CN109536493A - 用于抑制lect2基因表达的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向LECT2基因的双链核糖核酸(dsRNA)组合物，和使用这样的dsRNA组合物来改变(例如，抑制)LECT2的表达的方法。

Description

用于抑制LECT2基因表达的组合物和方法
本申请是申请日为2014年10月1日、申请号为201480065696.4、发明名称为“用于抑制LECT2基因表达的组合物和方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请交叉参考
本申请要求于2013年10月2日提交的美国临时申请号61/885,693以及于2014年8月11日提交的美国临时申请号62/035,819的权益，将其内容通过引用以其全文结合在此。
序列表
本申请包含已经以电子方式以ASCII格式提交并且特此通过引用以其全文结合的序列表。创建于2014年9月29日的所述ASCII拷贝被命名为A2038-7200WO_SL.txt，大小为294,414字节。
发明领域
本发明涉及LECT2基因的表达的特异性抑制。
发明背景
淀粉样变性是一组表征为在器官或组织中不溶性纤维蛋白聚集体(称为淀粉样蛋白)的沉淀的疾病。淀粉样蛋白可以从突变型或野生型蛋白形成。针对淀粉样蛋白疾病的一个命名***使用形成淀粉样蛋白沉淀物的蛋白的缩写(前有英文字母“A”)。因此，例如，ALECT2是淀粉样变性的缩写，该淀粉样变性涉及从白细胞衍生的趋化因子-2(ALECT2)形成的淀粉样蛋白沉淀物。
LECT2淀粉样变性(ALECT2)是淀粉样变性的最近发现的类型之一。LECT2淀粉样变性已经在患有肾或肝淀粉样变性的个体中观察到。这种形式的淀粉样变性可以与肾病综合征或与肝损害(例如，肝炎，例如，慢性肝炎)一起存在。它在墨西哥裔美国人中和/或以下个体中尤其流行，这些个体针对在成熟编码LECT2蛋白中位置40处(或在未加工的蛋白中位置58处)编码缬氨酸的G等位基因是纯合子。针对LECT2淀粉样变性的治疗是有限的，并且需要新的治疗。
发明概述
本发明描述了用于调节LECT2基因表达的方法和iRNA组合物。在某些实施例中，使用LECT2-特异性iRNA降低或抑制LECT2基因的表达。这样的抑制可以用于治疗与LECT2表达相关的障碍，如淀粉样变性，例如，LECT2淀粉样变性(ALECT2)。
因此，在此描述的是组合物和方法，如在细胞或在受试者中(例如，在哺乳动物如人类受试者中)，实现LECT2基因RNA转录物的RNA-诱导的沉默复合体(RISC)-介导的切割。还描述了用于治疗与LECT2基因表达相关的障碍(如LECT2淀粉样变性)的组合物和方法。
在一些实施例中，该LECT2淀粉样变性是一种肾淀粉样变性。
在一些实施例中，该LECT2淀粉样变性涉及在肾中淀粉样蛋白沉淀。
在一些实施例中，LECT2淀粉样变性与肾脏疾病(例如，肾病综合征)相关。在一些实施例中，该淀粉样变性与蛋白尿相关。在一些实施例中，不存在蛋白尿。
在一些实施例中，该LECT2淀粉样变性是一种肝淀粉样变性。在一些实施例中，该LECT2淀粉样变性涉及在肝中淀粉样蛋白沉淀。
在一些实施例中，该LECT2淀粉样变性与肝中炎症(例如，肝炎，例如，慢性肝炎)有关。
在一些实施例中，该受试者是墨西哥后裔(例如，墨西哥裔美国人)。
在实施例中，该受试者携带LECT2基因的G等位基因，该G等位基因编码成熟蛋白中位置40处(或在未加工蛋白中的氨基酸58)的缬氨酸。在实施例中，该受试者针对G等位基因(G/G基因型)是纯合的。在实施例中，在受试者中表达的LECT2蛋白在成熟蛋白中的位置40处(或在未加工蛋白中的氨基酸58处)具有缬氨酸。
在实施例中，在此描述的方法有效抑制淀粉样蛋白沉淀(例如，通过防止淀粉样蛋白沉淀或减少淀粉样蛋白沉淀，例如，通过减少淀粉样蛋白沉淀物的大小、数量、或程度)或与淀粉样蛋白沉淀有关的症状。
如在此使用的，术语“iRNA”、“RNAi”、“iRNA剂”、“RNAi剂”、或“iRNA分子”是指包含如在此定义的术语RNA的一种药剂，并且其例如经由RNA-诱导的沉默复合物(RISC)路径介导RNA转录物的靶向切割。在一个实施例中，如在此所述的iRNA抑制LECT2在细胞或哺乳动物中表达。
包括在于此表征的组合物中的iRNA(例如，dsRNA)包括RNA链(反义链)，该RNA链具有一个区域，例如，该区域是30个或更少个核苷酸，通常是1924个核苷酸的长度，该区域基本上与LECT2基因(例如，小鼠或人类LECT2基因)的mRNA转录物(在此还称作“LECT2-特异性iRNA”)的至少一部分互补。在实施例中，该LECT2 mRNA转录物是人类LECT2 mRNA转录物，例如，SEQ ID NO：1。在实施例中，该LECT2 mRNA转录物在SEQ ID NO：1的核苷酸位置37处具有A至G取代。在实施例中，mRNA转录物在成熟LECT2蛋白中的位置40(或在未加工的蛋白中的氨基酸58)处编码缬氨酸。在实施例中，该mRNA转录物在成熟LECT2蛋白中的位置40(或在未加工的蛋白中的氨基酸58)处编码异亮氨酸。
在实施例中，在此描述的iRNA(例如dsRNA)包括反义链，该反义链具有基本上与人类LECT2 mRNA的区域互补的区域。在实施例中，该人类LECT2 mRNA具有NM_002302.2的序列(SEQ ID NO：1)。在实施例中，该人类LECT2 mRNA在SEQ ID NO：1的核苷酸位置37处具有A至G取代。
在其他实施例中，iRNA涵盖具有RNA链(反义链)的dsRNA，该RNA链具有一个区域，该区域基本上与LECT2 mRNA的一部分互补。在一个实施例中，该iRNA涵盖具有RNA链(反义链)的dsRNA，该RNA链具有一个区域，该区域基本上与LECT2 mRNA的一部分互补，例如，人类LECT2 mRNA(例如，如在NM_002302.2中提供的人类LECT2 mRNA(SEQ ID NO：1)或在SEQ IDNO：1的核苷酸位置373处具有A至G取代)。
在一个实施例中，用于抑制LECT2基因表达的iRNA包括至少两个彼此互补的序列。iRNA包括具有第一序列的有义链和具有第二序列的反义链。反义链包含基本上与编码LECT2转录物的mRNA的至少一部分互补的核苷酸序列，并且该互补区域是30个或更少个核苷酸和至少15个核苷酸长度。总体上，iRNA长度是19个至24个核苷酸。
在一些实施例中，iRNA是19个至21个核苷酸长度。在一些实施例中，iRNA是19-21个核苷酸长度并且使一种脂质配制品，例如，脂质纳米颗粒(LNP)配制品(例如，LNP11制剂)。在一个实施例中，在稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)中配制靶向LECT2的iRNA。
在一些实施例中，iRNA是21个至23个核苷酸长度。在一些实施例中，iRNA是21-23个核苷酸长度并且处于共轭物的形式，例如，共轭至如在此描述的一种或多种GalNAc衍生物。
在一些实施例中，iRNA是从约15至约25个核苷酸长度，并且在其他实施例中，该iRNA是从约25至约30个核苷酸长度。与表达LECT2的细胞接触后，靶向LECT2的iRNA抑制LECT2基因的表达(例如，抑制至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％)，如通过如本领域已知的或如本文所述的方法分析。
在一个实施例中，在此表征的iRNA(例如，dsRNA)包括选自由表2-3、5-6和9-10的有义序列组成的组的dsRNA的第一序列以及选自由表2-3、5-6和9-10的相应反义序列组成的组的第二序列，或由其组成。
在实施例中，在此表征的iRNA(例如，dsRNA)包括选自在表2-3、5-6和9-10中所提供的那些的有义和/或反义序列，或由其组成。
在此表征的iRNA分子可以包括天然存在的核苷酸或可以包括至少一个修饰的核苷酸，包括但不限于2′-O-甲基修饰的核苷酸、具有5′-硫代磷酸酯基团的核苷酸和与胆甾醇基衍生物连接的末端核苷酸。可替代地，该经修饰的核苷酸可以选自下组：2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、无环核苷酸、脱碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、以及包括非天然碱基的核苷酸。这种修饰的序列可以基于，例如，所述iRNA的第一序列，所述第一序列选自由表2-3、5-6和9-10的有义序列组成的组，和第二序列，所述第二序列选自由表2-3、5-6和9-10的相应反义序列组成的组。
在一个实施例中，在此描述的iRNA靶向野生型LECT2RNA转录物变体，并且在另一个实施例中，iRNA靶向突变型转录物(例如，携带等位变体的LECT2RNA)。例如，本发明中表征的iRNA可以靶向LECT2的多态性变体，如单核苷酸多态性(SNP)。
在一些实施例中，该iRNA(例如，dsRNA)靶向(例如，减少)mRNA，该mRNA在成熟LECT2蛋白中的位置40(或在未加工的蛋白中的氨基酸58)处编码缬氨酸。在一些实施例中，该iRNA(例如，dsRNA)靶向(例如，减少)mRNA，该mRNA在成熟LECT2蛋白中的位置40(或在未加工的蛋白中的氨基酸58)处编码异亮氨酸。在另一个实施例中，该iRNA(例如，dsRNA)靶向(例如，减少)在成熟LECT2蛋白中的位置40(或在未加工的蛋白中的氨基酸58)处编码缬氨酸的mRNA和编码异亮氨酸的mRNA二者。
在另一个实施例中，iRNA靶向野生型和突变型LECT2转录物两者。在又另一个实施例中，iRNA靶向LECT2的具体转录物变体。在又另一个实施例中，iRNA靶向多种转录物变体。
在一个实施例中，本发明中表征的iRNA靶向LECT2RNA转录物的非编码区，如转录物的5′或3′非翻译区。
在一些实施例中，在此描述的iRNA处于共轭物(例如，碳水化合物共轭物)形式，该共轭物可以用作靶向部分和/或配体，如在此描述的。在一个实施例中，共轭物附接至dsRNA的有义链的3’末端。在一些实施例中，共轭物经由接头附接，例如，经由二价或三价分支接头。
在一些实施例中，共轭物包括一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。这样一种共轭物在此还称作GalNAc共轭物。在一些实施例中，共轭物将RNAi剂(例如，dsRNA)靶向特定细胞，例如，肝脏细胞，例如，肝实质细胞。GalNAc衍生物可以经由接头附接，例如，二价或三价分支接头。在具体的实施例中，该共轭物是
在一些实施例中，RNAi剂经由接头附接至碳水化合物共轭物，例如，如以下方案中示出的接头，其中X是O或S
在一些实施例中，X是O。在一些实施例中，X是S。
在一些实施例中，RNAi剂共轭至如表1中定义且如下示出的L96
在一些实施例中，将RNAi剂共轭至配体，该配体将RNAi(例如，dsRNA)靶向所希望的器官(例如，肝)或靶向具体的细胞类型(例如，肝实质细胞)。在实施例中，将RNAi剂共轭至配体(例如，GalNAc配体，例如，L96)，该配体将RNAi剂(例如，dsRNA)靶向肝。
在一方面，在此提供的是一种药物组合物，用于抑制LECT2基因在生物体(通常是人类受试者)中的表达。这种组合物一般包括在此所述的一种或多种iRNA和药学上可接受的载体或递送运载体。在一个实施例中，使用该组合物用于治疗与LECT2表达相关的障碍，例如，淀粉样变性，例如，LECT2淀粉样变性。
在一方面，在此提供的iRNA是用于抑制LECT2的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括有义链和反义链(15-30个碱基对长度)，并且该反义链与SEQ ID NO：1中的至少15个连续核苷酸互补。
在另一方面，在此提供的iRNA是双链RNAi(dsRNA)，它包括与反义链互补的有义链，其中所述反义链包括与LECT2RNA转录物互补的一个区域，其中每条链具有约14至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi剂由式(III)表示：
有义：5′np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3′
反义：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)1-Na′-nq′5′
(III)
其中：
i、j、k、以及l各自独立地是0或1；
p、p’、q、以及q’各自独立地是0-6；
Na和Na’各自独立地表示包括0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb′各自独立地表示包括0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
np、np′、nq、以及nq′各自独立地表示突出核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、以及Z′Z′Z′各自独立地表示三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰。
在实施例中，有义链共轭至至少一个配体。
在实施例中，i是1；j是1；或i和j两者均是1。
在实施例中，k是1；1是1；或k和l两者均是1。
在实施例中，XXX与X′X′X′互补，YYY与Y′Y′Y′互补，并且ZZZ与Z′Z′Z′互补。
在实施例中，Y′Y′Y′基序发生在该反义链从5′-端开始的位置11、12和13处。
在实施例中，Y′是2′-O-甲基。
在实施例中，双链体区域是15-30个核苷酸对的长度。
在实施例中，双链体区域是17-23个核苷酸对的长度。
在实施例中，双链体区域是19-21个核苷酸对的长度。
在实施例中，双链体区域是21-23个核苷酸对的长度。
在实施例中，核苷酸上的修饰选自下组，该组由以下各项组成：锁核酸(LNA)、无环核苷酸、己糖醇或己糖核酸(HNA)、环己烯核酸(CeNA)、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-脱氧、2’-羟基、及其任何组合。
在实施例中，核苷酸上的修饰是2′-O-甲基、2′-氟或两者。
在实施例中，配体包括碳水化合物。
在实施例中，配体经由接头附接。
在实施例中，接头是二价或三价分支接头。
在实施例中，配体是
在实施例中，配体和接头是如式XXIV所示的：
在实施例中，将配体附接至有义链的3’末端。
在实施例中，dsRNA具有(例如，包括)选自下组的核苷酸序列(例如，有义和/或反义序列)，该组是表2-3、5-6和9-10中提供的序列。
在又一方面，在此提供的iRNA是用于抑制LECT2的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括有义链和反义链，该反义链包括与LECT2RNA转录物互补的区域，该反义链包括与表2-3、5-6和9-10中任一个列出的反义序列之一相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
在一些实施例中，dsRNA包括至少一个修饰核苷酸。
在一些实施例中，修饰的核苷酸的至少一个选自下组，该组由以下各项组成：2′-O-甲基修饰的核苷酸、包含5′-硫代磷酸酯基的核苷酸和与胆甾醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基连接的末端核苷酸。
在一些实施例中，修饰的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、无环核苷酸、脱碱基核苷酸、2′-氨基修饰的核苷酸、2′-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、以及包括非天然碱基的核苷酸。
在一些实施例中，互补区域长度是至少17个核苷酸。
在一些实施例中，互补区域长度是在19个和21个核苷酸之间。
在一些实施例中，互补区域长度是19个核苷酸。
在一些实施例中，每一链的长度是不超过30个核苷酸。
在一些实施例中，至少一条链包含具有至少1个核苷酸的3’突出端。
在一些实施例中，至少一条链包含具有至少2个核苷酸的3’突出端。
在一些实施例中，在此描述的iRNA(例如，dsRNA)进一步包括配体。
在一些实施例中，配体是GalNAc配体。
在一些实施例中，该配体将该iRNA(例如，dsRNA)靶向肝(例如，肝实质细胞)。
在一些实施例中，配体共轭至dsRNA的有义链的3’末端。
在一些实施例中，互补区域由选自表2-3、5-6和9-10中提供的反义序列的反义序列组成。
在实施例中，互补区域由选自在此披露的双链体的反义序列组成，其中这些双链体将LECT2 mRNA或蛋白表达抑制至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％或90％。
在一些实施例中，dsRNA包括包含选自表2、3、5、6、9或10的有义链序列的(或由其组成的)有义链，和包含选自表2、3、5、6、9或10的反义序列的(或由其组成的)反义链。在实施例中，dsRNA包括一对对应的有义和反义序列，或由其组成，这些有义和反义序列选自表2-3和5-11中披露的那些双链体。在某些实施例中，dsRNA包括一对对应的有义和反义序列，或由其组成，这些有义和反义序列选自表8中披露的那些双链体。
在一方面，本发明提供了包含在此披露的至少一种iRNA(例如，dsRNA)的细胞。所述细胞典型地是哺乳动物细胞，如人类细胞。在实施例中，细胞是肝脏细胞(例如，肝实质细胞)。
在一方面，在此提供的是一种药物组合物，用于抑制LECT2基因的表达，该组合物包括在此描述的iRNA(例如，dsRNA)。
在本文描述的药物组合物的实施例中，iRNA(例如，dsRNA)在一种非缓冲溶液中进行给予。在实施例中，非缓冲溶液是盐水或水。
在本文描述的药物组合物的实施例中，iRNA(例如，dsRNA)与缓冲溶液一起给予。在实施例中，缓冲溶液可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任意组合。在实施例中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在本文描述的药物组合物的实施例中，iRNA(例如，dsRNA)靶向肝(例如，肝实质细胞)。
在本文描述的药物组合物的实施例中，静脉内给予组合物。
在本文描述的药物组合物的实施例中，皮下给予组合物。
在实施例中，药物组合物包括在此描述的iRNA(例如，dsRNA)，该iRNA包括配体(例如，GalNAc配体)，该配体将该iRNA(例如，dsRNA)靶向肝脏细胞，例如，肝实质细胞。
在实施例中，药物组合物包括在此描述的iRNA(例如，dsRNA)，该iRNA包括配体(例如，GalNAc配体)，并且将该药物组合物经皮下给予。在实施例中，该配体将该iRNA(例如，dsRNA)靶向肝脏细胞，例如，肝实质细胞。
在某些实施例中，药物组合物，例如，在此描述的组合物包括脂质配制品。在一些实施例中，RNAi剂是LNP配制品，例如，MC3配制品。在一些实施例中，LNP配制品将RNAi剂靶向特定细胞，例如，肝脏细胞(例如，肝实质细胞)。在实施例中，脂质配制品是LNP11配制品。在实施例中，静脉内给予组合物。
在另一个实施例中，配制这种药物组合物以便根据本文所述的剂量方案给药，例如，每4周不多于1次、每3周不多于1次、每2周不多于1次或每周不多于1次。在另一个实施例中，可以维持药物组合物的给药一个月或更长时间，例如，1个、2个、3个或6个月，或1年或更长时间。
在另一个实施例中，将包含在本发明中表征的iRNA(例如，靶向LECT2的dsRNA)的组合物与针对于LECT2表达相关的障碍(例如，LECT2淀粉样变性)的第二疗法结合地给予。可以将iRNA或包括在此提供的iRNA的组合物，在第二疗法之前、之后、或同时给予。在实施例中，在第二疗法之前给予该iRNA。在实施例中，在第二疗法之后给予该iRNA。在实施例中，与第二疗法同时给予该iRNA。
在一些实施例中，该第二疗法是非iRNA治疗剂，该非iRNA治疗剂有效治疗障碍或障碍的症状。
在一些实施例中，待通过在此披露的组合物或方法治疗的障碍是LECT2淀粉样变性，该LECT2淀粉样变性影响肾功能，例如，通过肾中的淀粉样蛋白沉淀。在一些这种实施例中，将该iRNA与支持肾功能(例如，透析)的疗法结合地给予。在实施例中，将该iRNA与利尿剂、ACE(血管紧张肽转换酶)抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、和/或透析结合，例如，以支持或管理肾功能。
在一些实施例中，待通过在此披露的组合物或方法治疗的障碍是LECT2淀粉样变性，该LECT2淀粉样变性涉及肝中淀粉样蛋白沉淀物。在一些这种实施例中，将该iRNA与支持肝功能的疗法结合地给予。
在一些这种实施例中，待通过在此披露的组合物或方法治疗的障碍是LECT2淀粉样变性，并且将该iRNA与去除受淀粉样变性影响的所有或部分器官(例如，切除受淀粉样变性影响的所有或部分肾脏或肝脏组织)结合地给予。任选地与去除的所有或部分器官的替换相结合(例如，与肾脏或肝脏器官移植结合)地进行。
在一方面，在此提供的是抑制细胞中LECT2表达的方法，该方法包括：(a)向该细胞中引入在此描述的iRNA(例如dsRNA)并且(b)维持步骤(a)中产生的细胞一段时间，该时间足以获得LECT2基因的mRNA转录物的降解，由此抑制该细胞中的LECT2基因的表达。
在一方面，在此提供的是用于降低或抑制细胞(例如，肝脏细胞，例如，肝实质细胞)中LECT2基因表达的方法。该方法包括将细胞与如在此描述的dsRNA接触，从而抑制LECT2基因的表达。如在此使用的，“接触”包括直接接触细胞，连同间接接触细胞。例如，当向受试者给予(例如，静脉内或皮下地)包括RNAi的组合物时，该受试者体内的细胞(例如，肝脏细胞)可以是被接触的。
在实施例中，该方法包括
(a)向该细胞引入双链核糖核酸(dsRNA)，其中该dsRNA包括至少两个彼此互补的序列。该dsRNA包括具有第一序列的有义链和具有第二序列的反义链；该反义链具有基本上与编码LECT2的mRNA的至少一部分互补的互补区域，并且其中该互补区域是30个或更少核苷酸长度，例如，15-30个核苷酸长度，并且总体上是19-24个核苷酸长度，并且其中与表达LECT2的细胞接触后，该dsRNA将LECT2基因的表达抑制至少10％、例如至少20％、至少30％、至少40％或更多；并且
(b)维持步骤(a)中产生的细胞一段时间，该时间足以获得LECT2基因的mRNA转录物的降解，由此降低或抑制该细胞中的LECT2基因的表达。
在抑制细胞中LECT2表达的前述方法的实施例中，将该细胞离体、体外、或体内地进行治疗。在实施例中，细胞是肝实质细胞。
在实施例中，细胞存在于需要治疗、预防和/或管理与LECT2表达相关的障碍的受试者中。
在实施例中，该障碍是LECT2淀粉样变性，如在此所描述。
在实施例中，LECT2表达被抑制至少30％。
在实施例中，该iRNA(例如，dsRNA)具有在0.0005-1nM，例如，在0.001和0.2nM之间、在0.002和0.1nM之间、在0.005和0.075nM之间、或在0.01和0.05nM之间的范围内的IC50。在实施例中，该iRNA(例如，dsRNA)具有等于或小于0.02nM，例如，在0.0005和0.02nM之间、在0.001和0.02nM之间、在0.005和0.02nM之间、或在0.01和0.02nM之间的IC50。在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)具有在0.01-1nM范围内的IC50。
在实施例中，细胞(例如，肝实质细胞)是哺乳动物细胞(例如，人类、非人类灵长动物、或啮齿动物细胞)。
在一个实施例中，该受试者是患有LECT2淀粉样变性的哺乳动物(例如，人类)。
在一个实施例中，引入的dsRNA降低或抑制细胞中LECT2基因的表达。
在一个实施例中，该dsRNA抑制LECT2基因的表达，或者抑制淀粉样蛋白沉淀(例如，通过抑制淀粉样蛋白沉淀或减少淀粉样蛋白沉淀，例如，通过减少淀粉样蛋白沉淀物的大小、数量、或程度)。与参照(例如，未治疗的或用非靶向dsRNA(例如，非靶向LECT2的dsRNA)治疗对照的)相比，抑制任选地涉及至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的抑制。
在其他方面，本披露提供了用于治疗与LECT2表达相关的病理过程(例如，淀粉样蛋白沉淀)的方法。在一个实施例中，该方法包括向受试者，例如需要这种治疗的患者给予有效(例如，治疗或预防有效)量的在此提供的dsRNA。
在一方面，在此提供的是治疗和/或预防与LECT2表达相关的障碍(例如，LECT2淀粉样变性)的方法，该方法包括向需要此类治疗的受试者给予治疗有效量的在此描述的iRNA(例如，dsRNA)、或在此描述的包括iRNA(例如，dsRNA)的组合物。
在一方面，在此提供的是治疗与LECT2表达相关的障碍(例如，LECT2淀粉样变性)的方法，该方法包括向需要此类治疗的受试者给予双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括有义链和反义链(15-30个碱基对长度)，并且该反义链与LECT2 mRNA转录物的至少15个连续核苷酸(例如，人类LECT2 mRNA转录物，例如，SEQ ID NO：1或在SEQ ID NO：1的核苷酸位置37处具有A至G取代的核苷酸序列)互补。在一个实施例中，该iRNA(例如，dsRNA)靶向mRNA，该mRNA在成熟LECT2蛋白中的位置40(或在未加工的蛋白中的氨基酸58)处编码缬氨酸。在一个实施例中，在此提供的是治疗患有LECT2淀粉样变性的受试者的方法，该方法包括向受试者给予双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括有义链和反义链(15-30个碱基对长度)，并且该反义链与LECT2 mRNA转录物的至少15个连续核苷酸(例如，人类LECT2mRNA转录物，例如，SEQ ID NO：1或在SEQ ID NO：1的核苷酸位置37处具有A至G取代的核苷酸序列)互补。在一个实施例中，该iRNA(例如，dsRNA)靶向mRNA，该mRNA在成熟LECT2蛋白中的位置40(或在未加工的蛋白中的氨基酸58)处编码缬氨酸。
在一些实施例中，靶向LECT2的iRNA的给予减轻或缓解患者中与LECT2表达相关的障碍的至少一个症状的严重性。
在一个实施例中，受试者患有LECT2淀粉样变性。在另一个实施例中，该受试者有风险患上LECT2淀粉样变性。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)被配制为LNP配制品。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)处于GalNAc共轭物的形式。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)以0.05-50mg/kg的剂量给予。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)以0.01mg/kg-5mg/kg受试者体重的浓度给予。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)被配制为LNP配制品并且是以0.05-5mg/kg的剂量给予。在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)被配制为LNP配制品并且是以0.1至0.5mg/kg的剂量给予。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)是处于GalNAc共轭物的形式并且是以0.5-50mg/kg的剂量给予。在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)是处于GalNAc共轭物的形式并且是以1至10mg/kg的剂量给予。
在实施例中，该方法抑制LECT2基因的表达，或者抑制淀粉样蛋白沉淀(例如，通过抑制淀粉样蛋白沉淀或减少淀粉样蛋白沉淀，例如，通过减少淀粉样蛋白沉淀物的大小、数量、或程度)。与参照(例如，未治疗的或用非靶向dsRNA(例如，非靶向LECT2的dsRNA)治疗对照的)相比，抑制任选地涉及至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％或更多的抑制。
在实施例中，该iRNA(例如，dsRNA)具有在0.0005-1nM，例如，在0.001和0.2nM之间、在0.002和0.1nM之间、在0.005和0.075nM之间、或在0.01和0.05nM之间的范围内的IC50。在实施例中，该iRNA(例如，dsRNA)具有等于或小于0.02nM，例如，在0.0005和0.02nM之间、在0.001和0.02nM之间、在0.005和0.02nM之间、或在0.01和0.02nM之间的IC50。在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)具有在0.01-1nM范围内的IC50。
在实施例中，在此描述的方法改善与LECT2有关的障碍相关的症状(例如，LECT2淀粉样变性)。
在实施例中，在此描述的方法抑制受试者中LECT2基因的表达。
在实施例中，在此描述的方法抑制淀粉样蛋白沉淀，(例如，通过抑制淀粉样蛋白沉淀或减少淀粉样蛋白沉淀，例如，通过减少淀粉样蛋白沉淀物的大小、数量、或程度)。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)或包括iRNA的组合物是根据剂量方案给予的。
在实施例中，该受试者是墨西哥后裔(例如，墨西哥裔美国人)。
在实施例中，该受试者携带LECT2基因的G等位基因，该G等位基因编码成熟蛋白中位置40处(在未加工蛋白中的氨基酸58)的缬氨酸。在实施例中，该受试者针对G等位基因(G/G基因型)是纯合的。
在实施例中，在受试者中表达的LECT2蛋白在成熟蛋白中的位置40处(或在未加工蛋白中的氨基酸58处)具有缬氨酸。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)或包括iRNA的组合物是例如根据剂量方案重复给予的。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)或包括iRNA的组合物是皮下给予。在实施例中，iRNA是处于GalNAc共轭物的形式。在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)以0.5-50mg/kg的剂量给予。在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)是处于GalNAc共轭物的形式并且是以1至10mg/kg的剂量给予。
在一方面，在此提供的是一种载体，该载体编码如在此描述的iRNA(例如，dsRNA)的至少一条链。
在一方面，在此提供的是一种编码dsRNA的至少一条链的载体，其中所述dsRNA包括与编码LECT2的mRNA的至少一部分互补的区域，其中所述dsRNA长度是30个或更少碱基对，并且其中所述dsRNA靶向所述mRNA以便切割。
在实施例中，该互补区域长度是至少15个核苷酸。
在实施例中，该互补区域长度是19至21个核苷酸。
在一方面，本发明提供一种用于抑制细胞中LECT2基因表达的载体。在一个实施例中，载体包括如在此所述的iRNA。在一个实施例中，该载体包含与核苷酸序列可操作连接的至少一种调节序列，其中所述核苷酸序列编码如本文所述的iRNA的至少一条链。在一个实施例中，载体包括LECT2iRNA的至少一条链。
在一个方面中，在此提供的是一种细胞，该细胞包括如在此所述的载体。
在一方面，在此提供的是一种细胞，该细胞包括用于抑制细胞中LECT2基因表达的载体。该载体包括与核苷酸序列可操作连接的调节序列，其中所述核苷酸序列编码如本文所述的iRNA的至少一条链。
在此提交的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文结合。
在下文描述中叙述本发明的不同实施方案的详细内容。本发明的其他特征、目的以及优点将通过以下说明、附图以及权利要求书而清楚。
附图说明
图1描绘了人类LECT2 mRNA转录物序列(参比序列NM_002302.2GI：59806344，记录日期2013年4月17日，SEQ ID NO：1)。
发明的详细说明
iRNA通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程引导mRNA的序列特异性降解。在此描述了iRNA和使用它们用于调节(例如，抑制)LECT2基因表达的方法。还提供了用于治疗与LECT2表达相关的障碍，如淀粉样变性(例如，LECT2淀粉样变性)的方法。
在此表征的组合物的iRNA包括RNA链(反义链)，该RNA链具有一个区域，该区域是30个或更少个核苷酸长度，即，15-30个核苷酸长度，通常是19-24个核苷酸长度，该区域基本上与LECT2基因的mRNA转录物(在此还称作“LECT2-特异性iRNA”)的至少一部分互补。这种iRNA的使用使得靶向降解基因的mRNA成为可能，该基因在与LECT2表达相关的障碍中涉及，如在此描述的。非常低剂量的LECT2-特异性iRNA可以特异性且高效地介导RNAi，导致LECT2基因表达的显著抑制。靶向LECT2的iRNA可以特异性且高效地介导RNAi，导致LECT2基因表达的显著抑制，例如，其可以在基于细胞的测定中评估。
以下描述公开了怎样制备和使用包含iRNA的组合物以调节(例如，抑制)LECT2基因表达，以及用于治疗与LECT2基因的表达相关的障碍的组合物和方法。
在本发明中表征的药物组合物的实施例包括具有反义链的iRNA，该反义链包括一个区域，该区域长度是30个或更少个核苷酸，通常长度是19-24个核苷酸，该区域基本上与LECT2基因的RNA转录物的至少一部分互补。
在一些方面，本发明中表征了包含LECT2iRNA和药学上可接受的载体的药物组合物、使用所述组合物抑制LECT2基因表达的方法和使用所述药物组合物来治疗与LECT2基因相关障碍(例如，LECT2淀粉样变性)的方法。
I.定义
为方便起见，在本说明书、实例以及所附权利要求书中使用的某些术语与短语的意义提供于下。如果在本说明书中的其他部分中的术语使用与在本部分提供的该术语的定义有明显偏差，应该以在本部分中的定义为准。
如在此使用的，“LECT2”是指白细胞趋化因子2(又称白细胞衍生的趋化物2、软骨调节素-II、chm-II或chm2)。参见，例如，山越(Yamagoe S)等人，基因组学(Genomics)，1998年3月15；48(3)：324-9。LECT2首先被鉴定为新颖的嗜中性粒细胞趋化蛋白，并且与软骨调节素II(软骨细胞和成骨细胞的生长刺激因子)一致。将人类LECT2基因映射到染色体5q31.1-q32。同前。
人类LECT2 mRNA转录物的序列可以在NM_002302.2(SEQ ID NO：1)处找到。小鼠LECT2 mRNA的序列可以在NM_010702.1并且在NM_010702.2处找到，并且大鼠LECT2 mRNA的序列可以在NM_001108405.1处找到。
分泌人类LECT2蛋白(16kDa蛋白)。由肝脏分泌LECT2蛋白。它与鸡myb-诱导的骨髓1蛋白的软骨调节素重复区域具有高度的序列相似性(ht中：//www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝LECT2；2013年8月29日登陆)。LECT2基因中的多态性已经与类风湿性关节炎相关。同前。
在不同组织中表达LECT2，这些组织包括脑和胃连同肝。小清水(Koshimizu)，Y和Ohtomi，M.(2010)脑研究(Brain Res)。1311：1-11。在使用间接的免疫过氧化物酶染色来研究在正常和患病人类中除了肝脏以外的器官和组织中LECT2的表达的研究中，发现LECT2一般在血管、内皮和平滑肌细胞，脂细胞，脑神经细胞、心尖部鳞状上皮、甲状旁腺细胞、汗液和皮脂腺腺上皮、哈索尔体(Hassall bodies)和一些免疫造血组织中的一些单核细胞中表达。这些蛋白一般是阴性的，尽管偶尔在成骨细胞，软骨细胞，心肌和骨骼肌细胞，胃肠道平滑肌细胞和某些组织的上皮细胞中是阳性染色。纳加伊(Nagai)等人，(1998)国际病理学(Pathol Int.)48(11)：882-6。
人类LECT2基因编码包括18个氨基酸信号肽的151个氨基酸。该分泌蛋白具有133个残基。已经确认在基因的外显子3中的核苷酸172处的G/A多态性(密码变更GTC到ATC)，并且解释了在未加工的蛋白的位置58处(或成熟蛋白的位置40)的缬氨酸或异亮氨酸的存在。G等位基因在欧洲后裔的个体中具有0.477的整体频率和0.6-0.7的频率范围。参见，班森(Benson)，M.D.等人，(2008)国际肾脏期刊(Kidney International)，74：218-222；墨菲(Murphy)，C.L.等人，(2010)美国肾脏病杂志(Am J Kidney Dis)，56(6)：1100-1107。患有LECT2淀粉样变性的患者典型针对G等位基因是纯合的。不希望受理论约束，已经提出用缬氨酸(G等位基因)替代埋入的异亮氨酸(A等位基因)侧链可以使蛋白脱稳，并且可以解释该LECT2变体的促淀粉样蛋白生成的倾向。墨菲(Murphy)，C.L.等人，(2010)美国肾脏病杂志(Am J Kidney Dis)，56(6)：1100-1107。
如在此使用的，“LECT2淀粉样变性”或“ALECT2”包括涉及淀粉样蛋白或淀粉样蛋白原纤维的沉淀的淀粉样变性，该淀粉样蛋白原纤维包含LECT2蛋白(例如，LECT2蛋白的任何多态变体)或LECT2蛋白的部分。LECT2蛋白可以是变体(例如，突变体)LECT2蛋白。该淀粉样变性可以是全身性的或局部的。在实施例中，该LECT2淀粉样变性涉及在肾和/或肝中淀粉样蛋白沉淀物。
“G”、“C”、“A”、“T”以及“U”每一者通常分别代表包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶以及尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”还可以指一种经修饰的核苷酸(如以下进一步详述)或一种替代性的置换部分。技术人员应很好地意识到，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶可以被其他部分置换而基本上不改变一种寡核苷酸(包括一种具有这种置换部分的核苷酸)的碱基配对特性。例如，而不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸发生碱基配对。因此，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明表征的的dsRNA的核苷酸序列中被一种包含例如肌苷的核苷酸所置换。在另一个实例中，寡核苷酸中任何地方的腺嘌呤和胞嘧啶可以分别地替换为鸟嘌呤和尿嘧啶，以形成与靶mRNA的G-U摇摆碱基配对。包含这类替换部分的序列适用于本发明表征的组合物和方法。
如在此使用的，术语“iRNA”、“RNAi”、“iRNA剂”、“RNAi剂”、或“iRNA分子”是指包含如在此定义的术语RNA的一种药剂，并且其例如经由RNA诱导的沉默复合物(RISC)路径介导RNA转录物的靶向切割。在一个实施例中，如在此所述的iRNA实现LECT2表达的抑制。ALECT2表达的抑制可以基于ALECT2 mRNA水平的下降或ALECT2蛋白水平的下降进行评估。如在此所使用的，“靶标序列”指的是在ALECT2基因的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。序列的靶部分将至少足够地长，以充当iRNA指导在这个部分或其附近切割的底物。例如，靶标序列总体上将是从9-36个核苷酸长度，例如，15-30个核苷酸长度，包括其之间的全部子范围。作为一个非限制性实例，靶序列可以具有从15-30个核苷酸、15-26个核苷酸、15-23个核苷酸、15-22个核苷酸、15-21个核苷酸、15-20个核苷酸、15-19个核苷酸、15-18个核苷酸、15-17个核苷酸、18-30个核苷酸、18-26个核苷酸、18-23个核苷酸、18-22个核苷酸、18-21个核苷酸、18-20个核苷酸、19-30个核苷酸、19-26个核苷酸、19-23个核苷酸、19-22个核苷酸、19-21个核苷酸、19-20个核苷酸、20-30个核苷酸、20-26个核苷酸、20-25个核苷酸、20-24个核苷酸、20-23个核苷酸、20-22个核苷酸、20-21个核苷酸、21-30个核苷酸、21-26个核苷酸、21-25个核苷酸、21-24个核苷酸、21-23个核苷酸或21-22核苷酸。
如在此所使用，术语“包含序列的链”是指包含一个核苷酸链的寡核苷酸，该核苷酸链通过使用标准核苷酸命名法提到的顺序来描述。
如在此所使用，并且除非另外指明，当用来描述与第二核苷酸序列相关的第一核苷酸序列时，术语“互补”是指包含该第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含该第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并且形成双链体结构的能力，如技术人员将理解。这样的条件可以例如是严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl，40mMPIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃持续12-16小时，接着洗涤。可以应用其他条件，比如可以在有机体中遇到的生理学相关条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用，确定最适宜于测试两个序列的互补性的条件集合。
在iRNA内部(例如，在如本文所述的dsRNA内部)的互补序列包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的整个长度范围内的碱基配对。此类序列在此可以称作相对于彼此“完全互补”。然而，在此在一个第一序列被称作相对于一个第二序列“基本上互补”的情况下，这两个序列可以是完全互补的，或者它们可以在针对高达30个碱基对的双链体杂交时形成一个或多个，但是总体上不多于5个、4个、3个或2个错配碱基配对，同时保留了在与它们的最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如，经由RISC路径的基因表达的抑制。然而，在两个寡核苷酸被设计为在杂交时形成一个或多个单链突出的情况下，此类突出不应该被认为是关于互补性确定的错配。例如，出于在此描述的目的，以下这样一种dsRNA也可以称作“完全互补”：该dsRNA包括一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸以及一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸，其中该更长的寡核苷酸包括一个与该更短的寡核苷酸完全互补的21核苷酸序列。
如在此所使用，就满足以上相对于它们杂交的能力而言的要求来说，“互补”序列还可以包括或完全形成自非沃森-克里克碱基对和/或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于G：U摇摆碱基配对或Hoogstein碱基配对。
本文的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可相对于在dsRNA的有义链与反义链之间，或iRNA剂的反义链与靶标序列之间的碱基配对使用，如将从其使用的上下文理解。
如在此使用的，与信使RNA(mRNA)的“基本上至少部分互补”的多核苷酸指与感兴趣的mRNA(例如，编码ALECT2蛋白的mRNA)的一个连续部分基本上互补的多核苷酸。)。例如，如果一个多核苷酸与编码LECT2的mRNA的一个非间断部分基本上互补，那么该序列则与LECT2 mRNA的至少一部分互补。作为另一个实例，如果一个多核苷酸与编码LECT2的mRNA的一个非间断部分基本上互补，那么该序列则与LECT2 mRNA的至少一部分互补。。
如在此所使用的，术语“双链RNA”或“dsRNA”指的是包括具有杂合的双链体区域的RNA分子或分子的复合体的iRNA，该区域包括两条反向平行的且基本上互补的核酸链，还可将其称之为相对于靶标RNA具有“有义”和“反义”取向。该双链体区可以是允许例如经RISC路径特异性降解所需靶标的任何长度，但是一般范围是从9至36个碱基对长度，例如，15-30个碱基对长度。就9和36碱基对之间的双链体时，双链体可以具有在这个范围内的任意长度，例如，9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36和其间的任何子范围，包括但不限于15-30碱基对、15-26碱基对、15-23碱基对、15-22碱基对、15-21碱基对、15-20碱基对、15-19碱基对、15-18碱基对、15-17碱基对、18-30碱基对、18-26碱基对、18-23碱基对、18-22碱基对、18-21碱基对、18-20碱基对、19-30碱基对、19-26碱基对、19-23碱基对、19-22碱基对、19-21碱基对、19-20碱基对、20-30碱基对、20-26碱基对、20-25碱基对、20-24碱基对、20-23碱基对、20-22碱基对、20-21碱基对、21-30碱基对、21-26碱基对、21-25碱基对、21-24碱基对、21-23碱基对或21-22碱基对。细胞中通过Dicer和相似酶加工产生的dsRNA通常具有范围19-22的碱基对长度。dsDNA的双链体区的一条链包含与靶RNA的区域基本上互补的序列。形成双链体结构的两个链可以来自具有至少一个自身互补区域的单一RNA分子，或可以由两个或更多个独立RNA分子组成。当该双链体区是形成自单个分子的两条链时，该分子可以在一条链的3’-端与形成该双链体结构的各自的另一条链的5’-端之间具有由核苷酸的一个单链的链分隔开的一个双链体区(在此称为“发夹环”)。发夹环可以包括至少一个未成对的核苷酸；在一些实施例中，发夹环可以包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个未配对的核苷酸。当dsRNA的两个基本上互补的链包含单独的RNA分子时，这些分子不是必须的，但是可以共价连接。当这两条链通过除发夹环之外的方式共价连接时，该连接结构被称为“接头”。术语“siRNA”还可以在此用作指代以上所述的dsRNA。
在另一个实施例中，该iRNA剂可以是被引入到细胞或组织中以抑制靶标mRNA的一个“单链siRNA”。单链RNAi剂结合到RISC核酸内切酶Argonaute 2上，该核酸内切酶然后切割该标靶mRNA。这些单链siRNA通常是15-30个核苷酸并且是化学修饰的。单链siRNA的设计和检测描述于美国专利号8,101,348中，以及利马(Lima)等人，(2012)《细胞》(Cell)150：883-894中，特此将它们各自的全部内容通过引用结合在此。在此描述的反义核苷酸序列中的任一个(例如，表2-3、5-6和9-10中提供的序列)可用作单链siRNA，如在此所述的或如通过利马等人，(2012)细胞150；：883-894中描述的进行了化学修饰的。
在另一方面，RNA剂是一种“单链的反义RNA分子”。单链的反义RNA分子是与靶标mRNA之内的一个序列互补的。单链的反义RNA分子能以化学计量的方式通过与该mRNA碱基配对并且物理性地阻碍翻译装置来抑制翻译，参见蒂尔斯(Dias，N.)等人，(2002)分子癌症治疗学(Mol.Cancer Ther.)1：347-355。可替代地，该单链的反义分子通过杂交至靶标并通过RNaseH切割事件切割靶标来抑制靶标mRNA。该单链反义RNA分子的长度可以是约10至约30个核苷酸并且具有与靶序列互补的序列。在一个实施例中，该单链的反义RNA分子可以包括一种序列，该序列是与在此所描述的靶位点中任一个互补的至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多个连续核苷酸，例如，在表2-3、5-6和9-10的任一个中所提供的序列。在另一个实施例中，该单链的反义RNA分子可以包括一种序列，该序列是来自在此所述的反义核苷酸序列中任一个的至少大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸，例如，表2-3、5-6和9-10中的任一个中提供的序列。
熟练技术人员将意识到术语“RNA分子”或“核糖核酸分子”不仅包括自然中表达或发现的RNA分子，而且还包括包含一个或多个核糖核苷酸/核糖核苷类似物或衍生物的RNA的类似物或衍生物，如在此所述的或如本领域中已知的。严格来说，“核糖核苷”包括核苷碱基和核糖，并且“核糖核苷酸”是具有一个、两个或三个磷酸部分的一种核糖核苷。然而，如在此使用的，术语“核糖核苷”和“核糖核苷酸”可以被认为是相等的。例如，如下文所述，可以在核碱基结构、在核糖结构中或在核糖-磷酸酯主链结构中修饰RNA。然而，包含核糖核苷类似物或衍生物的分子必须保留形成双链体的能力。作为非限制性实例，RNA分子也可以包括至少一个修饰的核糖核苷，其包括但不限于2′-O-甲基修饰的核苷，包括5′硫代磷酸酯基的核苷、与胆甾醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基连接的末端核苷、锁核苷、脱碱基核苷、无环核苷、2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷、2′-氨基修饰的核苷，2′-烷基修饰的核苷，吗啉代核苷、磷酰胺酯或包括非天然碱基的核苷，或其任意组合。可选地，RNA分子可以包含至少两个修饰的核糖核苷、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少31个或更多个修饰的核糖核苷，直到dsRNA分子的整个长度。对于RNA分子中这些多个修饰的核糖核苷中的每一个，修饰不需要是相同的。在一个实施例中，经构思用本文所述方法和组合物中的修饰RNA是具有形成所需双链体结构的能力并且经，例如RISC途径允许或介导靶RNA特异性降解的肽核酸(PNA)。
在一个方面，修饰的核糖核苷包括脱氧核糖核苷。在这种情况下，iRNA剂可以包含一个或多个脱氧核苷，包括例如脱氧核苷突出端或在dsRNA的双链部分内部的一个或多个脱氧核苷。在某些实施例中，例如，在一个或两个链中，该RNA分子包括至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高(但不是100％)脱氧核糖核苷的脱氧核糖核苷百分比。在其他实施例中，术语“iRNA”并不涵盖双链DNA分子(例如，天然发生的双链DNA分子或100％包含脱氧核苷的DNA分子)。
在一个方面，RNA干扰剂包括与靶RNA序列相互作用以指导靶RNA切割的单链RNA。不希望受理论约束，引入细胞中的长的双链RNA由称作Dicer的III型核酸内切酶分解成siRNA(夏普(Sharp)等人，基因和发育(Genes Dev.)2001，15：485)。Dicer(核糖核酸酶-III样酶)使dsRNA加工成具有特征性的两个碱基3′突出端的19-23个碱基对短干扰RNA(伯恩斯坦(Bernstein)等人，(2001)自然(Nature)409：363)。然后将siRNA结合到一种RNA诱导沉默复合体(RISC)中，其中一种或多种螺旋酶使siRNA双链体展开，从而能够实现互补反义链导引靶标识别(尼卡能(Nykanen)等人，(2001)细胞(Cell)107：309)。一旦与适宜的靶mRNA结合，RISC内部的一种或多种核酸内切酶切割靶以诱导沉默(巴希尔(Elbashir)等人，(2001)基因与发育(Genes Dev.)15：188)。因此，在一个方面，本发明涉及了促进实现靶基因沉默的RISC复合物形成的单链RNA。
如在此所使用的，术语“核苷酸突出”是指至少一个非配对的核苷酸，其从iRNA的双链体结构(例如，dsRNA)突出。例如，当dsRNA的一条链的3′-端延伸超过另一条链的5′-端时或反之亦然，存在核苷酸突出端。dsRNA可以包括具有至少一个核苷酸的突出端；替代地该突出端可以包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出端可以包括核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。一个或多个突出端可以处于有义链、反义链或其任意组合上。另外，突出端的一个或多个核苷酸可以存在于dsRNA的反义或有义链的5′末端、3′末端或两个末端上。
在一个实施例中，dsRNA的反义链在3′末端和/或5′末端具有一个1-10个核苷酸突出端。在一个实施例中，dsRNA的有义链在3′末端和/或5′末端具有一个1-10个核苷酸突出端。在另一个实施例中，突出中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
关于dsRNA，在此使用的“平端”或“平末端”是指在dsRNA的给定的末端没有非配对的核苷酸或核苷酸类似物，即，没有核苷酸突出。dsRNA的一个或两个末端可以是平端。当dsRNA的两个末端都是平末端，该dsRNA被称为平末端的。为了清楚起见，一个“平末端的”dsRNA是一个在其两端齐平的dsRNA，即，在该分子的任何一端都没有核苷酸突出。大多数情况下，这种分子将在其整个长度范围内是双链的。
术语“反义链”或“引导链”是指iRNA链，例如，dsRNA，其包括一个区域，该区域基本上与靶标序列互补。如在此所使用的，术语“互补性区域”指的是该反义链上基本上与一个序列互补的区域，例如如在此定义的一个靶标序列。其中互补区域不与靶序列完全互补的情况下，错配可以存在于分子的内部或末端区域内。通常，最耐受的错配存在于末端区域内，例如，在5′和/或3′末端的5、4、3或2个核苷酸内部。
如在此所使用的，术语“有义链”或“过客链”指的是包括与在此定义的术语反义链的一个区域基本上互补的一个区域的iRNA链。
如在此使用的，术语“SNALP”是指一种稳定的核酸-脂质颗粒。SNALP代表包覆缩减的含水内部的脂质囊泡，该含水内部包含核酸如iRNA或从中转录出iRNA的质粒。SNALP例如在美国专利申请公开号2006/0240093、2007/0135372中并且在国际申请号WO 2009/082817中描述。这些申请以其全文通过引用结合在此。
当提及iRNA时，“引入细胞内”意思是促进或影响摄取或吸收进入该细胞，如本领域内的普通技术人员所理解的。吸收或摄取iRNA可以通过无协助扩散过程或主动细胞过程或借助助剂或装置发生。该术语的含义并不限于体外的细胞；iRNA还可“被引入至细胞”，其中所述细胞是活的生物的一部分。在这种情况下，引入细胞中将包括递送至生物。例如，对于体内递送，可以将iRNA注射至组织部位中或全身施用。体内递送还可以通过β-葡聚糖递送***，如美国专利号5,032,401和5,607,677以及美国公开号2005/0281781中所描述的那些，将它们通过引用以其全文结合于此。体外引入细胞内包括本领域内已知的方法，例如电穿孔以及脂质转染法。另外的方法描述下文或在本领域内是已知的。
如在此使用的，术语“调节...的表达”是指与LECT2在对照细胞中的表达相比，至少部分“抑制”或部分“激活”LECT2基因在用如在此所述的iRNA组合物治疗过的细胞中的表达。对照细胞包括未处理的细胞或用非靶标对照iRNA处理的细胞。
术语“激活”、“增强”、“上调...的表达”、“增加...的表达”等，只要它们是指LECT2基因，在此是指至少部分激活LECT2基因的表达，表示为：可从LECT2基因在其中转录的一个第一细胞或一组第一细胞(已经经过治疗由此LECT2基因的表达被增加)中分离的LECT2mRNA的量增加，这是与一个第二细胞或一组第二细胞(对照细胞)相比，其与该一个第一细胞或一组第一细胞实质上相同，除了未经受如此的治疗。
在一个实施例中，通过给予如在此描述的iRNA激活LECT2基因表达至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施例中，通过给予本发明中表征的iRNA激活LECT2基因至少约60％、70％或80％。在一些实施例中，通过给予如本文所述的iRNA激活LECT2基因表达至少约85％、90％或95％或更多。在一些实施例中，与未治疗的细胞中的表达相比，LECT2基因表达在用如本文所述的iRNA治疗的细胞中增加至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更多倍。通过小dsRNA激活表达例如在李(Li)等人，2006美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)103：17337-42中并且在US 2007/0111963和US 2005/226848中描述，所述文献的每一篇通过引用方式结合在此。
术语“沉默”、“抑制...的表达”、“下调...的表达”、“抑制...的表达”等，只要它们是指LECT2基因，在此是指至少部分地抑制LECT2基因的表达，这是基于例如，LECT2 mRNA表达、LECT2蛋白表达、或与LECT2基因表达功能性相联系的另外的参数进行评估的。例如，LECT2表达的抑制可被表示为：与对照相比，可从LECT2基因在其中转录的一个第一细胞或一组第一细胞(已经经过治疗由此LECT2基因的表达被抑制)中分离的LECT2 mRNA的量减少。对照可以是一个第二细胞或一组第二细胞，其与该一个第一细胞或一组第一细胞实质上相同，除了该第二细胞或该组第二细胞未经受如此的处理(对照细胞)。抑制程度通常表示为对照水平的百分比，例如，
可替代地，抑制程度能以与LECT2基因表达功能性相联系的参数的降低而给出，例如LECT2基因编码的蛋白的量。与LECT2基因表达功能性相联系的参数的降低可以类似地表示为对照水平的百分比。原则上，LECT2基因沉默可以在(组成型地或通过基因组工程化)表达LECT2的任何细胞中通过任何合适的测定来确定。
例如，在某些情况下，通过给予在此披露的iRNA将LECT2基因表达抑制至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施例中，通过给予本文所披露的iRNA将LECT2基因抑制至少约60％、65％、70％、75％、或80％。在一些实施例中，通过给予如本文所述的iRNA将LECT2基因抑制至少约85％、90％、95％、98％、99％、或更多。
在本披露的上下文中，术语“治疗(treat，treatment)”等等意指预防、减轻或缓解与和LECT2表达有关的障碍相关的至少一种症状，或减缓或逆转这种障碍的进展或预期的进展例如，当使用来治疗LECT2淀粉样变性的时候，在此表征的方法可以用来抑制淀粉样蛋白沉淀，来减少或防止淀粉样变性的一种或多种症状，或来减少相关病症的风险或严重性(例如，肾病综合征或肝炎)。因此，除非在上下文中另外明确的指出，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”以及等等意在包含预防，例如，预防与LECT2表达相关的失调和/或失调的症状。
在疾病标记或症状的背景下，“降低”意为任何减少，例如，此水平的统计学上或临床上的显著减少。例如，该减少可以是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％。该减少可以下降至没患有这种障碍的个体的正常范围内的可接受的水平。
如在此所使用的，短语“治疗有效量”以及“预防有效量”等等指这样一个量，该量在治疗、预防或管理与LECT2表达相关的任何障碍或病理过程中提供一个治疗上的益处。治疗有效的具体量可以根据本领域内已知的因素而变化，像例如，障碍或病理学过程的类型、患者病史以及年龄、障碍或病理学过程的阶段、以及其他疗法的给予。
如在此所使用的，“药物组合物”包括药理学有效量的iRNA以及药学上可接受的载体。如在此所使用的，“药理学有效量”、“治疗有效量”或简言之的“有效量”指有效产生预期的药理学、治疗或预防结果的iRNA的量。例如，在治疗与LECT2表达相关的障碍(例如，LECT2淀粉样变性)的方法中，有效量包括有效减少与LECT2淀粉样变性有关的一种或多种症状的量，有效抑制淀粉样蛋白沉淀(例如，LECT2淀粉样蛋白沉淀)的量，或有效减少形成与LECT2淀粉样变性有关的病症的风险的量。例如，如果当一个与一种疾病或病症相关联的可测量的参数减少至少10％时，一个给定的临床治疗才被认为是有效的，那么一种用于该疾病或病症的治疗的药物的治疗的有效量是获得该参数至少减少10％所需要的一个量。例如，治疗有效量的靶向LECT2的iRNA可以将LECT2 mRNA的水平或LECT2蛋白的水平降低任何可测量的量，例如，至少10％、20％、30％、40％或50％。
术语“药学上可接受的载体”指用于一种治疗剂的给予的载体。此类载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇、及其组合。该术语特别地排除细胞培养基。对于口服给予的药物，药学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的赋形剂，比如惰性稀释剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠以及碳酸钙、磷酸钠以及磷酸钙，以及乳糖，而玉米淀粉以及褐藻酸是合适的崩解剂。结合剂可以包括淀粉以及明胶，而润滑剂(如果存在的话)将通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。如果希望的话，可以将片剂用一种材料进行包衣，比如单硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯，以延迟在胃肠道中的吸收。下文进一步描述药物制剂所包含的药剂。
当提及数字或数值范围时，术语“约”是指所提及的数字或数值范围是在一个实验变异内(或在统计实验误差内)的近似值，并且由此该数字或数值范围可以从，例如，所陈述数字或数值范围的1％与15％之间变化。
II.iRNA剂
本文中描述了调节(例如，抑制)LECT2基因表达的iRNA剂。
在一些实施例中，该iRNA剂激活LECT2基因在细胞或哺乳动物中的表达。
在一些实施例中，该iRNA剂包括用于在细胞或受试者中(例如，哺乳动物中，例如，人类中)抑制LECT2基因的表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子，其中该dsRNA包括一个具有互补性区域(该区域与在LECT2基因表达中形成的mRNA的至少一部分互补)的反义链，并且其中该互补性区域的长度小于或等于30个核苷酸，通常长度是19-24个核苷酸，并且其中该dsRNA在与表达该LECT2基因的细胞相接触时将该LECT2基因的表达抑制至少10％、20％、30％、40％、或50％。
LECT2基因的表达的调节(例如，抑制)可以通过，例如，PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法，或通过基于蛋白的方法，如，通过蛋白质印迹来评估。可以通过测量LECT2 mRNA水平，如通过bDNA或TaqMan测定法，或使用例如蛋白质印迹法或流式细胞技术通过测量蛋白质水平，如通过免疫荧光分析，测定细胞培养物中如COS细胞、HeLa细胞、原代肝实质细胞、HepG2细胞、原代培养物细胞中或在来自受试者的生物样本中的LECT2基因表达。
dsRNA包括两个RNA链，它们足够地互补以在其中将使用dsRNA的条件下杂交形成一个双链体结构。dsRNA的一条链(反义链)包括一个互补区域，该区域基本上是与衍生自LECT2基因表达过程中形成的mRNA的序列的靶标序列互补的，通常是完全互补的。另一条链(有义链)包括与反义链互补的区域，从而在适合的条件下组合时，这两条链杂交并形成双链体结构。通常，该双链体结构具有15和30之间并包括15和30碱基对长度，更通常地具有18和25之间并包括18和25碱基对长度，然而更通常地具有19和24之间并包括19和24个碱基对长度，并且更通常地具有19和21个之间并包括19和21个碱基对长度。同样地，与靶标序列互补的区域具有15和30个之间并包括15和30个核苷酸长度，更通常地具有18和25个之间并包括18和25个核苷酸长度，然而更通常地具有19和24个之间并包括19和24个核苷酸长度，并且最通常地具有19和21个之间并包括19和21个核苷酸长度。
在一些实施例中，dsRNA具有15和20个之间并包括15和20个核苷酸长度，并且在其他实施例中，dsRNA具有25和30个之间并包括25和30个核苷酸长度。如普通技术人员将认识，被靶向以便切割的RNA的靶向区域将最经常是较大RNA分子(往往mRNA分子)的部分。在相关的情况下，mRNA靶标的“一部分”是mRNA靶标的连续序列，其长度足够作为RNAi指导的切割的底物(即，经RISC途径的切割)。在一些情况下，具有短至9个碱基对的双链体的dsRNA可以介导RNAi指导的RNA切割。最经常地，靶标将是至少15个核苷酸长度，例如，15-30个核苷酸长度。
本领域技术人员将也认识到，双链体区是dsRNA的主要功能性部分，例如，9至36个碱基对(例如，15-30个碱基对)的双链体区。因此，在一个实施例中，为了达到被加工成导引所需RNA切割的(例如，15-30个碱基对)功能性双链体，具有大于30个碱基对的双链体区的RNA分子或RNA分子复合物是dsRNA。因此，随后，普通技术人员将认识到在一个实施例中miRNA是dsRNA。在另一个实施例中，dsRNA不是天然存在的miRNA。在另一个实施例中，用于靶向LECT2表达的iRNA剂不是在靶标细胞中通过切割较大dsRNA产生的。
如本文所述的dsRNA可以进一步包含一个或多个单链核苷酸突出。该dsRNA可以通过如进一步在以下所讨论的、本领域内已知的标准方法来进行合成，例如，通过使用自动化的DNA合成仪，比如从例如生物研究公司(Biosearch)、应用生物***公司(AppliedBiosystem公司)可商购的合成仪。
在一个实施例中，LECT2基因是人类LECT2基因。在另一个实施例中，LECT2基因是小鼠或大鼠LECT2基因。
在具体实施例中，该dsRNA包括有义链个反义链，该有义链包括选自表2-3、5-6和9-10中提供的有义序列，或由其组成，该反义链包括选自表2-3、5-6和9-10中提供的反义序列，或由其组成。
在一方面，dsRNA将至少包括有义和反义核苷酸序列，由此有义链选自表2-3、5-6和9-10中提供的序列，并且该相应的反义链选自表2-3、5-6和9-10中提供的序列。
在这些方面中，两个序列的一者与两个序列的另一者互补，其中这些序列中的一者与LECT2基因表达中产生的mRNA的序列基本上互补。如此，dsRNA将包括两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸描述为有义链，并且第二个寡核苷酸描述为相应的反义链。如在此的其他地方所描述并且如本领域中所知，与处于单独的寡核苷酸上相反，dsRNA的互补序列还可以被包含作为单一核酸分子的自我互补区。
熟练的技术人员将很好的意识到，具有20与23之间个碱基对(但是特别是21个碱基对)的双链结构的dsRNA被奉为是尤其有效地诱导RNA干扰(厄尔巴瑟等人，EMBO 2001，20：6877-6888)。然而，其他人已经发现较短或较长的RNA双链体结构物也可以是有效的。
在上文描述的实施例中，由于表2-3、5-6和9-10中提供的寡核苷酸序列的性质，本文所述的dsRNA可以包括长度最小19个核苷酸的至少一条链。可以合理地预期，具有表2、3、5、6、9或10中的序列之一的、在一个末端或两个末端减去仅仅数个核苷酸的更短的双链体与以上描述的dsRNA相比将类似地有效。
在一些实施例中，该dsRNA具有含有来自表2、3、5、6、9或10中的序列之一的至少15、16、17、18、19、20、或更多连续核苷酸的部分序列。
在一些实施例中，该dsRNA具有反义链和有义链，该反义链包括表2中提供的反义序列的至少15、16、17、18、或19个连续核苷酸，该有义链包括表2中提供的相应的有义序列的至少15、16、17、18、或19个连续核苷酸。
在一些实施例中，该dsRNA包括反义链和有义链，该反义链包括表3中提供的反义序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、或23个连续核苷酸，该有义链包括表3中提供的相应的有义序列的至少15、16、17、18、19、20、或21个连续核苷酸。
在一些实施例中，该dsRNA包括反义链和有义链，该反义链包括表5中提供的反义序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、或23个连续核苷酸，该有义链包括表5中提供的相应的有义序列的至少15、16、17、18、19、20、或21个连续核苷酸。
在一些实施例中，该dsRNA包括反义链和有义链，该反义链包括表6中提供的反义序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、或23个连续核苷酸，该有义链包括表6中提供的相应的有义序列的至少15、16、17、18、19、20、或21个连续核苷酸。
在一些实施例中，该dsRNA包括反义链和有义链，该反义链包括表5中提供的反义序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、或23个连续核苷酸，该有义链包括表9中提供的相应的有义序列的至少15、16、17、18、19、20、或21个连续核苷酸。
在一些实施例中，该dsRNA包括反义链和有义链，该反义链包括表6中提供的反义序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、或23个连续核苷酸，该有义链包括表10中提供的相应的有义序列的至少15、16、17、18、19、20、或21个连续核苷酸。
在一些这种实施例中，尽管该dsRNA包括表2、3、5、6、9或10中提供的序列的仅一部分，但是它在抑制LECT2表达水平方面与包括表2、3、5、6、9或10中所提供的全长序列的dsRNA是等效的。在一些实施例中，与包括在此披露的全序列的dsRNA相比，该dsRNA在其抑制LECT2基因的表达水平方面相差不超过5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50％的抑制。
表2-3、5-6和9-10中提供的iRNAs鉴定到LECT2转录物中对RISC介导切割敏感的位点。就这一点而论，本发明进一步表征了靶向这类序列之一内部的iRNA。如在此所使用，如果iRNA在具***点内的任何地方促进转录物的切割，则称该iRNA在RNA转录物的具***点内靶向。这种iRNA通常将包括来自表2-3、5-6和9-10中提供的序列之一的至少15个连续核苷酸，所述连续核苷酸与从LECT2基因中的选择序列保持连续的区域所取得的另外核苷酸序列连接。
尽管靶序列总体上是15-30个核苷酸长度，但是在这个范围内的特定序列指导任何给定靶RNA切割的适用性方面存在广泛变异。在此陈述的不同软件包和指南提供了用于针对任意给定基因靶标识别最优靶标序列的指南，但是还可以采取一种经验主义的方法，其中给定大小的“窗口”或“掩码”(作为一个非限制性实例，21个核苷酸)被照字面的或象征性地(包括，例如，计算机模拟)放置在靶标RNA序列上以识别可用作靶标序列的大小范围内的序列。通过移动该序列“窗口”渐进初始靶标序列位置的一个核苷酸上游或下游，可以鉴别下一个潜在的靶标序列，直到针对所选择的任何给定的靶标尺寸鉴别可能的序列的全套。这个过程(加上为了鉴定最佳执行的那些序列的所鉴定的序列的***合成和测试(使用此处所述的或如本领域中已知的测定))可以鉴定当用一种iRNA剂靶向时介导靶基因表达的最好抑制的那些RNA序列。因此，当例如在表2-3、5-6和9-10中鉴定的序列表示有效靶标序列时，在此考虑了可以通过以下方式实现抑制效力的进一步优化：沿着给定序列的上游或下游的一个核苷酸逐步地“窗口步移”来鉴别具有相同或更好抑制特性的序列。
另外，考虑了对于例如在表2-3、5-6和9-10中鉴定的任何序列，可以通过以下方式实现进一步优化：***地添加或移走核苷酸以产生较长或较短的序列，并且测试通过从该点上游于或下游于靶标RNA步移具有更长或更短尺寸的窗口所产生的那些序列。再次地，使这种方案与产生新候选物靶联系，同时在如本领域已知或如本文所述的抑制测定法中基于这些靶序列测试iRNA的有效性，可以导致效率抑制的进一步改善。再者，可以例如通过引入如本文所述或如本领域已知的修饰核苷酸、添加或改变突出端或如本领域已知和/或本文中讨论的其他修饰，调节这类优化的序列以便进一步优化该分子(例如，增加血清稳定性或循环半寿期、增加热稳定性、增强跨膜递送、靶向特定位置或细胞类型、增加与沉默途径酶的相互作用、增加从内体放中等)作为表达抑制剂。
如本文所述的iRNA可以含有一个或多个相对于靶标序列的错配。在一个实施例中，如本文所述的iRNA含有不多于3个错配。如果iRNA的反义链含有相对于靶序列的错配，则优选错配区域不应当位于互补区域的中心内。如果iRNA的反义链含有相对于靶序列的错配，则优选错配区域应当局限于距互补区域5′或3′末端的最末5个核苷酸内部。例如，对于与LECT2基因的某区域互补的23个核苷酸iRNA剂的RNA链而言，RNA链通常在中央13个核苷酸内部不含任何错配。本文所述的方法或本领域已知的方法可以用来确定含有相对于靶序列的错配的iRNA是否有效抑制LECT2基因表达。考虑具有错配的iRNA在抑制LECT2基因表达方面的效率是重要的，尤其是如果LECT2基因中的互补性具体区域已知在群体内具有多态性序列变异。
在一个实施例中，dsRNA的至少一个端具有1至4个、总体上1或2个核苷酸的单链核苷酸突出端。具有至少一个核苷酸突出的dsRNA相对于它们的平末端的对应物，具备出乎意料优越的抑制性特性。在又一个实施例中，将iRNA(例如，dsRNA)的RNA进行化学修饰以增强稳定性或其他有益特征。本发明中表征的核酸可以通过本领域充分建立的方法合成和/或修饰，如在“核酸化学实验室指南(Current protocols in nucleic acid chemistry)”，毕克奇(Beaucage，S.L.)等人(编著)，约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons，Inc.)，美国纽约(New York，NY，USA)中描述的那些方法，所述文献因此通过引用方式结合在此。修饰包括例如(a)末端修饰，例如，5′末端修饰(磷酸化、共轭、倒置键等)、3′末端修饰(共轭、DNA核苷酸、倒置键等)，(b)碱基修饰，例如，替换为稳定性碱基、去稳定性碱基或与扩充的配偶物库发生碱基配对的碱基、移除碱基(脱碱基核苷酸)、或共轭的碱基，(c)糖修饰(例如，在2′位置或4′位置，或具有无环糖)或糖的替换，以及(d)主链修饰，包括修饰或替换磷酸二酯键。在本发明中的有用的RNA化合物的具体实例包括但不限于含有修饰主链或无天然核苷间键的RNA。具有修饰骨架的RNA除其他之外包括在骨架中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的和如有时本领域中谈及，也可以将在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰RNA视为寡核苷。在具体的实施例中，修饰的RNA将在其核苷间主链中具有磷原子。
修饰的RNA骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，包括3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、磷酰胺酯，包括3′-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′键的硼烷磷酸酯、这些酯的2′-5′连接的类似物，和具有反转极性的那些酯，其中相邻对的核苷单位为3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′连接。还包括不同盐、混合盐以及游离酸形式。
教授制备以上含磷键的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号3,687：808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；以及美国专利RE39464，所述文献的每一篇通过引用方式结合在此。
其中不包含磷原子的修饰的RNA骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子核苷间键或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有以下结构的那些：吗啉代键联(从核苷的糖部分中部分地形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；含烯的骨架；氨基磺酸盐骨架；亚甲亚氨基和亚甲肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH2组分部分的其他骨架。
教授制备以上寡核苷的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，所述文献的每一篇通过引用方式结合在此。
在适合用于或构思用于iRNA的其他RNA模拟物中，将核苷酸单位的糖和核苷间键即主链替换为新基团。保持碱基单元以与适当的核酸靶标化合物杂交。一种这样的低聚化合物(已经显示具有优异杂交特性的RNA模拟物)被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖骨架被含有酰胺的骨架置换，具体是氨基乙基甘氨酸骨架。这些核碱基得以保持并且直接或间接地结合至该骨架的酰胺部分的氮杂氮原子上。教授制备PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号5,539,082；5,714,331；以及5,719,262，所述文献的每一篇通过引用方式结合在此。对PNA化合物的其他教授内容可以在例如尼尔森(Nielsen)等人，科学(Science)，1991，254，1497-1500中找到。
本发明中表征的一些实施例包括具有硫代磷酸酯主链的RNA和具有杂原子主链的寡核苷，并且尤其上文所参考美国专利号5,489,677的--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称作亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--、和--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯主链表述为--O--P--O--CH2--]，和上文所参考美国专利号5,602,240的酰胺主链。在一些实施例中，在此表征的RNA具有上文所参考美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构。
经修饰的RNA还可以含一个或多个经取代的糖部分。在此表征的iRNA(例如dsRNA)可以在2′位置包括以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中该烷基、烯基以及炔基可以是被取代的或未被取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性适合的修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是从1至约10。在其他实施例中，dsRNA在2’位置处包括以下之一：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基因基团、嵌入剂、用于改进iRNA的药物代谢动力学特性的基团或用于改进iRNA的药效特性的基团以及具有类似特性的其他取代基。在一些实施例中，该修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O--CH2CH2OCH3，也称作2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(马丁(Martin)等人，瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)，1995，78，486-504)，即，烷氧基-烷氧基基团。另一个示例修饰是2’-二甲基氨基氧乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称作2′-DMAOE，以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称作2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即2′-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。
在其他实施例中，iRNA剂包括一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或更多个)无环核苷酸(或核苷)。在某些实施例中，该有义链或该反义链或有义链和反义链二者，包括少于五个无环核苷酸/链(例如，四个、三个、两个或一个无环核苷酸/链)。该一个或多个无环核苷酸可以发现于，例如，iRNA剂的有义或反义链的，或两个链的双链区域中；有义或反义链的，或两个链的5’-端、3’-端、5’和3’-端二者处。在一个实施例中，一个或多个无环核苷酸存在于有义或反义链，或二者的位置1至8处。在一个实施例中，一个或多个无环核苷酸发现于反义链中，从反义链的5’-端的位置4至10(例如，位置6-8)处。在另一个实施例中，该一个或多个无环核苷酸发现于iRNA剂的一个或两个3’-末端突出端处。
如在此使用的术语“无环核苷酸”或“无环核苷”是指具有无环糖，例如，无环核糖的任何核苷酸或核苷。示例性无环核苷酸或核苷可以包括核碱基，例如，天然发生的或修饰的核碱基(例如，如在此描述的核碱基)。在某些实施例中，在任何核糖碳(C1、C2、C3、C4、或C5)之间的键从该核苷酸是独立地或结合地不存在的。在一个实施例中，在核糖环的C2-C3碳之间的键是不存在的，例如，无环2’-3’-开环核苷酸单体。在其他实施例中，在C1-C2、C3-C4、或C4-C5之间的键是不存在的(例如，1’-2’、3’-4’或4’-5’开环核苷酸单体)。实例性无环核苷酸披露于US 8,314,227，通过引用以其全文结合在此。例如，无环核苷酸可以包括US8,314,227的图1-2中的任何单体D-J。在一个实施例中，该无环核苷酸包括以下单体：
其中碱基是核碱基，例如，天然发生的或修饰的核碱基(例如，如在此描述的核碱基)。
在某些实施例中，可以将该无环核苷酸修饰或衍生化，例如，通过将无环核苷酸偶联至另一部分，例如，配体(例如，GalNAc、胆固醇配体)、烷基、多胺、糖、多肽等。
在其他实施例中，该iRNA剂包括一个或多个无环核苷酸以及一个或多个LNA(例如，如在此描述的LNA)。例如，一个或多个无环核苷酸和/或一个或多个LNA可以存在于有义链、反义链、或二者中。在一条链中的无环核苷酸的数量可以是与相对链中的LNA的数量相同的或不同的。在某些实施例中，该有义链和/或反义链包括位于双链区域或3’-突出端中的少于五个的LNA(例如，四个、三个、两个或一个LNA)。在其他实施例中，一个或多个LNA位于双链区域或有义链的3’-突出端中。可替代地，或结合地，该有义链和/或反义链包括双链区域或3’-突出端中的少于五个的无环核苷酸(例如，四个、三个、两个或一个无环核苷酸)。在一个实施例中，该iRNA剂的有义链包括在iRNA剂中的有义链的3’-突出端中的一个或两个LNA，并且包括在反义链的双链区域中的一个或两个无环核苷酸(例如，从反义链的5’-端的位置4至10(例如，位置6-8)处)。
在其他实施例中，在iRNA剂中包括一个或多个无环核苷酸(单独的或还有一个或多个LNA)导致以下各项中的一种或多种(或所有)：(i)脱靶效应的减少；(ii)RNAi中过客链参与减少；(iii)引导链针对其靶标mRNA的特异性增加；(iv)微小RNA脱靶效应的减少；(v)稳定性的增加；或(vi)iRNA分子对降解的抗性增加。
其他修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)以及2’-氟代(2’-F)。也可以在iRNA的RNA上的其他位置处作出相似的修饰，尤其在3′末端核苷酸上或在2′-5′连接的dsRNA中糖的3′位置和5′末端核苷酸的5′位置。。iRNAs还可以具有糖模拟物，例如代替呋喃戊糖的环丁基部分。教授制备这类修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；以及5,700,920，这些专利中的某些与本申请属于同一申请人，并且所述文献的每一篇通过引用方式结合在此。
iRNA还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰物或取代物。如在此所使用的，“非修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰核碱基包括但不局限于其他合成以及天然核碱基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶以及2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤基，8-氨基，8-氢硫基，8-硫烷基，8-羟基以及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤基尤其是5-溴，5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的核碱基包括披露于美国专利号3,687,808中的那些；披露于生物化学中的修饰核苷(Modified Nucleosides in Biochemistry)，生物技术与医药(Biotechnology andMedicine)，海瑞德威景(Herdewijn)P.编著威立-VCH，2008中的那些；披露于聚合物科学与工程的简明百科全书(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering)，第858-859页，克奥赤威兹(Kroschwitz)J.L编著约翰威立国际出版公司，1990中的那些；由英格力士(Englisch)等人，应用化学(Angewandte Chemie)，国际版，1991，30，613披露的那些；以及由桑格威(Sanghvi)Y S.，第15章，dsRNA研究与应用(dsRNAResearch and Applications)，第289-302页，克鲁克(Crooke)S.T.和黎布鲁(Lebleu)B.编著，CRC出版社，1993披露的那些。这些核碱基中的某些特别有用于提高在本发明中体现的低聚化合物的结合亲和力。这些碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮嘧啶以及N-2、N-6以及0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已经显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6℃-1.2℃(桑格威Y.S.、克鲁克S.T.和黎布鲁B.编著，dsRNA研究与应用，CRC出版社，波卡拉顿(Boca Raton)，1993，第276-278页)并且是示例性碱基取代，甚至更具体地当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
教授制备以上经修饰的核碱基以及其他经修饰的核碱基中的某些的代表性美国专利包括但不限于上述的美国专利号3,687,808，连同美国专利号4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；以及7,495,088，所述文献的每一篇通过引用方式结合在此，以及美国专利号5,750,692，也通过引用结合在此。
iRNA的RNA还可以修饰为包括一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个)锁核酸(LNA)(在此又称为“锁核苷酸”)。在一个实施例中，锁核酸是具有修饰的核糖部分的核苷酸，其中该核糖部分包括连接，例如，2’碳和4’碳的额外的桥。这个结构有效地将该核糖“锁”在3′-内切结构构象中。向siRNA添加锁核酸已经显示增加血清中的siRNA稳定性，增加热稳定性并且减少脱靶效应(埃尔曼(Elmen，J.)等人，(2005)核酸研究(NucleicAcids Research)33(1)：439-447；莫克(Mook，OR.)等人，(2007)分子癌症治疗(Mol CancTher)6(3)：833-843；谷万尔(Grunweller，A.)等人，(2003)核酸研究(Nucleic AcidsResearch)31(12)：3185-3193)。
教授制备锁核酸的代表性美国专利包括但不限于以下：美国专利号6,268,490；6,670,461；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,084,125；7,399,845、以及8,314,227，所述文献的每一篇通过引用以其全文结合在此。示例性LNA包括但不限于2′，4′-C亚甲基二环核苷酸(参见例如文格尔(Wengel)等人，国际PCT公开号WO 00/66604和WO 99/14226)。
在其他实施例中，iRNA剂包括一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或更多个)G-形钳核苷酸。G-形钳核苷酸是一种修饰的胞嘧啶类似物，其中该修饰赋予氢键在双链体内的互补鸟嘌呤的沃森-克里克和霍氏面的能力，参见，例如，林(Lin)和马泰乌奇(Matteucci)，1998，美国化学协会期刊(J.Am.Chem.Soc.)，120，8531-8532。在寡核苷酸中的单G-形钳类似物取代可以导致(当与互补的寡核苷酸杂交时)大幅提升的螺旋热稳定性和错配识别。iRNA分子中包括这种核苷酸可以导致提升的核酸靶标、互补序列、或模板链的亲和力和特异性。
对RNA分子的末端的潜在的稳定化修饰可包括N-(乙酰基氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-NHAC)、N-(己酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-NHAC)、胸苷-2′-O-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、2-二十二醇基(docosanoyl)-尿苷-3″-磷酸酯、反向dT(idT)及其他。这种修饰的披露可以在PCT公开号WO 2011/005861中找到。
iRNA基序
在一个实施例中，有义链序列可以由式(I)表示：
5′np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3′ (I)
其中：
i和j各自独立地是0或1；
p和q各自独立地是0-6；
各Na独立地表示包括0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb独立地表示包括0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
各np和nq独立地表示突出核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同修饰；并且
XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。优选地YYY全是2’-F修饰的核苷酸。
在一个实施例中，Na和/或Nb包含具有交替模式的修饰。
在一个实施例中，该YYY基序出现在该有义链的切割位点处或附近。例如，当该RNAi剂具有长度是17-23个核苷酸的一个双链体区时，该YYY基序可以出现在有义链的切割位点处或附近(例如：可以出现在位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12或11、12、13处)，计数从5’端起从第一个核苷酸开始；或任选地，计数从5’-端起在该双链体区内的第一个配对的核苷酸处开始。
在一个实施例中，i是1且j是0，或i是0且j是1，或i和j两者都是1。该有义链因此可以由以下式表示：
5′np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3′ (Ib)；
5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-hq 3′ (Ic)；或
5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3′ (Id)。
当该有义链由式(Ib)表示时，Nb表示包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。各Na可以独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该有义链表示为式(Ic)时，Nb表示一个寡核苷酸序列，包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。每个Na可独立地表示包括2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该有义链表示为式(Id)时，每个Nb独立地表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。各Na可以独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y和Z各自可以是彼此相同或不同的。
在其他实施例中，i是0并且j是0，并且该有义链可以由下式表示：
5′np-Na-YYY-Na-hq 3′ (Ia)。
当该有义链由式(Ia)表示时，每个Na独立地可以表示寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸。
在一个实施例中，该RNAi的反义链序列可以由式(II)表示：
5′nq’-Na′-(Z’Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(X′X′X′)1-N′a-np′3′ (II)
其中：
k和l各自独立地是0或1；
p’和q’各自独立地是0-6；
每个Na′独立地表示包括0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb′独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np′和nq′独立地表示突出核苷酸；
其中Nb’和Y’不具有相同的修饰；
并且
X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，Na’和/或Nb’包含具有交替模式的修饰。
Y′Y′Y′基序出现在该反义链的切割位点处或其附近。例如，当该RNAi剂具有17-23个核苷酸长度的双链体区域时，该Y′Y′Y′基序可以发生在该反义链的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15处)，该计数从5′末端，从第一个核苷酸开始；或任选地，该计数从5′-末端，从该双链体区域内的第一对核苷酸开始。优选地，该Y′Y′Y′基序出现在位置11、12、13处。
在一个实施例中，Y’Y’Y’基序全是2’-OMe修饰的核苷酸。
在一个实施例中，k是1且l是0，或k是0且1是1，或k和1两者都是1。
该反义链因此可以由以下式表示：
5′nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np’3′ (IIb)；
5′nq’-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np’3′ (IIc)；或
5′nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-Na′-np’3′ (IId)。
当该反义链是由式(IIb)表示时，Nb’表示一个寡核苷酸序列，包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。每个Na’独立地表示包括2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该反义链表示为式(IIc)时，Nb’表示一个寡核苷酸序列，包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。每个Na’独立地表示包括2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该反义链表示为式(IId)时，每个Nb’独立地表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。每个Na’独立地表示包括2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。
在其他实施例中，k是0且1是0，并且该反义链可以由下式表示：
5′np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3′ (Ia)。
当该反义链表示为式(IIa)时，各Na’独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X′、Y′和Z′各自可以是彼此相同的或不同的。
该有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地由以下各项修饰：LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羟基、或2’-氟代。例如，该有义链和反义链的每个核苷酸独立地由2’-O-甲基或2’-氟代修饰。具体地说，各X、Y、Z、X’、Y’以及Z’可以表示2’-O-甲基修饰或2’-氟代修饰。
在一个实施例中，该RNAi剂的有义链可以含有YYY基序，当双链体区是21个核苷酸时，该YYY基序出现在该链的9、10和11位置处，计数从5’-端起从第一个核苷酸开始，或任选地，计数从5’-端起在该双链体区内的第一个配对的核苷酸处开始；并且Y表示2’-F修饰。该有义链可以另外包含在双链体区的相反端作为翼修饰的XXX基序或ZZZ基序；并且XXX和ZZZ各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
在一个实施例中，该反义链可以含有出现在该链的位置11、12和13处的Y′Y′Y′基序，计数从5’-端起从第一个核苷酸开始，或任选地，计数从5’-端起在该双链体区内的第一个配对的核苷酸处开始；并且Y’表示2’-O-甲基修饰。该有义链可以另外含有在双链体区的相反端作为翼修饰的XXX基序或ZZZ基序；并且XXX和ZZZ各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
由上式(Ia)、(Ib)、(Ic)以及(Id)中任一项表示的有义链分别与由式(IIa)、(IIb)、(IIc)以及(IId)中任一项表示的反义链形成了一个双链体。
因此，用于本发明的这些方法中的RNAi剂可以包含一条有义链和一条反义链，每条链具有14至30个核苷酸，该RNAi双链体由式(III)表示：
有义：5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′
反义：3′np-Na-(X’X′X′)k-Nb-Y′Y′Y′-Nb-(Z′Z′Z′)1-Na-nq 5′
(III)
其中：
i、j、k、以及l各自独立地是0或1；
p、p′、q以及q′各自独立地是0-6；
各Na和Na’独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb’独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中
各np、np′、nq以及nq′，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示突出核苷酸；并且
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、以及Z′Z′Z′各自独立地表示三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，i是0并且j是0；或i是1并且j是0；或i是0并且j是1；或i和j两者均是0；或i和j两者均是1。在另一个实施例中，k是0并且l是0；或k是1并且l是0；k是0并且l是1；或k和l两者均是0；或k和l两者均是1。
形成RNAi双链体的该有义链和反义链的示例性组合包括下式：
5′np-Na-Y Y Y-Na-nq 3′
3′np’-Na’-Y′Y′Y′-Na’nq’5′
(IIIa)
5′np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3′
3′np’-Na’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Nanq’5′
(IIIb)
5′np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3′
3′np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Na’-nq’5′
(IIIc)
5′np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3′
3′np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na-nq’5′
(IIId)
当该RNAi剂由式(IIIa)表示时，各Na独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该RNAi剂由式(IIIb)表示时，各Nb独立地表示包含1-10个、1-7个、1-5个或1-4个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。各Na独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该RNAi剂表示为式(IIIc)时，每个Nb、Nb’独立地表示寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。每个Na独立地表示包括2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该RNAi剂表示为式(IIId)时，每个Nb、Nb’独立地表示寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。每个Na、Na’独立地表示包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb和Nb’各自独立地包括交替模式的修饰。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)中的X、Y和Z各自可以是彼此相同或不同的。
当该RNAi剂由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)以及(IIId)表示时，这些Y核苷酸中的至少一个可以与这些Y’核苷酸中的一个形成碱基对。可替代地，这些Y核苷酸中的至少两个与相应的Y’核苷酸形成碱基对；或这些Y核苷酸中的全部三个都与相应的Y’核苷酸形成碱基对。
当该RNAi剂由式(IIIb)或(IIId)表示时，这些Z核苷酸中的至少一个可以与这些Z’核苷酸中的一个形成碱基对。可替代地，这些Z核苷酸中的至少两个与相应的Z’核苷酸形成碱基对；或这些Z核苷酸中的全部三个都与相应的Z’核苷酸形成碱基对。
当该RNAi剂表示为式(IIIc)或(IIId)时，这些X核苷酸中的至少一个可以与这些X’核苷酸中的一个形成碱基对。可替代地，这些X核苷酸中的至少两个与相应的X’核苷酸形成碱基对；或这些X核苷酸中的全部三个都与相应的X’核苷酸形成碱基对。
在一个实施例中，Y核苷酸上的修饰不同于Y’核苷酸上的修饰，Z核苷酸上的修饰不同于Z’核苷酸上的修饰，和/或X核苷酸上的修饰不同于X’核苷酸上的修饰。
在一个实施例中，当该RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰。在另一个实施例中，当该RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰且np′＞0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键联连接到相邻核苷酸上。在又另一个实施例中，当该RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰，np′＞0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键联连接到相邻核苷酸上，并且有义链共轭到通过一个二价或三价分支接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。在另一个实施例中，当该RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰，np′＞0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键联连接到相邻核苷酸上，有义链包含至少一个硫代磷酸酯键联并且该有义链共轭到通过一个二价或三价分支接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。
在另一个实施例中，当该RNAi剂由式(IIIa)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰，np′＞0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键联连接到相邻核苷酸上，有义链包含至少一个硫代磷酸酯键联并且该有义链共轭到通过一个二价或三价分支接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。
在一个实施例中，该RNAi剂是一种多聚体，该多聚体含有至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体，其中这些双链体通过一种接头来连接。该接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，该多聚体进一步包含一个配体。这些双链体中的每个可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些双链体中的每个可以靶向两个不同靶位点处的相同基因。
在一个实施例中，该RNAi剂是一种多聚体，该多聚体含有由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的三个、四个、五个、六个或更多个双链体。该接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，该多聚体进一步包含一个配体。这些双链体中的每个可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些双链体中的每个可以靶向两个不同靶位点处的相同基因。
在一个实施例中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的两种RNAi剂在5’端和这些3’端中的一个或两个处彼此连接，并且任选地共轭到一个配体上。这些试剂中的每个可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些试剂中的每个可以靶向两个不同靶位点处的相同基因。
iRNA共轭物
在此披露的iRNA剂能处于共轭物的形式。该共轭物可以在iRNA分子的任何适合的位置处附接，例如，在该有义或反义链的3’末端或5’末端处。该共轭物可任选地经由接头附接。
在一些实施例中，在此所述的iRNA剂化学地连接至一个或多个配体、部分或共轭物，这可能赋予功能性，例如，通过影响(例如，增强)iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取。此类部分包括但不限于脂质部分如胆固醇部分(乐欣格(Letsinger)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acid.Sci.USA)，1989，86：6553-6556)，胆酸(马诺汗(Manoharan)等人，生物有机化学与医药化学快报(Biorg.Med.Chem.Let.)，1994，4：1053-1060)，硫醚如beryl-S-三苯甲基硫醇(马诺汗(Manoharan)等人，纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)，1992，660：306-309；马诺汗(Manoharan)等人，生物有机化学与医药化学快报(Biorg.Med.Chem.Let.)，1993，3：2765-2770)，硫代胆固醇(奥博汗瑟(Oberhauser)等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，1992，20：533-538)，脂肪链如十二烷基二醇或十一烷基残基(赛森-博和马拉(Saison-Behmoaras)等人，EMBO杂志，1991，10：1111-1118；卡波诺(Kabanov)等人，FEBS通讯，1990，259：327-330；斯伍那区克(Svinarchuk)等人，生物化学(Biochimie)，1993，75：49-54)，磷脂如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵1，2-二-O-十六烧基-外消旋-甘油-3-磷酸酯(马诺汗(Manoharan)等人，四面体通讯(TetrahedronLett.)，1995，36：3651-3654；舍阿(Shea)等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，1990，18：3777-3783)，聚胺或聚乙烯乙二醇链(马诺汗(Manoharan)等人，核苷&核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)，1995，14：969-973)或金刚烷乙酸(马诺汗(Manoharan)等人，四面体通讯(Tetrahedron Lett.)，1995，36：3651-3654)，十六烧基部分(米莎(Mishra)等人，生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)，1995：1264：229-237)，或十八胺或己胺-羰基羟胆固醇部分(克鲁克(Crooke)等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，1996，277：923-937)。
在一个实施例中，配体改变向其中并入该配体的iRNA试剂的分布、靶向或寿命。在一些实施例中，与例如不存在这样一种配体的种类相比，该配体提供针对所选靶标(例如，分子、细胞或细胞类型、区室(例如，细胞或器官区室、身体组织、器官或区域)的增强的亲和力)。典型的配体将不参与双链体核酸中的双链体配对。
配体可以包括天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HAS)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、茁霉多糖、壳多糖、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，如合成聚合物，例如，合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括作为一种聚赖氨酸(PLL)、聚L天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪的聚氨基酸。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、聚胺肽、树枝状聚合物的聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐、或α螺旋肽。
配体也可以包括靶向基团，例如，与指定的细胞类型如肾细胞结合的细胞或组织靶向剂，例如，凝集素，糖蛋白，脂质或蛋白质，例如，抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白质A、黏蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸、维生素B12、生物素、或RGD肽或RGD肽模拟物。
在一些实施例中，该配体是包括一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物的GalNAc配体。在一些实施例中，使用该GalNAc配体将iRNA靶向肝脏(例如，向肝实质细胞)。GalNAc配体的另外的描述提供于标题为碳水化合物共轭物的节段。
配体的其他例子包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、亲脂性分子，例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧己基、鲸蜡基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰)石胆酸、O3-(油酰)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪肽共轭物(例如，触角足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成性核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑聚类、吖啶-咪唑共轭物、四氮杂大环类的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如，糖蛋白，或肽，例如，对辅助配体具有特异亲和力的分子，或抗体，例如，与指定细胞类型如癌细胞、内皮细胞或骨细胞结合的抗体。配体也可以包括激素和激素受体。它们也可以包括非肽种类，如脂质、凝集素、糖类、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。该配体可以是例如脂多糖，p38MAP激酶的活化剂或NF-κB的活化剂。
配体可以是可以例如通过破坏细胞细胞骨架(例如，通过破坏细胞微管、微丝和/或中间丝)增加iRNA剂摄入细胞中的物质，例如，药物。药物可以例如是泰素(taxon)、长春新碱、长春碱、松胞菌素、诺考达唑、促微丝聚合剂(japlakinolide)、红海海绵素A、鬼笔环肽、海洋苔藓素(swinholide)A、茚满诺星(indanocine)或myoservin。
在一些实施例中，附接到如在此所描述的iRNA上的一个配体用作药物代谢动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包括亲油物质、胆酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括，但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬(ibuprofen)、维生素E、生物素等。包含许多硫代磷酸酯键联的寡核苷酸也已知与血清蛋白结合，因此骨架中包含多个硫代磷酸酯键联的短寡核苷酸，例如具有约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸，也服从于本发明作为配体(例如作为PK调节配体)。此外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适配体也适合用作在此所述的这些实施例中的PK调节配体。
本发明的配体-共轭的寡核苷酸可以通过使用这样一种寡核苷酸来合成，该寡核苷酸具有下垂的反应功能性，例如来源于该寡核苷酸上的连接分子的附接(如下所述)。该反应性寡核苷酸可以直接与可商购的配体，合成的、具有多种保护基中的任一种的配体，或具有连接部分附接于其上的配体发生反应。
在本发明的共轭物中使用的寡核苷酸可以方便且常规地通过固相合成的熟知技术来制备。用于这类合成的设备由多个供应商(包括例如应用生物***公司(AppliedBiosystems)(福斯特市，加利福尼亚州))销售。可另外地或替代地使用本领域中已知的用于这类合成的任何其他装置。使用相似的技术来制备其他寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化衍生物)也是已知的。
在本发明的配体-共轭的寡核苷酸以及具有序列特异性连接的核苷的配体-分子中，该寡核苷酸以及寡核苷可以利用标准核苷酸或核苷前体，或已经具有连接部分的核苷酸或核苷共轭物前体，已经具有配体分子的配体-核苷酸或核苷共轭物前体，或带有结构基元的非核苷配体，在适合的DNA合成仪上进行组装。
当使用已经具有连接部分的核苷酸-共轭物前体时，典型地完成该序列特异性连接的核苷的合成，并且然后该配体分子与该连接部分反应以形成配体共轭的寡核苷酸。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷通过一种自动合成仪合成，除了可商购以及寡核苷酸合成中常规使用的标准亚磷酰胺以及非标准亚磷酰胺之外，该合成还使用衍生自配体-核苷共轭物的亚磷酰胺。
脂质共轭物
在一个实施例中，该配体是脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子可以典型地结合血清蛋白，例如，人血清白蛋白(HSA)。结合HSA的配体允许共轭物分布至靶组织。例如，该靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。例如，可以使用蘩警生(neproxin)或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加共轭物对降解的抵抗力，(b)增加靶向或转运至靶标细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用来调节与血清蛋白(例如，HAS)的结合。
基于脂质的配体可以用来调制，例如，控制(如，抑制)共轭物与靶组织的结合。例如，与HSA更强烈结合的脂质或基于脂质的配体将更不可能靶向肾并且因此较不可能从身体清除。与HSA较不强烈结合的脂质或基于脂质的配体可以用来使共轭物靶向肾。
在一个实施例中，基于脂质的配体结合HSA。例如，该配体以足够的亲和力结合HSA，从而共轭物向分布至非肾组织的分布增强。然而，典型地是这种亲和力并不是这样强，从而HSA-配体结合不能逆转。
在另一个实施例中，基于脂质的配体微弱或根本不结合HSA，从而共轭物向肾的分布增强。作为基于脂质的配体的替代或除它之外，也可以使用靶向肾细胞的其他部分。
在另一个方面，配体是由靶标细胞(例如，正在增殖的细胞)摄取的部分，例如，维生素。这些特别可用于治疗以不希望的细胞(例如，恶性或非恶性型，例如，癌细胞)增殖为特征的病症。示例性维生素包括维生素A、E和K。其他示例性维生素包括是B维生素，例如，叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或由癌细胞摄取的其他维生素或养分。还包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
细胞渗透剂
在另一个方面，配体是细胞渗透剂，如螺旋形细胞渗透剂。在一个实施例中，该药剂是两亲的。一种示例性剂渗透剂是肽如tat或触角足蛋白。如果该试剂是肽，则它可以被修饰，包括肽酰基模拟物、反转异构体、非肽键联或假肽键联和D-氨基酸的使用。该螺旋剂典型地是α-螺旋剂，并且可以具有亲脂性和疏脂性相。
该配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称作寡肽模拟物)是能够折叠成与天然肽相似的限定三维结构的分子。肽和肽模拟物与iRNA剂的附接可以影响iRNA的药物代谢动力学分布，如通过增强细胞鉴别与吸收。肽或肽模拟物部分可以是约5-50氨基酸长的，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
肽或肽模拟物可以例如是细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状肽、约束肽或交联肽。在另一个替代中，该肽部分可以包含疏水性膜转位序列(MTS)。一种包含疏水性MTS的示例性肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：685)的RFGF。含有疏水性MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：686))也可以是靶向部分。该肽部分可以是一个“递送”肽，其可携带大的极性分子，包括肽、寡核苷酸、和跨细胞膜的蛋白。例如，已经发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：687))和果蝇触角足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：688))的序列能够作为递送肽发挥作用。肽或肽模拟物可以通过DNA的随机序列来编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(拉姆(Lam)等人，自然，354：82-84，1991)。典型地，经由一个合并的单体单元留至dsRNA剂的肽或肽模拟物是细胞靶向肽，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽或RGD模拟物。肽部分可以在长度上范围从约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，如以便增加稳定性或指导构象特性。可以利用以下描述的结构修饰中的任一个。
用于本发明的这些组合物和方法中的RGD肽可以是线性或环状的，并且可以被修饰，例如糖基化或甲基化以促进靶向一个或多个特定组织。含RGD的肽和肽模拟物可以包括D-氨基酸以及合成的RGD模拟物。除了RGD以外，可以使用靶向整合素配体的其他部分。该配体的优选共轭物靶向PECAM-1或VEGF。
RGD肽部分可以用来靶向特定细胞类型，例如，肿瘤细胞，如内皮肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞(扎特曼(Zitzmann)等人，癌症研究(Cancer Res.)，62：5139-43，2002)。RGD肽可以促进dsRNA剂靶向多种其他组织(包括肺、脾或肝脏)的肿瘤(青木(Aoki)等人，癌症基因疗法(Cancer Gene Therapy)8：783-787，2001)。典型地，RGD肽将促进iRNA剂靶向肾。该RGD肽可以是线性的或环状的，并且可以被修饰(例如糖基化或甲基化)以促进靶向特定组织。例如，糖基化的RGD肽可以递送iRNA剂至表达αVβ3的肿瘤细胞(华博纳(Haubncr)等人，核医学杂志(Jour.Nucl.Med.)，42：326-336，2001)。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞例如微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人细胞)。微生物细胞渗透肽可以是，例如，α-螺旋形线性肽(例如，LL-37或CeropinP1)，含有二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或牛抗菌肽)，或仅含一个或两个支配性氨基酸的肽(例如，PR-39或indolicidin)。细胞渗透肽还可以包括核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二重的两亲性肽，如MPG，该肽来源于HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(斯米尼(Simeoni)等人，核酸研究，31：2717-2724，2003)。
碳水化合物共轭物
在本发明的组合物与方法的一些实施例中，iRNA寡核苷酸进一步包括一种碳水化合物。碳水化合物共轭的iRNA对于核酸的体内递送以及适合于体内治疗用途的组合物而言是有利的，如在此所描述。如在此所使用，“碳水化合物”是指作为本身由具有至少6个碳原子(这些碳原子可以是线性、支链或环状的)与键合到每个碳原子上的氧、氮或硫原子的一个或多个单糖单元组成的碳水化合物的化合物；或具有由一个或多个单糖单元组成的碳水化合物部分的一部分的化合物，每个单糖具有至少六个碳原子(这些碳原子可以是线性、支链或环状的)与键合到每个碳原子上的氧、氮或硫原子。代表性的碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖以及含有从约4、5、6、7、8或9个单糖单元的寡糖)，以及多糖如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。具体的单糖包括C5和以上(例如，C5、C6、C7或C8)糖；二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元的糖(例如，C5、C6、C7或C8)。
在一个实施例中，碳水化合物共轭物包括单糖。在一个实施例中，该单糖是一种N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。GalNAc共轭物(其包括一种或多种N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物)描述于，例如，美国专利号8,106,022，通过引用将其全部内容结合在此。在一些实施例中，GalNAc共轭物用作将iRNA靶向特定细胞的配体。在一些实施例中，GalNAc共轭物将iRNA靶向肝脏细胞，例如，通过用作针对肝脏细胞(例如，肝实质细胞)的脱唾液酸糖蛋白受体的一种配体。
在一些实施例中，碳水化合物共轭物包括一个或多个GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可以经由接头附接，例如，二价或三价分支接头。在一些实施例中，GalNAc共轭物共轭至有义链的3’末端。在一些实施例中，GalNAc共轭物经由接头(例如，在此所述的接头)共轭至iRNA剂(例如，有义链的3’末端)。
在一些实施例中，该GalNAc共轭物是
在一些实施例中，RNAi剂经由接头附接至碳水化合物共轭物，例如，如以下方案中示出的接头，其中X是O或S
在一些实施例中，RNAi剂共轭至如表1中定义且如下示出的L96
在一些实施例中，用于在本发明的组合物以及方法中使用的碳水化合物共轭物是选自下组，该组由以下各项组成：
用于在于此描述的实施例中使用的另一个代表性碳水化合物共轭物包括但不限于
(式XXIII)，当X或Y其中一者是寡核苷酸时，另一者是氢。
在一些实施例中，该碳水化合物共轭物进一步包含如上所描述的一个或多个另外的配体，如但不限于PK调节剂和/或细胞渗透肽。
在一个实施例中，本发明的iRNA通过接头被共轭至碳水化合物。本发明的这些组合物和方法的具有接头的iRNA碳水化合物共轭物的非限制性实例包括但不限于，
(式XXX)，当X或Y其中一者是寡核苷酸时，另一者是氢。
接头
在一些实施例中，在此描述的该共轭物或配体可以借助不同接头附接到iRNA寡核苷酸上，这些接头可以是可切割的或不可切割的。
术语“接头”或“连接基团”意为一种有机部分，它连接一个化合物的两个部分，例如共价地附接一个化合物的两个部分。接头典型地包括一种直接的键或一种原子例如氧或硫，一种单位例如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或者一种原子链，例如但不限于经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被以下中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的杂环基；其中R8是氢、酰基、脂肪族的或经取代的脂肪族的。在一个实施例中，该接头是在约1-24个原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18个原子、7-17、8-17、6-16、7-16或8-16个原子之间。
在一个实施例中，本发明的dsRNA被共轭到选自下组的一种二价或三价分支接头上，该组具有以任何式(XXXI)-(XXXIV)示出的结构：
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B以及q5C对于每次出现独立地表示0-20并且其中该重复单元可以是相同或不同的；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C对于每次出现各自独立地是：不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C对于每次出现独立地是：不存在、亚烷基、取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被以下各项中的一个或多个中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)＝C(R”)、C≡C或C(O)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C对于每次出现各自独立地是：不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、 或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B以及L5C表示配体；即对于每次出现各自独立地表示单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；并且Ra是H或氨基酸侧链。三价共轭的GalNAc衍生物特别有用于与RNAi剂一起使用以用于抑制靶基因的表达，如具有式(XXXV)的那些：
式XXXV
其中L5A、L5B和L5C表示单糖，如GalNAc衍生物。
合适的二价与三价分支接头基团共轭GalNAc衍生物的实例包括但不限于在以上引用为式II、VII、XI、X以及XIII的结构。
一种可切割的连接基团在细胞外是足够稳定的，但它在进入靶标细胞时被切割以释放该接头结合在一起的两个部分。在一个优选的实施例中，该可切割的连接基团在靶标细胞中或在一个第一参考条件(其可以例如被选择为模拟或代表细胞内条件)下的切割比在受试者的血液中或在一个第二参考条件下(其可以例如被选择为模拟或代表在该血液或血清中发现的条件)快至少大约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少大约100倍。
可切割的连接基团易于受到切割因子(例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在)的影响。一般地，切割因子在细胞内比在血清或血液中更普遍或具有更高水平或活性。此类降解因子的实例包括：氧化还原因子，它们被选择用于具体底物或者无底物特异性，包括例如氧化或还原酶或者在细胞中出现的还原因子例如硫醇(它可以通过还原作用降解一种可氧化还原切割的连接基团)；酯酶；核内体或可以创造酸性环境的因子，例如可以导致pH为5或更低的那些；可以通过作为一种广义酸起作用而水解或降解一种酸可切割的连接基团的酶，肽酶(它可以是底物特异性的)，以及磷酸酶。
一种可切割的连锁群，例如二硫键可以对pH敏感。人血清的pH是7.4，而平均的细胞内pH稍低，范围为大约7.1-7.3。核内体具有在5.5-6.0范围内的更酸性的pH，并且溶酶体具有在5.0左右的甚至更酸性的pH。一些接头将具有在优选的pH下切割的可切割的连接基团，从而使阳离子脂质从细胞内的配体中释放，或进入希望的细胞区室中。
接头可以包括可被一种具体的酶切割的可切割的连接基团。结合到接头中的可切割的连接基团的类型可以取决于有待靶向的细胞。例如靶向肝脏的配体可以通过包括酯基团的接头而被连接到阳离子脂质上。肝脏细胞富含酯酶，并且因此该接头将在肝脏细胞中比在不富含酯酶的细胞类型中更有效地切割。富含酯酶的其他细胞类型包括肺、肾皮质以及睾丸的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型(如肝细胞和滑膜细胞)时，可以使用含有肽键的接头。
通常，一种候选的可切割的连接基团的适合性可以通过测试降解剂(或条件)切割该候选的连接基团的能力来进行评估。还希望的是也测试该候选的可切割的连接基团在血液中或当与其他非靶组织接触时抵抗切割的能力。因此，可以确定在一种第一条件与一种第二条件之间进行切割的相对敏感性，其中该第一条件被选择成指示在靶细胞中的切割并且该第二条件被选择成指示在其他组织或生物流体(例如血液或血清)中的切割。这些评估可以在无细胞***中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养物中或在整个动物中进行。有用的是在无细胞或培养条件下进行初始评估并且通过在整个动物中的进一步评估来进行确证。在优选实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在选择成模拟细胞内条件的体外条件下)的切割比在血液或血清(或在被选择成模拟细胞外条件的体外条件下)中的切割快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。
氧化还原可切割的连接基团
在一个实施例中，可切割的连接基团是一种氧化还原可切割的连接基团，其在还原或氧化时被切割。可还原切割的连接基团的一个实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定一种候选的可切割连接基团是否是适合的“可还原切割的连接基团”，或例如是否适合于与一种特定iRNA部分和特定靶向剂一起使用，可以参考在此描述的方法。例如可以通过用二硫苏糖醇(DTT)或本领域中已知的其他使用还原剂的试剂进行孵育来对一种候选物进行评估，这模拟了会在细胞(例如靶细胞)中观察到的切割速率。还可以在被选择成模拟血液或血清条件的条件下对这些候选物进行评估。在一个实施例中，候选化合物在血液中被切割至多约10％。在其他实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择成模拟细胞内条件的体外条件下)的降解比在血液(或在选择成模拟细胞外条件的体外条件下)中的降解快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。可以在被选择成模拟细胞内介质的条件下，使用标准的酶动力学测定来确定候选化合物的切割速率，并且将其与被选择成模拟细胞外介质的条件下的速率相比较。
基于磷酸酯的可切割连接基团
在另一个实施例中，可切割接头包括一种基于磷酸酯的可切割的连接基团。基于磷酸酯的可切割的连接基团通过降解或水解磷酸酯基团的试剂来切割。一种在细胞中切割磷酸酯基团的因子的实例是酶，例如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选的实施例是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。一个优选实施例是-O-P(O)(OH)-O-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选物。
酸可切割的连接基团
在另一个实施例中，可切割接头包括一种酸可切割的连接基团。酸可切割的连接基团是在酸性条件下被切割的一种连接基团。在优选的实施例中，酸可切割的连接基团在一个具有大约6.5或更低(例如大约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的pH的酸性环境中被切割，或者被多种因子(例如可以作为一种广义酸起作用的酶)切割。在细胞中，具体的低pH细胞器(例如核内体或溶酶体)可以提供一个针对酸可切割的连接基团的切割环境。酸可切割的连接基团的实例包括但不限于腙、酯以及氨基酸的酯。酸可切割的基团可以具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。一个优选实施例是当附接到酯(烷氧基基团)的氧的碳是芳基基团、取代的烷基基团或叔烷基基团(如二甲基戊基或叔丁基)时。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选物。
基于酯的可切割的连接基团
在另一个实施例中，可切割的接头包括一种基于酯的可切割的连接基团。基于酯的可切割的连接基团通过酶如细胞中的酯酶与酰胺酶来切割。基于酯的可切割的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基以及亚炔基基团的酯。酯可切割的连接基团具有通式-C(O)O-、或-OC(O)-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选物。
基于肽的可切割的连接基团
在又另一个实施例中，可切割的接头包括一种基于肽的可切割的连接基团。基于肽的可切割的连接基团通过酶(例如细胞中的肽酶与蛋白酶)而被切割。基于肽的可切割的连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如二肽、三肽，等等)以及多肽的肽键。基于肽的可切割的基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。该酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽以及蛋白质的特定类型的酰胺键。基于肽的切割基团通常限于在氨基酸之间形成以产生肽以及蛋白质的肽键(即，酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可切割的连接基团具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA与RB是这两个邻接氨基酸的R基团。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选物。教授制备RNA共轭物的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，前述专利的每个的全部内容通过引用结合在此。
给定化合物中的全部位置不必要一致地经修饰，并且实际上可以在单个化合物中或甚至在iRNA内部的单个核苷处掺入多于一个前述修饰。本发明也包括作为嵌合化合物的iRNA化合物。
在本发明的上下文中，“嵌合的”iRNA化合物或“嵌合体”是以下这样的iRNA化合物，例如，dsRNA，它们包含两个或更多个化学上不同的区域，每者由至少一个单体单元构成，即，在dsRNA化合物的情况下的一种核苷酸。这些iRNA典型地含有至少一个区域，其中该RNA被修饰以便赋予iRNA增加的核酸酶降解抗性、增加的细胞摄取和/或增加的靶核酸结合亲和力。iRNA的另外区域可以充当能够切割RNA：DNA或RNA：RNA杂交分子的酶的底物。举例而言，RNase H是一种切割RNA：DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，RNase H的激活导致RNA靶标的切割，从而大大增强iRNA抑制基因表达的效率。因此，与杂交至相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧dsRNA相比，可以在使用嵌合dsRNA时，经常用较短的iRNA获得可比较的结果。可以常规地通过凝胶电泳并且如果必要的话联合本领域中已知的核酸杂交技术来检测该RNA靶标的裂解。
在某些实例中，iRNA的RNA可以通过非配体基团来进行修饰。许多非配体分子已经被共轭到iRNA上以增强该iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，并且用于进行此类共轭的程序在科学文献中是可获得的。此类非配体部分已经包括脂质部分例如胆固醇(库博(Kubo，T.)等人，生物化学和生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)，2007，365(1)：54-61；乐欣格(Letsinger)等人，美国科学院院刊，1989，86：6553)、胆酸(马诺汗(Manoharan)等人，生物有机化学与医药化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)，1994，4：1053)、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(马诺汗等人，纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)，1992，660：306；马诺汗等人，生物有机化学与医药化学快报，1993，3：2765)、硫代胆固醇(奥博汗瑟(Oberhauser)等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，1992，20：533)、脂肪链如十二烷基二醇或十一烷基残基(赛森-博和马拉(Saison-Behmoaras)等人，EMBO J.，1991，10：111；卡波诺(Kabanov)等人，FEBS Lett.，1990，259：327；斯伍那区克(Svinarchuk)等人，生物化学(Biochimie)，1993，75：49)、磷脂如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵1，2-二-O-十六烧基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(马诺汗等人，四面体通讯(Tetrahedron Lett.)，1995，36：3651；舍阿(Shea)等人，核酸研究，1990，18：3777)、聚胺或聚乙烯乙二醇链(马诺汗等人，核苷&核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)，1995，14：969)，或金刚烷乙酸(马诺汗等人，四面体通讯，1995，36：3651)、棕榈基部分(米莎(Mishra)等人，生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)，1995，1264：229)，或十八胺或己胺-羰基-羟胆固醇部分(克鲁克(Crooke)等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，1996，277：923)。教导此类RNA共轭物的制备的代表性美国专利已经在上文列出。典型的共轭方案涉及在序列的一个或多个位置处合成具有氨基接头的RNA。然后使用适当的偶联剂或活化剂使该氨基基团与被共轭的分子进行反应。共轭反应可以用仍与固相支持物结合或在切割RNA后处于溶液相的RNA进行。通过HPLC纯化RNA共轭物典型地提供纯的共轭物。
iRNA的递送
可以按许多不同方式实现向有需求的受试者递送iRNA。可以通过向受试者施用包含iRNA(例如dsRNA)的组合物，直接进行体内递送。可选地，可以通过施用编码和指导iRNA表达的一种或多种载体间接地进行递送。这些替代方案在后文进一步论述。
直接递送
通常，递送核酸分子的任何方法可以适应于随iRNA使用(参见例如，阿赫塔尔(Akhtar S.)和朱利安(Julian RL.)(1992)细胞生物学趋势(Trends Cell.Biol.)2(5)：139-144和WO 94/02595，所述文献通过引用的方式完整结合在此)。然而，存在认为对体内成功递送iRNA分子重要的三种因素：(a)所递送分子的生物学稳定性，(2)防止非特异性作用，和(3)所递送分子在靶组织中的积累。可以通过局部施用，例如通过直接注射或植入至组织中(作为非限制性例子，肿瘤)或局部施用该试剂，使siRNA的非特异性作用最小化。局部施用至治疗部位使试剂的局部浓度最大化，限制该试剂向全身组织的暴露，所述全身组织否则可能受试剂损害或可能降解该试剂，并且允许较低总剂量的iRNA分子施用。几项研究已经显示在局部施用iRNA时成功敲减基因产物。例如，在猕猴中通过玻璃体内注射眼球内递送VEGF dsRNA(托伦蒂诺(Tolentino，MJ.)等人(2004)视网膜(Retina)24：132-138)和在小鼠中视网膜下注射(赖希(Reich，SJ.)等人(2003)分子视觉(Mol.Vis.)9：210-216)眼球内递送VEGF dsRNA均显示在年龄相关性黄斑变性的实验模型中防止血管新生。此外，在小鼠中直接肿瘤内注射dsRNA缩减肿瘤体积(派乐(Pille，J.)等人(2005)分子治疗(Mol.Ther.)11：267-274)并且可以延长带瘤小鼠的存活(金姆(Kim，WJ.)等人(2006)分子治疗14：343-350；李(Li，S.)等人(2007)分子治疗15：515-523)。也已经示出通过直接注射将RNA干扰成功局部递送递至CNS(多恩(Dorn)，G.等人，(2004)核酸(Nucleic Acids)32：e49；谭(Tan)，PH.等人，(2005)基因治疗(Gene Ther.)12：59-66；牧村(Makimura)，H.等人，(2002)BMC神经科学(BMC Neurosci.)3：18；希什金娜(Shishkina)，GT.等人，(2004)神经科学(Neuroscience)129：521-528；塔克尔(Thakker)，ER.等人，(2004)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)101：17270-17275；阿卡尼亚(Akaneya)，Y.等人，(2005)神经生理学期刊(J.Neurophysiol.)93：594-602)并且通过鼻内给予成功递送至肺(霍华德(Howard)，KA.等人，(2006)分子治疗14：476-484；张(Zhang)，X.等人，(2004)生物化学杂志(JJ.Biol.Chem.)279：10677-10684；比特科(Bitko)，V.等人，(2005)自然医学(Nat.Med.)11：50-55)。对于全身性给予iRNA用于治疗疾病，可以将RNA修饰或可替代地使用药物递送***进行递送；两种方法均起到防止dsRNA被体内核酸内切酶和核酸外切酶快速降解的作用。
RNA或药用载体的修饰也可以允许iRNA组合物靶向至靶标组织并避免不想要的脱靶效应。iRNA分子可以通过化学共轭至其他基团如在此所述的脂质或碳水化合物基团以进行修饰。此类共轭物可用于将iRNA靶向特定细胞，例如，肝脏细胞(liver cell)，像肝实质细胞(hepatocyte)。例如，GalNAc共轭物或脂质(例如，LNP)配制品可用于将iRNA靶向特定细胞，例如，肝脏细胞，像肝实质细胞。
亲脂性基团如胆固醇以增强细胞摄取并预防降解。例如将与亲脂性胆固醇部分共轭的针对ApoB的iRNA全身注射到小鼠中并且导致肝脏和空肠两者中apoB mRNA的敲减(苏兹赫克(Soutschek)J.等人(2004)自然432：173-178)。已经显示iRNA与适配体的共轭在***癌的小鼠模型中抑制肿瘤生长并且介导肿瘤消退(麦克纳马拉(McNamara)JO.等人(2006)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)24：1005-1015)。在替代性实施例中，可以使用药物递送***如纳米颗粒、树状物、聚合物、脂质体或阳离子递送***递送iRNA。带正电荷的阳离子递送***促进(带负电荷的)iRNA分子的结合并且也在带负电荷的细胞膜增强相互作用以允许iRNA由细胞高效摄取。阳离子脂质、树状物或聚合物可以与iRNA结合或被诱导以形成包装siRNA的囊泡或胶束(见例如，金姆(Kim SH.)等人(2008)缓释杂志(Journal ofControlled Release)129(2)：107-116)。囊泡或胶束的形成进一步防止全身给予时iRNA的降解。用于制造和施用阳离子-iRNA复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(见例如，索伦森(Sorensen，DR.)等人(2003)分子化学杂志(J.Mol.Biol)327：761-766；维尔马(Verma，UN.)等人(2003)临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)9：1291-1300；阿诺德(Arnold，AS)等人(2007)高血压杂志(J.Hypertens.)25：197-205，所述文献通过引用方式完整结合在此)。可用于全身性递送iRNA的药物递送***的一些非限制性实例包括DOTAP(索伦森，DR.等人，(2003)，上文；维尔马，UN.等人，(2003)，上文)、Oligofectamine、“固体核酸脂质粒子”(齐默尔曼(Zimmermann)，TS.等人，(2006)自然441：111-114)、心磷脂(钱(Chien)，PY.等人，(2005)癌症基因治疗12：321-328；帕尔(Pal)，A.等人，(2005)国际肿瘤学杂志(Int J.Oncol.)26：1087-1091)、聚乙亚胺(博奈特(Bonnet)ME.等人(2008)药学研究(Pharm.Res.)8月16日电子出版先于印刷版；艾格纳(Aigner)，A.(2006)生物医学与生物技术杂志(J.Biomed.Biotechnol.)71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(刘(Liu)，S.(2006)分子制药学(Mol.Pharm.)3：472-487)以及聚酰胺型胺类(托马里亚(Tomalia)，DA.等人(2007)生物化学会汇刊(Biochem.Soc.Trans.)35：61-67；柳(Yoo)，H.等人，(1999)药学研究(Pharm.Res.)16：1799-1804)。在一些实施例中，iRNA与环糊精形成用于全身给予的复合物。用于给予iRNA和环糊精的药物组合物的方法可以在美国专利号7,427,605中找到，所述专利通过引用以其全文结合在此。
载体编码的iRNA
在另一个方面，靶向LECT2基因的iRNA可以从***DNA或RNA载体中的转录单位表达(见，例如，卡秋尔(Couture，A)等人，TIG.(1996)，12：5-10；思科勒尔(Skillern，A.)等人，国际PCT公开号WO 00/22113，卡雷德(Conrad)，国际PCT公开号WO 00/22114，和卡雷德(Conrad)，美国专利号6,054,299)。取决于使用的具体构建体和靶组织或细胞类型，表达可以是瞬时的(在小时至周数量级上)或持久的(数周至数月或更长时间)。可以将这些转基因作为线性构建体、环状质粒或可以是整合或非整合载体的病毒载体引入。转基因也可以如此构建以允许它作为染色体外质粒遗传(加斯曼(Gassmann)等人，美国国家科学院院刊(1995)92：1292)。
iRNA的单条链或多条链可以从表达载体上的启动子转录。在两条单独的链待表达以产生例如dsRNA的情况下，可以将两个单独表达载体共引入(例如，通过转染或感染)靶标细胞中。可替代地，dsRNA的每个单独链可以通过均位于相同表达质粒上的启动子来转录。在一个实施例中，dsRNA表达为被一种接头多核苷酸序列连接的反向重复，由此该dsRNA具有茎环结构。
iRNA表达载体典型地是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞，例如，与脊椎动物细胞相容的表达载体，可以用来产生表达如本文所述的iRNA的重组构建体。真核细胞表达载体是本领域熟知的并且从许多商业来源可获得。典型地，此类载体含有用于***所需核酸区段的便利限制性位点。表达iRNA的载体的递送可以是全身性的，如通过静脉内或肌内施用，通过施用至从患者移植出来、随后重新引入患者的靶细胞或通过允许向所需靶细胞引入的任何其他手段。
可以将iRNA表达质粒作为与阳离子脂质载体(例如，Oligofectamine)或基于非阳离子脂质的载体(例如，TransitTKOTM)的复合物转染至靶标细胞中。本发明还想到了在一周或更长时间范围内用于iRNA介导的靶向靶RNA的不同区的敲低的多次脂质转染。成功地将载体引入到宿主细胞中可以使用多种已知的方法来监测。例如瞬时转染可以使用一种报告基因来进行信号化，例如荧光标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)。稳定的对离体细胞的转染可以使用以下这样的标记来进行确保：这些标记为被转染的细胞提供了对特定环境因子(例如抗生素或药物)的抗性，例如潮霉素B抗性。
可以随在此所述的方法和组合物一起使用的病毒载体***包括但不局限于：(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不局限于慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺伴随病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)***瘤病毒载体；(h)微小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，如正痘病毒，例如痘苗病毒载体，或禽痘病毒，例如金丝雀痘病毒或鸡痘病毒；以及(j)辅助病毒依赖性腺病毒或无肠腺病毒。复制缺陷型病毒也可以有利的。不同的载体将并入或将不并入细胞的基因组中。如果需要，构建体可以包含病毒序列以用于转染。可替代地，构建体可以并入能够发生附加型复制的载体(例如EPV和EBV载体)中。用于重组表达iRNA的构建体通常将需要调节元件，例如，启动子、增强子等，以确保RNA在靶标细胞中的表达。下文进一步描述针对载体和构建体考虑的其他方面。
可用于递送iRNA的载体将包括足以在所需靶细胞或组织中表达iRNA的调节元件(启动子、增强子等)。可以选择调节元件以提供组成型或调节/诱导型表达。
可以精确地调节iRNA的表达，例如，通过使用对某些生理调节剂(例如，循环型葡萄糖水平或激素)敏感的诱导型调节序列(多赫替(Docherty)等人，1994，实验生物学联合会会志(FASEB J.)8：20-24)。适合于在细胞中或哺乳动物中控制dsRNA表达的此类可诱导的表达***包括，例如，由以下项进行的调节：蜕皮激素、***、***、四环素、二聚作用的化学诱导物、以及异丙基-β-D1-硫代半乳糖苷(IPTG)。本领域技术人员将能够基于iRNA转基因的预期用途选择适宜的调节/启动子序列。
在一个具体实施例中，可以使用含有编码iRNA的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(见米勒(Miller)等人，酶学方法(Meth.Enzymol.)217：581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有对于病毒基因组正确包装并整合入宿主细胞DNA必需的组分。将编码iRNA的核酸序列克隆至促进该核酸递送入患者的一种或多种载体中。关于逆转录病毒载体的更多细节可以在例如博恩(Boesen)等人，生物疗法(Biotherapy)6：291-302(1994)找到，所述文献描述使用逆转录病毒载体递送mdr1基因至造血干细胞，以便使得干细胞对化疗更耐受。说明基因治疗中逆转录病毒载体用途的其他参考文献是：克洛斯(Clowes)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)93：644-651(1994)；凯恩(Kiem)等人，血液(Blood)83：1467-1473(1994)；萨尔蒙斯(Salmons)和古兹伯格(Gunzberg)，人类基因疗法(Human Gene Therapy)4：129-141(1993)；以及格罗斯曼(Grossman)和威尔逊(Wilson)，遗传发育新见(Curr.Opin.in Genetics and Devel.)3：110-114(1993)。意欲使用的慢病毒载体包括例如描述于美国专利号6,143,520；5,665,557和5,981,276中的基于HIV的载体，这些美国专利通过引用结合在此。
也构思腺病毒用于iRNA的递送。腺病毒是特别有吸引力的媒介物，例如，用于递送基因至呼吸道上皮。腺病毒天然地感染呼吸道上皮，在那里它们引起轻微疾病。基于腺病毒的递送***的其他靶是肝脏、中枢神经***、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感不***细胞的优点。科扎斯凯(Kozarsky)和威尔森，遗传学与发育学新观点3：499-503(1993)提出基于腺病毒的基因疗法的综述。布特(Bout)等人，人类基因疗法(Human Gene Therapy)5：3-10(1994)展示了腺病毒载体转移基因至恒河猴猴呼吸道上皮的用途。腺病毒在基因疗法中的用途的其他实例可以在罗森菲尔德(Rosenfeld)等人，科学(Science)252：431-434(1991)；罗森菲尔德等人，细胞68：143-155(1992)；马斯安格利(Mastrangeli)等人，临床研究杂志91：225-234(1993)；PCT公开WO 94/12649以及王(Wang)等人，基因疗法2：775-783(1995)中找到。用于表达本发明中表征的iRNA的合适AV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于递送该载体至靶细胞中的方法在夏(Xia)H等人，(2002)，自然生物技术(Nat.Biotech.)20：1006-1010中描述。
也构思使用腺联病毒(AAV)载体(沃尔什(Walsh)等人，美国实验生物学和医学学会学报(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.)204：289-300(1993)；美国专利号5,436,146)。在一个实施例中，iRNA可以从具有例如U6或H1RNA启动子或细胞巨化病毒(CMV)启动子的重组AAV载体作为两个单独的互补性单链RNA分子表达。用于表达本发明中表征的dsRNA的合适AAV载体、用于构建重组AV载体的方法以及用于递送该载体至靶细胞中的方法在萨穆尔斯基(Samulski)R等人(1987)，病毒学杂志(J.Virol.)61：3096-3101；费希尔(Fisher)KJ等人(1996)，病毒学杂志，70：520-532；萨穆尔斯基R等人(1989)，病毒学杂志63：3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号WO 94/13788；以及国际专利申请号WO 93/24641中描述，这些文献的完整披露内容通过引用结合在此。
另一种典型的病毒载体是痘病毒如痘苗病毒病毒，例如减毒痘苗病毒如修饰的安卡拉病毒(MVA)或NYVAC、禽痘病毒如鸡痘病毒或金丝雀痘病毒。
病毒载体的向性可以通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原来对这些载体假型化而进行修饰，或者适当时通过取代不同的病毒衣壳蛋白而进行修饰。例如慢病毒载体可以是用来自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、Mokola等的表面蛋白进行假病毒化。可以通过将载体工程化以表达不同衣壳蛋白血清型，使得AAV载体靶向不同的细胞；参见例如，拉宾诺维茨(Rabinowitz)J E等人，(2002)，病毒学杂志76：791-801，这些文献的完整披露内容通过引用结合在此。
载体的药物制剂可以包括在一种可接受的稀释剂中的该载体，或者可以包括一种缓释基质，该基因递送媒介物被嵌入其中。可替代地，当该完全的基因递送载体可以从重组细胞(例如逆转录病毒载体)完整地产出的情况下，该药物制剂可以包括产出该基因递送***的一个或多个细胞。
III.含有iRNA的药物组合物
在一个实施例中，本发明提供了包含如在此所描述的iRNA以及一种药学上可接受的载体的药物组合物。包含该iRNA的药物组合物对于治疗与LECT2基因表达或活性相关的疾病或障碍(例如，LECT2淀粉样变性)而言是有用的。基于递送模型配制这类药物组合物。例如，可以经配制以便通过肠胃外递送，例如，通过静脉内(IV)递送来全身性施用的组合物。在一些实施例中，在此提供的组合物(例如，LNP配制品)被配制以用于静脉内递送。在一些实施例中，在此提供的组合物(例如，包含GalNAc共轭物的组合物)被配制以用于皮下递送。
在此表征的药物组合物以足以抑制LECT2基因表达的剂量给予。通常，iRNA的适合剂量处于每日受体每千克体重0.01毫至200.0毫克范围内，通常处于每日受体每千克体重1至50mg范围内。例如，dsRNA可以按每单剂量0.05mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg施用。可以将该药物组合物一日给予一次，或者可以将该iRNA在一天内以适当的间隔给予两次、三次或更多次亚剂量，或者甚至可以通过控释制剂使用连续输注或递送而给予。在这种情况下，每个亚剂量中所含的iRNA必须相应地更少，以便实现每日总剂量。也可以将剂量单位复配用于在几天内递送，例如使用在几天时间范围内提供持久iRNA释放的常规持续释放配制品。持续释放配制品在本领域内是熟知的并且对于在特定部位递送试剂是特别有用的，由此可以与本发明的试剂使用。在这一实施例中，该剂量单位包含相应的多个每日剂量。
单剂量对LECT2水平的影响可以长久持续，从而后续剂量以不多于3、4或5天的间距或以不多于1、2、3，或4周的间距给予。
本领域技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗一个受试者所需的剂量和时间安排，这些因素包括(但不局限于)疾病或病症的严重性、之前的治疗、该受试者的总体健康和/或年龄、以及其他存在的疾病。此外，用治疗有效剂量的组合物治疗一个受试者可以包括单一治疗或者一系列治疗。使用常规方法或基于使用适当动物模型的体内测试，可以评估本发明涵盖的各个iRNA的有效剂量和体内半衰期。
适合的动物模型，例如，包含表达人类LECT2的转基因的小鼠可以用来确定LECT2siRNA的治疗有效剂量和/或有效剂量方案给予。
本披露还包括了包含在此表征的iRNA化合物的药物组合物和配制品。取决于希望局部还是***性治疗以及取决于有待治疗的区域，可以将本发明的药物组合物按许多方式给予。给予可以是局部的(例如，通过透皮贴剂)；肺的；例如通过粉末或气溶剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内的；鼻内的；表皮的以及经皮的、经口的或肠胃外的。肠胃外给予包括静脉内、动脉、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；表皮下，例如通过一个植入性装置；或颅内，例如通过实质内、鞘内或脑室内的给予。
iRNA可以按这样的方式递送以靶向特定组织，如产生红细胞的组织。例如，iRNA可以被递送至骨髓、肝脏(例如，肝脏肝细胞)、***、脾、肺(例如，肺胸膜)或脊椎。在一个实施例中，iRNA被递送至骨髓。
用于局部给予的药物组合物以及配制品可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体以及粉末。常规的药物载体、水、粉末或油基、增稠剂等等可以是必要的或希望的。包衣的避孕套、手套等等也可以是有用的。适合的局部配制品包括其中在本发明中体现的iRNA与局部用递送剂如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些。合适的脂质与脂质体包括中性的(例如，二油酰基磷脂酰基DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷酯酰胆碱)、阴离子的(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)以及阳离子的(例如，二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP以及二油酰基磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本发明表征的iRNA可以包囊化在脂质体中或可以形成与脂质体尤其是阳离子脂质体的复合物。可选地，iRNA可以与脂质、尤其与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸与酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、或C1-20烷基酯(例如异丙基肉豆蔻酸酯IPM)、甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部配制品被详细地描述于美国专利号6,747,014中，该美国专利通过引用方式结合在此。
脂质体配制品
除了已经被研究过并且用于药物的配制的微乳剂之外，还存在许多有组织的表面活性剂结构。这些包括单分子层、微粒、双分子层以及囊泡。囊泡(比如脂质体)由于其特异性以及它们从药物递送方面所提供的作用持续时间而引起人们很大兴趣。如在本发明中所使用的，术语“脂质体”意为一种由以球形双分子层或双分子层排列的两亲性分子脂质构成的囊泡。
脂质体是单层的或多层的囊泡，其具有一个形成自亲脂材料的膜以及一个水性内部。该水性部分包含有待递送的组合物。阳离子脂质体具有能够融合至细胞壁的优势。非阳离子脂质体尽管不能够一样有效地与细胞壁融合，但是可以被体内巨噬细胞摄取。
为了穿过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在适合透皮梯度的影响下通过一系列细孔，每个细孔具有小于50nm的直径。因此，希望的是使用高度可变形并且能够穿过这些细孔的脂质体。
脂质体的另外的优势包括：从天然磷脂获得的脂质体是生物相容的且生物可降解的；脂质体可以并入广泛类型的水溶性和脂溶性药物；脂质体可以在其内部区室中保护封装的药物免受代谢和降解(洛索夫(Rosoff)，“药物剂型(Pharmaceutical DosageForms)”，利伯曼(Lieberman)、列赫尔(Rieger)与班克(Banker)(编著)，1988，马塞尔德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，第245页)。在制备脂质体配制品方面的重要的考虑是脂质表面电荷、囊泡尺寸以及这些脂质体的水性体积。
脂质体对于将活性成分转移以及递送至作用位点是有用的。因为脂质体膜在结构上类似于生物膜，所以当脂质体被应用至一个组织时，这些脂质体开始与这些细胞膜合并，并且随着脂质体的合并和细胞进程，这些脂质体的内容物被排空进入该细胞，在这里活性剂可以起作用。
脂质体配制品已经作为许多药品的递送的模型成为广泛研究的焦点。越来越多的证据表明，对于局部给予而言，脂质体呈现超出其他制剂的一些优势。这些优势包括：减少的与所给予药物的高***性吸收相关的副作用、在希望的靶标处所给予药物的增加的积累、以及将广泛种类的药物(亲水的与疏水的两者)给予进入皮肤的能力。
一些报告已经详述了脂质体递送试剂(包括高分子量的DNA)进入皮肤的能力。已经将包括镇痛药、抗体、激素以及高分子量DNA的化合物给予至皮肤。大多数的应用导致靶向上表皮
脂质体分成两大类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的DNA分子相互作用而形成一种稳定的复合体。该带正电荷的DNA/脂质体复合物结合至带负电荷的细胞表面并且内化在内涵体中。由于核内体内的酸性pH，脂质体破裂，从而将它们的内含物释放到细胞质中(王等人，生物化学与生物物理研究通讯，1987，147，980-985)。
pH敏感的或带负电荷的脂质体捕获DNA而不是与其形成复合体。由于该DNA与该脂质是带类似的电荷，所以形成排斥而不是复合。然而，一些DNA包埋于这些脂质体的含水内部。pH-敏感脂质体已经用来递送编码胸苷激酶基因的DNA至培养的细胞单层。在靶标细胞内检测到外源基因的表达(周(Zhou)等人，控释杂志(Journal of Controlled Release)，1992，19，269-274)。
脂质体组合物的一个主要类型包括除了天然来源的磷脂酰胆碱以外的磷脂。例如中性脂质体组合物可以从二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)中形成。阴离子脂质体组合物通常可以形成自二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，而阴离子融合脂质体主要形成自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。另一个类型的脂质体组合物从磷脂酰胆碱(PC)，例如像大豆PC和蛋PC中形成。另一个类型从磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物中形成。
一些研究已经评价了脂质体药物制剂至皮肤的局部递送。将包含干扰素的脂质体应用至天竺鼠皮肤导致皮肤疱疹溃疡的减少，而通过其他手段的干扰素递送(例如，作为溶液或作为乳剂)是无效的(维纳(Weiner)等人，药物靶向杂志(Journal of DrugTargeting)，1992，2，405-410)。此外，另外的研究测试了作为脂质体配制品的一部分而给予的干扰素与使用水性***而给予的干扰素的疗效，并且总结出该脂质体制剂优于水性给予(杜普利斯(du Plessis)等人，抗病毒研究(Antiviral Research)，1992，18，259-265)。
还已经检验非离子型脂质体***以确定它们在递送药物至皮肤中的用途，具体地包含非离子表面活性剂和胆固醇的***。包括NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)以及NovasomeTM II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子型脂质体配制品用于将环孢霉素A递送入小鼠皮肤的真皮。结果表明此类非离子型脂质体***在促进环孢霉素A沉淀进入皮肤的不同层之内方面是有效的(胡(Hu)等人，S.T.P.药物科学(S.T.P.Pharma.Sci.)，1994，4，6，466)。
脂质体还包括“立体化学稳定的”脂质体，这个术语如在此所使用的指包括一种或多种专门化脂质的脂质体，当并入脂质体中时这些脂质导致相对于缺少此类专门化脂质的脂质体而言的增加的循环寿命。立体化学稳定的脂质体的实例是以下那些：在其中该脂质体的形成囊泡的脂质部分中的一部分(A)包括一种或多种糖脂，例如单唾液酸神经节苷酯GM1，或者(B)是用一种或多种亲水聚合物衍生，例如聚乙二醇(PEG)部分。虽然不希望受任何具体理论约束，但在本领域中认为，至少对于含有神经节苷脂、鞘磷脂或PEG-衍生化的脂质的空间稳定的脂质体，这些空间稳定的脂质体的循环半衰期提高来源于进入网状内皮***(RES)的细胞中的摄取减少(艾伦(Allen)等人，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)，1987，223，42；吴等人，癌症研究(Cancer Research)，1993，53，3765)。
包含一种或多种糖脂的不同脂质体是本领域中已知的。帕帕哈都久珀罗斯(Papahadjopoulos)等人(纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)，1987，507，64)报道了单唾液酸神经节苷酯GM1、硫酸半乳糖脑苷脂和磷脂酰肌醇改善脂质体的血液半衰期的能力。这些研究结果由加比宗(Gabizon)等人(美国国家科学院院刊)，1988，85，6949)阐释。均为艾伦等人的美国专利号4,837,028和WO 88/04924披露了包括(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂GM1或硫酸半乳糖脑苷脂的脂质体。美国专利号5,543,152(韦伯(Webb)等人)披露了包含鞘磷脂的脂质体。包含1，2-sn-二肉豆蔻磷脂酰胆碱的脂质体在WO 97/13499(利姆(Lim)等人)中披露。
含有由一种或多种亲水性聚合物衍生化的脂质的许多脂质体及其制备方法是本领域已知的。熊本(Sunamoto)等人(日本化学学会公报(Bull.Chem.Soc.Jpn.)，1980，53，2778)描述包含非离子去垢剂2C1215G的脂质体，所述脂质体含有PEG部分。伊录姆(Illum)等人(欧洲生物物理杂志(FEBS Lett.)，1984，167，79)报道了用聚合物二醇对聚苯乙烯颗粒的亲水包覆导致显著增长的血液半衰期。通过附接聚二醇(例如，PEG)的羧基所修饰的合成磷脂由Sears描述(美国专利号4,426,330和4,534,899)。克利巴诺夫(Klibanov)等人(FEBSLett.，1990，268，235)描述了展示以下的实验：包含用PEG或PEG硬脂酸酯衍生化的磷脂酰乙醇胺(PE)的脂质体具有显著增加的血液循环半衰期。布鲁姆(Blume)等人(生物化学与生物物理学学报(Biochimica et Biophysica Acta)，1990，1029，91)将这类观察结果扩展至其他PEG衍生化的磷脂，例如，由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG的组合形成的DSPE-PEG。授予Fisher的欧洲专利号EP 0445131 B1和WO 90/04384中描述了在它们的外表面上具有共价结合的PEG部分的脂质体。含有1-20摩尔％用PEG衍生化的PE的脂质体组合物及其使用方法由Woodle等人(美国专利号5,013,556和5,356,633)和马丁(Martin)等人(美国专利号5,213,804和欧洲专利号EP 0496813 B1)描述。包含许多其他脂质聚合共轭物的脂质体在WO 91/05545和美国专利号5,225,212(均授予马丁(Martin)等人)中和在WO 94/20073(Zalipsky等人)中公开包括PEG修饰的神经酰胺脂质的脂质体描述于WO 96/10391(佐伊(Choi)等人)中。美国专利号5,540,935(宫崎(Miyazaki)等人)以及美国专利号5,556,948(田川(Tagawa)等人)描述了包含PEG的脂质体，它们可以进一步被官能部分在其表面进行衍生化。
一些包括核酸的脂质体在本领域内是已知的。授予蒂埃里(Thierry)等人的WO96/40062公开了在脂质体中封装高分子量核酸的方法。授予田川(Tagawa)等人的美国专利号5,264,221公开了结合蛋白质的脂质体并且声称这类脂质体的内容物可以包含dsRNA。授予拉赫曼(Rahman)等人的美国专利号5,665,710描述在脂质体中封装寡脱氧核苷酸的某些方法。授予洛夫(Love)等人的WO 97/04787公开了包含靶向raf基因的dsRNA的脂质体。
传递体是又另一种类型的脂质体，并且是高度可变形的脂质聚集物，它们是用于药物递送媒介物的引人注目的候选者。传递体可以描述为脂滴，其是高度可变形从而它们能够容易地穿过比该脂滴更小的孔。传递体能适应在其中使用它们的环境，例如它们是自优化性的(能适应皮肤中孔的形状)、自我修复性的、频繁地到达它们的靶标而不片段化，并且通常是自我负载性的。为了制备传递体，可能的是将表面边缘激活剂(通常是表面活性剂)添加至一种标准的脂质体组合物。传递体已经被用于将血清白蛋白递送至皮肤。传递体介导的血清白蛋白的递送已经显示与包含血清白蛋白的溶液的皮下注射同样有效。
表面活性剂在配制品如乳剂(包括微乳剂)和脂质体中有广泛应用。对许多不同类型的表面活性剂(天然的和合成的两者)的特性进行分类并评级的最普通的方法是通过使用亲水/亲油平衡值(HLB)。亲水基团(又称为“头部”)的性质为对用于配制品中的不同表面活性剂进行归类提供了最有用的手段(列赫尔(Rieger)，“药物剂型”(PharmaceuticalDosage Forms)，马塞尔德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约州纽约(New York，N.Y.)，1988，第285页)。
如果该表面活性剂分子没有离子化，它被分类为一种非离子型表面活性剂。发现非离子型表面活性剂在药物与化妆品产品方面有广泛应用并且能够在广泛的pH范围使用。总体上，取决于它们的结构，它们的HLB值范围为从2至大约18。非离子型表面活性剂包括非离子型酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯以及乙氧基化酯。非离子型烷醇酰胺以及醚(例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇、以及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物)也包括在这一类别中。聚氧乙烯表面活性剂是该非离子型表面活性剂类别中最常用的成员。
如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带负电荷，则该表面活性剂被分类为阴离子型。阴离子型表面活性剂包括羧化物(例如皂)、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯(例如烷基硫酸酯以及乙氧基化的烷基硫酸酯)、磺酸酯(例如烷基苯磺酸酯、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯以及磺基琥珀酸酯)、以及磷酸酯。该阴离子型表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸酯和皂类。
如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带正电荷，则该表面活性剂被分类为阳离子型。阳离子型表面活性剂包括季铵盐以及乙氧基化胺。这些季铵盐是这一类别的最常用的成员。
如果该表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，该表面活性剂被分类为两性型。两性型表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱以及磷脂。
已经综述了表面活性剂在药品、配制品和在乳剂中的用途(列赫尔，“药物剂型”，马塞尔德克公司，纽约州纽约，1988，第285页)。
核酸脂质颗粒
在一个实施例中，本发明表征的LECT2dsRNA被完全包囊在脂质配制品中，从而例如形成一种SPLP、pSPLP、SNALP或其他核酸-脂质颗粒。如在此使用的，术语“SNALP”指一种稳定的核酸-脂质颗粒，包括SPLP。如在此使用的，术语“SPLP”指一种核酸-脂质颗粒，其包括包囊在脂质囊泡中的质粒DNA。SNALP与SPLP典型地包含一种阳离子脂质、一种非阳离子脂质以及一种阻止该颗粒聚集的脂质(例如一种PEG-脂质共轭物)。SNALP与SPLP对于合成应用是极其有用的，因为它们展示出在静脉内(i.v.)注射之后延长的循环寿命并且在远端位点积累(例如在与给予位点物理分开的位点)。SPLP包括“pSPLP”，pSPLP包括一种包囊化的缩合剂-核酸复合体，如在PCT公开号WO 00/03683中所提出的。本发明的颗粒典型地具有约50nm至约150nm，更典型地是约60nm至约130nm，更典型地是约70nm至约110nm，最典型地是约70nm至约90nm的平均直径，并且基本上是无毒的。另外，当出现在本发明的核酸-脂质颗粒中时，这些核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒及其制备方法在例如美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；以及PCT公开号WO 96/40964。
在一个实施例中，脂质与药物的比率(质量/质量比率)(例如脂质与dsRNA的比率)将处于从大约1∶1至大约50∶1，从大约1∶1至大约25∶1，从大约3∶1至大约15∶1，从大约4∶1至大约10∶1，从大约5∶1至大约9∶1，或大约6∶1至大约9∶1的范围内。
阳离子脂质可以例如N，N-二油烯基-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)、N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(I-(2，3-二油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(I-(2，3-二油烯基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N，N-二甲基-2，3-二油烯基氧基丙胺(DODMA)、1，2-二亚油烯基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1，2-二亚油烯基氨基甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1，2-二亚油烯基氧基-3-(二甲基氨基)乙酸基丙烷(DLin-DAC)、1，2-二亚油烯基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1，2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1，2-二亚油烯基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-二亚油酰基-2-亚油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1-二亚油烯基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1，2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1，2-二亚油烯基氧基-3-(N-甲基哌嗪代)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N，N-二亚油烯基氨基)-1，2-丙二醇(DLinAP)、3-(N，N-二油烯基氨基)-1，2-丙二醇(DOAP)、1，2-二亚油烯基氧代-3-(2-N，N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2，2-二油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR，5s，6aS)-N，N-二甲基-2，2-二((9Z，12Z)-十八-9，12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-胺(ALN 100)、(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七碳-6，9，28，31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、1，1′-(2-(4-(2-((2-(二(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)双十二烷-2-醇(Tech G1)或其混合物。该阳离子脂质可以占该颗粒中存在的总脂质的从大约20mol％至大约50mol％或大约40mol％。
在另一个实施例中，化合物2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环可以用来制备脂质-siRNA纳米颗粒。2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环的合成描述于2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61/107,998中，将其通过引用结合于此。
在一个实施例中，该脂质-siRNA颗粒包括40％2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环：10％DSPC：40％胆固醇：10％PEG-C-DOMG(摩尔百分数)，颗粒尺寸在63.0±20nm，并且具有0.027siRNA/脂质比率。
非阳离子脂质可以是一种阴离子脂质或一种中性脂质，包括但不限于：二硬脂酰磷酸卵磷酯(DSPC)、二油酰基磷酸卵磷酯(DOPC)、二棕榈酰磷酸卵磷酯(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷酸卵磷酯(POPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰基乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇，或其混合物。非阳离子脂质(如果包括胆固醇的话)可以占该颗粒中存在的总脂质的从大约5mol％至大约90mol％，大约10mol％，或大约58mol％。
抑制颗粒聚集的共轭脂质可以是例如一种聚乙二醇(PEG)-脂质，其包括但不限于PEG-PEG-(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)，或其混合物。PEG-DAA共轭物可以例如是PEG-二月桂基氧丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蔻基氧丙基(Ci4)、PEG-二棕榈基氧丙基(Ci6)或PEG-二硬脂基氧丙基(C]8)。防止颗粒聚集的共轭脂质可以占从0mol％至约20mol％或约2mol％在颗粒中存在的总脂质。
在一些实施例中，核酸-脂质颗粒进一步包括胆固醇，该胆固醇例如占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约60mol％或约48mol％。
在一些实施例中，该iRNA被配制成一种脂质纳米颗粒(LNP)。
LNP01
在一个实施例中，脂质ND98.4HCl(MW 1487)(见2008年3月26日提交的美国专利申请号12/056,230，所述文献通过引用的方式结合在此)、胆固醇(Sigma-Aldrich)和PEG-脑苷脂C16(Avanti极性脂质)可以用来制备脂质-dsRNA纳米颗粒(例如，LNP01颗粒)。可以如下制备每种组分在乙醇中的母液：ND98，133mg/ml；胆固醇，25mg/ml；PEG-神经酰胺C16，100mg/ml。然后可以例如42：48：10摩尔比组合ND98、胆固醇和PEG-神经酰胺C16储备溶液。合并的脂质溶液可以与(例如pH 5乙酸钠中的)水性dsRNA混合，这样使得最终乙醇浓度是约35％-45％并且最终乙酸钠浓度是约100-300mM。一旦混合，脂质-dsRNA纳米颗粒典型地自发形成。取决于所需的粒度分布，可以使用例如热桶挤出机，如Lipex挤出机(北部脂质公司(Northern Lipids，Inc))，经聚碳酸酯膜(例如100nm截值)挤出所产生的纳米颗粒混合物。在一些情况下，可以省略挤出步骤。可以通过例如透析或切线流过滤实现乙醇去除和同时交换缓冲液。缓冲液可以与例如在约pH 7，例如约pH 6.9、约pH 7.0、约pH 7.1、约pH7.2、约pH 7.3或约pH 7.4下的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)交换。
LNP01配制品例如在国际申请公开号WO 2008/042973中描述，将其通过引用结合在此。
另外的示例性脂质-dsRNA制剂提供于下表中。
表4：示例性脂质配制品
DSPC：二硬脂酰磷脂酰胆碱
DPPC：二棕榈酰磷脂酰胆碱
PEG-DMG：PEG-双二肉豆蔻酰甘油(C14-PEG，或PEG-C14)(平均分子量为2000的PEG)
PEG-DSG：PEG-二苯乙烯基甘油(C18-PEG，或PEG-C18)(平均分子量为2000的PEG)
PEG-cDMA：PEG-氨基甲酰基-1，2-二肉豆蔻基氧基丙胺(平均分子量为2000的PEG)
包含SNALP(1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA))的制剂描述于2009年4与15日提交的国际公开号WO 2009/127060中，通过引用将其结合于此。
包括XTC的配制品描述于，例如，以下各项中：2009年1月29日提交的美国临时序列号61/148,366；2009年3月2日提交的美国临时序列号61/156,851；2009年6月10日提交的美国临时序列号61/185,712；2009年7月24日提交的美国临时序列号61/228,373；2009年9月3日提交的美国临时序列号61/239,686以及2010年1月29日提交的国际申请号PCT/US2010/022614，将其通过引用特此结合。
包括MC3的配制品描述于例如以下各项中：2009年9月22日提交的美国临时序列号61/244,834，2009年6月10日提交的美国临时序列号61/185,800，以及2010年6月10日提交的国际申请号PCT/US 10/28224，将其通过引用特此结合。
包含ALNY-100的配制品描述于例如以下中：例如，2009年11月10日提交的国际专利申请号PCT/US 09/63933，将其通过引用特此结合。
包含C12-200的配制品描述于例如以下各项中：2009年5月5日提交的美国临时序列号61/175,770以及2010年5月5日提交的国际申请号PCT/US 10/33777，将其通过引用特此结合。
阳离子脂质的合成
在本发明中表征的核酸颗粒中使用的任何化合物，例如，阳离子脂质等可以通过已知的有机合成技术制备。除非另外指明，否则全部取代基如下文定义。
“烷基”意指包含从1至24个碳原子的直链或支链、非环状或环状的饱和脂肪族烃。代表性饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等；而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戍基等。代表性饱和环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和环状烷基包括环戊烯基和环己烯基等。
“烯基”意指在相邻碳原子之间含有至少一个双键的如上所定义的烷基。烯基包括顺式和反式异构体。代表性直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基等。
“炔基”意指在相邻碳之间另外含有至少一个三键的如上所定义的任何烷基或烯基。代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。
“酰基”是指任何烷基，烯基或炔基，其中，在附接点的碳被氧代基团取代，如下所定义。例如，-C(＝O)烷基、-C(＝O)烯基和-C(＝O)炔基是酰基。
“杂环”意味着一个5-至7-元单环、或7-至10-元二环的杂环，它是饱和的、不饱和的或芳香族的，并且它包含独立地选自氮、氧、和硫的从1或2个杂原子，并且其中该氮和硫杂原子可以是任选地氧化的，并且该氮杂原子可以任选地是季铵化的，包括双环，其中上述杂环的任一个被稠合至一个苯环。该杂环可通过任何杂原子或碳原子而附接。杂环包括如下文定义的杂芳基。杂环包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基(piperizynyl)、乙内酰脲基(hydantoinyl)、戊内酸胺基(valerolactamyl)、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。
术语“任选取代的烷基”，“任选取代的烯基”，“任选取代的炔基”，“任选取代的酰基”和“任选被取代的杂环”是指，当取代时，至少一个氢原子被一个取代基置换。在氧代取代基(＝O)的情况下，两个氢原子被置换。就这一点而言，取代基包括氧代、卤素、杂环、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy，其中n是0、1或2，Rx和Ry是相同或不同的并且独立地是氢、烷基或杂环，并且所述烷基和杂环取代基中的每一个可以进一步地被一个或多个氧代、卤素、-OH、-CN、烷基、-ORx、杂环、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy取代。
“卤素”是指氟、氯、溴、以及碘。
在一些实施例中，本发明中表征的方法可以需要使用保护基。保护基方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如有机合成中的保护基(Protective Groups in OrganicSynthesis)，格林(Green)T.W.等人，威利数字出版平台(Wiley-Interscience)，纽约市，1999)。简言之，本发明上下文中的保护基是降低或消除不希望的官能团反应性的任何基团。可以将保护基添加到官能团以掩蔽其在某些反应过程中的反应性并且随后将其移除以暴露原始官能团。在一些实施例中，使用“醇保护基”。“醇保护基”是减少或消除不希望的醇官能团反应性的任何基团。保护基团可以使用本领域中公知的技术添加和去除。
式A的合成
在一个实施例中，使用式A的阳离子脂质配制本发明中表征的核酸-脂质颗粒：
其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且R3和R4独立地是低级烷基或R3和R4可以是一起形成任选取代的杂环。在一些实施例中，阳离子脂质是XTC(2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环)。通常，可以通过以下反应方案1或2产生以上式A的脂质，其中除非另外指明，否则全部取代基如上文定义。
方案1
根据方案1制备脂质A，其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且R3和R4独立地是低级烷基或R3和R4可以一起形成任选取代的杂环。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备酮1和溴化物2。1和2的反应产生缩酮3。用胺4处理缩酮3产生式A的脂质。式A的脂质可以用式5的有机盐转化成相应的铵盐，其中X是选自卤素、氢氧化物、磷酸根、硫酸根等的阴离子反离子。
方案2
可选地，可以根据方案2制备酮1原料。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备格氏(Grignard)试剂6和氰化物7。6和7的反应产生酮1。如方案1中所述，酮1转化成式A的相应脂质。
MC3的合成
如下制备DLin-M-C3-DMA(即，(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七碳-6，9，28，31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)。将(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七碳-6，9，28，31-四烯-19-醇(0.53g)、4-N，N-二甲基氨基丁酸盐酸盐(0.51g)、4-N，N-二甲氨基吡啶(0.61g)以及1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)盐酸盐(0.53g)在二氯甲烷(5mL)中的溶液在室温搅拌过夜。将该溶液用稀盐酸洗涤，随后用稀碳酸氢钠水溶液洗涤。将有机部分在无水硫酸镁上干燥，过滤并且在旋转蒸发器上移除溶剂。使用1％-5％甲醇/二氯甲烷洗脱梯度，使残余物穿过硅胶柱(20g)。合并包含纯化产物的级分并且移除溶剂，产生无色油(0.54g)。
ALNY-100的合成
使用以下方案3进行缩酮519[ALNY-100]的合成：
515的合成：
在0℃在氮气氛下向双颈RBF(1L)中LiAlH4(3.74g，0.09852mol)在200ml无水THF中的搅拌悬浮液缓慢添加514(10g，0.04926mol)在70mLTHF中的溶液。在完全添加之后，将反应混合物加温至室温并且然后加热至回流，持续4h。通过TLC监测反应的进展。在完成反应(借助TLC监测)后，将混合物冷却至0℃并且通过小心添加饱和Na2SO4溶液淬灭。将反应混合物在室温搅拌4小时并滤出。将残余物用THF充分洗涤。将滤液和洗涤液混合并用400mL二噁烷和26mL浓HCl稀释并且在室温搅拌20分钟。在真空下剥离挥发物以提供作为白色固体的515盐酸盐。产率：7.12g 1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ＝9-34(宽，2H)，5.68(s，2H)，3.74(m，1H)，2.66-2.60(m，2H)，2.50-2.45(m，5H)。
516的合成：
向250mL双颈RBF中化合物515在100mL无水DCM中的搅拌溶液中添加NEt3(37.2mL，0.2669mol)并在氮气气氛下冷却至0℃。在缓慢添加50mL无水DCM中的N-(苄氧羰氧基)-琥珀酰亚胺(20g，0.08007mol)后，允许反应混合物加温到室温。在反应结束(通过TLC检测2-3小时)后，将混合物用1NHCl溶液(1x100mL)和饱和NaHCO3溶液(1 x 50mL)依次洗涤。随后在无水Na2SO4上干燥有机层并且蒸发溶剂以产生粗制材料，该粗制材料通过硅胶柱色谱法纯化以获得作为粘性物质的516。产率：11g(89％)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ＝7.36-7.27(m，5H)，5.69(s，2H)，5.12(s，2H)，4.96(br.，1H)2.74(s，3H)，2.60(m，2H)，2.30-2.25(m，2H)。LC-MS[M+H]-232.3(96.94％)。
517A和517B的合成：
将环戊烯516(5g，0.02164mol)溶解于单颈500mL RBF中的220mL丙酮和水(10∶1)的溶液内，并且在室温向其中添加N-甲基吗啉-N-氧化物(7.6g，0.06492mol)，随后添加叔-丁醇中的4.2mL 7.6％OsO4溶液(0.275g，0.00108mol)。在反应结束(约3小时)后，将混合物通过添加固体Na2SO3淬灭并且将所产生的混合物在室温搅拌1.5小时。将反应混合物用DCM(300mL)稀释并且用水(2 x 100mL)洗涤，随后用饱和NaHCO3(1 x 50mL)溶液、水(1x30mL)并最终用盐水(1 x 50mL)洗涤。在无水Na2SO4上干燥有机相并且在真空中移除溶剂。粗制材料的硅胶柱色谱法纯化提供了非对映异构体的混合物，这些非对映异构体由制备级HPLC分离。产率：约6g粗制物
517A-峰-1(白色固体)，5.13g(96％)。1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ＝7.39-7.31(m，5H)，5.04(s，2H)，4.78-4.73(m，1H)，4.48-4.47(d，2H)，3.94-3.93(m，2H)，2.71(s，3H)，1.72-1.67(m，4H)。LC-MS-[M+H]-266.3，[M+NH4+]-283.5存在，HPLC-97.86％。通过X射线证实立体化学。
518的合成：
使用与被描述用于合成化合物505的方法类似的方法，获得呈无色油状物的化合物518(1.2g，41％)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ＝7.35-7.33(m，4H)，7.30-7.27(m，1H)，5.37-5.27(m，8H)，5.12(s，2H)，4.75(m，1H)，4.58-4.57(m，2H)，2.78-2.74(m，7H)，2.06-2.00(m，8H)，1.96-1.91(m，2H)，1.62(m，4H)，1.48(m，2H)，1.37-1.25(br m，36H)，0.87(m，6H)HPLC-98.65％。
用于合成化合物519的一般方法：
将化合物518(1当量)在己烷(15mL)中的溶液以逐滴方式添加至LAH在THF(1M，2当量)中的冰***液中。在完成添加后，将混合物在40℃加热0.5小时，随后在冰浴上再次冷却。将混合物用饱和Na2SO4水溶液小心地水解，随后经塞里滤料(celite)过滤并缩减成油。柱色谱法提供呈无色油状物获得的纯519(1.3g，68％)。13C NMR＝130.2，130.1(x2)，127.9(x3)，112.3，79.3，64.4，44.7，38.3，35.4，31.5，29.9(x2)，29.7，29.6(x2)，29.5(x3)，29.3(x2)，27.2(x3)，25.6，24.5，23.3，226，14.1；电喷雾MS(+ve)：C44H80NO2(M+H)+的计算分子量为654.6，观察到分子量为654.6。
通过标准或非挤出方法制备的配制品可以按类似的方式来表征。例如配制品典型地通过视觉检查来进行表征。它们应该是发白的半透明溶液，无聚集物或沉淀。脂质纳米颗粒的粒径和粒径分布可以使用例如马尔文(Malvem)Zetasizer Nano ZS(马尔文公司(Malvern)，USA)通过光散射来进行测量。颗粒应该是约20-300nm，例如尺寸是40-100nm。该粒径分布应该是单峰的。配制品中的总dsRNA浓度以及捕获的片段是使用染料排除测定来评估。配制的dsRNA的样品可以与RNA结合染料如Ribogreen(分子探针公司(MolecularProbes))在配制品破坏性表面活性剂(例如0.5％Triton-X100)存在或不存在下孵育。配制品中的总dsRNA可以相对于标准曲线，通过来自含有表面活性剂的样品的信号来确定。该捕获的片段是通过将“游离”dsRNA内含物(如通过在表面活性剂不存在下的信号所测量的)从该总dsRNA内含物中减去来确定。包埋的dsRNA的百分比典型地＞85％。对于SNALP配制品而言，颗粒尺寸是至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、以及至少120nm。适合的范围典型地是约至少50nm至约至少110nm、约至少60nm至约至少100nm、或约至少80nm至约至少90nm。
用于口服给予的组合物和配制品包括粉剂或颗粒剂、微粒剂、纳米颗粒剂、在水或非水性介质中的混悬液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或迷你片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂可以是希望的。在一些实施例中，口服配制品是以下那些：在其中本发明所表征的dsRNA与一种或多种渗透增强剂表面活性剂以及螯合剂结合地给予。适合的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。合适的胆酸/盐包括鹅脱氧胆酸(CDCA)以及乌索脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸、甘油胆酸、甘油脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24，25-二氢-梭链孢酸钠以及甘油二氢梭链孢酸钠。合适的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、一种酰基肉毒碱、一种酰基胆碱、或一种甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如钠盐)。在一些实施例中，渗透增强剂的组合(例如脂肪酸/盐)是与胆汁酸/盐组合使用。一个示例性的组合是月桂酸、羊蜡酸以及UDCA的钠盐。其他渗透促强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡醚。本发明表征的dsRNA可以口服递送，以包括喷雾干燥颗粒的颗粒剂的形式递送，或者复合形成颗粒或纳米颗粒。DsRNA复合剂包括聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷基酯、聚氧乙烷(polyoxethane)、聚氰基丙烯酸烷基酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；DEAE衍生化聚亚胺、短梗霉多糖、纤维素和淀粉。合适的复合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如p-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-异丁烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白与DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D，L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、藻朊酸盐、以及聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服配制品及其制备在美国专利6,887，906、美国公开号20030027780以及美国专利号6,747,014中详述，这些文献的每一个通过引用结合在此。
用于肠胃外、实质内(进入脑)、鞘内、心室内或肝内给药的组合物和配制品可以包括无菌水溶液，其也可以包含缓冲液、稀释剂及其他适当的添加剂，例如但不限于：渗透增强剂、载体化合物及其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂以及含脂质体配制品。这些组合物可以产生自多种组分，这些组分包括但不限于预成形的液体、自乳化固体以及自乳化半固体。
本发明中表征的药物配制品(可以方便地以单位剂型存在)可以根据医药工业内熟知的常规技术来制备。此类技术包括以下这样的步骤：将这些活性成分与该(这些)药物载体或赋形剂进行联合。总体而言，这些配制品是通过以下步骤来制备：使这些活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或它们两者均匀地且精细地联合，并且如果需要，进而将产品成形。
本发明中表征的组合物可以被配制为许多可能的剂型中的任一者，这些剂型比如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软胶囊、栓剂以及灌肠剂。这些组合物还可以被配制为在水性或非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。
另外的配制品
乳剂
本发明的组合物可以被制备或配制为乳剂。乳剂典型地是一种液体以直径通常超过0.1μm的液滴形式分散于另一种中的多相体系(参见，例如安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递***(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦LV.、波波维奇(Popovich)NG.以及安赛尔HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(LippincottWilliams&Wilkins)(第8版)，纽约州纽约；爱德森，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第199页；洛索夫，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第245页；布洛克，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第2卷，第335页；希古契(Higuchi)，雷明顿氏药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿(Easton)，Pa.，1985，第301页)。乳剂经常是包含密切混合且彼此分散的两个不混溶的液相的双相体系。通常，乳剂可以为油包水(w/o)或水包油(o/w)两种。当水相作为微小液滴细碎并分散到本体油相中时，所产生的组合物被称为油包水(w/o)乳剂。可替代地，当油相作为微小液滴细碎并分散到本体水相中时，所产生的组合物被称为水包油(o/w)乳剂。除了分散相和活性药物外，乳剂还可以含其他组分，并且活性药物可以作为在水相、油相中的溶液，或者其自身作为独立相。如果需要，也可以存在药物赋形剂如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂。药物乳剂还可以为包括多于两种相的多重乳剂，比如像油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳剂的情况。此类复合配制品通常提供某些简单的二元乳剂所不具有的优势。当多重乳剂中的o/w乳剂的各油滴还包有小水滴时，该多重乳剂形成w/o/w乳剂。同样地，在油连续相中稳定化的水滴中封装油滴的***，构成o/w/o乳剂。
乳剂具有较小或没有热力学稳定性的特征。通常，乳剂的分散相或不连续相很好地分散在外相或连续相中并通过乳化剂或配制品的粘性保持这种形式。在乳剂状软膏基料或膏剂的情况下，乳剂的每个相都可以为半固体或固体。其他稳定乳剂的方式需要使用乳化剂，这些乳化剂可以合并进入到乳剂的任意相中。乳化剂可以大致分成4类：合成性的表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收基质和精细分散的固体(见例如，安塞尔药物剂型和药物递送***(Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen，LV.)，波波维奇(Popovich NG.)，以及安塞尔(Ansel HC.)，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，纽约州；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与班克(Banker)(编著)，1988，马塞尔德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。
合成性的表面活性剂，也称作表面活性试剂，已经发现在乳剂的配制中广泛应用并且已经在文献中综述(参见，例如安赛尔的药物剂型与药物传递***，艾伦LV.、波波维奇NG.以及安赛尔HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(第8版)，纽约州纽约；列赫尔，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第285页；爱德森，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，马塞尔德克公司，纽约州纽约，1988，第1卷，第199页)。表面活性剂典型地是两亲的，并且包含亲水部分和疏水部分。表面活性剂的亲水和疏水性的比率被称为亲水/亲油平衡值(HLB)，并且它是配制品制备中分类和选择表面活性剂的有价值的工具。表面活性剂可以基于亲水基团的性质：非离子、阴离子、阳离子和两性分成不同类别(见例如，安塞尔药物剂型和药物递送***(Ansel′s PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen，LV.)，波波维奇(PopovichNG.)，以及安塞尔(Ansel HC.)，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯出版公司(LippincottWilliams&Wilkins)(第8版)，纽约，纽约州；列赫尔(Rieger)，于药物剂型(PharmaceuticalDosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与班克(Banker)(编著)，1988，马塞尔德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，285页)。
乳剂配制品中使用的天然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和***胶。吸收基质具有亲水特性，所以它们能够吸收水以形成w/o乳剂并仍然保持它们的半固体稠度，如无水羊毛脂和亲水凡士林。精细分散的固体也已经被用做优良的乳化剂，尤其是与表面活性剂组合和在粘性制剂中使用。这些包括极性无机固体，如重金属氢氧化物、非溶胀粘土如膨润土、凹凸棒土、锂蒙脱石，高岭土、蒙脱土、胶状硅酸铝和胶状镁硅酸铝、颜料和非极性固体如碳或甘油基三硬脂酸酯。
在乳剂配制品中还包括多种非乳化材料，并且它们对乳剂的特性有帮助。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(布洛克(Block)于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与班克(Banker)(编著)，1988，马塞尔德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷2，第335页；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与班克(Banker)(编著)，1988，马塞尔德克公司(MarcelDekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，第199页)。
亲水胶体或水状胶体包括天然存在的树胶和合成的聚合物如多糖(如***树胶、琼脂、藻酸、角叉菜聚糖、瓜耳胶、刺梧桐树胶和皇蓍胶)，纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)和合成的聚合物(如卡波姆胶、纤维素醚和羰基乙烯基聚合物)。这些物质在水中分散或溶胀形成胶状溶液，这些胶状溶液通过在分散相液滴的周围形成强的界面膜并通过增强外相的粘度来稳定乳剂。
由于乳剂通常包含一些可以容易地支持微生物生长的成份如碳水化合物、蛋白、固醇和磷脂，所以这些制剂通常含有防腐剂。乳剂配制品中通常使用的防腐剂包括甲基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。通常也将抗氧剂加入到乳剂配制品中，以预防配制品的变质。所用的抗氧化剂可以是自由基清除剂，如生育酚，没食子酸烷基酯、丁化羟基茴香醚、丁化羟基甲苯，或还原剂如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，和抗氧化剂增效剂如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
通过皮肤途径、口途径和肠胃外途径使用乳剂配制品和制造它们的方法已经在文献中综述(见例如，安塞尔药物剂型和药物递送***(Ansel′s Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen，LV.)，波波维奇(Popovich NG.)，以及安塞尔(Ansel HC.)，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，纽约州；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical DosageForms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与班克(Banker)(编著)，1988，马塞尔德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。由于易于配制以及从吸收和生物利用度观点来看的有效性，用于口服递送的乳剂配制品已得到非常广泛地使用(参见，例如安赛尔药物剂型与药物传递***，艾伦LV.、波波维奇NG.以及安赛尔HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(第8版)，纽约州纽约；洛索夫，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第245页；爱德森，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第199页。基于矿物油的缓泻药、油溶性维生素和高脂肪营养制剂属于经常作为o/w乳剂口服给予的物质。
在本发明的一个实施例中，将iRNA和核酸的组合物配制为微乳剂。可以将微乳剂定义为水、油和两亲分子的体系，所述体系是光学各向同性和热动力学稳定的单一液态溶液(参见例如，安塞尔药物剂型和药物递送***(Ansel′s Pharmaceutical Dosage Formsand Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen，LV.)，波波维奇(Popovich NG.)，以及安塞尔(Ansel HC.)，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，纽约州；洛索夫(Rosoff)，于药物剂型(Pharmaceutical DosageForms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与班克(Banker)(编著)，1988，马塞尔德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，第245页)。典型地，微乳剂是通过如下方法制备的***：首先将油分散到表面活性剂水溶液中，然后加入足量的通常为中等链长度的醇的第四组分来形成透明***。因此，微乳剂也被描述成由表面活性分子的界面膜稳定化的两种不能混合的液体的热力学稳定的各向同性的澄清分散系(朗(Leung)与纱(Shah)，在：药物的受控释放：聚合物和聚集体***(Controlled Release of Drugs：Polymers andAggregate Systems)，洛索夫M.编著，1989，VCH出版公司，纽约，第185-215页)。通常微乳剂通过包括油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解质的三至五种组分的组合来制备。微乳剂是为油包水(w/o)还是水包油(o/w)类型取决于所使用的油和表面活性剂的特性以及表面活性剂分子的极性头部和羟基尾的结构和几何包装(斯科特(Schott)，雷明顿氏药物科学，麦克出版公司，伊斯顿，Pa.，1985，第271页)。
已经广泛研究了利用相图的现象学方法并且该方法已经产生了为本领域普通技术人员所知的如何配制微乳剂的广泛知识(参见例如，安塞尔药物剂型和药物递送***，艾伦LV.、波波维奇NG.以及安塞尔HC，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(第8版)，纽约州纽约；洛索夫，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第245页；布洛克，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第335页)。与常规乳剂相比，微乳剂提供的优点是能将非水溶性药物溶解到自发形成的热力学稳定的液滴的配制品中。
在微乳剂的制备中使用的表面活性剂包括但不限于单独的或与助表面活性剂组合使用的离子表面活性剂、非离子表面活性剂、Brij96、聚氧乙烯油基醚、聚脂肪酸甘油酯、单月桂酸四甘油酯(ML310)、单油酸四甘油酯(MO310)、单油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、单癸酸十甘油酯(MCA750)、单油酸十甘油酯(MO750)、一又二分之一油酸十甘油酯(SO750)(decaglycerol sequioleate)、十油酸十甘油酯(DAO750)。该辅助表面活性剂通常是短链醇如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，作用是通过渗透到表面活性剂膜中并由此在表面活性剂分子间产生空余空间来产生无序膜从而提高界面流动性。然而，微乳剂可以不用助表面活性剂进行制备，并且无醇的自乳化微乳剂***是本领域已知的。典型地，水相可以是(但不限于)水、药物的水溶液、甘油、PEG 300、PEG 400、聚甘油、丙二醇、和乙乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于如多种材料，比如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯，中等链(C8-C12)的单、二和三甘油三酯，聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇，聚乙二醇化的甘油酯(polyglycolized glyceride)，饱和的聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅油。
从药物溶解和增强的药物吸收方面看，微乳剂是特别令人感兴趣的。已经提出基于脂质的微乳剂(o/W和w/o)以增强药物(包括肽)的口服生物利用率(见例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；康斯坦丁尼德斯(Constantinides)等人，药物研究(Pharmaceutical Research)，1994，11，1385-1390；里切尔(Ritschel)，实验与临床药理学的方法与发现(Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.)，1993，13，205)。微乳剂提供以下优点：改进药物溶解、保护药物免遭酶水解、可能因表面活性剂引起的膜流动性和通透性改变而增强药物吸收、易于制备、比固体剂型易于口服施用、临床效力改善和毒性降低(见例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；康斯坦丁尼德斯(Constantinides)等人，药物研究(Pharmaceutical Research)，1994，11，1385；胡(Ho)等人，药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)，1996，85，138-143)。通常，微乳剂的成份在环境温度下混合在一起时，它们可以自发形成微乳剂。在配制热不稳定药物、肽或iRNA时，这可以是特别有利的。在化妆品和药物应用领域，微乳剂在活性组分的透皮递送中也是有效的。预期本发明的微乳剂组合物和配制品将促进iRNA和核酸从胃肠道的全身性吸收增加以及改善iRNA和核酸的局部细胞摄取。
本发明的微乳剂也可以含有另外的组分和添加剂，如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Grill3)、Labrasol、和改善制剂特性并增强本发明iRNA和核酸吸收的渗透增强剂。可以将本发明的微乳剂中所用的渗透增强剂划分为属于5大类之一--表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合性非表面活性剂(李(Lee)等人，治疗性药物载体***锐评(CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，第92页)。每个类型都已经在以上进行了讨论。
渗透增强剂
在一个实施例中，本发明采用了不同渗透增强剂来实现向动物皮肤高效递送核酸，具体地iRNA。大多数药物以离子化形式和非离子化形式两者存在于溶液中。然而，通常只有脂溶的或亲脂的药物易于穿过细胞膜。已经发现，如果用增渗剂处理要穿过的膜，甚至连非亲脂药物都可以穿过细胞膜。除了帮助非亲脂药物扩散穿过细胞膜以外，渗透增强剂还增强亲脂药物的渗透性。
可以将渗透增强剂划分为属于5大类之一，即，表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合性非表面活性剂(见例如，马姆斯顿(Malmsten，M.)药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants and polymers in drug delivery)，英富曼卫生保健(InformaHealth Care)，纽约，纽约州，2002；李(Lee)等人.，治疗性药物载体***锐评(CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，p.92)。以下更详细地描述了以上提及的渗透增强剂的类别中的每一个。
表面活性剂：在本发明的上下文中，表面活性剂(或“表面活性试剂”)为化学实体，当其溶解在水溶液中时，它能降低该溶液的表面张力或者水溶液和另一种液体之间的界面张力，结果是iRNA通过粘膜的吸收得到增强。除了胆汁盐和脂肪酸之外，这些渗透增强剂还包括例如月桂醇硫酸钠、聚氧乙烯基-9-月桂基醚和聚氧乙烯基-20-鲸蜡基醚(参见，例如，马姆斯顿(Malmsten，M.)药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants and polymersin drug delivery)，英富曼卫生保健(Informa Health Care)，纽约，纽约州，2002；李(Lee)等人.，治疗性药物载体***锐评(Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems)，1991，p.92)；以及全氟化学乳剂如FC-43(高松(Takahashi)等人，药物药理学杂志(J.Pharm.Pharmacol.)，1988，40，252)。
脂肪酸：充当渗透增强剂的各种脂肪酸及其衍生物包括例如油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油精(1-单油酰-外消旋-甘油)、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、其C1-20烷基酯(例如，甲基酯、异丙基酯和叔丁基酯)及其单和二甘油酯(即，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)。(参见例如，图伊杜(Touitou)，E.等人，药物递送中的增强(Enhancement in Drug Delivery)，CRC出版公司，马萨诸塞州丹佛斯(Danvers，MA)，2006；李等人，治疗性药物载体***锐评，1991，第92页；村西(Muranishi)，治疗性药物载体***锐评，1990，7，1-33；艾尔哈里里(E1Hariri)等人，药学与药理学杂志(J.Pharm.Pharmacol.)，1992，44，651-654)。
胆汁盐：胆汁的生理学作用包括促进脂质和脂肪维生素的分散和吸收(参见例如，马姆斯顿(Malmsten，M.)，药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants and polymersin drug delivery)，英富曼卫生保健(Informa Health Care)，纽约，纽约州，2002；布鲁顿(Brunton)，第38章，古德曼&吉尔曼，治疗的药理学基础第38章中(Goodman&Gilman′s ThePharmacological Basis of Therapeutics)，第9版，哈德曼(Hardman)等人编著，麦格劳希尔(McGraw-Hill)，纽约，1996，第934-935页)。不同天然的胆汁盐和它们的合成衍生物用作渗透增强剂。因此术语“胆汁盐”包括胆汁的任何天然存在的组分以及任何它们的合成衍生物。适合的胆汁盐包括，例如，胆酸(或其药学上可接受的钠盐、胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡糖胆酸(葡糖胆酸钠)、甘氨胆酸(甘氨胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺-24，25-二氢褐霉酸钠(STDHF)、糖二氢褐霉酸钠以及聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(参见例如，马尔姆斯滕M.药物递送中的表面活性剂和聚合物，健康传播杂志，纽约州纽约，2002；李等人，治疗性药物载体***锐评，1991，第92页；斯温雅德(Swinyard)，第39章，雷明顿氏药物科学，第18版，真纳罗(Gennaro)编辑，麦克出版公司，伊斯顿，Pa.，1990，第782-783页；村西，治疗性药物载体***锐评，1990，7，1-33；山本(Yamamoto)等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharm.Exp.Ther.)，1992，263，25；山下(Yamashita)等人，药物科学杂志，1990，79，579-583)。
螯合剂：与本发明有关使用的螯合剂可以定义为通过金属离子与其形成复合物将金属离子从溶液中除去的化合物，结果是通过粘膜的iRNA的吸收得到加强。关于它们在本发明中作为渗透增强剂的应用，因为多数特征化的DNA核酸酶需要二价金属离子用于催化并且因此可以被螯合剂抑制，螯合剂还具有充当DNase抑制剂的附加优势(加热特(Jarrett)，层析学杂志(J.Chromatogr.)，1993，618，315-339)。合适的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(酯)(如水杨酸钠、5-甲氧水杨酸酯和高香草酸酯)、胶原质的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(李(Lee)等人.，治疗性药物载体***锐评(Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems)，1991，p.92；Muranishi(村西)，治疗性药物载体***锐评(CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1990，7，1-33；布尔(Buur)等人，缓释杂志(J.Control Rel.)，1990，14，43-51)。
非螯合的非表面活性剂：如本文所用，非螯合性非表面活性剂渗透增强化合物可以定义为作为螯合剂或作为表面活性剂展示不明显活性但是反而增强iRNA经消化道粘膜吸收的化合物(参见例如，村西(Muranishi)，治疗性药物载体***锐评(Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems)，1990，7，1-33)。这类别的渗透增强剂包括例如不饱和环状脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(李(Lee)等人.，治疗性药物载体***锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，第92页)；以非甾体抗炎剂如双氯芬酸钠、引哚美辛和苯丁唑啉(山下(Yamashit)等人药物药理学(，J.Pharm.Pharmacol.)，1987，39，621-626)。
也可以添加在细胞水平增强摄取iRNA的物质至本发明的药物组合物和其他组合物。例如阳离子脂质，如脂质体(淳一(Junichi)等人，美国专利号5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子如聚赖氨酸(洛洛(Lollo)等人，PCT申请WO 97/30731)也已知增强dsRNA的细胞摄取。市售转染试剂的例子包括例如LipofectamineTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州(Invitrogen；Carlsbad，CA))、Lipofectamine 2000TM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、293fectinTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、CellfectinTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、DMRIE-CTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、FreeStyleTM MAX(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、LipofectamineTM 2000CD(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、LipofectamineTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、RNAiMAX(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、OligofectamineTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、OptifectTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、X-tremeGENE Q2转染试剂(罗氏公司(Roche)；格兰扎克尔街，瑞士(Grenzacherstrasse，Switzerland))、DOTAP脂质体转染试剂(格兰扎克尔街，瑞士)、DOSPER脂质体转染试剂(格兰扎克尔街，瑞士)或Fugene(格兰扎克尔街，瑞士)、试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州(Promega；Madison，WI))、TransFastTM转染试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州)、TfxTM-20试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州)、TfxTM-50试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州)、DreamFectTM(OZ生命科学公司；马赛市，法国(OZ Biosciences；Marseille，France))、EcoTransfect(OZ生命科学公司；马赛市，法国)、TransPassa D1转染试剂(新英格兰生物实验室；伊普斯威奇市，马萨诸塞州，美国(New England Biolabs；IpsWich，MA，USA))、LyoVecTM/LipoGenTM(英杰公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国(Invivogen；San Diego，CA，USA))、PerFectin转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国(Genlantis；San Diego，CA，USA))、NeuroPORTER转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、GenePORTER转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、GenePORTER 2转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、Cytofectin转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、BaculoPORTER转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、TroganPORTERTM转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、RiboFect(星谱生计公司；陶顿市，马萨诸塞州，美国(Bioline；Taunton，MA，USA))、PlasFect(星谱生计公司；陶顿市，马萨诸塞州，美国)、UniFECTOR(晨桥国际公司；山景城，加利福尼亚州，美国(B-Bridge International，Mountain View，CA，USA))、SureFECTOR(晨桥国际公司；山景城，加利福尼亚州，美国)或HiFectTM(晨桥国际公司；山景城，加利福尼亚州，美国)，连同其他。
其他物质可以用来增强所施用核酸渗透，包括二醇如乙二醇和丙二醇、吡咯如2-吡咯、氮酮和萜类如苧烯和薄荷酮。
载体
本发明的某些组合物还将载体化合物结合在配制品中。如在此所使用，“载体化合物”或“载体”可以指核酸或其类似物，它是惰性的(即本身不具有生物活性)，但却在体内过程中被认为是核酸，例如通过降解生物活性的核酸或促进其从循环中的除去而减少具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载体化合物的共给予(典型地后一种物质过量)可以引起肝脏、肾脏或其他外循环储库中回收的核酸量大幅度减少，假定归因于该载体化合物与该核酸之间对共同受体的竞争。例如与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酰胺基-4′异硫氰酸茋-2，2′-二磺酸共施用时，肝组织中部分硫代磷酸酯化的dsRNA的回收可以减少(宫尾(Miyao)等人，DsRNA研究与研发(DsRNA Res.Dev.)，1995，5，115-121；高仓(Takakura)等人，DsRNA&核酸药物研发(DsRNA&Nucl.Acid Drug Dev.)，1996，6，177-183)。
赋形剂
与载体化合物相反，“药物载体”或“赋形剂”是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或用于将一种或多种核酸递送至动物的任何其他药理学上惰性的媒介物。该赋形剂可以是液体或固体，当与核酸和特定药物组合物的其他组分组合时，参考意欲的给予方式，对赋形剂进行选择以提供希望的容积、稠度等。典型的药物载体包括但不限于结合剂(例如，糯性玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶态二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、淀粉乙醇酸钠等)；以及润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。
适合于非肠胃外给予的、不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用来配制本发明的组合物。适当的药学上可接受载体包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于局部给予核酸的配制品可以包括在普通溶剂如醇中的无菌或非无菌的水溶液、非水溶液，或在液体或固体油基质中的核酸溶液。这些溶液还可以包含缓冲液、稀释液和其他合适的添加剂。可以使用适合于非肠胃外给予的、且不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂。
适当的药学上可接受赋形剂包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
其他组分
本发明的组合物另外可以包含其他本领域熟知用量的在药物组合物中常用的辅助组分。因此，例如这些组合物可以包含另外的、可相容的药学上有活性的物质如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以包含对本发明的组合物的各种剂型的物理配制有用的其他物质，如染料、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当加入此类物质时，它们不应当过度干扰本发明的组合物的成份的生物活性。可以将这些配制品进行灭菌并且如果希望的话与助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、盐混合，用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色物质、芳香物质和/或芬芳物质等进行混合，这些助剂不与该配制品中的一种或多种核酸发生有害的相互作用。
水性悬浮液可以包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。
在一些实施例中，本发明中表征的药物组合物包含(a)一种或多种iRNA化合物和(b)通过非RNAi机制发挥作用的一种或多种生物试剂。此类生物药剂的实例包括干扰LECT2与至少一个LECT2结合配偶体的相互作用的试剂。
此类化合物的毒性与治疗功效可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如以确定LD50(50％群体的致死剂量)以及ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数，并且它可以被表示为比率LD50/ED50。典型地是那些表现出高的治疗指数的化合物。
从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制人类中使用的剂量范围时使用。在本发明中表征的组合物的剂量总体上处在一个循环浓度范围内，该范围包括具有很小或没有毒性的ED50。该剂量可以取决于所采用的剂型以及利用的给予途径而在该范围内变化。对于任何在本发明表征的方法中使用的化合物，该治疗上有效的剂量可以从细胞培养测定来进行初始估计。在动物模型中可以将一个剂量配制为达到该化合物的循环血浆浓度范围，或者当适当时，一个靶标序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，达到该多肽的一个降低的浓度)，该范围包括如在细胞培养中确定的IC50(即，测试化合物实现症状的半最大抑制时的浓度)。这类信息可以用来更精确地确定用于人类中的剂量。可以测量血浆中的水平，例如，通过高效液相层析。
除了给予它们之外，如在此所讨论的，还可以将在本发明中表征的iRNA与在治疗与LECT2表达相关的疾病或失调中有效的其他已知药剂联合给予。在任何情况下，基于使用本领域已知或本文所述的标准功效量值所观察到的结果，施用医师可以调整施用iRNA的量和时间。
治疗与LECT2基因表达相关的障碍的方法
本披露涉及靶向LECT2的iRNA的用途，用于抑制LECT2表达和/或治疗与LECT2表达相关的疾病、失调、或病理过程。
在一方面，提供了治疗与LECT2的表达相关的障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予在此披露的iRNA(例如，dsRNA)。在一些实施例中，该iRNA抑制(减少)LECT2表达。在一些实施例中，该iRNA增加了LECT2表达。
如在此使用的，“与LECT2表达相关的障碍”、“与LECT2表达相关的疾病”、“与LECT2表达相关的病理过程”或诸如此类包括LECT2表达改变的病症、障碍、或疾病(例如，相对于正常水平的减少或增加)。在一些实施例中，减少了LECT2表达。在一些实施例中，增加了LECT2表达。在实施例中，LECT2表达的减少或增加在受试者的血液中(例如，在血浆中)是可检测的。在实施例中，LECT2表达的减少或增加在来自受试者的组织样品中(例如，在肾样品或肝脏样品中)是可检测的。可以相对于在形成该障碍之前的相同的个体或没患有该障碍的其他个体中观察到的有关水平来评估该减少或增加。该减少或增加可以限于具体的器官、组织、或身体的区域(例如，肾或肝脏)。
如在此使用的，有待于根据在此所述的方法进行治疗的“受试者”包括人类或非人动物，例如，哺乳动物。该哺乳动物可以是，例如，啮齿类动物(例如，大鼠或小鼠)或灵长类(例如，猴)。在一些实施例中，受试者是人。
“对其有需要的受试者”包括患有、疑似患有、有风险形成与LECT2表达相关的障碍的受试者。在一些实施例中，该受试者患有、或疑似患有与LECT2表达相关的障碍。在一些实施例中，该受试者有风险形成与LECT2表达相关的障碍。
在一些实施例中，该受试者是一种动物，充当用于与LECT2表达相关的障碍(例如，LECT2淀粉样变性)的模型。
LECT2淀粉样变性
在实施例中，与LECT2表达相关的障碍是一种淀粉样变性，例如，LECT2淀粉样变性。LECT2淀粉样变性已经描述与若干临床研究中。参见，例如，班森(Benson)，M.D.等人，(2008)国际肾脏期刊(Kidney International)，74：218-222；墨菲(Murphy)，C.L.等人，(2010)美国肾脏病杂志(Am J Kidney Dis)，56(6)：1100-1107；拉森(Larsen)，C.P.等人，(2010)国际肾脏期刊(Kidney Int.)，77(9)：816-819；奥兰达(Holanda)，D.G.等人，(20011)肾脏病透析移植(Nephrol.Dial.Transplant.)，26(1)：373-376；和塞西(Sethi)，S.等人，(2012)国际肾脏期刊(Kidney International)82，226-234(以下塞西等人)。
LECT2淀粉样变性的临床和病理特征模拟淀粉样蛋白轻链(AL)淀粉样变性中的那些。这些症状包括，例如，肾脏疾病和肾衰竭的症状，例如，液体潴留，肿胀、和气促。淀粉样变性可以影响心脏、周围神经***、胃肠道、血液、肺和皮肤。心脏并发症包括，例如，心力衰竭和不规则心脏搏动。其他症状包括，例如，中风、肠胃疾病、肝脏肿大、脾功能减弱、肾上腺及其他内分泌腺的功能减弱、皮肤颜色改变或增生、肺部问题、出血和瘀斑问题、疲劳及体重减轻。在实施例中，在此描述的方法与在此描述的一种或多种症状的改善有关。
用于诊断淀粉样变性的方法，例如，LECT2淀粉样变性，描述于，例如，莱昂(Leung)，N.等人，(2010)血液(Blood)，2012年9月4日在线公布；DOI 10.1182/血液-2012-03-413682；席勒(Shiller)，S.M.等人(2011)。用于诊断遗传性淀粉样变性的实验室方法，淀粉样变性-机制和疗法展望(Amyloidosis-Mechanisms and Prospects for Therapy)，博士斯维特拉娜萨兰塞瓦(Svetlana Sarantseva)(编辑)，ISBN：978-953-307-253-1；塞西等人，(参见上文)以及在美国专利申请公开号20100323381。
基于由塞西等人提供的结果，LECT2淀粉样变性解释了肾淀粉样变性病例的显著比例。参见塞西等人的表1，其显示出由肾活检和/或肾切除标本的激光显微切割法和质谱分析所研究的肾淀粉样变性的127个病例中的26个被确定为是LECT2淀粉样蛋白类型。塞西等人进一步报道了，载脂蛋白E蛋白和血清淀粉样P成分(SAP)也存在于LECT2淀粉样变性的所有病例中。
在实施例中，该淀粉样变性(例如，LECT2淀粉样变性)涉及全身淀粉样蛋白沉淀。在实施例中，该淀粉样变性(例如，LECT2淀粉样变性)完全或主要局限于特定组织或器官(例如，局限于肾脏或肝脏)。
在实施例中，该淀粉样变性(例如，LECT2淀粉样变性)是遗传性的。
在实施例中，使用来自受试者的样品(例如，活检样品)的分析诊断LECT2淀粉样变性。在实施例中，该活检样品是肾活检。在实施例中，样品是肾切除术样品。在实施例中，该样品是来自肝活检或来自其他切除的肝组织。在实施例中，使用选自免疫组织化学、LECT2免疫测定、电镜、激光显微切割法、和质谱法中的一种或多种的方法分析样品。在实施例中，使用激光显微切割法和质谱法诊断该LECT2淀粉样变性。
在实施例中，该淀粉样变性(例如，LECT2淀粉样变性)影响肾脏，例如，涉及肾中的淀粉样蛋白沉淀。在实施例中，由于淀粉样变性导致肾功能受损。在实施例中，该受试者患有液体潴留、肿胀、和气促中的一种或多种。在实施例中，该受试者患有肾病综合征。在实施例中，该受试者患有蛋白尿。在实施例中，该受试者患有肾衰竭。
在实施例中，该淀粉样变性(例如，LECT2淀粉样变性)影响肝脏，例如，涉及肝脏中的淀粉样蛋白沉淀。在实施例中，由于淀粉样变性导致肝功能受损。在实施例中，该受试者患有肝炎，例如，慢性肝炎。在实施例中，该肝炎是病毒性肝炎。
已经发现LECT2淀粉样变性在墨西哥裔美国人中特别流行，并且还与LECT2基因的G等位基因的纯合性相关，该G等位基因在成熟蛋白中的位置40(在未加工的蛋白中的氨基酸58)处编码缬氨酸。参见，例如，班森(Benson)，M.D.等人，(2008)国际肾脏期刊(KidneyInternational)，74：218-222；墨菲(Murphy)，C.L.等人，(2010)美国肾脏病杂志(Am JKidney Dis)，56(6)：1100-1107。
在一些实施例中，该受试者是墨西哥后裔。在一些实施例中，该受试者是墨西哥裔美国人。
在实施例中，该受试者携带LECT2基因的G等位基因，该G等位基因编码成熟蛋白中位置40处(在未加工蛋白中的氨基酸58)的缬氨酸。在实施例中，该受试者针对G等位基因(G/G基因型)是纯合的。在实施例中，在受试者中表达的LECT2蛋白在成熟蛋白中的位置40处(或在未加工蛋白中的氨基酸58处)具有缬氨酸。
在一些实施例中，该方法减少了LECT2表达。在实施例中，相对于治疗前相同个体中的水平，评估LECT2表达的减少。在一些实施例中，通过将在治疗的受试者(或受试者组)中LECT2表达的水平与对照组(或受试者组，例如，未治疗的受试者(或受试者组)或用对照治疗(例如，非靶向LECT2的iRNA(例如，dsRNA))治疗的受试者(或受试者组))中的水平比较，该方法显示出减少了LECT2表达。
在实施例中，该方法减少了淀粉样蛋白沉淀，例如，包括LECT2蛋白或其部分的淀粉样蛋白的沉淀。在实施例中，该蛋白是野生型蛋白。在实施例中，该蛋白是在位置40(成熟的、分泌性蛋白的位置40，或未加工的蛋白的氨基酸58处，如在此描述的)处包括缬氨酸的人类LECT2蛋白，或其部分。在实施例中，该方法降低了淀粉样蛋白沉淀物的大小、数量、和/或程度。
在实施例中，该方法减少了与淀粉样蛋白沉淀有关的一种或多种症状。
在一些实施例中，该dsRNA以一种将dsRNA靶向具体器官或组织的形式给予，以抑制在该器官和组织中的淀粉样蛋白沉淀。
在一些实施例中，将该dsRNA靶向肝脏。在一些实施例中，将该dsRNA共轭至配体，例如GalNAc配体(例如，如在此描述的GalNAc配体)，该配体将dsRNA配体靶向肝脏(例如，靶向肝实质细胞)。
在此还提供了减少淀粉样蛋白沉淀的方法，该方法包括向对其有需要的受试者(例如，患有、疑似患有、或有风险发展为LECT2淀粉样变性的受试者)给予如在此披露的dsRNA。在实施例中，该方法降低(例如，防止或缩减)了淀粉样蛋白沉淀的大小、数量、和/或程度。可以使用本领域中已知的方法(例如，免疫测定、免疫组织化学、质谱分析)评估淀粉样蛋白沉淀物的大小、数量、和/或程度。淀粉样蛋白沉淀的减少可涉及淀粉样蛋白沉淀(例如，淀粉样蛋白沉淀物的大小、数量、和/或程度)降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。
在此提供的方法中，以治疗有效量给予iRNA(例如，dsRNA)和其组合物。例如，通过与适当的对照相比较，可以确定LECT2 siRNA给予的治疗效果。例如，可以在，例如，患有淀粉样变性(例如，LECT2淀粉样变性)的患者的组中，通过将任何适当的参数(例如，评估淀粉样蛋白沉淀的大小、数量、或程度的参数)与在适当的对照组中相同的参数进行比较，确定淀粉样蛋白沉淀的抑制。对照组(例如，在交叉设计中一组类似个体或相同组的个体)可以包括，例如，未治疗的群体，已经用常规治疗治疗的群体，已经用安慰剂或非靶向iRNA治疗的群体，等等。
类风湿性关节炎
类风湿性关节炎也是与LECT2表达相关的障碍。具体而言，在日本人群中，发现拥有LECT2基因的一个A等位基因(在成熟蛋白中位置40(或在未加工蛋白中氨基酸58)处编码异亮氨酸)会增加形成类风湿性关节炎的整体风险。拥有两个A等位基因与疾病严重性密切有关。参见龟冈(Kameoka)，Y.等人，(2000)美国风湿病协会杂志(Arth Rheum)，43(6)：1419-20。
在此提供的方法的一个实施例中，涉及LECT2表达的障碍是类风湿性关节炎。在一个实施例中，该dsRNA抑制在患有类风湿性关节炎的受试者中的LECT2表达。在一些这种实施例中，该dsRNA抑制在滑膜组织和/或在滑液-来源细胞(例如，单核细胞和成纤维细胞)中的LECT2表达。在一些实施例中，该dsRNA靶向mRNA，该mRNA在成熟蛋白中的位置40(在未加工的蛋白中的氨基酸58)处编码异亮氨酸。
肝损伤
LECT2表达可在急性肝损伤的过程中增加。
在此提供的方法的一个实施例中，涉及LECT2表达的障碍是急性肝损伤。在实施例中，该iRNA(例如，dsRNA)调节(例如，增加或减少)LECT2表达。在实施例中，该iRNA调节肝中LECT2表达。在实施例中，该iRNA减少肝中LECT2表达。在实施例中，该iRNA增加肝中LECT2表达。
联合疗法
在实施例中，将在此披露的iRNA(例如，dsRNA)结合第二疗法(例如，一种或多种另外的疗法)给予，该第二疗法已知有效治疗与LECT2表达相关的障碍(例如，LECT2淀粉样变性)或这种障碍的症状。iRNA可以在第二疗法之前、之后或同时给予。在实施例中，在第二疗法之前给予该iRNA。在实施例中，在第二疗法之后给予该iRNA。在实施例中，与第二疗法同时给予该iRNA。
该第二疗法可以是另外的治疗剂。iRNA以及另外的治疗剂可以在相同的组合物中组合地给予，或该另外的治疗剂可以作为单独的组合物的一部分给予。
在一些实施例中，该第二疗法是非iRNA治疗剂，该非iRNA治疗剂有效治疗障碍或障碍的症状。
在一些实施例中，待通过在此披露的组合物或方法治疗的障碍是LECT2淀粉样变性，该LECT2淀粉样变性影响肾功能，例如，通过肾中的淀粉样蛋白沉淀。在一些这种实施例中，将该iRNA与支持肾功能(例如，透析、利尿剂、血管紧张肽转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻断剂(ARB)、或透析)的疗法结合给予。
在一些实施例中，待通过在此披露的组合物或方法治疗的障碍是LECT2淀粉样变性，该LECT2淀粉样变性涉及肝中淀粉样蛋白沉淀物。在一些这种实施例中，将该iRNA与支持肝功能的疗法结合地给予。
在一些这种实施例中，待通过在此披露的组合物或方法治疗的障碍是LECT2淀粉样变性，并且将该iRNA与去除受淀粉样变性影响的所有或部分器官(例如，切除受淀粉样变性影响的所有或部分肾脏或肝脏组织)结合地给予。任选地与去除的所有或部分器官的替换相结合(例如，与肾脏或肝脏器官移植结合)地进行。
给药剂量、途径、和时间
可以给予受试者(例如，人类受试者，例如，患者)治疗量的iRNA。该治疗量可以是，例如，0.05-50mg/kg。例如，该治疗量可以是0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、或2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50mg/kgdsRNA。
在一些实施例中，配制该iRNA以便递送至靶器官，例如，至肝脏。
在一些实施例中，iRNA被配制为一种脂质配制品，例如，如在此所述的LNP配制品。在一些此类实施例中，该治疗量是0.05-5mg/kg，例如，0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、或5.0mg/kg dsRNA。在一些实施例中，静脉内给予脂质配制品，例如，LNP配制品。在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)被配制为LNP配制品并且是以0.1至0.5mg/kg的剂量给予(例如，静脉内给予)。
在一些实施例中，通过经一段时间的静脉内输注来给予iRNA，例如，经5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、或25分钟的时间。
在一些实施例中，iRNA处于如在此所述的GaINAc共轭物的形式。在一些此类实施例中，治疗量是0.5-50mg，例如，0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、或50mg/kg dsRNA。在一些实施例中，GalNAc共轭物是皮下给予的。在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)是处于GalNAc共轭物的形式并且是以1至10mg/kg的剂量给予(例如，静脉内给予)。
在一些实施例中，重复进行该给予，例如，定期地，像每天、两周(即，每两周)一次持续一个月、两个月、三个月、四个月或更久。在初始治疗方案后，可以基于更低频率给予治疗。例如，在双周给予持续三个月后，给予可以按每个月重复一次，持续六个月或一年或更长。
在一些实施例中，iRNA剂是以两个或更多个剂量给予的。在一些实施例中，后续剂量的数目或量取决于所希望的作用(例如，淀粉样蛋白沉淀的抑制)的实现或治疗或预防作用(例如，减少或预防与该障碍有关的一种或多种症状)的实现。
在一些实施例中，iRNA剂是根据一个时间表给予的。例如，可以每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、或每周五次给予该iRNA剂。在一些实施例中，该方案涉及定期间隔的给药，例如，每小时、每四小时、每六小时、每八小时、每十二小时、每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每周、每两周、或每月一次。在实施例中，该iRNA剂以实现所希望作用所需要的频率给予。
在实施例中，该时间表涉及密集的给予，随后是一个较长的时期，在该时期过程中，不给予该试剂。例如，该时间表可以涉及在相对短时期内给予的初始剂量设置(例如，约每6小时、约每12小时、约每24小时、约每48小时、或约每72小时)，随后是一个较长的时期，(例如，约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、或约8周)，在该时期过程中，不给予iRNA剂。在一个实施例中，iRNA剂初始地按小时给予，并且随后以一个较长的时间间隔给予(例如，每天、每周、每两周、或每月一次)。在另一个实施例中，iRNA剂初始地按天给予，并且随后以一个较长的时间间隔给予(例如，每周、每两周、或每月一次)。在某些实施例中，更长的时间间隔随时间增加或基于所希望的作用的实现来确定。
在给予全剂量iRNA之前，可以对患者给予一个较小剂量，例如5％输注剂量，并监控不良作用，例如，过敏反应、或升高的脂质水平或血压。在另一个实例中，可以针对不希望的效果对患者进行监控。
用于调节LECT2基因表达的方法
在又另一个方面，本发明提供了用于调节(例如，抑制或激活)LECT2基因在例如细胞中或受试者中的表达的方法。在一些实施例中，细胞是离体、体外、或体内的。在一些实施例中，该细胞是处于肝中(例如，肝实质细胞)。在一些实施例中，细胞是在受试者(例如，哺乳动物，例如像人类)中的。在一些实施例中，受试者(例如，人类)处于与LECT2表达相关的障碍的风险中，或被诊断为患有该障碍，如上所述。
在一个实施例中，该方法包括以有效降低细胞中LECT2基因的表达的量将该细胞与如在此所述的iRNA相接触。如在此使用的，“接触”包括直接接触细胞，连同间接接触细胞。例如，当向受试者给予(例如，静脉内或皮下地)包括iRNA的组合物时，该受试者体内的细胞可以是被接触的。
基于LECT2 mRNA的表达水平、LECT2蛋白、或与LECT2基因表达水平功能性相联系的另一个参数的水平，可以对LECT2基因的表达进行评估。在一些实施例中，LECT2的表达被抑制至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。在一些实施例中，iRNA具有以下范围内的IC50：0.001-0.01nM、0.001-0.10 nM、0.001-1.0nM、0.001-10nM、0.01-0.05nM、0.01-0.50nM、0.02-0.60nM、0.01-1.0nM、0.01-1.5nM、0.01-10nM。IC50值可以相对于适当的对照值被归一化，例如，非靶向性iRNA的IC50。
在一些实施例中，该方法包括向该细胞中引入在此描述的iRNA并且维持该细胞一段时间，该时间足以获得LECT2基因的mRNA转录物的降解，由此抑制该细胞中的LECT2基因的表达。
在一个实施例中，该方法包括向哺乳动物给予在此描述的一种组合物，例如，包括靶向LECT2的iRNA的组合物，以使得靶标LECT2基因的表达被降低，如持续一个延长的时间，例如，至少两天、三天、四天或更多天，例如，一周、两周、三周、或四周或更久。在一些实施例中，在第一次给予1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、或24小时内，LECT2表达下降是可检出的。
在另一个实施例中，该方法包括向哺乳动物给予如在此所述的组合物以使得靶标LECT2基因的表达与未治疗的动物相比，增加例如，至少10％。在一些实施例中，LECT2的激活发生超过一个延长的持续时间，例如，至少两天、三天、四天或更多天，例如，一周、两周、三周、或四周或更久。不希望受理论约束，通过稳定LECT2 mRNA转录物，与基因组中启动子相互作用和/或抑制LECT2表达抑制剂，iRNA可以激活LECT2表达。
对本发明中表征的方法和组合物有用的iRNA特异性靶向LECT2基因的RNA(初级或经加工的)。用于使用iRNA抑制LECT2基因的表达的组合物和方法可以如在本文中其他地方描述的进行制备和执行。
在一个实施例中，该方法包括给予包含iRNA的组合物，其中该iRNA包括核苷酸序列，该核苷酸序列与待治疗受试者(例如，哺乳动物，例如，人类)LECT2基因的RNA转录物的至少一部分互补。该组合物可以通过本领域内已知的任何手段进行给予，这些手段包括但不限于经口、腹膜内、或肠胃外途径(包括颅内(例如，心室内、实质内、鞘内)、静脉内、肌内、皮下、经皮、气道(气溶剂)、经鼻、直肠以及局部(包括口腔与舌下)给予)。
在某些实施例中，通过静脉内输注或注射给予这些组合物。在一些此类实施例中，该组合物包括一种脂质配制的siRNA(例如，LNP配制品，像LNP11制剂)，以用于静脉内输注。
在其他实施例中，皮下给予该组合物。在一些此类实施例中，该组合物包括共轭至GalNAc配体的iRNA。在一些此类实施例中，该配体将iRNA靶向肝脏(例如，靶向肝实质细胞)。
除非另外限定，否则在此使用的所有技术术语和科学术语具有如本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。尽管与在此描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本发明中体现的iRNA和方法，但以下描述了适合的方法和材料。在此提交的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文结合。在矛盾的情况下，本发明说明书，包括定义，将占据主导。此外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不意在是限制性的。
实例
实例1.LECT2 siRNA
使用标准命名法表示在此提供的核酸序列。参见表1的缩写。
表1：核酸序列表示中使用的核苷酸单体的缩写。应当理解在寡核苷酸中存在时这些单体是由5′-3′-磷酸二酯键相互连接。
1L96的化学结构如下：
实验方法
生物信息学
转录物
进行siRNA设计以鉴定靶向人类、猕猴(食蟹猴；此后称为“猕猴(cyno)”)、小鼠和大鼠LECT2转录物的siRNA。设计使用了来自NCBIRefSeq收集的如下转录物，这些转录物注解于NCBI基因数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)：人类，NM_002302.2；小鼠，NM_010702.1；大鼠，NM_001108405.1。针对猕猴，设计使用了从肝脏衍生的cDNA文库所测序的转录物。由于高等灵长类动物/啮齿动物序列趋异，以若干个单独的批次设计siRNA双链体，包括但不限于包含匹配以下各项的双链体的批次：仅人和猕猴转录物；仅人、猕猴和小鼠转录物；以及仅人、猕猴、小鼠和大鼠转录物。设计与列出的人转录物和在每次设计批次(以上)中考虑的其他物种转录物在指定区共有100％一致性的所有siRNA双链体。在一些情况中，当反义链：靶mRNA互补碱基对是GC或CG对时，允许在第一反义(最后有义)位置处的双链体与mRNA靶标之间的错配(参见表3，具有标记G21U、G21A、C21A的寡核苷酸)。在这些情况下，双链体被设计为在第一反义：最后有义对处具有UA或AU对。因此这些双链体维持互补性但是相对于靶标是错配的(U：C，U：G，A：C，或A：G)。
siRNA设计、特异性和功效预测
从每一序列预测所有可能的19mer的预测特异性。然后选择缺乏长于7个核苷酸的重复的候选19mer。这些353种候选人类/猕猴、24种人类/猕猴/小鼠、以及10种人类/猕猴/小鼠/大鼠siRNA用于使用在python脚本‘BruteForce.py’中实现的穷尽性“brute-force”算法，针对适当转录组(定义为在人类、猕猴、小鼠或大鼠NCBI Refseq组内的NM_和XM_记录的组)的综合搜索中。该脚本接下来解析该转录物-寡核苷酸比对，以产生基于该siRNA和任何潜在的“脱靶”转录物之间的错配的位置和数目的分数。对该脱靶分数进行加权，以强调siRNA的“种子”区的差异，在从该分子的5′-端起的位置2-9处。通过对单独错配分数求和给予来自brute-force搜索的每个寡转录物对一个错配分数；位置2-9中的错配计数为2.8，切割位点位置10-11中的错配计数为1.2，并且区12-19中的错配计数为1.0。通过对衍生自每个寡聚物的3个相异种子衍生的六聚体的七聚体和八聚体的频率做比较来进行另外的脱靶预测。使用从相对于5’起点开始的位置2-7的六聚物来产生2个七聚物和1个八聚物。通过添加3’A到六聚体产生“七聚体1”；通过添加5’A到六聚体产生七聚体2；通过添加A到该六聚体的5’和3’末端产生八聚体。预先计算了人、猕猴、小鼠或大鼠3’UTRome(定义为来自NCBI的Refseq数据库的转录组的子序列，其中编码区的末端‘CDS’被清楚定义)中的八聚体和七聚体的频率。使用来自八聚体频率范围的中值，将八聚体的频率归一化为七聚体的频率。然后通过计算((3×归一化的八聚体计数)+(2×七聚体2计数)+(1×七聚体1计数))之和，计算“mirSeedScore”。
两种siRNA链被指定为根据计算分数的特异性分类：得分高于3为高特异性的、等于3为特异性的，并且在2.2与2.8之间为中等特异性的。通过反义链的特异性对这些双链体进行分类，并且然后选择中等(或更高)特异性的双链体，其反义寡核苷酸拥有具有高预测功效的双链体的特征，包括在种子区的最大UA含量以及低的整体GC含量。选择23个人类/猕猴/小鼠有义：反义寡核苷酸对，这些寡核苷酸对包括6个第一反义位置交换为UA(见上文)。类似地，选择24个人类/猕猴，和5个人类/猕猴/小鼠/大鼠寡核苷酸对。然后将选定的反义寡核苷酸长度延长至23个核苷酸，并且有义寡核苷酸长度延长至21个核苷酸。然后选择仍然与至少人类和猕猴转录物完全匹配的48个寡核苷酸对(不包括UA交换序列的第一位置)用于合成并退火成双链体。(表3)
我们还选择了至少匹配人类LECT2转录物的一组198对19聚体的寡核苷酸。这些被选择以与所有其他注解的人类转录物具有至少一个错配，并且具有如上良好预期效果。(表2)
表2：人类LECT2 siRNA单链和双链体序列
表3：人类LECT2 siRNA单链和双链体序列
1H：人类；C：猕猴；M：小鼠；R：大鼠
实例2.LECT2 siRNA的体外筛选
实验方法
细胞培养和转染：
通过将14.8μl的Opti-MEM加每孔0.2μl的Lipofectamine RNAiMax(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，产品目录号13778-150)与每孔5μl的siRNA双链体添加至96孔板中转染原代猕猴肝实质细胞(PCH)(Celsis#M003055，批次CBT)并且在室温孵育15分钟。然后将包含约2 x 104PCH细胞的801的体外GRO CP大鼠介质(体外技术公司)添加至该siRNA混合物中。在RNA纯化之前将细胞孵育24小时。单剂量实验以10nM和0.1nM双链体终浓度进行并且剂量应答实验以经8、6倍的稀释的从10nM至36fM双链体终浓度进行。
RNA分离：
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(英杰公司，部件号：610-12)分离总RNA。收获细胞并且在150l裂解/结合缓冲液中进行裂解，然后使用Eppendorf Thermomixer在850rpm混合5分钟(混合速度在整个过程中相同)。将十微升磁珠与80μl裂解/结合缓冲液混合物添加至圆底板中并且混合1分钟。使用磁性表座捕获磁珠并且将该上清液移除而不扰动这些珠子。在移出上清液后，将裂解的细胞添加至剩余的磁珠并且混合5分钟。在除去上清液后，将磁珠用150μl洗涤缓冲液A(Wash Buffer A)洗涤2次并且混合1分钟。珠子再次被捕获并且去除上清液。然后将珠子用150μl洗涤缓冲液B(Wash Buffer B)进行洗涤，捕获，并且除上清液。然后将珠子用150μl洗脱缓冲液(Elution Buffer)进行洗涤、捕获并且除上清液。允许珠子干燥持续2分钟。在干燥之后，添加50μl的洗脱缓冲液(Elution Buffer)并且在70℃混合5分钟。用磁体捕获珠子持续5分钟。去除40μl的上清液并且添加至另一96孔板中。
cDNA合成：
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(应用生物***(Applied Biosystems)，福斯特市(Foster City)，加利福尼亚州，目录号4368813)合成cDNA。将母混合物(每一反应：2μl10×缓冲液、0.8μl 25X dNTP、2μl随机引物、1μl逆转录酶、1μl RNase抑制剂以及3.2μlH2O)添加至10μl总RNA中。使用Bio-Rad C-1000或S-1000热循环仪(Hercules公司，加利福尼亚州)经以下步骤产生cDNA：25℃ 10min，37℃ 120min，85℃ 5s，4℃保持。
实时PCR：
将2μl的cDNA添加至在384孔板(罗氏目录号04887301001)中的母混合物中，每孔母混合物包含0.5μl的按用户需要设计的猕猴GAPDH TaqMan探针(F-GCATCCTGGGCTACACTGA(SEQ ID NO：494)，R-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC(SEQ ID NO：495)，探针-CCAGGTGGTCTCCTCC(SEQ ID NO：496))、0.5μl人类Lect2(Hs01040204_m1-其与猕猴Lect2交叉反应)和5μlLightcycler 480探针母混合物(罗氏目录号04887301001)。实时PCR在LightCycler480实时PCR***(罗氏公司)上使用ΔΔCt(RQ)测定而进行。除非在总结表中另外指出，否则在两个独立转染中测试每种双链体，并且一式两份测定每个转染。
为了计算相对倍数变化，将实时数据使用ΔΔCt方法分析，并且相对于用10nMAD-1955转染的细胞或模拟转染的细胞进行的测定进行归一化。使用4参数拟合模型使用XLFit计算IC50，并且将IC50归一化为转染了AD-1955的细胞或原初细胞。
将修饰的和未修饰的LECT2 siRNA序列分别示于表5和6中。使用标准命名法(参见表1的缩写)表示在此提供的核酸序列。在一些情况中，当反义链：靶mRNA互补碱基对是GC或CG对时，允许在第一反义(最后有义)位置处的双链体与mRNA靶标之间的错配(参见表5和6，具有标记G21U、G21A、C21A的寡核苷酸)。在这些情况下，双链体被设计为在第一反义：最后有义对处具有UA或AU对。因此这些双链体维持互补性但是相对于靶标是错配的(U：C，U：G，A：C，或A：G)。
结果
原代猴肝实质细胞的单剂量筛选的结果示于表7中。以10nM和0.1nM的双链体终浓度进行单剂量实验，并且将数据表达为相对于AD-1955非靶向对照剩余的信使百分比。
表7.在原代猴肝实质细胞中LECT2 siRNA单剂量筛选
将在单剂量筛选中所测验的LECT2 siRNA双链体的子集进一步在原代猴肝实质细胞中的剂量应答筛选中进行测试。结果见表8。在从10nM至36fM双链体终浓度的剂量范围内进行剂量应答实验。数据作表达为IC50值。
表8.在原代猴肝实质细胞中LECT2 SiRNA剂量应答筛选
双链体ID IC50(nM)
AD-61272 0.0024
AD-61273 0.0006
AD-61266 0.003
AD-61267 0.0026
AD-61278 0.0124
AD-61284 0.0522
AD-61240 0.0084
AD-61251 0.0621
AD-61268 0.117
AD-61256 0.0163
AD-61244 0.0165
实例3.LECT2 siRNA基因步移
实验方法
生物信息学：
使用定制R和Python脚本设计靶向人类LECT2基因的一组93个重叠的siRNA(NCBIrefseqID NM_002302.2；NCBI Gene ID 3950“白细胞衍生的趋化因子2”)。LECT2 REFSEQmRNA具有1077个碱基长度。
体外筛选：
细胞培养和转染：
通过将14.8μl的Opti-MEM加每孔0.2μl的Lipofectamine RNAiMax(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，产品目录号13778-150)与每孔5μl的siRNA双链体添加至96孔板中转染原代猕猴肝实质细胞(PCH，Celsis#M003055，批次CBT)并且在室温孵育15分钟。然后将包含约2 x 104PCH细胞的无酚磺酞威廉斯氏介质E(美国生命技术公司号A1217601)添加至siRNA混合物中。在RNA纯化之前将细胞孵育24小时。以10nM进行单剂量实验。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(英杰公司，部件号：610-12)分离总RNA。收获细胞并且在150μl裂解/结合缓冲液中进行裂解，然后使用Eppendorf Thermomixer在850rpm混合5分钟(混合速度在整个过程中相同)。将十微升磁珠与80μl裂解/结合缓冲液混合物添加至圆底板中并且混合1分钟。使用磁性表座捕获磁珠并且将该上清液移除而不扰动这些珠子。在移出上清液后，将裂解的细胞添加至剩余的磁珠并且混合5分钟。在除去上清液后，将磁珠用150μl洗涤缓冲液A(Wash Buffer A)洗涤2次并且混合1分钟。珠子再次被捕获并且去除上清液。然后将珠子用150μl洗涤缓冲液B(Wash Buffer B)进行洗涤，捕获，并且除上清液。然后将珠子用150μl洗脱缓冲液(Elution Buffer)进行洗涤、捕获并且除上清液。允许珠子干燥持续2分钟。在干燥之后，添加50μl的洗脱缓冲液(Elution Buffer)并且在70℃混合5分钟。用磁体捕获珠子持续5分钟。去除40μl的上清液并且添加至另一96孔板中。
cDNA合成：
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(应用生物***(Applied Biosystems)，福斯特市(Foster City)，加利福尼亚州，目录号4368813)合成cDNA将母混合物(每一反应：2μl10×缓冲液、0.8μl 25X dNTP、2μl随机引物、1μl逆转录酶、1μl RNase抑制剂以及3.2μl H2O)添加至10μl总RNA中。使用Bio-Rad C-1000或S-1000热循环仪(Hercules公司，加利福尼亚州)经以下步骤产生cDNA：25℃ 10min，37℃ 120min，85℃ 5s，4℃保持。
实时PCR：
实时PCR：
将2μl的cDNA添加至在384孔板(罗氏目录号04887301001)中的母混合物，该母混合物每孔含0.5μl的按用户需要设计的猕猴GAPDH TaqMan探针(F-GCATCCTGGGCTACACTGA(SEQ ID NO：494)，R-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC(SEQ ID NO：495)，探针-CCAGGTGGTCTCCTCC(SEQ ID NO：496))、0.5μl人类Lect2(Hs01040204m1-其与猕猴Lect2交叉反应)和5μlLightcycler 480探针母混合物(罗氏目录号04887301001)。实时PCR在LightCycler480实时PCR***(罗氏公司)上使用ΔΔCt(RQ)测定而进行。除非在总结表中另外指出，否则在两个独立转染中测试每种双链体，并且一式两份测定每个转染。为了计算相对倍数变化，将实时数据使用ΔΔCt方法分析，并且相对于用10nM AD-1955转染的细胞或模拟转染的细胞进行的测定进行归一化。
将修饰的和未修饰的LECT2 siRNA序列分别示于表9和10中。使用标准命名法(参见表1的缩写)表示在此提供的核酸序列。
结果
使用修饰的LECT2 siRNA序列的原代猴肝实质细胞的单剂量筛选的结果示于表11中。以10nM的双链体终浓度进行单剂量实验，并且将数据表达为相对于AD-1955非靶向对照剩余的信使百分比。
表11.在原代猴肝实质细胞中Lect2单剂量筛选
等效物
利用不超出常规的实验，本领域技术人员将认识到，或将能够确定在此所描述的本发明具体实施例的许多等效物。此类等同物意在由以下权利要求书涵盖。

Claims (74)

1.一种用于抑制LECT2的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括长度是15-30个碱基对的有义链和长度是15-30个碱基对的反义链，并且该反义链与SEQ ID NO：1的至少15个连续核苷酸互补。
2.一种用于抑制LECT2表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括有义链和反义链，所述反义链包含与LECT2 RNA转录物互补的区域，该反义链包括与表2-3、5-6和9-10中列出的反义序列之一相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的dsRNA，其中所述dsRNA包括至少一个修饰的核苷酸。
4.一种双链RNAi(dsRNA)，包括与反义链互补的有义链，其中所述反义链包括与LECT2RNA转录物互补的区域，该LECT2 RNA转录物包括SEQ ID NO：1或在SEQ ID NO：1的核苷酸位置373处具有A至G取代的核苷酸序列，其中每条链具有约14个至约30个核苷酸，其中所述dsRNA由式(III)表示：
有义：5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′
反义：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)1-Na′-nq′5′(III)
其中：
i、j、k、以及1各自独立地是0或1；
p、p’、q、以及q′各自独立地是0-6；
Na和Na′各自独立地表示包括0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb′各自独立地表示包括0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
np、np′、nq、以及nq′各自独立地表示突出核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、以及Z′Z′Z′各自独立地表示三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰。
5.如权利要求4所述的dsRNA，其中i是1；j是1；或i和j两者均是1。
6.如权利要求4所述的dsRNA，其中k是1；l是1；或k和l两者均是1。
7.如权利要求4所述的dsRNA，其中XXX与X′X′X′互补，YYY与Y′Y′Y′互补，并且ZZZ与Z′Z′Z′互补。
8.如权利要求4所述的dsRNA，其中该Y′Y′Y′基序发生在该反义链从5′-端开始的位置11、12和13处。
9.如权利要求8所述的dsRNA，其中Y′是2′-O-甲基。
10.如以上权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该双链体区域长度是15-30个核苷酸对。
11.如以上权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该双链体区域长度是17-23个核苷酸对。
12.如以上权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该双链体区域长度是19-21个核苷酸对。
13.如以上权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该双链体区域长度是21-23个核苷酸对。
14.如以上权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该互补区域长度是至少17个核苷酸。
15.如以上权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该互补区域长度是19个核苷酸。
16.如以上权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该互补区域长度是在19个和21个核苷酸之间。
17.如以上权利要求中任一项所述的dsRNA，其中至少一条链包含具有至少1个核苷酸的3’突出端。
18.如权利要求10所述的dsRNA，其中至少一条链包含具有至少2个核苷酸的3′突出端。
19.如权利要求3或4所述的dsRNA，其中所述修饰的核苷酸的至少一个选自下组，该组由以下各项组成：2’-O-甲基修饰的核苷酸、包含5′-硫代磷酸酯基的核苷酸、以及与胆甾醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基连接的末端核苷酸。
20.如权利要求3或4所述的dsRNA，其中所述修饰的核苷酸的至少一个选自下组，该组由以下各项组成：2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧修饰的核苷酸、锁核酸(LNA)、无环核苷酸、脱碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、以及包含非天然碱基的核苷酸。
21.如权利要求3或4所述的dsRNA，其中这些核苷酸上的修饰选自下组，该组由以下各项组成：锁核酸(LNA)、无环核苷酸、己糖醇或己糖核酸(HNA)、环己烯核酸(CeNA)、2’-甲氧基乙基、2’-O-烷基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-O-甲基、2’-脱氧、2’-羟基、及其组合。
22.如权利要求3或4所述的dsRNA，其中这些核苷酸上的修饰是2’-O-甲基、2’-氟或两者。
23.如以上权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该有义链共轭至至少一个配体。
24.如权利要求23所述的dsRNA，其中该配体附接至该有义链的3’末端。
25.如权利要求23所述的dsRNA，其中该配体包括碳水化合物。
26.如权利要求23所述的dsRNA，其中该配体是GalNAc配体。
27.如权利要求23所述的dsRNA，其中该配体是
28.如权利要求23至27中任一项所述的dsRNA，其中该配体是经由接头而附接。
29.如权利要求28所述的dsRNA，其中该接头是二价或三价分支接头。
30.如权利要求28所述的dsRNA，其中该配体和接头是如式XXIV所示的：
31.如权利要求23至30中任一项所述的dsRNA，其中该配体将该dsRNA靶向肝实质细胞。
32.如以上权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该互补区域由以下反义序列组成，该反义序列选自表2-3、5-6和9-10中披露的反义序列。
33.如以上权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该dsRNA包括有义链和反义链，该有义链由有义序列组成，该有义序列选自表2-3、5-6和9-10中披露有义序列，该反义链由反义序列组成，该反义序列选自表2-3、5-6和9-10中披露的反义序列。
34.一种细胞，包含如以上权利要求中任一项所述的dsRNA。
35.一种用于抑制LECT2基因表达的药物组合物，该组合物包括如权利要求1至33中任一项所述的dsRNA。
36.如权利要求35所述的药物组合物，其中dsRNA在非缓冲溶液中进行给予。
37.如权利要求36所述的药物组合物，其中所述非缓冲溶液是盐水或水。
38.如权利要求35所述的药物组合物，其中所述dsRNA用缓冲溶液进行给予。
39.如权利要求38所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐、磷酸盐或其任何组合。
40.如权利要求38所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
41.如权利要求35所述的药物组合物，其中所述组合物包括脂质配制品。
42.如权利要求41所述的药物组合物，其中该脂质配制品是LNP配制品。
43.如权利要求42所述的药物组合物，其中该脂质配制品是LNP11配制品。
44.如权利要求35-43中任一项所述的药物组合物，其中该dsRNA靶向肝脏细胞或肝实质细胞。
45.如权利要求35-44中任一项所述的药物组合物，其中静脉内地给予所述组合物。
46.如权利要求35-44中任一项所述的药物组合物，其中皮下地给予所述组合物。
47.如权利要求45所述的药物组合物，其中所述组合物包括脂质配制品并且静脉内地给予。
48.如权利要求46所述的药物组合物，其中所述组合物包括共轭至配体的dsRNA，该配体选自碳水化合物配体或GalNAc配体。
49.一种抑制细胞中LECT2表达的方法，该方法包括：
(a)向该细胞中引入如权利要求1-33中任一项所述的dsRNA，并且
(b)维持步骤(a)的细胞一段时间，该时间足以获得LECT2基因的mRNA转录物的降解，由此抑制该LECT2基因在该细胞中的表达。
50.如权利要求49所述的方法，其中将该细胞离体、体外、或体内地进行处理。
51.如权利要求49所述的方法，其中该细胞存在于需要治疗、预防和/或管理与LECT2表达相关的障碍的受试者中。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述障碍是淀粉样变性。
53.如权利要求52所述的方法，其中该淀粉样变性是LECT2淀粉样变性。
54.如权利要求49-53中任一项所述的方法，其中该细胞是肝脏细胞或肝实质细胞。
55.如权利要求49-54中任一项所述的方法，其中LECT2的表达被抑制至少20％。
56.如权利要求49-54中任一项所述的方法，其中LECT2的表达被抑制至少30％。
57.一种治疗与LECT2表达相关的障碍的方法，该方法包括向需要此类治疗的受试者给予治疗有效量的
(i)如权利要求1-33中任一项所述的dsRNA或
(ii)如权利要求35-48中任一项所述的组合物。
58.一种治疗LECT2淀粉样变性的方法，该方法包括向需要此类治疗的受试者给予双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括长度是15-30个碱基对的有义链和长度是15-30个碱基对的反义链，并且该反义链与以下项的至少15个连续核苷酸互补：SEQ ID NO：1或在SEQID NO：1的核苷酸位置373处具有A至G取代的核苷酸序列。
59.如权利要求57或58所述的方法，其中该受试者患有淀粉样变性或有风险患上淀粉样变性。
60.如权利要求57或58所述的方法，其中该淀粉样变性是LECT2淀粉样变性。
61.如权利要求49-60中任一项所述的方法，其中根据剂量方案给予该dsRNA或包含该dsRNA的组合物。
62.如权利要求61所述的方法，其中该剂量方案是每周、每两周、或每月一次。
63.如权利要求49-62中任一项所述的方法，其中该方法减少LECT2淀粉样蛋白沉淀。
64.一种减少患有LECT2淀粉样变性的受试者中的LECT2淀粉样蛋白沉淀的方法，该方法包括向该受试者给予
(i)如权利要求1-33中任一项所述的dsRNA或
(ii)如权利要求35-48中任一项所述的组合物。
65.如权利要求57-64中任一项所述的方法，其中以0.05mg/kg-50mg/kg的剂量给予该dsRNA。
66.如权利要求57-64中任一项所述的方法，其中以0.01mg/kg至5mg/kg该受试者体重的浓度给予该dsRNA。
67.如权利要求65所述的方法，其中将该dsRNA配制为LNP配制品并且以0.1mg/kg至0.5mg/kg的剂量给予。
68.如权利要求65所述的方法，其中该dsRNA共轭至GalNAc配体。
69.如权利要求65所述的方法，其中该dsRNA共轭至GalNAc配体并且以1mg/kg至10mg/kg的剂量给予。
70.一种对dsRNA的至少一条链进行编码的载体，其中所述dsRNA包括与编码LECT2的mRNA的至少一部分互补的区域，其中所述dsRNA长度是30个碱基对或更少，并且其中所述dsRNA靶向所述mRNA以便切割。
71.如权利要求70所述的载体，其中该互补区域的长度是至少15个核苷酸。
72.如权利要求70所述的载体，其中所述dsRNA包括反义序列和/或有义序列，该反义序列和/或有义序列选自表2、3、5、6、9或10中披露的序列。
73.如权利要求70至72中任一项所述的载体，其中该互补区域的长度是19个至21个核苷酸。
74.一种细胞，包含如权利要求70-73中任一项所述的载体。
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