ES2631458T3 - Molécula de ARNmi definida por su fuente y sus usos terapéuticos en el cáncer asociado a la EMT - Google Patents

Abstract

Molécula de ARNmi o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma donde una fuente de dicha molécula de ARNmi o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con SEQ ID NO: 1 o una fuente de la misma, o una composición que comprende dicha molécula de ARNmi, equivalente o mimético o isomiR de la misma o fuente de la misma para su uso como un medicamento para tratar, revertir, curar y/o retrasar un cáncer asociado a la EMT induciendo un proceso de MET, donde dicha molécula de ARNmi es un ARNmi-518b, ARNmi-520f y/o ARNmi-524.

Description

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DESCRIPCION

Molecula de ARNmi definida por su fuente y sus usos terapeuticos en el cancer asociado a la EMT Campo de la invencion

[0001] La invencion se refiere al uso terapeutico de una molecula de ARNmi definida mas tarde por su fuente en enfermedades y afecciones de un cancer asociado con la EMT (transicion epitelial a mesenquimal).

[0002] La divulgacion se refiere al uso diagnostico de una molecula de ARNmi definida por su fuente mas tarde en enfermedades y afecciones asociadas con la EMT.

Antecedentes de la invencion

[0003] Muchos tumores solidos son epiteliales en origen (es decir carcinomas). Una perdida de marcadores celulares epiteliales (por ejemplo, E-cadherina) y una ganancia de marcadores celulares mesenquimales (por ejemplo, N-cadherina y vimentina) se ha observado en muestras de tumores de pacientes, incluyendo cancer de prostata (1). Las celulas cancerosas se pueden desdiferenciar a traves de esta denominada transicion epitelial a mesenquimal (EMT). Durante la EMT, las uniones celulares intercelulares se descomponen, aportando asi a las celulas tumorales la capacidad para invadir y migrar al tejido circundante o a traves de las paredes de los vasos sanguineos. Tales cambios fenotipicos se cree que desempenan un gran papel en la diseminacion de la enfermedad y en ultima instancia llevan a la progresion de la enfermedad, que se asocia frecuentemente a una prognosis pobre para los pacientes (2, 3).

[0004] La perdida de expresion de la E-cadherina se considera como una marca del contraste molecular de EMT. La EMT en las celulas tumorales se produce a partir de una reprogramacion transcripcional de la celula. En particular la represion transcripcional del promotor genico de la E-cadherina (CDH1) ha mostrado que desencadena el fenotipo de EMT. La proteina E-cadherina es una de las moleculas de cadherina mas importantes que median los contactos celula-celula en las celulas/tejidos epiteliales. CDH1 es reprimida por la union de los represores transcripcionales, SNAI1, SNAI2, TCF3, TWIST, ZEB1, ZEB2 o KLF8 (4-7), para tres denominadas E-cajas en la region del promotor proximal de CDH1 (8-10). La inhibition de la union de estos represores para el promotor de CDH1 puede revertir la EMT, tambien denominada transicion mesenquimal a epitelial (MET), e inhibe la invasion de celulas tumorales y la progresion tumoral (11). La WO 2009/044899 y la EP 2 208 499 divulgan que la expresion de un precursor de ARNmi-518 podria reducir la viabilidad e inducir la apoptosis en unas lineas celulares de cancer de colon y ovarico. La WO 2007/148235 divulga un metodo de diagnostico de un sujeto con un cancer especifico basado en la expresion de un ARNmi dado. Cervigne et al. Mol Gen 2009, vol 18, no 24, p4818-4829 divulgan una sobreexpresion significativa de un subconjunto de ARNmi incluyendo ARNmi-518b tanto en leucoplasias progresivas como en carcinomas de celulas escamosas orales (OSCC) en comparacion con la expresion en una celula normal.

[0005] Recientemente, la expresion de diferentes microARN ha mostrado que esta enlazada con la EMT (12). Al comparar perfiles de expresion de microARN de celulas con un fenotipo epitelial y mesenquimal (inducido), miembros de la familia de miR-200 (miR-141, miR-200a/b/c y miR-429) y miR-205 se identificaron como miRs asociados a la EMT (13-15). Los genes diana de los microARN asociados a la EMT de la familia miR-200 mostraron ser ZEB1 y ZEB2. MicroARN dirigidos a los otros represores transcripcionales conocidos de CDH1 (es decir, SNAI1, SNAI2, TCF3 y TWIST1) aun no se han encontrado. La identification de estos microARN en un perfil de expresion de celulas que han sufrido EMT no significa necesariamente que estos microARN estan implicados durante la EMT.

[0006] Huang et al. Nature Cell Biol. 2008, vol 10, no 2, p202-210 demuestran que otros miembros del agrupamiento miR-515 promueven la invasion tumoral y la metastasis. La US 2009/186353 divulga varios miembros del agrupamiento miR-515 como regulados de forma diferencial en el cancer, incluyendo cancer de vejiga de alto grado y el cancer de higado metastasico. Actualmente no existe ningun medicamento conocido eficaz que se pueda utilizar para prevenir, tratar, revertir y/o retrasar especificamente una enfermedad o condition asociada a la EMT en un sujeto. Los tratamientos estandar solo comprenden quimioterapia, radioterapia, cirugia. Particularmente, la identificacion de pacientes que desarrollaran o que ya han desarrollado metastasis y/o el tratamiento temprano de pacientes con marcadores de EMT que expresan tumores, tal como la expresion de cadherina mesenquimal y/o la expresion inferior de E-cadherina podria contribuir a una mejor supervivencia libre y global de la enfermedad. Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad de marcadores de diagnostico para EMT y para tratamientos nuevos de la enfermedad o condiciones asociadas con la EMT.

Descripcion de la invencion

[0007] En un primer aspecto de la invencion, se proporciona una molecula de ARNmi o un equivalente de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID

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NO: 1 o una composicion que comprende dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma o dicha fuente de la misma para su uso como un medicamento para prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar un cancer asociado a la EMT por induccion de un proceso de MET, donde dicha molecula de ARNmi es un ARNmi-518b, ARNmi- 520f y/o ARNmi-524. En un primer aspecto de la divulgacion, se proporciona una molecula de ARNmi o un equivalente de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 o una composicion que comprende dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma o dicha fuente de la misma para su uso como un medicamento para prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar una enfermedad o una condicion asociada a EMT, donde dicha molecula de ARNmi es un ARNmi-518b, ARNmi-520f y/o ARNmi-524 o un equivalente o un mimetico o un isomiR o una fuente del mismo. Los microARN (ARNmi) son ARN pequenos de 17-25 nucleotidos, que funcionan como reguladores de la expresion genica en eucariotas. Los ARNmi son inicialmente expresados en el nucleo como parte de transcritos primarios largos denominados ARNmi primarios (ARNmi-pri). Dentro del nucleo, los ARNmi-pri son digeridos parcialmente por la enzima Drosha, para formar ARNmi precursor de horquilla de 65-120 nucleotidos de longitud (ARNmi-pre) que se exportan al citoplasma para mas tratamiento por Dicer en ARNmi maduros mas cortos, que son las moleculas activas. En animales, estos ARN cortos comprenden una region "semilla" proximal 5' (nucleotidos 2 a 8) que parece ser el determinante primario de la especificidad de emparejamiento del ARNmi en la region no traducida 3' (3'-UTR) de un ARNm objetivo. Una explicacion mas detallada se da en la parte dedicada a las definiciones generales.

[0008] Cada una de las definiciones dadas a continuacion sobre una molecula de ARNmi, un equivalente de ARNmi o una fuente de ARNmi se debe usar para cada uno de los ARNmi identificados o equivalentes de ARNmi o fuentes de ARNmi de esta solicitud: ARNmi-124-1, ARNmi-206, ARNmi-1, ARNmi-141, ARNmi-200a, ARNmi-200b, ARNmi-200c, ARNmi-429, ARNmi-205, ARNmi518b, ARNmi520f, ARNmi524 y fuentes de los mismos, ademas incluyen una fuente que comprende al menos 80 nucleotidos y que comprenden una unidad que tiene al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1. Secuencias maduras preferidas (como se identifica en la tabla 3), semilla (como se identifica en la tabla 5) isomiRs (como se identifica en la tabla 6) o fuente (como se identifica en las tablas 2 (precursor de ARN) o 4 (ADN que codifica un precursor de ARN)) de dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma respectivamente se identifican en las tablas correspondientes. En el texto entero de la solicitud a menos que se indique lo contrario, un ARNmi tambien se puede denominar una molecula de ARNmi, un miR, o un equivalente del mismo o una fuente o un precursor del mismo. Un equivalente preferido es un maduro, un isomiR o un mimetico. Cada secuencia identificada aqui se puede identificar como SEQ ID NO como se usa en el texto de la solicitud o como SEQ ID NO correspondiente en el listado de secuencias.

[0009] En el contexto de la invencion una molecula de ARNmi o un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma puede ser un sintetico o natural o recombinante o maduro o parte de un ARNmi maduro o un ARNmi humano o derivado a partir de un ARNmi humano como se define mas adelante en la parte dedicada a las definiciones generales. Una molecula de ARNmi humana es una molecula de ARNmi que se encuentra en una celula, tejido, organo o liquidos biologicos humanos (es decir molecula de ARNmi humana endogena). Una molecula de ARNmi humana tambien puede ser una molecula de ARNmi humana derivada a partir de una molecula de ARNmi humana endogeno por sustitucion, eliminacion y/o adicion de un nucleotido. Una molecula de ARNmi o un equivalente o un mimetico de la misma puede ser una molecula de ARN monocatenaria o bicatenaria.

[0010] En el contexto de la invencion, una molecula de ARNmi preferida o un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma es de manera que una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende o consiste en al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 se define posteriormente de forma preferible de la siguiente manera.

SEQ ID NO: 1 es como sigue:

U C AnGCU GU GnC CCUnnAnAGGGAAGCnCUUUCUnUnGU CnnAAnG AAA AnnA nGnGCUnCCnUUUnGAGnnUUACnGUUUG

En la unidad representada por SEQ ID NO: 1, n puede ser cualquier base A, U, C o G. En otra forma de realizacion preferida, se proporciona una molecula de ARNmi o un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma de manera que una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO:1. Mas preferiblemente, la identidad es de al menos 99% o 100%. En una forma de realizacion preferida, dicha fuente es un precursor de una molecula de ARNmi-518b, ARNmi-520f o ARNmi-524 o un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma. Fuentes preferidas y precursores se definiran en la presente mas adelante. La invencion por lo tanto se refiere a una molecula de ARNmi o un equivalente o un

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mimetico o un isomiR de la misma o una fuente de la misma o una composicion que comprende dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma o fuente de la misma, tal y como se define en los siguientes parrafos, donde la molecula de ARNmi es un ARNmi-518b, ARNmi-520f y/o ARNmi-524 o un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma o una fuente de la misma. Las moleculas de ARNmi, equivalentes, mimeticos e isomiR preferidas se definiran mas tarde en la presente.

[0011] En una forma de realizacion preferida, un equivalente de un ARNmi-518b, un ARNmi-520f o de un ARNmi-524 es una molecula de ARNmi humana. Una molecula de ARNmi humana es una molecula de ARNmi que se encuentra en una celula, tejido u organo humano. Una molecula de ARNmi humana tambien puede ser una molecula de ARNmi humana derivada a partir de una molecula de ARNmi humana endogena por sustitucion, eliminacion y/o adicion de un nucleotido. En este contexto, un "nucleotido" puede referirse a 1, 2, 3, 4, 5 o mas nucleotidos. Un equivalente preferido de una molecula de ARNmi-518b, ARNmi-520f o ARNmi-524 no es una molecula de ARNmi mml-mir-519a o mml-mir-520c como se identifica de aqui en adelante. Una fuente preferida o precursor de una molecula de ARNmi-518b, ARNmi-520f o ARNmi-524 no es una fuente o un precursor de una molecula de ARNmi mml-mir-519a o mml-mir-520c segun se identifica de aqui en adelante. Las secuencias maduras rechazadas preferidas y precursoras de mml-mir-519a se identifican como SEQ ID NO: 108 y 109. Las secuencias maduras preferidas y precursoras de mml-mir-520c se identifican como SEQ ID NO: 110 y 111.

[0012] En una forma de realizacion preferida, una molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende al menos 6 de los 7 nucleotidos presentes en la secuencia semilla de dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma (la tabla 5 muestra la secuencia semilla preferida de cada una de las molecula de ARNmi identificadas aqui). Preferiblemente en esta forma de realizacion, una molecula de ARNmi o un equivalente o un mimetico o isomiR de la misma puede ser de 6, 7, 8, 9, 10, 11,12 a 30 nucleotidos de longitud y mas preferiblemente comprende al menos 6 de los 7 nucleotidos presentes en la secuencia semilla de dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma. Aun mas preferiblemente una molecula de ARNmi o un equivalente o un mimetico o isomiR de la misma es de 15 a 28 nucleotidos de longitud y mas preferiblemente comprende al menos 6 de los 7 nucleotidos presentes en la secuencia semilla. Aun mas preferiblemente una molecula de ARNmi tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleotidos o mas y preferiblemente comprende al menos 6 de los 7 nucleotidos presentes en la secuencia semilla. En cada una de estas formas de realizacion, una molecula de mirARN o un equivalente o un mimetico o isomiR de la misma puede comprender los 7 nucleotidos de la secuencia semilla como se identifican en la tabla 5. Aun mas preferiblemente una molecula de ARNmi tiene una longitud de al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleotidos o mas y comprende los 7 nucleotidos presentes en la secuencia semilla como se identifican en la tabla 5.

[0013] Por consiguiente, una molecula preferida de ARNmi-520f o equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende al menos 6 de los 7 nucleotidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 104 o 105 y mas preferiblemente tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleotidos o mas. Por consiguiente, una molecula de ARNmi-518b preferida o equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende al menos 6 de los 7 nucleotidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 103 y mas preferiblemente tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleotidos o mas.

[0014] Por consiguiente, una molecula de ARNmi-524 preferida o equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende al menos 6 de los 7 nucleotidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 106 o 107 y mas preferiblemente tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleotidos o mas.

[0015] En otra forma de realizacion preferida, una molecula de ARNmi o un equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende al menos 6 de los 7 nucleotidos presentes en una secuencia semilla dada como se identifica en la tabla 5 como SEQ ID NO: 87-107 y tiene al menos 80% de identidad sobre la secuencia madura entera (la tabla 3 muestra las secuencias maduras preferidas de cada uno de los ARNmi identificados aqui). Preferiblemente, la identidad es al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, o mas alta, tal como 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. Alternativamente, preferiblemente en esta forma de realizacion, una molecula de ARNmi o un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma tiene una longitud no mayor de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucleotidos, comprende al menos 6 de los 7 nucleotidos presentes en una secuencia semilla dada como se identifica en la tabla 5 como SEQ ID NO: 87-107 y tiene al menos 80% de identidad sobre la secuencia madura entera como se identifica en la tabla 3 como SEQ ID NO: 2-21. Preferiblemente, la identidad es al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. En otra forma de realizacion preferida, un isomiR de una molecula de ARNmi tiene al menos 80% de identidad con la secuencia de isomiR entera (la tabla 6 muestra el isomiR preferido de cada uno de los ARNmi maduros identificados como SEQ ID NO: 118-162). Preferiblemente, la identidad es al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o mas alto tal como 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. Preferiblemente en esta forma de realizacion, un isomiR

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de una molecula de ARNmi o un equivalente o un mimetico del mismo tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleotidos o mas.

[0016] La identidad se puede evaluar utilizando diferentes vias tal y como se define mas adelante aqui. Sin embargo, en una forma de realizacion preferida, identidad se refiere al porcentaje de identidad y se calcula por el numero de nucleotidos iguales entre base de datos y consulta, dividido por la longitud total de la consulta, y multiplicado por 100. Por consiguiente, una molecula de ARNmi-520f preferida o equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende al menos 6 de los 7 nucleotidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 104 o 105 y/o tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 945,95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 19, 118, 119 y/o 120 y/o tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucleotidos o mas. Por consiguiente, una molecula de ARNmi-518b preferida o equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende al menos 6 de los 7 nucleotidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 103 y/o tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 945,95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 18, 121,122 y/o 123 y/o tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucleotidos o mas. Por consiguiente, una molecula de ARNmi-524 preferida o equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende al menos 6 de los 7 nucleotidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 106 o 107 y/o tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 945,95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 20, 21, 124, 125, 126,127 y/o 128 y/o tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucleotidos o mas. Otra molecula de ARNmi preferida o equivalente o mimetico o un isomiR de la misma tiene al menos 80% de identidad con una secuencia semilla (como se identifica en la tabla 5 como SEQ ID NO: 87-107) o con una secuencia madura (como se identifica en la tabla 3 como SEQ ID NO: 221) o con una secuencia precursora (como se identifica en la tabla 2 como SEQ ID NO: 22-35) o con un ADN que codifica un precursor de ARN (como se identifica en la tabla 4 como SEQ ID NO: 36-47) o con una secuencia de isomiR (como se identifica en la tabla 6 como SEQ ID NO: 118-162). La identidad puede ser al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o 100%. La identidad es preferiblemente evaluada en toda la SEQ ID NO segun se identifica en una tabla. Sin embargo, la identidad tambien se puede evaluar en la parte de una SEQ ID NO dada. Parte puede referirse a al menos 50% de la longitud de la SEQ ID NO, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o 100%.

[0017] Un equivalente puede ser un isomiR o un mimetico. Una secuencia precursora puede dar como resultado mas de una secuencias de isomiR dependiendo del proceso de maduracion (vease, por ejemplo, ARNmi-520f o ARNmi-518b o ARNmi-524 donde en ciertos tejidos, multiples isomiRs se han identificado (Tabla 6: SEQ ID NO: 118-128). Un mimetico es una molecula que tiene una actividad similar o identica a la de una molecula de ARNmi. En este contexto una actividad similar tiene el mismo sentido que un nivel aceptable de una actividad.

[0018] Cada una de las moleculas ARNmi o equivalentes o mimeticos o isomiRs de la misma como se identifica aqui tiene un nivel aceptable de una actividad de un ARNmi dado del que derivan. Un nivel aceptable de una actividad es preferiblemente que dicho ARNmi o equivalente o mimeticos o isomiRs del mismo sigue siendo capaz de mostrar un nivel aceptable de dicha actividad de dicho ARNmi. Una actividad de un ARNmi dado o un equivalente del mismo es por ejemplo la capacidad para inducir una MET detectable como se definira mas adelante aqui. Un nivel aceptable de una actividad es preferiblemente al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% de la actividad del ARNmi del que derivan. Tal actividad puede ser segun se mide en una celula de vejiga de un individuo o in vitro en una celula por comparacion con la actividad del ARNmi del que derivan. La evaluation de la actividad se puede realizar en el nivel de ARNm, preferiblemente utilizando RT- qPCR. La evaluacion de la actividad se puede realizar en el nivel de proteina, preferiblemente utilizando analisis de transferencia de Western o, analisis de inmunohistoquimica o inmunofluorescencia de secciones transversales. La evaluacion de la actividad se puede realizar utilizando celulas que expresan un constructo de luciferasa de luciernaga dirigido por el promotor de CDH1 y midiendo la actividad de luciferasa. Una actividad preferida de cualquiera de las moleculas de ARNmi o equivalente de la misma como se identifica aqui (es decir, ARNmi-124-1, ARNmi-206, ARNmi181a-1, ARNmi-141, ARNmi-200a, ARNmi-200b, ARNmi-200c, ARNmi-429, ARNmi-205, ARNmi-518b, ARNmi-520f, ARNmi-524) o una actividad preferida de una molecula de ARNmi o equivalente de la misma identificada por una fuente preferida (es decir, una molecula de ARNmi o un equivalente de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1) es para inducir una MET detectable en un sujeto como se define aqui mas adelante.

[0019] Una fuente de una molecula de ARNmi o una fuente de un equivalente de una molecula de ARNmi, mimetico, isomiR puede ser cualquier molecula que sea capaz de inducir la production de una molecula de ARNmi o de un equivalente de la misma tal como un mimetico o isomiR segun se identifica aqui y que comprende una estructura tipo horquilla y/o una molecula de acido nucleico bicatenaria. La presencia de una estructura tipo horquilla se puede evaluar utilizando el programa RNAshapes (Steffen P., et al., (2006), Bioinformatics, 22: 500-503) usando ventanas deslizantes de 80, 100 y 120 nt o mas. La presencia de una

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estructura tipo horquilla esta normalmente presente en una fuente natural o endogena de una molecula de ARNmi mientras que una molecula de acido nucleico bicatenaria esta normalmente presente en una fuente recombinante o sintetica de una molecula de ARNmi o de un equivalente de la misma. Una fuente de una molecula de ARNmi o de un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma puede ser un ARN monocatenario, un bicatenario o un ARN parcialmente bicatenario o comprender tres cadenas, un ejemplo esto se describe en la WO2008/10558. Como se utiliza en este caso, parcialmente bicatenario se refiere a estructuras bicatenarias que tambien comprenden estructuras monocatenarias en los extremos 5' y/o 3'. Puede ocurrir cuando cada cadena de una molecula de ARNmi no tiene la misma longitud. En general, tal molecula de ARNmi bicatenaria parcial puede tener menos del 75% de estructura bicatenaria y mas del 25% de estructura monocatenaria, o menos del 50% de estructura bicatenaria y mas del 50% de estructura monocatenaria, o mas preferiblemente menos del 25%, 20 % o 15% de estructura bicatenaria y mas del 75%, 80%, 85% de estructura monocatenaria. Alternativamente, una fuente de una molecula de ARNmi o de un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma es una molecula de ADN que codifica un precursor de una molecula de ARNmi o de un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma. Las moleculas de ADN preferidas en este contexto se identifican en la tabla 4 como SEQ ID NO: 36-47. La invencion abarca el uso de una molecula de ADN que codifica un precursor de una molecula de ARNmi que tiene al menos 80% de identidad con dicha secuencia como se identifica en la tabla 4. Preferiblemente, la identidad es al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. Preferiblemente en esta forma de realization, una molecula de ADN tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleotidos o mas y tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una secuencia de ADN como se identifica en la tabla 4 como SEQ ID NO: 36-47. Por consiguiente, una fuente preferida de una molecula de ARNmi-520f tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con SEQ ID NO: 45 y/o tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleotidos o mas. Por consiguiente, una fuente preferida de una molecula de ARNmi-518b tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con SEQ ID NO: 44 y/o tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleotidos o mas. Por consiguiente, una fuente preferida de una molecula de ARNmi- 524 tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con SEQ ID NO: 46 y/o tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleotidos o mas.

[0020] La induction de la production de una molecula de ARNmi dada o de un equivalente de la misma o de un mimetico o un isomiR de la misma se obtiene preferiblemente cuando dicha fuente se introduce en una celula usando un ensayo tal y como se define a continuation. Las celulas abarcadas por la presente invencion se definen mas adelante. Una fuente preferida de una molecula de ARNmi o de un equivalente de la misma o de un mimetico o un isomiR de la misma es un precursor de la misma, mas preferiblemente un acido nucleico que codifica dicha molecula de ARNmi o un equivalente de la misma o un mimetico o un isomiR de la misma. Un precursor preferido es un precursor que se produce de forma natural. Un precursor puede ser un precursor sintetico o recombinante. Un precursor preferido de una molecula de ARNmi dada se identifica en la tabla 2 como SEQ ID NO: 22-35. La invencion abarca el uso de un precursor de una molecula de ARNmi o de un equivalente de la misma que tiene al menos 80% de identidad con dicha secuencia. Preferiblemente, la identidad es al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. Preferiblemente en esta forma de realizacion, una molecula de ARN tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleotidos o mas y tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una secuencia segun se identifica en la tabla 2 como SEQ ID NO: 22-35.

[0021] Por consiguiente, una fuente preferida de una molecula de ARNmi-520f tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con SEQ ID NO: 33 y/o tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleotidos o mas.

Por consiguiente, una fuente preferida de una molecula de ARNmi-518b tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con SEQ ID NO: 32 y/o tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleotidos o mas. Por consiguiente, una fuente preferida de una miRNA-524 molecula tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con SEQ ID NO: 34 y/o tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleotidos o mas. Fuentes preferidas o precursores se han definido mas adelante aqui. Una fuente preferida incluye o comprende un constructo de expresion que comprende un acido nucleico, es decir, ADN que codifica dicho precursor de dicho ARNmi, mas preferiblemente dicho constructo de expresion es un vector de terapia genica virica seleccionado de vectores de terapia genetica basados en un adenovirus, un virus adeno-asociado (AAV), un virus del herpes, un virus de la sifilis y un retrovirus. Un vector de terapia genica virico preferido es un vector AAV o Lentiviral. Otros vectores preferidos

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son vectores virales oncoliticos. Tales vectores se describen mas adelante aqui. Alternativamente, una fuente puede ser una molecula de ARNmi sintetica o un mimetico quimica como se define mas adelante en la parte dedicada a definiciones generales. [0022] La deteccion de la presencia de una molecula de ARNmi o de un equivalente de la misma tal como un mimetico o un isomiR se puede realizar utilizando cualquier tecnica conocida por la persona experta. La evaluacion del nivel de expresion o de la presencia de una molecula de ARNmi o de un equivalente de la misma se realiza preferiblemente utilizando tecnicas de biologia molecular tradicionales tales como qPCR (tiempo real), micromatrices, matrices de esferas, analisis de proteccion de ribonucleasa o analisis Northern o clonacion y secuenciacion. La persona experta entendera que alternativamente o en combinacion con la cuantificacion de una molecula de ARNmi o de un equivalente de la misma, la cuantificacion de un sustrato de una molecula de ARNmi correspondiente o de un equivalente de la misma o cualquier compuesto conocido por estar asociado con una funcion de dicha molecula de ARNmi o de dicho equivalente de la misma o la cuantificacion de una funcion o actividad de dicha molecula de ARNmi o de dicho equivalente de la misma utilizando un ensayo especifico esta abarcado dentro del campo de la invencion. Las composiciones y formulaciones preferidas se definen todas mas adelante aqui. Una molecula de ARNmi o un equivalente de la misma o un mimetico o un isomiR de la misma se puede utilizar como tal como una molecula desnuda, con o sin modificaciones quimicas, o encapsulada en una particula o conjugada con una fraccion. Una composicion preferida comprende una molecula de ARNmi o un equivalente de la misma o un mimetico o un isomiR de la misma encapsulada en una nanoparticula o una estructura liposomica. Una molecula de ARNmi o equivalente de la misma o un mimetico o un isomiR de la misma puede ser un hibrido de aptamero- ARNmi. Una molecula de ARNmi o equivalente de la misma puede ser un hibrido de aptamero-ARNmi. Un aptamero-ARNmi se define como un ARNmi enlazado a un nucleotido de ARN (o ADN), el ultimo adopta una conformacion que dirige la molecula del hibrido de aptamero-ARNmi a una proteina de superficie celular (por ejemplo, el antigeno de membrana especifico de la prostata (PSMA)). El ARNmi marcado con el aptamero se puede enlazar a por ejemplo polietilenglicol, lo que aumenta la vida media circulante de la quimera (Dassie, J.P., et al. Nat. Biotechnol. 27: 839-849 (2009)). Cualquier cancer en el que la EMT este implicada o asociada, se puede evitar, retardar, curar y/o tratar con una molecula tal y como se define aqui. En el contexto de la invencion, la Transition Epitelial-Mesenquimal (EMT) es una serie orquestada de eventos en los que las interacciones de la matriz celula-celula y celula-extracelular (ECM) se alteran para permitir liberar celulas epiteliales del tejido circundante. El citoesqueleto celular epitelial se reorganiza para conferir la capacidad de la celula para moverse a traves de una ECM tridimensional via la reprogramacion molecular de la celula. La reprogramacion molecular de una celula epitelial es necesaria para conseguir un fenotipo mesenquimal e implica la infrarregulacion o la disminucion de la expresion de las proteinas epiteliales, tal como E-cadherina y proteinas de union tales como desmoplaquina, claudina y ocludina. Ademas, la expresion de proteinas mesenquimales es sobrerregulada o aumentada, incluyendo por ejemplo, la expresion de proteinas de ECM tales como MMPs y fibronectina y proteinas de superficie celular tales como N-Cadherina e integrina avpo. Factores de transcription tambien se pueden sobrerregular o aumentar en las celulas que muestran un fenotipo mesenquimal tal como por ejemplo, SNAI1 (conocido tambien como SNAIL), TWIST, ZEB1 (conocido tambien como 5EF1) y ZEB2 (conocido tambien como SIP1). La referencia a la induction de la "transicion" de una celula epitelial a una celula que muestra un fenotipo mesenquimal deberia ser entendida como una referencia para inducir los cambios geneticos, morfologicos y/o funcionales que son necesarios para cambiar una celula epitelial a una celula que muestra un fenotipo mesenquimal del tipo definido aqui. La referencia a la induccion de la transicion mesenquimal a epitelial deberia ser entendida como que tiene el significado inverso.

[0023] En un cancer de la invencion, la EMT puede ser detectable antes de la aparicion del cancer, es decir, antes de la aparicion de un sintoma de dicho cancer. Ademas tambien esta abarcado por la presente invencion que la EMT sea detectable durante el desarrollo de dicho cancer, es decir despues de la aparicion de un sintoma de dicho cancer. Ademas tambien esta abarcado que la EMT sea detectable antes de la aparicion del cancer y durante el desarrollo de dicho cancer. La EMT se puede detectar utilizando cualquier tecnica conocida por la persona experta. Preferiblemente, la EMT es evaluada detectando una reduction de la expresion de E-cadherina epitelial y/o un aumento de la expresion de vimentina mesenquimal y/o cadherina mesenquimal usando inmunohistoquimica usando anticuerpos especificos dirigido contra E-cadherina y/o vimentina mesenquimal y/o cadherina mesenquimal respectivamente (2, 3). La N-Cadherina (CDH2) y la OB-cadherina (CDH11) son dos ejemplos de cadherinas mesenquimales. La evaluacion de la expresion se realiza preferiblemente en una biopsia o section tumoral en diferentes puntos temporales para un sujeto dado o en uno o mas puntos temporales para un sujeto dado y un control sano. La evaluacion se puede realizar cada semana, cada mes. El aumento/reduccion se puede evaluar por lo tanto cada semana, mes. Preferiblemente, una reduccion de la expresion de la E-cadherina epitelial se refiere a una reduccion significativa, preferiblemente una reduccion de al menos 5% de la expresion usando inmunohistoquimica. Mas preferiblemente, una reduccion se refiere a una reduccion de al menos 10%, aun mas preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90% o 100%. En este caso, ninguna expresion es detectable. Un aumento de 25 veces de E-cadherina se obtuvo utilizando una molecula de ARNmi-520f como se identifica aqui (un ejemplo representativo se muestra en el ejemplo 2, figura 4B). El efecto de esta molecula de ARNmi en este marcador es de forma cuantitativa (al menos 1,5 veces) mas pronunciado que el efecto correspondiente de la molecula de ARNmi de la familia 200 que ya se sabia que tiene un efecto en la E-cadherina como se muestra en el ejemplo 2, figura 4B. Por lo tanto se puede anticipar que una molecula de ARNmi-520f segun se identifica aqui se puede considerar como una molecula atractiva para un uso segun se identifica aqui. Preferiblemente, un aumento de la

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expresion de vimentina mesenquimal y/o cadherina mesenquimal significa un aumento significativo, preferiblemente un aumento de al menos 5% de la expresion usando inmunohistoquimica. Mas preferiblemente, un aumento significa un aumento de al menos 10%, aun mas preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 100%, o al menos 150% o mas. Un cancer en el que la EMT esta implicada o asociada es preferiblemente un cancer en el que se produce un proceso de desdiferenciacion. En este proceso de desdiferenciacion, una reduccion de la expresion de E-cadherina epitelial y/o un aumento de la expresion de vimentina mesenquimal y/o cadherina mesenquimal se produce preferiblemente y se puede evaluar como se ha explicado aqui. Como ejemplo, la EMT puede ser mostrada por celulas cancerosas que sufren este proceso y se convierten por lo tanto en metastasicas debido a su capacidad para separarse de las celulas vecinas y penetrar en y a traves de los tejidos circundantes. Por lo tanto, una enfermedad preferida de la invencion es un cancer (por ejemplo, maligno, metastasico) y otra enfermedad mas de la divulgacion es una fibrosis. Los canceres de una forma de realization preferida de la invencion incluyen un cancer de origen epitelial o un carcinoma o un tumor solido. Las celulas cancerosas pueden ser de vejiga, cerebro, pecho, colon, esofago, gastrointestinales, cabeza, rinon, higado, pulmon, nasofaringe, cuello, ovario, prostata, piel, estomago, testiculo, lengua o utero. Ademas, el cancer puede especificamente ser del siguiente tipo histologico, aunque no esta limitado a estos: neoplasma, maligno; carcinoma; carcinoma, no diferenciado; carcinoma de celula gigante y fusiforme; carcinoma de celula pequena; carcinoma papilar; carcinoma de celula escamosa; carcinoma de celula basal; carcinoma pilomatricial; carcinoma de celula transicional; carcinoma de celula transicional papilar; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma combinado; adenocarcinoma trabecular; carcinoma cistico adenoideo; adenocarcinoma de polipos adenomatosos; adenocarcinoma, poliposis coli familiar; carcinoma solido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma branquiolo-alveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromofobo; carcinoma acidofilo; adenocarcinoma oxifilico; carcinoma de basofilos; adenocarcinoma de celula clara; carcinoma de celula granulosa; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar y folicular; carcinoma esclerosante no encapsulante; carcinoma cortical suprarrenal; carcinoma endrometrioide; carcinoma de apendice de piel; adenocarcinoma apocrino; adenocarcinoma sebaceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma seroso papilar; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de celula en anillo de sello; carcinoma de conducto de infiltration; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatorio; enfermedad de Paget de mama; carcinoma de celula acinar; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma con metaplasia escamosa; tumor estromal ovarico, maligno; androblastoma, maligno; carcinoma de celulas de Sertoli. En una forma de realizacion preferida, el cancer asociado a la EMT es un cancer, preferiblemente un cancer de vejiga o de prostata. La EMT no se produce en todos los canceres. En los sarcomas de tejido blando y las leucemias el proceso de desdiferenciacion de la EMT no se produce. Por lo tanto en una forma de realizacion preferida, un cancer como se identifica aqui es un carcinoma y/o no es una leucemia y/o no es un sarcoma de tejido.

[0024] La EMT segun la divulgacion tambien puede producirse durante la inflamacion cronica o condiciones que promueven la interruption de tejido prolongada que pueden estimular la fibrosis, comprometiendo asi la integridad del tejido y funcion del organo. Una fibrosis se conoce tambien como fibrosis de organo o degeneration de organo (mencionada en Thierry J. P. et al., 2009, Cell, 139: 871-890). En tejidos fibroticos, los miofibroblastos se acumulan y segregan una cantidad excesiva de colageno que se deposita como fibras, comprometiendo asi la funcion del organo y llevando a su fallo. La fibrosis se origina de la conversion de una parte significativa de celulas epiteliales en miofibroblastos a traves de un proceso de EMT (Iwano et al., 2002 J. Clin. Invest. 110:341-50). Inicialmente demostrado en celulas diferenciadas de tubulos y conductos renales, ahora esta claro que el epitelio, endotelio, hepatocitos y cardiomiocitos de la lente pueden todos ser sometidos a EMT y contribuir significativamente a fibrosis tisular. Cada fibrosis en la que la EMT se supone o se sospecha que se produce esta abarcada dentro del campo de la divulgacion. Una condition o enfermedad asociada a la EMT segun la divulgacion tambien puede ser la cicatrization pobre de una herida, nefropatia renal diabetica, disfuncion de aloinjerto, cataratas o defectos en la formation de valvula cardiaca.

[0025] Actualmente no existe ningun medicamento conocido eficaz que se pueda utilizar para prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar especificamente un cancer asociado a la EMT en un sujeto. La invencion abarca el uso de una molecula de ARNmi o un equivalente de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 o una composition que comprende dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma o una fuente de la misma para este fin. Las moleculas de ARNmi preferidas o equivalentes o mimeticos o isomiR o fuentes de las mismas ya se han definido aqui.

[0026] Este uso incluye el aumento farmacologicamente de una actividad o el nivel de estado estable de dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma o de dicha fuente de la misma en un sujeto, en una celula de dicho sujeto, en un tejido de dicho sujeto o en el fluido corporal de dicho sujeto. En este uso, una actividad o nivel de estado estable de dicho ARNmi, o equivalente del mismo o fuente del mismo se aumenta para inducir una MET detectable en un sujeto. Una MET, transition mesenquimal a epitelial es lo contrario de una EMT. Por lo tanto, la induction de la MET es identica a la reversion de la EMT. Preferiblemente, una MET se evalua detectando un aumento de la expresion de E-cadherina epitelial y/o una reduccion de la expresion de vimentina mesenquimal usando inmunohistoquimica utilizando un anticuerpo especifico dirigido contra E-cadherina,

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vimentina mesenquimal y/o cadherina mesenquimal (2, 3) respectivamente. La evaluacion de la expresion se realiza preferiblemente en una biopsia o seccion tumoral en diferentes puntos temporales para un sujeto dado o en uno o mas puntos temporales para un sujeto dado y un control sano. La evaluacion se puede realizar en intervalos de tiempo regulares, por ejemplo cada semana, cada mes. El aumento/reduccion se puede evaluar por lo tanto regularmente, por ejemplo cada semana, cada mes. Una MET se ha detectado preferiblemente cuando durante al menos un punto temporal, se ha detectado un aumento de la expresion de E-cadherina epitelial y/o una reduccion de la expresion de vimentina mesenquimal y/o cadherina mesenquimal. Preferiblemente, una MET se ha detectado cuando durante al menos dos, tres, cuatro, cinco puntos temporales tal aumento de la expresion de E-cadherina epitelial y/o reduccion de la expresion de vimentina mesenquimal y/o cadherina mesenquimal se han detectado. Preferiblemente, un aumento de la expresion de E-cadherina epitelial significa un aumento significativo, preferiblemente un aumento de al menos 5% de la expresion usando inmunohistoquimica. Mas preferiblemente, un aumento significa un aumento de al menos 10%, aun mas preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150% o mas. Preferiblemente, una reduccion de la expresion de la vimentina mesenquimal y/o de la cadherina mesenquimal significa una reduccion significativa, preferiblemente una reduccion de al menos 5% de la expresion usando inmunohistoquimica. Mas preferiblemente, una reduccion significa una reduccion de al menos 10%, aun mas preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90% o 100%. En este caso, ninguna expresion es detectable.

[0027] Una actividad o nivel de estado estable de dicha molecula de ARNmi o un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 se puede aumentar en el nivel de la molecula de ARNmi (o equivalente o mimetico o isomiR de la misma) en si, por ejemplo proporcionando dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma a un sujeto, preferiblemente a una celula de un sujeto, o a un tejido de dicho sujeto, o a un organo de dicho sujeto o a dicho sujeto dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma siendo de una fuente exogena. Para proporcionar una molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma a partir de una fuente exogena, dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma se puede producir convenientemente por expresion de un acido nucleico que codifica dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma o que codifica una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma en una celula huesped adecuada como se describe mas adelante o como moleculas completamente sinteticas por sintesis quimica.

[0028] Preferiblemente, sin embargo, una actividad o nivel de estado estable de una molecula de ARNmi o equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma se aumenta por el reglaje del nivel de expresion de una secuencia de nucleotidos que codifica dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma o que codifica una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma. Preferiblemente, el nivel de expresion de una secuencia de nucleotidos se regula en una celula de dicho sujeto o en un tejido de dicho sujeto o en el sujeto. El nivel de expresion de una molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma o una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma se puede aumentar por introduccion de una molecula de ARNmi, o equivalente o mimetico o isomiR de la misma, o una fuente de la misma, o un constructo de expresion (o vector) en una celula, tejido, organo o fluido corporal de dicho sujeto, o en el sujeto por lo que un vector de expresion comprende una secuencia de nucleotidos que comprende una molecula de ARNmi o equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma o comprende una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma, y por lo cual una secuencia de nucleotidos esta bajo el control de un promotor capaz de dirigir la expresion de una secuencia de nucleotidos en dicha celula, tejido, organo, sujeto. El nivel de expresion de una molecula de ARNmi o equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma o fuente de la misma tambien se puede aumentar por introduccion de un constructo de expresion en una celula, tejido, organo, sujeto, por lo cual un constructo comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un factor capaz de trans-activacion de una secuencia de nucleotidos endogena que codifica una molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma.

[0029] Un uso de la invencion preferiblemente comprende la etapa de administrar a un sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que comprende un constructo de acidos nucleicos para aumentar la actividad o el nivel estable de una molecula de ARNmi o un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 o una fuente de la misma como se identifica aqui. Un constructo de acidos nucleicos puede ser un constructo de expresion como se especifica mas aqui. Preferiblemente, un constructo de expresion es un vector de terapia genica viral seleccionado de vectores de terapia genetica basados en un adenovirus, un virus adeno-asociado (AAV), un virus del herpes, un virus de la sifilis, un vector viral oncolitico y un retrovirus. Un vector de terapia genica viral preferido es un vector AAV o Lentiviral. Alternativamente, un uso de la invencion preferiblemente comprende la etapa de administracion a un sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que comprende una molecula de ARNmi o un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con

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al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 o una fuente de la misma tal y como se define aqui.

[0030] En un uso de la invencion, una celula, un tejido, un organo o fluido corporal es preferiblemente de un sujeto que se sospecha que tiene un alto riesgo de tener un cancer asociado a la EMT debido por ejemplo a su edad o a su contexto genetico o a su dieta. Alternativamente, en otra forma de realization preferida, el uso de la invencion se aplica a una celula, tejido, organo o fluido corporal de un sujeto diagnosticado con un riesgo predictivo para desarrollar mas tarde un cancer asociado a la EMT. Un metodo de diagnostico usado es preferiblemente una de las divulgaciones como se describe en este caso. Alternativamente, una celula, un tejido u organo a tratar se puede seleccionar basado en el riesgo de progresion del cancer asociado a la EMT. Tal riesgo de progresion se puede evaluar utilizando criterios patologicos clinicos tradicionales o prognosis basada en biomarcador conocidos por la persona experta. Esta abarcado tambien por la invencion la administration de una molecula de ARNmi o un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 o un precursor de la misma o una composition que comprende dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma o la fuente de la misma en un tejido o organo de dicho sujeto. Las moleculas de ARNmi preferidas o equivalentes o mimeticos o isomiR o fuentes de la misma ya se han definido aqui. En la invencion, una celula preferida, tejido u organo es una celula, tejido u organo que es o comprende una celula o tejido de vejiga o prostata o es o comprende la vejiga o prostata como organo.

[0031] Un tratamiento de un cancer asociado a la EMT puede incluir un tratamiento que previene la EMT en una celula tumoral que aun no se ha metastatizado o revierte la EMT (definida como transition mesenquimal a epitelial) en una celula tumoral que ya ha formado metastasis y/o esta migrando desde el tumor primario a sitios distantes en el cuerpo.

[0032] En otro uso, la invencion mencionada aqui se puede combinar con tratamientos estandar de cancer asociado a EMT tal como quimioterapia, radioterapia o cirugia. Ejemplos de agentes quimioterapeuticos se ejemplifican mas adelante aqui. Aunque la terapia genetica es una posibilidad para prevenir, tratar, revertir y/o retrasar un cancer asociado a EMT, otros tratamientos posibles tambien se pueden prever. Por ejemplo, el tratamiento por farmacos de "molecula pequena" para dirigir determinadas vias moleculares en la direction deseada, tambien se prefieren. Estas pequenas moleculas se identifican preferiblemente por el metodo de selection de la invencion tal y como se define mas adelante aqui.

[0033] En el contexto de la invencion, prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar un cancer asociado a EMT puede significar que:

• al menos un sintoma de este cancer ha sido mejorado, y/o

• al menos un parametro asociado a este cancer ha sido mejorado.

Un sintoma puede ser la presencia de metastasis como se explica mas adelante. Un parametro puede ser la evaluation de MET como se ha explicado anteriormente aqui. En el contexto de la invencion, prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar un cancer asociado a la EMT se puede sustituir alcanzando un efecto antitumoral. A menos que se indique lo contrario, un efecto antitumoral se evalua o detecta preferiblemente despues de al menos una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o mas en un sujeto tratado. Un efecto antitumoral se identifica preferiblemente en un sujeto como:

• una inhibition de la proliferation de celulas tumorales y/o

• un aumento en la capacidad de diferenciacion de celulas tumorales y/o

• una induction o induction aumentada de muerte de celulas tumorales y/o

• un retraso en la aparicion de metastasis y/o de migration de celulas tumorales y/o

• una inhibicion o prevention o retraso del aumento de un peso o crecimiento tumoral y/o

• una prolongation de la supervivencia del paciente de al menos un mes, varios meses o mas (en comparacion con aquellos no tratados o tratados con un control o en comparacion con el sujeto a inicio del tratamiento).

En el contexto de la invencion, un paciente puede sobrevivir y/o se puede considerar como libre de enfermedad. Alternativamente, el cancer se puede detener o retrasar. Una inhibicion de la proliferacion de celulas tumorales puede ser de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75% o mas. La proliferacion de celulas se puede evaluar utilizando tecnicas conocidas. Una induccion de la muerte de celulas tumorales puede ser de al menos 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% o mas. El crecimiento tumoral se puede inhibir al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75% o mas. La muerte de celulas tumorales se puede evaluar utilizando tecnicas conocidas por la persona experta. La muerte de celulas tumorales se puede evaluar utilizando MRI (formation de imagenes por resonancia magnetica) o CT (tomografia computarizada). En formas de

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realizacion determinadas, el aumento del peso del tumos o el crecimiento del tumor se puede inhibir al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75% o mas. El peso del tumor o el crecimiento del tumor se pueden evaluar utilizando tecnicas conocidas por la persona experta. La deteccion de crecimiento del tumor o la detection de la proliferation de celulas tumorales se puede evaluar in vivo por la medicion de cambios en la utilization de glucosa por tomografia de emision de positron con el analogo de glucosa 2-[18F]-fluor-2-deoxi-D- glucosa (FDG-PET) o [18F]-'3-fluoro-'3-deoxi-L-timidina PET. Una alternativa ex vivo puede ser la coloration de una biopsia tumoral con Ki67.

[0034] Un retraso en la aparicion de la metastasis y/o de la migration de celulas tumorales puede ser un retraso de al menos una semana, un mes, varios meses, un ano o mas tiempo. La presencia de metastasis se puede evaluar utilizando MRI, CT o ecografia o tecnicas que permitan la deteccion de celulas tumorales circulantes (CTC). Ejemplos de las ultimas pruebas son la prueba CellSearch CTC (Veridex), una selection magnetica basada en EpCam de CTCs de sangre periferica. En ciertas formas de realizacion, el crecimiento tumoral se puede retardar al menos una semana, un mes, dos meses o mas. En una forma de realizacion determinada, la aparicion de metastasis se retarda al menos una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o mas. Una molecula de ARNmi o un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma o una fuente de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o mimetico o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 se ha descubierto sorprendentemente que retrasa la aparicion de metastasis y/o la migracion de celulas tumorales de una forma mas pronunciada que el efecto correspondiente de la molecula de ARNmi de la familia 200 ya se sabia que tenia tal efecto como se muestra en el ejemplo 2, figura 6D. Por lo tanto, podemos anticipar que una molecula de ARNmi o una fuente de la misma como se identifica aqui se puede considerar como una molecula atractiva para su uso segun se identifica aqui.

[0035] Un aumento en la capacidad de diferenciacion de las celulas tumorales se pueden evaluar utilizando un marcador de diferenciacion especifico y tras la presencia de tal marcador en las celulas tratadas. Los marcadores o parametros preferidos ya han sido identificados aqui, es decir, los marcadores asociados a la MET. Esto se puede conseguir usando RT-PCR, transferencia de Western o inmunohistoquimica. Un aumento de la capacidad de diferenciacion puede ser al menos un aumento detectable despues al menos una semana de tratamiento utilizando cualquiera de las tecnicas identificadas. Preferiblemente, el aumento es de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% o mas, lo que significa que el numero de celulas diferenciadas dentro de una muestra dada aumentara en consecuencia. En formas de realizacion determinadas, el crecimiento del tumor se puede retardar al menos una semana, un mes, dos meses o mas. En una forma de realizacion determinada, la aparicion de metastasis se retarda al menos una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o mas.

[0036] En otra forma de realizacion preferida, se proporciona una composition que comprende ademas otra molecula de ARNmi seleccionada de:

a) al menos uno de ARNmi-124-1, ARNmi-206, ARNmi-181a-1, ARNmi-141, ARNmi-200a, ARNmi-200b,

ARNmi-200c, ARNmi-429 y ARNmi-205 y/o un equivalente o un mimetico o un isomiR o una fuente del

mismo.

[0037] Dado que no cada una de las moleculas de ARNmi identificadas o equivalentes o isomiRs o mimeticos de la misma esta previsto que tenga los mismos genes diana, se supone que el uso de una molecula de ARNmi o un equivalente o un isomiR o un mimetico de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 opcionalmente combinada con al menos una de la molecula de ARNmi, o equivalente o isomiR o mimetico de la misma o fuente de la misma identificada anteriormente bajo a) permite un tratamiento mas eficaz de un cancer asociado a la EMT. Las moleculas de ARNmi preferidas o equivalentes o mimeticos o isomiR o fuentes de las mismas ya se han definido aqui. Un tumor tratado por una composicion o un coctel de al menos una molecula de ARNmi o un equivalente o un isomiR o un mimetico de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 esta previsto que tenga menos posibilidades de escapar o resistir a dicho tratamiento. En otra forma de realizacion preferida, se abarca el diagnostico de la expresion de cada una de las moleculas ARNmi o de sus genes diana segun se identifica aqui y dependiendo del resultado la adaptation de la identidad de las moleculas ARNmi usadas al tratamiento.

[0038] Cuando la invention se refiere a una composicion que comprende mas de una molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico de la misma o fuente de la misma, se abarca que cada molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico de la misma o fuente de la misma pueda estar presente en cada composicion separada, cada composicion se administra consecutivamente o simultaneamente a un sujeto. Alternativamente, tambien se abarca que mas de una molecula de ARNmi o equivalente o isomiRs o mimeticos de las mismas o fuentes de las mismas este presente en una composicion tal y como se define aqui.

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[0039] En otro aspecto, se proporciona el uso de una molecula de ARNmi o un equivalente o un isomiR o un mimetico de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 o una fuente de la misma o una composicion que comprende dicha molecula de ARNmi, un equivalente o isomiR o mimetico o una fuente de la misma para la produccion de un medicamento para prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar un cancer asociado a la EMT. Cada caracteristica de este otro aspecto se ha descrito ya aqui.

[0040] En otro aspecto de la divulgacion, se proporciona un metodo para prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar un asociado a la EMT por la administracion de una molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico de la misma o fuente de la misma o composicion como se ha definido en la presente anteriormente a un sujeto que lo necesita. Cada caracteristica de este otro aspecto ya se ha descrito aqui. En otro aspecto de la divulgacion, se proporciona un metodo para diagnosticar la EMT o una enfermedad o condicion asociada a la EMT en un sujeto, el metodo incluye las etapas de:

(a) determinar el nivel de expresion de una molecula de ARNmi o un equivalente o isomiR o mimetico de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 o una fuente de la misma en un sujeto, y opcionalmente

(b) comparar el nivel de expresion de dicha molecula o equivalente de la misma o fuente de la misma tal y como se define en (a) con un valor de referencia para el nivel de expresion de dicha molecula, equivalente isomiR, mimetico o fuente de la misma, el valor de referencia preferiblemente es el valor medio para el nivel de expresion de dicha molecula, equivalente, isomiR, mimetico o fuente de la misma en un sujeto sano.

En el contexto de la divulgacion, diagnostico significa bien una estimacion de riesgos predictiva de un sujeto para el desarrollo de una enfermedad o condicion asociada a la EMT o para el desarrollo de la propia EMT. En el contexto de la divulgacion, un sujeto puede ser un animal. Preferiblemente un sujeto es un mamifero. El mamifero preferido es un ser humano. Preferiblemente, un sujeto es un ser humano. Ya que los niveles de expresion de estas secuencias de nucleotidos y/o cantidades de molecula de ARNmi correspondientes o equivalentes o isomiR o mimeticos de las mismas o fuente de las mismas pueden ser dificiles de medir en un sujeto, se usa preferiblemente una muestra de un sujeto. Segun otra forma de realizacion preferida, el nivel de expresion (de una secuencia de nucleotidos o molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico o fuente de la misma) se determina ex vivo en una muestra obtenida de un sujeto. La muestra preferiblemente comprende un fluido corporal de un sujeto. Un fluido corporal puede comprender o derivar de la sangre, suero, plasma, deposicion, orina o una biopsia de tejido o una biopsia tumoral o un tejido canceroso de origen epitelial de un sujeto. El tejido preferido es vejiga o prostata. Concretamente se contempla que la invention puede utilizarse para evaluar o diagnosticar diferencias entre etapas de la enfermedad o condicion asociada a la EMT, tal como entre pre-cancer y cancer, o entre un tumor primario y un tumor metastatizado.

[0041] Un aumento o reduction en el nivel de expresion de una secuencia de nucleotidos (o nivel estable de la molecula de ARNmi codificada o equivalente o isomiR o mimetico o fuente de la misma) se define preferiblemente como un cambio detectable del nivel de expresion de un nucleotido (o nivel estable de una molecula de ARNmi codificada o equivalente o isomiR o mimetico o fuente de la misma o cualquier cambio detectable en una actividad biologica de una molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico o fuente de la misma) utilizando un metodo tal y como se ha definido anteriormente en comparacion con el nivel de expresion de una secuencia de nucleotidos correspondiente (o nivel estable de una molecula de ARNmi codificada correspondiente o equivalente o isomiR o mimetico o fuente de la misma) en un sujeto sano. Una secuencia de nucleotidos preferida es una secuencia que codifica un precursor de una molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico de la misma o una secuencia precursora de una molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico de la misma. Segun una forma de realizacion preferida, un aumento o reduccion de una actividad ARNmi se cuantifica utilizando un ensayo especifico para una actividad de ARNmi. Un ensayo preferido es la evaluation de MET como se ha definido en la presente anteriormente.

[0042] Preferiblemente, una reduccion del nivel de expresion de una secuencia de nucleotidos significa una reduccion de al menos 5% del nivel de expresion de la secuencia de nucleotidos usando matrices. Mas preferiblemente, una reduccion del nivel de expresion de una secuencia de nucleotidos significa una reduccion de al menos 10%, aun mas preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90% o 100%. En este caso, no hay expresion detectable.

[0043] Preferiblemente, una reduccion del nivel de expresion de una molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico o fuente de la misma significa una reduccion de al menos 5% del nivel de expresion del ARNmi usando qPCR, micromatrices o analisis de Northernblot. Preferiblemente qPCR es RT qPCR de tallo-bucle. Mas preferiblemente, una reduccion del nivel de expresion de una molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico o fuente de la misma significa una reduccion de al menos 10%, aun mas preferiblemente al menos

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20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90% o 100 %. En este caso, no hay expresion detectable.

[0044] Preferiblemente, una reduccion de una actividad de ARNmi se refiere a una reduction de al menos 5% de una actividad de ARNmi utilizando un ensayo adecuado. Mas preferiblemente, una reduccion de una actividad ARNmi se refiere a una reduccion de al menos 10%, aun mas preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90% o 100%. En este caso, no hay expresion detectable.

[0045] Preferiblemente, un aumento del nivel de expresion de una secuencia de nucleotidos significa un aumento de al menos 5% del nivel de expresion de la secuencia de nucleotidos utilizando cualquiera de las tecnicas mencionadas aqui. Mas preferiblemente, un aumento del nivel de expresion de una secuencia de nucleotidos significa un aumento de al menos 10%, aun mas preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150% o mas.

[0046] Preferiblemente, un aumento del nivel de expresion de una molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico o fuente de la misma significa un aumento de al menos 5% del nivel de expresion de la molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico o fuente de la misma usando RT-qPCR, preferiblemente RT qPCR tallo-bucle. Mas preferiblemente, un aumento del nivel de expresion de una molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico o fuente de la misma significa un aumento de al menos 10%, aun mas preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150% o mas.

[0047] Preferiblemente, un aumento de una actividad de ARNmi significa un aumento de al menos 5% de una actividad ARNmi utilizando un ensayo adecuado. Mas preferiblemente, un aumento de una actividad de ARNmi significa un aumento de al menos 10%, aun mas preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150% o mas.

[0048] Preferiblemente, un nivel de expresion se determina ex vivo en una muestra obtenida de un sujeto. Mas preferiblemente, la muestra es tal y como se ha definido en la presente anteriormente y donde posteriormente, una secuencia de nucleotidos dada y/o molecula de ARNmi o equivalente o isomiR o mimetico o fuente de la misma es extraida y purificada usando metodos conocidos a la persona experta. Mas preferiblemente, la muestra es o comprende o se deriva de una biopsia tumoral, sangre u orina.

[0049] En un metodo de diagnostico de la divulgation preferiblemente el nivel de expresion de mas de uno, mas preferiblemente de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 moleculas de ARNmi o equivalentes o isomiRs o mimeticos o fuentes de las mismas y/o los niveles estables de la molecula de ARNmi correspondientes o equivalentes o isomiRs o mimeticos o fuentes de las mismas son determinados.

[0050] Por consiguiente en un metodo preferido, en la etapa (a) se determina el nivel de expresion de otra molecula de ARNmi o equivalente o fuente de la misma seleccionada de:

(a) al menos uno de ARNmi-124-1, ARNmi-206, ARNmi-181a-1, ARNmi-141, ARNmi-200a, ARNmi-200b, ARNmi-200c, ARNmi-429 and ARNmi-205 y/o un equivalente o una fuente de la misma.

En otro metodo preferido, la EMT o una enfermedad o condition asociada a la EMT se diagnostica cuando la comparacion conduce al hallazgo de una reduccion del nivel de expresion de dicha molecula de ARNmi o un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1. Las moleculas de ARNmi mas preferidas o unos equivalentes o mimeticos o isomiRs o fuentes de las mismas se han definido aqui anteriormente.

[0051] En otro metodo preferido, la EMT o una enfermedad o condicion asociada a la EMT se diagnostica cuando la comparacion conduce al hallazgo de una reduccion del nivel de expresion de la molecula de ARNmi o un equivalente de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 o una fuente de la misma y una reduccion del nivel de expresion de al menos uno de otro ARNmi seleccionado de:

(a) al menos uno de ARNmi-124-1, ARNmi-206, ARNmi-181a-1, ARNmi-141, ARNmi-200a, ARNmi-200b, ARNmi-200c, ARNmi-429 and ARNmi-205 y/o un equivalente o un mimetico o un isomiR o una fuente del mismo.

[0052] En otro aspecto de la invention, se proporciona un metodo para la identification de una sustancia o una molecula capaz de prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar un cancer asociado a la EMT induciendo un proceso de MET en un sujeto, el metodo incluye las etapas de:

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(a) proporcionar una poblacion de celula de prueba capaz de expresar una molecula de ARNmi o un equivalente o un isomiR de la misma, donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 o fuente de la misma, preferiblemente la poblacion de prueba comprende celulas de vejiga o prostata, y/o la poblacion de celula de prueba comprende celulas cancerosas y/o la poblacion de celula de prueba comprende celulas mamiferas, y/o la poblacion de celula de prueba comprende celulas humanas;

(b) poner en contacto la poblacion de celulas de prueba con la sustancia;

(c) determinar el nivel de expresion de dicha molecula de ARNmi o equivalente o isomiR de la misma o fuente de la misma o la actividad o nivel estable de dicha molecula de ARNmi o equivalente o isomiR de la misma o fuente de la misma en la poblacion de celulas de prueba en contacto con la sustancia;

(d) comparar la expresion, actividad o nivel estable determinado en (c) con la expresion, actividad o nivel estable de dicha molecula de ARNmi o equivalente o isomiR de la misma o fuente de la misma en una poblacion de celulas de prueba que no esta en contacto con la sustancia; y,

(e) identificar una sustancia que produce una diferencia en el nivel de expresion, actividad o nivel estable de dicha molecula de ARNmi o equivalente o isomiR de la misma o fuente de la misma, entre la poblacion de celulas de prueba que esta en contacto con la sustancia y la poblacion de celulas de prueba que no esta en contacto con la sustancia.

[0053] Preferiblemente, en el paso a), una celula de prueba comprende un constructo de acidos nucleicos que comprende una fuente o un precursor de una molecula de ARNmi o un equivalente o un isomiR de la misma donde una fuente o un precursor de dicha molecula de ARNmi o equivalente o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1. Las moleculas de ARNmi mas preferidas o unos equivalentes o isomiRs o fuentes de las mismas se han definido todos aqui anteriormente. Mas preferiblemente, una celula de prueba comprende un constructo de luciferasa de luciernaga impulsado por un promotor de CDH1. Preferiblemente, en un metodo los niveles de expresion, una actividad o niveles de estado estable superiores a los de una secuencia de nucleotidos o mayores que una molecula de ARNmi, equivalente o isomiR o fuente del mismo se comparan. Preferiblemente, en un metodo, una poblacion de celulas de prueba comprende celulas mamiferas, mas preferiblemente celulas humanas. Aun mas preferiblemente, una poblacion de celulas de prueba comprende celulas de vejiga o prostata. Una poblacion de celulas de prueba preferida no expresa una molecula de ARNmi o un equivalente o un isomiR de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con la unidad representada por SEQ ID NO: 1 o fuente de la misma o tiene una expresion reducida en comparacion con un homologo epitelial normal que expresa CDH1. Mas preferiblemente, una poblacion de celulas de prueba comprende una celula mesenquimal con baja expresion de CDH1, pero es capaz de expresar CDH1. Alternativamente o ademas de las celulas mencionadas anteriormente, en un aspecto la invencion tambien se refiere a una sustancia que se identifica en los metodos anteriormente mencionados. En un metodo preferido, los niveles de expresion, actividades o niveles estables de al menos otra molecula de ARNmi o isomiR o fuente de la misma se compara, preferiblemente donde la otra molecula de ARNmi o isomiR o fuente de la misma se selecciona de:

(a) al menos uno de ARNmi-124-1, ARNmi-206, ARNmi-181a-1, ARNmi-141, ARNmi-200a, ARNmi-200b, ARNmi-200c, ARNmi-429 y ARNmi-205 y/o un isomiR o una fuente del mismo.

Definiciones generales y tecnologias generales a las que se hace referencia aqui

[0054] Las moleculas de microARN ("ARNmi") son generalmente de 21 a 22 nucleotidos de longitud, aunque longitudes de 17 y hasta 25 nucleotidos se han descrito. Cualquier longitud de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 esta por lo tanto abarcada en la presente invencion. Los ARNmi se procesan cada uno a partir de una molecula de ARN precursora mas larga ("ARNmi precursor"). Los ARNmi precursores se transcriben a partir de genes no codificantes de proteina. Un precursor puede tener una longitud de al menos 50, 70, 75, 80, 85, 100, 150, 200 nucleotidos o mas. Los ARNmi precursores tienen dos regiones de complementariedad que les habilita para formar una estructura de tipo tallo-bucle o plegada hacia atras, que es escindida por enzimas llamadas Dicer y Drosha en animales. Dicer y Drosha son nucleasas de tipo ribonucleasas Ill. El ARNmi procesado es tipicamente una porcion del tallo. El ARNmi procesado (tambien denominado "ARNmi maduro") se vuelve parte de un complejo grande, conocido como el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), complejo para (infra)- regular un gen objetivo particular. Ejemplos de ARNmi animal incluyen aquellos que perfecta o imperfectamente hacen par de base con el ARNm objetivo, dando como resultado bien la degradacion de ARNm o la inhibition de la traduction respectivamente (Olsen et al., 1999; Seggerson et al., 2002). Las moleculas ARNsi tambien son procesadas por Dicer, pero a partir de una molecula de ARN larga bicatenaria. Los ARNsi no se encuentran naturalmente en celulas animales, pero pueden funcionar en tales celulas en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) para dirigir la escision especifica de secuencia de un ARNm objetivo (Denli et al., 2003).

[0055] El estudio de moleculas de ARNmi endogenas se describe en la solicitud de patente de EE.UU. 2008/0171667. Un ARNmi esta aparentemente activo en la celula cuando el ARN maduro monocatenario es

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ligado por un complejo de proteina que regula la traduccion de ARNm que hibridan al ARNmi. Introducir moleculas ARN exogenas que afectan a celulas de la misma manera que los ARNmi expresados endogenamente requiere que una molecula de ARN monocatenaria de la misma secuencia que el ARNmi maduro endogeno sea absorbida por el complejo de proteina que facilita el control traduccional. Una variedad de disenos de molecula de ARN se han evaluado. Tres disenos generales que maximizan la absorcion del ARNmi monocatenario deseado por la ruta de ARNmi han sido identificados. Una molecula de ARN con una secuencia de ARNmi que tiene al menos uno de los tres disenos se puede denominar como un ARNmi sintetico. Las moleculas de ARNmi de la invencion pueden reemplazar o suplementar la actividad de silenciamiento genico de un ARNmi endogeno. Un ejemplo de tales moleculas, caracteristicas preferidas y modificaciones de tales moleculas y composiciones que comprenden tales moleculas se describe en la WO2009/091982.

[0056] Moleculas de ARNmi de la invencion o equivalentes o fuente de las mismas comprenden, en algunas formas de realizacion, dos moleculas de ARN donde un ARN es identico a un ARNmi de origen natural maduro. La molecula de ARN que es identica a un ARNmi maduro se denomina cadena activa. La segunda molecula de ARN, denominada cadena complementaria, es al menos complementaria parcialmente a la cadena activa. Las cadenas activas y complementarias se hibridizan para crear un ARN bicatenario, que es similar al precursor de ARNmi de origen natural que es ligado por el complejo de proteina inmediatamente antes de la activacion del ARNmi en la celula. Maximizar la actividad de dicho ARNmi requiere maximizar la absorcion de la cadena activa y minimizar la absorcion de la cadena complementaria por el complejo de proteina de ARNmi que regula la expresion genica en el nivel de traduccion. Los disenos moleculares que proporcionan actividad de ARNmi optima implican modificaciones de la cadena complementaria. Dos disenos incorporan modificaciones quimicas de la cadena complementaria. La primera modificacion implica la creacion de un ARN complementario con un grupo diferente de un fosfato o hidroxilo en su 5' termino. La presencia de la modificacion 5' elimina aparentemente la absorcion de la cadena complementaria y favorece posteriormente la absorcion de la cadena activa por el complejo de proteina de ARNmi. La modificacion 5' puede ser cualquiera de una variedad de moleculas que incluyen NH2, NHCOCH3, biotina y otros. La segunda estrategia de modificacion quimica que reduce significativamente la absorcion de la cadena complementaria por la ruta de ARNmi es la incorporation de nucleotidos con modificaciones de azucar en los primeros 2-6 nucleotidos de la cadena complementaria. Debe observarse que las modificaciones de azucar de acuerdo con la segunda estrategia de diseno se pueden acoplar con modificaciones en el terminal 5' de acuerdo con la primera estrategia de diseno para mejorar adicionalmente las actividades de ARNmi. El tercer diseno de ARNmi implica la incorporacion de nucleotidos en el extremo 3' de la cadena complementaria que no son complementario de la cadena activa. Hibridos de los ARN activos resultantes y complementarios son muy estables en el extremo 3' de la cadena activa pero relativamente inestables en el extremo 5' de la cadena activa. Estudios con ARNsi indican que la estabilidad de hibridos 5' es un indicador clave de absorcion de ARN por el complejo de proteina que sostiene la interferencia de ARN, que esta al menos relacionada con la ruta de ARNmi en las celulas. Los inventores descubrieron que el uso juicioso de desapareamientos en la cadena de ARN complementaria mejora significativamente la actividad de dicho ARNmi.

Bibliotecas de ARNmi

[0057] En la divulgation, una aplicacion clave para los ARNmi segun se identifica aqui es la evaluation o diagnostico de la presencia de un individual o grupos de ARNmi en una muestra. Poblaciones de celulas con cada uno de los ARNmi diferentes se pueden despues evaluar para identificar ARNmi cuya presencia afecta a un fenotipo celular (es decir, EMT). El numero de diferentes ARNmi en las bibliotecas es variable. Se contempla que puede haber, al menos, o como mucho 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mas, o cualquier gama derivable en esta, moleculas especificas de ARNmi diferentes en la biblioteca. En formas de realization especificas, las bibliotecas tienen de 1 a 20 moleculas especificas de ARNmi diferentes, o de 5 a 20 moleculas especificas de ARNmi diferentes. Las moleculas especificas de ARNmi "diferentes" se refieren a acidos nucleicos que especificamente codifican ARNmi con secuencias diferentes.

[0058] Los ARNmi se contemplan por estar hechos principalmente de ARN, aunque en algunas formas de realizacion, pueden ser ARN, analogos de nucleotido, tales como acidos nucleicos bloqueados (LNA) o acidos nucleicos desbloqueados (UNA), ADN, o cualquier combination de ADN, ARN, analogos de nucleotidos, y PNAs (acidos nucleicos de peptido). Por consiguiente, se entiende que la biblioteca contiene uno o mas acidos nucleicos para estos ARNmi diferentes. En formas de realizacion especificas, la biblioteca es especifica para ARNmi humanos, aunque bibliotecas para organismos multiples se contemplan.

[0059] Una molecula de ARN de la invencion tiene o comprende o consiste en una region de ARNmi. En formas de realizacion especificas, una molecula de ARNmi o equivalente de la misma tiene una secuencia que deriva de cualquiera de SEQ ID NO: 2-21 inclusive (tabla 3). Se contempla particularmente que las moleculas de acido nucleico de la invencion se pueden derivar de cualquiera de las secuencias de ARNmi maduro en las SEQ ID NOs: 2-21.

[0060] Una molecula de ARNmi o equivalente de la misma incluira una secuencia que se extiende al menos de 1 a 5 nucleotidos de secuencia codificante arriba y/o abajo de la secuencia de ARNmi predicha. En algunas formas

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de realizacion, las moleculas tienen hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o mas nucleotidos contiguos, o cualquier gama derivable de la misma, que flanquean la secuencia que codifica del ARNmi procesado predominante en uno o ambos lados (extremo 5' y/o 3').

[0061] Bibliotecas de la divulgacion pueden contener secuencias de ARNmi de cualquier organismo que tiene ARNmi, especificamente incluyendo pero no limitado a, mamiferos tales como seres humanos, primates no humanos, ratas y ratones. Especificamente se contemplan las bibliotecas que tienen, tienen al menos, o tienen como mucho 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mas ARNmi diferentes (esto es, moleculas especificas de ARNmi que tienen secuencias diferentes derivadas de distintos genes de ARNmi). Especificamente se contemplan tales bibliotecas descritas en la frase precedente con respecto a cualquiera de las SEQ ID NO: 2-21 particularmente aquellas correspondientes a las secuencias de ARNmi (secuencia madura).

Acidos nucleicos

[0062] La presente invention se refiere a moleculas de acidos nucleicos tambien llamadas fuentes o precursores de ARNmi que pueden introducir ARNmi en celulas cultivadas o en un sujeto. Los acidos nucleicos se pueden producir en celulas o in vitro por enzimas purificadas aunque se producen preferentemente por sintesis quimica. Pueden ser crudos o purificados. El termino "ARNmi", a menos que se indique de otro modo, se refiere al ARNmi procesado, despues de que se haya escindido de su precursor. La tabla 2 indica que SEQ ID NO corresponde a una secuencia precursora particular de un ARNmi (SEQ ID NO: 22-35 y la tabla 3 que SEQ ID NO corresponde a la secuencia madura de un ARNmi (SEQ ID NO: 2-21). La tabla 4 identifica las secuencias de ADN clonadas en el vector lentiviral (SEQ ID NO: 36-47, que fueron usadas en la pantalla funcional como se describe en los ejemplos. La tabla 5 identifica la secuencia semilla preferida (como SEQ ID NO: 87-107) de cada uno de los ARNmi maduros de la tabla 3. El nombre del ARNmi se abrevia frecuentemente y se menciona sin el prefijo y se entendera como tal, dependiendo del contexto. A menos que se indique lo contrario, los ARNmi mencionados en la solicitud son secuencias humanas identificadas como mir-X o let-X, donde X es un numero y/o letra.

[0063] Se entiende que un ARNmi se deriva de secuencias genomicas o un gen no codificante. En este aspecto, el termino "gen" se usa por simplicidad para referirse a la secuencia genomica que codifica el ARNmi precursor para un ARNmi dado. Sin embargo, formas de realizacion de la invencion pueden implicar secuencias genomicas de un ARNmi que esta implicado en su expresion, tal como un promotor u otras secuencias reguladoras.

[0064] El termino "recombinante" se puede utilizar y generalmente se refiere a una molecula que ha sido manipulada in vitro o que es el producto replicado o expresado de tal molecula.

[0065] El termino "acido nucleico" es bien conocido en la tecnica. Un "acido nucleico" como se utiliza en este caso generalmente se refiere a una molecula (una o mas cadenas) de ADN, ARN o un derivado o analogo de la misma, que comprende una nucleobase. Una nucleobase incluye, por ejemplo, una purina de origen natural o base de pirimidina encontrada en el ADN (por ejemplo, una adenina "A", a guanina " G", a timina " T" o una citosina "C") o ARN (por ejemplo, un A, un G, un uracilo "U" o un C). El termino "acido nucleico" abarca los terminos "oligonucleotido" y "polinucleotido", cada uno como un subgenero del termino "acido nucleico".

[0066] El termino "ARNmi" generalmente se refiere a una molecula monocatenaria, pero en formas de realizacion especificas, moleculas implementadas en la invencion tambien abarcaran una region o una cadena adicional que es parcialmente (entre 10 y 50% complementaria a traves de la longitud de la cadena), sustancialmente (mas de 50% pero menos del 100% complementaria a traves de la longitud de la cadena) o complementaria completamente de otra region de la misma molecula monocatenaria o de otro acido nucleico. Asi, los acidos nucleicos pueden abarcar una molecula que comprende una o mas cadena(s) complementarias o autocomplementarias o "complemento(s)" de una secuencia particular que comprende una molecula. Por ejemplo, el ARNmi precursor puede tener una region autocomplementaria, que es hasta 100% complementaria.

[0067] Como se utiliza en este caso, "hibridacion", "hibridiza" o "capaz de hibridar" se entiende que se refiere a la formacion de un molecula de cadena doble o triple o una molecula con naturaleza de cadena parcial doble o triple usando tecnicas conocidas por la persona experta tales como procedimientos transferencia de Southern. El termino "recocimiento" como se utiliza en este caso es sinonimo de "hibridar". El termino "hibridacion", "hibridiza" o "capaz de hibridacion" puede significar condiciones de hibridacion "baja", "media" o "alta" tal y como se define por debajo.

[0068] Las condiciones de astringencia baja a media a alta significa pre-hibridacion e hibridacion a 42°C en 5X SSPE, 0,3% SDS, 200pg/ml de ADN de esperma de salmon cortado y desnaturalizado, y bien 25% 35% o 50% de formamida para astringencias bajas a medias a altas respectivamente. Posteriormente, la reaction de hibridacion es lavada tres veces durante 30 minutos cada una utilizando 2XSSC, 0,2% SDS y bien 55 °C, 65 °C, o 75 °C para astringencias de bajas a medias a altas.

[0069] Acidos nucleicos o derivados de los mismos de la invencion comprenderan, en algunas formas de realizacion la secuencia ARNmi de cualquier ARNmi descrito en SEQ ID NOs: 2-21 o son descritos en SEQ ID

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NO: 22-35 o en SEQ ID NO: 36-47. Se contempla que secuencias de acidos nucleicos de la invention derivadas de SEQ ID NO: 2-21 pueden tener, tener al menos, o tener como mucho 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, nucleotidos contiguos de SEQ ID NOs: 2-21 (o cualquier gama derivable de ello). En otras formas de realization, los acidos nucleicos son, son al menos, o son como mucho 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% identicos a la secuencia de ARNmi de SEQ ID NOs: 2-21 o a la secuencia precursora de cualquiera de las SEQ ID NOs: 22-35 o cualquier combination o gama derivable de ellas.

Nucleobases

[0070] Como se utiliza en este caso una "nucleobase" se refiere a una base heterociclica, tal como por ejemplo una nucleobase de origen natural (es decir, una A, T, G, C o U) encontrada en al menos un acido nucleico de origen natural (es decir, ADN y ARN), y derivado(s) y analogos de origen natural o no de tal nucleobase. Una nucleobase generalmente puede formar uno o mas enlaces de hidrogeno ("recocer" o "hibridar") con al menos una nucleobase de origen natural de manera que pueda sustituirse por emparejamientos de nucleobases de origen natural (por ejemplo, la union de hidrogeno entre A y T, G y C, y A y U).

[0071] Las nucleobases de "purina" y/o "pirimidina" abarcan nucleobases de purina y/o pirimidina de origen natural y tambien derivado(s) y analogo(s) de las mismas, incluyendo pero no limitado a, las que tienen una purina o pirimidina sustituida por una o mas fracciones de un alquilo, caboxialquilo, amino, hidroxilo, halogeno (es decir, fluoro, cloro, bromo o yodo), tiol o alquiltiol. Las fracciones preferidas de alquilo (por ejemplo, alquilo, caboxialquilo, etc.) comprenden de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, a aproximadamente 6 atomos de carbono. Otros ejemplos no limitativos de una purina o pirimidina incluyen una deazapurina, una 2,6-diaminopurina, un 5-fluorouracil, una xantina, una hipoxantina, una 8- bromoguanina, un 8-cloroguanina, una bromotimina, una 8-aminoguanina, una 8- hidroxiguanina, una 8-metilguanina, una 8-tioguanina, una azaguanina, una 2- aminopurina, una 5-etilcitosina, una 5-metilciosina, un 5-bromouracil, un 5-etiluracil, un 5-iodouracil, un 5-clorouracil, un 5-propiluracil, un tiouracil, una 2-metiladenina, una metiltioadenina, una N,N-diemetiladenina, unas azaadeninas, una 8- bromoadenina, una 8-hidroxiadenina, una 6-hidroxiaminopurina, una 6-tiopurina, una 4-(6- aminohexil/citosina) y similares.

Otros ejemplos son conocidos por los de habilidad en la tecnica.

[0072] Una nucleobase puede estar comprendida en un nucleosido o nucleotido, utilizando cualquier metodo de sintesis quimica o natural descrito aqui o conocido por uno de habilidad ordinaria en la tecnica. Tal nucleobase se puede marcar o puede ser parte de una molecula que esta marcada y contiene la nucleobase.

Nucleosidos

[0073] Como se utiliza en este caso, un "nucleosido" se refiere a una unidad quimica individual que comprende una nucleobase de manera covalente fijada a una fraction enlazadora de nucleobase. Un ejemplo no limitativo de una "fraccion enlazadora de nucleobase" es un azucar que comprende atomos de 5 carbonos (es decir, un "azucar de 5 carbonos"), incluyendo pero no limitado a una deoxiribosa, una ribosa, una arabinosa, o un derivado o un analogo de un azucar de 5 carbonos. Ejemplos no limitativos de un derivado o un analogo de un azucar de 5 carbonos incluyen un 2'-fluoro-2'-deoxiribosa o un azucar carbociclico donde un carbono se sustituye para un atomo de oxigeno en el anillo de azucar.

[0074] Diferentes tipos de fijacion(es) covalente(s) de una nucleobase a una fraccion enlazadora de nucleobase se conocen en la tecnica. A modo de ejemplo no limitativo, un nucleosido que comprende una nucleobase de una purina (es decir, A o G) o una 7-deazapurina de manera covalente tipicamente agrega la position 9 de una purina o una 7-deazapurina a la posicion I' de un azucar de 5 carbonos. En otro ejemplo no limitativo, un nucleosido que comprende una nucleobase de pirimidina (es decir, C, T o U) de manera covalente tipicamente agrega una posicion 1 de una pirimidina a una posicion I' de un azucar de 5 carbonos (Kornberg and Baker, 1992).

Nucleotidos

[0075] Como se utiliza en este caso, un "nucleotido" se refiere a un nucleosido que comprende ademas un "fraccion de estructura". Una fraccion de estructura de manera covalente generalmente agrega un nucleotido a otra molecula que comprende un nucleotido, o a otro nucleotido para formar un acido nucleico. La "fraccion de estructura" en los nucleotidos de origen natural tipicamente comprende una fraccion de fosforo, que esta de manera covalente unida a un azucar de 5 carbonos. La union de la fraccion de estructura ocurre tipicamente en la posicion 3' o 5' del azucar de 5 carbonos. Sin embargo, otros tipos de uniones se conocen en la tecnica, particularmente cuando un nucleotido comprende derivados o analogos de un azucar de 5 carbonos de origen natural o fraccion de fosforo.

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Analogos de acido nucleico

[0076] Un acido nucleico puede comprender, o estar compuesto totalmente por, un derivado o analogo de una nucleobase, una fraccion enlazadora de nucleobase y/o fraccion de estructura que puede estar presente en un acido nucleico de origen natural. ARN con analogos de acido nucleico tambien se puede marcar segun metodos de la invencion. Como se utiliza en este caso un "derivado" se refiere a una forma modificada quimicamente o alterada de una molecula de origen natural, mientras que los terminos " mimetico" o "analogo" se refieren a una molecula que puede parecerse o no estructuralmente a una molecula de origen natural o fraccion, pero posee funciones similares. Como se utiliza en este caso, una "fraccion" generalmente se refiere a un componente quimico o molecular menor de una estructura quimica o molecular mayor. Los analogos o derivados de nucleobases, nucleosidos y nucleotidos se conocen bien en la tecnica, y se han descrito (vease, por ejemplo, Scheit, 1980).

[0077] Ejemplos no limitativos adicionales de nucleosidos, nucleotidos o acidos nucleicos que comprenden azucar de 5 carbonos y/o derivados o analogos de fraccion de estructura, incluyen los de: la patente de EE.UU. n° 5.681.947, que describe oligonucleotidos que comprenden derivados de purina con los que forman helices triples y/o previenen la expresion de dsADN; las patentes estadounidenses 5.652.099 y 5.763.167, que describen acidos nucleicos que incorporan analogos fluorescentes de nucleosidos que se encuentran en el ADN o el ARN, particularmente para su uso como sondas de acidos nucleicos fluorescentes; la patente estadounidense 5.614.617, que describe analogos de oligonucleotidos con sustituciones en los anillos de pirimidina que poseen estabilidad de nucleasa mejorada; las patentes estadounidenses 5.670.663, 5.872.232 y 5.859.221, que describen analogos de oligonucleotidos con azucares de 5 carbonos modificados (es decir, fracciones de T- deoxifuranosilo modificadas) usadas en deteccion de acidos nucleicos; la patente estadounidense 5.446.137, que describe oligonucleotidos que comprenden al menos una fraccion de azucar de 5 carbonos sustituida en la posicion 4' con un sustituyente diferente del hidrogeno que se puede usar en ensayos de hibridacion; la patente estadounidense 5.886.165, que describe oligonucleotidos con ambos deoxiribonucleotidos con enlaces de internucleotidos 3'-5' y ribonucleotidos con enlaces de internucleotidos 2'-5'; la patente estadounidense 5.714.606, que describe una union de internucleotido modificado donde un oxigeno en la posicion 3' de la union de internucleotido se sustituye por un carbono para mejorar la resistencia a la nucleasa de los acidos nucleicos; la patente estadounidense 5.672.697, que describe oligonucleotidos que contienen uno o mas enlaces de internucleotidos de fosfonato de metileno que mejoran la resistencia a la nucleasa; las patentes estadounidenses 5.466.786 y 5.792.847, que describen la union de una fraccion sustituyente que puede comprender un medicamento o marcador para el carbono 2' de un oligonucleotido para proporcionar estabilidad de nucleasa mejorada y capacidad para entregar farmacos o fracciones de deteccion; la patente estadounidense 5.223.618, que describe analogos de oligonucleotidos con una union de estructura de carbono 2' o 3' que une la posicion 4' y la posicion 3' de la fraccion de azucar de 5 carbonos adyacente para captacion celular mejorada, resistencia a nucleasas e hibridacion a ARN diana; la patente estadounidense 5.470.967, que describe oligonucleotidos que comprenden al menos una union de internucleotido de sulfamato o sulfamida que son utiles como sonda de hibridacion de acido nucleico; las patentes estadounidenses 5.378.825, 5.777.092, 5.623.070, 5.610.289 y 5.602.240, que describen oligonucleotidos con fraccion enlazadora de tres o cuatro atomos que remplaza la fraccion de estructura de fosfodiester usada para resistencia a la nucleasa mejorada, absorcion celular y regular la expresion de ARN; la patente estadounidense 5.858.988, que describe el agente portador hidrofobico fijado a la posicion 2'-0 de los oligonucleotidos para mejorar su permeabilidad de membrana y estabilidad; la patente estadounidense 5.214.136, que describe oligonucleotidos conjugados a antraquinona en el termino 5' que poseen hibridacion mejorada a ADN o ARN; estabilidad mejorada a nucleasas; la patente estadounidense 5.700.922, que describe quimeras PNA-DNA-PNA donde el ADN comprende nucleotidos de 2'-deoxi-eritro- pentofuranosil para resistencia a la nucleasa mejorada, afinidad de enlace, y capacidad para activar ribonucleasa H; y WO98WO98/39352, WO99/14226, WO2003/95467 y WO2007/085485, que describen nucleotidos de ARN modificados de los cuales la fraccion de ribosa se modifica con un puente extra que conecta el oxigeno 2' y el carbono 4'. La ribosa bloqueada aumenta significativamente la afinidad de enlace y la especificidad; y la WO2008/147824, que describe nucleotidos de ARN modificado denominados UNA (acido nucleico desbloqueado). Los UNA son analogos acilicos de ARN en los que el enlace entre los atomos C2' y C3' han sido escindidos, mermando la afinidad de enlace hacia una cadena complementaria. Los UNA son compatibles con el reconocimiento de ribonucleasa H y la escision de ARN y mejoran el silenciamiento genico mediado por ARNsi; la WO2008/036127 que describe analogos de acido nucleico de morfolino, que contienen tanto enlaces de intersubunidad sin carga y cationicos; la WO/2007/069092 y la EP2075342 que describen acidos nucleicos de cremallera (ZNA), que contienen derivados de espermina conjugantes como fracciones cationicas (unidades Z) para un oligonucleotido; la patente estadounidense 5.708.154, que describe ARN enlazado a un ADN para formar un hibrido de ADN-ARN; la patente estadounidense 5.728.525, que describe el marcaje de analogos de nucleosidos con una marcador fluorescente universal.

[0078] Instrucciones adicionales para analogos de nucleosidos y analogos de acido nucleico son la patente estadounidense 5.728.525, que describe analogos de nucleosidos que estan marcado en el extremo; las patentes estadounidenses 5.637.683, 6.251.666 (sustituciones de L-nucleotidos), y 5.480.980 (nucleotidos de 7- deaza-2'-deoxiguanosina y analogos de acido nucleico de los mismos).

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[0079] El uso de otros analogos se contempla especificamente para su uso en el contexto de la presente invention. Tales analogos se pueden utilizar en las moleculas de acido nucleico sinteticas de la invention, tanto en toda la molecula como en nucleotidos seleccionados. Incluyen, pero de forma no limitativa,

1) modificaciones de ribosa (tales como 2'F, 2' NH2, 2'N3, 4'thio o 2' O-CH3) y

2) modificaciones de fosfato (tales como las que se encuentran en fosforotioatos, metil fosfonatos y fosforoboratos).

Tales analogos han sido creados para conferir estabilidad en los ARN reduciendo o eliminando su capacidad para ser escindidos por las ribonucleasas. Cuando estos analogos de nucleotido estan presentes en los ARN, pueden tener efectos profundamente positivos en la estabilidad de los ARN en animales. Se contempla que el uso de analogos de nucleotidos se puede usar solo o conjuntamente con cualquiera de las modificaciones de diseno de un ARNmi sintetico para cualquier acido nucleico de la invencion.

Nucleotidos modificados

[0080] Los ARNmi de la invencion especificamente contemplan el uso de nucleotidos que se modifican por mejorar sus actividades. Tales nucleotidos incluyen aquellos que son en el termino 5' o 3' del ARN al igual que aquellos que estan dentro de la molecula. Los nucleotidos modificados usados en las cadenas complementarias de dichos ARNmi bien bloquean el OH 5 ' o fosfato del ARN o introducen modificaciones de azucar internas que mejoran la absorcion de la cadena activa del ARNmi. Modificaciones para los ARNmi incluyen modificaciones de azucar internas que mejoran la hibridacion al igual que estabilizan las moleculas en las celulas y modificaciones terminales que ademas estabilizan los acidos nucleicos en las celulas. Ademas se contemplan modificaciones que se pueden detectar por microscopia u otros metodos para identificar las celulas que contienen los ARNmi sinteticos.

Preparation de acidos nucleicos

[0081] Un acido nucleico se puede hacer por cualquier tecnica conocida para uno de habilidad en la materia, tal como por ejemplo, sintesis quimica, production enzimatica o production biologica. Aunque los ARNmi segun la invencion se podrian producir utilizando metodos recombinantes, se prefiere producir ARNmi por sintesis quimica o produccion enzimatica. Los ARNmi se pueden producir por un numero de metodos, incluyendo metodos que implican tecnologia de ADN recombinante.

[0082] La sintesis de acidos nucleicos se realiza segun metodos estandar. Vease, por ejemplo, Itakura and Riggs (1980). Adicionalmente, la patente estadounidense 4.704.362, la patente estadounidense 5.221.619, y la patente estadounidense 5.583.013 describen cada una varios metodos para preparar acidos nucleicos. Ejemplos no limitativos de un acido nucleico (por ejemplo, un oligonucleotido), incluyen un acido nucleico hecho por sintesis in vitro quimicamente usando quimica de fosfotriester, fosfito o fosforamidita y tecnicas de fase solida tales como las descritas en la EP 266.032, o via productos intermedios de H-fosfonato de desoxinucleosido como se describe por Froehler et al., 1986 y la patente estadounidense numero de serie: 5.705.629. En los metodos de la presente invencion, uno o mas oligonucleotidos pueden ser utilizados. Varios mecanismos diferentes de sintesis de oligonucleotidos se han descrito en, por ejemplo, las patentes estadounidenses: 4.659.774, 4.816.571, 5.141.813, 5.264.566, 4.959.463, 5.428.148, 5.554.744, 5.574.146, 5.602.244.

[0083] Un ejemplo no limitativo de un acido nucleico producido enzimaticamente incluye uno producido por enzimas en reacciones de amplification tales como PCR(TM) (vease, por ejemplo, la patente estadounidense 4.683.202 y la patente estadounidense 4.682.195), o la sintesis de un oligonucleotido descrita en la patente estadounidense n° 5.645.897.

[0084] La sintesis de oligonucleotidos es bien conocida por los de habilidad en la tecnica. Se han descrito varios mecanismos diferentes de sintesis de oligonucleotidos en, por ejemplo, las patentes estadounidenses 4.659.774, 4.816.571, 5.141.813, 5.264.566, 4.959.463, 5.428.148, 5.554.744, 5.574.146, 5.602.244. Basicamente, la sintesis quimica se puede conseguir por el metodo de diester, el metodo triester, el metodo de polinucleotidos fosforilasa y por quimica de fase solida. Estos metodos se discuten con mas detalle mas adelante.

Metodo de diester

[0085] El metodo de diester fue el primero en ser desarrollado hasta un estado utilizable, principalmente por Khorana y sus colaboradores (Khorana, 1979). La etapa basica es la union de dos deoxinucleotidos protegidos adecuadamente para formar un dideoxinucleotido que contiene un enlace de fosfodiester. El metodo de diester esta bien establecido y se ha usado para sintetizar moleculas de ADN (Khorana, 1979).

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[0086] La diferencia principal entre los metodos de diester y triester es la presencia en el ultimo de un grupo protector extra en los atomos de fosfato de los reactivos y productos (Itakura et al., 1975). El grupo protector de fosfato es normalmente un grupo de clorofenilo, que hace que los productos intermedios de los nucleotidos y los polinucleotidos sean solubles en solventes organicos. Por lo tanto, las purificaciones se hacen en soluciones de cloroformo. Otras mejoras en el metodo incluyen (i) el acoplamiento en bloque de trimeros y oligomeros mayores, (ii) el uso extensivo de cromatografia en fase liquida de alta eficacia para la purificacion tanto de productos finales como de intermedios, y (iii) la sintesis en fase solida.

Metodo de polinucleotido fosforilasa

[0087] Este es un metodo enzimatico de sintesis de ADN que puede utilizarse para sintetizar muchos oligonucleotidos utiles (Gillam et al., 1978; Gillam et al., 1979). Bajo condiciones controladas, la polinucleotido fosforilasa anade predominantemente un nucleotido unico a un oligonucleotido corto.

[0088] La purificacion cromatografica permite obtener el aducto unico deseado. Al menos un trimero se requiere para iniciar el procedimiento, y este cebador debe ser obtenido por algun otro metodo. El metodo de polinucleotido fosforilasa funciona y tiene la ventaja de que los procedimientos implicados son conocidos por la mayoria de los bioquimicos.

Metodos de fase solida

[0089] A partir la tecnologia desarrollada para la sintesis en fase solida de polipeptidos, ha sido posible unir el nucleotido inicial a un material de soporte solido y proceder con la adicion gradual de nucleotidos. Cualquier etapa de mezcla y de lavado se simplifica, y el procedimiento es susceptible de automatizacion. Estas sintesis se realizan hoy en dia de forma rutinaria utilizando sintetizadores de acido nucleico automaticos.

[0090] La quimica de fosforamidita (Beaucage and Lyer, 1992) se ha convertido con mucho en la quimica de acoplamiento mas ampliamente usada para la sintesis de oligonucleotidos. Como ya saben los expertos en la tecnica, la sintesis de fosforamidita de oligonucleotidos implica la activacion de precursores de monomeros de nucleosido fosforamidita por reaccion con un agente de activacion para formar productos intermedios activados, seguido de adicion secuencial de los productos intermedios activados para la cadena de oligonucleotidos creciente (anclada generalmente en un extremo para un soporte solido adecuado) para formar el producto de oligonucleotidos.

Metodos recombinantes.

[0091] Metodos recombinantes para producir acidos nucleicos en una celula son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Incluyen el uso de vectores, plasmidos, cosmidos y otros vehiculos para la entrega de un acido nucleico a una celula, que puede ser la celula objetivo o sencillamente una celula huesped (para producir grandes cantidades de la molecula de ARN deseada). Alternativamente, tales vehiculos se pueden usar en el contexto de un sistema libre de celulas mientras los reactivos para generar la molecula de ARN estan presentes. Tales metodos incluyen los descritos en Sambrook, 2003, Sambrook, 2001 y Sambrook, 1989. En formas de realizacion determinadas, la presente invencion se refiere a moleculas de acido nucleico que no son sinteticas. En algunas formas de realizacion, la molecula de acido nucleico tiene una estructura quimica de un acido nucleico de origen natural y una secuencia de un acido nucleico de origen natural, tal como la secuencia exacta y entera de un ARNmi primario monocatenario (vease, Lee 2002), un ARNmi precursor monocatenario o un ARNmi maduro monocatenario. Ademas del uso de tecnologia recombinante, tales acidos nucleicos no sinteticos se pueden generar quimicamente, tal como utilizando tecnologia usada para la creacion de oligonucleotidos.

Diseno de ARNmi

[0092] Los ARNmi tipicamente comprenden dos cadenas, una cadena activa que es identica en la secuencia al ARNmi maduro que se esta estudiando y una cadena complementaria que es al menos complementaria parcialmente de la cadena activa. La cadena activa es la molecula pertinente biologicamente y deberia ser preferentemente absorbida por el complejo en las celulas que modulan la traduccion bien a traves de la degradation de ARNm o el control traduccional. La absorcion preferencial de la cadena activa tiene dos resultados profundos: (1) la actividad observada de dicho ARNmi aumenta espectacularmente y (2) los efectos no previstos inducidos por la absorcion y la activacion de la cadena complementaria son esencialmente eliminados. Segun la invencion, varios disenos de ARNmi se pueden utilizar para asegurar la absorcion preferencial de la cadena activa.

Agente de bloqueo 5'

[0093] La introduction de una fraction estable diferente del fosfato o hidroxilo en el extremo 5' de la cadena complementaria afecta a su actividad en la ruta de ARNmi. Esto asegura que solo la cadena activa del ARNmi se usara para regular la traduccion en la celula. Las modificaciones 5' incluyen, pero de forma no limitativa, NH2,

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biotina, un grupo de amina, un grupo de alquilamina inferior, un grupo de acetil, 2' O-Me, DMTO, fluoresceina, un tiol, o acridina o cualquier otro grupo con este tipo de funcionalidad.

[0094] Otras modificaciones de cadena sentido. La introduccion de modificaciones de nucleotidos tipo 2'-O Me, 2'-deoxi, T-deoxi-2'-fluoro, 2'-O-metil, 2'-O-metoxietil (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropil (2'-0-AP), 2'-O-dimetilaminoetil (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropil (2'-0-DMAp), 2'-O-dimetilaminoetiloxietil (2'-0-DmAEOE), o 2'-O-N- metilacetamido (2'-0-NMA), NH2, biotina, un grupo de amina, un grupo de alquilamina inferior, un grupo de acetil, DMTO, fluoresceina, un tiol, o acridina o cualquier otro grupo con este tipo de funcionalidad en la cadena complementaria del ARNmi puede eliminar la actividad de la cadena complementaria y mejorar la absorcion de la cadena activa del ARNmi.

[0095] Desapareamientos de bases en la cadena sentido. Como con los ARNsi (Schwarz 2003), la estabilidad relativa de los extremos 5' y 3' de la cadena activa del ARNmi determina aparentemente la absorcion y la activacion del activo por la ruta de ARNmi. La desestabilizacion del extremo 5' de la cadena activa del ARNmi por la colocacion estrategica de desapareamientos de bases en el extremo 3' de la cadena complementaria del ARNmi sintetico mejora la actividad de la cadena activa y esencialmente elimina el actividad de la cadena complementaria.

Celulas huesped y celulas diana

[0096] Las celulas en las que un ARNmi o fuente del mismo se introduce o donde la presencia de un ARNmi se evalua se pueden derivar de o estar contenidas en cualquier organismo. Preferiblemente, la celula es una celula de vertebrado. Mas preferiblemente, la celula es una celula de mamifero. Aun mas preferiblemente, la celula es una celula de humano. Una celula de mamifero puede ser de la linea germinal o somatica, totipotente o pluripotente, divisora o no divisora, de epitelio, inmortalizada o transformada, o similar. La celula puede ser una celula no diferenciada, tal como una celula madre, o una celula diferenciada, tal como de una celula de un organo o tejido. Alternativamente, las celulas se pueden clasificar como celulas epiteliales, de cerebro, pecho, cervix, colon, tracto gastrointestinal, corazon, rinon, intestino grueso, higado, pulmon, ovario, pancreas, corazon, prostata, vejiga, intestino delgado, estomago, testiculos o utero.

[0097] Como se utiliza en este caso, los terminos "celula", " linea celular" y "cultivo celular" se pueden utilizar de forma intercambiable. Todos estos terminos tambien incluyen su progenie, que es cualquiera y todas las generaciones posteriores formadas por division celular. Se entiende que cualquier descendiente puede no ser identico debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Una celula huesped puede ser "transfectada" o "transformada", lo que se refiere a un proceso por el que el acido nucleico exogeno es transferido o introducido en la celula huesped. Una celula transformada incluye la celula sujeto primaria y su progenie. Como se utiliza en este caso, los terminos celulas "disenadas" y "recombinantes" o celulas huesped se refieren a una celula en la que una secuencia de acidos nucleicos exogena, tal y como, por ejemplo, un ARN pequeno de interferencia o un constructo modelo que codifica un gen reportero ha sido introducido. Por lo tanto, las celulas recombinantes se pueden distinguir de las celulas de origen natural que no contienen un acido nucleico recombinantemente introducido.

[0098] Un tejido puede comprender una celula huesped o celulas para transformar o poner en contacto con una composition de entrega de acido nucleico y/o un agente adicional. El tejido puede ser parte o estar separado de un organismo. En formas de realization determinadas, un tejido y sus celulas constituyentes pueden comprender, pero no estan limitadas a cerebro, celulas madre, higado, pulmon, hueso, pecho, cervix, colon, endometrio, epitelio, esofago, celulas caliciformes, rinon, ovarios, pancreas, prostata, vejiga, piel, intestino delgado, estomago, testiculos, corazon, vasos sanguineos.

[0099] En formas de realizacion determinadas, la celula huesped o tejido puede estar comprendido en al menos un organismo. En formas de realizacion determinadas, el organismo puede ser un mamifero, un humano, un primate o murino. Uno de habilidad en la tecnica ademas entenderia las condiciones bajo las que hay que incubar todas las celulas huesped descritas anteriormente para mantenerlas y para permitir su division para formar progenie.

Metodos de entrega

[0100] La presente invention implica en algunas formas de realizacion la entrega de un acido nucleico en una celula. Esto puede realizarse como parte de un metodo de selection, o puede estar relacionado con una aplicacion terapeutica o de diagnostico. Las moleculas de ARN pueden ser codificadas por una molecula de acido nucleico comprendida en un vector. El termino "vector" se utiliza para referirse a una molecula de acido nucleico portador en la que una secuencia de acidos nucleicos se puede insertar para su introduccion en una celula en la que este puede ser replicado. Una secuencia de acidos nucleicos puede ser "exogena", que significa que es foranea de la celula en la que el vector se ha introducido o que la secuencia es homologa de una secuencia en la celula pero en una position en el acido nucleico de la celula huesped donde la secuencia no se encuentra habitualmente. Los vectores incluyen plasmidos, cosmidos, virus (bacteriofagos, virus de animales,

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lentivirus y virus de plantas) y cromosomas artificiales (por ejemplo, YACs). Uno de habilidad en la tecnica estaria bien equipado para construir un vector a traves de tecnicas estandar recombinantes, que se describen en Sambrook et al., 1989 y Ausubel et al., 1996. Ademas de codificar un polipeptido modificado tal como gelonina modificada, un vector puede codificar secuencias de polipeptidos no modificadas tales como una etiqueta o molecula de direccionamiento. Una molecula de direccionamiento es una que dirige el acido nucleico deseado a un organo particular, tejido, celula, u otra ubicacion en el cuerpo de un sujeto.

[0101] El termino "vector de expresion" se refiere a un vector que contiene una secuencia de acidos nucleicos que codifica para al menos parte de un producto genico capaz de ser transcrito. Los vectores de expresion pueden contener una variedad de "secuencias de control", que se refieren a secuencias de acidos nucleicos necesarias para la transcripcion y posiblemente la traduccion de una secuencia codificante operativamente enlazada en un organismo huesped particular. Ademas de las secuencias de control que rigen la transcripcion y la traduccion, los vectores y vectores de expresion puede contener secuencias de acidos nucleicos que sirven para otras funciones tambien y son descritos

[0102] Hay muchas formas en las que los vectores de expresion se pueden introducir en las celulas. En ciertas formas de realizacion de la invencion, el vector de expresion comprende un virus o vector disenado derivado de un genoma viral. La capacidad de ciertos virus para introducir celulas via endocitosis mediada por receptor, para integrar en el genoma de la celula huesped y expresar genes de forma estable y eficaz ha hecho que estos candidatos sean atractivos para la transferencia de genes foraneos en celulas mamiferas (Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986). Los primeros virus usados como vectores genicos fueron virus de ADN incluyendo los papovaviruses (virus simico 40, papiloma virus bovino y polioma) (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986) y los adenovirus (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986). Tienen una capacidad relativamente baja para las secuencias de ADN foraneas y tienen un espectro de huesped restringido. Ademas, su potencial oncogenico y efectos citopaticos en celulas permisivas generan problemas de seguridad. Pueden alojar solo hasta 8 kb de material genetico foraneo pero se pueden introducir facilmente en una variedad de lineas celulares y animales de laboratorio (Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986). Los vectores de expresion pueden contener un casete de expresion de ARNi que comprende un promotor y una o mas estructuras de tallo-bucle separadas por una o mas regiones separadoras (WO2006/084209). Otra forma de introducir los vectores de expresion en celulas, usando proteinas de fusion de avidina se describe en la US6.287.792.

[0103] Los retrovirus son un grupo de virus de ARN monocatenario caracterizados por una capacidad para convertir su ARN en ADN bicatenario en celulas infectadas; tambien pueden usarse como vectores. Otros vectores virales se pueden emplear como constructos de expresion en la presente invencion. Vectores derivados de virus tales como virus vaccinia (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988) virus adeno-asociado (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Hermonat and Muzycska, 1984, lentivirus (WO2008/071959, WO2004/054512), virus hemaglutinante de Japon (WO2004/035779), baculovirus (WO2006/048662) y virus de herpes se pueden emplear. Ofrecen diferentes caracteristicas atractivas para varias celulas mamiferas (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).

[0104] Se cree que otros metodos adecuados de entrega de acido nucleico para afectar la expresion de las composiciones de la presente invencion incluyen practicamente cualquier metodo por el que un acido nucleico (por ejemplo, ADN, incluyendo vectores virales y no virales) se puedan introducir en un organulo, una celula, un tejido o un organismo, como se describe en este caso o como conoceria uno de habilidad ordinaria en la tecnica. Tales metodos incluyen, pero de forma no limitativa, entrega directa de ADN tal como por inyeccion (las patentes de EEUU numeros: 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859), incluyendo microinyeccion (Harlan and Weintraub, 1985; patente de EEUU n° 5.789.215); por electroporacion (patente de EEUu n° 5.384.253); por precipitacion de fosfato calcico (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); usando DEAE-dextrano seguido de polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sonica directa (Fechheimer et al., 1987); por transfeccion mediada por liposoma (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991); por internalizacion fotoquimica (WO2008/007073); por bombardeo con microproyectiles (solicitud de PCT numeros: WO 94/09699 y 95/06128; patentes de EEUU numeros: 5.610.042, 5.322.783, 5.563.055, 5.550.318, 5.538.877 y 5.538.880); por agitacion con fibras de carburo de silicona (Kaeppler et al., 1990; patentes de EEUU numeros: 5.302.523 y 5.464.765); por transformacion mediada por Agrobacterium (patentes de EEUU numeros: 5.591.616 y 5.563.055); o por transformacion mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh et al., 1993; patentes de EEUU numeros: 4.684.611 y 4.952.500 por absorcion mediada por disecacion/inhibicion de ADN (Potrykus et al., 1985). Mediante la aplicacion de tecnicas tales como estas, organulo(s), celula(s), tejido(s) u organismo(s) se pueden transformar de forma estable o transitoria.

[0105] Una revision proporciona diferentes maneras de formular una molecula de ARN para optimizar su internalizacion en una celula (Kim SS., et al., Trends Mol. Med., 2009, 15: 491-500). Las siguientes publicaciones divulgan otras formas alternativas de formular una molecula de ARN para mejorar su internalizacion en una celula: la WO 2007/095152, describe el uso de PTD-DRBD (dominios de transduccion de peptido enlazados a

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dominio de union bicatenarios) para la entrega de oligonucleotidos, la WO 2009/086558, describe el uso de SNALP (particulas lipidicas de acidos nucleicos estables) particulas, que comprenden una mezcla de lipidos cationicos y fusogenicos que permiten la absorcion celular y la liberacion endosomal de la carga de acidos nucleicos de la particula, la WO 2009/149418, describe emulsiones fosfolipido-aceite-ARNi, la WO 2007/121947, describe el uso de un vehiculo de entrega basado en lipoplex, la WO 2009/132131, describe el uso de kpidos nuevos y particulas de acido nucleico-lipido que proporcionan encapsulation eficiente y entrega eficaz del acido nucleico encapsulado a celulas, la WO2004/091578 y WO2004/064805 describe tecnologia de cocleatos de capas de lipidos alternantes que giran en espiral alrededor de una molecula de acido nucleico, la WO2003/047494 y WO2003/047493 describen micelas inversas que incorporan acidos nucleicos para la entrega oral y mucosa, la WO 2008/156702, describe bacterias y particula terapeutica bacteriana (BTP), incluyendo oligonucleotidos como vehiculo de entrega a las celulas. Cada una de las formulaciones mencionadas o descritas en estas publicaciones estan abarcadas por la presente invention.

[0106] Una variedad de compuestos se han adjuntado a los extremos de los oligonucleotidos para facilitar su transporte a traves de las membranas celulares. Los peptidos senal cortos encontrados en HIV TAT, HSV VP22, Drosphila antennapedia, y otras proteinas se ha descubierto que permiten la transferencia rapida de biomoleculas a traves de las membranas (revisado por Schwarze 2000). Estos peptidos senal, denominados dominios de transduction de proteina (PTDs), se han unido a los oligonucleotidos para facilitar su entrega en las celulas cultivadas (Eguchi A, Dowdy SF, Trends Pharmacol Sci., 2009, 7:341-5). Los colesteroles han sido conjugados a oligonucleotidos para mejorar su absorcion en celulas en animales (MacKellar 1992). Los grupos de colesterol terminales aparentemente interaction con receptores o kpidos en las superficies de las celulas y facilitan la internalization de los oligonucleotidos modificados. Asimismo, la poli-L-lisina ha sido conjugada a oligonucleotidos para reducir la carga negativa neta y mejorar la absorcion en celulas (Leonetti 1990).

[0107] Se han desarrollado una variedad de compuestos que forman complejos con acidos nucleicos, los entregan a las superficies de las celulas, y facilitan su absorcion en y liberacion desde los endosomas. Entre estos estan: (1) una variedad de Kpidos tales como DOTAP (u otro lipido cationico), DDAB, DHDEAB y DOPE y

(2) polimeros no basados en kpidos como polietilenimina, poliamidoaminea y dendrimeros de estos y otros polimeros. En ciertas de estas formas de realization una combination de Kpidos se emplea tal como DOTAP y colesterol o un derivado de colesterol (patente de EEUU 6.770.291). Varios de estos reactivos se ha demostrado que facilitan la absorcion de acido nucleico en animales.

[0108] Los componentes celulares implicados en la ruta de ARNmi se estan haciendo conocidos. Las proteinas que estabilizan y/o transportan ARNmi dentro de las celulas pueden mejorar la estabilidad y la actividad de los ARNmi porque deberian proteger y guiar los ARNmi ligados una vez que estan en las celulas. Mezclas de proteinas transportadoras de ARNmi y ARNmi podrian mejorar la eficacia de tratamientos basados en ARNmi. Los ARN son moleculas hidrofilicas por su estructura de fosfato anionico y de azucar. Aunque las nucleobases son hidrofobicas, la hidrofilicidad domina debido a la union de hidrogeno extensiva resultante de los residuos de fosfato y de azucar. El caracter hidrofilico y la estructura anionica reducen la permeation celular. La conjugation de grupos lipofilicos como el colesterol (Manoharan, 2002) y derivados de acido laurico y litocolico con funcionalidad C32 (Lorenz et al., 2004), se ha demostrados que mejoran la absorcion celular. Ademas, la union de oligonucleotidos conjugados de esteroide a lipoproteinas diferentes en el flujo sanguineo, tales como LDL, protege su integridad y gobierna su biodistribucion (Rump et al., 2000). El colesterol fijado a las moleculas antisentido (Bijsterbosch et al., 2001) y los aptameros (Rusconi et al., 2004) tambien se ha demostrado que estabilizan los oligonucleotidos permitiendo la union a lipoproteinas. El colesterol se ha demostrado que mejora la absorcion y la estabilidad del suero de los ARNsi in vitro (Lorenz et al., 2004) e in vivo (Soutschek et al., 2004). Adicionalmente, un numero de moleculas pequenas como SB-435495 (Blackie et al., (2002), isradipina (Oravcova et al., 1994), amlodipina (Oravcova et al., 1994) y 2,2',4,4',5,5'-hexaclorobifenil (Borlakoglu et al., 1990) podria mejorar la absorcion celular, y mejorar la resistencia a la nucleasa promoviendo la asociacion de lipoproteinas.

Selection con bibliotecas de ARNmi

[0109] Como se usa en la solicitud de patente, la seleccion es un proceso donde varios reactivos especificos de ARNmi se entregan separadamente en poblaciones de celulas individuales o animales. En uno o mas momentos designados despues de la entrega, las poblaciones celulares o animales se evaluan para uno o mas fenotipos. Esas celulas o animales que tienen un fenotipo significativamente diferente de las celulas o animales en el grupo de control negativo se clasifican como positivos. El ARNmi que estaba siendo manipulado en la muestra se define como un hit. Los hits representan objetivos para investigation adicional y desarrollo terapeutico potencial. En algunas formas de realizacion, hay un proceso multifase para la seleccion, en formas de realizacion determinadas, hay cuatro etapas generales:

(1) desarrollo de ensayo cuantitativo para controlar el proceso celular que se esta estudiando.

[0110] Ensayos que miden la intensidad de un rango de fenotipo celular a partir de ensayos microscopicos que controlan el tamano celular, el estado del ciclo celular, o el anticuerpo que tine para ensayos enzimaticos que

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evaluan la produccion de un sustrato especifico en un lisado celular para dirigir las mediciones biomoleculas o moleculas pequenas en lisados, en celulas, o en el medio.

[0111] Importante para el exito de una selection es la creation de un ensayo que realmente mida el fenotipo celular y maximice la proportion de senal a ruido del ensayo. Maximizar la senal a ruido implica variables de prueba tales como el tiempo de ensayo, los componentes de ensayo, el tipo de celula y la cantidad de tiempo entre la transfection y el ensayo. Cuanto mayor es la diferencia en los resultados del ensayo entre un fenotipo positivo y un fenotipo de control negativo, mayor es la extension en los resultados de la seleccion y mejor es la oportunidad de identificar genes interesantes.

(2) Optimizar las condiciones de transfeccion para las celulas deseadas.

[0112] La primera fase de este proceso es identificar un reactivo de transfeccion y las condiciones de cultivo que maximicen la absorcion de ARNmi sinteticos mientras que se mantiene una viabilidad celular alta. Encontramos util evaluar 2-5 reactivos de transfeccion diferentes cuando se usan lineas celulares o 5-10 condiciones de electroporacion cuando se usan celulas primarias o de suspension. La transfeccion se puede optimizar para el reactivo o condition de electroporation que funciono mejor entre las condiciones evaluadas. La seleccion de bibliotecas especificas de ARNmi requiere condiciones para la transfeccion de alto rendimiento. En este tipo de seleccion, se uso la introduccion lentiviral antes que la transfeccion. Esto puede requerir tecnicas de optimizacion alternativas.

(3) Seleccion

[0113] Una vez que se han desarrollado el ensayo y el proceso de transfeccion, una biblioteca de ARNmi sinteticos o ARNmi expresados por virus se puede introducir secuencialmente en las celulas en una placa de 24 o 96 pocillos. Duplicar o triplicar las transfecciones para cada reactivo proporciona datos suficientes para el analisis estadistico razonable.

(4) Validation de hits

[0114] La validacion de un hit implica mostrar que el fenotipo observado se debe al ARNmi al que se dirige. Los hits se confirman tipicamente por la entrega de una serie de diluciones del inhibidor de ARNmi o ARNmi sintetico que se registro como hit en la celula que se evaluo originalmente. La confirmation es ligeramente diferente de la validacion. La confirmacion es una repetition del fenotipo inducido por el ARNmi, mientras que la validacion puede tambien incluir inversion del fenotipo antagonizando el fenotipo mediado por ARNmi.

Marcado y tecnicas de marcado

[0115] En algunas formas de realization, la presente invention se refiere a los ARNmi que estan marcados, tales como para ensayos de seleccion para evaluar la relevancia terapeutica o de diagnostico de una especie de ARNmi particular. Se contempla que el ARNmi puede primero ser aislado (bien a partir de una celula en la que el ARNmi es endogeno de la celula o a partir de una celula en la que el ARNmi es exogeno de la celular) y/o purificado antes del marcado. Esto puede conseguir una reaction que marca de forma mas eficaz el ARNmi, a diferencia de otro ARN en una muestra en la que el ARNmi no esta aislado o purificado antes del marcado. En muchas formas de realizacion de la invencion, el marcador es no radioactivo. Generalmente, los acidos nucleicos se pueden marcar anadiendo nucleotidos marcados (proceso de una unica fase) o anadiendo nucleotidos y marcando los nucleotidos anadidos (proceso de dos fases).

[0116] Ademas, los ARNmi se pueden marcar como se describe en la patente de EEUU 7.880.010. Tales nucleotidos incluyen los que se pueden marcar con un tinte, incluyendo un tinte fluorescente, o con una molecula tal como biotina. Los nucleotidos marcados estan facilmente disponibles; se pueden adquirir comercialmente o se pueden sintetizar por reacciones conocidas por los expertos en la tecnica.

Nucleotidos para marcado

[0117] Los nucleotidos para el marcado no son nucleotidos de origen natural, sino que se refieren a nucleotidos preparados que tienen una fraction reactiva en ellos. Funcionalidades reactivas especificas de interes incluyen: amino, sulfhidrilo, sulfoxilo, aminosulfhidrilo, azido, epoxido, isotiocianato, isocianato, anhidrido, monoclorotriazina, diclorotriazina, piridina mono o dihalogeno sustituida, diazina mono- o disustituida, maleimida, epoxido, aziridina, sulfonil haluro, haluro acido, haluro de alquilo, haluro de arilo, alquilsulfonato, ester de N- hidroxisuccinimida, ester de imido, hidracina, azidonitrofenilo, azida, 3-(2-piridil ditio)-propionamida, glioxal, aldehido, iodoacetilo, ester de cianometilo, ester de p-nitrofenilo, ester de O-nitrofenilo, ester de hidroxipiridina, imidazol de carbonilo, y los otros grupos quimicos de este tipo. En algunas formas de realizacion, la funcionalidad reactiva se puede unir directamente a un nucleotido, o se puede unir al nucleotido a traves de un grupo de conexion. La fraccion funcional y cualquier enlazador no puede sustancialmente perjudicar la capacidad del nucleotido que se va a anadir al ARNmi o que se va a marcar. Grupos de union representativos incluyen

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carbono que contiene grupos de union, tipicamente que varian de aproximadamente 2 a 18, normalmente de aproximadamente 2 a 8 atomos de carbono, donde el carbono que contiene grupos de union pueden o no incluir uno o mas heteroatomos, por ejemplo S, O, N, etc., y pueden o no incluir uno o mas sitios de insaturacion. De interes particular en muchas formas de realizacion son los grupos de union a alquilo, tipicamente grupos de union a alquilo inferiores de 1 a 16, normalmente de 1 a 4 atomos de carbono, donde los grupos de union pueden incluir uno o mas sitios de insaturacion. Los nucleotidos funcionalizados (o cebadores) usados en los metodos anteriores de generacion de objetivos funcionalizados se pueden fabricar utilizando protocolos conocidos o comprarse de vendedores comerciales, por ejemplo, Sigma, Roche, Ambion e IDT. Los grupos funcionales se pueden preparar segun formas conocidas por los expertos en la tecnica, con la informacion representativa de las patentes de EEUU numeros: 4.404.289, 4.405.711, 4.337.063 y 5.268.486 y Br. Pat. N° 1.529.202.

[0118] Nucleotidos modificados con amina se usan en diferentes formas de realizacion de la invention. El nucleotido modificado con amina es un nucleotido que tiene un grupo de amina reactivo para la fijacion del marcador. Se contempla que cualquier ribonucleotido (G, A, U o C) o desoxirribonucleotido (G, A, T o C) se puede modificar para el marcado. Ejemplos incluyen, pero de forma no limitativa, los siguientes ribo- y deoxiribo- nucleotidos modificados: 5-(3-aminoalil)-UTP; 8-[(4-amino)butil]-amino-ATP y 8-[(6-amino)butil]-amino- ATP; N6- (4-amino)butil-ATP, N6-(6-amino)butil-ATP, N4-[2,2-oxi-bis-(etilamina)]-CTP; N6-(6-Amino)hexil-ATP; 8-[(6- Amino)hexil]-amino-ATP; 5-propargilamino-CTP, 5-propargilamino-UTP; 5-(3-aminoalil)-dUTP; 8-[(4- amino)butil]- amino-dATP y 8-[(6-amino)butil]-amino-dATP; N-(4-amino)butil- dATP, N6-(6-amino)butil-dATP, N4-[2,2-oxi-to- (etilamina)]-dCTP; N6-(6-Amino)hexil-dATP; 8-[(6-Amino)hexil]-amino-dATP; 5-propargilamino-dCTP, y 5- propargilamino-dUTP. Tales nucleotidos se pueden preparar segun metodos conocidos por aquellos de habilidad en la tecnica. Ademas, un experto en la materia podria preparar otras entidades de nucleotidos con la misma modification con amina, tal como un 5-(3- aminoalil)-CTP, GTP, ATP, dCTP, dGTP, dTTP o dUTP en lugar de un 5-(3- aminoalil)-UTP.

Tecnicas de marcado

[0119] En algunas formas de realizacion, los acidos nucleicos se marcan anadiendo cataliticamente al acido nucleico un nucleotido o nucleotidos ya marcados. Uno o mas nucleotidos marcados se pueden anadir a las moleculas ARNmi. Vease la patente U.S. 6.723.509.

[0120] En otras formas de realizacion, un nucleotido no marcado o nucleotidos se anade cataliticamente a un ARNmi, y el nucleotido no marcado se modifica con una fraction quimica que permite que sea marcado posteriormente, en formas de realizacion de la invencion, la fraccion quimica es una amina reactiva de manera que el nucleotido es un nucleotido modificado con amina. Ejemplos de nucleotidos modificados con amina son conocidos por los de habilidad en la tecnica, muchos estan disponibles comercialmente tales como de Ambion, Sigma, Jena Bioscience y TriLink.

[0121] A diferencia del marcado de los ADNc durante sus sintesis, la cuestion del marcado de los ARNmi es como marcar la molecula ya existente. Con este fin, podemos usar una enzima capaz de utilizar un ribonucleotido de di- o trifosfato o desoxirribonucleotido como un sustrato para su adicion a un ARNmi, una molecula de ARN pequena. Ademas, en formas de realizacion especificas, implica el uso de un ribonucleotido de di- o trifosfato modificado, que se anade al extremo 3' de un ARNmi. La fuente de la enzima no es limitante. Ejemplos de fuentes para las enzimas incluyen levadura, bacterias gram-negativas tales como E. coli, lactococcus lactis y virus de la sifilis de oveja.

[0122] Enzimas capaces de anadir tales nucleotidos incluyen, pero de forma no limitativa, poli(A) polimerasa, transferasa terminal y polinucleotido fosforilasa. En formas de realizacion especificas de la invencion, la ligasa se contempla como no siendo la enzima usada para anadir el marcador, y en cambio, una enzima sin ligasa es emplea.

[0123] Poli(A) polimerasa se ha clonado a partir de un numero de organismos desde plantas a seres humanos. Se ha demostrado para catalizar la adicion de tractos de homopolimero a ARN (Martin et al., RNA, 4(2):226-30, 1998).

[0124] La transferasa terminal cataliza la adicion de nucleotidos en el termino 3' de un acido nucleico.

[0125] La polinucleotido fosforilasa puede polimerizar difosfatos de nucleotido sin necesidad de un cebador. Marcadores y etiquetas

[0126] Los ARNmi o las sondas de ARNmi se pueden marcar con una emision de positron (incluyendo radiactivo), enzimatico, colorimetrico (incluye espectro visible y UV, incluyendo fluorescente), luminiscente u otro marcador o etiqueta para fines de detection o aislamiento. El marcador se puede detectar directa o

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indirectamente. Las etiquetas radiactivas incluyen I, P, P y S. Ejemplos de etiquetas enzimaticas incluyen fosfatasa alcalina, luciferasa, peroxidasa de rabano y p-galactosidasa. Las etiquetas tambien pueden ser proteinas con propiedades luminiscentes, por ejemplo, proteina verde fluorescente y ficoeritrina.

[0127] Las etiquetas colorimetricas y fluorescentes contempladas para su uso como conjugados incluyen, pero de forma no limitativa, AMCA, tintes Alexa Fluor, tintes BODIPY, tal como BODIPY FL, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIP Y-R6G, BODIPY-TRX; Cascade Blue; Cascade Yellow; cumarina y sus derivados, tal como 7-amino-4-metilcumarina, aminocumarina e hidroxicumarina; tintes de cianina, tal como Cy3 y Cy5; eosinas y eritrosinas; fluoresceina y sus derivados, tal como isotiocianato de fluoresceina; quelatos macrociclicos de iones de lantanido, tal como Quantum Dye(™); Marina Blue; Oregon Green; tintes de rodamina, tal como rojo de rodamina, tetrametilrodamina y rodamina 6G; Texas Red;

[0128] Ejemplos especificos de tintes incluyen, pero de forma no limitativa, aquellos identificados anteriormente y los siguientes: Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500. Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, and, Alexa Fluor 750; tintes amino-reactivos, tales como BODIPY 493/503, BODEPY 530/550, BODEPY 558/568, BODIPY 564/570, BODDPY 576/589, BODIPY 581/591, BODEPY 630/650, BODIPY 650/655, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODEPY TMR, y, BODIPY-TR; Cy3, Cy5, 6-FAM, isotiocianato de fluoresceina, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Renographin, ROX, SYPRO, TAMRA, 2',4',5',7'-Tetrabromosulfonofluorescema y TET.

[0129] Ejemplos especificos de ribonucleotidos fluorescentemente marcados estan disponibles de Molecular Probes, e incluyen Alexa Fluor 488-5-UTP, Fluoresceina-12-UTP, BODEPY FL-14-UTP, BODIPY TMR-14-UTP, Tetrametilrodamina-6-UTP, Alexa Fluor 546-14-UTP, Texas Red-5-UTP y BODIPY TR-14-UTP. Otros ribonucleotidos fluorescentes estan disponibles de Amersham Biosciences, tales como Cy3-UTP y Cy5-UTP. Ejemplos de deoxiribonucleotidos fluorescentemente marcados incluyen dinitrofenilo (DNP)-11-dUTP, Cascade Blue-7-dUTP, Alexa Fluor 488-5-dUTP, Fluoresceina- 12-dUTP, Oregon Green 488-5-dUTP, BODEPY FL-14- dUTP, Rhodamine Green-5-dUTP, Alexa Fluor 532-5-dUTP, BODEPY TMR-14-dUTP, Tetramethylrhodamine-6- dUTP, Alexa Fluor 546-14-dUTP, Alexa Fluor 568-5-dUTP, Texas Red-12-dUTP, Texas Red-5-dUTP, BODEPY TR-14-dUTP, Alexa Fluor 594-5-dUTP, BODEPY 630/650-14-dUTP, BODIPY 650/665-14-dUTP; Alexa Fluor 488-7-OBEA-dCTP, Alexa Fluor 546-16-OBEA-dCTP, Alexa Fluor 594-7-OBEA-dCTP, Alexa Fluor 647-12- OBEA-dCTP. Se contempla que los acidos nucleicos se pueden marcar con dos etiquetas diferentes.

[0130] Se contempla que los ARNmi sinteticos se puedan marcar con mas de un marcador, o con dos marcadores diferentes. Ademas, la transferencia de energia por resonancia de fluorescencia (FRET) se puede emplear en metodos de la invencion (por ejemplo, Klostermeier et al., 2002; Emptage, 2001; Didenko, 2001). Tintes de transferencia por energia fluorescente, tales como naranja de tiazol-heterodimero de etidio; y, TOTAB se pueden utilizar. Alternativamente, el marcador puede no ser detectable de por si, sino detectable indirectamente o permitiendo el aislamiento o la separation del acido nucleico previsto. Por ejemplo, el marcador podria ser biotina, digoxigenina, cationes polivalentes, grupos quelantes y los otros ligandos, incluyen ligandos para un anticuerpo.

Tecnicas de visualizacion

[0131] Un numero de tecnicas para visualizar o detectar acidos nucleicos marcados estan disponibles facilmente. La referencia de Stanley T. Crooke, 2000 tiene una discusion de tales tecnicas (capitulo 6). Tales tecnicas incluyen microscopia, matrices, fluorimetna, cicladores de luz u otras maquinas de PCR en tiempo real, analisis FACS, contadores de centelleo, generadores de imagenes por fosforo, contadores Geiger, MRI, CAT, metodos de detection basados en anticuerpos (Westerns, inmunofluorescencia, inmunohistoquimica), tecnicas histoquimicas, HPLC (Griffey et al., 1997, espectroscopia, electroforesis en gel capilar (Cummins et al., 1996), espectroscopia; espectroscopia de masas; tecnicas radiologicas; y tecnicas de equilibrio de masa. Alternativamente, los acidos nucleicos se pueden marcar o etiquetar para permitir para su aislamiento eficaz. En otras formas de realization de la invencion, los acidos nucleicos son biotinilados.

[0132] Cuando dos o mas marcadores de color se emplean diferencialmente, las tecnicas de transferencia de energia por resonancia fluorescente (FRET) se puede emplear para caracterizar el ARNbc. Ademas, una persona experta en la materia es bien consciente de las formas de visualizar, identificar y caracterizar los acidos nucleicos marcados, y por consiguiente, tales protocolos se pueden utilizar como parte de la invencion. Ejemplos de herramientas que se pueden utilizar tambien incluyen microscopia fluorescente, un bioanalizador, un lector de placa, Storm (Molecular Dynamics), escaner de matriz, FACS (clasificadora de celulas activadas fluorescentes), o cualquier instrumento que tenga la capacidad de excitar y detectar una molecula fluorescente.

Preparation de matriz

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[0133] La presente invencion se puede emplear con matrices de ARNmi, que son macromatrices o micromatrices ordenadas de moleculas (sondas) de acidos nucleicos que son total o casi complementarias o identicas a una pluralidad de moleculas de ARNmi o moleculas de ARNmi precursoras y que estan posicionadas en un material de soporte en una organizacion separada espacialmente. Las macromatrices son tipicamente hojas de nitrocelulosa o nylon sobre las que las sondas se han salpicado. Las micromatrices situan las sondas de acidos nucleicos mas densamente de manera que hasta 10.000 moleculas de acido nucleico se pueden encontrar en una region tipicamente de 1 a 4 centimetros cuadrados. Las micromatrices se pueden fabricar manchando moleculas de acido nucleico, por ejemplo, genes, oligonucleotidos, etc., sobre sustratos o fabricando secuencias de oligonucleotidos in situ en un sustrato. Las moleculas de acido nucleico manchadas o fabricadas se pueden aplicar a un modelo de matriz de alta densidad de hasta aproximadamente 30 moleculas de acido nucleico no identicos por centimetro cuadrado o superior, por ejemplo, hasta aproximadamente 100 o incluso 1.000 por centimetro cuadrado. Las micromatrices tipicamente usan vidrio recubierto como soporte solido, a diferencia del material basado en nitrocelulosa de las matrices de filtro. Al tener una matriz ordenada de muestras de acido nucleico que complementan ARNmi, la posicion de cada muestra se puede rastrear y enlazar a la muestra original. Una variedad de diferentes dispositivos de matriz donde una pluralidad de sondas de acido nucleico distintas estan asociadas de forma estable a la superficie de un soporte solido se conocen por aquellos de habilidad en la tecnica. Sustratos utiles para matrices incluyen nylon, vidrio y silicona. Tales matrices pueden variar en un varias formas diferentes, incluyendo longitud de sonda media, secuencia o tipos de sondas, naturaleza de enlace entre la sonda y la superficie de matriz, por ejemplo covalente o no covalente, y similares.

[0134] Metodos representativos y equipos para la preparacion de una micromatriz se han descrito, por ejemplo,

en las patentes de EEUU numeros 5.143.854; 5.202.231; 5.242.974; 5.288.644; 5.324.633; 5.384.261; 5.405.783; 5.412.087; 5.424.186; 5.429.807; 5.432.049; 5.436.327; 5.445.934; 5.468.613; 5.470.710; 5.472.672; 806; 5.525.464; 5.503.980; 5.510.270; 5.525.464; 5.527.681; 5.529.756; 5.532.128; 5.545.531; 5.547.839; 5.554.501; 5.556.752; 5.561.071; 5.571.639; 5.580.726; 5.580.732; 5.593.839; 5.599.695; 5.599.672; 5.610;287;

5.624.711; 5.631.134; 5.639.603; 5.654.413; 5.658.734; 5.661.028; 5.665.547; 5.667.972; 5.695.940; 5.700.637;

5.744.305; 5.800.992; 5.807.522; 5.830.645; 5.837.196; 5.871.928; 5.847.219; 5.876.932; 5.919.626; 6.004.755;

6.087.102; 6.368.799; 6.383.749; 6.617.112; 6.638.717; 6.720.138, al igual que WO 93/17126; WO 95/11995;

WO 95/21265; WO 95/21944; WO 95/35505; WO 96/31622; WO 97/10365; WO 97/27317; WO 99/35505; WO 09923256; WO 09936760; WO0138580; WO 0168255; WO 03020898; WO 03040410; WO 03053586; WO 03087297; WO 03091426; WO03100012; WO 04020085; WO 04027093; EP 373 203; EP 785 280; EP 799 897 y UK 8 803 000. Se contempla que las matrices pueden ser matrices de alta densidad, de manera que contienen 100 o mas sondas diferentes. Se contempla que pueden contener 1.000, 16.000, 65.000, 250.000 o 1.000.000 o mas sondas diferentes. Las sondas se pueden dirigir a objetivos en uno o mas organismos diferentes. Las sondas de oligonucleotidos varian de 5 a 50, de 5 a 45, de 10 a 40, o de 15 a 40 nucleotidos de longitud en algunas formas de realizacion, en algunas formas de realizacion, las sondas de oligonucleotidos son de 20 a 25 nucleotidos de longitud.

[0135] La ubicacion y la secuencia de cada secuencia de sonda diferente en la matriz se conocen generalmente. Ademas, el gran numero de diferentes sondas puede ocupar una area pequena relativamente proporcionando una matriz de alta densidad que tiene una densidad de sonda generalmente mayor de aproximadamente 60, 100, 600, 1.000, 5.000, 10.000, 40.000, 100.000 o 400.000 sondas de oligonucleotidos diferentes por cm2. El area de superficie de la matriz puede ser de aproximadamente o menos de aproximadamente 1, 1,6, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 cm2. Ademas, una persona experta en la tecnica en la materia podria facilmente analizar datos generados utilizando una matriz. Tales protocolos se han descrito anteriormente, e incluyen informacion que se encuentra en WO 9743450; WO 03023058; WO 03022421; WO 03029485; WO03067217 WO 03066906; WO 03076928; WO 03093810; WO 03100448A1. Recientemente, metodos de perfilacion alternativos se han hecho disponibles, basados en hibridacion de solucion e inmovilizacion e identificacion posterior por ejemplo, la plataforma Illumina.

Preparacion de la muestra

[0136] Se contempla que el ARNmi de una amplia variedad de muestras se puede analizar utilizando ensayos descritos aqui. Mientras que el ARNmi endogeno se contempla para su uso con algunas formas de realizacion, el ARNmi recombinante o sintetico - incluyendo acidos nucleicos que son identicos a ARNmi endogeno o ARNmi precursor tambien se pueden manejar y analizar como se describe en este caso. Las muestras pueden ser muestras biologicas, en cuyo caso, pueden ser de sangre, fluido cerebroespinal, tejido, organos, tumor, semen, esputo, deposicion, orina, saliva, lagrimas, otro fluido corporal, foliculos pilosos, piel, o cualquier muestra que contenga o este formada por celulas biologicas. Alternativamente, la muestra puede no ser una muestra biologica, sino ser una mezcla quimica, tal como una mezcla reactiva libre de celulas (que puede contener una o mas enzimas biologicas).

Ensayos celulares para identificar ARNmi con lazos con la enfermedad

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[0137] Especificamente se contemplan dentro de la descripcion las aplicaciones que incluyen la identificacion de los ARNmi que contribuyen a la EMT que son partes ellos mismos de una enfermedad o condicion o pueden de otro modo estar asociados a un estado de enfermedad particular. Adicionalmente, una aplicacion contemplada incluye la identificacion de ARNmi que sean capaces de revertir la EMT e inducir la MET. Tambien, las funciones de ARNmi se pueden comparar entre una que se cree que es susceptible de una enfermedad particular o condicion asociada a la EMT y una que se cree que no es susceptible o resistente a esa enfermedad o condicion. Concretamente se contempla que las moleculas de ARN de la presente invencion pueden utilizarse para tratar cualquiera de las enfermedades o condiciones discutidas en la seccion precedente o para modular cualquiera de las vias celulares discutidas en la seccion precedente. Aplicaciones que se contemplan especificamente incluyen la identificacion de los ARNmi que contribuyen a los procesos celulares de EMT que son partes ellos mismos de una enfermedad o pueden de otro modo estar asociados a un estado de enfermedad particular. Tambien, las funciones de ARNmi se pueden comparar entre una muestra que se cree que es susceptible de una enfermedad particular o condicion asociada a la EMT y una que se cree que no es susceptible o resistente a esa enfermedad o condicion.

[0138] La eficacia de diferentes farmacos terapeuticos se puede alterar mediante los ARNmi tal y como se definen y usan segun la presente invencion. Ademas, se ha descrito que las celulas tumorales que han sido sometidas a EMT pueden hacerse resistentes a la quimioterapia y la inmunoterapia (Thiery et al. 2009 Cell 139:871-90). Por lo tanto, los farmacos basados en ARNmi que inducen la inversion de la EMT pueden mejorar la susceptibilidad a, por ejemplo, a la quimioterapia y la inmunoterapia. Tales farmacos terapeuticos incluyen, pero de forma no limitativa, farmacos quimioterapeuticos. Un "agente quimioterapeutico" se utiliza para connotar un compuesto o composicion que se administra en el tratamiento contra el cancer. Estos agentes o farmacos se categorizan por su modo de actividad dentro de una celula, por ejemplo, si afectan y hasta que grado afectan al ciclo celular. Alternativamente, un agente se puede caracterizar basado en su capacidad para reticular directamente ADN, para intercalar en ADN, o para inducir aberraciones cromosomicas y mitoticas afectando la sintesis de acido nucleico. Muchos agentes quimioterapeuticos entran dentro de las siguientes categorias: agentes alquilantes, antimetabolitos, antibioticos antitumorales, inhibidores mitoticos y nitrosureas.

[0139] Ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y

ciclosfosfamida; sulfonatos de alquilo tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenemelamina, trietilenofosforamida, trietiilenotiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo el analogo sintetico topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus analogos sinteticos de adocelesina, carcelesina y bicelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los analogos sinteticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrogeno tales como clorambucil, clornafacina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de oxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibioticos tales como los antibioticos de enedina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama y caliqueamicina omega); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; al igual que cromoforo de neocarcinostatina y cromoforos antibioticos de cromoproteina enediina relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, autrarnicin, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinias, dactinomicina, daunorubicina,

detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo morfolmo-doxorubicina, cianomorfolino- doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, acido micofenolico, nogalarnicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, cinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracil (5-FU); analogos de acido folico tal como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-suprarrenales tales como

aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de acido folico tal como acido frolinico; aceglatona; glicosido de aldofosfamida; acido aminolevulinico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; un epotilono; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; acido podofilinico; 2-etilhidracido; procarbazina; complejo polisacarido PSK; razoxano; rhizoxina; sizofirana; espirogermanio; acido tenuazonico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenas (especialmente T-2 toxina, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel y doxetaxel; clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; complejos de coordinacion de platino tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecan (por ejemplo, CPT-Il); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometlhilornitina (DMFO); retinoides

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tales como acido retinoico; capecitabina; y sales farmaceuticamente aceptables, acidos o derivados de cualquiera de los anteriores.

[0140] Tambien se incluyen en esta definicion los agentes anti-hormonales que actuan para regular o inhibir la accion de la hormona en tumores tales como los anti-estrogenos y moduladores receptores de estrogenos selectivos (SERMs), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LYl 17018, onapristona y toremifeno; inhibidores de aromatasa que inhiben la aromatasa enzimatica, que regula la produccion de estrogenos en las glandulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazolas, aminoglutetimida, acetato de megestrol, exemestano, formestania, fadrozol, vorozol, letrozol y anastrozol; y anti- androgenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; al igual que troxacitabina (un analogo de 1,3-dioxolano nucleosido citosina); oligonucleotidos antisentido, particularmente los que inhiben la expresion de genes en la senalizacion de vias implicadas en la proliferacion celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-a, Raf y H-Ras; ribozimas tales como un inhibidor de expresion VEGF y un inhibidor de expresion HER2; vacunas tales como vacunas de terapia genica y sales farmaceuticamente aceptables, acidos o derivados de cualquiera de los anteriores. Una lista de farmacos oncologicos aprobada por la FDA de EEUU con sus indicaciones aprobadas se puede encontrar en
www.accessdata.FDA.gov/scripts/cder/onctools/druglist.cfm. Ademas, se contempla que muestras que tienen diferencias en la actividad de ciertas vias tambien se puedan comparar. Tales vias celulares incluyen pero de forma no limitativa lo siguiente: cualquier via de adhesion o de motilidad incluyendo, pero no limitado a, aquellas que implican AMP ciclico, proteina quinasa A, receptores de pares de proteina de G, adenilciclasa, L-selectina, E-selectina, PECAM, VCAM-I, a-actinina, paxilina, cadherinas, AKT, integrina-a, integrina-p, RAF-I, ERK, PI-3 quinasa, vinculina, metaloproteinasas matriciales, Rho GTPasas, p85, factores trebol, profilina, FAK, MAP quinasa, Ras, caveolina, calpaina-1, calpaina-2, receptor de factor de crecimiento epidermico, ICAM-1, ICAM-2, cofilina, actina, gelsolina, Rho A, Rac, quinasa de cadena ligera de la miosina, receptor de factor de crecimiento derivado de las plaquetas o ezrina; cualquier via de apoptosis incluyendo, pero no limitada a, aquellas que implican AKT, ligando Fas, NFKB, caspasa-9, quinasa PB, caspasa- 3, caspasa-7, ICAD, CAD, EndoG, granzima B, Bad, Bax, Bid, Bak, APAF-I, citocromo C, p53, ATM, Bcl-2, PARP, Chk1, Chk2, Rho-21, c-Jun, Rho73, Rad51, Mdm2, Rad50, c-Abl, BRCA-I, perforina, caspasa-4, caspasa- 8, caspasa-6, caspasa-1, caspasa-2, caspasa-10, Rho, Jun quinasa, Jun quinasa quinasa, Rip2, lamina-A,, lamina-Bl, lamina-B2, receptor Fas, H2O2, granzima A, NADPH oxidasa, HMG2, CD4; Cd28, CD3, TRADD, IKK, FADD, GADD45, receptor de muerte DR3, receptor de muerte DR4/5, FLIPs, APO-3, GRB2, SHC, ERK, MEK, RAF-1, AMP ciclico, proteina quinasa A, E2F, proteina de retinoblastoma, Smac/Diablo, receptor ACH, 14- 3-3, FAK, SODD, receptor TNF, RTP, ciclina DI, PCNA, BcI-XL, PIP2, PIP3, PTEN, ATM, Cdc2, proteina quinasa C, calcineurina, IKKa, IKKp, IKKy, SOS-I, c-FOS, Traf-1, Traf-2, IkBP o el proteasoma; cualquier via de activacion celular incluyendo, pero no limitada a, aquellas que implican proteina quinasa A, oxido nitrico, caveolina-1, actina, calcio, proteina quinasa C, Cdc2, ciclina B, Cdc25, GRB2, SRC proteina quinasa, factores de ribosilacion de ADP (ARFs), fosfolipasa D, AKAP95; p68, Aurora B, CDK1, Eg7, histona H3, PKAc, CD80, PI3 quinasa, WASP, Arp2, Arp3, p34, p20, PP2A, angiotensina, enzima de conversion de angiotensina, receptor activado de proteasa-1, receptor activado de proteasa-4, Ras, RAF-I, PLCp, PLCy, COX-I, receptores acoplados a proteina G, fosfolipasa a2, IP3, SUMO1, SUMO 2/3, ubiquitina, Ran, Ran-GAP, Ran-GEF, p53, glucocorticoides, receptor de glucocorticoides, componentes del complejo SWI/SNF, RanBP1, RanBP2, importinas, exportinas, RCC1, CD40, ligando CD40, p38, DCKa, IRKp, NFKB, TRAF2, TRAF3, TRAF5, TRAF6, IL-4, receptor de IL-4, CDK5, factor de transcripcion de AP-I, CD45, CD4, receptores de celulas T, quinasa MAP, factor de crecimiento de nervio, receptor de factor de crecimiento de nervio, c-Jun, c-Fos, Jun kinase, GRB2, SOS-I, ERK-I, ERK, JAK2, STAT4, IL-12, receptor de IL-12, sintasa de oxido nitrico, TYK2, IFNy, elastasa, IL-8, epitelinas, IL-2, receptor de IL-2, CD28, SMaD3, SMAD4, TGFp o receptor de TGFp; cualquier ruta de regulacion de ciclo celular, senalizacion o diferenciacion incluyendo pero, no limitado a, aquellas que implican TNFs, SRC proteina quinasa, Cdc2, ciclina B, Grb2, Sos- 1, SHC, p68, Aurora quinasas, proteina quinasa A, proteina quinasa C, Eg7, p53, ciclinas, quinasas dependientes de ciclina, factor de crecimiento neuronal, factor de crecimiento epidermico, proteina de retinoblastoma, ATF-2, ATM, ATR, AKT, CHK1, CHK2, 14-3-3, WEE1, CDC25 CDC6, proteinas de complejo de reconocimiento de origen, p15, p16, p27, p21, ABL, c- ABL, SMADs, ubiquitina, SUMO, proteinas de choque termico, Wnt, GSK-3, angiotensina, p73 cualquier PPAR, TGFa, TGFp, p300, MDM2, GADD45, Notch, cdc34, BRCA-I, BRCA- 2, SKP1, el proteasoma, CUL1, E2F, pi 07, hormonas esteroideas, receptores de hormonas esteroideas, kBa, IKBp, Sin3A, proteinas de choque termico, Ras, Rho, ERKs, IKKs, PI3 quinasa, Bcl- 2, Bax, PCNA, quinasas MAP, dineina, RhoA, PKAc, ciclina AMP, FAK, PIP2, PIP3, integrinas, trombopoyetina, FAS, ligando Fas, PLK3, MEKs, JAKs, STATs, acetilcolina, calcineurina de paxilina, p38, importinas, exportinas, Ran, Rad50, Rad51, ADN polimerasa, ARN-polimerasa, Ran-GAP, Ran-GEF, NuMA, Tpx2, RCC1, Sonic Hedgehog, Crml, Patched (Ptc-1), MPF, CaM quinasas, tubulina, actina, proteinas asociadas a cinetocoro, proteinas de union a centromero, telomerasa, TERT, PP2A, c-MYC insulina, receptores de celulas T, receptores de celulas B, CBP, 1KB, NFKB, RAC1, RAF1, EPO, diacilglicerol, c-Jun, c-Fos, Jun quinasa, factores inducibles por hipoxia, GATA4, p-catenina, a-catenina, calcio, arrestina, survivina, caspasas, procaspases, CREB, CREM, cadherinas, PECAMs, corticoesteroides, factores que estimulan colonias, calpainas, adenilciclasa, factores de crecimiento, oxido nitrico, receptores de transmembrana, retinoides, proteinas G, canales ionicos, activadores transcripcionales, coactivadores transcripcionales, represores transcripcionales, interleuquinas, vitaminas, interferones, correpresores transcripcionales, el poro nuclear, nitrogeno, toxinas, proteolisis, o fosforilacion; o cualquier via metabolica incluyendo pero, no limitada a, las que implican la biosintesis de aminoacidos, oxidacion de acidos grasos, biosintesis de neurotransmisores y otras moleculas de senalizacion celular, biosintesis de

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poliaminas, biosintesis de Kpidos y esfingolipidos, catabolismo de aminoacidos y nutrientes, smtesis de nucleotidos, eicosanoides, reacciones de transporte de electrones, degradacion asociada a ER, glucolisis, fibrinolisis, formation de cuerpos cetonicos, formation de fagosomas, metabolismo de colesterol, regulation de ingesta de alimentos, homeostasis de energia, activation de protrombina, sintesis de lactosa y otros azucares, resistencia a multifarmacos, biosmtesis de fosfatidilcolina, el proteasoma, proteina precursora amiloide, Rab GTPasas, sintesis de almidon, glicosilacion, smtesis de fosfogliceridos, vitaminas, el ciclo del acido titrico, receptor IGF-I, el ciclo de la urea, transporte vesicular o vias de salvamento. Ademas se contempla que las moleculas de acidos nucleicos de la invention se puedan emplear en metodos de diagnostico y terapeuticos con respecto a cualquiera de las vias o factores anteriores. Asi, en algunas formas de realization de la invencion, un ARNmi inhibe, elimina, activa, induce, aumenta o de otro modo modula una o mas de las vias anteriores o factores se contempla como parte de metodos de la invencion. El acido nucleico se puede usar en la divulgation para diagnosticar una enfermedad o condition basada en la relation de ese ARNmi con cualquiera de las vias anteriormente descritas.

Otros ensayos

[0141] Ademas del uso de matrices y micromatrices, se contempla que un numero de ensayos de diferencia se podrian emplear para analizar los ARNmi, sus actividades y sus efectos. Tales ensayos incluyen, pero de forma no limitativa, RT-PCR, hibridacion in situ, ensayo de protection de hibridacion (HPA)(GenProbe), ensayo de ADN ramificado (bDNA) (Collins, M. L. et al. (1997). Nucleic Acids Research 25: 2979-2984), amplification de circulo rodante (RCA), detection de hibridacion de molecula unica (US Genomics), ensayo invasor (ThirdWave Technologies) y ensayo de union puente (Qiagen). Se contempla que tales metodos se pueden utilizar en el contexto de matrices, al igual que en el contexto de ensayos de diagnostico.

Aplicaciones terapeuticas y de diagnostico

[0142] Los ARNmi que afectan rasgos fenotipicos proporcionan puntos de intervention para aplicaciones terapeuticas al igual que para aplicaciones de diagnostico (mediante la seleccion para la presencia o ausencia de un ARNmi particular). Concretamente se contempla que las moleculas de ARN de la presente invencion pueden utilizarse para tratar cualquiera de las enfermedades o condiciones discutidas en la section precedente. Ademas, cualquiera de los metodos anteriormente descritos tambien se puede emplear con respecto a aspectos terapeuticos de la invencion. Ademas, cualquiera de los metodos anteriormente descritos tambien se puede emplear con respecto a aspectos de diagnostico de la divulgacion. Por ejemplo, metodos con respecto a la deteccion de ARNmi o seleccion de estos tambien se pueden emplear en un contexto de diagnostico. En usos terapeuticos, una cantidad eficaz de los ARNmi de la presente invencion se administra a una celula, que puede o no estar en un animal. En algunas formas de realizacion, una cantidad terapeuticamente eficaz de los ARNmi de la presente invencion se administra a un individuo para el tratamiento contra el cancer asociado a la EMT. El termino "cantidad eficaz", como se utiliza en este caso, se define como la cantidad de las moleculas de la presente invencion que es necesaria para dar como resultado el cambio fisiologico deseado en la celula o tejido al que se administra. El termino "cantidad terapeuticamente eficaz", como se utiliza en este caso, se define como la cantidad de moleculas de la presente invencion que consigue un efecto deseado con respecto a un cancer asociado a la EMT como se ha definido en la presente anteriormente. Un experto en la materia reconoce facilmente que en muchos casos las moleculas pueden no proporcionar una cura pero pueden proporcionar un beneficio parcial, tal como un alivio o mejora de al menos un sintoma. En algunas formas de realizacion, un cambio fisiologico que tiene algun beneficio se considera tambien beneficioso terapeuticamente. Asi, en algunas formas de realizacion, una cantidad de moleculas que proporciona un cambio fisiologico se considera una "cantidad efectiva" o una "cantidad terapeuticamente efectiva".

[0143] En algunas formas de realizacion una molecula tiene una secuencia que corresponde a la secuencia de ARNmi a partir de ese animal particular, a diferencia de otro animal. Asi, en algunas formas de realizacion, una secuencia humana se utiliza como una molecula de ARN de la presente invencion. En experimentos in vivo, una secuencia ARNmi usada en un animal de prueba puede diferir de una secuencia humana correspondiente. En este caso, un ARNmi que difiere de la secuencia humana se puede usar para demostrar efecto terapeutico en el animal. Los resultados obtenidos con esta secuencia evaluada en un animal se pueden extrapolar a resultados previstos en humanos con una molecula de ARNmi correspondiente.

Modos de administration y formulaciones

[0144] Las moleculas de acido nucleico de la invencion se pueden administrar a un sujeto solo o en forma de una composition farmaceutica para el tratamiento de una condicion o enfermedad. Las composiciones farmaceuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o mas portadores fisiologicamente aceptables, diluyentes, excipientes o productos auxiliares que facilitan el procesamiento del ARNmi en preparaciones que se pueden usar farmaceuticamente. La formulation apropiada depende de la ruta de administracion elegida. Para la administracion topica los ARNmi de la invencion se pueden formular como soluciones, geles, pomadas, cremas, suspensiones, etc. como bien se conocen en la tecnica. Las formulaciones sistemicas incluyen aquellas disenadas para la administracion por inyeccion, por ejemplo, inyeccion subcutanea, intravenosa, intramuscular,

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intratecal o intraperitoneal, al igual que las disenadas para administracion transdermica, transmucosa, inhalacion, oral o pulmonar. Para la inyeccion, los acidos nucleicos de la invencion se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones compatibles fisiologicamente tales como la solucion de Hanks, la solucion de Ringer, o tampon de solucion salina fisiologica. La solucion puede contener agentes formulatorios tales como agentes suspension, estabilizantes y/o de dispersion.

[0145] Alternativamente, las moleculas de acido nucleico pueden ser en polvo para la constitucion con un vehiculo adecuado, por ejemplo, agua sin pirogeno esteril, antes de su uso. Para la administracion transmucosa, penetrantes apropiados para que la barrera sea permeada se usan en la formulacion. Tales penetrantes se conocen generalmente en la tecnica. Para la administracion oral, los acidos nucleicos se pueden formular facilmente combinando las moleculas con portadores farmaceuticamente aceptables bien conocidos en la tecnica. Tales portadores permiten que los acidos nucleicos de la invencion se formulen como comprimidos, pildoras, grageas, capsulas, fiquidos, geles, jarabes, lodos, suspensiones y similares, para ingestion oral por un paciente a tratar. Para formulaciones solidas orales tales como, por ejemplo, polvos, capsulas y comprimidos, excipientes adecuados incluyen productos de relleno tales como azucares, por ejemplo lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa tales como almidon de maiz, almidon de trigo, almidon de arroz, almidon de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica y/o polivinilpirrolidona (PVP); agentes de granulacion; y agentes aglutinantes. Si se desea, agentes de desintegracion pueden ser adicionados, como la polivinilpirrolidona reticulada, agar, o acido alginico o una sal derivada tal como alginato de sodio. Si se desea, formas de dosificacion solidas puede estar recubiertas con azucar o recubiertas entericas utilizando tecnicas estandar. Para preparaciones liquidas oral tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones, portadores, excipientes o diluyentes adecuados incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, etc. Adicionalmente, agentes aromatizantes, conservantes, agentes colorantes y similares pueden ser adicionados. Para la administracion bucal, las moleculas puede tomar la forma de comprimidos, pastillas, etc. formulados de manera convencional. Para la administracion por inhalacion, las moleculas para su uso segun la presente invencion se entregan convenientemente en forma de un aerosol desde embalajes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificacion se puede determinar mediante una valvula para entregar una cantidad dosificada. Las capsulas y cartuchos de gelatina para su uso en un inhalador o insuflador se pueden formular con una mezcla de polvo de los acidos nucleicos y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidon. Las moleculas de ARN tambien se pueden formular en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retencion, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tal como manteca de cacao u otros gliceridos.

[0146] Ademas de las formulaciones descritas previamente, las moleculas tambien se pueden formular como una preparacion de deposito. Tales formulaciones de larga actuacion se pueden administrar por implantacion (por ejemplo subcutaneamente o intramuscularmente) o por inyeccion intramuscular. Asi, por ejemplo, las moleculas se pueden formular con materiales polimericos adecuados o hidrofobicos (por ejemplo como una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio de iones, o como derivados dificilmente solubles, por ejemplo, como una sal dificilmente soluble. Alternativamente, otros sistemas de entrega farmaceutica se pueden emplear.

[0147] Liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos por vehiculos de entrega que se pueden utilizar para entregar acidos nucleicos de la invencion.

[0148] Un acido nucleico de la invencion se puede administrar en combinacion con un portador o lipido para aumentar la absorcion celular. Por ejemplo, el oligonucleotido se puede administrar en combinacion con un lipido cationico. Ejemplos de fipidos cationicos incluyen, pero de forma no limitativa, lipofectina, DOTMA, DOPE y DOTAP. La publicacion de la WO0071096 describe formulaciones diferentes, tales como un DOTAP, colesterol o formulacion derivada de colesterol que se puede usar eficazmente para terapia genica. Otras descripciones tambien discuten diferentes formulaciones de lipidos o liposomicas incluyendo nanoparticulas y metodos de administracion; estas incluyen, pero de forma no limitativa, la publicacion de patente de EEUU 20030203865, 20020150626, 20030032615 y 20040048787. Los metodos usados para la formacion de particulas tambien se describen en las patentes de EeUU numeros: 5.844.107, 5.877.302, 6.008.336, 6.077.835, 5.972.901, 6.200.801 y 5.972.900. Los acidos nucleicos tambien se pueden administrar en combinacion con una amina cationica tal como poli-L-lisina. Los acidos nucleicos tambien se pueden conjugar a una fraccion quimica, tal como transferrina y colesterilos. Ademas, los oligonucleotidos se pueden dirigir a ciertos organos o tejidos mediante el enlace de grupos quimicos especificos al oligonucleotido. Por ejemplo, la union del oligonucleotido a una matriz adecuada de residuos de manosa dirigira el oligonucleotido al higado. Otros ligandos objetivo se describen en Liu B., Brief Funct. Genomic Proteomic 6:112-119, 2007. Ejemplos adicionales son azucares de carbohidrato tales como galactosa, N-acetilgalactosamina, manosa; vitaminas tales como folatos; moleculas pequenas incluyendo naproxen, ibuprofeno u otras moleculas de union a proteina conocidas, ciclodextrina, que se dirige al receptor de transferrina, tambien llamada ciclodextrina modificada de transferencia (Hu-Lieskovan et al., 2005), PEI (RGD-targeted PEG-PEI, Schiffelers et al. 2004), anisamida, RGD-peptido o mimeticos de RGD, poliarginina, fragmento de anticuerpo monocatenario anti-TfR/TfRscFv, anexina A5 (que se dirige a las membranas que exponen fofatidilserina, Garnier B. et al., Bioconjug Chem., 2009, 11:2114-22), la WO 2009/126933 que describe

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composiciones y metodos para la entrega especifica de sitio de acidos nucleicos mediante la combinacion de estos con los ligandos objetivo y componentes endosomoliticos. Los ligandos de objetivo que son preferentemente adecuados son proteinas de superficie celular asociadas a tumores, mas preferiblemente proteinas de superficie celular asociadas a tumores de prostata. La direction de acidos nucleicos tambien se puede realizar usando tecnologia de aptamero como se describe en la WO2005/111238. Ademas, fracciones de lipidos adicionales, tales como PEG-lipidos, colesterol, Kpidos auxiliares endosomoliticos o peptidos (WO2009/046220) o la morfologia general de las nanoparticulas generadas (caracterizadas por la carga y el tamano de particula) para los vehiculos de entrega anteriormente mencionados pueden conferir especificidad de objetivo para celulas cancerosas y/o vasculatura tumoral.

[0149] Adicionalmente, las moleculas se pueden entregar utilizando un sistema de liberation prolongada, tal como matrices semipermeables de polimeros solidos que contienen el agente terapeutico. Varios de los materiales de liberacion prolongada se han establecido y son conocidos por aquellas personas expertas en la tecnica. Las capsulas de liberacion prolongada pueden, dependiendo de su naturaleza quimica, liberar las moleculas durante unas pocas semanas hasta mas de 100 dias. Dependiendo de la naturaleza quimica y la estabilidad biologica de las moleculas quimericas, estrategias adicionales para la estabilizacion de moleculas se pueden emplear.

[0150] Alternativamente, las moleculas se pueden entregar utilizando un sistema de entrega a base de quimica de coordination como se describe en la WO2007011217.

[0151] Los acidos nucleicos se pueden incluir en cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente como los acidos libres o bases o como sales farmaceuticamente aceptables. Sales farmaceuticamente aceptables son aquellas sales que sustancialmente retienen la actividad biologica de las bases libres y que se preparan por reaction con acidos inorganicos. Las sales farmaceuticas tienden a ser mas soluble en solventes acuosos y otros solventes proticos que las formas de base libre correspondientes.

[0152] Las composiciones farmaceuticas de la presente invention comprenden una cantidad eficaz de una o mas moleculas de ARNmi disueltas o dispersadas en un portador farmaceuticamente aceptable. Las frases "farmaceutico o farmaceuticamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen o producen reacciones adversas, alergicas u otras reacciones adversas aceptables cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un humano, segun sea apropiado. Si ciertos efectos adversos son aceptables se determina segun la gravedad de la enfermedad.

La preparation de una composition farmaceutica que contiene al menos un polipeptido quimerico o ingrediente activo adicional sera conocido por los expertos en la tecnica a la luz de la presente description, como se ejemplifica en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990. Ademas, para la administration a un animal (por ejemplo, humano) se entiende que las preparaciones deberia cumplir con los estandares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza como establece la FDA Office of Biological Standards.

[0153] Como se utiliza en este caso, "portador farmaceuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersion, recubrimientos, surfactantes, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifungicos), agentes isotonicos, agentes de retraso de absorcion, sales, conservantes, farmacos, estabilizadores de medicamento, geles, ligantes, excipientes, agentes de desintegracion, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, tintes, materiales similares y combinaciones de los mismos, como conoceria un tecnico en la materia (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company,1990, pp. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier portador convencional es incompatible con la sustancia activa, su uso en las composiciones farmaceuticas o terapeuticas se contempla.

[0154] Los ARNmi pueden comprender diferentes tipos de portadores dependiendo de si son para administrar en forma de solido, liquido o aerosol, y de si necesitan ser esteriles para este tipo de formas de administracion como inyeccion. La presente invencion se puede administrar por via intravenosa, intradermica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostatica, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravitrea, intravaginal, intrarrectal, topica, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutanea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericardial, intraumbilical, intraocular, oral, topica, local, inhalation (por ejemplo, inhalacion de aerosol), inyeccion, infusion, infusion continua, perfusion localizada banando celulas diana directamente, via un cateter, via un lavado, en cremas, en composiciones lipidicas (por ejemplo, liposomas), o por otro metodo o cualquier combinacion de lo anterior como conoceria un tecnico en la materia (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990).

[0155] La cantidad de dosificacion real de una composicion de la presente invencion administrada a un animal o un paciente se puede determinar por factores fisicos y fisiologicos tales como peso corporal, gravedad de condition, el tipo de enfermedad que se esta tratando, intervenciones terapeuticas precedentes o concurrentes, idiopatia del paciente y en la forma de administracion. El profesional responsable de la administracion

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determinara, de cualquier manera, la concentracion de ingrediente(s) activo(s) de una composition y la dosis apropiada para el sujeto particular.

[0156] En ciertas formas de realization, las composiciones farmaceuticas pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,1% de un compuesto activo. En otras formas de realizacion, un compuesto activo puede comprender entre aproximadamente 2% a aproximadamente 75% del peso de la unidad, o entre aproximadamente 25% a aproximadamente 60%, por ejemplo, o de 2% a 75% del peso de la unidad o de 25% a 60% por ejemplo y cualquier gama derivable de esta. En otros ejemplos no limitativos, una dosis tambien puede comprender menos de 1 microgramo/kg/peso corporal, o 1 microgramo/kg/peso corporal, desde 5 microgramo/kg/peso corporal, 10 microgramo/kg/peso corporal, 50 microgramo/kg/peso corporal, 100 microgramo/kg/peso corporal, 200 microgramo/kg/peso corporal, 350 microgramo/kg/peso corporal, 500 microgramo/kg/peso corporal, 1 miligramo/kg/peso corporal, 5 miligramo/kg/peso corporal, 10 miligramo/kg/peso corporal, 50 miligramo/kg/peso corporal, 100 miligramo/kg/peso corporal, 200 miligramo/kg/peso corporal, 350 miligramo/kg/peso corporal, o 500 miligramo/kg/peso corporal, a 1000 miligramo/kg/peso corporal o mas por administration, y cualquier gama derivable de esta. En ejemplos no limitativos de una gama derivable de las cifras enumeradas aqui, una gama de 5 miligramo/kg/peso corporal a 100 miligramo/kg/peso corporal, 5 microgramo/kg/peso corporal a 500 miligramo/kg/peso corporal, etc., se puede administrar, basada en las cifras anteriormente descritas.

[0157] En cualquier caso, la composicion puede comprender diferentes antioxidantes para retardar la oxidation de uno o mas componentes. Adicionalmente, la prevention de la action de microorganismos puede ser provocada por conservantes tales como varios agentes antibacterianos y antifungicos, incluyendo pero no limitados a parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal o combinaciones de los mismos.

[0158] Las moleculas se pueden formular en una composicion en forma de base libre, neutral o sal. Sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composicion proteinacea, o que se forman con acidos inorganicos tales como por ejemplo, acidos clorhidricos o fosforicos, o tales acidos organicos como acido acetico, oxalico, tartarico o mandelico. Sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien pueden derivar de bases inorganicas tales como por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidroxidos ferricos; o tales bases organicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaina.

[0159] En formas de realizacion donde la composicion esta en una forma liquida, un portador puede ser un solvente o medio de dispersion que comprende pero no esta limitado a, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol liquido, etc.), kpidos (por ejemplo, trigliceridos, aceites vegetales, liposomas) y combinaciones de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina; manteniendo el tamano de particula requerido mediante la dispersion en portadores tales como, por ejemplo poliol liquido o lipidos; por el uso de surfactantes tales como, por ejemplo hidroxipropilcelulosa; o combinaciones de los mismos de tales metodos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, tales como, por ejemplo, azucares, cloruro sodico o combinaciones de los mismos.

[0160] En otras formas de realizacion, se pueden usar colirios, soluciones o esprays nasales, aerosoles o inhalantes en la presente invention. Tales composiciones se disenan generalmente para ser compatibles con el tipo de tejido objetivo. En un ejemplo no limitativo, las soluciones nasales son normalmente soluciones acuosas disenadas para ser administradas a los orificios nasales en gotas o esprays. Las soluciones nasales se preparan de modo que son similares en muchos aspectos a las secreciones nasales, de modo que la accion ciliar normal se mantiene. Asi, en formas de realizacion preferidas las soluciones nasales acuosas normalmente son isotonicas o ligeramente tamponadas para mantener un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5. Ademas, conservantes antimicrobianos, similar a los usados en preparaciones oftalmicas, farmacos o estabilizadores de medicamentos apropiados, si es necesario, se pueden incluir en la formulation. Por ejemplo, varias preparaciones nasales comerciales se conocen e incluyen farmacos tales como antibioticos o antihistaminicos. En formas de realizacion determinadas, las moleculas se preparan para la administracion por vias tales como la ingestion oral. En estas formas de realizacion, la composicion solida puede comprender, por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pildoras, capsulas (por ejemplo, capsulas duras o blandas con carcasa de gelatina), formulaciones de liberation prolongada, composiciones bucales, pastillas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas o combinaciones de los mismos. Las composiciones orales se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta. Portadores preferidos para administracion oral comprenden diluyentes inertes, portadores comestibles asimilables o combinaciones de los mismos. En otros aspectos de la invencion, la composicion oral se puede preparar como un jarabe o elixir. Un jarabe o elixir, y puede comprender, por ejemplo, al menos un agente activo, un agente edulcorante, un conservante, un agente aromatizante, un tinte, un conservante o combinaciones de los mismos.

[0161] En determinadas formas de realizacion preferidas una composicion oral puede comprender uno o mas ligantes, excipientes, agentes de desintegracion, lubricantes, agentes aromatizantes y combinaciones de los mismos. En formas de realizacion determinadas, una composicion puede comprender uno o mas de los

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siguientes: un ligante, tal como, por ejemplo, goma tragacanto, acacia, almidon de maiz, gelatina o combinaciones de los mismos; un excipiente, tal como, por ejemplo, fosfato dicalcico, manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio o combinaciones del mismo; un agente de desintegracion, tal como, por ejemplo, almidon de maiz, almidon de patata, acido alginico o combinaciones del mismo; un lubricante, tal como, por ejemplo, estearato de magnesio; un agente edulcorante, tal como, por ejemplo, sacarosa, lactosa, sacarina o combinaciones de las mismas; un agente aromatizante, tal como, por ejemplo menta, aceite de gaulteria, aromatizante de cereza, aromatizante de naranja, etc. o combinaciones de los anteriormente mencionados. Cuando la forma unitaria de dosificacion es una capsula, puede contener, ademas de materiales del tipo anterior, portadores tales como un portador liquido. Varios materiales mas pueden estar presentes como recubrimientos o par modificar de otro modo la forma fisica de la unidad de dosificacion. Por ejemplo, comprimidos, pildoras o capsulas pueden estar recubiertos con goma laca, azucar o ambas.

[0162] La composicion debe ser estable bajo las condiciones de produccion y almacenamiento, y conservada contra la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciara que la contaminacion de endotoxina se mantenga minimamente a un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg proteina.

[0163] En formas de realizacion particulares, la absorcion prolongada de una composicion inyectable se puede provocar por el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorcion, tal como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.

[0164] Cualquier forma de realizacion mencionada anteriormente con respecto a la entrega o transporte a las celulas se puede emplear tambien con respecto a la implementacion de la entrega de compuestos medicinales discutidos en esta seccion.

Dosificaciones eficaces

[0165] Las moleculas de la invencion se usaran generalmente en una cantidad eficaz para conseguir el fin deseado. Para el uso para tratar o prevenir una condicion de enfermedad, las moleculas de la invencion, o composiciones farmaceuticas de las mismas, se administran o aplican en una cantidad terapeuticamente eficaz. Una cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad eficaz para mejorar o prevenir los sintomas, o prolongar la supervivencia del paciente que se va a tratar. La determinacion de una cantidad terapeuticamente eficaz esta bien en las capacidades de los expertos en la tecnica, especialmente en vista de la divulgacion detallada proporcionada aqui.

[0166] Para la administration sistemica, una dosis terapeuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, una dosis se puede formular en modelos animales para conseguir una gama de concentration circulante que incluye el EC50 como se determina en el cultivo celular. Tal information puede utilizarse para determinar con mas con precision las dosis utiles en seres humanos.

[0167] Las dosificaciones iniciales tambien se pueden estimar a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando tecnicas que se conocen en la tecnica. Un experto en la materia podrian facilmente optimizar la administracion a seres humanos basado en datos de animales.

[0168] La cantidad de dosificacion y el intervalo se puede ajustar individualmente para proporcionar niveles de plasma de las moleculas que son suficientes para mantener el efecto terapeutico. Las dosificaciones de pacientes usuales para la administracion por inyeccion varia de 0,01 a 0,1 mg/kg/dia, o de 0,1 a 5 mg/kg/dia, preferiblemente de 0,5 a 1 mg/kg/dia o mas. Niveles de suero eficaces terapeuticamente se pueden conseguir por la administracion de dosis multiples cada dia.

[0169] En casos de administracion local o absorcion selectiva, la concentracion local eficaz de las proteinas pueden no estar relacionada con la concentracion de plasma. Alguien de habilidad en la tecnica sera capaz de optimizar las dosificaciones locales eficaces terapeuticamente sin experimentation excesiva.

[0170] La cantidad de moleculas administradas dependera, por supuesto, del sujeto que se va a tratar, del peso del sujeto, de la gravedad de la afliccion, de la forma de administracion y de la decision del medico que prescribe.

[0171] La terapia se puede repetir intermitentemente cuando los sintomas son detectables o incluso cuando no son detectables. La terapia se puede proporcionar sola o en combination con otros farmacos o tratamientos (incluyendo cirugia).

Toxicidad

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[0172] Preferiblemente, una dosis terapeuticamente efectiva de las moleculas descritas aqui proporcionara beneficio terapeutico sin causar toxicidad sustancial. La toxicidad de las moleculas descritas aqui se pueden determinar por procedimientos farmaceuticos estandar en cultivos de celulas o animales experimentales, por ejemplo, determinando la LD50 (la dosis letal para el 50% de la poblacion) o la LD100 (la dosis letal para el 100% de la poblacion). La proportion de dosis entre el efecto toxico y terapeutico es el indice terapeutico. Se prefieren las proteinas que muestran altos indices terapeuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios de animales se pueden usar en la formulation de una gama de dosificaciones que no es toxica para su uso en seres humanos. La dosificacion de las proteinas descritas aqui se extiende preferiblemente dentro de una gama de concentraciones circulantes que incluye la dosis efectiva con poca o ninguna toxicidad. La dosificacion puede variar dentro de esta gama dependiendo de la forma de dosificacion empleada y la forma de administration utilizada. La formulacion exacta, la forma de administration y la dosificacion pueden ser elegidas por el medico particular en vista de la condition del paciente. (Vease, por ejemplo, Fingl et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1).

Grupos colgantes

[0173] Un "grupo colgante" se puede unir o conjugar al acido nucleico. Los grupos colgantes pueden aumentar la absorcion celular del acido nucleico. Los grupos colgantes se pueden enlazar a cualquier portion del acido nucleico pero estan comunmente enlazados al extremo(s) de la cadena de oligonucleotidos. Ejemplos de grupos colgantes incluyen, pero de forma no limitativa: derivados de acridina (es decir, 2-metoxi-6-cloro-9-amoacridina); reticuladores tales como los derivados de psoraleno, azidofenacilo, proflavina y azidoproflavina; endonucleasas artificiales; complejos metalicos tales como EDTA-Fe(II), o-fenantrolina-Cu(I), y porfirina-Fe(II); fracciones alquilantes; nucleasas tales como amino-1-hexanolstafilococal nucleasa y fosfatasa alcalina; transferasas terminales; abzimas; fracciones de colesteril; portadores lipofilicos; conjugados de peptido; alcoholes de cadena larga; esteres de fosfato; amino; grupos de mercapto; marcadores radiactivos; marcadores no radiactivos tales como tintes; y polilisina u otras poliaminas. En un ejemplo, el acido nucleico se conjuga con un carbohidrato, carbohidrato sulfatado o glicano.

Kits

[0174] Cualquiera de las composiciones descritas aqui puede estar comprendida en un kit. En un ejemplo no limitativo, los ARNmi individuales estan incluidos en un kit. El kit puede incluir ademas uno o mas ARNmi sinteticos de control negativo que pueden utilizarse para controlar los efectos de la entrega de ARNmi sinteticos. El kit puede incluir ademas agua y tampon de hibridacion para facilitar la hibridacion de las dos cadenas de los ARNmi sinteticos. El kit tambien puede incluir uno o mas reactivo(s) de transfection para facilitar la entrega del ARNmi a las celulas.

[0175] En otro ejemplo no limitativo, los ARNmi sinteticos multiples estan incluidos en un kit. El kit puede incluir ademas uno o mas ARNmi sinteticos de control negativo que pueden utilizarse para controlar los efectos de la entrega de los ARNmi sinteticos. El kit tambien puede incluir uno o mas reactivos de transfeccion para facilitar la entrega en celulas.

[0176] Los componentes de los kits se pueden empaquetar bien en medios acuosos o en forma liofilizada. Los medios contenedores de los kits incluiran generalmente por lo menos un vial, probeta, matraz, botella, jeringa u otros medios contenedores, en los que un componente se puede colocar, y preferiblemente, dividir en partes alicuotas adecuadamente. Donde hay mas de un componente en el kit (el reactivo de etiquetado y el marcador se pueden empaquetar juntos), el kit tambien generalmente contendra un segundo, tercero u otro contenedor adicional en el que los componentes adicionales se pueden colocar separadamente. Sin embargo, varias combinaciones de componentes pueden estar comprendidas en un frasco. Los kits de la presente invencion tambien tipicamente incluiran unos medios para contener los acidos nucleicos, y cualquiera de los otros contenedores reactivos confinamiento estrecho para la venta comercial. Tales contenedores pueden incluir contenedores de plastico moldeados por inyeccion o soplado en los que los viales deseados se retienen.

[0177] Cuando los componentes del kit estan provistos en una y/o mas soluciones liquidas, la solution kquida es una solucion acuosa, con una solucion acuosa esteril preferida particularmente.

[0178] Sin embargo, los componentes del kit pueden estar provistos como polvo seco. Cuando los reactivos y/o componentes estan provistos como un polvo seco, el polvo se puede reconstituir anadiendo un solvente adecuado. Se preve que el solvente tambien se pueda proporcionar en otros medios contenedores.

[0179] Los medios contenedores incluiran generalmente por lo menos un frasco, probeta, matraz, botella, jeringa y/o otros medios contenedores, en los que las formulaciones de acido nucleico se colocan, preferiblemente, situadas adecuadamente. Los kits tambien pueden comprender unos segundos medios contenedores para contener un tampon esteril farmaceuticamente aceptable y/o otro diluyente. Los kits de la presente invention tambien incluiran tipicamente medios para contener los viales en confinamiento estrecho para la venta comercial,

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tal como, por ejemplo, contenedores plasticos moldeados por inyeccion y/o soplado en los que los viales deseados se retienen.

[0180] Tales kits tambien pueden incluir componentes que preservan o mantienen el ARNmi o que protegen contra su degradacion. Tales componentes pueden ser libres de ARNasa o proteger contra las ARNasas. Tales kits generalmente comprenderan, en medios adecuados, contenedores diferentes para cada reactivo o solucion individual.

[0181] Un kit tambien incluira instrucciones para utilizar los componentes del equipo, al igual que el uso de cualquier otro reactivo no incluido en el kit. Las instrucciones pueden incluir variaciones que se pueden implementar.

[0182] Los kits de la invencion tambien pueden incluir uno o mas de los siguientes: ARNmi, biblioteca de ARNmi, biblioteca de combinacion de ARNmi, ARNmi de control negativo, agua libre de nucleasa; contenedores libres de ribonucleasa, tales como tubos de 1,5 ml; tampon de hibridacion; y reactivo(s) de transfeccion.

[0183] Se contempla que tales reactivos sean las formas de realizacion de los kits de la invencion. Tales kits, sin embargo, no se limitan a los articulos particulares identificados por encima y pueden incluir cualquier reactivo usado para la manipulacion o caracterizacion de ARNmi.

Identidad de secuencia

[0184] La "identidad de secuencia" se defiende aqui como una relacion entre dos o mas secuencias de acido nucleico (nucleotido, polinucleotido, ARN, ADN), como se determina por comparacion de las secuencias. En la tecnica, "identidad" tambien significa el grado de relacion de secuencia entre secuencias de acidos nucleicos, segun sea el caso, como se determina por la correspondencia entre cadenas de tales secuencias.

[0185] En una forma de realizacion preferida, la identidad tambien significa porcentaje de identidad y se puede calcular por el numero de nucleotidos iguales entre base de datos y consulta, dividido por la longitud total de la consulta, y multiplicado por 100.

[0186] La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular facilmente por metodos conocidos, incluyendo pero no limitado a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).

[0187] Metodos preferidos para determinar la identidad se disenan para dar la mayor correspondencia entre las secuencias evaluadas. Metodos para determinar la identidad y la similitud se codifican en programas informaticos disponibles publicamente. Metodos de programas informaticos preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen por ejemplo el paquete del programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). La programa BLAST X esta disponible publicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El algoritmo de Smith Waterman bien conocido tambien se puede usar para determinar la identidad.

[0188] Parametros preferidos para comparacion de acidos nucleicos incluyen el siguiente: algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Matriz de comparacion: coincidencias=+10, falta de coincidencia=0; Penalizacion por espacio: 50; Penalizacion por longitud de espacio: 3. Disponible como el programa Gap de Genetics Computer Group, situado en Madison, Wis. Anteriormente se han dado los parametros por defecto para comparaciones de acidos nucleicos.

[0189] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para referirse a que los articulos que van despues del verbo estan incluidos, pero articulos que no se mencionan especificamente no estan excluidos. Ademas el verbo "consistir" se puede sustituir por "consistir esencialmente en", que significa que una molecula de ARNmi, un equivalente o una fuente de la misma o una composicion tal y como se define aqui puede comprender componente(s) adicional(es) a los identificados especificamente, dicho(s) componente(s) adicional(es) no alteran la caracteristica unica de la invencion. Ademas, la referencia a un elemento por el articulo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad que mas de uno del elemento este presente, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. El articulo indefinido "un" o "una" normalmente significa "al menos uno". Los ejemplos siguientes se ofrecen para uso ilustrativo solo, y no estan destinados a limitar el alcance de la presente invencion de ninguna manera.

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Descripcion de las figuras

[0190]

Figura 1. Diagrama de flujo del protocolo de seleccion para la inversion de EMT, y vision de conjunto de los resultados obtenidos de una de las placas de la biblioteca de expresion de microARN basados en Lentivirus (ITM0081-0160). A, se anadio caldo de Lentivirus (1,0 ul; MOI=3 a 300) a celulas TSUpr1-pEcad-Luc durante 24 horas. Dos dias post-infeccion (dia 4), se aplico seleccion de puromicina, y seis dias post-infeccion (dia 8) se midio la actividad de luciferasa. B, las proporciones de luciferasa de luciernaga/Renilla corregida en la base se pusieron en placas contra MOI lentiviral. Los cuatro miRs con senales significativamente por encima de la base (proporcion FLuc/RLuc > media + 2 x desviacion tipica) estan rodeados. Los cuatro valores de control representan proporciones FLuc/RLuc inducidas por miR-141 y miR-200c, que fueron suministrados en tubos separados (ambos por duplicado).

Figura 2: vision de conjunto del vector de expresion pEcad-Luc/Rluc. El promotor del gen de CDH1 (GenBank L34545, posicion -294 a +44), que contiene las tres E-cajas, se obtuvo por amplificacion por PCR usando ADN genomico humano como un modelo. El fragmento promotor de CDH1 fue clonado arriba del gen de luciferasa de luciernaga en el vector basico pGL2 (Promega). El casete de luciferasa de Renilla dirigido por el promotor HSV- Tk se obtuvo a partir del vector pRL-TK (Promega), y el casete de resistencia a los antibioticos de zeocina dirigido por el promotor SV40 del vector pVgRXR (Invitrogen). La luciferasa de Renilla y los cassetes de ZeocinR fueron clonados en el vector basico pGL2 en las ubicaciones indicadas.

Figura 3: caracterizacion de modelos de linea celular tumoral. El ARN total fue aislado de cultivos de linea celular confluyente al 70-80%, y analizado para CDH1 y expresion de vimentina por qPCR. Los valores de expresion relativos se representaron graficamente, y las celulas con alto CDH1/bajo VIM y bajo CDH1/alto VIM fueron designadas epitelial y mesenquimal, respectivamente.

Figura 4: induction de MET usando mimeticos de ARNmi sinteticos. A, celulas TSUpr1-pEcad-Luc se transfectaron transitoriamente con 20 a 60 nM de mimeticos de miR sinteticos (Ambion o Dharmacon; vease tabla 7 para detalles). Cuatro dias post-transfeccion, la actividad de Luc y RLuc se midio, y las proporciones Luc/RLuc se normalizaron para celulas transfectadas de control negativo (NC). B, las celulas fueron transfectadas y tratadas como se describe en la figura 4A. El ARN total fue aislado y usado para analisis de ARNmi y qPCR genica. Los niveles de expresion de CDH1 y CDH2, normalizados para el gen de mantenimiento HPRT, como porcentaje de celulas transfectadas NC se muestran. C, diferentes lineas celulares tumorales parentales se transfectaron con mimeticos de miR-200c y miR-520f y otros mimeticos de miR y se analizaron para expresion de CDH1 (como se describe en la Fig. 4B).

Figura 5: creation de sistemas de expresion de ARNmi inducibles por doxiciclina. A, los precursores de miR- 200c y miR-520f fueron aislados del provirus integrado en celulas TSUpr1 infectadas con lentivirus pCDH (en los experimentos de seleccion de miR) por digestion enzimatica de restriction. Los precursores de miR fueron clonados en los sitios NheI/EagI del vector de expresion de miR inducible por pmRi-ZsGreen1 (Clontech PT5049- 1). El mapa del vector de expresion miR-520f se muestra. B, las celulas PC3 (ATCC# CRL-1435) fueron transfectadas con el vector avanzado pTet-on (Clontech PT3899-5), y seleccionadas en el medio que contiene G418 (300ug/ml). Las celulas fueron transitoriamente transfectadas con el vector indicador pTRE-Luc, tratadas con 0, 0,1 y 1,0 ug/ml doxiciclina (DOX, Sigma D9891) durante 2 dias, y luego analizadas para activation de Luc. C, las celulas PC3-Tet-on (clon 8) fueron luego transfectadas con el vector pmRi-ZsGreen1-miR-200c o miR- 520f, y seleccionadas en el medio que contiene puromicina (5ug/ml). Los clones estables de PC3-mRi-ZsGreen- miR-X fueron evaluados para la induccion de ARNmi y expresion genica. Las celulas fueron tratadas con 0 y 1,0 ug/ml DOX durante 4 dias, ARN total fue aislado, y ARNmi y expresion genica (tabla 8) fueron analizados por qPCR.

Figura 6: influencia de ARNmi en la invasion de celulas tumorales. A, cincuenta mil (PC3) o cuarenta mil (TSUpr1) celulas fueron sembradas en camaras de invasion Biocoat Matrigel, 8 micras (BD 354480), en medio sin suero. La camara de invasion fue colocada en 24-pocillos con medio con 10% de suero fetal de ternera como quimioatrayente. Como un control, la misma cantidad de celulas fue sembrada sobre la superficie de una placa de cultivo de 24 pocillos. Despues de 48 horas de incubation, las celulas en de camara de invasion fueron retiradas por aspiration y limpieza del compartimento interno con un hisopo. La camara de invasion se puso luego en reactivo de viabilidad celular CellTiter-GLO (CTG, Promega-G7571) e incubado durante 15 minutos. La actividad de CTG se midio en un luminometro Victor3. B, ensayos de invasion celular fueron realizadas con celulas PC3-mRi-ZsGreen1-miR-X que fueron pretratadas durante 2 dias con 1yug/ml DOX. Ademas, las celulas PC3 infectadas con lentivirus miR-200c y miR-520f (MOI=30), y seleccionadas en la puromicina durante 4 dias, fueron usadas. El porcentaje de invasion celular fue calculado como la actividad de CTG en la parte inferior de la membrana dividida por el total de actividad de CTG (de las celulas crecidas en la superficie de una placa de cultivo de 24 pocillos). La inhibition de invasion celular por un ARNmi especifico fue calculada por la division del porcentaje de invasion celular contra celulas no tratadas (-DOX) o de control (virus de vector vacio). C, los

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niveles de expresion de microARN relativos en cultivos paralelos se determinaron por RT-qPCR de tallo-bucle. D, los ensayos de invasion celular fueron realizadas con celulas TSUpr-pEcad que fueron infectadas con lentivirus que contiene precursor miR-124-1, miR-181a-1, miR-200c, miR-206, miR-518b, miR-520f o miR-524 de vector vacio (MOI=30), y seleccionados en puromicina durante 4 dias. La invasion celular fue calculada como se describe en la Fig. 6B.

Ejemplos

Ejemplo 1

Material y metodos

Generacion de la biblioteca lentiviral que codifica ARNmi

constituyente

concentracion volumen proveedor / cat. #

tampon

10X 1 uL Stratagene / 600159

dNTPs

10 mM cada 0,2 uL GE Healthcare / 27-18(5-8)0-04

cebador sentido

10 uM 0,2 uL IDT (Integrated DNA Technologies)

cebador antisentido

10 uM 0,2 uL " "

gADN

100 ng/uL 0,1 uL fuente privada

Pfu ADN pol

2.5 U/uL 0,1 uL Stratagene / 600159

H2O

N/A 8,2 uL N/A

temp. (°C) tiempo ciclos

95 2 min

95 15 s 40

59* 15 s 40 * -0,1 °C / ciclo

72 90 s 40

72 15 min

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[0191] Los ARNmi humanos fueron seleccionados tanto del repositorio de ARNmi publico (
www.mirbase.org) como de los datos de secuenciacion profunda de ARN pequenos propietarios (vease WO 2007/081204). Las secuencias de ARNmi fueron amplificadas desde su ubicacion genomica con amplicones que contenian la horquilla de pre-ARNmi en toda su longitud y una secuencia flanqueante en ambos lados de 50-150 pares de bases. Los cebadores para los amplicones fueron disenados utilizando el software Primer3 (
www.geneious.com). Si el programa de diseno de cebador no pudo encontrar cebadores apropiados en las secuencias designadas, los requisitos para las secuencias flanqueantes se ajustaron a 0-200 pares de bases. Los cebadores disenados fueron complementados con un saliente 5' GCGC y un sitio de restriction para la donation direccional. Como predeterminado el cebador arriba del ARNmi fue complementado con un sitio de restriccion BamHI (GGATCC) y el cebador abajo del ARNmi fue complementado con un sitio de restriccion EcoRI (GAATTC). Los cebadores de los amplicones con sitios de restriccion BamHI o EcoRI internos (es decir, que se producen en la secuencia genomica) fueron complementados con bien un sitio BglII (AGATCT) o un sitio XbaI (TCTAGA) respectivamente. Los ARNmi fueron amplificados utilizando los cebadores anteriormente mencionados a partir de ADN genomico humano de un individuo individual en la siguiente reaction por PCR:

[0192] Todos los loci de ARNmi fueron amplificados en reacciones separadas de PCR de 10 uL. Los productos fueron purificados utilizando el equipo de tampon Qiagen PCR Clean-Up y las placas de filtro Whatman Unifilter GF/C (Cat. # 7700-1101). El ADN fue eluido con 17 uL H2O por pocillo. Los eluatos separados fueron usados en la siguiente reaccion de restriccion:

constituyente

concentracion volumen proveedor / cat. #

tampon E

10X 2 uL Promega / R005A

EcoRI*

12 U/uL 0,1 uL Promega / R6017

BamHI*

10 U/uL 0,1 uL Promega / R6025

eluato

N/A 16 uL N/A

H2O

N/A 1,8 uL N/A

*Amplicones con sitios de restriccion internos para EcoRI o BamHI fueron cortados con XbaI o BglII respectivamente en su lugar. La reaccion EcoRI+BglII se hizo con tampon Promega D. La reaccion BamHI+XbaI se hizo con tampon Promega E.

[0193] Restriction durante 2 horas a 37 °C. Las reacciones de restriction separadas de 20 uL fueron purificadas utilizando el conjunto de tampon PCR Qiagen Clean-Up y las placas de filtro Whatman Unifilter GF/C (Cat. # 5 7700-1101). El ADN fue eluido con 20 uL H2O por pocillo. Los eluatos separados fueron usados en la siguiente

reaction de ligamiento:

constituyente

concentracion volumen proveedor / cat. #

tampon

10X 2 uL Promega / C1263

T4 ADN ligasa

1-3 U/uL 0,2 uL Promega / M1804

pCDH* restringido

1 ng/uL 7,8 uL System Biosciences / CD510B-1

eluato

N/A 10 uL N/A

Ligamiento durante toda la noche a 4 °C. *Para donation direccional, pCDH se corto tanto con EcoRI como con BamHI. Un constructo alterno llamado pCDH- se hizo con sitios de restriccion de EcoRI y BamHI invertidos de modo que los amplicones con 5' BamHI y 3' EcoRI fueron clonados en la direction apropiada. Los amplicones con un sitio de EcoRI interno se cortaron con XbaI y se ligaron en un vector pCDH que fue restringido con XbaI y BamHI.

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[0194] Los ligados resultantes fueron transformados separadamente en bacterias (celulas competentes de etapa unica Promega (KRX), cat. # L3002). 50 uL de celulas competentes se diluyeron con 950 uL de tampon de transformation II (10 mM MOPS, 75 mM CaCl2, 10 mM RbCl, 15% glicerol, esterilizado por filtro). Por 20 uL de ligado 20 uL de celulas competentes diluidas se anadieron. La mezcla fue incubada durante 15 minutos en hielo, 15 se sometio a choque termico a 37 °C durante 30 segundos, y se volvio a poner en el hielo. Despues de 2 minutos las bacterias transformadas fueron reconstituidas en 150 uL de caldo de lisogenia (LB). Las bacterias se dejaron recuperar durante 20 minutos a 37 °C despues de lo cual se colocaron en placas separadamente en placas de LB-agar conteniendo ampicilina (50 ug/mL) y se dejaron crecer durante toda la noche a 37 °C.

20 [0195] Colonias individuales de cada placa se escogieron y subcultivaron durante toda la noche en 400 uL de LB

conteniendo ampicilina (50 ug/mL). 1 uL del subcultivo se liso en 100 uL de agua para fines de secuenciacion. El lisado bacteriano se uso en la siguiente reaccion por PCR:

constituyente

concentracion volumen proveedor / cat. #

tampon

5X 1 uL fuente privada

dNTPs

10 mM cada 0,1 uL GE Healthcare / 27-18(5-8)0-04

pCDH-fWd

10 uM 0,1 uL IDT (Integrated DNA Technologies)

pCDH-rev

10 uM 0,1 uL " "

lisato

1:100 1 uL N/A

Taq ADN pol

desconocido 0,02 uL fuente privada

5

10

15

20

25

constituyente

concentracion volumen proveedor / cat. #

H2O

N/A 2,68 uL N/A

temp. (°C)

tiempo ciclos

95

2 min

95

15 s 40

59*

15 s 40 * -0,1 °C / ciclo

72

90 s 40

72

15 min

4

pCDH-sentido CACGCTGTTTTGACCTCCATAGA pCDH-antisentido CACTGACGGGCACCGGAG (SEQ ID NO: 84-85)

[0196] Los productos de PCR fueron diluidos 25X. 1 uL del producto de PCR diluido se uso en la siguiente reaccion de secuenciacion de Sanger:

constituyente

concentracion volumen proveedor / cat. #

tampon

N/A 1,9 uL fuente privada

BigDye v3.1

N/A 0,1 uL ABI / 4336921

pCDH-seq

10 uM 0,1 uL IDT (Integrated DNA Technologies)

producto de PCR

1:25 1 uL N/A

H2O

N/A 1,9 uL N/A

temp. (°C)

tiempo ciclos

94

10 seg.

50

5 s 40

60

2 min 40

10

pCDH-seq GACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGC (SEQ ID NO: 86)

[0197] 30 u de mezcla de precipitacion (80% de etanol, 50 mM de acetato sodico pH 5,5) se anadio a cada uno de los productos de reaccion de secuenciacion. Las mezclas fueron agitadas en vortex durante 10 segundos y centrifugadas a 5000 rcf durante 45 minutos a 4 °C. El sobrenadante fue aspirado y los granulos de ADN fueron lavados con 30 uL de etanol al 80% helado y centrifugados a 5000 rcf durante 5 minutos a 4 °C. El sobrenadante fue aspirado y el granulado de ADN fue secado en un bloque de calor durante 10 minutos. El granulado de ADN seco fue disuelto en 10 uL H2O. La solucion de ADN resultante fue secuenciada en un analizador de ADN ABI 3730XL. Las secuencias fueron comparadas con las secuencias genomicas previstas. Los clones correctos fueron anadidos a la biblioteca. Para los clones incorrectos 4 colonias bacterianas adicionales fueron escogidas, y analizadas para secuencia de inserto.

5

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65

[0198] Los constructos de la biblioteca fueron subcultivados durante toda la noche en 50 mL de LB conteniendo ampicilina (100 ug/mL) y aislados con el kit Qiagen QIAfilter Plasmid Midi (Cat. # 12245) suplementado con el set Qiagen EndoFree Plasmid Buffer (Cat. # 19048) segun las instrucciones del fabricante. El ADN fue disuelto en el tampon de TE suministrado y llevado a una concentracion final de 500 ng/uL.

[0199] Ordenamos los constructos que no fuimos capaces de clonar nosotros mismos como minigenes de Integrated DNA Technologies. En estos casos, la horquilla en toda su longitud mas 20 pares de bases flanqueando cada sitio se clonaron en nuestro vector como un servicio por el IDT.

[0200] El embalaje y la produccion viral fue realizado por System Biosciences como se describe en el manual del usuario de CD-500B1-CD523-A1.

Cultivo celular

[0201] La linea celular TSUpr1/pEcad-luc/Rluc fue generada por transfeccion estable de la linea celular de carcinoma de vejiga de celula transicional humana TSUpr1 con el vector de expresion pEcad-Luc/Rluc (figura 2). Un clon unico, resistente a la zeocina, (clon 1 .c.4) se uso para todos los experimentos.

[0202] Las celulas TSUpr1/pEcad-luc/Rluc se mantuvieron en el medio RPMI-1640 (Invitrogen, 31870), suplementadas con 10% de suero bovino fetal (Sigma, F7524), L-Glutamina (Invitrogen 25030-024) y 50ug/ml de zeocina (Invitrogen, R250-01). Las celulas se mantuvieron en una atmosfera humedecida a 37°C y 5% CO2. Las celulas se dividieron una vez a la semana en una proporcion de 1:20.

Productos quimicos

[0203] Polibreno (2ug/ml; Sigma, H9268) se uso para aumentar la eficiencia de infeccion con las particulas lentivirales codificantes de ARNmi. Puromicina (5ug/ml; Sigma, P8833) se uso para seleccionar celulas que expresan el ARNmi de interes. Zeocina (50ug/ml; Invitrogen, R250-01) se uso para mantener la integration y la expresion del transgen Ecad-luc/Rluc.

Protocolo de seleccion de MET:

Dia 1: siembra de celulas

[0204] Celulas TSUpr1/pEcad-luc/Rluc fueron sembradas en una densidad de 2.500 celulas por pocillo en placas de 96 pocillos (100 ul volumen total por pocillo), por duplicado.

Dia 2: infeccion lentiviral

[0205] Los constructos lentivirales empaquetados se proporcionaron como particulas virales pseudotipadas congeladas VSV-G, y se almacenaron a -80°C. Antes del uso, los contenidos fueron descongelados a temperatura ambiente y puestos en hielo inmediatamente despues. Para abrir los tubos se utilizo una herramienta de apertura de tapa SepraSeal (Fisher Scientific Cat. #: 50823908) y los precipitados fueron resuspendidos por pipeteo en varias veces. El medio se retiro utilizando una pipeta multicanal. Suavemente, 200ul de medio fresco (+FBS/glutamina/zeocina) conteniendo 2 ug/ml de polibreno (Sigma, H9268) se anadio a las celulas. Despues, 1,0 ul de particulas lentivirales no diluidas se anadio a cada pocillo (por duplicado). En cada placa de 96 pocillos, se anadieron particulas lentivirales codificantes de miR-141 y miR-200c como controles positivos.

Dia 3: medio fresco

[0206] Veinticuatro horas despues de la adicion de lentivirus, el medio se retiro utilizando una pipeta multicanal. Las celulas fueron lavadas una vez con 0,9% NaCl, 50ul por pocillo. Posteriormente, 100ul (+FBS/glutamina/zeocina) de medio fresco se anadio a cada pocillo.

Dia 4: selection de puromicina

[0207] El medio se retiro utilizando una pipeta multicanal. Para seleccionar celulas transducidas, 200/ti de medio fresco conteniendo 5 ug/ml de puromicina (Sigma, P8833) se anadio a las celulas. Nota, las celulas no se lavaron entremedias.

Dia 8: ensayo de indicador de luciferasa dual (Promega)

[0208] El medio fue retirado utilizando una pipeta multicanal. Despues, las celulas fueron lavadas suavemente con 0,9% de NaCl (50 ul/pocillo). Para preparar lisatos celulares, tampon de lisis pasiva 1x (Promega, E1980) se anadio a las celulas (20ul por pocillo), y se incubo a temperatura ambiente durante 20 minutos en una coctelera

5

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20

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35

de placa. Los lisatos celulares fueron transferidos a un placas de microtitulacion de 96 pocillos blancas (Thermo Scientific, 9502887). La actividad de luciferasa de Renilla y luciernaga se midio en un contador Victor3 Multilabel (PerkinElmer), segun las instrucciones del fabricante.

Aislamiento de ARN total

[0209] Celulas TSUpr1/pEcad-luc/Rluc se sembraron en una densidad de 15.000 celulas por pocillo en placas de 24 pocillos. La infeccion lentiviral fue realizada como se ha descrito anteriormente. Debido a la cantidad limitada de particulas virales, se anadio virus a una multiplicidad de infeccion (MOI) de 30, y si fue posible una MOI de 100. En el dia 8, el ARN total fue aislado utilizando el reactivo de Trizol (200yul por pocillo), segun las instrucciones del fabricante (Invitrogen, 15596-018). La concentration y la pureza del ARN fue determinada en un espectrofotometro Nanodrop-1000 (Thermo Scientific).

RT-PCR en tiempo real

[0210] Dos microgramos de ARN total se trato con ADNasa I (Invitrogen; 18068-015) y ADNc fue sintetizado utilizando cebadores de hexamero aleatorios y transcriptasa inversa de Superscript II-MMLV (Invitrogen, 18064014). La reaction RT (30yul) fue diluida 4 veces en H2O.

[0211] La expresion genica fue determinada por qPCR SYBR Green, usando mezcla de PCR SYBR Green (Roche, 04707516001) y 2gl de ADNc como un modelo. ARN no sometido a transcriptasa inversa se uso como un control negativo para amplification por PCR. Los cebadores especificos de gen son de la siguiente manera:

E-Cadherina

sentido1 5'-GAAAAGAGAGT GGAAGT G-3'

antisentido1 5'-GTGAAGGGAGATGTATTG-3'

E-cadherina

sentido 2 5'-CAGGTCTCCTCTTGGCTCTG-3'

antisentido2 5'-ACTTT GAATCGGGT GTCGAG-3'

N-Cadherina

sentido 5'-GAGGATTAGCCGGAACAACA-3'

antisentido 5'-AACAAATTTCCCCCATCTCC-3'

SNAIL

sentido 5'-AGGAT CTCCAGGCTCGAAAG-3'

antisentido 5'-GACATCTGAGTGGGTCTGGA-3'

SLUG

sentido 5'-TTCGGACCCACACATTACCT-3'

antisentido 5'-TTGGAGCAGTTTTTGCACTG-3'

ZEB1

sentido 5'-ATGCGGAAGACAGAAAATGG-3'

antisentido 5'-GTCACGTTCTTCCGCTTCTC-3'

ZEB2

sentido 5'-CGCTT GACAT CACT GAAGGA-3'

antisentido 5'-CTTGCCACACT CT GT GCATT-3'

P2M

sentido 5'-AGCAGAGAATGGAAAGTCAAA-3'

antisentido 5'-TGCTGCTTACATGTCTCG-3'

(SEQ ID NO: 48-63).

[0212] Q-PCR se realizo en un instrumento LightCycler LC480 (Roche), utilizando las siguientes condiciones de amplificacion: 5 min. 95°C, seguido de 45 ciclos de 10 seg. 95°C, 20 seg. 60°C, 20 seg. 72°C. Para conjunto de cebador 1 de E-cadherina, se uso una temperatura de recocimiento de 49°C (en vez de 60°C). Los valores Cp fueron determinados utilizando el software LightCycler 480 SW 1.5 (Roche). La expresion de Beta-2- microglobulina se uso para normalizacion. Los niveles de expresion genica relativos se calcularon segun el modelo descrito por Pfaffl (18).

RT-PCR tallo-bucle

[0213] La expresion de microARN se determino por RT-PCR tallo-bucle como se describe (19). Para esto, 100 ng de ARN total se transcribio inversamente utilizando 0,375 pmol de cebadores tallo-bucle (SL) especificos de miR:

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miR-141:

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC

CCATCT-y

miR-200c:

5 ’ -GTCGT ATC C AGT GC AGGGT CC G AGGT ATT CGC ACTGG AT ACGAC TCCATC-V

miR-181a-1:

5 ’ -GTCGT ATCC AGT GC AGGGT C CG AGGT ATTCGC ACT GG AT ACGAC A CTCAC-3’

miR-124*:

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGAC GGCATT-3’

miR-518b:

5 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACA CCTCT-3’

miR-520f:

5GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC AACCCT-3’

miR-524-5p:

5 ’ -GTCGT ATCC AGT GC AGGGTCC GAGGT ATTCGC ACTGGATAC GAC GAGAAA-3 ’

miR-524-3p:

5’- GTCGT AT C C AGT GCAGGGTCC GAGGT ATT C GC ACTGG AT AC GAC ACTCCA-3’

(SEQ ID NO: 64-71

en 1xRT tampen, conteniendo 0,25 mM dNTPs, 3,33 u/ul transcriptasa inversa Superscript II-MMLV (Invitrogen) y 0,25 u/ul de inhibidor de ribonucleasa HRP-I (Amersham), durante 30 min. a 16°C, 30 min a 42°C y 5 min a 85°C. Los productos de RT tallo-bucle fueron diluidos 2 veces en H2O.

[0214] La expresien de microARN fue determinada por qPCR SYBR Green, usando mezcla de RCP (0,5 ul cebador sentido (25 pmol/ul), 0,5 ul cebador antisentido (25 pmol/ul), 8 ul H2O, 10 ul 2x mezcla RCP SYBR Green, Roche) y 2ul de producto RT de tallo-bucle como un modelo. El ARN no sometido a SL-RT se use como un control negativo para amplificacien de PCR. Los cebadores especificos de miR son de la siguiente manera:

5

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Cebadores sentido:

miR-141: 5'-GCCCGCTAACACTGTCTGGTAAAG -3' miR-200c: 5'-GCCCGCTAATACTGCCGGGTAATG -3' miR-181a-1: 5'-TGCCAGAACATTCAACGCTGTCG-3' miR-124*: 5'-TGCCAGTAAGGCACGCGGTGA-3' miR-518b: 5'-TGCCAGCAAAGCGCTCCCCTTTAG-3' miR-520f: 5'-GCCCGCAAGTGCTTCCTTTTAGAG-3' miR-524-5p: 5'-GCCCGCCTACAAAGGGAAGCACT-3' miR-524-3p: 5'-TGCCAGGAAGGCGCTTCCCTTTG-3'

Se uso un cebador universal antisentido: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'

(SEQ ID NO: 72-80)

[0215] Q-PCR se realizo en un instrumento LightCycler LC480 (Roche), utilizando las siguientes condiciones de amplificacion: 5 min. 95°C, seguido de 45 ciclos de 10 seg. 95°C, 20 seg. 60°C, 10 seg. 72°C. Los valores Cp fueron determinados utilizando el software LightCycler 480 SW 1.5 (Roche). La expresion de U6 snRNA (RNA6- 1) se uso para normalizacion (U6 (RNU6-1) cebadores: RT 5'-GTCATCCTTGCGCAGG-3' U6 sentido 5'- CGCTTCGGCAGCACAT AT AC-3' y U6 antisentido 5'-AGGGGCCATGCTAATCTTCT-3' (SEQ ID NO: 81-83). Los niveles de expresion de miR relativo se calcularon segun el modelo descrito por Pfaffl (18).

Analisis de secuencia de ADN

[0216] La secuencia de los ARNmi clonados en los vectores lentivirales para los hits como se describe en la tabla 1 fue verificada de la siguiente manera. Los acidos nucleicos totales de celulas transducidas lentivirales fueron aislados utilizando reactivo de Trizol, segun las instrucciones del fabricante (Invitrogen, 15596-018). La concentration y la pureza de los acidos nucleicos fue determinada en un espectrofotometro Nanodrop-1000 (Thermo Scientific). ADN proviral fue amplificado por PCR, usando 500 ng de acidos nucleicos como entrada, y cebadores especificos de vector lentiviral de pCDH (sentido: 5'-CACGCTGTTTTGACCTCCATAGA-3', antisentido: 5'-CACTGACGGGCACCGGAG-3', (SEQ ID NO: 84-85).) durante 35 ciclos a una temperatura de recocimiento de 65°C. Los productos amplificados fueron purificados utilizando el sistema de purification de las preparaciones de Wizard PCR (Promega). El analisis de secuencia de ADN se realizo utilizando 2 gl de amplicon purificado, 5 pmoles de cebador especifico de pCDH (5'-GACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGC-3', (sEq ID NO: 86).), y el kit Big Dye Terminator v 1.1 (Applied Biosystems). Los productos fueron analizados en un analizadores de ADN 3730 (Applied Biosystems). Los datos fueron recogidos utilizando el Collection Software v3.0 y analizados utilizando el programa Sequencing Analysis v5.3.1 (Applied Biosystems). La secuencia para todos los ARNmi clonados fue correcta y se da en la tabla 4.

Resultados

Selection de microARN por transition mesenquimal a epitelial (MET)

[0217] EMT en celulas tumorales se produce a partir de una reprogramacion transcripcional de la celula. En particular, la represion transcripcional del promotor del gen de E-cadherina (CDH1) se ha demostrado que desencadena el fenotipo de EMT. La proteina E-cadherina es una de las moleculas de cadherina mas importantes que media los contactos celula-celula en celulas/tejidos epiteliales. La CDH1 es reprimida por la union de los represores transcripcionales, SNAI1, SNAI2, TCF3, TWIST, ZEB1 o ZEB2 (20-23), a tres de las denominadas E-cajas en la region del promotor proximal de CDH1 (24-26). La inhibition de la union de estos represores al promotor de CDH1 puede revertir la EMT, llamada tambien transicion mesenquimal a epitelial (MET), e inhibe la invasion de celulas tumorales y la progresion tumoral en modelos animales (27). Se plantea la hipotesis de que un conjunto extenso de microARN es capaz de inducir MET, mediante la orientation de uno de los represores transcripcionales asociados a la EMT. La supresion de los represores transcripcionales asociados a la EMT dara lugar a la reactivation de la expresion genica de CDH1. Esta reactivation de CDH1 se puede monitorizar facilmente por activation de luciferasa de luciernaga dirigida por el promotor de CDH1. Por lo tanto, se clono el elemento de nucleo del promotor del gen de CDH1, que contenia las tres E-cajas (24,25), en un vector de expresion para dirigir la expresion de luciferasa de luciernaga. Como control interno, se inserto un casete de luciferasa de Renilla impulsado por el promotor HSV-Tk en el mismo vector (pEcad-Luc). Se transfecto de forma estable la linea celular de cancer de vejiga TSUpr1 con este constructo indicador. La expresion de ARNm de CDH1 endogena en esta linea celular no es detectable, mientras que diferentes marcadores mesenquimales son expresados (24, 28).

Seleccion de MET inducida por microARN: configuration

[0218] Las celulas TSUpr1-pEcad-Luc son susceptibles de seleccion de puromicina. Como primera fase en la configuracion del modelo de seleccion, se determino la eficiencia de transduction de las celulas TSU. Las celulas TSU fueron infectadas con un lentivirus que expresa eGFP en diferentes MOIs, y las celulas transducidas fueron

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seleccionadas en el medio que contenia puromicina. El numero de celulas infectadas, y por lo tanto resistentes a la puromicina, fue determinado por un ensayo de supervivencia celular MTT. En dos experimentos independientes, demostramos que a un MOI de 8, una eficiencia de transduccion (MTT de celula infectada+puro/MTT de celula infectada-puro x 100%) de al menos 60% se pudo obtener. Con en estos resultados, se decidio realizar los experimentos de infeccion pilotos en un MOI de 3 y 30.

[0219] Recientemente, la familia miR-200 y miR-205 demostraron regular EMT dirigiendose a ZEB1 y ZEB2 (1315). Dos ARNmi de la familia miR-200, miR-141 y miR-200c, fueron seleccionados para configurar y optimizar nuestro ensayo de seleccion de MET. Las celulas TSU fueron infectadas con ambos vectores de ARNmi (MOI=30). Dos (dia 4) y seis (dias 8) dias postinfeccion, se midio la actividad de luciferasa de luciernaga dirigida por el promotor de E-cadherina y se normalizo contra la actividad de luciferasa de Renilla controlada por HSV-Tk. El dia 8, la proportion de FLuc/RLuc fue inducida mas de 2 veces por miR-200c, y mas de 1,5 veces por miR- 141 (figura 1; tabla 1). Para reducir el "ruido" de celulas no-infectados (FLuc- y RLuc+), se aplico la seleccion de puromicina. La proporciones de FLuc/RLuc inducidos por miR-141 y miR-200c fueron comparables con aquellos sin seleccion.

[0220] Las celulas TSU fueron infectadas con 0,2 microlitros de lentivirus de mIR no diluido. Dos dias despues de la infeccion, la seleccion de puromicina fue aplicada durante 4 dias. Seis dias post-infection las actividades de luciferasa se midieron. El resultado de la seleccion de los primeros 80 microARN se muestra en la figura 1. Los cuatro "hits" positivos (FLuc/RLuc > media + 2 x SD) fueron microARN conocidos por regular EMT, es decir, miR- 141, miR-200c, miR-205 y miR-429. Este experimento de piloto indico la validez del sistema de seleccion.

Seleccion de MET inducida por microARN

[0221] Diferentes constructos lentivirales en la biblioteca de miR tienen titulos muy altos. Por lo tanto, sin dilution de caldos de virus antes de la infeccion, en algunos casos MOIs altos de virus fueron aplicados. La adicion de lentivirus de miR-141 y miR-200c en MOI altos (100 a 600) no tuvo ninguna toxicidad significativa, mientras que la induction de la proporcion FLuc/RLuc mejoro ligeramente. Por lo tanto, la biblioteca de expresion de microARN basado en lentivirus entera fue seleccionada utilizando un microlitro de lentivirus no diluido (todo por duplicado). Despues de la seleccion todos los 1120 miRs (14 placas, cada una conteniendo 80 vectores miR), 65 "hits" positivos (FLuc/RLuc > media + 2 x SD) se descubrieron. Ademas de estos 65 miRs, 59 miRs adicionales fueron seleccionados basados en, por ejemplo, senal de Luc aumentada con senal de RLuc aumentada, dejando la proporcion por debajo del umbral. Estos 124 miRs fueron reseleccionados en el modelo TSUpr1-pEcad-luc, despues de lo cual 30 miRs con una proporcion FLuc/RLuc positiva reproducible permanecieron (26 de 30 del grupo de 65 "hits").

Validation de microARN de MET preliminar

[0222] Para validar adicionalmente y seleccionar miRs importantes para regulation de EMT/MET, se estudiaron sus efectos en la expresion de gen endogeno, es decir, CDH1 (E-cadherina), CDH2 (N-Cadherina), SNAI1 (SNAIL), SNAI2 (SLUG), ZEB1 (deltaEFI) y ZEB2 (SIP1). Celulas TSUpr1-pEcad-luc fueron infectadas con los 30 miRs identificados por seleccion de MET (MOI= 30 y 100). Seis dias despues de la infeccion, el ARN total fue aislado y usado para analisis de qPCR de los genes anteriormente mencionados (tabla 1). La regulacion prevista de la expresion de CDH1 (E-cadherina) fue solo observada con algunos miRs (n=10), como fue la infrarregulacion de la expresion de CDH2 (N-Cadherina) (n=8). De esos miRs, miR-181a-1, miR-200a, mir-429 y miR-524 dio lugar tanto a sobrerregulacion de CDH1 como infrarregulacion de CDH2. La cinetica de la expresion de cadherina por miRs asociados a EMT es dependiente de cadherina. Esto puede explicar la sobre e infra regulacion no consistente de ambas cadherinas, en momento temporal elegido (6 dias post introduction de miR). La marca de EMT o de inverso, MET, es conmutacion de cadherina. Por lo tanto, la proporcion (relativa) de expresion de CDH1/CDH2 se uso como una medida para estudiar el papel de los miRs identificados en la regulacion de EMT. Como se muestra en la tabla 1, diez miRs (de los 12) tuvieron una proporcion de CDH1/CDH2 aumentada (gama: 1,85-17,65). Los otros dos miRs indujeron la expresion de CDH1 significativamente (en linea con la induccion de FLuc), pero estos miRs tambien sustancialmente (> 2 veces) indujeron la expresion de CDH2. De los 12 miRs que indujeron la expresion de CDH1 endogena o indujeron un cambio de cadherina, todos tambien infrarregularon al menos un represor transcripcional de CDH1 en el nivel de ARN.

Conclusiones

[0223] En el conjunto de 12 miRs seleccionados, los miRs asociados a la EMT conocidos (familia miR-200 y miR- 205) estan presentes, lo que confirma la especificidad de nuestro sistema. De los restantes 9 miRs, tres miRs (miR-518b, miR-520f y miR-524) pertenecen a la familia miR-515 humana. En este estudio, los miembros de la familia miR-200 en general infrarregularon la expresion de ZEB2, lo que esta asociado a la infrarregulacion de la expresion de CDH2 (en el dia 8). Por otro lado, los miembros de la familia miR-515 en general infrarregularon la expresion de SNAI2, que estaba asociada con la sobrerregulacion de la expresion de CDH1. Estas diferencias destacables pueden subyacer dos mecanismos diferentes de regulacion de EMT por los miembros de la familia

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miR-200 y miR-515. La expresion y la funcion de los 3 miembros de la familia miR-515 no ha sido estudiada ni reportada en las bases de datos disponibles publicamente, y por lo tanto proporciona una primera vision sobre el papel de estos miR en la EMT.

Ejemplo 2

Materiales y metodos Cultivo celular

[0224] Las celulas TSUpr1/pEcad-luc/Rluc (a.k.a. TSUpr1-pEcad) y la linea celular de cancer de prostata PC-3 (ATCC# CRL-1435) se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, 31870), suplementadas con 10% de suero bovino fetal (Sigma, F7524), L-glutamina (Invitrogen 25030-024) y para TSUpr1/pEcad-luc/Rluc 50yug/ml zeocina (Invitrogen, R250-01). Las celulas se mantuvieron en una atmosfera humedecida a 37°C y 5% CO2.

Generacion de un sistema de expresion de ARNmi inducible

[0225] Para facilitar la expresion de ARNmi a largo plazo y controlada, se hizo uso del sistema de expresion de ARNmi de miR-X Tet-inducible (Clontech Inc.). El precursor de ARNmi fue clonado en la 3'UTR del unidad de transcripcion de proteina fluorescente ZsGreen. La expresion de ARNmi se determina en el vector por el fuertemente regulado, promotor inducible Ptight, y la actividad del transactivador coexpresado (Tet-on). En presencia de doxiciclina el promotor Ptight sera activado, dando como resultado la coexpresion de altos niveles de ARNmi y proteina ZsGreen1, con niveles bajos de expresion en celulas no inducidas.

[0226] Los precursores miR-200c y miR-520f fueron amplificados por PCR, usando ADN proviral de celulas TSUpr1 infectadas con lentivirus como modelo, y los cebadores especificos de vector sentido y antisentido pCDH universales (SEQ ID NO: 84-85). Los productos de amplificacion fueron digeridos con EcoRI/Nhel; estos sitios son del sitio de clonacion multiple del vector de pCDH lentiviral. Los fragmentos digeridos fueron clonados en los sitios EcoRI/NheI de un vector modificado pEGFP-N3 (Clontech #6080-1), que fue obtenido por BamHI / NotI excitando el EGFP ORF desde el vector, y cerrando el vector despues del relleno mediado por ADN polimerasa de Klenow de los salientes BamHI y Notl. El precursor de miR fue extirpado de este vector por digestion de EagI/NheI y clonado en los sitios EagI/NheI del vector pmRi-ZsGreen1 (Clontech PT5049-1, Fig. 5A). La clonacion apropiada fue confirmada por analisis de secuencia de ADN. El vector de transactivador pTet-on (Clontech PT3899-5) fue transfectado en la linea celular de cancer de prostata PC3 (ATCC# CRL-1435). Los clones resistentes a G418 fueron evaluados para actividad de pTet-on apropiada, en un ensayo de indicador de lucifereasa de pTRE transitorio.

[0227] Despues, los vectores pmRi-ZsGreen1-miR-X fueron transfectados en las celulas PC3-Tet-on (clon 8), junto con una etiqueta de seleccion de puromicina. Las colonias resistentes a la puromicina fueron seleccionadas, y se seleccionaron rapidamente para expresion de ZsGreen1 inducible con DOX (por medicion de fluorescencia en placas de 96 pocillos en el multimetro Victor3). Las celulas ZsGreen1 positivas fueron ademas analizadas para expresion ARNmi inducible con DOX.

Ensayos de invasion celular

[0228] Para ensayos de invasion celular, celulas PC3-mRi-ZsGreen1-miR-X inducibles con DOX fueron incubadas en presencia de DOX (1 ug/ml) durante 2 dias, antes del ensayo de invasion. Celulas PC3 y TSUpr1- pEcad fueron transducidas con las particulas lentivirales de expresion de mIR (MOI=30), como se describe en el ejemplo 1. Las celulas transducidas lentivirales fueron seleccionadas por puromicina y transferidas 1 vez antes del uso. Cincuenta mil (PC3) o 40.000 (TSUpr1-pEcad) celulas fueron sembradas en camaras de invasion Biocoat Matrigel (8 micras; BD 354480) en medio sin suero (Fig. 6A). La camara de invasion fue colocada en 24 pocillos que contenian medio con 10% de suero fetal de ternera como quimioatrayente. Como control, la misma cantidad de celulas fue sembrada en placas de cultivo de 24 pocillos. Despues de 48 horas de incubacion, las celulas de la camara de invasion fueron retiradas por aspiracion y limpieza del compartimento interno con un hisopo. La camara de invasion se puso luego en reactivo de viabilidad celular CellTiter-GLO (CTG, Promega- G7571), se incubo durante 15 minutos, y luego se analizo en un luminometro Victor3. La invasion celular fue calculada como la actividad de CTG en la parte inferior de la membrana dividida por la actividad de CTG de las celulas que crecieron en una placa de 24 pocillos. La inhibicion de la invasion celular por un ARNmi especifico fue calculada por la division del porcentaje de invasion celular de celulas tratadas con DOX versus celulas no tratadas, o la invasion de celulas transducidas contra celulas transducidas por el vector vacio.

RT-PCR en tiempo real

[0229] El mismo protocolo que se describe bajo el ejemplo 1 se uso para RT-PCR de los genes siguientes: vimentina y CDH11 y HPRT. Los cebadores siguientes fueron usados para los genes respectivos:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

HPRT

sentido 5'- CTCAACTTTAACTGGAAAGAATGTC -3'

antisentido 5'- TCCTTTTCACCAGCAAGCT -3'Vimentina sentido

5'- GGCTCAGATTCAGGAACAGC -3'

antisentido 5'- GCTTCAACGGCAAAGTTCTC -3'

CDH11

sentido 5'- GGTCTGGAACCAGTTCTTCG -3'

antisentido 5'- GGCATGAATGTTCCCTGATT -3'

(SEQ ID NO: 112-117)

Resultados

Validacion de los microARN que inducen MET Validacion in vitro usando mimeticos de microARN

[0230] Para convalidar los microARN identificados mediante seleccion de una biblioteca de expresion de ARNmi lentiviral, se usaron mimeticos de ARNmi sintetico. Las mimeticos de miR sintetico usadas fueron suministradas por Ambion o Dharmacon (Thermo Scientific); vease tabla 7 para detalles. Las mimeticos de miR-200c de ambas companias fueron comparados y mostraron igual eficacia (es decir, induction de CDH1; datos no mostrados). Las celulas TSUpr1-pEcad-luc/Rluc fueron transitoriamente transfectadas con 20 a 60 nM de mimeticos de miR sintetico. Cuatro dias post-transfeccion, se midio la actividad de Luc y RLuc, y las proporciones Luc/RLuc fueron normalizadas para celulas transfectadas mimetico de control negativo (NC). De todos las mimeticos evaluadas, miR-124, 181a, 200c, 206 y miR-520f mostraron una induccion de la proportion Luc/RLuc (Fig. 4A). Salvo miR- 200c y miR-520f, las otras mimeticos de miR infrarregularon la actividad de RLuc, y mostraron toxicidad celular (no mostrada). De todos estos miRs, miR-200c y miR-520f fuertemente indujeron (~20-veces) expresion de CDH1 endogena, mientras que miR-124* y miR-181a indujeron CDH1 aproximadamente 2,5-veces (Fig. 4B). MiR-200c, miR-518 y miR-524 infrarregularon la expresion de CDH2 mas del 30% (Fig. 4B). La eficacia de las mimeticos de miR fue ademas evaluada en otras diferentes lineas celulares tumorales con un fenotipo tipo mesenquimal (basadas en las proporciones de expresion de ARNm de vimentina y CDH1; figura 3). Como en TSUpr1-pEcad-luc/Rluc, miR-200c y miR-520f tambien indujeron la expresion de CDH1 en celulas TSUpr1, PC3, PANC-1, MIA-PaCa2 y MDA-MB-231 de tipo salvaje (Fig. 4C).

Generation de un sistema de expresion de ARNmi inducible

[0231] Clones resistentes a G418 fueron evaluados para actividad de pTet-on apropiada, en un ensayo indicador de luciferasa pTRE transitorio. Tras el tratamiento con doxiciclina (DOX) (0,1 y 1,0 ug/ml), el clon 8 mostro una induccion fuerte de expresion de luciferasa, mientras que la actividad de Luc en celulas no inducidas (sin DOX) no excedia los niveles basicos (Fig. 5B). Como se muestra en la figura 5C, diferentes clones transfectados con pmRi-ZsGreen1-miR-X clones mostraron expresion de miR-200c o miR-520f inducible con DOX, que fue dependiente de la dosis de DOX, alcanzando niveles de maximo en alrededor de 1 ug/ml DOX (no mostrado).

[0232] La expresion genica endogena en las celulas que expresan miR-200c y miR-520f inducible fue analizada por qPCR. Se observo sobrerregulacion de CDH1, mientras que se observo infrarregulacion de CDH11 y vimentina reiteradamente para ambos miRs (tabla 8). Las celulas PC3 tambien mostraron la induccion mas debil de CDH1 por mimeticos de miR-200c y miR-520f de todas las lineas celulares evaluadas. Ademas de la infrarregulacion de los marcadores mesenquimales, los represores transcripcionales, tales como ZEB1, ZEB2 y SNAI2 fueron tambien infrarregulados despues de la induccion de miR-200c y miR-520f (tabla 8). Colectivamente, estos datos indican que en las lineas celulares inducibles miR-200c y miR-520f, los miRs correspondientes al igual que sus genes diana de EMT directos e indirectos se pueden regular a nivel molecular.

Inhibicion de invasion de celulas tumorales

[0233] Para estudiar si los miRs identificados tambien regulan la EMT en el nivel celular, se realizaron ensayos de invasion celular utilizando los clones estables inducibles miR-520f y miR-200c como generados por encima, y miR-200c y miR-520f que expresan lentivirus como se ha descrito anteriormente. Todos los clones de miR-200c y miR-520f evaluados, inhibieron la invasion celular en el rango de 48-68% (Fig. 6B). La induccion de la expresion de ARNmi fue determinada en cultivos en paralelo y se encontro positiva (Fig. 6C). Los niveles de miR no mostraron una correlation significativa con el porcentaje de invasion. Estos datos indican que miR-520f, identificado en el ensayo de seleccion de Luc como un ARNmi de induccion de MET, podria tambien revertir uno de los aspectos biologicos celulares clave de EMT, es decir invasion celular.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

[0234] Para confirmar el efecto de los otros miembros de la familia miR-515, miR-518b y miR-524, en la invasion celular fue evaluada en el modelo de selection TSUpr1/pEcad-luc/Rluc. Las celulas TSUpr1-pEcad fueron infectadas con lentivirus que contiene precursor de mIR. Los tres miRs de la misma familia de miR-515, miR- 518b, miR-520f y miR-524, inhibieron la invasion celular en 25-53% (Fig. 6D). La expresion de los ARNmi maduros correspondientes fue confirmada por qPCR de tallo-bucle (como se describe en el ejemplo 1; no mostrado).

Conclusiones

[0235] Los tres miembros de la familia miR-515, miR-518b, miR-520f y miR-524, fueron identificados en la seleccion de MET. Las mimeticos de miR-518b y miR-524 infrarregularon la expresion del marcador mesenquimal CDH2, mientras que, las mimeticos de miR-520f sobrerregularon fuertemente la expresion del marcador epitelial CDH1 en diferentes modelos de linea celular. La invasion celular de las celulas PC3 a traves de Matrigel fue inhibida despues de la induction de la expresion de miR-520f. El efecto anti-invasion se observo tambien cuando los tres ARNmi fueron expresadas en el modelo de seleccion TSUpr1-pEcad. De hecho, miR- 200c no redujo la invasion en este modelo. Esto indica la gran fuerza de estos tres miembros de miR-515 como teniendo actividad de anti-invasion en diferentes celulas y tipos de tumores a diferencia de miR-200c.

Inhibicion de la formation de metastasis en un modelo animal

[0236] El hecho de que estos tres miembros de la familia miR-515 pudieran activar el promotor del gen E- cadherina in vitro, basado en la activation del indicador de luciferasa, y la induccion de CDH1 endogena (miR- 520f) o la reduction de la expresion de CDH2 (miR-518b y miR-524), y pudieran todos inhibir la invasion celular tumoral in vitro, indica que estos microARN son potentes herramientas para inhibir la invasion y la metastasis de celulas tumorales in vivo. Para confirmar la actividad anti-metastasica de miR-520f, miR-518b y miR-524 en una preparation in vivo, se configuro un experimento de metastasis tumoral experimental. Ratones desnudos, machos, inmunodeficientes BALB/c (6-8 semanas de edad) fueron inyectados con 0,5 x 106 (200yul de volumen) de celulas PC3-mRi-ZsGreen1 que expresan bien miR-520f, miR-518b y miR-524, via la vena de la cola (lateral) (29). A grupos de 6 ratones se les dio agua potable que contenia DOX (0,2 mg/ml) durante todo el experimento, y un grupo de control de ratones inyectados con celulas PC3-mRi-ZsGreen1 no tratadas con DOX que expresan bien miR-520f, miR-518b y miR-524 reciben agua libre de DOX. Los ratones se monitorizan diariamente, y si no sufren graves inconvenientes, se sacrifican despues de 2 meses. Los pulmones son el sitio primario de metastasis, ya que contienen el primer lecho capilar que las celulas inyectadas encontraran despues de la inyeccion (30, 31). Se sugiere que las celulas que pasan el lecho capilar del pulmon, tambien pueden formar metastasis en otros organos (30). El numero y tamano de metastasis se determina de forma macroscopica (es decir, por examen visual a traves de un microscopio de diseccion) y microscopicamente (es decir, estudiando la expresion de ZsGreen en el pulmon y otras secciones de tejido). Se preve, basado en todos los datos disponibles presentados anteriormente, que las celulas que expresan bien miR-520f, miR-518b o miR-524 forman menos (y menor) metastasis en este modelo animal que las celulas que no expresan dichos ARNmi. Esta prueba de concepto preparara el terreno para otra prueba preclinica de miR-520f, miR-518b y miR-524 como un farmaco para tratar enfermedades asociadas a la EMT.

[0237] Para confirmar adicionalmente el efecto inhibitorio de miR-520f, miR-518b y miR-524 en la metastasis in vivo, diferentes lineas celulares tumorales, disenadas con pmRi-ZsGreen1-miR-520f, 518b o 524, se inyectan ortotopicamente en ratones desnudos (NOD-SCID o BALB/c nu/nu). En momentos diferentes despues de la inyeccion de celulas tumorales, los ratones reciben agua que contiene DOX o libre de DOX. La invasion local y la metastasis distante a los pulmones y otros organos se monitoriza por la formacion de imagenes in vivo de ZsGreen1 o LUC. La sobre-expresion de miR-520f, miR-518b o miR-524 (inducida por DOX en el agua potable) esta prevista que reduzca el numero de metastasis. Ademas, los ratones ortotopicamente inyectados con celulas tumorales, donde miR-520f, miR-518b o miR-524 se activaron, esta previsto que tengan un indice de supervivencia media que se prolongara significativamente en comparacion con el de los ratones que no han recibido DOX (es decir sin activacion de miR-520f, miR-518b o miR-524 en celulas tumorales). La supervivencia de los animales se definira por la supervivencia sin complicaciones serias.

Tabla 1: lista de microARN identificada por seleccion de MET (luciferasa) y regulation de genes endogenos asociados a la EMT. Celulas TSUpr1-pEcad-Luc fueron infectadas con 30 microARN positivos de luciferasa (vease texto). El ARN total fue transcrito inverso, y usado para analisis de PCR en tiempo real con SYBR Green de los genes de CDH1 (Ecad), CDH2 (Ncad), SNAI1, SNAI2, ZEB1 y ZEB2. LUC, induccion de proportion FLuc/RLuc, promedio de 3 experimentos; CDH1, (induccion de) expresion de CDH1 endogena; CDH2, (inhibicion de) expresion de CDH2 endogena; represor, represores transcripcionales de CDH1 que fueron infrarregulados al menos 2 veces, o entre 1,3 y 2 veces (subrayado). Solo los datos para 12 microARN que son de interes para posteriores estudios se muestran; vease texto para un razonamiento detallado de la seleccion estos 12 miRs.

ARNmi

LUC CDH1 CDH2 CDH1ICDH2 Represor

ARNmi

LUC CDH1 CDH2 CDH1ICDH2 Represor

miR-124-1

1,76 1,30 2,46 0,53 SNAI2

miR-181a-1

1,59 4,22 0,89 4,74 SNAI2

miR-141

1,95 0,58 0,04 14,45 ZEB2, SNAI1

miR-200a

1,66 2,18 0,67 3,25 ZEB2

miR-200c

2,53 0,71 0,04 17,65 ZEB2, ZEB1

miR-205

1,79 0,39 0,08 4,86 ZEB2

miR-429

1,50 3,39 0,41 8,28 ZEB2

miR-206

1,73 2,24 2,07 1,08 SNAI2

miR-518b

1,62 3.09 1.67 1,85 SNAI2

miR-520f

1,43 12,92 1,16 11,14 SNAI2, ZEB2

miR-524

1,57 1,60 0,45 3,56 ZEB2

miR-200b

2,08 5,17 1,18 4,38 ZEB2

Tabla 2. Secuencias precursoras de ARNmi identificados en la seleccion de MET (vease tabla 1). Lista de secuencias precursoras de ARNmi (direccion 5' a 3'). Todas las secuencias fueron obtenidas de la miRBase (version 14: Sept 2009;
www.mirbase.org).

5

SEQ ID

ARNmi Secuencia precursora

22

miR-124-1 AGGCCUCUCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAAUGUC CAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAAUGGGGCUG

23

miR-124-2 AUCAAGAUUAGAGGCUCUGCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAU UUAAUGUCAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAGCGGAGC CUACGGCUGCACUUGAA

24

miR-124-3 UGAGGGCCCCUCUGCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAUGUCUA UACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAGAGGCGCCUCC

25

miR-181a-1 UGAGUUUUGAGGUUGCUUCAGUGAACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU UUGGAAUUAAAAUCAAAACCAUCGACCGUUGAUUGUACCCUAUGGC UAACCAUCAUCUACUCCA

26

miR-141 CGGCCGGCCCUGGGUCCAUCUUCCAGUACAGUGUUGGAUGGUCU AAUUGUGAAGCUCCUAACACUGUCUGGUAAAGAUGGCUCCCGGGUG GGUUC

27

miR-200a

SEQ ID

ARNmi Secuencia precursora

CCGGGCCCCUGUGAGCAUCUUACCGGACAGUGCUGGAUUUCC CAGCUUGACUCUAACACUGUCUGGUAACGAUGUUCAAAGGUGA CCCGC

28

miR-200c CCCUCGUCUUACCCAGCAGUGUUUGGGUGCGGUUGGGAGUCUC UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGAGG

29

miR-205 AAAGAUCCUCAGACAAUCCAUGUGCUUCUCUUGUCCUUCAUUCC ACCGGAGUCUGUCUCAUACCCAACCAGAUUUCAGUGGAGUGA AGUUCAGGAGGCAUGGAGCUGACA

30

miR-429 GCGUCUUACCAGACAUGGUUAGACCUGGCCCUCUGUCUAAUAC UGUCUGGUAAAACCGUCCAUCCGCUGC

31

miR-206 UGCUUCCCGAGGCCACAUGCUUCUUUAUAUCCCCAUAUGGAUU ACUUUGCUAUGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGGUUUCGGCAAGUG

32

miR-518b UCAUGCUGUGGCCCUCCAGAGGGAAGCGCUUUCUGUUGUCUGAAAG AAAACAAAGCGCUCCCCUUUAGAGGUUUACGGUUUGA

33

miR-520f UCUCAGGCUGUGACCCUCUAAAGGGAAGCGCUUUCUGUGGU CAGAAAGAAAAGCAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUUACCGUUU GGGA

34

miR-524 UCUCAUGCUGUGACCCUACAAAGGGAAGCACUUUCUCUUGUCCAAA GGAAAAGAAGGCGCUUCCCUUUGGAGUGUUACGGUUUGAGA

35

miR-200b CCAGCUCGGGCAGCCGUGGCCAUCUUACUGGGCAGCAUUGGAUGGA GUCAGGUCUCUAAUACUGCCUGGUAAUGAUGACGGCGGAGCCCUGC ACG

Tabla 3. Secuencias maduras de ARNmi identificados en la seleccion de MET (vease tabla 1). Lista de secuencias de ARNmi maduros (direccion 5' a 3').

microARN

ARNmi maduro SEQ ID ARNmi SEQ madura

hsa-miR-124-1

miR-124 2 uaaggcacgcggugaaugcc

hsa-miR-124-2

miR-124* 3 cguguucacagcggaccuugau

hsa-miR-124-3

hsa-miR-181a-1

miR-181a 4 aacauucaacgcugucggugagu

miR-181a* 5 accaucgaccguugauuguacc

hsa-miR-141

miR-141 6 uaacacugucugguaaagaugg

miR-141* 7 caucuuccaguacaguguugga

hsa-miR-200a

miR-200a 8 uaacacugucugguaacgaugu

miR-200a* 9 caucuuaccggacagugcugga

hsa-miR-200b

miR-200b 10 uaauacugccugguaaugauga

miR-200b* 11 caucuuacugggcagcauugga

hsa-miR-200c

miR-200c 12 uaauacugccggguaaugaugga

miR-200c* 13 cgucuuacccagcaguguuugg

hsa-miR-205

miR-205 14 uccuucauuccaccggagucug

miR-205* 15 gauuucaguggagugaaguuc

hsa-miR-429

miR-429 16 uaauacugucugguaaaaccgu

hsa-miR-206

miR-206 17 uggaauguaaggaagugugugg

hsa-miR-518b

miR-518b 18 caaagcgcuccccuuuagaggu

hsa-miR-520f

miR-520f 19 aagugcuuccuuuuagaggguu

hsa-miR-524

miR-524-5p 20 cuacaaagggaagcacuuucuc

miR-524-3p 21 gaaggcgcuucccuuuggagu

Tabla 4. Secuencias de ARNmi identificados en la seleccion de MET como clonadas en vectores lentivirales (vease tabla 1)

Seq ID

ARNmi Secuencia clonada en vector lentiviral

36

miR-124-1 TTTCTTTCACCTTTCCTTCCTTCCTTCCTCCTTTCCTTCCTCAGGAGAA AGGCCTCTCTCTCCGTGTT CACAGCGGACCTTGATTTAAATGTCC ATA CAATTAAGGCACGCGGT GAAT GCCAAGAAT GGGGCT GGCT GAGCA CCGTGGGTCGGCGAGGGCCCGCCAAGGAAGGAGCGACC

37

miR-181a- 1 GTTGTTTCTGTCTCCCATCCCCTTCAGATACTTACAGATACTGTAAAG T GAGTAGAATTCTGAGTTTT GAGGTTGCTT CAGTGAACATTC AACGCT GTCGGT GAGTTTGGAATTAAAAT CAAAACCATCGACCGTTGATT GTAC CCTATGGCTAACCATCATCTACTCCATGGTGCTCAGAATTCGCTGAAG ACAGGAAACCAAA

38

miR-141

Seq ID

ARNmi

Secuencia clonada en vector lentiviral

CCTGTAGCAACTGGT GAGCGCGCACCGTAGTTCTCT GT CGGCCGGCC CTGGGTCCATCTTCCAGTACAGTGTTGGATGGTCTAATTGTGAAGCTC CTAACACT GT CT GGTAAAGAT GGCTCCCGGGTGGGTT CTCTCGGCAGT AACCTTCAGGGAGCCCTGAAGACCATGGAGGACTACTGACCAACAA CCTCTGACCTT

39

miR-200a

GTTCTTCCCTGGGCTTCCACAGCAGCCCCTGCCTGCCTGGCGGGACC CCACGTCCCTCCCGGGCCCCTGTGAGCATCTTACCGGACAGTGCTGG ATTT CCCAGCTT GACTCTAACACT GT CTGGTAACGAT GTTCAAAGGT G ACCCGCCGCTCGCCGGGGACACCACCGAGGCACATCCGGAGCTCCTAC"

40

miR-200c

AAGCT GCCT GACCCAAGGTGGGCGGGCT GGGCGGGGGCCCTCGT CT

TACCCAGCAGTGTTTGGGTGCGGTTGGGAGTCTCTAATACTGCCGGG

TAATGATGGAGGCCCCTGTCCCTGTGTCAGCAACATCCATCGCCTCA

41

miR-205

AGTGTCTACAGGCTGAGGTTGACATGCATCCCCACCCTCTGAGAAAAA GATCCT C AGACAAT CCAT GT GCTTCTCTT GT CCTTCATTCCACCGGAGT CT GTCTCATACCC AACC AGATTT CAGTGGAGT GAAGTT CAGGAGGC AT GGAGCTGACAACCATGAGGCCTCGGCAGCCACCGCCACCACCGCCGC CGCCACCACCGTAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA

GCAGCAAGAGTAACT

42

miR-429

AGACACCAGCCCAGGACCCGGAGGCCACCCACACCACCGCCGGCCGA

TGGGCGTCTTACCAGACATGGTTAGACCTGGCCCTCTGTCTAATACTGT

CTGGTAAAACCGTCCATCCGCTGCCTGATCACCGTTAGAGGAGAGAGC

TGCCTGCCCTGCAGCTCATCAGTGCAAAGCC

43

miR-206

GCAAGGAGGAAAGATGCTACAAGTGGCCC ACTT CT GAGATGCGGGCT GCTT CT GGATGACACT GCTTCCCGAGGCC ACATGCTT CTTTATATCCC CATATGGATTACTTTGCTATGGAATGTAAGGAAGTGTGTGGTTTCGGC AAGT GCCTCCT CGCTGGCCCC AGGGT ACCACC CGGAGCACAGGTTTG GT GACCTT CTT C

Claims (6)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Molecula de ARNmi o un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma donde una fuente de dicha molecula de ARNmi o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleotidos y comprende una unidad con al menos 98% de identidad con SEQ ID NO: 1 o una fuente de la misma, o una composicion que comprende dicha molecula de ARNmi, equivalente o mimetico o isomiR de la misma o fuente de la misma para su uso como un medicamento para tratar, revertir, curar y/o retrasar un cancer asociado a la EMT induciendo un proceso de MET, donde dicha molecula de ARNmi es un ARNmi-518b, ARNmi-520f y/o ARNmi-524.
2. 2. Molecula de ARNmi, un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma o una fuente de la misma o la composicion que comprende dicha molecula de ARNmi, equivalente o fuente de la misma segun la reivindicacion

   1 para su uso segun la reivindicacion 1, donde el cancer asociado a la EMT es un carcinoma.
3. 3. Molecula de ARNmi, un equivalente o un mimetico o un isomiR de la misma o una fuente de la misma o la composicion que comprende dicha molecula de ARNmi, equivalente o fuente de la misma segun la reivindicacion

   2 para su uso segun la reivindicacion 1 o 2, donde el carcinoma es un cancer de vejiga o prostata.
4. 4. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende ademas otra molecula de ARNmi, un mimetico o isomiR o fuente de la misma seleccionado de: al menos uno de ARNmi-124-1, ARNmi-206, ARNmi-181a-1, ARNmi-141, ARNmi-200a, ARNmi-200b, ARNmi-200c, ARNmi-429 y ARNmi-205 y/o una fuente de la misma.
5. 5. Metodo para la identificacion de una sustancia capaz de tratar, revertir, curar y/o retrasar un cancer asociado a la EMT en una celula mediante la induction de un proceso de MET, el metodo comprende las etapas de:

   (a) proporcionar una poblacion de celulas de prueba capaces de expresar una molecula de ARNmi o equivalente o un isomiR de la misma tal y como se define en la reivindicacion 1, preferiblemente, la poblacion de prueba comprende celulas de vejiga, mas preferiblemente la poblacion de celulas de prueba comprende celulas de mamiferos, aun mas preferiblemente celulas humanas;

   (b) poner en contacto o incubar la poblacion de celulas de prueba con la sustancia;

   (c) determinar el nivel de expresion de dicha molecula de ARNmi o equivalente o isomiR de la misma o la actividad o el nivel de estado estable de dicha molecula de ARNmi o equivalente o isomiR de la misma en la poblacion de celulas de prueba puesta en contacto o incubada con la sustancia;

   (d) comparar la expresion, la actividad o el nivel de estado estable determinado en (c) con la expresion, la actividad o el nivel de estado estable de dicha molecula o equivalente o isomiR en una poblacion de celulas de prueba que no esta en contacto con la sustancia; e,

   (e) identificar una sustancia que produce una diferencia en el nivel de expresion, la actividad o el nivel de estado estable de dicha molecula de ARNmi o equivalente o isomiR, entre la poblacion de celulas de prueba que esta en contacto con la sustancia y la poblacion de celulas de prueba que no esta en contacto con la sustancia.
6. 6. Metodo segun la reivindicacion 5, en el cual los niveles de expresion, las actividades o los niveles de estado estable de al menos otra molecula de ARNmi, o isomiR o fuente de la misma se comparan, preferiblemente donde la otra molecula de ARNmi, o isomiR o fuente de la misma se selecciona de: al menos uno de ARNmi- 124-1, ARNmi-206, ARNmi-181a-1, ARNmi-141, ARNmi-200a, ARNmi-200b, ARNmi-200c, ARNmi-429 y ARNmi- 205 y/o un isomiR y/o una fuente del mismo.