JP5118626B2 - 発酵性糖を得るためのバイオマス処理 - Google Patents
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Description
本発明は、エネルギー省によって授与された契約番号04−03−CA−70224の下で米国政府後援でなされたものであった。政府は本発明における特定の権利を有する。
a)バイオマスを、アンモニアを含んでなる水溶液と接触させ、バイオマス−水性アンモニア混合物を形成する工程であって、ここで該アンモニアは該バイオマス−水性アンモニア混合物のアルカリ性pHを維持するために少なくとも十分な濃度で存在するが、該アンモニアはバイオマスの乾燥重量に対して約12重量パーセント未満で存在し、かつさらに該バイオマスの乾燥重量は該バイオマス−水性アンモニア混合物の重量に対して少なくとも約15重量パーセントの高固体濃度にある、工程、
b)工程(a)の該生産物を適切な条件下で糖化酵素共同体と接触させ、発酵性糖を生産する工程、
を含んでなる。
本開示では多数の用語が用いられる。以下の定義が提供される。
「発酵性糖」という用語は、発酵方法中の微生物による炭素源として使用可能なオリゴ糖および単糖を示す。
前処理後、生産物は、アンモニア、部分的に分解されたバイオマスおよび発酵性糖の混合物を含んでなる。さらなる加工に先立ち、アンモニアは、真空の適用により前処理されたバイオマスから除去されうる。アンモニアの除去によりpHが低下することから、より少ない中和酸を用いることで糖化および発酵における所望のpHを得る。これは前処理混合物における塩負荷の低下を招く。典型的には、一部のアンモニアが残存し、それは発酵における窒素源をもたらすのに望ましい。
以上本発明を要約すれば下記のとおりである。
1.a)バイオマスを、アンモニアを含んでなる水溶液と接触させ、バイオマス−水性アンモニア混合物を形成し、前処理されたバイオマス生産物を生産する工程であって、ここでアンモニアはバイオマス−水性アンモニア混合物のアルカリ性pHを維持するために少なくとも十分な濃度で存在するが、前記アンモニアはバイオマスの乾燥重量に対して約12重量パーセント未満で存在し、かつさらにバイオマスの乾燥重量はバイオマス−水性アンモニア混合物の重量に対して少なくとも約15重量パーセントの高固体濃度にある、工程、
b)工程(a)の生産物を、適切な条件下で糖化酵素共同体と接触させ、発酵性糖を生産する工程、
を含んでなる、発酵性糖の生産のためのバイオマスの処理方法。
2.バイオマス−水性アンモニア混合物のpHが8より大きい前記1に記載の方法。
3.バイオマスとアンモニアを含んでなる水溶液との接触に先立ち、バイオマスに真空を適用する前記1に記載の方法。
4.前記バイオマスの乾燥重量が少なくとも約15%〜約80%の高固体濃度にある前記1に記載の方法。
5.前記バイオマスの乾燥重量が少なくとも約15%〜約60%の高固体濃度にある前記4に記載の方法。
6.前記アンモニアがバイオマスの乾燥重量に対して約10重量パーセント未満で存在する前記1に記載の方法。
7.前記アンモニアがバイオマスの乾燥重量に対して約6%もしくはそれ以下の重量パーセントで存在する前記6に記載の方法。
8.バイオマスがバイオエネルギー作物、農業残渣、都市固体廃棄物、産業固体廃棄物、工場廃棄物、木材および林業廃棄物よりなる群から選択される前記1に記載の方法。
9.バイオマスが、スイッチグラス、紙くず、製紙汚泥、トウモロコシ粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシの皮、コーンストーバー、草、小麦、小麦のわら、まぐさ、大麦、大麦のわら、稲わら、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀物の加工から得られる成分、木、枝、根、葉、ウッドチップ、おがくず、低木およびブッシュ、野菜、果物、花ならびに動物糞尿よりなる群から選択される前記1に記載の方法。
10.バイオマスが、トウモロコシ穂軸、コーンストーバー、トウモロコシの皮、サトウキビバガス、おがくず、スイッチグラス、小麦のわら、まぐさ、大麦のわら、稲わら、および草よりなる群から選択される前記9に記載の方法。
11.バイオマスが、トウモロコシ穂軸、コーンストーバー、おがくず、およびサトウキビバガスよりなる群から選択される前記10に記載の方法。
12.アンモニアが、アンモニアガス、水酸化アンモニウム、尿素、およびこれらの組み合わせよりなる群から選択される前記1に記載の方法。
13.アンモニアを含んでなる前記水溶液が少なくとも1つの追加塩基をさらに含んでなる前記1に記載の方法。
14.前記少なくとも1つの塩基が、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、水酸化カルシウムおよび炭酸カルシウムよりなる群から選択される前記13に記載の方法。
15.(a)が約4℃〜約200℃の温度で実施される前記1に記載の方法。
16.(a)が約75℃〜約150℃の温度で実施される前記15に記載の方法。
17.(a)が90℃より高く約150℃以下の温度で実施される前記16に記載の方法。
18.(a)が最大約25時間の期間に実施される前記1に記載の方法。
19.(a)が最大約8時間の期間に実施される前記18に記載の方法。
20.(a)のアンモニアの少なくとも一部が(b)に先立ち除去される前記1または2に記載の方法。
21.(a)からのアンモニアが再生される前記1に記載の方法。
22.(b)の接触させる工程が少なくとも約15%のバイオマス濃度の乾燥重量で行われる前記1に記載の方法。
23.(a)、(b)または(a)および(b)が少なくとも1回繰り返される前記1に記載の方法。
24.(a)において少なくとも1つの可塑剤、柔軟剤またはこれらの組み合わせを添加する工程をさらに含んでなる前記1に記載の方法。
25.前記少なくとも1つの可塑剤、柔軟剤またはこれらの組み合わせが、ポリオール、ポリオールのエステル、グリコールエーテル、アセトアミド、エタノール、およびエタノールアミンよりなる群から選択される前記24に記載の方法。
26.(a)の前または間、(b)の前または間、あるいはそれらの組み合わせにおいてエネルギーを加える工程をさらに含んでなる前記1に記載の方法。
27.前記エネルギーが、ミリング、クラッシング、粉砕、破砕、チョッピング、ディスクリファイニング、超音波およびマイクロ波よりなる群から選択される前記26に記載の方法。
28.糖化に先立ち、発酵からの二酸化炭素を使用して前処理における混合物のpHを調節する前記1に記載の方法。
29.前記糖化酵素共同体が少なくとも1つのグリコシダーゼを含んでなる前記1に記載の方法。
30.前記糖化酵素共同体が、セルロースを加水分解するグリコシダーゼ、ヘミセルロースを加水分解するグリコシダーゼ、澱粉を加水分解するグリコシダーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、リグニナーゼおよびフェルロイルエステラーゼよりなる群から選択される少なくとも1つの酵素を含んでなる前記1に記載の方法。
31.前記糖化酵素共同体が、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノキシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼよりなる群から選択される少なくとも1つの酵素を含んでなる前記1に記載の方法。
32.(b)が約15℃〜約100℃の温度および約2〜約11のpHで実施される前記1に記載の方法。
以下の略語が用いられる。
「HPLC」は高性能液体クロマトグラフィー、「C」は摂氏、「kPa」はキロパスカル、「m」はメートル、「mm」はミリメートル、「kW」はキロワット、「μm」はマイクロメートル、「μL」はマイクロリットル、「mL」はミリリットル、「L」はリットル、「min」は分、「mM」はミリモル、「cm」はセンチメートル、「g」はグラム、「kg」はキログラム、「wt」は重量、「hr」は時間、「temp」または「T」は温度、「theoret」は理論、「pretreat」は前処理、「DWB」はバイオマスの乾燥重量である。
ジッパークレーブ(Zipperclave)(登録商標)反応器
4リットルのジッパークレーブ(Zipperclave)(登録商標)反応器(オートクレーブ・エンジニアーズ(Autoclave Engineers)、エリー(Erie)、ペンシルバニア州)は、バイオマス負荷用の2.5リットルのハステロイ(Hastelloy)(登録商標)筒状容器およびバイオマスを混合するための撹拌器を具備するバッチ式圧力容器である。反応容器は、所望の前処理温度で制御される電気ヒーターによって囲まれている。バイオマスを最高で前処理温度まで速やかに誘導するため、直接蒸気注入も用いられる。蒸気圧を調節および制御し、所望の前処理温度を維持する。蒸気凝縮物を、ジッパークレーブ(Zipperclave)(登録商標)反応器のヘッドプレート、容器および反応器の筒状容器と内壁との間に形成されるリザーバに通じる筒状容器ドレンの外側を加熱することによって形成し、前処理されたスラリーの過剰な希釈を阻止する。
ジャイゴ(Jaygo)反応器は、ハステロイ(Hastelloy)(登録商標)C−22合金製の130−リットル(直径約51cm×長さ91cm)の水平のパドル型反応器(ジャイゴ・マニュファクチュアリング(Jaygo Manufacturing,Inc.)、マーワー(Mahwah)、ニュージャージー州)である。反応器は約177℃(862kPa)に加熱可能な蒸気ジャケットを具備する。バイオマスを最高で前処理温度まで速やかに誘導するため、直接蒸気注入も用いられる。蒸気圧を調節および制御し、所望の前処理温度を維持する。極めて多くのポートにより、他の溶媒および温液の注入が可能になる。
4リットルのスチームガン反応器(オートクレーブ・エンジニアーズ(Autoclave Engineers)、エリー(Erie)、ペンシルバニア州)は、2つのボール弁によって閉鎖される長さ102mmで計画された80ハステロイ(Hastelloy)(登録商標)パイプより構成される蒸気ジャケット付き反応器である。追加の電気ヒーターを、反応器のジャケットが付いていない露出された全表面上に設け、かつ前処理の定値温度に制御する。バイオマスを最高の前処理温度まで速やかに誘導するため、直接蒸気注入も用いられる。蒸気圧を調節および制御し、所望の前処理温度を維持する。反応器の底部を51mmにネックダウンする。すべての前処理した材料を、反応器の底部で交換可能なダイを通して排出させ、厚肉のジャケット付き冷却フラッシュタンク内部で支持された0.21m3のナイロン(ホットフィル(Hotfill)(登録商標))製バッグ内に回収する。
ディスクリファイナーは、11kWの電気モーターを具備するスプラウト・ワルドロン(Sprout Waldron)モデルの30.5cmのリファイナー(アンドリッツ(Andritz,Inc.)、マンシー(Muncy)、ペンシルバニア州)である。固定板と回転板の間の間隙は可変である。フィードオーガー(feed auger)の速度もまた0〜88rpmで可変である。リファイナーへの注入口を6つの注入ポートを用いて改良することで、回転するリファイナープレートのすぐ前方における蒸気、熱水、または他の掃引ガスおよび液体の導入が可能になる。リファイナーに、プレート(デュラメタル(Durametal,Corp.)、テュラティン(Tulatin)、オレゴン州)をNi−HardでのパターンD2A506またはNi−Hardでのパターン18034−Aで装備した。
9LのPEHReactor(NREL、ゴールデン(Golden)、コロラド州にて構築;同時係属中の米国特許出願第CL3447号明細書を参照)は、処理反応体の導入用の注入ランスを具備する約15cm×51cmのステンレス鋼製の反応容器を有する。注入ランスは、容器の一端部上のカバー内のポートに回転ジョイントを用いて接続され、それは容器への接近手段として追加ポートを有する。4つのバッフルが容器壁の全長にわたり、壁に垂直に取り付けられる。容器内で浮遊状態にあるバッフルおよび3.2cmX3.2cmの22個のセラミック製摩擦媒体シリンダー(E.R.アドバンスド・セラミックス(E.R.Advanced Ceramics)、イーストパレスタイン(East Palestine)、オハイオ州)は、容器の回転時にバイオマスと反応物との機械的混合を適用し、それにより反応物のバイオマスへの吸収が促進される。PEHReactorを、回転のための機構を提供するベルコ・セル−プロダクション・ローラー・アパラタス(Bellco Cell−Production Roller Apparatus)(ベルコ・テクノロジー(Bellco Technology)、ヴァインランド(Vineland)、ニュージャージー州)上に設置し、ローラー装置を具備する反応器を、熱を供給する温度制御チャンバー内に収容する。外部ソースをカバー内のランスに接続されたポートに取り付けることにより、反応容器に真空および圧力を印加できる。
セルロースの定量
各バイオマス出発試料中のセルロースの量を、ASTM E1758−01「HPLCにより炭水化物を測定するための標準的方法(Standard method for the determination of carbohydrates by HPLC)」などの当該技術分野で周知の方法を用いて測定した。
糖化液中の可溶性糖(グルコース、セロビオース、キシロース、ガラクトース、アラビノースおよびマンノース)、アセトアミド、乳酸ならびに酢酸を、適切なガードカラムを有するバイオ・ラッド(Bio−Rad)HPX−87Pおよびバイオ・ラッド(Bio−Rad)HPX−87Hカラム(バイオ・ラッドラボラトリーズ(Bio−Rad Laboratories)、ハーキュリーズ(Hercules)、カリフォルニア州)を用い、HPLC(アジレント(Agilent)モデル1100、アジレント・テクノロジーズ(Agilent Technologies)、パロアルト(Palo Alto)、カリフォルニア州)によって測定した。試料のpHを測定し、必要に応じ硫酸を用いて5〜6に調節した。次いで、試料を直接に0.2μmのシリンジフィルターを通してHPLCバイアルに通過させた。HPLCの稼動条件は以下の通りであった。
バイオ・ラッド(Biorad)アミネックス(Aminex)HPX−87P(炭水化物用):
注入容量:10〜50μL、濃度および検出器の限界に依存
移動相:HPLCグレードの水、0.2μmに濾過および脱気
流速:0.6mL/分
カラム温度:80〜85℃、ガードカラム温度<60℃
検出器温度:可能な限り主カラム温度に近い
検出器:屈折率
実行時間:35分間のデータ収集に加え、実行後の15分間(後の溶出化合物のために可能な調節を行う)
注入容量:5〜10μL、濃度および検出器の限界に依存
移動相:0.01N硫酸、0.2μmに濾過および脱気
流速:0.6mL/分
カラム温度:55℃
検出器温度:可能な限りカラム温度に近い
検出器:屈折率
実行時間:25〜75分間のデータ収集
高いバイオマス濃度、高温でのストーバーの前処理およびアンモニア濃度の比較
バイオマス負荷の導入前に、ジッパークレーブ(Zipperclave)(登録商標)反応容器およびヘッドプレートを、蒸気を反応器内に循環させかつ数回通風することにより、目的の前処理温度まで予備加熱した。前処理前に、予備加熱の間に形成される凝縮物を真空吸引により除去した。ハステロイ(Hastelloy)(登録商標)筒状容器に0.635cm(1/4インチ)に粉砕したストーバー(100g、乾燥重量を基準)を負荷し、それを予熱した反応器に入れた。反応器の撹拌器を20rpmに設定する一方、容器内部および負荷されたバイオマスに真空(約85kPa)を適用した。バイオマス−水性アンモニア混合物の重量に対して30重量パーセントの濃度にあるバイオマスの乾燥重量ならびに表1に挙げる所望のアンモニア濃度を与えるのに必要な強度の水酸化アンモニウムを、スプレー型ノズルを有する容器の底部付近に注入した。試験試料がバイオマスの乾燥重量に対して12%の最終アンモニア濃度を有する一方、バイオマスの乾燥重量に対して35%の最終アンモニア濃度を有する試料を比較として用いた。バイオマス負荷の温度が50℃に達した場合、蒸気を反応器の底部付近に導入して流動化し、バイオマス負荷の温度を140℃または170℃に上昇させた。前処理の最後に、反応器の開放および前処理されたバイオマスの回収に先立ち、反応器をベントコンデンサを通して減圧し、真空(約85kPa)を3分間適用し、温度を低下させ、追加のアンモニアを前処理されたスラリーから除去した。
高いバイオマス濃度、低温、および極めて少量のアンモニアでのストーバーの前処理
ジャイゴ(Jaygo)反応器に0.635cmに粉砕したストーバー(13kg、乾燥重量を基準)を負荷した。真空(67.7kPa)を容器に適用し、希釈水酸化アンモニウム溶液を注入することで、アンモニア6.2g/バイオマスの乾燥重量100gのアンモニア濃度およびバイオマス−水性アンモニア混合物の総重量に対して30重量パーセントの濃度にあるバイオマスの乾燥重量が得られた。真空を解放し、蒸気をジャケットに適用してストーバーを100℃まで加熱した。浸漬したストーバーの温度を32rpmで常に混合しながら8時間保持し、次いで生産されたスラリーを連続混合しつつ一晩冷却しておいた。
高いバイオマス濃度、低温、および極めて低いアンモニア濃度でのトウモロコシ穂軸の前処理とその後の高いバイオマス濃度での糖化
全粒または粉砕トウモロコシ穂軸(約13kg、乾燥重量を基準)をジャイゴ(Jaygo)反応器に負荷した。トウモロコシ穂軸をプレートC−2975を具備するディスクリファイナーに通過させることにより粉砕した(「一般的方法」)。生産された粉砕トウモロコシ穂軸を1.27cmのスクリーンに通過させた。保持された任意の切片を、再びディスクリファイナーに0.5cmのより小さい間隙で通過させた。反応器に真空を適用し、希釈水酸化アンモニウム溶液を注入することで、表3に示すように所望の最終アンモニア濃度(2%もしくは6%)および乾燥バイオマスの濃度(30%もしくは40%)が得られた。真空を解放し、全粒トウモロコシ穂軸試料に対して93℃および粉砕トウモロコシ穂軸試料に対して85℃の温度まで浸漬しながら、蒸気をジャケットに適用してトウモロコシ穂軸を加熱した。加熱速度を高める目的で、短時間、撹拌器速度を増加させた(最大96rpm)。浸漬したトウモロコシ穂軸の温度を、32rpmで常に混合しながら4もしくは8時間保持し、次いで連続混合しつつ一晩冷却しておいた。
高いバイオマス濃度、高温、および極めて低いアンモニア濃度でのトウモロコシ穂軸の前処理とその後の高いバイオマス濃度での糖化
粉砕トウモロコシ穂軸(13kg、乾燥を基準)をジャイゴ(Jaygo)反応器に負荷した。反応器の真空を引いた後、2%のアンモニアおよび30乾燥重量%のバイオマスの濃度を与えるのに適切な強度の水酸化アンモニウム溶液を、室温、32rpmで混合しながら反応器にポンピングした。次いで、反応器の内容物を低圧のジャケット蒸気を用いて95℃に加熱した。一旦反応器が95℃に達すると、直接蒸気注入を用いて反応器の内容物を145℃に加熱した。反応器が145℃に達すると、反応器の内容物を、ジャケット蒸気および部分的に直接蒸気注入を用いてその温度で20分間保持した。20分後、反応器に至る通気口上で真空を引き、シュレッダーモーターを5分間作動させた。1時間後、ジャケットに対して冷却水を作動させた。ジャイゴ(Jaygo)反応器の内容物を33℃〜37℃に冷却し、次いで反応器をCO2を用いて138kPaまで加圧した。加圧されたCO2雰囲気を30分間維持した。反応器の内容物の最終温度は27℃〜31℃であった。浸漬/前処理されたバイオマスのpHは約7.5であった。
可塑剤の添加を伴う前処理
全粒トウモロコシ穂軸を、実施例3に記載のように、可塑剤としての作用を意図して添加されるバイオマスの乾燥重量に対して3重量パーセントのグリセロールを有するジャイゴ(Jaygo)反応器内で、バイオマス−水性アンモニア混合物の総重量に対して約30%のバイオマスの乾燥重量の濃度、バイオマスの乾燥重量に対して2重量パーセントのアンモニアにて、100℃で8時間かけて前処理した。前処理後、生産された材料のpHを固体クエン酸を用いて5に調節した。次いで、実施例3に記載のように前処理されたトウモロコシ穂軸を消化した。未処理のストーバー中の28mgのスペザイム(Spezyme)CP(登録商標)/gセルロースと未処理のトウモロコシ穂軸中の28mg/gのセルロース、マルチフェクト・キシラナーゼ(Multifect Xylanase)(登録商標)との酵素混合物を使用した。消化の96時間後、グルコース濃度は92.3g/L、キシロース濃度は54.4g/Lであった。
前処理されたバイオマスのディスクリファイニング
実施例1に記載のように、ストーバーを、表5に挙げる、低いアンモニア濃度(12%)または比較としてのアンモニア濃度(35%)を有する異なる試料、温度、時間、ならびに酵素条件の下で前処理した。全粒トウモロコシ穂軸を、実施例3に記載のように、表5に挙げる、極めて少量のアンモニア(3%もしくは6%)を有する異なる試料および他の条件の下で前処理した。前処理後、試料をスプラウト・ワルドロン(Sprout Waldron)ディスクリファイナーに通過させた。静止プレートと回転プレートの間の間隙を0.254mm(0.010インチ)、フィードオーガー速度を7rpmに設定した。実施例2に記載のように精製された材料を糖化し、生産された糖化液の糖含有量を「一般的方法」における糖測定プロトコルに従って測定した。96時間後における糖化の結果を表5に示す。結果は、糖化に先立つディスクリファイニングの場合、より良い消化率が得られるかまたはより低い酵素濃度の使用が有効であることを示した。
前処理されたバイオマスのスチームガン処理
実施例1に記載のように、ストーバーを、ジャイゴ(Jaygo)反応器内で、バイオマス−水性アンモニア混合物の総重量に対して30乾燥重量%のバイオマス、DWBに対して6重量パーセントのアンモニア、100℃で8時間という条件を用いて前処理した。トウモロコシ穂軸を、実施例3に記載のように、ジャイゴ(Jaygo)反応器内で、バイオマス−水性アンモニア混合物の総重量に対して40乾燥重量%のバイオマス、DWBに対して6重量パーセントのアンモニア、93℃で8時間という条件を用いて前処理した。前処理された各バイオマスの試料を4リットルのスチームガン反応器に別々に負荷した。前処理された材料に、ダイを通して放出される前に、170℃を5分間、または140℃を20分間施した。生産された材料を実施例2に記載のように糖化した。結果を下記表6に示す。結果は、糖化に先立つスチームガン処理によりグルコースの放出が改善されることを示した。
アンモニア再生を伴う前処理のモデリング
低温(85℃)、長い滞留時間(4時間)と高温(130℃)、短い滞留時間(20分)という2つの前処理スキームにおいて、アンモニア再生の利点についてアスペン(Aspen)モデル(アスペン・テクノロジーズ(Aspen Technologies)、ケンブリッジ(Cambridge)、マサチューセッツ州、バージョン12.1)を用いて検証した。各モデルでは、前処理反応器の後に順次低圧で作動する3つの一連のフラッシュタンクを設けることで、アンモニア再生のための手段を提供した。供給流れが各タンクに入る時、それは圧力の低下に起因して気体および液体画分に分離した。気体画分が前処理へ再生される一方、液体画分は方法内の次の工程に進んだ。前処理において、DWBに対して2重量パーセントのアンモニアおよびバイオマス−水性アンモニア混合物の総重量に対して約27乾燥重量%のバイオマスを仮定すると、各方法における新たに供給されるアンモニアと再生流れからのアンモニアについて表7に示す。両モデルにおけるフラッシュタンクを、アンモニア再生が類似するように同様に作動させた。両方のシナリオにおいて、必要なアンモニアの半分を超える量を再生を通して供給することで、新たなアンモニアに対する必要性およびコストが低減された。
少量のアンモニアで前処理され、糖化されたトウモロコシ穂軸のバイオマスからのエタノールの生産、および多量のアンモニアで前処理され、糖化されたストーバーに対する比較
全粒トウモロコシ穂軸を、実施例3に記載のように、ジャイゴ(Jaygo)反応器内で、バイオマスの乾燥重量に対して6重量パーセントのアンモニア、バイオマス−水性アンモニア混合物の総重量に対して40重量パーセントの濃度にあるバイオマスの乾燥重量の下で、93℃で8時間前処理することにより、トウモロコシ穂軸の加水分解物を生産した。前処理後、反応器を真空下で90℃に加熱することにより、アンモニアを除去した。次いで、前処理されたバイオマスのpHを硫黄酸を用いて5に調節した。前処理されたバイオマスを、ジャイゴ(Jaygo)反応器内で、28mg/gのセルロース、スペザイム(Spezyme)(登録商標)セルラーゼおよび28mg/gのセルロース、マルチフェクト(Multifect)(登録商標)キシラナーゼを用い、前処理されたバイオマス−糖化酵素共同体混合物の総重量に対して30%にあるバイオマスの乾燥重量にて、50℃およびpH5で168時間かけて糖化した。生産された加水分解物を、シックスフォース(Sixfors)発酵器(インフォース(INFORS AG)、スイス)内でのジモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)8bの発酵において使用した。ジモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)8bは、遺伝子操作により改善されてもはや野生型ではないエタノールの生産物を生産し、かつ米国特許出願公開第2003/0162271A1号明細書に記載があるジモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)の株である(実施例IV、VIおよびXII)。トウモロコシ穂軸の加水分解物は、78g/Lのグルコース、51g/Lのキシロース、6g/Lのアセトアミド、および7g/Lの酢酸を含んでなるものであった。トウモロコシ穂軸の加水分解物を、最終スラリー中での酵母抽出物およびKH2PO4の濃度がそれぞれ約5g/Lおよび2g/Lであるような量で、それらよりなる濃縮された水性培地が平衡した状態で、40%および80%の強度で使用した。さらに、40%の加水分解物スラリー中にグルコースおよびキシロースを、それらの濃度を80%の加水分解物スラリー中の場合と同じ濃度にするのに十分な量で添加した。発酵を37℃で行った。発酵器内での撹拌は100rpmであり、pHを2N KOHの添加により5.5に維持した。結果を表8に示す。糖類およびエタノールを「一般的方法」に記載のように分析した。
極めて少量のアンモニアで前処理され、糖化されたトウモロコシ穂軸バイオマスからの1
,3−プロパンジオールの生産
トウモロコシ穂軸の前処理および糖化から生産された加水分解物を発酵させ、1,3−プロパンジオールを生産した。加水分解物を、スチームガン反応器内でトウモロコシ穂軸片を前処理することにより生産した。第1のトウモロコシ穂軸バイオマスをPEHReactor内に負荷し(「一般的方法」に記載)、真空を適用し、希釈水酸化アンモニウム溶液を注入することで、アンモニア4g/バイオマスの乾燥重量100gのアンモニア濃度およびバイオマスの乾燥重量30g/バイオマス−水性アンモニア混合物全体100gの濃度にあるバイオマスの乾燥重量が得られた。アンモニアおよびトウモロコシ穂軸を負荷した反応容器を4℃で30分間回転させた。内容物をスチームガン反応器に移し(「一般的方法」に記載)、温度を145℃に上昇させ、混合物の温度を20分間保持した。スチームガンから得られた材料をフラッシュタンクに排出し、フラッシュタンク上で真空を維持することでアンモニアの除去を促進した。pH調節後、前処理されたバイオマスを、28.4mg/gのセルロース、スペザイム(Spezyme)CP(登録商標)セルラーゼおよび10.1mgの活性タンパク質/gのβ−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼおよびアラビノフラノシダーゼよりなるセルロース酵素共同体を用い、バイオマスの乾燥重量30g/前処理されたバイオマス−糖化酵素共同体混合物100gで、50℃およびpH5.5で72時間かけて糖化した。生産された加水分解物を、組換え大腸菌(E.coli)株RJ8n pBE93−k1により1,3−プロパンジオールに変換するための発酵性糖のソースとして使用した。株RJ8n pBE93−k1の作成は、PCT出願の国際公開第2004/018645号明細書にて詳細に記載されており(実施例7)、それは米国特許第6,358,716号明細書に記載のRJ8n株の派生株である。加水分解物を、最終pHを6.8に調節した状態や、7.5g/LのKH2PO4、2.0g/Lのクエン酸*H2O、4.0ml/Lの28%NH4OH、3.0g/Lの(NH4)2SO4、2.0g/LのMgSO4 *7H2O、0.2g/LのCaCl2 *2H2O、0.33g/Lのクエン酸第二鉄アンモニウム、0.5g/Lの酵母抽出物、0.1mg/LのビタミンB12、1.0mg/LのFeSO4 *7H2O、1mg/LのZnSO4 *7H2O、0.1g/LのCuSO4 *5H2O、1mg/LのCoCl2 *6H2O、0.3mg/LのMnSO4 *7H2O、0.1g/LのH3BO4、0.10g/LのNaMoO4 *2H2O、10mg/LのNaClよりなる水性培地が平衡した状態で、10%で使用した。250mLのバッフル付きフラスコ内の50mLの培地内の冷凍ストック(抗凍結剤として15%グリセロール)から培養を開始した。培養物を34℃および300rpmの振盪下で24時間インキュベートした。生産された1,3−プロパンジオールの量を、以下の条件下でHPLCによって測定した。
カラム:ショウデックス(Showdex)SH1011
試料容量:20μL
移動相:0.01N H2SO4
流速:0.5ml/分
カラム温度:50℃
検出器:ウォーターズ(Waters)996フォトダイオードアレイ
検出器温度:40℃
実行時間:40分
前処理の間でのアセトアミドの形成
実施例3および実施例4に記載の方法に従って前処理したトウモロコシ穂軸から誘導された試料を分析し、バイオマス中のアセチル基の行方を判定した。前処理液(不可溶性固体が除去された前処理混合物)における酢酸およびアセトアミドの含有量について以下のようにアッセイした。各試料のpHをH2SO4(72%)を用いて約3に調節した。アセトアミドの測定においては、下に挙げる条件に従い、試料を0.2μmのフィルターに通過させ、HPLCによって分析した。酢酸塩全体(酢酸およびアセトアミドとして存在する酢酸塩を含む)の測定においては、酸性化試料を121℃で1時間オートクレーブし、この工程の間にアセトアミドを酢酸に量的に変換した。オートクレーブ後、試料を冷却しておいた。次いで、下に挙げる条件に従い、試料を0.2μmのフィルターに通過させて試料バイアルに入れ、分析した。酢酸およびアセトアミドの濃度を各々において生産された標準曲線から判定した。
流速:0.6mL/分
カラム温度:55〜65℃
検出器温度:可能な限りカラム温度に近い
検出器:屈折率
実行時間:60分
カラム:バイオ・ラッド(Biorad)アミネックス(Aminex)HPX−87Hカラムと対応するガードカラム
アセトアミドおよび酢酸のジモモナス(Zymomonas)の成長に対する作用
アセトアミドおよび酢酸の毒性を試験するため、アセトアミドまたは酢酸を有する場合と有さない場合に、ジモモナス・モビリス(Z.mobilis)株8b(実施例9に記載)をpH6.0の発酵培地で成長させた。発酵培地を、10g/Lの酵母抽出物、2g/LのKH2PO4、70g/Lのグルコース、40g/Lのキシロースおよび0.1MのMES緩衝液より構成した。ジモモナス・モビリス(Z.mobilis)8bを、補充していない培地(対照)、6g/Lのアセトアミドを補充した培地、または7.2g/Lの酢酸を補充した培地内で、30℃で、150rpmで回転する25mLのバッフル付きエルレンマイヤー(Erlenmeyer)振盪フラスコ内で成長させた。図1に示すように、アセトアミドの存在がジモモナス・モビリス(Z.mobilis)の成長速度または最終密度に対して全く作用しなかったのに対し、酢酸の存在は成長速度の減少および細胞収率の低下(乾燥細胞質量により測定されたもの)を招いた。
高いバイオマス濃度、高温、および極めて少量のアンモニアでのバガスの前処理、ならびに低濃度および高濃度での糖化
摩擦媒体を全く有しないPEHReactor(「一般的方法」に記載)に1.27cmに粉砕したバガス(370g、乾燥重量を基準)を負荷した。このサトウキビバガスは、元々ハワイ・シュガー・プランターズ・アソシエーション(Hawaii Sugar Planters Association)、クニア(Kunia)支局、オアフ(Oahu)、ハワイ州から入手したサトウキビクローンH65−7052由来のNIST参照材料RM8491であった。それを、ワイリー(Wiley)製ミルで粉砕し、2mmのスクリーンを通過させ、その際に微粉(+74メッシュ)を除去した。PEHReactor容器を、外表面上で氷と接触状態で回転することにより4℃に冷却した。真空を反応容器に適用し、冷室内で4℃で予備冷却しかつ氷水槽内に浸漬したチュービングを通過させた希釈水酸化アンモニウム溶液を注入することで、4g/バイオマスの乾燥重量100gのアンモニア濃度および45g/バイオマス−水性アンモニア混合物全体100gの濃度にあるバイオマスの乾燥重量が得られた。アンモニアおよびバガスを負荷した反応容器を、氷を回転する反応容器の表面に適用して4℃に冷却し、4℃で30分間回転させた。この時点で、内容物を「一般的方法」に記載のスチームガン反応器に移した。一旦スチームガン反応器にアンモニア−バガス混合物を負荷し、温度を145℃に上昇させ、混合物の温度を20分間保持した。前処理時間の最後に、バガスをスチームガン反応器から1インチの環状ダイを通してフラッシュタンクに排出した。次いで、前処理したバガスの試料を振盪フラスコ内で糖化し、別の試料(約163gの乾燥重量)をPEHReactor内で糖化した。振盪フラスコでの糖化を、前処理されたバイオマス−糖化酵素共同体混合物の総重量に対して5乾燥重量%のバイオマスにて行う一方、PEHReactorでの糖化を、前処理されたバイオマス−糖化酵素共同体混合物の総重量に対して30乾燥重量%のバイオマスにて行った。温度を50℃で維持した。
高いバイオマス濃度、高温、および極めて少量のアンモニアでのイエロ−ポプラおがくずの前処理、ならびに低濃度および高濃度での糖化
摩擦媒体を有しないPEHReactorにイエロ−ポプラおがくず(596g、乾燥重量を基準;ソーミラー(Sawmiller Inc.)、ヘイデンヴィル(Heydenville)、オハイオ州から購入)を負荷した。反応容器に真空を適用し、希釈水酸化アンモニウム溶液を注入し、6g/バイオマスの乾燥重量100gのアンモニア濃度および44g/バイオマス−水性アンモニア混合物全体100gの濃度にあるバイオマスの乾燥重量が得られた。実施例13に記載のようにアンモニアおよびイエロ−ポプラおがくずを負荷した反応容器を4℃にし、4℃で30分間回転させた。この時点で、内容物をスチームガン反応器に移した。一旦スチームガン反応器にアンモニア−ポプラ混合物を負荷すると、温度を145℃に上昇させ、混合物の温度を20分間保持した。前処理時間の最後に、イエロ−ポプラおがくずをスチームガン反応器から1インチの環状ダイを通してフラッシュタンクに排出した。次いで、実施例13に記載のように、振盪フラスコ内で前処理したイエロ−ポプラおがくずの試料を糖化し、別の試料をPEHReactor内で糖化した。振盪フラスコでの糖化を、前処理されたバイオマス−糖化酵素共同体混合物の総重量に対して5乾燥重量%のバイオマスにて行う一方、(約279gの乾燥重量の前処理されたおがくずを使用する)PEHReactorでの糖化を、前処理されたバイオマス−糖化酵素共同体混合物の総重量に対して30乾燥重量にて%のバイオマス行った。前処理されていないイエロ−ポプラおがくずもまた、振盪フラスコ内で前処理されたバイオマス−糖化酵素共同体混合物の総重量に対して5乾燥重量%のバイオマスにて糖化した。あらゆる糖化を、28.4mg/gのセルロース、スペザイム(Spezyme)CP(登録商標)セルラーゼおよび28.4mg/gのセルロース、マルチフェクト(Multifect)(登録商標)キシラナーゼを用い、50℃およびpH5.5で96時間かけて行った。下記の表12に示す収率は、理論収率の百分率として各糖について公表されたものである。
極めて少量のアンモニアで前処理され、糖化されたトウモロコシ穂軸バイオマスから得られる加水分解物に対する酵母発酵によるエタノールの生産
実施例10で1,3−プロパンジオールを生産するのに使用されたものと同じ加水分解物をさらに使用し、酵母発酵によりエタノールを生産した。この加水分解物を、振盪フラスコ内で野生型サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisiae)によりエタノールに変換するための発酵性糖のソースとして使用した。加水分解物を、10g/Lの酵母抽出物および20g/Lのペプトンよりなる水性培地が平衡した状態で、10%(v/v)の強度で使用した。酵母を250mLのバッフル付きフラスコ内の50mLの培地内で培養した。培養物を、250rpmの振盪下、30℃で24時間インキュベートした。生産されたエタノールの量を実施例9に記載のようにHP
LCによって測定した、2つのフラスコからの結果を下記の表13に挙げる。
極めて少量のアンモニアで前処理され、糖化されたトウモロコシ穂軸バイオマスから得られた加水分解物に対する乳酸桿菌(Lactobacillus)発酵による乳酸の生産
振盪フラスコ内で、実施例10で1,3−プロパンジオールを生産するのに使用されたものと同じ加水分解物をさらに使用し、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)を用いた発酵により乳酸を生産した。加水分解物を、5g/Lの酵母抽出物、10g/Lのペプトン、2g/Lのクエン酸アンモニウム、5g/Lの酢酸ナトリウム、0.1g/LのMgSO4、0.05g/LのMnSO4および2g/LのK2HPO4よりなる水性培地ならびに1g/Lのトゥイーン(Tween)が平衡した状態で、10%(v/v)で使用した。乳酸桿菌(Lactobacillus)を250mLのバッフル付きフラスコ内の50mLの培養液中で培養した。2通りの培養物を、150rpmの振盪下、34℃で24時間インキュベートした。生産された乳酸の量を実施例10に記載のようにHPLCによって測定したものを表14に挙げる。2つのフラスコの2つの試料は、同じ培養物における2通りのアッセイのことである。
より高い乾燥バイオマス濃度での極めて少量のアンモニアを用いたトウモロコシ穂軸の前処理
全粒トウモロコシ穂軸を、約0.95cmのジョー間隔を有するジョークラッシャー(2.2kWモーター)、その後にデランパー(delumper)(1.5kWモーター、フランクリン・ミラー(Franklin Miller Inc.)、リビングストン(Livingston)、ニュージャージー州)で処理し、その後に1.9cmの米国標準スクリーンを備えたスウェコ(Sweco)スクリーンでスクリーニングした。約805gの粉砕トウモロコシ穂軸をPEHReactorに負荷した。トウモロコシ穂軸中の含水率は約7%であった。負荷に先立ち、反応容器内の雰囲気を窒素で5回フラッシュした。実験開始前、全く摩擦媒体を有しない反応器を回転させずに75℃に予備加熱した。反応容器内の温度が75℃で安定化した時、インキュベータ内の回転機構を作動させ、回転を19rpmに調節した。次いで、アンモニア6g/バイオマスの乾燥重量100gのアンモニア濃度および固体濃度としてバイオマスの乾燥重量50g/バイオマス−アンモニア混合物の総重量100gを得るために、適量の希釈水酸化アンモニウム溶液を反応器内にポンピングした。1g/バイオマスの乾燥重量100gのエタノールもまた溶液に添加した。アンモニア溶液を加熱ループを通して、2ガルのパール(Parr)反応器を使用して作り上げた、約75℃に加熱した水槽にポンピングした。加熱された希釈水酸化アンモニウム溶液を、注入ランスを介して反応容器に注入し、反応器内で回転し転がる粉砕トウモロコシ穂軸上にスプレーした。反応器を19rpmで回転させながら75℃で2時間維持した。その時間の最後に、真空(約85kPa)を反応容器に30分間適用し、アンモニアを除去し、反応器の内容物の温度を約50℃に低下させた。次いで、二酸化炭素を反応器に注入して真空を解放し、反応器をCO2のゲージ圧が103kPaになるまで加圧し、50℃で30分間圧力保持した。
トウモロコシ穂軸のより高い固体濃度での極めて少量のアンモニアを用いた前処理および代替条件
全粒トウモロコシ穂軸をハンマーミル(10インチのハンマーミル、グレン・ミル(Glen Mills Inc.)、クリフトン(Clifton)、ニューハンプシャー州)で処理し、1.27cmのスクリーンを通過させた。約805gの粉砕トウモロコシ穂軸をPEHReactorに負荷した。トウモロコシ穂軸中の含水率は約7%であった。22個のセラミック製の摩擦シリンダー(直径3.2cm×長さ3.2cm;E.R.アドバンスド・セラミックス(E.R.Advanced Ceramics)、イーストパレスタイン(East Palestine)、オハイオ州)も反応器に添加した。実験開始前、反応器を回転させずに95℃に予備加熱した。開始前に真空(約85kPa)を反応容器に適用し、容器を密封した。反応容器内の温度が95℃で安定化した時、インキュベータ内の回転機構を作動させ、かつ回転を19rpmに調節した。次いで、アンモニア6g/バイオマスの乾燥重量100gのアンモニア濃度および固体濃度としてバイオマスの乾燥重量50g/バイオマス−アンモニア混合物の総重量100gを得るために、適量の希釈水酸化アンモニウム溶液を反応器内にポンピングした。アンモニア溶液を加熱ループを通して、2ガルのパール(Parr)反応器を使用して作り上げた、沸騰した水槽内にポンピングした。加熱した希釈水酸化アンモニウム溶液を、注入ランスを介して反応容器に注入し、反応器内で回転し転がる粉砕トウモロコシ穂軸上にスプレーした。反応器を19rpmで回転させながら95℃で2時間維持した。その時間の最後に、真空(約85kPa)を反応容器に30分間適用し、アンモニアを除去しかつ反応器の内容物の温度を約50℃に低下させた。次いで、二酸化炭素を反応器に注入して真空を解放し、反応器をゲージ圧103kPaまで加圧し、50℃で30分間圧力保持した。
トウモロコシ穂軸の極めて少量のアンモニアおよび追加塩基を用いた前処理
全粒トウモロコシ穂軸を約0.95cmのジョー間隔を有するジョークラッシャー(2.2kWモーター)、その後にデランパー(1.5kWモーター、フランクリン・ミラー(Franklin Miller Inc.))で処理し、その後に1.9cmの米国標準スクリーンを備えたスウェコ(Sweco)スクリーンでスクリーニングした。約460gの粉砕トウモロコシ穂軸をPEHReactorに負荷した。トウモロコシ穂軸中の含水率は約7%であった。実験開始前、反応器を回転させずに95℃に予備加熱した。開始前に真空(約85kPa)を反応容器に適用し、容器を密封した。容器内の温度が95℃で再安定化した時、インキュベータ内の回転機構を作動させ、かつ回転を19rpmに調節した。次いで、固体濃度としてバイオマスの乾燥重量30g/バイオマス−アンモニア混合物の総重量100gを維持する一方、NaOH1.9g/バイオマスの乾燥重量100gの濃度を得るための、アンモニア3.2g/バイオマスおよびNaOHの乾燥重量100gのアンモニア濃度を得るための適量の水酸化アンモニウム溶液を反応器内にポンピングした。アンモニアおよび追加塩基の溶液を加熱ループを通して、2ガルのパール(Parr)反応器を使用して作り上げた、沸騰した水槽内にポンピングした。加熱した希釈水酸化アンモニウム溶液を、注入ランスを介して反応容器に注入し、反応器内で回転し転がる粉砕トウモロコシ穂軸上にスプレーした。注入後、容器における真空を大気圧に解放した。反応器を95℃で30分維持し、次いで温度を85℃に低下させ、ここではそれを4時間維持した。その時間の最後に、真空(約85kPa)を反応容器に30分間適用し、アンモニアを除去しかつ反応器の内容物の温度を約50℃に低下させた。次いで、二酸化炭素を反応器に注入して真空を解放し、反応器をゲージ圧103kPaまで加圧し、50℃で30分間圧力保持した。
室温および極めて少量のアンモニアでの前処理
全粒トウモロコシ穂軸を、約0.95センチのジョー間隔を有するジョークラッシャー(2.2kWモーター)、その後にデランパー(1.5kWモーター、フランクリン・ミラー(Franklin Miller Inc.))で加工した後、1.9cmの米国標準スクリーンを具備したスウェコ(Sweco)製スクリーンでスクリーニングした。約460gの粉砕トウモロコシ穂軸をPEHReactorに負荷した。トウモロコシ穂軸中の含水率は約7%であった。22個のセラミック製摩擦シリンダー(直径3.2cmx長さ3.2cm;E.R.アドバンスド・セラミックス(E.R.Advanced Ceramics)、イーストパレスタイン(East Palestine)、オハイオ州)も反応器に添加した。開始前には真空(約85kPa)を反応容器に適用し、容器を密封した。反応器内の温度が室温(22〜26℃)で再安定化した時、インキュベータ内の回転機構を作動させ、回転を19rpmに調節した。次いで、固体濃度としてバイオマスの乾燥重量30g/バイオマス−アンモニア混合物の総重量を維持する一方、アンモニア4g/バイオマスの乾燥重量100gのアンモニア濃度を得るための適量の希釈水酸化アンモニウム溶液を反応器内にポンピングした。希釈水酸化アンモニウム溶液を、注入ランスを介して反応容器に注入し、反応器内で回転し転がる粉砕トウモロコシ穂軸上にスプレーした。注入後、各容器における真空を大気圧に解放した。反応器を室温(22〜26℃)で24時間維持した。その時間の最後に、真空(約81kPa)を反応容器に30分間適用し、アンモニアを除去した。次いで、二酸化炭素を反応器に注入して真空を解放し、反応器をCO2を用いて103kPaゲージ圧に加圧し、室温で30分間圧力保持した。
Claims (1)
- a)バイオマスを、アンモニアを含んでなる水溶液と接触させ、バイオマス−水性アンモニア混合物を形成し、それによって前処理されたバイオマス生産物を生産する工程であって、ここでアンモニアはバイオマス−水性アンモニア混合物を7.0より大きいpHで維持するために少なくとも十分な濃度で存在するが、前記アンモニアはバイオマスの乾燥重量に対して12重量パーセント未満で存在し、かつさらにバイオマスの乾燥重量はバイオマス−水性アンモニア混合物の重量に対して15重量パーセント以上の固体濃度にある、工程、
b)工程(a)の前処理されたバイオマス生産物を少なくとも一つの糖化酵素と接触させ、発酵性糖を生産する工程、
を含んでなる、発酵性糖の生産のためのバイオマスの処理方法。
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