JP2014506791A - miR−34の合成模倣体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、分子生物学および医学の分野に関する。より具体的には、疾患および/または病態の処置のための、少なくともmiR-34機能特性を有するRNA分子、およびいくつかの態様においては、miR-34に関連する増強された特徴を有するRNA分子に関する方法および組成物である。いくつかの態様において、miR-34aとしてまたはmiR-34cとして機能するRNA分子が、これらの関連で提供される。
2001年に、いくつかのグループがクローニング法を用いて、線虫(C. elegans)、ショウジョウバエ(Drosophila)およびヒトから「マイクロRNA」(miRNA)の大集団を単離かつ特定した(Lau et al., 2001; Lee and Ambros, 2001; Lagos-Quintana et al., 2003)。
(22mer)を含む活性鎖を持つ。或る態様において、成熟miR-34a配列はSEQ ID NO: 1の配列および3'末端に付加的なUを持つ
(23mer)。したがって、或る態様において、RNA分子は、SEQ ID NO:2のヌクレオチド1〜22位の配列を有する活性鎖を持つ。いくつかの態様において、SEQ ID NO:2のヌクレオチド1〜22位の配列を有する活性鎖を持つRNA分子であって、配列の3'末端にA、C、G、またはUが存在するために長さが23ヌクレオチドである、該RNA分子が提供されることがさらに企図される。いくつかの態様において、活性鎖は、1つまたは複数の内部位置に修飾ヌクレオチドを持つ。
の成熟miR-34a配列を含みうるか、または
のヌクレオチド1〜22位の配列を含みうる。SEQ ID NO:2は、SEQ ID NO:1の成熟miR-34a配列を3'末端の付加的なUとともに持つ。SEQ ID NO:2は、miRBase 16.0データベース中の成熟ヒトmiR-34a (Griffths-Jones et al., 2006) (成熟ヒトmiR-34a配列はSEQ ID NO:1であり、およびその相補体はSEQ ID NO:3である)と比べて3'末端に余分なUを持つ。これらの態様のどちらかにおいて、活性鎖は同じ配列を含む。さらなる態様において、活性鎖は、SEQ ID NO:2を含むまたはSEQ ID NO:2からなる配列を持つ。いくつかの態様において、活性鎖は、修飾ヌクレオチドの同一性が、言及されているSEQ ID NOに対するものである、該修飾ヌクレオチドを持ちうる。
i) 5'末端の最初の2つの位置には存在しない少なくとも2つの修飾ヌクレオチドを含む、活性鎖;
ii) 末端から最初もしくは最後の2つの位置において少なくとも2つの修飾ヌクレオチドを含む活性鎖;
iii) SEQ ID NO:5に対する位置3 (G)、4 (C)、11 (G)、12 (U)、13 (A)、14 (G)、15 (C)、16 (C)、17 (U)、および/または18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む活性鎖;
iv) SEQ ID NO:5に対する位置11 (G)および12 (U)に修飾ヌクレオチドを含む活性鎖;
v) SEQ ID NO:5に対する位置17 (U)および18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む活性鎖;
vi) SEQ ID NO:5に対する位置11 (G)、12 (U)、17 (U)、および18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む活性鎖;
vii) SEQ ID NO:5に対する位置3 (G)および4 (C)における修飾ヌクレオチドと、位置11 (G)、12 (U)、13 (A)、14 (G)、15 (C)、16 (C)、17 (U)、および/もしくは18 (G)における少なくとも1つの修飾ヌクレオチドとを含む、活性鎖; または、
viii) SEQ ID NO:5に対する位置3 (G)、4 (C)、11 (G)、12 (U)、13 (A)、14 (G)、15 (C)、16 (C)、17 (U)、および18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む活性鎖。
(23mer)に対する位置1 (A)、2 (A)、3 (C)、4 (A)、5 (A)、6 (C)、9 (G)、10 (C)、11 (U)、12 (A)、13 (A)、14 (G)、17 (A)、18 (C)、19 (U)、20 (G)、21 (C)、22 (C)、および/または23 (A)ならびにそれらの任意の組み合わせに位置する修飾ヌクレオチドを含む。SEQ ID NO:4は、SEQ ID N0:4が5'末端に付加的なAを持つことを除き、
(22mer)と同じ配列を含む。いくつかの態様において、パッセンジャー鎖は、SEQ ID NO:3からなる、またはSEQ ID NO:3を含むが、しかしSEQ ID NO:4からならない、またはSEQ ID NO:4を含まない。SEQ ID NO:4に対する修飾ヌクレオチドは、
における、位置1 (A)、2 (C)、3 (A)、4 (A)、5 (C)、8 (G)、9 (C)、10 (U)、11 (A)、12 (A)、13 (G)、16 (A)、17 (C)、18 (U)、19 (G)、20 (C)、21 (C)、および/または22 (A)の修飾ヌクレオチドに対応する。
(23mer)に対する位置1(G)、2 (C)、3 (A)、4 (A)、7 (A)、8 (G)、9 (C)、10 (U)、aa (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、19 (U)、21 (C)、22 (C)、および/または23 (U)ならびにそれらの任意の組み合わせに位置する修飾ヌクレオチドを含む。
(23mer)に対する位置1(G)、2 (C)、3 (A)、4 (A)、7 (A)、8 (G)、9 (C)、10 (U)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、19 (U)、21 (C)、22 (C)、および/または23 (U)ならびにそれらの任意の組み合わせに位置する修飾ヌクレオチドを含む。
i) 5'末端での末端修飾を除きいかなる修飾ヌクレオチドも含まない、パッセンジャー鎖;
ii) SEQ ID NO:6に対する位置1 (G)、2 (C)、3 (A)、21 (C)、22 (C)、および/もしくは23 (U)に修飾ヌクレオチドを含むパッセンジャー鎖;
iii) SEQ ID NO:6に対する位置a) 1 (G)、2 (C)、3 (A)および/もしくはb) 22 (C)および23 (U)のサブセットに位置する修飾ヌクレオチドを含むパッセンジャー鎖;
iv) SEQ ID NO:6に対する位置1 (G)、2 (C)、および3 (A)に位置する修飾ヌクレオチドを含むパッセンジャー鎖;
v) SEQ ID NO:6に対する位置22 (C)および23 (U)に位置する修飾ヌクレオチドを含むパッセンジャー鎖;
vi) SEQ ID NO:6に対する位置1 (G)、2 (C)、3 (A)、22 (C)および23 (U)に位置する修飾ヌクレオチドを含むパッセンジャー鎖;
vii) a)がSEQ ID NO:6に対する位置1 (G)、2 (C)、および3 (A)であり; かつb)が位置22 (C)および23 (U)である、位置a)および/もしくはb)の群において修飾ヌクレオチドを含むが、いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドは群a)およびb)の両方には位置しない、パッセンジャー鎖;
viii) SEQ ID NO:6に対する位置4 (A)、7 (A)、8 (G)、9 (C)、10 (U)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、19 (U)、および/もしくは21 (C)に位置する修飾ヌクレオチドを含むパッセンジャー鎖;
ix) SEQ ID NO:6に対する位置1 (G)、2 (C)、3 (A)、4 (A)、7 (A)、8 (G)、9 (C)、10 (U)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、19 (U)、および/もしくは21 (C)に位置する修飾ヌクレオチドを含むパッセンジャー鎖;
x) SEQ ID NO:6に対する位置4 (A)、7 (A)、8 (G)、9 (C)、10 (U)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、19 (U)、21 (C) 22 (C)および/もしくは23 (U)に位置する修飾ヌクレオチドを含むパッセンジャー鎖;
xi) SEQ ID NO:6に対する位置1 (G)、2 (C)、3 (A)、4 (A)、7 (A)、8 (G)、9 (C)、10 (U)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、19 (U)、21 (C) 22 (C)および/もしくは23 (U)に位置する修飾ヌクレオチドを含むパッセンジャー鎖;
xii) SEQ ID NO:6に対する位置1 (G)、2 (C)、3 (A)、17 (A)、18 (C)、21 (C)、22 (C)、および23 (U)に修飾ヌクレオチドを含むパッセンジャー鎖;
xiii) SEQ ID NO:6に対する位置1 (G)、2 (C)、3 (A)、17 (A)、18 (C)、21 (C)、22 (C)、および23 (U)に修飾ヌクレオチドを含むパッセンジャー鎖;
xiv) SEQ ID NO:6に対する位置1 (G)、2 (C)、3 (A)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、21 (C)、22 (C)、および23 (U)に修飾ヌクレオチドを含むパッセンジャー鎖; または、
xv) SEQ ID NO:6に対する位置1 (G)、2 (C)、3 (A)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、17 (A)、18 (C)、21 (C)、22 (C)、および23 (U)に修飾ヌクレオチドを含むパッセンジャー鎖。
i) 5'末端での末端修飾を除きいかなる修飾ヌクレオチドも含まない、パッセンジャー鎖;
ii) SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1 (A)、2 (A)、20 (G)、21 (C)、22 (C)、および23 (A)における修飾ヌクレオチドとを含む、パッセンジャー鎖;
iii) SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1 (A)、2 (A)、3 (C)、4 (A)、22 (C)、および23 (A)における修飾ヌクレオチドとを含む、パッセンジャー鎖; または、
iv) SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1 (A)、2 (A)、19 (U)、20 (G)、22 (C)、および23 (A)における修飾ヌクレオチドとを含む、パッセンジャー鎖。
i) SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1 (A)、2 (A)、20 (G)、21 (C)、22 (C)、および23 (A)における修飾ヌクレオチドとを含む、パッセンジャー鎖;
ii) SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1 (A)、2 (A)、3 (C)、4 (A)、22 (C)、および23 (A)における修飾ヌクレオチドとを含む、パッセンジャー鎖;
iii) SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1 (A)、2 (A)、19 (U)、20 (G)、22 (C)、および23 (A)における修飾ヌクレオチドとを含む、パッセンジャー鎖; または
iv) 5'末端修飾を除きいかなる修飾ヌクレオチドも含まない、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:4を含むパッセンジャー鎖。
i) SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、21、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、パッセンジャー鎖;
ii) SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、3、4、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、パッセンジャー鎖; または、
iii) SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、19、20、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、パッセンジャー鎖。
、ここで、N1はA、C、G、またはUであり; N2はA、C、G、またはUであり; N3はA、C、G、U、またはなしであり; N4はA、C、G、またはUであり; N5はA、C、G、またはUであり; かつN6はA、C、G、U、またはなしである)およびii) 少なくとも1つの修飾された内部ヌクレオチドを含む活性鎖と、b) 5'末端のヌクレオチドの末端修飾を含む完全に相補的なパッセンジャー鎖とを含んだ、長さが22または23塩基対の二本鎖で平滑末端のRNA分子である。特定の態様において、分子は、長さが23塩基対である。
i) 5'末端の最初の2つの位置には存在しない少なくとも2つの修飾ヌクレオチドを含む、活性鎖;
ii) 末端から最初もしくは最後の2つの位置において少なくとも2つの修飾ヌクレオチドを含む活性鎖;
iii) 位置3、4、11、12、13、14、15、16、17、および/もしくは18に修飾ヌクレオチドを含む活性鎖;
iv) 位置11および12に修飾ヌクレオチドを含む活性鎖;
v) 位置17および18に修飾ヌクレオチドを含む活性鎖;
vi) 位置11、12、17、および18に修飾ヌクレオチドを含む活性鎖;
vii) 位置3 (G)および4 (C)における修飾ヌクレオチドと、位置11、12、13、14、15、16、17、および/もしくは18における少なくとも1つの修飾ヌクレオチドとを含む、活性鎖;
viii) 位置3、4、11、12、13、14、15、16、17、および18に修飾ヌクレオチドを含む活性鎖; または、
ix) 最大で11個の修飾された内部ヌクレオチドを含む活性鎖。
態様は、miRNAに関連する組成物および方法、ならびにmiRNA模倣体の使用を対象にする。方法には、そのような模倣体を調製する段階およびそのような模倣体を用いて、miRNA活性または機能を細胞に提供する段階が含まれる。或る態様において、miRNA模倣体は、治療的、予後予測的、および診断的用途のために用いられ、特に、miRNA活性または機能が関わる病態または疾患のための治療的用途に関連する方法および組成物のために用いられる。
核酸は、成熟マイクロRNA (「miRNA」または「miR」)分子と同一、相補的、または部分的に相補的な配列である、配列または配列のセグメントを含む。成熟miRNA分子は一般に、長さが21〜22ヌクレオチドであるが、16ヌクレオチドおよび最長27ヌクレオチドの長さのものが報告されている。miRNAはそれぞれ、より長い前駆体RNA分子(「前駆体miRNA」)からプロセッシングされる。前駆体miRNAは、非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体miRNAは、動物ではDicerと呼ばれるリボヌクレアーゼIII様ヌクレアーゼ酵素によって切断されるステム-ループ様または折り畳み様の構造の形成を可能とする2つの相補性領域を持つ。プロセッシングされたmiRNAは典型的には、ステムの一部である。
miR-34は、がん治療のならびに他の疾患および障害の治療の介入ポイントとなる多数の細胞活性の調節に関わることが以前に実証された(2005年5月31日付で出願された米国特許出願第11/141,707号および2005年11月14日付で出願された米国特許出願第11/273,640号)。それらの特許出願は参照により本明細書に組み入れられる。
態様は、RNA分子の活性を模倣できる分子を含んだ、miRNA模倣体に関する。RNA分子は、塩基-糖の組み合わせであるヌクレオシドを含有する。ヌクレオシドの塩基部分は、典型的には、複素環塩基部分である。そのような複素環塩基のうちで最も一般的な2つのクラスが、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合的に連結されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は糖の2'、3'または5'ヒドロキシル部分に連結されうる。RNA鎖はヌクレオチド(リボヌクレオチド)から構成されること、および5'末端はヌクレオチドまたはヌクレオシドでありうることが企図される。言い換えれば、ヌクレオシドの糖部分に連結されたリン酸基が存在しうる、またはリン酸基の代わりにヒドロキシル基だけが存在しうる。本明細書において論じられる場合、いくつかの態様において、化学部分または化学基が、ヒドロキシル基もしくはリン酸基であるものまたは元はヒドロキシル基もしくはリン酸基であったものを通じて糖に付着している、末端ヌクレオシドまたはヌクレオチドの修飾が存在する。
と95%同一である。或る態様において、そのような活性鎖は、1つのヌクレオチドがNによって表されるさまざまなリボヌクレオチド(A、C、G、またはU)で置換されている5'から3'方向の下記の配列を持つ。
と少なくとも95%同一であり、SEQ ID NO:2に対するヌクレオチドの置換を有する。そのような態様において、活性鎖の配列は、付加Uを3'末端に持つこと、またはSEQ ID NO:2における最後のUに対する置換が存在することを除き、上記に開示された配列の1つを含む。他の態様において、SEQ ID NO:2に対する2個のヌクレオチドの置換が存在することを除き、SEQ ID NO:2と少なくとも90%同一である活性鎖が存在する。そのような態様において、付加Uが存在すること、またはSEQ ID NO:2における最後のUに対する置換が存在することを除き、上記に開示された配列中にさらなる置換が存在する。
と95%同一であり、これはSEQ ID NO:2に対するヌクレオチドの挿入を含む。そのような態様において、活性鎖の配列は、付加Uを3'末端に持つことを除き(3'末端に付加Uに関する挿入が存在する場合を除き)、上記に開示された配列の1つを含む。態様には、SEQ ID NO:2に対する1つまたは2つの挿入を有するものが含まれる。
と少なくとも95%同一である。或る態様において、そのような活性鎖は、1つのヌクレオチドがNによって表されるさまざまなリボヌクレオチド(A、C、G、またはU)で置換されている5'から3'方向の下記の配列を持つ。
(22mer)と95%同一である。或る態様において、活性鎖は、SEQ ID NO:3の1つのヌクレオチドが欠失されている5'から3'方向の下記の配列を持つ。
と95%同一であり、これはSEQ ID NO:2よりも2塩基長い。或る態様において、パッセンジャー鎖は、SEQ ID NO:4の1つのヌクレオチドが欠失されている5'から3'方向の下記の配列を持つ。
と95%同一である。或る態様において、そのようなパッセンジャー鎖は、1つのヌクレオチドがNによって表されるさまざまなリボヌクレオチド(A、C、G、またはU)で置換されている5'から3'方向の下記の配列を持つ。
と90%同一であるか、または少なくとも90%同一である。或る態様において、そのようなパッセンジャー鎖は、1つまたは2つのヌクレオチドが、異なるリボヌクレオチドで置換されている5'から3'方向の下記の配列を持つ。或る態様において、Nによって表される1つの置換が存在する。
(23mer)と95%同一である。或る態様において、パッセンジャー鎖は、SEQ ID NO:6の1つのヌクレオチドが欠失されている5'から3'方向の下記の配列を持つ。
と95%同一である。或る態様において、そのようなパッセンジャー鎖は、1つのヌクレオチドがNによって表されるさまざまなリボヌクレオチド(A、C、G、またはU)で置換されている5'から3'方向の下記の配列を持つ。
核酸は、当業者に周知の技法を用いて単離されうるが、特定の態様において、核酸小分子を単離するための方法、および/またはRNA分子を単離するための方法を利用することができる。クロマトグラフィーは、核酸をタンパク質から、または他の核酸から分離または単離するために用いられることが多い過程である。そのような方法は、ゲルマトリックスを用いる電気泳動、フィルタカラム、キャピラリー電気泳動、アルコール沈殿、および/または他のクロマトグラフィーを伴いうる。細胞由来のmiRNAが用いられるまたは評価される場合、方法には一般に、細胞をカオトロピック剤(例えば、グアニジニウムイソチオシアネート)および/または界面活性剤(例えば、N-ラウロイルサルコシン)で溶解した後に、RNAの特定の集団を単離するための過程を実施する段階が伴う。
あるいは、核酸合成は、標準的な方法によって行われる。例えば、Itakura and Riggs (1980)を参照されたい。さらに、米国特許第4,704,362号、同第5,221,619号、および同第5,583,013号は各々、合成核酸を調製するさまざまな方法について記述している。合成核酸(例えば、合成オリゴヌクレオチド)の非限定的な例としては、ホスホトリエステル、ホスファイト、もしくはホスホラミダイト化学を用いるインビトロ化学合成、および参照により本明細書に組み入れられるEP 266,032に記述されているものなどの固相法によって、または各々が参照により本明細書に組み入れられるFroehler et al., 1986および米国特許第5,705,629号により記述されたデオキシヌクレオシドH-ホスホネート中間体によって作製された核酸が挙げられる。本明細書において記述される方法において、1種または複数種のオリゴヌクレオチドが用いられうる。オリゴヌクレオチド合成は当業者に周知である。オリゴヌクレオチド合成のさまざまな異なる機構が、例えば、各々が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,659,774号、同第4,816,571号、同第5,141,813号、同第5,264,566号、同第4,959,463号、同第5,428,148号、同第5,554,744号、同第5,574,146号、同第5,602,244号に開示されている。
或る態様は、細胞へ導入されると内在性のmiR-34aまたはmiR-34cの活性を発揮する核酸に関する。或る局面において、治療用核酸(核酸ともいわれる)は、合成miRNA配列、非合成miRNA配列、または合成miRNA配列および非合成miRNA配列の組み合わせでありうる。態様は、或る局面において、miR-34aまたはmiR-34cとして機能する短い核酸分子(治療用核酸)に関する。核酸分子は、典型的には、合成される。「合成」という用語は、機器または装置によって化学的に合成される、かつ細胞内で天然には産生されない、核酸分子をいう。
方法は、成熟miRNA配列を含むまたは成熟miRNA配列から本質的になる治療用核酸の有効量の送達を含む。薬学的組成物の「有効量」は、概して、記載された所望の結果を達成するために、例えば、疾患もしくはその症状の程度を改善するために、軽減するために、最小限に抑えるために、または制限するために、検出可能かつ反復可能に十分な量であると定義される。疾患の除去、根絶または治癒を含む、他のさらに厳密な定義が適用されうる。
或る態様において、組成物および方法は、治療用核酸を伴う。これらの組成物を第2の治療と組み合わせて用いて、miRNA治療の効果を増強することができ、または利用されている別の治療の治療効果を高めることができる。これらの組成物はがん細胞の殺傷および/または細胞の過剰増殖の阻害のような所望の効果を達成するのに有効な、組み合わせた量で提供される。この過程は、細胞と治療用核酸または第2の治療とを同じ時点でまたは異なる時点で接触させる段階を伴いうる。これは、1種もしくは複数種の薬剤を含む1種もしくは複数種の組成物もしくは薬理学的製剤と細胞とを接触させることによって、または2種もしくはそれ以上の異なる組成物もしくは製剤と細胞とを接触させることによって達成することができ、ここで1種の組成物が(1) 治療用核酸; および/または(2) 第2の治療を提供する。化学療法、放射線療法、外科的治療、免疫療法または遺伝子治療を含む、第2の組成物または方法を施すことができる。
下記の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。当業者は、下記の実施例に開示された技法が、本発明者らにより、本発明の実践においてうまく機能することが見出された技法に当たること、したがって本発明の実践に関する好ましい様式を構成すると見なされうると理解するはずである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、開示されている特定の態様に多くの変更が成されうること、またそれでも本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するはずである。
miRNAの活性は、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)のタンパク質と相互作用するその能力およびハイブリダイゼーションを通じてmRNA標的と相互作用するその能力の両方に依る。細胞内でのmiRNAの活性を妨害せずに二本鎖miR-34a中のどのヌクレオチドを修飾できるかを判定するため、本発明者らは、2'酸素-メチル(2'O-Me)修飾ヌクレオチドが二本鎖miRNAの活性鎖上のまたはパッセンジャー鎖上の隣接する2つの位置に組み入れられた一連の二本鎖miR-34a模倣体を用いた(表1)。2'O-Me修飾に加えて、各パッセンジャー鎖は、5'-アミノC6ヌクレオチド(6-炭素スペーサーに付着した第一級アミン基)からなる5'末端修飾を有した。
本発明者らは、パッセンジャー鎖および活性鎖の両方において修飾ヌクレオチドを持つmiR-34a模倣体の抗細胞増殖活性を評価した。さまざまな修飾パッセンジャー鎖および活性鎖オリゴヌクレオチドをアニールさせて、両方の鎖に修飾を有するmiR-34a模倣体を形成させた。肺がん(H460)細胞株、前立腺がん(PC3)細胞株、および肝臓がん(C3A)細胞株に、さまざまな模倣体を、および陰性対照miRNA (Ambion, カタログ番号AM17103)を30 nMの終濃度で逆トランスフェクトした。製造元の推奨に従い下記のパラメータを用いて、リポフェクトアミン2000 (Invitrogen)を使用した; 細胞5,000個/96ウェルプレートのウェル、リポフェクトアミン2000 0.1〜0.2 μl (細胞株個別に至適化)、培地全量100 μl中。トランスフェクション後6日目に、製造元のプロトコルに従って細胞に対しalamarBlue(登録商標)アッセイ法(Invitrogen, カタログ番号DAL 1100)を行った。蛍光プレートリーダーを用いて、alamarBlue(登録商標)の還元基質であるレゾルフィンの蓄積を測定した(励起560 nm、発光590 nm)。レゾルフィンの蛍光は、1ウェルあたりの生存細胞数と相関する。非修飾miR-34a模倣体をトランスフェクトした細胞の蛍光を、二本鎖2'O-Me修飾miR-34aをトランスフェクトした細胞の蛍光で割り、この結果に100を掛けることにより、各トランスフェクト細胞集団に対する増殖細胞の相対数を計算した。結果を表3に示す。
2'OHは、リボヌクレアーゼがRNA分子を切断するのに必要とされるため、2'修飾ヌクレオチドをRNA分子に組み入れることで、それらをヌクレアーゼ消化に対してさらに耐性とすることができる。本発明者らは、インビトロ安定性アッセイ法および精製RNase A (Ambion, カタログ番号AM2270)を用いて、修飾miR-34a模倣体および非修飾miR-34a模倣体の安定性を比較した。
miR-34a模倣体の抗増殖活性を評価し、2'O-Me修飾のないmiR-34a模倣体と比較した。肺がん細胞(H460)に、異なる4種の二本鎖miR-34a模倣体および陰性対照miRNA (Ambion, カタログ番号AM17103)を1、3および10 nMの終濃度で逆トランスフェクトした。製造元の推奨に従い下記のパラメータを用いて、リポフェクトアミン2000 (Invitrogen)を使用した; 細胞5,000個/96ウェルプレートのウェル、リポフェクトアミン2000 0.1〜0.2 μl (細胞株個別に至適化)、培地全量100 μl中。トランスフェクションから3日後に、製造元のプロトコルに従って細胞に対しalamarBlue(登録商標)アッセイ法(Invitrogen, カタログ番号DAL 1100)を行った。蛍光プレートリーダーを用いて、alamarBlue(登録商標)の還元基質であるレゾルフィンの蓄積を測定した(励起560 nm、発光590 nm)。レゾルフィンの蛍光は、1ウェルあたりの生存細胞数と相関する。所与の濃度のmiR-34a模倣体をトランスフェクトした細胞由来の蛍光を、同じ濃度の陰性対照miRNAをトランスフェクトした細胞由来の蛍光で割り、この結果に100を掛けることにより、各トランスフェクト細胞集団に対する生存細胞の相対比率を計算した。100%未満の値は、miR-34a模倣体が、陰性対照miRNAをトランスフェクトした細胞集団と比べて集団中の生存細胞の数を低減したことを示す。結果を表5に示す。
miRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)によるmRNA転写調節のガイド配列として機能する。miRNA模倣体は、RISCに進入した後に、(1) miRNAに結合されたmRNAを切断するようにRISCを誘導すること、(2) 結合されたmRNAがリボソームと相互作用するのを防ぐことによって結合されたmRNAの半減期を変化させること、および/または(3) 遺伝子それ自体がmiRNA模倣体によって調節される遺伝子によって調節されるmRNAの量の変化を引き起こすことにより、トランスフェクト細胞のmRNAプロファイルを変化させることができる。
miRNAの活性は、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)のタンパク質と相互作用するその能力およびハイブリダイゼーションを通じてmRNA標的と相互作用するその能力の両方に依る。細胞内でのmiRNAの活性を妨害せずに二本鎖mir-34c RNA模倣体中のどのヌクレオチドを修飾できるかを判定するため、本発明者らは、2'O-Me修飾ヌクレオチドが二本鎖miRNAの活性鎖上のまたはパッセンジャー鎖上の隣接する2つの位置に組み入れられた一連の二本鎖mir-34c模倣体を用いた(表10)。2'O-Me修飾に加えて、各パッセンジャー鎖は、5'-アミノC6修飾を有していた。
本発明者らは、パッセンジャー鎖および活性鎖の両方において修飾ヌクレオチドを持つmir-34c模倣体の抗細胞増殖活性を評価した。さまざまな修飾パッセンジャー鎖および活性鎖オリゴヌクレオチドをアニールさせて、両方の鎖に修飾を有するmir-34c模倣体を形成させた。H460肺がん細胞に、さまざまな模倣体を、または陰性対照miRNA (Ambion, カタログ番号AM17103)を30 nMの終濃度で逆トランスフェクトした。製造元の推奨に従い下記のパラメータを用いて、リポフェクトアミン2000 (Invitrogen)を使用した; 細胞5,000個/96ウェルプレートのウェル、リポフェクトアミン2000 0.1〜0.2 μl (細胞株個別に至適化)、培地全量100 μl中。トランスフェクション後6日目に、製造元のプロトコルに従って細胞に対しalamarBlue(登録商標)アッセイ法(Invitrogen, カタログ番号DAL 1100)を行った。蛍光プレートリーダーを用いて、alamarBlueの還元基質であるレゾルフィンの蓄積を測定した(励起560 nm、発光590 nm)。レゾルフィンの蛍光は、1ウェルあたりの生存細胞数と相関する。修飾mir-34c模倣体をトランスフェクトした細胞の蛍光を、2'O-Me修飾mir-34c模倣体をトランスフェクトした細胞の蛍光で割り、この結果に100を掛けることにより、各トランスフェクト細胞集団に対する増殖細胞の相対数を計算した。結果を表12に示す。
2'OHは、リボヌクレアーゼがRNA分子を切断するのに必要とされるため、2'修飾ヌクレオチドをRNA分子に組み入れることで、それらをヌクレアーゼ消化に対してさらに耐性とすることができる。本発明者らは、インビトロ安定性アッセイ法および精製RNase A (Ambion, カタログ番号AM2270)を用いて、修飾mir-34c模倣体および非修飾mir-34c模倣体の安定性を比較した。
最もヌクレアーゼ耐性であるmir-34c模倣体のうちの4つの抗増殖活性を評価し、2'O-Me修飾のないmir-34c模倣体と比較した。肺がん細胞(H460)に、異なる4種の二本鎖mir-34c模倣体および陰性対照miRNA (Ambion, カタログ番号AM17103)を3、10および30 nMの終濃度で逆トランスフェクトした。製造元の推奨に従い下記のパラメータを用いて、リポフェクトアミン2000 (Invitrogen)を使用した; 細胞5,000個/96ウェルプレートのウェル、リポフェクトアミン2000 0.1〜0.2 μl (細胞株個別に至適化)、培地全量100 μl中。トランスフェクションから3日後に、製造元のプロトコルに従って細胞に対しalamarBlue(登録商標)アッセイ法(Invitrogen, カタログ番号DAL 1100)を行った。蛍光プレートリーダーを用いて、alamarBlue(登録商標)の還元基質であるレゾルフィンの蓄積を測定した(励起560 nm、発光590 nm)。レゾルフィンの蛍光は、1ウェルあたりの生存細胞数と相関する。所与の濃度のmir-34c模倣体をトランスフェクトした細胞由来の蛍光を、同じ濃度の陰性対照miRNAをトランスフェクトした細胞由来の蛍光で割り、この結果に100を掛けることにより、各トランスフェクト細胞集団に対する生存細胞の相対比率を計算した。100%未満の値は、mir-34c模倣体が、陰性対照miRNAをトランスフェクトした細胞集団と比べて集団中の生存細胞の数を低減したことを示す。結果を表14に示す。
miRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)のガイド配列として機能し、mRNAの翻訳を調節する。miRNA模倣体は、RISCに進入した後に、(1) miRNAに結合されたmRNAを切断するようにRISCを誘導すること、(2) 結合されたmRNAがリボソームと相互作用するのを防ぐことによって結合されたmRNAの半減期を変化させること、および/または(3) 遺伝子それ自体がmiRNA模倣体によって調節される遺伝子によって調節されるmRNAの量の変化を引き起こすことにより、トランスフェクト細胞のmRNAプロファイルを変化させることができる。
以下を含む、長さが22または23塩基対の二本鎖で平滑末端のRNA分子:
a) 5'から3'方向のSEQ ID NO:1を含む活性鎖; ならびに
b) 完全に相補的なパッセンジャー鎖であって、
i) 該パッセンジャー鎖の最初および最後の2つのヌクレオチドにおける修飾ヌクレオチドと、
ii) 5'末端のヌクレオチドの末端修飾と
を含む、該パッセンジャー鎖。
[本発明1002]
長さが23塩基対であり、活性鎖がSEQ ID NO:2を含む、本発明1001のRNA分子。
[本発明1003]
パッセンジャー鎖がSEQ ID NO:4に対する位置1、2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、22、および/または23に修飾ヌクレオチドを含み、該パッセンジャー鎖中のヌクレオチドの総数の半分よりも少ないヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、本発明1001のRNA分子。
[本発明1004]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置i) 1および2ならびに/またはii) 22および23に位置する修飾ヌクレオチドを含む、本発明1001〜1003のいずれかのRNA分子。
[本発明1005]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置i) 1および2ならびにii) 22および23に位置する修飾ヌクレオチドを含む、本発明1002〜1003のいずれかのRNA分子。
[本発明1006]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置i) 3および4ならびに/またはii) 19および20に位置する修飾ヌクレオチドを含む、本発明1001〜1005のいずれかのRNA分子。
[本発明1007]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置i) 3および4またはii) 19および20に位置する修飾ヌクレオチドを含むが、しかし位置i)およびii)の両方には含まない、本発明1006のRNA分子。
[本発明1008]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置5および6に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1004〜1007のいずれかのRNA分子。
[本発明1009]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置9および10に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1004〜1007のいずれかのRNA分子。
[本発明1010]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置11および12に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1004〜1007のいずれかのRNA分子。
[本発明1011]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置13および14に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1004〜1007のいずれかのRNA分子。
[本発明1012]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置17および18に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1004〜1007のいずれかのRNA分子。
[本発明1013]
パッセンジャー鎖中の修飾ヌクレオチドの数が4個〜8個である、本発明1004のRNA分子。
[本発明1014]
パッセンジャー鎖中の修飾ヌクレオチドの数が5個〜7個である、本発明1013のRNA分子。
[本発明1015]
パッセンジャー鎖中の修飾ヌクレオチドの数が6個である、本発明1014のRNA分子。
[本発明1016]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置7、8、9、15、および16に位置する修飾ヌクレオチドを持たない、本発明1001〜1015のいずれかのRNA分子。
[本発明1017]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、21、22、および23に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1001〜1016のいずれかのRNA分子。
[本発明1018]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、3、4、22、および23に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1001〜1016のいずれかのRNA分子。
[本発明1019]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、19、20、22、および23に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1001〜1016のいずれかのRNA分子。
[本発明1020]
活性鎖が少なくとも2つの修飾ヌクレオチドを含み、該修飾ヌクレオチドが5'末端の最初の2つの位置には存在しない、本発明1001〜1019のいずれかのRNA分子。
[本発明1021]
活性鎖が、5'末端の最初の2つの位置において修飾ヌクレオチドを持たない、本発明1001〜1019のいずれかのRNA分子。
[本発明1022]
活性鎖が、末端から最初または最後の2つの位置において修飾ヌクレオチドを含まない、本発明1001のRNA分子。
[本発明1023]
活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置3、4、11、12、13、14、15、16、17、および/または18に修飾ヌクレオチドを持つ、本発明1020〜1022のいずれかのRNA分子。
[本発明1024]
活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置15および16に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1023のRNA分子。
[本発明1025]
活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置3および4に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1023のRNA分子。
[本発明1026]
活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置11および12に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1023のRNA分子。
[本発明1027]
活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置11、12、13、および14に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1023のRNA分子。
[本発明1028]
活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置17および18に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1023のRNA分子。
[本発明1029]
活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置11、12、15、および16に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1023〜1028のいずれかのRNA分子。
[本発明1030]
活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置13、14、17、および18に修飾ヌクレオチドをさらに含む、本発明1029のRNA分子。
[本発明1031]
活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置3、4、15、および16に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1023〜1028のいずれかのRNA分子。
[本発明1032]
活性鎖が、いかなる修飾ヌクレオチドも持たない、本発明1001〜1019のいずれかのRNA分子。
[本発明1033]
パッセンジャー鎖が、5'末端修飾を除きいかなる修飾ヌクレオチドも含まない、本発明1029のRNA分子。
[本発明1034]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、20、21、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、本発明1029のRNA分子。
[本発明1035]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、3、4、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、本発明1029のRNA分子。
[本発明1036]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、19、20、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、本発明1029のいずれかのRNA分子。
[本発明1037]
パッセンジャー鎖が、5'末端修飾を除きいかなる修飾ヌクレオチドも含まない、本発明1030のRNA分子。
[本発明1038]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、20、21、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、本発明1030のRNA分子。
[本発明1039]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、3、4、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、本発明1030のRNA分子。
[本発明1040]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、19、20、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、本発明1030のいずれかのRNA分子。[A-ID 206/P-ID 215]
[本発明1041]
パッセンジャー鎖が、5'末端修飾を除きいかなる修飾ヌクレオチドも含まない、本発明1031のRNA分子。
[本発明1042]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、21、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、本発明1031のRNA分子。
[本発明1043]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、3、4、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、本発明1031のRNA分子。
[本発明1044]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、19、20、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、本発明1031のいずれかのRNA分子。
[本発明1045]
パッセンジャー鎖の末端修飾が低級アルキルアミン基を含む、本発明1001〜1044のいずれかのRNA分子。
[本発明1046]
修飾ヌクレオチドが糖修飾を持つ、本発明1001〜1045のいずれかのRNA分子。
[本発明1047]
糖修飾が2'-OMeである、本発明1046のRNA分子。
[本発明1048]
SEQ ID NO:2の配列を持つ活性鎖と、5'末端に修飾ヌクレオチドを有する別個でかつ完全に相補的なパッセンジャー鎖とを含み、両端が平滑末端である、長さが20〜23塩基対の二本鎖RNA分子であって、
該活性鎖が、少なくとも1つの修飾された内部ヌクレオチドを含み、かつ該二本鎖RNA分子が、内部ヌクレオチドのいかなる修飾も欠く二本鎖で平滑末端のRNA分子と比べてより安定である、
該二本鎖RNA分子。
[本発明1049]
本発明1001〜1048のいずれかのRNA分子を含む、薬学的組成物。
[本発明1050]
本発明1001〜1048のいずれかのRNA分子を細胞に投与する段階を含む、miR-34a活性を細胞に提供するための方法。
[本発明1051]
本発明1001〜1048のいずれかのRNA分子の有効量を細胞に投与する段階を含む、細胞増殖を低下させるための方法。
[本発明1052]
本発明1001〜1048のいずれかのRNA分子の有効量を細胞に投与する段階を含む、細胞においてアポトーシスを誘導するための方法。
[本発明1053]
本発明1001〜1048のいずれかのRNA分子を含む薬学的組成物を患者に投与する段階を含む、患者においてがんを処置するための方法。
[本発明1054]
さらなるがん治療を患者に施す段階をさらに含む、本発明1054の方法。
[本発明1055]
患者が、がんと診断されている、本発明1053の方法。
[本発明1056]
以下を含む、長さが23または24塩基対の二本鎖で平滑末端のRNA分子:
a) i) 5'から3'方向のSEQ ID NO:5と、
ii) 少なくとも1つの修飾された内部ヌクレオチドと
を含む、活性鎖; および
b) 5'末端のヌクレオチドの末端修飾を含む、完全に相補的なパッセンジャー鎖。
[本発明1057]
長さが23塩基対である、本発明1056のRNA分子。
[本発明1058]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置1 (G)、2 (C)、3 (A)、21 (C)、22 (C)、および/または23 (U)に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1056のRNA分子。
[本発明1059]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置i) 1 (A)、2 (A)、および3 (C)ならびに/またはii) 22 (C)および23 (A)のサブセットに位置する修飾ヌクレオチドを含む、本発明1056〜1058のいずれかのRNA分子。
[本発明1060]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置i) 1 (A)、2 (A)、および3 (C)に位置する修飾ヌクレオチドを含む、本発明1056〜1059のいずれかのRNA分子。
[本発明1061]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置ii) 22 (C)および23 (A)に位置する修飾ヌクレオチドを含む、本発明1056〜1060のいずれかのRNA分子。
[本発明1062]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置1 (A)、2 (A)、3 (C)、22 (C)、および23 (A)に位置する修飾ヌクレオチドを含む、本発明1059のRNA分子。
[本発明1063]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置i)またはii)に位置する修飾ヌクレオチドを含むが、しかし位置i)およびii)の両方には含まない、本発明1059のRNA分子。
[本発明1064]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置4 (A)、7 (A)、8 (G)、9 (C)、10 (U)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、19 (U)、および/または21 (C)に位置する修飾ヌクレオチドをさらに含む、本発明1056〜1063のいずれかのRNA分子。
[本発明1065]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置5 (U)、6 (C)、15 (A)、および/または16 (C)に位置する修飾ヌクレオチドを持たない、本発明1056のいずれかのRNA分子。
[本発明1066]
パッセンジャー鎖中の修飾ヌクレオチドの数が2個〜8個である、本発明1056のいずれかのRNA分子。
[本発明1067]
パッセンジャー鎖中の修飾ヌクレオチドの数が3個〜5個である、本発明1066のRNA分子。
[本発明1068]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置1 (A)、2 (A)、3 (C)、17 (A)、18 (C)、21 (C)、22 (C)、および23 (A)に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1056のいずれかのRNA分子。
[本発明1069]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置1 (A)、2 (A)、3 (C)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、21 (C)、22 (C)、および23 (A)に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1056のいずれかのRNA分子。
[本発明1070]
パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置1 (A)、2 (A)、3 (C)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、17 (A)、18 (C)、21 (C)、22 (C)、および23 (A)に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1056のいずれかのRNA分子。
[本発明1071]
活性鎖が少なくとも2つの修飾ヌクレオチドを含み、該修飾ヌクレオチドが5'末端の最初の2つの位置には存在しない、本発明1056〜1070のいずれかのRNA分子。
[本発明1072]
活性鎖が、5'末端の最初の2つの位置において修飾ヌクレオチドを持たない、本発明1056〜1070のいずれかのRNA分子。
[本発明1073]
活性鎖が、末端から最初または最後の2つの位置において修飾ヌクレオチドを含まない、本発明1056のRNA分子。
[本発明1074]
活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置3 (G)、4 (C)、11 (G)、12 (U)、13 (A)、14 (G)、15 (C)、16 (C)、17 (U)、および/または18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1071〜1073のいずれかのRNA分子。
[本発明1075]
活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置11 (G)および12 (U)に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1074のRNA分子。
[本発明1076]
活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置17 (U)および18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1074のRNA分子。
[本発明1077]
活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置11 (G)、12 (U)、17 (U)、および18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1074のRNA分子。
[本発明1078]
活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置3 (G)、4 (C)、13 (A)、14 (G)、15 (C)、および/または16 (C)に修飾ヌクレオチドをさらに含む、本発明1077のRNA分子。
[本発明1079]
パッセンジャー鎖が、いかなる修飾ヌクレオチドも含まない、本発明1074〜1078のいずれかのRNA分子。
[本発明1080]
活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置11 (G)、12 (U)、17 (U)、および18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1068のRNA分子。
[本発明1081]
活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置11 (G)、12 (U)、17 (U)、および18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1069のRNA分子。
[本発明1082]
活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置11 (G)、12 (U)、17 (U)、および18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1070のいずれかのRNA分子。
[本発明1083]
パッセンジャー鎖の末端修飾が低級アルキルアミン基を含む、本発明1056〜1082のいずれかのRNA分子。
[本発明1084]
修飾ヌクレオチドが修飾糖を持つ、本発明1056〜1083のいずれかのRNA分子。
[本発明1085]
糖修飾が2'-OMeである、本発明1084のRNA分子。
[本発明1086]
以下を含む、長さが23または24塩基対の二本鎖で平滑末端のRNA分子:
a) i) 5'から3'方向のSEQ ID NO:5と、
ii) 少なくとも1つの修飾された内部ヌクレオチドと
を含む、活性鎖; ならびに
b) 5'末端のヌクレオチドの末端修飾と、SEQ ID NO:6に対する位置1 (G)、2 (C)、3 (A)、21 (C)、22 (C)および/または23 (U)における少なくとも1つの糖修飾とを含む、完全に相補的なパッセンジャー鎖。
[本発明1087]
以下を含む、長さが23または24塩基対の二本鎖で平滑末端のRNA分子:
a) 5'から3'方向のSEQ ID NO:5の少なくとも塩基1〜23位を含む活性鎖; ならびに
b) i) 5'末端のヌクレオチドの末端修飾と、
ii) 最初の3つまたは最後の3つのヌクレオチドにおける糖修飾と、
iii) SEQ ID NO:6に対する位置11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、17 (A)、および/または18 (C)のうちの1つまたは複数におけるヌクレオチドの糖修飾と
を含む、完全に相補的なパッセンジャー鎖。
[本発明1088]
本発明1056〜1087のいずれかのRNA分子を含む、薬学的組成物。
[本発明1089]
本発明1056〜1086のいずれかのRNA分子を細胞に投与する段階を含む、miR-34c活性を細胞に提供するための方法。
[本発明1090]
本発明1056〜1086のいずれかのRNA分子の有効量を細胞に投与する段階を含む、細胞増殖を低下させるための方法。
[本発明1091]
本発明1056〜1086のいずれかのRNA分子の有効量を細胞に投与する段階を含む、細胞においてアポトーシスを誘導するための方法。
[本発明1092]
本発明1056〜1086のいずれかのRNA分子を含む薬学的組成物を患者に投与する段階を含む、患者においてがんを処置するための方法。
[本発明1093]
さらなるがん治療を患者に施す段階をさらに含む、本発明1092の方法。
[本発明1094]
患者が、がんと診断されている、本発明1092の方法。
[本発明1095]
以下を含む、長さが22または23塩基対の二本鎖で平滑末端のRNA分子:
a) i) 5'から3'方向のSEQ ID NO:7と、
ii) 少なくとも1つの修飾された内部ヌクレオチドと
を含む、活性鎖; および
b) 5'末端のヌクレオチドの末端修飾を含む、完全に相補的なパッセンジャー鎖。
[本発明1096]
長さが23塩基対である、本発明1095のRNA分子。
[本発明1097]
活性鎖が、該活性鎖中の位置3、4、11、12、13、14、15、16、17、および/または18に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1095〜1096のRNA分子。
[本発明1098]
活性鎖が、少なくとも2つの修飾された内部ヌクレオチドを含む、本発明1095〜1097のいずれかのRNA分子。
[本発明1099]
活性鎖が、最大で11個の修飾された内部ヌクレオチドを含む、本発明1098のRNA分子。
[本発明1100]
パッセンジャー鎖が少なくとも1つの修飾された内部ヌクレオチドを含む、本発明1095〜1099のいずれかのRNA分子。
[本発明1101]
パッセンジャー鎖が、該パッセンジャー鎖中の位置1、2、3、4、9、10、11、12、13、14、19、21、および/または22に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1100のRNA分子。
[本発明1102]
パッセンジャー鎖が、位置15および/または16に修飾ヌクレオチドを持たない、本発明1095〜1101のいずれかのRNA分子。
[本発明1103]
パッセンジャー鎖がSEQ ID NO:3を含む、本発明1095〜1102のいずれかのRNA分子。
[本発明1104]
パッセンジャー鎖が、該パッセンジャー鎖中の位置1、2、3、5、6、9、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、および/または22に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1103のRNA分子。
[本発明1105]
活性鎖がSEQ ID NO:5を含む、本発明1095〜1102のいずれかのRNA分子。
[本発明1106]
パッセンジャー鎖が、該パッセンジャー鎖中の位置1、2、3、4、7、8、9、10、11、12、13、14、19、21、22、および/または23に修飾ヌクレオチドを含む、本発明1105のRNA分子。
[本発明1107]
活性鎖がSEQ ID NO:9の配列を含む、本発明1095〜1106のいずれかのRNA分子。
[本発明1108]
以下を含む、長さが22または23塩基対の二本鎖で平滑末端のRNA分子:
a) i) 5'から3'方向のSEQ ID NO:9と、
ii) 位置3、4、11、12、13、14、15、16、17、および/または18における修飾ヌクレオチドと
を含む、活性鎖; ならびに
b) 5'末端のヌクレオチドの末端修飾を含む、完全に相補的なパッセンジャー鎖。
本発明の他の目的、特性および利点は、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の態様を示すが、例証としてのみ与えられると理解されるべきである。というのは、本発明の趣旨および範囲内でのさまざまな変更および修正が、この詳細な説明から当業者には明らかになるからである。
Claims (108)
- 以下を含む、長さが22または23塩基対の二本鎖で平滑末端のRNA分子:
a) 5'から3'方向のSEQ ID NO:1を含む活性鎖; ならびに
b) 完全に相補的なパッセンジャー鎖であって、
i) 該パッセンジャー鎖の最初および最後の2つのヌクレオチドにおける修飾ヌクレオチドと、
ii) 5'末端のヌクレオチドの末端修飾と
を含む、該パッセンジャー鎖。 - 長さが23塩基対であり、活性鎖がSEQ ID NO:2を含む、請求項1記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖がSEQ ID NO:4に対する位置1、2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、22、および/または23に修飾ヌクレオチドを含み、該パッセンジャー鎖中のヌクレオチドの総数の半分よりも少ないヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項1記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置i) 1および2ならびに/またはii) 22および23に位置する修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置i) 1および2ならびにii) 22および23に位置する修飾ヌクレオチドを含む、請求項2〜3のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置i) 3および4ならびに/またはii) 19および20に位置する修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置i) 3および4またはii) 19および20に位置する修飾ヌクレオチドを含むが、しかし位置i)およびii)の両方には含まない、請求項6記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置5および6に修飾ヌクレオチドを含む、請求項4〜7のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置9および10に修飾ヌクレオチドを含む、請求項4〜7のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置11および12に修飾ヌクレオチドを含む、請求項4〜7のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置13および14に修飾ヌクレオチドを含む、請求項4〜7のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置17および18に修飾ヌクレオチドを含む、請求項4〜7のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖中の修飾ヌクレオチドの数が4個〜8個である、請求項4記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖中の修飾ヌクレオチドの数が5個〜7個である、請求項13記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖中の修飾ヌクレオチドの数が6個である、請求項14記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置7、8、9、15、および16に位置する修飾ヌクレオチドを持たない、請求項1〜15のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、21、22、および23に修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜16のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、3、4、22、および23に修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜16のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、19、20、22、および23に修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜16のいずれか一項記載のRNA分子。
- 活性鎖が少なくとも2つの修飾ヌクレオチドを含み、該修飾ヌクレオチドが5'末端の最初の2つの位置には存在しない、請求項1〜19のいずれか一項記載のRNA分子。
- 活性鎖が、5'末端の最初の2つの位置において修飾ヌクレオチドを持たない、請求項1〜19のいずれか一項記載のRNA分子。
- 活性鎖が、末端から最初または最後の2つの位置において修飾ヌクレオチドを含まない、請求項1記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置3、4、11、12、13、14、15、16、17、および/または18に修飾ヌクレオチドを持つ、請求項20〜22のいずれか一項記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置15および16に修飾ヌクレオチドを含む、請求項23記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置3および4に修飾ヌクレオチドを含む、請求項23記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置11および12に修飾ヌクレオチドを含む、請求項23記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置11、12、13、および14に修飾ヌクレオチドを含む、請求項23記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置17および18に修飾ヌクレオチドを含む、請求項23記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置11、12、15、および16に修飾ヌクレオチドを含む、請求項23〜28のいずれか一項記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置13、14、17、および18に修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項29記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:2に対する位置3、4、15、および16に修飾ヌクレオチドを含む、請求項23〜28のいずれか一項記載のRNA分子。
- 活性鎖が、いかなる修飾ヌクレオチドも持たない、請求項1〜19のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、5'末端修飾を除きいかなる修飾ヌクレオチドも含まない、請求項29記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、20、21、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、請求項29記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、3、4、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、請求項29記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、19、20、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、請求項29のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、5'末端修飾を除きいかなる修飾ヌクレオチドも含まない、請求項30記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、20、21、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、請求項30記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、3、4、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、請求項30記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、19、20、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、請求項30のいずれか一項記載のRNA分子。[A-ID 206/P-ID 215]
- パッセンジャー鎖が、5'末端修飾を除きいかなる修飾ヌクレオチドも含まない、請求項31記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、21、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、請求項31記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、3、4、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、請求項31記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:4と、SEQ ID NO:4に対する位置1、2、19、20、22、および23における修飾ヌクレオチドとを含む、請求項31のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖の末端修飾が低級アルキルアミン基を含む、請求項1〜44のいずれか一項記載のRNA分子。
- 修飾ヌクレオチドが糖修飾を持つ、請求項1〜45のいずれか一項記載のRNA分子。
- 糖修飾が2'-OMeである、請求項46記載のRNA分子。
- SEQ ID NO:2の配列を持つ活性鎖と、5'末端に修飾ヌクレオチドを有する別個でかつ完全に相補的なパッセンジャー鎖とを含み、両端が平滑末端である、長さが20〜23塩基対の二本鎖RNA分子であって、
該活性鎖が、少なくとも1つの修飾された内部ヌクレオチドを含み、かつ該二本鎖RNA分子が、内部ヌクレオチドのいかなる修飾も欠く二本鎖で平滑末端のRNA分子と比べてより安定である、
該二本鎖RNA分子。 - 請求項1〜48のいずれか一項記載のRNA分子を含む、薬学的組成物。
- 請求項1〜48のいずれか一項記載のRNA分子を細胞に投与する段階を含む、miR-34a活性を細胞に提供するための方法。
- 請求項1〜48のいずれか一項記載のRNA分子の有効量を細胞に投与する段階を含む、細胞増殖を低下させるための方法。
- 請求項1〜48のいずれか一項記載のRNA分子の有効量を細胞に投与する段階を含む、細胞においてアポトーシスを誘導するための方法。
- 請求項1〜48のいずれか一項記載のRNA分子を含む薬学的組成物を患者に投与する段階を含む、患者においてがんを処置するための方法。
- さらなるがん治療を患者に施す段階をさらに含む、請求項54記載の方法。
- 患者が、がんと診断されている、請求項53記載の方法。
- 以下を含む、長さが23または24塩基対の二本鎖で平滑末端のRNA分子:
a) i) 5'から3'方向のSEQ ID NO:5と、
ii) 少なくとも1つの修飾された内部ヌクレオチドと
を含む、活性鎖; および
b) 5'末端のヌクレオチドの末端修飾を含む、完全に相補的なパッセンジャー鎖。 - 長さが23塩基対である、請求項56記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置1 (G)、2 (C)、3 (A)、21 (C)、22 (C)、および/または23 (U)に修飾ヌクレオチドを含む、請求項56記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置i) 1 (A)、2 (A)、および3 (C)ならびに/またはii) 22 (C)および23 (A)のサブセットに位置する修飾ヌクレオチドを含む、請求項56〜58のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置i) 1 (A)、2 (A)、および3 (C)に位置する修飾ヌクレオチドを含む、請求項56〜59のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置ii) 22 (C)および23 (A)に位置する修飾ヌクレオチドを含む、請求項56〜60のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置1 (A)、2 (A)、3 (C)、22 (C)、および23 (A)に位置する修飾ヌクレオチドを含む、請求項59記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置i)またはii)に位置する修飾ヌクレオチドを含むが、しかし位置i)およびii)の両方には含まない、請求項59記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置4 (A)、7 (A)、8 (G)、9 (C)、10 (U)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、19 (U)、および/または21 (C)に位置する修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項56〜63のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置5 (U)、6 (C)、15 (A)、および/または16 (C)に位置する修飾ヌクレオチドを持たない、請求項56のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖中の修飾ヌクレオチドの数が2個〜8個である、請求項56のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖中の修飾ヌクレオチドの数が3個〜5個である、請求項66記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置1 (A)、2 (A)、3 (C)、17 (A)、18 (C)、21 (C)、22 (C)、および23 (A)に修飾ヌクレオチドを含む、請求項56のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置1 (A)、2 (A)、3 (C)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、21 (C)、22 (C)、および23 (A)に修飾ヌクレオチドを含む、請求項56のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、SEQ ID NO:6に対する位置1 (A)、2 (A)、3 (C)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、17 (A)、18 (C)、21 (C)、22 (C)、および23 (A)に修飾ヌクレオチドを含む、請求項56のいずれか一項記載のRNA分子。
- 活性鎖が少なくとも2つの修飾ヌクレオチドを含み、該修飾ヌクレオチドが5'末端の最初の2つの位置には存在しない、請求項56〜70のいずれか一項記載のRNA分子。
- 活性鎖が、5'末端の最初の2つの位置において修飾ヌクレオチドを持たない、請求項56〜70のいずれか一項記載のRNA分子。
- 活性鎖が、末端から最初または最後の2つの位置において修飾ヌクレオチドを含まない、請求項56記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置3 (G)、4 (C)、11 (G)、12 (U)、13 (A)、14 (G)、15 (C)、16 (C)、17 (U)、および/または18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む、請求項71〜73のいずれか一項記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置11 (G)および12 (U)に修飾ヌクレオチドを含む、請求項74記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置17 (U)および18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む、請求項74記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置11 (G)、12 (U)、17 (U)、および18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む、請求項74記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置3 (G)、4 (C)、13 (A)、14 (G)、15 (C)、および/または16 (C)に修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項77記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、いかなる修飾ヌクレオチドも含まない、請求項74〜78のいずれか一項記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置11 (G)、12 (U)、17 (U)、および18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む、請求項68記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置11 (G)、12 (U)、17 (U)、および18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む、請求項69記載のRNA分子。
- 活性鎖が、SEQ ID NO:5に対する位置11 (G)、12 (U)、17 (U)、および18 (G)に修飾ヌクレオチドを含む、請求項70のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖の末端修飾が低級アルキルアミン基を含む、請求項56〜82のいずれか一項記載のRNA分子。
- 修飾ヌクレオチドが修飾糖を持つ、請求項56〜83のいずれか一項記載のRNA分子。
- 糖修飾が2'-OMeである、請求項84記載のRNA分子。
- 以下を含む、長さが23または24塩基対の二本鎖で平滑末端のRNA分子:
a) i) 5'から3'方向のSEQ ID NO:5と、
ii) 少なくとも1つの修飾された内部ヌクレオチドと
を含む、活性鎖; ならびに
b) 5'末端のヌクレオチドの末端修飾と、SEQ ID NO:6に対する位置1 (G)、2 (C)、3 (A)、21 (C)、22 (C)および/または23 (U)における少なくとも1つの糖修飾とを含む、完全に相補的なパッセンジャー鎖。 - 以下を含む、長さが23または24塩基対の二本鎖で平滑末端のRNA分子:
a) 5'から3'方向のSEQ ID NO:5の少なくとも塩基1〜23位を含む活性鎖; ならびに
b) i) 5'末端のヌクレオチドの末端修飾と、
ii) 最初の3つまたは最後の3つのヌクレオチドにおける糖修飾と、
iii) SEQ ID NO:6に対する位置11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、17 (A)、および/または18 (C)のうちの1つまたは複数におけるヌクレオチドの糖修飾と
を含む、完全に相補的なパッセンジャー鎖。 - 請求項56〜87のいずれか一項記載のRNA分子を含む、薬学的組成物。
- 請求項56〜86のいずれか一項記載のRNA分子を細胞に投与する段階を含む、miR-34c活性を細胞に提供するための方法。
- 請求項56〜86のいずれか一項記載のRNA分子の有効量を細胞に投与する段階を含む、細胞増殖を低下させるための方法。
- 請求項56〜86のいずれか一項記載のRNA分子の有効量を細胞に投与する段階を含む、細胞においてアポトーシスを誘導するための方法。
- 請求項56〜86のいずれか一項記載のRNA分子を含む薬学的組成物を患者に投与する段階を含む、患者においてがんを処置するための方法。
- さらなるがん治療を患者に施す段階をさらに含む、請求項92記載の方法。
- 患者が、がんと診断されている、請求項92記載の方法。
- 以下を含む、長さが22または23塩基対の二本鎖で平滑末端のRNA分子:
a) i) 5'から3'方向のSEQ ID NO:7と、
ii) 少なくとも1つの修飾された内部ヌクレオチドと
を含む、活性鎖; および
b) 5'末端のヌクレオチドの末端修飾を含む、完全に相補的なパッセンジャー鎖。 - 長さが23塩基対である、請求項95記載のRNA分子。
- 活性鎖が、該活性鎖中の位置3、4、11、12、13、14、15、16、17、および/または18に修飾ヌクレオチドを含む、請求項95〜96記載のRNA分子。
- 活性鎖が、少なくとも2つの修飾された内部ヌクレオチドを含む、請求項95〜97のいずれか一項記載のRNA分子。
- 活性鎖が、最大で11個の修飾された内部ヌクレオチドを含む、請求項98記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が少なくとも1つの修飾された内部ヌクレオチドを含む、請求項95〜99のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、該パッセンジャー鎖中の位置1、2、3、4、9、10、11、12、13、14、19、21、および/または22に修飾ヌクレオチドを含む、請求項100記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、位置15および/または16に修飾ヌクレオチドを持たない、請求項95〜101のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖がSEQ ID NO:3を含む、請求項95〜102のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、該パッセンジャー鎖中の位置1、2、3、5、6、9、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、および/または22に修飾ヌクレオチドを含む、請求項103記載のRNA分子。
- 活性鎖がSEQ ID NO:5を含む、請求項95〜102のいずれか一項記載のRNA分子。
- パッセンジャー鎖が、該パッセンジャー鎖中の位置1、2、3、4、7、8、9、10、11、12、13、14、19、21、22、および/または23に修飾ヌクレオチドを含む、請求項105記載のRNA分子。
- 活性鎖がSEQ ID NO:9の配列を含む、請求項95〜106のいずれか一項記載のRNA分子。
- 以下を含む、長さが22または23塩基対の二本鎖で平滑末端のRNA分子:
a) i) 5'から3'方向のSEQ ID NO:9と、
ii) 位置3、4、11、12、13、14、15、16、17、および/または18における修飾ヌクレオチドと
を含む、活性鎖; ならびに
b) 5'末端のヌクレオチドの末端修飾を含む、完全に相補的なパッセンジャー鎖。
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