIS 512497、ISIS 486178、ISIS 570808、ISIS 594292、ISIS 598768、ISIS 598769、ISIS 569473、ISIS 594300及ISIS 598777。在首次劑量之後十三週，處死動物且進行組織分析。分離mRNA以對恆河猴DMPK進行即時PCR分析且相對於RIBOGREEN®加以校正。引子探針組RTS3164(上述)用於量測mRNA含量且結果顯示於下表30中。另外，再分離mRNA以使用引子探針組RTS4447對恆河猴DMPK進行即時PCR分析並相對於RIBOGREEN®加以校正，且且結果顯示於下表31中。RTS4447(正向序列AGCCTGAGCCGGGAGATG，在本文中指定為SEQ ID NO：20；逆向序列GCGTAGTTGACTGGCAAAGTT，在本文中指定為SEQ ID NO：21；探針序列AGGCCATCCGCATGGCCAACC，在本文中指定為SEQ ID NO：22)。
表30
實例20：在食蟹獼猴中進行之十三(13)週活體內可耐受性研究
在第1、3、5及7天，經由皮下注射向各組雄性食蟹獼猴投與40mg/kg之ISIS 445569,ISIS 512497,ISIS 486178,ISIS 570808,ISIS 594292,ISIS 598768,ISIS 598769,ISIS 569473,ISIS 594300及ISIS 598777。在第7天投藥之後，經由皮下注射向各猴投與40mg/kg/週之ISIS 445569、ISIS 512497、ISIS 486178、ISIS 570808、ISIS 594292、ISIS 598768、ISIS 598769、ISIS 569473、ISIS 594300及ISIS 598777。
在第28及91天，在各猴接受皮下劑量之後48小時，獲取 血液及尿樣品以進行分析。一些猴在第56天給與之劑量之後48小時被獲取血液及尿。量測治療組中各動物之丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、乳酸去氫酶(LDH)及肌酸激酶(CK)且平均值呈現於下表中。具有負號之樣品天數值表示在治療開始之前的時間點。舉例而言，治療天數值-7表示在首次劑量之前7天獲取之樣品。在首次劑量之後十三週，處死動物且進行組織分析。
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<213> 家鼷鼠
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<213> 家鼷鼠
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<212> DNA
<213> 家鼷鼠
<220>
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<213> 家鼷鼠
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<212> DNA
<213> 家鼷鼠
<220>
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<212> DNA
<213> 家鼷鼠
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<213> 家鼷鼠
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 家鼷鼠
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<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
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<211> 21
<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 27
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<210> 869
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 869
<210> 870
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 870
<210> 871
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 871
<210> 872
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 872
<210> 873
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 873
<210> 874
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 874

Claims (167)

  1. 一種包含由10-30個連接之核苷組成且具有一核苷鹼基序列之經修飾寡核苷酸的化合物，該核苷鹼基序列包含含有至少8個互補於DMPK核酸之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基之互補區域。
  2. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸之至少一個核苷包含選自以下之中之雙環糖：cEt、LNA、α-L-LNA、ENA及2’-硫代LNA。
  3. 如申請專利範圍第1項至第2項中任一項之化合物，其中該靶區域為DMPK核酸之外顯子9。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之化合物，其中該互補區域包含至少10個互補於DMPK轉錄物之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基。
  5. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之化合物，其中該互補區域包含至少12個互補於DMPK核酸之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基。
  6. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之化合物，其中該互補區域包含至少14個互補於DMPK核酸之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基。
  7. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之化合物，其中該互補區域包含至少16個互補於DMPK核酸之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之化合物，其中該DMPK核酸為DMPK前mRNA。
  9. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之化合物，其中該DMPK核酸為DMPK mRNA。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之化合物，其中該DMPK核酸具有選自以下之中之核苷鹼基序列：SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2。
  11. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含含有至少10個互補於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基之互補區域的核苷鹼基序 列。
  12. 如申請專利範圍第1項至第10項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含含有至少12個互補於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基之互補區域的核苷鹼基序列。
  13. 如申請專利範圍第1項至第10項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含含有至少14個互補於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基之互補區域的核苷鹼基序列。
  14. 如申請專利範圍第1項至第10項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含含有至少16個互補於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之具有相等長度之靶區域的連續核苷鹼基之互補區域的核苷鹼基序列。
  15. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：1之核苷鹼基1343至核苷鹼基1368。
  16. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：1之核苷鹼基1317至核苷鹼基1366。
  17. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：1之核苷鹼基2748至核苷鹼基2791。
  18. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：1之核苷鹼基730至核苷鹼基748。
  19. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：2之核苷鹼基8603至核苷鹼基8619。
  20. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：2之核苷鹼基13836至核苷鹼基13851。
  21. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：2之核苷鹼基10201至核苷鹼基10216。
  22. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該靶區域為自SEQ ID NO.：2之核苷鹼基10202至核苷鹼基10218。
  23. 如申請專利範圍第1項至第22項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有歷經該寡核苷酸之整個長度至少80%互補於該靶區域的核苷鹼基序列。
  24. 如申請專利範圍第1項至第22項中任一項之化合物，其中該經修飾寡 核苷酸具有歷經該寡核苷酸之整個長度至少90%互補於該靶區域的核苷鹼基序列。
  25. 如申請專利範圍第1項至第22項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有歷經該寡核苷酸之整個長度至少100%互補於該靶區域的核苷鹼基序列。
  26. 如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之化合物，其具有包含在SEQ ID NO：23-874之任一者中敘述之序列的至少8個連續核苷鹼基之核苷鹼基序列。
  27. 如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23-32中敘述之序列之至少10個連續核苷鹼基的核苷鹼基序列。
  28. 如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23-32中敘述之序列之至少12個連續核苷鹼基的核苷鹼基序列。
  29. 如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23-32中敘述之序列之至少14個連續核苷鹼基的核苷鹼基序列。
  30. 如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23-32中敘述之序列之至少16個連續核苷鹼基的核苷鹼基序列。
  31. 如申請專利範圍第1項至第30項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：23中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
  32. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：25中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
  33. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：26中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
  34. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：27中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
  35. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：28中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
  36. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：29中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
  37. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：30中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
  38. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：31中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
  39. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有由SEQ ID NO：32中敘述之序列組成之核苷鹼基序列。
  40. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31或32中敘述之序列之核苷鹼基序列。
  41. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：23、25、26、27、28、29、30、31或32中敘述之序列之核苷鹼基序列。
  42. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：33-874之任一者中敘述之序列的核苷鹼基序列。
  43. 如申請專利範圍第1項至第42項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸之該核苷鹼基序列至少90%互補於SEQ ID NO：1-19之任一者。
  44. 如申請專利範圍第1項至第34項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸之該核苷鹼基序列100%互補於SEQ ID NO：1-19之任一者。
  45. 如申請專利範圍第1項至第30項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成。
  46. 如申請專利範圍第1項至第30項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成。
  47. 如申請專利範圍第1項至第30項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由18個連接之核苷組成。
  48. 如申請專利範圍第1項至第30項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由19個連接之核苷組成。
  49. 如申請專利範圍第1項至第30項中任一項之化合物，其中該經修飾寡 核苷酸由20個連接之核苷組成。
  50. 如申請專利範圍第1項至第49項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸為單股寡核苷酸。
  51. 如申請專利範圍第1項至第50項中任一項之化合物，其中至少一個核苷包含經修飾糖。
  52. 如申請專利範圍第1項至第51項中任一項之化合物，其中至少兩個核苷包含經修飾糖。
  53. 如申請專利範圍第52項之化合物，其中該等經修飾糖各自具有相同修飾。
  54. 如申請專利範圍第52項之化合物，其中該等經修飾糖之至少一者具有不同修飾。
  55. 如申請專利範圍第51項至第54項中任一項之化合物，其中至少一個經修飾糖為雙環糖。
  56. 如申請專利範圍第55項之化合物，其中該雙環糖選自以下之中：cEt、LNA、α-L-LNA、ENA及2’-硫代LNA。
  57. 如申請專利範圍第56項之化合物，其中該雙環糖包含cEt。
  58. 如申請專利範圍第56項之化合物，其中該雙環糖包含LNA。
  59. 如申請專利範圍第56項之化合物，其中該雙環糖包含α-L-LNA。
  60. 如申請專利範圍第56項之化合物，其中該雙環糖包含ENA。
  61. 如申請專利範圍第56項之化合物，其中該雙環糖包含2’-硫代LNA。
  62. 如申請專利範圍第1項至第61項中任一項之化合物，其中至少一個經修飾糖包含2’-取代之核苷。
  63. 如申請專利範圍第62項之化合物，其中該2’-取代之核苷選自以下之中：2’-OCH3、2’-F和2’-O-甲氧基乙基。
  64. 如申請專利範圍第1項至第63項中任一項之化合物，其中至少一個經修飾糖包含2’-O-甲氧基乙基。
  65. 如申請專利範圍第1項至第64項中任一項之化合物，其中至少一個核苷包含經修飾核苷鹼基。
  66. 如申請專利範圍第65項之化合物，其中該經修飾核苷鹼基為5-甲基胞嘧啶。
  67. 如申請專利範圍第1項至第67項中任一項之化合物，其中各胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶。
  68. 如申請專利範圍第1項至第67項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸包含：a.由連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由連接之核苷組成之5’翼段；c.由連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間且其中各翼段之各核苷包含經修飾糖。
  69. 如申請專利範圍第68項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成。
  70. 如申請專利範圍第68項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成。
  71. 如申請專利範圍第68項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由18個連接之核苷組成。
  72. 如申請專利範圍第68項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由19個連接之核苷組成。
  73. 如申請專利範圍第68項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由20個連接之核苷組成。
  74. 如申請專利範圍第68項至第73項中任一項之化合物，其中該5’翼段由兩個連接之核苷組成。
  75. 如申請專利範圍第68項至第73項中任一項之化合物，其中該5’翼段由三個連接之核苷組成。
  76. 如申請專利範圍第68項至第73項中任一項之化合物，其中該5’翼段由四個連接之核苷組成。
  77. 如申請專利範圍第68項至第73項中任一項之化合物，其中該5’翼段由五個連接之核苷組成。
  78. 如申請專利範圍第68項至第73項中任一項之化合物，其中該5’翼段由六個連接之核苷組成。
  79. 如申請專利範圍第68項至第78項中任一項之化合物，其中該3’翼段 由兩個連接之核苷組成。
  80. 如申請專利範圍第68項至第78項中任一項之化合物，其中該3’翼段由三個連接之核苷組成。
  81. 如申請專利範圍第68項至第78項中任一項之化合物，其中該3’翼段由四個連接之核苷組成。
  82. 如申請專利範圍第68項至第78項中任一項之化合物，其中該3’翼段由五個連接之核苷組成。
  83. 如申請專利範圍第68項至第78項中任一項之化合物，其中該3’翼段由六個連接之核苷組成。
  84. 如申請專利範圍第68項至第83項中任一項之化合物，其中該間隔段由六個連接之去氧核苷組成。
  85. 如申請專利範圍第68項至第83項中任一項之化合物，其中該間隔段由七個連接之去氧核苷組成。
  86. 如申請專利範圍第68項至第83項中任一項之化合物，其中該間隔段由八個連接之去氧核苷組成。
  87. 如申請專利範圍第68項至第83項中任一項之化合物，其中該間隔段由九個連接之去氧核苷組成。
  88. 如申請專利範圍第68項至第83項中任一項之化合物，其中該間隔段由十個連接之去氧核苷組成。
  89. 如申請專利範圍第1項至第31項、第33項、第37項至第45項或第51項至第88項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由三個連接之核苷組成之5’翼段；c.由三個連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各翼段之各核苷包含雙環糖。
  90. 如申請專利範圍第1項至第31項、第33項、第37項至第45項或第51項至第88項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含： a.由八個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由四個連接之核苷組成且具有AABB 5’翼基元之5’翼段；c.由四個連接之核苷組成且具有BBAA 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間。
  91. 如申請專利範圍第1項至第30項、第34項、第35項、第46項或第50項至第88項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成且包含：a.由七個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由五個連接之核苷組成且具有AAABB 5’翼基元之5’翼段；c.由五個連接之核苷組成且具有BBAAA 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間。
  92. 如申請專利範圍第1項至第31項、第33項、第37項至第45項或第51項至第88項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由八個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由四個連接之核苷組成且具有E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c.由四個連接之核苷組成且具有K-K-E-E 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖。
  93. 如申請專利範圍第1項至第30項、第34項、第35項、第46項或第50項至第88項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成且包含：a.由七個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由五個連接之核苷組成且具有E-E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c.由五個連接之核苷組成且具有K-K-E-E-E 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖。
  94. 如申請專利範圍第1項至第30項、第32項、第33項或第49項至第88項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由20個連接之核苷組成且包含： a.由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由五個連接之核苷組成之5’翼段；c.由五個連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各翼段之各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖。
  95. 如申請專利範圍第1項至第31項、第33項、第34項、第37項至第45項或第53項至第88項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由三個連接之核苷組成之5’翼段；c.由三個連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間，且其中各翼段之各核苷包含cEt糖。
  96. 如申請專利範圍第1項至第67項中任一項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸包含至少8個互補於SEQ ID NO.：1之核苷鹼基1343及核苷鹼基1368內之靶區域的連續核苷鹼基，且其中該經修飾寡核苷酸包含：a.由連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由連接之核苷組成之5’翼段；c.由連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間且其中各翼段之各核苷包含經修飾糖。
  97. 如申請專利範圍第96項之化合物，其中該5’翼段中之各經修飾糖具有相同修飾。
  98. 如申請專利範圍第96項之化合物，其中該5’翼段中之至少兩個經修飾糖具有不同修飾。
  99. 如申請專利範圍第96項至第98項中任一項之化合物，其中該3’翼段中之各經修飾糖具有相同修飾。
  100. 如申請專利範圍第96項至第98項中任一項之化合物，其中該3’翼段中之至少兩個經修飾糖具有不同修飾。
  101. 如申請專利範圍第96項之化合物，其中至少一個經修飾糖為選自以下 之中之雙環糖：cEt、LNA、α-L-LNA、ENA及2’-硫代LNA。
  102. 如申請專利範圍第90項至第91項之化合物，其中各B表示選自以下之中之雙環糖：cEt、LNA、α-L-LNA、ENA及2’-硫代LNA。
  103. 如申請專利範圍第102項之化合物，其中該雙環糖包含BNA。
  104. 如申請專利範圍第102項之化合物，其中該雙環糖包含cEt。
  105. 如申請專利範圍第102項之化合物，其中該雙環糖包含LNA。
  106. 如申請專利範圍第102項之化合物，其中該雙環糖包含α-L-LNA。
  107. 如申請專利範圍第102項之化合物，其中該雙環糖包含ENA。
  108. 如申請專利範圍第102項之化合物，其中該雙環糖包含2’-硫代LNA。
  109. 如申請專利範圍第90項或第91項之化合物，其中各A表示選自以下之中之2’-取代之核苷：2’-OCH3、2’-F和2’-O-甲氧基乙基。
  110. 如申請專利範圍第109項之化合物，其中該2’-取代之核苷包含2’-O-甲氧基乙基。
  111. 如申請專利範圍第1項至第111項中任一項之化合物，其中至少一個核苷間鍵聯為經修飾核苷間鍵聯。
  112. 如申請專利範圍第1項至第111項中任一項之化合物，其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  113. 一種化合物，其由ISIS 486178組成。
  114. 一種化合物，其由ISIS 512497組成。
  115. 一種化合物，其由ISIS 598768組成。
  116. 一種化合物，其由ISIS 594300組成。
  117. 一種化合物，其由ISIS 594292組成。
  118. 一種化合物，其由ISIS 569473組成。
  119. 一種化合物，其由ISIS 598769組成。
  120. 一種化合物，其由ISIS 570808組成。
  121. 一種化合物，其由ISIS 598777組成。
  122. 一種具有如SEQ ID NO：23中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由三個連接之核苷組成之5’翼段； c.由三個連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各翼段之各核苷包含雙環糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
  123. 一種具有如SEQ ID NO：29中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由三個連接之核苷組成之5’翼段；c.由三個連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各翼段之各核苷包含雙環糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
  124. 一種具有如SEQ ID NO：31中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由三個連接之核苷組成之5’翼段；c.由三個連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各翼段之各核苷包含雙環糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
  125. 一種具有如SEQ ID NO：26中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由八個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由四個連接之核苷組成且具有E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c.由四個連接之核苷組成且具有K-K-E-E 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖； f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
  126. 一種具有如SEQ ID NO：30中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由八個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由四個連接之核苷組成且具有E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c.由四個連接之核苷組成且具有K-K-E-E 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
  127. 一種具有如SEQ ID NO：32中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成且包含：a.由八個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由四個連接之核苷組成且具有E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c.由四個連接之核苷組成且具有K-K-E-E 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
  128. 一種具有如SEQ ID NO：27中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成且包含：a.由七個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由五個連接之核苷組成且具有E-E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c.由五個連接之核苷組成且具有K-K-E-E-E 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
  129. 一種具有如SEQ ID NO：28中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該 經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成且包含：a.由七個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由五個連接之核苷組成且具有E-E-E-K-K 5’翼基元之5’翼段；c.由五個連接之核苷組成且具有K-K-E-E-E 3’翼基元之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各E表示2’-O-甲氧基乙基糖且各K表示cEt糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
  130. 一種具有如SEQ ID NO：25中闡述之核苷鹼基序列之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由20個連接之核苷組成且包含：a.由十個連接之去氧核苷組成之間隔段；b.由五個連接之核苷組成之5’翼段；c.由五個連接之核苷組成之3’翼段；d.其中該間隔段位於該5’翼段與該3’翼段之間；e.其中各翼段之各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；f.其中各核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；且g.其中各胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶。
  131. 如申請專利範圍第1項至第130項中任一項之化合物，其包含共軛物。
  132. 一種組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
  133. 一種治療動物之DM1之方法，其包含向有需要的動物投與如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之組合物。
  134. 如申請專利範圍第133項之方法，其中該化合物降低DMPK mRNA含量。
  135. 如申請專利範圍第133項之方法，其中該化合物降低DMPK蛋白表現。
  136. 如申請專利範圍第133項之方法，其中該化合物降低CUGexp DMPK。
  137. 如申請專利範圍第133項之方法，其中該化合物優先降低CUGexp DMPK。
  138. 如申請專利範圍第133項之方法，其中該化合物降低CUGexp DMPK mRNA。
  139. 如申請專利範圍第133項之方法，其中該化合物優先降低CUGexp DMPK mRNA。
  140. 如申請專利範圍第138項或第139項之方法，其中CUGexp之該優先降低係在肌肉組織中。
  141. 一種減輕動物之肌強直之方法，其包含向有需要的動物投與如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之組合物。
  142. 一種減輕動物之MBLN依賴性拼接病變之方法，其包含向有需要的動物投與如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之組合物。
  143. 如申請專利範圍第142項之方法，其中Serca1、m-Titin、Clcn1及Zasp之任一者之拼接得以矯正。
  144. 如申請專利範圍第133項至第143項中任一項之方法，其中該投藥為全身性投藥。
  145. 如申請專利範圍第133項至第143項中任一項之方法，其中該投藥為非經腸投藥。
  146. 如申請專利範圍第144項之方法，其中該全身性投藥為皮下投藥、靜脈內投藥、腦室內投藥及鞘內投藥之任一者。
  147. 如申請專利範圍第133項至第143項中任一項之方法，其中該投藥不為肌肉內投藥。
  148. 如申請專利範圍第133項至第143項中任一項之方法，其中該動物為人類。
  149. 一種減輕有需要的動物之Serca1之拼接病變的方法，其係藉由投與如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之組合物，且藉此導致包括Serca1外顯子22來達成。
  150. 一種減輕有需要的動物之m-Titin之拼接病變的方法，其係藉由投與如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之組合物，且藉此導致包括m-Titin外顯子5來達成。
  151. 一種減輕有需要的動物之Clcn1之拼接病變的方法，其係藉由投與如申 請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之組合物，且藉此導致包括Clcn1外顯子7a來達成。
  152. 一種減輕有需要的動物之Zasp之拼接病變的方法，其係藉由投與如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之組合物，且藉此導致包括Zasp外顯子11來達成。
  153. 一種降低細胞中之DMPK mRNA之方法，其包含使細胞與如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之組合物接觸。
  154. 一種降低細胞中之DMPK蛋白之方法，其包含使細胞與如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之組合物接觸。
  155. 一種降低細胞中之CUGexp mRNA之方法，其包含使細胞與如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之組合物接觸。
  156. 如申請專利範圍第153項至第155項中任一項之方法，其中該細胞係在動物中。
  157. 如申請專利範圍第156項之方法，其中該動物為人類。
  158. 一種達成CUGexp DMPK RNA之優先降低之方法，其包含：a.選擇患有1型肌強直性營養不良或具有CUGexp DMPK RNA之受試者；以及b.向該受試者投與如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之組合物；其中如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之該化合物或如申請專利範圍第132項之組合物在結合該CUGexp DMPK RNA時活化核糖核酸酶，藉此達成該CUGexp DMPK RNA之優先降低。
  159. 一種達成CUGexp DMPK RNA之優先降低之方法，其包含：a.選擇患有1型肌強直性營養不良或具有CUGexp DMPK RNA之受試者；以及b.向該受試者全身性投與如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之組合物； 其中該化學修飾之反義寡核苷酸在結合該CUGexp DMPK RNA時達成該CUGexp DMPK RNA之優先降低。
  160. 一種減輕懷疑患有1型肌強直性營養不良或具有核保留之CUGexp DMPK RNA之受試者之拼接病變的方法，其包含：向該受試者投與如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之組合物，其中如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之該化合物或如申請專利範圍第132項之組合物在結合該突變DMPK RNA時活化核糖核酸酶，藉此減輕拼接病變。
  161. 一種在動物中優先降低CUGexp DMPK RNA、減輕肌強直或減輕拼接病變之方法，其包含向該動物投與如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之醫藥組合物，其中該化合物降低該動物中之DMPK表現，藉此在該動物中優先降低CUGexp DMPK RNA、減輕肌強直或減輕拼接病變。
  162. 一種用於治療患有1型肌強直性營養不良之動物之方法，其包含鑑別患有1型肌強直性營養不良之該動物，向該動物投與治療有效量的如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之醫藥組合物，其中患有1型肌強直性營養不良之該動物得以治療。
  163. 一種降低DMPK表現之方法，其包含向動物投與如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之醫藥組合物，其中DMPK之表現得以降低。
  164. 如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之醫藥組合物，其係用於治療動物之DM1。
  165. 如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之醫藥組合物，其係用於減輕動物之肌強直。
  166. 如申請專利範圍第1項至第131項中任一項之化合物或如申請專利範圍第132項之醫藥組合物，其係用於減輕動物之MBLN依賴性拼接病變。
  167. 一種如申請專利範圍第1項至第131項中任一項 之化合物或如申請專利範圍第132項之醫藥組合物的用途，其係用於製備用於治療1型肌強直性營養不良或其症狀之藥劑。
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