JP2021046433A - 人工ヌクレオシド及び人工ヌクレオチド並びに人工オリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
1.下記式(I):
Z1及びZ2はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基保護基又はリン含有基であり、
R1、R2、R3及びR4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基又はC1−6アルキル基若しくはC2−6アルケニル基(該C1−6アルキル基及びC2−6アルケニル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、C1−6アルコキシ基及びシアノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)であり、
Yは、NR5R6
(該R5及びR6はそれぞれ独立して、水素原子、C1−6アルキル基若しくはC2−6アルケニル基(該C1−6アルキル基及びC2−6アルケニル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、C1−6アルコキシ基、C2−6アルケニルオキシ基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−6アルケニルオキシカルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルキルカルボニルオキシ基、C1−6アルキルカルボニルアミノ基及びC1−6アルコキシカルボニルアミノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)又はC7−10アラルキル基(該C7−10アラルキル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6アルコキシ基、C2−6アルケニルオキシ基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−6アルケニルオキシカルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキル基、C1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルキルカルボニルオキシ基、C1−6アルキルカルボニルアミノ基及びC1−6アルコキシカルボニルアミノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)であるか、又は
R5及びR6は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、3−11員含窒素非芳香族ヘテロ環基(該3−11員含窒素非芳香族ヘテロ環基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6アルコキシ基、C2−6アルケニルオキシ基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−6アルケニルオキシカルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキル基、C1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルキルカルボニルオキシ基、C1−6アルキルカルボニルアミノ基及びC1−6アルコキシカルボニルアミノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)を形成している)、又は
C2−9芳香族複素環式基(該C2−9芳香族複素環式基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6アルコキシ基、C2−6アルケニルオキシ基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−6アルケニルオキシカルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキル基、C1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルキルカルボニルオキシ基、C1−6アルキルカルボニルアミノ基及びC1−6アルコキシカルボニルアミノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)であり、
nは、1から3の整数である。ここで、nが2又は3であるとき、2又は3のR3及びR4はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。)で示される化合物、又はその塩。
3.R1、R2、R3及びR4が、水素原子である、1.又は2.に記載の化合物又はその塩。
4.Yが、NR5R6であり、該R5及びR6はそれぞれ独立して、水素原子又はC1−3アルキル基である、1.から3.の何れか一つに記載の化合物又はその塩。
5.Yが、NR5R6であり、該R5及びR6は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、モルホリンを形成している、1.から3.の何れか一つに記載の化合物又はその塩。
6.Yが、ピリジル基、イミダゾリル基又はベンゾイミダゾリル基である、1.から3.の何れか一つに記載の化合物又はその塩。
7.nが2である、1.から6.の何れか一つに記載の化合物又はその塩。
8.Z1が、水素原子又はヒドロキシ基保護基である、1.から7.の何れか一つに記載の化合物又はその塩。
9.Z2が、水素原子又はリン含有基である、1.から8.の何れか一つに記載の化合物又はその塩。
10.Z2が、ヒドロキシ基保護基である、1.から8.の何れか一つに記載の化合物、又はその塩。
R1、R2、R3及びR4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基又はC1−6アルキル基若しくはC2−6アルケニル基(該C1−6アルキル基及びC2−6アルケニル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、C1−6アルコキシ基及びシアノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)であり、
Yは、NR5R6(該R5及びR6はそれぞれ独立して、水素原子、C1−6アルキル基若しくはC2−6アルケニル基(該C1−6アルキル基及びC2−6アルケニル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、C1−6アルコキシ基、C2−6アルケニルオキシ基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−6アルケニルオキシカルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルキルカルボニルオキシ基、C1−6アルキルカルボニルアミノ基及びC1−6アルコキシカルボニルアミノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)又はC7−10アラルキル基(該C7−10アラルキル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6アルコキシ基、C2−6アルケニルオキシ基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−6アルケニルオキシカルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキル基、C1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルキルカルボニルオキシ基、C1−6アルキルカルボニルアミノ基及びC1−6アルコキシカルボニルアミノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)であるか、又はR5及びR6は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、3−11員含窒素非芳香族ヘテロ環基(該3−11員含窒素非芳香族ヘテロ環基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6アルコキシ基、C2−6アルケニルオキシ基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−6アルケニルオキシカルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキル基、C1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルキルカルボニルオキシ基、C1−6アルキルカルボニルアミノ基及びC1−6アルコキシカルボニルアミノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)を形成している)、又は
C2−9芳香族複素環式基(該C2−9芳香族複素環式基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6アルコキシ基、C2−6アルケニルオキシ基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−6アルケニルオキシカルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキル基、C1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルキルカルボニルオキシ基、C1−6アルキルカルボニルアミノ基及びC1−6アルコキシカルボニルアミノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)であり、
nは、1から3の整数である。ここで、nが2又は3であるとき、2又は3のR3及びR4はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。)で示されるヌクレオシド構造を1以上含む人工オリゴヌクレオチド又はその製薬上許容される塩。
13.R1、R2、R3及びR4が、水素原子である、11.又は12.に記載の人工オリゴヌクレオチド又はその製薬上許容される塩。
14.Yが、NR5R6であり、該R5及びR6はそれぞれ独立して、水素原子又はC1−3アルキル基である、11.から13.の何れか一つに記載の人工オリゴヌクレオチド又はその製薬上許容される塩。
15.Yが、NR5R6であり該R5及びR6は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、モルホリンを形成している、11.から13.の何れか一つに記載の人工オリゴヌクレオチド又はその製薬上許容される塩。
16.Yが、ピリジル基、イミダゾリル基又はベンゾイミダゾリル基である、11.から13.の何れか一つに記載の人工オリゴヌクレオチド又はその製薬上許容される塩。
17.nが2である、11.から16.の何れか一つに記載の人工オリゴヌクレオチド又はその製薬上許容される塩。
本明細書中「n−」はノルマル、「i−」はイソ、「sec−」はセカンダリー、「tert−」はターシャリー、「m−」はメタ、「p−」はパラを意味する。「Ph」はフェニル、「Me」はメチル、「Pr」はプロピル、「Bu」はブチル、「DMTr」はジメトキシトリチルを意味する。
また、本明細書において「2−オキソ−ピリミジン−1−イル基」及び「2−チオキソ−ピリミジン−1−イル基」とは、「2−オキソ−1H−ピリミジン−1−イル基」及び「2−チオキソ−1H−ピリミジン−1−イル基」の「1H」を省略して記載したものであり、「2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基」及び「2−チオキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基」、並びに「1H−ピリミジン−2−オン−1−イル」及び「1H−ピリミジン−2−チオン−1−イル」とそれぞれ同義である。さらにこれらの部分構造に互変異性体が存在する場合、そのうちの一つの名称ですべての互変異性体を代表するものとする。
保護基により置換された官能基とは、官能基が有する水素原子が保護基により置換された官能基を意味する。
前記「C7−10アラルキル基」に置換基が置換されている場合、特に限定がない限り、該置換基は独立して、C6−10芳香族炭素環又はC2−9芳香族複素環部分に置換されていても、C1−4アルキル部分に置換されていても、両方に置換されていてもよい。
またC6−10アリールオキシ基は、「C6−10芳香族炭素環式基」がオキシ基に結合した基を意味する。
「テトラヒドロチオピラニル基」としては、テトラヒドロチオピラン−2−イル基等が挙げられる。前記置換基群Bから単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されているテトラヒドロチオピラニル基としては、4−メトキシテトラヒドロチオピラン−4−イル基等が挙げられる。
「芳香族スルホニル基」とは、C6−10芳香族炭素環式基又はC2−9芳香族複素環式基(該C6−10芳香族炭素環式基及びC2−9芳香族複素環式基は、無置換であるか又は、前記置換基群Bより単独に若しくは異なって選ばれる1つ以上の置換基で置換されている)がスルホニル基に結合した1価の置換基を意味する。芳香族スルホニル基としては、例えば、ベンゼンスルホニル基、p−トルエンスルホニル基等が挙げられる。
C1−6アルコキシ基で置換されたC1−6アルコキシ基で置換されたC1−6アルキル基としては、2−メトキシエトキシメチル基等が挙げられる。
ハロゲン原子で置換されたC1−6アルコキシ基で置換されたC1−6アルキル基としては、2,2,2−トリクロロエトキシメチル基、ビス(2−クロロエトキシ)メチル基等が挙げられる。
ハロゲン原子又はトリアルキルシリル基で置換されたC1−6アルコキシカルボニル基としては、2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル基、2−トリメチルシリルエトキシカルボニル基等が挙げられる。
無置換であるか、又は前記置換基群Bから単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基でC6−10芳香族炭素環部分が置換されているアラルキルオキシカルボニル基としては、ベンジルオキシカルボニル基、4−メトキシベンジルオキシカルボニル基、3,4−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、2−ニトロベンジルオキシカルボニル基、4−ニトロベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。
例えば、前記「ヒドロキシ基保護基」として挙げられたものの他、ジスルフィド結合を形成する基も含む。ジスルフィド結合を形成する基としては、アルキルチオ基(メチルチオ基、エチルチオ基、tert−ブチルチオ基)及びC6−10芳香族炭素環式基で置換されたアルキルチオ基(ベンジルチオ等)等が挙げられる。
好ましいスルファニル基保護基は、脂肪族アシル基又は芳香族アシル基である。さらに好ましくは、ベンゾイル基である。
例えば、前記「ヒドロキシ基保護基」の保護基として挙げられたものが挙げられる。
Bxにおける好ましいアミノ基保護基は、脂肪族アシル基、芳香族アシル基又はC6−10アリールオキシ基で置換されたC1−6アルキルカルボニル基である。より好ましくは、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、モノメトキシベンゾイル基、ジメトキシベンゾイル基、トリメトキシベンゾイル基又はフェノキシアセチル基であり、さらに好ましくは、アセチル基、イソブチリル基又はベンゾイル基であり、特に好ましくはベンゾイル基である。
本実施形態の人工ヌクレオシド及び人工ヌクレオチドは、下記式(I)で示される化合物、又はその塩である。2’位酸素原子上のカルバモイルエチル基窒素原子に、アルキル基を介してアミノ基あるいは複素環基が導入されていることで、ヌクレアーゼ耐性に非常に優れるオリゴヌクレオチドを構成することができる。
R1、R2、R3及びR4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、C1−6アルキル基又はC2−6アルケニル基であり、該C1−6アルキル基及びC2−6アルケニル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、C1−6アルコキシ基及びシアノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている。
C2−9芳香族複素環式基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6アルコキシ基、C2−6アルケニルオキシ基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−6アルケニルオキシカルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキル基、C1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルキルカルボニルオキシ基、C1−6アルキルカルボニルアミノ基及びC1−6アルコキシカルボニルアミノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている。
Bxの具体例としては、下記式(V−1)から(V−10)で示される基が挙げられる。
Raにおけるアミノ基保護基は、好ましくは、C1−6アルキル基、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、C6−10アリールオキシ基で置換されたC1−6アルキルカルボニル基である。
Rbにおけるアミノ基保護基は、好ましくは、C1−6アルキル基、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、C6−10アリールオキシ基で置換されたC1−6アルキルカルボニル基である。
Z1及びZ2におけるヒドロキシ基保護基としては、既述の「核酸合成の際に安定してヒドロキシ基を保護し得る保護基」であるヒドロキシ基保護基が挙げられる。好ましくはC1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、テトラヒドロピラニル基、シリル基、脂肪族スルホニル基、芳香族スルホニル基等が挙げられる。ここで、C1−6アルキル基及びC2−6アルケニル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、C1−6アルコキシ基(C1−6アルコキシ基は、無置換であるか、又は前記置換基群Aから単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)、C6−10芳香族炭素環式基及びC2−9芳香族複素環式基(C6−10芳香族炭素環式基及びC2−9芳香族複素環式基は、無置換であるか、又は前記置換基群Bから単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1から3個の置換基により置換されている。また、Z1がシリル基であるとき、シリル基を構成する1個の置換基は、3’位の酸素原子に置き換わっていてもよく、Z2がシリル基であるとき、シリル基を構成する1個の置換基は、5’位の酸素原子に置き換わっていてもよい。また、Z1及びZ2がシリル基であるとき、Z1及びZ2は、それらがそれぞれ結合する酸素原子と一緒になって、下記式(III)で示される基を形成してもよい。
Z1及びZ2におけるヒドロキシ基保護基は、さらに好ましくは、C1−6アルキル基又はシリル基である。
ここで、C1−6アルキル基は、C6−10芳香族炭素環式基(C6−10芳香族炭素環式基は、無置換であるか、又は前記置換基群Bから単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1から3個の置換基により置換されている。またZ1及びZ2は、それらがそれぞれ結合する酸素原子と一緒になって、前記式(III)で示される基を形成してもよい。
式(Z2−1):−P(ORX1)(NRX2 2)
式中、RX1及びRX2は、それぞれ独立してC1−6アルキル基であり、該アルキル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、C1−6アルコキシ基、シアノ基、C6−10芳香族炭素環式基及びC2−9芳香族複素環式基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている。
式中、RX3は酸素原子又は硫黄原子であり、RX4はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基保護基、C1−6アルキル基、又はC6−10芳香族炭素環式基であり、該アルキル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、C1−6アルコキシ基、シアノ基、C6−10芳香族炭素環式基及びC2−9芳香族複素環式基からなる置換基群から単独に若しくは異なって選ばれる1つ以上の置換基で置換されており、該芳香族炭素環式基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、C1−6アルコキシ基、C1−6アルキル基及びシアノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている。
式中、RX5は、酸素原子又は硫黄原子である。RX6は水素原子、ヒドロキシ基保護基、又はC6−10芳香族炭素環式基である。
式(Z2−4):−P(ORX1)(NRX2 2)
式中、RX1はC1−6アルキル基又は、シアノ基で置換されたC1−6アルキル基であり、RX2はC1−6アルキル基である。
式(Z2−5):−P(=O)(OH)2
式(Z2−6):−P(=O)H(OH)
リン含有基は、より好ましくは、シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ基(式:−P(OC2H4CN)(N(i−Pr)2)で示される基)又はヒドロキシホスフィニル基(式:−P(=O)H(OH)で示される基)である。
その他の様態として、上記式(I)で示される化合物、又はその塩を製造する過程においては、その中間体としてZ2がヒドロキシ基保護基であることが好ましい。そのため、ヒドロキシ基保護基は、核酸合成の際に安定してヒドロキシ基を保護し得るものであれば限定されず、保護基の種類、構造は、それぞれの人工ヌクレオチド及び人工ヌクレオシドにおいて同一でも異なっていてもよい。Z2がヒドロキシ基保護基である場合には、当該ヒドロキシ基保護基は、好ましくは、アセチル基、tert−ブチル基、tert−ブトキシメチル基、メトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、1−エトキシエチル基、1−(2−クロロエトキシ)エチル基、2−トリメチルシリルエチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、p−フェニルベンゾイル基、2,6−ジクロロベンジル基、レブリノイル基、ジフェニルメチル基、p−ニトロベンジル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、tert−ブチルジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ギ酸ベンゾイル基、クロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、ピバロイル基、イソブチリル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、メタンスルホニル基、p−トルエンスルホニル基又はトリフルオロメタンスルホニル基である。当該ヒドロキシ基保護基は、より好ましくは、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、tert−ブチルジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基又はトリイソプロピルシリル基である。
R1は、好ましくは水素原子又はC1−3アルキル基であり、より好ましくは水素原子である。R2は、好ましくは水素原子又はC1−3アルキル基であり、より好ましくは水素原子である。
R3は、好ましくは水素原子又はC1−3アルキル基であり、より好ましくは水素原子である。R4は、好ましくは水素原子又はC1−3アルキル基であり、より好ましくは水素原子である。
R5は、好ましくは水素原子又はC1−3アルキル基であり、より好ましくはメチル基である。
R6は、好ましくは水素原子又はC1−3アルキル基であり、より好ましくはメチル基である。
R5及びR6がこれらが結合している窒素原子と一緒になって形成する3−11員含窒素非芳香族ヘテロ環は、好ましくは4−8員含窒素非芳香族ヘテロ環のうち、メチレン基を4乃至6個含む環であり、ピペリジン、ピロリジン、モルホリン、チオモルホリン、ホモピペリジン、ホモモルホリン等が挙げられる。より好ましくは、さらに、環を構成する原子に酸素原子又は硫黄原子を含む環であり、モルホリン、チオモルホリン、ホモモルホリンが挙げられる。特に好ましくは、モルホリンである。また、該4−8員含窒素非芳香族ヘテロ環は無置換であることが好ましい。
本実施形態の人工オリゴヌクレオチドは、下記式(II)で示されるヌクレオシド構造を1以上含む人工オリゴヌクレオチド又はその製薬上許容される塩である。
YがC2−9芳香族複素環式基である場合、該C2−9芳香族複素環式基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6アルコキシ基、C2−6アルケニルオキシ基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−6アルケニルオキシカルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキル基、C1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルキルカルボニルオキシ基、C1−6アルキルカルボニルアミノ基及びC1−6アルコキシカルボニルアミノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている。
人工オリゴヌクレオチドにおける式(II)で示されるヌクレオシド構造の位置及び数は特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。例えば式(II)で示されるヌクレオシド構造を、オリゴヌクレオチドの3’末端又は5’末端に含有してもよい。3’末端に含まれる場合、例えば、以下の式(VI)で示される構造となる。
また、5’末端に含まれる場合、例えば、以下の式(VII)で示される構造となる。
ここで「由来する基」とは、対象となる分子から水素原子、ヒドロキシ基等を取り除いて形成される基を意味する。
例えば、人工オリゴヌクレオチドのリン酸エステル部分は、天然の核酸が有するホスホジエステル結合が挙げられるが、それに限らず、修飾されたホスホジエステル結合でもよい。ホスホジエステル結合の修飾の例としては、例えば、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、キラル−メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、ボラノホスフェート化等が挙げられる。
人工オリゴヌクレオチド中の式(II)で示されるヌクレオシド構造以外の糖部分を有するヌクレオシドとしては、天然のリボース若しくはデオキシリボース、修飾されたリボース若しくはデオキシリボース等が挙げられる。公知の修飾としては、例えば、特開平10−304889号公報国際公開第2005/021570号、特開平10−195098号公報、特表2002−521310号公報、国際公開第2007/143315号、国際公開第2008/043753号、国際公開第2008/029619号、国際公開第2008/049085号、国際公開第2011/052436号において、開示されているヌクレオチド等が挙げられる。前記文献には下記のヌクレオチドが開示されている。:ヘキシトールヌクレオチド(HNA)、シクロヘキセンヌクレオチド(CeNA)、ペプチド核酸(PNA)、グリコール核酸(GNA)、トレオヌクレオチド(TNA)、モルホリノ核酸、トリシクロ−DNA(tcDNA)、2’−O−メチル化ヌクレオシド、2’−MOE(2’−O−メトキシエチル)化ヌクレオチド、2’−AP(2’−O−アミノプロピル)化ヌクレオチド、2’−フルオロ化ヌクレオチド、2’−F−アラビノヌクレオチド(2’−F−ANA)、4’−CH2−O−2’ 化ヌクレオチド(LNA、Locked nucleic acid)、架橋化ヌクレオチド(BNA(Bridged Nucleic Acid))、2’−O−メチルカルバモイルエチル化ヌクレオチド(MCE)。
ハロアルカンジイル基は、前記アルカンジイル基の任意の位置の水素原子が、1以上の前記ハロゲン原子で置換されてなる基を意味する。
非芳香族炭素環とは、環を構成する原子が全て炭素原子であり、環を構成する原子数が3から10である芳香族の単環、縮合環、スピロ環又は橋掛け環であり、環中に二重結合又は3重結合を含んでいてもよい環を意味する。非芳香族炭素環としては、例えば、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタン、シクロヘキセン、シクロヘキサジエン、ビシクロ[4.4.0]デカン、アダマンタン等が挙げられる。
本実施形態の人工オリゴヌクレオチドは、その製薬上許容される塩を含有する。該塩の具体例、調製方法等は既述の人工ヌクレオシド及び人工ヌクレオチドにおける塩と同様である。
人工オリゴヌクレオチド又はその製薬上許容される塩は、溶媒和物(例えば、水和物等)及び/又は結晶多形を形成する場合があり、本発明はそのような各種の溶媒和物及び結晶多形も包含する。溶媒和物の具体例は既述の人工ヌクレオシド及び人工ヌクレオチドと同様である。
経口投与用組成物としては、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体に溶解させた懸濁液又は溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。
非経口、硬膜下腔、又は、脳室内投与用組成物としては、バッファー、希釈剤及びその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。
さらに、本発明の人工オリゴヌクレオチドは、前記標的遺伝子の発現が原因となる疾患等を改善又は予防するために、改善又は予防に有効な用量レベルで投与することができる。
例えば、R1及びR2の少なくとも一方がアルキル基である化合物Aを合成するためには、まず、ヒドロキシ基の保護・脱保護反応により3’位のヒドロキシ基が保護され5’位のヒドロキシ基が脱保護された化合物(化合物A−2)を得る。次に、化合物A−2の5’位のヒドロキシ基を酸化し、R1に対応するアルキル金属試薬又はグリニャール試薬などを用いて所望のR1を導入できる。また必要であれば、もう一度5’位のヒドロキシ基を酸化し、R2に対応するアルキル金属試薬又はグリニャール試薬などを用いて所望のR2を導入できる。得られた化合物の3’位の保護されたヒドロキシ基を脱保護することで、R1及びR2の少なくとも一方がアルキル基である化合物Aを合成できる。
1又は複数のR3、1又は複数のR4、及びYがアルキル基部分に結合した一級アルキルアミンを用いて、エステル−アミド交換反応により化合物Bを得ることができる。エステル−アミド交換反応としては、例えば、溶媒中、1〜100当量の該一級アルキルアミンを反応させる方法が挙げられる。
また、当業者に公知の方法により化合物Aを加水分解してカルボン酸誘導体とした後に、該カルボン酸誘導体と、1又は複数のR3、1又は複数のR4、及びYがアルキル基部分に結合した一級アルキルアミンとの縮合反応により得ることができる。
例えば、化合物Aをアルコール溶媒中、1〜20当量の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を反応させて、カルボン酸誘導体とした後、該カルボン酸誘導体を、溶媒中、塩酸1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド及び1−ヒドロキシベンゾトリアゾール存在下、1〜10当量の該一級アルキルアミンを反応させる方法が挙げられる。
化合物Bのヒドロキシ基を、当業者に公知な反応(例えば、モノ置換−クロロ(アルコキシ)ホスフィン類又はジ置換−アルコキシホスフィン類を用いる反応)によりリン酸化することにより、化合物Cを得ることができる。リン酸化反応の具体的な例としては、溶媒中、2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを反応させる方法、及び、溶媒中、トリス−(1,2,4−トリアゾリル)ホスファイトを反応させる方法等が挙げられる。
リン酸化反応の反応部位は、R1、R2、R3、R4、Y及びBxと空間的に離れたヒドロキシ基であるため、多様なR1、R2、R3、R4、Y及びBxの構造に対して、上記のリン酸化反応は適用可能である。
13C−NMRデータが記載されている場合には、125MHz(Varian AS500;Varian社製)で測定し、測定溶媒に由来するシグナルを内部標準としたシグナルの化学シフトδ(単位:ppm)を表す。
31P−NMRデータが記載されている場合には202MHz(Varian AS500;Varian社製)で測定し、リン酸を内部標準としたシグナルの化学シフトδ(単位:ppm)を表す。
条件1:
装置:Bruker microTOF II
測定溶媒:メタノール
測定モード:陽イオン又は陰イオン
条件2:
装置:Bruker ultrafleXtreme
Matrix:10 mg/mLクエン酸水素二アンモニウムを含む飽和3−ヒドロキシピコリン酸アセトニトリル溶液
Target plate:MTP 384 target plate polished steel BC
測定モード:Linear + 陽イオン
シリカゲルカラムクロマトグラフィーでの精製は、特に記述がない場合は、関東化学(株)製シリカゲルN60を用いた。
ヌクレオシド類縁体:(2R,3R,4R,5R)−2−([ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ]メチル)−5−(5−メチル−2,4−ジオキソ−3,4−ジヒドロピリミジン−1(2H)− イル)−4−(3−オキソ −3−((2−(ピリジン−2−イル)エチル)アミノ)プロポキシ)テトラヒドロフラン−3−イル (2−シアノエチル)ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物3)の合成
化合物1(オーガニック・アンド・バイオモレキュラー・ケミストリー、第12巻、6457ページ(2014年))に記載の方法に準じて合成した)(150mg、0.2mmol)を脱水メタノール(1.6ml)に溶解させた。その溶液に2−(2−アミノエチル)ピリジン(0.4ml)を加え、55℃で42時間反応させた。反応後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて酢酸エチルで抽出した。その有機層を回収し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール)により精製し、化合物2を得た(73 mg、収率 50%)。
MS (ESI):[M−H]− 735.3022.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz):δ1.34 (1H, s), 2.29−2.56 (2H, m), 2.90−3.03 (2H, m), 3.35−3.51 (2H, m), 3.52−3.62 (2H, m), 3.63−3.85 (8H, m), 3.90−3.96 (1H, m), 4.02 (1H, t, J = 4.7), 4.07−4.15 (1H, m), 4.50 (1H, t, J = 4.8), 5.02−5.19 (1H, brs), 6.01 (1H, d, J = 4.6), 6.81 (1H, d, J = 8.4), 7.11−7.25 (4H, m), 7.27−7.43 (9H, m), 7.55−7.66 (2H, m), 8.54 (1H, d, J = 5.0), 10.48−10.60 (1H, brs).
13C NMR (CDCl3, 125 MHz):δ171.5, 164.5, 159.3, 158.8, 158.8, 151.0, 148.8, 144.4, 137.3, 135.6, 135.5, 135.4, 130.2, 128.3, 128.1, 127.2, 123.7, 122.0, 113.4, 111.2, 87.0, 84.0, 82.5, 77.4, 77.2, 76.9, 69.5, 66.0, 63.0, 55.4, 55.3, 39.5, 36.8, 35.7, 11.9.
化合物2 (73mg、0.1mmol)の脱水ピリジン、脱水トルエン及び脱水ジクロロメタン溶液を共沸により脱水し、その後脱水ジクロロメタン(1ml)に溶解させた。その溶液にN,N−ジイソプロピルエチルアミン(30μl、0.13mmol)、2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(30μl、0.17mmol)を加え、室温で2時間反応させた。反応後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール)により精製し、化合物3を得た(50mg、収率 54%)。
MS (ESI):[M+Na]+ 959.4079.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) :δ0.87−0.97 (3H, m), 0.99−1.13 (9H, m), 1.27−1.42 (3H, m), 2.21−2.32 (1H, m), 2.33−2.47 (2H, m), 2.50−2.63 (1H, m),2.80−2.94 (1H, m), 3.00−3.14 (1H, m), 3.17−3.29 (1H, m), 3.32−4.05 (17H, m), 4.07−4.26 (1H, m), 4.29−4.43 (1H, m), 5.81−6.03 (1H, m), 6.63−6.89 (5H, m), 7.00−7.24 (8H, m), 7.29−7.41 (2H, m), 7.46−7.56 (1H, m), 7.56−7.68 (1H, m), 8.41−8.59 (1H, m), 9.86−10.78 (1H, m).
13C NMR (CDCl3, 125 MHz):δ171.2, 171.1, 164.1, 164.1, 159.3, 159.3, 158.8, 151.0, 149.2, 144.3, 144.2, 136.8, 136.8, 135.4, 135.4, 135.3, 135.0, 134.9, 130.2, 128.4, 128.3, 128.1, 127.3, 123.5, 121.7, 117.9, 117.5, 113.4, 111.5, 87.7, 87.6, 87.1, 87.0, 83.7, 83.2, 82.6, 82.1, 77.4, 77.2, 76.9, 70.8, 70.7, 70.6, 70.5, 67.8, 67.3, 62.4, 62.2, 58.7, 58.5, 57.9, 57.7, 55.4, 55.4, 55.3, 43.4, 43.3, 43.3, 43.2, 39.6, 39.5, 37.4, 37.3, 24.8, 24.8, 24.7, 24.7, 24.6, 20.6, 20.5, 20.3, 20.2, 12.0, 11.9.
31P NMR (CDCl3, 202 MHz):δ151.0, 150.7.
ヌクレオシド類縁体:(2R,3R,4R,5R)−2−([ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ]メチル)−4−(3−((2−(ジメチルアミノ)エチル)アミノ)−3−オキソプロポキシ)−5−(5−メチル−2,4−ジオキソ−3,4−ジヒドロピリミジン−1(2H)−イル)テトラヒドロフラン−3−イル(2−シアノエチル)ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物5)の合成
化合物1(オーガニック・アンド・バイオモレキュラー・ケミストリー、第12巻、6457ページ(2014年))に記載の方法に準じて合成した) (660mg、0.85mmol)のメタノール(6.8ml)溶液にN,N−ジメチルエチレンジアミン(1.7ml、15.6mmol)を加え、55℃で24時間撹拌した。反応後、水を加えジクロロメタンで抽出した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール)により精製し、化合物4を得た(286mg、収率 48%)。
MS (ESI):[M+H]+ 703.3331.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) :δ1.38 (3H, s), 2.23 (6H, s), 2.33 (1H, d, J = 16.3), 2.38−2.68 (3H, m),3.21−3.32 (1H, m),3.36−3.59 (3H, m),3.71−3.89 (7H, m),3.96−4.10 (2H, m),4.13−4.18 (1H, m),4.55 (1H, t, J = 4.6),6.04 (1H, d, J = 4.6),6.84 (4H, d, J = 8.5), 7.26−7.33 (7H, m), 7.38−7.44 (2H, m), 7.65 (1H, s).
13C NMR (CDCl3, 125 MHz) :δ171.6, 164.5, 158.8, 158.8, 152.1, 144.5, 135.5, 135.4, 135.3, 130.2, 130.2, 128.2, 128.1, 127.3, 113.4, 111.8, 87.1, 86.7, 84.5, 83.1, 69.6, 65.7, 63.3, 57.6, 55.4, 44.3, 36.7, 34.8, 11.9.
化合物4 (960mg、1.37mmol)の脱水ピリジン、脱水トルエン及び脱水ジクロロメタン溶液を共沸により脱水し、その後脱水ジクロロメタン(13.4ml)に溶解させた。その溶液にN,N−ジイソプロピルエチルアミン(690μl、4.0mmol)、2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(730μl、3.3mmol)を加え、室温で2時間反応させた。反応後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで抽出した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール)により精製し、化合物5を得た(408mg、収率 33%)。
MS (ESI):[M+H]+ 903.4401.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz):δ0.95−1.03 (3H, m), 1.11−1.20 (9H, m), 1.33−1.40 (3H, m), 2.18−2.26 (6H, m), 2.33−2.57 (5H, m), 2.62−2.70 (1H, m), 3.24−3.39 (3H, m), 3.46−3.69 (4H, m), 3.73−3.83 (7H, m), 3.85−4.15 (3H, m), 4.17−4.31 (1H, m), 4.43−4.55 (1H, m), 5.99−6.07 (1H, m), 6.60−6.74 (1H, m), 6.76−6.91 (4H, m), 7.27−7.35 (7H, m), 7.37−7.46 (2H, m), 7.64−7.73 (1H, m).
13C NMR (CDCl3, 125MHz):δ171.0, 170.9, 164.1, 164.1, 158.9, 151.0, 150.9, 144.4, 144.3, 135.4, 135.4, 135.4, 135.3, 135.3, 130.4, 130.3, 128.5, 128.4, 128.1, 128.1, 127.3, 118.0, 117.6, 113.4, 111.5, 111.3, 88.1, 88.1, 87.1, 87.0, 83.0, 82.9, 82.3, 81.6, 70.8, 70.7, 70.6, 67.8, 67.4, 62.3, 61.9, 58.7, 58.6, 58.1, 58.0, 57.8, 55.4, 55.4, 55.4, 45.1, 45.1, 43.5, 43.4, 43.3, 43.2, 37.2, 37.1, 24.8, 24.8, 24.7, 24.7, 20.6, 20.6, 20.4, 20.3, 11.9, 11.9.
31P NMR (CDCl3, 202 MHz):δ150.8, 150.5.
ヌクレオシド類縁体:(2R,3R,4R,5R)−2−((ビス (4−メトキシフェニル)(フェニル) メトキシ]メチル)−5−(5−メチル−2,4−ジオキソ−3,4−ジヒドロピリミジン−1(2H)− イル)−4−(3−((2−モルホリノエチル)アミノ)−3−オキソプロポキシ)テトラヒドロフラン−3−イル (2−シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物7)の合成
化合物1((オーガニック・アンド・バイオモレキュラー・ケミストリー、第12巻、6457ページ(2014年))に記載の方法に準じて合成した;200mg、0.27mmol)のメタノール(2.2ml)溶液に、4−(2−アミノエチル)モルホリン(1.7ml、15.6mmol)を加え、55℃で23時間撹拌した。反応後、水を加え、ジクロロメタンで抽出した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(富士シシリア社製アミンシリカNH、展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール)により精製し、化合物6を得た(140mg、収率 70%)。
MS (ESI):[M+H]+ 745.3431.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz):δ1.36 (3H, s), 2.25−2.70 (8H, m), 3.26−3.56 (4H, m), 3.61−3.75 (4H, m), 3.75−3.89 (7H, m), 4.01−4.12 (2H, m), 4.12−4.23 (1H, m), 4,58 (1H, t, J = 4.4), 4.65−5.15 (1H, brs), 6.07 (1H, d, J = 5.1), 6.71 (1H, t, J =5.3), 6.84 (5H, d, J =8.9), 7.26−7.33 (6H, m), 7.35−7.44(2H, m), 7.66 (1H, s), 9.05−9.57 (1H, brs).
13C NMR (CDCl3, 125 MHz):δ171.4, 163.9, 158.9, 158.8, 151.4, 144.4, 135.5, 135.4, 135.3, 130.2, 130.2, 128.2, 128.1, 127.3, 113.4, 111.7, 87.2, 86.5, 86.5, 84.4, 82.7, 77.4, 77.2, 76.9, 69.5, 66.5, 65.7, 63.3, 57.6, 55.4, 55.4, 53.4, 35.4, 35.2, 11.8.
化合物6 (270mg、0.36mmol)の脱水ピリジン、脱水トルエン及び脱水ジクロロメタンの溶液を共沸により脱水し、その後脱水ジクロロメタン(3.6ml)に溶解させた。その溶液にN,N−ジイソプロピルエチルアミン(190μl、1.1mmol)、2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(190μl、0.85mmol)を加え、室温で3時間反応させた。反応後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで抽出した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール)により精製し、化合物7を得た(200mg、収率 58%)。
MS (ESI):[M+H]+ 945.4496.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz):δ0.90−1.05 (2H, m),1.06−1.24 (10H, m),1.27−1.42 (3H, m), 2.17−2.77 (11H, m), 3.25−3.60 (6H, m), 3.60−4.00 (12H, m), 4.00−4.16 (2H, m), 4.16−4.33 (1H, m), 4.42−4.59 (1H, m), 5.95−6.12 (1H, m), 6.62−6.92 (5H, m), 7.27−7.36 (6H, m), 7.37−7.49 (2H, m), 7.65−7.86 (1H, m), 9.41−9.91 (1H, brs).
13C NMR (CDCl3, 125 MHz):δ171.0, 163.9, 158.9, 150.7, 150.6, 144.3, 144.3, 135.4, 135.3, 135.2, 130.4, 130.3, 128.4, 128.4, 128.1, 128.1, 127.4, 127.3, 117.9, 117.6, 113.5, 113.2, 111.3, 111.3, 88.7, 88.6, 88.5, 88.4, 87.1, 87.0, 82.9, 82.7, 82.4, 82.2, 81.7, 81.5, 77.4, 77.2, 76.9, 70.6, 70.4, 68.0, 67.7, 67.0, 61.8, 57.5, 57.5, 55.5, 55.5, 55.3, 55.3, 53.5, 43.4, 43.3, 37.2, 36.0, 24.8, 24.7, 20.6, 20.6, 20.4, 20.3, 11.9, 11.9.
31P NMR (CDCl3, 202 MHz):δ150.9, 150.2.
ヌクレオシド類縁体:(2R,3R,4R,5R)−4−(3−((2−(1H−ベンゾ[d]イミダゾール−1−イル)エチル)アミノ)−3−オキソプロポキシ)−2−((ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ]メチル)−5−(5−メチル−2,4−ジオキソ−3,4−ジヒドロピリミジン−1(2H)−イル)−テトラヒドロフラン−3−イル(2−シアノエチル)ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物9)の合成
化合物1(オーガニック・アンド・バイオモレキュラー・ケミストリー、第12巻、6457ページ(2014年)に記載の方法に準じて合成した) (1.1g、1.4 mmol)のメタノール(14ml)溶液に、N−(2−アミノエチル)ベンゾイミゾール(8.3g、50.4mmol)を加え、55℃で22時間撹拌した。反応後、水を加え、ジクロロメタンで抽出した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール)により精製し、化合物8を得た(170mg,収率 16%)。
得られた化合物8 (170mg、0.22mmol)を脱水ピリジン、脱水トルエン及び脱水ジクロロメタン溶液を共沸により脱水し、その後脱水ジクロロメタン(2.2ml)に溶解させた。その溶液にN,N−ジイソプロピルエチルアミン(113μl、0.66 mmol)、2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(118μl、0.53mmol)を加え、室温で0.5時間反応させた。反応後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで抽出した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(富士シリシア社製アミンシリカNH、展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール)により精製し、化合物9を得た(143mg、収率 67%)。
MS (ESI):[M+H]+ 976.4372.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz):δ0.94−1.16 (3H, m),1.08−1.16 (9H, m),1.29−1.35 (3H, m), 2.27−2.61 (4H, m), 3.24−3.29 (1H, m), 3.38−3.85 (16H, m), 3.92−4.48 (7H, m), 5.66−5.70 (1H, m), 6.80−6.96 (4H, m), 6.96−7.06 (1H, m), 7.23−7.48 (22H, m), 7.64−7.70 (1H, m), 7.75−7.81 (1H, m), 7.91−7.95 (1H, m), 8.34−8.43 (1H, m).
13C NMR (CDCl3, 125 MHz):δ172.0,171.8,164.0,163.9,158.9,158.8,150.9,150.7,144.4,144.2,143.8,143.5,135.4,135.3,135.0,134.9,130.5,130.3,128.5,128.3,128.2,128.0,123.1,123.0,122.3,122.2,120.4,120.2,118.0,117.9,117.7,117.6,113.4,113.2,111.4,111.3,109.9,109.8,89.1,89.0,88.9,88.8,87.0,86.9,82.4,82.2,77.1,70.7,70.5,70.3,70.0,67.8,67.5,67.2,61.6,61.5,61.3,61.2,58.1,58.0,57.9,57.8,55.5,55.3,44.3,44.1,43.4,43.3,43.2,43.1,39.4,39.3,39.3,39.2,37.1,36.9,25.0,24.5,20.6,20.5,20.4,20.2,12.0,11.8.
31P NMR (CDCl3, 202 MHz):δ150.2, 150.8.
化合物17(ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、第54巻、2321ページ(1989年)に記載の方法に準じて合成した)(1.21g、2.0mmol)をピリジンに溶解し減圧下濃縮、トルエンに溶解し減圧下濃縮及びジクロロメタンに溶解し減圧下濃縮する操作を3回ずつ実施した後、tert−ブチルアルコールとジクロロメタンの混合溶媒(20 ml、tert−ブチルアルコール/ジクロロメタン=3/1(体積比))に溶解した。その溶液に炭酸セシウム(650mg、2.0mmol)、アクリル酸アリル(4.8ml、40mmol)を加え、室温で5時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣に酢酸エチルを加え、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒:ヘキサン−酢酸エチル)により精製し、化合物18を得た(1.1g、収率 75%)。
1H NMR(CDCl3, 500 MHz): δ7.93(dd,2H),7.71(d,1H),7.68−7.62(m,1H),7.50(dd,2H),5.86(ddt,1H),5.72(s,1H),5.26(dq,1H),5.17(dq,1H),4.59−4.49(m,2H),4.26(d,1H),4.22(dd,1H),4.11(dd,1H),4.05(t,2H),3.98(dd,1H),3.90(d,1H),2.67−2.54(m,2H),1.95(d,3H),1.14-0.96(m,28H).
化合物18(684mg、1.1mmol)を脱水テトラヒドロフラン(11ml)に溶解した。その溶液にテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0価)(141mg、0.12mmol)及びモルホリン(0.96ml、11 mmol)を加え、室温で30分間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒:ヘキサン−酢酸エチル)により精製した後、ダウエックス HCR−S 強酸性イオン交換樹脂(Na形)に通してナトリウム塩とすることで、化合物19を得た(450 mg、収率 69%)。
1H NMR (CDCl3 , 500 MHz): δ10.74(s,1H),7.64(s,1H),5.71(s,1H),4.30−4.18(m,3H),4.12(dd,1H),4.02(dt,1H),3.97(dd,1H),3.94(d,1H),2.74−2.64(m,1H),2.60−2.50(m,1H),1.91(s,3H),1.18−0.92(m,28H).
化合物19(190mg、0.26mmol)をN,N−ジメチルホルムアミド(2.6ml)に溶解した。その溶液にO−ベンゾトリアゾリル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート[HBTU](187mg、0.52mmol)、1−(2−アミノエチル)ベンゾイミダゾール(83mg、0.52mmol)を加え、室温で2.5時間撹拌した。反応終了後、酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒(酢酸エチル/ヘキサン=1/1(体積比))を加え、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒:ヘキサン−酢酸エチル)により精製し、化合物20を得た(150mg、収率 81%)。
MS (ESI):[M−H]− 714.3453.
1H NMR(CDCl3, 500 MHz):δ9.62(s,1H),7.94(s,1H),7.79−7.70(m,1H),7.48(d,1H),7.45−7.41(m,1H),7.29−7.20(m,2H),5.34(s,1H),4.40(ddd,1H),4.33(dt,1H),4.23−4.14(m,2H),4.09(dd,1H),3.91−3.73(m,4H),3.65(d,1H),3.57(ddt,1H),2.55(ddd,1H),2.48(ddd,1H),1.86(d,3H),1.11−0.86(m,28H).
化合物20(555mg、0.78mmol)を脱水テトラヒドロフラン(7.8ml)に溶解した。その溶液にトリエチルアミン(161μl、1.2mmol)及びトリエチルアミン三フッ化物水素酸塩(370μl、2.3mmol)を加え、室温で2.5時間撹拌した。反応後、反応混合物にトリメチルエトキシシラン(723μl、4.7mmol)を加えて30分間撹拌し、濾過後、得られた固体を減圧下乾燥し、化合物21を得た(330mg, 収率 90%)。
MS (ESI):[M−H]− 472.1831.
1H NMR(DMSO−d6, 500 MHz)δ11.34(s,1H),8.16−8.09(m,2H),7.78(d,1H),7.64(d,1H),7.58(d,1H),7.26(t,1H),7.19(t,1H),5.83(d,1H),5.21−5.16(m,2H),4.29(t,2H),4.17(q,1H),3.93(t,1H),3.84(q,1H),3.74−3.52(m,4H),3.48−3.38(m,2H),2.35−2.24(m,2H),1.76(d,3H).
化合物20(310mg, 0.65mmol)をピリジンに溶解後減圧下濃縮する操作を3回実施した後、ピリジン(6.5ml)に溶解した。その溶液に4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(266mg、0.79mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール)により精製し、化合物8を得た(320mg、収率 63%)。
MS (ESI):[M−H]− 774.3140.
1H NMR(CDCl3, 500 MHz):δ9.56(s,1H),7.80(s,1H),7.61−7.58(m,1H),7.51(d,1H),7.43−7.12(m,11H),6.89−6.77(m,4H),5.99(d,1H),4.46(t,1H),4.37−4.29(m,2H),4.15−4.10(m,1H),4.07−3.96(m,2H),3.86(dt,1H),3.83−3.73(m,7H),3.59−3.46(m,2H),3.39(dd,1H),2.62−2.53(m,1H),2.50−2.42(m,1H),1.35(s,3H).
化合物1の代わりに化合物8(320mg、0.41mmol)を用い、実施例4−1に記載の方法と同様に反応を行い、化合物9を得た(325mg、収率 80%)。
実施例1から4で得た化合物3、5、7及び9に由来するヌクレオシド構造を含有する人工オリゴヌクレオチド(化合物10−16;配列番号1から7:以下の表1に示す)を、核酸自動合成装置nS−8II(ジーンデザイン社製)を用いて、1.0μmolスケールで合成した。
アミダイトユニット(化合物3、5、7及び9)は、アセトニトリルに溶解して用いた。なお、表1において、化合物3、5、7及び9に由来するヌクレオチド構造は順にX1、X2、X3及びX4と表記した。また、表1において、「(M)」は2’−O−メチル化リボヌクレオシドを意味し、大文字のアルファベットはデオキシリボヌクレオチドを意味し、「^」はホスホロチオエート結合を意味し、「5」は、ヌクレオチドの塩基が5−メチルシトシンであることを意味する。
合成した人工オリゴヌクレオチド(化合物10−12)の純度は、イオン交換クロマトグラフィーにより確認したところ、97%(化合物10)、96%(化合物11)、96%(化合物12)、94%(化合物14)、97%(化合物15)、96%(化合物16)であった。化合物13の純度は、HPLCにより確認したところ、99%であった。
カラム:DNAPac PA−100 (DIONEX,4x250mm)
カラム温度: 50℃
溶離液 25mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)/1M塩化ナトリウム−25mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH6.0)=100/0→(45分)→40/60
流速:1.0mL/min
溶離液:0.1Mのヘキサフルオロイソプロピルアルコールと8mMのトリエチルアミンとを含む水溶液/メタノール=95/5(1分)→(14分)→75/25(3.5分)
流速:1.0mL/min
カラム:WatersXBridgeTM C18 2.5μm,4.6mm×75mm
カラム温度:60℃
検出:UV(260nm)
実施例5と同様にして、下記の式(Q1)で表されるMOE化ヌクレオシド構造を含む人工オリゴヌクレオチド(化合物C1)、式(Q2)で表されるMCE化ヌクレオシド構造を含む人工オリゴヌクレオチド(化合物C2及びC3)、2’−О−メチル化リボヌクレオシド構造を含む人工オリゴヌクレオチド(化合物C4)を合成した。分子量はMALDI−TOF−MASSにより測定した。結果を表2に示す。なお、表2において、式(Q1)で表されるヌクレオチド構造をQ1、(Q2)で表されるヌクレオチド構造をQ2と表記した。また、表2において、「(M)」は2’−O−メチル化リボヌクレオシドを意味し、大文字のアルファベットはデオキシリボヌクレオチドを意味し、「^」はホスホロチオエート結合を意味し、「5」は、ヌクレオチドの塩基が5−メチルシトシンであることを意味する。
実施例5で合成した人工オリゴヌクレオチド化合物10(PyECE)、化合物11(DMAECE)及び化合物12(MorECE)、参考例1で合成した人工オリゴヌクレオチド化合物C1(MOE)及び化合物C2(MCE)について、オリゴヌクレオチドを3’側から分解するエキソヌクレアーゼに対する耐性を検討した。
用いたバッファーの組成(終濃度)は、Tris・HCl(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩、pH8.0)50mM、MgCl2 10mMであり、測定前に十分に脱気した。HPLCによる定量条件は以下に示すとおりである。
溶離液:0.1Mのヘキサフルオロイソプロピルアルコールと8mMのトリエチルアミンとを含む水溶液/メタノール=95/5(1分)→(14分)→75/25(3.5分)
流速:1.0mL/min
カラム:WatersXBridgeTM C18 2.5μm,4.6mm×75mm
カラム温度:60℃
検出:UV(260nm)
この結果、MOEオリゴヌクレオチド(MOE)は60分後にはすべて分解している。MCEオリゴヌクレオチド(MCE)においても120分後の残存率は10%であり、180分後の残存率は2%である。一方で、化合物10(PyECE)、化合物11(DMAECE)及び化合物12(MorECE)における120分後の残存率は、それぞれ38%、29%、50%であり、180分後の残存率は、それぞれ24%、14%、36%である。従って、化合物10(PyECE)、化合物11(DMAECE)及び化合物12(MorECE)は、公知の人工ヌクレオチドから調製される人工オリゴヌクレオチド(MOE及びMCE)を大きく上回る酵素耐性を有することが分かった。
実施例5で合成した人工オリゴヌクレオチド化合物13(BimECE)及び参考例1で合成した人工オリゴヌクレオチド化合物C2(MCE)について、オリゴヌクレオチドを3’側から分解するエキソヌクレアーゼに対する耐性を検討した。処理条件、分析条件は実施例6と同じである。
この結果、MCEオリゴヌクレオチド(MCE)は120分後にはほぼすべて分解している。一方で、化合物13(BimECE)における120分後の残存率は、50%であり、180分後の残存率は、24%であった。従って、BimECEオリゴヌクレオチド(BimMCE)は公知の人工ヌクレオチドから調製される人工オリゴヌクレオチド(MCE)を大きく上回る酵素耐性を有することが分かった。
実施例5で合成した人工オリゴヌクレオチドである化合物14−16(アンチセンス鎖)とRNAセンス鎖(3’−UCAAAUCCAGAGGCUAGCAG−5’)とをアニーリング処理した後、Tm値を測定することにより、アンチセンスのハイブリッド形成能を調べた。
コントロールとしては、MCE化ヌクレオシド構造を含む人工オリゴヌクレオチド(化合物C3)及び2’−О−メチル化リボヌクレオシド構造を含む人工オリゴヌクレオチド(化合物C4)
を利用した。
次に、アニーリングしたサンプルを260nmの吸光度が2になるように注射用水で希釈した。この吸光度が2のサンプルを150uL、10xPBS(−)を30μL、注射用水を120μL混合し、300μLの測定溶液を作製した。
分光光度計(Shimadzu,Pharma Spec UV−1700)内にサンプルを入れたセルを固定した後、サンプル溶液を90℃まで加熱し、さらに10分間90℃に保った後測定を開始した。温度は5℃まで毎分0.5℃ずつ下降させ、1℃間隔で260nmにおける紫外部吸収を測定した。その後、次は逆に5℃から毎分0.5℃ずつ上昇させて、90℃まで0.5℃間隔で260nmにおける紫外部吸収を測定した。測定は3回行った。表3には昇温測定時のTm値の平均値と標準偏差を記した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用い、セル室内には結露防止のために脱水した空気を通した。
実施例4で得た化合物9に由来するヌクレオシド構造を含有する人工オリゴヌクレオチド(化合物17;配列番号12:以下の表4に示す)を、核酸自動合成装置nS−8II(ジーンデザイン社製)を用いて、1.0μmolスケールで合成した。
アミダイトユニット(化合物9)は、アセトニトリルに溶解して用いた。なお、表4に
おける配列表記は、表1と同じである。
合成した人工オリゴヌクレオチド(化合物17)の純度は、HPLCによりにより確認したところ、99%であった。
溶離液:0.1Mのヘキサフルオロイソプロピルアルコールと8mMのトリエチルアミンとを含む水溶液/メタノール=95/5(1分)→(14分)→75/25(3.5分)
流速:1.0mL/min
カラム:WatersXBridgeTM C18 2.5μm,4.6mm×75mm
カラム温度:60℃
検出:UV(260nm)
実施例9と同様にして、式(Q2)で表されるMCE化ヌクレオシド構造を含む人工オリゴヌクレオチド(化合物C5)を合成した。分子量はMALDI−TOF−MASSにより測定した。結果を表5に示す。なお、表5において、(Q2)で表されるヌクレオチド構造をQ2と表記した。また、表5における配列表記は、表2と同じである。
ヒト肝癌由来細胞株HuH−7の細胞を3000細胞/ウェルとなるように96ウェルプレートに播き、5%CO2下37℃にて24時間培養した。化合物17及び化合物C5を、その最終濃度が0.1nMとなるようにLipofectamine(登録商標) RNAiMax(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて各ウェルに添加した(トランスフェクション)。4時間後に培地を交換し、さらに7日後に細胞を回収し、細胞からRNeasy mini kit(QIAGEN社製)を用いてTotal RNAを抽出した。
Total RNAからPrimeScript RT Master Mix(タカラバイオ株式会社製)を用いてcDNAを得た。得られたcDNA及びTaqMan(登録商標)Gene Expression ID(Applied Biosystems社製)を用いて7500 Real−Time PCR System(Applied Biosystems社製)によりリアルタイムPCRを行い、miRNA−122の標的遺伝子であるAldolase AおよびBranched chain ketoacid dehydrogenase kinase(BCKDK)のmRNA量を定量した。リアルタイムPCRでは、ハウスキーピング遺伝子のGAPDH(Glyceraldehyde−3−Phosphate Dehydrogenase)のmRNA量も同時に定量した。GAPDHのmRNA量に対するAldolase AのmRNA量を、Aldolase Aの発現レベルとして評価し、GAPDHのmRNA量に対するBCKDKのmRNA量を、BCKDKの発現レベルとして評価した。トランスフェクション操作を行わなかった細胞をコントロールとして用いた。結果を図3及び図4に示す。この際、Aldolase A及びBCKDKの発現量が高いほど、アンチセンス効果が高いことを示す。
なお、用いたプライマーは、TaqMan Gene Expression Assay(Applied Biosystems社製)であり、Assay IDは、以下のとおりであった:
ヒトAldolase A定量用: Hs00605108_g1
ヒトBCKDK定量用: Hs00195380_m1
ヒトGAPDH定量用: Hs99999905_m1
Claims (17)
- 下記式(I):
(式中、Bxは、プリン−9−イル基、2−オキソ−ピリミジン−1−イル基又は2−チオキソ−ピリミジン−1−イル基(該プリン−9−イル基、2−オキソ−ピリミジン−1−イル基及び2−チオキソ−ピリミジン−1−イル基はそれぞれ独立して、無置換であるか、又はハロゲン原子、C1−6アルキル基、アミノ基、アミノ基保護基により置換されたアミノ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシ基保護基により置換されたヒドロキシ基、スルファニル基及びスルファニル基保護基により置換されたスルファニル基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)であり、
Z1及びZ2はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基保護基又はリン含有基であり、
R1、R2、R3及びR4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基又はC1−6アルキル基若しくはC2−6アルケニル基(該C1−6アルキル基及びC2−6アルケニル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、C1−6アルコキシ基及びシアノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)であり、
Yは、NR5R6
(該R5及びR6はそれぞれ独立して、水素原子、C1−6アルキル基若しくはC2−6アルケニル基(該C1−6アルキル基及びC2−6アルケニル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、C1−6アルコキシ基、C2−6アルケニルオキシ基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−6アルケニルオキシカルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルキルカルボニルオキシ基、C1−6アルキルカルボニルアミノ基及びC1−6アルコキシカルボニルアミノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)又はC7−10アラルキル基(該C7−10アラルキル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6アルコキシ基、C2−6アルケニルオキシ基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−6アルケニルオキシカルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキル基、C1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルキルカルボニルオキシ基、C1−6アルキルカルボニルアミノ基及びC1−6アルコキシカルボニルアミノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)である)であり、
nは、1から3の整数である。ここで、nが2又は3であるとき、2又は3のR3及びR4はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。)で示される化合物又はその塩。 - Bxが、6−アミノプリン−9−イル基、2−アミノ−6−ヒドロキシプリン−9−イル基、2−オキソ−4−アミノ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基、2−オキソ−4−アミノ−5−メチル−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基、2−オキソ−4−ヒドロキシ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基又は2−オキソ−4−ヒドロキシ−5−メチル−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基である、請求項1に記載の化合物又はその塩。
- R1、R2、R3及びR4が、水素原子である、請求項1又は2に記載の化合物又はその塩。
- R5及びR6が、それぞれ独立して、水素原子又はC1−3アルキル基である、請求項1から3の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
- R6が、メチル基である、請求項1から4の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
- R5及びR6が、メチル基である、請求項1から5の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
- nが2である、請求項1から6の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
- Z1が、水素原子又はヒドロキシ基保護基である、請求項1から7の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
- Z2が、水素原子又はリン含有基である、請求項1から8の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
- Z2が、ヒドロキシ基保護基である、請求項1から8の何れか一項に記載の化合物、又はその塩。
- 下記式(II):
(式中、Bxは、プリン−9−イル基、2−オキソ−ピリミジン−1−イル基又は2−チオキソ−ピリミジン−1−イル基(該プリン−9−イル基、2−オキソ−ピリミジン−1−イル基及び2−チオキソ−ピリミジン−1−イル基はそれぞれ独立して、無置換であるか、又はハロゲン原子、C1−6アルキル基、アミノ基、アミノ基保護基により置換されたアミノ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシ基保護基により置換されたヒドロキシ基、スルファニル基及びスルファニル基保護基により置換されたスルファニル基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)であり、
R1、R2、R3及びR4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基又はC1−6アルキル基若しくはC2−6アルケニル基(該C1−6アルキル基及びC2−6アルケニル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、C1−6アルコキシ基及びシアノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)であり、
Yは、NR5R6
(該R5及びR6はそれぞれ独立して、水素原子、C1−6アルキル基若しくはC2−6アルケニル基(該C1−6アルキル基及びC2−6アルケニル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、C1−6アルコキシ基、C2−6アルケニルオキシ基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−6アルケニルオキシカルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルキルカルボニルオキシ基、C1−6アルキルカルボニルアミノ基及びC1−6アルコキシカルボニルアミノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)又はC7−10アラルキル基(該C7−10アラルキル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6アルコキシ基、C2−6アルケニルオキシ基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−6アルケニルオキシカルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキル基、C1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルキルカルボニルオキシ基、C1−6アルキルカルボニルアミノ基及びC1−6アルコキシカルボニルアミノ基からなる群から単独に若しくは異なって選ばれる1以上の置換基で置換されている)である)であり、
nは、1から3の整数である。ここで、nが2又は3であるとき、2又は3のR3及びR4はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。)で示されるヌクレオシド構造を1以上含む人工オリゴヌクレオチド、又はその製薬上許容される塩。 - Bxが、6−アミノプリン−9−イル基、2−アミノ−6−ヒドロキシプリン−9−イル基、2−オキソ−4−アミノ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基、2−オキソ−4−アミノ−5−メチル−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基、2−オキソ−4−ヒドロキシ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基又は2−オキソ−4−ヒドロキシ−5−メチル−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基である、請求項11に記載の人工オリゴヌクレオチド、又はその製薬上許容される塩。
- R1、R2、R3及びR4が、水素原子である、請求項11又は12に記載の人工オリゴヌクレオチド、又はその製薬上許容される塩。
- R5及びR6が、それぞれ独立して、水素原子又はC1−3アルキル基である、請求項11から13の何れか一項に記載の人工オリゴヌクレオチド、又はその製薬上許容される塩。
- R6が、メチル基である、請求項11から14の何れか一項に記載の人工オリゴヌクレオチド、又はその製薬上許容される塩。
- R5及びR6が、メチル基である、請求項11から15の何れか一項に記載の人工オリゴヌクレオチド、又はその製薬上許容される塩。
- nが2である、請求項11から16の何れか一項に記載の人工オリゴヌクレオチド、又はその製薬上許容される塩。
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