CN116209465A - 用il-2缀合物与抗egfr抗体的免疫肿瘤学组合疗法 - Google Patents

用il-2缀合物与抗egfr抗体的免疫肿瘤学组合疗法 Download PDF

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Abstract

本文公开了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用IL‑2缀合物与抗EGFR抗体的组合。

Description

用IL-2缀合物与抗EGFR抗体的免疫肿瘤学组合疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月25日提交的美国临时申请号63/044,199和2021年6月3日提交的美国临时申请号63/196,448的优先权，将其中每一个的公开内容通过引用以其整体特此并入。
背景技术
不同T细胞群调节免疫***，以维持免疫稳态和耐受性。例如，调节性T(Treg)细胞通过防止病理性自身反应性来防止免疫***的不适当应答，而细胞毒性T细胞靶向并且破坏感染的细胞和/或癌细胞。在一些情况下，不同T细胞群的调节为疾病或适应证的治疗提供选择。可以通过组合疗法中另外的药剂或方法的存在来增强不同T细胞群的调节。
细胞因子包括细胞信号传导蛋白的家族，如趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子以及在先天性和适应性免疫细胞稳态中发挥作用的其他生长因子。细胞因子是由免疫细胞(如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞和不同的基质细胞)产生的。在一些情况下，细胞因子调节体液免疫应答与基于细胞的免疫应答之间的平衡。
白介素是调节以下细胞的发育和分化的信号传导蛋白：T淋巴细胞和B淋巴细胞、单核细胞谱系的细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞和造血细胞。白介素是由辅助CD4+T和B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和其他组织驻留细胞产生的。
在一些情况下，白介素2(IL-2)信号传导用于调节T细胞应答，且随后用于治疗癌症。因此，在一个方面，本文提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括施用IL-2缀合物与抗EGFR抗体的组合。
发明内容
本文描述了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(a)IL-2缀合物和(b)抗EGFR抗体。
示例性实施方案包括以下。
实施方案1.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(a)IL-2缀合物和(b)抗EGFR抗体，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(I)的结构替代：
Figure BDA0004086255800000011
/>
其中：
Z是CH2并且Y是
Figure BDA0004086255800000012
Y是CH2并且Z是
Figure BDA0004086255800000021
Z是CH2并且Y是
Figure BDA0004086255800000022
或者
Y是CH2并且Z是
Figure BDA0004086255800000023
W是具有约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa或60kDa平均分子量的PEG基团；并且
X是具有以下结构的L-氨基酸：
Figure BDA0004086255800000024
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点；
其中所述式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，Z是CH2并且Y是
Figure BDA0004086255800000025
实施方案3.根据实施方案1所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，Y是CH2并且Z是
Figure BDA0004086255800000026
实施方案4.根据实施方案1所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，Z是CH2并且Y是
Figure BDA0004086255800000027
实施方案5.根据实施方案1所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，Y是CH2并且Z是
Figure BDA0004086255800000028
实施方案6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，所述PEG基团具有约25kDa、30kDa或35kDa的平均分子量。
实施方案7.根据实施方案6所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，所述PEG基团具有约30kDa的平均分子量。
实施方案8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述式(I)结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是P64。
实施方案9.根据实施方案1所述的方法，其中所述式(I)的结构具有式(IV)或式(V)的结构，或者是式(IV)与式(V)的结构的混合物：
Figure BDA0004086255800000031
其中：
W是具有约25kDa、30kDa或30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
Figure BDA0004086255800000032
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
实施方案10.根据实施方案9所述的方法，其中所述式(IV)或式(V)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是P64。
实施方案11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述抗EGFR抗体是西妥昔单抗。
实施方案12.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(a)IL-2缀合物和(b)西妥昔单抗，其中所述IL-2缀合物包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG30kD]具有式(XII)或式(XIII)的结构，或者是式(XII)与式(XIII)的结构的混合物：
Figure BDA0004086255800000033
Figure BDA0004086255800000041
其中：
n是整数，n是使得-(OCH2CH2)n-OCH3具有约30kDa分子量的整数；
q是1、2或3；并且
所述波浪线指示与SEQ ID NO:50内未被替代的氨基酸残基的共价键。
实施方案13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中q是1。
实施方案14.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中q是2。
实施方案15.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中q是3。
实施方案16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述平均分子量是数均分子量。
实施方案17.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述平均分子量是重均分子量。
实施方案18.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
实施方案19.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中将所述IL-2缀合物施用至所述受试者，约每两周一次、约每三周一次或约每4周一次。
实施方案20.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中将所述抗EGFR抗体施用至所述受试者，约每周一次、约每两周一次、约每三周一次或约每4周一次。
实施方案21.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中通过静脉内施用将所述IL-2缀合物施用至所述受试者。
实施方案22.根据实施方案1-21中任一项所述的方法，其中分开施用所述IL-2缀合物和所述抗EGFR抗体。
实施方案23.根据实施方案23所述的方法，其中依序施用所述IL-2缀合物和所述抗EGFR抗体。
实施方案24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述癌症选自肾细胞癌(RCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、尿路上皮癌、微卫星不稳定癌、微卫星稳定癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌(CRC)、***、肝细胞癌(HCC)、梅克尔细胞癌(MCC)、黑色素瘤、小细胞肺癌(SCLC)、食管癌、食管鳞状细胞癌(ESCC)、胶质母细胞瘤、间皮瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、***癌、去势抵抗性***癌、转移性去势抵抗性***癌、或具有DNA损伤应答(DDR)缺陷的转移性去势抵抗性***癌、膀胱癌、卵巢癌、中度至低度突变负担的肿瘤、皮肤鳞状细胞癌(CSCC)、鳞状细胞皮肤癌(SCSC)、低表达至不表达PD-L1的肿瘤、超出其原发解剖学起源部位全身性播散至肝脏和CNS的肿瘤以及弥漫性大B细胞淋巴瘤。
实施方案25.根据实施方案1-24中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用约16μg/kg的所述IL-2缀合物。
实施方案26.根据实施方案1-24中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用约24μg/kg的所述IL-2缀合物。
实施方案27.根据实施方案1-10或12-26中任一项所述的方法，其中所述抗EGFR抗体选自帕尼单抗(Vectibix)、奈西妥木单抗(necitumumab)(Portrazza)、JNJ-61186372(埃万妥单抗(Amivantamab))、IMC-C225、ABX-EGF、ICR62和EMD 55900。
实施方案28.一种用于在根据实施方案1-27中任一项所述的方法中使用的IL-2缀合物。
实施方案29.IL-2缀合物用于制造用于根据实施方案1-27中任一项所述的方法的药剂的用途。
附图说明
本发明的新颖特征在随附权利要求书中具体阐述。将通过参考阐述了利用本发明原理的说明性实施方案的以下具体实施方式和附图获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在所述附图中：
图1A-图1C示出了在与3种单独的供体人PBMC和不同量的IL-2缀合物以及西妥昔单抗一起共培养的CAL27细胞中的细胞毒性％。
图2A示出了在与人PBMC和不同量的IL-2缀合物以及西妥昔单抗一起共培养的CAL27细胞中的细胞毒性％。
图2B示出了在与人PBMC和不同量的IL-2缀合物以及西妥昔单抗一起共培养的A431细胞中的细胞毒性％。
图3A示出了对与NK92细胞一起共培养并且用不同量的IL-2缀合物和西妥昔单抗处理的A431细胞的细胞毒性作用。
图3B示出了对与NK92细胞一起共培养并且用不同量的IL-2缀合物和西妥昔单抗处理的DLD-1细胞的细胞毒性％。
图3C示出了对与NK92细胞一起共培养并且用不同量的IL-2缀合物和西妥昔单抗处理的FaDu细胞的细胞毒性％。
图3D示出了对与NK92细胞一起共培养并且用不同量的IL-2缀合物和西妥昔单抗处理的CAL27细胞的细胞毒性％。
图4A示出了在施用IL-2缀合物后的特定时间，用16μg/kg IL-2缀合物与西妥昔单抗组合治疗的指示受试者中的外周CD8+Teff细胞计数。
图4B示出了在施用IL-2缀合物后特定时间，用16μg/kg IL-2缀合物与西妥昔单抗组合治疗的指示受试者中的外周CD8+Teff细胞计数的变化。将数据相对于预处理(C1D1)CD8+Teff细胞计数归一化。
图5A示出了在施用IL-2缀合物后特定时间，用16μg/kg IL-2缀合物与西妥昔单抗组合治疗的指示受试者中的外周NK细胞计数。
图5B示出了在施用IL-2缀合物后特定时间，用16μg/kg IL-2缀合物与西妥昔单抗组合治疗的指示受试者中的外周NK细胞计数的变化。将数据相对于预处理(C1D1)NK细胞计数归一化。
图6A示出了在施用IL-2缀合物后特定时间，用16μg/kg IL-2缀合物与西妥昔单抗组合治疗的指示受试者中的外周CD4+Treg细胞计数。
图6B示出了在施用IL-2缀合物后特定时间，用16μg/kg IL-2缀合物与西妥昔单抗组合治疗的指示受试者中的外周CD4+Treg细胞计数的变化。将数据相对于预处理(C1D1)CD4+Treg细胞计数归一化。
图7A示出了在施用IL-2缀合物后特定时间，用16μg/kg IL-2缀合物与西妥昔单抗组合治疗的指示受试者中的嗜酸性粒细胞计数。
图7B示出了在施用IL-2缀合物后特定时间，用16μg/kg IL-2缀合物与西妥昔单抗组合治疗的指示受试者中的嗜酸性粒细胞计数的变化。将数据相对于预处理(C1D1)嗜酸性粒细胞计数归一化。
图8A示出了在施用IL-2缀合物后特定时间，用16μg/kg IL-2缀合物与西妥昔单抗组合治疗的指示受试者中的淋巴细胞计数。
图8B示出了在施用IL-2缀合物后特定时间，用16μg/kg IL-2缀合物与西妥昔单抗组合治疗的指示受试者中的淋巴细胞计数的变化。将数据相对于预处理(C1D1)淋巴细胞计数归一化。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与要求保护的主题所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。应当理解，前述一般说明和以下具体实施方式只是示例性和解释性的，并且不限制要求保护的任何主题。在通过引用并入本文的任何材料与本公开文本的明确内容不一致的情况下，以明确内容为准。在本申请中，除非另外明确陈述，否则单数的使用包括复数含义。必须指出，如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/一种(a、an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地规定。在本申请中，除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用是非限制性的。
在说明书中对“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”的提及意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开文本的至少一些实施方案中，但不必包括在本发明的所有实施方案中。
如本文所用，范围和数量可以表示为“约”特定值或范围。约也包括确切的量。因此，“约5μL”意指“约5μL”并且也意指“5μL”。通常，术语“约”包括预期在实验误差内的量，如例如，在15％、10％或5％内。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
如本文所用，术语“一个或多个个体”、“一名或多名受试者”和“一名或多名患者”意指任何哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，哺乳动物是非人。所述术语均不要求或不限于以卫生保健工作者(例如医生、注册护士、执业护士、医师助理、护理员或临终关怀工作者)进行监督(例如持续或间断)为特征的情况。
如本文所用，关于结合亲和力的术语“显著的”或“显著地”意指细胞因子(例如，IL-2多肽)的结合亲和力的足以影响细胞因子(例如，IL-2多肽)与靶受体的结合的变化。在一些情况下，所述术语是指至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大的变化。在一些情况下，所述术语意指至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更大的变化。
在一些情况下，关于经由细胞因子信号传导复合物激活一种或多种细胞群的术语“显著的”或“显著地”意指足以激活细胞群的变化。在一些情形中，将激活细胞群的变化测量为受体信号传导效力。在此类情况下，可以提供EC50值。在其他情况下，可以提供ED50值。在另外的情况下，可以提供细胞因子的浓度或剂量。
如本文所用，术语“效力”是指产生靶效应所需的细胞因子(例如，IL-2多肽)的量。在一些情况下，术语“效力”是指激活靶细胞因子受体(例如，IL-2受体)所需的细胞因子(例如，IL-2多肽)的量。在其他情况下，术语“效力”是指激活靶细胞群所需的细胞因子(例如，IL-2多肽)的量。在一些情形中，将效力测量为ED50(有效剂量50)或产生50％最大效应所需的剂量。在其他情况下，将效力测量为EC50(有效浓度50)或在50％群体中产生靶效应所需的剂量。
如本文所用，术语“非天然氨基酸”是指除20种天然存在的氨基酸中的一种之外的氨基酸。示例性非天然氨基酸描述于Young等人,“Beyond the canonical 20amino acids:expanding the genetic lexicon,”J.of Biological Chemistry 285(15):11039-11044(2010)中，将其公开内容通过引用并入本文。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和只要展现出所希望的抗原结合活性的抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗原是EGFR。
如本文所用的术语“一种或多种单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体(即，构成所述群体的各抗体是相同的和/或结合相同表位，但是例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的产生期间产生的可能变体抗体除外，此类变体通常以少量存在)获得的抗体。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”指示抗体的特征为从基本上同质的抗体群获得，并且不应视为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明待使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，所述多种技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
如本文所用，“核苷酸”是指包含核苷部分和磷酸酯部分的化合物。示例性天然核苷酸包括但不限于腺苷三磷酸(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷三磷酸(CTP)、鸟苷三磷酸(GTP)、腺苷二磷酸(ADP)、尿苷二磷酸(UDP)、胞苷二磷酸(CDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、腺苷一磷酸(AMP)、尿苷一磷酸(UMP)、胞苷一磷酸(CMP)和鸟苷一磷酸(GMP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、胸苷二磷酸(dTDP)、脱氧胞苷二磷酸(dCDP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧腺苷一磷酸(dAMP)、脱氧胸苷一磷酸(dTMP)、脱氧胞苷一磷酸(dCMP)和脱氧鸟苷一磷酸(dGMP)。包含脱氧核糖作为糖部分的示例性天然脱氧核糖核苷酸包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP和dGMP。包含核糖作为糖部分的示例性天然核糖核苷酸包括ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP和GMP。
如本文所用，“碱基”或“核碱基”是指核苷或核苷酸(核苷和核苷酸涵盖核糖或脱氧核糖变体)的至少核碱基部分，所述核苷或核苷酸在一些情形中可以含有对核苷或核苷酸的糖部分的进一步修饰。在一些情形中，“碱基”也用于代表整个核苷或核苷酸(例如，“碱基”可以通过DNA聚合酶掺入DNA中，或通过RNA聚合酶掺入RNA中)。然而，除非上下文要求，否则术语“碱基”不应解释为必然代表整个核苷或核苷酸。在本文提供的碱基或核碱基化学结构中，仅示出核苷或核苷酸的碱基，为清楚起见省略了糖部分和任选的任何磷酸酯残基。如本文提供的碱基或核碱基化学结构中使用的，波浪线代表与核苷或核苷酸的连接，其中核苷或核苷酸的糖部分可以被进一步修饰。在一些实施方案中，波浪线代表碱基或核碱基与核苷或核苷酸的糖部分(如戊糖)的附接。在一些实施方案中，戊糖是核糖或脱氧核糖。
在一些实施方案中，核碱基通常是核苷的杂环碱基部分。核碱基可以是天然存在的，可以是经修饰的，可以与天然碱基没有相似性，和/或可以是合成的，例如通过有机合成而合成。在某些实施方案中，核碱基包含核苷或核苷酸中的任何原子或原子组，其中所述原子或原子组能够在使用或不使用氢键的情况下与另一核酸的碱基相互作用。在某些实施方案中，非天然核碱基不是源自天然核碱基。应注意的是，非天然核碱基不一定具有碱基特性，但是为了简单起见，它们称为核碱基。在一些实施方案中，当提及核碱基时，“(d)”指示核碱基可以附接至脱氧核糖或核糖，而没有括号的“d”指示核碱基附接至脱氧核糖。
如本文所用，“核苷”是包含核碱基部分和糖部分的化合物。核苷包括但不限于天然存在的核苷(如在DNA和RNA中发现的)、脱碱基核苷、经修饰的核苷和具有模拟碱基和/或糖基团的核苷。核苷包括包含任何种类的取代基的核苷。核苷可以是通过核酸碱基与糖的还原基团之间的糖苷连接形成的糖苷化合物。
如本文所用的术语化学结构的“类似物”是指与母体结构保持基本相似性但它可能不容易从母体结构合成得到的化学结构。在一些实施方案中，核苷酸类似物是非天然核苷酸。在一些实施方案中，核苷类似物是非天然核苷。容易从母体化学结构合成得到的相关化学结构称为“衍生物”。
如本文所用，“剂量限制性毒性”(DLT)被定义为在治疗周期的第1天至第29天(包含)±1天内发生的不良事件，所述不良事件不是明确地或无疑地仅仅与无关原因相关并且符合实施例5中所示的DLT标准。
如本文所用，“西妥昔单抗”是指由Eli Lilly and Co.以品牌名“Erbitux”市售的嵌合(小鼠/人)抗EGFR抗体。
尽管本发明的各种特征可以在单一实施方案的上下文中描述，但所述特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在分开的实施方案的背景下描述本发明，但是本发明也可以在单一实施方案中实现。
IL-2缀合物
白介素2(IL-2)是一种多效性1型细胞因子，其结构包含15.5kDa的四α-螺旋束。IL-2的前体形式的长度为153个氨基酸残基，其中前20个氨基酸形成信号肽，并且残基21-153形成成熟形式。IL-2主要由CD4+T细胞在抗原刺激后产生，以及由CD8+细胞、自然杀伤(NK)细胞、和自然杀伤T(NKT)细胞、激活的树突细胞(DC)和肥大细胞以较低程度产生。IL-2信号传导通过与IL-2受体(IL-2R)亚基、IL-2Rα(也称为CD25)、IL-2Rβ(也称为CD122)和IL-2Rγ(也称为CD132)的特定组合的相互作用来进行。IL-2与IL-2Rα的相互作用以约10-8M的Kd形成“低亲和力”IL-2受体复合物。IL-2与IL-2Rβ和IL-2Rγ的相互作用以约10-9M的Kd形成“中亲和力”IL-2受体复合物。IL-2与所有三种亚基IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ的相互作用以约>10-11M的Kd形成“高亲和力”IL-2受体复合物。
在一些情况下，经由“高亲和力”IL-2Rαβγ复合物的IL-2信号传导调节调节性T细胞的激活和增殖。调节性T细胞或CD4+CD25+Foxp3+调节性T(Treg)细胞通过抑制效应细胞(如CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞)来介导免疫稳态的维持。在一些情况下，Treg细胞是从胸腺生成(tTreg细胞)，或者是从外周的幼稚T细胞诱导(pTreg细胞)。在一些情形中，将Treg细胞视为外周耐受的介体。实际上，在一项研究中，CD25耗尽的外周CD4+T细胞的转移在裸小鼠中产生多种自身免疫性疾病，而CD4+CD25+T细胞的共转移抑制自身免疫的发展(Sakaguchi,等人,“Immunologic self-tolerance maintained by activatedT cells expressing IL-2receptor alpha-chains(CD25),”J.Immunol.155(3):1151-1164(1995)，将其中每一个的公开内容通过引用并入本文)。Treg细胞群的增大下调效应T细胞增殖并抑制自身免疫和T细胞抗肿瘤应答。
经由“中亲和力”IL-2Rβγ复合物的IL-2信号传导调节CD8+效应T(Teff)细胞、NK细胞和NKT细胞的激活和增殖。CD8+Teff细胞(也称为细胞毒性T细胞、Tc细胞、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、细胞裂解性T细胞、Tcon或杀伤T细胞)是识别并杀伤受损细胞、癌细胞和病原体感染的细胞的T淋巴细胞。NK和NKT细胞是与CD8+Teff细胞类似的淋巴细胞类型，其靶向癌细胞和病原体感染的细胞。
在一些情况下，IL-2信号传导用于调节T细胞应答，且随后用于治疗癌症。例如，以高剂量形式施用IL-2以诱导用于治疗癌症的Teff细胞群的扩增。然而，高剂量IL-2进一步导致对Treg细胞的伴随刺激，从而减弱抗肿瘤免疫应答。高剂量IL-2还诱导由脉管***中的IL-2Rα链表达细胞(包括2型先天免疫细胞(ILC-2)、嗜酸性粒细胞和内皮细胞)的接合介导的毒性不良事件。这导致嗜酸性粒细胞增多症、毛细血管渗漏和血管渗漏综合征(VLS)。
过继细胞疗法使得医生能够有效利用患者自身的免疫细胞对抗疾病，如增殖性疾病(例如，癌症)以及感染性疾病。可以通过组合疗法中另外的药剂或方法的存在来进一步增强IL-2信号传导的作用。例如，表皮生长因子受体(EGFR)是在许多癌症类型中过度表达的细胞表面受体。EGFR的激活促进细胞增殖和存活，以及血管生成，导致肿瘤生长和转移。细胞生长和血管生成可以通过阻断EGFR与表皮生长因子(EGF)的结合调节。抗EGFR抗体与EGFR的胞外结构域结合并且防止EGF与EGFR结合，因此抑制下游信号转导级联并且导致细胞生长减少。抗EGFR抗体也可以通过竞争性抑制转化生长因子α(TGF-α)与EGFR结合引起相同效果。
本文提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(a)IL-2缀合物和(b)抗EGFR抗体。某些示例性IL-2多肽和IL-2缀合物提供于表1中。
表1.
Figure BDA0004086255800000091
/>
Figure BDA0004086255800000101
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Figure BDA0004086255800000111
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Figure BDA0004086255800000121
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Figure BDA0004086255800000131
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Figure BDA0004086255800000141
/>
Figure BDA0004086255800000151
/>
Figure BDA0004086255800000161
X＝包含非天然氨基酸的位点。
[AzK]＝N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸，具有化学文摘注册号1167421-25-1。
[AzK_PEG]＝经由DBCO介导的点击化学与PEG稳定缀合的N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸，以形成包含式(II)或式(III)的结构的化合物。例如，如果指定，PEG5kD指示用甲氧基封端的线性聚乙二醇链，其平均分子量为5千道尔顿。从点击反应生成的区域异构体的比率为约1:1或大于1:1。术语“DBCO”意指包含二苯并环辛炔基团的化学部份。
[AzK_L1_PEG]＝经由DBCO介导的点击化学与PEG稳定缀合的N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸，以形成包含式(IV)或式(V)的结构的化合物。例如，如果指定，PEG5kD指示用甲氧基封端的线性聚乙二醇链，其平均分子量为5千道尔顿。从点击反应生成的区域异构体的比率为约1:1或大于1:1。术语“DBCO”意指包含二苯并环辛炔基团的化学部份。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(I)的结构替代：
Figure BDA0004086255800000171
其中：
Z是CH2并且Y是
Figure BDA0004086255800000172
Y是CH2并且Z是
Figure BDA0004086255800000173
Z是CH2并且Y是
Figure BDA0004086255800000174
或者
Y是CH2并且Z是
Figure BDA0004086255800000175
W是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000176
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点；
其中所述式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71。
在本文所述的式(I)的任何实施方案或变型中，所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是溶剂化物。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是水合物。
在本文所述的式(I)的一些实施方案或变型中，X是L-氨基酸。
在式(I)的一些实施方案中，Z是CH2并且Y是
Figure BDA0004086255800000177
在式(I)的一些实施方案中，Y是CH2并且Z是
Figure BDA0004086255800000178
在式(I)的一些实施方案中，Z是CH2并且Y是/>
Figure BDA0004086255800000181
在式(I)的一些实施方案中，Y是CH2并且Z是/>
Figure BDA0004086255800000182
在式(I)的一些实施方案中，q是1。在式(I)的一些实施方案中，q是2。在式(I)的一些实施方案中，q是3。
在式(I)的一些实施方案中，q是1并且式(I)的结构是式(Ia)的结构：
Figure BDA0004086255800000183
其中：
Z是CH2并且Y是
Figure BDA0004086255800000184
Y是CH2并且Z是
Figure BDA0004086255800000185
Z是CH2并且Y是
Figure BDA0004086255800000186
或者
Y是CH2并且Z是
Figure BDA0004086255800000187
W是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000188
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点；
其中式(Ia)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71。
在式(Ia)的一些实施方案中，Z是CH2并且Y是
Figure BDA0004086255800000189
在式(Ia)的一些实施方案中，Y是CH2并且Z是/>
Figure BDA0004086255800000191
在式(Ia)的一些实施方案中，Z是CH2并且Y是/>
Figure BDA0004086255800000192
在式(Ia)的一些实施方案中，Z是CH2并且Y是/>
Figure BDA0004086255800000193
在式(Ia)的一些实施方案中，Y是CH2并且Z是
Figure BDA0004086255800000194
在一些实施方案中，所述PEG基团具有选自约5kDa、10kDa、20kDa和30kDa的平均分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有约5kDa的平均分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有约10kDa的平均分子量。在一些实施方案中，在所述PEG基团中具有约15kDa的平均分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有约20kDa的平均分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有约25kDa的平均分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有约30kDa的平均分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有约35kDa的平均分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有约40kDa的平均分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有约45kDa的平均分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有约50kDa的平均分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有约60kDa的平均分子量。
在一些实施方案中，式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71，其中式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自F41、E61和P64，其中式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中是K34，其中式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中是F41，其中式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中选自F43，其中式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中是K42，其中式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中是E61，其中式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中是P64，其中式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中是R37，其中式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中是T40，其中式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中选自E67，其中式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中是Y44，其中式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ IDNO:3中的位置。在一些实施方案中，式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中是V68，其中式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中是L71，其中式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:15-19中任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG]具有式(II)或式(III)的结构，或者式(II)与式(III)的混合物：
Figure BDA0004086255800000201
W是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000202
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在这里和自始至终，式(II)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在这里和自始至终，式(III)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
在一些实施方案中，q是1并且式(II)和式(III)的结构是式(IIa)和式(IIIa)的结构：
Figure BDA0004086255800000203
Figure BDA0004086255800000211
其中：
W是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000212
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，所述[AzK_PEG]是式(II)与式(III)的混合物。在一些实施方案中，所述[AzK_PEG]是式(IIa)与式(IIIa)的混合物。
在一些实施方案中，所述[AzK_PEG]具有式(II)的结构。在一些实施方案中，所述[AzK_PEG]具有式(IIa)的结构。
在一些实施方案中，所述[AzK_PEG]具有式(III)的结构。在一些实施方案中，所述[AzK_PEG]具有式(IIIa)的结构。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述[AzK_PEG]具有式(III)的结构。在一些实施方案中，所述[AzK_PEG]具有式(IIIa)的结构。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(III)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:15、16、17、18和19中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG]含有具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:15、16、17、18和19中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG]含有具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:15、16、17、18和19中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG]含有具有约10kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:15、16、17、18和19中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG]含有具有约15kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:15、16、17、18和19中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG]含有具有约20kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:15、16、17、18和19中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG]含有具有约25kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:15、16、17、18和19中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG]含有具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:15、16、17、18和19中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG]含有具有约35kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:15、16、17、18和19中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG]含有具有约40kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:15、16、17、18和19中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG]含有具有约45kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:15、16、17、18和19中的任一个的氨基酸序列，[AzK_PEG]含有具有约50kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:15、16、17、18和19中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG]含有具有约60kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:15、16、17、18和19中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG]含有具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团，并且所述PEG基团是甲氧基PEG基团、线性甲氧基PEG基团或分支甲氧基PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:20-24中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG5kD]具有式(II)或式(III)的结构，或者式(II)与式(III)的混合物。
Figure BDA0004086255800000231
其中：
W是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000241
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_PEG5kD]具有式(IIa)或式(IIIa)的结构，或者式(IIa)与式(IIIa)的混合物。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ IDNO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述[AzK_PEG5kD]具有式(II)的结构
Figure BDA0004086255800000242
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_PEG5kD]具有式(IIa)的结构。
在一些实施方案中，所述[AzK_PEG5kD]具有式(III)的结构：
Figure BDA0004086255800000243
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_PEG5kD]具有式(IIIa)的结构。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:25-29中的任一个的序列，其中[AzK_PEG30kD]具有式(II)或式(III)的结构，或者是式(II)与式(III)的结构的混合物。
Figure BDA0004086255800000244
Figure BDA0004086255800000251
其中：
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000252
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_PEG30kD]具有式(IIa)或式(IIIa)的结构，或者是式(IIa)与式(IIIa)的结构的混合物。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ IDNO:28的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述[AzK_PEG30kD]具有式(II)的结构：
Figure BDA0004086255800000253
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_PEG30kD]具有式(IIa)的结构。
在一些实施方案中，所述方法使用IL-2缀合物，在所述缀合物中[AzK_PEG30kD]具有式(III)的结构：
Figure BDA0004086255800000254
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_PEG30kD]具有式(IIIa)的结构。
在一些实施方案中，所述[AzK_PEG]是式(II)与式(III)的结构的混合物：
Figure BDA0004086255800000261
其中：
W是具有选自5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000262
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_PEG]是式(IIa)与式(IIIa)的结构的混合物。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_PEG]的总量包含的式(II)结构的量与式(III)结构的量的比率是约1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_PEG]的总量包含的式(II)结构的量与式(III)结构的量的比率大于1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_PEG]的总量包含的式(II)结构的量与式(III)结构的量的比率小于1:1。
在一些实施方案中，W是线性或分支PEG基团。在一些实施方案中，W是线性PEG基团。在一些实施方案中，W是分支PEG基团。在一些实施方案中，W是甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，所述甲氧基PEG基团是线性的或分支的。在一些实施方案中，所述甲氧基PEG基团是线性的。在一些实施方案中，所述甲氧基PEG基团是分支的。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:20至24中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG5kD]是式(II)与式(III)的结构的混合物：
Figure BDA0004086255800000263
Figure BDA0004086255800000271
其中：
W是具有5kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000272
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_PEG5kD]是式(IIa)与式(IIIa)的结构的混合物。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_PEG5kD]的总量包含的式(II)结构的量与式(III)结构的量的比率是约1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_PEG5kD]的总量包含的式(II)结构的量与式(III)结构的量的比率大于1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_PEG5kD]的总量包含的式(II)结构的量与式(III)结构的量的比率小于1:1。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:25-29中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_PEG30kD]是式(II)与式(III)的结构的混合物：
Figure BDA0004086255800000273
其中：
W是具有30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000281
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_PEG30kD]是式(IIa)与式(IIIa)的结构的混合物。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_PEG30kD]的总量包含的式(II)结构的量与式(III)结构的量的比率是约1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_PEG30kD]的总量包含的式(II)结构的量与式(III)结构的量的比率大于1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_PEG30kD]的总量包含的式(II)结构的量与式(III)结构的量的比率小于1:1。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含式(II)或式(III)的结构，或者式(II)与式(III)的混合物，其中W是线性或分支的PEG基团，或者其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在一些实施方案中，W在式(II)或式(III)的结构中是线性PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)或式(III)的结构中是分支PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)或式(III)的结构中是甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，W在式(II)或式(III)的结构中是线性或分支的甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，所述甲氧基PEG基团在式(II)或式(III)的结构中是线性的。在一些实施方案中，所述甲氧基PEG基团在式(II)或式(III)的结构中是分支的。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:40-44中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG]具有式(IV)或式(V)的结构，或者式(IV)与式(V)的混合物：
Figure BDA0004086255800000282
其中：
W是具有选自5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000291
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在式(IV)或式(V)，或者式(IV)或式(V)的混合物的一些实施方案中，q是1。在式(IV)或式(V)，或者式(IV)或式(V)的混合物的一些实施方案中，q是2。在式(IV)或式(V)，或者式(IV)或式(V)的混合物的一些实施方案中，q是3。
在这里和自始至终，式(IV)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在这里和自始至终，式(V)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
在一些实施方案中，q是1并且式(IV)和式(V)的结构是式(IVa)和式(Va)：
Figure BDA0004086255800000292
其中：
W是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000293
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，所述[AzK_L1_PEG]是式(IV)与式(V)的混合物。在一些实施方案中，所述[AzK_L1_PEG]是式(IVa)与式(Va)的混合物。
在一些实施方案中，所述[AzK_L1_PEG]具有式(IV)的结构：
Figure BDA0004086255800000301
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_L1_PEG]具有式(IVa)的结构。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述[AzK_L1_PEG]具有式(V)的结构：
Figure BDA0004086255800000302
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_L1_PEG]具有式(V)的结构。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有选自约5kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(V)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:40、41、42、43和44中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG]含有具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:40、41、42、43和44中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG]含有具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:40、41、42、43和44中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG]含有具有约10kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:40、41、42、43和44中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG]含有具有约15kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:40、41、42、43和44中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG]含有具有约20kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:40、41、42、43和44中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG]含有具有约25kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:40、41、42、43和44中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG]含有具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:40、41、42、43和44中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG]含有具有约35kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:40、41、42、43和44中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG]含有具有约40kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:40、41、42、43和44中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG]含有具有约45kDa的平均分子量的PEG基团在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:40、41、42、43和44中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG]含有具有约50kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:40、41、42、43和44中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG]含有具有约60kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有选自SEQ ID NO:40、41、42、43和44中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG]含有具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团，并且其中所述PEG基团是甲氧基PEG基团、线性甲氧基PEG基团或分支甲氧基PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:45-49中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG5kD]具有式(IV)或式(V)的结构，或者式(IV)与式(V)的混合物：
Figure BDA0004086255800000321
其中：
W是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000322
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_L1_PEG5kD]具有式(IVa)或式(Va)的结构，或者式(IVa)与式(Va)的混合物。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ IDNO:48的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述[AzK_L1_PEG5kD]具有式(IV)的结构
Figure BDA0004086255800000331
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_L1_PEG5kD]具有式(IVa)的结构。
在一些实施方案中，所述[AzK_L1_PEG5kD]具有式(V)的结构
Figure BDA0004086255800000332
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_L1_PEG5kD]具有式(Va)的结构。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:50-54中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG30kD]具有式(IV)或式(V)的结构，或者是式(IV)与式(V)的结构的混合物：
Figure BDA0004086255800000333
其中：
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000334
/>
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_L1_PEG30kD]具有式(IVa)或式(Va)的结构，或者是式(IVa)与式(Va)的结构的混合物。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ IDNO:53的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述[AzK_L1_PEG30kD]具有式(IV)的结构：
Figure BDA0004086255800000341
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_L1_PEG30kD]具有式(IVa)的结构。
在一些实施方案中，所述[AzK_L1_PEG30kD]具有式(V)的结构：
Figure BDA0004086255800000342
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_L1_PEG30kD]具有式(Va)的结构。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:40-44中的任一个的氨基酸序列，其中[Azk_L1_PEG]是式(IV)与式(V)的结构的混合物：
Figure BDA0004086255800000343
/>
其中：
W是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000351
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_L1_PEG]的总量包含的式(IV)结构的量与式(V)结构的量的比率是约1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_L1_PEG]的总量包含的式(IV)结构的量与式(V)结构的量的比率大于1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_L1_PEG]的总量包含的式(IV)结构的量与式(V)结构的量的比率小于1:1。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:45至49中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG5kD]是式(IV)与式(V)的结构的混合物：
Figure BDA0004086255800000352
其中：
W是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000353
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一个实施方案中，q是1并且所述[AzK_L1_PEG5kD]是式(IVa)与式(Va)的结构的混合物。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_L1_PEG5kD]的总量包含的式(IV)结构的量与式(V)结构的量的比率是约1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_L1_PEG5kD]的总量包含的式(IV)结构的量与式(V)结构的量的比率大于1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_L1_PEG5kD]的总量包含的式(IV)结构的量与式(V)结构的量的比率小于1:1。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:50-54中的任一个的氨基酸序列，其中[AzK_L1 PEG30kD]是式(IV)与式(V)的结构的混合物：
Figure BDA0004086255800000361
其中：
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000362
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，q是1并且所述[AzK_L1 PEG30kD]是式(IVa)与式(Va)的结构的混合物。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_L1_PEG30kD]的总量包含的式(IV)结构的量与式(V)结构的量的比率是约1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_L1_PEG30kD]的总量包含的式(IV)结构的量与式(V)结构的量的比率大于1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中[AzK_L1_PEG30kD]的总量包含的式(IV)结构的量与式(V)结构的量的比率小于1:1。
在一些实施方案中，W在式(IV)或(V)的结构中是具有选自约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa和30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或(V)的结构中是具有约5kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或(V)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或(V)的结构中是具有约10kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或(V)的结构中是具有约15kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或(V)的结构中是具有约20kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或(V)的结构中是具有约25kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或(V)的结构中是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或(V)的结构中是具有约35kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或(V)的结构中是具有约40kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或(V)的结构中是具有约45kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或(V)的结构中是具有约50kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或(V)的结构中是具有约55kDa的平均分子量的PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或(V)的结构中是具有约60kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，本文所述的IL-2缀合物包含式(IV)或式(V)的结构，或者式(II)与式(III)的混合物，其中W是线性或分支PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或式(V)的结构中是线性PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或式(V)的结构中是分支PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或式(V)的结构中是甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，W在式(IV)或式(V)的结构中是线性或分支的甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，所述甲氧基PEG基团在式(IV)或式(V)的结构中是线性的。在一些实施方案中，所述甲氧基PEG基团在式(IV)或式(V)的结构中是分支的。
关于用于本文所述方法的IL-2缀合物，甲氧基PEG基团的示例性结构示于以下mPEG-DBCO结构中。
Figure BDA0004086255800000371
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VI)或(VII)的结构或者(VI)与(VII)的混合物替代：
Figure BDA0004086255800000372
Figure BDA0004086255800000381
其中：
n是在约2至约5000范围内的整数；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000382
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在式(VI)或式(VII)，或者式(VI)或式(VII)的混合物的一些实施方案中，q是1。在式(VI)或式(VII)，或者式(VI)或式(VII)的混合物的一些实施方案中，q是2。在式(VI)或式(VII)，或者式(VI)或式(VII)的混合物的一些实施方案中，q是3。
在这里和自始至终，式(VI)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在这里和自始至终，式(VII)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
在一些实施方案中，q是1并且式(VI)和式(VII)的结构是式(VIa)和式(VIIa)的结构：
Figure BDA0004086255800000383
其中：
n是在约2至约5000范围内的整数；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000391
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，式(VI)和(VII)的化合物中的n在以下范围内：约5至约4600、或约10至约4000、或约20至约3000、或约100至约3000、或约100至约2900、或约150至约2900、或约125至约2900、或约100至约2500、或约100至约2000、或约100至约1900、或约100至约1850、或约100至约1750、或约100至约1650、或约100至约1500、或约100至约1400、或约100至约1300、或约100至约1250、或约100至约1150、或约100至约1100、或约100至约1000、或约100至约900、或约100至约750、或约100至约700、或约100至约600、或约100至约575、或约100至约500、或约100至约450、或约100至约350、或约100至约275、或约100至约230、或约150至约475、或约150至约340、或约113至约340、或约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约340至约795、或约341至约682、或约568至约909、或约227至约1500、或约225至约2280、或约460至约2160、或约460至约2050、或约341至约1820、或约341至约1710、或约341至约1250、或约225至约1250、或约341至约1250、或约341至约1136、或约341至约1023、或约341至约910、或约341至约796、或约341至约682、或约341至约568、或约114至约1000、或约114至约950、或约114至约910、或约114至约800、或约114至约690、或约114至约575。在一些实施方案中，式(VI)和(VII)的化合物中的n是选自以下的整数：2、5、10、11、22、23、113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137、1249、1250、1251、1362、1363、1364、1476、1477、1478、1589、1590、1591、1703、1704、1705、1817、1818、1819、1930、1931、1932、2044、2045、2046、2158、2159、2160、2271、2272、2273、2839、2840、2841、2953、2954、2955、3408、3409、3410、3976、3977、3978、4544、4545和4546。
在一些实施方案中，式(VI)、式(VII)的结构或者式(VI)与(VII)的混合物在IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71，其中式(I)的结构在IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(VI)、式(VII)的结构或者式(VI)与(VII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71。在一些实施方案中，式(VI)、式(VII)的结构或者式(VI)与(VII)的混合物在SEQ IDNO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置K34。在一些实施方案中，式(VI)、式(VII)的结构或者式(VI)与(VII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置F41。在一些实施方案中，式(VI)、式(VII)的结构或者式(VI)与(VII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置F43。在一些实施方案中，式(VI)、式(VII)的结构或者式(VI)与(VII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置K42。在一些实施方案中，式(VI)、式(VII)的结构或者式(VI)与(VII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置E61。在一些实施方案中，式(VI)、式(VII)的结构或者式(VI)与(VII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置P64。在一些实施方案中，式(VI)、式(VII)的结构或者式(VI)与(VII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置R37。在一些实施方案中，式(VI)、式(VII)的结构或者式(VI)与(VII)的混合物在SEQ IDNO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置T40。在一些实施方案中，式(VI)、式(VII)的结构或者式(VI)与(VII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置E67。在一些实施方案中，式(VI)、式(VII)的结构或者式(VI)与(VII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置Y44。在一些实施方案中，式(VI)、式(VII)的结构或者式(VI)与(VII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置V68。在一些实施方案中，式(VI)、式(VII)的结构或者式(VI)与(VII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置L71。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(VI)结构的量与式(VII)结构的量的比率是约1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(VI)结构的量与式(VII)结构的量的比率大于1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(VI)结构的量与式(VII)结构的量的比率小于1:1。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VI)或(VII)的结构或者(VI)与(VII)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71，并且其中n是以下的整数：100至约1150、或约100至约1100、或约100至约1000、或约100至约900、或约100至约750、或约100至约700、或约100至约600、或约100至约575、或约100至约500、或约100至约450、或约100至约350、或约100至约275、或约100至约230、或约150至约475、或约150至约340、或约113至约340、或约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约340至约795、或约341至约682、或约568至约909、或约227至约1500、或约225至约2280、或约460至约2160、或约460至约2050、或约341至约1820、或约341至约1710、或约341至约1250、或约225至约1250、或约341至约1250、或约341至约1136、或约341至约1023、或约341至约910、或约341至约796、或约341至约682、或约341至约568、或约114至约1000、或约114至约950、或约114至约910、或约114至约800、或约114至约690、或约114至约575。在一些实施方案中，式(VI)和(VII)的化合物中的n是选自以下的整数：2、5、10、11、22、23、113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137、1249、1250、1251、1362、1363、1364、1476、1477、1478、1589、1590、1591、1703、1704、1705、1817、1818、1819、1930、1931、1932、2044、2045、2046、2158、2159、2160、2271、2272、2273、2839、2840、2841、2953、2954、2955、3408、3409、3410、3976、3977、3978、4544、4545和4546。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VI)或(VII)的结构或者(VI)与(VII)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自F41、F43、K42、E61和P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(VI)和(VII)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137和1249。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VI)或(VII)的结构或者(VI)与(VII)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自E61和P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(VI)和(VII)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VI)或(VII)的结构或者(VI)与(VII)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基是E61，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(VI)和(VII)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VI)或(VII)的结构或者(VI)与(VII)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基是P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(VI)和(VII)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，式(VI)和(VII)的结构中的n是使得PEG部分的分子量在以下范围内的整数：约1,000道尔顿至约200,000道尔顿、或约2,000道尔顿至约150,000道尔顿、或约3,000道尔顿至约125,000道尔顿、或约4,000道尔顿至约100,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约100,000道尔顿、或约6,000道尔顿至约90,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约80,000道尔顿、或约8,000道尔顿至约70,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约70,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约65,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约60,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约6,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,500道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,500道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约9,500道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,500道尔顿至约30,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约30,000道尔顿。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VI)或(VII)的结构或者(VI)与(VII)的混合物替代，其中n是使得PEG部分为以下分子量的整数：约5,000道尔顿、约7,500道尔顿、约10,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约100,000道尔顿、约125,000道尔顿、约150,000道尔顿、约175,000道尔顿或约200,000道尔顿。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VI)或(VII)的结构或者(VI)与(VII)的混合物替代，其中n是使得PEG部分为以下分子量的整数：约5,000道尔顿、约7,500道尔顿、约10,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿或约50,000道尔顿。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VIII)或(IX)的结构或者(VIII)与(IX)的混合物替代：
Figure BDA0004086255800000421
其中：
n是在约2至约5000范围内的整数；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000422
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在式(VIII)或式(IX)，或者式(VIII)或式(IX)的混合物的一些实施方案中，q是1。在式(VIII)或式(IX)，或者式(VIII)或式(IX)的混合物的一些实施方案中，q是2。在式(VIII)或式(IX)，或者式(VIII)或式(IX)的混合物的一些实施方案中，q是3。
在这里和自始至终，式(VIII)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在这里和自始至终，式(IX)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
在一些实施方案中，q是1并且式(VIII)和式(IX)的结构是式(VIIIa)或(IXa)的结构：
Figure BDA0004086255800000423
Figure BDA0004086255800000431
其中：
n是在约2至约5000范围内的整数；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000432
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，式(VIII)和(IX)的化合物中的n在以下范围内：约5至约4600、或约10至约4000、或约20至约3000、或约100至约3000、或约100至约2900、或约150至约2900、或约125至约2900、或约100至约2500、或约100至约2000、或约100至约1900、或约100至约1850、或约100至约1750、或约100至约1650、或约100至约1500、或约100至约1400、或约100至约1300、或约100至约1250、或约100至约1150、或约100至约1100、或约100至约1000、或约100至约900、或约100至约750、或约100至约700、或约100至约600、或约100至约575、或约100至约500、或约100至约450、或约100至约350、或约100至约275、或约100至约230、或约150至约475、或约150至约340、或约113至约340、或约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约340至约795、或约341至约682、或约568至约909、或约227至约1500、或约225至约2280、或约460至约2160、或约460至约2050、或约341至约1820、或约341至约1710、或约341至约1250、或约225至约1250、或约341至约1250、或约341至约1136、或约341至约1023、或约341至约910、或约341至约796、或约341至约682、或约341至约568、或约114至约1000、或约114至约950、或约114至约910、或约114至约800、或约114至约690、或约114至约575。在一些实施方案中，式(VIII)和(IX)的化合物中的n是选自以下的整数：2、5、10、11、22、23、113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137、1249、1250、1251、1362、1363、1364、1476、1477、1478、1589、1590、1591、1703、1704、1705、1817、1818、1819、1930、1931、1932、2044、2045、2046、2158、2159、2160、2271、2272、2273、2839、2840、2841、2953、2954、2955、3408、3409、3410、3976、3977、3978、4544、4545和4546。
在一些实施方案中，式(VIII)、式(IX)的结构或者式(VIII)与(IX)的混合物在IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71，其中式(VIII)、式(IX)的结构或其混合物在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(VIII)、式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71。在一些实施方案中，式(VIII)、式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置K34。在一些实施方案中，式(VIII)、式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物在SEQID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置F41。在一些实施方案中，式(VIII)、式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置F43。在一些实施方案中，式(VIII)、式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置K42。在一些实施方案中，式(VIII)、式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置E61。在一些实施方案中，式(VIII)、式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置P64。在一些实施方案中，式(VIII)、式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置R37。在一些实施方案中，式(VIII)、式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置T40。在一些实施方案中，式(VIII)、式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置E67。在一些实施方案中，式(VIII)、式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物在SEQID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置Y44。在一些实施方案中，式(VIII)、式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置V68。在一些实施方案中，式(VIII)、式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置L71。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(VIII)结构的量与式(IX)结构的量的比率是约1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(VIII)结构的量与式(IX)结构的量的比率大于1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(VIII)结构的量与式(IX)结构的量的比率小于1:1。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VIII)或(IX)的结构或者(VIII)与(IX)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71，并且其中n是以下的整数：100至约1150、或约100至约1100、或约100至约1000、或约100至约900、或约100至约750、或约100至约700、或约100至约600、或约100至约575、或约100至约500、或约100至约450、或约100至约350、或约100至约275、或约100至约230、或约150至约475、或约150至约340、或约113至约340、或约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约340至约795、或约341至约682、或约568至约909、或约227至约1500、或约225至约2280、或约460至约2160、或约460至约2050、或约341至约1820、或约341至约1710、或约341至约1250、或约225至约1250、或约341至约1250、或约341至约1136、或约341至约1023、或约341至约910、或约341至约796、或约341至约682、或约341至约568、或约114至约1000、或约114至约950、或约114至约910、或约114至约800、或约114至约690、或约114至约575。在一些实施方案中，式(VIII)和(IX)的化合物中的n是选自以下的整数：2、5、10、11、22、23、113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137、1249、1250、1251、1362、1363、1364、1476、1477、1478、1589、1590、1591、1703、1704、1705、1817、1818、1819、1930、1931、1932、2044、2045、2046、2158、2159、2160、2271、2272、2273、2839、2840、2841、2953、2954、2955、3408、3409、3410、3976、3977、3978、4544、4545和4546。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VIII)或(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自F41、F43、K42、E61和P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(VIII)和式(IX)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137和1249。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VIII)或(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自E61和P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(VIII)和式(IX)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VIII)或(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基是E61，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(VIII)和式(IX)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VIII)或式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基是P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(VIII)和式(IX)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VIII)或式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物替代，其中n是使得PEG部分的分子量在以下范围内的整数：约1,000道尔顿至约200,000道尔顿、或约2,000道尔顿至约150,000道尔顿、或约3,000道尔顿至约125,000道尔顿、或约4,000道尔顿至约100,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约100,000道尔顿、或约6,000道尔顿至约90,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约80,000道尔顿、或约8,000道尔顿至约70,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约70,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约65,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约60,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约6,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,500道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,500道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约9,500道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,500道尔顿至约30,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约30,000道尔顿。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VIII)或式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物替代，其中n是使得PEG部分为以下分子量的整数：约5,000道尔顿、约7,500道尔顿、约10,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约100,000道尔顿、约125,000道尔顿、约150,000道尔顿、约175,000道尔顿或约200,000道尔顿。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(VIII)或式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物替代，其中n是使得PEG部分为以下分子量的整数：约5,000道尔顿、约7,500道尔顿、约10,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿或约50,000道尔顿。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(X)或式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物替代：
Figure BDA0004086255800000461
其中：
n是在约2至约5000范围内的整数；
q是1、2或3；并且
所述波浪线指示与SEQ ID NO:3内未被替代的氨基酸残基的共价键。
在式(X)或式(XI)或者式(X)或式(XI)的混合物的一些实施方案中，q是1。在式(X)或式(XI)或者式(X)或式(XI)的混合物的一些实施方案中，q是2。在式(X)或式(XI)或者式(X)或式(XI)的混合物的一些实施方案中，q是3。
在这里和自始至终，式(X)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在这里和自始至终，式(XI)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
在一些实施方案中，q是1并且式(X)和式(XI)的结构是式(Xa)和式(XIa)的结构：
Figure BDA0004086255800000471
其中：
n是在约2至约5000范围内的整数；并且
所述波浪线指示与SEQ ID NO:3内未被替代的氨基酸残基的共价键。
在一些实施方案中，式(X)和式(XI)内手性中心的立体化学是外消旋的，是富含(R)的，是富含(S)的，基本上是(R)，基本上是(S)，是(R)或者是(S)。在一些实施方案中，式(X)和式(XI)内手性中心的立体化学是外消旋的。在一些实施方案中，式(X)和式(XI)内手性中心的立体化学是富含(R)的。在一些实施方案中，式(X)和式(XI)内手性中心的立体化学是富含(S)的。在一些实施方案中，式(X)和式(XI)内手性中心的立体化学基本上是(R)。在一些实施方案中，式(X)和式(XI)内手性中心的立体化学基本上是(S)。在一些实施方案中，式(X)和式(XI)内手性中心的立体化学是(R)。在一些实施方案中，式(X)和式(XI)内手性中心的立体化学是(S)。
在一些实施方案中，式(X)和(XI)的化合物中的n在以下范围内：约5至约4600、或约10至约4000、或约20至约3000、或约100至约3000、或约100至约2900、或约150至约2900、或约125至约2900、或约100至约2500、或约100至约2000、或约100至约1900、或约100至约1850、或约100至约1750、或约100至约1650、或约100至约1500、或约100至约1400、或约100至约1300、或约100至约1250、或约100至约1150、或约100至约1100、或约100至约1000、或约100至约900、或约100至约750、或约100至约700、或约100至约600、或约100至约575、或约100至约500、或约100至约450、或约100至约350、或约100至约275、或约100至约230、或约150至约475、或约150至约340、或约113至约340、或约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约340至约795、或约341至约682、或约568至约909、或约227至约1500、或约225至约2280、或约460至约2160、或约460至约2050、或约341至约1820、或约341至约1710、或约341至约1250、或约225至约1250、或约341至约1250、或约341至约1136、或约341至约1023、或约341至约910、或约341至约796、或约341至约682、或约341至约568、或约114至约1000、或约114至约950、或约114至约910、或约114至约800、或约114至约690、或约114至约575。在一些实施方案中，式(X)和(XI)的化合物中的n是选自以下的整数：2、5、10、11、22、23、113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137、1249、1250、1251、1362、1363、1364、1476、1477、1478、1589、1590、1591、1703、1704、1705、1817、1818、1819、1930、1931、1932、2044、2045、2046、2158、2159、2160、2271、2272、2273、2839、2840、2841、2953、2954、2955、3408、3409、3410、3976、3977、3978、4544、4545和4546。
在一些实施方案中，式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71，其中式(X)、式(XI)的结构或其混合物在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物其中式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71。在一些实施方案中，式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置K34。在一些实施方案中，式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物在SEQID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置F41。在一些实施方案中，式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置F43。在一些实施方案中，式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置K42。在一些实施方案中，式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置E61。在一些实施方案中，式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置P64。在一些实施方案中，式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置R37。在一些实施方案中，式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置T40。在一些实施方案中，式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置E67。在一些实施方案中，式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置Y44。在一些实施方案中，式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置V68。在一些实施方案中，式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置L71。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(X)结构的量与式(XI)结构的量的比率是约1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(X)结构的量与式(XI)结构的量的比率大于1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(X)结构的量与式(XI)结构的量的比率小于1:1。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71，并且其中n是以下的整数：100至约1150、或约100至约1100、或约100至约1000、或约100至约900、或约100至约750、或约100至约700、或约100至约600、或约100至约575、或约100至约500、或约100至约450、或约100至约350、或约100至约275、或约100至约230、或约150至约475、或约150至约340、或约113至约340、或约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约340至约795、或约341至约682、或约568至约909、或约227至约1500、或约225至约2280、或约460至约2160、或约460至约2050、或约341至约1820、或约341至约1710、或约341至约1250、或约225至约1250、或约341至约1250、或约341至约1136、或约341至约1023、或约341至约910、或约341至约796、或约341至约682、或约341至约568、或约114至约1000、或约114至约950、或约114至约910、或约114至约800、或约114至约690、或约114至约575。在一些实施方案中，式(VI)和(VII)的化合物中的n是选自以下的整数：2、5、10、11、22、23、113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137、1249、1250、1251、1362、1363、1364、1476、1477、1478、1589、1590、1591、1703、1704、1705、1817、1818、1819、1930、1931、1932、2044、2045、2046、2158、2159、2160、2271、2272、2273、2839、2840、2841、2953、2954、2955、3408、3409、3410、3976、3977、3978、4544、4545和4546。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自F41、F43、K42、E61和P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(X)和式(XI)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137和1249。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自E61和P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(X)和式(XI)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基是E61，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(X)和式(XI)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基是P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(X)和式(XI)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，式(X)和式(XI)的结构中的n是使得PEG部分的分子量在以下范围内的整数：约1,000道尔顿至约200,000道尔顿、或约2,000道尔顿至约150,000道尔顿、或约3,000道尔顿至约125,000道尔顿、或约4,000道尔顿至约100,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约100,000道尔顿、或约6,000道尔顿至约90,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约80,000道尔顿、或约8,000道尔顿至约70,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约70,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约65,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约60,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约6,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,500道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,500道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约9,500道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,500道尔顿至约30,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约30,000道尔顿。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物替代，其中n是使得PEG部分为以下分子量的整数：约5,000道尔顿、约7,500道尔顿、约10,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约100,000道尔顿、约125,000道尔顿、约150,000道尔顿、约175,000道尔顿或约200,000道尔顿。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(X)、式(XI)的结构或者式(X)与式(XI)的混合物替代，其中n是使得PEG部分为以下分子量的整数：约5,000道尔顿、约7,500道尔顿、约10,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿或约50,000道尔顿。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XII)或式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物替代：
Figure BDA0004086255800000501
其中：
n是在约2至约5000范围内的整数；
q是1、2或3；并且
所述波浪线指示与SEQ ID NO:3内未被替代的氨基酸残基的共价键。
在式(XII)或式(XIII)，或者式(XII)或式(XIII)的混合物的一些实施方案中，q是1。在式(XII)或式(XIII)，或者式(XII)或式(XIII)的混合物的一些实施方案中，q是2。在式(XII)或式(XIII)，或者式(XII)或式(XIII)的混合物的一些实施方案中，q是3。
在这里和自始至终，式(XII)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在这里和自始至终，式(XIII)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
在一些实施方案中，q是1并且式(XII)和式(XIII)的结构是式(XIIa)和式(XIIIa)的结构：
Figure BDA0004086255800000511
其中：
n是在约2至约5000范围内的整数；并且
所述波浪线指示与SEQ ID NO:3内未被替代的氨基酸残基的共价键。
在一些实施方案中，式(XII)和式(XIII)内手性中心的立体化学是外消旋的，是富含(R)的，是富含(S)的，基本上是(R)，基本上是(S)，是(R)或者是(S)。在一些实施方案中，式(XII)和式(XIII)内手性中心的立体化学是外消旋的。在一些实施方案中，式(XII)和式(XIII)内手性中心的立体化学是富含(R)的。在一些实施方案中，式(XII)和式(XIII)内手性中心的立体化学是富含(S)的。在一些实施方案中，式(XII)和式(XIII)内手性中心的立体化学基本上是(R)。在一些实施方案中，式(XII)和式(XIII)内手性中心的立体化学基本上是(S)。在一些实施方案中，式(XII)和式(XIII)内手性中心的立体化学是(R)。在一些实施方案中，式(XII)和式(XIII)内手性中心的立体化学是(S)。
在一些实施方案中，式(XII)和(XIII)的化合物中的n在以下范围内：约5至约4600、或约10至约4000、或约20至约3000、或约100至约3000、或约100至约2900、或约150至约2900、或约125至约2900、或约100至约2500、或约100至约2000、或约100至约1900、或约100至约1850、或约100至约1750、或约100至约1650、或约100至约1500、或约100至约1400、或约100至约1300、或约100至约1250、或约100至约1150、或约100至约1100、或约100至约1000、或约100至约900、或约100至约750、或约100至约700、或约100至约600、或约100至约575、或约100至约500、或约100至约450、或约100至约350、或约100至约275、或约100至约230、或约150至约475、或约150至约340、或约113至约340、或约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约340至约795、或约341至约682、或约568至约909、或约227至约1500、或约225至约2280、或约460至约2160、或约460至约2050、或约341至约1820、或约341至约1710、或约341至约1250、或约225至约1250、或约341至约1250、或约341至约1136、或约341至约1023、或约341至约910、或约341至约796、或约341至约682、或约341至约568、或约114至约1000、或约114至约950、或约114至约910、或约114至约800、或约114至约690、或约114至约575。在一些实施方案中，式(XII)和式(XIII)的化合物中的n是选自以下的整数：2、5、10、11、22、23、113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137、1249、1250、1251、1362、1363、1364、1476、1477、1478、1589、1590、1591、1703、1704、1705、1817、1818、1819、1930、1931、1932、2044、2045、2046、2158、2159、2160、2271、2272、2273、2839、2840、2841、2953、2954、2955、3408、3409、3410、3976、3977、3978、4544、4545和4546。
在一些实施方案中，式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71，其中式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71。在一些实施方案中，式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置K34。在一些实施方案中，式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置F41。在一些实施方案中，式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置F43。在一些实施方案中，式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置K42。在一些实施方案中，式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置E61。在一些实施方案中，式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在SEQID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置P64。在一些实施方案中，式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置R37。在一些实施方案中，式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置T40。在一些实施方案中，式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置E67。在一些实施方案中，式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置Y44。在一些实施方案中，式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置V68。在一些实施方案中，式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置L71。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(XII)结构的量与式(XIII)结构的量的比率是约1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(XII)结构的量与式(XIII)结构的量的比率大于1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(XII)结构的量与式(XIII)结构的量的比率小于1:1。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71，并且其中n是以下的整数：100至约1150、或约100至约1100、或约100至约1000、或约100至约900、或约100至约750、或约100至约700、或约100至约600、或约100至约575、或约100至约500、或约100至约450、或约100至约350、或约100至约275、或约100至约230、或约150至约475、或约150至约340、或约113至约340、或约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约340至约795、或约341至约682、或约568至约909、或约227至约1500、或约225至约2280、或约460至约2160、或约460至约2050、或约341至约1820、或约341至约1710、或约341至约1250、或约225至约1250、或约341至约1250、或约341至约1136、或约341至约1023、或约341至约910、或约341至约796、或约341至约682、或约341至约568、或约114至约1000、或约114至约950、或约114至约910、或约114至约800、或约114至约690、或约114至约575。在一些实施方案中，式(XII)和式(XIII)的化合物中的n是选自以下的整数：2、5、10、11、22、23、113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137、1249、1250、1251、1362、1363、1364、1476、1477、1478、1589、1590、1591、1703、1704、1705、1817、1818、1819、1930、1931、1932、2044、2045、2046、2158、2159、2160、2271、2272、2273、2839、2840、2841、2953、2954、2955、3408、3409、3410、3976、3977、3978、4544、4545和4546。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自F41、F43、K42、E61和P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(XII)和式(XIII)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137和1249。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自E61和P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(XII)和式(XIII)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基是E61，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(XII)和式(XIII)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基是P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(XII)和式(XIII)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，式(XII)或式(XIII)的结构中的n是使得PEG部分的分子量在以下范围内的整数：约1,000道尔顿至约200,000道尔顿、或约2,000道尔顿至约150,000道尔顿、或约3,000道尔顿至约125,000道尔顿、或约4,000道尔顿至约100,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约100,000道尔顿、或约6,000道尔顿至约90,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约80,000道尔顿、或约8,000道尔顿至约70,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约70,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约65,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约60,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约6,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,500道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,500道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约9,500道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,500道尔顿至约30,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约30,000道尔顿。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物替代，其中n是使得PEG部分为以下分子量的整数：约5,000道尔顿、约7,500道尔顿、约10,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约100,000道尔顿、约125,000道尔顿、约150,000道尔顿、约175,000道尔顿或约200,000道尔顿。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XII)、式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物替代，其中n是使得PEG部分为以下分子量的整数：约5,000道尔顿、约7,500道尔顿、约10,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿或约50,000道尔顿。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的E61或P64处的氨基酸残基被式(VIII)或式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物替代：
Figure BDA0004086255800000541
其中：
n是使得PEG基团的分子量为约15,000道尔顿至约60,000道尔顿的整数；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000551
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在式(VIII)或式(IX)，或者式(VIII)或式(IX)的混合物的一些实施方案中，q是1。在式(VIII)或式(IX)，或者式(VIII)或式(IX)的混合物的一些实施方案中，q是2。在式(VIII)或式(IX)，或者式(VIII)或式(IX)的混合物的一些实施方案中，q是3。
在这里和自始至终，式(VIII)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在这里和自始至终，式(IX)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
在一些实施方案中，q是1并且式(VIII)和式(IX)的结构是式(VIIIa)和式(IXa)的结构：
Figure BDA0004086255800000552
其中：
n是使得PEG基团的分子量为约15,000道尔顿至约60,000道尔顿的整数；并且X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000553
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中E61处的氨基酸残基被式(VIII)或式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)混合物替代，并且其中n是使得PEG基团的分子量为约20,000道尔顿至约40,000道尔顿的整数。在一些实施方案中，n是使得PEG基团的分子量为约30,000道尔顿的整数。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中P64处的氨基酸残基被式(VIII)或式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)混合物替代，并且其中n是使得PEG基团的分子量为约20,000道尔顿至约40,000道尔顿的整数。在一些实施方案中，n是使得PEG基团的分子量为约30,000道尔顿的整数。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的E61或P64处的氨基酸残基被式(VIII)或(IX)的结构或者(VIII)与(IX)的混合物替代：
Figure BDA0004086255800000561
其中：
n是使得PEG基团的分子量为约15,000道尔顿至约60,000道尔顿的整数；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800000562
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中E61处的氨基酸残基被式(VIII)或式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)混合物替代，并且其中n是使得PEG基团的分子量为约20,000道尔顿至约40,000道尔顿的整数。在一些实施方案中，n是使得PEG基团的分子量为约30,000道尔顿的整数。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中P64处的氨基酸残基被式(VIII)或式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)混合物替代，并且其中n是使得PEG基团的分子量为约20,000道尔顿至约40,000道尔顿的整数。在一些实施方案中，n是使得PEG基团的分子量为约30,000道尔顿的整数。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被与PEG基团共价键合的半胱氨酸替代。在一些实施方案中，所述PEG基团具有选自以下的分子量：5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa。在一些实施方案中，所述PEG基团具有5kDa的分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有10kDa的分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有15kDa的分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有20kDa的分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有25kDa的分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有30kDa的分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有35kDa的分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有40kDa的分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有45kDa的分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有50kDa的分子量。在一些实施方案中，所述PEG基团具有60kDa的分子量。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列并且所述IL-2缀合物中被半胱氨酸替代的至少一个氨基酸残基选自K34、T36、R37、T40、F41、K42、F43、Y44、E60、E61、E67、K63、P64、V68、L71和Y106。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列并且所述IL-2缀合物中被半胱氨酸替代的至少一个氨基酸残基选自K34、T40、F41、K42、Y44、E60、E61、E67、K63、P64、V68和L71。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列并且所述IL-2缀合物中被半胱氨酸替代的至少一个氨基酸残基选自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中至少一个非赖氨酸残基被包含接头和水溶性聚合物的赖氨酸替代。在一些实施方案中，所述水溶性聚合物是PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含经由不可释放的连接共价键合的PEG基团。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含不可释放的、共价键合的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的非赖氨酸氨基酸被赖氨酸残基替代，并且其中所述赖氨酸残基包含一个或多个水溶性聚合物和共价接头。在一些实施方案中，所述赖氨酸残基位于SEQ ID NO:3的K34-Y106区。在一些实施方案中，所述赖氨酸残基位于K34处。在一些实施方案中，所述赖氨酸残基位于F41处。在一些实施方案中，所述赖氨酸残基位于F43处。在一些实施方案中，所述赖氨酸残基位于K42处。在一些实施方案中，所述赖氨酸残基位于E61处。在一些实施方案中，所述赖氨酸残基位于P64处。在一些实施方案中，所述赖氨酸残基位于R37处。在一些实施方案中，所述赖氨酸残基位于T40处。在一些实施方案中，所述赖氨酸残基位于E67处。在一些实施方案中，所述赖氨酸残基位于Y44处。在一些实施方案中，所述赖氨酸残基位于V68处。在一些实施方案中，所述赖氨酸残基位于L71处。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的非赖氨酸氨基酸被包含以下的氨基酸替代：(a)赖氨酸；(b)共价接头；以及(3)和一个或多个水溶性聚合物。在一些实施方案中，所述一个或多个水溶性聚合物包含PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XIV)或式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物替代：
Figure BDA0004086255800000571
/>
Figure BDA0004086255800000581
其中：
m是0至20的整数；
p是0至20的整数；
n是在约2至约5000范围内的整数；并且
所述波浪线指示与SEQ ID NO:3内未被替代的氨基酸残基的共价键。
在这里和自始至终，式(XIV)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在这里和自始至终，式(XV)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)内手性中心的立体化学是外消旋的，是富含(R)的，是富含(S)的，基本上是(R)，基本上是(S)，是(R)或者是(S)。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)内手性中心的立体化学是外消旋的。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)内手性中心的立体化学是富含(R)的。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)内手性中心的立体化学是富含(S)的。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)内手性中心的立体化学基本上是(R)。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)内手性中心的立体化学基本上是(S)。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)内手性中心的立体化学是(R)。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)内手性中心的立体化学是(S)。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是0至20、或1至18、或1至16、或1至14、或1至12、或1至10、或1至9、或1至8、或1至7、或1至6、或1至5、或1至4、或1至3、或1至2。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是1。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是2。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是3。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是4。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是5。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是6。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是7。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是8。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是9。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是10。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是11。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是12。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是13。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是14。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是15。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是16。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是17。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是18。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是19。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是20。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是1至20、或1至18、或1至16、或1至14、或1至12、或1至10、或1至9、或1至8、或1至7、或1至6、或1至5、或1至4、或1至3、或1至2。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是1。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是2。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是3。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是4。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是5。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是6。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是7。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是8。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是9。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是10。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是11。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是12。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是13。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是14。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是15。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是16。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是17。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是18。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是19。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的p是20。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中式(XIV)和式(XV)的化合物中的n在以下范围内：约5至约4600、或约10至约4000、或约20至约3000、或约100至约3000、或约100至约2900、或约150至约2900、或约125至约2900、或约100至约2500、或约100至约2000、或约100至约1900、或约100至约1850、或约100至约1750、或约100至约1650、或约100至约1500、或约100至约1400、或约100至约1300、或约100至约1250、或约100至约1150、或约100至约1100、或约100至约1000、或约100至约900、或约100至约750、或约100至约700、或约100至约600、或约100至约575、或约100至约500、或约100至约450、或约100至约350、或约100至约275、或约100至约230、或约150至约475、或约150至约340、或约113至约340、或约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约340至约795、或约341至约682、或约568至约909、或约227至约1500、或约225至约2280、或约460至约2160、或约460至约2050、或约341至约1820、或约341至约1710、或约341至约1250、或约225至约1250、或约341至约1250、或约341至约1136、或约341至约1023、或约341至约910、或约341至约796、或约341至约682、或约341至约568、或约114至约1000、或约114至约950、或约114至约910、或约114至约800、或约114至约690、或约114至约575。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中式(XIV)和式(XV)的化合物中的m是1至6的整数，p是1至6的整数，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是2至6的整数，p是2至6的整数，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是2至4的整数，p是2至4的整数，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是1，p是2，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是2，p是2，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是3，p是2，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是4，p是2，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是5，p是2，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是6，p是2，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是7，p是2，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是8，p是2，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是9，p是2，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是10，p是2，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和(XV)的化合物的一些实施方案中，m是11，p是2，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是11，p是2，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是2，p是2，并且n是选自以下的整数：680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中式(XIV)和式(XV)的化合物中的n是选自以下的整数：2、5、10、11、22、23、113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137、1249、1250、1251、1362、1363、1364、1476、1477、1478、1589、1590、1591、1703、1704、1705、1817、1818、1819、1930、1931、1932、2044、2045、2046、2158、2159、2160、2271、2272、2273、2839、2840、2841、2953、2954、2955、3408、3409、3410、3976、3977、3978、4544、4545和4546。在一些实施方案中，式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71，其中式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71。在一些实施方案中，式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置K34。在一些实施方案中，式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置F41。在一些实施方案中，式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在SEQ IDNO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置F43。在一些实施方案中，式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置K42。在一些实施方案中，式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置E61。在一些实施方案中，式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置P64。在一些实施方案中，式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置R37。在一些实施方案中，式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在SEQ IDNO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置T40。在一些实施方案中，式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置E67。在一些实施方案中，式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置Y44。在一些实施方案中，式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置V68。在一些实施方案中，式(XIV)、式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置L71。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(XIV)结构的量与式(XV)结构的量的比率是约1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(XIV)结构的量与式(XV)结构的量的比率大于1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(XIV)结构的量与式(XV)结构的量的比率小于1:1。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XIV)或式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71，并且其中n是以下的整数：100至约1150、或约100至约1100、或约100至约1000、或约100至约900、或约100至约750、或约100至约700、或约100至约600、或约100至约575、或约100至约500、或约100至约450、或约100至约350、或约100至约275、或约100至约230、或约150至约475、或约150至约340、或约113至约340、或约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约340至约795、或约341至约682、或约568至约909、或约227至约1500、或约225至约2280、或约460至约2160、或约460至约2050、或约341至约1820、或约341至约1710、或约341至约1250、或约225至约1250、或约341至约1250、或约341至约1136、或约341至约1023、或约341至约910、或约341至约796、或约341至约682、或约341至约568、或约114至约1000、或约114至约950、或约114至约910、或约114至约800、或约114至约690、或约114至约575。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的n是选自以下的整数：2、5、10、11、22、23、113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137、1249、1250、1251、1362、1363、1364、1476、1477、1478、1589、1590、1591、1703、1704、1705、1817、1818、1819、1930、1931、1932、2044、2045、2046、2158、2159、2160、2271、2272、2273、2839、2840、2841、2953、2954、2955、3408、3409、3410、3976、3977、3978、4544、4545和4546。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XIV)或式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自F41、F43、K42、E61和P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137和1249。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XIV)或式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自E61和P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XIV)或式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基是E61，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XIV)或式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基是P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(XIV)和式(XV)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XIV)或式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物替代，其中n是使得PEG部分的分子量在以下范围内的整数：约1,000道尔顿至约200,000道尔顿、或约2,000道尔顿至约150,000道尔顿、或约3,000道尔顿至约125,000道尔顿、或约4,000道尔顿至约100,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约100,000道尔顿、或约6,000道尔顿至约90,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约80,000道尔顿、或约8,000道尔顿至约70,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约70,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约65,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约60,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约6,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,500道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,500道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约9,500道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,500道尔顿至约30,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约30,000道尔顿。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XIV)或式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物替代，其中n是使得PEG部分为以下分子量的整数：约5,000道尔顿、约7,500道尔顿、约10,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约100,000道尔顿、约125,000道尔顿、约150,000道尔顿、约175,000道尔顿或约200,000道尔顿。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XIV)或式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物替代，其中n是使得PEG部分为以下分子量的整数：约5,000道尔顿、约7,500道尔顿、约10,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿或约50,000道尔顿。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XIV)或式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自F41、F43、K42、E61和P64，m是1至6的整数，p是1至6的整数，并且n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是2，p是2，并且n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137和1249。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XIV)或式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基选自E61和P64，并且其中m是1至6的整数，p是1至6的整数，并且n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是2，p是2，并且n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XIV)或式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基是E61，并且其中m是1至6的整数，p是1至6的整数，并且n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是2，p是2，并且n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XIV)或式(XV)的结构或者式(XIV)与式(XV)的混合物替代，其中SEQ ID NO:3中被替代的氨基酸残基是P64，并且其中m是1至6的整数，p是1至6的整数，并且n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在式(XIV)和式(XV)的化合物的一些实施方案中，m是2，p是2，并且n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XVI)或式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物替代：
Figure BDA0004086255800000641
其中：
m是0至20的整数；
n是在约2至约5000范围内的整数；并且
所述波浪线指示与SEQ ID NO:3内未被替代的氨基酸残基的共价键。
在这里和自始至终，式(XVI)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在这里和自始至终，式(XVII)的结构涵盖其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)内手性中心的立体化学是外消旋的，是富含(R)的，是富含(S)的，基本上是(R)，基本上是(S)，是(R)或者是(S)。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)内手性中心的立体化学是外消旋的。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)内手性中心的立体化学是富含(R)的。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)内手性中心的立体化学是富含(S)的。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)内手性中心的立体化学基本上是(R)。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)内手性中心的立体化学基本上是(S)。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)内手性中心的立体化学是(R)。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)内手性中心的立体化学是(S)。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是1至20、或1至18、或1至16、或1至14、或1至12、或1至10、或1至9、或1至8、或1至7、或1至6、或1至5、或1至4、或1至3、或1至2。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是1。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是2。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是3。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是4。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是5。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是6。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是7。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是8。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是9。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是10。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是11。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是12。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是13。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是14。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是15。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是16。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是17。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是18。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是19。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是20。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中式(XVI)和式(XVII)的化合物中的n在以下范围内：约5至约4600、或约10至约4000、或约20至约3000、或约100至约3000、或约100至约2900、或约150至约2900、或约125至约2900、或约100至约2500、或约100至约2000、或约100至约1900、或约100至约1850、或约100至约1750、或约100至约1650、或约100至约1500、或约100至约1400、或约100至约1300、或约100至约1250、或约100至约1150、或约100至约1100、或约100至约1000、或约100至约900、或约100至约750、或约100至约700、或约100至约600、或约100至约575、或约100至约500、或约100至约450、或约100至约350、或约100至约275、或约100至约230、或约150至约475、或约150至约340、或约113至约340、或约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约340至约795、或约341至约682、或约568至约909、或约227至约1500、或约225至约2280、或约460至约2160、或约460至约2050、或约341至约1820、或约341至约1710、或约341至约1250、或约225至约1250、或约341至约1250、或约341至约1136、或约341至约1023、或约341至约910、或约341至约796、或约341至约682、或约341至约568、或约114至约1000、或约114至约950、或约114至约910、或约114至约800、或约114至约690、或约114至约575。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中式(XVI)和式(XVII)的化合物中的m是1至6的整数，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是2至6的整数，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是2至4的整数，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是1，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是2，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是3，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是4，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是5，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是6，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是7，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是8，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是9，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是10，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是11，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是12，并且n是选自以下的整数：113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是2，并且n是选自以下的整数：680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136和1137。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中式(XVI)和式(XVII)的化合物中的n是选自以下的整数：2、5、10、11、22、23、113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137、1249、1250、1251、1362、1363、1364、1476、1477、1478、1589、1590、1591、1703、1704、1705、1817、1818、1819、1930、1931、1932、2044、2045、2046、2158、2159、2160、2271、2272、2273、2839、2840、2841、2953、2954、2955、3408、3409、3410、3976、3977、3978、4544、4545和4546。在一些实施方案中，式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71，其中式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO:3中的位置。在一些实施方案中，式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71。在一些实施方案中，式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在SEQ IDNO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置K34。在一些实施方案中，式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置F41。在一些实施方案中，式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置F43。在一些实施方案中，式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置K42。在一些实施方案中，式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置E61。在一些实施方案中，式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置P64。在一些实施方案中，式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置R37。在一些实施方案中，式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置T40。在一些实施方案中，式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置E67。在一些实施方案中，式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置Y44。在一些实施方案中，式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在SEQ ID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置V68。在一些实施方案中，式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物在SEQID NO:3的IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是在位置L71。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(XVI)结构的量与式(XVII)结构的量的比率是约1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(XVI)结构的量与式(XVII)结构的量的比率大于1:1。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物的总量包含的式(XVI)结构的量与式(XVII)结构的量的比率小于1:1。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物替代，所述至少一个氨基酸残基选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71，并且其中n是以下的整数：100至约1150、或约100至约1100、或约100至约1000、或约100至约900、或约100至约750、或约100至约700、或约100至约600、或约100至约575、或约100至约500、或约100至约450、或约100至约350、或约100至约275、或约100至约230、或约150至约475、或约150至约340、或约113至约340、或约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约340至约795、或约341至约682、或约568至约909、或约227至约1500、或约225至约2280、或约460至约2160、或约460至约2050、或约341至约1820、或约341至约1710、或约341至约1250、或约225至约1250、或约341至约1250、或约341至约1136、或约341至约1023、或约341至约910、或约341至约796、或约341至约682、或约341至约568、或约114至约1000、或约114至约950、或约114至约910、或约114至约800、或约114至约690、或约114至约575。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的n是选自以下的整数：2、5、10、11、22、23、113、114、227、228、340、341、454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137、1249、1250、1251、1362、1363、1364、1476、1477、1478、1589、1590、1591、1703、1704、1705、1817、1818、1819、1930、1931、1932、2044、2045、2046、2158、2159、2160、2271、2272、2273、2839、2840、2841、2953、2954、2955、3408、3409、3410、3976、3977、3978、4544、4545和4546。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中被式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物替代的至少一个氨基酸残基选自F41、F43、K42、E61和P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137和1249。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中被式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物替代的至少一个氨基酸残基选自E61和P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物替代，被替代的至少一个氨基酸残基是E61，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物替代，被替代的至少一个氨基酸残基是P64，并且其中n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在一些实施方案中，式(XVI)和式(XVII)的化合物中的n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物替代，其中n是使得PEG部分的分子量在以下范围内的整数：约1,000道尔顿至约200,000道尔顿、或约2,000道尔顿至约150,000道尔顿、或约3,000道尔顿至约125,000道尔顿、或约4,000道尔顿至约100,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约100,000道尔顿、或约6,000道尔顿至约90,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约80,000道尔顿、或约8,000道尔顿至约70,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约70,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约65,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约60,000道尔顿、或约5,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约6,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约7,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,500道尔顿至约40,000道尔顿、或约8,500道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约9,500道尔顿至约35,000道尔顿、或约9,500道尔顿至约30,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约10,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约30,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约50,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约45,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约35,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约30,000道尔顿。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物替代，其中n是使得PEG部分为以下分子量的整数：约5,000道尔顿、约7,500道尔顿、约10,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿、约70,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约100,000道尔顿、约125,000道尔顿、约150,000道尔顿、约175,000道尔顿或约200,000道尔顿。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物替代，其中n是使得PEG部分为以下分子量的整数：约5,000道尔顿、约7,500道尔顿、约10,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿或约50,000道尔顿。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中被式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物替代的至少一个氨基酸残基选自F41、F43、K42、E61和P64，m是1至6的整数，并且n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是2，并且n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909、910、1021、1022、1023、1135、1136、1137和1249。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中被式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物替代的至少一个氨基酸残基选自E61和P64，并且其中m是1至6的整数，并且n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是2，并且n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物替代，被替代的至少一个氨基酸残基是E61，并且其中m是1至6的整数，并且n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是2，并且n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中被式(XVI)、式(XVII)的结构或者式(XVI)与式(XVII)的混合物替代的至少一个氨基酸残基是P64，并且其中m是1至6的整数，并且n是以下的整数：约450至约800、或约454至约796、或约454至约682、或约568至约909。在式(XVI)和式(XVII)的化合物的一些实施方案中，m是2，并且n是选自以下的整数：454、455、568、569、680、681、682、794、795、796、908、909和910。在一些实施方案中，n是约500至约1000。在一些实施方案中，n是约550至约800。在一些实施方案中，n是约681。
在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO.:1-98。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO.:15-29。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO.:40-54。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO.:55-69。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO.:70-84。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含式(I)的结构。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含式(II)的结构。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含式(III)的结构。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含式(IV)的结构。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含式(V)的结构。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:13。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:18。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ IDNO:21。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:26。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQIDNO:28。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:26。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:28。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQID NO:30。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:32。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:34。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:35。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:36。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:37。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:39。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:40。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:41。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:42。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:43。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:44。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:46。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:47。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:48。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ IDNO:49。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:50。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQID NO:56。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:57。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:60。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:61。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:62。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:63。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:64。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:65。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:66。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:67。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:68。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:69。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:70。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:71。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:72。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:73。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ IDNO:75。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:76。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:77。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:78。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:79。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:80。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:81。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQID NO:82。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:83。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:84。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:85。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:88。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:89。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:90。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:91。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:93。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:94。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:95。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:98。
在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:86、88、90、92、94、96和98中的任一个的氨基酸序列。在这些实施方案的任一个中，将式(I)的结构或其任何变体(如式(II)-式(XV)或其任何变体)掺入包含非天然氨基酸的位点中。
在一些实施方案中，IL-2缀合物在氨基酸位置处被修饰。在一些情况下，所述修饰是针对天然氨基酸的。在一些情况下，所述修饰是针对非天然氨基酸的。在一些情况下，本文描述包含至少一种非天然氨基酸的分离和修饰的IL-2多肽。在一些情形中，IL-2多肽包含与SEQ ID NO:3至84中的任一个约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施方案中，IL-2缀合物进一步包含另外的突变。在一些情形中，另外的突变位于选自以下的氨基酸位置：K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107。在此类情形中，氨基酸与另外的缀合部分缀合，用于增加血清半衰期、稳定性或其组合。可替代地，在与另外的缀合部分结合之前，氨基酸首先突变为天然氨基酸，如赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸；或者突变为非天然氨基酸。
在一些情形中，PEG基团不限于特定结构。在一些情形中，PEG是线性的(例如，封端的，例如，烷氧基PEG或双官能PEG)、分支的或多臂的(例如，叉状PEG或附接至多元醇核心的PEG)、树枝状(或星形)架构，其各自具有或不具有一个或多个可降解连接。此外，水溶性聚合物的内部结构可以以任何数量的不同重复模式来组织，并且可以选自均聚物、交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、交替三聚物、无规三聚物和嵌段三聚物。
PEG通常将包含许多(OCH2CH2)单体[或(CH2CH2O)单体，取决于如何定义PEG]。如本文所用，重复单元的数量由“(OCH2CH2)n”中的下标“n”来标识。因此，(n)的值通常落入一个或多个以下范围中：2至约3400、约100至约2300、约100至约2270、约136至约2050、约225至约1930、约450至约1930、约1200至约1930、约568至约2727、约660至约2730、约795至约2730、约795至约2730、约909至约2730，以及约1,200至约1,900。对于分子量已知的任何给定聚合物，可以通过用聚合物的总重均分子量除以重复单体的分子量来确定重复单元的数量(即“n”)。
在一些情况下，PEG是封端聚合物，即至少一个末端用相对惰性的基团(如低碳C1-6烷氧基或羟基)封端的聚合物。在聚合物是PEG时，例如，可以使用甲氧基-PEG(通常称为mPEG)，其是PEG的线性形式，其中聚合物的一个末端是甲氧基(—OCH3)基团，而另一个末端是羟基或可以被任选地化学修饰的其他官能团。
在一些实施方案中，构成本文公开的IL-2缀合物的PEG基团是线性或分支PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是线性PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是分支PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是线性或分支甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是线性甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是分支甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是具有约100道尔顿至约150,000道尔顿的平均分子量的线性或分支PEG基团。示例性范围包括例如以下重均分子量：在大于5,000道尔顿至约100,000道尔顿范围内、在约6,000道尔顿至约90,000道尔顿范围内、在约10,000道尔顿至约85,000道尔顿范围内、在大于10,000道尔顿至约85,000道尔顿范围内、在约20,000道尔顿至约85,000道尔顿范围内、在约53,000道尔顿至约85,000道尔顿范围内、在约25,000道尔顿至约120,000道尔顿范围内、在约29,000道尔顿至约120,000道尔顿范围内、在约35,000道尔顿至约120,000道尔顿范围内以及在约40,000道尔顿至约120,000道尔顿范围内。PEG基团的示例性重均分子量包括约100道尔顿、约200道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800道尔顿、约900道尔顿、约1,000道尔顿、约1,500道尔顿、约2,000道尔顿、约2,200道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约4,000道尔顿、约4,400道尔顿、约4,500道尔顿、约5,000道尔顿、约5,500道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约55,000道尔顿、约60,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿、约75,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约95,000道尔顿和约100,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG基团是具有如上文所公开的平均分子量的线性PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是具有如上文所公开的平均分子量的分支PEG基团。在一些实施方案中，构成本文公开的IL-2缀合物的PEG基团是具有限定的分子量±10％或15％或20％或25％的线性或分支PEG基团。例如，本公开文本的范围内包括包含分子量为30,000Da±3000Da、或30,000Da±4,500Da、或30,000Da±6,000Da的PEG基团的IL-2缀合物。
在一些实施方案中，构成本文公开的IL-2缀合物的PEG基团是具有约5,000道尔顿至约60,000道尔顿的平均分子量的线性或分支PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是具有以下平均分子量的线性或分支PEG基团：约5,000道尔顿、约5,500道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约55,000道尔顿、约60,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿、约75,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约95,000道尔顿和约100,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG基团是具有以下平均分子量的线性或分支PEG基团：约5,000道尔顿、约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、约50,000道尔顿或约60,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG基团是具有以下平均分子量的线性或分支PEG基团：约5,000道尔顿、约30,000道尔顿、约50,000道尔顿或约60,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG基团是具有以下平均分子量的线性PEG基团：约5,000道尔顿、约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、约50,000道尔顿或约60,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG基团是具有以下平均分子量的分支PEG基团：约5,000道尔顿、约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、约50,000道尔顿或约60,000道尔顿。
在一些实施方案中，构成本文公开的IL-2缀合物的PEG基团是具有约5,000道尔顿至约60,000道尔顿的平均分子量的线性甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是具有以下平均分子量的线性甲氧基PEG基团：约5,000道尔顿、约5,500道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约55,000道尔顿、约60,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿、约75,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约95,000道尔顿和约100,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG基团是具有以下平均分子量的线性甲氧基PEG基团：约5,000道尔顿、约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、约50,000道尔顿或约60,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG基团是具有以下平均分子量的线性甲氧基PEG基团：约5,000道尔顿、约30,000道尔顿、约50,000道尔顿或约60,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG基团是具有以下平均分子的线性甲氧基PEG基团：约5,000道尔顿、约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、约50,000道尔顿或约60,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG基团是平均分子量为约5,000道尔顿的线性甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是平均分子量为约10,000道尔顿的线性甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是平均分子量为约20,000道尔顿的线性甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是平均分子量为约30,000道尔顿的线性甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是平均分子量为约50,000道尔顿的线性甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是平均分子量为约60,000道尔顿的线性甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，构成本文公开的IL-2缀合物的PEG基团是具有限定的分子量±10％或15％或20％或25％的线性甲氧基PEG基团。例如，本公开文本的范围内包括包含分子量为30,000Da±3000Da、或30,000Da±4,500Da、或30,000Da±6,000Da的线性甲氧基PEG基团的IL-2缀合物。
在一些实施方案中，构成本文公开的IL-2缀合物的PEG基团是具有约5,000道尔顿至约60,000道尔顿的平均分子量的分支甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是具有以下平均分子量的分支甲氧基PEG基团：约5,000道尔顿、约5,500道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约55,000道尔顿、约60,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿、约75,000道尔顿、约80,000道尔顿、约90,000道尔顿、约95,000道尔顿和约100,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG基团是具有以下平均分子量的分支甲氧基PEG基团：约5,000道尔顿、约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、约50,000道尔顿或约60,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG基团是具有以下平均分子量的分支甲氧基PEG基团：约5,000道尔顿、约30,000道尔顿、约50,000道尔顿或约60,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG基团是具有以下平均分子量的分支甲氧基PEG基团：约5,000道尔顿、约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、约50,000道尔顿或约60,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG基团是具有以下平均分子量的分支甲氧基PEG基团：约5,000道尔顿、约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约30,000道尔顿、约50,000道尔顿或约60,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG基团是平均分子量为约5,000道尔顿的分支甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是平均分子量为约10,000道尔顿的分支甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是平均分子量为约20,000道尔顿的分支甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是平均分子量为约30,000道尔顿的分支甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是平均分子量为约50,000道尔顿的分支甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是平均分子量为约60,000道尔顿的分支甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，构成本文公开的IL-2缀合物的PEG基团是具有限定的分子量±10％或15％或20％或25％的分支甲氧基PEG基团。例如，本公开文本的范围内包括包含分子量为30,000Da±3000Da、或30,000Da±4,500Da、或30,000Da±6,000Da的分支甲氧基PEG基团的IL-2缀合物。
在一些实施方案中，示例性PEG基团包括但不限于来自Quanta Biodesign,Ltd的线性或分支的离散PEG(dPEG)；来自Nektar Therapeutics的线性、分支或叉状PEG；以及来自JenKem Technology的Y形PEG衍生物。
在本文所述的式(I)的任何实施方案或变体以及包含它们的药物组合物中，平均分子量涵盖重均分子量和数均分子量两者；换言之，例如，30kDa数均分子量和30kDa重均分子量两者都有资格作为30kDa分子量。在一些实施方案中，平均分子量是重均分子量。在其他实施方案中，平均分子量是数均分子量。应理解，在本文提供的方法中，向受试者施用如本文所述的IL-2缀合物包括施用多于单个分子的IL-2缀合物；这样，用于描述PEG基团的分子量的术语“平均”是指向受试者施用的剂量中IL-2缀合物分子的PEG基团的平均分子量。
缀合化学
各种缀合反应用于缀合物接头、缀合部分和掺入本文所述IL-2多肽中的非天然氨基酸。此类缀合反应通常与水性条件相容，如“生物正交”反应。在一些实施方案中，缀合反应由化学试剂(如催化剂)、光或者在接头、缀合部分或非天然氨基酸上发现的反应性化学基团来介导。在一些实施方案中，缀合反应由酶介导。在一些实施方案中，本文所用的缀合反应描述于Gong,Y.,Pan,L.Tett.Lett.2015,56,2123中，将其公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，本文所用的缀合反应描述于Chen,X.；Wu.Y-W.Org.Biomol.Chem.2016,14,5417中，将其公开内容通过引用并入本文。
在一些变型中，本文所述的IL-2缀合物可以通过包括1,3-偶极环加成反应的缀合反应来制备。在一些实施方案中，1,3-偶极环加成反应包括叠氮化物与膦的反应(“点击”反应)。在一些实施方案中，缀合反应由铜催化。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应产生包含经由***附接的接头或缀合部分的细胞因子肽。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括叠氮化物与应变烯烃的反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括叠氮化物与应变炔烃的反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括叠氮化物与环炔烃(例如DBCO)的反应。
在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括方案1中概述的反应，其中X是包含非天然氨基酸的IL-2缀合物中的位置，如在SEQ ID NO:5、6、7、8、9、30、31、32、33和34中的任一项中。
方案1.
Figure BDA0004086255800000741
在一些实施方案中，缀合部分包含水溶性聚合物。在一些实施方案中，反应基团包含炔烃或叠氮化物。
在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括方案2中概述的反应，其中X是包含非天然氨基酸的IL-2缀合物中的位置，如在SEQ ID NO:5、6、7、8、9、30、31、32、33和34中的任一项中。
方案2.
Figure BDA0004086255800000742
在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括方案3中概述的反应，其中X是包含非天然氨基酸的IL-2缀合物中的位置，如在SEQ ID NO:5、6、7、8、9、30、31、32、33和34中的任一项中。
方案3.
Figure BDA0004086255800000743
在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括方案4中概述的反应，其中X是包含非天然氨基酸的IL-2缀合物中的位置，如在SEQ ID NO:5、6、7、8、9、30、31、32、33和34中的任一项中。
方案4.
Figure BDA0004086255800000751
/>
在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括叠氮化物部分(如含于含有衍生自N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸(AzK)的氨基酸残基的蛋白质中的叠氮化物部分)与应变环炔(如衍生自DBCO的应变环炔，所述DBCO是包含二苯并环辛炔基团的化学部分)之间的环加成反应。包含DBCO部分的PEG基团可市售获得或者可以通过本领域普通技术人员已知的方法来制备。示例性反应示于方案5和6中。
方案5.
Figure BDA0004086255800000761
方案6.
Figure BDA0004086255800000771
本文所述的缀合反应(如点击反应)可以生成单一区域异构体或区域异构体的混合物。在一些情况下，区域异构体的比率是约1:1。在一些情况下，区域异构体的比率是约2:1。在一些情况下，区域异构体的比率是约1.5:1。在一些情况下，区域异构体的比率是约1.2:1。在一些情况下，区域异构体的比率是约1.1:1。在一些情况下，区域异构体的比率大于1:1。
IL-2多肽产生
在一些情况下，重组产生或化学合成本文所述的IL-2缀合物，其含有天然氨基酸突变或非天然氨基酸突变。在一些情况下，例如通过宿主细胞***或在无细胞***中重组产生本文所述的IL-2缀合物。在本文所述的任何实施方案或变型中，所述氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸。在一些实施方案中，所述氨基酸是L-氨基酸。在其他实施方案中，所述氨基酸是D-氨基酸。
在一些情况下，通过宿主细胞***重组产生IL-2缀合物。在一些情形中，宿主细胞是真核细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或植物细胞)或原核细胞
(例如，***或革兰氏阴性细菌)。在一些情形中，真核宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在一些情形中，哺乳动物宿主细胞是稳定的细胞系，或者是将目的遗传物质掺入其自身基因组中并且具有在多代细胞***后表达所述遗传物质的产物的能力的细胞系。在其他情形中，哺乳动物宿主细胞是瞬时细胞系，或者是未将目的遗传物质掺入其自身基因组中并且不具有在多代细胞***后表达所述遗传物质的产物的能力的细胞系。
示例性哺乳动物宿主细胞包括293T细胞系、293A细胞系、293FT细胞系、293F细胞、293H细胞、A549细胞、MDCK细胞、CHO DG44细胞、CHO-S细胞、CHO-K1细胞、Expi293FTM细胞、Flp-InTMT-RExTM293细胞系、Flp-InTM-293细胞系、Flp-InTM-3T3细胞系、Flp-InTM-BHK细胞系、Flp-InTM-CHO细胞系、Flp-InTM-CV-1细胞系、Flp-InTM-Jurkat细胞系、FreeStyleTM293-F细胞、FreeStyleTMCHO-S细胞、GripTiteTM293MSR细胞系、GS-CHO细胞系、HepaRGTM细胞、T-RExTMJurkat细胞系、Per.C6细胞、T-RExTM-293细胞系、T-RExTM-CHO细胞系和T-RExTM-HeLa细胞系。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是昆虫宿主细胞。示例性昆虫宿主细胞包括果蝇(Drosophila)S2细胞、Sf9细胞、Sf21细胞、High FiveTM细胞和
Figure BDA0004086255800000787
细胞。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是酵母宿主细胞。示例性酵母宿主细胞包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(K.phaffii)酵母菌株，如GS115、KM71H、SMD1168、SMD1168H和X-33，以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母菌株，如INVSc1。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是植物宿主细胞。在一些情况下，植物细胞包括来自藻类的细胞。示例性植物细胞系包括来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)137c或细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PPC 7942的菌株。
在一些实施方案中，宿主细胞是原核宿主细胞。示例性原核宿主细胞包括BL21、Mach1TM、DH10BTM、TOP10、DH5α、DH10BacTM、OmniMaxTM、MegaXTM、DH12STM、INV110、TOP10F'、INVαF、TOP10/P3、ccdB Survival、PIR1、PIR2、Stbl2TM、Stbl3TM或Stbl4TM。
在一些情况下，用于产生本文所述的IL-2多肽的合适的多核酸分子或载体包括源自真核或原核来源的任何合适的载体。示例性多核酸分子或载体包括来自细菌(例如，大肠杆菌(E.coli))、昆虫、酵母(例如，巴斯德毕赤酵母，K.phaffii)、藻类或哺乳动物来源的载体。细菌载体包括例如pACYC177、pASK75、pBAD载体系列、pBADM载体系列、pET载体系列、pETM载体系列、pGEX载体系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE载体系列、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAG CTS、pFLAGMAC、pFLAG Shift-12c、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC或pTAC-MAT-2。
昆虫载体包括例如pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBact M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393、pVL1393 M10、pVL1393 M11、pVL1393 M12、FLAG载体(如pPolh-FLAG1或pPolh-MAT2)或MAT载体(如pPolh-MAT1或pPolh-MAT2)。
酵母载体包括例如
Figure BDA0004086255800000781
pDESTTM14载体、/>
Figure BDA0004086255800000785
pDESTTM15载体、/>
Figure BDA0004086255800000782
pDESTTM17载体、/>
Figure BDA0004086255800000783
pDESTTM24载体、/>
Figure BDA0004086255800000786
pYES-DEST52载体、pBAD-DEST49/>
Figure BDA0004086255800000784
目的载体、pAO815毕赤酵母属载体、pFLD1巴斯德毕赤酵母(K.phaffii)载体、pGAPZA、B和C巴斯德毕赤酵母(K.phaffii)载体、pPIC3.5K毕赤酵母属载体、pPIC6 A、B和C毕赤酵母属载体、pPIC9K毕赤酵母属载体、pTEF1/Zeo、pYES2酵母载体、pYES2/CT酵母载体、pYES2/NT A、B和C酵母载体或pYES3/CT酵母载体。
藻类载体包括例如pChlamy-4载体或MCS载体。
哺乳动物载体包括例如瞬时表达载体或稳定表达载体。示例性哺乳动物瞬时表达载体包括p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV 19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV6a,b,c、pFLAG-CMV 5.1、pFLAG-CMV 5a,b,c、p3xFLAG-CMV 7.1、pFLAG-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV 24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3或pBICEP-CMV 4。示例性哺乳动物稳定表达载体包括pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV 14、pFLAG-Myc-CMV22、p3xFLAG-Myc-CMV 26、pBICEP-CMV 1或pBICEP-CMV 2。
在一些情况下，将无细胞***用于产生本文所述的IL-2多肽。在一些情形中，无细胞***包含来自细胞的胞质和/或核组分的混合物，并且适合于体外核酸合成。在一些情况下，无细胞***利用原核细胞组分。在其他情况下，无细胞***利用真核细胞组分。核酸合成是在基于例如果蝇细胞、非洲爪蟾卵、古细菌或HeLa细胞的无细胞***中获得的。示例性无细胞***包括大肠杆菌S30提取***、大肠杆菌T7 S30***或
Figure BDA0004086255800000791
XpressCF和XpressCF+。
无细胞翻译***不同地包含组分，如质粒、mRNA、DNA、tRNA、合成酶、释放因子、核糖体、伴侣蛋白、翻译起始和延伸因子、天然和/或非天然氨基酸和/或用于蛋白质表达的其他组分。任选地修饰此类组分以提高产量、增加合成速率、增加蛋白质产物保真度或掺入非天然氨基酸。在一些实施方案中，本文所述的细胞因子是使用US 8,778,631；US 2017/0283469；US 2018/0051065；US 2014/0315245；或US 8,778,631中描述的无细胞翻译***合成的。在一些实施方案中，无细胞翻译***包含经修饰的释放因子，或者甚至从所述***去除一种或多种释放因子。在一些实施方案中，无细胞翻译***包含降低的蛋白酶浓度。在一些实施方案中，无细胞翻译***包含具有重新分配的密码子的经修饰的tRNA，所述密码子用于编码非天然氨基酸。在一些实施方案中，在无细胞翻译***中使用本文所述的合成酶用于掺入非天然氨基酸。在一些实施方案中，在将tRNA添加到无细胞翻译***之前，使用酶促或化学方法用非天然氨基酸对所述tRNA进行预加载。在一些实施方案中，用于无细胞翻译***的组分是从经修饰的生物体(如经修饰的细菌、酵母或其他生物体)获得。
在一些实施方案中，经由表达宿主***或通过无细胞***以循环排列的形式产生IL-2多肽。
包含非天然氨基酸的IL-2多肽的产生
可以在本公开中使用正交或扩增的遗传密码，其中将存在于IL-2多肽的核酸序列中的一个或多个特定密码子分配以编码非天然氨基酸，使得可以通过使用正交tRNA合成酶/tRNA对将其遗传掺入IL-2中。正交tRNA合成酶/tRNA对能够将非天然氨基酸装载在tRNA，并且能够响应于所述密码子将所述非天然氨基酸掺入多肽链中。
在一些情况下，密码子是密码子琥珀、赭石、蛋白石或四联体密码子。在一些情形中，密码子对应于将用于携带非天然氨基酸的正交tRNA。在一些情形中，密码子是琥珀。在其他情形中，密码子是正交密码子。
在一些情况下，密码子是四联体密码子，其可以由正交核糖体ribo-Q1解码。在一些情形中，四联体密码子如以下文献中所述：Neumann等人,“Encoding multipleunnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome,”Nature,464(7287):441-444(2010)，将其公开内容通过引用并入本文。
在一些情况下，本公开文本中使用的密码子是重编码的密码子，例如，被可替代密码子替代的同义密码子或稀有密码子。在一些情形中，重新编码的密码子如Napolitano等人,“Emergent rules for codon choice elucidated by editing rare argininecodons in Escherichia coli,”PNAS,113(38):E5588-5597(2016)中所述，将其公开内容通过引用并入本文。在一些情形中，重编码的密码子如以下文献中所述：Ostrov等人,“Design,synthesis,and testing toward a 57-codon genome,”Science 353(6301):819-822(2016)，将其公开内容通过引用并入本文。
在一些情况下，利用非天然核酸，导致一种或多种非天然氨基酸掺入IL-2中。示例性非天然核酸包括但不限于尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基(I)、2-氨基腺嘌呤-9-基、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(具体地5-溴)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。某些非天然核酸，如5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2取代的嘌呤、N-6取代的嘌呤、O-6取代的嘌呤、2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、增加双链体形成稳定性的那些分子、通用核酸、疏水性核酸、混杂核酸、尺寸扩大的核酸、氟化核酸、5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基、其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶，5-卤代胞嘧啶，5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，嘧啶核酸的其他炔基衍生物，6-偶氮基尿嘧啶，6-偶氮基胞嘧啶，6-偶氮基胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(特别是5-溴)、5-三氟甲基、其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤，7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤，8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮腺嘌呤，3-脱氮鸟嘌呤，3-脱氮腺嘌呤，三环嘧啶，吩噁嗪胞苷([5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)，吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-夹，吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)，咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)，吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3’,2’:4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)，其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环替代的那些，7-脱氮-腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤，2-氨基吡啶，2-吡啶酮，氮杂胞嘧啶，5-溴胞嘧啶，溴尿嘧啶，5-氯胞嘧啶，氯代胞嘧啶，环胞嘧啶，胞嘧啶***糖苷，5-氟胞嘧啶，氟嘧啶，氟尿嘧啶，5,6-二氢胞嘧啶，5-碘胞嘧啶，羟基脲，碘尿嘧啶，5-硝基胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟尿嘧啶和5-碘尿嘧啶，2-氨基-腺嘌呤，6-硫代-鸟嘌呤，2-硫代-胸腺嘧啶，4-硫代-胸腺嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶，4-硫代-尿嘧啶，N4-乙基胞嘧啶，7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤，5-羟基胞嘧啶，2’-脱氧尿苷，2-氨基-2’-脱氧腺苷，以及描述于以下文献中的那些：美国专利号3,687,808；4,845,205；4,910,300；4,948,882；5,093,232；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653和6,005,096；WO 99/62923；Kandimalla等人,(2001)Bioorg.Med.Chem.9:807-813；The Concise Encyclopedia ofPolymer Science and Engineering,Kroschwitz,J.I.编辑,John Wiley&Sons,1990,858-859；Englisch等人,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613；和Sanghvi,第15章,Antisense Research and Applications,Crooke和Lebleu编辑,CRCPress,1993,273-288。另外的碱基修饰可以在例如以下文献中找到：美国专利号3,687,808；Englisch等人,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613；和Sanghvi,第15章,Antisense Research and Applications,第289-302页,Crooke和Lebleu编辑,CRC Press,1993；将其中每一个的公开内容通过引用并入本文。
包含各种杂环碱基和各种糖部分(和糖类似物)的非天然核酸是本领域可获得的，并且在一些情形中，核酸包括除了天然存在的核酸的五种主要碱基组分以外的一种或几种杂环碱基。例如，在一些情形中，杂环碱基包括尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鸟嘌呤-7-基、鸟嘌呤-8-基、4-氨基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2,3-d]嘧啶5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2.3-d]嘧啶-3-基，其中嘌呤经由9-位置、嘧啶经由1-位置、吡咯并嘧啶经由7-位置且吡唑并嘧啶经由1-位置附接至核酸的糖部分。
在一些实施方案中，核苷酸类似物还在磷酸酯部分被修饰。经修饰的磷酸酯部分包括但不限于在两个核苷酸之间的连接处被修饰的那些，并且含有例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯)和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯)、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。应理解，两个核苷酸之间的这些磷酸酯或经修饰的磷酸酯连接是通过3'-5'连接或2'-5'连接，并且所述连接含有相反的极性，如3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。许多美国专利传授了如何制备和使用含有经修饰的磷酸酯的核苷酸并且所述美国专利包括但不限于3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050；将其中每一个的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，非天然核酸包括2’,3’-二脱氧-2’,3’-二脱氢-核苷(PCT/US2002/006460)、5’-取代的DNA和RNA衍生物(PCT/US2011/033961；Saha等人,J.OrgChem.,1995,60,788-789；Wang等人,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,1999,9,885-890；Mikhailov等人,Nucleosides&Nucleotides,1991,10(1-3),339-343；Leonid等人,1995,14(3-5),901-905；Eppacher等人,Helvetica Chimica Acta,2004,87,3004-3020；PCT/JP2000/004720；PCT/JP2003/002342；PCT/JP2004/013216；PCT/JP2005/020435；PCT/JP2006/315479；PCT/JP2006/324484；PCT/JP2009/056718；PCT/JP2010/067560)、或制备为具有经修饰的碱基的单磷酸酯的5’-取代的单体(Wang等人,NucleosidesNucleotides&Nucleic Acids,2004,23(1&2),317-337)；将其中每一个的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，非天然核酸包括在糖环的5’-位置和2’-位置处的修饰(PCT/US94/02993)，如5’-CH2-取代的2’-O-保护的核苷(Wu等人,Helvetica Chimica Acta,2000,83,1127-1143和Wu等人,Bioconjugate Chem.1999,10,921-924，将其公开内容通过引用并入本文)。在一些情形中，非天然核酸包括酰胺连接的核苷二聚体，其已经被制备用于掺入寡核苷酸中，其中二聚体中3’连接的核苷(5’至3’)包含2’-OCH3和5’-(S)-CH3(Mesmaeker等人,Synlett,1997,1287-1290)。非天然核酸可以包括2’-取代的5’-CH2(或O)修饰的核苷(PCT/US92/01020)。非天然核酸可以包括5’-亚甲基膦酸酯DNA和RNA单体以及二聚体(Bohringer等人,Tet.Lett.,1993,34,2723-2726；Collingwood等人,Synlett,1995,7,703-705；和Hutter等人,Helvetica Chimica Acta,2002,85,2777-2806)。非天然核酸可以包括具有2’-取代基的5’-膦酸酯单体(US2006/0074035)和其他经修饰的5’-膦酸酯单体(WO1997/35869)。非天然核酸可以包括5’-修饰的亚甲基膦酸酯单体(EP614907和EP629633)。非天然核酸可以包括在5’和/或6’-位置处包含羟基的5’或6’-膦酸核糖核苷的类似物(Chen等人,Phosphorus,Sulfur and Silicon,2002,777,1783-1786；Jung等人,Bioorg.Med.Chem.,2000,8,2501-2509；Gallier等人,Eur.J.Org.Chem.,2007,925-933；和Hampton等人,J.Med.Chem.,1976,19(8),1029-1033)。非天然核酸可以包括5’-膦酸酯脱氧核糖核苷单体和具有5’-磷酸酯基团的二聚体(Nawrot等人,Oligonucleotides,2006,16(1),68-82)。非天然核酸可以包括具有6’-膦酸基团的核苷，其中所述5’或/和6’-位置是未经取代的或者被硫代-叔丁基(SC(CH3)3)(及其类似物)；亚甲基氨基(CH2NH2)(及其类似物)或氰基(CN)(及其类似物)取代(Fairhurst等人,Synlett,2001,4,467-472；Kappler等人,J.Med.Chem.,1986,29,1030-1038；Kappler等人,J.Med.Chem.,1982,25,1179-1184；Vrudhula等人,J.Med.Chem.,1987,30,888-894；Hampton等人,J.Med.Chem.,1976,19,1371-1377；Geze等人,J.Am.Chem.Soc,1983,105(26),7638-7640；和Hampton等人,J.Am.Chem.Soc,1973,95(13),4404-4414)。将本段中所列的每个参考文献的公开内容均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，非天然核酸还包括糖部分的修饰。在一些情形中，核酸含有其中糖基团已经被修饰的一种或多种核苷。此类糖修饰的核苷可以赋予增强的核酸酶稳定性、增加的结合亲和力或一些其他有益的生物学特性。在某些实施方案中，核酸包含化学修饰的呋喃核糖环部分。化学修饰的呋喃核糖环的例子包括但不限于添加取代基(包括5'和/或2'取代基；两个环原子桥接形成双环核酸(BNA)；用S、N(R)或C(R1)(R2)替代核糖基环氧原子(R＝H、C1-C12烷基或保护基团)；及其组合。化学修饰的糖的例子可以发现于WO 2008/101157、US 2005/0130923和WO 2007/134181中，将其中每一个的公开内容通过引用并入本文。
在一些情况下，经修饰的核酸包含经修饰的糖或糖类似物。因此，除核糖和脱氧核糖之外，所述糖部分还可以是戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、***糖、木糖、来苏糖或糖“类似物”环戊基。所述糖可以呈吡喃糖基或呋喃糖基形式。所述糖部分可以是核糖、脱氧核糖、***糖或2'-O-烷基核糖的呋喃糖苷，并且所述糖可以以[α]或[β]异头构型附接至相应的杂环碱基。糖修饰包括但不限于2'-烷氧基-RNA类似物、2'-氨基-RNA类似物、2'-氟-DNA和2'-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体。例如，糖修饰可以包括2'-O-甲基-尿苷或2'-O-甲基-胞苷。糖修饰包括2'-O-烷基-取代的脱氧核糖核苷和2'-O-乙二醇样核糖核苷。这些糖或糖类似物以及其中此类糖或类似物附接至杂环碱基(核酸碱基)的相应“核苷”的制备是已知的。还可以进行糖修饰并且将其与其他修饰组合。
糖部分的修饰包括核糖和脱氧核糖的天然修饰以及非天然修饰。糖修饰包括但不限于在2'位置处的以下修饰：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是经取代或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。2'糖修饰还包括但不限于-O[(CH2)nO]m CH3、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)nONH2和-O(CH2)nON[(CH2)n CH3)]2，其中n和m是1至约10。
2'位置处的其他修饰包括但不限于：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2 CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸药代动力学特性的基团或用于改善寡核苷酸的药效学特性的基团，以及具有类似特性的其他取代基。还可以在所述糖的其他位置(特别是在3'末端核苷酸或2'-5'连接的寡核苷酸中糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置)处进行类似的修饰。经修饰的糖还包括在桥环氧处含有修饰(如CH2和S)的那些糖。核苷酸糖类似物也可以具有糖模拟物，如环丁基部分代替戊呋喃糖基糖。许多美国专利传授了此类经修饰的糖结构的制备，并且详述并描述了一系列的碱基修饰，所述美国专利是如美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121、5,596,091；5,614,617；5,681,941；和5,700,920，将其中每一个的公开内容通过引用以其整体并入本文。
具有经修饰的糖部分的核酸的例子包括但不限于包含5’-乙烯基、5’-甲基(R或S)、4’-S、2’-F、2’-OCH3和2’-O(CH2)2OCH3取代基的核酸。2'位置处的取代基还可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-(C1-C1O烷基)、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)和O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中Rm和Rn各自独立地是H或者取代或未取代的C1-C10烷基。
在某些实施方案中，本文所述的核酸包括一种或多种双环核酸。在某些此类实施方案中，双环核酸包含在4’核糖基环原子与2’核糖基环原子之间的桥。在某些实施方案中，本文提供的核酸包括一种或多种双环核酸，其中所述桥包含4'至2'双环核酸。此类4’至2’双环核酸的例子包括但不限于以下式中的一种：4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)-O-2’和4’-CH(CH2OCH3)-O-2’及其类似物(参见，美国专利号7,399,845)；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’及其类似物(参见WO2009/006478、WO2008/150729、US2004/0171570、美国专利号7,427,672，Chattopadhyaya等人,J.Org.Chem.,209,74,118-134，和WO2008/154401)。还参见例如：Singh等人,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Elayadi等人,Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等人,Chem.Biol,2001,8,1-7；Oram等人,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；美国专利号4,849,513；5,015,733；5,118,800；5,118,802；7,053,207；6,268,490；6,770,748；6,794,499；7,034,133；6,525,191；6,670,461；和7,399,845；国际公开号WO 2004/106356、WO1994/14226、WO 2005/021570、WO 2007/090071和WO 2007/134181；美国专利公开号US2004/0171570、US 2007/0287831和US 2008/0039618；美国临时申请号60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787和61/099,844；以及国际申请号PCT/US2008/064591、PCT US2008/066154、PCT US2008/068922和PCT/DK98/00393。将本段中所列的每个参考文献的公开内容均通过引用并入本文。
在某些实施方案中，核酸包含连接的核酸。核酸可以使用任何核酸间连接而连接在一起。核酸间连接基团的两个主要类别是通过磷原子的存在或不存在来定义的。代表性的含磷的核酸间连接包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(P＝S)。代表性的不含磷的核酸间连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯(-O-C(O)-S-)、硫代氨基甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-Si(H)2-O-)；和N,N*-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3))。在某些实施方案中，可以将具有手性原子的核酸间连接制备为外消旋混合物，制备为单独的对映体，例如，烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。非天然核酸可以含有单个修饰。非天然核酸可以在所述部分之一内或不同部分之间含有多个修饰。
对核酸的骨架磷酸酯修饰包括但不限于甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(桥连或非桥连)、磷酸三酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯，并且可以以任何组合使用。还可以使用其他非磷酸酯连接。
在一些实施方案中，骨架修饰(例如，甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间连接)可以赋予经修饰的核酸免疫调节活性和/或增强其体内稳定性。
在一些情况下，磷衍生物(或经修饰的磷酸酯基团)附接至糖或糖类似物部分，并且可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。含有经修饰的磷酸酯连接或非磷酸酯连接的示例性多核苷酸可以发现于Peyrottes等人,1996,Nucleic Acids Res.24:1841-1848；Chaturvedi等人,1996,NucleicAcids Res.24:2318-2323；Schultz等人,(1996)Nucleic Acids Res.24:2966-2973；Matteucci,1997,“Oligonucleotide Analogs:an Overview”in Oligonucleotides asTherapeutic Agents,(Chadwick和Cardew,编辑)John Wiley and Sons,New York,NY；Zon,1993,“Oligonucleoside Phosphorothioates”in Protocols for Oligonucleotidesand Analogs,Synthesis and Properties,Humana Press,第165-190页；Miller等人,1971,JACS 93:6657-6665；Jager等人,1988,Biochem.27:7247-7246；Nelson等人,1997,JOC 62:7278-7287；美国专利号5,453,496；和Micklefield,2001,Curr.Med.Chem.8:1157-1179中；将其中每一个的公开内容通过引用并入本文。
在一些情形中，骨架修饰包括用可替代部分如阴离子基团、中性基团或阳离子基团替代磷酸二酯连接。此类修饰的例子包括：阴离子核苷间连接；N3'至P5'氨基磷酸酯修饰；硼烷磷酸酯DNA；原寡核苷酸；中性核苷间连接，如甲基膦酸酯；酰胺连接的DNA；亚甲基(甲基亚氨基)连接；甲缩醛(formacetal)和硫代甲缩醛连接；含有磺酰基的骨架；吗啉代寡聚物；肽核酸(PNA)；以及带正电荷的脱氧核糖核酸胍(DNG)寡聚物(Micklefield,2001,Current Medicinal Chemistry 8:1157-1179)。经修饰的核酸可以包含嵌合或混合的骨架，所述嵌合的或混合的骨架包含一种或多种修饰(例如，磷酸酯连接的组合，如磷酸二酯和硫代磷酸酯连接的组合)。
磷酸酯的取代基包括，例如，短链烷基或环烷基核苷间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接。这些包括具有以下的那些：吗啉代连接(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH2组成部分的其他骨架。许多美国专利披露如何制备和使用这些类型的磷酸酯替代，并且包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439。还应理解，在核苷酸取代物中，核苷酸的糖和磷酸部分二者都可以被替代，例如被酰胺型连接(氨乙基甘氨酸)(PNA)替代。美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262传授了如何制备和使用PNA分子，将其中每一个通过引用并入本文。还参见Nielsen等人,Science,1991,254,1497-1500。还可能将其他类型的分子(缀合物)连接至核苷酸或核苷酸类似物，以增强例如细胞摄取。缀合物可以与所述核苷酸或核苷酸类似物化学连接。此类缀合物包括但不限于脂质部分如胆固醇部分(Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556)、胆酸(Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.,1994,4,1053-1060)、硫醚(例如，己基-S-三苯甲硫醇)(Manoharan等人,Ann.KY.Acad.Sci.,1992,660,306-309；Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765-2770)、巯基胆固醇(Oberhauser等人,Nucl.Acids Res.,1992,20,533-538)、脂肪链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)(Saison-Behmoaras等人,EM5OJ,1991,10,1111-1118；Kabanov等人,FEBS Lett.,1990,259,327-330；Svinarchuk等人,Biochimie,1993,75,49-54)、磷脂(例如，二-十六烷基-rac-甘油或者三乙基铵l-二-O-十六烷基-rac-甘油-S-H-膦酸盐)(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654；Shea等人,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)，聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等人,Biochem.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)、或十八胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937)。许多美国专利传授了此类缀合物的制备，并且包括但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。将本段中所列的每个参考文献的公开内容均通过引用并入本文。
在一些情形中，非天然核酸进一步形成非天然碱基对。能够在体内条件下形成非天然DNA或RNA碱基对(UBP)的示例性非天然核苷酸包括但不限于TAT1、dTAT1、5FM、d5FM、TPT3、dTPT3、5SICS、d5SICS、NaM、dNaM、CNMO、dCNMO及其组合。在一些实施方案中，非天然核苷酸包括：
Figure BDA0004086255800000851
示例性非天然碱基对包括：(d)TPT3-(d)NaM；(d)5SICS-(d)NaM；(d)CNMO-(d)TAT1；(d)NaM-(d)TAT1；(d)CNMO-(d)TPT3；和(d)5FM-(d)TAT1。
能够形成可以用于制备本文公开的IL-2缀合物的非天然UBP的非天然核苷酸的其他例子可以发现于Dien等人,J Am Chem Soc.,2018,140:16115-16123；Feldman等人,JAmChem Soc,2017,139:11427-11433；Ledbetter等人,J Am Chem Soc.,2018,140:758-765；Dhami等人,Nucleic Acids Res.2014,42:10235-10244；Malyshev等人,Nature,2014,509:385-388；Betz等人,J Am Chem Soc.,2013,135:18637-18643；Lavergne等人,J Am ChemSoc.2013,135:5408-5419；和Malyshev等人Proc Natl Acad Sci USA,2012,109:12005-12010中；将其中每一个的公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，非天然核苷酸包括：
Figure BDA0004086255800000852
在一些实施方案中，可以用于制备本文公开的IL-2缀合物的非天然核苷酸可能衍生自下式的化合物：
Figure BDA0004086255800000861
其中R2选自氢、烷基、烯基、炔基、甲氧基、甲硫醇、甲烷硒基、卤素、氰基和叠氮基；并且
波浪线指示与核糖基或2’-脱氧核糖基的键，其中核糖基或2’-脱氧核糖基部分的5’-羟基呈游离形式，与单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、α-硫代三磷酸酯、β-硫代三磷酸酯或γ-硫代三磷酸酯基团连接，或者包含在RNA或DNA中或RNA类似物或DNA类似物中。
在一些实施方案中，可以用于制备本文公开的IL-2缀合物的非天然核苷酸可能衍生自下式的化合物：
Figure BDA0004086255800000862
其中：
每个X独立地是碳或氮；
当X是氮时R2不存在，而当X是碳时，R2是存在的且独立地是氢、烷基、烯基、炔基、甲氧基、甲硫醇、甲烷硒基、卤素、氰基或叠氮基；
Y是硫、氧、硒或仲胺；
E是氧、硫或硒；并且
波浪线指示与核糖基、脱氧核糖基或二脱氧核糖基部分或其类似物的键合点，其中所述核糖基、脱氧核糖基或二脱氧核糖基部分或其类似物是游离形式，连接至单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、α-硫代三磷酸酯、β-硫代三磷酸酯或γ-硫代三磷酸酯基团，或包含在RNA或DNA中或者RNA类似物或DNA类似物中。
在一些实施方案中，每个X是碳。在一些实施方案中，至少一个X是碳。在一些实施方案中，一个X是碳。在一些实施方案中，至少两个X是碳。在一些实施方案中，两个X是碳。在一些实施方案中，至少一个X是氮。在一些实施方案中，一个X是氮。在一些实施方案中，至少两个X是氮。在一些实施方案中，两个X是氮。
在一些实施方案中，Y是硫。在一些实施方案中，Y是氧。在一些实施方案中，Y是硒。在一些实施方案中，Y是仲胺。
在一些实施方案中，E是硫。在一些实施方案中，E是氧。在一些实施方案中，E是硒。
在一些实施方案中，当X是碳时R2是存在的。在一些实施方案中，当X是氮时R2不存在。在一些实施方案中，每个R2在存在的情况下是氢。在一些实施方案中，R2是烷基，如甲基、乙基或丙基。在一些实施方案中，R2是烯基，如-CH2＝CH2。在一些实施方案中，R2是炔基，如乙炔基。在一些实施方案中，R2是甲氧基。在一些实施方案中，R2是甲硫醇。在一些实施方案中，R2是甲烷硒基。在一些实施方案中，R2是卤素，如氯、溴或氟。在一些实施方案中，R2是氰基。在一些实施方案中，R2是叠氮基。
在一些实施方案中，E是硫，Y是硫，并且每个X独立地是碳或氮。在一些实施方案中，E是硫，Y是硫，并且每个X是碳。
在一些实施方案中，可以用于制备本文公开的IL-2缀合物的非天然核苷酸可能衍生自
Figure BDA0004086255800000871
/>
Figure BDA0004086255800000872
在一些实施方案中，可以用于制备本文公开的IL-2缀合物的非天然核苷酸包括
Figure BDA0004086255800000873
/>
Figure BDA0004086255800000881
Figure BDA0004086255800000882
或其盐。
在一些实施方案中，可以用于制备本文公开的IL-2缀合物的非天然核苷酸可能衍生自
Figure BDA0004086255800000883
在一些实施方案中，可以用于制备本文公开的IL-2缀合物的非天然核苷酸包括
Figure BDA0004086255800000891
在一些实施方案中，非天然碱基对生成非天然氨基酸，如以下文献中所述：Dumas等人,“Designing logical codon reassignment-Expanding the chemistry inbiology,”Chemical Science,6:50-69(2015)。
在一些实施方案中，非天然氨基酸通过包含非天然核酸的合成密码子掺入IL-2多肽中。在一些情况下，非天然氨基酸通过正交的、经修饰的合成酶/tRNA对掺入IL-2中。此类正交对包含天然合成酶，所述天然合成酶能够将非天然氨基酸装载到非天然tRNA上，同时最小化a)其他内源性氨基酸装载到非天然tRNA上和b)非天然氨基酸装载到其他内源性tRNA上。此类正交对包含能够通过非天然合成酶进行装载，同时避免通过内源合成酶装载a)其他内源氨基酸的tRNA。在一些实施方案中，从各种生物体(如细菌、酵母、古细菌或人来源)鉴定出此类对。在一些实施方案中，正交合成酶/tRNA对包含来自单一生物体的组分。在一些实施方案中，正交合成酶/tRNA对包含来自两种不同的生物体的组分。在一些实施方案中，正交合成酶/tRNA对包含在修饰之前促进两种不同氨基酸的翻译的组分。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的丙氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的精氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的天冬酰胺合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的天冬氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的半胱氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的谷氨酰胺合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的谷氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的丙氨酸甘氨酸。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的组氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的亮氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的异亮氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的赖氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的甲硫氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的苯丙氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的脯氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的丝氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的苏氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的色氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的酪氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的缬氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的磷酸丝氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的丙氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的精氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的天冬酰胺tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的天冬氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的半胱氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的谷氨酰胺tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的谷氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的丙氨酸甘氨酸。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的组氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的亮氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的异亮氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的赖氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的甲硫氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的苯丙氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的脯氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的丝氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的苏氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的色氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的酪氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的缬氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的磷酸丝氨酸tRNA。
在一些实施方案中，非天然氨基酸通过氨酰基(aaRS或RS)-tRNA合成酶-tRNA对掺入IL-2多肽中。示例性aaRS-tRNA对包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)(Mj-Tyr)aaRS/tRNA对、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)tRNACUA对、大肠杆菌LeuRS(Ec-Leu)/嗜热脂肪芽孢杆菌tRNACUA对和吡咯赖氨酰-tRNA对。在一些情况下，非天然氨基酸通过Mj-TyrRS/tRNA对掺入IL-2多肽中。可以通过Mj-TyrRS/tRNA对掺入的示例性UAA包括但不限于对位取代的苯丙氨酸衍生物，如对-氨基苯丙氨酸和对-甲氧基苯丙氨酸；间位取代的酪氨酸衍生物，如3-氨基酪氨酸、3-硝基酪氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸和3-碘酪氨酸；苯基硒代半胱氨酸；对-硼苯丙氨酸；以及邻-硝基苄基酪氨酸。
在一些情况下，非天然氨基酸通过Ec-Tyr/tRNACUA或Ec-Leu/tRNACUA对掺入IL-2多肽中。可以通过Ec-Tyr/tRNACUA或Ec-Leu/tRNACUA对掺入的示例性UAA包括但不限于含有苯甲酮、酮、碘化物或叠氮化物取代基的苯丙氨酸衍生物；O-炔丙基酪氨酸；α-氨基辛酸、O-甲基酪氨酸、O-硝基苄基半胱氨酸；和3-(萘-2-基氨基)-2-氨基-丙酸。
在一些情况下，非天然氨基酸通过吡咯基-tRNA对掺入IL-2多肽中。在一些情形中，PylRS获自古细菌，例如获自产甲烷的古细菌。在一些情形中，PylRS获自巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)或乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)。可以通过吡咯赖氨酰-tRNA对掺入的示例性UAA包括但不限于酰胺和氨基甲酸酯取代的赖氨酸，如2-氨基-6-((R)-四氢呋喃-2-甲酰胺基)己酸、N-ε-D-脯氨酰基-L-赖氨酸和N-ε-环戊基氧基羰基-L-赖氨酸；N-ε-丙烯酰基-L-赖氨酸；N-ε-[(1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙氧基)羰基]-L-赖氨酸；和N-ε-(1-甲基环丙-2-烯甲酰氨基)赖氨酸。在一些实施方案中，本文公开的IL-2缀合物可以通过使用马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)tRNA来制备，所述tRNA通过巴氏甲烷八叠球菌(M.barkeri)吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶(Mb PylRS)选择性装载非天然氨基酸，如N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸(AzK)。其他方法是本领域普通技术人员已知的，如Zhang等人,Nature 2017,551(7682):644-647中披露的那些，将其公开内容通过引用并入本文。
在一些情况下，将非天然氨基酸通过US 9,988,619和US 9,938,516中披露的合成酶掺入IL-2多肽，将所述文献的每一个的公开内容通过引用并入本文。
在合适的培养基中培养或维持引入了本文公开的构建体或载体的宿主细胞，使得产生tRNA、tRNA合成酶和目的蛋白质。培养基还包含一种或多种非天然氨基酸，使得目的蛋白质掺入所述一种或多种非天然氨基酸。在一些实施方案中，来自细菌、植物或藻类的三磷酸核苷转运蛋白(NTT)也存在于宿主细胞中。在一些实施方案中，本文公开的IL-2缀合物是通过使用表达NTT的宿主细胞来制备。在一些实施方案中，用于宿主细胞中的核苷酸三磷酸核苷转运蛋白可以选自TpNTT1、TpNTT2、TpNTT3、TpNTT4、TpNTT5、TpNTT6、TpNTT7、TpNTT8(假微型海链藻(T.pseudonana))、PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5、PtNTT6(三角褐指藻(P.tricornutum))、GsNTT(嗜硫原始红藻(Galdieria sulphuraria))、AtNTT1、AtNTT2(拟南芥(Arabidopsis thaliana))、CtNTT1、CtNTT2(沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis))、PamNTT1、PamNTT2(嗜阿米巴原衣原体(Protochlamydia amoebophila))、CcNTT(石竹杀手杆菌(Caedibacter caryophilus))、RpNTT1(普氏立克次体(Rickettsiaprowazekii))。在一些实施方案中，NTT选自PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5和PtNTT6。在一些实施方案中，所述NTT是PtNTT1。在一些实施方案中，所述NTT是PtNTT2。在一些实施方案中，所述NTT是PtNTT3。在一些实施方案中，所述NTT是PtNTT4。在一些实施方案中，所述NTT是PtNTT5。在一些实施方案中，所述NTT是PtNTT6。可以使用的其他NTT公开于Zhang等人,Nature 2017,551(7682):644-647；Malyshev等人Nature 2014(509(7500),385-388；和Zhang等人Proc Natl Acad Sci USA,2017,114:1317-1322；将其中每一个的公开内容通过引用并入本文。
正交tRNA合成酶/tRNA对用非天然氨基酸装载tRNA，并响应于所述密码子将所述非天然氨基酸掺入多肽链中。示例性aaRS-tRNA对包括但不限于詹氏甲烷球菌(Mj-Tyr)aaRS/tRNA对、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌tRNACUA对、大肠杆菌LeuRS(Ec-Leu)/嗜热脂肪芽孢杆菌tRNACUA对和吡咯赖氨酰-tRNA对。可以根据本公开文本使用的其他aaRS-tRNA对包括源自马氏甲烷八叠球菌的那些，描述于以下文献中的那些：Feldman等人,J Am Chem Soc.,2018 140:1447-1454；以及Zhang等人Proc Natl Acad Sci USA,2017,114:1317-1322；将其中每一个的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中提供在表达NTT和tRNA合成酶的细胞***中制备本文公开的IL-2缀合物的方法。在本文所述的一些实施方案中，NTT选自PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5和PtNTT6，并且tRNA合成酶选自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌和马氏甲烷八叠球菌。在一些实施方案中，NTT是PtNTT1，并且tRNA合成酶源自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌或马氏甲烷八叠球菌。在一些实施方案中，NTT是PtNTT2，并且tRNA合成酶源自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌或马氏甲烷八叠球菌。在一些实施方案中，NTT是PtNTT3，并且tRNA合成酶源自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌或马氏甲烷八叠球菌。在一些实施方案中，NTT是PtNTT3，并且tRNA合成酶源自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌或马氏甲烷八叠球菌。在一些实施方案中，NTT是PtNTT4，并且tRNA合成酶源自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌或马氏甲烷八叠球菌。在一些实施方案中，NTT是PtNTT5，并且tRNA合成酶源自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌或马氏甲烷八叠球菌。在一些实施方案中，NTT是PtNTT6，并且tRNA合成酶源自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌或马氏甲烷八叠球菌。
在一些实施方案中，本文公开的IL-2缀合物可以在细胞(如大肠杆菌)中制备，所述细胞包含(a)核苷三磷酸转运蛋白PtNTT2(包括截短的变体，其中全长蛋白质的前65个氨基酸残基被缺失)，(b)含有双链寡核苷酸的质粒，所述双链寡核苷酸编码具有所需氨基酸序列的IL-2变体并且含有包含第一非天然核苷酸和第二非天然核苷酸的非天然碱基对，以在所需位置处提供密码子，将在所述位置掺入非天然氨基酸，如N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸(AzK)，(c)编码源自马氏甲烷八叠球菌的tRNA的质粒，并且其包含非天然核苷酸以提供公认的反密码子(针对IL-2变体的密码子)替代其天然序列，以及(d)编码巴氏甲烷八叠球菌来源的吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶(Mb PylRS)的质粒，其可以是编码所述tRNA的相同质粒或不同质粒。在一些实施方案中，所述细胞进一步补充有包含一种或多种非天然碱基的脱氧核糖三磷酸酯。在一些实施方案中，所述细胞进一步补充有包含一种或多种非天然碱基的核糖三磷酸酯。在一些实施方案中，所述细胞进一步补充有一种或多种非天然氨基酸，如N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸(AzK)。在一些实施方案中，编码所需IL-2变体的氨基酸序列的双链寡核苷酸在例如编码具有SEQ ID NO:3的蛋白质的序列的位置34、37、40、41、42、43、44、61、64、68或71或者编码具有SEQ ID NO:4的蛋白质的序列的位置35、38、41、42、43、45、62、65、69或72处含有密码子AXC，其中X是非天然核苷酸。在一些实施方案中，所述细胞进一步包含质粒，所述质粒可以是蛋白质表达质粒或另一种质粒，其编码来自马氏甲烷八叠球菌的正交tRNA基因，所述正交tRNA基因包含匹配AXC的反密码子GYT替代其天然序列，其中Y是互补的并且可以与所述密码子中的非天然核苷酸相同或不同的非天然核苷酸。在一些实施方案中，密码子中的非天然核苷酸与反密码子中的非天然核苷酸不同且互补。在一些实施方案中，密码子中的非天然核苷酸与反密码子中的非天然核苷酸相同。在一些实施方案中，在双链寡核苷酸中的构成非天然碱基对的第一和第二非天然核苷酸可以衍生自
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在一些实施方案中，在双链寡核苷酸中的构成非天然碱基对的第一和第二非天然核苷酸可以衍生自
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在一些实施方案中，第一和第二非天然核苷酸的三磷酸酯包括/>
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或其盐。在一些实施方案中，第一和第二非天然核苷酸的三磷酸酯包括
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或其盐。在一些实施方案中，包含第一非天然核苷酸和第二非天然核苷酸的mRNA衍生的双链寡核苷酸可以包含含有衍生自/>
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的非天然核苷酸的密码子。在一些实施方案中，马氏甲烷八叠球菌tRNA可以包含含有非天然核苷酸的反密码子，其识别包含所述mRNA的非天然核苷酸的密码子。马氏甲烷八叠球菌tRNA中的反密码子可以包含衍生自/>
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自/>
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自/>
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，tRNA包含衍生自
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，tRNA包含衍生自
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，tRNA包含衍生自/>
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，tRNA包含衍生自/>
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，tRNA包含衍生自/>
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，tRNA包含衍生自/>
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自/>
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的非天然核苷酸并且tRNA包含衍生自/>
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自/>
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的非天然核苷酸并且tRNA包含衍生自/>
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自/>
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的非天然核苷酸并且tRNA包含衍生自/>
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的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自/>
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的非天然核苷酸并且tRNA包含衍生自/>
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的非天然核苷酸。将宿主细胞在含有适当营养素的培养基中培养，并且补充有(a)包含一种或多种非天然碱基的脱氧核糖核苷三磷酸酯，所述一种或多种非天然碱基对于编码具有密码子的细胞因子基因的一种或多种质粒的复制是必需的，(b)包含一种或多种非天然碱基的核糖核苷三磷酸酯，所述一种或多种非天然碱基对于以下的转录是必需的：(i)对应于细胞因子的编码序列并且含有包含一种或多种非天然碱基的密码子的mRNA，和(ii)含有包含一种或多种非天然碱基的反密码子的tRNA，以及(c)要掺入目的细胞因子的多肽序列中的一种或多种非天然氨基酸。然后将宿主细胞维持在允许目的蛋白质表达的条件下。
所表达的含AzK的所得蛋白质可以通过本领域普通技术人员已知的方法来纯化，然后可以允许其与炔烃(如包含如本文公开的具有所需平均分子量的PEG链的DBCO)在本领域普通技术人员已知的条件下反应，以提供本文公开的IL-2缀合物。其他方法是本领域普通技术人员已知的，如以下文献中披露的那些：Zhang等人,Nature 2017,551(7682):644-647；WO 2015157555；WO 2015021432；WO 2016115168；WO 2017106767；WO 2017223528；WO2019014262；WO 2019014267；WO 2019028419；和WO 2019/028425；将其中每一个的公开内容通过引用并入本文。
所表达的包含一种或多种非天然氨基酸(例如Azk)的所得蛋白质可以通过本领域普通技术人员已知的方法来纯化，然后可以允许其与炔烃(如包含如本文公开的具有所需平均分子量的PEG链的DBCO)在本领域普通技术人员已知的条件下反应，以提供本文公开的IL-2缀合物。其他方法是本领域普通技术人员已知的，如以下文献中披露的那些：Zhang等人,Nature 2017,551(7682):644-647；WO 2015157555；WO 2015021432；WO 2016115168；WO2017106767；WO 2017223528；WO 2019014262；WO 2019014267；WO 2019028419；和WO 2019/028425；将其公开内容通过引用并入本文。
可替代地，包含一种或多种非天然氨基酸的IL-2多肽是通过将本文所述的核酸构建体引入宿主细胞中来制备，所述核酸构建体包含tRNA和氨酰基tRNA合成酶并且包含具有一个或多个框内正交(终止)密码子的目的核酸序列。将宿主细胞在含有适当的营养素的培养基中培养，补充有(a)包含一种或多种非天然碱基的脱氧核糖核苷三磷酸酯，所述一种或多种非天然碱基对于一种或多种质粒的复制是必需的，所述一种或多种质粒编码包含新密码子和反密码子的细胞因子基因；(b)核糖核苷三磷酸酯，其对于对应于以下的mRNA的转录是必需的：(i)含有密码子的细胞因子序列，和(ii)含有反密码子的正交tRNA；以及(c)一种或多种非天然氨基酸。然后将宿主细胞维持在允许目的蛋白质表达的条件下。响应于非天然密码子，将一个或多个非天然氨基酸掺入多肽链中。例如，将一种或多种非天然氨基酸掺入IL-2多肽中。可替代地，可以在蛋白质的两个或更多个位点处将两个或更多个非天然氨基酸掺入IL-2多肽中。
一旦在宿主细胞中产生了掺入非天然氨基酸的IL-2多肽，就可以通过本领域已知的多种技术(包括酶促、化学和/或渗透裂解和物理破坏)从其提取。IL-2多肽可以通过本领域中已知的标准技术来纯化，所述标准技术如制备型离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱或者本领域普通技术人员已知的任何其他合适的技术。
合适的宿主细胞可以包括细菌细胞(例如，大肠杆菌，BL21(DE3))，但最合适的宿主细胞是真核细胞，例如昆虫细胞(例如果蝇，如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))、酵母细胞、线虫(例如秀丽隐杆线虫(C.elegans))、小鼠(例如小家鼠(Mus musculus))或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞、人293T细胞、HeLa细胞、NIH 3T3细胞和小鼠红白血病(MEL)细胞)或人细胞或其他真核细胞。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。合适地，宿主细胞是哺乳动物细胞，如人细胞或昆虫细胞。在一些实施方案中，合适的宿主细胞包括大肠杆菌。
通常可以在本发明的实施方案中使用的其他合适的宿主细胞是在实施例部分中提到的那些。可以经由常规转化或转染技术将载体DNA引入宿主细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”旨在指用于将外来核酸分子(例如，DNA)引入宿主细胞中的多种公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法是本领域熟知的。
当创建细胞系时，通常优选地制备稳定细胞系。例如，对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知根据所使用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可以将外来DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些组成部分，通常将编码可选择标记物(例如，对抗生素的抗性)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。优选的可选择标记物包括赋予对药物(如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性的那些可选择标记物。可以将编码可选择标记物的核酸分子在相同载体上引入宿主细胞中，或者可以引入单独的载体上。可以通过药物选择来鉴定被引入的核酸分子稳定转染的细胞(例如，已掺入可选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
在一个实施方案中，将本文所述的构建体整合到宿主细胞的基因组中。稳定整合的优点是实现了各个细胞或克隆之间的均匀性。另一个优点是可以进行最佳生产者的选择。因此，希望创建稳定的细胞系。在另一个实施方案中，将本文所述的构建体转染到宿主细胞中。将构建体转染到宿主细胞中的优点是可以使蛋白质产量最大化。在一个方面，描述了包含本文所述的核酸构建体或载体的细胞。
抗EGFR抗体
本文所述的治疗癌症的方法包括施用抗EGFR抗体与本文所述的IL-2缀合物组合。
在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体是抑制性抗体。在一些实施方案中，所述抗EGFR抑制剂抗体选自西妥昔单抗(Erbitux)、帕尼单抗(Vectibix)、奈西妥木单抗(Portrazza)、JNJ-61186372(埃万妥单抗)、IMC-C225、ABX-EGF、ICR62和EMD 55900。在一些实施方案中，所述抗EGFR抑制剂抗体是西妥昔单抗(Erbitux)。在一些实施方案中，所述抗EGFR抑制剂抗体是帕尼单抗(Vectibix)。在一些实施方案中，所述抗EGFR抑制剂抗体是奈西妥木单抗(Portrazza)。在一些实施方案中，所述抗EGFR抑制剂抗体是JNJ-61186372(埃万妥单抗)。在一些实施方案中，所述抗EGFR抑制剂抗体是IMC-C225。在一些实施方案中，所述抗EGFR抑制剂抗体是ABX-EGF。在一些实施方案中，所述抗EGFR抑制剂抗体是ICR62。在一些实施方案中，所述抗EGFR抑制剂抗体是EMD 55900。
治疗方法
在一方面，本文提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的：(a)如本文所述的IL-2缀合物，和(b)抗EGFR抗体。
还提供了用于在治疗有需要的受试者的癌症的本文公开的方法中使用的如本文所述的IL-2缀合物。
在进一步的方面，提供了如本文所述的IL-2缀合物用于制造用于治疗有需要的受试者的癌症的本文公开的方法的药剂的用途。
癌症类型
在一些实施方案中，所述癌症选自肾细胞癌(RCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、尿路上皮癌、微卫星不稳定癌、微卫星稳定癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌(CRC)、***、肝细胞癌(HCC)、梅克尔细胞癌(MCC)、黑色素瘤、小细胞肺癌(SCLC)、食管癌、食管鳞状细胞癌(ESCC)、胶质母细胞瘤、间皮瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、***癌、去势抵抗性***癌、转移性去势抵抗性***癌、或具有DNA损伤应答(DDR)缺陷的转移性去势抵抗性***癌、膀胱癌、卵巢癌、中度至低度突变负担的肿瘤、皮肤鳞状细胞癌(CSCC)、鳞状细胞皮肤癌(SCSC)、低表达至不表达PD-L1的肿瘤、超出其原发解剖学起源部位全身性播散至肝脏和CNS的肿瘤以及弥漫性大B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，所述受试者的癌症选自肾细胞癌(RCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、尿路上皮癌、黑色素瘤、梅克尔细胞癌(MCC)和头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。在一些实施方案中，所述癌症是肾细胞癌(RCC)。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，所述癌症是尿路上皮癌。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是梅克尔细胞癌(MCC)。在一些实施方案中，所述癌症是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。
在一些实施方案中，所述癌症呈实体瘤的形式。在一些实施方案中，所述癌症是晚期实体瘤或转移性实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症呈液体瘤的形式。
施用
在一些实施方案中，所述反应是完全反应、部分反应或疾病稳定。在一些实施方案中，通过静脉内、皮下、肌内、脑内、鼻内、动脉内、关节内、皮内、玻璃体内、骨内输注、腹膜内或鞘内施用将所述IL-2缀合物施用至所述受试者。在一些实施方案中，通过静脉内、皮下或肌内施用将所述IL-2缀合物施用至所述受试者。在一些实施方案中，通过静脉内施用将所述IL-2缀合物施用至所述受试者。在一些实施方案中，通过皮下施用将所述IL-2缀合物施用至所述受试者。在一些实施方案中，通过肌内施用将所述IL-2缀合物施用至所述受试者。
在一些实施方案中，治疗的持续时间长达24个月，如1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月或24个月。在一些实施方案中，治疗的持续时间再进一步延长长达24个月。
在一些实施方案中，在向受试者施用抗EGFR抗体之前，将IL-2缀合物施用至所述受试者。在一些实施方案中，在向受试者施用IL-2缀合物之前，将抗EGFR抗体施用至所述受试者。在一些实施方案中，将IL-2缀合物和抗EGFR抗体同时施用至所述受试者。在一些实施方案中，将IL-2缀合物与抗EGFR抗体的施用分开地施用至所述受试者。在一些实施方案中，将IL-2缀合物与抗EGFR抗体依序施用至受试者。在一些实施方案中，在同一天将IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至所述受试者。在一些实施方案中，在不同的日期将IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至所述受试者。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每周一次、每两周一次、每三周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次、每13周一次、每14周一次、每15周一次、每16周一次、每17周一次、每18周一次、每19周一次、每20周一次、每21周一次、每22周一次、每23周一次、每24周一次、每25周一次、每26周一次、每27周一次或每28周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每两周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每三周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每4周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每5周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每6周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每7周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每8周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每9周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每10周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每11周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每12周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每13周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每14周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每15周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每16周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每17周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每18周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每19周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每20周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每21周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每22周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每23周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至有需要的受试者，每24周一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物约每7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天施用一次。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物约每14、15、16、17、18、19、20或21天施用一次。
在一些实施方案中，对应于这种量的给定药剂的量根据多种因素而变化，所述因素如特定化合物、疾病的严重程度、需要治疗的受试者或宿主的特性(例如，体重)，然而根据围绕病例的特定情况(包括例如所施用的具体药剂、施用途径和所治疗的受试者或宿主)以本领域已知的方式常规地确定。在一些情况下，所需剂量方便地以单个剂量或作为分开的剂量存在，所述分开的剂量是同时(或在短时间段内)或以适当的间隔(例如每天两个、三个、四个或更多个子剂量)施用。
在一些实施方案中，将IL-2缀合物以约8μg/kg至24μg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，将IL-2缀合物以约8μg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，将IL-2缀合物以约16μg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，将IL-2缀合物以约24μg/kg的剂量施用。在这些实施方案的任一个中，将IL-2缀合物每3周以如本文所述的剂量施用。
在一些实施方案中，可以将抗EGFR抗体以一定剂量并且使用已确定对该抗体单独或与IL-2缀合物组合安全且有效的给药方案施用。在一些实施方案中，将抗EGFR抗体通过静脉输注施用。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每周一次、每两周一次、每三周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次、每13周一次、每14周一次、每15周一次、每16周一次、每17周一次、每18周一次、每19周一次、每20周一次、每21周一次、每22周一次、每23周一次、每24周一次、每25周一次、每26周一次、每27周一次或每28周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每两周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每三周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每4周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每5周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每6周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每7周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每8周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每9周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每10周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每11周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每12周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每13周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每14周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每15周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每16周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每17周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每18周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每19周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每20周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每21周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每22周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每23周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)施用至有需要的受试者，每24周一次。在一些实施方案中，将西妥昔单抗(或另一种抗EGFR抗体)约每7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天施用一次。
在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体是西妥昔单抗。在一些实施方案中，将西妥昔单抗以约100mg/m2至约500mg/m2的负荷剂量通过静脉输注施用。在本文所述的任何实施方案中，西妥昔单抗的负荷剂量是mg/m2受试者的体表面积。在一些实施方案中，将西妥昔单抗以约100mg/m2的负荷剂量通过静脉内输注施用。在一些实施方案中，将西妥昔单抗以约150mg/m2的负荷剂量通过静脉内输注施用。在一些实施方案中，将西妥昔单抗以约200mg/m2的负荷剂量通过静脉内输注施用。在一些实施方案中，将西妥昔单抗以约250mg/m2的负荷剂量通过静脉内输注施用。在一些实施方案中，将西妥昔单抗以约300mg/m2的负荷剂量通过静脉内输注施用。在一些实施方案中，将西妥昔单抗以约350mg/m2的负荷剂量通过静脉内输注施用。在一些实施方案中，将西妥昔单抗以约400mg/m2的负荷剂量通过静脉内输注施用。在一些实施方案中，将西妥昔单抗以约450mg/m2的负荷剂量通过静脉内输注施用。在一些实施方案中，将西妥昔单抗以约500mg/m2的负荷剂量通过静脉内输注施用。在一些实施方案中，将初始剂量的西妥昔单抗以约400mg/m2的负荷剂量通过静脉内输注施用，并且将所有后续剂量的西妥昔单抗以约250mg/m2的负荷剂量通过静脉内输注施用。在这些实施方案的任一个中，将西妥昔单抗经约30-240分钟输注。在一些实施方案中，将西妥昔单抗经约30分钟输注。在一些实施方案中，将西妥昔单抗经约60分钟输注。在一些实施方案中，将西妥昔单抗经约90分钟输注。在一些实施方案中，将西妥昔单抗经约120分钟输注。在一些实施方案中，将西妥昔单抗经约150分钟输注。在一些实施方案中，将西妥昔单抗经约180分钟输注。在一些实施方案中，将西妥昔单抗经约210分钟输注。在一些实施方案中，将西妥昔单抗经约240分钟输注。在这些实施方案的任一个中，将西妥昔单抗以约1mg/min至约10mg/min(如1mg/min、2mg/min、3mg/min、4mg/min、5mg/min、6mg/min、7mg/min、8mg/min、9mg/min或10mg/min)的输注速率施用。在一些实施方案中，将第一剂量的西妥昔单抗以比后续剂量的西妥昔单抗的剂量更高的负荷剂量施用。在一些实施方案中，第一剂量的西妥昔单抗的输注时间比后续剂量的西妥昔单抗的输注时间更长。在一些实施方案中，将西妥昔单抗每3周以如本文所述的剂量施用。在一些实施方案中，将西妥昔单抗每2周以如本文所述的剂量施用。在一些实施方案中，将西妥昔单抗每周以如本文所述的剂量施用。
另外的药剂/预先药物治疗
在一些实施方案中，本文所述的任何方法进一步包括施用抗组胺药。在一些实施方案中，所述抗组胺药是西替利嗪。在一些实施方案中，所述抗组胺药是普鲁米近。在一些实施方案中，所述抗组胺药是右氯苯那敏。在一些实施方案中，所述抗组胺药是苯海拉明。在一些实施方案中，将苯海拉明以约25至50mg的剂量静脉内施用。
在一些实施方案中，本文所述的任何方法进一步包括施用镇痛剂(如对乙酰氨基酚)。在一些实施方案中，将对乙酰氨基酚以约650至1000mg的剂量口服施用。
在一些实施方案中，本文所述的任何方法进一步包括施用血清素5-HT3受体拮抗剂。在一些实施方案中，所述血清素5-HT3受体拮抗剂是格拉司琼。在一些实施方案中，所述血清素5-HT3受体拮抗剂是多拉司琼。在一些实施方案中，所述血清素5-HT3受体拮抗剂是托烷司琼。在一些实施方案中，所述血清素5-HT3受体拮抗剂是帕洛诺司琼。在一些实施方案中，所述血清素5-HT3受体拮抗剂是昂丹司琼。在一些实施方案中，将昂丹司琼以约8mg至0.15mg/kg的剂量静脉内施用。
在一些实施方案中，本文所述的任何方法进一步包括施用抗组胺药(如西替利嗪、普鲁米近、右氯苯那敏或苯海拉明)、镇痛剂(如对乙酰氨基酚)和/或血清素5-HT3受体拮抗剂(如格拉司琼、多拉司琼、托烷司琼、帕洛诺司琼或昂丹司琼)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用抗组胺药(如西替利嗪、普鲁米近、右氯苯那敏或苯海拉明)和镇痛剂(如对乙酰氨基酚)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用抗组胺药(如西替利嗪、普鲁米近、右氯苯那敏或苯海拉明)和血清素5-HT3受体拮抗剂(如格拉司琼、多拉司琼、托烷司琼、帕洛诺司琼或昂丹司琼)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用镇痛剂(如对乙酰氨基酚)和血清素5-HT3受体拮抗剂(如格拉司琼、多拉司琼、托烷司琼、帕洛诺司琼或昂丹司琼)。在一些实施方案中，本文所述的任何方法进一步包括施用抗组胺药(如西替利嗪、普鲁米近、右氯苯那敏或苯海拉明)、镇痛剂(如对乙酰氨基酚)和血清素5-HT3受体拮抗剂(如格拉司琼、多拉司琼、托烷司琼、帕洛诺司琼或昂丹司琼)。
在一些实施方案中，本文所述的任何方法进一步包括施用预先药物治疗，例如以预防或减少输注相关反应(IAR)或流感样症状的急性效应。在一些实施方案中，将所述预先药物治疗在施用IL-2缀合物和/或抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)之前施用。在一些实施方案中，将所述预先药物治疗在施用IL-2缀合物之前施用。在一些实施方案中，将所述预先药物治疗在施用抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)之前施用。在一些实施方案中，将所述预先药物治疗在施用IL-2缀合物和抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)之前施用。
在一些实施方案中，IL-2缀合物的预先药物治疗与抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)的预先药物治疗不同。在一些实施方案中，IL-2缀合物的预先药物治疗与抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)的预先药物治疗相同。在IL-2缀合物和抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)的预先药物治疗相同的一些情况下，仅施用单个剂量的预先药物治疗。在IL-2缀合物和抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)的预先药物治疗相同的其他情况下，施用多个剂量的预先药物治疗。在一些实施方案中，针对所施用的所有剂量的IL-2缀合物施用预先药物治疗。在一些实施方案中，针对第一1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量的IL-2缀合物并且不针对任何后续剂量的IL-2缀合物施用预先药物治疗。在一些实施方案中，针对第一4个剂量的IL-2缀合物并且不针对任何后续剂量的IL-2缀合物施用预先药物治疗。在一些实施方案中，针对所施用的所有剂量的抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)施用预先药物治疗。在一些实施方案中，针对第一1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量的抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)并且不针对任何后续剂量的抗EGFR抗体施用预先药物治疗。在一些实施方案中，针对第一剂量的抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)并且不对任何后续剂量的抗EGFR抗体施用预先药物治疗。
在一些实施方案中，本文所述的任何方法进一步包括在施用IL-2缀合物之前施用预先药物治疗。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物预先药物治疗是抗组胺药，如西替利嗪、普鲁米近、右氯苯那敏或苯海拉明。在一些实施方案中，所述抗组胺药是苯海拉明。在一些实施方案中，将苯海拉明以约25至50mg的剂量静脉内施用。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物预先药物治疗是血清素5-HT3受体拮抗剂(如格拉司琼、多拉司琼、托烷司琼、帕洛诺司琼或昂丹司琼)。在一些实施方案中，所述血清素5-HT3受体拮抗剂是昂丹司琼。在一些实施方案中，将昂丹司琼以约8mg至0.15mg/kg的剂量静脉内施用。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物预先药物治疗是镇痛剂(如对乙酰氨基酚)。在一些实施方案中，将对乙酰氨基酚以约650至1000mg的剂量口服施用。
在一些实施方案中，本文所述的任何方法进一步包括在施用抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)之前施用预先药物治疗。在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体预先药物治疗是抗组胺药，如西替利嗪、普鲁米近、右氯苯那敏或苯海拉明。在一些实施方案中，所述抗组胺药是苯海拉明。在一些实施方案中，将苯海拉明以约25至50mg的剂量静脉内施用。在一些实施方案中，所述西妥昔单抗预先药物治疗是血清素5-HT3受体拮抗剂(如格拉司琼、多拉司琼、托烷司琼、帕洛诺司琼或昂丹司琼)。在一些实施方案中，所述血清素5-HT3受体拮抗剂是昂丹司琼。在一些实施方案中，将昂丹司琼以约8mg至0.15mg/kg的剂量静脉内施用。在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体预先药物治疗是镇痛剂(如对乙酰氨基酚)。在一些实施方案中，将对乙酰氨基酚以约650至1000mg的剂量口服施用。
在一些实施方案中，本文所述的任何方法进一步包括在施用IL-2缀合物之前施用第一剂量的预先药物治疗并且在施用抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)之前施用第二剂量的预先药物治疗。在一些实施方案中，IL-2缀合物的预先药物治疗与抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)的预先药物治疗相同。在一些实施方案中，IL-2缀合物的预先药物治疗与抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)的预先药物治疗不同。在一些实施方案中，所述预先药物治疗是抗组胺药，如西替利嗪、普鲁米近、右氯苯那敏或苯海拉明。在一些实施方案中，所述抗组胺药是苯海拉明。在一些实施方案中，将苯海拉明以约25至50mg的剂量静脉内施用。在一些实施方案中，所述预先药物治疗是血清素5-HT3受体拮抗剂(如格拉司琼、多拉司琼、托烷司琼、帕洛诺司琼或昂丹司琼)。在一些实施方案中，所述血清素5-HT3受体拮抗剂是昂丹司琼。在一些实施方案中，将昂丹司琼以约8mg至0.15mg/kg的剂量静脉内施用。在一些实施方案中，所述预先药物治疗是镇痛剂(如对乙酰氨基酚)。在一些实施方案中，将对乙酰氨基酚以约650至1000mg的剂量口服施用。在一些实施方案中，所述预先药物治疗包括抗组胺药和血清素5-HT3受体拮抗剂。在一些实施方案中，所述预先药物治疗包括抗组胺药和镇痛剂。在一些实施方案中，所述预先药物治疗包括血清素5-HT3受体拮抗剂和镇痛剂。在一些实施方案中，所述预先药物治疗包括抗组胺药、血清素5-HT3受体拮抗剂和镇痛剂。在IL-2缀合物和抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)的预先药物治疗(如苯海拉明)相同的一些情况下，仅施用单个剂量的预先药物治疗。在IL-2缀合物和抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)的预先药物治疗相同的其他情况下，施用多个剂量的预先药物治疗。
在本文所述的方法的一些实施方案中，给药顺序如下：(i)抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)的预先药物治疗；(ii)抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)；(iii)IL-2缀合物的预先药物治疗；和(iv)IL-2缀合物。在抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)的预先药物治疗与IL-2缀合物的预先药物治疗(如苯海拉明)相同的一些变型中，可以省略施用IL-2缀合物的预先药物治疗。在一些实施方案中，给药顺序如下：(i)IL-2缀合物的预先药物治疗；(ii)IL-2缀合物；(iii)抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)的预先药物治疗；和(iv)抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)。在抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)的预先药物治疗与IL-2缀合物的预先药物治疗(如苯海拉明)相同的一些变型中，可以省略施用抗EGFR抗体的预先药物治疗。
受试者
在一些实施方案中，施用有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体是针对成人的。在一些实施方案中，所述成人是男性。在其他实施方案中，所述成人是女性。在一些实施方案中，所述成人的年龄是至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95岁。在一些实施方案中，施用有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体是针对婴儿、儿童或青少年的。在一些实施方案中，所述受试者为至少1月龄、2月龄、3月龄、6月龄、9月龄或12月龄。在一些实施方案中，所述受试者为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19岁。
在一些实施方案中，所述受试者患有可测量的疾病(即，癌症)，如通过RECISTv1.1确定。在一些实施方案中，已经确定所述受试者的东部肿瘤协作组(EasternCooperative Oncology Group，ECOG)体能状态为0或1。在一些实施方案中，所述受试者具有足够的心血管、血液、肝脏和肾脏功能，如通过医生确定。在一些实施方案中，所述受试者已确定(例如，由医生)具有大于或等于12周的期望寿命。
在一些实施方案中，所述受试者具有足够的心血管、血液、肝脏和肾脏功能。
在一些实施方案中，所述受试者患有组织学或细胞学确诊的晚期和/或转移性实体瘤，其中根据临床判断(即，如通过医生确定)至少一个肿瘤病变具有可进行安全性活检的位置。在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量之前接受过先前的抗癌疗法。在一些实施方案中，先前的抗癌疗法的治疗相关毒性已经消退到适当的水平。
在一些实施方案中，所述受试者为具有生育潜力的女性并且在治疗期间和施用最后的治疗剂量后至少3个月使用医学上接受的节育方法。在一些实施方案中，所述受试者为在施用第一治疗剂量前7天内妊娠测试为阴性(通过血清妊娠试验)的绝经前女性。在一些实施方案中，所述受试者为在施用第一治疗剂量前7天内妊娠测试为阴性(通过血清妊娠试验)的绝经后少于12个月的女性。
在一些实施方案中，所述受试者为未进行手术绝育并且在治疗期间和施用最后的剂量后至少3个月使用医学上接受的节育方法的男性。在一些实施方案中，所述男性在治疗时间段期间和施用最后治疗剂量后至少3个月不捐献或储存***。
在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量的14天内未接受放射疗法。在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量的7天内未接受姑息性辐射或立体定向放射外科手术。
在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量的2周内未用全身抗癌疗法或研究性抗癌剂治疗。在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量的4周内未用免疫疗法或酪氨酸激酶抑制剂疗法治疗。
在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量的30天内未做过大型外科手术。在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量前超过30天做过大型外科手术并且已经从与程序相关的任何不良反应中恢复到至少1级。在一些实施方案中，所述受试者预期在疗程期间不需要做大型外科手术。
在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量之前3个月内不患有需要全身治疗的活动性自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量之前没有记录的需要全身类固醇或免疫抑制剂的临床严重的自身免疫性疾病的病史。
在一些实施方案中，所述受试者不患有原发性中枢神经***(CNS)疾病或软脑膜疾病。在一些实施方案中，所述受试者患有已知的CNS转移但是接受了适当的治疗并且是无症状的，在施用第一治疗剂量之前至少8周没有放射学进展的证据，并且在施用第一治疗剂量之前14天内不需要诱导抗惊厥的类固醇或酶。
在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量的6个月内不患有肺功能异常，包括肺炎、活动性肺炎、需要使用类固醇的间质性肺疾病、特发性肺纤维化、确认的胸腔积液以及休息时或需要辅助供氧疗法的严重呼吸困难。
在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量的14天内未服用肠胃外抗生素。
在一些实施方案中，所述受试者没有同种异体移植史或实体器官移植史。在一些实施方案中，所述受试者不患有人类免疫缺陷病毒(HIV)感染或丙型肝炎活动性感染。在一些实施方案中，所述受试者不患有未被控制的乙型肝炎病毒(HBV)感染。
在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量之前的2周内无临床上显著的出血(例如，胃肠出血、颅内出血)。在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量的3个月内无深静脉血栓形成或肺栓塞的先前诊断。
在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量之前6个月内没有严重或不稳定心脏病症(如充血性心力衰竭(纽约心脏协会(New York Heart Association)III或IV级)、心脏搭桥手术或冠状动脉支架置入术、血管成形术、心脏射血分值低于正常下限、不稳定心绞痛、医学上未被控制的高血压(例如收缩压≥160mm Hg或舒张压≥100mm Hg)、需要药物治疗的未被控制的心律失常(≥2级，根据NCI CTCAE v5.0)、或心肌梗塞)。
在一些实施方案中，所述受试者没有使用Fridericia公式(QTcF)男性>450毫秒(msec)或女性>470毫秒(msec)确定的非药物诱导的校正QT间期延长史。
在一些实施方案中，所述受试者对本文公开的IL-2缀合物、PEG、聚乙二醇化药物或抗EGFR抗体(例如像，西妥昔单抗)中的任一种没有已知的超敏反应或禁忌证。
在一些实施方案中，所述受试者不患有活动性次发性恶性肿瘤(secondmalignancy)。在一些实施方案中，所述受试者没有先前的恶性肿瘤史。在一些实施方案中，所述受试者在施用第一治疗剂量之前患有已经治愈性手术切除的非黑色素瘤性皮肤癌或***。
在一些实施方案中，所述受试者没有任何严重的医学病症(包括预先存在的自身免疫性疾病或炎性障碍)、实验室异常、精神病症或会妨碍治疗或使治疗不适当的任何其他显著或不稳定的并发医学疾病。
在一些实施方案中，所述受试者未怀孕或哺乳。在一些实施方案中，所述受试者不期望在疗程期间以及在施用最后的治疗剂量后随访3个月怀孕或生育孩子。
在一些实施方案中，所述受试者在疗程期间未接受用任何研究性药剂、疫苗或装置的并行治疗。在一些实施方案中，在医生批准后，所述受试者在疗程期间接受用研究性药剂、疫苗或装置的并行治疗。
施用效果
在一些实施方案中，施用IL-2缀合物和抗EGFR抗体后，受试者经历反应，如通过实体瘤免疫相关反应评价标准(Immune-related Response Evaluation Criteria in SolidTumors，iRECIST)测量的。在一些实施方案中，施用IL-2缀合物和抗EGFR抗体后，受试者经历根据RECIST 1.1版本的客观反应率(ORR)。在一些实施方案中，施用IL-2缀合物和抗EGFR抗体后，受试者经历根据RECIST 1.1版本的反应持续时间(DOR)。在一些实施方案中，施用IL-2缀合物和抗EGFR抗体后，受试者经历根据RECIST 1.1版本的无进展存活期(PFS)。在一些实施方案中，施用IL-2缀合物和抗EGFR抗体后，受试者经历根据RECIST 1.1版本的总存活期。在一些实施方案中，施用IL-2缀合物和抗EGFR抗体后，受试者经历根据RECIST 1.1版本的至反应的时间(Time to Response)(TTR)。在一些实施方案中，施用IL-2缀合物和抗EGFR抗体后，受试者经历根据RECIST 1.1版本的疾病控制率(DCR)。在这些实施方案的任一个中，所述受试者的经历是基于医生对受试者拍摄的射线图像的审查。
在一些实施方案中，基于医生对受试者拍摄的射线图像的审查停止治疗。
在一些实施方案中，基于医生对不同时间点的外周血的免疫表型的审查停止治疗。在一些实施方案中，基于医生对不同时间点的肿瘤样品的免疫表型的审查停止治疗。在一些实施方案中，基于医生对不同时间点的本文公开的任何IL-2缀合物的抗体的存在的审查停止治疗。在一些实施方案中，基于医生对不同时间点的本文公开的任何IL-2缀合物的血浆浓度的审查停止治疗。在这些实施方案的任一个中，医师的复查是基于相关参数的适当分析。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不引起所述受试者的血管渗漏综合征。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不引起所述受试者的2级、3级或4级血管渗漏综合征。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不引起所述受试者的2级血管渗漏综合征。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不引起所述受试者的3级血管渗漏综合征。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不引起所述受试者的4级血管渗漏综合征。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不引起所述受试者的血管张力丧失。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不引起血浆蛋白和液体外渗到所述受试者的血管外空间。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不引起所述受试者的低血压和器官灌注减少。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不引起所述受试者的嗜中性粒细胞功能受损。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不引起所述受试者的趋化性降低。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者与所述受试者的播散性感染的风险增加不相关。在一些实施方案中，所述播散性感染是脓毒症或细菌性心内膜炎。在一些实施方案中，所述播散性感染是脓毒症。在一些实施方案中，所述播散性感染是细菌性心内膜炎。在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物和抗EGFR抗体之前，治疗所述受试者的任何先前存在的细菌感染。在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物和抗EGFR抗体之前，用选自苯唑西林、萘夫西林、环丙沙星和万古霉素的抗细菌剂治疗所述受试者。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会加重所述受试者预先存在的或初始呈现的自身免疫性疾病或炎性障碍。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会加重所述受试者预先存在的或初始呈现的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会加重所述受试者预先存在的或初始呈现的炎性障碍。在一些实施方案中，所述受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍选自克罗恩病、硬皮病、甲状腺炎、炎性关节炎、糖尿病、眼球型重症肌无力、新月体性IgA肾小球肾炎、胆囊炎、脑血管炎、史-约综合征和大疱性类天疱疮。在一些实施方案中，所述受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是克罗恩病。在一些实施方案中，所述受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是硬皮病。在一些实施方案中，所述受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是甲状腺炎。在一些实施方案中，所述受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是炎性关节炎。在一些实施方案中，所述受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是糖尿病。在一些实施方案中，所述受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是眼球型重症肌无力。在一些实施方案中，所述受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是新月体性IgA肾小球肾炎。在一些实施方案中，所述受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是胆囊炎。在一些实施方案中，所述受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是脑血管炎。在一些实施方案中，所述受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是史-约综合征。在一些实施方案中，所述受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是大疱性类天疱疮。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会引起所述受试者的精神状态变化、言语困难、皮质盲、肢体或步态共济失调、幻觉、激越、迟钝或昏迷。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会引起所述受试者的癫痫。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者在患有已知癫痫障碍的受试者中不是禁忌的。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会引起所述受试者的毛细血管渗漏综合征。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会引起所述受试者的2级、3级或4级毛细血管渗漏综合征。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会引起所述受试者的2级毛细血管渗漏综合征。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会引起所述受试者的3级毛细血管渗漏综合征。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会引起所述受试者的4级毛细血管渗漏综合征。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会在将所述IL-2缀合物施用至所述受试者后引起所述受试者的平均动脉血压下降。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者确实会引起所述受试者的低血压。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会引起所述受试者经历收缩压低于90mm Hg或收缩压相对于基线下降20mm Hg。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会引起所述受试者的水肿或者肾功能损伤或肝功能损伤。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会引起所述受试者的嗜酸性粒细胞增多症。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会引起所述受试者的外周血中的嗜酸性粒细胞计数超过500个/μL。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会引起所述受试者的外周血中的嗜酸性粒细胞计数超过500μL至1500个/μL。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会引起所述受试者的外周血中的嗜酸性粒细胞计数超过1500个/μL至5000个/μL。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会引起所述受试者的外周血中的嗜酸性粒细胞计数超过5000个/μL。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者在接受现有的精神药物方案的受试者中不是禁忌的。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者在接受现有的肾毒性、骨髓毒性、心脏毒性或肝毒性药物方案的受试者中不是禁忌的。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者在接受现有的氨基糖苷、细胞毒性化学疗法、多柔比星、氨甲蝶呤或天冬酰胺酶方案的受试者中不是禁忌的。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者在接受含有抗肿瘤剂的组合方案的受试者中不是禁忌的。在一些实施方案中，所述抗肿瘤剂选自达卡巴嗪、顺铂、他莫昔芬和干扰素-α。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不会在所述IL-2缀合物施用至所述受试者后引起所述受试者的一个或多个4级不良事件。在一些实施方案中，4级不良事件选自体温过低；休克；心动过缓；心室期外收缩；心肌缺血；晕厥；出血；房性心律失常；静脉炎；二度房室传导阻滞；心内膜炎；心包积液；外周坏疽；血栓形成；冠状动脉障碍；口炎；恶心和呕吐；肝功能测试异常；胃肠出血；呕血；血性腹泻；胃肠道障碍；肠穿孔；胰腺炎；贫血；白细胞减少；白细胞增多；低钙血症；碱性磷酸酶升高；血尿素氮(BUN)升高；高尿酸血症；非蛋白氮(NPN)升高；呼吸性酸中毒；嗜睡；激越；神经病；偏执狂反应；抽搐；癫痫大发作性抽搐；谵妄；哮喘、肺水肿；通气过度；低氧症；咯血；通气不足；气胸；瞳孔散大；瞳孔障碍；肾功能异常；肾衰；和急性肾小管坏死。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至一组受试者不会在所述IL-2缀合物施用至所述受试者后在大于1％的所述受试者中引起一个或多个4级不良事件。在一些实施方案中，4级不良事件选自体温过低；休克；心动过缓；心室期外收缩；心肌缺血；晕厥；出血；房性心律失常；静脉炎；二度房室传导阻滞；心内膜炎；心包积液；外周坏疽；血栓形成；冠状动脉障碍；口炎；恶心和呕吐；肝功能测试异常；胃肠出血；呕血；血性腹泻；胃肠道障碍；肠穿孔；胰腺炎；贫血；白细胞减少；白细胞增多；低钙血症；碱性磷酸酶升高；血尿素氮(BUN)升高；高尿酸血症；非蛋白氮(NPN)升高；呼吸性酸中毒；嗜睡；激越；神经病；偏执狂反应；抽搐；癫痫大发作性抽搐；谵妄；哮喘、肺水肿；通气过度；低氧症；咯血；通气不足；气胸；瞳孔散大；瞳孔障碍；肾功能异常；肾衰；和急性肾小管坏死。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至一组受试者不会在将所述IL-2缀合物施用至所述受试者之后在大于1％的所述受试者中引起一种或多种不良事件，其中所述一种或多种不良事件选自十二指肠溃疡形成；肠坏死；心肌炎；室上性心动过速；继发于视神经炎的永久性或暂时性失明；短暂脑缺血发作；脑膜炎；脑水肿；心包炎；过敏性间质性肾炎；和气管食管瘘。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至一组受试者不会在施用后在大于1％的所述受试者中引起一种或多种不良事件，其中所述一种或多种不良事件选自恶性高热；心脏停搏；心肌梗塞；肺栓塞；脑卒中；肠穿孔；肝或肾衰竭；导致***的严重抑郁症；肺水肿；呼吸停止；呼吸衰竭。
在一些实施方案中，将IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至所述受试者在不增加所述受试者中外周CD4+调节性T细胞的数量的情况下增加所述受试者中外周CD8+T和NK细胞的数量。在一些实施方案中，将IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至所述受试者在不增加所述受试者中外周嗜酸性粒细胞的数量的情况下增加所述受试者中外周CD8+T和NK细胞的数量。在一些实施方案中，将IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至所述受试者在不增加所述受试者中瘤内CD8+T和NK细胞的数量的情况下在不增加所述受试者中瘤内CD4+调节性T细胞的数量的情况下增加所述受试者中外周CD8+T和NK细胞的数量。
在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物和抗EGFR抗体施用至受试者不需要加强监护设施或者心肺或加强监护医学方面的熟练专家的可用性。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至受试者不需要加强监护设施或者心肺或加强监护医学方面的熟练专家的可用性。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至受试者不需要加强监护设施的可用性。在一些实施方案中，将有效量的IL-2缀合物施用至受试者不需要心肺或加强监护医学方面的熟练专家的可用性。
在一些实施方案中，IL-2缀合物和抗EGFR抗体组合疗法的施用改善了对癌症的ADCC反应，例如，通过改善抗EGFR抗体的ADCC功能。在一些实施方案中，IL-2缀合物和抗EGFR抗体组合疗法的施用增加了先天和适应性免疫细胞。在一些实施方案中，IL-2缀合物和抗EGFR抗体组合疗法的施用促进了肿瘤微环境内的免疫激活。在一些实施方案中，IL-2缀合物和抗EGFR抗体的施用导致两种药剂的组合的抗癌活性与任一种药剂单独的抗癌活性相比时的协同改善。在一些实施方案中，施用IL-2缀合物增加了激活的NK细胞的数和量，其增强了由抗EGFR抗体触发的ADCC。
另外的药剂
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的除抗EGFR抗体之外的一种或多种化学治疗剂。在一些实施方案中，所述一种或多种化学治疗剂包含一种或多种基于铂的化学治疗剂。在一些实施方案中，所述一种或多种化学治疗剂包含卡铂和培美曲塞。在一些实施方案中，所述一种或多种化学治疗剂包含卡铂和纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方案中，所述一种或多种化学治疗剂包含卡铂和多西紫杉醇。在一些实施方案中，所述受试者的癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。
试剂盒/制品
在某些实施方案中，本文公开了与本文所述的一种或多种方法和组合物一起使用的试剂盒和制品。此类试剂盒包括载体、包装或容器，其被分隔以容纳一个或多个容器如小瓶、管等，所述一个或多个容器中的每一个包含有待在本文所述的方法中使用的单独要素之一。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，容器由各种材料(如玻璃或塑料)形成。所述试剂盒包含IL-2缀合物和抗EGFR抗体。
试剂盒通常包括列出内容物和/或使用说明的标签、以及包含使用说明的包装说明书。通常还将包括一组指令。
在一个实施方案中，标签在容器上或与容器相关。在一个实施方案中，当形成标签的字母、数字或其他字符被贴附、模制或蚀刻到容器本身中时，标签在容器上；当标签存在于也容纳容器的插座或载体内时，标签与容器相连，例如作为包装说明书。在一个实施方案中，标签用于指示，内容物要被用于特定治疗应用。标签还指示使用内容物的指示，如在本文所述的方法中。
在某些实施方案中，药物组合物存在于包装或分配器装置中，所述装置含有一个或多个含有本文所提供化合物的单位剂型。包装例如含有金属或塑料箔，如泡罩包装。在一个实施方案中，包装或分配器装置附有施用说明书。在一个实施方案中，包装或分配器还附有与容器相连的通知，所述通知的形式由管理药物制造、使用或销售的政府机构规定，所述通知反映了所述机构对用于人或兽医施用的药物形式的批准。例如，此类通知是由美国食品和药物监督管理局批准的药物标签，或批准的产品插页。在一个实施方案中，还制备在相容的药物载体中配制的含有本文所提供化合物的组合物，将其放置在适当的容器中，并标记用于治疗所指示病症。
示例性实施方案
本公开文本通过以下实施方案作进一步描述。每个实施方案的特征可在适当和实用的情况下与任何其他实施方案组合。
实施方案P1.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(a)IL-2缀合物和(b)抗EGFR抗体，其中所述IL-2缀合物包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(I)的结构替代：
Figure BDA0004086255800001091
其中：
Z是CH2并且Y是
Figure BDA0004086255800001092
Y是CH2并且Z是
Figure BDA0004086255800001093
Z是CH2并且Y是
Figure BDA0004086255800001094
或者
Y是CH2并且Z是
Figure BDA0004086255800001095
W是具有选自5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团；并且
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800001101
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点；
其中所述式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71，
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或水合物。
实施方案P2.根据实施方案P1所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，Z是CH2并且Y是
Figure BDA0004086255800001102
实施方案P3.根据实施方案P1所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，Y是CH2并且Z是
Figure BDA0004086255800001103
实施方案P4.根据实施方案P1-3中任一项所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，所述PEG基团具有25kDa、30kDa或35kDa的平均分子量。
实施方案P5.根据实施方案4所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，所述PEG基团具有30kDa的平均分子量。
实施方案P6.根据实施方案P1-5中任一项所述的方法，其中所述式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是P64。
实施方案P7.根据实施方案P1所述的方法，其中所述式(I)的结构具有式(XII)或式(XIII)的结构，或者是式(XII)与式(XIII)的结构的混合物：
Figure BDA0004086255800001104
其中：
n是在约2至约5000范围内的整数；并且
所述波浪线指示与SEQ ID NO:3内未被替代的氨基酸残基的共价键，
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或水合物。
实施方案P8.根据实施方案P7所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，n是使得-(OCH2CH2)n-OCH3具有约25kDa、30kDa或35kDa的分子量的整数。
实施方案P9.根据实施方案P8所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，n是使得-(OCH2CH2)n-OCH3具有约30kDa的分子量的整数。
实施方案P10.根据实施方案P7-9中任一项所述的方法，其中所述式(XII)或式(XIII)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是P64。
实施方案P11.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(a)IL-2缀合物，和(b)抗EGFR抗体，其中所述IL-2缀合物包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG30kD]具有式(IV)或式(V)的结构，或者是式(IV)与式(V)的结构的混合物：
Figure BDA0004086255800001111
其中：
W是具有选自5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团；
X具有以下结构：
Figure BDA0004086255800001112
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点；
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或水合物。
实施方案P12.根据实施方案P11所述的方法，其中W是具有选自25kDa、30kDa或35kDa的平均分子量的PEG基团。
实施方案P13.根据实施方案P12所述的方法，其中W是具有30kDa的平均分子量的PEG基团。
实施方案P14.根据实施方案P1-13中任一项所述的方法，其中所述抗EGFR抗体是西妥昔单抗。
实施方案P15.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(a)IL-2缀合物和(b)西妥昔单抗，其中所述IL-2缀合物包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG30kD]具有式(XII)或式(XIII)的结构，或者是式(XII)与式(XIII)的结构的混合物：
Figure BDA0004086255800001121
其中：
n是使得-(OCH2CH2)n-OCH3具有约30kDa的分子量的整数；并且
所述波浪线指示与SEQ ID NO:50内未被替代的氨基酸残基的共价键，
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或水合物。
实施方案P16.根据实施方案P1-15中任一项所述的方法，其中所述癌症选自肾细胞癌(RCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、尿路上皮癌、微卫星不稳定癌、微卫星稳定癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌(CRC)、***、肝细胞癌(HCC)、梅克尔细胞癌(MCC)、黑色素瘤、小细胞肺癌(SCLC)、食管癌、食管鳞状细胞癌(ESCC)、胶质母细胞瘤、间皮瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、***癌、去势抵抗性***癌、转移性去势抵抗性***癌、或具有DNA损伤应答(DDR)缺陷的转移性去势抵抗性***癌、膀胱癌、卵巢癌、中度至低度突变负担的肿瘤、皮肤鳞状细胞癌(CSCC)、鳞状细胞皮肤癌(SCSC)、低表达至不表达PD-L1的肿瘤、超出其原发解剖学起源部位全身性播散至肝脏和CNS的肿瘤以及弥漫性大B细胞淋巴瘤。
实施方案P17.根据实施方案P1-16中任一项所述的方法，其中将所述IL-2缀合物施用至所述受试者，每周一次、每两周一次、每三周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次或每8周一次。
实施方案P18.根据实施方案P1-17中任一项所述的方法，其中通过静脉内施用将所述IL-2缀合物施用至受试者。
实施例
这些实施例仅仅出于说明性目的提供，并且不限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1.IL-2缀合物IL-2_P65_[AzK_L1_PEG30kD]-1的制备。
将用于生物缀合的IL-2使用本文公开的方法使用以下在大肠杆菌中表达为包涵体：(a)编码以下的表达质粒：(i)具有所需氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列的基因含有第一非天然碱基对以提供在所需位置(其中掺入了非天然氨基酸N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸(AzK))处的密码子，和(ii)源自马氏甲烷八叠球菌Pyl的tRNA，其基因包含第二非天然核苷酸以提供匹配的反密码子替代其天然序列；(b)编码巴氏甲烷八叠球菌衍生的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(Mb PylRS)的质粒；(c)AzK；和(d)核苷酸三磷酸转运蛋白PtNTT2的截短变体，其中全长蛋白的前65个氨基酸残基被缺失。编码IL-2变体的氨基酸序列的双链寡核苷酸含有密码子AXC作为编码具有SEQ ID NO:3的蛋白质的序列的密码子64，其中P64被本文所述的非天然氨基酸替代。编码来自马氏甲烷八叠球菌的正交tRNA基因的质粒包含匹配AXC的反密码子GYT替代其天然序列，其中Y是如本文所公开的非天然核苷酸。X和Y选自如本文公开的非天然核苷酸dTPT3和dNaM。将表达的蛋白质从包涵体中提取出来并且使用标准程序重新折叠，然后使用DBCO介导的无铜点击化学对含有AzK的IL-2产物进行位点特异性聚乙二醇化，以将稳定的共价mPEG部分(具有30kDa平均分子量的甲氧基线性PEG基团)附接到AzK(如上文方案6中所概述的)。
IL-2缀合物“IL-2_P65_[AzK_L1_PEG30kD]-1”包含SEQ ID NO:50，其中位置64处的脯氨酸被AzK_L1_PEG30kD替代，其中AzK_L1_PEG30kD被定义为式(IV)或式(V)的结构或者式(IV)与式(V)的混合物和30kDa线性mPEG链。IL-2缀合物“IL-2_P65_[AzK_L1_PEG30kD]-1”还被定义为包含SEQ ID NO:3的化合物，其中位置64处的脯氨酸残基(P64)被式(VIII)或式(IX)的结构或者式(VIII)与式(IX)的混合物替代，其中n是使得PEG基团的分子量为约30kDa的整数。IL-2缀合物“IL-2_P65[AzK_L1_PEG30kD]-1”还被定义为包含SEQID NO:3的化合物，其中位置64处的脯氨酸残基(P64)被式(XII)或式(XIII)的结构或者式(XII)与式(XIII)的混合物替代，其中n是使得PEG基团的分子量为约30kDa的整数。
实施例2.使用IL-2_P65_[AzK_L1_PEG30kD]-1和西妥昔单抗的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)测定.
使用钙黄绿素-乙酰氧基甲基(钙黄绿素-AM；Invitrogen)释放测定检查IL-2_P65_[AzK_L1_PEG30kD]-1对西妥昔单抗的ADCC功能的影响。
材料。
使用以下细胞系：A431(EGFR高表达细胞系)、人PBMC获自健康供体，并且使用EasySep人NK细胞富集试剂盒(Stemcell)富集。
使用以下试剂：钙黄绿素-乙酰氧基甲基(钙黄绿素-AM；Invitrogen)、丙磺舒(Invitrogen)、超低IgG胎牛血清(Thermofisher)和人同种型IgG1抗体(Biolegend)。
程序.
根据制造商推荐的方案使用RoboSepTM仪器从PBMC中阴性选择人原代NK细胞。将纯化的NK细胞与不同浓度(0.1μg/mL、0.01μg/mL、0.001μg/mL和0μg/mL)的IL-2_P65_[AzK_L1_PEG30kD]-1在补充有1％低IgG FBS的RPMI 1640培养基中在37℃下在具有5％CO2的加湿培养箱中一起培养18小时。将这些培养的细胞用作效应细胞。将人EGFR阳性癌细胞系(A431)用钙黄绿素-AM标记30min(将50μg稀释于25μL DMSO中以制备储备溶液，然后将10μL钙黄绿素储备溶液添加到4mL RPMI 1640+1％低IgG FBS+1％丙磺舒中用于4×106个细胞的染色)，然后洗涤并且以5×103个细胞/孔的密度铺板到96孔圆底板上。将西妥昔单抗和同种型人IgG1抗体以不同浓度(10μg/mL至1pg/mL)添加30min以允许调理作用，然后添加NK细胞。收集用IL-2_P65_[AzK_L1_PEG30kD]-1激活的NK细胞并且将其作为效应细胞以3:1的E:T比(6×104个NK细胞比2×104个靶细胞)添加。然后将板在37℃下在具有5％CO2的加湿培养箱中孵育1小时，并且收获90μL上清液并且将其转移到不透明96孔微孔板中用于在Envision 2104板读取器(激发：492nm；发射：515nm)上使用荧光测定分析。
为了最大的释放，将细胞用2％Triton X-100裂解。将培养基背景的荧光值从实验释放的荧光值(A)、靶细胞自发释放的荧光值(B)和靶细胞最大释放的荧光值(C)中减去。
使用以下公式计算每个板(一式两份)的细胞毒性和ADCC百分比：
细胞毒性(％)＝(A-B)/(C-B)×100
ADCC(％)＝细胞毒性(％，用抗体)-细胞毒性(％，不用抗体)
对于每个实验，使用三个重复孔一式三份地进行测量。每个实验重复至少3次。通过使用GraphPad Prism 5(GraphPad Software,Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥)将数据点拟合到4参数方程来计算半数最大有效浓度(EC50)值。
结果。
在没有通过IL-2_P65_[AzK_L1_PEG30kD]-1激活的情况下，西妥昔单抗处理的人NK细胞展现出针对表达EGFR的癌细胞系(A431和A549)的细胞毒性，而没有展现出针对不表达EGFR的细胞(NCI-H69)的细胞毒性。在通过IL-2_P65_[AzK_L1_PEG30kD]-1激活后，西妥昔单抗处理的人NK细胞展现出针对表达EGFR的癌细胞系(A431和A549)的增强的细胞毒性。
实施例3.IL-2缀合物和西妥昔单抗的体外研究(PBMC ADCC测定).
进行了一项研究，研究了使用人PBMC与钙黄绿素标记的癌细胞系(CAL27和A431)共培养，实施例1的IL-2缀合物与西妥昔单抗组合对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的影响。
CAL27细胞.
试剂.
生物测定缓冲液：将1％超低IgG FBS添加到无酚红RPMI中。完全测定缓冲液：将450μL丙磺舒添加到45mL生物测定缓冲液中，其中最终丙磺舒浓度为77μg/mL。钙黄绿素-乙酰氧基甲基酯(钙黄绿素-AM)：在25μL DMSO中50μg。钙黄绿素-AM染色缓冲液：将10μL钙黄绿素-AM添加到4mL完全测定缓冲液中(最终钙黄绿素-AM浓度为5μg/mL)。Triton-X-100裂解缓冲液：将20μL Triton-X-100添加到4mL完全测定缓冲液中(最终浓度为0.5％)。
程序.
在第1天，制备IL-2缀合物的6点1:5稀释系列(在PBS中)。IL-2缀合物浓度为2、0.4、0.08、0.016、0.0032和0μg/mL。将PBMC通过以200x g离心5分钟收集并且以2千万个细胞/mL重新悬浮于无酚红RPMI+10％超低IgG中。将适当体积的这些PBMC转移到多孔储器的6个部分中，向其中添加一定范围的IL-2缀合物稀释液。通过上下移液将PBMC与IL-2缀合物充分混合并且使用多通道移液器将50μL转移到圆底96孔板中(最终每孔PBMC数为100万)。将六个空孔保留用于接下来的一天添加的对照。将板在5％二氧化碳的存在下在37℃下在加湿培养箱中孵育过夜。
在第2天，将CAL27细胞(表达EGFR的口腔上皮鳞状细胞癌细胞系)使用TrypLE表达解离缓冲液收获并且通过以200x g离心5分钟收集。将细胞计数并且将500万个细胞重新悬浮于4mL钙黄素-AM染色缓冲液中并且在5％二氧化碳的存在下在37℃下孵育30分钟。然后将细胞通过以200x g离心5分钟收集并且在完全测定缓冲液中洗涤两次。将细胞计数并且以40万个细胞/mL重新悬浮，最终靶细胞数为20,000个/孔。
将西妥昔单抗抗体(Eli Lilly&Co.)稀释至3X工作浓度(3、0.3、0.03、0.003μg/mL)用于1、0.1、0.001、0.0001μg/mL的最终测定浓度。将同种型对照(hIgG1，Biolegend)在完全测定缓冲液中稀释至3μg/mL用于1μg/mL的最终浓度。将等体积的染色CAL27细胞以40万个细胞/mL与抗体稀释液或同型对照混合并且在4℃下孵育30分钟以允许抗体结合。孵育后，将100μL抗体-CAL27细胞混合物添加到含有来自第1天的50μL IL-2缀合物处理的PBMC的96孔板中。
一式三份地制备对照孔，所述对照孔不含PBMC但是含有用完全测定缓冲液处理的50μL钙黄绿素-AM染色的CAL27细胞(背景信号)或者用50μL Triton-X-100处理的染色的CAL27(用于细胞裂解后的最大信号)，两者均用完全测定缓冲液制成至多150μL最终体积。将板以200x g离心1分钟，并且然后在5％二氧化碳的存在下在37℃下孵育60分钟。孵育后，将板再次短暂离心，然后将90μL上清液转移到新的黑色透明底板中并且在Envision 2104板读取器(激发：492nm；发射：515nm)上读取荧光信号。
使用以下公式计算细胞毒性：
细胞毒性(％)＝(A-B)/(C-B)×100
其中A是处理的细胞的荧光值；B是来自单独靶细胞的背景；并且C是获得自Triton-X-100处理的最大释放值。
数据表示在西妥昔单抗的存在下IL-2缀合物处理的人PBMC对靶癌细胞的细胞毒性％。将来自技术重复的平均百分比转换为比例。使用双向广义线性混合模型(GLMM)，用IL-2缀合物、西妥昔单抗和它们的相互作用的因素，用随机供体效应，将比例作为伪二项式变量进行分析。随后进行事后检验(用Dunnett-Hsu调整)以比较IL-2缀合物处理组与对照组。使用SAS(1)9.4版本软件进行统计分析。小于5％(p<0.05)的概率被认为是显著的。
结果。
在1、0.1和0.01mg/mL的西妥昔单抗剂量水平下，以0.08、0.4和2mg/mL浓度的IL-2缀合物增强了西妥昔单抗针对表达EGFR的CAL27细胞的ADCC功能(p<0.05)(图1A-图1C)。在0.001mg/mL的西妥昔单抗剂量水平下，以0.4和2mg/mL浓度的IL-2缀合物增强了西妥昔单抗针对表达EGFR的CAL27细胞的ADCC功能(p<0.05)。图2A进一步示出了西妥昔单抗针对表达EGFR的CAL27细胞的增强的ADCC功能(PBMC与CAL27比率50:1)。
来自GLMM模型的固定效应检验表明，因素IL-2缀合物、西妥昔单抗和它们的相互作用对细胞毒性具有显著影响，即不同西妥昔单抗浓度在IL-2缀合物组之间的差异显著不同。成对比较指示了在西妥昔单抗浓度为0.001mg/mL时，IL-2缀合物2mg/mL组相对于对照组之间的显著差异(p＝0.0001)以及IL-2缀合物0.4mg/mL组相对于对照组之间的显著差异(p＝0.0001)。成对比较还指示了在西妥昔单抗浓度为0.01mg/mL时，IL-2缀合物2mg/mL组相对于对照组之间的显著差异(p<0.0001)，IL-2缀合物0.4mg/mL组相对于对照组之间的显著差异(p<0.0001)，以及IL-2缀合物0.08mg/mL组相对于对照组之间的显著差异(p＝0.0003)。另外，成对比较指示了在西妥昔单抗浓度为0.1mg/mL时，IL-2缀合物2mg/mL组相对于对照组之间的显著差异(p<0.0001)，IL-2缀合物0.4mg/mL组相对于对照组之间的显著差异(p<0.0001)，以及IL-2缀合物0.08mg/mL组相对于对照组之间的显著差异(p<0.0001)。最后，成对比较指示了在西妥昔单抗浓度为1mg/mL时，IL-2缀合物2mg/mL组相对于对照组之间的显著差异(p<0.0001)，IL-2缀合物0.4mg/mL组相对于对照组之间的显著差异(p<0.0001)，以及IL-2缀合物0.08mg/mL组相对于对照组之间的显著差异(p<0.0001)。
数据证明了IL-2缀合物增强了西妥昔单抗针对表达EGFR的CAL27癌细胞的ADCC功能。使用IL-2缀合物与同种型对照组合未观察到显著差异。
A431细胞.
遵循上文概述的CAL27细胞的程序，使用表达EGFR的A431细胞(表皮样癌)进行研究。图2B示出了西妥昔单抗针对表达EGFR的A431细胞的增强的ADCC功能(PBMC与A431比率50:1)。数据证明了IL-2缀合物增强了西妥昔单抗针对表达EGFR的A431癌细胞的ADCC功能。
实施例4.使用工程化细胞系NK-92.CD16 V作为效应细胞的ADCC测定.
使用钙黄绿素-乙酰氧基甲基(钙黄绿素-AM；Invitrogen)释放测定检查IL-2_P65_[AzK_L1_PEG30kD]-1对西妥昔单抗的ADCC功能的影响。
材料。
将NK-92.CD16 V(高亲和力变体)(Conkwest Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥)用作效应细胞系。将以下细胞系用作靶细胞：CAL27、A431、DLD-1和FaDu。
使用以下试剂：西妥昔单抗抗体(Eli Lilly&Co.)；人同种型IgG1抗体(Biolegend)；钙黄绿素-乙酰氧基甲基(钙黄绿素-AM；Invitrogen C3100MP)和丙磺舒(Invitrogen；P36400)。生物测定培养基是含有1％超低IgG胎牛血清的无酚红RPMI，补充有1％丙磺舒用于完全测定培养基。将补充有IL-2(100U/mL)和氢化可的松(Sigma H6909；10mL以50μM)的MyeloCult H5100(Stemcell目录号05150)用于NK-92.CD16 V细胞培养。
程序.
将IL-2补充物从NK-92.CD16 V细胞培养物中吸出，然后在开始测定之前将所述细胞培养物孵育过夜。第二天，在37℃下在具有5％CO2的加湿培养箱中，在补充有1％低IgGFBS的无酚红RPMI 1640培养基中在不同浓度(0.1μg/mL、0.01μg/mL、0.001μg/mL和0μg/mL)的IL-2_P65_[AzK_L1_PEG30kD]-1的存在下，将细胞在96孔圆底板中铺板(将60,000个细胞以效应细胞与靶细胞3:1比率铺板)18小时。将这些细胞用作效应细胞。接下来的一天，将人EGFR阳性癌细胞系(A431、DLD-1、FaDu或CAL27)用钙黄绿素-AM标记30min(将50μg稀释于25μL DMSO中以制备储备溶液，然后将10μL钙黄绿素储备溶液添加到含有1％低IgG FBS和1％丙磺舒的4mL RPMI 1640中用于5×106个细胞的染色)，并且然后洗涤。将细胞分到几个标记的管中用于与不同浓度的西妥昔单抗或同型对照一起孵育。将西妥昔单抗和同种型人IgG1抗体以3X浓度(最终测定浓度10μg/mL至1pg/mL)添加，并且将标记的靶细胞和抗体混合并且允许静置30min以允许调理作用。此次孵育后，将靶细胞(20,000)和抗体添加到100μL中的NK-92.CD16 V细胞的上方。将板以1100rpm短暂离心1分钟，然后在37℃和5％CO2下孵育1小时。孵育后，将板再次如前短暂离心，并且在不干扰细胞的情况下将90μL上清液从每个孔转移到具有透明底的黑色板中。使用Envision 2104(激发：492nm；发射：515nm)读取荧光信号。
为了最大的释放，将细胞用2％Triton X-100裂解。将培养基背景的荧光值从实验释放的荧光值(A)、靶细胞自发释放的荧光值(B)和靶细胞最大释放的荧光值(C)中减去。
使用以下公式计算每个板(一式两份)的细胞毒性和ADCC百分比：
细胞毒性(％)＝(A-B)/(C-B)×100
ADCC(％)＝细胞毒性(％，用抗体)-细胞毒性(％，不用抗体)
对于每个实验，使用三个重复孔一式三份地进行测量。每个实验重复至少3次。通过使用GraphPad Prism 5(GraphPad Software,Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥)将数据点拟合到4参数方程来计算半数最大有效浓度(EC50)值。
结果。
使用NK92细胞系ADCC测定的表达EGFR的A431(表皮样癌)(NK92与A431比率3:1)、DLD-1(腺癌，结直肠)(NK92与DLD-1比率3:1)、FaDu(上皮鳞状细胞癌)(NK92与FaDu比率3:1)和CAL27(上皮鳞状细胞癌)(NK92与CAL27比率3:1)细胞的细胞毒性数据分别示于图3A-图3D中。数据证明了IL-2缀合物增强了西妥昔单抗针对表达EGFR的癌细胞的ADCC功能。
实施例5.使用IL-2缀合物和西妥昔单抗的组合疗法的临床研究.
概述.使用实施例1的IL-2缀合物的单一疗法已经被证明促进外周的NK细胞数量的增加，所述NK细胞是介导IgG1抗体(如西妥昔单抗)的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)的重要效应细胞。
进行了一项1/2期，开放标签，多中心研究，评估实施例1中所述的IL-2缀合物与西妥昔单抗组合用于治疗患有晚期或转移性实体瘤的参与者的临床益处。
参与者每3周一次通过IV输注接受IL-2缀合物(16或24μg/kg剂量)。此群组的在这里和自始至终的讨论，每kg受试者的药物质量(例如16μg/kg)是指排除PEG和接头质量的IL-2质量。将西妥昔单抗在第1周期第1天以经120分钟输注的400mg/m2的初始负荷剂量(最大输注速率10mg/min)给予，然后从第1周期第8天施用开始所有后续剂量为经60分钟输注的250mg/m2(最大输注速率10mg/min)。在每21天周期的第1、8和15天给予西妥昔单抗。IL-2缀合物的输注时间是每次约30分钟。对于每个治疗周期，在施用IL-2缀合物之前，所有参与者在IL-2缀合物输注前30至60分钟均接受IL-2缀合物预先药物治疗，以预防或减少输注相关反应(IAR)或流感样症状的急性效应。IL-2缀合物预先药物治疗如下：退热药(口服)和抗组胺药(H1阻断剂)。镇吐药由监督医生自行决定提供。在施用第一剂量的西妥昔单抗之前，所有参与者均用苯海拉明(约25至50mg，静脉内)进行预先药物治疗。基于监督医生的评估，后续剂量的西妥昔单抗的预先药物治疗是任选的。当IL-2缀合物和西妥昔单抗在同一天给予时，接受苯海拉明作为西妥昔单抗预先药物治疗的参与者可以跳过作为IL-2缀合物预先药物治疗的苯海拉明。给药顺序如下：(i)西妥昔单抗的预先药物治疗(在西妥昔单抗输注开始之前30-60min)；(ii)西妥昔单抗；(iii)IL-2缀合物的预先药物治疗(在IL-2缀合物输注开始之前30-60min施用)；和(iv)IL-2缀合物。治疗重复多达总共35个周期或长达735天的时间段。
以下生物标记物充当安全性和/或功效的替代预测指标：
嗜酸性粒细胞增多症(升高的外周嗜酸性粒细胞计数)：与血管渗漏综合征(VLS)相关的IL-2诱导的细胞(嗜酸性粒细胞)增殖的细胞替代标记物；
白介素5(IL-5)：IL-2诱导的2型先天淋巴样细胞的激活以及导致嗜酸性粒细胞增多症和潜在的VLS的此趋化因子的释放的细胞因子替代标记物；
白介素6(IL-6)：IL-2诱导的细胞因子释放综合征(CRS)的细胞因子替代标记物；以及
干扰素γ(IFN-γ)：IL-2诱导的CD8+细胞毒性T淋巴细胞的激活的细胞因子替代标记物。
以下生物标记物充当抗肿瘤免疫活性的替代预测指标：
外周CD8+效应细胞：IL-2诱导的这些靶细胞在外周增殖的标记物，浸润后成为诱导可能潜在的治疗反应的替代标记物；
外周CD8+记忆细胞：IL-2诱导的这些靶细胞在外周增殖的标记物，浸润后成为诱导可能持久潜在的治疗和记忆群体的维持的替代标记物；
外周NK细胞：IL-2诱导的这些靶细胞在外周增殖的标记物，浸润后成为诱导可能快速的治疗反应的替代标记物；以及
外周CD4+调节细胞：IL-2诱导的这些靶细胞在外周增殖的标记物，浸润后成为诱导免疫抑制性TME和抵消基于效应物的治疗效果的替代标记物。
使用16μg/kg剂量的IL-2缀合物的第一群组
结果。5名受试者包括中位年龄为69岁(范围为65-72岁)的两名人类男性和3名女性。所有受试者的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态为0或1，并且接受过1至4种先前的全身疗法线。癌症是***癌(1名试者)、结肠腺癌(1名受试者)、肾上腺皮质癌(1名受试者)、肺鳞状细胞癌(1名受试者)和小肠癌(1名受试者)。所有五名受试者均患有转移性疾病。
所述受试者均接受IL-2缀合物(16μg/kg)与西妥昔单抗组合治疗2-7个周期(2-7个剂量的IL-2缀合物)。两名受试者(一名患有***癌并且一名患有转移性肾上腺皮质癌)在组合治疗2个周期后显示出疾病进展(PD)，导致IL-2缀合物和西妥昔单抗组合治疗停止。一名结肠癌受试者在5个周期后显示出疾病进展。两名受试者正在进行：一名肺鳞状细胞癌在3个周期，一名小肠癌在7个周期。
测量外周CD8+Teff细胞计数(图4A-图4B)。在一些受试者中，在先前的剂量后3周观察到超过基线的延长的CD8+扩增(例如，大于或等于2倍变化)。
外周NK细胞计数示于图5A-图5B中。在每名受试者中均观察到了NK细胞计数的增加。在先前剂量后的8天和3周，受试者普遍显示出超过基线的升高的NK细胞计数。
外周CD4+Treg计数示于图6A-图6B中。
测量了嗜酸性粒细胞计数(图7A-图7B)。患有IL-2诱导的嗜酸性粒细胞增多症的患者中的测量值没有超过四倍的增加并且始终低于2328-15958个嗜酸性粒细胞/μL的范围，如Pisani等人,Blood 1991年9月15日；78(6):1538-44中所报道的。还测量了淋巴细胞计数(图8A-图8B)。
结果总结与讨论.测试的所有受试者均具有CD8+T效应(Teff)细胞、NK细胞和CD4+Treg细胞的剂量后外周扩增。
不良事件(AE)是指不管因果性归因如何，被施用药物产品的临床研究受试者中的任何不幸医疗事件。剂量限制性毒性被定义为在治疗周期的第1天至第29天(包含)±1天内发生的AE，所述AE不是明确地或无疑地仅仅与无关原因相关并且符合以下标准中的至少一个：
·持续≥7天的3级嗜中性粒细胞减少症(绝对嗜中性粒细胞计数<1000/mm3>500/mm3)，或任何持续时间的4级嗜中性粒细胞减少症
·3+级发热性嗜中性粒细胞减少症
·4+级血小板减少症(血小板计数<25,000/mm3)
·持续≥5天或者与临床明显出血或需要血小板输注相关的3+级血小板减少症(血小板计数<50,000-25,000/mm3)
·10天内无法满足绝对嗜中性粒细胞计数为至少1,000个细胞/mm3和血小板计数为至少75,000个细胞/mm3的恢复标准
·持续≥5天的任何其他4+级血液毒性
·无胆汁郁积迹象或者诸如病毒性感染或其他药物的另外原因的3+级ALT或AST结合胆红素>2倍ULN(即Hy’s法则)
·用预先药物治疗发生的3级输注相关反应；4级输注相关反应
·被定义为与液体潴留和肺水肿相关的低血压的3级血管渗漏综合征
·3+级过敏反应
·3+级低血压
·在开始接受的护理标准医疗管理的7天内未消退到<2级的3+级AE
·3+级细胞因子释放综合征
以下例外适用于非血液AE：
·在≤3天内用优化的医疗管理消退到≤2级的3级疲劳、恶心、呕吐或腹泻
·3级发热(如通过>40℃持续≤24小时所定义的)
·在没有预先药物治疗的情况下发生的3级输注相关反应；后续剂量应使用预先药物治疗并且如果反应再发生，则它将是DLT
·在开始接受的护理标准医疗管理(例如，全身皮质类固醇疗法)的7天内消退到≤2级的3级关节痛或皮疹
如果受试者在基线时具有1级或2级ALT或AST升高，考虑间接的肝转移，3级升高也必须≥3倍基线并且持续7天。
严重AE被定义为导致以下任何结局的任何AE：死亡；危及生命的AE；住院治疗或延长现有的住院时间；持续的或严重的丧失能力或者进行正常生活功能的能力被基本破坏；或者先天性异常/出生缺陷。在基于适当的医学判断可能危及受试者并且可能需要医疗或手术干预以防止上文所列结局之一的情况下，可能不会导致死亡、危及生命或需要住院治疗的重大医疗事件可以被认为是严重的。此类医疗事件的例子包括需要在急诊室或家中进行强化治疗的过敏性支气管痉挛、不导致住院治疗的血液恶液质素或惊厥、或者药物依赖或药物滥用的形成。
IL-5无明显升高。无累积毒性。无末梢器官毒性。无QTc延长或其他心脏毒性。总的来说，被认为IL-2缀合物被认为是良好耐受的。
5名受试者中有四名具有至少一次治疗紧急AE(TEAE)。TEAE大部分是1-2级，一名受试者具有至少一次3级，并且一名受试者具有至少一次4级TEAE。四名受试者具有治疗相关AE。这些包括：一名1级输注反应；一名1级恶心；一名1级疲劳；一名2级腹泻；和一名4级淋巴细胞计数减少。两名受试者具有3次不相关SAE：一名吞咽困难和脊髓压迫；和一名胸腔积液。所述TEAE不导致任何药物停止，无剂量减少、无DLT并且无过敏反应或CRS。治疗相关AE用接受的护理标准消退。TEAE详述于表2，并且治疗相关不良事件总结于表3。
表2.治疗紧急不良事件：n＝5。
Figure BDA0004086255800001191
Figure BDA0004086255800001201
表3.治疗相关不良事件：n＝5。
Figure BDA0004086255800001202
/>
使用24μg/kg剂量的IL-2缀合物的第二群组
结果。3名受试者是中位年龄为71岁(范围为65-75岁)的人类男性。所有受试者的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态为1。一名受试者接受过1种先前的疗法线，并且第二名受试者接受过4种先前的疗法线。癌症是胃癌(1名受试者)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)(1名受试者)和结肠癌(1名受试者)。所有受试者均患有转移性疾病。所述受试者均接受IL-2缀合物(24μg/kg)与西妥昔单抗组合治疗1个周期(1个剂量的IL-2缀合物)。一名受试者在组合治疗的第一周期后显示出疾病进展(PD)，这阻止了施用进一步治疗剂量的IL-2缀合物和西妥昔单抗组合治疗。
其中两名受试者经历了至少一次TEAE。其中一名受试者经历了至少一次3级治疗相关AE(其是3级寒战)。没有受试者具相关SAE。没有观察到DLT并且没有由于TEAE的药物停止。TEAE详述于表4，并且治疗相关的不良事件总结于表5。
表4.治疗紧急不良事件：n＝3。
Figure BDA0004086255800001203
Figure BDA0004086255800001211
表5.治疗相关不良事件：n＝3。
Figure BDA0004086255800001212
尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和例子的方式详细地描述了前述发明，但是描述和例子不应被解释为限制本发明的范围。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实践本发明时，可以采用在本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案。下面的权利要求旨在限定本发明的范围，从而覆盖在这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。在此引用的所有专利和科学文献的公开内容均明确地通过引用以其整体并入本文。在通过引用并入本文的任何材料与本公开文本的明确内容不一致的情况下，以明确内容为准。
序列表
<110> 新索思股份有限公司
<120> 用IL-2缀合物与抗EGFR抗体的免疫肿瘤学组合疗法
<130> 01183-0090-00PCT
<150> US 63/044,199
<151> 2020-06-25
<160> 98
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> IL-2 (智人) (成熟形式)
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
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Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 2
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> IL-2 (智人) (前体) NCBI登录号：AAB46883.1
<400> 2
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成的：阿地白介素
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130
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<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_C125S
<400> 4
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130
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<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_P65X
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (65)..(65)
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (35)..(35)
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(43)
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<220>
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<220>
<223> 合成的：IL-2_K43[AzK_PEG]
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是[AzK_PEG]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 18
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K35[AzK_PEG]
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (35)..(35)
<223> Xaa是[AzK_PEG]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 19
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<220>
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<220>
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Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 21
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_E62[AzK_PEG5kD]
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (62)..(62)
<223> Xaa是[AzK_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 21
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130
<210> 22
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F42[AzK_PEG5kD]
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是[AzK_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
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130
<210> 23
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K43[AzK_PEG5kD]
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是[AzK_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 23
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<210> 24
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<220>
<223> 合成的：IL-2_K35[AzK_PEG5kD]
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (35)..(35)
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N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 24
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_P65[AzK_PEG30kD]
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (65)..(65)
<223> Xaa是[AzK_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 25
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Xaa Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 26
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_E62[AzK_PEG30kD]
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (62)..(62)
<223> Xaa是[AzK_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 26
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Xaa Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 27
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F42[AzK_PEG30kD]
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是[AzK_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 27
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 28
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K43[AzK_PEG30kD]
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是[AzK_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 28
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Xaa Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 29
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K35[AzK_PEG30kD]
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (35)..(35)
<223> Xaa是[AzK_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 29
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Xaa Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 30
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_P65X-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (64)..(64)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 30
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Xaa
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 31
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_E62X-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (61)..(61)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 31
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Xaa Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 32
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F42X-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (41)..(41)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 32
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
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115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 33
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K43X-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 33
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Xaa Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 34
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K35X-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 34
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Xaa Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 35
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_P65[AzK]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (64)..(64)
<223> Xaa是[AzK]：N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 35
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Xaa
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 36
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_E62[AzK]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (61)..(61)
<223> Xaa是[AzK]：N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 36
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Xaa Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
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100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 37
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F42[AzK]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (41)..(41)
<223> Xaa是[AzK]：N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 37
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 38
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K43[AzK]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是[AzK]：N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 38
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 39
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K35[AzK]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> Xaa是[AzK]：N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 39
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Xaa Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
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100 105 110
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115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 40
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_P65[AzK_L1_PEG]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (64)..(64)
<223> Xaa是[AzK_L1_PEG]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 40
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Xaa
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 41
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_E62[AzK_ L1_PEG]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (61)..(61)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 41
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Xaa Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
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100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 42
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F42[AzK_ L1_PEG]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (41)..(41)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 42
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
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Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 43
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K43[AzK_ L1_PEG]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 43
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Xaa Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 44
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K35[AzK_ L1_PEG]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 44
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Xaa Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
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Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 45
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_P65[AzK_ L1_PEG5kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (64)..(64)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 45
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1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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130
<210> 46
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_E62[AzK_ L1_PEG5kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (61)..(61)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 46
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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<211> 132
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F42[AzK_ L1_PEG5kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (41)..(41)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 47
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1 5 10 15
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65 70 75 80
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
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N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 49
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_P65[AzK_ L1_PEG30kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (64)..(64)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 50
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1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_E62[AzK_ L1_PEG30kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (61)..(61)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 51
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130
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<211> 132
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F42[AzK_ L1_PEG30kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (41)..(41)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 52
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<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K43[AzK_ L1_PEG30kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 53
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K35[AzK_ L1_PEG30kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 54
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (65)..(65)
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F42[AzK_ L1_PEG]-2
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 57
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<220>
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<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 58
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<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (35)..(35)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG]：与PEG稳定缀合的
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<400> 59
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<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_P65[AzK_ L1_PEG5kD]-2
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (65)..(65)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 60
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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130
<210> 61
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_E62[AzK_ L1_PEG5kD]-2
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (62)..(62)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 61
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 62
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F42[AzK_ L1_PEG5kD]-2
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 62
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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130
<210> 63
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K43[AzK_ L1_PEG5kD]-2
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 63
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 64
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K35[AzK_ L1_PEG5kD]-2
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (35)..(35)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 64
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Xaa Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 65
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_P65[AzK_ L1_PEG30kD]-2
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (65)..(65)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 65
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Xaa Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 66
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_E62[AzK_ L1_PEG30kD]-2
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (62)..(62)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 66
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130
<210> 67
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F42[AzK_ L1_PEG30kD]-2
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 67
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1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
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65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 68
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
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35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 69
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K35[AzK_ L1_PEG30kD]-2
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (35)..(35)
<223> Xaa是[AzK_ L1_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 69
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Xaa Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
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130
<210> 70
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_P65[AzK_PEG]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (64)..(64)
<223> Xaa是[AzK_PEG]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 70
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
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100 105 110
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115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 71
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_E62[AzK_ PEG]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (61)..(61)
<223> Xaa是[AzK_ PEG]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 71
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 72
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F42[AzK_ PEG]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (41)..(41)
<223> Xaa是[AzK_ PEG]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 72
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 73
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K43[AzK_ PEG]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是[AzK_ PEG]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 73
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
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130
<210> 74
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K35[AzK_ PEG]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> Xaa是[AzK_ PEG]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 74
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
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Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
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100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 75
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_P65[AzK_ PEG5kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (64)..(64)
<223> Xaa是[AzK_ PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 75
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
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115 120 125
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130
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<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_E62[AzK_PEG5kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (61)..(61)
<223> Xaa是[AzK_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 76
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
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115 120 125
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130
<210> 77
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F42[AzK_PEG5kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (41)..(41)
<223> Xaa是[AzK_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 77
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
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100 105 110
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115 120 125
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130
<210> 78
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K43[AzK_PEG5kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是[AzK_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 78
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
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130
<210> 79
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K35[AzK_PEG5kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> Xaa是[AzK_PEG5kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 79
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
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130
<210> 80
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_P65[AzK_PEG30kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (64)..(64)
<223> Xaa是[AzK_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 80
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Xaa
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 81
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_E62[AzK_PEG30kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (61)..(61)
<223> Xaa是[AzK_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 81
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
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Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
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Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 82
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F42[AzK_PEG30kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (41)..(41)
<223> Xaa是[AzK_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的与PEG稳定缀合的
<400> 82
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 83
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K43[AzK_PEG30kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是[AzK_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 83
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Xaa Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 84
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_K35[AzK_PEG30kD]-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> Xaa是[AzK_PEG30kD]：与PEG稳定缀合的
N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸
<400> 84
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Xaa Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 85
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F44X
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (44)..(44)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 85
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Xaa Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 86
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_F44X-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 86
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Xaa Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 87
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_R38X
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (38)..(38)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 87
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Xaa Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 88
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_R38X-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (37)..(37)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 88
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Xaa Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 89
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_T41X
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (41)..(41)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 89
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Xaa Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 90
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_T41X-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(40)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 90
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Xaa Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 91
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_E68X
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (68)..(68)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 91
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Xaa Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 92
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_E68X-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (67)..(67)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 92
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Xaa Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 93
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_Y45X
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 93
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Xaa Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 94
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_Y45X-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (44)..(44)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 94
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Xaa Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 95
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_V69X
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (69)..(69)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 95
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Xaa Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 96
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_V69X-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (68)..(68)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 96
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Xaa Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 97
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_L72X
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (72)..(72)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 97
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Xaa Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 98
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的：IL-2_L72X-1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (71)..(71)
<223> Xaa是非天然氨基酸
<400> 98
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Xaa Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130

Claims (29)

1.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(a)IL-2缀合物和(b)抗EGFR抗体，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(I)的结构替代：
Figure FDA0004086255790000011
其中：
Z是CH2并且Y是
Figure FDA0004086255790000012
Y是CH2并且Z是
Figure FDA0004086255790000013
Z是CH2并且Y是
Figure FDA0004086255790000014
或者
Y是CH2并且Z是
Figure FDA0004086255790000015
W是具有约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa或60kDa平均分子量的PEG基团；并且
X是具有以下结构的L-氨基酸：
Figure FDA0004086255790000016
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点；
其中所述式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置选自K34、F41、F43、K42、E61、P64、R37、T40、E67、Y44、V68和L71。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，Z是CH2并且Y是
Figure FDA0004086255790000017
/>
3.根据权利要求1所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，Y是CH2并且Z是
Figure FDA0004086255790000021
4.根据权利要求1所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，Z是CH2并且Y是
Figure FDA0004086255790000022
5.根据权利要求1所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，Y是CH2并且Z是
Figure FDA0004086255790000023
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，所述PEG基团具有约25kDa、30kDa或35kDa的平均分子量。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在所述IL-2缀合物中，所述PEG基团具有约30kDa的平均分子量。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述式(I)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是P64。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述式(I)的结构具有式(IV)或式(V)的结构，或者是式(IV)与式(V)的结构的混合物：
Figure FDA0004086255790000024
其中：
W是具有约25kDa、30kDa或30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
Figure FDA0004086255790000025
X-1指示与前面的氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后面的氨基酸残基的附接点。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述式(IV)或式(V)的结构在所述IL-2缀合物的氨基酸序列中的位置是P64。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述抗EGFR抗体是西妥昔单抗。
12.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(a)IL-2缀合物和(b)西妥昔单抗，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG30kD]具有式(XII)或式(XIII)的结构，或者是式(XII)与式(XIII)的结构的混合物：
Figure FDA0004086255790000031
其中：
n是整数，n是使得-(OCH2CH2)n-OCH3具有约30kDa分子量的整数；
q是1、2或3；并且
所述波浪线指示与SEQ ID NO:50内未被替代的氨基酸残基的共价键。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中q是1。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中q是2。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中q是3。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述平均分子量是数均分子量。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述平均分子量是重均分子量。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中将所述IL-2缀合物施用至所述受试者，约每两周一次、约每三周一次或约每4周一次。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中将所述抗EGFR抗体施用至所述受试者，约每周一次、约每两周一次、约每三周一次或约每4周一次。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中通过静脉内施用将所述IL-2缀合物施用至受试者。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中分开地施用所述IL-2缀合物和所述抗EGFR抗体。
23.根据权利要求23所述的方法，其中依序施用所述IL-2缀合物和所述抗EGFR抗体。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述癌症选自肾细胞癌(RCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、尿路上皮癌、微卫星不稳定癌、微卫星稳定癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌(CRC)、***、肝细胞癌(HCC)、梅克尔细胞癌(MCC)、黑色素瘤、小细胞肺癌(SCLC)、食管癌、食管鳞状细胞癌(ESCC)、胶质母细胞瘤、间皮瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、***癌、去势抵抗性***癌、转移性去势抵抗性***癌、或具有DNA损伤应答(DDR)缺陷的转移性去势抵抗性***癌、膀胱癌、卵巢癌、中度至低度突变负担的肿瘤、皮肤鳞状细胞癌(CSCC)、鳞状细胞皮肤癌(SCSC)、低表达至不表达PD-L1的肿瘤、超出其原发解剖学起源部位全身性播散至肝脏和CNS的肿瘤以及弥漫性大B细胞淋巴瘤。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用约16μg/kg的所述IL-2缀合物。
26.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用约24μg/kg的所述IL-2缀合物。
27.根据权利要求1-10或12-26中任一项所述的方法，其中所述抗EGFR抗体选自帕尼单抗(Vectibix)、奈西妥木单抗(Portrazza)、JNJ-61186372(埃万妥单抗)、IMC-C225、ABX-EGF、ICR62和EMD 55900。
28.一种用于在根据权利要求1-27中任一项所述的方法中使用的IL-2缀合物。
29.IL-2缀合物用于制造用于根据权利要求1-27中任一项所述的方法的药剂的用途。
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