JP2007520222A - グルココルチコイドレセプター発現の調節 - Google Patents
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Abstract
Description
グルココルチコイドは同定された第一のステロイドホルモンの一つであって、糖新生の刺激、グルコースの取り込みの減少および末梢組織での利用、グリコーゲンの沈着の増大、免疫および炎症反応の抑制、サイトカイン合成の阻害ならびに種々の発生における事象の促進が挙げられる多様な生理的機能の原因である。グルココルチコイドはまた、ストレス応答に特に重要である。ストレス誘導性のグルココルチコイド合成および放出の増加により、他の反応の中でも消化器官の作業量の増大、炎症性メディエーターの阻害、サイトカイン合成の阻害、およびグルコース産生の増大がもたらされる(Karin, Cell, 1998, 93,487-490)。
本発明は、グルココルチコイドレセプターをコードする核酸を標的とし、かつ、グルココルチコイドレセプター発現を調節するアンチセンス化合物、特に核酸および核酸様オリゴマーに関する。本発明の化合物を含む医薬および他の組成物もまた提供される。さらに、グルココルチコイドレセプターの調節剤のスクリーニング方法、および細胞、組織または動物においてグルココルチコイドレセプター発現を調節する方法であって、前記細胞、組織または動物を、一つ以上の本発明の化合物または組成物と接触させることを含む方法も提供される。グルココルチコイドレセプター発現に関連する疾患または症状を有する疑いがあるか、または罹患し易い動物、特にヒトの処置方法もまた本明細書中に記載する。かかる方法は、治療的または予防的有効量の一つ以上の本発明の化合物または組成物を、処置を必要とする人に投与することを含む。
A. 発明の概観
本発明は、アンチセンス化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチド、およびグルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子の機能または作用を調節するのに用いるために、同様の種を用いる。これは、グルココルチコイドレセプターをコードする一つ以上の核酸分子と、特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにより達成される。本明細書中で用いる用語「標的核酸」および「グルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子」は、グルココルチコイドレセプターをコードするDNA、かかるDNAから転写されたRNA(プレmRNAおよびmRNAまたはその部分を含む)、およびかかるRNAから誘導されたcDNAを含めて簡便に用いられている。本発明の化合物のその標的核酸とのハイブリダイゼーションは、一般的に「アンチセンス」と呼ばれる。結果として、本発明のいくつかの好ましい態様の実施に含まれると考えられる好ましいメカニズムを、本明細書中で「アンチセンス阻害」という。このようなアンチセンス阻害は、代表的には、オリゴヌクレオチド鎖またはセグメントの水素結合に基づくハイブリダイゼーションに基づき、その結果、少なくとも一つの鎖またはセグメントは、切断されるか、分解されるか、または作動不可能になる。これに関し、このようなアンチセンス阻害のための特異的核酸分子およびその機能を標的とすることが現在では好ましい。
本発明によれば、アンチセンス化合物には、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列(EGS)オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー(alternate splicer)、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズし、その発現を調節する、他のオリゴマー化合物が挙げられる。従って、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状またはヘアピンオリゴマー化合物の形態で導入され得、かつ、内部または末端突出物またはループのような構造的要素を含み得る。本発明の化合物は、一旦システム内に導入されると、一つ以上の酵素または構成タンパク質の作用を惹起して、標的核酸の修飾を起こし得る。
アンチセンス化合物の特定の核酸分子に対する「ターゲッティング」は、本発明の文脈において複数工程のプロセスであり得る。該プロセスは、通常、機能を調節すべき標的核酸を同定することから始まる。この標的核酸は、例えば、その発現が特定の障害または疾患状態に関連する細胞遺伝子(または遺伝子から転写されたmRNA)、あるいは感染性因子由来の核酸分子であり得る。本発明において、標的核酸はグルココルチコイドレセプターをコードする。
さらなる態様では、本明細書中で同定される「好ましい標的セグメント」は、グルココルチコイドレセプター発現を調節するさらなる化合物のスクリーニングにおいて用いられ得る。「調節剤」は、グルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子の発現を減少または増加し、好ましい標的セグメントに相補的な少なくとも8核酸塩基部分を含む化合物である。スクリーニング方法は、グルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子の好ましい標的セグメントを、一つ以上の候補調節剤と接触させる工程、およびグルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子の発現を減少または増加する一つ以上の候補の調節剤を選択する工程を含む。一旦、候補の調節剤または調節剤がグルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子の発現を調節(例えば、減少するかまたは増加するかのいずれか)可能であることが示されると、調節剤は、グルココルチコイドレセプターの機能のさらなる調査的研究に、あるいは本発明に従って研究薬、診断薬または治療剤として用いられ得る。
本発明のアンチセンス化合物は、診断、治療、および予防のために、ならびに研究試薬、およびキットとして利用され得る。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、優れた特異性で遺伝子発現を阻害し得るが、特定の遺伝子の機能を解明するために、または生物学的経路の種々の要素の機能を識別するために、当業者にしばしば用いられる。
当該分野で公知であるように、ヌクレオシドは塩基と糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常は、時々「核酸塩基」または単に「塩基」と呼ばれるヘテロ環塩基である。かかるヘテロ環塩基の2つの最も一般的な種類は、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノース糖を含むかかるヌクレオシドは、リン酸基が、該糖の2’、3’、または5’ヒドロキシル部のどちらかに結合され得る。オリゴヌクレオチドの形成においては、該リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させ、線状高分子化合物を形成する。次に、かかる線状高分子化合物の各末端がさらに結合し、環状化合物を形成し得るが、線状化合物が一般に好ましい。さらに、線状化合物は、内部核酸塩基相補性を有し得るため、完全に、または部分的に、二本鎖化合物を生じるように、折りたたまれ得る。オリゴヌクレオチド内において、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成するものと一般に称されている。RNAおよびDNAの通常の結合または主鎖は、3’から5’へのリン酸ジエステル結合である。
本発明において好ましいアンチセンス化合物の具体的な例としては、修飾された主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書中に定義される場合、修飾された主鎖を有するオリゴヌクレオチドとしては、主鎖中にリン原子を保持するもの、および主鎖中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、かつ当該分野で時々引用されるように、これらのヌクレオシド間主鎖にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。
4,469,863号; 4,476,301号; 5,023,243号; 5,177,196号; 5,188,897号;
5,264,423号; 5,276,019号; 5,278,302号; 5,286,717号; 5,321,131号;
5,399,676号; 5,405,939号; 5,453,496号; 5,455,233号; 5,466,677号;
5,476,925号; 5,519,126号; 5,536,821号; 5,541,306号; 5,550,111号;
5,563,253号; 5,571,799号; 5,587,361号; 5,194,599号; 5,565,555号;
5,527,899号; 5,721,218号; 5,672,697号および5,625,050号が挙げられ、いくつかは一般に本願の所有するところであり、その各々が本明細書中に参照によって援用される。
5,185,444号; 5,214,134号; 5,216,141号; 5,235,033号; 5,264,562号;
5,264,564号; 5,405,938号; 5,434,257号; 5,466,677号; 5,470,967号;
5,489,677号; 5,541,307号; 5,561,225号; 5,596,086号; 5,602,240号;
5,610,289号; 5,602,240号; 5,608,046号; 5,610,289号; 5,618,704号;
5,623,070号; 5,663,312号; 5,633,360号; 5,677,437号; 5,792,608号;
5,646,269号および5,677,439号が挙げられ、いくつかは一般に本願の所有するところであり、その各々が本明細書中に参照によって援用される。
他の好ましいアンチセンス化合物、例えばオリゴヌクレオチド模倣剤においては、該ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方(すなわち主鎖)が、新規な基により置換される。該核酸塩基単位は、適当な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されてきた、あるかかる化合物、オリゴヌクレオチド模倣剤は、ペプチド核酸(PNA)と称される。PNA化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖主鎖は、特にアミノエチルグリシン主鎖であるアミド含有主鎖で置換される。該核酸塩基は、保持され、該主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に、直接、または間接的に、結合する。PNA化合物の調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第:5,539,082号; 5,714,331号および5,719,262号が挙げられ、それぞれは参照として本明細書に援用される。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsenら, Science, 1991, 254, 1497-1500に見出し得る。
修飾されたアンチセンス化合物はまた、一つ以上の置換された糖部分を含有し得る。アンチセンス化合物、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましく、2’位で、次のもの:OH;F;O-、S-、もしくはN-アルキル;O-、S-、もしくはN-アルケニル;O-、S-もしくはN-アルキニル;またはO-アルキル-O-アルキルの一つを含み、ここでアルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換された、または置換されていないC1からC10のアルキル、またはC2からC10のアルケニルおよびアルキニルであり得る。O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON((CH2)nCH3)2が特に好ましく、ここで、nおよびmは、1から約10である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2’位に次のもの:C1からC10の低級アルキル、置換された低級の、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリル、もしくはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を向上するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を向上するための基、および類似の性質を有する他の置換基、の一つを含む。好ましい修飾としては、2’-メトキシエトキシ(2’-O-(2-メトキシエチル)または2’-MOEとしてもまた公知の2’-O-CH2CH2OCH3)(Martinら, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504)すなわち、アルコキシアルコキシ基、が挙げられる。さらに好ましい修飾としては、本明細書中以下の実施例に記載されるように、2’-DMAOEとしてもまた公知の2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、O(CH2)2ON(CH3)2基、およびまた本明細書中以下の実施例に記載されるように、(当該分野でまた2’-O-ジメチル-アミノ-エトキシ-エチルまたは2’-DMAEOEとして公知の)2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ、すなわち、2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2が挙げられる。
5,319,080号; 5,359,044号; 5,393,878号; 5,446,137号; 5,466,786号;
5,514,785号; 5,519,134号; 5,567,811号; 5,576,427号; 5,591,722号;
5,597,909号; 5,610,300号; 5,627,053号; 5,639,873号; 5,646,265号;
5,658,873号; 5,670,633号; 5,792,747号;および5,700,920号が挙げられ、いくつかは本出願に共通して所有され、並びにそれぞれはその全体の中で参照として本明細書に援用される。
アンチセンス化合物はまた、核酸塩基(当該分野でヘテロ環式塩基、または単に「塩基」としばしば称される)修飾または置換を含み得る。本明細書中で使用される場合、「非修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基であるアデニン(A)及びグアニン(G)、ならびにピリミジン塩基であるチミン(T)、シトシン(C)及びウラシル(U)が挙げられる。修飾された核酸塩基としては、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及び他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニル(-C≡C-CH3)ウラシル及びシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル(偽ウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル、及び他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン及び7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン及び7-デアザアデニン、及び3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンなどの他の合成、及び天然核酸塩基が挙げられる。さらなる修飾された核酸塩基としては、フェノキサジンシチジン(1H-ピリミド(5,4-b)(1,4)ベンゾキサジン-2(3H)-オン)、フェノチアジンシチジン(1H-ピリミド(5,4-b)(1,4)ベンゾチアジン-2(3H)-オン)、置換されたフェノキサジンシチジン(例えば、9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド(5,4-b)(1,4)ベンゾキサジン-2(3H)-オン)などのGクランプ、カルバゾールシチジン(2H-ピリミド(4,5-b)インドール-2-オン)、ピリドインドールシチジン(H-ピリド(3’,2’:4,5)ピロロ(2,3-d)ピリミジン-2-オン)などの三環式ピリミジンが挙げられる。修飾された核酸塩基としてはまた、該プリンまたはピリミジン塩基が、他のヘテロ環、例えば7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジン、及び2-ピリドンで置換されたものが挙げられ得る。さらなる核酸塩基としては、米国特許第3,687,808号に開示されたもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 858-859ページ, Kroschwitz, J.I., 編John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englischら, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613により開示されたもの、及びSanghvi, Y.S., 15章, Antisense Research and Applications, 289-302ページ, Crooke, S.T.及びLebleu, B., 編, CRC Press, 1993により開示されたものが挙げられる。かかる核酸塩基のいくつかは、本発明の化合物の結合親和性を増大させるのに、特に有用である。これらとしては、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、及び5-プロピニルシトシンを含む5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびにN-2、N-6、及びO-6置換プリンが挙げられる。5-メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を0.6〜1.2℃増大させることが示され、より詳しくは2’-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合、現在好ましい塩基置換である。
米国特許第:4,845,205号; 5,130,302号; 5,134,066号;5,175,273号; 5,367,066号; 5,432,272号; 5,457,187号; 5,459,255号;5,484,908号; 5,502,177号; 5,525,711号; 5,552,540号; 5,587,469号;5,594,121号, 5,596,091号; 5,614,617号; 5,645,985号; 5,830,653号;5,763,588号; 6,005,096号;及び5,681,941号(いくつかは本出願に共通して所有され、それぞれは参照として本明細書に援用される)、及び米国特許第5,750,692号(本出願に共通して所有され、また参照として本明細書に援用される)が挙げられる。
本発明のアンチセンス化合物の別の修飾としては、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを高める一つ以上の部分または結合体をアンチセンス化合物に化学的に連結することが挙げられる。かかる部分または結合体としては、第一級または二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した結合体群が挙げられ得る。本発明の結合体群としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質を高める群、及びオリゴマーの薬動力学的性質を高める群が挙げられる。典型的な結合体群としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料が挙げられる。薬力学的性質を高める群としては、本発明の関係においては、取り込みを向上させ、分解耐性を高め、及び/または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する群が挙げられる。薬動力学的性質を高める群としては、本発明の関係においては、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝、または排出を向上させる群が挙げられる。代表的な結合体群は、1992年10月23日に出願された国際特許出願第PCT/US92/09196号、及び米国特許第6,287,860号に開示されて、全開示は参照として本明細書に援用される。結合体部分としては、限定されないが、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオール、もしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール、もしくはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート、ポリアミン、もしくはポリエチレングリコール鎖、または、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、または、オクタデシルアミン、もしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分などの脂質部分が挙げられる。本発明のアンチセンス化合物はまた、活性のある製剤原料、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、ホリニン酸、ベンゾサイアジアザイド、クロロサイアザイド、ジアゼピン、インドメチシン(indomethicin)、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌物質、または抗生物質に結合され得る。オリゴヌクレオチド−薬物結合体及びその調製法は、米国特許出願第09/334,130号(1999年6月15日に出願)に記載され、その全体の中で本明細書に参照として援用される。
所定の化合物のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際には前記修飾の一つ以上が、単一の化合物に、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにさえ、組み込まれ得る。
キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従って、アンチセンス化合物の形態である。かかるオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解への増大した耐性、増大した細胞取り込み、増大した安定性、及び/または標的核酸に対する増大した結合親和性をオリゴヌクレオチドに付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾された、少なくとも一つの領域を典型的には含有する。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断し得る酵素の基質としてはたらき得る。例として、RNアーゼ(RNAse) Hは、RNA:DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。RNアーゼ Hの活性化は、したがって、RNA標的の切断を生じ、その結果オリゴヌクレオチドに媒介された遺伝子発現の阻害の有効性を大いに高める。RNA:RNAハイブリッドの切断は、同様に、細胞及びウイルスのRNAの両方を切断するRNアーゼL(RNAseL)などのエンドリボヌクレアーゼの作用を通じて達成され得る。RNA標的の切断は、通常通り、ゲル電気泳動、及び必要に応じて、当該分野で公知の、関連する核酸ハイブリダイゼーション法によって、検出され得る。
本発明の化合物はまた、取り込み、分布及び/または吸収を助けるために、混合され、カプセルに入れられ、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所、もしくは他の製剤などの他の分子、分子構造もしくは化合物の混合物と結合され、または他の場合には会合され得る。かかる取り込み、分布及び/または吸収を助ける製剤の調製法を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第:5,108,921号;5,354,844号; 5,416,016号; 5,459,127号; 5,521,291号; 5,543,158号;5,547,932号; 5,583,020号; 5,591,721号; 4,426,330号; 4,534,899号;5,013,556号; 5,108,921号; 5,213,804号; 5,227,170号; 5,264,221号;5,356,633号; 5,395,619号; 5,416,016号; 5,417,978号; 5,462,854号;5,469,854号; 5,512,295号; 5,527,528号; 5,534,259号; 5,543,152号;5,556,948号; 5,580,575号; 及び5,595,756号が挙げられ、それぞれは参照として本明細書に援用される。
治療用組成物の製剤化およびその引き続く投与(administration)(投与(dosing))は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。投与は、数日〜数ヶ月続く治療の過程内で、または治癒が達成されたもしくは疾患状態の減少が達成されるまで、治療すべき疾患状態の重篤度および反応性に依存する。最適な投与スケジュールは、患者の身体内での薬物の蓄積を測定することにより計算され得る。当業者は、最適な投薬量、投与方法および頻度を容易に決定し得る。最適な投薬量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対効能に依存して変動し得、一般的には、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて効果的であることが見出されているEC50に基づいて評価され得る。一般的に、投薬量は、体重1kg当たり0.0001μg〜100 gであり、1日毎に、1週間毎に、1ヶ月毎にもしくは1年毎に1回以上、または2〜20年毎に1回でも投与され得る。当業者は、投与の頻度を、体液または組織中での測定された薬物の滞留時間および濃度に基づいて容易に評価し得る。首尾良い治療の後、患者に、疾患状態の再発を予防するための維持療法を受けさせることが望ましくあり得るが、この場合、オリゴヌクレオチドを、体重1kg当たり0.0001μg〜100 gの範囲内で、1日毎に1回以上〜20年毎に1回、維持投薬量で投与する。
アミダイトおよびその中間体を含む以下の化合物は、米国特許第6,426,220号およびPCT公開第WO 02/36743号に記載のように調製された; 5-メチル dC アミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-チミジン中間体、5-メチル-dCアミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシ-5-メチルシチジン中間体、5-メチルdCアミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジンの最後から2番目の中間体、(5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-イル)-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト(5-メチルdCアミダイト)、2'-フルオロデオキシアデノシン、2'-フルオロデオキシグアノシン、2'-フルオロウリジン、2'-フルオロデオキシシチジン、2'-O-(2-メトキシエチル)修飾アミダイト、2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン中間体、5'-O-DMT-2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジンの最後から2番目の中間体、(5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-O-イル)-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト(MOE Tアミダイト)、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルシチジン中間体、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(2-メトキシエチル)-N4-ベンゾイル-5-メチル-シチジンの最後から2番目の中間体、(5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-イル)-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト(MOE 5-Me-Cアミダイト)、(5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-N6-ベンゾイルアデノシン-3'-O-イル)-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト(MOE Aアミダイト)、(5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-N4-イソブチリルグアノシン-3'-O-イル)-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト(MOE Gアミダイト)、2'-O-(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトおよび2'-O-(ジメチルアミノ-オキシエチル)ヌクレオシドアミダイト、2'-(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-(2-ヒドロキシエチル)-5-メチルウリジン、2'-O-((2-フタルイミドキシ)エチル)-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-((2-ホルムアドキシイミノオキシ)エチル)-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-(N,Nジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-((2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト)、2'-(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト、N2-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-O-(2-エチルアセチル)-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)グアノシン-3'-((2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト)、2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(2'-DMAEOE)ヌクレオシドアミダイト、2'-O-(2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル)-5-メチルウリジン、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)-エチル))-5-メチルウリジンおよび5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)-エチル))-5-メチルウリジン-3'-O-(シアノエチル-N,N-ジイソプロピル)ホスホルアミダイト。
本発明に従って用いられるアンチセンス化合物は、固相合成の周知の技術により、簡便かつ決まりきった手順で調製され得る。かかる合成のための装置は、例えば、Applied Biosystems(Foster City, CA)を含むいくつかの販売業社により販売されている。当該分野で公知のかかる合成の任意の他の手段が、さらにまたは代替的に使用され得る。同様の技術を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体等のオリゴヌクレオチドを調製することが周知である。
未置換および置換ホスホジエステル(P=O)オリゴヌクレオチドは、ヨウ素で酸化する標準的なホスホルアミダイト化学を用いる自動化DNA合成機 (Applied Biosystemsモデル394)で合成される。
MMI結合オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、MDH結合オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、およびアミド-3結合オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、およびアミド-4結合オリゴヌクレオシドとしても特定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、ならびに、例えば、交互にMMIおよびP=OまたはP=S結合を有する混合骨格化合物は、米国特許第5,378,825号、同第5,386,023号、同第5,489,677号、同第5,602,240号および同第5,610,289号に記載のように調製され、全ては参照として本明細書に援用される。
一般的に、RNA合成化学は、戦略的な中間体反応における種々の保護基の選択的組み込みに基づく。当業者は、有機合成における保護基の使用を理解するであろうが、有用な保護基の種類には、シリルエーテルが含まれる。特定のかさ高いシリルエーテルは、2'-ヒドロキシル上の酸に不安定なオルトエステル保護基と組み合わせて、5'-ヒドロキシルを保護するのに用いられる。次いで、この保護基の組は、標準的な固相合成技術により使用される。全ての他の合成工程後、酸に不安定なオルトエステル保護基を最後に除去することが重要である。さらに、必要に応じて、合成の間に早期にシリル保護基を使用することにより、2'-ヒドロキシルの望まない脱保護が起こることなく、容易な除去が確実になる。
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型のものであり得る。これらには、結合ヌクレオシドの「ギャップ」部分が結合ヌクレオシドの5'と3'の「ウイング」部分の間に位置する第1の型、および「ギャップ」部分がオリゴマー化合物の3'または5'末端のいずれかに位置する第2の「開放末端」型が挙げられる。第1の型のオリゴヌクレオチドはまた、「ギャップマー(gapmer)」またはギャップトオリゴヌクレオチドとしても当該分野で公知である。第2の型のオリゴヌクレオチドは、「ヘミマー(hemimer)」または「ウイングマー(wingmer)」としても当該分野で公知である。
2'-O-アルキルホスホロチオエートおよび2'-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチド部分を有するキメラオリゴヌクレオチドは、上述のApplied Biosystems自動化DNA合成機モデル394を用いて合成される。オリゴヌクレオチドは、自動化合成機ならびにDNA部分用の2'-デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホスホルアミダイトおよび5'と3'ウイング用の5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホルアミダイトを使用して合成される。標準的な合成サイクルを、5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホルアミダイト用に反応時間を長くしたカップリング工程を導入することにより変更する。完全に保護したオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、濃縮アンモニア(NH40H)中で12〜16時間、55℃で脱保護する。次いで、脱保護オリゴを、適切な方法(沈殿、カラムクロマトグラフィー、真空中での容積減少、ならびにキャピラリー電気泳動および質量分析法による収率および純度の分光学的分析)で回収する。
(2'-O-(2-メトキシエチル))--(2'-デオキシ)--(-2'-O-(メトキシエチル))キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルアミダイトを2'-O-(メトキシエチル)アミダイトに置換し、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについて上述した手順により調製された。
(2'-O-(2-メトキシエチル ホスホジエステル)--(2'-デオキシホスホロチオエート)--(2'-O-(2-メトキシエチル) ホスホジエステル)キメラオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについて上述した手順により、2'-O-メチル アミダイトを2'-O-(メトキシエチル)アミダイトに置換し、ヨウ素で酸化してキメラ構造のウイング部内でホスホジエステルヌクレオチド間結合を形成し、3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキシド(Beaucage試薬)を利用して硫化することによりセンターギャップにホスホロチオエートヌクレオチド間結合を形成することによって、調製される。
本発明によれば、一連の核酸二本鎖は、本発明のアンチセンス化合物およびその相補物を含み、グルココルチコイドレセプターを標的とするように設計され得る。二本鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、表1のオリゴヌクレオチドの少なくとも8核酸塩基部分を含む。鎖の末端は、1つ以上の天然または修飾された核酸塩基の付加により修飾されて、突出を形成し得る。次いで、dsRNAのセンス鎖を、アンチセンス鎖の相補物として設計および合成するが、これもまたいずれかの末端に修飾または付加を含み得る。例えば、ある態様において、dsRNA二本鎖の鎖は両方とも、中央の核酸塩基に対して相補的であり、各々が一方または両方の末端に突出を有するであろう。
制御された多孔質ガラス固相支持体からの切断および濃水酸化アンモニウム中で、55℃で12-16時間脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを、3容積未満のエタノールを用いて、1 M NH40Acから沈殿によって回収する。合成したオリゴヌクレオチドを、電子スプレー質量分析法(分子量測定)およびキャピラリーゲル電気泳動により分析し、全長の少なくとも70%の物質であると決定した。この合成で得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量を、-16 amu産物(+/- 32+/-48)に対する正確な分子量の比により測定した。いくつかの研究については、オリゴヌクレオチドを、Chiangら, J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171に記載のように、HPLCにより精製した。HPLCで精製した物質について得られた結果は、HPLCで精製しなかった物質について得られた結果と同様であった。
オリゴヌクレオチドは、固相P(III)ホスホルアミダイト化学により、96ウェル形式で同時に96配列を集めることができる自動化合成機で合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、水性ヨウ素での酸化により得た。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中の3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン 1,1 ジオキシド(Beaucage 試薬)を利用した硫化により生じさせた。標準的な塩基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトは、商業販売業者(例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CAまたはPharmacia, Piscataway, NJ)から購入した。非標準的ヌクレオシドは、標準的なまたは特許された方法のように合成される。これらは、塩基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトとして利用される。
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈およびUV吸収スペクトル測定により評価した。個々の産物の全長完全性は、96ウェル形式(Beckman P/ACETMMDQ)のそれぞれにおけるキャピラリー電気泳動(CE)により評価したか、または個々に調製した試料については、市販のCE装置(例えば、Beckman P/ACETM5000, ABI 270)により評価した。基本および骨格の組成を、電子スプレー質量分析法を利用した化合物の質量分析により確認した。全てのアッセイ試験プレートを、単チャネルまたは多チャネルロボットピペッターを用いて、マスタープレートから希釈した。プレートは、プレート上の少なくとも85%の化合物が全長の少なくとも85%であった場合、許容可能であると判定した。
アンチセンス化合物が標的核酸の発現に与える影響は、標的核酸が測定可能なレベルで存在する限り、多様な細胞型のいずれかで試験することができる。これは、例えば、PCRまたはノーザンブロット分析を用いて、常套的に測定することができる。以下の細胞型は、例示の目的のために提供されるが、標的が選択された細胞型中で発現する限り、他の細胞型も常套的に用いることができる。これは、例えば、ノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはRT-PCRのような、当該分野で常套的な方法により容易に測定することができる。
ヒト移行細胞膀胱癌細胞株T-24は、American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA)から入手した。T-24細胞を、10%子ウシ胎児血清(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)、ペニシリン(1mL当たり100単位)およびストレプトマイシン(1mL当たり100μg)(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)を添加した完全McCoy5A基礎培地(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)中で常套的に培養した。細胞を、90%コンフルエンスに達したときにトリプシン処理および希釈により常套的に継代培養した。RT-PCR分析で用いるため、細胞を、96ウェルプレート(Falcon-Primaria #353872)に、7000細胞/ウェルの密度で播種した。
ヒト肺癌細胞株A549は、American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA)から入手した。A549細胞を、10%子ウシ胎児血清(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)、ペニシリン(1mL当たり100単位)およびストレプトマイシン(1mL当たり100μg)(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)を添加したDMEM基礎培地(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)中で常套的に培養した。細胞を、90%コンフルエンスに達したときにトリプシン処理および希釈により常套的に継代培養した。
ヒト新生児皮膚線維芽細胞(NHDF)は、Clonetics Corporation (Walkersville, MD)から入手した。NHDFは、供給業者により推奨されるように添加された線維芽細胞増殖培地(Clonetics Corporation, Walkersville, MD)中で常套的に維持した。細胞を、供給業者により推奨されるように、10回の継代培養まで維持した。
ヒト胚ケラチノサイト(HEK)は、Clonetics Corporation (Walkersville, MD)から入手した。HEKは、供給業者により推奨されるように処方されたケラチノサイト増殖培地 (Clonetics Corporation, Walkersville, MD)中で常套的に維持した。細胞を、供給業者により推奨されるように、10回の継代培養まで常套的に維持した。
ヒト胚芽細胞腫細胞株HepG2は、American Type Culture Collection (Manassas, VA)から入手した。 HepG2細胞を、10%子ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、及び1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco/Life Technologies,Gaithersburg,MD)を添加したイーグルMEM中で常套的に培養した。細胞を、90%コンフルエンスに達したときにトリプシン処理および希釈により常套的に継代培養した。細胞を、RT-PCR分析での使用のために、96ウェルプレート(Falcon-Primaria #3872)に、7,000細胞/ウェルの密度で播種した。
マウス脳内皮細胞株b.ENDは、Max Plank Institute(Bad Nauheim, Germany)のWerner Risau博士から入手した。b.END細胞を、10%子ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を添加した高グルコースDMEM(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)で常套的に培養した。細胞を、9
0%コンフルエンスに達したときに、トリプシン処理および希釈により常套的に継代培養した。RT-PCR分析で用いるため、細胞を、96ウェルプレート(Falcon-Primaria #3872)に、3000細胞/ウェルの密度で播種した。
正常ラット腎臓(NRK)細胞は、American Type Culture Collection (Manassas, VA)から入手した。 それらを、37℃、90%空気−10%CO2の加湿雰因気下、10%子ウシ胎児血清(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)、100ug/mlペニシリンおよび100ug/mlストレプトマイシン及び0.1mM非必須アミノ酸(すべてInvitrogen Life Technologies, Carlsbad, CAからのサプリメント)を添加した最小必須培地(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)で連続単層培養として成長させた。細胞を、85%-90%コンフルエンスに達したときにトリプシン処理および希釈により常套的に継代培養した。細胞を、アンチセンスオリゴヌクレオチドトランスフェクションでの使用のために、96ウェルプレート(Falcon-Primaria #353872, BD Biosciences, Bedford, MA)に、6,000細胞/ウェルの密度で播種した。
一次マウス肝細胞はCharles River Labsから入手されるCD-1マウスから調整される。一次マウス肝細胞を10%子ウシ胎児血清(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)、250nMデキサメタゾン(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)、10nMウシインシュリン(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)を添加した肝細胞付着培地(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)で常套的に培養した。細胞を、本発明のオリゴマー化合物での処理のために、96ウェルプレート(Falcon-Primaria #353872, BD Biosciences, Bedford, MA)に、4,000-6,000細胞/ウェルの密度で播種した。
細胞が65-75%コンフルエンシーに達したとき、それらをオリゴヌクレオチドで処理する。96ウェルプレートで増殖した細胞について、ウェルを、100μLのOPTI-MEMTM-1血清使用量低減培地(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)で1回洗浄し、次いで、3.75μg/mLのLIPOFECTINTM(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)および所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含む130μLのOPTI-MEMTM-1で処理した。細胞を処理し、データを3連で得た。37℃での4-7時間の処理後、培地を新鮮な培地と交換した。オリゴヌクレオチド処理の16-24時間後、細胞を採集した。
(
、配列番号:1)、
またはヒトJun-N末端キナーゼ-2(JNK2)に標的化したISIS 18078
(
、配列番号:2)のいずれかから選択される。両方の対照は、ホスホロチオエート骨格を有する2'-O-メトキシエチルギャップマー(太字で示す2'-O-メトキシエチル)である。マウスまたはラット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスおよびラットc-rafの両方に標的化したISIS 15770、
、配列番号:3、ホスホロチオエート骨格を有する2'-O-メトキシエチルギャップマー(太字で示す2'-O-メトキシエチル)である。次いで、c-H-ras(ISIS 13920に対して)、JNK2(ISIS 18078に対して)またはc-raf(ISIS 15770に対して)mRNAについて80%阻害を生じる陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、当該細胞株の引き続く実験における新しいオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用する。80%阻害が達成できない場合、c-H-ras、JNK2またはc-raf mRNAの60%阻害を生じる陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を、該細胞株の引き続く実験におけるオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として用いる。60%阻害が達成されない場合、当該特定の細胞株は、オリゴヌクレオチドトランスフェクション実験に不適切であるとみなす。本明細書中で用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、50 nM〜300 nMである。
グルココルチコイドレセプター発現のアンチセンス調節は、当該分野で公知の種々の方法でアッセイすることができる。例えば、グルココルチコイドレセプター mRNAレベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)またはリアルタイムPCR(RT-PCR)により定量することができる。リアルタイム定量PCRが現在のところ好ましい。RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNA上で行うことができる。本発明のRNA分析の好ましい方法は、本明細書中の他の実施例に記載の全細胞RNAの使用である。RNAの単離の方法は当該分野で周知である。ノーザンブロット分析もまた当該分野で常套的である。リアルタイム定量(PCR)は、PE-Applied Biosystems, Foster City, CAから市販されている市販のABI PRISMTM7600、7700または7900 Sequence Detection Systemを用い、製造業者の使用説明書に従って簡便に達成することができる。
表現型アッセイ
グルココルチコイドレセプター阻害剤を、本明細書中で開示された方法により同定し、該化合物を、特定の疾患状態または状態の治療の効率を予測できる測定可能な終点をそれぞれ有する1つまたはそれ以上の表現型アッセイでさらに研究する。表現型アッセイ、それらの使用のためのキットおよび試薬は当業者に周知であり、健康および疾患におけるグルココルチコイドレセプターの役割および/または関連を研究するために、本明細書中で用いられる。いくつかの商業用の供給業者のいずれか1つから購入できる代表的な表現型アッセイには、細胞生存率、細胞毒性、増殖または細胞生存を測定するもの(Molecular Probes, Eugene, OR; PerkinElmer, Boston, MA)、 酵素アッセイを含むタンパク質ベースのアッセイ(Panvera, LLC, Madison, WI ; BD Biosciences, Franklin Lakes,NJ ; Oncogene Research Products, San Diego, CA)、細胞調節、シグナル伝達、炎症、酸化プロセスおよびアポトーシス(Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI)、トリグリセリド蓄積(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、血管新生アッセイ、管形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイならびに代謝アッセイ(Chemicon International Inc., Temecula, CA; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)が挙げられる。
ポリ(A)+mANA単離
ポリ(A)+mRNAを、Miuraら(Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764)に従って単離した。ポリ(A)+mRNAを単離する他の方法は、当該分野で常套的である。簡潔には、96ウェルプレート上で増殖した細胞について、増殖培地を細胞から除去し、各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。60μL溶解緩衝液(10 mM Tris-HCl、pH 7.6、1 mM EDTA、0.5 M NaCl、0.5% NP-40、20 mM バナジル-リボヌクレオシド複合体)を各ウェルに添加し、プレートを穏やかに攪拌し、次いで、室温で5分インキュベートした。55μLの溶解物を、オリゴd(T)被覆96ウェルプレート(AGCT Inc., Irvine CA)に移した。プレートを室温で60分インキュベートし、200μLの洗浄緩衝液(10 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.3 M NaCl)で3回洗浄した。最後の洗浄後、プレートをペーパータオル上にブロットして過剰な洗浄緩衝液を除去し、次いで5分間風乾した。70℃に予熱した60μlの溶出緩衝液(5 mM Tris-HCl pH 7.6)を各ウェルに添加し、プレートを90℃のホットプレート上で5分間インキュベートし、次いで、溶出液を新鮮な96ウェルプレートに移した。
Qiagen, Inc.(Valencia, CA)から購入したRNEASY 96TMキットおよび緩衝液を用い、製造業者が推奨する手順に従って、全RNAを単離した。手短にいえば、96ウェルプレート上で増殖した細胞について、増殖培地を細胞から除去し、各ウェルを200μLの冷PBSを用いて洗浄した。150μLの緩衝液RLTを各ウェルに添加し、プレートを20秒間激しく振とうした。次いで、150μLの70%エタノールを各ウェルに添加し、内容物を、3回上下にピペッティングすることにより混合した。次いで、試料を、廃液回収トレーを備え、かつ減圧源に取り付けられたQIAVACTMマニホルドに取り付けられた、RNEASY 96TMウェルプレートに移した。1分間減圧した。500μLの緩衝液RW1を、RNEASY 96TMプレートの各ウェルに添加し、15分インキュベートし、再び1分間減圧した。追加の500μLの緩衝液RW1を、RNEASY 96TMプレートの各ウェルに添加し、2分間減圧した。次いで、1 mLの緩衝液RPEをRNEASY 96TMプレートの各ウェルに添加し、90秒間減圧した。次いで、緩衝液RPEでの洗浄を繰り返し、さらに3分間減圧した。次いで、プレートをQIAVACTMマニホルドから取り外し、ペーパータオルにブロットし、乾燥させた。次いで、プレートを、1.2 mL回収管を含む回収管ラックを備えたQIAVACTMマニホルドに再び取り付けた。次いで、140μLのRNアーゼ(RNAse)を含まない水を各ウェルにピペッティングし、1分間インキュベートし、次いで3分間減圧することにより、RNAを溶出させた。
グルココルチコイドレセプターmRNAレベルの定量は、ABI PRISMTM7600、7700または7900 Sequence Detection System(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、製造業者の使用説明書に従って、リアルタイム定量PCRにより達成した。これは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物のリアルタイムでの高スループット定量を可能にする、閉鎖した管の非ゲルベースの蛍光検出システムである。PCRが完了した後に増幅産物を定量する標準的なPCRとは対照的に、リアルタイム定量PCRの産物は、それらが蓄積されるにつれて定量される。これは、フォワードおよびリバースPCRプライマーの間で特異的にアニ−リングし、かつ2つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドプローブを、PCR反応に含むことにより達成される。レポーター色素(例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CAまたはIntegrated DNA Technologies Inc., Coralville, IAのいずれかから入手したFAMまたはJOE)をプローブの5'末端に付加させ、クエンチャー色素(例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CAまたはIntegrated DNA Technologies Inc., Coralville, IAのいずれかから入手したTAMRA)をプローブの3'末端に付加させる。プローブおよび色素がインタクトである場合、レポーター色素発光を、3'クエンチャー色素の近傍でクエンチングする。増幅の間、プローブの標的配列へのアニーリングにより、Taqポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性により切断され得る基質を生じる。PCR増幅サイクルの伸長期の間、プローブのTaqポリメラーゼによる切断により、プローブの残りから(すなわち、クエンチャー部分から)レポーター色素が放出され、配列特異的蛍光シグナルが生じる。各サイクルについて、さらなるレポーター色素分子を、それらの各々のプローブから切断し、蛍光強度を、通常の間隔で、ABI PRISMTMSequence Detection System内に配置したレーザー光学機械によりモニタリングする。各アッセイにおいて、未処理対照試料からのmRNAの連続的希釈を含む一連の平行反応により、標準曲線が得られ、これを、試験試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害率を定量するのに用いる。
フォワードプライマー:AGGTTGTGCAAATTAACAGTCCTAACT(配列番号:5)
リバースプライマー:TAGTCTTTTGCAACCATCATCCA(配列番号:6)
であり、PCRプローブは:
FAM-AGCACCTAGTCCAGTGACCTGCTGGGTAAA-TAMRA(配列番号:7)
であった(FAMは蛍光色素であり、TAMRAはクエンチャー色素である)。ヒトGAPDHについて、PCRプライマーは:
フォワードプライマー:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(配列番号:8)
リバースプライマー:GAAGATGGTGATGGGATTTC(配列番号:9)
であり、PCRプローブは:
5'JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA3'(配列番号:10)
(JOEは蛍光レポーター色素であり、TAMRAはクエンチャー色素)であった。
フォワードプライマー:GACATCTTGCAGGATTTGGAGTT(配列番号:12)
リバースプライマー:AACAGGTCTGACCTCCAAGGACT(配列番号:13)
であり、PCRプローブは:
FAM-CGGGTCCCCAGGTAAAGAGACAAACGA-TAMRA(配列番号:14)
であった(FAMは蛍光レポーター色素であり、TAMRAはクエンチャー色素である)。マウスGAPDHについて、PCR プライマーは:
フォワードプライマー:GGCAAATTCAACGGCACAGT(配列番号:15)
リバースプライマー:GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT(配列番号:16)
であり、PCRプローブは:
5'JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-TAMRA3'(配列番号:17)
(JOEは蛍光レポーター色素であり、TAMRAはクエンチャー色素)であった。
フォワードプライマー:AAACAATAGTTCCTGCAGCATTACC(配列番号:19)
リバースプライマー:CATACAACACCTCGGGTTCAATC(配列番号:20)
であり、PCRプローブは:
FAM-ACCCCTACCTTGGTGTCACTGCT-TAMRA(配列番号:21)
であった(FAMは蛍光レポーター色素であり、TAMRAはクエンチャー色素である)。ラットGAPDHについて、PCR プライマーは:
フォワードプライマー:TGTTCTAGAGACAGCCGCATCTT(配列番号:22)
リバースプライマー:CACCGACCTTCACCATCTTGT(配列番号:23)
であり、PCRプローブは:
5'JOE-TTGTGCAGTGCCAGCCTCGTCTCA-TAMRA3'(配列番号:24)
(JOEは蛍光レポーター色素であり、TAMRAはクエンチャー色素)であった。
アンチセンス処理の18時間後、細胞単層を冷PBSで2回洗浄し、1 mLのRNAZOLTM(TEL-TEST “B”Inc., Friendswood, TX)中で溶解した。全RNAを、製造業者が推奨するプロトコールに従って調製した。20μgの全RNAを、MOPS緩衝液システム(AMRESCO, Inc. Solon, OH)を用いて、1.1%のホルムアルデヒドを含む1.2%アガロースゲルを通して電気泳動することにより分画した。RNAを、Northern/Southern Transfer buffer system(TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX)を用いる一晩の毛細管移動により、ゲルからHYBONDTM-N+ナイロン膜(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)に移した。RNAの移動は、UV可視化により確認した。STRATALINKERTMUV Crosslinker 2400(Stratagene, Inc, La Jolla, CA)を用いるUV架橋により膜を固定化し、次いで、QUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液(Stratagene, La Jolla, CA)を用い、ストリンジェントな条件についての製造業者の推奨を用いてプローブした。
本発明に従い、一連のアンチセンス化合物を、公開された配列(本明細書中で配列番号:4として援用されるGenBank受託番号NM_000176.1、本明細書中で配列番号:25として援用されるGenBank受託番号AC012634のヌクレオチド1〜106000の配列、本明細書中で配列番号:26として援用されるGenBank受託番号X03348.1、および本明細書中で配列番号:27として援用されるGenBank受託番号U01351.1)を用いて、ヒトグルココルチコイドレセプター RNAの異なる領域を標的化するように設計した。化合物を表1および表2に示す。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的配列上の第1の(5'最末端)ヌクレオチド番号を示す。表1および表2中の全ての化合物は、両側(5'および3'方向)に5ヌクレオチドの「ウイング」が隣接する10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)である。ウイングは2'-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間(主鎖)結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート(P=S)である。全てのシトシン残基は、5-メチルシトシンである。
本発明に従い、第2の一連のアンチセンス化合物を、公開された配列(本明細書中で配列番号:11として援用されるGenBank受託番号NM_008173.1、本明細書中で配列番号:217として援用されるGenBank受託番号X66367.1、本明細書中で配列番号:218として援用されるGenBank受託番号BF181849.1、本明細書中で配列番号:219として援用されるGenBank受託番号BE373661.1、および本明細書中で配列番号:220として援用されるGenBank受託番号AC007995.19のヌクレオチド145001〜164000の配列の相補鎖)を用いて、マウスグルココルチコイドレセプター RNAの異なる領域を標的化するように設計した。化合物を表3に示す。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的配列上の第1の(5'最末端)ヌクレオチド番号を示す。表3中の全ての化合物は、両側(5'および3'方向)に5ヌクレオチドの「ウイング」が隣接する10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)である。ウイングは2'-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間(主鎖)結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート(P=S)である。全てのシトシン残基は、5-メチルシトシンである。化合物をマウスグルココルチコイドレセプター mRNAレベルに与える影響について、本明細書中の他の実施例に記載した定量リアルタイムPCRにより分析した。データは、b.END細胞を本発明の150nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した2回の実験の平均である。各データポイントの陽性対照は表中にて配列番号により特定している。「N.D.」は、存在する場合、「データがない」ことを示す。
本発明に従い、第3の一連のアンチセンス化合物を、公開された配列(本明細書中で配列番号:18として援用されるGenBank受託番号NM_012576.1、および本明細書中で配列番号:256として援用されるGenBank受託番号Y00489.1)を用いて、ラットグルココルチコイドレセプター RNAの異なる領域を標的化するように設計した。化合物を表4に示す。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的配列上の第1の(5'最末端)ヌクレオチド番号を示す。表4中の全ての化合物は、両側(5'および3'方向)に5ヌクレオチドの「ウイング」が隣接する10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)である。ウイングは2'-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間(主鎖)結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート(P=S)である。全てのシトシン残基は、5-メチルシトシンである。化合物をラットグルココルチコイドレセプター mRNAレベルに与える影響について、本明細書中の他の実施例に記載した定量リアルタイムPCRにより分析した。データは、NRK細胞を本発明の150nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した2回の実験の平均である。各データポイントの陽性対照は表中にて配列番号により特定している。「N.D.」は、存在する場合、「データがない」ことを示す。
ウエスタンブロット分析(免疫ブロット分析)は、標準的な方法を用いて行う。細胞を、オリゴヌクレオチド処理の16〜20時間後に採取し、PBSで1回洗浄し、Laemmli緩衝液(100μl/ウェル)中に懸濁し、5分間煮沸し、16%SDS-PAGEゲル上に装填する。ゲルを、1.5時間、150Vで作動させ、ウエスタンブロッティング用の膜に移す。グルココルチコイドレセプターに指向した適切な一次抗体を、一次抗体種に対して指向した、放射標識または蛍光標識した二次抗体と共に用いる。バンドをPHOSPHORIMAGERTM(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)を用いて可視化する。
本発明のさらなる態様において、ISIS 180271、ISIS 180272、ISIS 180277、ISIS 180280、ISIS 180281およびISIS 180314を用量応答実験にて試験した。ISIS 118920(GTTCATTCTAAAGTGGTCAC、配列番号:300)は、タンパク質ホスファターゼ触媒サブユニット2αを標的とし、対照として使用した。b.END細胞を24ウェルプレート中、1ウェルあたり40,000細胞の密度で平板培養した。次いで細胞を、1、5、10、25、50、100または200nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理し、本明細書中の他の実施例に記載したように、1mlの培養液につき100nMオリゴヌクレオチドあたり3μlのLIPOFECTIN(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)と混合した。マウスグルココルチコイドレセプターの発現を本明細書中の他の実施例に記載したようにリアルタイムPCRにより測定した。データをマウスグルココルチコイドレセプターmRNAの阻害率として表し、データを未処理の対照細胞に対して標準化した。結果は3回の実験の平均であり、表5に示す。対照オリゴヌクレオチドで処理された結果において、数字の前に付く「+」は、遺伝子発現が増加することを示す。
本発明にしたがって、ISIS 180271、ISIS 180272およびISIS 180280を一次マウス肝細胞での用量応答実験にて試験し、50、100、200または400nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。ISIS 129685(AATATTCGCACCCCACTGGT、配列番号:301)、ISIS 129686(CGTTATTAACCTCCGTTGAA、配列番号:302)およびISIS 129695(TTCTACCTCGCGCGATTTAC、配列番号:303)は、タンパク質ホスファターゼ2Aを標的とし、対照オリゴヌクレオチドとして使用されたオリゴヌクレオチドである。細胞を処理し、mRNA発現レベルを本明細書中の他の実施例に記載したように測定した。データを未処理の対照細胞に対して標準化し、マウスグルココルチコイドレセプター中の変化率として表した。ここで、「-」とは発現の減少を示し、「+」とは発現の増加を示す。結果は3回の実験の平均であり、表6にて示す。
db/db +/- マウスはdb/dbマウスの異型接合の同腹子であり、しばしばリーン同腹子と言われるが、それらはdb(肥満症および高血糖症)表現型を示さないからである。6週齢のdb/db +/- 雄マウスに、50mg/kgのアンチセンスオリゴヌクレオチドを週2回、皮下投与した。合計で5回投与した。使用されたグルココルチコイドアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ISIS 180272(配列番号:69)およびISIS 180280(配列番号:77)であった。マウスPTENに対して標的化されたISIS 116847(CTGCTAGCCTCTGGATTTGA、配列番号:304)を、陽性対照として使用した。アンチセンス化合物を緩衝食塩水で調製し、0.2ミクロンフィルターで濾過することで滅菌した。血液試料を、マウスおよびラットから尾を切り取ることで得た。血漿グルコース値を、最初の投与前(-6日目)およびマウスを屠殺する前日(15日目)に測定した。屠殺後、血清脂質を測定し、肝臓での標的減少もまた測定した。
Ob/obマウスは、結果的に肥満症および高血糖症となる変異を、レプチン遺伝子中に有する。したがってこれらのマウスは、肥満症および糖尿病の調査、ならびにこれらの症状を処置するために設計された処置法のための有用なモデルである。本発明にしたがって、グルココルチコイドレセプターに対して標的化された化合物を、肥満症および高血糖症のob/obモデルにて試験する。
レプチンは食欲を制御する、脂肪組織によって産生されるホルモンである。ヒトおよび非ヒト動物の双方においてこのホルモンの欠乏は、肥満をもたらす。db/dbマウスは、肥満および高血糖をもたらすレプチンレセプター遺伝子における変異を有する。したがって、かかるマウスは肥満および糖尿病の研究、ならびにかかる症状を処置するように設計される処置方法のための有用なモデルである。レプチン遺伝子において変異を有するob/obマウスよりもインスリンの低循環レベルを有し、高血糖であるdb/dbマウスは、2型糖尿病を有するげっ歯類のモデルとしてしばしば使用される。本発明に従って、本発明のオリゴマー化合物を、肥満および糖尿病を有するdb/dbモデルにおいて試験した。
ZDF +/-ラットは、Zucker Diabetic Fattyラットのヘテロ接合同腹子であり、これはホモ接合ZDF fa/faラットの損なわれたインスリン感応性の表現型を表さないため、やせた同腹子としばしば称される。ホモ接合ZDFラットは、レプチンレセプターにおける変異を有し、損なわれたインスリン感応性を有する有用な動物モデルとなる。
レプチンレセプター欠損(fa/fa)Zucker diabetic fatty (ZDF) ラットは、2型糖尿病の研究のための別の有用なモデルである。糖尿病はかかる8〜10週の年齢の雄ラットにおいて自然発生的に発症し、過食症、多尿症、煩渇多飲症、および損なわれた体重増加、すなわち糖尿病の臨床症状と並行して起こる症状と関連する。Phillips MS, Liu Q, Hammond HA, Dugan V, Hey PJ, Caskey CJ, Hess JF, 1996, Nat Genet 13, 18-19。
HFD/STZラットモデル (Reedら, 2000, Metabolism, 49, 1390-1394に基づく) は、食餌的要素に関して高脂肪の食餌により誘発される、ヒト2型糖尿病(DIOすなわち食餌誘発性肥満としても公知)およびストレプトゾトシンにより誘発される高血糖をよく模倣する。ob/obおよびdb/dbモデルとは異なり、該糖尿病表現型は、レプチン遺伝子またはレプチンレセプター遺伝子のいずれかの変異によってもたらされていない。
全身的阻害効果を有するグルココルチコイドレセプターアンタゴニストは、視床下部下垂体軸の刺激などの望ましくない副作用をもたらし得る。アンチセンス阻害剤の重要な利点は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるグルココルチコイドレセプターの発現の減少は、大部分が、グルココルチコイドレセプターの阻害についての望ましい標的組織である肝臓および脂肪組織において観察されるが、少数が全身で観察されることである。したがって、この標的の他の種類の阻害剤と比較して、オリゴヌクレオチド阻害剤により望ましくない全身的副作用(主として視床下部下垂体軸の刺激)の可能性が減少することが考えられる。
グルココルチコイドレセプター発現のアンチセンス阻害剤は、肥満または体重増加を減少させることが期待される。これを、DIO(食餌誘発性肥満)モデルとしても公知の高脂肪食餌(HFD)モデルにおいて検証した。
エキソビボ肝臓グルコース産生量を、グルココルチコイドレセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 180281)で処置したSprague Dawleyラットの肝臓切片において測定した。対照ラットおよびアンチセンス処置したラットを24時間絶食させ、12.5 mg/kgの用量でビヒクルまたはデキサメタゾン(Bausch & Lomb, Tampa, FL)のいずれかを投与した。処置の6時間後、Krumdieck Tissue Slicer (Alabama Research and Development, Munford, AL)を用いて、精密切断した肝臓切片を調製し、0.1% BSA、10 mM乳酸塩、1 mMピルビン酸ナトリウム、10 mMアラニン、および10 mMグリセロール(NGS培養液)を補給したグルコースなしのDMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA)中でインキュベートした。1時間の前保温の後、個々の切片を0.5 mlのNGS培養液を含む24ウェルプレートの個々のウェルに移し、1.5時間後に培養液に放出されたグルコースをHitachi 912 臨床化学分析装置(clinical chemistry analyzer)により測定した。肝臓切片を秤量し、肝臓組織の1ミリグラム当たりのグルコース産生量を測定した。
さらなる候補のマウスグルココルチコイドレセプターのアンチセンス阻害剤を、種々の種におけるインビボのグルココルチコイドレセプターmRNAの発現を減少させる能力について、先にスクリーニングしたオリゴヌクレオチドと比較して評価した。これを表7に示す。示されているのは、オリゴヌクレオチド配列、および配列番号:4(ヒトグルココルチコイドレセプターmRNA、GenBank受託番号NM_000176.1)における位置(5’末端核酸塩基の位置)である。さらに、示されているのは、ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスのグルココルチコイドレセプターmRNAに対する相補性である(「yes」は完全な相補性を意味し、「1 mm」は完全な相補性からの1つのミスマッチを意味する)。
主要な(lead)マウスグルココルチコイドレセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドの2型糖尿病のマウスモデルにおけるグルココルチコイドレセプターmRNAレベルに対する効果を調べた。グルココルチコイドレセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 345198)のob/obマウスへの全身投与の4週間後、肝臓グルココルチコイドレセプターmRNA発現の用量に依存した減少が観察された。オリゴヌクレオチドは、6.25 mg/kg、12.5 mg/kg、または25 mg/kgの用量で、週に2回、4週間、皮下投与した。グルココルチコイドレセプターmRNAレベルは、かかる用量で、それぞれ54%、67%および72%減少し、グルココルチコイドレセプター発現の用量に依存した阻害を示した。対照オリゴヌクレオチドは、グルココルチコイドレセプター発現に対する効果を有さなかった。
グルココルチコイドレセプターmRNAのレベルを減少させることに加え、グルココルチコイドレセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド処置は、糖尿病モデルにおいて、血漿グルコースレベルおよび循環脂質レベルを減少させた。生理食塩水および対照アンチセンス化合物処置したob/obマウスにおいて、研究期間の全体にわたって、高血糖は悪化し続けたが、ISIS 345198処置した動物は、血漿グルコースレベルにおいて、有意な用量に依存する減少を示した。処置の4週間後、血漿グルコースレベルは、それぞれ、25 mg/kg、12.5 mg/kg、および6.25 mg/kgで、ISIS 345198で処置したマウスについて、約225 mg/dL、約250 mg/dL、および約300 mg/dLであった。生理食塩水処置の4週間後、マウスは約600 mg/dLの血漿グルコースレベルを有し、対照オリゴヌクレオチドで処置したマウスは、約490 mg/dLの血漿グルコースレベルを有した。
体重における変化は観察されなかったが、身体成分の濃度分析を行い、身体脂肪質量における変化を精密に測定した。身体成分分析は、グルココルチコイドレセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 345198)25 mg/kgで、週に2回、4週間処置したob/obマウスにおいて、Lunar X線濃度計(GE Medical Systems, Madison, WI53717)を用いて行った。グルココルチコイドレセプターアンチセンス化合物は、4週間の処置期間の後、身体の脂質質量を有意に減少させた(生理食塩水50.7±0.4に対してグルココルチコイドレセプターアンチセンス45.7±0.5、p<0.05)。この減少はまた、精巣上体脂肪パッド重量における減少として反映された(生理食塩水5.09±0.10グラムに対してグルココルチコイドレセプターアンチセンス4.3±0.12グラム、p<0.05)。血漿アディポネクチン、レジスチン、TNFαおよびインスリンのレベルをLinco Researchのキット(St. Charles, MOおよびALPCO. Windham, NH)を用いてELISAにより測定した;血漿インターロイキン-6(IL-6)レベルをELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN)により測定した。
Claims (78)
- グルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子を標的とする8〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物であり、前記化合物がグルココルチコイドレセプターをコードする前記核酸分子に相補的であり、前記化合物がグルココルチコイドレセプターmRNAの発現を阻害する、アンチセンス化合物。
- 13〜50核酸塩基長である、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- 15〜30核酸塩基長である、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- オリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- DNAオリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- RNAオリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- 二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- キメラオリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- 前記化合物の少なくとも一部がオリゴヌクレオチド-RNA二重鎖を形成するRNAとハイブリダイズする、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- グルココルチコイドレセプターをコードする前記核酸分子と少なくとも90%の相補性を有する、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- グルココルチコイドレセプターをコードする前記核酸分子と少なくとも95%の相補性を有する、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- グルココルチコイドレセプターをコードする前記核酸分子と少なくとも99%の相補性を有する、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- 少なくとも一つの修飾されたヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基を有する、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- 少なくとも1つの2'-O-メトキシエチル糖部分を有する、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- 少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- 少なくとも1つのシトシンが、5-メチルシトシンである、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- 少なくとも一つのロックド核酸(LNA)糖部分、ENAまたはPNAを有する、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- 前記アンチセンス化合物が配列番号32、33、34、36、37、39、40、43、44、46、48、50、51、52、53、54、55、57、58、59、60、61、62、63、65、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、179、182、183、185、186、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、202、203、204、206、208、209、210、211、212、213、214、216、221、222、223、224、225、226、227、228、232、233、234、236、237、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、280、281、282、283、284、285、286、287、291、292、293、294、295、298、299、306、307、308、309または310の少なくとも8核酸塩基部分を含む、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- 前記アンチセンス化合物が配列番号32、33、34、36、37、39、40、43、44、46、48、50、51、52、53、54、55、57、58、59、60、61、62、63、65、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、179、182、183、185、186、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、202、203、204、206、208、209、210、211、212、213、214、216、221、222、223、224、225、226、227、228、232、233、234、236、237、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、280、281、282、283、284、285、286、287、291、292、293、294、295、298、299、306、307、308、309および310からなる群より選択される配列を有する、請求項1記載のアンチセンス化合物。
- 配列番号36、50、60、71、72、73、78、100、306、307、308、309または310の核酸塩基配列を有する、アンチセンス化合物。
- 前記化合物が配列番号4の全ての5’UTRのヌクレオチド13〜119、開始コドン領域のヌクレオチド114〜151、コード領域のヌクレオチド351〜533、667〜845、877〜1243、1356〜1488、1552〜1756、1819〜1999、2008〜2139、2146〜2194、2201〜2301、もしくは2386〜2416、または3’UTRのヌクレオチド2488〜2685、2723〜3435、3499〜3789、3826〜3860、3886〜3905、3918〜3937、4031〜4072、4082〜4193もしくは4244〜4758;または配列番号25の3’UTRのヌクレオチド104562〜104648を標的とする、ヒトグルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子を標的とする8〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物。
- 化合物が配列番号11の開始コドン領域のヌクレオチド2〜20、コード領域のヌクレオチド301〜1405、1459〜2043もしくは2050〜2309、3’UTRのヌクレオチド2376〜2433もしくは2521〜2546、全て;配列番号219の5’UTRのヌクレオチド227〜297;または配列番号220の3’UTRのヌクレオチド14909〜18389を標的とする、マウスグルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子を標的とする8〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物。
- 化合物が配列番号18のコード領域のヌクレオチド150〜2129もしくは2136〜2395、または3’UTRのヌクレオチド2472〜3705、4576〜4867、5039〜5293、5680〜5877もしくは6214〜6263、全て;または配列番号256のコード領域のヌクレオチド278〜304を標的とする、ラットグルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子を標的とする8〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物。
- グルココルチコイドレセプターの発現を阻害するように、細胞または組織を請求項1のアンチセンス化合物と接触させることを含む、細胞または組織においてグルココルチコイドレセプターの発現を阻害する方法。
- グルココルチコイドレセプターに関連のある疾患または症状を有する動物を処置する方法であって、グルココルチコイドレセプターの発現が阻害されるように、該動物に治療的または予防的有効量の請求項1のアンチセンス化合物を投与することを含む、方法。
- 疾患または症状が糖尿病、肥満、代謝症候群X、高血糖症または高脂血症である、請求項25記載の方法。
- 糖尿病が2型糖尿病である、請求項26記載の方法。
- 前記高脂血症が高血中コレステロールレベルまたは高血中トリグリセリドレベルである、請求項26記載の方法。
- 前記グルココルチコイドレセプターの発現の阻害が肝臓または脂肪内で生じる、請求項26記載の方法。
- 下垂体におけるグルココルチコイドレセプターの発現が阻害されない、請求項25記載の方法。
- 動物中の血漿コルチコステロンおよび血漿ACTHの基本レベルがアンチセンス処理により影響を受けない、請求項25記載の方法。
- 動物において血中グルコースレベルを減少させる方法であって、前記動物に治療的または予防的有効量の、グルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子を標的とする、8〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物を投与することを含み、前記アンチセンス化合物グルココルチコイドレセプターの発現を阻害する、動物において血中グルコースレベルを減少させる、方法。
- 動物がヒトまたはげっ歯類である、請求項32記載の方法。
- 血中グルコースレベルが血漿グルコースレベルまたは血清グルコースレベルである、請求項32記載の方法。
- 動物が糖尿病の動物である、請求項32記載の方法。
- 血中グルコースレベルがリンパ球減少を伴わずに減少する、請求項32記載の方法。
- 動物中の血漿コルチコステロンおよび血漿ACTHの基本レベルがアンチセンス処理により影響を受けない、請求項32記載の方法。
- 動物におけるグルココルチコイドレセプターに関連のある疾患または症状の開始を予防または遅延させる方法であって、該動物に治療的または予防的有効量の8〜80核酸塩基長の、グルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を投与することを含み、前記アンチセンス化合物がグルココルチコイドレセプターの発現を阻害する、方法。
- 該動物がヒトまたはげっ歯類である、請求項38記載の方法。
- 疾患または症状が代謝性の疾患または症状である、請求項38記載の方法。
- 代謝性疾患または症状が糖尿病、肥満、高脂血症、高血糖症または代謝症候群Xである、請求項40記載の方法。
- 前記糖尿病が2型糖尿病である、請求項41記載の方法。
- 前記高脂血症が高血中コレステロールまたは高血中トリグリセリドレベルである、請求項41記載の方法。
- 前記疾患または症状の開始がリンパ球減少を伴わずに予防されるかまたは遅延される、請求項38記載の方法。
- 動物中の血漿コルチコステロンおよび血漿ACTHの基本レベルがアンチセンス処理により影響を受けない、請求項38記載の方法。
- 動物において血中グルコースレベルの増加を阻害するかまたは遅延する方法であって、該動物に治療的または予防的有効量の8〜80核酸塩基長の、グルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を投与することを含み、前記アンチセンス化合物がグルココルチコイドレセプターの発現を阻害する、動物において血中グルコースレベルの増加を予防するかまたは遅延する、方法。
- 該動物がヒトまたはげっ歯類である、請求項46記載の方法。
- 動物が肥満である、請求項46記載の方法。
- 正常動物と比較した際に動物がインスリン抵抗性である、請求項46記載の方法。
- 血中グルコースレベルが血漿グルコースレベルまたは血清グルコースレベルである、請求項46記載の方法。
- 動物が糖尿病の動物である、請求項46記載の方法。
- 前記血中グルコースレベルの増加の開始がリンパ球減少を伴うことなく予防されるかまたは遅延される、請求項46記載の方法。
- 動物中の血漿コルチコステロンおよび血漿ACTHの基本レベルがアンチセンス処理により影響を受けない、請求項46記載の方法。
- 動物において血中脂肪レベルを減少させる方法であって、該動物に治療的または予防的有効量の8〜80核酸塩基長の、グルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を投与することを含み、前記アンチセンス化合物がグルココルチコイドレセプターの発現を阻害する、動物において血中脂肪レベルを減少させる、方法。
- 動物がヒトまたはげっ歯類である、請求項54記載の方法。
- 血中脂肪レベルが血中コレステロールレベルまたは血中トリグリセリドレベルである、請求項54記載の方法。
- 動物が糖尿病の動物である、請求項54記載の方法。
- 前記血中脂肪レベルがリンパ球減少を伴うことなく減少する、請求項54記載の方法。
- 動物における血漿コルチコステロンおよび血漿ACTHの基本レベルがアンチセンス処理により影響を受けない、請求項54記載の方法。
- 動物において血中脂肪レベルの増加の開始を阻害または遅延する方法であって、前記動物に治療的または予防的有効量の8〜80核酸塩基長の、グルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を投与することを含み、前記アンチセンス化合物がグルココルチコイドレセプターの発現を阻害する、方法。
- 動物がヒトまたはげっ歯類である、請求項60記載の方法。
- 動物が肥満である、請求項60記載の方法。
- 正常動物と比較した際に動物がインスリン抵抗性である、請求項60記載の方法。
- 血中脂肪レベルが血中コレステロールレベルまたは血中トリグリセリドレベルである、請求項60記載の方法。
- 動物が糖尿病の動物である、請求項60記載の方法。
- 前記血中脂肪レベルの増加の開始がリンパ球減少を伴うことなく阻害されるかまたは遅延される、請求項60記載の方法。
- 該動物における血漿コルチコステロンおよび血漿ACTHの基本レベルがアンチセンス処理により影響を受けない、請求項60記載の方法。
- 動物の下垂体ではなく肝臓または脂肪においてグルココルチコイドレセプター発現を減少させる方法であって、前記動物に治療的または予防的有効量の化合物を投与することを含み、下垂体ではなく肝臓または脂肪においてグルココルチコイドレセプターの発現を阻害する、方法。
- 前記化合物がグルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子を標的とする8〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物である、請求項68記載の方法。
- 動物における血漿コルチコステロンおよび血漿ACTHの基本レベルがアンチセンス処理により影響を受けない、請求項68記載の方法。
- 動物において体脂肪量を減少させる方法であって、前記動物に治療的または予防的有効量の8〜80核酸塩基長の、グルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を投与することを含み、前記アンチセンス化合物がグルココルチコイドレセプターの発現を阻害する、方法。
- 動物がヒトまたはげっ歯類である、請求項71記載の方法。
- 前記体脂肪量がリンパ球減少を伴うことなく減少する、請求項71記載の方法。
- 該動物における血漿コルチコステロンおよび血漿ACTHの基本レベルがアンチセンス処理により影響を受けない、請求項71記載の方法。
- 動物において体脂肪量の増加の開始を阻害または遅延する方法であって、前記動物に治療的または予防的有効量の8〜80核酸塩基長の、グルココルチコイドレセプターをコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を投与することを含み、前記アンチセンス化合物がグルココルチコイドレセプターの発現を阻害する、方法。
- 動物がヒトまたはげっ歯類である、請求項75記載の方法。
- 前記体脂肪量の増加の開始がリンパ球減少を伴うことなく阻害されるかまたは遅延される、請求項75記載の方法。
- 血漿コルチコステロンおよび血漿ACTHの基本レベルがアンチセンス処理により影響を受けない、請求項75記載の方法。
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