JP2010528617A - リボスイッチならびにリボスイッチを使用するためのおよびリボスイッチと共てに使用するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
リボスイッチは、抗生物質および他の小分子治療のための標的である。リボスイッチおよびその一部を使用して、RNA分子ならびに他のエレメントおよび分子の発現または機能を調節することができる。リボスイッチおよびその一部を、種々の他の方法で使用して、例えば、化合物を同定または検出することができる。化合物を使用して、リボスイッチを刺激、活性化、阻害、および/または非活性化することができる。リボスイッチおよびその一部を単独および他の核酸との組み合わせの両方にて種々の構築物およびRNA分子で使用することができ、核酸によってコードすることができる。
Description
(関連する出願への相互参照)
本願は、2007年5月29日に出願された米国仮特許出願第60/932,112号の利益を主張する。2007年5月29日に出願された米国仮特許出願第60/932,112号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
(連邦政府の後援による研究に係る陳述)
本発明は、NIHによって授与された補助金番号GM068819、RR19895−02およびR33DK07027、NHLBIによって授与された補助金番号HV38186、国立総合医学研究所によって授与された補助金番号T32GM007223、ならびに米国科学財団によって授与された補助金番号EIA−0323510のもと、政府の援助を受けてなされた。政府は本発明における特定の権利を保有する。
(発明の分野)
本開示の発明は、一般に、遺伝子発現分野、具体的には、遺伝子発現の調節領域に関する。
本願は、2007年5月29日に出願された米国仮特許出願第60/932,112号の利益を主張する。2007年5月29日に出願された米国仮特許出願第60/932,112号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
(連邦政府の後援による研究に係る陳述)
本発明は、NIHによって授与された補助金番号GM068819、RR19895−02およびR33DK07027、NHLBIによって授与された補助金番号HV38186、国立総合医学研究所によって授与された補助金番号T32GM007223、ならびに米国科学財団によって授与された補助金番号EIA−0323510のもと、政府の援助を受けてなされた。政府は本発明における特定の権利を保有する。
(発明の分野)
本開示の発明は、一般に、遺伝子発現分野、具体的には、遺伝子発現の調節領域に関する。
発明の背景
細胞が種々の遺伝子発現パターンの変化による複数の生化学シグナルおよび環境信号に応答しなければならないので、正確な遺伝子調節は生物系の本質的特徴である。最も公知の遺伝子調節機構は、化学的または物理的な刺激を感知し、その後に関連するDNAまたは伝令RNA配列との選択的相互作用によって遺伝子発現を調整するタンパク質因子の使用を含む。タンパク質は、複合体形状を採用することができ、生物系がその化学的および物理的環境を正確に感知することができる種々の機能を実行する。代謝産物に応答するタンパク質因子は、典型的には、DNAに結合することによって転写開始を調整するか(例えば、lacリプレッサータンパク質;非特許文献1)、RNAに結合することによって転写終結(例えば、PyrRタンパク質;非特許文献2)または翻訳(例えば、TRAPタンパク質;非特許文献3)のいずれかを調節するように作用する。タンパク質因子は、アロステリック調整または翻訳後改変などの種々の機構によって環境刺激に応答し、高応答性遺伝子スイッチとしての機能を果たすためにこれらの機能を活用するのに長けている(例えば、非特許文献4を参照のこと)。
細胞が種々の遺伝子発現パターンの変化による複数の生化学シグナルおよび環境信号に応答しなければならないので、正確な遺伝子調節は生物系の本質的特徴である。最も公知の遺伝子調節機構は、化学的または物理的な刺激を感知し、その後に関連するDNAまたは伝令RNA配列との選択的相互作用によって遺伝子発現を調整するタンパク質因子の使用を含む。タンパク質は、複合体形状を採用することができ、生物系がその化学的および物理的環境を正確に感知することができる種々の機能を実行する。代謝産物に応答するタンパク質因子は、典型的には、DNAに結合することによって転写開始を調整するか(例えば、lacリプレッサータンパク質;非特許文献1)、RNAに結合することによって転写終結(例えば、PyrRタンパク質;非特許文献2)または翻訳(例えば、TRAPタンパク質;非特許文献3)のいずれかを調節するように作用する。タンパク質因子は、アロステリック調整または翻訳後改変などの種々の機構によって環境刺激に応答し、高応答性遺伝子スイッチとしての機能を果たすためにこれらの機能を活用するのに長けている(例えば、非特許文献4を参照のこと)。
遺伝子調節におけるタンパク質因子の広範な関与に加えて、RNAが遺伝子調節で積極的な役割を果たし得ることも公知である。最近の研究により、小さな非コードRNAが破壊のためのmRNAの選択的ターゲティングで役割を果たし、それにより、遺伝子発現が下方制御されるという実質的役割が明らかにされ始めている(例えば、非特許文献5およびそのリファレンスを参照のこと)。このRNA干渉過程は、短いRNAがワトソン−クリック塩基相補性を介して意図するmRNA標的を選択的に認識する能力を活用し、その後に結合したmRNAをタンパク質作用によって破壊する。新規であるが特異性の高いRNA結合部位を使用してタンパク質因子を生成するよりも進化過程によって新規の標的特異的RNA因子を生成することの方がはるかに容易であるので、RNAはこの系における理想的な分子認識のための作用因子である。
タンパク質が、酵素、受容体、および構造機能についての、生物学が有するほとんどの要件を満たすにもかかわらず、RNAはこれらの能力でも役立ち得る。例えば、RNAは、相当な酵素力および正確な分子認識を示す多数のリボザイムドメイン(非特許文献6;非特許文献7)および受容体ドメイン(非特許文献8;非特許文献9)を形成するのに十分な構造可塑性を有する。さらに、これらの活性を組み合わせて、エフェクター分子によって選択的に調整されるアロステリックリボザイム(非特許文献10;非特許文献11)を作製することができる。
細菌リボスイッチRNAは、主に、特定のmRNAの主なコード領域の5’非翻訳領域(5’−UTR)内に存在する遺伝子調節エレメントである。構造探索研究(以下でさらに考察している)により、リボスイッチエレメントが一般に以下の2つのドメインから構成されることが明らかとなっている:リガンド結合ドメインとしての機能を果たす天然のアプタマー(T.Hermann,D.J.Patel,Science 2000,287,820;L.Goldら、Annual Review of Biochemistry 1995,64,763)および遺伝子発現に関与するRNAエレメント(例えば、シャイン−ダルカルノ(SD)エレメント;転写ターミネーターステム)と適合する「発現プラットフォーム」。
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発明の概要
調節可能な遺伝子発現構築物であって、コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むRNAをコードする核酸分子を含み、リボスイッチがRNAの発現を調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同である、構築物を本明細書中に開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。リボスイッチは、2つ以上のアプタマードメインおよび1つの発現プラットフォームドメインも含むことができ、アプタマードメインの少なくとも1つおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。アプタマードメインの少なくとも2つは協同的結合を示すことができる。
調節可能な遺伝子発現構築物であって、コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むRNAをコードする核酸分子を含み、リボスイッチがRNAの発現を調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同である、構築物を本明細書中に開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。リボスイッチは、2つ以上のアプタマードメインおよび1つの発現プラットフォームドメインも含むことができ、アプタマードメインの少なくとも1つおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。アプタマードメインの少なくとも2つは協同的結合を示すことができる。
リボスイッチが天然に存在するリボスイッチの非天然誘導体であるリボスイッチも開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。リボスイッチは、1つまたは複数のさらなるアプタマードメインをさらに含むことができる。アプタマードメインの少なくとも2つは協同的結合を示すことができる。リボスイッチをトリガー分子によって活性化することができ、リボスイッチは、トリガー分子によって活性化された場合にシグナルを産生する。
目的の化合物を検出する方法であって、該方法は、サンプルとリボスイッチとを接触させる工程を含み、リボスイッチが目的の化合物によって活性化され、リボスイッチが目的の化合物によって活性化された場合にシグナルを産生し、サンプルが目的の化合物を含む場合にリボスイッチがシグナルを産生し、リボスイッチがリボスイッチまたはリボスイッチの誘導体を含む、方法をさらに開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチであり得る。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチが構造を変化させることができ、構造の変化が、構造依存性標識を介してシグナルを産生する。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチは構造を変化させることもでき、構造の変化によってリボスイッチに連結されたRNAの発現が変化し、発現の変化によってシグナルが産生される。シグナルを、リボスイッチに連結されたRNAから発現したレポータータンパク質によって産生することができる。
(a)リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験する工程であって、阻害がリボスイッチを介し、リボスイッチがリボスイッチまたはリボスイッチの誘導体を含む、試験工程、(b)細胞と工程(a)で遺伝子発現を阻害した化合物との接触によって遺伝子発現を阻害する工程であって、細胞がリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって遺伝子発現を阻害する、阻害工程を含む方法も開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチであり得る。
(a)リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子の遺伝子発現の抑制について化合物を試験する工程であって、抑制がリボスイッチを介し、リボスイッチがリボスイッチまたはリボスイッチの誘導体を含む、試験工程、(b)細胞と工程(a)で遺伝子発現を抑制した化合物との接触によって遺伝子発現を抑制する工程であって、細胞がリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって遺伝子発現を抑制する、抑制工程を含む方法も開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチであり得る。
リボスイッチを同定する方法であって、該方法は、トリガー分子の存在下および非存在下でRNA分子のインライン自発性切断(in−line spontaneous cleavage)を評価する工程であって、RNA分子がトリガー分子によって調節される遺伝子によってコードされる評価工程を含み、RNA分子のインライン自発性切断パターンの変化がトリガー分子に応答性を示すリボスイッチを示す、方法を開示する。トリガー分子は、サイクリックジGMP、S−アデノシルホモシステイン、preQ1、Moco、またはSAMであり得る。
遺伝子発現を変化させる方法であって、該方法は、化合物と細胞とを接触させる工程を含み、該化合物が、サイクリックジGMP、pGpG、GpG、またはGpGpGである、方法も開示する。化合物はまた、サイクリックジGMP応答性リボスイッチを活性化することができるサイクリックジGMP、pGpG、GpG、またはGpGpGの誘導体であり得る。遺伝子発現を変化させる方法であって、該方法は、化合物と細胞とを接触させる工程を含み、該化合物がS−アデノシルホモシステインである、方法も開示する。化合物はまた、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチを活性化することができるS−アデノシルホモシステインの誘導体であり得る。例えば、化合物はS−アデノシル−L−システイン(SAC)であり得る。遺伝子発現を変化させる方法であって、該方法は、化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物がpreQ1である、方法も開示する。化合物はまた、preQ1応答性リボスイッチを活性化することができるpreQ1の誘導体であり得る。遺伝子発現を変化させる方法であって、該方法は、化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物がMocoである、方法も開示する。化合物はまた、Moco応答性リボスイッチを活性化することができるMocoの誘導体であり得る。遺伝子発現を変化させる方法であって、該方法は、化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物がSAMである、方法も開示する。化合物はまた、SAM応答性リボスイッチを活性化することができるSAMの誘導体であり得る。SAM−IVリボスイッチを活性化するための化合物はまた、MeAzaAdoMetであり得る。
preQ1応答性リボスイッチ(およびpreQ1応答性リボスイッチ由来のリボスイッチ)との使用に有用な化合物には、1位のNをC、OまたはSと置換することができ、2位のアミノ基を水素結合供与体と置換することができ、6位の酸素を水素結合受容体と置換することができ、7位のアミノ基を水素結合受容体と置換することができ、窒素を水素結合供与体と置換するかこれを使用して誘導体化することができるpreQ1の誘導体が含まれる。
水素結合供与体および受容体の例には、NH、NH2 +、NH3 +、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5が含まれ、式中、R5は、NH2 +、NH3 +、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2 +、CNH2NH3 +、C(NH3 +)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4−ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4−ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル,1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1、4 ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、およびトリスアミノメチルメチルである。
細胞を、遺伝子発現の変化が必要であると同定することができる。細胞は細菌細胞であり得る。化合物は、細菌細胞を死滅させるか増殖を阻害することができる。被験体への化合物の投与によって化合物と細胞とを接触させることができる。細胞は被験体中の細菌細胞であり得、化合物は細菌細胞を死滅させるか増殖を阻害する。被験体は、細菌感染を有し得る。細胞は、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチを含むことができる。化合物を、別の抗菌化合物と組み合わせて投与することができる。化合物は、バイオフィルム中の細菌増殖を阻害することができる。
細胞の生理学的状態を変化させる方法であって、該方法は、化合物と細胞とを接触させる工程を含み、該化合物が、サイクリックジGMP、pGpG、GpG、またはGpGpGである、方法も開示する。化合物はまた、サイクリックジGMP応答性リボスイッチを活性化することができるサイクリックジGMP、pGpG、GpG、またはGpGpGの誘導体であり得る。
トリガー分子を産生する方法であって、該方法は、トリガー分子を産生することができる変異細菌細胞を培養する工程であって、変異細菌細胞がトリガー分子に応答性を示すリボスイッチ中に変異を含み、変異を持たない細胞と比較して、変異が変異細菌細胞によってトリガー分子の産生を増加させる、培養工程、およびトリガー分子を細胞培養物から単離し、それにより、トリガー分子を産生する工程を含む、方法も開示する。トリガー分子は、例えば、サイクリックジGMP、S−アデノシルホモシステイン、preQ1、Moco、またはSAMであり得る。本方法により、リボスイッチ中に変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、トリガー分子の産生を少なくとも10%増加させることができる。本方法により、リボスイッチ中に変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、トリガー分子の産生を少なくとも15%増加させることができる。本方法により、リボスイッチ中に変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、トリガー分子の産生を少なくとも25%増加させることができる。リボスイッチは、ノックアウト変異を含むことができる。リボスイッチ中に変異を含む細菌細胞であって、変異を持たない細胞と比較して、変異が細胞によってリボスイッチのトリガー分子の産生を測定可能に増加させる、細菌細胞をさらに開示する。
細菌細胞増殖を阻害する方法であって、細胞とリボスイッチに結合する化合物とを接触させる工程を含み、細胞が化合物に対して応答性を示すリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって細菌細胞増殖を阻害し、それにより、遺伝子発現が変化する、方法も開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチであり得る。本方法により、化合物と接触しない細胞と比較して細菌細胞増殖を少なくとも10%減少させることができる。被験体への化合物の投与により、化合物と細胞とを接触させることができる。細胞は被験体中の細菌細胞であり得、化合物は細菌細胞を死滅させるか増殖を阻害する。被験体は、細菌感染を有し得る。化合物を、別の抗菌化合物と組み合わせて投与することができる。
サンプル中の化合物の検出方法であって、化合物に応答性を示すリボスイッチをサンプルと接触させる工程、および化合物とリボスイッチとの間の相互作用を検出する工程を含み、化合物とリボスイッチとの間の相互作用が化合物の存在を示す、方法を開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチを標識することができる。
細胞と、遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験することによって遺伝子の遺伝子発現を阻害する化合物と同定された化合物との接触によってリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子の遺伝子発現を阻害する工程を含み、阻害がリボスイッチを介する、方法も開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、SAM応答性リボスイッチ、またはかかるリボスイッチの誘導体であり得る。
細胞と、遺伝子の遺伝子発現の抑制について化合物を試験することによって遺伝子の遺伝子発現を抑制する化合物と同定された化合物との接触によってリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子の遺伝子発現を抑制する工程を含み、抑制がリボスイッチを介する、方法も開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、SAM応答性リボスイッチ、またはかかるリボスイッチの誘導体であり得る。
開示の方法および組成物のさらなる利点を以下の記載に一部示し、この記載から利点が一部理解される。あるいは、利点を、開示の方法および組成物の実施によって知ることができる。開示の方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘した要素および組み合わせによって理解および達成される。上記の一般的記載および以下の詳細な記載の両方は例示および説明のみであり、特許請求の範囲に記載の本発明を制限するものではないと理解すべきである。
本明細書中に組み込まれ、且つ本明細書の一部を構成する添付の図面は、開示の方法および組成物のいくつかの実施形態を例示し、記載と共に、開示の方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。
発明の詳細な説明
以下の特定の実施形態の詳細な記載およびそこに含まれる実施例、ならびに添付の図面および前および後の記載を参照して、開示の方法および組成物をより容易に理解することができる。
以下の特定の実施形態の詳細な記載およびそこに含まれる実施例、ならびに添付の図面および前および後の記載を参照して、開示の方法および組成物をより容易に理解することができる。
伝令RNAは、典型的には、タンパク質または小さなRNA調節因子によって、および翻訳過程の間のリボゾームによって作用する遺伝子情報の受動的キャリアと考えられている。一定のmRNAが天然のアプタマードメインを保有し、これらのRNAドメインへの特異的代謝産物の直接結合によって遺伝子発現が調整されることが発見された。天然リボスイッチは、典型的には天然RNAと関連しない2つの驚くべき機能を示す。第1に、mRNAエレメントは異なる構造状態を採用することができ、一方の構造は、その標的代謝産物の正確な結合ポケットとしての機能を果たす。第2に、構造状態間の代謝産物誘導性アロステリック相互交換により、いくつかの異なる機構のうちの1つによって遺伝子発現レベルが変化する。リボスイッチを、典型的には、以下の2つの個別のドメインに分けることができる:1つは標的に選択的に結合するドメイン(アプタマードメイン)および他方は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン(発現プラットフォーム)。これらの2ドメイン間の動的相互作用により遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節される。
異なるクラスのリボスイッチが同定されており、活性化化合物(本明細書中でトリガー分子と呼ぶ)を選択的に認識することが示されている。例えば、補酵素B12、グリシン、チアミンピロリン酸(TPP)、およびフラビンモノヌクレオチド(FMN)は、これらの化合物の代謝経路または輸送経路における重要な酵素をコードする遺伝子中に存在するリボスイッチを活性化する。各リボスイッチクラスのアプタマードメインは、高度に保存されたコンセンサス配列および構造に適合する。したがって、配列相同性検索を使用して、関連するリボスイッチドメインを同定することができる。リボスイッチドメインは、細菌、古細菌、および真核生物由来の種々の生物で発見されている。
A.リボスイッチRNAの一般的構成
細菌リボスイッチRNAは、特定のmRNAの主なコード領域の5’非翻訳領域(5’−UTR)内に主に存在する遺伝子調節エレメントである。構造探索研究(以下でさらに考察)により、リボスイッチエレメントは一般に以下の2つのドメインから構成されることが明らかである:リガンド結合ドメインとしての機能を果たす天然のアプタマー(T.Hermann,D.J.Patel,Science 2000,287,820;L.Gold,et al.,Annual Review of Biochemistry 1995,64,763)および遺伝子発現に関与するRNAエレメント(例えば、シャイン−ダルガルノ(SD)エレメント;転写終結ステム)を妨害する「発現プラットフォーム」である。in vitroで合成したアプタマードメインが発現プラットフォームの非存在下で適切なリガンドに結合するという観察から、これらの結論を導いている(米国特許出願公開第2005−0053951号の実施例2、3、および6を参照のこと)。さらに、構造探索調査により、ほとんどのリボスイッチのアプタマードメインが個別に試験した場合に特定の二次構造および三次構造の折り畳みを採用し、全5’リーダーRNAの関係において試験した場合にアプタマー構造と本質的に同一であることが示唆される。これは、多くの場合、アプタマードメインが発現プラットフォームと無関係に折り畳まれるモジュラー単位であることを示す(米国特許出願公開第2005−0053951号の実施例2、3、および6を参照のこと)。
細菌リボスイッチRNAは、特定のmRNAの主なコード領域の5’非翻訳領域(5’−UTR)内に主に存在する遺伝子調節エレメントである。構造探索研究(以下でさらに考察)により、リボスイッチエレメントは一般に以下の2つのドメインから構成されることが明らかである:リガンド結合ドメインとしての機能を果たす天然のアプタマー(T.Hermann,D.J.Patel,Science 2000,287,820;L.Gold,et al.,Annual Review of Biochemistry 1995,64,763)および遺伝子発現に関与するRNAエレメント(例えば、シャイン−ダルガルノ(SD)エレメント;転写終結ステム)を妨害する「発現プラットフォーム」である。in vitroで合成したアプタマードメインが発現プラットフォームの非存在下で適切なリガンドに結合するという観察から、これらの結論を導いている(米国特許出願公開第2005−0053951号の実施例2、3、および6を参照のこと)。さらに、構造探索調査により、ほとんどのリボスイッチのアプタマードメインが個別に試験した場合に特定の二次構造および三次構造の折り畳みを採用し、全5’リーダーRNAの関係において試験した場合にアプタマー構造と本質的に同一であることが示唆される。これは、多くの場合、アプタマードメインが発現プラットフォームと無関係に折り畳まれるモジュラー単位であることを示す(米国特許出願公開第2005−0053951号の実施例2、3、および6を参照のこと)。
最終的に、アプタマードメインのリガンド結合状態または非結合状態は発現プラットフォームを介して解釈され、それは遺伝子発現の際に影響を及ぼす。モジュラーエレメントとしてのリボスイッチの投影は、アプタマードメインが種々の生物の間(およびTPPリボスイッチについて認められるように、界の間でさえも)で高度に保存されるのに対して(N.Sudarsan,et al.,RNA 2003,9,644)、発現プラットフォームは、付加された読み取り枠(open reading flame)の発現が調節される配列、構造、および機構で変化するという事実によってさらに支持される。例えば、B.subtilisのtenA mRNAのTPPリボスイッチへのリガンド結合によって転写が終結する(A.S.Mironov,et al., Cell 2002,111,747)。この発現プラットフォームは、E.coli由来のthiM mRNA中のTPPリボスイッチの発現プラットフォームと比較して配列および構造が異なり、TPP結合はSD遮断機構によって翻訳を阻害する(米国特許出願公開第2005−0053951号の実施例2を参照のこと)。TPPアプタマードメインは容易に認識可能であり、これらの2つの転写単位の間で機能的特徴がほぼ同一であるが、これらを実施する遺伝子調節機構および発現プラットフォームは非常に異なる。
リボスイッチRNAのアプタマードメインは、典型的には、約70〜170nt長の範囲である(米国特許出願公開第2005−0053951号の図11)。in vitro進化実験でかなりより短く構造が複雑である多種多様な小分子結合アプタマーが同定されたことを考慮すると、この観察はいくらか予想外であった(T.Hermann,D.J.Patel,Science 2000,287,820;L.Gold,et al.,Annual Review of Biochemistry 1995,64,763;M.Famulok,Current Opinion in Structural Biology 1999,9,324)。人工アプタマーと比較した天然アプタマー配列の複雑さおよび情報量の実質的増加についての理由が依然として証明されていないにもかかわらず、この複雑さは、高い親和性および選択性で機能するRNA受容体を形成するのに必要であるとみられる。リガンド−リボスイッチ複合体の見かけ上のKD値は、低ナノモル(nanomolar)から低マイクロモル(micromolar)までの範囲である。いくつかのアプタマードメインは、追加発現プラットフォームから単離した場合、インタクトなリボスイッチよりも改良された標的リガンドに対する親和性を示す(約10〜100倍)ことも注目に値する(米国特許出願公開第2005−0053951号の実施例2を参照のこと)。おそらく、完全にインタクトなリボスイッチRNAによって必要とされる複数の異なるRNA高次構造のサンプリングにはエネルギーコストがかかり、リガンド親和性の喪失が反映される。アプタマードメインは分子スイッチとしての機能を果たさなければならないので、これは、天然のアプタマーに対する機能的要求を付加することもでき、この付加は、そのより精巧な構造を合理化するのに役立ち得る。
B.サイクリックジGMPリボスイッチ(GEMMモチーフ)
GEMMモチーフを含むサイクリックジGMP応答性リボスイッチ(サイクリックジGMPリボスイッチまたはGEMMリボスイッチともいうことができる)は、P1およびP2と指定した2つの隣接するヘアピン(対合領域)を含む(図1および3)。P1は、配列および構造中で高度に保存されており、3−ヌクレオチド内部ループによって分離された2塩基対および6塩基対のステムからなり、末端ループによってキャッピングされている。内部ループは高度に保存されており、末端ループはほぼ必ずGNRAテトラループである(Hendrix 1997)。P1ステムは、いくつかの部位で共変動するという相当な証拠を提示し、広範な細菌にわたって構造中に高度に保存されている。この事実ならびにP2のより適度の共変動および可変長ステムにより、GEMMが構造化RNAとして機能する強力な証拠が得られる。実施例2は、GEMMモチーフがリボスイッチ中で機能することを証明している。P1およびP2に連結する配列は、事実上常にAAAであり、322の例で例外はわずか2つである。
GEMMモチーフを含むサイクリックジGMP応答性リボスイッチ(サイクリックジGMPリボスイッチまたはGEMMリボスイッチともいうことができる)は、P1およびP2と指定した2つの隣接するヘアピン(対合領域)を含む(図1および3)。P1は、配列および構造中で高度に保存されており、3−ヌクレオチド内部ループによって分離された2塩基対および6塩基対のステムからなり、末端ループによってキャッピングされている。内部ループは高度に保存されており、末端ループはほぼ必ずGNRAテトラループである(Hendrix 1997)。P1ステムは、いくつかの部位で共変動するという相当な証拠を提示し、広範な細菌にわたって構造中に高度に保存されている。この事実ならびにP2のより適度の共変動および可変長ステムにより、GEMMが構造化RNAとして機能する強力な証拠が得られる。実施例2は、GEMMモチーフがリボスイッチ中で機能することを証明している。P1およびP2に連結する配列は、事実上常にAAAであり、322の例で例外はわずか2つである。
P2ヘアピンは、P1よりも適度に保存される。P1テトラループがGAAAである場合、GNRAテトラループ受容体は、通常はP2中に出現する。この受容体は、しばしば、周知の11−ntモチーフであり、GAAAループに支持され得るが、いくつかの配列は新規のテトラループ受容体であり得る。P1がGYRAテトラループを有する場合、P2塩基により近いバルジが時折見出されるにもかかわらず、受容体様配列はほとんど存在しない(図2)。
GEMM RNAは、1型および2型と呼ばれる2つの類似の構造の1つに適合する(図3B)。両型は、同定した503の代表において広範な共変動を示す2つの塩基対合領域(P1およびP2)を保有する(Weinberg 2007)。1型RNA(303例)は、第2の位置にプリン(R)と共にP1上にGNRAテトラループ(Heus 1991)を有する。GRRA配列の存在は、P2末端のテトラループ受容体の存在と相関し、この受容体はこのテトラループ型とドッキングすることが公知である(Costa 1995)。対照的に、2型RNA(171例)は、テトラループの第2の位置にピリミジン(Y)を有し、いくつかの例では、GYRAテトラループとのドッキングを好むP2上の構造を含む(Costa 1995)。さらなる29個の割り当てられていない代表が存在し、そのうちの24個は非対合ヌクレオチドに隣接したGNRAテトラループを保有し、5個はテトラループ配列を欠く。
GNRAテトラループおよびその受容体は、一般に構造化されたRNA中に見出され、以前にリボスイッチアプタマー中で認められている(Regulski 2008)。しかし、P1およびP2ヘアピンの先端の配列および構造の可変性により、サイクリックジGMPの任意の結合部位が最も保存された特徴を保有する中央または基部に存在する可能性が高いことが示唆される。
多数のGEMM例には、rho非依存性転写ターミネーターヘアピンが含まれる。ターミネーターステムの5’側は、しばしば、P2ステムの3’側と重複する(そしておそらく競合する)(図2B)。GEMMがリボスイッチである場合、リガンド結合は、提案されたP1およびP2構造を安定化し、それにより、競合する転写ターミネーターの形成を防止することができる。このモデルでは、より高いリガンド濃度によって遺伝子発現が増加する。δ−proteobacteria中のGEMM代表の1/3および他の分類群のいくつかは、「タンデム」配置にあり、ある例では、同一UTR中の別の場所の3’および別の場所付近に見出される。調節RNAのかかる配置は、簡潔な調節RNA立体配置によって許容されるよりも精巧な遺伝子発現調節に関与する(Sudarsan 2006;Welz 2007;Mandal 2006)。
GEMMは細菌に広範に存在し、高度に保存された配列および構造を有するようであり、推定RNAに実質的な生化学的制約を強要する機能が示唆される。322のGEMM配列がグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方で見出された。これはδ−proteobacteria、特にGeobacterおよび関連する属で共通である。γ−proteobacteria内で、AlteromonadalesおよびVibrionalesに遍在する。FirmicutesおよびPlanctomycetes(Plantomycetes)門の一定の目でも共通である。GEMMを有する重要な病原体には、コレラおよび炭疽の原因病原体が含まれる。
配列データが遺伝子注釈づけを含む309のGEMM例のうち、GEMMは、297の例で遺伝子に対して5’調節立体配置にあり、これはシス調節の役割に関与する。おそらくGEMMによって調節される遺伝子は広範な機能を示すが、ほとんどの遺伝子は細胞外環境または膜に関連し、多数の遺伝子は運動性に関連する。
GEMMの生物学的役割の理解により、広範な種々の微生物過程を明らかにすることができ、この過程は調節されるようである。実際、GEMMは、既にいくつかの研究対象とされているVibrio choleraeおよびGeobacter sulfurreducens種における2つの系に関与する。Vibrio choleraeはヒトでコレラを引き起こすが、その生活環の多くを水中で過ごし、多数の甲殻類のキチン含有外骨格に接着することができる。キチン(GlcNAc(N−アセチルグルコサミン)のポリマー)は、多数のV.choleraeの遺伝子発現に影響を及ぼすことが示されている(Meibom 2004)。GEMMは、これらのキチン誘導性遺伝子の2つを調節するようである。第1のgbpAは、キチンビーズ(Meibom 2004)およびヒト上皮細胞(Kirn 2005)への接着ならびにマウス感染(Kirn 2005)に重要である。
第2のキチン誘導性遺伝子はtfoXVCである。珍しいことに、キチンは、V.choleraeにおける天然のコンピテンスを誘導し(Meibom 2005)、tfoXVC発現はこのコンピテンスに不可欠である。V.choleraeは、個別のtfoXドメインに対応するCDDモデルであるCOG3070およびpfam04994に適合する2つの遺伝子を有する。両ドメインから10−25より良好なRPSBLAST(Schaffer 2001)E値が得られる。これらのうちの1つはtfoXVC(VC1153遺伝子座)である。GEMMは、tfoXGEMM(VC1722)と呼ばれる他の遺伝子を調節するようである。したがって、V.choleraeおよび関連細菌では、GEMMは、キチン誘導性コンピテンスに関与し得るか、高濃度のキチンを含まない環境でコンピテンスでさえも調節することができる。
Geobacteria sulfurreducensおよび関連するδ−proteobacteriaは、電子受容体としてFe(III)などの金属イオンを使用して有機化合物を酸化することによってATPを生成することができる(Methe2003)。GEMMは、Geobacter種におけるピリ線毛アセンブリ遺伝子に関連する。G.sulfurreducensにおけるピリ線毛は、導電性を示しており(Reguera 2005)、したがって、金属イオンの還元過程の一部である。
さらに、GEMMは、G.sulfurreducensにおいて7つのチトクロームc遺伝子を調節するようである。この細菌が111の推定チトクロームc遺伝子を有するにもかかわらず、7つのGEMM関連遺伝子のうちの5つが以前の研究で同定されており、特別な役割を有し得る。OmcS(外膜チトクロームS)は、G.sulfurreducensの外膜上に非常に豊富な2つのタンパク質のうちの1つであり、不溶性酸化鉄(III)の還元に必要であるが、可溶性クエン酸鉄(III)に必要ない(Mehta 2005)。OmcGおよびOmcHは、OmcB(多くの条件下で不可欠なチトクロームc)の産生に必要である(Kimm 2006)。OmcAおよびOmcTは、OmcG、OmcH、またはOmcSと関連する。4つの他のOmc注釈づけのみがGEMMと直接関連しないG.sulfurreducensに残存する(OmcB、OmcC、OmcE、およびOmcF)。
公知のリボスイッチと異なり、GEMMは、非常に多様な遺伝子機能に関連する(実施例1中の表2)。この所見は、GEMMリボスイッチが代謝経路の調節のための典型的なフィードバックセンサーとしての機能を果たさないことを示す。むしろ、GEMMは、シグナル伝達、または潜在的に細胞間情報交換に関与する第2のメッセンジャー分子を感知する(Bassler 2006)。実施例2は、GEMMモチーフの二次メッセンジャートリガー分子がサイクリックジGMPであることを証明している。この方法では、異なる細菌は、異なる過程を調節するためにGEMMおよびそのシグナル伝達分子を使用する。多数のGEMM関連遺伝子がシグナル伝達ドメインをコードするという事実は、多数のシグナル伝達タンパク質が調節される機構を示す。実施例2は、GEMM RNAが実際に新規に見出されたリボスイッチクラスのアプタマー成分としての機能を果たすことを証明している。
C.S−アデノシルホモシステインリボスイッチ
SAHモチーフを含むS−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ(SAHリボスイッチともいうことができる)は、分岐ステム構造を含む(図1および9A)。SAHモチーフは、配列および構造中で高度に保存されており(図1および9A)、予想されるステム領域内の共変動を示す(モジュラーステムおよび可変長ステムが含まれる)。SAHリボスイッチを、実施例1および3に記載する。SAHモチーフは、SAH(S−アデノシルホモシステイン)代謝に関連する遺伝子に対して5’調節立体配置、主に、β−およびいくつかのγ−proteobacteria、具体的にはシュードモナス(Pseudomonas)属中で見出される。SAHは、S−アデノシルメチオニン(SAM)代謝回路の一部であり、その主な成分には、アミノ酸のメチオニンおよびその誘導体ホモシステインが含まれる。SAHは、メチル化反応の補因子としてSAMを使用する酵素の副生成物である。典型的には、SAHは、ホモシステインおよびアデノシンに加水分解される。次いで、ホモシステインを使用して、メチオニンを合成し、最終的にSAMを合成する。
SAHモチーフを含むS−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ(SAHリボスイッチともいうことができる)は、分岐ステム構造を含む(図1および9A)。SAHモチーフは、配列および構造中で高度に保存されており(図1および9A)、予想されるステム領域内の共変動を示す(モジュラーステムおよび可変長ステムが含まれる)。SAHリボスイッチを、実施例1および3に記載する。SAHモチーフは、SAH(S−アデノシルホモシステイン)代謝に関連する遺伝子に対して5’調節立体配置、主に、β−およびいくつかのγ−proteobacteria、具体的にはシュードモナス(Pseudomonas)属中で見出される。SAHは、S−アデノシルメチオニン(SAM)代謝回路の一部であり、その主な成分には、アミノ酸のメチオニンおよびその誘導体ホモシステインが含まれる。SAHは、メチル化反応の補因子としてSAMを使用する酵素の副生成物である。典型的には、SAHは、ホモシステインおよびアデノシンに加水分解される。次いで、ホモシステインを使用して、メチオニンを合成し、最終的にSAMを合成する。
SAHが多数のSAM依存性メチルトランスフェラーゼを阻害するので、高レベルのSAHは細胞に有毒である(Ueland 1982)。したがって、細胞は、SAH濃度の上昇を感知し、有毒レベルに到達する前にこの化合物を破棄する必要がある可能性が高い。SAHモチーフが関連する遺伝子は、メチオニン合成で使用されるメチル供与体を合成するS−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ(ahcY)、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ(metH)、およびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(metF)である。SAHモチーフのこの遺伝子配置およびその高保存度は、SAHの感知およびその産物がSAH破壊に必要な遺伝子の発現の活性化での役割と一致する。実際、生化学的および遺伝的証拠は、このモチーフがSAH感知リボスイッチであることを示す。
D.PreQ1リボスイッチ(preQ1−IIまたはCOG4708モチーフ)
preQ1−IIを含むPreQ1応答性リボスイッチ(COG4708モチーフともいうことができる)。preQ1リボスイッチ、preQ1−IIリボスイッチ、またはCOG4708リボスイッチ)ともいうことができるかかるリボスイッチは、Streptococcusのいくつかの種およびLactococcus lactis中のCOG4708遺伝子の上流に見出されるが、StreptococcusにおけるCOG4708遺伝子ファミリーのいくつかの例は推定RNAモチーフを欠く。COG4708遺伝子は、膜タンパク質をコードすると予想される。preQ1−IIリボスイッチを、実施例1および4に記載する。
preQ1−IIを含むPreQ1応答性リボスイッチ(COG4708モチーフともいうことができる)。preQ1リボスイッチ、preQ1−IIリボスイッチ、またはCOG4708リボスイッチ)ともいうことができるかかるリボスイッチは、Streptococcusのいくつかの種およびLactococcus lactis中のCOG4708遺伝子の上流に見出されるが、StreptococcusにおけるCOG4708遺伝子ファミリーのいくつかの例は推定RNAモチーフを欠く。COG4708遺伝子は、膜タンパク質をコードすると予想される。preQ1−IIリボスイッチを、実施例1および4に記載する。
COG4708モチーフは系統発生学的に高度に制約されており、6つの固有の配列しか持たないにもかかわらず、このモチーフは、共変動、モジュラーステム、および可変長ステムを示す(図1、15、および16A)。モチーフは、COG4708遺伝子のシャイン−ダルカルノ配列と重複するシュードノットを有し、モチーフがこれらの遺伝子のシスレギュレーターをコードすることを示す。
改変核酸塩基preQ1を感知するリボスイッチが最近特徴づけられた(Roth 2007)。このリボスイッチがCOG4708と関連するので、COG4708がpreQ1に関連する代謝産物の輸送体であることが提案された。したがって、COG4708モチーフがpreQ1感知リボスイッチでもあると見なされた。実験はこのことを支持している。COG4708モチーフは、以前に特徴づけられたpreQ1感知リボスイッチ(Roth 2007)と配列や構造が類似しない。
E.細菌における転写終結のリボスイッチ調節
細菌は、主に、転写終結に2つの方法を使用する。転写伸長複合体を不安定化するために、一定の遺伝子はRhoタンパク質に依存する終結シグナルを組み込む一方で(J.P.Richardson,Biochimica et Biophysica Acta 2002,1577,251)、他の遺伝子はRho非依存性ターミネーター(固有のターミネーター)を使用する(I.Gusarov,E.Nudler,Molecular Cell 1999,3,495;E.Nudler,M.E.Gottesman,Genes to Cells 2002,7,755)。後者のRNAエレメントは、GCリッチステム−ループおよびその後の一続きの6〜9個のウリジル残基から構成される。固有のターミネーターは、細菌ゲノム全体に広く存在し(F.Lilloら、2002,18,971)、典型的には、遺伝子またはオペロンの3’末端に存在する。興味深いことに、5’−UTR内に存在する固有のターミネーターの例の数の増加が認められる。
細菌は、主に、転写終結に2つの方法を使用する。転写伸長複合体を不安定化するために、一定の遺伝子はRhoタンパク質に依存する終結シグナルを組み込む一方で(J.P.Richardson,Biochimica et Biophysica Acta 2002,1577,251)、他の遺伝子はRho非依存性ターミネーター(固有のターミネーター)を使用する(I.Gusarov,E.Nudler,Molecular Cell 1999,3,495;E.Nudler,M.E.Gottesman,Genes to Cells 2002,7,755)。後者のRNAエレメントは、GCリッチステム−ループおよびその後の一続きの6〜9個のウリジル残基から構成される。固有のターミネーターは、細菌ゲノム全体に広く存在し(F.Lilloら、2002,18,971)、典型的には、遺伝子またはオペロンの3’末端に存在する。興味深いことに、5’−UTR内に存在する固有のターミネーターの例の数の増加が認められる。
細菌によって使用される広範な種々の遺伝子調節ストラテジーのうち、RNAポリメラーゼが調節様式で5’−UTR内の終結シグナルに応答するクラスの例が増加している(T.M.Henkin,Current Opinion in Microbiology 2000,3,149)。一定の条件中で、RNAポリメラーゼ複合体は、外部シグナルによって終結シグナルを認識または無視するように指示される。調節されずに転写開始が起こり得るにもかかわらず、mRNA合成(および遺伝子発現の)調節は、最終的に、固有のターミネーターの調節によって指示される。少なくとも2つの相互の排他的なmRNA高次構造のうちの1つにより、転写終結をシグナル伝達するRNA構造が形成または破壊される。いくつかの例ではRNAであり(F.J.Grundyら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2002,99,11121;T.M.Henkin,C.Yanofsky,Bioessays 2002,24,700)、他の例ではタンパク質である(J.Stulke,Archives of Microbiology 2002,177,433)トランス作用因子は、一般に、特定の細胞内シグナルの受取りおよびその後のRNA高次構造の1つの安定化に必要である。リボスイッチにより、RNA構造の調整と遺伝子調節機構によって解釈される代謝産物シグナルとの間の直接的な関連が得られる。
ほとんどの臨床抗菌化合物はたった4つの細胞過程のうちの1つを標的する(Wolfson 2006)。細菌がこれらの過程を保護するための十分に発達した耐性機構を有するので(D’Costa 2006)、薬物介入に対して脆弱な新規の標的を開発するのに有用である。脆弱な過程の1つの型は、リボスイッチによる遺伝子発現の調節である(Winkler 2005)。一定の細菌mRNAの5’−UTR中で典型的に見出される公知の各リボスイッチクラスのメンバーは、特定の基本的代謝産物に結合するように進化した構造化受容体(すなわち、「アプタマー」)(Mandal 2004)を形成する。ほとんどの場合、リガンド結合は、結合した代謝産物の合成または輸送に関与する遺伝子または遺伝子群の発現を調節する。リボスイッチによって調節される生化学経路がしばしば細菌の生存に不可欠であるので、リボスイッチターゲティングによるこれらの経路の抑制は致死的であり得る。
いくつかの抗菌代謝産物アナログは、リボスイッチのターゲティングによって機能する(Sudarsan 2003;Sudarsan 2005;Woolley 1943)。例えば、抗菌チアミンアナログであるピリチアミン(Woolley 1943)は、チアミンピロリン酸塩結合リボスイッチのターゲティングによって機能する可能性が最も高い(Sudarsan 2005)。同様に、抗菌リジンアナログであるL−アミノエチルシステイン(Shiota 1958)(AEC、図1b)は、B.subtilis由来のlysCリボスイッチに結合し、lysC調節レポーター遺伝子の発現を抑制する(Sudarsan 2006)。さらに、lysCリボスイッチは、AECに耐性を示すB.subtilis株(Lu 1991)およびEscherichia coli株(Patte 1998)で変異する。
他で特定しない限り、開示の方法および組成物は、特定の合成方法、特定の分析技術、または特定の試薬に制限されず、それ自体、変化することができると理解するべきである。本明細書中で使用した専門用語は特定の実施形態のみを記載することを目的とし、制限することを意図しないとも理解するべきである。
材料
開示の方法および組成物のために使用することができるか、これらと併せて使用することができるか、これらの調製で使用することができるか、または、これらの生成物である、材料、組成物、および成分を開示する。これらおよび他の材料を本明細書中に開示し、特にこれらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などを開示する場合、これらの化合物の種々の個々および集合的組み合わせおよび順列(permutation)のそれぞれに関する特別な言及は明確に開示できず、それぞれ、本明細書中で具体的に意図および記載されると理解される。例えば、リボスイッチまたはアプタマードメインを開示および考察し、多数の分子(リボスイッチまたはアプタマードメインが含まれる)に作製することができる多数の改変物を考察する場合、それとは反対であると具体的に示されない限り、リボスイッチまたはアプタマードメインおよび可能な改変物の各々および全ての組み合わせおよび順列を特に意図する。したがって、分子A、B、およびCのクラスを開示し、ならびに分子D、E、およびFのクラス、および組み合わせ分子の例(A−D)も開示する場合、各々を個別に引用しない場合でさえも、各々を個別または集合的に意図する。したがって、この例では、A−E、A−F、B−D、B−E、B−F、C−D、C−E、およびC−Fの各組み合わせを特に意図し、A、B、およびC;D、E、およびF;ならびに組み合わせ例A−Dの開示から開示されると見なすべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも特に意図および開示される。したがって、例えば、A−E、B−F、およびC−Eの下位集団(sub−group)を特に意図し、A、B、およびC;D、E、およびF;および組み合わせ例A−Dの開示から開示されると見なすべきである。この概念を、本出願の全局面(開示の組成物を作製および使用する方法における工程が含まれるが、これらに限定されない)に適用する。したがって、実施することができる種々のさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる工程の各々を開示の方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを使用して実施することができ、それぞれのかかる組み合わせが特に意図され、開示されると見なすべきであると理解される。
開示の方法および組成物のために使用することができるか、これらと併せて使用することができるか、これらの調製で使用することができるか、または、これらの生成物である、材料、組成物、および成分を開示する。これらおよび他の材料を本明細書中に開示し、特にこれらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などを開示する場合、これらの化合物の種々の個々および集合的組み合わせおよび順列(permutation)のそれぞれに関する特別な言及は明確に開示できず、それぞれ、本明細書中で具体的に意図および記載されると理解される。例えば、リボスイッチまたはアプタマードメインを開示および考察し、多数の分子(リボスイッチまたはアプタマードメインが含まれる)に作製することができる多数の改変物を考察する場合、それとは反対であると具体的に示されない限り、リボスイッチまたはアプタマードメインおよび可能な改変物の各々および全ての組み合わせおよび順列を特に意図する。したがって、分子A、B、およびCのクラスを開示し、ならびに分子D、E、およびFのクラス、および組み合わせ分子の例(A−D)も開示する場合、各々を個別に引用しない場合でさえも、各々を個別または集合的に意図する。したがって、この例では、A−E、A−F、B−D、B−E、B−F、C−D、C−E、およびC−Fの各組み合わせを特に意図し、A、B、およびC;D、E、およびF;ならびに組み合わせ例A−Dの開示から開示されると見なすべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも特に意図および開示される。したがって、例えば、A−E、B−F、およびC−Eの下位集団(sub−group)を特に意図し、A、B、およびC;D、E、およびF;および組み合わせ例A−Dの開示から開示されると見なすべきである。この概念を、本出願の全局面(開示の組成物を作製および使用する方法における工程が含まれるが、これらに限定されない)に適用する。したがって、実施することができる種々のさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる工程の各々を開示の方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを使用して実施することができ、それぞれのかかる組み合わせが特に意図され、開示されると見なすべきであると理解される。
A.リボスイッチ
リボスイッチは、発現するRNA分子の一部であり、トリガー分子によって結合した場合に状態が変化する発現調節エレメントである。リボスイッチを、典型的には、以下の2つの個別のドメインに分けることができる:1つは標的に選択的に結合するドメイン(アプタマードメイン)および他は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン(発現プラットフォームドメイン)である。遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節されるこれらの2ドメイン間の動的相互作用がもたらされる。単離および組換えリボスイッチ、かかるリボスイッチを含む組換え構築物、かかるリボスイッチに作動可能に連結された非相同配列、かかるリボスイッチを保有する細胞およびトランスジェニック生物、リボスイッチ組換え構築物、ならびに非相同配列に作動可能に連結されたリボスイッチを開示する。非相同配列は、例えば、目的のタンパク質またはペプチド(レポータータンパク質またはペプチドが含まれる)をコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは、天然に存在するリボスイッチであるか、これに由来する(天然に存在するサイクリックジGMPリボスイッチなど)。リボスイッチは、人工アプタマーを含むか、任意選択的に排除することができる。例えば、人工アプタマーには、in vitro進化および/またはin vitro選択によってデザインまたは選択されるアプタマーが含まれる。リボスイッチは、天然に存在するリボスイッチのコンセンサス配列(サイクリックジGMPリボスイッチ、SAHリボスイッチ、preQ1リボスイッチ、Mocoリボスイッチ、およびSAM−IVリボスイッチのコンセンサス配列など)を含むことができる。サイクリックジGMPリボスイッチのコンセンサス配列を、図1および図3Bに示す。サイクリックジGMPリボスイッチの例を、図2および3Cに示す。SAHリボスイッチのコンセンサス配列を、図1および9Aに示す。preQ1-II(preQ1−IIまたはCOG4708モチーフ)リボスイッチのコンセンサス配列を、図1、15(配列)および16A(構造)に示す。
リボスイッチは、発現するRNA分子の一部であり、トリガー分子によって結合した場合に状態が変化する発現調節エレメントである。リボスイッチを、典型的には、以下の2つの個別のドメインに分けることができる:1つは標的に選択的に結合するドメイン(アプタマードメイン)および他は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン(発現プラットフォームドメイン)である。遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節されるこれらの2ドメイン間の動的相互作用がもたらされる。単離および組換えリボスイッチ、かかるリボスイッチを含む組換え構築物、かかるリボスイッチに作動可能に連結された非相同配列、かかるリボスイッチを保有する細胞およびトランスジェニック生物、リボスイッチ組換え構築物、ならびに非相同配列に作動可能に連結されたリボスイッチを開示する。非相同配列は、例えば、目的のタンパク質またはペプチド(レポータータンパク質またはペプチドが含まれる)をコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは、天然に存在するリボスイッチであるか、これに由来する(天然に存在するサイクリックジGMPリボスイッチなど)。リボスイッチは、人工アプタマーを含むか、任意選択的に排除することができる。例えば、人工アプタマーには、in vitro進化および/またはin vitro選択によってデザインまたは選択されるアプタマーが含まれる。リボスイッチは、天然に存在するリボスイッチのコンセンサス配列(サイクリックジGMPリボスイッチ、SAHリボスイッチ、preQ1リボスイッチ、Mocoリボスイッチ、およびSAM−IVリボスイッチのコンセンサス配列など)を含むことができる。サイクリックジGMPリボスイッチのコンセンサス配列を、図1および図3Bに示す。サイクリックジGMPリボスイッチの例を、図2および3Cに示す。SAHリボスイッチのコンセンサス配列を、図1および9Aに示す。preQ1-II(preQ1−IIまたはCOG4708モチーフ)リボスイッチのコンセンサス配列を、図1、15(配列)および16A(構造)に示す。
リボスイッチが天然に存在するリボスイッチの非天然誘導体であるリボスイッチを開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチであり得る。開示のリボスイッチ(その誘導体および組換え形態が含まれる)は、一般に、任意の供給源に由来し得る(天然に存在するリボスイッチおよびde novoでデザインしたリボスイッチが含まれる)。任意のかかるリボスイッチを、開示の方法中または開示の方法と共に使用することができる。しかし、異なるリボスイッチ型を定義することができ、いくつかのかかるサブタイプは、特定の方法においてまたは特定の方法を使用して有用であり得る(一般に、本明細書の他の場所に記載)。リボスイッチ型には、例えば、天然に存在するリボスイッチ、天然に存在するリボスイッチの誘導体および改変形態、コンセンサスリボスイッチ、キメラリボスイッチ、および組換えリボスイッチが含まれる。天然に存在するリボスイッチは、天然に見出されるリボスイッチの配列を有するリボスイッチである。かかる天然に存在するリボスイッチは、天然に存在するように天然に存在するリボスイッチの単離形態または組換え形態であり得る。すなわち、リボスイッチは、同一の一次構造を有するが、新規の遺伝子構成または核酸構成で単離または操作されている。コンセンサスリボスイッチは、天然に存在するリボスイッチのコンセンサス構造の配列および特徴を有する。キメラリボスイッチを、例えば、任意のリボスイッチのまたは特定のクラスもしくは型のリボスイッチのリボスイッチの一部および同一のリボスイッチのまたは任意の異なるクラスもしくは型のリボスイッチの異なるリボスイッチの一部;任意のリボスイッチのまたは特定のクラスもしくは型のリボスイッチのリボスイッチの一部および任意の非リボスイッチ配列または成分で構成することができる。組換えリボスイッチは、新規の遺伝子または核酸状況で単離または操作されているリボスイッチである。
リボスイッチは、1つまたは複数のアプタマードメインを有することができる。複数のアプタマードメインを有するリボスイッチ中のアプタマードメインは、トリガー分子の協同的結合を示すことができるか、トリガー分子の協同的結合を示すことができない(すなわち、アプタマーは協同的結合を示す必要がない)。後者の場合、アプタマードメインは、非依存性結合剤であるということができる。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、1つまたは複数の発現プラットフォームドメインを有することができる。例えば、トリガー分子の協同的結合を示す2つのアプタマードメインを有するリボスイッチを、両方のアプタマードメインによって調節される1つの発現プラットフォームドメインに連結することができる。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、リンカーを介して結合した1つまたは複数のアプタマーを有することができる。かかるアプタマーがトリガー分子の協同的結合を示す場合、リンカーは協同的リンカーであり得る。
xとx−1との間のヒル係数nを有する場合(xは、協同的結合について分析されるアプタマードメイン数(またはアプタマードメイン上の結合部位数)である)、アプタマードメインは協同的結合を示すということができる。したがって、例えば、リボスイッチが2と1との間のヒル係数を有する場合、2つのアプタマードメインを有するリボスイッチは協同的結合を示すということができる。使用した値xが協同的結合について分析したアプタマードメイン数(必ずしもリボスイッチ中のアプタマードメインの存在数ではない)に依存すると理解すべきである。一部のみしか協同的結合を示さない場合にリボスイッチが複数のアプタマードメインを有することができるので、これは理解される。
非相同アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むキメラリボスイッチを開示する。すなわち、キメラリボスイッチは、ある供給源由来のアプタマードメインおよび別の供給源由来の発現プラットフォームドメインから構成される。非相同供給源は、例えば、異なる特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。非相同アプタマーは、非リボスイッチアプタマーにも由来し得る。非相同発現プラットフォームドメインは、非リボスイッチ供給源にも由来し得る。
改変リボスイッチまたは誘導体リボスイッチを、in vitro選択および進化技術を使用して産生することができる。一般に、リボスイッチに適用されるin vitro進化技術は、リボスイッチ配列の一部が変化している一方で、リボスイッチの他の部分が一定に保持されている改変(variant)リボスイッチ組の産生を含む。次いで、改変リボスイッチ組の活性化、非活性化、または遮断(または他の機能的もしくは構造的基準)を評価することができ、目的の基準を満たす改変リボスイッチを使用またはさらなる進化ラウンドのために選択する。改変体生成に有用な基盤リボスイッチは、本明細書中に開示の特異的およびコンセンサスリボスイッチである。コンセンサスリボスイッチを使用して、どのリボスイッチ部分がin vitro選択および進化のために変化するかについての情報を提供することができる。
調節が変化した改変リボスイッチも開示する。リボスイッチの調節を、リボスイッチ(キメラリボスイッチである)の発現プラットフォームドメインへのアプタマードメインの作動可能な連結によって変化させることができる。次いで、アプタマードメインは、例えば、アプタマードメインのためのトリガー分子の作用によってリボスイッチの調節を媒介することができる。アプタマードメインを、任意の適切な様式で(例えば、リボスイッチの通常または天然のアプタマードメインの新規のアプタマードメインとの置換によるものが含まれる)、リボスイッチの発現プラットフォームドメインに作動可能に連結することができる。一般に、アプタマードメインが由来するリボスイッチを活性化、誘導体化、または遮断することができる任意の化合物または条件を使用して、キメラリボスイッチを活性化、誘導体化、または遮断することができる。
不活化リボスイッチも開示する。リボスイッチの共有結合の変化(例えば、リボスイッチの一部の架橋または化合物のリボスイッチへのカップリング)によってリボスイッチを不活化することができる。この様式でのリボスイッチの不活化は、例えば、リボスイッチに対しトリガー分子の結合を防止するか、トリガー分子の結合の際にリボスイッチの状態の変化を防止するか、リボスイッチの発現プラットフォームドメインがトリガー分子の結合の際に発現に影響を及ぼすのを防止する変化に起因し得る。
バイオセンサーリボスイッチも開示する。バイオセンサーリボスイッチは、その同系のトリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを産生する操作リボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、閾値レベルまたは閾値レベルを超えるトリガー分子で誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、in vivoまたはin vitroでの使用のためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかシグナル産生に関与するタンパク質をコードするレポーターRNAに作動可能に連結されたバイオセンサーリボスイッチを、細胞または生物にリボスイッチ/レポーターRNAをコードする核酸構築物を保有させるように操作することによってin vivoで使用することができる。in vitroで使用するバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識(リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル)を含むリボスイッチである。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチからの或いはそれに由来するアプタマードメインを使用する。バイオセンサーリボスイッチを、種々の状況およびプラットフォームで使用することができる。例えば、バイオセンサーリボスイッチを、固体支持体(プレート、チップ、ストリップ、およびウェルなど)と共に使用することができる。
新規のトリガー分子を認識する改変リボスイッチまたは誘導体リボスイッチも開示する。新規のトリガー分子を認識する新規のリボスイッチおよび/または新規のアプタマーを、公知のリボスイッチのために選択するか、公知のリボスイッチからデザインするか、公知のリボスイッチから誘導することができる。例えば、リボスイッチ中のアプタマー改変体組を産生する工程、目的の化合物の存在下での改変リボスイッチの活性化を評価する工程、活性化された改変リボスイッチ(または、例えば、最高にまたは最も選択的に活性化されたリボスイッチ)の選択、および所望の活性、特異性、活性と特異性との組み合わせ、または特性の他の組み合わせの改変リボスイッチが得られるまでこれらの工程を繰り返すことによってこれを行うことができる。
一般に、発現プラットフォームドメイン中の調節された鎖をアプタマードメインの調節鎖に相補的であるようにデザインまたは適合させることによって、任意のアプタマードメインを任意の発現プラットフォームドメインと共に使用するために適合させることができる。あるいは、調節鎖が発現プラットフォーム中の機能的に重要な配列に相補的であるように、アプタマーの配列およびアプタマードメインの調節鎖を適合させることができる。例えば、調節鎖を、調節鎖とSD配列との間のステム構造の形成の際に、SD配列がリボゾームに接近不可能となり、それにより、翻訳開始が減少するか防止されるようにRNAのシャイン−ダルカルノ配列に相補的であるように適応することができる。アプタマー鎖がアプタマードメイン中にP1ステムを形成させるための対応する変化を配列中に有することに留意のこと。協同的結合を示す複数のアプタマーを有するリボスイッチの場合、活性化アプタマー(発現プラットフォームドメインと相互作用するアプタマー)のP1ステムのみを、SD配列を有するステム構造を形成するようにデザインする必要がある。
別の例として、転写ターミネーターを、転写ターミネーター配列の一部がアプタマードメインの調節鎖(配列は調節された鎖である)と相補的であるRNA分子(RNAの非翻訳領域中が最も都合がよい)に付加することができる。これにより、アプタマードメインの調節配列がアプタマー鎖および調節された鎖を有するオルタナティブなステム構造を形成することが可能となり、それにより、リボスイッチの活性化または非活性化の際に転写ターミネーターステムが形成または破壊される。リボスイッチの調節下でオルタナティブなステム構造の類似のデザインによって任意の他の発現エレメントを得ることができる。
リボスイッチによって調節される転写ターミネーターのために、リボスイッチおよび発現プラットフォームエレメントの転写速度および間隔は、適切な調節に重要であり得る。転写速度を、例えば、転写を中止してリボスイッチを形成し、トリガー分子を感知することを可能にするためのポリメラーゼ中止エレメント(polymerase pausing element)(例えば、一連のウリジン残基)を含めることによって調整することができる。
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むRNAをコードする核酸分子を含み、リボスイッチがRNAの発現を調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同である、調節可能な遺伝子発現構築物を開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、SAM応答性リボスイッチ、またはかかるリボスイッチの誘導体であり得る。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。リボスイッチは、2つ以上のアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインの少なくとも1つが非相同である。アプタマードメインの少なくとも2つは協同的結合を示すことができる。
非相同リボスイッチおよびコード領域を含むRNA分子を開示する。すなわち、かかるRNA分子は、ある供給源由来のリボスイッチおよび別の供給源由来のコード領域から構成される。非相同供給源は、例えば、異なるRNA分子、異なる転写物、異なる遺伝子由来のRNAまたは転写物、異なる細胞由来のRNAまたは転写物、異なる生物由来のRNAまたは転写物、異なる種由来のRNAまたは転写物、天然の配列および人工または操作された配列、特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。
本明細書中に開示する場合、用語「コード領域」は、アミノ酸をコードする核酸の任意の領域をいう。これは、コドンまたはコドンのテンプレートを含む核酸鎖および二本鎖核酸分子の場合のかかる核酸鎖の相補物の両方を含むことができる。コード領域でない核酸領域を、非コード領域ということができる。転写される伝令RNA分子は、典型的には、5’末端および3’末端の両方に非コード領域を含む。真核生物mRNA分子は、イントロンなどの内部非コード領域も含むことができる。いくつかのRNA分子型は、tRNA分子およびrRNA分子などの機能的コード領域を含まない。機能的コード領域を含まないRNA分子(非コードRNA分子ともいうことができる)の発現も、開示のリボスイッチによって調節するか影響を及ぼすことができる。したがって、開示のリボスイッチを、コード領域へのリボスイッチの作動可能な連結のための本明細書中に開示の任意の様式で非コードRNA分子に作動可能に連結することができる。リボスイッチは、コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むRNAの調節のために本明細書中に開示のようにかかるRNAの発現を調節することができる。任意の核酸分子の機能を、開示のリボスイッチによって調節するか影響を及ぼすこともできる。例には、RNA、DNA、および人工核酸(ペプチド核酸(PNA)、モルホリノおよびロックド核酸(LNA)、ならびにグリコール核酸(GNA)およびトレオース核酸(TNA)が含まれる)が含まれるが、これらに限定されない。開示の方法では、リボスイッチは、例えば、コード領域の発現、コードされたタンパク質の発現、非コードRNA分子の発現、RNAまたはコード領域の転写、またはコードされたタンパク質の翻訳を調節することができる。
1.アプタマードメイン
アプタマーは、特定の化合物および化合物クラスに選択的に結合することができる核酸セグメントおよび構造である。リボスイッチは、トリガー分子の結合の際にリボスイッチの状態または構造が変化するアプタマードメインを有する。機能的リボスイッチでは、アプタマードメインに連結した発現プラットフォームドメインの状態または構造は、トリガー分子がアプタマードメインに結合した場合に変化する。リボスイッチのアプタマードメインは、任意の供給源(例えば、天然リボスイッチのアプタマードメイン、人工アプタマー、操作された、選択された、進化した、または誘導されたアプタマーまたはアプタマードメインが含まれる)に由来し得る。リボスイッチ中のアプタマーは、一般に、ステム構造の形成などによって連結した発現プラットフォームドメイン部分と相互作用することができる少なくとも1つの部分を有する。このステム構造は、トリガー分子の結合の際に形成されるか破壊されるかのいずれかである。
アプタマーは、特定の化合物および化合物クラスに選択的に結合することができる核酸セグメントおよび構造である。リボスイッチは、トリガー分子の結合の際にリボスイッチの状態または構造が変化するアプタマードメインを有する。機能的リボスイッチでは、アプタマードメインに連結した発現プラットフォームドメインの状態または構造は、トリガー分子がアプタマードメインに結合した場合に変化する。リボスイッチのアプタマードメインは、任意の供給源(例えば、天然リボスイッチのアプタマードメイン、人工アプタマー、操作された、選択された、進化した、または誘導されたアプタマーまたはアプタマードメインが含まれる)に由来し得る。リボスイッチ中のアプタマーは、一般に、ステム構造の形成などによって連結した発現プラットフォームドメイン部分と相互作用することができる少なくとも1つの部分を有する。このステム構造は、トリガー分子の結合の際に形成されるか破壊されるかのいずれかである。
種々の天然リボスイッチのコンセンサスアプタマードメインを、米国特許出願公開第2005−0053951号の図11および本明細書中の他所に示す。サイクリックジGMPリボスイッチのコンセンサス配列および構造を、図1および3に見出すことができる。SAHリボスイッチのコンセンサス配列を、図1および9Aに示す。preQ1-II(preQ1−IIまたはCOG4708モチーフ)リボスイッチのコンセンサス配列を、図1、15(配列)、および16A(構造)に示す。これらのアプタマードメイン(本明細書中に具体化された全てのダイレクト改変体(direct variant)が含まれる)を、リボスイッチ中で使用することができる。コンセンサス配列および構造は、配列および構造の変形を示す。示した変形内のアプタマードメインを本明細書中でダイレクト改変体という。これらのアプタマードメインを、改変(modified)または改変(variant)アプタマードメインが産生されるように改変することができる。保存的改変には、対の中のヌクレオチドが相補性を維持するような塩基対合ヌクレオチドの任意の変化が含まれる。中等度の改変には、示した長さ範囲の20%以下のまたは等しい(長さまたは長さの範囲を示す)ステムまたはループの長さの変化が含まれる。コンセンサス構造が特定の長さのステムまたはループを示す場合、または、長さの範囲が列挙または表示される場合、ループおよびステムの長さを、「示す」と見なす。中等度の改変には、示した長さ範囲の40%以下のまたは等しい(長さまたは長さの範囲を示さない)ステムまたはループの長さの変化が含まれる。中等度の改変には、アプタマードメインの非特定部分の機能的改変体も含まれる。
開示のリボスイッチのアプタマードメインを、任意の他の目的、および任意の他の状況のためにアプタマーとして使用することもできる。例えば、アプタマーを使用して、リボザイム、他の分子スイッチ、および構造の変化がRNAの機能に影響を及ぼし得る任意のRNA分子を調節することができる。
2.発現プラットフォームドメイン
発現プラットフォームドメインは、リボスイッチを含むRNA分子の発現に影響を及ぼすリボスイッチの一部である。発現プラットフォームドメインは、一般に、ステム構造の形成などによって連結したアプタマードメインの一部と相互作用することができる少なくとも1つの部分を有する。このステム構想は、トリガー分子の結合の際に形成されるか破壊されるかのいずれかである。ステム構造は、一般に、発現調節構造を形成するか、これの形成を防止するかのいずれかである。発現調節構造は、構造を含むRNA分子の発現を許容するか、防止するか、増強するか、阻害する構造である。例には、シャイン−ダルガルノ配列、開始コドン、転写ターミネーター、安定性シグナル、ならびにプロセシングシグナル(RNAスプライシングジャンクションおよび調節エレメントなど)が含まれる。
発現プラットフォームドメインは、リボスイッチを含むRNA分子の発現に影響を及ぼすリボスイッチの一部である。発現プラットフォームドメインは、一般に、ステム構造の形成などによって連結したアプタマードメインの一部と相互作用することができる少なくとも1つの部分を有する。このステム構想は、トリガー分子の結合の際に形成されるか破壊されるかのいずれかである。ステム構造は、一般に、発現調節構造を形成するか、これの形成を防止するかのいずれかである。発現調節構造は、構造を含むRNA分子の発現を許容するか、防止するか、増強するか、阻害する構造である。例には、シャイン−ダルガルノ配列、開始コドン、転写ターミネーター、安定性シグナル、ならびにプロセシングシグナル(RNAスプライシングジャンクションおよび調節エレメントなど)が含まれる。
B.トリガー分子
トリガー分子は、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物である。これには、リボスイッチの天然または通常のトリガー分子およびリボスイッチを活性化することができる他の化合物が含まれる。天然または通常のトリガー分子は、所与の天然のリボスイッチのためのトリガー分子であるかまたはいくつかの非天然リボスイッチの場合、リボスイッチがデザインされるためのトリガー分子か、それと共にリボスイッチが選択される(例えば、in vitro選択技術またはin vitro進化技術など)トリガー分子である。
トリガー分子は、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物である。これには、リボスイッチの天然または通常のトリガー分子およびリボスイッチを活性化することができる他の化合物が含まれる。天然または通常のトリガー分子は、所与の天然のリボスイッチのためのトリガー分子であるかまたはいくつかの非天然リボスイッチの場合、リボスイッチがデザインされるためのトリガー分子か、それと共にリボスイッチが選択される(例えば、in vitro選択技術またはin vitro進化技術など)トリガー分子である。
C.化合物
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物およびかかる化合物を含む組成物も開示する。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。化合物を使用して、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる。リボスイッチのトリガー分子(ならびに他の活性化化合物)を使用して、リボスイッチを活性化することができる。トリガー分子以外の化合物を使用して、一般に、リボスイッチを非活性化または遮断することができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチの存在からのトリガー分子の除去によって非活性化することもできる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチを活性化しないトリガー分子のアナログの結合によって遮断することができる。
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物およびかかる化合物を含む組成物も開示する。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。化合物を使用して、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる。リボスイッチのトリガー分子(ならびに他の活性化化合物)を使用して、リボスイッチを活性化することができる。トリガー分子以外の化合物を使用して、一般に、リボスイッチを非活性化または遮断することができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチの存在からのトリガー分子の除去によって非活性化することもできる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチを活性化しないトリガー分子のアナログの結合によって遮断することができる。
RNA分子がリボスイッチを含む、RNA分子またはRNA分子をコードする遺伝子の発現を変化させるための化合物も開示する。化合物のRNA分子との接触によってこれを行うことができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。したがって、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する条件に応じたリボスイッチを含む目的のRNA分子を供して、RNAの発現を変化させるために使用することができる。例えば、転写の終結またはRNAへのリボゾーム結合遮断の結果として発現を変化させることができる。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質に応じて、RNA分子の発現を減少または防止することができるか、RNA分子の発現を促進または増加することができる。
RNA分子またはRNA分子をコードする遺伝子の発現を調節するための化合物も開示する。リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってリボスイッチを含む天然に存在する遺伝子またはRNAの発現を調節するための化合物も開示する。遺伝子がこの遺伝子を保有する細胞または生物の生存に不可欠である場合、リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断により、細胞または生物が死滅、静止、または衰弱し得る。
リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってリボスイッチを含む単離遺伝子、操作遺伝子、もしくは組換え遺伝子またはRNAの発現を調節するための化合物も開示する。遺伝子が所望の発現産物をコードする場合、リボスイッチの活性化および非活性化を使用して、遺伝子発現を誘導し、それにより、発現産物を産生することができる。遺伝子が遺伝子発現または別の細胞過程のインデューサーまたはリプレッサーをコードする場合、リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断により、他の調節された遺伝子または細胞過程を誘導、抑制、または脱抑制することができる。多数のかかる二次調節効果は公知であり、リボスイッチとの使用に適合することができる。かかる調節(regulation)の一次調節(control)としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチトリガー分子が小さな非抗原性分子であり得ることである。
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物を同定する方法も開示する。例えばリボスイッチを活性化する化合物を、試験化合物とリボスイッチとの接触させる工程およびリボスイッチの活性化を評価する工程によって同定することができる。リボスイッチが活性化される場合、試験化合物を、リボスイッチを活性化する化合物と同定する。リボスイッチの活性化を、任意の適切な様式で評価することができる。例えば、リボスイッチをレポーターRNAに連結することができ、レポーターRNAの発現、発現レベル、または発現レベルの変化を、試験化合物の存在下および非存在下で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、高次構造依存性標識(リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル)を含むことができる。かかるリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するか、これから誘導するアプタマードメインを使用する。認められるように、調節アッセイまたは測定を使用するか調節アッセイまたは測定を使用しないで、リボスイッチの活性化を評価することができる。
リボスイッチを非活性化する化合物の同定方法を、類似の方法で行うことができる。リボスイッチを遮断する化合物の同定を、任意の適切な様式で行うことができる。例えば、リボスイッチを活性化または非活性化することが公知の化合物の存在下および試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を評価するためのアッセイを行うことができる。試験化合物の非存在下で観察されるように活性化または非活性化が認められない場合、試験化合物を、リボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定する。
サイクリックジGMP、SAH、preQ1、Moco、およびSAM−IVリボスイッチと相互作用する化合物を本明細書中に開示する。これらの化合物のさらなる改変バージョンは、RNA構造中の他の官能基への新規の接触によってリボスイッチへの結合を改善することができる。さらに、(他の特徴のうちで)生物学的利用能、毒性、および合成の容易さの調整を、これら2つの骨格(scaffold)領域中の改変によって調節することができる。これは、リボスイッチの構造モデルがこれらの部位で多数の改変が可能であることを示すからである。
ハイスループットスクリーニングを使用して、標準的または非標準的な分子認識様式のいずれかを使用してリボスイッチRNAにも結合する全く新しい化学的骨格を明らかにすることもできる。複数の異なるアプローチを使用して、代謝産物結合RNAを検出することができる(ゲルベースおよびチップベースの検出方法を使用したアロステリックリボザイムアッセイならびにインライン探索アッセイが含まれる)。リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の同定および同定された化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物同定方法と同定された化合物の製造方法との組み合わせにより、これを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触、リボスイッチの活性化の評価、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造によって化合物を作製することができる。
化合物によるリボスイッチの活性化、非活性化、または遮断のチェックおよびチェックした化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物の活性化、非活性化、または遮断評価方法とチェックした化合物の製造方法との組み合わせによってこれを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触、リボスイッチの活性化の評価、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造によって化合物を作製することができる。化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する能力についての化合物のチェックは、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することを以前には知られていない化合物の同定および化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することが既に知られていた場合のリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の能力の評価の両方をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「置換された」は、有機化合物の全ての許容される置換基が含まれることを意図する。広範な態様では、許容される置換基には、非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環式および複素環式、ならびに芳香族および非芳香族の有機化合物の置換基が含まれる。例示的な置換基には、例えば、以下に記載の置換基が含まれる。許容される置換基は、適切な有機化合物について1つまたは複数および同一または異なり得る。本開示の目的のために、ヘテロ原子(窒素など)は、ヘテロ原子の原子価を満たす本明細書中に記載の有機化合物の水素置換基および/または任意の許容される置換基を有することができる。本開示は、いかなる様式においても有機化合物の許容される置換基に制限されることを意図しない。また、用語「置換」または「〜と置換された」には、かかる置換が置換される原子および置換基の許容される原子価に従い、置換によって安定な化合物(例えば、再配置、環状化、除去などによって自発的に変換を受けない化合物)が得られるという暗黙の条件が含まれる。
「A1」、「A2」、「A3」、および「A4」を、本明細書中で、種々の特定の置換基を示すための一般的な記号として使用する。これらの記号は、任意の置換基であり得、本明細書中に開示の置換基に制限されず、ある場合に置換基が一定の置換基であると定義される場合、別の場合に置換基をいくつかの他の置換基と定義することができる。
用語「アルキル」は、本明細書中で使用する場合、1〜24個の炭素原子の分岐または非分岐の飽和炭化水素基(メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、t−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、およびテトラコシルなど)である。アルキル基は、置換または非置換でもあり得る。アルキル基を、1つまたは複数の基(下記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない)と置換することができる。用語「低級アルキル」は、6個以下の炭素原子のアルキル基(例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシルなど)である。
明細書を通して、「アルキル」を、一般に、非置換アルキル基および置換アルキル基の両方をいうために使用するが、置換アルキル基はまた、アルキル基上の特定の置換基の同定によって本明細書中で具体的に言及される。例えば、用語「ハロゲン化アルキル」は、具体的には、1つまたは複数のハライド(例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素)と置換されたアルキル基をいう。用語「アルコキシアルキル」は、具体的には、1つまたは複数の下記のアルコキシ基と置換されたアルキル基をいう。用語「アルキルアミノ」は、具体的には、1つまたは複数の下記のアミノ基などと置換されたアルキル基をいう。「アルキル」をある例で使用する場合、「ハロゲン化アルキル」などの特定の用語を別の例で使用し、用語「アルキル」が「ハロゲン化アルキル」などの特定の用語もいわないことを意味しない。
このプラクティスを、本明細書中に記載の他の基にも使用する。すなわち、「シクロアルキル」などの用語は、非置換および置換のシクロアルキル部分の両方をいう一方で、置換部分を、さらに、本明細書中で具体的に特定することができる。例えば、特定の置換シクロアルキルは、例えば、「アルキルシクロアルキル」をいうことができる。同様に、置換アルコキシは、具体的には、例えば、「ハロゲン化アルコキシ」をいうことができ、特定の置換アルケニルは、例えば、「アルケニルアルコール」などであり得る。さらに、一般用語(「シクロアルキル」など)および特定の用語(「アルキルシクロアルキル」など)の使用プラクティスは、一般用語が特定の用語も含まないことを意味しない。
用語「アルコキシ」は、本明細書中で使用する場合、単一の末端エーテル結合によって結合したアルキル基である。すなわち、「アルコキシ」基を、−OA1(式中、A2は上記定義のアルキルである)と定義することができる。
用語「アルケニル」は、本明細書中で使用する場合、構造式が少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を含む2〜24個の炭素原子の炭化水素基である。(A1A2)C=C(A3A4)などの非対称構造は、EおよびZ異性体の両方を含むことを意図する。これは、非対称アルケンが存在する本明細書中の構造式から推測することができるか、結合記号C=Cによって明確に示すことができる。アルケニル基を、1つまたは複数の基(下記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない)と置換することができる。
用語「アルキニル」は、本明細書中で使用する場合、構造式が少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を含む2〜24個の炭素原子の炭化水素基である。アルキニル基を、1つまたは複数の基(下記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない)と置換することができる。
用語「アリール」は、本明細書中で使用する場合、任意の炭素ベースの芳香基を含む基(ベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、フェノキシベンゼンなどが含まれるが、これらに限定されない)である。用語「アリール」には、芳香基の環内に組み込まれた少なくとも1つのヘテロ原子を有する芳香基を含む基と定義される「ヘテロアリール」も含まれる。ヘテロ原子の例には、窒素、酸素、硫黄、およびリンが含まれるが、これらに限定されない。同様に、用語「アリール」にも含まれる用語「非ヘテロアリール」は、ヘテロ原子を含まない芳香基を含む基を定義する。アリール基は、置換または非置換であり得る。アリール基を、1つまたは複数の基(本明細書中に記載のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない)と置換することができる。用語「ビアリール」は、アリール基の特定の型であり、アリールの定義内に含まれる。ビアリールは、ナフタレンのような融合環構造を介して共に結合するか、ビフェニルのような1つまたは複数の炭素−炭素結合を介して結合する2つのアリール基をいう。
用語「シクロアルキル」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも3つの炭素原子から構成される非芳香族炭素ベースの環である。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれるが、これらに限定されない。用語「ヘテロシクロアルキル」は、環の少なくとも1つの炭素原子がヘテロ原子(窒素、酸素、硫黄、またはリンなどであるが、これらに限定されない)と置換された上記定義のシクロアルキル基である。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、置換または非置換であり得る。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基を、1つまたは複数の基(本明細書中に記載のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない)と置換することができる。
用語「シクロアルケニル」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも3つの炭素原子から構成され、且つ少なくとも1つの二重結合(すなわち、C=C)を含む非芳香族炭素ベースの環である。シクロアルケニル基の例には、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、およびシクロヘキサジエニルなどが含まれるが、これらに限定されない。用語「ヘテロシクロアルケニル」は、上記定義のシクロアルケニル基の1つの型であり、用語「シクロアルケニル」の意味の範囲内に含まれ、環の少なくとも1つの炭素原子がヘテロ原子(窒素、酸素、硫黄、またはリンなどが含まれるが、これらに限定されない)と置換されている。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、置換または非置換であり得る。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基を、1つまたは複数の基(本明細書中に記載のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない)と置換することができる。
用語「環状基(cyclic group)」を、アリール基、非アリール基(すなわち、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニル基)、またはその両方のいずれかをいうために本明細書中で使用する。環状基は、置換または非置換であり得る1つまたは複数の環系を有する。環状基は、1つまたは複数のアリール基、1つまたは複数の非アリール基、または1つまたは複数のアリール基および1つまたは複数の非アリール基を含むことができる。
用語「アルデヒド」は、本明細書中で使用する場合、式−C(O)Hで示される。本明細書を通して、「C(O)」はC=Oの略語である。
用語「アミン」または「アミノ」は、本明細書中で使用する場合、式NA1A2A3(式中、A1、A2、およびA3は、独立して、上記の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る)によって示される。
用語「カルボン酸」は、本明細書中で使用する場合、式−C(O)OHによって示される。「カルボキシラート」は、本明細書中で使用する場合、式−C(O)O−によって示される。
用語「エステル」は、本明細書中で使用する場合、式−OC(O)A1または−C(O)OA1(式中、A1は、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る)によって示される。
用語「エーテル」は、本明細書中で使用する場合、式A1OA2(式中、A1およびA2は、独立して、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る)によって示される。
用語「ケトン」は、本明細書中で使用する場合、式A1C(O)A2(式中、A1およびA2は、独立して、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る)によって示される。
用語「ハライド」は、本明細書中で使用する場合、ハロゲンであるフッ素、塩素、臭素、およびヨウ素をいう。
用語「ヒドロキシル」は、本明細書中で使用する場合、式−OHによって示される。
用語「スルホ−オキソ」は、本明細書中で使用する場合、式−S(O)A1(すなわち、「スルホニル」)、A1S(O)A2(すなわち、「スルホキシド」)、−S(O)2A1、A1SO2A2(すなわち、「スルホン」)、−OS(O)2A1、または−OS(O)2OA1(式中、A1およびA2は、上記の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る)によって示される。本明細書を通して、「S(O)」は、S=Oの略語である。
用語「スルホニルアミノ」または「スルホンアミド」は、本明細書中で使用する場合、式−S(O)2NH−によって示される。
用語「チオール」は、本明細書中で使用する場合、式−SHによって示される。
本明細書中で使用する場合、「Rn」(式中、nはいくつかの整数である)は、上記列挙の1つまたは複数の基を独立して保有することができる。選択される基に応じて、第1の基を第2の基内に組み込むことができるか、あるいは、第1の基は、第2の基に対する懸垂基であり得る(すなわち、結合することができる)。例えば、句「アミノ基を含むアルキル基」を使用して、アミノ基を、アルキル基のバックボーン内に組み込むことができる。あるいは、アミノ基を、アルキル基のバックボーンに結合することができる。選択される基の性質は、第1の基が第2の基に埋め込まれるか第2の基に結合するかどうかによって決定される。
逆に記載されない限り、実線のみでしめされ、ウェッジや破線で示されない化学結合を有する式は、可能な各異性体(例えば、各鏡像異性体およびジアステレオマーならびに異性体の混合物(ラセミ混合物またはスカレミック混合物(scalemic mixture)など))を意図する。
本明細書中に開示の一定の材料、化合物、組成物、および成分を、購入するか、当業者に一般的に公知の技術を使用して容易に合成することができる。例えば、開示の化合物および組成物の調製で使用される出発材料および試薬は、販売業者(Aldrich Chemical Co.,(Milwaukee,Wis.)、Acros Organics(Morris Plains,N.J.)、Fisher Scientific(Pittsburgh,Pa.)、またはSigma(St.Louis,Mo.)など)から入手可能であるか、リファレンス(Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis,Volumes 1−17(John Wiley and Sons,1991);Rodd’s Chemistry of Carbon Compounds,Volumes 1−5 and Supplementals(Elsevier Science Publishers,1989);Organic Reactions,Volumes 1−40(John Wiley and Sons,1991);March’s Advanced Organic Chemistry,(John Wiley and Sons,4th Edition);およびLarock’s Comprehensive Organic Transformations(VCH Publishers Inc.,1989)など)に記載の手順に従った当業者に公知の方法によって調製する。
開示のリボスイッチを活性化するための化合物には、サイクリックジGMP、pGpG、GpG、またはGpGpG、サイクリックジGMP応答性リボスイッチを活性化することができるサイクリックジGMP、pGpG、GpG、またはGpGpGの誘導体、S−アデノシルホモシステイン、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチを活性化することができるS−アデノシルホモシステインの誘導体、preQ1、preQ1応答性リボスイッチを活性化することができるpreQ1の誘導体、Moco、Moco応答性リボスイッチを活性化することができるMocoの誘導体、SAM、およびSAM応答性リボスイッチを活性化することができるSAMの誘導体が含まれる。SAM−IVリボスイッチを活性化するための化合物はまた、MeAzaAdoMetであり得る。
S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチの活性化のために、化合物はS−アデノシルホモシステインであり得る。化合物はまた、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチを活性化することができるS−アデノシルホモシステインの誘導体であり得る。例えば、化合物はS−アデノシル−L−システイン(SAC)であり得る。図12Bは、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチを活性化することができる化合物に重要な構造エレメントを示す。
preQ1応答性リボスイッチ(およびpreQ1応答性リボスイッチ由来のリボスイッチ)の活性化のために、化合物は、1位のNをC、OまたはSと置換することができ、2位のアミノ基を水素結合供与体と置換することができ、6位の酸素を水素結合受容体と置換することができ、7位のアミノ基を水素結合受容体と置換することができ、窒素を水素結合供与体と置換するかこれを使用して誘導することができる、preQ1の誘導体であり得る。
特定の部分または基を本明細書中で水素結合供与体または水素結合受容体ということができる一方で、参照を容易にするために種々の置換基を単に分類するためにこの専門用語が使用されると理解すべきである。かかる用語を、特定の部分がリボスイッチまたはいくつかの他の化合物との水素結合に実際に関与することを意味すると解釈すべきではない。例えば、本明細書中で水素結合受容体(または供与体)といわれる部分が、リボスイッチまたは他の化合物との疎水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または他の型の相互作用に唯一または付加的に関与することができる可能性がある。
本明細書中に開示の一定の基を本明細書中で水素結合受容体および水素結合供与体の両方をいうことができるとも理解される。例えば、−OHは、水素原子の供与による水素結合供与体であり得る。−OHは、酸素原子上の1つまたは複数の非結合電子対による水素結合受容体でもあり得る。したがって、本明細書を通して、種々の部分が水素結合供与体および受容体であり得、そのようなものとして言及することができる。
上記定義内のあらゆる化合物は、本明細書中に具体的に開示されていることを意図するか、見なされるべきである。さらに、上記定義内で同定することができるあらゆる下位集団は、本明細書中に具体的に開示されていることを意図するか、見なされるべきである。結果として、任意の化合物または化合物の下位集団が特に使用のために含まれるか使用から排除されるか、化合物リスト中に含まれるか化合物リストから排除されることを特に意図する。例として、各化合物が上記定義の通りであり、且つサイクリックジGMP応答性リボスイッチを活性化することができる化合物群が意図される。
リボスイッチと相互作用する化合物についての本明細書中に記載の特定の接触および相互作用(水素結合の供与または受容など)が好ましいが、化合物のリボスイッチとの相互作用に不可欠ではないと理解すべきである。例えば、化合物は、開示の接触および相互作用を有する化合物よりも低い親和性および/または特異性でリボスイッチと相互作用することができる。さらに、化合物上の異なるまたはさらなる官能基は、新規、異なる、および/または相殺するリボスイッチとの接触を導入することができる。かかる官能基は、他のリボスイッチ部分を有することができるか、これを有し、接触し、相互作用するようにデザインすることができる。かかる接触および相互作用は、トリガー分子およびコア構造の接触および相互作用を相殺することができる。
D.構築物、ベクター、および発現系
開示のリボスイッチを、任意の適切な発現系と共に使用することができる。組換え発現を、通常、プラスミドなどのベクターを使用して行う。ベクターは、リボスイッチコード配列および発現するRNA(例えば、タンパク質をコードするRNA)に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。ベクターはまた、転写および翻訳に必要な他のエレメントを含むことができる。本明細書中で使用する場合、ベクターは、外因性DNAを含む任意のキャリアをいう。したがって、ベクターは、分解することなく細胞に外因性核酸を輸送する作用物質(agent)であり、送達された細胞中で核酸を発現させるプロモーターを含む。ベクターには、プラスミド、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。リボスイッチ調節構築物の輸送に適切な種々の原核生物および真核生物発現ベクターを産生することができる。かかる発現ベクターには、例えば、pET、pET3d、pCR2.1、pBAD、pUC、および酵母ベクターが含まれる。ベクターを、例えば、種々のin vivoおよびin vitro状況で使用することができる。
開示のリボスイッチを、任意の適切な発現系と共に使用することができる。組換え発現を、通常、プラスミドなどのベクターを使用して行う。ベクターは、リボスイッチコード配列および発現するRNA(例えば、タンパク質をコードするRNA)に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。ベクターはまた、転写および翻訳に必要な他のエレメントを含むことができる。本明細書中で使用する場合、ベクターは、外因性DNAを含む任意のキャリアをいう。したがって、ベクターは、分解することなく細胞に外因性核酸を輸送する作用物質(agent)であり、送達された細胞中で核酸を発現させるプロモーターを含む。ベクターには、プラスミド、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。リボスイッチ調節構築物の輸送に適切な種々の原核生物および真核生物発現ベクターを産生することができる。かかる発現ベクターには、例えば、pET、pET3d、pCR2.1、pBAD、pUC、および酵母ベクターが含まれる。ベクターを、例えば、種々のin vivoおよびin vitro状況で使用することができる。
ウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、AIDSウイルス、神経向性ウイルス(neuronal trophic virus)、シンドビスウイルスおよび他のRNAウイルス(HIVバックボーンを有するこれらのウイルスが含まれる)が含まれる。ベクターとしての使用が適切となるこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーも有用である。Verma(1985)に記載のレトロウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルス(Murine Maloney Leukemia virus)(MMLV)、およびベクターとしてMMLVの所望の性質を発現するレトロウイルスが含まれる。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、RNAポリメラーゼIII転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を調節するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作する場合、ウイルスは、典型的には、1つまたは複数の初期遺伝子を除去し、除去したウイルスDNAの代わりに遺伝子または遺伝子/プロモーターカセットをウイルスゲノム中に挿入する。
「プロモーター」は、一般に、転写開始部位に対して比較的固定した位置に存在する場合に機能するDNA配列である。「プロモーター」は、RNAポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。
「エンハンサー」は、一般に、転写開始部位から固定していない距離で機能し、転写単位に対して5’側(Laimins,1981)または3’側(Lusky et al.,1983)であり得るDNA配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロン内に存在することができ(Banerji et al.,1983)、コード配列自体の内部にも存在することができる(Osborne et al.,1984)。これらは、通常、10bp長と300bp長との間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近接するプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、プロモーターと同様に、転写調節を媒介する応答エレメントをしばしば含む。エンハンサーは、しばしば、発現調節を決定する。
真核生物宿主細胞(酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または有核細胞)で使用される発現ベクターはまた、mRNA発現に影響を及ぼし得る転写終結に必要な配列を含むことができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするmRNAの非翻訳部分中でポリアデニル化セグメントとして転写される。3’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位がポリアデニル化領域も含むことが好ましい。この領域の利点の1つは、転写単位がmRNAのようにプロセシングおよび輸送される可能性が増加することである。発現構築物中でのポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを導入遺伝子構築物中で使用することが好ましい。
ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含む。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達されたかどうか、および一旦送達されると発現するかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするE.Coli lacZ遺伝子である。
いくつかの実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであり得る。かかる選択可能なマーカーが宿主細胞に首尾よく導入された場合、形質転換された宿主細胞は選択圧下においた場合に生存することができる。2つの広く使用されている異なるカテゴリーの選択レジメが存在する。第1のカテゴリーは、細胞の代謝および補充培地と無関係に増殖する能力を欠く変異細胞の使用に基づく。第2のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームをいい、変異細胞系統の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を使用する。新規の遺伝子を有するそれらの細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択を生き抜く。かかる優性選択の例は、薬物であるネオマイシン(Southern and Berg,1982)、ミコフェノール酸(Mulligan and Berg,1980)、またはハイグロマイシン(Sugden et al.,1985)を使用する。
遺伝子材料(プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体であるが、これらに限定されない)の直接移入の使用またはカチオニックリポソームなどの細胞またはキャリア中の遺伝子材料の移入を介して、遺伝子を移入することができる。かかる方法は当該分野で周知であり、本明細書中に記載の方法での使用に容易に適応することができる。移入ベクターは、細胞に遺伝子を送達させるために使用される任意のヌクレオチド構築物(例えば、プラスミド)または一般的な遺伝子送達ストラテジーの一部(例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部)(Ram et al.Cancer Res.53:83−88,(1993))であり得る。適切なトランスフェクション手段(ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、または物理的機械的方法(エレクトロポレーションおよびDNAの直接拡散など)が含まれる)は、例えば、Wolff,J.A.,et al.,Science,247,1465−1468,(1990);and Wolff,J.A.Nature,352,815−818,(1991)に記載されている。
1.ウイルスベクター
好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、AIDSウイルス、神経向性ウイルス、シンドビスウイルスおよび他のRNAウイルス(HIVバックボーンを有するこれらのウイルスが含まれる)である。ベクターとしての使用が適切となるこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーも好ましい。好ましいレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)、およびベクターとしてMMLVの所望の性質を発現するレトロウイルスが含まれる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより高い遺伝子負荷量(すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子)を輸送することができ、この理由のために、一般的に使用されるベクターである。しかし、これらは、非増殖細胞で有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、作業が容易であり、高力価を有し、エアゾール処方物中で送達させることができ、非***細胞にトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは、巨大であり、いくつかの遺伝子挿入部位を有し、熱安定性を示し、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって誘発される宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターである。この型の好ましいベクターは、インターロイキン8または10のコード領域を保有する。
好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、AIDSウイルス、神経向性ウイルス、シンドビスウイルスおよび他のRNAウイルス(HIVバックボーンを有するこれらのウイルスが含まれる)である。ベクターとしての使用が適切となるこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーも好ましい。好ましいレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)、およびベクターとしてMMLVの所望の性質を発現するレトロウイルスが含まれる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより高い遺伝子負荷量(すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子)を輸送することができ、この理由のために、一般的に使用されるベクターである。しかし、これらは、非増殖細胞で有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、作業が容易であり、高力価を有し、エアゾール処方物中で送達させることができ、非***細胞にトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは、巨大であり、いくつかの遺伝子挿入部位を有し、熱安定性を示し、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって誘発される宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターである。この型の好ましいベクターは、インターロイキン8または10のコード領域を保有する。
ウイルスベクターは、細胞に遺伝子を導入するためのほとんどの化学的方法または物理的方法よりも高い処理能力(遺伝子導入能力)を有する。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、RNAポリメラーゼIII転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を調節するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作する場合、ウイルスは、典型的には、1つまたは複数の初期遺伝子を除去し、除去したウイルスDNAの代わりに遺伝子または遺伝子/プロモーターカセットをウイルスゲノム中に挿入する。この構築物型は、約8kbまでの外来遺伝子材料を保有することができる。除去された初期遺伝子の必要な機能を、典型的には、トランスで初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように操作された細胞系統によって供給される。
i.レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、レトロウイルス科のウイルスファミリー(任意の型、亜科、属、向性が含まれる)に属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般に、Verma,I.M.,Retroviral vectors for gene transfer.In Microbiology−1985,American Society for Microbiology,pp.229−232,Washington,(1985)(本明細書中で参考として援用される)に記載されている。遺伝子治療のためのレトロウイルスベクターの使用方法の例は、米国特許第4,868,116号および同第4,980,286号;PCT出願国際公開第90/02806号および国際公開第89/07136号;およびMulligan,(Science 260:926−932(1993))(その教示が本明細書中で参考として援用される)に記載されている。
レトロウイルスは、レトロウイルス科のウイルスファミリー(任意の型、亜科、属、向性が含まれる)に属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般に、Verma,I.M.,Retroviral vectors for gene transfer.In Microbiology−1985,American Society for Microbiology,pp.229−232,Washington,(1985)(本明細書中で参考として援用される)に記載されている。遺伝子治療のためのレトロウイルスベクターの使用方法の例は、米国特許第4,868,116号および同第4,980,286号;PCT出願国際公開第90/02806号および国際公開第89/07136号;およびMulligan,(Science 260:926−932(1993))(その教示が本明細書中で参考として援用される)に記載されている。
レトロウイルスは、本質的に、核酸カーゴ(nucleic acid cargo)に詰められたパッケージである。核酸カーゴは、パッケージングシグナルを保有し、これらのパッケージングシグナルは、複製された娘分子がパッケージコート内に効率的に詰められることを確実にする。パッケージシグナルに加えて、複製および複製されたウイルスのパッケージングのためにシスで必要な多数の分子が存在する。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与するgag、pol、およびenv遺伝子を含む。これは、典型的には標的細胞に移入される外来DNAと置換されるgag、pol、およびenv遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的には、パッケージコートへの組み込みのためのパッケージングシグナル、gag転写単位の開始をシグナル伝達する配列、逆転写に必要なエレメント(逆転写のtRNAプライマーに結合するプライマー結合部位が含まれる)、DNA合成中にRNA鎖のスイッチを導く末端反復配列、第2のDNA合成鎖の合成のためのプライミング部位としての機能を果たすプリンリッチ配列である5’→3’LTR、および宿主ゲノムに挿入するためのレトロウイルスのDNA状態を挿入することができるLTRの末端付近の特異的配列を含む。gag、pol、およびenv遺伝子の除去により、約8kbの外来配列がウイルスゲノムに挿入され、逆転写するようになり、複製の際に新規のレトロウイルス粒子に詰められる。この核酸量は、各転写物のサイズに応じて、1つから多数の遺伝子の送達に十分である。挿入物中に他の遺伝子と共に正または負の選択マーカーのいずれかを含めることが好ましい。
ほとんどのレトロウイルスベクター中の複製機構およびパッケージングタンパク質が除去されているので(gag、pol、およびenv)、典型的には、パッケージング細胞系統へのこれらの配置によってベクターを生成する。パッケージング細胞系統は、複製およびパッケージング機構を含むが、いかなるパッケージングシグナルも欠くレトロウイルスを使用してトランスフェクションまたは形質転換した細胞系統である。選択のDNAを保有するベクターをこれらの細胞系統にトランスフェクションする場合、目的の遺伝子を含むベクターを複製し、ヘルパー細胞によってシスで提供される機構によって新規のレトロウイルス粒子にパッケージングする。必要なシグナルを欠くので、この機構のゲノムはパッケージされない。
ii.アデノウイルスベクター
複製欠損アデノウイルスの構築は記載されている(Berkner et al., J.Virology 61:1213−1220(1987);Massie et al., Mol.Cell.Biol.6:2872−2883(1986);Haj−Ahmad et al., J.Virology 57:267−274(1986);Davidson et al., J.Virology 61:1226−1239(1987);Zhang ”Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome−mediated transfection and PCR analysis” BioTechniques 15:868−872(1993))。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利点は、これらのウイルスが最初の感染細胞内で複製することができるが新規の感染ウイルス粒子を形成できないので、他の細胞型に拡大することができる範囲が制限されていることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、CNS実質、および多数の他の組織部位への直接的なin vivo送達後に高効率の遺伝子移入を達成することが示されている(Morsy, J.Clin.Invest.92:1580−1586(1993);Kirshenbaum, J.Clin.Invest.92:381−387(1993);Roessler, J.Clin.Invest.92:1085−1092(1993);Moullier, Nature Genetics 4:154−159(1993);La Salle, Science 259:988−990(1993);Gomez−Foix, J.Biol.Chem.267:25129−25134(1992);Rich, Human Gene Therapy 4:461−476(1993);Zabner, Nature Genetics 6:75−83(1994);Guzman, Circulation Research 73:1201−1207(1993);Bout, Human Gene Therapy 5:3−10(1994);Zabner, Cell 75:207−216(1993);Caillaud, Eur.J.Neuroscience 5:1287−1291(1993);and Ragot, J.Gen.Virology 74:501−507(1993))。組換えアデノウイルスは、特異的細胞表面受容体への結合によって遺伝子形質導入を達成し、その後、野生型または複製欠損アデノウイルスと同一の様式で、受容体媒介エンドサイトーシスによってウイルスを内在化する (Chardonnet and Dales, Virology 40:462−477(1970);Brown and Burlingham,J.Virology 12:386−396(1973);Svensson and Persson, J.Virology 55:442−449(1985);Seth,et al., J.Virol. 51:650−655(1984);Seth,et al.,Mol.Cell.Biol. 4:1528−1533(1984);Varga et al., J.Virology 65:6061−6070(1991);Wickham et al., Cell 73:309−319(1993))。
複製欠損アデノウイルスの構築は記載されている(Berkner et al., J.Virology 61:1213−1220(1987);Massie et al., Mol.Cell.Biol.6:2872−2883(1986);Haj−Ahmad et al., J.Virology 57:267−274(1986);Davidson et al., J.Virology 61:1226−1239(1987);Zhang ”Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome−mediated transfection and PCR analysis” BioTechniques 15:868−872(1993))。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利点は、これらのウイルスが最初の感染細胞内で複製することができるが新規の感染ウイルス粒子を形成できないので、他の細胞型に拡大することができる範囲が制限されていることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、CNS実質、および多数の他の組織部位への直接的なin vivo送達後に高効率の遺伝子移入を達成することが示されている(Morsy, J.Clin.Invest.92:1580−1586(1993);Kirshenbaum, J.Clin.Invest.92:381−387(1993);Roessler, J.Clin.Invest.92:1085−1092(1993);Moullier, Nature Genetics 4:154−159(1993);La Salle, Science 259:988−990(1993);Gomez−Foix, J.Biol.Chem.267:25129−25134(1992);Rich, Human Gene Therapy 4:461−476(1993);Zabner, Nature Genetics 6:75−83(1994);Guzman, Circulation Research 73:1201−1207(1993);Bout, Human Gene Therapy 5:3−10(1994);Zabner, Cell 75:207−216(1993);Caillaud, Eur.J.Neuroscience 5:1287−1291(1993);and Ragot, J.Gen.Virology 74:501−507(1993))。組換えアデノウイルスは、特異的細胞表面受容体への結合によって遺伝子形質導入を達成し、その後、野生型または複製欠損アデノウイルスと同一の様式で、受容体媒介エンドサイトーシスによってウイルスを内在化する (Chardonnet and Dales, Virology 40:462−477(1970);Brown and Burlingham,J.Virology 12:386−396(1973);Svensson and Persson, J.Virology 55:442−449(1985);Seth,et al., J.Virol. 51:650−655(1984);Seth,et al.,Mol.Cell.Biol. 4:1528−1533(1984);Varga et al., J.Virology 65:6061−6070(1991);Wickham et al., Cell 73:309−319(1993))。
好ましいウイルスベクターは、E1遺伝子が除去されたアデノウイルスに基づいたウイルスベクターであり、これらのヴィロン(viron)をヒト293細胞系統などの細胞系統中で生成する。別の好ましい実施形態では、E1およびE3遺伝子の両方をアデノウイルスゲノムから除去する。
別のウイルスベクター型は、アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づく。この欠損パルボウイルスは、多数の細胞型に感染することができ、ヒトに非病原性を示すので、好ましいベクターである。AAV型ベクターは、約4〜5kbを輸送することができ、野生型AAVは、第19染色体に安定に挿入されることが公知である。この部位特異的組み込み特性を含むベクターが好ましい。このベクター型の特に好ましい実施形態は、Avigen,San Francisco,CA製のP4.1 Cベクターである。これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、HSV−tk、および/またはマーカー遺伝子(緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子など)を含むことができる。
ウイルスおよびレトロウイルス中の挿入遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の調節を補助するためのプロモーターおよび/またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定した位置に存在する場合に機能する配列またはDNA配列である。プロモーターは、RNAポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。
2.ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を調節する好ましいプロモーターを、種々の供給源(例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスゲノム)、または非相同哺乳動物プロモーター(例えば、βアクチンプロモーター)から得ることができる。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターを、SV40ウイルス複製起点も含むSV40制限フラグメントとして得ることが都合が良い(Fiers et al.,Nature,273: 113(1978))。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターを、HindIII E制限フラグメントとして得ることが都合が良い(Greenway,P.J.et al.,Gene 18: 355−360(1982))。勿論、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本明細書中で有用である。
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を調節する好ましいプロモーターを、種々の供給源(例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスゲノム)、または非相同哺乳動物プロモーター(例えば、βアクチンプロモーター)から得ることができる。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターを、SV40ウイルス複製起点も含むSV40制限フラグメントとして得ることが都合が良い(Fiers et al.,Nature,273: 113(1978))。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターを、HindIII E制限フラグメントとして得ることが都合が良い(Greenway,P.J.et al.,Gene 18: 355−360(1982))。勿論、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本明細書中で有用である。
エンハンサーは、一般に、転写開始部位から固定していない距離で機能し、転写単位に対して5’側(Laimins,L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.78: 993(1981))または3’側(Lusky,M.L.,et al.,Mol.Cell Bio.3: 1108(1983))のいずれかであり得るDNA配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロン内に存在することができ(Banerji,J.L.et al.,Cell 33: 729(1983))、ならびにコード配列自体の内部にも存在することができる(Osborne,T.F.,et al.,Mol.Cell Bio.4: 1293(1984))。これらは、通常、10bp長と300bp長との間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近接するプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、転写調節を媒介する応答エレメントをしばしば含む。プロモーターはまた、転写調節を媒介する応答エレメントを含む。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現調節を決定する。哺乳動物遺伝子由来の多数のエンハンサー配列が現在知られているが(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン)、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(bp100〜270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
プロモーターおよび/またはエンハンサーを、その機能を誘発する軽度または特異的な化学事象のいずれかによって特異的に活性化することができる。系を、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節することができる。ガンマ線照射などの照射への曝露またはアルキル化化学療法薬によってウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法も存在する。
プロモーターおよび/またはエンハンサー領域が全ての真核細胞型で活性であることが好ましい。この型の好ましいプロモーターは、CMVプロモーター(650塩基)である。他の好ましいプロモーターは、SV40プロモーター、サイトメガロウイルス(全長プロモーター)、およびレトロウイルスベクターLTFである。
全ての特異的調節エレメントをクローン化し、これを使用して、黒色腫細胞などの特定の細胞型で選択的に発現する発現ベクターを構築することができることが示されている。グリア線維酸性タンパク質(glial fibrillary acetic protein)(GFAP)プロモーターを使用して、神経膠起源の細胞中の遺伝子が選択的に発現されている。
真核生物宿主細胞(酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または有核細胞)で使用される発現ベクターはまた、mRNA発現に影響を及ぼし得る転写終結に必要な配列を含むことができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするmRNAの非翻訳部分中でポリアデニル化セグメントとして転写される。3’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位がポリアデニル化領域も含むことが好ましい。この領域の利点の1つは、転写単位がmRNAのようにプロセシングおよび輸送される可能性が増加することである。発現構築物中でのポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを導入遺伝子構築物中で使用することが好ましい。転写単位の好ましい実施形態では、ポリアデニル化領域は、SV40初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約400塩基からなる。転写された単位は、他の標準的な配列のみを含むか、上記配列と組み合わせて構築物からの発現または構築物の安定性を改善することも好ましい。
3.マーカー
ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達され、一旦送達されると発現するかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするE.Coli lacZ遺伝子である。
ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達され、一旦送達されると発現するかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするE.Coli lacZ遺伝子である。
いくつかの実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであり得る。哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログG418、ヒドロマイシン(hydromycin)、およびピューロマイシンである。かかる選択可能なマーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移入された場合、形質転換された哺乳動物宿主細胞は選択圧下においた場合に生存することができる。2つの広く使用されている異なるカテゴリーの選択レジメが存在する。第1のカテゴリーは、細胞の代謝および補充培地と無関係に増殖する能力を欠く変異細胞系統の使用に基づく。2つの例は以下である:CHO DHFR−細胞およびマウスLTK−細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素を添加せずに増殖する能力を欠く。これらの細胞が完全なヌクレオチド合成経路に必要な一定の遺伝子を欠くので、これらの細胞は、補充培地中に欠けているヌクレオチドを供給しない限り生存できない。培地の補充の代替は、インタクトなDHFR遺伝子またはTK遺伝子を各遺伝子を欠く細胞に導入し、それによってその増殖要件を変化させることである。DHFR遺伝子またはTK遺伝子で形質転換しなかった各細胞は、非補充培地で生存できない。
第2のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームをいい、変異細胞系統の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を使用する。薬物耐性を伝達するタンパク質を発現する細胞は、選択を生き抜く。かかる優性選択の例は、薬物であるネオマイシン(Southern P.and Berg,P.,J.Molec.Appl.Genet.1: 327(1982))、ミコフェノール酸(Mulligan,R.C.and Berg,P.Science 209: 1422(1980))、またはハイグロマイシン(Sugden,B.et al.,Mol.Cell.Biol.5: 410−413(1985))を使用する。3つの例は、真核生物調節下で細菌遺伝子を使用して、適切な薬物G418もしくはネオマイシン(ジェネテシン)、xgpt(ミコフェノール酸)、またはハイグロマイシンに対する耐性を伝達する。他には、ネオマイシンアナログG418およびピューラマイシン(puramycin)が含まれる。
E.バイオセンサーリボスイッチ
バイオセンサーリボスイッチも開示する。バイオセンサーリボスイッチは、その同系トリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを生成する操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、トリガー分子の閾値レベル以上で誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、in vivoまたはin vitroで使用するためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかその生成に関与するタンパク質をコードするレポーターRNAに作動可能に連結されたサイクリックジGMPバイオセンサーリボスイッチを、サイクリックジGMPリボスイッチ/レポーターRNAをコードする核酸構築物を保有するように細胞または生物を操作することによってin vivoで使用することができる。in vitroで使用するためのバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識を含むリボスイッチであり、この標識由来のシグナルは、リボスイッチの活性化状態に応じて変化する。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するかこれから誘導されるアプタマードメイン(サイクリックジGMPなど)を使用する。
バイオセンサーリボスイッチも開示する。バイオセンサーリボスイッチは、その同系トリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを生成する操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、トリガー分子の閾値レベル以上で誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、in vivoまたはin vitroで使用するためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかその生成に関与するタンパク質をコードするレポーターRNAに作動可能に連結されたサイクリックジGMPバイオセンサーリボスイッチを、サイクリックジGMPリボスイッチ/レポーターRNAをコードする核酸構築物を保有するように細胞または生物を操作することによってin vivoで使用することができる。in vitroで使用するためのバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識を含むリボスイッチであり、この標識由来のシグナルは、リボスイッチの活性化状態に応じて変化する。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するかこれから誘導されるアプタマードメイン(サイクリックジGMPなど)を使用する。
F.レポータータンパク質およびペプチド
リボスイッチの活性化の評価またはバイオセンサーリボスイッチの評価のために、レポータータンパク質またはペプチドを使用することができる。レポータータンパク質またはペプチドをRNAによってコードすることができ、その発現はリボスイッチによって調節される。実施例は、いくつかの特異的レポータータンパク質の使用を記載している。レポータータンパク質およびペプチドの使用は周知であり、リボスイッチとの使用のために容易に適応することができる。レポータータンパク質は、検出することができるか検出可能なシグナルを産生する任意のタンパク質またはペプチドであり得る。好ましくは、タンパク質またはペプチドの存在を、標準的な技術(例えば、放射免疫アッセイ、放射性標識、免疫アッセイ、酵素活性のためのアッセイ、吸光度、蛍光、発光、およびウェスタンブロット)を使用して検出することができる。より好ましくは、レポータータンパク質レベルを、低レベルでさえも、標準的な技術を使用して容易に定量可能である。有用なレポータータンパク質には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、およびそれらの誘導体(Photinus pyralis由来のホタルルシフェラーゼ(FL)およびRenilla reniformis由来のウミシイタケルシフェラーゼ(RL)など)が含まれる。
リボスイッチの活性化の評価またはバイオセンサーリボスイッチの評価のために、レポータータンパク質またはペプチドを使用することができる。レポータータンパク質またはペプチドをRNAによってコードすることができ、その発現はリボスイッチによって調節される。実施例は、いくつかの特異的レポータータンパク質の使用を記載している。レポータータンパク質およびペプチドの使用は周知であり、リボスイッチとの使用のために容易に適応することができる。レポータータンパク質は、検出することができるか検出可能なシグナルを産生する任意のタンパク質またはペプチドであり得る。好ましくは、タンパク質またはペプチドの存在を、標準的な技術(例えば、放射免疫アッセイ、放射性標識、免疫アッセイ、酵素活性のためのアッセイ、吸光度、蛍光、発光、およびウェスタンブロット)を使用して検出することができる。より好ましくは、レポータータンパク質レベルを、低レベルでさえも、標準的な技術を使用して容易に定量可能である。有用なレポータータンパク質には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、およびそれらの誘導体(Photinus pyralis由来のホタルルシフェラーゼ(FL)およびRenilla reniformis由来のウミシイタケルシフェラーゼ(RL)など)が含まれる。
G.高次構造依存性標識
高次構造依存性標識は、標識が会合した分子または化合物(リボスイッチなど)の形態または高次構造の変化に基づいて蛍光強度または波長が変化する全ての標識をいう。プローブおよびプライマーとの関係において使用される高次構造依存性標識の例には、分子ビーコン、アンプリフォー(Amplifluor)、FRETプローブ、切断性FRETプローブ、TaqManプローブ、スコーピオンプライマー、蛍光三重鎖オリゴ(fluorescent triplex oligo)(三重鎖分子ビーコンまたは三重鎖FRETプローブが含まれるが、これらに限定されない)、蛍光水溶性複合ポリマー、PNAプローブ、およびQPNAプローブが含まれる。かかる標識を、特に、その機能の原理を、リボスイッチと共に使用するために適応させることができる。いくつかの高次構造依存性標識型は、Schweitzer and Kingsmore,Curr.Opin.Biotech.12:21−27(2001)中に概説されている。
高次構造依存性標識は、標識が会合した分子または化合物(リボスイッチなど)の形態または高次構造の変化に基づいて蛍光強度または波長が変化する全ての標識をいう。プローブおよびプライマーとの関係において使用される高次構造依存性標識の例には、分子ビーコン、アンプリフォー(Amplifluor)、FRETプローブ、切断性FRETプローブ、TaqManプローブ、スコーピオンプライマー、蛍光三重鎖オリゴ(fluorescent triplex oligo)(三重鎖分子ビーコンまたは三重鎖FRETプローブが含まれるが、これらに限定されない)、蛍光水溶性複合ポリマー、PNAプローブ、およびQPNAプローブが含まれる。かかる標識を、特に、その機能の原理を、リボスイッチと共に使用するために適応させることができる。いくつかの高次構造依存性標識型は、Schweitzer and Kingsmore,Curr.Opin.Biotech.12:21−27(2001)中に概説されている。
ステム消光標識(stem quenched label)(高次構造依存性標識の一形態)は、ステム構造を形成する場合に標識からの蛍光が消光されるように消光部分が近接するような核酸上に配置された蛍光標識である。ステムが破壊される場合(標識を含むリボスイッチが活性化する場合など)、消光部分はもはや蛍光標識に近接せず、蛍光が増加する。この効果の例を、分子ビーコン、蛍光三重鎖オリゴ、三重鎖分子ビーコン、三重鎖FRETプローブ、およびQPNAプローブで見出すことができ、その操作原理をリボスイッチと共に使用するために適応させることができる。
ステム活性化標識(高次構造依存性標識の一形態)は、ステム構造の形成によって蛍光が増加するか変化する標識または標識対である。ステム活性化標識には、受容体および供与体が近接する場合(標識を含む核酸鎖がステム構造を形成する場合)に供与体から受容体への蛍光共鳴エネルギー転移によって受容体が蛍光を発するような受容体蛍光標識および供与体部分が含まれ得る。ステム活性化標識は、典型的には、核酸分子中でステム構造を形成する場合に受容体および供与体が近接するような核酸分子(リボスイッチなど)上に配置された標識対である。ステム活性化標識の供与体部分自体が蛍光標識である場合、この標識は、受容体に近接しない場合(すなわち、ステム構造を形成しない場合)に蛍光(典型的には、受容体の蛍光よりも異なる波長で)としてエネルギーを放出することができる。ステム構造を形成する場合、全体的な効果としては、供与体蛍光が減少し、受容体蛍光が増加する。FRETプローブはステム活性化標識の使用例であり、その操作上の原理をリボスイッチと共に使用するために適応することができる。
H.検出標識
リボスイッチの活性化、非活性化、もしくは遮断、またはリボスイッチの活性化、非活性化、もしくは遮断の際に産生された核酸またはタンパク質の発現の検出および定量を補助するために、検出標識を、検出プローブまたは検出分子に組み込むか、発現した核酸またはタンパク質に直接組み込むことができる。本明細書中で使用する場合、検出標識は、核酸またはタンパク質と直接または間接的に会合することができ、それにより、測定可能な検出シグナルが直接的または間接的のいずれかで得られる任意の分子である。多数のかかる標識は、当業者に公知である。開示の方法での使用に適切な検出標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体、およびリガンドである。
リボスイッチの活性化、非活性化、もしくは遮断、またはリボスイッチの活性化、非活性化、もしくは遮断の際に産生された核酸またはタンパク質の発現の検出および定量を補助するために、検出標識を、検出プローブまたは検出分子に組み込むか、発現した核酸またはタンパク質に直接組み込むことができる。本明細書中で使用する場合、検出標識は、核酸またはタンパク質と直接または間接的に会合することができ、それにより、測定可能な検出シグナルが直接的または間接的のいずれかで得られる任意の分子である。多数のかかる標識は、当業者に公知である。開示の方法での使用に適切な検出標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体、およびリガンドである。
適切な蛍光標識の例には、イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)、5,6−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル(NBD)、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、アミノ−メチルクマリン(AMCA)、エオシン、エリスロシン、BODIPY(登録商標)、カスケードブルー(登録商標)、オレゴングリーン(登録商標)、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、クォンタムダイTM(quantum dyeTM)などのランタニドイオンの大環状キレート、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体などの蛍光エネルギー転移染料、ならびにシアニン染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5およびCy7が含まれる。他の特定の蛍光標識の例には、3−ヒドロキシピレン5,8,10−トリスルホン酸、5−ヒドロキシトリプタミン(5−HT)、酸性フクシン、アリザリンコンプレクソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、ステアリン酸アントロイル(anthroyl stearate)、アストラゾンブリリアントレッド4G、アストラゾンオレンジR、アストラゾンレッド6B、アストラゾンイエロー7GLL、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン、オーロホスフィンG、BAO9(ビスアミノフェニルオキサジアゾール)、BCECF、硫酸ベルベリン、ビスベンズアミド、ブランコホルFFG溶液、ブランコホルSV、ボディピー F1(Bodipy F1)、ブリリアントスルホフラビンFF、カルカインブルー(calcien blue)、カルシウムグリーン、カルコフロールRW溶液、カルコフロールホワイト、カルコホールホワイトABT溶液、カルコホールスタンダード溶液、カルボスチリル、カスケードイエロー、カテコールアミン、キナクリン(chinacrine)、コリホスフィンO、クマリン−ファロイジン、CY3.1 8、CY5.1 8、CY7、ダンス(1−ジメチルアミノナファリン5スルホン酸)、ダンサ(ジアミノナフチルスルホン酸)、ダンシルNH−CH3、ジアミノフェニルオキシジアゾール(DAO)、ジメチルアミノ−5−スルホン酸、ジピロメテンホウ素二フッ化物(dipyrrometheneboron difluoride)、ジフェニルブリリアントフラビン7GFF、ドーパミン、エリスロシンITC、オイクリシン、FIF(ホルムアルデヒド誘導蛍光)、フラゾオレンジ、フルオ3、フルオレスカミン、フラ−2、ゲナクリルブリリアントレッドB、ゲナクリルブリリアントイエロー10GF、ゲナクリルピンク3G、ゲナクリルイエロー5GF、gloxalic acid、グラニュラーブルー、ヘマトポルフィリン、インド−1、イントラホワイトCf液、リューコフォーPAF(Leucophor PAF)、リューコフォーSF、リューコフォーWS、リサミンローダミンB200(RD200)、ルシフェルイエローCH、ルシフェルイエローVS、マグダラレッド、マリーナブルー、マキシロンブリリアントフラビン10GFF、マキシロンブリリアントフラビン8GFF、MPS(メチルグリーンピロニンスチルベン)、ミトラマイシン、NBDアミン、ニトロベンゾキサジドール、ノルアドレナリン、ヌクレアーファストレッド、ヌクレアーイエロー、ナイロサンブリリアントフラビンE8G、オキサジアゾール、パシフィックブルー、パラローザニリン(ホイルゲン)、ホルウィットAR溶液、ホルウィットBKL、ホルウィットRev、ホルウィットRPA、ホスフィン3R、フタロシアニン、フィコエリトリンR、ポリアザインダセンポントクロームブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオンイエロー、ピロニン、ピロニンB、ピロザールブリリアントフラビン7GF、キナクリンマスタード、ローダミン123、ローダミン5GLD、ローダミン6G、ローダミンB、ローダミンB200、ローダミンBエキストラ、ローダミンBB、ローダミンBG、ローダミンWT、セロトニン、セブロンブリリアントレッド2B、セブロンブリリアントレッド4G、セブロンブリリアントレッドB、セブロンオレンジ、セブロンイエローL、SITS(プリムリン)、SITS(スチルベンイソチオスルホン酸)、スチルベン、スナーフ1、スルホローダミンB Can C、スルホローダミンGエキストラ、テトラサイクリン、チアジンレッドR、チオフラビンS、チオフラビンTCN、チオフラビン5、チオライト、チオゾールオレンジ、チノポールCBS、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンB、ユビテックスSFC、キシレンオレンジ、およびXRITCが含まれる。
有用な蛍光標識は、フルオレセイン(5−カルボキシフルオレセイン−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)、ローダミン(5,6−テトラメチルローダミン)、ならびにシアニン染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5およびCy7である。これらの蛍光体の吸収および発光の極大は、FITC(490nm;520nm)、Cy3(554nm;568nm)、Cy3.5(581nm;588nm)、Cy5(652nm:672nm)、Cy5.5(682nm;703nm)およびCy7(755nm;778nm)であり、したがって、同時検出が可能である。フルオレセイン染料の他の例には、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、2’,4’,1,4,−テトラクロロフルオレセイン(TET)、2’,4’,5’,7’,1,4−ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、2’,7’−ジメトキシ−4’,5’−ジクロロ−6−カルボキシローダミン(JOE)、2’−クロロ−5’−フルオロ−7’,8’−融合フェニル−1,4−ジクロロ−6−カルボキシフルオレセイン(NED)および2’−クロロ−7’−フェニル−1,4−ジクロロ−6−カルボキシフルオレセイン(VIC)が含まれる。蛍光標識は、種々の商業供給者(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ;Molecular Probes,Eugene,OR;およびResearch Organics,Cleveland,Ohioが含まれる)から得ることができる。
目的とするさらなる標識には、それらが関連するプローブが標的分子に特異的に結合する場合にのみシグナルを提供するものが含まれ、かかる標識には、Tyagi & Kramer,Nature Biotechnology(1996)14:303および欧州特許第0070685 B1号に記載の「分子ビーコン」が含まれる。目的とする他の標識には、米国特許第5,563,037号、国際公開第97/17471号、および国際公開第97/17076号に記載されているものが含まれる。
標識ヌクレオチドは、合成の間に発現核酸へ直接組み込むための検出標識の有用な形態である。核酸に組み込むことができる検出標識の例には、BrdUrd(5−ブロモデオキシウリジン、Hoy and Schimke,Mutation Research 290:217−230(1993))、アミノアリルデオキシウリジン(Henegariu et al.,Nature Biotechnology 18:345−348(2000))、5−メチルシトシン(Sano et al.,Biochim.Biophys.Acta 951:157−165(1988))、ブロモウリジン(Wansick et al.,J.Cell Biology 122:283−293(1993))などのヌクレオチドアナログ、およびビオチン(Langer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:6633(1981))またはジゴキシゲニン(digoxygenin)(Kerkhof,Anal.Biochem.205:359−364(1992))などの適切なハプテンで改変したヌクレオチドが含まれる。適切な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネートdUTP、シアニン−3−dUTPおよびシアニン−5−dUTPである(Yu et al.,Nucleic Acids Res.,22:3226−3232(1994))。DNAに好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、BrdUrd(ブロモデオキシウリジン、BrdUrd、BrdU、BUdR、Sigma−Aldrich Co)である。検出標識のDNAへの組み込みに有用な他のヌクレオチドアナログは、AA−dUTP(アミノアリル−デオキシウリジントリホスフェート、Sigma−Aldrich Co.)および5−メチル−dCTP(Roche Molecular Biochemicals)である。検出標識のRNAへの組み込みに有用なヌクレオチドアナログは、ビオチン−16−UTP(ビオチン−16−ウリジン−5’−トリホスフェート、Roche Molecular Biochemicals)である。フルオレセイン、Cy3およびCy5は、直接標識のためにdUTPに結合することができる。Cy3.5およびCy7は、ビオチン−またはジゴキシゲニン標識プローブの二次検出用のアビジンまたは抗ジゴキシゲニン結合体として利用可能である。
ビオチンなどの核酸に組み込まれる検出標識を、その後に当該技術で周知の感度のよい方法を使用して検出することができる。例えば、ビオチンは、ビオチンに結合しているストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体(Tropix,Inc.)を使用して検出することができ、その後に適切な基質(例えば、化学発光基質CSPD:3−(4−メトキシスピロ−〔1,2,−ジオキセタン−3−2’−(5’−クロロ)トリシクロ〔3.3.1.13,7〕デカン〕−4−イル)フェニルリン酸二ナトリウム;Tropix,Inc.)の化学発光により検出することができる。標識はまたは、例えば、化学シグナル増幅により、または発光シグナルを生じる酵素(例えば、化学発光1,2−ジオキセタン基質)もしくは蛍光シグナルを生じる酵素への基質を使用することにより検出することができる、アルカリホスファターゼ、ダイズペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびポリメラーゼなどの酵素であり得る。
2個以上のこれらの検出標識を組み合わせる分子も検出標識と見なされる。既知の検出標識のいずれかを、開示されているプローブ、タグ、分子、および方法と共に使用して、開示の方法で産生された活性化または非活性化リボスイッチ、または核酸、またはタンパク質を標識および検出することができる。検出標識により生成されたシグナルを検出および測定する方法も、当業者に公知である。例えば、放射性同位体を、シンチレーションカウンティングまたは直接可視化により検出することができ、蛍光分子を、蛍光分光光度計を使用して検出することができ、リン光分子を、分光光度計またはカメラによる直接可視化により検出することができ、酵素を、酵素により触媒された反応の産物の検出または可視化により検出することができ、抗体を、抗体に結合した二次検出標識を検出することによって検出することができる。本明細書で使用する場合、検出分子は、検出する化合物または組成物と相互作用し、1つまたは複数の検出標識をカップリングする分子である。
I.配列類似性
本明細書中で考察するように、用語相同性および同一性の使用は類似性と同一であることを意味すると理解される。したがって、例えば、用語相同性を2配列間(例えば、非天然配列)で使用する場合、これは必ずしもこれら2配列間の進化的関係を示しているわけではなく、むしろ、それらの核酸配列間の類似性または関連性に注目していると理解される。2つの進化的に関連した分子間の相同性の多数の決定方法を、これらが進化的に関連するかどうかと無関係に、配列類似性を測定するために任意の2つ以上の核酸またはタンパク質に日常的に適用する。
本明細書中で考察するように、用語相同性および同一性の使用は類似性と同一であることを意味すると理解される。したがって、例えば、用語相同性を2配列間(例えば、非天然配列)で使用する場合、これは必ずしもこれら2配列間の進化的関係を示しているわけではなく、むしろ、それらの核酸配列間の類似性または関連性に注目していると理解される。2つの進化的に関連した分子間の相同性の多数の決定方法を、これらが進化的に関連するかどうかと無関係に、配列類似性を測定するために任意の2つ以上の核酸またはタンパク質に日常的に適用する。
一般に、本明細書中に開示のリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子、およびタンパク質の任意の公知の改変体および誘導体または生じ得るものを定義する1つの方法は、公知の特異的配列に対する相同性に関する改変体および誘導体の定義によると理解される。本明細書中に開示の特定の配列のこの同一性も、本明細書中の他所で考察する。一般に、本明細書中に開示のリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子、およびタンパク質の改変体は、典型的には、定められた配列または天然配列に対して少なくとも約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99%の相同性を有する。当業者は、2つのタンパク質または核酸(遺伝子など)の相同性の決定方法を容易に理解する。例えば、相同性がその最高レベルとなるような2つの配列のアラインメント後に相同性を計算することができる。
相同性の別の計算方法を、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための最適な配列アラインメントを、Smith and Waterman Adv.Appl.Math.2:482(1981)の局所的相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch,J.MoL Biol.48:443(1970)の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988)の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WIのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または調査によって行うことができる。
例えば、Zuker,M.Science 244:48−52,1989,Jaeger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:7706−7710,1989,Jaeger et al.Methods Enzymol.183:281−306,1989(少なくとも核酸アラインメントに関する材料について本明細書中で参考として援用される)に開示のアルゴリズムによって、核酸についての同型の相同性を得ることができる。典型的には任意の方法を使用することができると理解され、場合によってはこれらの種々の方法の結果が異なり得ると理解されるが、当業者は、これらの方法の少なくとも1つを使用して同一性を見出す場合、配列は定められた同一性を有するといわれると理解する。
例えば、本明細書中で使用する場合、別の配列に対して特定の相同率を有するものとして列挙される配列は、1つまたは複数の上記の計算方法のいずれかによって計算した列挙した相同性を有する配列をいう。例えば、本明細書中で定義するように、Zuker計算法を使用して第1の配列が第2の配列に対して80%相同性を有すると計算される場合、任意の他の計算法によって計算した場合に第1の配列が第2の配列に対して80%相同性を持たない場合でさえ、第1の配列は第2の配列に対して80%相同性を有する。別の例として、本明細書中で定義するように、Zuker計算法およびPearson and Lipman計算法の両方を使用して第1の配列が第2の配列に対して80%相同性を有すると計算される場合、Smith and Watermanの計算法、Needleman and Wunschの計算法、Jaegerの計算法、または任意の他の計算法によって計算した場合に第1の配列が第2の配列に対して80%相同性を持たない場合でさえ、第1の配列は第2の配列に対して80%相同性を有する。さらに別の例として、本明細書中で定義するように、各計算法を使用して第1の配列が第2の配列に対して80%相同性を有すると計算される場合、第1の配列は第2の配列に対して80%相同性を有する(しかし、実際には、異なる計算法により、しばしば、異なる相同率の計算値が得られる)。
J.ハイブリッド形成および選択的ハイブリッド形成
用語「ハイブリッド形成」は、典型的には、少なくとも2つの核酸分子(プライマーまたはプローブとリボスイッチまたは遺伝子など)の間の配列駆動相互作用を意味する。配列駆動相互作用は、2つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体の間でヌクレオチド特異的様式にて起こる相互作用を意味する。例えば、Cと相互作用するGまたはTと相互作用するAは、配列駆動相互作用である。典型的には、配列駆動相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面またはフーグスティーン面上で起こる。2つの核酸のハイブリッド形成は、当業者に公知の多数の条件およびパラメータに影響を受ける。例えば、塩濃度、pH、および反応温度の全てが2つの核酸分子がハイブリッド形成するかどうかに影響を及ぼす。
用語「ハイブリッド形成」は、典型的には、少なくとも2つの核酸分子(プライマーまたはプローブとリボスイッチまたは遺伝子など)の間の配列駆動相互作用を意味する。配列駆動相互作用は、2つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体の間でヌクレオチド特異的様式にて起こる相互作用を意味する。例えば、Cと相互作用するGまたはTと相互作用するAは、配列駆動相互作用である。典型的には、配列駆動相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面またはフーグスティーン面上で起こる。2つの核酸のハイブリッド形成は、当業者に公知の多数の条件およびパラメータに影響を受ける。例えば、塩濃度、pH、および反応温度の全てが2つの核酸分子がハイブリッド形成するかどうかに影響を及ぼす。
2つの核酸分子間の選択的ハイブリッド形成のパラメータは、当業者に周知である。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件を、ストリンジェントなハイブリッド形成条件と定義することができる。例えば、ハイブリッド形成のストリンジェンシーを、ハイブリッド形成工程および洗浄工程のいずれかまたは両方の温度および塩濃度の両方によって調節する。例えば、選択的ハイブリッド形成を達成するためのハイブリッド形成条件は、高イオン強度溶液(6×SSCまたは6×SSPE)中でTm(分子の半分がそのハイブリッド形成パートナーから解離する融点)より約12〜25℃低い温度でのハイブリッド形成およびそれに続く洗浄温度がTmより約5℃〜20℃低いように選択された温度と塩濃度との組み合わせによる洗浄を含むことができる。温度および塩条件は、フィルター上に固定した参照DNAサンプルを目的の標識核酸とハイブリッド形成させ、次いで、異なるストリンジェンシー条件下で洗浄する予備実験において実験的に容易に決定される。ハイブリッド形成温度は、典型的には、DNA−RNAおよびRNA−RNAハイブリッド形成についてはより高い。上記の条件または当該分野で公知の条件を使用して、ストリンジェンシーを達成することができる(Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989;Kunkel et al.Methods Enzymol.1987:154:367,1987(少なくとも核酸のハイブリッド形成に関連する材料について本明細書中で参考として援用される))。DNA:DNAハイブリッド形成のための好ましいストリンジェントなハイブリッド形成条件は、約68°C(水溶液中)の6×SSCまたは6×SSPEおよびそれに続く68℃での洗浄であり得る。ハイブリッド形成および洗浄のストリンジェンシーを、必要に応じて、所望の相補度が減少するのに合わせて、さらに、変動性が検索される任意の領域のG−CまたはA−Tの豊富さに応じて減少させることができる。同様に、ハイブリッド形成および洗浄のストリンジェンシーを、必要に応じて、所望の相同性が増加するのに合わせて、さらに、高相同性が望まれる任意の領域のG−CまたはA−Tの豊富さに応じて増加させることができ、これらは全て当該分野で公知である。
別の選択的ハイブリッド形成を定義する方法は、他の核酸に結合した核酸の1つの量(比率)の検索による。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%の制限核酸が非制限核酸に結合する場合である。典型的には、非制限核酸は、例えば、10、または100、または1000倍過剰である。このアッセイ型を、制限核酸および非制限核酸の両方が、例えば、それらのkdよりも10倍、または100倍、または1000倍を下回る条件下、または核酸分子の一方のみが10倍、または100倍、または1000倍である条件下、または核酸分子の一方または両方がそれらのkdを超える条件下で行うことができる。
別の選択的ハイブリッド形成を定義する方法は、所望の酵素操作を促進するためにハイブリッド形成が必要な条件下で酵素的に操作される核酸の比率の検索による。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%の核酸が、酵素操作を促進する条件下で酵素的に操作される場合である。例えば、酵素操作がDNA伸長である場合、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%の核酸分子が伸長される場合である。好ましい条件には、製造者によって示唆される条件または当該分野で操作を実行する酵素に適切であることが示された条件も含まれる。
相同性と同様に、2つの核酸分子の間のハイブリッド形成レベルを決定するための本明細書中に開示の種々の方法が多数存在すると理解される。これらの方法および条件により、2つの核酸分子間で異なる比率でハイブリッド形成を提供し得るが、他で示さない限り、任意の方法のパラメータを満たすことで十分であると理解される。例えば、80%ハイブリッド形成が必要である場合、およびこれらの方法のいずれか1つにおける必要なパラメータ内でハイブリッド形成が起こる限り、本明細書中に開示されると見なされる。
当業者は、組成物または方法が集合的または単独にハイブリッド形成の決定のためのこれらの基準のうちのいずれか1つを満たす場合、この組成物または方法は本明細書中に開示される組成物または方法であると理解すると理解される。
K.核酸
核酸ベースである種々の分子(例えば、リボスイッチ、アプタマー、ならびにリボスイッチおよびアプタマーをコードする核酸が含まれる)を本明細書中に開示する。開示の核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換物から構成され得る。これらの分子および他の分子の制限されない例は、本明細書中に述べられている。例えば、ベクターを細胞中で発現する場合、発現したmRNAは、典型的には、A、C、G、およびUから構成されると理解される。同様に、例えば、外因性送達によって核酸分子を細胞または細胞環境に導入する場合、細胞環境下で核酸分子の分解を減少させるヌクレオチドアナログから核酸分子が構成されることが有利であると理解される。
核酸ベースである種々の分子(例えば、リボスイッチ、アプタマー、ならびにリボスイッチおよびアプタマーをコードする核酸が含まれる)を本明細書中に開示する。開示の核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換物から構成され得る。これらの分子および他の分子の制限されない例は、本明細書中に述べられている。例えば、ベクターを細胞中で発現する場合、発現したmRNAは、典型的には、A、C、G、およびUから構成されると理解される。同様に、例えば、外因性送達によって核酸分子を細胞または細胞環境に導入する場合、細胞環境下で核酸分子の分解を減少させるヌクレオチドアナログから核酸分子が構成されることが有利であると理解される。
それらの関連する機能が維持される限り、リボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、および任意の他のオリゴヌクレオチドおよび核酸は、改変ヌクレオチド(ヌクレオチドアナログ)から構成され得るかまたはそれを含むことができる。多くの改変ヌクレオチドが知られており、オリゴヌクレオチドおよび核酸で使用することができる。ヌクレオチドアナログは、いくつかの改変型(塩基部分、糖部分またはリン酸部分のいずれかに対応する)を含むヌクレオチドである。塩基部分に対する改変には、A、C、GおよびT/U、ならびに異なるプリンまたはピリミジン塩基の天然および合成改変が含まれる(ウラシル−5−イル、ヒポキサンチン−9−イル(I)および2−アミノアデニン−9−イルなど)。改変塩基には、5−メチルシトシン(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニンおよびグアニジンの6−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニジンの2−プロピルおよび他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミンおよび2−チオシトシン、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニルウラシルおよびシトシン、6−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5−ウラシル(シュードウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシルおよび他の8−置換のアデニンおよびグアニン、5−ハロ、特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換のウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン、8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、7−デアザグアニンおよび7−デアザアデニン、ならびに3−デアザグアニンおよび3−デアザアデニンが含まれるが、これらに限定されない。さらなる塩基改変を、例えば、米国特許第3,687,808号、Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613およびSanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,pages 289−302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.ed.,CRC Press,1993で見出すことができる。特定のヌクレオチドアナログ(5−置換ピリミジン、6−アザピリミジン、ならびにN−2、N−6およびO−6置換プリンなど)には、2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシンが含まれる。5−メチルシトシンは、二重鎖形成の安定性を増加することができる。他の改変塩基は、ユニバーサル塩基(universal base)として機能するものである。ユニバーサル塩基には、3−ニトロピロールおよび5−ニトロインドールが含まれる。ユニバーサル塩基は、通常の塩基の代わりになるが、塩基対合に対して偏りがない。すなわち、ユニバーサル塩基は、任意の他の塩基と塩基対合することができる。塩基改変は、しばしば、例えば2’−O−メトキシエチルなどの糖改変と組み合わせて、二重鎖の安定性の増加などの特有の特性を得ることができる。塩基改変の範囲を詳述し、記載する、多数の米国特許(第4,845,205号、第5,130,302号、第5,134,066号、第5,175,273号、第5,367,066号、第5,432,272号、第5,457,187号、第5,459,255号、第5,484,908号、第5,502,177号、第5,525,711号、第5,552,540号、第5,587,469号、第5,594,121号、第5,596,091号、第5,614,617号および第5,681,941号など)が存在する。これらの特許は、それぞれその全体が、特に、塩基改変、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのオリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについて本明細書中で参照として援用される。
ヌクレオチドアナログは、糖部分の改変を含むこともできる。糖部分の改変には、リボースおよびデオキシリボースの天然改変、ならびに合成改変が含まれる。糖改変には、2’位での以下の改変が含まれるが、これらに限定されない:OH;F;O−、S−またはN−アルキル;O−、S−またはN−アルケニル;O−、S−またはN−アルキニル;またはO−アルキル−O−アルキル(ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、C1〜C10置換または非置換のアルキルまたはC2〜C10置換または非置換のアルケニルおよびアルキニルであり得る)。2’糖改変には、−O〔(CH2)nO〕mCH3、−O(CH2)nOCH3、−O(CH2)nNH2、−O(CH2)nCH3、−O(CH2)n−ONH2および−O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2(ここで、nおよびmは、1〜約10である)も含まれるが、これらに限定されない。
2’位での他の改変には、C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O−アルカリルもしくはO−アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、介入物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および同様な特性を有する他の置換基が含まれるが、これらに限定されない。類似の改変を、糖の他の位置、特に3’末端ヌクレオチド上または2’−5’結合オリゴヌクレオチド内の糖の3’位、および5’末端ヌクレオチドの5’位で行うこともできる。改変糖には、架橋環酸素での改変(CH2およびSなど)を含むものも含まれる。ヌクレオチド糖アナログは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣物を有することもできる。かかる改変糖構造の調製を教示する多数の米国特許(第4,981,957号、第5,118,800号、第5,319,080号、第5,359,044号、第5,393,878号、第5,446,137号、第5,466,786号、第5,514,785号、第5,519,134号、第5,567,811号、第5,576,427号、第5,591,722号、第5,597,909号、第5,610,300号、第5,627,053号、第5,639,873号、第5,646,265号、第5,658,873号、第5,670,633号および第5,700,920号など)が存在し、それぞれその全体が、特に、改変糖構造、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される。
ヌクレオチドアナログは、リン酸部分を改変することもできる。改変リン酸部分には、2つのヌクレオチド間の架橋が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート(3’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートが含まれる)、ホスフィネート、ホスホルアミデート(3’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートが含まれる)、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートを含むように改変できるものが含まれるが、これらに限定されない。2つのヌクレオチド間のこれらのリン酸または改変リン酸架橋は、3’−5’架橋または2’−5’架橋を介することができ、および架橋は、3’−5’から5’−3’までまたは2’−5’から5’−2’までなどの逆の極性を含むことができることが理解される。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。多数の米国特許が改変リン酸を含むヌクレオチドをどのように作製し、使用するかを教示しており、第3,687,808号、第4,469,863号、第4,476,301号、第5,023,243号、第5,177,196号、第5,188,897号、第5,264,423号、第5,276,019号、第5,278,302号、第5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676号、第5,405,939号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,536,821号、第5,541,306号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号および第5,625,050号が含まれるが、これらに限定されない(それぞれその全体が、特に、改変リン酸、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される)。
ヌクレオチドアナログは単一の改変しか含む必要がないが、1つの部分の中にまたは異なる部分の間に、複数の改変を含むこともできることが理解される。
ヌクレオチド置換物は、ヌクレオチドと同様の機能的性質を有するが、リン酸部分を含まない分子である(ペプチド核酸(PNA)など)。ヌクレオチド置換物は、ワトソン・クリックまたはフーグスティーン様式で相補核酸を認識し、それにハイブリダイズする(塩基対合する)分子であるが、リン酸部分以外の部分を介して一緒に結合する分子である。ヌクレオチド置換物は、適切な標的核酸と相互作用する場合、二重らせん型構造に調和することもできる。
ヌクレオチド置換物は、リン酸部分および/または糖部分が置換されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ヌクレオチド置換物は、標準的なリン原子を含まない。リン酸の置換物は、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間架橋、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間架橋、または1つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間架橋であり得る。これらには、モルホリノ架橋(ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成されている);シロキサン骨格;硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;アルケン含有骨格;スルファミン酸骨格;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格;スルホン酸およびスルホンアミド骨格;アミド骨格を有するもの、ならびに混合N、O、SおよびCH2成分部分を有する他のものが含まれる。多数の米国特許がこれらの種類のリン酸置換体をどのように作製し、使用するかを開示しており、第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,264,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,610,289号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号、および第5,677,439号が含まれるが、これらに限定されない(それぞれその全体が、特に、リン酸置換体、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される)。
また、ヌクレオチドの糖とリン酸の両方の部分を、例えばアミド型架橋(アミノエチルグリシン)(PNA)で置換することができることが、核酸置換物において理解される。米国特許第5,539,082号、同第5,714,331号および同第5,719,262号は、PNA分子をどのように作製し、使用するかを教示しており、それぞれ本明細書中で参考として援用される。(Nielsen et al.,Science 254:1497−1500(1991)も参照すること)。
オリゴヌクレオチドおよび核酸をヌクレオチドから構成することができ、異なるヌクレオチド型または同一のヌクレオチド型から構成することができる。例えば、オリゴヌクレオチドにおける1つまたは複数のヌクレオチドが、リボヌクレオチド、2’−O−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと2’−O−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、ヌクレオチドの約10%〜約50%が、リボヌクレオチド、2’−O−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと2’−O−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、ヌクレオチドの約50%以上が、リボヌクレオチド、2’−O−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと2’−O−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、あるいは全てのヌクレオチドが、リボヌクレオチド、2’−O−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと2’−O−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得る。かかるオリゴヌクレオチドおよび核酸を、キメラオリゴヌクレオチドおよびキメラ核酸と呼ぶことができる。
L.固体支持体
固体支持体は、分子(トリガー分子など)およびリボスイッチ(または開示の方法で使用されるか開示の方法によって産生された他の成分)を会合することができる固体状態の基質または支持体である。リボスイッチおよび他の分子を、固体支持体と直接または間接的に会合することができる。例えば、分析物(例えば、トリガー分子、試験化合物)を、固体支持体表面に結合することができるか、固体支持体上に固定した捕捉剤(例えば、分析物に結合する化合物または分子)と会合することができる。別の例として、リボスイッチを、固体支持体表面に結合することができるか、固体支持体上に固定したプローブと会合することができる。アレイは、複数のリボスイッチ、プローブ、または他の分子がアレイ、グリッド、または他の組織化されたパターンに会合された固体支持体である。
固体支持体は、分子(トリガー分子など)およびリボスイッチ(または開示の方法で使用されるか開示の方法によって産生された他の成分)を会合することができる固体状態の基質または支持体である。リボスイッチおよび他の分子を、固体支持体と直接または間接的に会合することができる。例えば、分析物(例えば、トリガー分子、試験化合物)を、固体支持体表面に結合することができるか、固体支持体上に固定した捕捉剤(例えば、分析物に結合する化合物または分子)と会合することができる。別の例として、リボスイッチを、固体支持体表面に結合することができるか、固体支持体上に固定したプローブと会合することができる。アレイは、複数のリボスイッチ、プローブ、または他の分子がアレイ、グリッド、または他の組織化されたパターンに会合された固体支持体である。
固体支持体で使用する固体状態の基質には、成分を直接または間接的に会合することができる任意の固体材料が含まれ得る。これには、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン(登録商標)、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンラバー、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルソエステル、官能性シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸などの材料が含まれる。固体状態の基質は、任意の有用な形態(薄膜、膜、ボトル、皿、ファイバー、織り繊維、成形ポリマー、粒子、ビーズ、微粒子、またはこれらの組み合わせが含まれる)を有することができる。固体状態の基質および固体支持体は、多孔質または非多孔質であり得る。チップは、矩形または四角の材料小片である。固体状態の基質の好ましい形態は、薄膜、ビーズ、またはチップである。有用な固体状態の基質の形態はマイクロタイターディッシュである。いくつかの実施形態では、マルチウェルガラススライドを使用することができる。
アレイは、固体支持体上の規定または所定の位置に固定した複数のリボスイッチ、トリガー分子、他の分子、化合物、またはプローブを含むことができる。固体支持体上のそれぞれの所定の位置は、一般に、1種の成分型を有する(すなわち、その位置の全成分は同一である)を有する。あるいは、固体支持体上の同一の所定の位置に複数の成分型を固定することができる。各位置は、所与の成分の複数のコピーを有する。固体支持体上の異なる成分の空間的分離により、個別に検出および同定が可能である。
有用であるにもかかわらず、固体支持体は単一の単位または構造である必要はない。リボスイッチ、トリガー分子、他の分子、化合物、および/またはプローブの組を、多数の固体支持体の一面に分布させることができる。例えば、ある極端な場合では、各成分を個別の反応管または反応容器中、または個別のビーズまたは微粒子上に固定することができる。
オリゴヌクレオチドの固体状態の基質への固定方法は十分に確立されている。オリゴヌクレオチド(アドレスプローブおよび検出プローブが含まれる)を、確立されたカップリング法を使用して基質にカップリングすることができる。例えば、適切な付着方法は、Pease et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(11):5022−5026(1994)およびKhrapko et al.,Mol Biol(Mosk)(USSR)25:718−730(1991)に記載されている。カゼイン被覆スライド上の3’−アミンオリゴヌクレオチドの固定方法は、Stimpson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6379−6383(1995)に記載されている。オリゴヌクレオチドの固体状態の基質への有用な付着方法は、Guo et al.,Nucleic Acids Res.22:5456−5465(1994)に記載されている。
固体支持体上に固定した各成分(例えば、リボスイッチ、トリガー分子、または他の分子)を、固体支持体の異なる所定の領域に配置することができる。異なる位置は、異なる反応チャンバーであり得る。異なる所定の領域それぞれを、相互の異なる領域から物理的に分離することができる。固体支持体の異なる所定の領域の間の距離は、固定されていても変化しても良い。例えば、アレイでは、各成分を、相互に固定した距離に配置することができる一方で、ビーズに会合した成分は固定した空間的関係にない。特に、複数の固体支持体単位(例えば、複数のビーズ)の使用により、距離が変化する。
成分を、任意の密度で固体支持体上に会合または固定することができる。成分を、立方センチメートルあたり400種を超える異なる成分を含む密度で固体支持体に固定することができる。成分アレイは、多数の成分を有することができる。例えば、アレイは、固体支持体上に固定した少なくとも1,000種の異なる成分、固体支持体上に固定した少なくとも10,000種の異なる成分、固体支持体上に固定した少なくとも100,000種の異なる成分、または固体支持体上に固定した少なくとも1,000,000種の異なる成分を有することができる。
M.キット
上記の材料および他の材料を、開示の方法の実施または実施の補助に有用なキットとして任意の適切な組み合わせで一緒に包装することができる。所与のキット中のキット構成成分を、開示の方法で一緒に使用するためにデザインおよび適合することが有用である。例えば、化合物検出のためのキット、1つまたは複数のバイオセンサーリボスイッチを含むキットを開示する。キットはまた、リボスイッチの活性化の検出のための試薬および標識を含むことができる。
上記の材料および他の材料を、開示の方法の実施または実施の補助に有用なキットとして任意の適切な組み合わせで一緒に包装することができる。所与のキット中のキット構成成分を、開示の方法で一緒に使用するためにデザインおよび適合することが有用である。例えば、化合物検出のためのキット、1つまたは複数のバイオセンサーリボスイッチを含むキットを開示する。キットはまた、リボスイッチの活性化の検出のための試薬および標識を含むことができる。
N.混合物
開示の方法の実施または実施のための調製によって形成された混合物を開示する。例えば、リボスイッチおよびトリガー分子を含む混合物を開示する。
開示の方法の実施または実施のための調製によって形成された混合物を開示する。例えば、リボスイッチおよびトリガー分子を含む混合物を開示する。
方法が組成物、または成分、または試薬の混合または接触を含むときはいつでも、方法の実施により、多数の異なる混合物が作製される。例えば、方法が3つの混合工程を含む場合、工程を個別に実施する場合にこれらの各工程後に固有の混合物が形成される。さらに、工程の実施方法と無関係に、全工程の完了時点に混合物が形成される。本開示は、開示の方法の実施によって得られたこれらの混合物および任意の開示の試薬、組成物、または成分(例えば、本明細書中に開示)を含む混合物を意図する。
O.系
開示の方法の実施または実施における補助に有用な系を開示する。系は、一般に、構造、機械、およびデバイスなどならびに組成物、化合物、材料などの製品の組み合わせを含む。開示または開示から明らかなかかる組み合わせを意図する。例えば、バイオセンサーリボスイッチ、固体支持体、および信号読み取りデバイスを含む系を開示および意図する。
開示の方法の実施または実施における補助に有用な系を開示する。系は、一般に、構造、機械、およびデバイスなどならびに組成物、化合物、材料などの製品の組み合わせを含む。開示または開示から明らかなかかる組み合わせを意図する。例えば、バイオセンサーリボスイッチ、固体支持体、および信号読み取りデバイスを含む系を開示および意図する。
P.データ構造およびコンピュータ制御
開示の方法で使用されるか、開示の方法によって生成されるか、開示の方法から生成されるデータ構造を開示する。データ構造は、一般に、組成物または媒体中に回収され、組織化され、保存され、そして/または統合された任意の形態のデータ、情報、および/またはオブジェクトである。電子的形態(RAM中または保存ディスク上など)で保存されたリボスイッチ構造および活性化の測定値は、1つのデータ構造型である。
開示の方法で使用されるか、開示の方法によって生成されるか、開示の方法から生成されるデータ構造を開示する。データ構造は、一般に、組成物または媒体中に回収され、組織化され、保存され、そして/または統合された任意の形態のデータ、情報、および/またはオブジェクトである。電子的形態(RAM中または保存ディスク上など)で保存されたリボスイッチ構造および活性化の測定値は、1つのデータ構造型である。
開示の方法、その任意の一部、またはその調製を、コンピュータ制御によって調節、管理、または支援することができる。かかるコンピュータ制御を、コンピュータ制御されたプロセスまたは方法によって実施することができ、データ構造を使用および/または生成することができ、コンピュータプログラムを使用することができる。かかるコンピュータ制御、コンピュータ制御されたプロセス、データ構造、およびコンピュータプログラムが意図され、本明細書中に開示されると理解すべきである。
方法
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する方法を開示する。かかる方法は、例えば、リボスイッチとリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物またはトリガー分子とを接触する工程を含むことができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。化合物を使用して、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる。リボスイッチのためのトリガー分子(および他の活性化化合物)を使用して、リボスイッチを活性化することができる。一般に、トリガー分子以外の化合物を使用して、リボスイッチを非活性化または遮断することができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチの有するその存在からのトリガー分子の除去によって非活性化することもできる。したがって、開示のリボスイッチの非活性化方法は、例えば、リボスイッチの有するその存在からまたはリボスイッチとの接触からのトリガー分子(または他の活性化化合物)の除去工程を含むことができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチを活性化しないトリガー分子アナログの結合によって遮断することができる。
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する方法を開示する。かかる方法は、例えば、リボスイッチとリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物またはトリガー分子とを接触する工程を含むことができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。化合物を使用して、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる。リボスイッチのためのトリガー分子(および他の活性化化合物)を使用して、リボスイッチを活性化することができる。一般に、トリガー分子以外の化合物を使用して、リボスイッチを非活性化または遮断することができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチの有するその存在からのトリガー分子の除去によって非活性化することもできる。したがって、開示のリボスイッチの非活性化方法は、例えば、リボスイッチの有するその存在からまたはリボスイッチとの接触からのトリガー分子(または他の活性化化合物)の除去工程を含むことができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチを活性化しないトリガー分子アナログの結合によって遮断することができる。
化合物をRNA分子と接触させることによってRNA分子またはRNA分子をコードする遺伝子の発現を変化させる方法も開示し、このRNA分子はリボスイッチを含む。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。したがって、リボスイッチを含む目的のRNA分子を、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する条件に供することによって、RNA発現を変化させることができる。例えば、転写の終結またはRNAへのリボゾーム結合の遮断の結果として発現を変化させることができる。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質に応じて、RNA分子の発現を減少または防止することができるか、RNA分子の発現を促進または増加させることができる。
リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってリボスイッチを含む天然に存在する遺伝子またはRNAの発現を調節する方法も開示する。遺伝子が遺伝子を保有する細胞または生物の生存に不可欠である場合、リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断により、細胞または生物が死滅させるか、休止させるか、衰弱させることができる。例えば、微生物の生存に不可欠な天然に存在する遺伝子中での天然に存在するリボスイッチの活性化により、微生物を死滅させることができる(リボスイッチの活性化によって発現がオフになるか抑制される場合)。これは、抗菌効果および抗生効果のための開示の化合物および方法の使用の1つの根拠である。これらの抗菌効果を有する化合物は、静菌性または殺菌性を示すと見なされる。
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物を選択および同定する方法も開示する。リボスイッチの活性化は、トリガー分子の結合の際のリボスイッチの状態の変化をいう。リボスイッチを、トリガー分子以外の化合物およびトリガー分子の結合以外の方法で活性化することができる。用語トリガー分子を、本明細書中で、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物をいうために使用する。これには、リボスイッチおよびリボスイッチを活性化することができる他の化合物のための天然または通常のトリガー分子が含まれる。天然または通常のトリガー分子は、所与の天然のリボスイッチのトリガー分子またはいくつかの非天然リボスイッチの場合、リボスイッチがデザインされるか、リボスイッチが選択される(例えば、in vitro選択技術またはin vitro進化技術など)トリガー分子である。非天然トリガー分子を、非天然トリガー分子ということができる。
細菌と本明細書中に開示されているか本明細書中に開示の方法によって同定された化合物とを接触させる工程を含む、細菌を死滅または阻害する方法も開示する。
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物を同定する方法も開示する。例えば、リボスイッチを活性化する化合物を、試験化合物とリボスイッチとの接触およびリボスイッチの活性化の評価によって同定することができる。リボスイッチが活性化される場合、試験化合物を、リボスイッチを活性化する化合物と同定する。リボスイッチの活性化を、任意の適切な様式で評価することができる。例えば、リボスイッチをレポーターRNAに連結することができ、レポーターRNAの発現、発現レベル、または発現レベルの変化を、試験化合物の存在下および非存在下で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、高次構造依存性標識(リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル)を含むことができる。かかるリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するか、これから誘導したアプタマードメインを使用する。認められるように、調節アッセイまたは測定を使用するかあるいは調節アッセイまたは測定を使用しないで、リボスイッチ活性化の評価を実施することができる。リボスイッチを非活性化する化合物の同定方法を、類似の方法で行うことができる。
本明細書中の他所に開示の方法に加えて、リボスイッチを遮断する化合物の同定を、任意の適切な様式で行うことができる。例えば、リボスイッチを活性化または非活性化することが公知の化合物の存在下および試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を評価するためのアッセイを行うことができる。試験化合物の非存在下において認められないのと同様に活性化または非活性化が認められない場合、試験化合物を、リボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定する。
バイオセンサーリボスイッチを使用した化合物の検出方法も開示する。本方法は、試験サンプルとバイオセンサーリボスイッチとを接触させる工程およびバイオセンサーリボスイッチの活性化を評価する工程を含むことができる。バイオセンサーリボスイッチの活性化は、試験サンプル中のバイオセンサーリボスイッチのためのトリガー分子の存在を示す。バイオセンサーリボスイッチは、その同系トリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを産生する操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、トリガー分子の閾値レベルまたは閾値レベルを超えて誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、in vivoまたはin vitroでの使用のためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかその生成に関与するタンパク質をコードするレポーターRNAに作動可能に連結されたサイクリックジGMPバイオセンサーリボスイッチを、リボスイッチ/レポーターRNAをコードする核酸構築物を保有するように細胞または生物を操作することによってin vivoで使用することができる。in vitroで使用するためのバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識を含むサイクリックジGMPリボスイッチであり、この標識由来のシグナルは、リボスイッチの活性化状態に応じて変化する。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するサイクリックジGMPリボスイッチに由来するかこれから誘導されるアプタマードメインを使用する。
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の同定および同定された化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物同定方法と同定された化合物の製造方法との組み合わせにより、これを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触工程、リボスイッチの活性化の評価工程、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造工程によって化合物を作製することができる。
化合物によるリボスイッチの活性化、非活性化、または遮断のチェック工程およびチェックした化合物の製造工程によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示したように化合物の活性化、非活性化、または遮断の評価方法とチェックした化合物の製造方法との組み合わせによってこれを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触工程、リボスイッチ活性化の評価工程、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造工程によって化合物を作製することができる。化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する能力についての化合物のチェックは、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することを以前に知られていない化合物の同定および化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することが既に知られていた場合のリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の能力の評価の両方をいう。目的の化合物を検出する方法であって、サンプルとリボスイッチとを接触させる工程を含み、リボスイッチが目的の化合物によって活性化され、リボスイッチが目的の化合物によって活性化された場合にシグナルを産生し、サンプルが目的の化合物を含む場合にリボスイッチがシグナルを産生し、リボスイッチがリボスイッチまたはリボスイッチの誘導体を含む方法をさらに開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチであり得る。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチが高次構造を変化させることができ、高次構造の変化が、高次構造依存性標識を介してシグナルを産生する。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチは高次構造を変化させることもでき、高次構造の変化によってリボスイッチに連結されたRNAの発現が変化し、発現の変化によってシグナルが産生される。シグナルを、リボスイッチに連結されたRNAから発現したレポータータンパク質によって産生することができる。
目的の化合物を検出する方法であって、サンプルとリボスイッチとを接触させる工程を含み、リボスイッチが目的の化合物によって活性化され、リボスイッチが目的の化合物によって活性化された場合にシグナルを産生し、サンプルが目的の化合物を含む場合にリボスイッチがシグナルを産生し、リボスイッチがリボスイッチまたはリボスイッチの誘導体を含む方法をさらに開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチであり得る。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチが高次構造を変化させることができ、高次構造の変化が、高次構造依存性標識を介してシグナルを産生する。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチは高次構造を変化させることもでき、高次構造の変化によってリボスイッチに連結されたRNAの発現が変化し、発現の変化によってシグナルが産生される。シグナルを、リボスイッチに連結されたRNAから発現したレポータータンパク質によって産生することができる。
具体的には、サイクリックジGMP応答性リボスイッチをサンプルと接触させる工程、サイクリックジGMPとサイクリックジGMP応答性リボスイッチとの間の相互作用を検出する工程を含み、サイクリックジGMPとサイクリックジGMP応答性リボスイッチとの間の相互作用がサイクリックジGMPの存在を示す、サンプル中のサイクリックジGMPを検出する方法を開示する。サイクリックジGMP応答性リボスイッチを標識することができる。
(a)リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験する工程であって、阻害がリボスイッチを介し、リボスイッチがリボスイッチまたはリボスイッチの誘導体を含む、試験工程、(b)細胞と工程(a)で遺伝子発現を阻害した化合物との接触によって遺伝子発現を阻害する工程を含み、細胞がリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって遺伝子発現を阻害する、方法も開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチであり得る。
(a)リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子の遺伝子発現の抑制について化合物を試験する工程であって、抑制がリボスイッチを介し、リボスイッチがリボスイッチまたはリボスイッチの誘導体を含む、試験工程、(b)細胞と工程(a)で遺伝子発現を抑制した化合物との接触によって遺伝子発現を抑制する工程を含み、細胞がリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって遺伝子発現を抑制する、方法も開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチであり得る。
化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物が、サイクリックジGMP、pGpG、GpG、またはGpGpGである、遺伝子発現を変化させる方法も開示する。化合物はまた、サイクリックジGMP応答性リボスイッチを活性化することができるサイクリックジGMP、pGpG、GpG、またはGpGpGの誘導体であり得る。化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物がS−アデノシルホモシステインである、遺伝子発現を変化させる方法も開示する。化合物はまた、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチを活性化することができるS−アデノシルホモシステインの誘導体であり得る。化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物がpreQ1である、遺伝子発現を変化させる方法も開示する。化合物はまた、preQ1応答性リボスイッチを活性化することができるpreQ1の誘導体であり得る。化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物がMocoである、遺伝子発現を変化させる方法も開示する。化合物はまた、Moco応答性リボスイッチを活性化することができるMocoの誘導体であり得る。化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物がSAMである、遺伝子発現を変化させる方法も開示する。化合物はまた、SAM応答性リボスイッチを活性化することができるSAMの誘導体であり得る。SAM−IVリボスイッチを活性化するための化合物はまた、MeAzaAdoMetであり得る。
S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチの活性化のために、化合物は、S−アデノシルホモシステインであり得る。化合物はまた、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチを活性化することができるS−アデノシルホモシステインの誘導体であり得る。例えば、化合物はS−アデノシル−L−システイン(SAC)であり得る。図12Bは、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチを活性化することができる化合物に重要な構造エレメントを示す。
preQ1応答性リボスイッチ(およびpreQ1応答性リボスイッチ由来のリボスイッチ)の活性化のために、化合物は、1位のNをC、O またはSと置換することができ、2位のアミノ基を水素結合供与体と置換することができ、6位の酸素を水素結合受容体と置換することができ、7位のアミノ基を水素結合受容体と置換することができ、窒素を水素結合供与体と置換するかこれを使用して誘導することができる、preQ1の誘導体であり得る。
細胞を、遺伝子発現の変化が必要であると同定することができる。細胞は細菌細胞であり得る。化合物は、細菌細胞を死滅させるか増殖を阻害することができる。被験体への化合物の投与によって化合物と細胞とを接触させることができる。細胞は被験体中の細菌細胞であり得、化合物は細菌細胞を死滅させるか増殖を阻害する。被験体は、細菌感染を有し得る。細胞は、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチを含むことができる。化合物を、別の抗菌化合物と組み合わせて投与することができる。化合物は、バイオフィルム中の細菌増殖を阻害することができる。化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物が、サイクリックジGMP、pGpG、GpG、またはGpGpGである、細胞の生理学的状態を変化させる方法も開示する。化合物はまた、サイクリックジGMP応答性リボスイッチを活性化することができるサイクリックジGMP、pGpG、GpG、またはGpGpGの誘導体であり得る。
トリガー分子の存在下および非存在下でRNA分子のインライン自発性切断を評価する工程を含み、RNA分子がトリガー分子によって調節される遺伝子によってコードされ、RNA分子のインライン自発性切断パターンの変化がトリガー分子に応答するリボスイッチを示す、リボスイッチを同定する方法を開示する。トリガー分子は、サイクリックジGMP、S−アデノシルホモシステイン、preQ1、Moco、またはSAMであり得る。
(a)リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験する工程であって、阻害がリボスイッチを介し、リボスイッチがサイクリックジGMP応答性リボスイッチまたはサイクリックジGMP応答性リボスイッチの誘導体を含む、試験工程、(b)細胞と工程(a)で遺伝子発現を阻害した化合物との接触によって遺伝子発現を阻害する工程を含み、細胞がリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって遺伝子発現を阻害する、方法を開示する。
細胞と遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験することによって遺伝子の遺伝子発現を阻害する化合物と同定された化合物との接触によってリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子の遺伝子発現を阻害する工程を含み、阻害がリボスイッチを介し、リボスイッチがサイクリックジGMP応答性リボスイッチまたはサイクリックジGMP応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法も開示する。
A.抗菌化合物の同定
リボスイッチは、有機小分子の結合のために進化した構造化RNAの新規のクラスである。リボスイッチの天然の結合ポケットを、代謝産物アナログを使用するか、天然代謝産物の形状−空間を模倣する化合物によってターゲティングすることができる。リボスイッチの小分子リガンドにより、薬物候補を生成するための誘導体化に有用な部位が得られる。いくつかのリボスイッチの分布は、米国特許出願公開第2005−0053951号の表1に示されている。一旦リボスイッチクラスが同定され、薬物標的としてのその潜在力が評価されると(サイクリックジGMPリボスイッチなど)、候補分子を同定することができる。
リボスイッチは、有機小分子の結合のために進化した構造化RNAの新規のクラスである。リボスイッチの天然の結合ポケットを、代謝産物アナログを使用するか、天然代謝産物の形状−空間を模倣する化合物によってターゲティングすることができる。リボスイッチの小分子リガンドにより、薬物候補を生成するための誘導体化に有用な部位が得られる。いくつかのリボスイッチの分布は、米国特許出願公開第2005−0053951号の表1に示されている。一旦リボスイッチクラスが同定され、薬物標的としてのその潜在力が評価されると(サイクリックジGMPリボスイッチなど)、候補分子を同定することができる。
細菌の薬物耐性株の出現により、新規クラスの抗生物質同定の必要性が強調される。抗リボスイッチ薬は、以下の理由のために非常に興味深い抗菌作用様式を示す。リボスイッチは、基本的代謝過程に重要な遺伝子発現を調節する。したがって、薬物を使用したこれらの遺伝子調節エレメントの操作により、新規の抗生物質が得られる。これらの抗菌薬を、静菌性または殺菌性を示すと見なすことができる。リボスイッチはまた、代謝産物に選択的に結合するように進化したRNA構造を保有し、したがって、これらのRNA受容体は、タンパク質酵素および受容体のように良好な薬物標的物を作製する。
化合物の非存在下での同一のリボスイッチアッセイと比較して(すなわち、コントロールアッセイと比較して)、化合物の存在下のリボスイッチアッセイにおけるシグナルが少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%、または500%増加する場合に、化合物がリボスイッチを活性化すると同定することができるか、リボスイッチ活性化活性を有すると決定することができる。リボスイッチアッセイを、任意の適切なリボスイッチ構築物を使用して行うことができる。リボスイッチ活性化アッセイに特に有用なリボスイッチ構築物を、本明細書中の他所に記載している。1つまたは複数の特定のリボスイッチ、リボスイッチ構築物、またはリボスイッチクラスに関して、化合物を、リボスイッチを活性化するかリボスイッチ活性化活性を有すると同定することができる。便宜上、あるリボスイッチクラスを活性化するかあるリボスイッチクラスのリボスイッチ活性化活性を有すると同定された化合物を、特定のリボスイッチ(特定の種で見出されたそのクラスのリボスイッチなど)についてもそのように同定することができる。例えば、サイクリックジGMPリボスイッチを活性化するかサイクリックジGMPリボスイッチに対するリボスイッチ活性化活性を有すると同定された化合物を、特定のサイクリックジGMPリボスイッチ(例えば、 Vibrio choleraeまたはGluconacetobacter xylinusで見出されたサイクリックジGMPリボスイッチなど)についてそのように同定することができる。
B.抗菌化合物の使用方法
in vivoおよびin vitro抗菌方法を本明細書中に開示する。「抗菌の」は、細菌増殖の阻害もしくは防止、細菌の死滅、または細菌数の減少を意味する。したがって、細菌を有効量の本明細書中に開示の1つまたは複数の化合物と接触させる工程を含む、細菌増殖を阻害または防止する方法を開示する。開示の化合物のさらなる構造を本明細書中に提供する。
in vivoおよびin vitro抗菌方法を本明細書中に開示する。「抗菌の」は、細菌増殖の阻害もしくは防止、細菌の死滅、または細菌数の減少を意味する。したがって、細菌を有効量の本明細書中に開示の1つまたは複数の化合物と接触させる工程を含む、細菌増殖を阻害または防止する方法を開示する。開示の化合物のさらなる構造を本明細書中に提供する。
細胞とリボスイッチに結合する化合物とを接触させる工程を含み、細胞が化合物に応答性を示すリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって細菌細胞増殖を阻害し、それにより、遺伝子発現が変化する、細菌細胞増殖を阻害する方法を開示する。リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチであり得る。本方法により、化合物と接触しない細胞と比較して細菌細胞増殖を少なくとも10%減少させることができる。被験体への化合物の投与により、化合物と細胞とを接触させることができる。細胞は被験体中の細菌細胞であり得、化合物は細菌細胞を死滅させるか増殖を阻害する。被験体は、細菌感染を有し得る。化合物を、別の抗菌化合物と組み合わせて投与することができる。
細菌は、以下の属由来の細菌などの任意の細菌であり得る:例えば、Bacillus、Acinetobacter、Actinobacillus、Burkholderia、Campylobacter、Clostridium、Desulfitobacterium、Enterococcus、Erwinia、Escherichia、Exiguobacterium、Fusobacterium、Geobacillus、Geobacter、Gluconacetobacter、Haemophilus、Heliobacter、Klebsiella、Idiomarina、Lactobacillus、Lactococcus、Leuconostoc、Listeria、Moorella、Mycobacterium、Oceanobacillus、Oenococcus、Pasteurella、Pediococcus、Pseudomonas、Shewanella、Shigella、Solibacter、Staphylococcus、Streptococcus、Thermoanaerobacter、Thermotoga、およびVibrio。細菌は、例えば、Actinobacillus pleuropneumoniae、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus clausii、Bacillus halodurans、Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus thuringiensis、Clostridium acetobutylicum、Clostridium dificile、Clostridium perfringens、Clostridium tetani、Clostridium thermocellum、Desulfitobacterium hafniense、Enterococcus faecalis、Erwinia carotovora、Escherichia coli、Exiguobacterium sp.、Fusobacterium nucleatum、Geobacillus kaustophilus、Geobacter sulfurreducens、Gluconacetobacter xylinus、Haemophilus ducreyi、Haemophilus influenzae、Haemophilus somnus、Idiomarina loihiensis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus casei、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactis、Leuconostoc mesenteroides、Listeria innocua、Listeria monocytogenes、Moorella thermoacetica、Oceanobacillus iheyensis、Oenococcus oeni、Pasteurella multocida、Pediococcus pentosaceus、Pseudomonas aeruginosa、Shewanella oneidensis、Shigella flexneri、Solibacter usitatus、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Thermoanaerobacter tengcongensis、Thermotoga maritima、Vibrio cholerae、Vibrio fischeri、Vibrio parahaemolyticus、またはVibrio vulnificusであり得る。細菌増殖を、細菌が見出される任意の状況で阻害することもできる。例えば、流動物、バイオフィルム、および表面上での細菌増殖を阻害することができる。本明細書中に開示の化合物を、任意の他の化合物または組成物と組み合わせて投与または使用することができる。例えば、開示の化合物を、別の抗菌化合物と組み合わせて投与または使用することができる。
「細菌増殖の阻害」を、1つの細菌が娘細胞に***する能力の減少または細菌集団が娘細胞を形成する能力の減少と定義する。細菌が再生する能力を、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または100%またはそれを超えて減少させることができる。
細菌を1つまたは複数の本明細書中に開示および記載の化合物と接触させる工程を含む、細菌または細菌集団の増殖の阻害および/または死滅方法も提供する。
「細菌の死滅」を、1つの細菌の死滅または複数の細菌(コロニー中の細菌など)の数の減少と定義する。複数の形態の細菌について言及する場合、「細菌の死滅」を、10%の集団、20%の集団、30%の集団、40%の集団、50%の集団、60%の集団、70%の集団、80%の集団、90%の集団、または100%以下の集団の比率での所与の細菌集団の細胞死と定義する。
本明細書中に開示の化合物および組成物は、in vitroまたはin vivoで抗菌活性を有し、同様に殺菌性を示し得る他の化合物または組成物と併せて使用することができる。
本明細書中に提供される化合物の、用語「治療有効量」は、非毒性であるが、1つまたは複数の症状を望ましく減少させるのに十分な化合物の量を意味する。以下に指摘するように、化合物の正確な必要量は、被験体の種、年齢、および一般的な健康状態、処置を受ける疾患の重症度、使用された特定の化合物、ならびにその投与様式などに応じて被験体によって変化する。したがって、正確な「有効量」を特定することは可能でない。しかし、当業者は、適切な有効量を、日常的な実験のみを使用して決定することができる。
本明細書中に開示の組成物および化合物を、薬学的に許容可能なキャリア中にてin vivoで投与することができる。「薬学的に許容可能な」は、生物学的でないか、そうでなければ望ましくないことはない材料を意味する。すなわち、材料を、いかなる望ましくない生物学的影響を引き起こすことなくまたは含有するいかなる薬学的組成物の他の成分との有害様式での相互作用も引き起こすことなく被験体に投与することができる。当業者に周知のように、キャリアを、当然のことながら、有効成分の任意の分解を最小にし、被験体における任意の有害な副作用を最小にするように選択する。
本明細書中に開示の組成物または化合物を、経口、非経口(例えば、静脈内)、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮、体外、局所など(局所的鼻腔内投与または吸入剤による投与が含まれる)で投与することができる。本明細書中で使用する場合、「局所鼻腔内投与」は、外鼻孔の一方または両方を介した鼻および鼻道への組成物の送達を意味し、噴霧機構もしくは液滴機構、または核酸もしくはベクターのエアゾール化による送達を含むことができる。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達によって鼻または口を介して行うことができる。挿管によって呼吸器系の任意の領域(例えば、肺)に直接送達させることもできる。組成物の正確な必要量は、被験体の種、年齢、体重、および一般的な健康状態、処置を受けるアレルギー障害の重症度、使用された特定の核酸またはベクター、ならびにその投与様式などに応じて被験体によって変化する。したがって、全ての組成物について正確な量を特定することは可能でない。しかし、当業者は、適切な量を、本明細書中に教示された日常的な実験のみを使用して決定することができる。
組成物または化合物の非経口投与は、使用する場合、一般に、注射によって特徴づけられる。注射剤を、従来の形成で、液体溶液または懸濁液、注射前に液体中に懸濁する溶液に適切な固体形態、または乳濁液として調製することができる。より最近に修正された非経口投与アプローチは、一定の投薬量を維持するような遅延放出系または徐放系の使用を含む。例えば、米国特許第3,610,795号(本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。
本明細書中に開示の組成物および化合物を、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて治療的に使用することができる。適切なキャリアおよびその処方物は、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,PA 1995に記載されている。典型的には、処方物を等張にするのに適切な量の薬学的に許容可能な塩を処方物中で使用する。薬学的に許容可能なキャリアの例には、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のpHは、好ましくは、約5〜約8、より好ましくは約7〜約7.5である。さらなるキャリアには、マトリックスが成形製品の形態である(例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子)抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性調製物が含まれる。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じて、一定のキャリアがより好ましいことが当業者に明らかである。
薬学的キャリアは、当業者に公知である。これらは、最も典型的には、ヒトへの薬物投与のための標準的なキャリアである(滅菌水、生理食塩水、生理学的pHの緩衝化溶液などの溶液が含まれる)。組成物を、筋肉内または皮下に投与することができる。他の化合物を、当業者によって使用される標準的な手順にしたがって投与する。
薬学的組成物は、選択の分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、および界面活性剤などを含むことができる。薬学的組成物はまた、1つまたは複数の有効成分(抗菌薬、抗炎症薬、および麻酔薬など)を含むことができる。
薬学的組成物を、局所処置または全身処置のいずれが望ましいかおよび処置する領域に応じて多数の方法で投与することができる。投与は、局所(眼科、膣、直腸、鼻腔内が含まれる)、経口、吸入、または非経口(例えば、点滴、皮下、腹腔内、または筋肉内注射)であり得る。開示の抗体を、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮に投与することができる。
非経口投与のための調製物には、滅菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油(オリーブ油など)、および注射可能な有機エステル(オレイン酸エチルなど)である。水性キャリアには、水、アルコール溶液/水溶液、乳濁液または懸濁液(生理食塩水および緩衝化溶媒が含まれる)が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補給液(nutrient replenisher)、および電解質補給液(リンゲルデキストロースにもとづくものなど)などが含まれる。防腐剤および他の添加物も存在し得る(例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなど)。
局所投与のための処方物には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の薬学的キャリア、水性、粉末、または油性ベース、および増粘剤などが必要であるか望ましくあり得る。
経口投与のための組成物には、粉末または顆粒、水性媒体または非水性媒体での懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味物質、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましくあり得る。
いくつかの組成物を、無機酸(塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸など)および有機酸(ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸など)との反応によりまたは無機塩基(水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど)および有機塩基(モノ、ジ、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンなど)との反応によって形成された薬学的に許容可能な酸付加塩または塩基付加塩として潜在的に投与することができる。
本明細書中に開示の治療組成物を、化合物分子をカップリングする個別のキャリアとしてのモノクローナル抗体の使用によって送達させることもできる。本開示の治療組成物を、標的化が可能な(targetable)薬物キャリアとしての可溶性ポリマーとカップリングすることもできる。かかるポリマーには、ポリビニル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドフェノール(polyhydroxypropylmethacryl−amidephenol)、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル残基と置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが含まれ得るが、これらに限定されない。さらに、本開示の治療組成物を、薬物の制御放出の実施に有用な生分解性ポリマークラス(例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルソエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマー)とカップリングすることができる。
細菌感染の、好ましくは少なくとも約3%、より好ましくは約10%、より好ましくは約20%、より好ましくは約30%、より好ましくは約50%、より好ましくは75%、さらにより好ましくは約100%が化合物の投与によって減少する。感染の減少を、白血球数の減少、解熱、炎症の減少、細菌数の減少、または細菌感染の他の指標の減少などのパラメーターによって決定する。細菌感染減少率を増加させるために、被験体に無毒のままで最も有効なレベルに投薬量を増加させることができる。
全体を通して使用する場合、「被験体」は、個体をいう。好ましくは、被験体は、哺乳動物(非ヒト哺乳動物または霊長類、およびより好ましくはヒトなど)である。「被験体」には、飼い慣らされた動物(domesticated animal)(ネコ、イヌなど)、家畜(例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど)、実験動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど)、および魚類が含まれ得る。
「細菌感染」を、被験体またはサンプル中の細菌の存在と定義する。かかる細菌は、被験体またはサンプルの内部または表面に天然に存在する細菌の増殖であり得るか、外来生物の侵入に起因し得る。
本明細書中に開示の化合物を、抗生物質と同一の様式で使用することができる。抗生物質の使用は、当該分野で十分に確立されている。その使用の一例には、動物の処置が含まれる。必要に応じて、開示の化合物を、通常、獣医または栄養士の専門的指導の下で注射または飼料もしくは水を介して動物に投与することができる。化合物を、疾患の重症度および動物種などの環境に応じて、個別または群のいずれかで動物に送達させる。全動物が類似の免疫状態にあり、且つ全動物が同一の病原微生物に曝露されている場合、群れ全体を治療およびケアする必要があり得る。
化合物の別の使用例には、細菌感染した水生動物を選択する工程、開示の化合物、キレート剤(EDTAなど)、TRIENEを含む抗菌溶液を準備する工程、溶液にpH緩衝剤を添加し、そのpHを約7.0と約9.0との間の値に調整する工程、水生動物をその溶液中に浸漬し、動物の微生物負荷の減少に有効な期間水生動物を溶液中に静置する工程、水生動物を溶液から出して、動物をその溶液を含んでいない水に戻す工程を含む、水生動物の微生物完成の減少が含まれる。EDTA、開示の化合物、TRIENE、およびpH緩衝剤を含む溶液中の水生動物の浸漬を、動物の微生物負荷が消失するまで繰り返すことができる(米国特許第6,518,252号)。
本明細書中に開示の化合物の他の使用には、歯科治療および水の精製(これには、例えば、都市用水、汚物処理システム、飲料水および非飲料水の供給、および孵化場が含まれ得る)が含まれるが、これらに限定されない。
C.トリガー分子の生産方法
トリガー分子を産生することができる変異細菌細胞を培養する工程であって、変異細菌細胞がトリガー分子に応答性を示すリボスイッチ中に変異を含み、変異を持たない細胞と比較して、変異が変異細菌細胞によるトリガー分子の産生を増加させる、培養工程、およびトリガー分子を細胞培養物から単離し、それにより、トリガー分子を生産する工程を含む、トリガー分子を生産する方法を本明細書中に開示する。トリガー分子は、サイクリックジGMP、S−アデノシルホモシステイン、preQ1、Moco、またはSAMであり得る。
トリガー分子を産生することができる変異細菌細胞を培養する工程であって、変異細菌細胞がトリガー分子に応答性を示すリボスイッチ中に変異を含み、変異を持たない細胞と比較して、変異が変異細菌細胞によるトリガー分子の産生を増加させる、培養工程、およびトリガー分子を細胞培養物から単離し、それにより、トリガー分子を生産する工程を含む、トリガー分子を生産する方法を本明細書中に開示する。トリガー分子は、サイクリックジGMP、S−アデノシルホモシステイン、preQ1、Moco、またはSAMであり得る。
変異細菌細胞はノックアウト変異体であり得、この細胞は、トリガー分子に応答性を示すリボスイッチを産生することができない。この細胞は、完全に除去されたリボスイッチをコードする領域を有し得る。トリガー分子の産生を、10、20、30、40、50、60、70、80、90%、またはそれを超えて増加させることができる。これを、インタクトなリボスイッチを有する細胞によって産生される全トリガー分子の量と比較した全トリガー分子の量によって測定することができる。
変異を持たない細胞と比較して変異が細胞によるトリガー分子の産生を測定可能に増加させる、トリガー分子に応答性を示すリボスイッチに変異を含む細菌細胞をさらに開示する。「測定可能に増加する」は、10、20、30、40、50、60、70、80、90%またはそれを超えるトリガー分子産生の増加を意味する。
(実施例1)
A.実施例1:CMfinder比較ゲノミクスパイプラインを使用した細菌における22の候補構造化RNAの同定
比較ゲノミクスに基づいたコンピュータパイプラインを細菌に適用し、22の候補RNAモチーフを同定した。6つは、特異的代謝産物の結合に関する遺伝子発現を調節するmRNAエレメントであるリボスイッチであると考えられた。個別の研究では、これらのうちの2つが新規のリボスイッチであることが確認された。3つの他のリボスイッチ候補は、Lactobacillales目における推定輸送体遺伝子、Burkholderialesにおけるクエン酸回路遺伝子、またはいくつかの門におけるモリブデン補因子生合成遺伝子のいずれかの上流である。残りのリボスイッチ候補である広範なGEMM(環境、膜、および運動性の遺伝子)モチーフは、Vibrio choleraeにおける天然のコンピテンスおよびGeobacter sulfurreducensにおける電子受容体としての金属イオンの使用に重要な遺伝子に関連する。他のモチーフのうちの1つは、以前に公開された候補リボスイッチykkC/yxkDに類似の遺伝子分布を有するが、異なる構造を有する。可能な非コードRNAを、5つの門、いくつかのさらなるシス調節RNA(ε−proteobacteria中の1つ(プリン生合成に関与するpurDの上流)が含まれる)、およびCyanobacteria中の1つ(ATPシンターゼオペロン内)で同定した。これらの候補RNAを、複数の細胞過程に関与するRNAモチーフの増加しているリストに加え、多数のさらなるRNAが依然として発見されていないことを示す。
A.実施例1:CMfinder比較ゲノミクスパイプラインを使用した細菌における22の候補構造化RNAの同定
比較ゲノミクスに基づいたコンピュータパイプラインを細菌に適用し、22の候補RNAモチーフを同定した。6つは、特異的代謝産物の結合に関する遺伝子発現を調節するmRNAエレメントであるリボスイッチであると考えられた。個別の研究では、これらのうちの2つが新規のリボスイッチであることが確認された。3つの他のリボスイッチ候補は、Lactobacillales目における推定輸送体遺伝子、Burkholderialesにおけるクエン酸回路遺伝子、またはいくつかの門におけるモリブデン補因子生合成遺伝子のいずれかの上流である。残りのリボスイッチ候補である広範なGEMM(環境、膜、および運動性の遺伝子)モチーフは、Vibrio choleraeにおける天然のコンピテンスおよびGeobacter sulfurreducensにおける電子受容体としての金属イオンの使用に重要な遺伝子に関連する。他のモチーフのうちの1つは、以前に公開された候補リボスイッチykkC/yxkDに類似の遺伝子分布を有するが、異なる構造を有する。可能な非コードRNAを、5つの門、いくつかのさらなるシス調節RNA(ε−proteobacteria中の1つ(プリン生合成に関与するpurDの上流)が含まれる)、およびCyanobacteria中の1つ(ATPシンターゼオペロン内)で同定した。これらの候補RNAを、複数の細胞過程に関与するRNAモチーフの増加しているリストに加え、多数のさらなるRNAが依然として発見されていないことを示す。
新規の構造化RNAの最近の発見(He 2006;Storz 2005;Kima 2006;Claverie 2005)は、かかるRNAが細胞で共通であることを示す。さらなる構造化RNAの発見を補助するために、細菌内の保存RNAを同定することができる自動化パイプラインが開発されている(Yao 2007)。このパイプラインは、相同遺伝子のmRNAの潜在的な5’UTR(非翻訳領域)を構築し、CMfinder(Yao 2006)プログラムを使用して各UTR組内の保存RNA構造(すなわち、「モチーフ」)を推定する。次いで、自動化相同検索を使用して、これらのモチーフのさらなる例を見出し、CMfinderを使用して各モチーフの二次構造モデルおよび配列アラインメントを改良する。推定されるRNA二次構造を有するアラインメント組を出力し、これらのアラインメントをその後に手作業で分析してモデルを改善し、どのモチーフがさらなる研究に有利であるかを評価する。
RNAに対する他の自動化検索が実施されているにもかかわらず(Barrick 2004;Corbino 2005;Axmann 2005;Seliverstov 2005;McCutcheon 2003;Coventry 2004;Washietl 2005;Pedersen 2006;Torarinsson 2006)、このパイプライン(Yao 2007)を、3つの特徴によってこれらの検索から識別する。第1に、このパイプラインはCMfinderを使用し、このCMfinderは、いくつかの入力配列がモチーフを含まないか、非関連配列ドメインを保有するモチーフの代表を含むかのいずれかである場合でさえ、モチーフを発見することができる。CMfinderはまた、配列保存が低い場合でさえも有用なアラインメントを生成することができるが、このアルゴリズムは配列が類似するのもは何でも活用する。第2に、このパイプラインは、相同性検索を統合して各モチーフのアラインメントおよび構造モデルを自動的に洗練させる。第3に、このパイプラインは相同遺伝子のUTRをアラインメントするので、シス調節RNAを見い出すのに適しており、配列保存に対するその依存性がさらに減少する。
実際、テストケースとして細菌門Firmicutesを使用して、このパイプラインが事実上全ての公知のシス調節RNAを有用に予想することが以前に証明された(Yao 2007)。パイプラインはまた、これらが偶然に相同遺伝子の上流である場合にトランスにコードされたRNA(すなわち「非コードRNA」(ncRNA))である可能性が高いモチーフを見い出す。
このパイプラインを使用して、そのゲノムが配列決定された全細菌の間の構造化RNAを見い出すことができる。保存された構造化RNAである可能性が高い22モチーフを記載する。リボスイッチ(特定の小分子を直接感知して遺伝子発現を調節するmRNA中に通常見出される構造化RNA型)が主な研究対象であった(Winkler 2005;Batey 2006)。その後の実験により、これらのモチーフのうちの2つが新規のリボスイッチであることが確認された。第1のモチーフはSAH(S−アデノシルホモシステイン)に結合し(図1)、第2のモチーフはStreptomyces coelicolorおよび関連種におけるSAM(S−アデノシルメチオニン)結合リボスイッチである。別のリボスイッチ候補を使用した実験の証拠は、これがモリブデン補因子(すなわち、「Moco」)を感知することを示す。
特に興味深い候補は、リボスイッチに典型的な性質を有するGEMM(環境、膜、および運動性の遺伝子)モチーフである。例えば、GEMMは、広範且つ高度に保存された遺伝子エレメントであり、309例のうち297例で、隣接する読み取り枠(ORF)の5’UTR中に存在する可能性が高くなるように配置されている。GEMMによって調節されると予想される遺伝子は、典型的に、細胞外条件に対する感知および反応に関連し、GEMMがシグナル伝達または細胞間情報交換のために産生された代謝産物を感知することができると示唆される。
1.材料と方法
i.候補RNAモチーフの同定
保存ドメインデータベース(Marchler−Bauer 2005)バージョン2.08で分類された遺伝子の潜在的な5’UTRを、コンピュータパイプラインの入力として使用した(Yao 2007)。完成したゲノム配列および遺伝子の位置を、RefSeq(Pruitt 2005)バージョン14から取り出したが、その遺伝子含量が他のゲノムと高度に類似するゲノムを排除した。UTR抽出アルゴリズム(Neph 2006)により、オペロン構造のためにUTRが常に遺伝子のすぐ上流に存在し得ないという事実が説明された。
i.候補RNAモチーフの同定
保存ドメインデータベース(Marchler−Bauer 2005)バージョン2.08で分類された遺伝子の潜在的な5’UTRを、コンピュータパイプラインの入力として使用した(Yao 2007)。完成したゲノム配列および遺伝子の位置を、RefSeq(Pruitt 2005)バージョン14から取り出したが、その遺伝子含量が他のゲノムと高度に類似するゲノムを排除した。UTR抽出アルゴリズム(Neph 2006)により、オペロン構造のためにUTRが常に遺伝子のすぐ上流に存在し得ないという事実が説明された。
各保存ドメインについて、収集された潜在的UTR配列をCMfinderバージョン0.2へのインプットとして供し、UTR組内の構造的に保存されたモチーフの複数の局所配列アラインメントを生成した。次いで、誤注釈づけされたORFの理由を明らかにするために遺伝子間領域が両末端上の50ヌクレオチドまで伸長したことを除き、これらのアラインメントを使用して、注釈づけされた遺伝子間領域内のさらなるホモログを検索した。この相同性検索を、ML−ヒューリスティックフィルタ(Weinberg 2006)を備えたRAVENNAプログラムバージョン0.2f(Weinberg 2004;Weinberg 2004ii;Weinberg 2006)、Infernal(Eddy 2005)バージョン0.7によって実行した大域モードにおける共分散モデル(Eddy 1994)、およびE値(Klein 2003)カットオフ10を使用して行った。次いで、CMfinderを、これらの新規のホモログを使用して、その最初のアラインメントを洗練させた。公知のRNAを、Rfamデータベース(Griffiths−Jones 2005)バージョン7.0に基づいて検出した。短い配列の系統発生的保存、種の多様性、および構造基準に基づいて予想をスコアリングした。パイプラインアルゴリズムは、他の場所により詳細に記載されている(Yao 2007)。
細菌ゲノム配列データをグループ分けし、UTR抽出を行い、各群について個別にモチーフ予想および相同性検索を行った。これは、異なる門におけるUTRがしばしば同一モチーフを含まないという事実によって動機付けされた。しかし、わずかな配列決定したメンバーを有する門を分類学に基づいて融合して、モチーフを予測するのに十分な配列データをアセンブリすることを試みた。1つまたは2つの配列決定したメンバーしか持たない門(例えば、Chloroflexi)を無視した。以下の8群を使用した:(1)Firmicutes、(2)Actinobacteria、(3)α−proteobacteria、(4)β−proteobacteria、(5)γ−proteobacteria、(6)δ−およびε−proteobacteria、(7)Cyanobacteria、および(8)Bacteroidetes、Chlorobi、Chlamydiae、Verrucomicrobia、およびSpirochaetes。
ii.候補モチーフの分析および相同性検索ストラテジー
次いで、有望なモチーフを選択し、さらなる相同性検索の実施によってこれらをさらに分析し、そのアラインメントをRALEEで編集した(Griffiths−Jones 2005)。NCBI BLAST(Altschul 1997)、Mfold(Zuker 2003)、Rnall(Wan 2004)を使用し(rho非依存性転写ターミネーターを同定するため)、CMfinderおよびRAVENNAを使用してこれらの分析を補助した。モチーフに関連する代謝経路に関する情報を、KEGG(Kanehisa 2006)から検索した。さらなる構造エレメントの同定によってアラインメントを拡大するために、アラインメントのその5’末端および3’末端を50〜100ヌクレオチド伸長し、必要に応じて、CMfinderを使用するか手作業の検査のいずれかによって再アラインメントした。
次いで、有望なモチーフを選択し、さらなる相同性検索の実施によってこれらをさらに分析し、そのアラインメントをRALEEで編集した(Griffiths−Jones 2005)。NCBI BLAST(Altschul 1997)、Mfold(Zuker 2003)、Rnall(Wan 2004)を使用し(rho非依存性転写ターミネーターを同定するため)、CMfinderおよびRAVENNAを使用してこれらの分析を補助した。モチーフに関連する代謝経路に関する情報を、KEGG(Kanehisa 2006)から検索した。さらなる構造エレメントの同定によってアラインメントを拡大するために、アラインメントのその5’末端および3’末端を50〜100ヌクレオチド伸長し、必要に応じて、CMfinderを使用するか手作業の検査のいずれかによって再アラインメントした。
ホモログのさらなる検索に、いくつかの方法でRAVENNAを使用した。大域モードおよび局所モード(Eddy 2005)の共分散モデル検索の両方により、相補性の結果が得られた。手作業で指示する検索で使用した配列データベースは、RefSeqバージョン19(Pruitt 2005)の「微生物」サブセット、ならびに酸性鉱山廃液(Tyson 2004)(GenBank アクセッション AADL01000000)およびサルガッソー海(Venter、2004)(AACY01000000)由来の環境ショットガン配列であった。
適切な場合、これらの配列の4種のサブセットを検索した。第1に、環境配列データを必ずしも使用したわけではなかった。第2に、モチーフが本来由来する細菌群中のゲノムのみを検索した(例えば、β−proteobacteria)。第3に、遺伝子間領域(前述のように50ヌクレオチド伸長した)のみを検索した。第4に、BLASTプログラムであるtblastnを使用して、モチーフに関連する遺伝子と相同な遺伝子を検索した。次いで、RAVENNA検索を、これらのマッチの2Kb上流(5’UTRを含むと予想される)および200ヌクレオチド下流に対して行った(見かけ上のコード相同性が真のORFの上流を伸長し、それにより、BLASTが開始コドンを誤同定し得るので)。BLASTデータベースとしてモチーフの細菌群を使用することにより、高度に多様なホモログの発見が容易になった。例えば、ε−proteobacteriaにおけるpurD遺伝子上流の検索により、短縮ステムを有するpurDモチーフのホモログ(以下を参照のこと)が明らかとなった。さらに、かかる小さなデータベースを使用して、ML−発見的フィルタをRAVENNAで先に行った。BLASTデータベースとして全配列組を使用する場合、この配列組は他の門のホモログを見い出すのに役立ち得る。
iii.モチーフの排除
モチーフが構造化RNAに特徴的な特徴を示すことができなかった場合、モチーフをさらなる研究から排除した。構造予測を誤ったモチーフの排除を補助するために、配列情報のみを使用して予想された構造中の全ての塩基対を除去することによって相同性検索を行った。構造が保存されない配列ベースのマッチは、予想した構造が不正確であることを示す。しかし、かかるホモログを、構造が保存されると仮定する共分散モデルによって除外することができる。配列ホモログによって提案された構造が実際は不十分に保存されていたことが明らかになった場合、いくつかのモチーフをこのストラテジーを使用して排除した。
モチーフが構造化RNAに特徴的な特徴を示すことができなかった場合、モチーフをさらなる研究から排除した。構造予測を誤ったモチーフの排除を補助するために、配列情報のみを使用して予想された構造中の全ての塩基対を除去することによって相同性検索を行った。構造が保存されない配列ベースのマッチは、予想した構造が不正確であることを示す。しかし、かかるホモログを、構造が保存されると仮定する共分散モデルによって除外することができる。配列ホモログによって提案された構造が実際は不十分に保存されていたことが明らかになった場合、いくつかのモチーフをこのストラテジーを使用して排除した。
iv.コンセンサス図についての保存および共変動の範囲の確立
コンセンサス図中で反映された保存範囲を確立するために(例えば、図1中)、配列に加重して高度に類似するホモログの重要性を減じた。加重にはInferal(Eddy 2005)によって実行されるGSCアルゴリズム(Gerstein 1994)を使用し、次いで、加重ヌクレオチド頻度を複数の配列アラインメント中の各位置で計算した。塩基対を共変動として分類するために、ワトソン−クリックまたはG−U対の加重頻度を計算した。しかし、両ヌクレオチドが除外されていたか、いずれかのヌクレオチドの同一性が不明であった(例えば、4つのいずれかの塩基を示す「N」であった)アラインメント配列を破棄した。2つの配列がモチーフを保有する配列のうちの両方の位置が異なるワトソン−クリックまたはG−U対を有していた場合、共変動位置として分類した。1つの位置のみが異なっていた場合、オカレンスを適合性変異として分類した。しかし、非ワトソン−クリックまたはG−U対の頻度が5%を超えた場合、これらの位置を、共変動または適合性変異と注釈付けしなかった。
コンセンサス図中で反映された保存範囲を確立するために(例えば、図1中)、配列に加重して高度に類似するホモログの重要性を減じた。加重にはInferal(Eddy 2005)によって実行されるGSCアルゴリズム(Gerstein 1994)を使用し、次いで、加重ヌクレオチド頻度を複数の配列アラインメント中の各位置で計算した。塩基対を共変動として分類するために、ワトソン−クリックまたはG−U対の加重頻度を計算した。しかし、両ヌクレオチドが除外されていたか、いずれかのヌクレオチドの同一性が不明であった(例えば、4つのいずれかの塩基を示す「N」であった)アラインメント配列を破棄した。2つの配列がモチーフを保有する配列のうちの両方の位置が異なるワトソン−クリックまたはG−U対を有していた場合、共変動位置として分類した。1つの位置のみが異なっていた場合、オカレンスを適合性変異として分類した。しかし、非ワトソン−クリックまたはG−U対の頻度が5%を超えた場合、これらの位置を、共変動または適合性変異と注釈付けしなかった。
2.結果
i.新規のRNAモチーフの評価および分析
CMfinderパイプラインによって予測された有望な構造化RNAモチーフを手作業で試験して、コンセンサス配列および構造モデルを洗練させ(材料と方法を参照のこと)、可能な機能に関する情報を得た。各候補についての重要な所見を表1にまとめている。同定された22のモチーフのうちの7つを図1に示す。
i.新規のRNAモチーフの評価および分析
CMfinderパイプラインによって予測された有望な構造化RNAモチーフを手作業で試験して、コンセンサス配列および構造モデルを洗練させ(材料と方法を参照のこと)、可能な機能に関する情報を得た。各候補についての重要な所見を表1にまとめている。同定された22のモチーフのうちの7つを図1に示す。
表1.推定構造化RNAモチーフのまとめ。「RNA」=RNAとして機能する(dsDNAと対照的)、「Cis」=シス調節性、「スイッチ」=リボスイッチ。評価:「Y」=確実に真、「y」=おそらく真、「?」=可能性あり、「n」=おそらく真でない、「N」=確実に真でない。これらの評価を、実験的試験前に行った。残りの列は、以下である:「門/綱」(モチーフを含む門またはproteobacteriaについては綱)、「M,V」(「M」=モジュラーステム(時々しか存在しないステムである)を有する、「V」=可変長ステム)、「Cov.」=共変動対合の位置の数(方法を参照のこと;この数字のみによってモチーフを分類することは望ましくなく、むしろ、全体としてアラインメントを評価すべきであることに留意のこと)、「#」=代表数、「Non cis」=X/Y(ここで、Xは遺伝子に対して5’調節性立体配置にない代表数であり、Yは注釈づけされた遺伝子を有する配列内の代表数である(いくつかのRefSeq配列は注釈づけを欠く))。MocoおよびSAM−IVリボスイッチデータを、将来の報告で示す。ガンマ−150および球菌−1は、付録のみに示す。
リボスイッチなどのシス調節RNAは、mRNA遺伝子を調節するmRNA領域である。細菌では、ほとんどのシス調節RNAは、調節下でmRNAの5’UTR中に見出される。転写開始部位を確実に予想することが可能ではないにもかかわらず、エレメントがmRNAの5’UTR中に存在し得る場合(転写開始部位がエレメントに対して5’にある場合)、モチーフの代表は遺伝子に対して「5’調節立体配置」に存在すると宣言される。ほとんどまたは全てのモチーフの代表が遺伝子に対して5’調節立体配置にある場合、これは、モチーフがシス調節機能を有することができるという証拠である。
シス調節RNAは、しばしば、以下の2つの注目すべき構造の特徴のうちの1つを有する:rho非依存性転写ターミネーターまたはシャイン−ダルガルノ配列(細菌リボゾーム結合部位)と重複するステム(Winkler 2005)。rho非依存性転写ターミネーターは、強力なヘアピンおよびその後の4つ以上のU残基からなる(Henkin 2002)。調節RNAドメインは、ターミネーターステムの条件付き形成によって遺伝子発現を調節することができる。同様に、条件付きで形成されたステムは、シャイン−ダルガルノ配列と重複し、それにより、翻訳レベルで遺伝子を調節することができる(Winkler 2005)。
本研究で同定された、いくつかのモチーフは、1つまたはタンデムなヘアピンからなる。これらのうちのいくつかは、ホモ二量体タンパク質が逆鎖(opposite strand)中の所与のDNAベースのエレメントに結合するタンパク質結合モチーフである可能性がある。便宜上、モチーフが構造化RNAを形成できないか、mRNAレベルで機能できないにもかかわらず、かかるモチーフは5’調節立体配置を有するとも説明される。
ii.GEMMモチーフ
GEMMは細菌に広範に存在し、高度に保存された配列および構造を有するようであり、推定RNAに実質的な生化学的制約を課する機能が示唆される。322のGEMM配列がグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方で見出された。これはδ−proteobacteria、特にGeobacterおよび関連する属で共通である。γ−proteobacteria内で、AlteromonadalesおよびVibrionalesに遍在する。FirmicutesおよびPlantomycetes門の一定の目でも共通である。GEMMを有する重要な病原体には、コレラおよび炭疽の原因病原体が含まれる。
GEMMは細菌に広範に存在し、高度に保存された配列および構造を有するようであり、推定RNAに実質的な生化学的制約を課する機能が示唆される。322のGEMM配列がグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方で見出された。これはδ−proteobacteria、特にGeobacterおよび関連する属で共通である。γ−proteobacteria内で、AlteromonadalesおよびVibrionalesに遍在する。FirmicutesおよびPlantomycetes門の一定の目でも共通である。GEMMを有する重要な病原体には、コレラおよび炭疽の原因病原体が含まれる。
配列データが遺伝子注釈づけを含む309のGEMM例のうち、GEMMは、297の例で遺伝子に対して5’調節立体配置にあり、これはシス調節の役割を意味する。おそらくGEMMによって調節される遺伝子は広範な機能を示すが、ほとんどの遺伝子は細胞外環境または膜に関連し、多数の遺伝子は運動性に関連する。
GEMMは、P1およびP2と指定した2つの隣接するヘアピン(対合領域)からなる(図1および3)。P1は、配列および構造中で高度に保存されており、3−ヌクレオチド内部ループによって分離された2塩基対および6塩基対のステムからなり、末端ループによってキャッピングされている。内部ループは高度に保存されており、末端ループはほぼ必ずGNRAテトラループである(Hendrix 1997)。P1ステムは、いくつかの位置で共変動するという相当な証拠があり、広範な細菌にわたって構造において高度に保存されている。この事実ならびにP2のより適度な共変動および可変長ステムにより、GEMMが構造化RNAとして機能する強力な証拠が得られる。実施例2は、GEMMモチーフがリボスイッチ中で機能することを証明している。P1およびP2に連結する配列は、事実上常にAAAであり、322の例で例外はわずか2つである。
P2ヘアピンは、P1よりも適度に保存される。P1テトラループがGAAAである場合、GNRAテトラループ受容体は、通常はP2中に出現する。この受容体は、しばしば、周知の11−ntモチーフであり、GAAAループに支持され得るが、いくつかの配列は新規のテトラループ受容体であり得る。P1がGYRAテトラループを有する場合、P2塩基により近いバルジが時折見出されるにもかかわらず、受容体様配列はほとんど存在しない(図2)。
多数のGEMM例には、rho非依存性転写ターミネーターヘアピンが含まれる。ターミネーターステムの5’側は、しばしば、P2ステムの3’側と重複する(そしておそらく競合する)(図2B)。GEMMがリボスイッチである場合、リガンド結合は、提案されたP1およびP2構造を安定化し、それにより、競合する転写ターミネーターの形成を防止することができる。このモデルでは、より高いリガンド濃度によって遺伝子発現が増加する。δ−proteobacteria中のGEMM代表の1/3および他の分類群のいくつかは、「タンデム」配置にあり、ある例では、同一UTR中の別の場所の3’および別の場所付近に見出される。調節RNAのかかる配置は、簡潔な調節RNA立体配置によって許容されるよりも精巧な遺伝子発現調節に関与する(Sudarsan 2006;Welz 2007;Mandal 2006)。
GEMMの生化学的役割の理解により、広範な種々の微生物過程を明らかにすることができ、GEMMは微生物過程を調節するようである。実際、GEMMは、既にいくつかの研究対象とされているVibrio choleraeおよびGeobacter sulfurreducens種における2つの系に関与する。Vibrio choleraeはヒトでコレラを引き起こすが、その生活環の多くを水中で過し、多数の甲殻類のキチン含有外骨格に接着することができる。キチン(GlcNAc(N−アセチルグルコサミン)のポリマー)は、多数のV.choleraeの遺伝子発現に影響を及ぼすことが示されている(Meibom 2004)。GEMMは、これらのキチン誘導性遺伝子の2つを調節するようである。第1のgbpAは、キチンビーズ(Meibom 2004)およびヒト上皮細胞(Kirn 2005)への接着ならびにマウス感染(Kirn 2005)に重要である。
第2のキチン誘導性遺伝子はtfoXVCである。注目すべきことに、キチンは、V.choleraeにおける天然のコンピテンスを誘導し(Meibom 2005)、tfoXVC発現はこのコンピテンスに不可欠である。V.choleraeは、個別のtfoXドメインに対応するCDDモデルであるCOG3070およびpfam04994に適合する2つの遺伝子を有する。両ドメインから10−25より良好なRPSBLAST(Schaffer 2001)E値が得られる。これらのうちの1つはtfoXVC(VC1153遺伝子座)である。GEMMは、tfoXGEMM(VC1722)と呼ばれる他の遺伝子を調節するようである。したがって、V.choleraeおよび関連細菌では、GEMMは、キチン誘導性コンピテンスに関与し得るか、高濃度のキチンを含まない環境下でコンピテンスでさえも調節することができる。
Geobacteria sulfurreducensおよび関連するδ−proteobacteriaは、電子受容体としてFe(III)などの金属イオンを使用して有機化合物を酸化することによってATPを生成することができる(Methe 2003)。GEMMは、Geobacter種におけるピリ線毛アセンブリ遺伝子に関連する。G.sulfurreducensにおけるピリ線毛は、導電性を示しており(Reguera 2005)、したがって、金属イオンの還元過程の一部である。
さらに、GEMMは、G.sulfurreducensにおいて7つのチトクロームc遺伝子を調節するようである。この細菌が111の推定チトクロームc遺伝子を有するにもかかわらず、7つのGEMM関連遺伝子のうちの5つが以前の研究で同定されており、特別な役割を有し得る。OmcS(外膜チトクロームS)は、G.sulfurreducensの外膜上に非常に豊富な2つのタンパク質のうちの1つであり、不溶性酸化鉄(III)の還元に必要であるが、可溶性クエン酸鉄(III)には必要でない(Mehta 2005)。OmcGおよびOmcHは、OmcB(多くの条件下で不可欠なチトクロームc)の産生に必要である(Kimm 2006)。OmcAおよびOmcTは、OmcG、OmcH、またはOmcSと関連する。4つの他のOmc注釈づけのみがGEMMと直接関連しないG.sulfurreducensに残存する(OmcB、OmcC、OmcE、およびOmcF)。
公知のリボスイッチと異なり、GEMMは、非常に多様な遺伝子機能に関連する(表2)。この所見は、GEMMリボスイッチが代謝経路の調節のための典型的なフィードバックセンサーとしての機能を果たさないことを示す。むしろ、GEMMは、シグナル伝達、またはおそらく細胞間情報交換に関与する第2のメッセンジャー分子を感知する(Bassler 2006)。実施例2は、GEMMモチーフの二次メッセンジャートリガー分子がサイクリックジGMPであることを証明している。この方法では、異なる細菌は、異なる過程を調節するためにGEMMおよびそのシグナル伝達分子を使用する。多数のGEMM関連遺伝子がシグナル伝達ドメインをコードするという事実は、多数のシグナル伝達タンパク質が調節される機構を示す。実施例2は、GEMM RNAが実際に新規に見出されたリボスイッチクラスのアプタマー成分としての機能を果たすことを証明している。
SAHモチーフは、配列および構造中で高度に保存されており(図1)、予想されるステム領域内の共変動を示す(モジュラーステムおよび可変長ステムが含まれる)。SAHモチーフは、SAH(S−アデノシルホモシステイン)代謝に関連する遺伝子に対して5’調節立体配置、主に、β−およびいくつかのγ−proteobacteria、特にシュードモナス属中で見出される。SAHは、S−アデノシルメチオニン(SAM)代謝回路の一部であり、その主な成分には、アミノ酸メチオニンおよびその誘導体ホモシステインが含まれる。SAHは、メチル化反応の補因子としてSAMを使用する酵素の副生成物である。典型的には、SAHは、ホモシステインおよびアデノシンに加水分解される。次いで、ホモシステインを使用して、メチオニンを合成し、最終的にSAMを合成する。
SAHが多数のSAM依存性メチルトランスフェラーゼを阻害するので、高レベルのSAHは細胞に有毒である(Ueland 1982)。したがって、細胞は、SAH濃度の上昇を感知し、有毒レベルに到達する前にこの化合物を破棄する必要がある可能性が高い。SAHモチーフが関連する遺伝子は、メチオニン合成で使用されるメチル供与体を合成するS−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ(ahcY)、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ(metH)、およびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(metF)である。SAHモチーフのこの遺伝子配置およびその高保存度は、SAHの感知およびその産物がSAH破壊に必要な遺伝子の発現の活性化での役割と一致する。実際、生化学的および遺伝的証拠は、このモチーフがSAH感知リボスイッチであるという仮説を支持する。
iv.COG4708モチーフ
このモチーフは、Streptococcusのいくつかの種およびLactococcus lactisのCOG4708遺伝子の上流に見出されるが、StreptococcusのCOG4708遺伝子ファミリーのいくつかの例では推定RNAモチーフを欠く。COG4708遺伝子は、膜タンパク質をコードすると予想される。
このモチーフは、Streptococcusのいくつかの種およびLactococcus lactisのCOG4708遺伝子の上流に見出されるが、StreptococcusのCOG4708遺伝子ファミリーのいくつかの例では推定RNAモチーフを欠く。COG4708遺伝子は、膜タンパク質をコードすると予想される。
COG4708モチーフ(preQ1−IIモチーフともいうことができる)は系統発生学的に高度に制約されており、6つの固有の配列しか持たないにもかかわらず、このモチーフは、共変動、モジュラーステム、および可変長ステムを示す(図1)。モチーフは、COG4708遺伝子のシャイン−ダルガルノ配列と重複するシュードノットを有し、モチーフがこれらの遺伝子のシスレギュレーターをコードすることを示す。
改変核酸塩基preQ1を感知するリボスイッチが最近特徴づけられた(Roth 2007)。このリボスイッチがCOG4708と関連するので、COG4708がpreQ1に関連する代謝産物の輸送体であることが提案された。したがって、COG4708モチーフがpreQ1感知リボスイッチでもあると考えられた。実験はこのことを支持している。COG4708モチーフは、以前に特徴づけられたpreQ1感知リボスイッチ(Roth 2007)と配列や構造が類似しない。
v.sucAモチーフ
SucAモチーフは、関連下流遺伝子であるsucB/aceFおよびlpdと同時転写される可能性が高いsucA遺伝子に対して5’調節立体配置中のみで見出される。これらの3つの遺伝子産物は、クエン酸回路中で2−オキソグルタル酸塩からスクシニル−CoAを合成する。sucAモチーフの全ての検出例は、Burkholderiales目の中のβ−proteobacteriaにある。sucAモチーフ中の多数のヌクレオチドが厳格に保存されているが、そうでないヌクレオチドは、共変動を示し、非標準的塩基対をほとんど含まない(図1)。モチーフは推定シャイン−ダルガルノ配列と重複するステムを有し、それにより、sucAモチーフはシス調節RNAに対応することができる。sucAモチーフの比較的複雑な構造は、これがリボスイッチであり得ることを示す。
SucAモチーフは、関連下流遺伝子であるsucB/aceFおよびlpdと同時転写される可能性が高いsucA遺伝子に対して5’調節立体配置中のみで見出される。これらの3つの遺伝子産物は、クエン酸回路中で2−オキソグルタル酸塩からスクシニル−CoAを合成する。sucAモチーフの全ての検出例は、Burkholderiales目の中のβ−proteobacteriaにある。sucAモチーフ中の多数のヌクレオチドが厳格に保存されているが、そうでないヌクレオチドは、共変動を示し、非標準的塩基対をほとんど含まない(図1)。モチーフは推定シャイン−ダルガルノ配列と重複するステムを有し、それにより、sucAモチーフはシス調節RNAに対応することができる。sucAモチーフの比較的複雑な構造は、これがリボスイッチであり得ることを示す。
vi.23S−メチルモチーフ
本モチーフは、23SrRNAに作用することができるrRNAメチルトランスフェラーゼと注釈づけされた遺伝子の上流に一貫して存在する。23S−メチルRNAが、逆鎖上の介在配列中の他の遺伝子と共に23SrRNAメチルトランスフェラーゼORFからおよそ3Kbに存在する場合、1つの例外が見出される。23S−メチルモチーフは、Firmicutesの目であるLactobacillalesに限定される。
本モチーフは、23SrRNAに作用することができるrRNAメチルトランスフェラーゼと注釈づけされた遺伝子の上流に一貫して存在する。23S−メチルRNAが、逆鎖上の介在配列中の他の遺伝子と共に23SrRNAメチルトランスフェラーゼORFからおよそ3Kbに存在する場合、1つの例外が見出される。23S−メチルモチーフは、Firmicutesの目であるLactobacillalesに限定される。
23S−メチルモチーフは、2つの大きなヘアピンからなる。第2のヘアピンは一続きのUで終結し、rho非依存性転写ターミネーターであり得る。両ステムは相当な共変動を有し、これらが機能的RNAの一部であるという強力な証拠が得られる。構造モデルは多数の対合位置が時折非標準的塩基対を有することを示すにもかかわらず、モチーフの各例は主にエネルギー的に好ましい対からなる。推定転写ターミネーターの存在は、これがシス調節RNAであることを示す。23SrRNAメチルトランスフェラーゼがRNA基質と相互作用するので、リボゾームタンパク質遺伝子の自己調節と類似の様式で23S−メチルモチーフを使用してその発現を自己調節することができる(Zengel 1994)。
vii.hemB/抗hemBモチーフ
本モチーフは、種々のβ−proteobacteria、特にBurkholderiaで見出される。転写され得るDNA鎖に関していくつかの多義性が存在し、これは、その構造が類似する共変動および両方向での保存を示すからである。ある方向では、これはしばしばhemB遺伝子の上流にある。これはこの方向でシス調節RNAであり得るが、hemBモチーフ代表のすぐ下流に存在する相互に相同でない2つの遺伝子が存在し、これらはシス調節RNAの通常の様式で調節されるべき誤った鎖上に存在する。他の方向では(アンチhemB)、モチーフは、典型的には、遺伝子の5’UTRに存在しない。アンチhemBモチーフは、転写ターミネーターヘアピンで終結する。アンチhemB例下流の多数の遺伝子は、逆鎖上にあり、したがって、アンチhemBが非コードRNAをコードすることができることを示す。
本モチーフは、種々のβ−proteobacteria、特にBurkholderiaで見出される。転写され得るDNA鎖に関していくつかの多義性が存在し、これは、その構造が類似する共変動および両方向での保存を示すからである。ある方向では、これはしばしばhemB遺伝子の上流にある。これはこの方向でシス調節RNAであり得るが、hemBモチーフ代表のすぐ下流に存在する相互に相同でない2つの遺伝子が存在し、これらはシス調節RNAの通常の様式で調節されるべき誤った鎖上に存在する。他の方向では(アンチhemB)、モチーフは、典型的には、遺伝子の5’UTRに存在しない。アンチhemBモチーフは、転写ターミネーターヘアピンで終結する。アンチhemB例下流の多数の遺伝子は、逆鎖上にあり、したがって、アンチhemBが非コードRNAをコードすることができることを示す。
viii.MAEB(Burkholderiaにおける代謝関連エレメント)
本モチーフは、いくつかの保存された位置を有する1つのヘアピンからなる(図1)。これはBurkholderia(β−proteobacteria属)に広範に存在する。これは、典型的には保存されたリンカー配列と共に連続して複数回見出されるが(2〜6コピー)、2つの例中で12コピーにも及ぶ。単一または反復MAEBモチーフの141個のオカレンスのうちの132個は遺伝子に対して5’調節立体配置内に存在する。実際、これらの多数の遺伝子は、一次代謝に直接関与し(例えば、小分子の生合成、異化、または輸送に関与する遺伝子)、DNA修復、複製、シグナル伝達、または運動性などの遺伝子ではない。1つを超える例中のMAEB下流の46個の保存ドメイン(仮説上の遺伝子を除く)のうち、少なくとも42個を、一次代謝に関与すると注釈づけする。一次代謝に関与しない多数の細菌遺伝子が存在するので、これらのデータは代謝遺伝子調節との機能的関連を示す。
本モチーフは、いくつかの保存された位置を有する1つのヘアピンからなる(図1)。これはBurkholderia(β−proteobacteria属)に広範に存在する。これは、典型的には保存されたリンカー配列と共に連続して複数回見出されるが(2〜6コピー)、2つの例中で12コピーにも及ぶ。単一または反復MAEBモチーフの141個のオカレンスのうちの132個は遺伝子に対して5’調節立体配置内に存在する。実際、これらの多数の遺伝子は、一次代謝に直接関与し(例えば、小分子の生合成、異化、または輸送に関与する遺伝子)、DNA修復、複製、シグナル伝達、または運動性などの遺伝子ではない。1つを超える例中のMAEB下流の46個の保存ドメイン(仮説上の遺伝子を除く)のうち、少なくとも42個を、一次代謝に関与すると注釈づけする。一次代謝に関与しない多数の細菌遺伝子が存在するので、これらのデータは代謝遺伝子調節との機能的関連を示す。
MAEBと豊富なグリシンに対する細胞応答との間の関係が存在し得る。MAEBはgcvPおよびgcvT(グリシン切断系の一部である)と頻繁に関連し、過剰なグリシンがクエン酸回路に流れ込む。MAEBはまた、いくつかのクエン酸回路遺伝子に関連する。しかし、MAEBは、グリシンまたはクエン酸回路とより希薄な関係を有するいくつかの他の遺伝子と関連する。最も多数のMAEB反復がこの系中のgcv遺伝子と関連するので、グリシン切断系との関係が存在し得る。さらに、グリシンに結合する少なくとも1つのリボスイッチクラスが存在するが、このクラスは、MAEBを有する生物中のゲノムあたりたった1コピーでしか存在せず、MAEBのためのグリシン調節での役割に留まり得る。
MAEBモチーフの代表は、塩基対合を保存する共変動を示すが、他は対合を破壊する変異を保有する。この事実は、実際に、これが、各タンパク質単位が逆鎖に結合するようにタンパク質二量体に結合するDNA配列であり得る。対称的な位置の1つの対でのヌクレオチドは、ステムの両側でプリン(AまたはG)として保存される。プリンがワトソン−クリック対では決してないので、プリンは逆鎖上に同じ同一性を持つことができない。DNA結合モチーフの例が異なり得ることが予想されるにもかかわらず、対称プリンは、モチーフ自体(単に例ではない)が逆鎖上に異なるパターンを有することを意味する。
ix.ミニ−ykkCモチーフ
ミニ−ykkCモチーフは、そのステムが相当な共変動を示し、そのループが特徴的なACGRモチーフを有する2つのタンデムヘアピンからなる(図1)。ミニ−ykkCは、α−、β−、およびγ−proteobacteriaに広範に存在し、他の分類群にさらなる例が存在する。前記ykkC/yxkDモチーフと類似の遺伝子組のシス−レギュレーターのようであるので、本モチーフをミニ−ykkCと命名した(Barrick 2004)(以後「ykkC」と呼ぶ)。ykkCおよびミニ−ykkCに共通の8つ全ての保存ドメインを以下に列挙する。ykkCおよびミニ−ykkCの構造は無関係のようである。
ミニ−ykkCモチーフは、そのステムが相当な共変動を示し、そのループが特徴的なACGRモチーフを有する2つのタンデムヘアピンからなる(図1)。ミニ−ykkCは、α−、β−、およびγ−proteobacteriaに広範に存在し、他の分類群にさらなる例が存在する。前記ykkC/yxkDモチーフと類似の遺伝子組のシス−レギュレーターのようであるので、本モチーフをミニ−ykkCと命名した(Barrick 2004)(以後「ykkC」と呼ぶ)。ykkCおよびミニ−ykkCに共通の8つ全ての保存ドメインを以下に列挙する。ykkCおよびミニ−ykkCの構造は無関係のようである。
ykkCモチーフは、高度に構造化され、広範に保存されたモチーフである。しかし、ミニ−ykkCの簡潔な構造は、その広範な系統発生によって広範な保存を指示する機能が示唆されるにもかかわらず、ほとんどの他のリボスイッチに特徴的ではない。比較的狭い一連の遺伝子機能に関連し、そのコード領域に近い(90%がシャイン−ダルガルノ配列の33ヌクレオチド内に存在する)ので、ミニ−ykkCは、シス調節エレメントのようである。遺伝子発現を調節するために使用される機構が異なり得るにもかかわらず、ミニ−ykkCはykkCモチーフと同一の役割を果たすことができる。たった1つのヘアピンを有するミニ−ykkCの例が存在し得ることに留意のこと。
x.PurDモチーフ
PurDモチーフは、完全に配列決定されたε−proteobacteria(例えば、CampylobacterおよびHelicobacter)中の全purD遺伝子の上流に見出される。purD遺伝子は、プリン生合成に関与するGAR(ホスホリボシルグリシンアミド)シンセターゼをコードする。purDモチーフは、塩基対合を破壊するいくつかの変異も示すが、共変動およびモジュラーステムを示す(図1)。
PurDモチーフは、完全に配列決定されたε−proteobacteria(例えば、CampylobacterおよびHelicobacter)中の全purD遺伝子の上流に見出される。purD遺伝子は、プリン生合成に関与するGAR(ホスホリボシルグリシンアミド)シンセターゼをコードする。purDモチーフは、塩基対合を破壊するいくつかの変異も示すが、共変動およびモジュラーステムを示す(図1)。
xi.6Cモチーフ
本モチーフはActinobacteriaに広範に存在し、2つのヘアピンからなり、各ヘアピンのループは、少なくとも一続きの6Cを含む。6Cモチーフは、そのステム中に顕著な共変動を示す。6Cモチーフ例は、通常、染色体分配およびピリ線毛アセンブリに関連すると予想される遺伝子に適度に近い(200〜300ヌクレオチド)。
本モチーフはActinobacteriaに広範に存在し、2つのヘアピンからなり、各ヘアピンのループは、少なくとも一続きの6Cを含む。6Cモチーフは、そのステム中に顕著な共変動を示す。6Cモチーフ例は、通常、染色体分配およびピリ線毛アセンブリに関連すると予想される遺伝子に適度に近い(200〜300ヌクレオチド)。
xii.トランスポゾンおよび切出し酵素関連モチーフ
α−proteobacteriaにおける1つのトランスポザーゼ関連モチーフおよびActinobacteriaにおけるXis切出し酵素に関連する別のモチーフも見出された。両モチーフは、主に、10〜15塩基対ステムを有する1つのヘアピンからなる。両モチーフはまた、多数の共変動も示し、これにより、これらのモチーフが機能的構造化RNAを形成することが示唆される。切出し酵素モチーフは、切出し酵素遺伝子に対して5’調節立体配置内に存在する。
α−proteobacteriaにおける1つのトランスポザーゼ関連モチーフおよびActinobacteriaにおけるXis切出し酵素に関連する別のモチーフも見出された。両モチーフは、主に、10〜15塩基対ステムを有する1つのヘアピンからなる。両モチーフはまた、多数の共変動も示し、これにより、これらのモチーフが機能的構造化RNAを形成することが示唆される。切出し酵素モチーフは、切出し酵素遺伝子に対して5’調節立体配置内に存在する。
xiii.ATPCモチーフ
ATPCモチーフはいくつかのCyanobacteriaにおいてATPシンターゼオペロン中のAサブユニットとCサブユニットをコードする遺伝子間で見出される。ATPCモチーフ例は、Prochlorococcus marinusの全ての配列決定された株および一定のSynechococcus種で見出される。本モチーフは、主に、3ステムジャンクションからなる。以前の研究により、Cyanobacterial ATPシンターゼオペロン中のヘアピン様構造が提案されたが、この構造はより複雑な形状ではなく、ATPCモチーフと異なる位置に存在するCurtis 1988)。
ATPCモチーフはいくつかのCyanobacteriaにおいてATPシンターゼオペロン中のAサブユニットとCサブユニットをコードする遺伝子間で見出される。ATPCモチーフ例は、Prochlorococcus marinusの全ての配列決定された株および一定のSynechococcus種で見出される。本モチーフは、主に、3ステムジャンクションからなる。以前の研究により、Cyanobacterial ATPシンターゼオペロン中のヘアピン様構造が提案されたが、この構造はより複雑な形状ではなく、ATPCモチーフと異なる位置に存在するCurtis 1988)。
xiv.The シアノ−30Sモチーフ
本モチーフは、いくつかのCyanobacteria中に見出され、30Sリボゾームタンパク質S1をコードする遺伝子に対して5’調節立体配置内にある。これは、相互に異なる2つのヘアピン、P1ループ中の5つのヌクレオチドがP2の3’末端をちょうど超えたヌクレオチドと塩基対合するシュードノットからなる。P1およびP2中の対合を破壊するいくつかの変異が存在するにもかかわらず、これらのステム中に多数の代償的変異も存在する。さらに、シュードノット中の対合は共変動し、全ての代表中に存在する。
本モチーフは、いくつかのCyanobacteria中に見出され、30Sリボゾームタンパク質S1をコードする遺伝子に対して5’調節立体配置内にある。これは、相互に異なる2つのヘアピン、P1ループ中の5つのヌクレオチドがP2の3’末端をちょうど超えたヌクレオチドと塩基対合するシュードノットからなる。P1およびP2中の対合を破壊するいくつかの変異が存在するにもかかわらず、これらのステム中に多数の代償的変異も存在する。さらに、シュードノット中の対合は共変動し、全ての代表中に存在する。
遺伝子コンテクストを考慮すると、このモチーフは、下流リボゾームタンパク質遺伝子のリガンドを模倣することができ(Zengel 1994)、それにより、この遺伝子産物はその自己の発現を調節する。シアノ−30Sモチーフの同定により、かかるRNAが広範な種々の門で見出されるという見解が支持される。
xv.Lactobacillalesモチーフ
lacto−1およびlacto−2モチーフは、Lactobacillales目に制限される。lacto−1モチーフはいくつかの共変動を有するが、いくつかの変異が塩基対合を破壊する。いくつかの例は、主なヘアピンとシャイン−ダルガルノ配列との間のS(MK)(またはSAM−III)(Fuchs 2006)リボスイッチの可変領域を交差する。lacto−2モチーフは、多数の内部ループを有する大きなヘアピンからなり、このループのいくつかは、高度に保存された配列を有する。いくつかの変異が対合を破壊するにもかかわらず、相当な量の共変動が存在し、lacto−2モチーフ例が構造化RNAであることが示唆される。
lacto−1およびlacto−2モチーフは、Lactobacillales目に制限される。lacto−1モチーフはいくつかの共変動を有するが、いくつかの変異が塩基対合を破壊する。いくつかの例は、主なヘアピンとシャイン−ダルガルノ配列との間のS(MK)(またはSAM−III)(Fuchs 2006)リボスイッチの可変領域を交差する。lacto−2モチーフは、多数の内部ループを有する大きなヘアピンからなり、このループのいくつかは、高度に保存された配列を有する。いくつかの変異が対合を破壊するにもかかわらず、相当な量の共変動が存在し、lacto−2モチーフ例が構造化RNAであることが示唆される。
xvi.TD(Treponema denticola)モチーフ
2つの予想されるモチーフは、Treponema denticolaにおいていくつかの例を有するが、任意の他の配列決定された細菌において見出されない。TD−1およびTD−2モチーフは、それぞれ、28および36の代表を有する。7つのTD−1モチーフ代表は、TD−2の例の逆相補物と重複し、2つのほとんどの5’ヘアピンを共有する。
2つの予想されるモチーフは、Treponema denticolaにおいていくつかの例を有するが、任意の他の配列決定された細菌において見出されない。TD−1およびTD−2モチーフは、それぞれ、28および36の代表を有する。7つのTD−1モチーフ代表は、TD−2の例の逆相補物と重複し、2つのほとんどの5’ヘアピンを共有する。
両モチーフは、共変動および可変長またはモジュラーステムのいずれかを示す。TD−1モチーフは、通常、遺伝子に対して5’調節立体配置内にある。TD−2モチーフは5’調節立体配置を共有しないので、非コードRNAに対応することができる。
3.考察
CMfinderベースの比較ゲノミクスパイプラインを使用して、22の新規の推定RNAモチーフが見出された。2つは、リボスイッチと既に実験で確認されている。いくつかの他のモチーフについて、共変動および他の特徴は、モチーフが機能的構造化RNAであり、多数のモチーフについての可能な機能が提案されていることを示す。したがって、パイプラインは、新規RNAの発見に有用なようである。
CMfinderベースの比較ゲノミクスパイプラインを使用して、22の新規の推定RNAモチーフが見出された。2つは、リボスイッチと既に実験で確認されている。いくつかの他のモチーフについて、共変動および他の特徴は、モチーフが機能的構造化RNAであり、多数のモチーフについての可能な機能が提案されていることを示す。したがって、パイプラインは、新規RNAの発見に有用なようである。
その知見は、CMfinderベースのパイプラインが広く存在し且つ高度に保存された広範な二次構造を保有するRNAを回収することができること、およそ60ヌクレオチド長以上であること、および相同遺伝子と関連することを示している。3つの候補リボスイッチは、これらの特徴を有する(GEMM、Moco、およびSAH)。残り3つの候補であるSAM−IV、COG4708モチーフ、およびsucAモチーフは、これらのモチーフが分類法レベルで1つの目以外では見出されないという点で、最も知られているリボスイッチよりも分布が狭い。
(実施例2)
B.実施例2:真正細菌におけるリボスイッチクラスは二次メッセンジャーサイクリックジGMPを感知する
サイクリックジGMPは、多様な細菌種において広範な生理学的変化を誘発するための二次メッセンジャーとして機能する環状RNAジヌクレオチドである。過程の調節には、細胞分化、運動型とバイオフィルム生活様式との間の変換、および毒性遺伝子発現が含まれる。しかし、遺伝子発現を調節するためにサイクリックジGMPによって使用される機構は、20年前よりも前の化合物の発見以来依然として未解明のままである。データは、多数の細菌種におけるサイクリックジGMPが多数の基本的細胞過程に関与する遺伝子発現を調節するリボスイッチによって感知されることを示す。種々のサイクリックジGMPレギュロン(毒性遺伝子発現、ピリ線毛形成、および鞭毛オルガネラ生合成に関連するいくつかのリボスイッチが含まれる)が明らかにされている。さらに、サイクリックジGMPリボスイッチのコンセンサスに適合する配列は、バクテリオファージのゲノム中に存在する。
B.実施例2:真正細菌におけるリボスイッチクラスは二次メッセンジャーサイクリックジGMPを感知する
サイクリックジGMPは、多様な細菌種において広範な生理学的変化を誘発するための二次メッセンジャーとして機能する環状RNAジヌクレオチドである。過程の調節には、細胞分化、運動型とバイオフィルム生活様式との間の変換、および毒性遺伝子発現が含まれる。しかし、遺伝子発現を調節するためにサイクリックジGMPによって使用される機構は、20年前よりも前の化合物の発見以来依然として未解明のままである。データは、多数の細菌種におけるサイクリックジGMPが多数の基本的細胞過程に関与する遺伝子発現を調節するリボスイッチによって感知されることを示す。種々のサイクリックジGMPレギュロン(毒性遺伝子発現、ピリ線毛形成、および鞭毛オルガネラ生合成に関連するいくつかのリボスイッチが含まれる)が明らかにされている。さらに、サイクリックジGMPリボスイッチのコンセンサスに適合する配列は、バクテリオファージのゲノム中に存在する。
二次メッセンジャーサイクリックジGMP(図3A)は、細菌Gluconacetobacter xylinus由来のセルロースシンターゼのアクチベーターとして発見された(Ross 1985;Ross 1987)。その後の研究により、サイクリックジGMPが細菌にほぼ遍在し、広範囲にわたって細胞生理学に影響を及ぼすことが明らかとなった(Jenal 2006;Ryan 2006;Tamayo 2007)。サイクリックジGMPは、GGDEFアミノ酸ドメインによって特徴づけられるジグアニル酸シクラーゼ(DGC)酵素によって2つのグアノシン−5’−三リン酸塩分子から形成された環状RNAジヌクレオチドである。一旦形成されると、化合物は、EALまたはHD−GYPアミノ酸ドメインのいずれかを含むホスホジエステラーゼ(PDE)酵素によって選択的に分解される(Jenal 2006;Ryan 2006;Tamayo 2007;Simm 2004およびその参考文献)。多数の細菌種(病原体Vibrio choleraeが含まれる)は、多数の異なるDGCおよびPDEタンパク質を有する(Galperin 2001;Ulrich 2005;Roemling 2005)。これらのタンパク質の活性は、細胞サイクリックジGMP濃度を調整するための特異的刺激によって誘発され(Roemling 2005)、V.choleraeにおけるこの二次メッセンジャー濃度の変化は、皺、バイオフィルム形成、および毒性を調節することが公知である(Lim 2006c;Beyhan 2007;Tischler 2005;Waters 2008)。
細菌で多様な生理学的変化を引き起こすためにサイクリックジGMPによって使用される機構は、長い間不明であった。サイクリックジGMP切断PDEによるターゲティングに加えて、この二次メッセンジャーはいくつかのDGCタンパク質に結合して、それ自体の合成をアロステリックに抑制することができる(Chan 2004;Wassman 2007)。公知の唯一の他のタンパク質標的は、G.xylinus セルロースシンターゼ(Ross 1985;Ross 1987)、Pseudomonas aeruginosa PelDタンパク質(Lee 2007)、およびPilZドメインタンパク質(Ryjenkov 2006)である。しかし、これらのタンパク質に結合するサイクリックジGMPは、その大域的細胞効果を完全に説明していない(Tamayo 2007;Wolfe 2008)。したがって、依然として発見されていないサイクリックジGMPの重要な調節標的が存在する。
サイクリックジGMPのリボスイッチ。サイクリックジGMPリボスイッチの存在によってどのようにしてこの二次メッセンジャーが多数の遺伝子の転写および翻訳を調節するのかを説明することができるとの仮説が立てられている(Tamayo 2007)。いくつかの生物中でDGCおよびPDEタンパク質の読み取り枠(ORF)のすぐ上流に存在するGEMMと呼ばれる高保存RNAドメインの同定が最近報告された(Weinberg、2007)。このRNAドメインはまた、サイクリックジGMPによって調節される可能性が高い遺伝子に頻繁に関連する。GEMM RNAの高保存およびゲノム分布は、その標的リガンド濃度の変化に応答して遺伝子発現を調節する代謝産物感知リボスイッチ(Winkler 2005;Breaker 2008(Science))の特徴である。
GEMM RNAは、1型および2型と呼ばれる2つの類似の構造の1つに適合する(図3B)。両型は、同定した503の代表において広範な共変動を示す2つの塩基対合領域(P1およびP2)を保有する(Weinberg,2007)。1型RNA(303例)は、第2の位置にプリン(R)と共にP1上にGNRAテトラループ(Heus 1991)を有する。GRRA配列の存在は、P2の端のテトラループ受容体の存在と相関し、それはこのテトラループ型とドッキングすることが公知である(Costa 1995)。対照的に、2型RNA(171例)は、テトラループの第2の位置にピリミジン(Y)を有し、いくつかの例では、GYRAテトラループとのドッキングを好むP2上の構造を含む(Costa 1995)。さらなる29個の割り当てられていない代表が存在し、そのうちの24個は非対合ヌクレオチドに隣接したGNRAテトラループを保有し、5個はテトラループ配列を欠く。
GNRAテトラループおよびその受容体は、一般に構造化されたRNA中に見出され、以前にリボスイッチアプタマー中で認められている(Regulski 2008)。しかし、P1およびP2ヘアピンの先端の配列および構造の可変性により、サイクリックジGMPの任意の結合部位が最も保存された特徴を保有する中央または基底の部分に位置する可能性が高いことが示唆される。
GEMM RNAはサイクリックジGMPに選択的に結合する。病原性細菌V.choleraeのゲノムは、個別の染色体上に2つのGEMM RNA配列を保有する。染色体I上で、1型GEMM RNA(Vc1と呼ばれる)はV.cholerae gbpA遺伝子の上流に存在し、キチンまたはその主な単量体単位N−アセチル−D−グルコサミンに結合するタンパク質因子をコードする。GbpAは、ヒトにおけるコレラ感染に関与している(Kirn、2005)。染色体II上で、別の1型RNA(Vc2と呼ばれる)は、tfoXに相同な遺伝子(VC1722)の上流に存在する(Mandal 2003;Meibom 2005)。tfoX遺伝子(いくつかの生物ではsxyと呼ばれる;Cameron 2008)は、V.choleraeがキチンに曝露された場合にコンピテンスが増加する遺伝子の調節を担う因子をコードする。この配列類似性を考慮すると、VC1722タンパク質はまた、転写因子として機能することができる。
両GEMM RNAを使用して生化学分析および遺伝子分析を行って、これらがサイクリックジGMPのアプタマーとして機能するかどうかを決定した。110ヌクレオチドVc2 RNA構築物(110Vc2;図3C)を、100μMサイクリックジGMPの非存在下または存在下でのインライン探索(Soukup 1999)に供した(図3D)。P1ステムおよびP2ステムの塩基の自発的切断パターンの変化により、構造調整を受けた領域付近の保存ヌクレオチド(1〜3と記す)が二次メッセンジャー結合に重要であることが示唆される。Vc1 RNA を含む構築物およびBacillus cereusおよびClostridium difficile由来の代表的なサイクリックジGMPアプタマーについて類似の結果を得た。
種々のサイクリックジGMP濃度を使用したインライン探索に110Vc2 RNAを供することにより、約1nMの見かけ上の解離定数(KD)を確立した。得られたプロット(図4A)は、RNAアプタマーとそのリガンドとの間の1:1飽和相互作用と一致する(Welz 2007)。アプタマーが報告された種々の多量体サイクリックジGMP複合体の1つと結合することができるにもかかわらず(Egli 1990;Zhang 2006)、測定したKD値をはるかに超える濃度でこれらの分子間サイクリックジGMP複合体の形成が起こる。さらに、KDの変化は、インライン探索反応でK+がNa+に置換された場合、これらの1価の金属が形成されたサイクリックジGMP複合体型に影響を及ぼすにもかかわらず、認められない。
110Vc2アプタマーとサイクリックジGMPとの間に形成された複合体は、Escherichia coliのPilZタンパク質ドメインによるサイクリックジGMP結合について測定された親和性(KD=840 nM;Ryjenkov 2006)よりほぼ3桁強い。さらに、二次メッセンジャーの種々のアナログは、Vc2アプタマーによって強く識別される(図4B)。試験したアナログから、二次メッセンジャーの環状構造およびそのグアニン核酸塩基の両方が実質的にリガンド認識に寄与することは明らかである。例えば、EAL PDEによるサイクリックジGMPの線状分解産物(pGpGと呼ばれる)は、ほぼ3桁弱くアプタマーに結合する。同様に、HD−GYP PDEのpG(5’GMP)産物は、サイクリックジGMPのKDより5桁高い濃度であってもアプタマーに結合しない。したがって、このアプタマークラスの生物学的に関連するリガンドは、サイクリックジGMPのようであり、この二次メッセンジャーの分解産物ではないようである。
サイクリックジGMPは、2つの構造的に制限された3’,5’リン酸ジエステル結合を含むRNAジヌクレオチドである(図3A)。いくつかの場合、幾何学的に制限されたヌクレオチド間結合により、RNA鎖切断が加速される(Soukup 1999)。サイクリックジGMPがインライン探索条件下で安定的であるかどうかを評価するために、自発的分解についての速度定数を決定した。インライン探索条件下で、サイクリックジGMPは、3.2×10−6/分の速度定数で切断され(図4C)、これは約150日の半減期に対応する。この速度定数は、類似の条件下でインキュベートした場合に制限されない線状ポリヌクレオチド中に存在するRNA結合について予想される速度定数に類似する(Li 1999)。したがって、二次メッセンジャーは、インライン探索アッセイ中で安定的であり、PDE酵素作用に供されない場合に細胞中でなおさらに安定的である可能性が高い。
サイクリックジGMPリボスイッチによる遺伝子調節。細菌リボスイッチは、典型的には、あまり保存されていない発現プラットフォームのすぐ上流に存在する保存アプタマーを保有する。細菌中のほとんどの発現プラットフォームは、転写終結または翻訳開始を調節する構造を形成する(Barrick 2007)。類似の構造は多数のGEMM RNA代表に関連し、サイクリックジGMPアプタマーがリボスイッチ成分である可能性が高いことを示す。
サイクリックジGMPアプタマーがリボスイッチの感知ドメインとして生体内で機能するかどうかを評価するために、V.cholerae、B.cereus、およびC.difficile由来の4つの5’UTRを選択した。Vc2について、予想された天然プロモーターを含むDNA、アプタマーまたはそのバリアント(図5A)、および隣接発現プラットフォームを使用して、E.coliのlacZレポーター遺伝子との翻訳融合物を調製した。アプタマー−レポーター融合構築物を保有するトランスジェニックE.coli細胞を液体培地中で増殖させ、β−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。
野生型(WT)Vc2アプタマーを保有するレポーター構築物は、高レベルの遺伝子発現を示す(図5B)。対照的に、P1を破壊する変異またはさもなければP2バルジ中の厳格に保存されたヌクレオチドの変化を保有する構築物M1およびM3は、WTの10%未満のレポーター遺伝子を発現する。さらに、P1の構造を修復する4つの変異(M2)を有するアプタマーは、ほぼWTの遺伝子発現を示す。これらの結果は、Vc2アプタマーを組み込むリボスイッチが隣接ORFの翻訳の活性化によって「オン」スイッチとして機能することを示す。同様に、B.cereus(Bc1およびBc2)およびC.difficile(Cd1)由来のサイクリックジGMPリボスイッチのための転写融合物を調製した。WTおよびM3変異体の発現パターンは、Bc1の「オン」スイッチ機能およびBc2およびCd1の「オフ」スイッチ機能と一致する(図5B)。
サイクリックジGMP濃度の変化は、リボスイッチ媒介遺伝子発現を調整する。サイクリックジGMPリボスイッチによる遺伝子発現の調整を、二次メッセンジャーの細胞濃度を操作しながらCd1 RNAの「オフ」スイッチ作用を試験することによって確立した。サイクリックジGMP濃度を、V.choleraeのvieA遺伝子産物の発現によって調整した。VieAは、二次メッセンジャーのその線状pGpG形態への加水分解の促進によってサイクリックジGMPの細胞濃度を低下させると予想されるEALホスホジエステラーゼ(PDE)である(Li 1999)。空のベクターを保有するか、PDE活性を排除するE170A変異を有するVieAタンパク質を発現する細胞(Tamayo 2005)は、増殖条件下で細胞に通常のサイクリックジGMP濃度を維持すると予想される。
lacZを有するWT Cd1リボスイッチの転写融合物を保有し、X−galを有する寒天プレート上で増殖させたトランスジェニックB.subtilis細胞は、空のプラスミドベクターまたは不活性なE170A VieA変異体をコードするベクターのいずれかで同時形質転換した場合、低いβ−ガラクトシダーゼ活性を示す(図6A)。対照的に、頑強なβ−ガラクトシダーゼ活性は、レポーター構築物およびVieA PDEをコードするベクターで同時形質転換する細胞において明らかである。液体培養由来のこれらのトランスジェニック細胞をアッセイした場合に類似の傾向が認められるのに対して、Cd1アプタマー中にM3変異を保有するレポーター構築物は依然としてvieA発現の影響をあまり受けない(図6B)。これらの所見は、Cd1リボスイッチによる「オフ」スイッチ機能とも一致し、この機能は、細胞中のサイクリックジGMP濃度の低下によってPDE作用を軽減する。
多様な細菌におけるサイクリックジGMPリボスイッチの役割。V.choleraeがたった2つのサイクリックジGMPリボスイッチ代表しか持たないにもかかわらず(図7)、これらのRNAの生理学的役割は重大である。Vc1リボスイッチに関連するgbpA遺伝子産物は、細菌が哺乳動物の腸にコロニー形成してコレラ病を発症させる重要な決定因子であることが報告された糖結合タンパク質である(Kirn、2005)。V.choleraeは哺乳動物宿主の腸にコロニー形成する場合にそのサイクリックジGMPレベルを低下させることも示されている(Tamayo 2005)。サイクリックジGMPレベルの変化に対するCd1リボスイッチの応答を証明するために本研究で使用したV.choleraeのvieA遺伝子(図6A)は、細菌感染に不可欠であることが公知である。したがって、VieA作用によって起こるサイクリックジGMPレベルの低下をVc1リボスイッチによって感知して、GbpAの発現およびV.cholerae感染を容易にすることが可能である。
Vc2リボスイッチに関連するVC1722遺伝子は、コンピテンスに重要な公知の転写因子に類似のタンパク質をコードする(Meibom 2005)。皺表現型を産生するV.cholerae変異体が高レベルのサイクリックジGMPを有し、より高いVC1722 mRNA発現を示すことが以前に示されている(Lim 2006c;Beyhan 2007)。これは、VC1722 mRNAに関連するVc2リボスイッチが、サイクリックジGMP濃度が上昇した場合により高い遺伝子発現が得られる遺伝子「オン」スイッチであることを示すデータと一致する(図5B)。
いくつかの生物は、非常に多数のサイクリックジGMPリボスイッチ代表を有する(図7)。30の代表が同定されているGeobacter uraniumreducensは、そのゲノムが配列決定された細菌種のうちで最も多数のサイクリックジGMPアプタマーRNAを有する。これらは、タンデムサイクリックジGMPアプタマーを保有する5つのRNAと共に25個の異なる転写単位の上流に分布する。2つのアミノ酸と協同的に結合するいくつかのグリシンアプタマーについて類似のタンデム配置が認められている(Mandal 2004c)。しかし、より一般的なタンデム配置が同一リガンドに応答する完全なリボスイッチに関与する(Welz 2007;Sudarsan 2006)。両方のタンデム構造の配置により、リボスイッチがリガンド濃度のより小さな変化により繊細に応答し(Welz 2007)、より計数的な遺伝子スイッチとして機能することが可能となる。
多数のサイクリックジGMPリボスイッチに関連する遺伝子機能が未知であるにもかかわらず、C.difficileにおけるいくつかの代表のそれらの位置に注目すべきである(図7)。Cd1リボスイッチは、この種の全鞭毛装置を構築するのに必要なタンパク質をコードする大きなオペロンの5’UTR中に存在する遺伝子「オフ」スイッチである(図5および6)。この配置により、いくつかの細菌がリボスイッチを使用してサイクリックジGMP濃度の変化を感知してオルガネラの生合成を調節し、運動型対固着の生活様式の変換を調節することが明らかとなる。
C.difficileゲノム内に組み込まれたPhiCD119バクテリオファージDNA内に存在するサイクリックジGMPリボスイッチ代表の同定も興味深い。バクテリオファージゲノムの溶解モジュール内に存在するリボスイッチ配列はまた、バクテリオファージ粒子中にパッケージングされたDNAで明らかである(Govind 2006)。20を超える代謝産物感知リボスイッチクラスが報告されており、且つこれらのクラスの何千もの代表が同定されているにもかかわらず、サイクリックジGMP RNA Cd2、Cd12、およびファージ由来の関連RNAは、バクテリオファージ関連リボスイッチの唯一の公知の例である。おそらくウイルスは基本的代謝産物を感知する必要がほとんどないが、二次メッセンジャーサイクリックジGMP濃度の変化によって起こる細菌細胞の生理学的形質転換のモニタリングによって進化上の利点を得ることができる。
1.材料と方法
i.バイオインフォマティクス
公知のサイクリックジGMPリボスイッチ組を、以前に確立された複数の配列アラインメント(Weinberg 2007)の使用によって拡大して、さらなる相同性検索を行った。これらの検索を、RAVENNA(Weinberg 2006)を使用して、RefSeqバージョン25(Pruitt 2005)微生物配列ならびに酸性鉱山廃液(Tyson 2004)、土壌およびホエールフォール(Tringe 2005)、ヒト消化管(Gill 2006)、マウス消化管(Turnbaugh 2006)、無腸の海ミミズ(Woyke 2006)、スラッジコミュニティ(Garcia Martin 2006)、および世界的海洋調査(Venter 2004;Rusch 2007)由来の環境配列に対して行った。コンセンサス図中で反映された保存統計学(図3)を、以前に確立されたプロトコールを使用して計算した(Weinberg 2007)。RefSeqおよびDOE Joint Genome Instituteまたは世界的海洋調査由来の遺伝子注釈づけを使用して図7を作製した。遺伝子を、保存ドメインデータベース(Marchler−Bauer 2005)バージョン2.08に基づいて分類した。
i.バイオインフォマティクス
公知のサイクリックジGMPリボスイッチ組を、以前に確立された複数の配列アラインメント(Weinberg 2007)の使用によって拡大して、さらなる相同性検索を行った。これらの検索を、RAVENNA(Weinberg 2006)を使用して、RefSeqバージョン25(Pruitt 2005)微生物配列ならびに酸性鉱山廃液(Tyson 2004)、土壌およびホエールフォール(Tringe 2005)、ヒト消化管(Gill 2006)、マウス消化管(Turnbaugh 2006)、無腸の海ミミズ(Woyke 2006)、スラッジコミュニティ(Garcia Martin 2006)、および世界的海洋調査(Venter 2004;Rusch 2007)由来の環境配列に対して行った。コンセンサス図中で反映された保存統計学(図3)を、以前に確立されたプロトコールを使用して計算した(Weinberg 2007)。RefSeqおよびDOE Joint Genome Instituteまたは世界的海洋調査由来の遺伝子注釈づけを使用して図7を作製した。遺伝子を、保存ドメインデータベース(Marchler−Bauer 2005)バージョン2.08に基づいて分類した。
ii.オリゴヌクレオチド、化学物質、プラスミド、および細菌株
DNAオリゴヌクレオチドを、Sigma−Genosysまたはイェール大学W.M.Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratoryから購入した。サイクリックジGMP、pGpG、および3’、5’−サイクリックGMPをBioLog Life Science Institute(Germany)から購入し、3’−グアノシン一リン酸塩をMP Biomedicalsから購入した。ApG、GpG、GpA、pGpA、およびGpGpGを、Oligos Etcから購入した。他の全ての化学物質を、Sigma−Aldrichから購入した。
DNAオリゴヌクレオチドを、Sigma−Genosysまたはイェール大学W.M.Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratoryから購入した。サイクリックジGMP、pGpG、および3’、5’−サイクリックGMPをBioLog Life Science Institute(Germany)から購入し、3’−グアノシン一リン酸塩をMP Biomedicalsから購入した。ApG、GpG、GpA、pGpA、およびGpGpGを、Oligos Etcから購入した。他の全ての化学物質を、Sigma−Aldrichから購入した。
pDG1661およびpDG148を、Bacillus Genetic Stock Center(BGSC;オハイオ州立大学)から入手した。pRS414は、Dr.R.Simons(UCLA)から贈与された。V.cholerae O1 biovar eltor N16961株のゲノムDNAは、Dr.B.Bassler(Princeton U.)から提供された。B.subtilis 1A1株、B.cereus 6A5株(ATCC 14579)、およびB.cereus 6A15株(ATCC 10987)もBGSCから入手した。ATCC 9689株由来のC.difficileゲノムDNAを、ATCCから入手した。コンピテントDH5−α E.coliを、New England Biolabsから購入した。
iii.サイクリックジGMPの分解動力学
500μMのサイクリックジGMP溶液を、インライン探索緩衝液(50mM Tris−HCl(pH8.3、23℃)、100mM KCl、20mM MgCl2)の存在下で種々の時間インキュベートした。サイクリックジGMPの添加によって反応を開始し、Agilent Zorbax Oligoカラム(5μM、6.2mm×80mm)を備えたAgilent Technologies 1200シリーズHPLCに10μLアリコートを注入する時に反応をクエンチした。化合物を、95% 0.1M NaHPO4(pH6.0、23℃)および5%アセトニトリルから100% 1M NaClまでから構成される勾配の移動相を使用して溶離した。254nmの吸光度をモニタリングした。サイクリックジGMPに対する速度定数を、未分解で残存するサイクリックジGMPの割合の自然対数対時間をプロットすることによって確立した。得られた直線の負の勾配は速度定数を反映する。
500μMのサイクリックジGMP溶液を、インライン探索緩衝液(50mM Tris−HCl(pH8.3、23℃)、100mM KCl、20mM MgCl2)の存在下で種々の時間インキュベートした。サイクリックジGMPの添加によって反応を開始し、Agilent Zorbax Oligoカラム(5μM、6.2mm×80mm)を備えたAgilent Technologies 1200シリーズHPLCに10μLアリコートを注入する時に反応をクエンチした。化合物を、95% 0.1M NaHPO4(pH6.0、23℃)および5%アセトニトリルから100% 1M NaClまでから構成される勾配の移動相を使用して溶離した。254nmの吸光度をモニタリングした。サイクリックジGMPに対する速度定数を、未分解で残存するサイクリックジGMPの割合の自然対数対時間をプロットすることによって確立した。得られた直線の負の勾配は速度定数を反映する。
iv.サイクリックジGMPアナログの純度分析および完全性
サイクリックジGMPのジ−およびトリ−ヌクレオチドアナログの純度を、Agilent Technologies 1200シリーズHPLCを使用して、溶離化合物の254nmの吸光度のモニタリングによって試験した。化合物を、Agilent Extend C18カラム(3.5μM、4.6mm×150mm)を使用し、95%水、5%アセトニトリル、および0.1%トリフルオロ酢酸(trifluoroacetic)から100%アセトニトリルおよび0.1%トリフルオロ酢酸までの勾配移動相を使用して分離した。HPLC軌跡により、50%から95%のUV吸収物質が所望のアナログに対応することが明らかとなった。
サイクリックジGMPのジ−およびトリ−ヌクレオチドアナログの純度を、Agilent Technologies 1200シリーズHPLCを使用して、溶離化合物の254nmの吸光度のモニタリングによって試験した。化合物を、Agilent Extend C18カラム(3.5μM、4.6mm×150mm)を使用し、95%水、5%アセトニトリル、および0.1%トリフルオロ酢酸(trifluoroacetic)から100%アセトニトリルおよび0.1%トリフルオロ酢酸までの勾配移動相を使用して分離した。HPLC軌跡により、50%から95%のUV吸収物質が所望のアナログに対応することが明らかとなった。
各アナログに対して高分解能質量分析を行って、それらの正確な質量を確認した。C20H25N10O11P(GpA)についてのHRMS(ES)の計算値および(M−H)−実測値は以下であった:612.1442、611.1375;C20H25N10O11P(ApG):612.1442、611.13723;C20H25N10O12P(GpG):628.1391、627.13207;C20H26N10O14P2(pGpA):692.1105、691.10410;C30H37N15O19P2(GpGpG):973.1865、972.1825、および(M−2H)−2 485.58597。
v.RNAの調製
DNAテンプレートを、T7 RNAポリメラーゼ(T7 RNAP)のプロモーター配列+RNAの収率を増加させるための転写開始部位の2つのグアニン残基を付加したプライマーと共に野生型または変異pRS414プラスミドDNAを使用したPCR増幅によって調製した。RNA分子を、適切なDNAテンプレートおよびT7 RNAPを含む20mM Tris−HCl(pH8.0、23℃)、20mM NaCl、14mM MgCl2、および100μM EDTAを使用した試験管内転写によって調製した。RNAを、変性(8M尿素)10%ポリアクリルアミドゲルにて精製し、10mM Tris−HCl(pH7.5、23℃)、200mM NaCl、および1mM EDTA(pH8.0)中にてゲルから溶離させた。製造者のプロトコールに従って、RNAをエタノールを使用して沈殿させ、アルカリホスファターゼ(Roche Diagnostics)を使用して脱リン酸化し、[γ−32P]ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を使用して5’放射性同位元素標識した。放射性同位元素標識したRNAを、上記のようにゲル精製した。
DNAテンプレートを、T7 RNAポリメラーゼ(T7 RNAP)のプロモーター配列+RNAの収率を増加させるための転写開始部位の2つのグアニン残基を付加したプライマーと共に野生型または変異pRS414プラスミドDNAを使用したPCR増幅によって調製した。RNA分子を、適切なDNAテンプレートおよびT7 RNAPを含む20mM Tris−HCl(pH8.0、23℃)、20mM NaCl、14mM MgCl2、および100μM EDTAを使用した試験管内転写によって調製した。RNAを、変性(8M尿素)10%ポリアクリルアミドゲルにて精製し、10mM Tris−HCl(pH7.5、23℃)、200mM NaCl、および1mM EDTA(pH8.0)中にてゲルから溶離させた。製造者のプロトコールに従って、RNAをエタノールを使用して沈殿させ、アルカリホスファターゼ(Roche Diagnostics)を使用して脱リン酸化し、[γ−32P]ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を使用して5’放射性同位元素標識した。放射性同位元素標識したRNAを、上記のようにゲル精製した。
vi.インライン探索
インライン探索アッセイを、以前に記載の方法(Soukup 1999)に類似の方法を使用して行った。簡潔に述べれば、5’32P標識したRNA(サイクリックジGMPのKD分析については約50pM、他の全ての分析については約5nM)を、表示の化合物と共に、20mM MgCl2、100mM KCl、および50mM Tris(pH8.3、23℃)中にて23℃で約40時間インキュベートした。RNA切断産物を、変性10%PAGEによって分離し、Phosphorimager(Molecular Dynamics)を使用して視覚化し、SAFA v1.1ソフトウェア(Das 2005)またはImageQuant(Molecular Dynamics)を使用して分析した。SAFAソフトウェアを使用して、各レーンにロードしたRNA量の相違を補正し、各バンド強度を決定した。強度の顕著な変化を示したバンドを、構造調整を受けたと同定した。
インライン探索アッセイを、以前に記載の方法(Soukup 1999)に類似の方法を使用して行った。簡潔に述べれば、5’32P標識したRNA(サイクリックジGMPのKD分析については約50pM、他の全ての分析については約5nM)を、表示の化合物と共に、20mM MgCl2、100mM KCl、および50mM Tris(pH8.3、23℃)中にて23℃で約40時間インキュベートした。RNA切断産物を、変性10%PAGEによって分離し、Phosphorimager(Molecular Dynamics)を使用して視覚化し、SAFA v1.1ソフトウェア(Das 2005)またはImageQuant(Molecular Dynamics)を使用して分析した。SAFAソフトウェアを使用して、各レーンにロードしたRNA量の相違を補正し、各バンド強度を決定した。強度の顕著な変化を示したバンドを、構造調整を受けたと同定した。
サイクリックジGMPに対する110Vc2のKDを決定するために、種々の濃度のサイクリックジGMPを使用して、上記のようにインライン探索を行った。例外的に低濃度の放射性同位元素標識された110Vc2 RNAの使用により、ロードしたサンプルにさらなる非標識RNAを補足し、インライン探索に個別に供した。これにより、ゲルマトリックスに非特異的に結合した放射性同位元素標識RNA量が減少し、画像化中のバンドの解像度が増大した。ImageQuantソフトウェア(Molecular Dynamics)を使用して解離定数(KD)を決定し、構造調整部位の各バンド強度を比較した。それにより、リガンドの非存在下で調整が起こらず、最も高い試験濃度のリガンドの存在下で完全に調整されると推測された。表示の調整部位での調整の割合(F)対リガンド濃度の対数[L]のプロッティングおよびSigmaPlot 9(Systat Software)を使用した式F=[L]/([L]+KD)へのデータのフィッティングによって解離定数を決定した。
vii.プラスミドおよび細菌株の調製
Vc2(COG3070(Tfox様遺伝子)の5’UTR)を、EcoRI-BamHIフラグメントとしてV.choleraeゲノムDNAから増幅し、翻訳レポーターベクターpRS414にクローン化し、E.coliにおけるその遺伝子調節機能を、以前に記載の方法に類似の方法を使用して確立した(Nahvi 2002)。具体的には、ORFの開始に関する−348ntから+21ntまでの領域を、COG3070 ORFの第7コドンをlacZレポーター遺伝子の第9コドンにインフレームで融合したlacZレポーターベクター中で翻訳融合物としてクローン化した。調節領域中の変異を、製造者の説明書にしたがってQuikChange部位特異的変異誘発キット(Stratagene)を使用して、このプラスミドから生成した。
Vc2(COG3070(Tfox様遺伝子)の5’UTR)を、EcoRI-BamHIフラグメントとしてV.choleraeゲノムDNAから増幅し、翻訳レポーターベクターpRS414にクローン化し、E.coliにおけるその遺伝子調節機能を、以前に記載の方法に類似の方法を使用して確立した(Nahvi 2002)。具体的には、ORFの開始に関する−348ntから+21ntまでの領域を、COG3070 ORFの第7コドンをlacZレポーター遺伝子の第9コドンにインフレームで融合したlacZレポーターベクター中で翻訳融合物としてクローン化した。調節領域中の変異を、製造者の説明書にしたがってQuikChange部位特異的変異誘発キット(Stratagene)を使用して、このプラスミドから生成した。
B.cereusおよびC.difficileにおける推定ORF上流の5’UTR領域を、EcoRI-BamHIフラグメントとしてPCRによって増幅し、ベクターpDG1661にクローン化してプロモーターレスlacZ遺伝子との転写融合物を得た。増幅フラグメントは、UTR上流の推定プロモーターエレメントおよび対応する遺伝子の上流のリボスイッチに関連する転写ターミネーターを含んでいた。得られた構築物を、以前に記載のように、B.subtilisのamyE遺伝子座に組み込んだ(Sudarsan 2003)。変異構築物を、上記の部位特異的変異誘発を使用して生成した。
V.cholerae由来のサイクリックジGMP特異的ホスホジエステラーゼ遺伝子(vieA)を、PCRによってゲノムDNAから増幅した。vieA遺伝子を、以前に記載のライゲーション非依存性クローニングを使用して、改変pDG148ベクター中のPspacプロモーターの下流に存在するstuI部位にクローン化した(Joseph 2001)。vieA遺伝子が構成性発現すると予想されるように本ベクター中のlacI遺伝子を変異した。vieAノックアウト変異体E170Aを、上記の部位特異的変異誘発を使用して作製した。
viii.β−ガラクトシダーゼアッセイ
野生型および変異Vc2−pRS414構築物を、コンピテントNEB 5−α(New England Biolabs)E.coli細胞に形質転換した。各コロニーを、50μg/mLカルベニシリンを含むLuria−Bertaniブロス中にて振とうしながら37℃で一晩増殖させた。培養物を、約0.1のOD600まで希釈し、約0.6のOD600まで増殖させた後、標準的プロトコールに従ってβ−ガラクトシダーゼアッセイを行った(Miller 1992)。Bc1、Bc2、およびCd1を含むpDG1661で形質転換したB.subtilis株の一晩培養物を約0.2のOD600まで継代し、その後に約1のOD600まで約3時間増殖させ、上記のようにβ−ガラクトシダーゼアッセイを行った。
野生型および変異Vc2−pRS414構築物を、コンピテントNEB 5−α(New England Biolabs)E.coli細胞に形質転換した。各コロニーを、50μg/mLカルベニシリンを含むLuria−Bertaniブロス中にて振とうしながら37℃で一晩増殖させた。培養物を、約0.1のOD600まで希釈し、約0.6のOD600まで増殖させた後、標準的プロトコールに従ってβ−ガラクトシダーゼアッセイを行った(Miller 1992)。Bc1、Bc2、およびCd1を含むpDG1661で形質転換したB.subtilis株の一晩培養物を約0.2のOD600まで継代し、その後に約1のOD600まで約3時間増殖させ、上記のようにβ−ガラクトシダーゼアッセイを行った。
上記のトランスジェニックB.subtilis細胞を使用した固体寒天プレート上で行った遺伝子発現アッセイを、37℃で少なくとも16時間の画線細胞の増殖によって行った。寒天(TBAB)は、必要に応じて、400μg/mL X−galおよび5μg/mLのクロラムフェニコールおよび/またはカナマイシンを含んでいた。
(実施例3)
C.実施例3:S−アデノシルホモシステインを感知し、補酵素再利用に関与する遺伝子を活性化するリボスイッチ
多数のグラム陽性およびグラム陰性の細菌種におけるS−アデノシル−L−メチオニン(SAM)再利用に関与する遺伝子の上流に見出される高度に保存されたRNAモチーフを同定した。このモチーフの代表の系統発生分布および保存された構造の特徴は、リボスイッチ機能を示す。リボスイッチは、細菌mRNAの5’非翻訳領域(UTR)中に典型的に見出される、広範に存在する代謝産物感知遺伝子調節エレメントである。無タンパク質試験管内アッセイでS−アデノシルホモシステイン(SAH)を特異的に認識するこのRNAモチーフの例を同定し、これらのRNAがSAMおよび他の密接に関連するアナログを強く識別することを確認した。代表的なSAHモチーフは、代謝産物が結合した場合に生体内で下流遺伝子の発現を活性化することが見出された。これらの所見により、SAHモチーフRNAが、SAHに選択的に結合して消費されたSAM補酵素の再利用に不可欠な遺伝子を調節するリボスイッチクラスの異なるリガンド結合アプタマーであることが確認される。
C.実施例3:S−アデノシルホモシステインを感知し、補酵素再利用に関与する遺伝子を活性化するリボスイッチ
多数のグラム陽性およびグラム陰性の細菌種におけるS−アデノシル−L−メチオニン(SAM)再利用に関与する遺伝子の上流に見出される高度に保存されたRNAモチーフを同定した。このモチーフの代表の系統発生分布および保存された構造の特徴は、リボスイッチ機能を示す。リボスイッチは、細菌mRNAの5’非翻訳領域(UTR)中に典型的に見出される、広範に存在する代謝産物感知遺伝子調節エレメントである。無タンパク質試験管内アッセイでS−アデノシルホモシステイン(SAH)を特異的に認識するこのRNAモチーフの例を同定し、これらのRNAがSAMおよび他の密接に関連するアナログを強く識別することを確認した。代表的なSAHモチーフは、代謝産物が結合した場合に生体内で下流遺伝子の発現を活性化することが見出された。これらの所見により、SAHモチーフRNAが、SAHに選択的に結合して消費されたSAM補酵素の再利用に不可欠な遺伝子を調節するリボスイッチクラスの異なるリガンド結合アプタマーであることが確認される。
RNAアプタマーは、特異的リガンドに対して選択的結合ポケットを形成する高度に構造化されたポリヌクレオチドである(Goldら、1995;OsborneおよびEllington、1997)。その標的に対して高い親和性および選択性を示すように操作されたアプタマーを作製し、このアプタマーは基礎研究、バイオテクノロジー、および治療薬に適用される高い潜在性を有し得る(Breaker,2004;BunkaおよびStockley、2006)。RNAアプタマーはまた、多数の細菌伝令RNAの5’UTR中に天然に存在することができ、これらはリボスイッチと呼ばれる遺伝子調節エレメントのセンサードメインとしての機能を果たす(MandalおよびBreaker、2004a;SoukupおよびSoukup、2004;WinklerおよびBreaker、2005)。その操作された対応物と同様に、天然アプタマーは、重要な代謝遺伝子の発現を正確に調節するために細胞によって使用されるRNAアプタマーに必要な高い親和性および特異性でその標的に結合することができる。しかし、天然アプタマーは、典型的には、操作されたアプタマーよりはるかに長く(34ヌクレオチドと200ヌクレオチドとの間の範囲)(Breaker、2006)、おそらく、天然アプタマーは、タンパク質から作製された遺伝子調節因子と競合するために必要な高レベルの性能を示すことが可能である。
各リボスイッチは、通常、そのアプタマードメインによる代謝産物結合を活用して、隣接する発現プラットフォームの構造変化を引き起こす。これらの構造の変化により、読み取り枠(ORF)または下流に存在する複数のORFからのタンパク質産生レベルが確立される。しかし、代謝物結合によって常に折り畳みの変化が起こるわけではない。例えば、あるリボスイッチクラスは、その作用が下流ORFの発現を抑制する自己切断リボザイムの補酵素として標的代謝産物を使用する(Winklerら、2004;Cochraneら、2007)。使用した機構と無関係に、リボスイッチはしばしば遺伝子を調節し、この遺伝子のタンパク質産物が代謝産物または代謝産物の前駆体の合成、分解、または輸送に関与し、代謝産物または代謝産物の前駆体の細胞濃度がアプタマードメインによって感知される。
リボスイッチアプタマーは、改変塩基または支持タンパク質因子が関与しない限り、4つの共通ヌクレオチドのみを使用してその標的代謝産物の正確な結合ポケットを形成しなければならない。SAM(Corbinoら、2005;Fuchsら、2006)およびpreQ1(Weinbergら、2007)などのいくつかのリガンドが全く異なるアプタマー構造を有する複数のリボスイッチクラスによって検出されるにもかかわらず、これによって各アプタマーに強い選択圧が与えられ、進化を通して一定の構造の特徴が維持される。遠縁の生物から同定されたリボスイッチアプタマークラスの代表でさえ、配列および二次構造の相当な保存を示す。本保存は、アプタマーによって結合されるリガンドの同一性と相まって、リボスイッチの異なるクラスへの組織化の基礎を形成する。
リボスイッチアプタマーの保存された特徴は、公知のリボスイッチクラスの代表数を拡大し(例えば、Rodionovら、2002;Rodionovら、2003a;Nahviら、2004;Rodionovら、2004;)、以前に知られていなかったリボスイッチクラスを発見する(例えば、Rodionovら、2003b;Barrickら、2004;Corbinoら、2005;Weinbergら、2007)ためにコンピュータ支援検索アルゴリズムによって活用されている。対照的に、発現プラットフォームは、同一のリボスイッチクラス内でさえも配列および構造が広範に変化する。例えば、TPPリボスイッチは、種々の発現プラットフォーム構造を有するコンセンサスアプタマーを組み込んで、細菌における転写終結および翻訳開始(Winklerら、2002;Mironovら、2002;Rentmeisterら、2007)および真核生物におけるRNAスプライシング(Sudarsanら、2003a;Kuboderaら、2003;Bocobzaら、2007;Cheahら、2007;Wachterら、2007)を調節する。
上で述べたように、異なる構造クラス由来のアプタマーを有するリボスイッチは、同一の標的代謝産物を認識することができる。補酵素SAM(またはAdoMet)を特異的に認識する4つのリボスイッチクラスが発見されており、これらは、SAM−I(Epshteinら、2003;McDanielら、2003;Winklerら、2003)、SAM−II(Corbinoら、2005,Limら、2006b)、SAM−IIIまたはSMK(Fuchsら、2006)、およびSAM−IV(Weinbergら、2007;未発表データ)と呼ばれている。これらのクラスのうち、SAM−Iリボスイッチは最も広範な公知の系統発生分布を有し、多数の細菌群で例が見出されている(Rodionovら、2004)。SAM−IIリボスイッチは、グラム陰性proteobacteriaおよびbacteroidetesで広く見出される一方で(Corbinoら、2005)、SAM−IIIリボスイッチはグラム陽性乳酸細菌のみで報告されている(Fuchsら、2006)。4つの全クラスのアプタマーは、SAM依存性メチル基転移の副生成物であるSAH(またはAdoHcy)よりもSAMに優先的に結合する(Takusagawaら、1998)。例えば、SAM−IおよびSAM−IIアプタマーの代表は、それぞれ、約80倍および1000倍を超えてSAHを識別する(Limら、2006b)。化合物がたった1つのメチル基が異なることを考慮すれば、この識別レベルは特筆すべきである。
SAHからL−メチオニンへの変換を担う遺伝子の上流に常に見出される高度に保存された一次配列および二次構造を有する細菌RNAエレメントの発見を本明細書中に記載する。RNAエレメントは、SAHに選択的に結合してSAMを少なくとも1000倍識別する異なるアプタマークラスを示し、このクラスは、4つの公知のSAMアプタマーの分子認識の特徴と全く対照的である。細菌Pseudomonas syringaeのahcY mRNAでは、SAHアプタマーへの代謝産物の結合による構造変化によって生体内での下流遺伝子の発現が活性化し、したがって、SAHアプタマーが異なるSAH応答性リボスイッチクラスのセンサー成分を形成する。
1.結果
i.SAH再利用に関連する保存されたRNAモチーフの同定
さらなるリボスイッチクラスおよび他の構造化調節RNAモチーフを同定する目的で、多数の細菌クラス中の遺伝子ファミリーの遺伝子間領域(IGR)の体系的検索を、CMfinder比較ゲノミクスパイプライン(Yaoら、2007)を使用して行った(Weinbergら、2007)。この検索ストラテジーを使用して細菌中に多数のRNAモチーフが同定され、いくつかのモチーフが代謝産物感知リボスイッチとして機能するRNAに予想される特徴を有する。
i.SAH再利用に関連する保存されたRNAモチーフの同定
さらなるリボスイッチクラスおよび他の構造化調節RNAモチーフを同定する目的で、多数の細菌クラス中の遺伝子ファミリーの遺伝子間領域(IGR)の体系的検索を、CMfinder比較ゲノミクスパイプライン(Yaoら、2007)を使用して行った(Weinbergら、2007)。この検索ストラテジーを使用して細菌中に多数のRNAモチーフが同定され、いくつかのモチーフが代謝産物感知リボスイッチとして機能するRNAに予想される特徴を有する。
1つの候補リボスイッチクラスはSAHモチーフと呼ばれた。これはこのRNAの代表に最も一般に関連する遺伝子がS−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ(ahcY、COG0499)、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ(metH、COG1410)、およびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(metF、COG0685)であるからである(図8)。SAHモチーフ代表のゲノムコンテクストおよびその高い保存度は、SAHの感知およびその産物がSAMを再合成するためのSAH再利用に必要な遺伝子発現の活性化での役割と一致する。SAM依存性メチル化反応のSAH副生成物(Takusagawaら、1998)は、SAMと比較して類似またはさらに良好な親和性で多数のSAM依存性メチルトランスフェラーゼに結合し、したがって、これらの酵素の強力なインヒビターとして機能する(Ueland、1982)。メチルトランスフェラーゼ活性が高い間に、化合物が低毒性生成物に変換されない限り、細胞は有毒レベルのSAHを蓄積し得る。したがって、SAHの迅速な感知およびSAMを再編成するためのSAHの再利用の遺伝子の活性化が重要である。
真正細菌には、共にSAHからホモシステインに変換するSAH異化のための2つの主な経路が存在する(図8)。多数の細菌種では、SAHヌクレオシダーゼ(EC 3.2.2.9)は、SAHのN−グリコシド結合の切断を触媒してアデニンおよびS−リボシルホモシステインを生成する(Della Ragioneら、1985)。次いで、後者の化合物をluxSの遺伝子産物によって加水分解して、ホモシステインを形成することができる(Schauderら、2001)。別の経路は、SAHモチーフ代表に一般に関連するahcYを含む。SAHヒドロラーゼ(ahcYの遺伝子産物)は、SAHのチオエーテル結合の分解を触媒して、アデノシンおよびホモシステインを生成する(Shimizuら、1984)。metHの遺伝子産物は、次いで、metFの遺伝子産物によって5,10−メチルTHFから生成される(Sheppard、1999)5−メチルテトラヒドロ葉酸(5−メチルTHF)をメチル供与体として使用してホモシステインをL−メチオニンにメチル化する(Oldら、1988)。metK遺伝子によってコードされるSAMシンターゼは、メチオニンおよびATPからSAMを再生してサイクルを完成する(TaborおよびTabor、1984)。β−proteobacteriaおよびγ−proteobacteriaのいくつかの種においてmetK遺伝子がSAH RNAモチーフの上流に極めて近接して存在し、これが同一オペロン中に存在し得ることに留意することが興味深い。luxS遺伝子産物のホモログ(COG1854)は保存されたRNAエレメントが見出されたゲノム中で同定されなかったので、これらの生物において、SAHの異化はSAHヒドロラーゼを含む経路によって排他的に進行することができる。
修正構造モデルに適合するSAH RNAモチーフの全部で95個のオカレンスが見出され、これらの適合物のうちの68個が重複していない。同定された全てのSAH RNAモチーフの例は、環境配列からまたはRNAモチーフに隣接する遺伝子同一性が利用できない不完全に配列決定されたゲノムから同定されたモチーフを除いて、SAH再利用遺伝子に隣接して見出される。ほとんどの場合、SAH RNAの代表は、ほとんど例外なく、SAHヒドロラーゼ(ahcY)、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(metF)、および時折メチオニンシンターゼ(metH)をコードするオペロンのようなものの上流に存在する。Burkholderia、Dechloromonas、およびRalstoniaのいくつかの種では、オペロンは、未知の機能の予想される膜タンパク質(COG1950)を含む。SAH RNA関連オペロンで稀にしか出現しない他の遺伝子には、rRNAメチラーゼ(COG1189)(コンピテンス特異的遺伝子(tfoX、COG3070)のレギュレーター)およびグアノシンポリリン酸塩代謝に関与する酵素(spoT、COG0317)をコードする遺伝子が含まれる。
RNAモチーフのコンセンサス配列および構造モデル(図9A)を、アラインメント中の68個の非重複配列に基づいて構築した。コンセンサスRNAモチーフは、P1およびP2と指定された塩基対合領域に隣接した高度に保存されたヌクレオチドの中核から構成され、ここで、P2は可変配列ループ(L2)によってキャッピングされている。RNAはまた、中核とRNAの3’末端の高度に保存されたヌクレオチドとの間にシュードノット(P4)を形成する。ヘアピン(P3およびL3)は、いくつかの代表においてP1ステムとP4ステムとの間に生じる。二次構造エレメントは、全て共変動によって支持される。
β−proteobacteriaおよびγ−proteobacteriaに加えて、このコンセンサス配列および構造に適合するRNAの例は、□−proteobacteriaの種およびいくつかのグラム陽性Actinobacteria(図9B)でも見出された。異なるゲノム領域中に存在する、予想されるahcYおよびmetHコード配列の両方の前に2つのインシデントが同定されたAcidovorax sp.、Dechloromonas aromatica、Azoarcus sp.、Polaromonas naphthalenivorans、Polaromonas sp.、Rhodoferax ferrireducens、およびRubrivivax gelatinosusを除き、ほとんどの生物は、1つのRNAエレメントのオカレンスを有する。
ii.68 metH RNAによるSAHの選択的結合
SAH RNAの構造の特徴およびゲノム配置は、これらがSAHを感知するリボスイッチのアプタマーとしての機能を果たすことを示す。無タンパク質試験管内系において代謝産物を特異的に認識して遺伝子調節エレメントとして機能することができる(リボスイッチの2つの決定的な特徴)RNAモチーフの例を探求した。Dechloromonas aromatica中のmetH遺伝子の上流に同定されたSAH RNAを含む68−ヌクレオチドRNA(68 metHと指定、図10A)を選択した。D.aromatica 68 metH RNAは、このモチーフのコンセンサス配列および構造に密接に対応するほぼ最短の配列である。その長さの減少は、任意選択的P3ステムの非存在に一部起因する(図9A)。
SAH RNAの構造の特徴およびゲノム配置は、これらがSAHを感知するリボスイッチのアプタマーとしての機能を果たすことを示す。無タンパク質試験管内系において代謝産物を特異的に認識して遺伝子調節エレメントとして機能することができる(リボスイッチの2つの決定的な特徴)RNAモチーフの例を探求した。Dechloromonas aromatica中のmetH遺伝子の上流に同定されたSAH RNAを含む68−ヌクレオチドRNA(68 metHと指定、図10A)を選択した。D.aromatica 68 metH RNAは、このモチーフのコンセンサス配列および構造に密接に対応するほぼ最短の配列である。その長さの減少は、任意選択的P3ステムの非存在に一部起因する(図9A)。
インライン探索アッセイ(SoukupおよびBreaker、1999)を使用して、予想される二次構造を確証し(図10A)、68 metH RNAがSAHに直接結合することを立証した。このアッセイは、RNAの自発的切断が構築されないヌクレオチド間結合でより迅速に生じ、それにより、RNA構造の特徴およびリガンドに結合した場合にこれらが受ける変化を明らかにすることができるという事実を活用する。5’ 32P標識された68 metH RNAを、漸増濃度のSAHを含む反応物中でインキュベートし、得られた自発的切断産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した(図10B)。任意のリガンドの非存在下で、L2を形成すると予想されるRNA領域、P1とP2とを分離する内部ループ、およびRNAの3’末端部分でより高いバンド強度が認められた。これらの所見により、P1およびP2が形成されるが、RNAのコアおよび3’テール(P4シュードノットのヌクレオチドを含む)中の高度に保存されたヌクレオチドの大部分がリガンドの非存在下であまり構造化しないことが示唆される。
漸増濃度のSAHの存在下で、RNA全体のいくつかの位置でバンド強度の漸進的変化が認められた。これは、RNAがこの代謝産物のアプタマーとしての機能を果たす場合に予想されるように、SAHによってRNA折り畳みが変化することが確認された。さらに、多数の他のリボスイッチアプタマーについて典型的に認められるように、構造変化は系統発生学的に保存された領域で主に見出される(図9A、図10A)。SAH結合に応答した最も注目すべき変化は、シュードノットP4の安定化およびコアの他の保存されたヌクレオチド中の柔軟性の低下である。これは、高度に保存されたヌクレオチドがSAHの結合ポケット形成に関与することを示す。
SAHに対する68 metH RNAの見かけ上の解離定数KDは、SAH濃度範囲にわたるいくつかのヌクレオチド位置での自発的切断範囲の定量によって約20nMと評価された(図10Bおよび10C)。この見かけ上のKD値はリボスイッチアプタマーに典型的であり、約200μM(Winklerら、2004)から約200pM(WelzおよびBreaker、2007;Sudarsanら、2006)までの範囲であることが見出された。インライン探索アッセイによって明らかになった類似のSAH媒介性の形状変化を、P.syringaeのahcY遺伝子由来の122−ヌクレオチドのSAHアプタマー構築物を使用して得た。122 ahcY RNAが任意選択的なP3ステムを保有するにもかかわらず、RNAはリガンド結合に関してアプタマーコア中に重要な構造変化を受け、見かけ上のKD値は68 metH RNAについて測定したKD値に類似する。
SAH応答性リボスイッチのセンサーとして機能するためのSAHアプタマーについて、それがSAHと類似の構造の生物学的に関連する化合物を区別できなければならない。おそらく最も重要には、アプタマーは、1つのメチル基および硫黄中心の関連する正電荷のみがSAHと異なるSAMを識別しなければならない。インライン探索およびSAMの商業的供給源を使用して、68 metH RNAは、他のSAHアプタマーと同様に、SAHについて確立された見かけ上のKD値よりも10倍しか高くない見かけ上のKD値を示すことが見出された。しかし、SAMは自発的に分解してかなりのレベルでSAH汚染し、新たに調製した市販のSAMサンプルでさえも約10%のSAHを含む(Sigma−Aldrich Technical Service)。したがって、68 metH RNAによるSAMのより高いレベルの識別は、SAMサンプル中のSAHの存在によって不明確であり得る。
SAHアプタマーがSAMを識別する能力をより正確に評価するために、SAMのSAM−Iクラスリボスイッチアプタマーへの結合特性を密接に模倣することが以前に示されたSAHのスルホンアナログを使用したインライン探索(Limら、2006b)を行った。具体的には、SAHのスルホンアナログは、SAM中に存在する硫黄上にメチル基を欠くが、硫黄から電子密度を引いて天然補酵素のそれに類似のこの原子の相対的正電荷を増加させる2つの電気陰性酸素原子を保有する。インライン探索の結果(図10C)により、スルホンアナログがSAHより約3桁低い見かけ上のKDで68 metH RNAに結合することが明らかとなる。
また、SAMに対する68 metH アプタマーのKD値を平衡透析法の使用によって評価して、SAH アプタマーの機能を156 metAと呼ばれる以前に報告されたSAM−IIアプタマー(Corbinoら、2005)の機能と比較した。68 metH RNAまたは156 metA RNA(10□M)のいずれかを、平衡透析法装置の一方のチャンバーに添加し、100nMの[3H]SAM(図11A)を他方のチャンバーに添加した。チャンバーを、分子量カットオフ5000ダルトンの透過性膜によって分離した。[3H]SAMの硫黄中心のメチル基が放射性同位元素標識されるので、夾雑SAHは放射性を示さず、したがって、2チャンバー間の放射能の平衡分布に影響を及ぼさない。
同一アッセイ条件下で68 metH RNAが存在する場合にシフトしないのと比較して、156 metA RNAは、SAM−IIアプタマーを含むチャンバーに有利なように[3H]SAMの分布が約1.5倍シフトする(図11B)。インライン探索によって決定したところ、156 metA RNAのSAMに対する見かけ上のKDは約1□Mである(Corbinoら、2005)。したがって、SAMに対する68 metHのKD値は、1□Mより高い。さらに、25μMの68 metH RNAを使用した場合にSAM−IIリボスイッチについて認められた放射能シフトに等価な放射能シフトが存在しないことは、SAMに対するそのKDは25μMに過ぎない可能性が高いことを示す。これは、68 metH RNAがSAMよりもよりよく1000倍高い可能性がある親和性でSAHを認識することを示す(図11C)。SAHとSAMとの間のこの識別は、リボスイッチがSAHと等価であるか少し過剰なSAM濃度に曝露した場合でさえもSAHレベルの変化に応答したSAH再利用遺伝子の発現を正確に調節するのに十分なはずである。
SAHアプタマーの分子認識特性を、SAHの15アナログに対する68 metH RNAの見かけ上のKD値を確立することによってより詳細に評価した(図12A)。アミノ酸のカルボキシル基およびアミノ基、糖環および核酸塩基上の種々の位置、ならびにチオエステル結合を改変した。S−アデノシルシステイン(SAC)以外の全てのアナログは、親和性が少なくとも3桁減少する。興味深いことに、SAM感知リボスイッチに観察されるものと異なり、SACのより短いアミノ酸側鎖による親和性の喪失は小さなものでしかなかった(Limら、2006b)。
SAHのスルホン(化合物3)およびアザ(化合物4)誘導体中の硫黄原子の変化はまた親和性を3桁減少させ、このリガンド認識位置の重要性を示す。化合物4は、インライン探索のために使用した条件下であまり変化しない(Limら、2006b)。したがって、RNAとのそのより弱い相互作用がメチル基の存在によって立体干渉を引き起こし得る。硫黄原子での化合物3のより高い正の電荷密度(Limら、2006b)は、化合物4と比較して本化合物のわずかにより弱い結合に寄与し得る。さらに、SAH中の硫黄中心の2組の孤立電子対は、RNAのリガンド認識で重要な役割を果たし得る。SAH(およびSAC)の硫黄原子は、考えられる限り、電荷移動またはファンデルワールス相互作用によってアプタマーと生産的に相互作用することができる。最後に、アデノシンはSAHアプタマーと弱く相互作用するが(Kd約100□M)、ホモシステインやメチオニンは1mMもの濃度でもRNA構造のいかなる調整も引き起こさない。
これらの結果を使用して、68 metH RNAによるSAHの分子認識モデルを作製した(図12B)。いくつかの他のリボスイッチアプタマークラスについて認められるように、このモデルは、本質的にリガンド上のあらゆる官能基が重要な分子認識決定要因としての機能を果たすことを示す(例えば、 Mandalら、2003;Sudarsanら、2003b;Mandalら、2004c;Limら、2006a;Limら、2006b)。
iii.SAH結合はレポーター遺伝子の発現を活性化する
SAHエレメントとP.syringae由来のahcY mRNAの開始コドンとの間の配列は、P4ステムの3’末端の2つのヌクレオチドが二者択一的にリボゾーム結合部位またはシャイン−ダルガルノ(SD)配列と塩基対合することができる追加のステム−ループ構造を形成すると予想される(図13A)。この後者の相互作用は、2つの塩基対によって追加のステム−ループ構造を伸長し、したがって、SD隔離ステムとして機能することができる。したがって、このRNAは、おそらくSD配列の曝露によってリガンド結合するときに遺伝子発現を活性化してmRNAとのリボゾーム相互作用を容易にするSAH応答性リボスイッチとして機能する。D.aromatica metH遺伝子由来のSAHアプタマーについて類似のSAH媒介性再配置が予想されるにもかかわらず、このRNAとのリガンド結合が転写ターミネーターステムの形成を調節するようである。
SAHエレメントとP.syringae由来のahcY mRNAの開始コドンとの間の配列は、P4ステムの3’末端の2つのヌクレオチドが二者択一的にリボゾーム結合部位またはシャイン−ダルガルノ(SD)配列と塩基対合することができる追加のステム−ループ構造を形成すると予想される(図13A)。この後者の相互作用は、2つの塩基対によって追加のステム−ループ構造を伸長し、したがって、SD隔離ステムとして機能することができる。したがって、このRNAは、おそらくSD配列の曝露によってリガンド結合するときに遺伝子発現を活性化してmRNAとのリボゾーム相互作用を容易にするSAH応答性リボスイッチとして機能する。D.aromatica metH遺伝子由来のSAHアプタマーについて類似のSAH媒介性再配置が予想されるにもかかわらず、このRNAとのリガンド結合が転写ターミネーターステムの形成を調節するようである。
P.syringaeにおけるahcY遺伝子の5’UTRを含むIGRをlacZコード配列のすぐ上流に融合した生体内遺伝子調節アッセイを行った。この構築物は、レポーター遺伝子ORFとインフレームで融合したahcY遺伝子の開始コドンを保持していた。得られた翻訳融合ベクターをP.syringaeに形質転換して、野生型(WT)レポーター株を産生した。同様に、アプタマー機能を破壊または修復すると予想される一連の変異レポーター株を構築した(図13A)。形質転換したP.syringae株を、次いで、King培地B(リッチ)またはVogel−Bonner培地(最小)のいずれかで増殖させ、変異構築物のレポーター発現レベルをWTレポーター構築物由来の結果と比較した(図13B)。
リッチ培地では、SAH濃度は高いと予想される。これは細胞が補因子としてSAMの使用が必要な代謝経路を利用するはずであるからである。予想通り、WT構築物の□−ガラクトシダーゼレポーター活性は、ステムP1とP2またはJ1−2との間のジャンクション(図13A)中の2つの保存ヌクレオチドを破壊する変異を保有する構築物M1と比較して上昇する(図13B、上)。この所見は、SAH結合が遺伝子発現を活性化し、リガンド結合を破壊する変異によってリボスイッチがオフ状態に戻るという考えと一致する。残念なことに、M2によって保有される変異によるP2ステムの不安定化がリボスイッチ機能を破壊すると予想されたという事実にもかかわらず、M2およびM3の両方はWT様発現を示す。しかし、インライン探索(SAHの存在下および非存在下)により、M2構築物が著しく誤折り畳みされ、それにより、レポーター構築物が高遺伝子発現に戻り得ることが明らかとなった。過剰に誤折り畳みしなかった構築物を得たP2のさらなる変異を試験した。予想通り、変異体M4(P2破壊)およびM5(P2修復)は、それぞれ、遺伝子発現の喪失およびその後の遺伝子発現の修復を示す。これらの所見は、アプタマーの破壊によってリボスイッチが遺伝子発現のオフ状態に戻ることを再度示し、M2変異が実際にその誤折り畳みおよび遺伝子発現の結果で異常であることを示す。
同様に、構築物M6、M7、およびM8によって保有される変異の影響は、SD隔離を含む遺伝子調節機構と一致する。これらの構築物は、それぞれ、P4の安定性を低下させる2つの変異を保有し、かかる構築物に対するSAH結合親和性の喪失がインライン探索の使用によって認められた。さらに、SAH結合が破壊された構築物はまた、低い□−ガラクトシダーゼレポーター活性を得ることができる。この結果は、実際、M6およびM8について認められるが、M7はWT発現に近い(図13A)。M7変異はP4形成を破壊するにもかかわらず、この変異はSD配列に重複する隔離ステムも破壊することができる。したがって、M7リボスイッチは、もはやOFF状態に戻す能力がないはずであり、認められるように、リボスイッチ−レポーター融合構築物の遺伝子発現は高くなり得る。最少培地(Vogel−Bonner培地)で増殖した細胞を使用して類似の一連のレポーター遺伝子アッセイを行った。最少培地で増殖した種々の構築物を使用して同一の傾向が認められたが(図13B、下)、レポーター発現についての絶対値はリッチ培地においてより高かった。最小培地における全レポーター発現のこの減少は、一般的な代謝活性およびタンパク質合成の減少に起因し得る。
インライン探索を使用して、P4ステム形成とSD隔離ステム形成との間の競合を観察することができるかどうかを判定した。図13Aに示したものと類似の151 ahcY RNAに基づいたより長い構築物を使用したインライン探索により、SAHが存在する場合にSD隔離ステムが実際にWT構築物中で破壊されることが明らかとなる。対照的に、本構築物のM6バージョンはSAHの有無と無関係にSD隔離ステムを形成するのに対して、M7バリアントはこのステムを形成できない。したがって、完全なP4ステムおよび完全なSD隔離ステムの相互排他的形成は、P.syringae ahcY遺伝子由来のSAHリボスイッチの発現プラットフォームの重要な成分であり得る。
生体内での代謝産物エフェクターとしてSAHをさらに確立するために、細胞SAHレベルを増加させることが公知のエフェクターを補充した最小培地中で増殖させたWT株のレポーター発現を測定した(図14)。アデノシン−2’,3’−ジアルデヒド(SAHヒドロラーゼのインヒビター)およびアデノシン+ホモシステインは共に、細胞SAHレベルを実質的に増加させることが以前に報告されている(Hermesら、2004)。SAHヒドロラーゼインヒビターまたはアデノシン/ホモシステイン混合物のいずれかを補充した培地は、WTリボスイッチ−レポーター融合構築物の発現を約10〜20倍増加させ(図14A)、アデノシン−2’,3’−ジアルデヒド濃度の増加により、WTを使用した遺伝子発現は増加するが、欠損変異体M1およびM7では増加しなかった(図14B)。培地へのメチオニンの添加により、リボスイッチ媒介性発現が同様に増加する。増殖培地中の過剰なメチオニンにより、細胞SAM濃度がより高くなり(Winklerら、2003)、細胞SAH濃度も増加し得る。
対照的に、培地への250□M SAHの添加によってレポーター発現はわずかしか増加しない。SAHはインタクトな分子として細胞膜を横切らず(Ueland、1982)、このことは、何故この化合物の添加がレポーター発現レベルにほとんど影響を及ぼさないかを説明している。P4の形成を破壊し、且つアプタマーのコアコンセンサス配列を変化させる変異を保有するM6リボスイッチ−レポーター融合構築物を用いて、遺伝子発現がほぼ認められないので、レポーター発現の上方制御はリボスイッチ依存性のようである(図13A)。
2.考察
SAHはSAM依存性メチル転移反応の生成物として生物系に遍在しているが、高濃度で存在する場合にこれらの反応のインヒビターとしても機能する(Ueland、1982)。したがって、多数の細胞は、SAHを選択的に感知して過剰なSAHを破棄する必要がある。いくつかの生物では、SAHは、硫黄代謝に関与する遺伝子を調節するタンパク質遺伝因子(Reyら、2005)によって感知される。これらの所見により、RNA分子が類似の能力でSAHを感知してその異化に必要な重要遺伝子を調節するのに役立ち得ることが明らかとなる。
SAHはSAM依存性メチル転移反応の生成物として生物系に遍在しているが、高濃度で存在する場合にこれらの反応のインヒビターとしても機能する(Ueland、1982)。したがって、多数の細胞は、SAHを選択的に感知して過剰なSAHを破棄する必要がある。いくつかの生物では、SAHは、硫黄代謝に関与する遺伝子を調節するタンパク質遺伝因子(Reyら、2005)によって感知される。これらの所見により、RNA分子が類似の能力でSAHを感知してその異化に必要な重要遺伝子を調節するのに役立ち得ることが明らかとなる。
SAHエレメントの同定により、SAHに選択的に結合する、高度に保存され且つ広範に分布する細菌RNAの第1の例が得られる。このRNAは、常にORFのすぐ上流に存在するリボスイッチクラスのアプタマードメインとしての役割を果たし、その予想されるタンパク質産物がSAH異化に関与する。これは、SAHリボスイッチの大部分がリガンド結合に応答して遺伝子発現をオンにする可能性が高いことを示す。実際、RNAエレメントの直接リガンド結合が一定の二次構造および三次構造を安定化して隣接ORFのSD配列に接近可能にし、リボゾーム結合およびその後の翻訳を可能にする。
SAH結合に対して強く識別するいくつかの異なるクラスの公知のSAM感知リボスイッチが存在するにもかかわらず(Limら、2006b;Fuchs、2006)、SAHリボスイッチは、SAH結合を好み、且つSAMを拒絶するようにこの識別を逆にする同定された第1のRNAクラスである。他のリボスイッチクラスと同様に、他の密接に関連する化合物による遺伝子発現の調節を防止するために、リガンド結合の高い選択性が必要であり得る。SAHアプタマーによる強い分子識別により、不必要に活性化したSAH異化遺伝子発現からSAMなどの他の化合物が排除される可能性が高く、これはSAHが高レベルに蓄積する場合のみに必要である。SAM(SAHの代謝前駆体)は通常の条件下でSAHよりも巨大な細胞プールを有するので、SAHアプタマーのこの識別力は特に重要である(Ueland、1982)。SAHリボスイッチの遺伝子コンテクストおよびSAMを約3桁の規模で識別するその能力は、SAHが生体内でRNAエレメントによって感知される代謝産物であることを示す。したがって、SAHリボスイッチにより、SAH濃度が適切な遺伝子発現に値する場合のみに細胞がSAH分解のための資源を拡大することが可能であるセンサーおよび遺伝子調節エレメントのクラスを有する遺伝子が得られる。
天然SAMアプタマーと同様に、本研究で最も詳細に試験したSAHアプタマーは、分子認識のためのリガンド上の本質的にあらゆる官能基を使用する。1つの留意すべき例外は、SAHアプタマーが、親和性を実質的に喪失することなく、リガンドのアミノ酸部分からのメチレン基の除去を許容するという所見である。S−アデノシルシステイン(SAC;図12A、化合物2)はSAH中に存在する同一の一連の官能基を保有するが、これらの基のいくつかはアプタマーの結合ポケット中の1Å以上が置換されなければならない。より短いSACアナログの許容について、RNAアプタマーがそれぞれがリガンドの片側と相互作用する2つの個別の結合ポケットを形成することができると説明することが可能である。これにより、結合部位が異なる長さのリガンドを認識可能な一定レベルの適応性が得られる。見かけ上のKD値は次第に低くなっていくが、次第に短くなって行くチアミン一リン酸塩およびチアミン化合物に結合することができるTPP結合リボスイッチについてのこのリボスイッチアプタマー機能型の優先性が報告されている(Winklerら、2002)。TPPリボスイッチアプタマーの原子分解モデル(EdwardsおよびFerre−D’Amare,2006;Serganovら、2006;Thoreら、2006)により、比較的高い親和性でより短いチアミン一リン酸塩リガンドに結合するようにその位置を調整することができる二分リガンド結合ポケットが明らかとなる。
SAHアプタマー中で最も高度に保存されたヌクレオチドは、主に、P4中およびP1、P2、およびP4に架橋するジャンクション中に存在する(図9A)。インライン探索によって認められたこれらの残基の構造の実質的な調整によって明らかなように、これらのヌクレオチドは、SAHの結合ポケットの形成に関与し得る(図10Aおよび10B)。これらのヌクレオチドは、硫黄中心で電荷を欠くリガンドに結合するポケットを形成し、したがって、SAM−Iアプタマーのそれと異なる方法でこの原子中心と相互作用する構造を形成する。SAHアプタマーは、本研究で試験した硫黄中心が改変されている両化合物を拒絶する(図12A、化合物3および4)。SAHの硫黄を置換した窒素中心が同様に不荷電であるので、化合物4に対する識別は特に注目に値する。したがって、SAHリボスイッチは、SAH中の硫黄に等価な原子上のさらなる化学部分を保有するSAM、3、および4のような化合物の立体排除によって識別することは明白である。
リボスイッチクラスのリストの拡大に加えて、SAHアプタマーの同定は、高選択性SAHセンサーとして適用される。例えば、SAHはホモシステインの供給源であり、これを心血管疾患のマーカーとして使用することができる(Nygardら、1999)。SAHエレメントのコンセンサスに適合する配列決定した細菌ゲノム中で同定された最も短い例は、50ヌクレオチドをわずかに超えるサイズである(Dechloromonas aromaticaにおけるORF Daro_0186の上流に存在する)。SAHに対するナノモルの親和性およびSAMなどの密接に関連するアナログに対する数桁規模の識別ならびに容易に利用可能な発現プラットフォームを結びつけて考えて、SAHエレメントは試験管内および生体内適用のための所望の性質を有する。
3.実験手順
i.オリゴヌクレオチド、化学物質、および細菌
合成DNAオリゴヌクレオチドを、イェール大学 W.M.Keck Foundation Biotechnology Resource LaboratoryまたはSigma−Genosysから購入し、他で記載しない限りさらに処理することなく使用した。[3H]SAMまたはS−(5’−アデノシル)−L−メチオニン−(メチル−3H)をSigma−Aldrichから購入し、[γ−32P]ATPをAmersham Biosciencesから購入した。化合物4は、シェフィールド大学 G.Michael Blackburn教授から譲渡された。SAHアナログ3、5、6、および9〜16(それらの調製を他の場所に記載した)を除いた他の全ての化学物質をSigma−Aldrichから購入した(Limら、2006b)。Pseudomonas syringae pv.tomato str.DC3000は、コーネル大学 Gregory B.Martin教授から譲渡された。
i.オリゴヌクレオチド、化学物質、および細菌
合成DNAオリゴヌクレオチドを、イェール大学 W.M.Keck Foundation Biotechnology Resource LaboratoryまたはSigma−Genosysから購入し、他で記載しない限りさらに処理することなく使用した。[3H]SAMまたはS−(5’−アデノシル)−L−メチオニン−(メチル−3H)をSigma−Aldrichから購入し、[γ−32P]ATPをAmersham Biosciencesから購入した。化合物4は、シェフィールド大学 G.Michael Blackburn教授から譲渡された。SAHアナログ3、5、6、および9〜16(それらの調製を他の場所に記載した)を除いた他の全ての化学物質をSigma−Aldrichから購入した(Limら、2006b)。Pseudomonas syringae pv.tomato str.DC3000は、コーネル大学 Gregory B.Martin教授から譲渡された。
ii.RNAの調製
68 metHおよび122 ahcY RNAを、T7 RNAポリメラーゼおよび対応するDNAテンプレートを使用した試験管内での転写によって調製した。68 metHのDNAテンプレートを、製造者の説明書にしたがってSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen)を使用して合成テンプレートDNAとハイブリッド形成したT7プロモーター配列を保有するプライマーの伸長によって生成した。合成テンプレートDNAを、変性(8M尿素)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)の使用によって伸長前に精製した。野生型および変異122 ahcY RNAのDNAテンプレートを、下記の適切なプラスミドを使用したPCR増幅から生成した。RNA転写物を変性PAGEによって精製し、10mM Tris−HCl(pH7.5、23℃)、200mM NaCl、および1mM EDTAを含む溶液を使用してゲルフラグメントから溶離させた。製造者の説明書にしたがって、RNAをエタノールでの沈殿によって濃縮し、アルカリホスファターゼ(Roche Diagnostics)を使用して脱リン酸化し、[γ−32P]ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を使用して5’放射性同位元素標識した。放射性同位元素標識したRNAを、上記のように変性PAGEによって精製し、単離した。
68 metHおよび122 ahcY RNAを、T7 RNAポリメラーゼおよび対応するDNAテンプレートを使用した試験管内での転写によって調製した。68 metHのDNAテンプレートを、製造者の説明書にしたがってSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen)を使用して合成テンプレートDNAとハイブリッド形成したT7プロモーター配列を保有するプライマーの伸長によって生成した。合成テンプレートDNAを、変性(8M尿素)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)の使用によって伸長前に精製した。野生型および変異122 ahcY RNAのDNAテンプレートを、下記の適切なプラスミドを使用したPCR増幅から生成した。RNA転写物を変性PAGEによって精製し、10mM Tris−HCl(pH7.5、23℃)、200mM NaCl、および1mM EDTAを含む溶液を使用してゲルフラグメントから溶離させた。製造者の説明書にしたがって、RNAをエタノールでの沈殿によって濃縮し、アルカリホスファターゼ(Roche Diagnostics)を使用して脱リン酸化し、[γ−32P]ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を使用して5’放射性同位元素標識した。放射性同位元素標識したRNAを、上記のように変性PAGEによって精製し、単離した。
平衡透析法のために使用される野生型および変異68 metH RNAを上記のように調製および精製するが、脱リン酸化および放射性同位元素標識を使用しなかった。平衡透析法のために使用される156 metA RNA(Corbinoら、2005)を、Agrobacterium tumefaciensのGV2260株のホールセルPCRによって生成したDNAテンプレートを使用して、上記のように調製した。
iii.インライン探索分析
インライン探索アッセイを、本質的に以前に記載のように行った(SoukupおよびBreaker、1999)。5’32P標識RNAを、50mM Tris−HCl(pH8.3、25℃)、20mM MgCl2、100mM KCl、および表示濃度の試験化合物を含む10μlの体積にて室温で約40時間インキュベートした。自発的切断産物を変性10%PAGEによって分離し、PhosphorImager(Molecular Dynamics)を使用して視覚化し、SAFA v1.1ソフトウェア(Dasら、2005)を使用して定量した。各ヌクレオチド位置でのRNAの切断量を、SAFA分析から得た。この分析は、不変レベルで自発的に切断する基準ヌクレオチド位置を自動的に決定して、各レーンの異なるロード量を修正する。各調整部位での各バンド強度を合計および正規化して、構造的に調整されたRNAの割合についての値を得た。これにより、リガンドの非存在下では調整されず、最高濃度のリガンドの存在下で最大に調整されると見なされた。見かけ上の解離定数(KD)の値を、SigmaPlot9ソフトウェア(Systat Software,Inc.)を使用した調整の割合(F)対3つ全ての示した調整部位でのリガンド濃度([L])のプロットの式F=[L]/([L]+KD)へのフィッティングによって決定した。
インライン探索アッセイを、本質的に以前に記載のように行った(SoukupおよびBreaker、1999)。5’32P標識RNAを、50mM Tris−HCl(pH8.3、25℃)、20mM MgCl2、100mM KCl、および表示濃度の試験化合物を含む10μlの体積にて室温で約40時間インキュベートした。自発的切断産物を変性10%PAGEによって分離し、PhosphorImager(Molecular Dynamics)を使用して視覚化し、SAFA v1.1ソフトウェア(Dasら、2005)を使用して定量した。各ヌクレオチド位置でのRNAの切断量を、SAFA分析から得た。この分析は、不変レベルで自発的に切断する基準ヌクレオチド位置を自動的に決定して、各レーンの異なるロード量を修正する。各調整部位での各バンド強度を合計および正規化して、構造的に調整されたRNAの割合についての値を得た。これにより、リガンドの非存在下では調整されず、最高濃度のリガンドの存在下で最大に調整されると見なされた。見かけ上の解離定数(KD)の値を、SigmaPlot9ソフトウェア(Systat Software,Inc.)を使用した調整の割合(F)対3つ全ての示した調整部位でのリガンド濃度([L])のプロットの式F=[L]/([L]+KD)へのフィッティングによって決定した。
iv.平衡透析法
チャンバー間の分離を5000ダルトン分子量カットオフの透析膜によって維持するDispo−Equilibrium Biodialyzer(The Nest Group,Inc.,Southboro,MA,USA)の各サイドへの20μlサンプルの送達によって、平衡透析法を行った。一方のチャンバーは、100mM Tris−HCl(pH8.3、24℃)、20mM MgCl2、100mM KCl、および100nM [3H]SAMから構成される緩衝液を含んでいた。反対側のチャンバーは、同一の緩衝液および表示濃度の156 metAまたは68 metH RNAのいずれかを含んでいた。25℃で11.5時間のインキュベーション後、5μlアリコートを両チャンバーから取り出し、液体シンチレーションカウンターによって放射能を測定した。
チャンバー間の分離を5000ダルトン分子量カットオフの透析膜によって維持するDispo−Equilibrium Biodialyzer(The Nest Group,Inc.,Southboro,MA,USA)の各サイドへの20μlサンプルの送達によって、平衡透析法を行った。一方のチャンバーは、100mM Tris−HCl(pH8.3、24℃)、20mM MgCl2、100mM KCl、および100nM [3H]SAMから構成される緩衝液を含んでいた。反対側のチャンバーは、同一の緩衝液および表示濃度の156 metAまたは68 metH RNAのいずれかを含んでいた。25℃で11.5時間のインキュベーション後、5μlアリコートを両チャンバーから取り出し、液体シンチレーションカウンターによって放射能を測定した。
v.生体内レポーター遺伝子発現アッセイ
予想されるahcY翻訳開始部位(GenBank受入れ番号:NC_004578.1;ヌクレオチド5,771,072〜5,771,444)と比較したヌクレオチド−367〜+6を、Pseudomonas syringae pv.tomato str.DC3000のホールセルPCRによってBamHI−HindIIIフラグメントとして増幅した。PCR産物を、lacZレポーター遺伝子のすぐ上流の翻訳融合ベクターpRA301にクローン化した(AkakuraおよびWinans、2002)。このレポーターベクターは、pseudomonas aeruginosaベクターpVS1(Itohら、1984)由来の複製起点repおよび安定領域staを保有するので、シュードモナスで安定に維持される。変異体M1〜M8を、テンプレートして得られたプラスミド、適切な変異誘発プライマー、およびQuikChange部位特異的変異誘発キット(Stratagene)を製造者の説明書にしたがって使用して生成した。全組換えプラスミドの完全性を、配列決定によって確認した。pRA301バリアントのPseudomonas syringaeへの形質転換を、標準的なプロトコールにしたがったエレクトロポレーションによって行った(Ausubelら、1992)。正確な形質転換体を、スペクチノマイシン(75μg/ml)に対する選択性および リファンピシン(50μg/ml)耐性によって同定した。
予想されるahcY翻訳開始部位(GenBank受入れ番号:NC_004578.1;ヌクレオチド5,771,072〜5,771,444)と比較したヌクレオチド−367〜+6を、Pseudomonas syringae pv.tomato str.DC3000のホールセルPCRによってBamHI−HindIIIフラグメントとして増幅した。PCR産物を、lacZレポーター遺伝子のすぐ上流の翻訳融合ベクターpRA301にクローン化した(AkakuraおよびWinans、2002)。このレポーターベクターは、pseudomonas aeruginosaベクターpVS1(Itohら、1984)由来の複製起点repおよび安定領域staを保有するので、シュードモナスで安定に維持される。変異体M1〜M8を、テンプレートして得られたプラスミド、適切な変異誘発プライマー、およびQuikChange部位特異的変異誘発キット(Stratagene)を製造者の説明書にしたがって使用して生成した。全組換えプラスミドの完全性を、配列決定によって確認した。pRA301バリアントのPseudomonas syringaeへの形質転換を、標準的なプロトコールにしたがったエレクトロポレーションによって行った(Ausubelら、1992)。正確な形質転換体を、スペクチノマイシン(75μg/ml)に対する選択性および リファンピシン(50μg/ml)耐性によって同定した。
野生型(WT)および変異Pseudomonas syringaeレポーター株におけるlacZ遺伝子の発現レベルを測定するために、細胞を、King培地B(Kingら、1954)(20g/l Proteose Peptone no.3、10g/l グリセロール、1.5g/l K2HPO4、1.5g/l MgSO4・7H2O、pH7.2)、50μg/mlリファンピシン、および75μg/mlスペクチノマイシンまたはVogel−Bonner最小培地(0.2g/l MgSO4・7H2O、2g/lクエン酸一水和物、10g/l K2HPO4、3.5g/l NH4NaHPO4・4H2O、pH 7.0)、0.5% w/vグルコース、50μg/mlリファンピシン、および75μg/mlスペクチノマイシンのいずれかにて振とうしながら28℃で一晩増殖させた。一晩培養物を、同一培地でA600=0.1〜0.2に希釈し、表示のさらなる化合物を補充した。培養物をさらに4.5時間(King培地B)または6時間(Vogel−Bonner培地)インキュベートし、その後に標準的なプロトコールにしたがってβ−ガラクトシダーゼアッセイを行った(Miller、1992)。報告したミラー単位は、3つの反復実験の平均であった。
(実施例4)
D.実施例4:Streptococcaceae bacteriaにおける第2の天然preQ1 アプタマークラスの確認
真正細菌ゲノムのバイオインフォマティクス検索により、関連遺伝子の試験でリガンドの同一性が直ちに明らかにならない多数のリボスイッチ候補が得られた。これらのモチーフの1つは、Streptococcaceae科においてCOG4708またはDUF988に分類された仮説上の膜タンパク質をコードする遺伝子の5’非翻訳領域(UTR)内にもっぱら見出される。キューオシン生合成中間体であるpre−キューオシン1(preQ1)に結合するリボスイッチは、Streptococcaceae外の細菌の多数のFirmicute種における相同遺伝子の5’UTR中に同定された。Streptococcus pneumoniae R6由来のCOG4708 RNAモチーフの代表もpreQ1に結合することを本明細書中に示す。さらに、このRNAの代表は、前に記載したpreQ1リボスイッチクラスのそれと異なる構造および分子認識特性を有する。preQ1は2つ以上の異なる天然アプタマークラスが存在する第2の代謝産物であり、同一の代謝産物に結合するために異なる構造を利用する天然アプタマーが共通であり得ることを示す。さらに、preQ1結合RNAとCOG4708に分類されるタンパク質をコードするほとんどの遺伝子との関連は、これらのタンパク質がpreQ1または別のキューオシン生合成中間体の輸送体として機能することを示す。
D.実施例4:Streptococcaceae bacteriaにおける第2の天然preQ1 アプタマークラスの確認
真正細菌ゲノムのバイオインフォマティクス検索により、関連遺伝子の試験でリガンドの同一性が直ちに明らかにならない多数のリボスイッチ候補が得られた。これらのモチーフの1つは、Streptococcaceae科においてCOG4708またはDUF988に分類された仮説上の膜タンパク質をコードする遺伝子の5’非翻訳領域(UTR)内にもっぱら見出される。キューオシン生合成中間体であるpre−キューオシン1(preQ1)に結合するリボスイッチは、Streptococcaceae外の細菌の多数のFirmicute種における相同遺伝子の5’UTR中に同定された。Streptococcus pneumoniae R6由来のCOG4708 RNAモチーフの代表もpreQ1に結合することを本明細書中に示す。さらに、このRNAの代表は、前に記載したpreQ1リボスイッチクラスのそれと異なる構造および分子認識特性を有する。preQ1は2つ以上の異なる天然アプタマークラスが存在する第2の代謝産物であり、同一の代謝産物に結合するために異なる構造を利用する天然アプタマーが共通であり得ることを示す。さらに、preQ1結合RNAとCOG4708に分類されるタンパク質をコードするほとんどの遺伝子との関連は、これらのタンパク質がpreQ1または別のキューオシン生合成中間体の輸送体として機能することを示す。
リボスイッチは、遺伝子発現を調節するための小分子代謝産物に結合する構造化RNAである(MandalおよびBreaker 2004a;SoukupおよびSoukup 2004;TuckerおよびBreaker 2005;WinklerおよびBreaker 2005)。リボスイッチは、典型的には、リガンド結合アプタマーおよびリガンド結合を遺伝子調節に変える発現プラットフォームからなる。各リボスイッチクラスのアプタマーは、通常、リガンド結合部位によって強いられる制限によって十分に保存される。アプタマー配列のこの保存およびアプタマーの構造により、ゲノム配列のバイオインフォマティクス分析が新規のリボスイッチ候補の同定のための有効なツールとなる(例えば、Rodionovら2002;Rodionovら2003;Barrickら2004;Abreu−GoodgerおよびMerino 2005;Corbinoら2005;Weinbergら2007)。対照的に、発現プラットフォームは非常に変化し、転写終結および翻訳阻害などの多様な遺伝子調節機構を利用することができる(MandalおよびBreaker 2004a)。発現プラットフォームを、通常、各リボスイッチ配列の試験によって識別することができるが、配列および構造保存のその相対的欠如により、新規のリボスイッチクラスのバイオインフォマティクスによる発見のための標的としてのその有用性が妨げられる。
バイオインフォマティクス検索を使用して、多数のリボスイッチおよびリボスイッチの候補が発見されている(例えば、Barrickら2004;Corbinoら2005)。ごく最近、数百個の細菌ゲノムの検索に適用したCMfinderパイプライン(Yaoら2006)を使用した22のRNAモチーフの発見を使用した(Weinbergら2007)。22モチーフのうちの6個は、リボスイッチなどのシス調節RNAに共通の特徴を示す。例えば、これらのモチーフは、遺伝子または異なる遺伝子組のすぐ上流に一貫して存在する。さらに、これらのモチーフの代表は、以下の2つの特徴のうちの1つを有する:rho非依存性転写ターミネーターまたはすぐ下流に存在する遺伝子のリボゾーム結合部位またはシャイン−ダルガルノ配列(SD)に重複するステム。いくつかの記載のモチーフについて、リガンド同一性を、RNAのゲノムコンテクストから推測した(Weinbergら2007;Wangら2008;Regulskiらが提出)。他のモチーフについて、以前にゲノムコンテクストからリガンド同一性に関する情報はほとんど得られなかったか全く得られなかった。1つのかかるRNAモチーフは、COG4708またはDUF988に分類されるFirmicutesで見出された保存された仮説上の膜タンパク質の遺伝子のみと関連することが見出された。
キューオシン(Q)生合成前駆体preQ1に応答するリボスイッチ(Rothら2007)が記載されている。Qは、ほとんどの細菌においてTyr、Asn、Asp、およびHisのtRNA中のGUNアンチコドンのゆらぎ位置で見出される高改変塩基である(HaradaおよびNishimura 1972)。Q改変は、翻訳忠実度に重要であることが公知である(Meierら1985;BienzおよびKubli 1981;Urbonaviciusら2001)。Q生合成は、GTPから開始され、一連の酵素工程において中間体preQ0(7−シアノ−7−デアザグアニン)およびpreQ1(7−アミノメチル−7−デアザグアニン)を介して進行する(Kuchinoら1976;Okadaら1978;Iwata−Reuyl 2003;GaurおよびVarshney 2005;Van Lanenら2005)。preQ1は特異的グアニンtRNAと優先的に置換され、残りの生合成工程がin situで起こる(Okadaら1979;Slanyら1993)。したがって、preQ1は、tRNAへの挿入前に遊離形態で存在する最後のQ前駆体である。
公知のpreQ1リボスイッチクラスの代表(Rothら2007)は、しばしばQ生合成オペロンの上流に存在するが(Readerら2004)、いくつかはまたそうでなければQに関連しないタンパク質をコードする他の遺伝子の上流で同定されており、これらの遺伝子型の1つはCOG4708に分類される。したがって、COG4708タンパク質がQ生合成前駆体の輸送に関連し得ると推測された。
本研究では、COG4708タンパク質をコードする遺伝子に関連するRNAがpreQ1に強固且つ選択的に結合し、遺伝子の「オフ」スイッチと一致する特徴も示すと判定した。したがって、このRNAモチーフの代表が実際にpreQ1リボスイッチの第2のクラス(以後、preQ1−IIと呼ぶ)としての機能を果たすと提案された。preQ1−IIリボスイッチアプタマーは、以前に記載されたpreQ1リボスイッチ(Rothら2007)(現在、preQ1−Iに改名)のそれよりも実質的に異なる構造および分子認識プロフィールを有する。したがって、preQ1は、天然RNAアプタマーの少なくとも2つのクラスによって認識される代謝産物の第2の例としてのS−アデノシルメチオニン(SAM)(Corbinoら2005)に連結する。さらに、新規のリボスイッチクラスの発見を、そのホモログが公知のリボスイッチによって調節されるmRNAの非コード領域中で検索することによって補助することができる。
1.結果と考察
i.COG4708 RNAモチーフのバイオインフォマティクス
COG4708 RNAモチーフの元の記載には、Streptococcaceae科由来の22個の配列を含み、そのうちの6つは固有であった(Weinbergら2007)。COG4708 RNAモチーフのさらなる例を同定するために、アップデートされた配列データベースリリース(RefSeq25)を使用して相同性検索を行った。モチーフと適合するさらなる18個の配列を同定し、それにより、配列の総数は40個になり、固有の配列数は13個になった(図15)。
i.COG4708 RNAモチーフのバイオインフォマティクス
COG4708 RNAモチーフの元の記載には、Streptococcaceae科由来の22個の配列を含み、そのうちの6つは固有であった(Weinbergら2007)。COG4708 RNAモチーフのさらなる例を同定するために、アップデートされた配列データベースリリース(RefSeq25)を使用して相同性検索を行った。モチーフと適合するさらなる18個の配列を同定し、それにより、配列の総数は40個になり、固有の配列数は13個になった(図15)。
ほとんどの新規の代表を、代表的な株が以前に配列決定されているS.pneumoniae、S.pyogenes、またはLactococcus lactisなどの生物において同定した。したがって、いくつかのさらなるCOG4708 RNAは、既に記載のものと非常に類似しているか同一である。S.suis、S.sanguinis、およびLactobacillus caseiにおけるモチーフの配列適合も同定した。モチーフの全ての代表は、COG4708またはDUF988と注釈付けしたタンパク質をコードする遺伝子の5’−UTR中で見出された。アプタマー内にシュードノット、ループ配列、およびSD配列を含む以前に記載のモチーフ(Weinbergら2007)の保存された特徴は、全ての新規の代表中に存在する(図16A)。この構造化RNAクラスは、以前に決定されたよりも広範な細菌種にわたって保存されている。さらに、RNAのコンセンサス配列パターンおよび二次構造モデルの両方は、preQ1−Iアプタマークラスについて認められたものよりも実質的により複雑である(Rothら2007)。
ii.COG4708 RNAモチーフの代表は、preQ1感知リボスイッチとして機能する可能性が高い。
前記のpreQ1−Iリボスイッチ(Rothら2007)とのCOG4708タンパク質をコードする遺伝子の関連に基づいて、COG4708の遺伝子に関連する第2の保存されたRNAモチーフもpreQ1を感知すると仮定される。COG4708 RNAがpreQ1結合に応答した構造変化を受けるかどうかを決定するために、インライン探索アッセイ(SoukupおよびBreaker 1999;Winklerら2002)を、preQ1の存在下および非存在下でこのモチーフの代表に対して行った。インライン探索アッセイは、内部リン酸エステル転送に起因する自発的RNA切断速度の相違を活用する。代謝産物結合の際のRNA構造の変化によって一般にRNAフラグメンテーションパターンが変わるように、RNA鎖の非制限領域は、典型的には、制限領域よりも切断速度が速い(SoukupおよびBreaker 1999;LiおよびBreaker 1999)。
S.pneumoniae R6由来のCOG4708 RNAモチーフを含む103−ヌクレオチド構築物(以後、1−103 RNAと呼ぶ)に対応する5’32P標識RNAを種々の濃度のpreQ1とインキュベートし、自発的切断産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分離した。1−103 RNAの断片化パターンは濃度依存性の変化を示し、したがって、preQ1依存性RNA構造変化が起こることが明らかとなる(図16B)。これらの所見により、COG4708 RNAが異なるクラスのpreQ1アプタマー(本発明者らによってpreQ1−IIと命名した)であることも確認される。全長1−103 RNA構築物の切断パターンは、系統発生分析に基づいて予想される二次構造と一致する(Weinbergら2007)。ループおよび連結領域は切断の証拠を示す一方で、予想される塩基対合領域が依然として主に切断から保護される(図16C)。切断速度の減少を示すほとんどのヌクレオチドは、最も高度に保存されたヌクレオチドに対応する(図16C)。SD配列およびP3を含む抗SDは、preQ1の非存在下でいくつかの切断を示す。この切断はリガンド結合の際に減少し、このことはSDと抗SDとの相互作用がpreQ1の存在下で安定化することを示し、SDを隔離して翻訳開始を防止すると予想される。対照的に、16以下の番号を付けたヌクレオチドで生じる高レベルの自発的切断は、1−103 RNA構築物の5’領域が依然として大部分が構築されていないことを示す。この所見は、preQ1−IIアプタマー代表のうちの保存されたヌクレオチドの比較的まばらな分布を加味して、この領域がアプタマー構造の重要な部分の形成に関与しないことを示す。
バイオインフォマティクスおよび構造探索データに基づいて、S.pneumoniae由来のpreQ1−II RNAモチーフが遺伝子オフスイッチとして機能し、リガンド結合がP3二次構造を安定化させてSD配列を隔離し、遺伝子発現を防止することが示されている。この遺伝子調節機構は、いくつかの他のリボスイッチについて以前に認められている(Rodionovら2002;MandalおよびBreaker 2004a;Fuchsら2006;Wangら2008)。同様に、preQ1−Iリボスイッチの代表は、preQ1に応答して相同COG4708遺伝子の発現を下方制御すると予想される(Rothら2007)。
iii.最小preQ1−II二次構造をバイオインフォマティクスによって正確に予想する。
短縮構築物がpreQ1結合活性を保持するかどうかを決定するために、一連の5’および3’短縮RNAおよび使用されるインライン探索を構築した。対合エレメントP1〜P4(ヌクレオチド17〜90)を含むRNAのpreQ1に対する見かけ上のKDは約100nMである(図17A、B)。この親和性は他のリボスイッチアプタマーについて認められた範囲内であり、したがって、インライン探索中に比較的構築されてないままであるほとんどの5’−ヌクレオチド(図16C)が高親和性代謝産物結合に必要ないことを証明する。P1を欠くさらにより短いRNA構築物(ヌクレオチド33〜90)は17−90 RNA構築物とほぼ同一のKDを有し、いくつかの位置で共変動が認められたにもかかわらず、保存されたP1エレメントもpreQ1リガンドの分子認識に関与する可能性が低いことが明らかとなる(Weinbergら2007)。おそらくP1は、本発明者らの試験管内インライン探索アッセイによって捕捉されない生体内でのRNA折り畳みまたは機能中で役割を果たす。
提案された構造モデルをさらに試験するために、17−90 RNAの各対合エレメント中に破壊変異および代償的変異を保有する構築物を作製し(図17C)、これらの構築物のリガンド結合活性をインライン探索の使用によって評価した(図17D)。予想通り、P2の破壊変異(M1)により、リガンド結合親和性が約1/100に減少し(KDは約10μM)、代償的変異(M2)によってリガンド結合親和性を部分的に救済する(KD約250nM)。自発的切断産物のパターンは、P2がM1中で対合せず、M2中で対合する構造と一致する。
それぞれP3およびP4に存在する破壊変異M3およびM5は共にpreQ1結合を無効にする(図17D)。代償的変異M6(P4中)が予想通りにリガンド結合を完全に修復するのに対して、P3塩基対合を修復するために代償的変化を保有するM4変異体はpreQ1結合を修復しない。この代償的変異の欠損は、いくつかの理由に起因し得る。M3およびM4は共に、インライン探索中にリガンドの非存在下で野生型RNAのものとは異なる自発的切断パターンを示し、これらの変異によって相当な誤折り畳みを生じることを示す。さらに、変異したP3ヌクレオチドはSD配列および抗SD配列の存在によって厳格に保存され、この領域はリガンド結合を調整する(図16B、C)。これらの特徴により、P3における塩基同一性の変化が広範な誤折り畳みを生じ、M4構築物においてpreQ1結合に重要な分子接触(直接または間接的のいずれか)を欠き得ることが示唆される。
iv.平衡透析法によってpreQ1結合を確認する
異なる方法論を使用して3H−preQ1および17−90 RNA構築物を使用して平衡透析実験を行い、リガンド結合および分子認識の特異性を確認した。平衡透析法のために、3H−preQ1を平衡透析装置のチャンバーaに添加し、過剰なRNAをチャンバーbに添加する。2つのチャンバーを、5,000ダルトン分子量カットオフの透析膜によって分離する(図18A)。溶液を平衡化し、続いて各チャンバー中のトリチウム画分を液体シンチレーションカウンティングによって測定した。3H−preQ1が17−90 RNAで平衡化された場合にRNAにトリチウムがシフトして2つのチャンバーの放射性シグナル比(b/a)が約1.75になるのが認められ(図18B)、これはRNAが3H−preQ1に結合してチャンバーbに隔離されたことを示す。RNAを用いないか、P3ステムを形成する能力を欠くRNA(1−81 RNA)を用いて3H−preQ1(1μM)を平衡化する場合、3H標識は均一に分布する(b/a 約1)。3H−preQ1を用いて17−90 RNAを平衡化して放射能の非対称分布を確立する場合、過剰な非標識preQ1をチャンバーaに再度添加して3H標識を再分布させる。しかし、過剰な非標識グアニンの添加では3Hの分布に影響を及ぼさず、試験濃度のグアニンでは17−90 RNA中のリガンド結合部位を3H−preQ1と競合できないことを示す。
異なる方法論を使用して3H−preQ1および17−90 RNA構築物を使用して平衡透析実験を行い、リガンド結合および分子認識の特異性を確認した。平衡透析法のために、3H−preQ1を平衡透析装置のチャンバーaに添加し、過剰なRNAをチャンバーbに添加する。2つのチャンバーを、5,000ダルトン分子量カットオフの透析膜によって分離する(図18A)。溶液を平衡化し、続いて各チャンバー中のトリチウム画分を液体シンチレーションカウンティングによって測定した。3H−preQ1が17−90 RNAで平衡化された場合にRNAにトリチウムがシフトして2つのチャンバーの放射性シグナル比(b/a)が約1.75になるのが認められ(図18B)、これはRNAが3H−preQ1に結合してチャンバーbに隔離されたことを示す。RNAを用いないか、P3ステムを形成する能力を欠くRNA(1−81 RNA)を用いて3H−preQ1(1μM)を平衡化する場合、3H標識は均一に分布する(b/a 約1)。3H−preQ1を用いて17−90 RNAを平衡化して放射能の非対称分布を確立する場合、過剰な非標識preQ1をチャンバーaに再度添加して3H標識を再分布させる。しかし、過剰な非標識グアニンの添加では3Hの分布に影響を及ぼさず、試験濃度のグアニンでは17−90 RNA中のリガンド結合部位を3H−preQ1と競合できないことを示す。
平衡透析中に認められた傾向がインライン探索によって認められたpreQ1−IIアプタマーの結合機能と一致するにもかかわらず、3H標識のシフト範囲は予想するほど大きくない。使用濃度のRNAによって3H−preQ1の結合部位を過剰に供給したはずであり、そのリガンドに対するアプタマーのKDの測定値を考慮すると、全preQ1分子をRNAで飽和するのに十分なはずであった。したがって、非標識preQ1競合物の非存在下で平衡が起こった場合、b/a比はより大きいはずであった。
この矛盾をさらに試験するために、17−90 RNAでの平衡化後に残存する非シフト3H標識物質を含むチャンバーaの内容物を新規に調製した17−90 RNAのサンプルの反対側の新規の装置のチャンバーaに移し、2つのチャンバーを再平衡化させる実験を行った(図18C)。予想通り、3H標識物質は両チャンバー間で均一に分布し(図18D)、3Hの非シフト部分の分子供給源がRNAに結合せず、preQ1である可能性が低いことを示した。この分析から、たった約25%の3H標識物質がpreQ1であると評価された。この結論との一致は、平衡透析法のために使用した3H標識preQ1サンプルの純度分析の結果である。約82%の3H標識が溶媒に由来し、混合物中に存在するUV吸収化合物は他にない。まとめると、平衡透析実験は、COG4708 RNAモチーフのコアを保有するRNA構築物がpreQ1の選択的アプタマーとして機能することも示す。
v.17−90 RNAによるpreQ1の選択的認識
S.pneumoniae由来のpreQ1−IIアプタマーの分子認識決定要因を、一連のpreQ1アナログに対する17−90 RNAの結合親和性の測定によって確立した。アミノメチル基の認識を評価するために、本発明者らは、preQ0(7−シアノ−7−デアザグアニン)、7−(N,N’−ジメチルアミノメチル)−7−デアザグアニン、および7−カルボキシアミド−7−デアザグアニンを試験した。ジメチルアミノメチルアナログおよびpreQ0の両方が約500nMのKD値を示し、アルキルアミン基の末端で生じる実質的な立体的閉塞が存在せず、この基が水素結合供与体として機能する可能性が低いことを示す(図19A)。むしろ、アミノエチル基に対する生産的相互作用は、水素結合受容体としてのアミノ基を含み得る。稀であるが、アミノ基の窒素原子(Luisiら1998)は、いくつかの他の核酸構造中で水素結合受容体としての機能を果たすことができる。
S.pneumoniae由来のpreQ1−IIアプタマーの分子認識決定要因を、一連のpreQ1アナログに対する17−90 RNAの結合親和性の測定によって確立した。アミノメチル基の認識を評価するために、本発明者らは、preQ0(7−シアノ−7−デアザグアニン)、7−(N,N’−ジメチルアミノメチル)−7−デアザグアニン、および7−カルボキシアミド−7−デアザグアニンを試験した。ジメチルアミノメチルアナログおよびpreQ0の両方が約500nMのKD値を示し、アルキルアミン基の末端で生じる実質的な立体的閉塞が存在せず、この基が水素結合供与体として機能する可能性が低いことを示す(図19A)。むしろ、アミノエチル基に対する生産的相互作用は、水素結合受容体としてのアミノ基を含み得る。稀であるが、アミノ基の窒素原子(Luisiら1998)は、いくつかの他の核酸構造中で水素結合受容体としての機能を果たすことができる。
平衡透析法の使用によって認められたように(図18B)、17−90 RNAはグアニンに対し強く識別する(KD約10μM)。グアニンアナログである7−デアザグアニンは、ほんのわずかにより良好な親和性で結合し、preQ1の選択性がほとんどないのは7位の窒素原子の非存在に由来することを示す。1mMもの高濃度での7−メチルグアニン結合の欠如は、7位の分子認識接触のいかなる破壊よりもむしろ9位での水素結合供与体の非存在に起因する可能性が高い。
試験した残りのプリン化合物から、2位のアミンがリガンド結合に重要であることあ明らかである(図19A)。2,6−ジアミノプリン(DAP)は、グアニン様ワトソン−クリック塩基対合縁部を欠くが、試験濃度でのRNAによって測定可能に結合する能力を保持する唯一の化合物である。興味深いことに、プリン環の6位にケト酸素(グアニン)またはアミン(DAP)のいずれかを保有する化合物により、ほぼ同一のKD値が得られる。しかし、6位に環外官能基を欠くことによってグアニンおよびDAPと異なる2−アミノプリンについて結合は検出されない。したがって、6位のグアニンのケト基およびDAPのアミノ基は、分子認識に等しく寄与するようである。より複雑な可能性が存在するにもかかわらず、この所見についての最も簡潔な説明は、6位のpreQ1のケト基およびDAPアミンの窒素原子の両方が水素結合受容体としての機能を果たすことである。
17−90 RNAおよびそのpreQ1リガンドによって作製された推定分子認識接触のまとめにより(図19B)、preQ1−Iアプタマーについて同定された分子認識接触と比較した相違が明らかとなる(Rothら2007)。7−ジメチルアミノメチルおよび7−カルボキシメチルアナログの相対的特異性が2つのアプタマークラスについて逆になるので、7位のアミノメチル部分の認識が実質的に異なる。さらに、preQ1−Iリボスイッチがグアニンとさらに強い相互作用を形成し、グアニンに対するpreQ1の顕著に低い特異性が得られる。preQ1−Iリボスイッチと同様に、2位のアミンは17−90 RNAのリガンド結合に重要なようである。しかし、アナログ結合データは、preQ1−IIアプタマーがプリン環のN1位と接触しないことを示す。これは、リガンドとpreQ1−Iアプタマーとの間に形成されると提案されたワトソン−クリック塩基対と異なる(Rothら2007)。これは、preQ1−IIアプタマーの異なる配列および構造エレメントが折り畳まれてpreQ1−Iアプタマーによって作製されたものと異なる結合ポケットを形成するという既存のデータから明らかである。
vi.ワトソン−クリック塩基対合でリガンド認識が説明される可能性は低い
グアニンおよびアデニンに結合するリボスイッチは、選択的リガンド結合のために標準的なワトソン−クリック塩基対を使用することが見出されている(Gilbertら2006;MandalおよびBreaker 2004b;Bateyら2004;Serganovら2004;Noeskeら2005)。プリンリボスイッチアプタマーの1つの点変異は、グアニンとアデニンとの間のアプタマー特異性を切り替えるのに十分である(MandalおよびBreaker 2004b)。同様に、2’−デオキシグアノシンに結合するリボスイッチの特異性を、類似の変異によって変化させることができる(Kimら2007)。類似の機構をpreQ1−Iリボスイッチアプタマーで使用することができ、この機構により、保存されたシチジンのウリジンへの変異によってリガンド特異性がpreQ1からDAPへ変化する(Rothら2007)。
グアニンおよびアデニンに結合するリボスイッチは、選択的リガンド結合のために標準的なワトソン−クリック塩基対を使用することが見出されている(Gilbertら2006;MandalおよびBreaker 2004b;Bateyら2004;Serganovら2004;Noeskeら2005)。プリンリボスイッチアプタマーの1つの点変異は、グアニンとアデニンとの間のアプタマー特異性を切り替えるのに十分である(MandalおよびBreaker 2004b)。同様に、2’−デオキシグアノシンに結合するリボスイッチの特異性を、類似の変異によって変化させることができる(Kimら2007)。類似の機構をpreQ1−Iリボスイッチアプタマーで使用することができ、この機構により、保存されたシチジンのウリジンへの変異によってリガンド特異性がpreQ1からDAPへ変化する(Rothら2007)。
17−90 RNAがリガンド特異性を促進するために類似の機構を使用するかどうかを評価するために、唯一の普遍的に保存された非対合シチジン(C33)(図15、図16A)をウリジンに変異した。preQ1−IIアプタマー中に存在するさらなる厳格に保存されたシチジン残基(C32およびC51)が存在するにもかかわらず、これらの残基は予想される塩基対合したエレメント内に存在し、したがって、リガンドと標準的な塩基対合を形成する可能性が低い。しかし、33位にUを保有する変異RNAが野生型RNAと非常に類似して挙動し、preQ1に対するKDが約250nMであることが認められた。したがって、この残基は、リガンドと標準的な塩基対合を形成する可能性が低い。このRNA領域がリガンド結合を調整せず(図16B、C)、P1がリガンド結合に必要ないことを考慮すると、この所見は驚くべきものではない。
ヌクレオチドC41はまた、preQ1との塩基対形成の候補として認められた。このヌクレオチドは保存されたアプタマーのコアの近位にあり、リガンド結合を調整する(図16)。40個の公知のCOG4708 RNAのたった1つの代表でC41がU残基に変異することが見出された(図15)。ある位置にこのCからUへの変化を保有する17−90 RNA構築物はpreQ1に対する親和性が2桁の規模で喪失し(図20A)、この残基が実際にリガンド結合に重要であることを示す。しかし、変異構築物は、アデニン塩基対合表面を有するアナログを好むための特異性の変化を受けない。これらの結果は、C41もリガンドと標準的な塩基対を形成し得ないことを示す。
U41変異体は野生型17−90 RNAよりも不十分にpreQ1に結合するにもかかわらず、この変異体は野生型と本質的に同一の親和性でDAPに結合する(図20B)。対照的に、グアニン結合はもはやU41変異体を使用して検出できない。これらの所見は、41位のヌクレオチドがpreQ1−IIアプタマーの分子認識モデルと一致する様式でリガンドと接触することを示す(図19B)。C41の環外アミノ基はpreQ1のケト基に水素を供与することができるが、U41中のこのアミンの代わりのケト基は等価な水素結合を形成できない(図20C)。したがって、認められるように、変異RNAは、野生型RNAより不十分にpreQ1に結合するはずである(図20A)。対照的に、C41の環外アミノ基は、DAPの6位の環外アミンの窒素原子に水素を供与して水素結合を形成することができる。同様に、U41の対応するケト基は水素結合受容体としての機能を果たすことができ、DAPの6位の同一の環外アミンと等価な水素結合を形成可能である(図20C)。この配置は、C41およびU41 RNAによるDAP結合に対してほぼ同一のKD値(図20B)が何故認められるのかを説明することができる。
2.結論
preQ1は、1つを超える天然アプタマークラスによって認識される代謝産物の第2の例である。今までにS−アデノシルメチオニン(AdoMetまたはSAM)を認識する4つの異なるアプタマークラスが同定されている。SAM−IまたはS−box(Epshteinら2003;McDanielら2003;Winklerら2003)、SAM−II(Corbinoら2006)、SAM−IIIまたはSMK−ボックス(Fuchsら2006)、およびSAM−IV(Weinbergら2007)は、しばしば、異なる生物中の同一の遺伝子を調節する(例えば、SAMシンターゼ、ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼ)。第2の天然preQ1アプタマークラスの発見は、SAMが特別なケースではなく、さらなる代謝産物を複数の異なるRNA構造によって結合して異なる生物中の類似の遺伝子組を調節することができることを示す。
preQ1は、1つを超える天然アプタマークラスによって認識される代謝産物の第2の例である。今までにS−アデノシルメチオニン(AdoMetまたはSAM)を認識する4つの異なるアプタマークラスが同定されている。SAM−IまたはS−box(Epshteinら2003;McDanielら2003;Winklerら2003)、SAM−II(Corbinoら2006)、SAM−IIIまたはSMK−ボックス(Fuchsら2006)、およびSAM−IV(Weinbergら2007)は、しばしば、異なる生物中の同一の遺伝子を調節する(例えば、SAMシンターゼ、ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼ)。第2の天然preQ1アプタマークラスの発見は、SAMが特別なケースではなく、さらなる代謝産物を複数の異なるRNA構造によって結合して異なる生物中の類似の遺伝子組を調節することができることを示す。
2つのpreQ1結合RNAのCOG4708またはDUF988に分類される膜タンパク質との関連は、このタンパク質がキューオシン生合成中間体の輸送体であることを示す。その遺伝子がTPPリボスイッチに関連する未知の機能の膜タンパク質は、その後に、TPPおよびチアミン輸送に関与することが示され(Rodionovら2002;Winklerら2002;Schynsら2005)、これは、どのようにしてRNA遺伝子調節エレメントの特徴をタンパク質機能の説明に導くことができるのかを説明している。同様に、mRNAによってコードされるタンパク質機能の知識は、関連リボスイッチのリガンド同一性の確立に役立ち得る。
興味深いことに、多数の細菌において、preQ1の生合成または輸送に関連する遺伝子に相同な多数の遺伝子が存在するにもかかわらず、これらの遺伝子は確立された調節機構を持たない。したがって、かかる遺伝子のmRNAが他のpreQ1リボスイッチクラスを保有することができると推測した。新規のpreQ1アプタマーが発見される可能性を評価するために、preQ1−IおよびpreQ1−IIアプタマーを欠き、そのゲノムが配列決定されている生物におけるいくつかのCOG4708遺伝子の上流の遺伝子間領域を観察した。
COG4708遺伝子は細菌中での分布範囲が狭く、3つの例以外の全ての例がBacilliおよびClostridia綱にある(図21)。γ−proteobacteria(Rubrobacter xylanophilus)でCOG4708の1つの例が存在し、古細菌(Thermophilum pendensおよびStaphylothermus marinus)で見出された2つの例が存在する。COG4708タンパク質に対応する遺伝子は、46例のうちの30例でpreQ1アプタマーと関連する(図21)。いくつかの生物は、2コピーの遺伝子を含み、リボスイッチは、典型的にはこれらのコピーのうちのたった1つに関連するが、Alkaliphilus metalliredigensでは、この遺伝子の両方のコピーよりpreQ1−Iリボスイッチが先行する。COG4708の遺伝子が公知のpreQ1感知RNAに関連しない多数の生物では、ORFのすぐ上流の遺伝子間領域は、50塩基対を超える。これは、RNAアプタマーがmRNAの5’UTR中に存在するのに十分な空間である。しかし、かかる領域は、典型的には、任意の他の配列に対する検出可能な相同性をほとんど示さないか全く示さない。これは、かかる領域が構造化RNAを欠くか、かかる領域が多数の他の細菌でホモログを有するアプタマーを保有しないことを示す。
インライン探索アッセイを使用して、Moorella thermoacetica、Clostridium difficile、Oenococcus oeni、Geobacillus kaustophilusにおけるCOG4708タンパク質をコードするORFの上流およびStreptococcus thermophilusにおける両COG4708コピーの上流の遺伝子間領域を試験した。試験したRNAはどれもpreQ1の存在下で構造調整を示さず、これらのRNAがpreQ1結合リボスイッチを含まないことを示す。しかし、外来性5’または3’配列由来の干渉に起因するRNA誤折り畳みを含むいくつかの異なる因子ならびに生体内条件と試験管内条件との間の相違がインライン探索アッセイを複雑にし得る。
ほとんどの他の同定されたリボスイッチと対照的に、preQ1−IIアプタマーは非常に分布が狭く、主にStreptococcaceae科由来の細菌に存在する。SAM−IIIも同一の細菌群に制限されるようであるので(Fuchsら2006)、この狭い分布には前例がある。
3.材料と方法
i.化学物質およびDNAオリゴヌクレオチド
preQ1、preQ0、7−(N,N’−ジメチルアミノメチル)−7−デアザグアニン、7−カルボキシアミド−7−デアザグアニン、および7−アミノメチル−7−デアザアデニンの化学合成は以前に記載した(Rothら2007)。残りのプリン化合物および他の化学物質を、他で記載しない限り、Sigma−Aldrichから購入した。3H−preQ1を、以前に記載のように得た(Hurtら2007)。合成DNAは、Sigma−Genosysによって調製された。
i.化学物質およびDNAオリゴヌクレオチド
preQ1、preQ0、7−(N,N’−ジメチルアミノメチル)−7−デアザグアニン、7−カルボキシアミド−7−デアザグアニン、および7−アミノメチル−7−デアザアデニンの化学合成は以前に記載した(Rothら2007)。残りのプリン化合物および他の化学物質を、他で記載しない限り、Sigma−Aldrichから購入した。3H−preQ1を、以前に記載のように得た(Hurtら2007)。合成DNAは、Sigma−Genosysによって調製された。
ii.RNAの調製
preQ1−II(Cog4708 RNA)モチーフに対応するCOG4708をコードする遺伝子の5’UTRの一部を、以下のプライマーを使用してStreptococcus pneumoniae R6からPCR増幅した:5’−GGAATTCAACAAGTCTAACAGAAAAGTAG AAAGGCGGGC−3’(配列番号1)、5’−TTTTGTCATTTTTTCTCCTTTAACGT CTGGATAACTCTCAAAAGC−3’(配列番号2)。次いで、得られた二本鎖DNAを、TOPO TAクローニングキット(Invitrogen)を使用してpCR2.1にクローン化した。プラスミドインサートを配列決定し(イェール大学 The W.M.Keck Foundation Biotechnology Resource Center)、T7プロモーター配列が前に存在し、且つ転写効率を改善するための2つのグアノシン残基を含む所望のRNAをコードするDNAフラグメントのPCR増幅用テンプレートとして使用した。破壊変異および代償的変異を、PCRの変異プライマーを使用してPCR産物に導入した。PCR産物をT7 RNAポリメラーゼを使用して試験管内で転写し、得られたRNAを、他の場所に記載の方法に類似の方法を使用した変性6%PAGEによって精製した(Seetharamanら2001)。
preQ1−II(Cog4708 RNA)モチーフに対応するCOG4708をコードする遺伝子の5’UTRの一部を、以下のプライマーを使用してStreptococcus pneumoniae R6からPCR増幅した:5’−GGAATTCAACAAGTCTAACAGAAAAGTAG AAAGGCGGGC−3’(配列番号1)、5’−TTTTGTCATTTTTTCTCCTTTAACGT CTGGATAACTCTCAAAAGC−3’(配列番号2)。次いで、得られた二本鎖DNAを、TOPO TAクローニングキット(Invitrogen)を使用してpCR2.1にクローン化した。プラスミドインサートを配列決定し(イェール大学 The W.M.Keck Foundation Biotechnology Resource Center)、T7プロモーター配列が前に存在し、且つ転写効率を改善するための2つのグアノシン残基を含む所望のRNAをコードするDNAフラグメントのPCR増幅用テンプレートとして使用した。破壊変異および代償的変異を、PCRの変異プライマーを使用してPCR産物に導入した。PCR産物をT7 RNAポリメラーゼを使用して試験管内で転写し、得られたRNAを、他の場所に記載の方法に類似の方法を使用した変性6%PAGEによって精製した(Seetharamanら2001)。
S.thermophilus由来の記載の構築物に対応するDNAフラグメントを、PCR(DillonおよびRosen 1990)によってゲノム配列に基づいた合成オリゴヌクレオチド組から構築した。M.thermoacetica、O.oeni(PSU−1)、C.difficile、およびG.kaustophilus由来のCOG4708タンパク質をコードする遺伝子の上流の遺伝子間領域に対応するDNAフラグメントを、各ゲノムDNAおよび適切な位置にT7プロモーター配列を含むプライマーを使用したPCRによって増幅した。O.oeniおよびC.difficileのゲノムDNAサンプルを、ATCCから入手した。RNA分子を、上記の試験管内転写によって調製した。
iii.インライン探索アッセイ
試験管内転写によって調製したRNA分子を、製造者の説明書にしたがって、アルカリホスファターゼ(Roche Diagnostics)を使用して脱リン酸化し、[γ−32P]ATP(GE Biosciences)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)で放射性同位元素標識した。5’32P標識RNAを、上記のようにPAGEによって精製した。約1nMの5’32P標識したRNAを含むインライン探索反応を、上記のようにリガンドを使用するか使用しないでアセンブリした(SoukupおよびBreaker、1999)。50mM Tris−HCl(pH8.3、23℃)、20mM MgCl2、および100mM KClを含む反応混合物を、25℃で約40時間インキュベートした。M.thermoaceticaおよびG.kaustophilus起源のRNAについて、58℃で30分間および60℃で15分間でもそれぞれインキュベートした。サンプルを変性10%PAGEで分離し、Molecular Dynamics PhosphorImagerおよびImageQuaNTソフトウェアを使用して、画像化および定量を行った。
試験管内転写によって調製したRNA分子を、製造者の説明書にしたがって、アルカリホスファターゼ(Roche Diagnostics)を使用して脱リン酸化し、[γ−32P]ATP(GE Biosciences)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)で放射性同位元素標識した。5’32P標識RNAを、上記のようにPAGEによって精製した。約1nMの5’32P標識したRNAを含むインライン探索反応を、上記のようにリガンドを使用するか使用しないでアセンブリした(SoukupおよびBreaker、1999)。50mM Tris−HCl(pH8.3、23℃)、20mM MgCl2、および100mM KClを含む反応混合物を、25℃で約40時間インキュベートした。M.thermoaceticaおよびG.kaustophilus起源のRNAについて、58℃で30分間および60℃で15分間でもそれぞれインキュベートした。サンプルを変性10%PAGEで分離し、Molecular Dynamics PhosphorImagerおよびImageQuaNTソフトウェアを使用して、画像化および定量を行った。
一連のリガンド濃度を使用してインライン探索アッセイを行うことによってKD値を決定した。各分析について示した部位での正規化したRNAの切断の割合を各リガンド濃度で計算し、それらのポイントに標準結合曲線をフィッティングした。最も高い試験濃度がそれぞれ100μM、100μM、10μM、および30μMであるpreQ1、グアニン、7−カルボキシアミド−7−デアザグアニン、7−アミノメチル−7−デアザアデニンを除き、ほとんどの試験化合物の濃度は1nMと1mMとの間で様々であった。
iv.平衡透析法
50mM Tris−HCl(pH8.3、23℃)、20mM MgCl2、100mM KCl、および1μMの3H標識preQ1を含む30μl混合物を、DispoEquilibrium Dialyzer(ED−1、Harvard Bioscience)の一方のチャンバーに配置し、3H標識preQ1を差し引いた同一成分を含む同体積を反対側に添加した。言及する場合、後者の溶液は5μM 17−90 RNAまたは5μM 1−81 RNAのいずれかも含んでいた。14時間の平衡化後、5μlアリコートを装置の各サイドから取り出して液体シンチレーションカウンティングによって2つのチャンバー中の3H標識の分布を決定した。競合的結合試験のために、1mM非標識化合物を含む3μLの上記の緩衝液混合物をRNAを欠くチャンバーに添加し、同体積の緩衝液をRNA含有チャンバーに添加した。チャンバーをさらに8時間平衡化後、3H−標識の分布を上記のように再評価した。
50mM Tris−HCl(pH8.3、23℃)、20mM MgCl2、100mM KCl、および1μMの3H標識preQ1を含む30μl混合物を、DispoEquilibrium Dialyzer(ED−1、Harvard Bioscience)の一方のチャンバーに配置し、3H標識preQ1を差し引いた同一成分を含む同体積を反対側に添加した。言及する場合、後者の溶液は5μM 17−90 RNAまたは5μM 1−81 RNAのいずれかも含んでいた。14時間の平衡化後、5μlアリコートを装置の各サイドから取り出して液体シンチレーションカウンティングによって2つのチャンバー中の3H標識の分布を決定した。競合的結合試験のために、1mM非標識化合物を含む3μLの上記の緩衝液混合物をRNAを欠くチャンバーに添加し、同体積の緩衝液をRNA含有チャンバーに添加した。チャンバーをさらに8時間平衡化後、3H−標識の分布を上記のように再評価した。
3H標識preQ1のHPLCは、preQ1と一致する1つのUV活性ピークを示した。3H−標識がpreQ1に組み込まれなかったものに由来するかどうかを評価するために、40μLアリコートの3H−preQ1溶液(約2mM)を8mgの脱色炭および200μL水と混合した。次いで、スラリーを、遠心分離によって分離し、上清を取り出し、濾過した(0.22ミクロン)。上清のHPLC分析により、水性部分にpreQ1が存在しないことが明らかとなり、炭素がその複素環を完全に吸収したことを示した。上清部分に存在するトリチウムおよび炭素残渣を、液体シンチレーションカウンティングによって測定した。
v.バイオインフォマティクス
RefSeq25に対して相同性検索を行い(Pruittら2007)、COG4708 RNAモチーフコンセンサス配列を以前に記載のように決定した(Weinbergら2007)。COG4708(DUF988)遺伝子の例を、PFAMデータベース(リリース22.0)(Finnら2006)によって同定した。いくつかの生物由来のCOG4708タンパク質配列のNCBIゲノムデータベースに対するBLAST検索では、いかなるさらなる配列も得られなかった。例を、完全に配列決定されたゲノムに制限し、preQ1−IまたはpreQ1−IIリボスイッチがCOG4708タンパク質をコードするORFの上流の遺伝子間領域に存在するかどうか決定した。同種の高度に類似の株または分離株をリストから除去して重複性を減少させた。
RefSeq25に対して相同性検索を行い(Pruittら2007)、COG4708 RNAモチーフコンセンサス配列を以前に記載のように決定した(Weinbergら2007)。COG4708(DUF988)遺伝子の例を、PFAMデータベース(リリース22.0)(Finnら2006)によって同定した。いくつかの生物由来のCOG4708タンパク質配列のNCBIゲノムデータベースに対するBLAST検索では、いかなるさらなる配列も得られなかった。例を、完全に配列決定されたゲノムに制限し、preQ1−IまたはpreQ1−IIリボスイッチがCOG4708タンパク質をコードするORFの上流の遺伝子間領域に存在するかどうか決定した。同種の高度に類似の株または分離株をリストから除去して重複性を減少させた。
(実施例5)
E.実施例5:モリブデン補因子およびタングステン補因子代謝に関与する細菌遺伝子を調節する広範に存在するリボスイッチ候補
モリブデン酸塩輸送体、モリブデン補因子(Moco)生合成酵素、および補酵素としてMocoを使用するタンパク質をコードする遺伝子の上流に存在する高度に保存されたRNAモチーフを同定した。バイオインフォマティクス検索により、γ−proteobacteria、δ−proteobacteria、Clostridia、Actinobacteria、Deinococcus−Thermus種、および環境サンプル由来のDNAにおける176の代表を同定した。遺伝子アッセイを使用して、Moco生合成オペロンに関連するEscherichia coli中のMoco RNAがMoco産生に応答して遺伝子発現を調節することが証明された。さらに、この保存されたRNAがMocoの密接に関連するアナログを識別することを示す証拠を得た。これらの結果は、広範な系統発生的保存およびいくつかの例に近い典型的な遺伝子調節構造と併せて、この構造化RNAの代表がMocoを感知する新規のリボスイッチクラスに該当することを示す。さらに、関連するタングステン補因子(Tuco)によって誘発される可能性が高いこのRNAのバリアントが同定された。このバリアントは、金属成分としてモリブデンのかわりにタングステンを保有する。
E.実施例5:モリブデン補因子およびタングステン補因子代謝に関与する細菌遺伝子を調節する広範に存在するリボスイッチ候補
モリブデン酸塩輸送体、モリブデン補因子(Moco)生合成酵素、および補酵素としてMocoを使用するタンパク質をコードする遺伝子の上流に存在する高度に保存されたRNAモチーフを同定した。バイオインフォマティクス検索により、γ−proteobacteria、δ−proteobacteria、Clostridia、Actinobacteria、Deinococcus−Thermus種、および環境サンプル由来のDNAにおける176の代表を同定した。遺伝子アッセイを使用して、Moco生合成オペロンに関連するEscherichia coli中のMoco RNAがMoco産生に応答して遺伝子発現を調節することが証明された。さらに、この保存されたRNAがMocoの密接に関連するアナログを識別することを示す証拠を得た。これらの結果は、広範な系統発生的保存およびいくつかの例に近い典型的な遺伝子調節構造と併せて、この構造化RNAの代表がMocoを感知する新規のリボスイッチクラスに該当することを示す。さらに、関連するタングステン補因子(Tuco)によって誘発される可能性が高いこのRNAのバリアントが同定された。このバリアントは、金属成分としてモリブデンのかわりにタングステンを保有する。
リボスイッチは、代謝産物または金属イオンに選択的に結合し、遺伝子調節エレメントとして機能する構造化RNAドメインである(MandalおよびBreaker、2004;SoukupおよびSoukup、2004;WinklerおよびBreaker、2005;Winkler、2005)。リボスイッチは、一般に、真正細菌mRNAの非翻訳領域中に見出され、通常、転写伸長または翻訳開始の調節によって遺伝子発現を調節する(BreakerおよびBarrick,2007)。まれに例外はあるが(Winklerら、2004;Barickら、2004)、リボスイッチは2つのモジュラー領域(アプタマードメインおよび発現プラットフォーム)から構成される。アプタマーは標的代謝産物のための選択的結合ポケットを形成し、この結合事象は隣接発現プラットフォームの折り畳みをアロステリックに調節して、遺伝子発現を調節する。各リボスイッチクラスの代謝産物結合ポケットは、遠縁の生物から同定された代表の間でさえも配列および構造中で高度に保存される(BreakerおよびBarrick、2007)。
リボスイッチにより、バイオインフォマティクス検索を使用した発見のための優れた標的が作製される。例えば、CMfinder比較ゲノミクスパイプライン(Yaoら、2007;Weinbergら、2007)は、新規の機能RNAエレメントを同定するために使用した1つのバイオインフォマティクスアプローチを示す。これは、相同遺伝子の推定5’非翻訳領域(5’UTR)を同定し、次いで、種々の生物由来のUTRの間の配列および二次構造の保存の証拠についてこれらの領域を試験する。配列および構造の保存パターンを使用して、最初に予想したモチーフの洗練のためにさらなるホモログを同定する。CMfinderパイプラインにより、最近検証されたか(Wangら、2008)、検証を待っている多数の有望なリボスイッチ候補を同定した。報告された1つの新規のモチーフは、モリブデン補因子(Moco)代謝に関与するタンパク質をコードする読み取り枠(ORF)の上流で一般に見出される大きく且つ複雑なRNAドメインである(Weinbergら、2007)。
Mocoは、モリブデン原子(Mo)が配位している三環式ピラノプテリン(Schwartz、2005;Baughら、1998)である。モリブデンは、元素周期表でクロムおよびタングステンと同列にある遷移金属である。生合成後、Mocoを、Mo依存性酵素の活性部位に挿入する。この酵素は炭素、窒素、および硫黄代謝回路における重要な反応を触媒するためにMoの酸化還元活性を利用する(Baughら、1998)。このモチーフの176例を、広範な種々の真正細菌(γ−Proteobacteria、δ−Proteobacteria、Clostridia、Actinobacteria、およびDeinococcus−Thermusが含まれる)および環境配列において同定した(Weinbergら、2007)。このモチーフは、代謝産物感知リボスイッチに典型的な特徴(広範な配列保存、予想される塩基対合エレメント内のヌクレオチド共変動の証拠、および保存された非対合ヌクレオチドと混合した塩基対合エレメントの精巧なアセンブリが含まれる)を示す。
E.coli由来の代表的なMoco RNAがMocoを選択的に感知し、この補酵素レベルの変化に応答して隣接遺伝子の発現を調節するという証拠を本明細書中に提供する。さらに、Moco RNAがMocoと密接に関連するアナログであるTucoとの間の識別の調節に関与することを示し、したがって、MocoがMoco RNAによって形成されたアプタマーによって特異的に認識されるという、さらなる証拠が得られる。これらの実験による所見は、一定のRNAバリアントと補酵素代謝の特徴との間の相関と併せて、この構造化RNAクラスが異なるMocoおよびTucoを感知するリボスイッチを含むことを示す。
1.結果と考察
i.Mocoモチーフは、広範に存在し、高度に保存されている
比較ゲノミクスパイプライン(Yaoら、2007)を使用してγ−proteobacteriaにおけるモリブデン補因子生合成プロテインAをコードする遺伝子のUTRを試験した場合、共変動および構造化RNAが示唆される他の特徴(Weinbergら、2007)を示すモチーフを同定した。これらの検索により、γ−Proteobacteria、δ−Proteobacteria、Clostridia、Actinobacteria、Deinococcus−Thermus種、および環境DNA配列中のこのモチーフ(「Moco RNA」と呼ぶ)の176個の例を同定した。これらの配列を、推定コンセンサス構造によってガイドされたRALEE(Griffiths−Jones、2005)を使用した手作業のアラインメントによって比較した。このアラインメントにより、モチーフの中心の多ステムジャンクション付近の配列保存が最も高く(図22)、ほとんどのヌクレオチドが75〜100%の配列保存を示すことが明らかとなる。
i.Mocoモチーフは、広範に存在し、高度に保存されている
比較ゲノミクスパイプライン(Yaoら、2007)を使用してγ−proteobacteriaにおけるモリブデン補因子生合成プロテインAをコードする遺伝子のUTRを試験した場合、共変動および構造化RNAが示唆される他の特徴(Weinbergら、2007)を示すモチーフを同定した。これらの検索により、γ−Proteobacteria、δ−Proteobacteria、Clostridia、Actinobacteria、Deinococcus−Thermus種、および環境DNA配列中のこのモチーフ(「Moco RNA」と呼ぶ)の176個の例を同定した。これらの配列を、推定コンセンサス構造によってガイドされたRALEE(Griffiths−Jones、2005)を使用した手作業のアラインメントによって比較した。このアラインメントにより、モチーフの中心の多ステムジャンクション付近の配列保存が最も高く(図22)、ほとんどのヌクレオチドが75〜100%の配列保存を示すことが明らかとなる。
5つもの塩基対合エレメント(P1〜P5と記す)がMoco RNAの二次構造の構造を形成する。このうち、保存された二次構造は、それぞれ、P4の遠位末端およびP2バルジの中央に見出されるGNRAテトラループ(HeusおよびPardi、1991)およびテトラループ受容体(CostaおよびMichel、1995)である。5つのMoco RNA以外の全てにおけるテトラループ配列はGAAAである。しかし、GCAAテトラループを保有する4つ全てのMoco RNAは受容体を欠く一方で、GAAAテトラループを有するたった2つのMoco RNAが受容体を欠く。類似の相関は、GEMMモチーフと呼ばれる別の新規に見出されたRNAモチーフの代表について以前に認められている(Weinbergら、2007)。
Mocoモチーフの代表を、P3ステムの有無に基づいて2つの群に分類することができる。全ての公知の代表のアラインメントにより、高度に保存された見かけ上のアプタマー領域およびその後に続く公知の代謝産物感知リボスイッチに典型的な異なる発現プラットフォーム型を形成すると見られる配列が明らかになる。例えば、moaABCDEオペロン上流のE.coli Moco RNAの可能な発現プラットフォーム(図23a)は、P1ステムを形成するヌクレオチド内の下流読み取り枠(ORF)のリボゾーム結合部位を含むようである。このアラインメントは、アプタマードメインによるリガンド結合が遺伝子発現を抑制することを示すことができる。細菌の内因性転写ターミネーターの予想される配列および構造に適合するステム−ループ構造の上流に推定アプタマードメインが見出される例も存在する(GusarovおよびNudler、1999;YarnellおよびRoberts、1999)。さらに、いくつかの生物は、1つを超えるMoco RNA代表を保有し、同一生物中に両方の発現プラットフォーム型が出現する。
ほとんどの生物がゲノムあたり1つのMoco RNA代表を保有するが、そのゲノムが完全に配列決定された、いくつかの生物においては4つまたは5つものモチーフの例を有する。最多数のMoco RNAの代表を、Desulfitobacterium hafniense(8個有する)およびSyntrophomonas wolfei(少なくとも15バージョン有する)が保有する。興味深いことに、Moco RNAモチーフのタンデム配置はS.wolfeiおよびGeobacter metallireducens中に存在する。稀であるが、他の代謝産物感知リボスイッチクラスを有するタンデム配置のリボスイッチまたはそのサブドメインが同定されている(MandalおよびBreaker、2004;Famulok、2004;Sudarsanら、2006;StoddardおよびBatey、2006)。これらのより複雑な構造がリボスイッチによって使用されて、複数のシグナル伝達インプットに応答する能力(Sudarsanら、2006)などの精巧な機能を達成するか、より小さなリガンド濃度の変化により応答する(MandalおよびBreaker、2004;WelzおよびBreaker、2007)。S.wolfei中の1つのオペロンは、連続した3つのMoco RNAを保有する。
ii.Mocoモチーフは、Moco生合成遺伝子に関連する
最も知られているリボスイッチは、シスで機能してそれらの同族リガンドの結合に応答して近位遺伝子の発現を調節する。リボスイッチアプタマーによって感知されるリガンドは、典型的には、酵素によって触媒される経路の最終産物または調節下でmRNAによってコードされる酵素である。あるいは、その発現がリボスイッチによって調節される遺伝子産物の補因子または基質として小分子リガンドが時折必要である。リボスイッチが通常シス調節機構を使用するので、リボスイッチの下流に存在する遺伝子によってコードされるタンパク質の機能により、リガンドの同一性に関する大量の情報を得ることができる。
最も知られているリボスイッチは、シスで機能してそれらの同族リガンドの結合に応答して近位遺伝子の発現を調節する。リボスイッチアプタマーによって感知されるリガンドは、典型的には、酵素によって触媒される経路の最終産物または調節下でmRNAによってコードされる酵素である。あるいは、その発現がリボスイッチによって調節される遺伝子産物の補因子または基質として小分子リガンドが時折必要である。リボスイッチが通常シス調節機構を使用するので、リボスイッチの下流に存在する遺伝子によってコードされるタンパク質の機能により、リガンドの同一性に関する大量の情報を得ることができる。
Moco RNAの機能を確立する目的で、この保存されたRNAの代表を保有する隣接ゲノム位置中の遺伝子の機能を考慮した。γ−Proteobacteria(E.coliが含まれる)では、モチーフはmoaABCDEオペロンの上流に見出され(図23a)、このオペロンはモリブドプテリン(MPT)生合成を担うタンパク質をコードする(Schwarz、2005)。いくつかの細菌では、代表はmodABCの上流にも存在し、このmodABCは高親和性モリブデン酸塩輸送体複合体をコードする(GrundenおよびShanmugam、1997)。Mocoモチーフがモリブドプテリン生合成オペロンおよびモリブドプテリンオキシドレダクターゼをコードすると予想される遺伝子の両方の上流に存在する3つのγ−Proteobacteria種(Haemophilus somnus、Haemophilus ducreyi、およびActinobacillus pleuropneumoniae血清型亜型1)も存在する。Mocoモチーフは、Moco生合成酵素、高親和性モリブデン酸塩輸送体、および反応を触媒するためにMocoを使用する酵素の遺伝子の異なる配置の上流にも見出される。一般に、これらのゲノムコンテクストは、このリボスイッチ候補の潜在的リガンドとしてMocoまたはその補因子の生合成中間体を示す。いくつかの公知のリボスイッチクラスは他の共通の補酵素を感知してそれに応答し、したがって、Mocoはこのリボスイッチ候補の最も可能性の高いリガンドと見なされた。
モリブデン補因子生合成は、真正細菌からヒトまで保存されている複雑且つ古い経路である。モリブデンまたはMocoを必要としない唯一の生物は、その代わりにタングステンおよび類似の補酵素Tucoを使用する(Schwarz、2005)。E.coliでは、全部で15のタンパク質をコードするMoco代謝に関与する以下の5つの公知のオペロンが存在する:moa、mob、mod、moe、およびmog(Shanmugamら、1999)。Moco生合成の最初の2つのステップは、moaオペロンによってコードされる遺伝子によって触媒される(図23b)。具体的には、S−アデノシルメチオニン依存性酵素、MoaAおよび特徴づけられていないホモ六量体MoaCによって触媒される反応においてグアノシン−5’−三リン酸(GTP)がサイクリックピラノプテリン一リン酸(cPMP)に変換される(WuebbensおよびRajagopalan、1995)。1時間未満の半減期を有するので、cPMPは最も安定なMoco生合成中間体である(Santamaria−Araugoら、2004)。次いで、MoaDおよびMoaEによって形成されたヘテロ四量体MPTシンターゼ複合体は、2つの硫黄原子のcPMPへの転移を触媒し、それにより、MPTジチオラートが得られる(Pitterleら、1993)。
次いで、Mocoは、MPTのアデニル化およびモリブデン補因子を形成するためのMoの挿入を含む独立した一連のステップを介してmogAおよびmoeAの生成物によってMPTから合成される(NicholsおよびRajagopalan、2002)。E.coliでは、Mocoを、MobAによってビス−モリブドプテリングアニンジヌクレオチド補因子(ビス−MGD)にさらに改変する(Lakeら、2000)。次いで、このビス−MGDを、モリブデン含有酵素に挿入する。他の真正細菌では、Mocoを、補酵素としても使用する他の誘導体が得られるように改変することができる(Schwarz、2005)。上述の全てのMoco生合成遺伝子およびMocoまたはその誘導体を補酵素として使用する酵素をコードするいくつかの遺伝子は、少なくともいくつかの細菌においてMocoRNAモチーフに関連する(図23b)。
iii.Moco RNAの構造特徴の生化学分析
Mocoおよびその生合成中間体の化学的不安定性を考慮すると、試験管内での直接結合相互作用についてこれらの化合物を試験することは実用的でなかった。したがって、E.coli由来のMoco RNAがリボスイッチ機能と一致する特徴を有するかどうかを決定するための一連の生化学実験および遺伝子実験を行った。このMoco RNA代表についての提案された構造モデルを評価するための、塩基対合P1エレメントの始まりの5’の9ヌクレオチド上流からP1の3’末端を超える10ヌクレオチドまでにわたるMocoモチーフを含む138−ヌクレオチドRNA構築物(138moaAと呼ぶ、図24a)。138 moaAは、P3ステム(いくつかの代表では存在しない)、予想されるリボゾーム結合部位、およびmoaA ORFのAUG翻訳開始コドンを含む。RNAはまた、5’末端に試験管内転写による産生を容易にするための2つのさらなるG残基を保有する。微量の5’32P標識138moaA RNAを、インライン探索分析(SoukupおよびBreaker、1999)に供した。この分析は、RNA構造中の相違によって引き起こされる種々のヌクレオチド間結合の自発的切断の頻度の相違を活用して硬直した構造および柔軟な構造の領域を同定する。
Mocoおよびその生合成中間体の化学的不安定性を考慮すると、試験管内での直接結合相互作用についてこれらの化合物を試験することは実用的でなかった。したがって、E.coli由来のMoco RNAがリボスイッチ機能と一致する特徴を有するかどうかを決定するための一連の生化学実験および遺伝子実験を行った。このMoco RNA代表についての提案された構造モデルを評価するための、塩基対合P1エレメントの始まりの5’の9ヌクレオチド上流からP1の3’末端を超える10ヌクレオチドまでにわたるMocoモチーフを含む138−ヌクレオチドRNA構築物(138moaAと呼ぶ、図24a)。138 moaAは、P3ステム(いくつかの代表では存在しない)、予想されるリボゾーム結合部位、およびmoaA ORFのAUG翻訳開始コドンを含む。RNAはまた、5’末端に試験管内転写による産生を容易にするための2つのさらなるG残基を保有する。微量の5’32P標識138moaA RNAを、インライン探索分析(SoukupおよびBreaker、1999)に供した。この分析は、RNA構造中の相違によって引き起こされる種々のヌクレオチド間結合の自発的切断の頻度の相違を活用して硬直した構造および柔軟な構造の領域を同定する。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分離した場合、インライン探索の間に生成されたRNA切断産物の得られたパターン(図24b)は、比較配列分析を基に推定した主な二次構造の特徴のほとんどと一致した(図22)。具体的には、高レベルの自発的ホスホエステル転移を示すほとんどの部位がステムP3およびP5のループに局在し、予想される塩基対合ステム間を架橋するジャンクション中にクラスターを形成する。しかし、自発的切断パターンは、大部分のP2ステムのために提案された二次構造と一致しない。このステムは構造的柔軟性を潜在的に示すことができる2つの内部バルジを有することができるにもかかわらず、認められたいくつかのRNAフラグメントは、塩基対合することができるヌクレオチドでの切断の結果である。
インライン探索の結果により、いくつかの高度に保存されたヌクレオチドを保有するP2ステムおよびジャンクションの高次構造が変化して、リガンド結合ポケットを形成することができると示唆される。これは、他の公知のリボスイッチアプタマーの挙動と一致し、このアプタマーのうちのいくつかは、インライン探索アッセイによって、標的代謝産物の添加の際に構造の実質的な変化を受けることが認められる(Nahviら、2002;Winklerら、2002;Mandalら、2003)。
iv.Moco RNAは遺伝子調節エレメントとして機能する
E.coliでは、moaオペロンの転写を調節することが公知の2つのプロモーター部位および付随するタンパク質因子結合部位が存在する(図23a)。S2プロモーター部位は、嫌気性タンパク質転写因子Fnrに依存する(Andersonら、2000;SpiroおよびGuest、1990)。嫌気性条件に応答するオペロンのこの転写上方制御によってMoco(嫌気性呼吸に関与する一定のタンパク質が補酵素として必要とする)の生合成の増加が可能となる。moaオペロンのS1プロモーター部位をモリブデン酸塩結合ModE(Andersonら、2000)によって活性化し、このモリブデン酸塩結合ModEは、細胞中のモリブデン酸塩に結合してmodABCDオペロンの転写を上方制御する転写因子である(Grudenら、1999)。これにより、細胞中で利用可能なMocoを合成するのに十分なモリブデン酸塩が確実に存在する。さらに、CueRの予想される結合部位がMocoエレメントの下流に存在するにもかかわらず、銅応答因子CueRによってmoaオペロン中のいくつかの遺伝子を調節する証拠が存在する(YamamotoおよびIshihama、2005)。
E.coliでは、moaオペロンの転写を調節することが公知の2つのプロモーター部位および付随するタンパク質因子結合部位が存在する(図23a)。S2プロモーター部位は、嫌気性タンパク質転写因子Fnrに依存する(Andersonら、2000;SpiroおよびGuest、1990)。嫌気性条件に応答するオペロンのこの転写上方制御によってMoco(嫌気性呼吸に関与する一定のタンパク質が補酵素として必要とする)の生合成の増加が可能となる。moaオペロンのS1プロモーター部位をモリブデン酸塩結合ModE(Andersonら、2000)によって活性化し、このモリブデン酸塩結合ModEは、細胞中のモリブデン酸塩に結合してmodABCDオペロンの転写を上方制御する転写因子である(Grudenら、1999)。これにより、細胞中で利用可能なMocoを合成するのに十分なモリブデン酸塩が確実に存在する。さらに、CueRの予想される結合部位がMocoエレメントの下流に存在するにもかかわらず、銅応答因子CueRによってmoaオペロン中のいくつかの遺伝子を調節する証拠が存在する(YamamotoおよびIshihama、2005)。
この多層転写調節ネットワークに加えて、S1プロモーターとmoaA開始コドンとの間の131−ntストレッチが第3の調節系に寄与することが知られていた(Andersonら、2000)。具体的には、この領域の存在により、Mocoが細胞中に存在する場合にmoaオペロンの抑制が可能となる(Andersonら、2000;BakerおよびBoxer、1991)。E.coliにおけるmoaオペロン発現に及ぼすFnrおよびModE転写因子の影響は、5’非翻訳領域(UTR)のこの部分が欠失される場合にのみ認め得る。興味深いことに、この131−nt領域は、Moco RNAモチーフを正確に含む。さらに、DNAのこの部分または対応するRNA転写物に対して作用するタンパク質調節因子は同定されておらず、このmRNA部分がMocoの直接的センサーとしての機能を果たすことができるという可能性については未解決のままである。
Moco RNAの構造上の特徴は、E.coli moaオペロンの公知の遺伝子調節の特徴を加味して、Moco RNA代表が代謝産物感知リボスイッチであることを示す。Moco RNAが遺伝子調節エレメントとして機能することを確認するために、PCRを使用して、野生型moaA 5’UTRに対応するE.coliゲノムの一部を増幅した。このゲノムセグメントは、P1の5’の始まりの9nt上流から始まり、P1の3’末端を超えてmoaAコード領域に21nt伸長する149−ヌクレオチドRNA(149 moaAと呼ぶ)をコードする。また、P3ステム中の塩基対合を破壊し(M1)、その後に修復する(M2)変異を有する149 moaA RNAを発現する2つのバリアントDNAを生成する(図25a)。
これらの配列を、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の上流且つインフレームで翻訳融合プラスミドにクローン化した。融合物を、本質的に活性なlacUV5プロモーターの調節下において、moaAオペロンの発現を自然に制限する上流の嫌気性且つモリブデン酸塩依存性のプロモーター調節の影響を排除した。この一連のプラスミドを、moaA遺伝子が欠失したE.coli株中に配置した。得られた形質転換体を、アラビノース誘導性且つグルコース抑制性プロモーターの調節下にてmoaABCDEオペロンを含むプラスミドで形質転換した(Guzmanら、1995)。これらの二重形質転換株は、Moco濃度が高いか低い場合のレポーター遺伝子発現に関する149 moaA RNAの役割を決定することができた。
野生型149 moaA構築物(WT)を保有する細胞は、アラビノースの存在下で増殖させた場合に低いβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現を示した(高濃度のMocoが予想される)(図25b)。対照的に、WT構築物を有する細胞は、グルコースの存在下で増殖させた場合にレポーター遺伝子発現が3倍を超える増加を示す(低濃度のMocoが予想される)。この結果は、Moco RNAエレメントが遺伝子発現を抑制し、これは、Moco生合成経路における小分子産物に対する応答による可能性がもっとも高いことを示す。遺伝子「オフ」スイッチとしてのこのMoco RNAの機能は、バイオインフォマティクスによって予想される機構と一致する。
P3ステム中の変異(M1)の導入によるMoco RNAの保存された二次構造の破壊により、遺伝子発現の抑制解除がもたらされる。対照的に、塩基対合を修復するさらなる変異(M2)を使用したP3配列の変化はまた、Moco生合成のアラビノース誘導の際の遺伝子抑制が修復される。これらのバリアントによって示された遺伝子調節の破壊および野生型レポーター遺伝子発現レベルへの回帰は、Moco RNAが活性にその保存された二次構造が必要な遺伝子調節エレメントであることを示す。
v.モリブデン輸送はMoco RNA遺伝子調節機能に影響を及ぼす
モリブデン酸塩を、modオペロンによってコードされる高親和性タンパク質依存性ABC輸送体を介してE.coli細胞に輸送する(GrundenおよびShanmugam、1997;Maupin−Furlowら、1995)。モリブデン酸塩を補足しない培地では、野生型E.coliの細胞内モリブデン酸塩濃度は1.0μMであるのに対して、モリブデン酸塩輸送体欠損株における細胞内モリブデン酸塩濃度は0.2μMと評価される(ScottおよびAmy、1989)。しかし、このモリブデン酸塩欠損およびこれに起因する有害反応を、増殖培地へのモリブデン酸ナトリウムの添加によって克服することができる。高細胞外モリブデン酸ナトリウム濃度下で、硫酸塩輸送系は、モリブデン酸塩を移入することができ、それにより、野生型およびモリブデン酸塩輸送体欠損株の細胞内モリブデン酸塩濃度を約5μMにすることができる(ScottおよびAmy、1989;Rosentelら、1995)。
モリブデン酸塩を、modオペロンによってコードされる高親和性タンパク質依存性ABC輸送体を介してE.coli細胞に輸送する(GrundenおよびShanmugam、1997;Maupin−Furlowら、1995)。モリブデン酸塩を補足しない培地では、野生型E.coliの細胞内モリブデン酸塩濃度は1.0μMであるのに対して、モリブデン酸塩輸送体欠損株における細胞内モリブデン酸塩濃度は0.2μMと評価される(ScottおよびAmy、1989)。しかし、このモリブデン酸塩欠損およびこれに起因する有害反応を、増殖培地へのモリブデン酸ナトリウムの添加によって克服することができる。高細胞外モリブデン酸ナトリウム濃度下で、硫酸塩輸送系は、モリブデン酸塩を移入することができ、それにより、野生型およびモリブデン酸塩輸送体欠損株の細胞内モリブデン酸塩濃度を約5μMにすることができる(ScottおよびAmy、1989;Rosentelら、1995)。
モリブデン酸塩が149 moaA RNAによる遺伝子調節に重要であるかどうかを決定するために、E.coliのmodCノックアウト株を、高親和性モリブデン酸塩輸送体機能を排除するように導いた。次いで、この株を、moaABCDE誘導性発現プラスミドならびに野生型および変異149 moaAレポーター融合プラスミドで形質転換した。微量のモリブデン酸塩を含むLuria−Bertani(LB)培地(SambrookおよびRussell、2001)中で増殖させた場合、modC欠失により、WT 149 moaAレポーター融合物が高レベルの遺伝子発現をもたらす(図25c)。対照的に、同一の株を10mMモリブデン酸ナトリウムを補足したLB中で増殖させた場合、機能的ModCを保有する形質転換体のそれと類似のレベルに発現が抑制される。これは、適量のモリブデン酸塩が細胞中で利用可能でない限り、Moco RNAを介した遺伝子発現を誘発するために必要とされる分子は十分な濃度で存在しないことを示す。
興味深いことに、細胞を10mMタングステン酸ナトリウムを補足したLB中で増殖させる場合、modC欠失を保有する形質転換体中の野生型149 moaAレポーター融合構築物は抑制解除されるようになる。上で述べたように、タングステンは、細胞に侵入して、補因子の金属イオン成分としてモリブデンと置き換わり得る。しかし、149 moaA RNAが代謝産物感知リボスイッチ(例えば、Moco)として機能する場合、これは、モリブデンに配位した化合物とタングステンに配位した類似化合物との間を識別する能力を有する。全ての場合、破壊変異(M1)および代償的変異(M2)を保有するレポーター融合構築物により、期待される遺伝子発現プロフィールが得られる。
vi.生合成遺伝子の変異により、Mocoが調節リガンドであることが示唆される
上記結果を考慮すると、MocoがMoco RNAによって直接感知することができる調節因子であると推測された。Moco生合成経路中の特定の化合物が遺伝子発現の調節を担うというさらなる証拠を得るために、経路に沿った種々の遺伝子に合わせたノックアウト変異を作製した。前に試験したmoaAノックアウトに加えて(図25b)、mogA、modC、またはmoeAのノックアウト(Δ)を有する株を作製し、moaABCDE誘導性発現プラスミドおよび野生型149 moaAレポーター融合プラスミドで形質転換した。ΔmogA、ΔmodC、およびΔmoeAノックアウト株は、moaABCDE発現プラスミドの誘導と無関係に、抑制解除を示す(図26)。結果は、これら3つのタンパク質が小分子シグナルの産生に不可欠であり、moaオペロンの誘導がこれらのタンパク質の喪失を代償できないことを示す。
上記結果を考慮すると、MocoがMoco RNAによって直接感知することができる調節因子であると推測された。Moco生合成経路中の特定の化合物が遺伝子発現の調節を担うというさらなる証拠を得るために、経路に沿った種々の遺伝子に合わせたノックアウト変異を作製した。前に試験したmoaAノックアウトに加えて(図25b)、mogA、modC、またはmoeAのノックアウト(Δ)を有する株を作製し、moaABCDE誘導性発現プラスミドおよび野生型149 moaAレポーター融合プラスミドで形質転換した。ΔmogA、ΔmodC、およびΔmoeAノックアウト株は、moaABCDE発現プラスミドの誘導と無関係に、抑制解除を示す(図26)。結果は、これら3つのタンパク質が小分子シグナルの産生に不可欠であり、moaオペロンの誘導がこれらのタンパク質の喪失を代償できないことを示す。
ΔmodC株の遺伝子発現の特徴は、前に認められた特徴に類似し(図25c)、モリブデン酸塩輸送がシグナル伝達化合物の形成に必要であることが証明される。しかし、ΔmoeA株の特徴により、モリブデン酸塩のみがシグナル伝達化合物である可能性が低いことが明らかになる。MoeAは、モリブデンのモリブドプテリン(Moco生合成経路の最終ステップ)への挿入を触媒し、この活性は149 moaA RNAによる遺伝子発現の調節に必要である。
多数のリボスイッチクラスについて、リボスイッチアプタマーによって感知されるリガンドは、調節される生合成経路中の最終補酵素または代謝産物である(WinklerおよびBreaker、2005)。Mocoは全ドメインに広く存在する化合物である一方で、いくつかの細菌はMo依存性酵素の活性部位に挿入されるMocoの誘導体を生成する。Mocoは、このリボスイッチクラスの最も論理的なリガンドである。
E.coliでは、Mocoをタンパク質に挿入することができる前に、MocoをMobAによってさらに改変しなければならない(Iobbi−Nivolら、1995;Johnsonら、1991)。次いで、得られたMocoのビス−MGD形態(図23b)を、モリブドプロテイン(molybdoprotein)に挿入することができる。Mocoの誘導体がリボスイッチリガンドであり得るかどうかを決定するために、ΔmobA株を構築し、その影響を上記のレポーター遺伝子発現に関して評価した。グルコースを含むLB中で増殖させた場合、他の全ての形質転換体と同一の抑制解除が認められる(図26)。しかし、細胞をアラビノースを補足したLB中で増殖させる場合、レポーター融合構築物の抑制は修復される。MobAを使用しなかっとしても、細胞は、moaA 149 RNAによって調節された遺伝子発現を抑制することが必要な小分子を産生することができる。これらの結果は、MocoがMoco RNA依存性遺伝子調節を担う小分子であることと一致する。
vii.Moco RNAがMocoとTucoとを識別することができる証拠
リボスイッチは、生合成経路内の密接に関連する中間体の間で分化する能力で知られている。Clostridia種およびいくつかの好熱性古細菌種は、モリブデンよりもむしろタングステンをモリブドプテリンに組み込み、それにより、密接に関連した化合物Tucoが形成される(Johnsonら、1993)。MoおよびWの原子半径およびイオン半径は実質的に同一であり、その電子親和力も同様である(KletzinおよびAdams、1996)。今回の研究に重要なのは、E.coliがWを最終W−ビス−MGD補因子に組み込み、次いで、補因子を機能的トリメチルアミンN−オキシドレダクターゼに挿入することができることを示したことである(Bucら、1999)。
リボスイッチは、生合成経路内の密接に関連する中間体の間で分化する能力で知られている。Clostridia種およびいくつかの好熱性古細菌種は、モリブデンよりもむしろタングステンをモリブドプテリンに組み込み、それにより、密接に関連した化合物Tucoが形成される(Johnsonら、1993)。MoおよびWの原子半径およびイオン半径は実質的に同一であり、その電子親和力も同様である(KletzinおよびAdams、1996)。今回の研究に重要なのは、E.coliがWを最終W−ビス−MGD補因子に組み込み、次いで、補因子を機能的トリメチルアミンN−オキシドレダクターゼに挿入することができることを示したことである(Bucら、1999)。
以前の研究(Andersonら、2000)では、131−nt上流領域によるmoaABCDEオペロンの見かけ上の抑制がMocoの存在下で起こるが、Tucoの存在下で抑制解除される。この以前の所見は本データと一致し(図25c)、Moco RNA−レポーター融合構築物を保有する細胞が培地へのタングステン酸塩の添加に影響を受けないことを証明する。したがって、Moco RNAは、これら2つのほぼ同一の補因子を識別することができる。
Moco RNA代表の系統発生的分布および配列アラインメントの調査により、モチーフに2つの主なクラスが存在することが明らかになった。Moco RNAモチーフの176例のうち、58例はP3ステムを欠く。しかし、この群は系統発生的区分に沿って厳格に分類されず、同一リガンドを認識するリボスイッチアプタマーの構造バリアントの伝播と一致する。
興味深いことに、Moco RNAの2つの構造型は、細菌の間でのMocoおよびTucoの利用とほぼ完全な一致を示し(表3)、これは、2つのRNA型によってMocoまたはTucoのいずれかを選択的に認識することが可能であることを示す。MocoまたはTucoを使用する生物を、これらの補因子に関連する化合物を使用または輸送すると予想されるタンパク質をコードする遺伝子の存在によって暫定的に同定することができる。P3ステムを含むMoco RNAは、モリブドプテリンまたはMocoを合成するタンパク質をコードする遺伝子と排他的に関連し、補酵素としてMocoを使用することが公知であるか予想される酵素をコードする遺伝子のみとも関連する。対照的に、P3ステムを欠くMoco RNA代表を保有する19生物のうちの17生物はまた、Tuco代謝を示す遺伝子を保有する。さらに、P3欠如RNAは、モリブドプテリン生合成(モリブドプテリンはTucoおよびMoco生合成の両方の前駆体である)に関連する酵素をコードする遺伝子または補酵素としてTucoを使用することが公知であるか予想される酵素をコードする遺伝子とほぼ排他的に関連する。
MocoおよびTuco代謝を用いたMoco RNA型の分離の見かけ上の例外は、予測されるモリブデン酸塩輸送体に関連するP3欠如RNAを有するPelobacter carbinolicusについて明らかである(表3、注釈づけa)。しかし、この輸送体クラスのメンバーは、タングステン酸塩を識別できず、したがって、この生物中の輸送体は、Tuco生合成に実際に重要であり得る。Moco RNAの両構造変動を保有する生物においてさえ、P3含有RNAおよびP3欠如RNAのMocoおよびTuco代謝過程へのそれぞれの分離は主に維持される。
2つのMoco RNA型の特筆すべき分離を、P3ステムの有無によって異なり、MocoまたはTucoをそれぞれ選択的に感知する2つのMoco RNA型の存在によって説明することができる。しかし、P3ステムをE.coli Moco RNAから欠失しているが、この変化は試験した全増殖条件下で遺伝子調節を完全に破壊した。おそらく、この欠如のみではMocoからTucoへのMoco RNAの特異性の交換に不十分である。
上で述べたように、RNAエレメントの三重配置は、S.wolfei中の見かけ上の7遺伝子オペロン中に存在する。このオペロン中の遺伝子は、モリブドプテリン合成、モリブデン酸塩またはタングステン酸塩の輸送、および未知の機能の他の遺伝子に関与するタンパク質をコードすることが予想される。このシリーズ中の3つの全RNAはP3ステムを欠く。さらに、推定内因性転写ターミネーターを、最初の2つのRNAモチーフならびに、オペロン中の第3のモチーフと第1のORFとの間の長いギャップにしたがって観察した。各リボスイッチが実際に個別の発現プラットフォームを介して機能する場合、および、P3ステムの非存在がTuco結合を示す場合、以前に記載のタンデムリボスイッチ(WelzおよびBreaker、2007)と比較して、より高い「デジタル」遺伝子調節特性を有する三重配置によって細胞がTuco濃度の小さな変化に例外的に応答することが可能である。
2.結論
E.coliでは、moaABCDEオペロンの転写は、ModEおよびFNRの両方によって上方制御される。しかし、Moco RNAおよびMocoが存在する場合にこのオペロンの翻訳が防止される。ModEおよびFNRの調節は、Moco産生の必要条件(FNRによって感知される嫌気性増殖条件)および可能条件(ModEによって感知される十分なモリブデン酸塩レベル)が細胞中に存在する場合moaABCDE転写物のみが確実に作製される。Moco RNAが実際にリボスイッチである場合、さらなる調節層を添加する。Moco感知リボスイッチは、moaABCDE転写物への遊離Moco結合によって示されるように、十分なレベルのMocoが既に存在する場合、Moco生合成タンパク質は作製されないことを確実にする。この系により、細胞内のMocoに対する要求の変化に迅速であるが有効に応答することが可能である。
E.coliでは、moaABCDEオペロンの転写は、ModEおよびFNRの両方によって上方制御される。しかし、Moco RNAおよびMocoが存在する場合にこのオペロンの翻訳が防止される。ModEおよびFNRの調節は、Moco産生の必要条件(FNRによって感知される嫌気性増殖条件)および可能条件(ModEによって感知される十分なモリブデン酸塩レベル)が細胞中に存在する場合moaABCDE転写物のみが確実に作製される。Moco RNAが実際にリボスイッチである場合、さらなる調節層を添加する。Moco感知リボスイッチは、moaABCDE転写物への遊離Moco結合によって示されるように、十分なレベルのMocoが既に存在する場合、Moco生合成タンパク質は作製されないことを確実にする。この系により、細胞内のMocoに対する要求の変化に迅速であるが有効に応答することが可能である。
本明細書中に示した実験データおよびバイオインフォマティクスデータは、Moco RNAモチーフに適合するRNAがMocoまたはTuco感知リボスイッチアプタマーとしての機能を果たし得ることを示す。RNAは、リボスイッチ機能と一致するゲノム分布を有し、149 moaA RNAは、その二次構造に依存する遺伝子調節機能を示す。しかし、Mocoおよびその代謝中間体の不安定性により、インライン探索、平衡透析法、または蛍光ベースのアッセイなどの一般的に使用される技術を使用したこれらの補酵素のRNAへの直接結合の証明が妨げられる。これらの後者の実験を典型的に使用して、タンパク質因子の完全な非存在下でリガンド結合が起こることを証明する。
いくつかの一連の証拠は、タンパク質因子が代謝産物感知に関与せず、RNAが直接的センサーとしての機能を果たすことを示す。以前の研究により、E.coliにおいてMoco生合成遺伝子を調節する酸素およびモリブデン酸塩に応答するタンパク質因子を同定した(Andersonら、2000;SpiroおよびGuest、1990;Grudenら、1999)。しかし、この生物におけるmoaA遺伝子のすぐ上流に存在する調節領域のための因子は同定されていない。さらに、Moco RNA代表を、2つの異なる構造(P3を含むものおよび含まないもの)に分類することができ、これらのモチーフ型の分布は、生物によるMoco、Tuco、またはその両方の使用と相関する(表3)。MocoおよびTucoの直接的センサーとしての機能を果たすのがRNAである場合、これらの構造的に異なるRNAのかかる組合せ(assortment)が予想される。
Moco RNAはまた、他のリボスイッチ代表といくつかの重要な特徴を共有する。例えば、補酵素B12(Nahviら、2004)、チアミンピロリン酸(Winklerら、2002a)、フラビンモノヌクレオチド(Winklerら、2002b)、およびリジン(Sudarsanら、2003)に応答するE.coli中に存在することが公知のリボスイッチアプタマーの4つの他のクラスが存在する。Moco RNA(Weinbergら、2007)と同様に、これらのリボスイッチは全てRNAから構成される非リボスイッチ遺伝子調節エレメントと比較して大きく(図27)、これらは全て高レベルのヌクレオチド配列および配列保存を有している(BarrickおよびBreaker、2007)。E.coli由来のMoco RNAおよび公知のリボスイッチアプタマーは、100ヌクレオチドより大きく、且つ4〜6つのステムを保有する。このステムは、遠縁の生物由来の代表においてさえ塩基対合を維持するヌクレオチド共変動の証拠を示す。
E.coli由来のRNAに結合する公知の代謝調節タンパク質(CspA(PhadtareおよびInouye、1999)、BglG(Houmanら、1990)、およびその他(Liuら、1997;Torres−Lariosら、2002;Vecerekら、2005;RichardsonおよびRichardson、1996;TangおよびGuest、1999)など)は、非常により小さなRNAストレッチを認識する。これらのタンパク質結合配列中に任意の二次構造が存在する場合、二次構造は、一般に、1つのヘアピンからなる。この傾向に対する1つの例外はThrRS RNAエレメント(Torres−Lariosら、2002)であり、このエレメントは、通常は大きな構造化tRNAに結合するアミノアシル−tRNAシンセターゼによる結合を好むように構造が進化している。ほとんどのタンパク質結合RNAモチーフと対照的に、E.coli moaA RNA由来のMoco RNAは、138ヌクレオチドに及び、少なくとも5つの保存ステム−ループエレメントを形成する。したがって、Moco RNAの大きく且つ広範に保存された構造は、タンパク質因子によって結合するほとんどのRNA遺伝子調節エレメントよりもE.coli由来の公知のリボスイッチRNAでより特徴的である。これらの特徴は、Moco RNAが新規に見出された代謝産物感知リボスイッチクラスのメンバーであることを示す。
3.実験手順
i.オリゴヌクレオチドおよび化学物質
合成DNAは、イェール大学 Howard Hughes Medical Institute Keck Foundation Biotechnology Resource Centerによって合成された。以下の化学物質をSigma−Aldrichから購入した:カルベニシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、L−アラビノース、D−グルコース、グリセロール、モリブデン酸ナトリウム、およびタングステン酸ナトリウム。
i.オリゴヌクレオチドおよび化学物質
合成DNAは、イェール大学 Howard Hughes Medical Institute Keck Foundation Biotechnology Resource Centerによって合成された。以下の化学物質をSigma−Aldrichから購入した:カルベニシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、L−アラビノース、D−グルコース、グリセロール、モリブデン酸ナトリウム、およびタングステン酸ナトリウム。
ii.細菌株および培地
E.coli DJ480株(MG1655 ΔlacX74)(CabreraおよびJin、2001)をD.J.Jin(National Institutes of Health)から入手し、NEB5α細胞をNew England Biolabsから入手した。Wanner遺伝子破壊セット(pKD46、pKD13、およびpCP20)(DatsenkoおよびWanner、2000)に対応するプラスミドを、イェール大学 E.coli Genetic Stock Centerから得た。培地補助剤を各実験について記載のように添加した:カルベニシリン、50μg/mL;クロラムフェニコール、5μg/mL;カナマイシン50μg/mL;L−アラビノース、0.2%(w/v);D−グルコース、0.2%(w/v)。アラビノース補足を適用する場合、グリセロール0.2%(w/v)を、培地に添加する(Guzmanら、1995)。
E.coli DJ480株(MG1655 ΔlacX74)(CabreraおよびJin、2001)をD.J.Jin(National Institutes of Health)から入手し、NEB5α細胞をNew England Biolabsから入手した。Wanner遺伝子破壊セット(pKD46、pKD13、およびpCP20)(DatsenkoおよびWanner、2000)に対応するプラスミドを、イェール大学 E.coli Genetic Stock Centerから得た。培地補助剤を各実験について記載のように添加した:カルベニシリン、50μg/mL;クロラムフェニコール、5μg/mL;カナマイシン50μg/mL;L−アラビノース、0.2%(w/v);D−グルコース、0.2%(w/v)。アラビノース補足を適用する場合、グリセロール0.2%(w/v)を、培地に添加する(Guzmanら、1995)。
iii.Moco RNAの調製
インライン探索のために使用した138 moaA RNA構築物を、連続的PCR増幅反応によって生成されたテンプレートを使用した試験管内転写によって調製した。moaA上流の遺伝子間領域を、プライマー5’−GAATTCCCTGGAGTCAGATTATCCGC(配列番号4)および5’−CTGGATCCAGTTGTGAAGCCATGTACAC(配列番号5)を使用して、PCRによってE.coli K12 ゲノムDNAから増幅した。EcoRIおよびBamHIによる消化後、PCR産物をpRS414にクローン化し、得られたプラスミドの完全性を、DNA配列決定によって確認した。このプラスミドを、138 moaA構築物をコードするDNA構築物のPCR増幅のためのテンプレートとして使用し(RNA転写物の5’末端に対応するGG付加を含む)、非テンプレート鎖のプライマーはT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいた。以前に記載のように、RNA分子を、T7 RNAポリメラーゼを使用した試験管内での転写によって調製し、変性PAGEを使用して精製した(Rothら、2006)。
インライン探索のために使用した138 moaA RNA構築物を、連続的PCR増幅反応によって生成されたテンプレートを使用した試験管内転写によって調製した。moaA上流の遺伝子間領域を、プライマー5’−GAATTCCCTGGAGTCAGATTATCCGC(配列番号4)および5’−CTGGATCCAGTTGTGAAGCCATGTACAC(配列番号5)を使用して、PCRによってE.coli K12 ゲノムDNAから増幅した。EcoRIおよびBamHIによる消化後、PCR産物をpRS414にクローン化し、得られたプラスミドの完全性を、DNA配列決定によって確認した。このプラスミドを、138 moaA構築物をコードするDNA構築物のPCR増幅のためのテンプレートとして使用し(RNA転写物の5’末端に対応するGG付加を含む)、非テンプレート鎖のプライマーはT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいた。以前に記載のように、RNA分子を、T7 RNAポリメラーゼを使用した試験管内での転写によって調製し、変性PAGEを使用して精製した(Rothら、2006)。
iv.138 moaA RNAのインライン探索分析
製造者によって供給されたプロトコールにしたがって、試験管内転写によって調製したRNAの40ピコモル(pmole)を、アルカリホスファターゼ(Roche Diagnostics)を使用して脱リン酸化し、20ピコモルをT4 ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を使用してγ−32P[ATP]で放射性同位元素標識した。PAGEによって精製された放射性同位元素標識RNAを使用したインライン探索反応物を、以前に記載のようにアセンブリし(Mandalら、2003)、50mM Tris−HCl(pH8.3、23℃)、100mM KCl、20mM MgCl2、および約5nM前駆体RNAを含む10μLの体積中にて25℃で40時間インキュベートした。得られたRNAフラグメントを、10%変性PAGEの使用によって分離し、Molecular Dynamics PhosphorImagerを使用して画像化し、ImageQuaNTソフトウェアを使用して定量した。
v.moaA、mogA、modC、moeA、およびmobAノックアウトの生成
特定の遺伝子が欠失したE.coli DJ480株を、他の場所に記載のように(DatsenkoおよびWanner、2000)、λ−red組換え法および適切なPCR産物を使用して生成した。簡潔に述べれば、プラスミドpKD13および以下のプライマーを使用したPCR増幅によって変異体を作製した:
moaA、5’−AGGAAGAAATGACTTCGCCTCCCGTATCTGGAAAGGTG TACATGGCTATTCCGGGGATCCGTCGACC(配列番号6)および
5’−ACCTGACTCATCTGATCTCTCCTTTTGACGTTTTA GCCGCCAATGTACGATGTAGGCTGGAGCTGCTTCG;mogA(配列番号7)、
5’−TGTATCATTCTGTTTAACGAGACTGTTTAAACGGAAA AATCTTGATGAATATTCCGGGGATCCGTCGACC(配列番号8)および
5’− TTGAGATCCCCCCGCTCGGGGGGATTTTTTTATTCGC TAACGTCGCGTCTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG;moeA(配列番号9),
5’−GACATAATAGGCAAATTCGATTTTGCCTCCGCAGGA GTGTTTTCATGGAAATTCCGGGGATCCGTCGACC(配列番号10)および
5’−CAGCATCTCCTGATCGCTGAGTTCCGCCATTACAGG CCTCCGAACAACGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(配列番号11);
modC、5’−GAATGGCTGGCCAGAATCAGCCGTGAACGGGCGGG GCGCTAATCATGCTGATTCCGGGGATCCGTCGACC(配列番号12)および
5’−TTGCCCAGTTCATTTATAGCCACCTGATTAATCAG GCGGTTATCGACACTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(配列番号13);
mobA、5’−GACACGTTAGCAGGGTCAATCCCACAATAAAAGAG GCGATATCGGTGAATATTCCGGGGATCCGTCGACC(配列番号14)および
5’− ACTCCACGCGGCAAAGGCGAGTAACGGTATCATC GTTTTTCCTGCCATCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(配列番号15)。
製造者によって供給されたプロトコールにしたがって、試験管内転写によって調製したRNAの40ピコモル(pmole)を、アルカリホスファターゼ(Roche Diagnostics)を使用して脱リン酸化し、20ピコモルをT4 ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を使用してγ−32P[ATP]で放射性同位元素標識した。PAGEによって精製された放射性同位元素標識RNAを使用したインライン探索反応物を、以前に記載のようにアセンブリし(Mandalら、2003)、50mM Tris−HCl(pH8.3、23℃)、100mM KCl、20mM MgCl2、および約5nM前駆体RNAを含む10μLの体積中にて25℃で40時間インキュベートした。得られたRNAフラグメントを、10%変性PAGEの使用によって分離し、Molecular Dynamics PhosphorImagerを使用して画像化し、ImageQuaNTソフトウェアを使用して定量した。
v.moaA、mogA、modC、moeA、およびmobAノックアウトの生成
特定の遺伝子が欠失したE.coli DJ480株を、他の場所に記載のように(DatsenkoおよびWanner、2000)、λ−red組換え法および適切なPCR産物を使用して生成した。簡潔に述べれば、プラスミドpKD13および以下のプライマーを使用したPCR増幅によって変異体を作製した:
moaA、5’−AGGAAGAAATGACTTCGCCTCCCGTATCTGGAAAGGTG TACATGGCTATTCCGGGGATCCGTCGACC(配列番号6)および
5’−ACCTGACTCATCTGATCTCTCCTTTTGACGTTTTA GCCGCCAATGTACGATGTAGGCTGGAGCTGCTTCG;mogA(配列番号7)、
5’−TGTATCATTCTGTTTAACGAGACTGTTTAAACGGAAA AATCTTGATGAATATTCCGGGGATCCGTCGACC(配列番号8)および
5’− TTGAGATCCCCCCGCTCGGGGGGATTTTTTTATTCGC TAACGTCGCGTCTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG;moeA(配列番号9),
5’−GACATAATAGGCAAATTCGATTTTGCCTCCGCAGGA GTGTTTTCATGGAAATTCCGGGGATCCGTCGACC(配列番号10)および
5’−CAGCATCTCCTGATCGCTGAGTTCCGCCATTACAGG CCTCCGAACAACGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(配列番号11);
modC、5’−GAATGGCTGGCCAGAATCAGCCGTGAACGGGCGGG GCGCTAATCATGCTGATTCCGGGGATCCGTCGACC(配列番号12)および
5’−TTGCCCAGTTCATTTATAGCCACCTGATTAATCAG GCGGTTATCGACACTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(配列番号13);
mobA、5’−GACACGTTAGCAGGGTCAATCCCACAATAAAAGAG GCGATATCGGTGAATATTCCGGGGATCCGTCGACC(配列番号14)および
5’− ACTCCACGCGGCAAAGGCGAGTAACGGTATCATC GTTTTTCCTGCCATCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(配列番号15)。
FLP認識標的部位に隣接したカナマイシン耐性カセットおよび隣接染色体配列に対して同一の50ヌクレオチド配列同一性を含む得られた約1.4kb長のPCR産物を精製し、DpnI消化に供した。DJ480細胞を、相同組換えを促進するλファージ由来のRedリコンビナーゼをコードするRedヘルパープラスミドpKD46で形質転換した。形質転換体を、アンピシリン耐性について選択した。L−アラビノースを使用して増殖させたDJ480/pKD46細胞を、遺伝子特異的/pKD13 PCR産物で形質転換した。DJ480の染色体へのPCR産物の組換えを、カナマイシン耐性形質転換体の選択によって決定した。全ての得られた欠失変異体を、カナマイシンカセットに特異的な内部プライマー
(k1 5’−CAGTCATAGCCGAATAGCCT(配列番号16)およびk2 5’−CGGTGCCCTGAATGAACTGC(配列番号17))および隣接遺伝子特異的プライマー(moaA 5’−CGCTAGTATCGGCATAACCAC(配列番号18)および5’−GAATCGCGCAGATAGTGACCG(配列番号19)、mogA 5’−GCTACCTCTTCTGAAGCCTGTCTGT(配列番号20)および5’− ATGGGTGAAGTACTGAACGAGCAGT(配列番号21)、moeA 5’−GATGGATATGGCATGTAAAGGCAGG(配列番号22)および5’−AGCACGCGAGAATCTTTCAGCGCCT(配列番号23)、modC 5’−GAGCGGCGAGACTGTGCATTA(配列番号24)および5’−GCAACGCCGATGACGCGGTA(配列番号25)、ならびにmobA 5’−CTTCATTCAGACGTTTACATTTCATAG(配列番号26)および5’−CATCCATATCATGGTGCGTATGCTTA(配列番号27))の両方を使用したPCRによって検証した。
(k1 5’−CAGTCATAGCCGAATAGCCT(配列番号16)およびk2 5’−CGGTGCCCTGAATGAACTGC(配列番号17))および隣接遺伝子特異的プライマー(moaA 5’−CGCTAGTATCGGCATAACCAC(配列番号18)および5’−GAATCGCGCAGATAGTGACCG(配列番号19)、mogA 5’−GCTACCTCTTCTGAAGCCTGTCTGT(配列番号20)および5’− ATGGGTGAAGTACTGAACGAGCAGT(配列番号21)、moeA 5’−GATGGATATGGCATGTAAAGGCAGG(配列番号22)および5’−AGCACGCGAGAATCTTTCAGCGCCT(配列番号23)、modC 5’−GAGCGGCGAGACTGTGCATTA(配列番号24)および5’−GCAACGCCGATGACGCGGTA(配列番号25)、ならびにmobA 5’−CTTCATTCAGACGTTTACATTTCATAG(配列番号26)および5’−CATCCATATCATGGTGCGTATGCTTA(配列番号27))の両方を使用したPCRによって検証した。
次いで、カナマイシンカセットを、FLPプラスミドpCP20の使用による部位特異的組換えによって排除した。得られたカナマイシン感受性形質転換体を、pre−FLP検証のために使用した同一のプライマーを使用したPCRによって検証した。
vi.β−ガラクトシダーゼ翻訳融合物および変異体の構築
オペレーター結合部位を欠く構造的に活性なlacUV5プロモーターによって駆動するMoco RNA−レポーター融合構築物の調製を、以下のように行った。E.coli moaABCDEオペロンのS1転写開始部位と比較して1〜145のヌクレオチド配列(図23a)を、56 nt lacUV5プロモーター配列(下線)(Dicksonら、1975)を含むプライマー5’−GAATTCCTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCT TCCGGCTCGTATAATGTGTGGAACCACTAAACACTCTAGCCTC(配列番号28)およびプライマー5’−CTGGATCCAGTTGTGAAGCCATGTACAC(配列番号29)を使用したPCRによってE.coli K12株から増幅した。EcoRIおよびBamHIでの消化後、増幅産物をlacZのプロモーターレスコピーを含むpRS414プラスミド(Simonsら、1987)にクローン化して、lacZの9番目のコドンとmoaAの5番目のコドンとの間のインフレーム融合物を得た。NEB−5α細胞を、得られたプラスミドで形質転換した。形質転換体をアンピシリン耐性について選択し、lacUV5−Mocoモチーフ−lacZ翻訳融合物の完全性をDNA配列決定によって確認した。全ての部位特異的変異を、QuikChange部位特異的変異誘発キット(Stratagene)および適切な変異誘発DNAプライマーを使用してMocoリボスイッチに導入した。全ての変異を、DNA配列決定によって確認した。
オペレーター結合部位を欠く構造的に活性なlacUV5プロモーターによって駆動するMoco RNA−レポーター融合構築物の調製を、以下のように行った。E.coli moaABCDEオペロンのS1転写開始部位と比較して1〜145のヌクレオチド配列(図23a)を、56 nt lacUV5プロモーター配列(下線)(Dicksonら、1975)を含むプライマー5’−GAATTCCTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCT TCCGGCTCGTATAATGTGTGGAACCACTAAACACTCTAGCCTC(配列番号28)およびプライマー5’−CTGGATCCAGTTGTGAAGCCATGTACAC(配列番号29)を使用したPCRによってE.coli K12株から増幅した。EcoRIおよびBamHIでの消化後、増幅産物をlacZのプロモーターレスコピーを含むpRS414プラスミド(Simonsら、1987)にクローン化して、lacZの9番目のコドンとmoaAの5番目のコドンとの間のインフレーム融合物を得た。NEB−5α細胞を、得られたプラスミドで形質転換した。形質転換体をアンピシリン耐性について選択し、lacUV5−Mocoモチーフ−lacZ翻訳融合物の完全性をDNA配列決定によって確認した。全ての部位特異的変異を、QuikChange部位特異的変異誘発キット(Stratagene)および適切な変異誘発DNAプライマーを使用してMocoリボスイッチに導入した。全ての変異を、DNA配列決定によって確認した。
vii.MoaABCDE pBAD33過剰発現プラスミドの構築
moaABCDEオペロンをpBAD33プラスミド(Guzmanら、1995)にクローン化して、細胞内のMocoレベルのアラビノース誘導性調節を可能にした。2.7kb KpnI−HindIII moaABCDEフラグメントを、プライマー5’−CTAGGTACCTCTGGAAAGGTGTACATGGCTTCACAAC(配列番号30)および5’−TAGAAGCTTAACTACCAGCGTTTTGCCGCCTGCTG(配列番号31)を使用したPCRによってE.coli K12から増幅した。PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって精製し、KpnIおよびHindIII消化に供し、pBAD33も同様に行った。次いで、消化したフラグメントをアラビノース誘導性プロモーター下流のpBAD33にライゲーションし、NEB−5α細胞に形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール耐性について選択し、融合物をDNA配列決定によって確認した。
moaABCDEオペロンをpBAD33プラスミド(Guzmanら、1995)にクローン化して、細胞内のMocoレベルのアラビノース誘導性調節を可能にした。2.7kb KpnI−HindIII moaABCDEフラグメントを、プライマー5’−CTAGGTACCTCTGGAAAGGTGTACATGGCTTCACAAC(配列番号30)および5’−TAGAAGCTTAACTACCAGCGTTTTGCCGCCTGCTG(配列番号31)を使用したPCRによってE.coli K12から増幅した。PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって精製し、KpnIおよびHindIII消化に供し、pBAD33も同様に行った。次いで、消化したフラグメントをアラビノース誘導性プロモーター下流のpBAD33にライゲーションし、NEB−5α細胞に形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール耐性について選択し、融合物をDNA配列決定によって確認した。
viii.変異株の生成
moaA、mogA、modC、moeA、およびmobAノックアウトDJ480株を、野生型または変異149 moaA−レポーター融合物を含むlacUV5−Mocoモチーフ−lacZ融合物pRS414プラスミドおよびmoaABCDE pBAD33過剰発現プラスミドの両方で同時に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン耐性およびクロラムフェニコール耐性の両方について選択した。
moaA、mogA、modC、moeA、およびmobAノックアウトDJ480株を、野生型または変異149 moaA−レポーター融合物を含むlacUV5−Mocoモチーフ−lacZ融合物pRS414プラスミドおよびmoaABCDE pBAD33過剰発現プラスミドの両方で同時に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン耐性およびクロラムフェニコール耐性の両方について選択した。
ix.E.coli由来の149 moaA RNAによる遺伝子調節の生体内分析
E.coliの野生型および変異レポーター株中のlacZ由来の遺伝子発現を測定するために、細胞を、表示のように補足した3mLのLBを含む14mL培養バイアル中にて37℃で一晩振とうしながら増殖させた。次いで、細胞を、96ウェルプレート中のLB150μL中においてOD600 0.05まで希釈し、0.5と0.7との間のA600までに37℃で振とうしながら増殖させ、次いで、遺伝子発現実験のために回収した。β−ガラクトシダーゼ活性を、他の場所に記載の96ウェルマイクロプレートプロトコールを使用してアッセイした(Blountら、2007)。
E.coliの野生型および変異レポーター株中のlacZ由来の遺伝子発現を測定するために、細胞を、表示のように補足した3mLのLBを含む14mL培養バイアル中にて37℃で一晩振とうしながら増殖させた。次いで、細胞を、96ウェルプレート中のLB150μL中においてOD600 0.05まで希釈し、0.5と0.7との間のA600までに37℃で振とうしながら増殖させ、次いで、遺伝子発現実験のために回収した。β−ガラクトシダーゼ活性を、他の場所に記載の96ウェルマイクロプレートプロトコールを使用してアッセイした(Blountら、2007)。
x.MocoおよびTuco代謝のバイオインフォマティクス分析
MocoおよびTuco代謝の種々の生物への割り当てならびにMoco RNAモチーフ型の3つの過程(モリブドプテリン生合成、Moco生合成または使用、およびTuco生合成または使用;表3)に関与する遺伝子への割り当てを配列相同性分析によって行った。Tucoを使用するが、実験的にそのように証明されなかった生物を同定するために、BLASTを使用してtupAおよびtupBに相同な遺伝子を検索した。これらの遺伝子は、Eubacterium acidaminophilumにおいてタングステン酸塩に特異的な輸送体をコードすることが示されている(Makdessiら、2001)。Pelobacter carbinolicusおよびDesulfotalea psychrophiliaにおけるTuco代謝をwtpAホモログの存在に基づいて割り当て、このホモログは、異なるが選択的なタングステン酸塩の輸送体であることが示されている(Beversら、2006)。隣接遺伝子のタンパク質産物の注釈付けした機能の試験または注釈付けが利用可能でない場合の配列相同性を使用した機能の割り当てによってMoco RNAモチーフの上記列挙の3つの過程への割り当てを行った。
MocoおよびTuco代謝の種々の生物への割り当てならびにMoco RNAモチーフ型の3つの過程(モリブドプテリン生合成、Moco生合成または使用、およびTuco生合成または使用;表3)に関与する遺伝子への割り当てを配列相同性分析によって行った。Tucoを使用するが、実験的にそのように証明されなかった生物を同定するために、BLASTを使用してtupAおよびtupBに相同な遺伝子を検索した。これらの遺伝子は、Eubacterium acidaminophilumにおいてタングステン酸塩に特異的な輸送体をコードすることが示されている(Makdessiら、2001)。Pelobacter carbinolicusおよびDesulfotalea psychrophiliaにおけるTuco代謝をwtpAホモログの存在に基づいて割り当て、このホモログは、異なるが選択的なタングステン酸塩の輸送体であることが示されている(Beversら、2006)。隣接遺伝子のタンパク質産物の注釈付けした機能の試験または注釈付けが利用可能でない場合の配列相同性を使用した機能の割り当てによってMoco RNAモチーフの上記列挙の3つの過程への割り当てを行った。
表3 P3の存在または非存在とMocoまたはTuco関連遺伝子の存在との間の相関。Moco関連遺伝子を保有する生物を、公知のMoco依存性タンパク質およびモリブデン酸塩輸送に関与するタンパク質に相同な遺伝子について各生物のゲノム検索によって同定した。Tuco関連遺伝子を保有する生物を、Mocoについて記載され、且つ他の場所に公開されたように同定した(Beversら、2006;Iyerら、2006)。モリブドプテリン(moly)の生合成に重要な遺伝子がMocoまたはTucoのいずれかの産生に関与し得るので、これらの遺伝子の存在を、個別の列に示した。アスタリスクが存在しないのは、生物が指定の化合物に関連する遺伝子を欠くことを意味するのではなく、むしろ、文献またはゲノムデータベース検索のいずれかでこれらの遺伝子の存在についての証拠を見出せなかったことを示す。遺伝子のゲノム検索は、NCBI Entrez Genome Projectデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi)由来の注釈付けしたゲノムに依存した。
注釈:影を付けたボックスa〜cは、RNA型とMocoまたはTuco遺伝子調節との間の相関が破られているように現れる例のみを特定する。しかし、aは、P3欠如RNAがmodAに関連し、そのタンパク質産物がモリブデン酸塩とタングステン酸塩とを識別できない輸送体である場合を指定する(Chanら、1995)。bについて、P3欠如RNAは、Tuco関連遺伝子COG2414(タングステン依存性アルデヒドフェレドキシンレダクターゼをコードする)(Harborneら、1992)およびnirB(硝酸レダクターゼをコードし、通常はMocoを必要とする)(Clarkeら、2000)を保有する2遺伝子オペロンに関連する。cでは、P3欠如RNAは、推定Moco使用亜硫酸オキシダーゼ酵素をコードする2つの遺伝子に関連する。したがって、aおよびbは相関を破らない一方で、他の可能性には、cにおける所見を説明するために呼び出される必要がある(テキストを参照のこと)。また、S.wolfeiでは、1つのP3含有RNAはtroAに関連し、このtroAは金属輸送複合体の成分をコードすると予想される。類似のアレンジメントがDesulfitobacterium hafniense DCB−2において存在する。しかし、TroAおよびニトロゲナーゼMoFeタンパク質(Moco含有タンパク質である)の構造的な構成は類似する(Chanら、1995)。したがって、P3含有RNAはMoFeニトロゲナーゼの遺伝子に関連するのは明らかである。
F.実施例6:SAM−IVリボスイッチのアプタマーコアはSAM−Iリボスイッチのリガンド結合部位を模倣する
「SAM−IV」と呼ばれる新規のリボスイッチファミリーは、S−アデノシルメチオニン(SAMまたはAdoMet)の直接的感知によって遺伝子発現を調節すると報告されている第4の異なるmRNAエレメント組である。ファミリー特異的ヌクレオチド同一性を有する再配置された構造およびヌクレオチド位置にもかかわらず、SAM−IVリボスイッチは、前述のSAM−Iリボスイッチと共に保存されたヌクレオチド位置を共有する。配列分析および分子認識試験により、SAM−IおよびSAM−IVリボスイッチが類似のリガンド結合部位を共有するが、異なる骨格を有することが示唆される。これらの所見は、RNAが相当な構造多用途性を有することを示し、リボスイッチがこの潜在力を活用して遺伝子調節におけるRNA範囲を拡大することが明らかとなる。
リボスイッチは、特定の代謝産物に特異的に結合し、代謝産物濃度の変化に応答して遺伝子発現を調節するmRNAエレメントである(MandalおよびBreaker 2004;WinklerおよびBreaker 2005;Batey 2006;Coppinsら2007)。S−アデノシルメチオニン(多数のメチラーゼ酵素の補因子)は、以下の3つの以前に公開されたリボスイッチクラスによって認識される:SAM−I(Winklerら2003;McDanielら2003;Epshteinら2003)、SAM−II(Corbinoら2005)、およびSAM−III(またはSMK)(Fuchsら2006)リボスイッチ。3つ全てのリボスイッチファミリーがSAMを特異的に認識する一方で、これらは配列または構造が見かけ上類似していない。
複数の異なるSAM結合リボスイッチの発見は、例えば複数の自己切断リボザイムの発見のように、RNAが多様な方法で同一の生化学的課題を解決するのに十分な構造の精巧さを有することを支持する。さらに、2つの大リボザイムクラス(群IイントロンおよびRNアーゼP RNA)の構造研究および配列分析は、これらのRNA中の異なる骨格が触媒コア中のヌクレオチドの同一の位置を支持することを示す(MichelおよびWesthof 1990;Krasilnikovら2004;Torres−Lariosら2006;VicensおよびCech 2006)。
バイオインフォマティクスを使用した細菌における新規のリボスイッチの検索の間に(Yaoら2007;Weinbergら2007)、新規のSAM結合リボスイッチ組に分類された保存された構造化RNAモチーフを同定した。これらの「SAM−IV」リボスイッチは、Actimomycetales(例えば、Mycobacterium tuberculosis(結核の原因病原体))で主に見出される。SAM−IVリボスイッチは、SAM−Iリボスイッチのリガンド結合コアと類似するが、構造およびヌクレオチド同一性において他の場所に多数の相違を有する。したがって、SAM−IおよびSAM−IVリボスイッチは、異なる骨格であるが、高度に類似のリガンド結合コアを有し得る。SAM−IVリボスイッチを使用した所見は、構造模倣が大リボザイムに制限されないことを示し、それにより、多様な構造化RNA種の間で広範に存在すると示唆される。
1.結果と考察
i.SAM−IVモチーフの同定
SAM−IVモチーフを、CMfinder比較ゲノミクスパイプライン(Weinbergら2007;Yaoら2007)を使用して見い出した。ほとんどのSAM−IV例は、硫黄代謝に関与する遺伝子の上流(おそらく、5’UTR中)に存在し、SAM−IVがSAM結合リボスイッチに対応することを示す。SAM−IV RNAのほとんど全ての公知のオカレンスは、Actinomycetales目に存在する。
i.SAM−IVモチーフの同定
SAM−IVモチーフを、CMfinder比較ゲノミクスパイプライン(Weinbergら2007;Yaoら2007)を使用して見い出した。ほとんどのSAM−IV例は、硫黄代謝に関与する遺伝子の上流(おそらく、5’UTR中)に存在し、SAM−IVがSAM結合リボスイッチに対応することを示す。SAM−IV RNAのほとんど全ての公知のオカレンスは、Actinomycetales目に存在する。
ii.SAM−IVモチーフコアは、SAM−Iのコアに類似する
SAM−IVの高度に保存された領域と、SAM−I、SAM−II、およびSAM−IIIリボスイッチの高度に保存された領域とを比較した。SAM−IVは、SAM−I結合コアの重要な配列および構造の特徴を共有するが、ヌクレオチド同一性の顕著な相違が他の場所に見出され、構造全体で非常に偏りがある(図28)。リガンド原子の5Å以内に原子を有するSAM−Iの三次元構造(MontangeおよびBatey 2006)中の全ヌクレオチドとしてのコア(図28、太字)を同定し、保存された構造の特徴の見かけ上の類似性に基づいて類似のSAM−IVの位置にSAM−Iをマッピングした。周囲の保存されたヌクレオチド同一性または他の特徴が共通の同一性が偶然起こる可能性が低いことを示す場合、ヌクレオチド同一性を、両モチーフに共通に分類した(図28、影付き)。
SAM−IVの高度に保存された領域と、SAM−I、SAM−II、およびSAM−IIIリボスイッチの高度に保存された領域とを比較した。SAM−IVは、SAM−I結合コアの重要な配列および構造の特徴を共有するが、ヌクレオチド同一性の顕著な相違が他の場所に見出され、構造全体で非常に偏りがある(図28)。リガンド原子の5Å以内に原子を有するSAM−Iの三次元構造(MontangeおよびBatey 2006)中の全ヌクレオチドとしてのコア(図28、太字)を同定し、保存された構造の特徴の見かけ上の類似性に基づいて類似のSAM−IVの位置にSAM−Iをマッピングした。周囲の保存されたヌクレオチド同一性または他の特徴が共通の同一性が偶然起こる可能性が低いことを示す場合、ヌクレオチド同一性を、両モチーフに共通に分類した(図28、影付き)。
両モチーフは多ステムジャンクションを有し、P3ステム中のヌクレオチド同一性が広範に類似する(図28)。P1とP2との間のジャンクションも類似性を共有し、両モチーフは、P2の末端ループとP3の3’側のジャンクションとの間にシュードノットを形成するようである。このシュードノットを適応させるために、SAM−I中のP2は標準的なkinkターンを有する(Lescouteら2005;MontangeおよびBatey 2006)。興味深いことに、SAM−IV中のP2中の内部ループはkinkターンと同様に機能することができ、これらのRNAがシュードノット構造を採用することが可能である。
しかし、2つのモチーフは、多数の場所で異なる構造エレメントおよび異なるヌクレオチド保存パターンを有する(図28、淡色の影)。SAM−Iコア中のP4ヘアピンはSAM−IV中に存在しないが、異なるP4ヘアピンがSAM−IV中のP1の外側に見出される。これらのP4ヘアピンは、異なる保存ヌクレオチド同一性を有する。コアの外側に付加したP4に加えて、SAM−IVはさらなるシュードノットを形成することができ、これはSAM−Iでは欠く。また、SAM−IVは、そのループおよびステムの長さがSAM−Iのそれと異なり、配列がほとんど類似しないようであるという点で、SAM−Iとは非常に異なるP2を有す。実際、P2中のkinkターンはSAM−Iリボスイッチ中で高度に保存されているが(BarrickおよびBreaker 2007)、SAM−IVリボスイッチ配列はこの構造モチーフを持たない。SAM−IとSAM−IVとの間の保存ヌクレオチド同一性の他の相違は、P3の先端、P1のベース、およびP3の3’側のジャンクションに存在する。
これらの相違のために、SAM−IVリボスイッチは、少なくとも3つの以前の研究におけるSAM−Iに基づいた相同性検索による検出から逃れていた。第1の研究では、Actinobacteriaのゲノムを、PATプログラムを用いて調節RNA(SAM−Iアプタマーが含まれる)について検索した(Seliverstovら2005)。第2に、グラム陽性細菌を、RNA−PATTERNプログラムを使用して、SAM−Iアプタマーおよび硫黄代謝における他の遺伝子調節エレメントについて検索した(Rodionovら2004)。第3に、全細菌における公知のリボスイッチのホモログの検索にSequenceSnifferおよびRAVENNA(WeinbergおよびRuzzo 2006)(保存された配列および二次構造を確率的にモデリングするために統計プロフィール技術を活用する)を使用した。多数のactinomycetesが異なるゲノム座標でSAM−IおよびSAM−IVリボスイッチの両方を保有しているのにもかかわらず、SAM−IVリボスイッチを検出するための全ての試みは失敗した。
SAM−IおよびSAM−IVの類似性は、主にそのコアに制限されるので、SAM−IおよびSAM−IVリボスイッチは、類似の結合部位および分子認識特性を共有することができる。これは、SAM−I原子分解モデル(MontangeおよびBatey 2006)によって支持され、このモデルにより、6つのヌクレオチドがリガンドと直接相互作用すると提案された(図28)。これら6つの位置でのヌクレオチド同一性は、1つを除いて全てのSAM−I代表で厳格に保存されている。これらのリガンド接触位置に対応すると提案されたSAM−IV中の6つの位置のうちの5つが、SAM−Iリボスイッチと同一のヌクレオチド同一性で全ての公知のSAM−IV代表中で保存されている。第6のU88は、典型的には、SAM−IV中でシトシンであるが、4つ全ての核酸塩基がこの位置で認められる。
iii.SAM−IV RNAの分子認識の特徴
SAM−IV RNAの分子認識を評価するために、インライン探索アッセイ(SoukupおよびBreaker 1999)を、Streptomyces coelicolorで見出されるSAM−IVを含む132−ヌクレオチドRNA(132 Sc RNAと呼ばれる)に適用した。これらのアッセイでは、132 Sc RNAは、約150nMの見かけ上の解離定数(KD)でSAMに結合するのに対して、S−アデノシルホモシステイン(SAH)については20μMであった。アデノシンおよびメチオニンのKD値は1mMより低かった(図29)。これらの値は、132 Sc RNAアプタマーが、他のSAMリボスイッチアプタマークラスと類似の親和性および特異性でSAMに結合することを証明する。
SAM−IV RNAの分子認識を評価するために、インライン探索アッセイ(SoukupおよびBreaker 1999)を、Streptomyces coelicolorで見出されるSAM−IVを含む132−ヌクレオチドRNA(132 Sc RNAと呼ばれる)に適用した。これらのアッセイでは、132 Sc RNAは、約150nMの見かけ上の解離定数(KD)でSAMに結合するのに対して、S−アデノシルホモシステイン(SAH)については20μMであった。アデノシンおよびメチオニンのKD値は1mMより低かった(図29)。これらの値は、132 Sc RNAアプタマーが、他のSAMリボスイッチアプタマークラスと類似の親和性および特異性でSAMに結合することを証明する。
SAM−IVリボスイッチは、SAM−I中のU88に対応するヌクレオチドを保存しない(図28)。SAM−Iリボスイッチ中のこの位置のO2カルボニル酸素がSAMリガンド中の硫黄の正電荷を感知すると予想されるので(MontangeおよびBatey 2006)、硫黄の位置が異なる以下の化合物に対するSAM−IおよびSAM−IVリボスイッチの親和性を比較した:SAM、SAH、SAHスルホン(BorchardtおよびWu 1974)、ならびに2つのアザ誘導体であるAzaAdoMetおよびMeAzaAdoMet(Thompsonら1999)。132 Sc RNAは、U88に類似の位置に核酸塩基としてウラシルの代わりにシトシンを有する。シトシンがO2カルボニルを保存するにもかかわらず、ワトソン−クリックG−C対によって形成されたさらなる水素結合は、リガンドの正電荷との相互作用を破壊することができ、それにより、SAM−Iリボスイッチ中のU88の完全な保存を説明することができる。
132 Sc RNAの分子認識を、124yitJと呼ばれる以前に研究されたSAM−Iリボスイッチの分子認識と比較した(Winklerら2003)。リボスイッチによるリガンド中の改変に対する識別を測定するために、改変リガンドのKDの比をSAMのKDで割った。SAM−IおよびSAM−IVリボスイッチは、SAMおよびSAM誘導体と結合して類似の測定されたKD比が得られる(表4)。これらのデータは、SAM−IV中のU88があまり保存されていないが、SAM−IV分子認識がSAM−Iと類似していることを示す。
iv.SAM−IVは遺伝子調節エレメントである
SAM−IVが生体内で遺伝子発現を調節するかどうかを決定するために、S.coelicolor遺伝子座SCO2146の上流のSAM−IV含有遺伝子間領域を、xylEレポーター遺伝子との翻訳融合物としてクローン化した。プロモーターをSAM−IV遺伝子間領域中に容易に同定することができないので、この領域をグリセロール−誘導性プロモーターの調節下においた(Kieserら2000)。
SAM−IVが生体内で遺伝子発現を調節するかどうかを決定するために、S.coelicolor遺伝子座SCO2146の上流のSAM−IV含有遺伝子間領域を、xylEレポーター遺伝子との翻訳融合物としてクローン化した。プロモーターをSAM−IV遺伝子間領域中に容易に同定することができないので、この領域をグリセロール−誘導性プロモーターの調節下においた(Kieserら2000)。
最も知られているSAMリボスイッチは、SAMへの結合の際に遺伝子発現を低下させ、それにより、SAMレベルが高い場合にそのタンパク質産物が必要とされない遺伝子の発現を減少させる。SAM−IVが遺伝子調節エレメントであるかどうかを試験するために、SAM−IVリボスイッチの機能を破壊するか修復すると予想される変異を導入した。第1の変異(M1)は、これらのヌクレオチドがSAM−Iアプタマー中のヌクレオチドに類似すると仮定することによってSAMに直接接触すると予想される位置を改変した。第2の変異(M2)は、保存された二次構造中の塩基対合を破壊する。第3の変異(M3)は、代償的変異によってM2で喪失された塩基対合を回復し、野生型活性を回復することができる。
複合培地での増殖後に4つの各リボスイッチ−レポーター融合物を保有するS.coelicolor細胞中のXylE活性を測定した。ここで、SAMの細胞濃度は豊富であると予想される。予想どおり、M1およびM2リボスイッチを有する株は野生型またはM3リボスイッチを有する株よりも高いレポーター遺伝子発現を示した(図30)。これらの結果は、S.coelicolor由来のSAM−IV RNAが遺伝子調節エレメントであることを示しており、分子認識実験はSAMに応答することを示している。細胞SAM濃度を枯渇させた条件下でレポーター遺伝子発現を測定したが、これらの結果は、構築物を使用した非常に低レベルのレポーター遺伝子発現のために決定的ではなかった。
SAMレベルがこれらの種において抗生物質産生および胞子形成に影響を及ぼすので、硫黄代謝の遺伝子調節はStreptomycesで特に興味深い(Kimら2003;Okamotoら2003)。SAM−IVによって明らかに調節されるいくつかの遺伝子(例えば、SCO2146)は、セレノシステインリアーゼと予想される。これらは、例えば、硫黄代謝で役割を果たすことができる。
v.SAM−IVの進化史
多岐にわたる進化を説明することができるモデルを本明細書中に示す。本モデルでは、SAM−I様祖先は、そのP4ステムを喪失し、P4の喪失に起因するその後の任意の負の影響をP1ステムの3’側の異なるP4ステムの獲得によって代償し、最終的にSAM−IV様RNAを得た。3つの事実がこのモデルと一致する。第1に、SAM−IVはActinomycetalesにほとんど制限される一方で、SAM−Iはこの分類群および多数の他の分類群で見出され、これらが先祖を共有する場合、おそらくSAM−Iに類似すると示唆される。第2に、P4は、骨格にのみ関与することが見出され(MontangeおよびBatey 2006)、それにより、置換がより容易であり得る。第3に、少数のSAM−Iリボスイッチは完全にP4ステムおよびループを欠き、P4喪失を許容することができる。
多岐にわたる進化を説明することができるモデルを本明細書中に示す。本モデルでは、SAM−I様祖先は、そのP4ステムを喪失し、P4の喪失に起因するその後の任意の負の影響をP1ステムの3’側の異なるP4ステムの獲得によって代償し、最終的にSAM−IV様RNAを得た。3つの事実がこのモデルと一致する。第1に、SAM−IVはActinomycetalesにほとんど制限される一方で、SAM−Iはこの分類群および多数の他の分類群で見出され、これらが先祖を共有する場合、おそらくSAM−Iに類似すると示唆される。第2に、P4は、骨格にのみ関与することが見出され(MontangeおよびBatey 2006)、それにより、置換がより容易であり得る。第3に、少数のSAM−Iリボスイッチは完全にP4ステムおよびループを欠き、P4喪失を許容することができる。
vi.SAM−IVリボスイッチの分類および重要性
タンパク質を、種々の基準によってファミリーおよびスーパーファミリーに分類する(OrengoおよびThornton 2005)。独自の基準は、配列相同性のみに基づいた(Dayhoffら1976)。他のグループはこの前例を継続するが(例えば、Barkerら1996)、あるところでは構造的または機能的な類似性も考慮している(Murzinら1995)。一般に、ファミリーに分類されたタンパク質は明確な相同性を有する一方で、スーパーファミリーに分類されたタンパク質は、より遠縁なようであり、相同性は「可能性あり」としか見なされない(Murzinら1995;Dayhoffら1976)。SAM−IとSAM−IVリボスイッチとの間の保存および再配置構造の不適合なパターンを考慮して、およびその類似性が最新の配列分析方法を回避するため、本発明者らは、それらが異なるファミリーを含むと提案する。しかし、それらのコアの類似性は、それらを1つのスーパーファミリーに分類するのに十分示唆的である。SAM−IVリボスイッチに対する三次元構造研究がそれらの分類を精巧にするのに役立ち得る。リボスイッチは、「クラス」および「型」に形成される。クラスは、構造および機能の性質を共有する一連のリボスイッチと定義する一方で、型を使用して、同一クラスに属するが異なる下部構造を保有するRNAを分類する。この専門用語を相同タンパク質の分類に使用した専門用語と関連づけるために、「クラス」は「ファミリー」に対応し、「型」は「サブファミリー」に対応する。
タンパク質を、種々の基準によってファミリーおよびスーパーファミリーに分類する(OrengoおよびThornton 2005)。独自の基準は、配列相同性のみに基づいた(Dayhoffら1976)。他のグループはこの前例を継続するが(例えば、Barkerら1996)、あるところでは構造的または機能的な類似性も考慮している(Murzinら1995)。一般に、ファミリーに分類されたタンパク質は明確な相同性を有する一方で、スーパーファミリーに分類されたタンパク質は、より遠縁なようであり、相同性は「可能性あり」としか見なされない(Murzinら1995;Dayhoffら1976)。SAM−IとSAM−IVリボスイッチとの間の保存および再配置構造の不適合なパターンを考慮して、およびその類似性が最新の配列分析方法を回避するため、本発明者らは、それらが異なるファミリーを含むと提案する。しかし、それらのコアの類似性は、それらを1つのスーパーファミリーに分類するのに十分示唆的である。SAM−IVリボスイッチに対する三次元構造研究がそれらの分類を精巧にするのに役立ち得る。リボスイッチは、「クラス」および「型」に形成される。クラスは、構造および機能の性質を共有する一連のリボスイッチと定義する一方で、型を使用して、同一クラスに属するが異なる下部構造を保有するRNAを分類する。この専門用語を相同タンパク質の分類に使用した専門用語と関連づけるために、「クラス」は「ファミリー」に対応し、「型」は「サブファミリー」に対応する。
SAM−IとSAM−IVリボスイッチとの間の関係と性質が異なる可能性があるが、さらなるリボスイッチファミリーは構造多様性を示す。例えば、preQ1−Iリボスイッチを、ループ配列に基づいてサブファミリーに分配することができる(Rothら2007)。また、以前に報告されたアデノシルコバラミン結合リボスイッチ(Nahviら2004)は通常保存されているドメインを欠く一方で、その3’隣接配列はリガンド認識に不可欠である。このバリアントは、典型的なアデノシルコバラミンリボスイッチよりもプリニルコバラミンに高い親和性を示したので、バリアントの結合コアを変化させることができる。
結果は、リボスイッチRNAが多様な構造を使用して重要なヌクレオチドを同一の結合部位に配置することができることを証明する。I群イントロンおよびRNアーゼ P RNAについての類似の所見を考慮して、この現象が広範なRNAによって示されるとここに結論づける。RNAの構造レパートリーのこの頑強な天然の用途は、RNAが分子感知および遺伝子調節のための強力且つ多用途のポリマーであるという結論を支持する。
2.材料と方法
i.バイオインフォマティクス
SAM−IVモチーフをCMfinder比較ゲノミクスパイプラインを使用して同定し、そのアラインメントを以前に確立されたストラテジーを使用して推測したが(Weinbergら2007;Yaoら2007)、RefSeqのバージョン21(Pruittら2005)を使用した。SAM−Iアラインメントデータは他の場所に公開されていた(BarrickおよびBreaker 2007)。図28に示した保存統計学(conservation statistics)を、以前に報告されているように計算した(Weinbergら2007)。
i.バイオインフォマティクス
SAM−IVモチーフをCMfinder比較ゲノミクスパイプラインを使用して同定し、そのアラインメントを以前に確立されたストラテジーを使用して推測したが(Weinbergら2007;Yaoら2007)、RefSeqのバージョン21(Pruittら2005)を使用した。SAM−Iアラインメントデータは他の場所に公開されていた(BarrickおよびBreaker 2007)。図28に示した保存統計学(conservation statistics)を、以前に報告されているように計算した(Weinbergら2007)。
ii.微生物遺伝学およびプラスミド
遺伝子発現のリボスイッチ調節を試験するために、本発明者らは、カテコール2,3−ジオキシゲナーゼをコードするxylEレポーター遺伝子(Kieserら2000)の上流のS.coelicolor中のSAM−IV含有遺伝子間領域をクローン化した。この酵素はカテコールを2−ヒドロキシムコナートセミアルデヒドに変換し、375nmでのその吸光度によって比色アッセイが可能である。本発明者らはpMT3226(Kieserら2000)(Escherichia coli中で複製され、アプラマイシン耐性遺伝子およびxylEレポーター遺伝子をグリセロール−誘導性プロモーターの下流に含む組み込みStreptoymcesプラスミド)を使用した。xylE遺伝子との翻訳融合物を構築するために、第2のBamHI部位を、プライマー5’− GAAGAGGTGACGTCATGGATCCGAACAAAGGTGTA ATGC(配列番号32)およびその逆方向相補物を使用してQuikChange(Stratagene)によってpMT3226に付加した。SAM−IVを含むS.coelicolor遺伝子間領域を、プライマー5’−CTAGGATCCGCCACGCGTAGCGGCCCTGGTGTGT(配列番号33)および5’− GTAGGATCCACAGCGGTGGGTACGGACATGGCG(BamHI部位に下線、配列番号34)を使用したPCRによってゲノムDNAから増幅した。高G+C DNA産物の増幅を補助するために、PCR反応物は、1.3Mベタイン(Sigma−Aldrich)および5%DMSO(Frackmanら1998)を含んでいた。「pEZ35」をアセンブリするために、pMT3226およびPCR産物をBamHIで切断し、pMT3226由来の小フラグメントをアガロースゲル精製によって取り出し、DNA分子をライゲーションし、正確な配列および配向を配列決定によって検証した。変異リボスイッチ(M1、M2、M3)を含むベクターを、QuikChangeによって作製した。抱合(conjugation)によって、プラスミドをS.coelicolor M145に導入した(Kieserら2000)。接合完了体(exconjugant)の胞子ストックを、MS寒天上にて28℃で増殖させた細胞から回収し(Kieserら2000)、−20℃の15%グリセロール中で保存した。硫酸アプラマイシン(Sigma−Aldrich)を、E.coliについては100μg/mL使用し、S.coelicolorについては50μg/mL使用した。
遺伝子発現のリボスイッチ調節を試験するために、本発明者らは、カテコール2,3−ジオキシゲナーゼをコードするxylEレポーター遺伝子(Kieserら2000)の上流のS.coelicolor中のSAM−IV含有遺伝子間領域をクローン化した。この酵素はカテコールを2−ヒドロキシムコナートセミアルデヒドに変換し、375nmでのその吸光度によって比色アッセイが可能である。本発明者らはpMT3226(Kieserら2000)(Escherichia coli中で複製され、アプラマイシン耐性遺伝子およびxylEレポーター遺伝子をグリセロール−誘導性プロモーターの下流に含む組み込みStreptoymcesプラスミド)を使用した。xylE遺伝子との翻訳融合物を構築するために、第2のBamHI部位を、プライマー5’− GAAGAGGTGACGTCATGGATCCGAACAAAGGTGTA ATGC(配列番号32)およびその逆方向相補物を使用してQuikChange(Stratagene)によってpMT3226に付加した。SAM−IVを含むS.coelicolor遺伝子間領域を、プライマー5’−CTAGGATCCGCCACGCGTAGCGGCCCTGGTGTGT(配列番号33)および5’− GTAGGATCCACAGCGGTGGGTACGGACATGGCG(BamHI部位に下線、配列番号34)を使用したPCRによってゲノムDNAから増幅した。高G+C DNA産物の増幅を補助するために、PCR反応物は、1.3Mベタイン(Sigma−Aldrich)および5%DMSO(Frackmanら1998)を含んでいた。「pEZ35」をアセンブリするために、pMT3226およびPCR産物をBamHIで切断し、pMT3226由来の小フラグメントをアガロースゲル精製によって取り出し、DNA分子をライゲーションし、正確な配列および配向を配列決定によって検証した。変異リボスイッチ(M1、M2、M3)を含むベクターを、QuikChangeによって作製した。抱合(conjugation)によって、プラスミドをS.coelicolor M145に導入した(Kieserら2000)。接合完了体(exconjugant)の胞子ストックを、MS寒天上にて28℃で増殖させた細胞から回収し(Kieserら2000)、−20℃の15%グリセロール中で保存した。硫酸アプラマイシン(Sigma−Aldrich)を、E.coliについては100μg/mL使用し、S.coelicolorについては50μg/mL使用した。
遺伝学実験を開始するために、胞子ストックを氷上で解凍し、1mLのtriton X−100緩衝液(Hodgson 1982)で洗浄し、1mL dH2Oに再懸濁した。この混合物を、25mL培養物中に、H2Oと比較して測定してA450約0.03となるよう接種した(Hodgson 1982)。培地は、夾雑リスクを低下させるためにデキストロース(Becton Dickinson)を含まない24g/Lダイズトリプシンブロス(TSB)、4%グリセロール、20μg/mL硫酸アプラマイシン(ベクターを欠く細胞以外)、および12.5μg/mLナリジクス酸ナトリウム(Sigma−Aldrich)であった。培養物を、250mLフラスコ中にて振とうしながら28℃で50.5時間増殖させた。次いで、無細胞抽出物中のXylE活性を測定した(Kieserら2000)。粗抽出物中に残存する細胞デブリスがXylE酵素曲線にノイズを加えるので、2回の遠心分離後に上清を抽出し、次いで、孔径0.2μmの膜(Whatman)によって濾過し、その後に20分間遠心分離した。反応物は、1mL無カテコールアッセイ緩衝液、100μL無細胞抽出物、10μL 20mMカテコールを含んでおり、Varian 50 Bio分光光度計にて375nmの吸光度を6秒毎に20分間測定した。濾過にもかかわらず、時折デブリスが残存し、このデブリスが全ての可視波長(375nmが含まれる)で吸収があった。480nm(XylE反応生成物によって著しく吸収されるわけではない波長)での変化が20分間にわたって0.0004を超え、且つ375nmに匹敵する規模になった場合、本発明者らは結果を破棄し、新たな反応を準備した。全20分間にわたるA375の変化を使用してXylE活性を評価した。これは、以前に報告されているように(Kieserら2000)、線形範囲のみの使用よりも再現性があり得る。
iii.インライン探索アッセイ
pEZ35プラスミド(上記)中のアプタマーに対応するDNAを、プライマー5’−TAATACGACTCACTATAGGTTTTTCGACAGGTCATGAGTGACAGTC(T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列に下線、配列番号35)および5’−AGGGGTCCGCGCTTGCCGTGGACCTTGCTG(配列番号36)を使用したPCRによって増幅した。以前に記載されたプロトコール(Rothら2007)を使用して、5’32P標識RNA分子を、試験管内転写によってPCR産物から調製し、脱リン酸化し、[γ−32P]ATPで放射性同位元素標識した。以前に記載のように(Rothら2007)、インライン探索反応を準備し、5’32P標識フラグメントを変性PAGEによって分離し、画像化した。
pEZ35プラスミド(上記)中のアプタマーに対応するDNAを、プライマー5’−TAATACGACTCACTATAGGTTTTTCGACAGGTCATGAGTGACAGTC(T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列に下線、配列番号35)および5’−AGGGGTCCGCGCTTGCCGTGGACCTTGCTG(配列番号36)を使用したPCRによって増幅した。以前に記載されたプロトコール(Rothら2007)を使用して、5’32P標識RNA分子を、試験管内転写によってPCR産物から調製し、脱リン酸化し、[γ−32P]ATPで放射性同位元素標識した。以前に記載のように(Rothら2007)、インライン探索反応を準備し、5’32P標識フラグメントを変性PAGEによって分離し、画像化した。
表4.SAM−IおよびSAM−IVによる分子認識。SAM誘導体についてのKD値を列挙し、所与の化合物のKDのSAMのKDに対する比も同様に列挙する。SAM−IのKD値は以前に計算されている(Limら2006)。化合物の構造は、以下のナンバリングスキームを使用して以前に示されていた(Limら2006):SAM(化合物1)、SAH(2)、SAH スルホン(4)、AzaAdoMet(5)、MeAzaAdoMet(6)。
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用する場合、他で明確に示さない限り、単数形「a」、「an」、および「the」には複数形が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「a riboswitch」は複数のかかるリボスイッチが含まれ、「the riboswitch」は1つまたは複数のリボスイッチおよび当業者に公知のその等価物などをいう。
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、その後に記載する事象、環境、または材料が出現または存在してもしなくてもよいことを意味し、ならびに記載には、事象、環境、または材料が出現または存在する例およびそれが出現しないかまたは存在しない例が含まれることを意味する。
範囲を、本明細書中で、「約」1つの特定の値から、および/または「約」別の特定の値までと示すことができる。かかる範囲を示す場合、他で具体的に示さない限り、一方の特定の値からおよび/または他方の特定の値までの範囲も具体的に意図され、開示されると見なされる。同様に、値を先行詞「約」の使用によって近似値で示す場合、特定の値が別の具体的に意図される実施形態を形成し、他で具体的に示されない限り、開示されたと見なすべきであると理解される。他で具体的に示されない限り、各範囲の終点(endpoint)が他の終点に関して有意であり、且つ他の終点に依存しないとさらに理解される。最終的に、例示的に開示された範囲内の全ての各値および値の部分的範囲も具体的に意図され、他で具体的に示さない限り、開示されると見なすべきであると理解すべきである。特定の場合にこれらの実施形態のいくつかまたは全てが例示的に開示されるかどうかと無関係に、上記を適用する。
他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、開示の方法および組成物が属する分野の当業者に一般的に理解される意味を有する。本明細書中に記載のものに類似するか等価な任意の方法および材料を本発明の方法および組成物の実施または試験で使用することができるにもかかわらず、特に有用な方法、デバイス、および材料は記載の通りである。本明細書中で引用した刊行物および刊行物が引用した材料は、特に本明細書中で参考として援用される。本発明は、先行発明によるかかる開示に先行する権利がないと承認していると解釈されない。いかなるリファレンスも先行技術を構成していると承認していない。リファレンスの考察はその著者の主張を記載し、出願人が引用した書類の正確性および適切性に挑む権利を留保する。多数の刊行物が本明細書で参照されているにもかかわらず、かかるリファレンスは任意のこれらの書類が当該分野の一般的知識の一部を形成することを承認しないことが明確に理解される。
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、用語「含む(comprise)」およびこの用語の変形形態(「含む(comprising)」および「含む(comprises)」など)は、「含むが、これらに限定されない」を意味し、例えば、他の添加物、成分、整数、または工程を排除することを意図しない。
当業者は、日常的な実験しか使用せずに、本明細書中に記載の方法および組成物の特定の実施形態に対する多数の等価物を認識するか、確認することができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
参考文献
Claims (28)
- 調節可能な遺伝子発現構築物であって、
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むRNAをコードする核酸分子を含み、該リボスイッチが該RNAの発現を調節し、該リボスイッチおよび該コード領域が非相同であり、該リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチである、構築物。 - 前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項1に記載の構築物。
- 前記リボスイッチが2つ以上のアプタマードメインおよび1つの発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインの少なくとも1つおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項1に記載の構築物。
- 前記アプタマードメインの少なくとも2つが協同的結合を示す、請求項3に記載の構築物。
- リボスイッチであって、該リボスイッチが天然に存在するリボスイッチの非天然誘導体であり、該リボスイッチは、サイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチである、リボスイッチ。
- 前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項5に記載のリボスイッチ。
- 前記リボスイッチが、GEMMモチーフ、SAHモチーフ、preQ1−IIモチーフ、Mocoモチーフ、またはSAM−IVモチーフを含む、請求項6に記載のリボスイッチ。
- 前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化され、該リボスイッチが該トリガー分子によって活性化された場合にシグナルを産生する、請求項5に記載のリボスイッチ。
- 前記リボスイッチが図1または図3のコンセンサス構造の1つを有する、請求項1に記載の構築物。
- 前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインが天然に存在するサイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチに由来する、請求項1に記載の構築物。
- 前記アプタマードメインが、天然に存在するサイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチのアプタマードメインである、請求項10に記載の構築物。
- 前記アプタマードメインが前記天然に存在するリボスイッチのアプタマードメインのコンセンサス構造を有する、請求項10に記載の構築物。
- 前記アプタマードメインが、前記天然に存在するリボスイッチの塩基対の保存的変化のみからなる、請求項10に記載の構築物。
- 目的の化合物を検出する方法であって、該方法が、
サンプルとリボスイッチとを接触させる工程を含み、該リボスイッチが該目的の化合物によって活性化され、該リボスイッチが該目的の化合物によって活性化された場合にシグナルを産生し、該サンプルが該目的の化合物を含む場合に該リボスイッチがシグナルを産生し、該リボスイッチが、サイクリックジGMP応答性リボスイッチまたはサイクリックジGMP応答性リボスイッチの誘導体、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチまたはS−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチの誘導体、preQ1応答性リボスイッチまたはpreQ1応答性リボスイッチの誘導体、Moco応答性リボスイッチまたはMoco応答性リボスイッチの誘導体、またはSAM応答性リボスイッチまたはSAM応答性リボスイッチの誘導体である、方法。 - 前記目的の化合物によって活性化された場合に前記リボスイッチが構造を変化させ、該構造の変化が、構造依存性標識を介してシグナルを産生する、請求項14に記載の方法。
- 前記目的の化合物によって活性化された場合に前記リボスイッチが構造を変化させ、該構造の変化によって該リボスイッチに連結されたRNAの発現が変化し、該発現の変化によってシグナルが産生される、請求項14に記載の方法。
- 前記シグナルが、前記リボスイッチに連結された前記RNAから発現したレポータータンパク質によって産生される、請求項16に記載の方法。
- (a)リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子の遺伝子発現の変化について化合物を試験する工程であって、該変化が該リボスイッチを介し、該リボスイッチが、サイクリックジGMP応答性リボスイッチまたはサイクリックジGMP応答性リボスイッチの誘導体、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチまたはS−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチの誘導体、preQ1応答性リボスイッチまたはpreQ1応答性リボスイッチの誘導体、Moco応答性リボスイッチまたはMoco応答性リボスイッチの誘導体、またはSAM応答性リボスイッチまたはSAM応答性リボスイッチの誘導体である、試験工程、
(b)細胞と工程(a)で遺伝子発現を変化させた化合物との接触によって遺伝子発現を変化させる工程を含み、
該細胞がリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、該化合物が該リボスイッチへの結合によって該遺伝子の発現を阻害する、方法。 - リボスイッチを同定する方法であって、該方法が、
化合物の存在下および非存在下でRNA分子のインライン自発性切断を評価する工程であって、該RNA分子が該化合物によって調節される遺伝子によってコードされる、評価工程を含み、
該RNA分子の該インライン自発性切断パターンの変化がリボスイッチを示し、(a)該RNAがサイクリックジGMP応答性リボスイッチもしくはサイクリックジGMP応答性リボスイッチの誘導体を含み、該化合物がサイクリックジGMPであり、(b)該RNAがS−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチもしくはS−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチの誘導体を含み、該化合物がS−アデノシルホモシステインであり、(c)該RNAがpreQ1応答性リボスイッチもしくはpreQ1応答性リボスイッチの誘導体を含み、該化合物がpreQ1であり、または(d)該RNAがMoco応答性リボスイッチもしくはMoco応答性リボスイッチの誘導体、またはSAM応答性リボスイッチもしくはSAM応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法。 - 遺伝子発現を変化させる方法であって、該方法が、
化合物と細胞とを接触させる工程を含み、ここで、該細胞がサイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、該化合物がサイクリックジGMP応答性リボスイッチ、S−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、preQ1応答性リボスイッチ、Moco応答性リボスイッチ、またはSAM応答性リボスイッチへの結合によって該遺伝子の発現を変化させる接触工程である、方法。 - 前記細胞が、遺伝子発現の変化を必要とすると同定されている、請求項20に記載の方法。
- 前記細胞が細菌細胞である、請求項20に記載の方法。
- 前記化合物が細菌細胞を死滅させるか増殖を阻害する、請求項22に記載の方法。
- 前記化合物および前記細胞が、被験体への該化合物の投与によって接触する、請求項20に記載の方法。
- 前記細胞が前記被験体中の細菌細胞であり、該化合物が前記細菌細胞を死滅させるか、増殖を阻害する、請求項24に記載の方法。
- 前記被験体が細菌に感染している、請求項25に記載の方法。
- 前記化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与する、請求項20に記載の方法。
- 前記化合物がバイオフィルム中の細菌増殖を阻害する、請求項20に記載の方法。
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