BR112019011612A2 - processos melhorados para a produção de etanol a partir de substratos celulósicos que contêm xilose com o uso de cepas de levedura geneticamente modificadas - Google Patents

Abstract

Trata-se de células hospedeiras recombinantes que têm um polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose e um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma isomerase de xilose, em que as células têm capacidade para fermentar xilose na presença de glicose e sob crescimento limitado por oxigênio. Também são descritos processos de fermentação de material sacarificado com o uso das células recombinantes para produzir etanol em rendimentos superiores.

Description

“PROCESSOS MELHORADOS PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL A

PARTIR DE SUBSTRATOS CELULÓSICOS QUE CONTÊM XILOSE COM O USO DE CEPAS DE LEVEDURA GENETICAMENTE MODIFICADAS” Referência a uma Listagem de Sequências

[0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequência em forma legível por computador, que é incorporada ao presente documento a título de referência.

Antecedentes

[0002] O etanol é um combustível usado em transportes normalmente em mistura com gasolina. Material celulósico é utilizado como matéria-prima nos processos de produção de etanol. Existem vários processos na técnica para fazer hidrolisados de celulose e hemicelulose contendo glicose, manose, xilose e arabinose. A glicose e manose são convertidas eficientemente para etanol durante o metabolismo anaeróbico natural. No entanto, para obter um processo economicamente relevante em escala industrial, xilose dentro dos hidrolisados deve ser fermentada em etanol.

[0003] Esforços para estabelecer e melhorar pentose (por exemplo, xilose) com utilização da levedura Saccharomyces cerevisiae foram relatados (Kim et al., 2013, Biotechnol Adv. 31(6):851-61). Isso inclui expressão heteróloga de xilose redutase (XR) e desidrogenase de xilitol (XDH) de leveduras de fermentação de xilose natural como Scheffersomyces (Pichia) stipitis e diversas espécies de Candida, bem como a superexpressão de xilulocinase (XK) e as quatro enzimas na trajetória de pentose fosfato não oxidativa (PPP), a saber, transcetolase (TKL), transaldolase (TAL), ribose-5-fosfato cetol-isomerase (RKI) e D-ribulose-5- fosfato 3-epimerase (RPE). Modificar a preferência de cofator de S. stipitis XR em relação a NADH em tais sistemas foi constatado como fornecendo vantagens metabólicas, bem como melhorar crescimento anaeróbico. As trajetórias que substituem a XR/XDH por sequência de codificação de xilose isomerase heteróloga (XI) também foram relatadas. Essas e outras modificações “foram descritas, por exemplo, nos documentos WO2003/062430, WO2009/017441, WO2010/059095, WO2012/113120 e WO?2012/135110.

[0004] Apesar da melhoria em processos de produção de etanol a partir de material celulósico ao longo da última década, absorção de pentoses (por exemplo, xilose) através da membrana de levedura permanece um desafio. Em uma abordagem, células hospedeiras de S. cerevisiae que têm uma trajetória de xilose redutase (XR)/desidrogenase de xilitol (XDH) foram — geneticamente — modificadas — para superexpressar diversos transportadores de hexose (HXT1, HXT2, HXT5, e HXT7), mas mostraram consumo de xilose insuficiente (<60%) durante cofermentação de glicose e xilose (Goncalves et. al, 2014, Enzyme Microb. Technol., 63: 13-20). Esse estudo revelou que superexpressão de cepa HXT2 produziu fermentações anaeróbicas incompletas com taxas de etanol significativamente inferiores em comparação com cepas que expressam o qualquer um dentre outros transportadores (HXT1, HXT5 ou HXT7). Desse modo, ainda há uma necessidade por novos processos industriais que podem ser usados para produção melhorada de etanol com o uso de substratos de resíduo de planta celulósica que contêm xilose, como processos de fermentação que utilizam simultaneamente pentoses (por exemplo, xilose) e glicose mediante condições limitantes de oxigênio.

Sumário

[0005] São descritas no presente documento células hospedeiras — recombinantes que compreendem um polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose (por exemplo, HXT2),

em que as células têm capacidade de fermentar pentoses (por exemplo, xilose). Em um aspecto, as células recombinantes compreendem ainda um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma sequência de codificação de xilose isomerase.

[0006] Em algumas modalidades, o transportador de hexose tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o transportador de hexose tem sequência de aminoácidos que compreende ou que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0007] Em algumas modalidades, a sequência de codificação de xilose isomerase tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, a sequência de codificação de xilose isomerase tem sequência de aminoácidos que compreende ou que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

18.

[0008] Em algumas modalidades, as células recombinantes têm capacidade de taxa maior de crescimento anaeróbico em uma pentose (por exemplo, xilose) em comparação com uma célula idêntica sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose em cerca de ou após 4 dias de incubação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 2).

[0009] Em algumas modalidades, as células recombinantes têm capacidade de maior consumo de pentose (por exemplo, xilose) em comparação com uma célula idêntica sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose em cerca de ou após 40 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 3). Em algumas modalidades, as células recombinantes têm capacidade de consumir mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de pentose (por exemplo, xilose) no meio, e/ou têm capacidade de consumir mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de glicose no meio, em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 4).

[0010] Em algumas modalidades, as células recombinantes têm capacidade de maior produção de etanol em comparação com uma célula idêntica sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose em cerca de ou após 40 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 3).

[0011] Em algumas modalidades, as células recombinantes compreendem ainda um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma xilulocinase (XK), por exemplo, uma XK que têm pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 22.

[0012] Em algumas modalidades, as células recombinantes compreendem ainda um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo selecionado a partir de uma ribulose 5 fosfato 3-epimerase (RPE1), uma ribulose 5 fosfato isomerase (RKI1), uma transcetolase (TKL1), uma transaldolase (TAL1).

[0013] Em algumas modalidades, as células recombinantes compreendem uma ruptura para um ou mais genes endógenos que codificam uma GPD e/ou GPP.

[0014] Em algumas modalidades, as células recombinantes são selecionadas a partir de Saccharomyces, Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Rhodosporidium, Candida, Yarrowia, Lipomyces, Cryptococcus, ou Dekkera sp. células. Em algumas modalidades, as células recombinantes são Saccharomyces cerevisiae células, como derivados de cepa Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositada sob Acessão nº NRRL Y-50973 no Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 U.S.A.).

[0015] Também são descritos métodos de produzir etanol com o uso das células recombinantes. Um aspecto é um método para produzir etanol, que compreende cultivar uma célula recombinante descrita no presente documento em um meio fermentável sob condições adequadas para produzir etanol. Em outro aspecto é um método para produzir etanol, que compreende: (a) sacarificação de um material celulósico e/ou que contém amido com uma composição de enzima; e (b) fermentar o material sacarificado da etapa (a) com uma célula recombinante descrita no presente documento.

[0016] Em algumas modalidades dos métodos, fermentação consome uma quantidade aumentada de glicose e pentose (por exemplo, xilose) em comparação com fermentação com o uso de uma célula idêntica sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose mediante as mesmas condições (por exemplo, em cerca de ou após 40 horas de fermentação, como as condições descritas no Exemplo 3). Em uma modalidade, mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de pentose (por exemplo xilose) no meio é consumida, e/ou mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de glicose no meio é consumida, em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 4).

[0017] Em algumas modalidades dos métodos, fermentação fornece maior produção de etanol em comparação com fermentação com o uso de uma célula idêntica sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose mediante as mesmas condições (por exemplo, em cerca de ou após 40 horas de fermentação, como as condições descritas no Exemplo 3).

[0018] Em algumas modalidades dos métodos, fermentação é conduzida mediante condições anaeróbicas.

[0019] Em algumas modalidades dos métodos, o mesmo ainda compreende recuperar o produto de fermentação da fermentação.

[0020] Em algumas modalidades dos métodos, sacarificação ocorre em um material celulósico, e o material celulósico é pré-tratado. Em algumas modalidades, o pré-tratamento é um pré-tratamento de ácido diluído.

[0021] Em algumas modalidades dos métodos, sacarificação ocorre em um material celulósico, e a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas a partir de um celulase, um polipeptídeo AAS9, uma hemicelulase, um CIP, uma esterase, uma expansina, uma enzima ligninolítica, uma oxirredutase, uma pectinase, uma protease, e uma swollenina. Em algumas modalidades, a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas a partir de uma endoglucanase, uma celobio-hidrolase, e uma beta-glucosidase. Em algumas modalidades, a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas a partir de uma xilanase, uma acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase, e uma glucuronidase.

[0022] Em algumas modalidades dos métodos, sacarificação e fermentação são realizados simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Em algumas modalidades, sacarificação e fermentação são realizadas sequencialmente (SHF).

Breve Descrição das Figuras

[0023] A Figura 1 mostra um mapa de plasmídeo para pFYD1090.

[0024] A Figura 2 mostra um mapa de plasmídeo para pFYD1092.

[0025] A Figura 3 mostra um mapa de plasmídeo para pFYD1497.

[0026] A Figura 4 mostra resultados de testes de local anaeróbico em placas de ágar de SD2 (glicose) e SX2 (xilose) com incubação a 30 ºC. Uma série de diluições de cada cepa foram preparadas a fim de identificar aproximadamente 2.000, 200, 20 e 2 de unidades de formação de colônia (CFU) nas placas que começam com 2.000 CFU no lado direito das placas.

[0027] A Figura 5 mostra resultados das fermentações de seringa anaeróbica em meio SX2.5. + e Tr: xilose e concentração de EtoH (9/1) para as fermentações de FYD853, respectivamente. O e p: xilose e concentração de EtoH (g/l) para as fermentações de FYD1547, respectivamente. As linhas contínuas indicam os valores médios para as fermentações de FYD853 e as linhas pontilhadas indicam os valores médios para as fermentações de FYD1547.

[0028] A Figura6 mostra resultados das fermentações de seringa anaeróbica em meio SD5X2.5. E, + e Tr: glicose, xilose e concentração de EtoH (g/l) para as fermentações de FYDB853, respectivamente. O, O e p: glicose, xilose e concentração de EtOH (g/l) para as fermentações de FYD1547, respectivamente. As linhas contínuas indicam os valores médios para as fermentações de FYD853 e as linhas pontilhadas indicam os valores médios para as fermentações de FYD1547.

[0029] A Figura7 mostra crescimento anaeróbico para cepas de levedura FYD853 e FYD1547 em meio SD?2 (glicose).

[0030] A Figura8 mostra crescimento anaeróbico para cepas de levedura FYD853 e FYD1547 em meio SX1/SD1 (xilose + glicose).

[0031] A Figura 9 mostra crescimento anaeróbico para cepas de levedura FYD853 e FYD1547 em meio SX2 (xilose).

[0032] A Figura 10 mostra crescimento anaeróbico para cepas de levedura MBG4982 e McTs1084-1087 em meio SD2 (glicose).

[0033] A Figura 11 mostra crescimento anaeróbico para cepas de levedura MBG4982 e McTs1084-1087 em meio SX1/SD1 (xilose + glicose).

[0034] A Figura 12 mostra crescimento anaeróbico para cepas de levedura MBG4982 e McTs1084-1087 em meio SX2 (xilose).

[0035] A Figura 13 mostra concentrações de etanol de amostras de fermentação de cepas de levedura FYD853 e FYD1547 em meio SX6, SD6, ou SX3/SD3.

[0036] A Figura 14 mostra concentrações de etanol de amostras de fermentação de cepas de levedura MBG4982 e McTs1084-1087 em meio SX6, SD6, ou SX3/SD3.

[0037] A Figura 15 mostra crescimento em meio SD2 para cepas que têm a trajetória de utilização de xilose XR/XDH do fundo de P51- F11.

[0038] A Figura 16 mostra crescimento em meio SX1/SD1 para cepas que têm a trajetória de utilização de xilose XR/XDH do fundo de P51-F11.

[0039] A Figura 17 mostra crescimento em meio SX2 para cepas que têm a trajetória de utilização de xilose XR/XDH do fundo de P51- F11.

[0040] A Figura 18 mostra crescimento em meio SD2 para cepas que têm a trajetória de utilização de xilose XR/XDH do fundo de P52- B02.

[0041] A Figura 19 mostra crescimento em meio SX1/SD1 para cepas que têm a trajetória de utilização de xilose XR/XDH do fundo de P52-B02.

[0042] A Figura 20 mostra crescimento em meio SX2 para cepas que têm a trajetória de utilização de xilose XR/XDH do fundo de P52- B0?2.

[0043] A Figura 21 mostra crescimento em meio SD2 para cepas que têm a trajetória de utilização de xilose XR/XDH do fundo de P55- HO1.

[0044] A Figura 22 mostra crescimento em meio SX1/SD1 para cepas que têm a trajetória de utilização de xilose XR/XDH do fundo de P55-H01.

[0045] A Figura 23 mostra crescimento em meio SX2 para cepas que têm a trajetória de utilização de xilose XR/XDH do fundo de P55- HO1.

Definições

[0046] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de gene podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou pode codificar os polipeptídeos que têm sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0047] Atividade Auxiliar 9: O termo "Atividade Auxiliar 9" ou "AAS9" significa um polipeptídeo classificado como uma monooxigenase lítica de polissacarídeo (Quinlan et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 208:

15079-15084; Phillips et a/., 2011, ACS Chem. Biol. 6: 1399-1406; Lin et al., 2012, Structure 20: 1051-1061). Os polipeptídeos AA9 eram previamente classificados na Família 61 de glicosídeo hidrolases (GH61) de acordo com Henrissat, 1991, Biochem. J. 280: 309 a 316, e Henrissat e Bairoch, 1996, Biochem. J. 316: 695-696.

[0048] Os polipeptídeos AAS9 intensificam a hidrólise de um material celulósico por uma enzima tendo atividade celulolítica. Atividade de melhoramento celulolítico podem ser determinadas medindo-se o aumento em açúcares de redução ou o aumento do total de celobiose e glicose da hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica mediante as seguintes condições: 1 a 50 mg de proteína/g total de celulose em palha de milho pré-tratada (PCS), em que proteína total é composta por 50 a 99,5% p/p de proteína de enzima celulolítica e 0,5 a 50% p/p de proteína de um polipeptídeo AA9 para 1 a 7 dias em uma temperatura adequada, como 40 ºC a 80 ºC, por exemplo, 50ºC, 55ºC, 60ºC, 65ºC, ou 70ºC, e um pH adequado, como 4 a 9, por exemplo, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, ou 8,5, em comparação com uma hidrólise de controle com carregamento total de proteína igual sem atividade de melhoramento celulolítico (1 a 50 mg de proteína/g celulolítica de celulose em PCS).

[0049] A atividade intensificadora do polipeptídeo AA9 pode ser determinada usando uma mistura de CELLUCLASTTY 1.5L (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) e beta-glucosidase como a fonte da atividade celulolítica, em que a beta-glucosidase está presente a um peso de pelo menos 2 a 5% de proteína da carga de proteína de celulase. Em uma modalidade, a beta-glucosidase é uma beta-glucosidase Aspergillus oryzae (por exemplo, produzida de modo recombinante em Aspergillus oryzae de acordo com o documento WO 02/095014). Em outra modalidade, a beta- glucosidase é uma beta-glucosidase Aspergillus fumigatus (por exemplo,

produzida de modo recombinante em Aspergillus oryzae como descrito no documento WO 02/095014).

[0050] A atividade intensificadora do polipeptídeo AA9 pode ser também determinada por incubação de um polipeptídeo AA9 com celulose expandida com ácido fosfórico (PASC) a 0,5%, acetato de sódio a 100 MM pH 5, MNSO. à 1 MM, ácido gálico a 0,1%, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus a 0,025 mgml, e TRITONº X-100 (4-(1,1,3,3- tetrametilbutil)fenil-polietileno glicol) a 0,01% durante 24 a 96 horas a 40 ºC, seguida por determinação da glicose liberada a partir da PASC.

[0051] A atividade intensificadora do polipeptídeo AA9 pode ser também determinada de acordo com WO 2013/028928 para composições a temperatura elevada.

[0052] Os polipeptídeos AAS9 intensificam a hidrólise de um material celulósico catalisada por enzimas tendo atividade celulolítica por redução da quantidade de enzima celulolítica requerida para se alcançar o mesmo grau de hidrólise, preferencialmente pelo menos 1,01 vezes, p.ex., pelo menos 1,05 vezes, pelo menos 1,10 vezes, pelo menos 1,25 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou pelo menos 20 vezes.

[0053] Beta-glucosidase: O termo "beta-glucosidase" designa uma beta-D-glucosídeo glucoidrolase (E.C. 3.2.1.21) que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glicose não redutores terminais com a liberação de beta-D-glicose. A atividade de beta-glucosidase pode ser determinada usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo como substrato de acordo com o procedimento de Venturi et a/., 2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glucosidase é definida como 1,0 umol de ânion b-nitrofenolato produzido por minuto a 25 ºC, pH 4,8 a partir de p-nitrofenil-

beta-D-glucopiranosídeo a 1 mM como substrato em citrato de sódio a 50 mM contendo TWEENº 20 a 0,01%.

[0054] Beta-xilosidase: O termo "beta-xilosidase" designa uma beta-D-xilosídeo xiloidrolase (E.C. 3.2.1.37) que catalisa a exo-hidrólise de beta (1—4)-xilo-oligossacarídeos curtos para remover resíduos de D- xilose sucessivos de terminais não redutores. A atividade de beta-xilosidase pode ser determinada usando p-nitrofenil-beta-D-xilosídeo a 1 mM como substrato em citrato de sódio a 100 mM contendo TWEENGQ 20 a 0,01% a pH 5, 40 ºC. Uma unidade de beta-xilosidase é definida como 1,0 umo! de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 40 ºC, pH 5 a partir de p-nitrofenil- beta-D-xilosídeo a 1 mM em citrato de sódio a 100 mM contendo TWEENQO a 0,01%.

[0055] Catalase: O termo "catalase" significa uma peróxido de hidrogênio:peróxido de hidrogênio oxidorreductase (EC 1.11.1.6) que catalisa a conversão de 2 H2O> para O> + 2 H2O. Para propósitos da presente invenção, a atividade de catalase é determinada de acordo com a Patente dos EUA No. 5,646,025. Uma unidade de atividade de catalase iguala a quantidade de enzima que catalisa a oxidação de 1 umole de peróxido de hidrogênio sob as condições de ensaio.

[0056] Celobio-hidrolase: O termo "celobio-hidrolase" designa uma 1,4-beta-D-glucana celobio-hidrolase (E.C. 3.2.1.91 e E.C.

3.2.1.176) que catalisa a hidrólise de ligações de 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celooligossacarídeos, ou qualquer polímero que contém beta-1,4- glicose ligada, liberando celobiose da extremidade de redução (celobio- hidrolase |) ou extremidade de não redução (celobio-hidrolase Il) da cadeia (Teeri, 1997, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Biochem. Soc. Trans. 26: 173 a 178). A atividade de celobio-hidrolase pode ser determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al.,

1972, Anal. Biochem. 47: 273 a 279; van Tilbeurgh et a/., 1982, FEBS Letters 149: 152 a 156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283- 288; e Tomme et a/., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575 a 581.

[0057] “Composição celulolítica de enzima ou celulase: O termo "composição de enzima celulolítica" ou "celulase" significa uma ou mais (p.ex., várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Tais enzimas incluem endoglucanase (ou endoglucanases), celobio-hidrolase (ou celobio-hidrolases), beta-glucosidase (ou beta-glucosidases), ou suas combinações. As duas abordagens básicas para medição da atividade de enzima celulolítica incluem: (1) medir a atividade de enzima celulolítica total e (2) medir as atividades de enzimas celulolíicas individuais (endoglucanases, celobio-hidrolases e beta-glucosidases) como revisto em Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452 a 481. A atividade de enzima celulolítica total pode ser medida usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman Nºo1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de algas, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio mais comum da atividade celulolítica total é o ensaio de papel de filtro usando papel de filtto Whatman Nº1 como o substrato. O ensaio foi estabelecido pela International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Pure Appl. Chem. 59: 257 a 268).

[0058] A atividade de enzima celulolítica pode ser determinada por medição do aumento na produção/liberação de açúcares durante a hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica (ou enzimas) sob as seguintes condições: 1-50 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulose em palha de milho pré-tratada (PCS) (ou outro material celulósico pré-tratado) durante 3-7 dias a uma temperatura adequada tal como 40 ºC-80 ºC, p.ex., 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC, 65 ºC, ou 70 ºC, e a um pH adequado tal como 4-9, p.ex., 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, ou 7,0, em comparação com uma hidrólise de controle sem adição de proteína enzimática celulolítica. Condições típicas são reações de 1 ml, PCS lavada ou não lavada, sólidos insolúveis a 5% (peso seco), acetato de sódio a 50 MM pH 5, MNSO.s à 1 MM, 50 ºC, 55 ºC, ou 60 ºC, 72 horas, análise de açúcares por cromatografia em coluna AMINEXº HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA).

[0059] Material celulósico: O termo "material celulósico”" designa qualquer material que contém celulose. O polissacarídeo predominante na parede celular primária da biomassa é celulose, o segundo mais abundante é hemicelulose e o terceiro é pectina. A parede celular secundária, produzida após a célula ter parado de crescer, contém também polissacarídeos e é fortalecida por lignina polimérica covalentemente reticulada à hemicelulose. A celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e assim uma beta-(1-4)-D-glucana linear, enquanto que as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, tais como xilanas, xiloglucanas, arabinoxilanas, e mananas em complexas estruturas ramificadas com um espectro de substituintes. Embora geralmente polimorfa, a celulose é encontrada em tecido vegetal principalmente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias de glucana paralelas. As hemiceluloses estão usualmente ligadas por ligações de hidrogênio à celulose, bem como a outras hemiceluloses, que ajudam a estabilizar a matriz da parede celular.

[0060] A celulose é geralmente encontrada, por exemplo, nos caules, folhas, peles, cascas e sabugos de plantas ou folhas, ramos e madeira de árvores. O material celulósico pode ser, porém, sem limitação, resíduo agrícola, material herbáceo (incluindo cultivos para produção de energia), resíduo sólido municipal, polpa e resíduo de fábrica de papel, papel residual, e madeira (incluindo resíduo florestal) (consulte, por exemplo, Wiselogel et a/., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman,

editor), pp. 105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et a/., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, editor executivo, Volume 65, pp. 23- 40, Springer-Verlag, Nova lorque). É entendido aqui que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material das paredes celulares vegetais contendo lignina, celulose, e hemicelulose em uma matriz mista. Em uma modalidade, o material celulósico é qualquer material de biomassa. Em outra modalidade, o material celulósico é lignocelulose, que compreende celulose, hemicelulose, e lignina.

[0061] Em uma modalidade, o material celulósico é resíduo agrícola, material herbáceo (incluindo culturas energéticas), resíduos sólidos urbanos, resíduos de fábricas de pasta celulósica e papel, resíduos de papel ou madeira (incluindo resíduos de silvicultura).

[0062] Em outra modalidade, o material celulósico é cana-do- reino, bagaço, bambu, sabugo de milho, fibra de milho, palha de milho, miscanto, palha de arroz, grama, ou palha de trigo.

[0063] Em outramodalidade, o material celulósico é choupo, eucalipto, abeto, pinheiro, álamo, espruce ou salgueiro.

[0064] Em outra modalidade, o material celulósico é celulose de algas, celulose bacteriana, fibra de algodão, papel de filtro, celulose microcristalina (por exemplo, AVICELO), ou celulose tratada com ácido fosfórico.

[0065] Em outra modalidade, o material celulósico é uma biomassa aquática. Como usado no presente documento, o termo “biomassa aquática" significa biomassa produzida em um ambiente aquático por um processo de fotossíntese. A biomassa aquática pode ser algas, plantas emergentes, plantas de folhas flutuantes ou plantas submersas.

[0066] O materialcelulósico pode ser usado como tal ou pode ser sujeito a pré-tratamento, usando métodos convencionais conhecidos na técnica, como descrito aqui. Em uma modalidade preferida, o material celulósico é pré-tratado.

[0067] Sequência de codificação: O termo “sequência de codificação" ou "região de codificação" significa uma sequência de polinucleotídeos que especifica a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As fronteiras da sequência de codificação são geralmente determinadas por um quadro de leitura aberto, que começa normalmente com o códon de início ATG ou códons de início alternativos como GTG e TTG e termina com um códon de terminação como TAA, TAG e TGA. À sequência de codificação pode ser uma sequência de DNA genômico, cDNA, um polinucleotídeo sintético e/ou um polinucleotídeo recombinante.

[0068] Sequência de controle: O termo “sequência de controle” significa uma sequência de ácidos nucleicos necessária para expressão do polipeptídeo. As sequências de controle podem ser nativas ou estranhas ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, e nativas ou estranhas entre si. Tais sequências de controle incluem, mas sem limitações, uma sequência líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró- peptídeos, sequência promotora, sequência de peptídeos de sinal, e sequência de terminadores da transcrição. As sequências de controle podem ser dotadas de ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos, facilitando a ligação das sequências de controle com a região codificante do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

[0069] Ruptura: O termo “ruptura” significa que uma região de codificação e/ou sequência de controle de um gene referenciado é parcial ou completamente modificada (como por deleção, inserção e/ou substituição de um ou mais nucleotídeos) resultando na ausência (inativação) ou diminuição da expressão e/ou na ausência ou diminuição da atividade enzimática do polipeptídeo codificado. Os efeitos da interrupção podem ser medidos usando técnicas conhecidas na técnica, como a detecção da ausência ou da diminuição da atividade enzimática a partir de medições de extratos isentos de células referenciadas nesse documento; ou pela ausência ou diminuição do MRNA correspondente (por exemplo, pelo menos 25% de diminuição, pelo menos 50% de diminuição, pelo menos 60% de diminuição, pelo menos 70% de diminuição, pelo menos 80% de diminuição, ou pelo menos 90% de diminuição); a ausência ou diminuição da quantidade do polipeptídeo correspondente com atividade enzimática (por exemplo, pelo menos 25% de diminuição, pelo menos 50% de diminuição, pelo menos 60% de diminuição, pelo menos 70% de diminuição, pelo menos 80% de diminuição, ou pelo menos 90% de diminuição); ou a ausência ou diminuição da atividade específica do polipeptídeo correspondente com atividade enzimática (por exemplo, pelo menos 25% de diminuição, pelo menos 50% de diminuição, pelo menos 60% de diminuição, pelo menos 70% de diminuição, pelo menos 80% de diminuição, ou pelo menos 90% de diminuição). As rupturas de um gene particular de interesse podem ser geradas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por recombinação homóloga direta (consulte Methods in Yeast Genetics (edição e 1997 ), Adams, Gottschling, Kaiser, e Stems, Cold Spring Harbor Press (1998)).

[0070] Gene endógeno: O termo “gene endógeno” significa um gene que é nativo da célula hospedeira referenciada. “Expressão de gene endógeno” significa expressão de um gene endógeno.

[0071] Endoglucanase: O termo "endoglucanase" designa uma 4-(1,3;1,4)-beta-D-glucana 4-glucanoidrolase (E.C. 3.2.1.4) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas na celulose, derivados da celulose (tais como carboximetilcelulose e hidroxietilcelulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3-1,4 glucanas mistas, tais como beta-D- glucanas ou xiloglucanas de cereais e outro material vegetal contendo componentes celulósicos. A atividade de endoglucanase pode ser determinada por medição da redução na viscosidade do substrato ou aumento nas extremidades redutoras determinado por um ensaio de açúcares redutores (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452- 481). A atividade de endoglucanase pode ser também determinada usando celulose de carboximetila (CMC) como substrato de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268, em pH 5, 40ºC.

[0072] Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, porém sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional e secreção. A expressão pode ser medida — por exemplo, para detectar expressão aumentada — por técnicas conhecidas na técnica, como a medição dos níveis de MRNA e/ou polipeptídeo traduzido.

[0073] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo e está operacionalmente ligada a sequências de controle, em que as sequências de controle proporcionam expressão do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. No mínimo, o vetor de expressão compreende uma sequência promotora, e sequências de sinais de terminação transcricional e translacional.

[0074] Meio fermentável: O termo "meio fermentável" ou "meio de fermentação” se refere a um meio que compreende um ou mais (por exemplo, dois, diversos) açúcares, como glicose, frutose, sacarose,

celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose, e/ou oligossacarídeos solúveis, em que o meio tem capacidade, em parte, de ser convertido (fermentado) por uma célula hospedeira em um produto desejado, como etanol. Em alguns casos, o meio de fermentação é derivado de uma fonte natural, como a cana de açúcar, amido ou celulose, e pode ser o resultado do pré-tratamento da fonte por hidrólise enzimática (sacarificação). O termo meio de fermentação é entendido no presente documento como se referindo a um meio antes do microrganismo (ou microrganismos) de fermentação ser(serem) adicionados, como, um meio que resulta de um processo de sacarificação, bem como um meio usado em um processo de sacarificação e fermentação simultâneos (SSF).

[0075] Enzima hemicelulolítica ou hemicelulase: O termo "enzima hemicelulolítica" ou "hemicelulase" significa uma ou mais (p.ex., várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Consulte, por exemplo, Shallom e Shoham, 2003, Current Opinion In Microbiology 6(3): 219 a 228). As hemicelulases são componentes-chave na degradação de biomassa vegetal. Exemplos de hemicelulases incluem, porém, sem limitação, uma acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma esterase de ácido coumárico, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glicuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase, e uma xilosidase. Os substratos para estas enzimas, hemiceluloses, são um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados e lineares que estão ligados através de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular vegetal, reticulando as mesmas em uma rede robusta. As hemiceluloses estão também covalentemente ligadas à lignina, formando em conjunto com a celulose uma estrutura altamente complexa. A estrutura variável e a organização de hemiceluloses exigem a ação concertada de muitas enzimas para a sua degradação completa. Os módulos catalíticos de hemicelulases são glicosídeo hidrolases (GHs) que hidrolisam ligações glicosídicas, ou carboidrato esterases (CEs), que hidrolisam ligações de éster de grupos laterais de acetato ou ácido ferúlico. Estes módulos catalíticos, com base na homologia da sua sequência primária, podem ser atribuídos às famílias GH e CE. Algumas famílias, com um dobra similar geral, podem ser ainda agrupadas em clãs, alfabeticamente marcados (por exemplo, GH-A). Uma classificação mais informativa e atualizada destas e outras enzimas ativas em carboidratos está disponível na base de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy). As atividades de enzimas hemicelulolíticas podem ser medidas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & Appl. Chem. 59: 1739-1752, em uma temperatura adequada como 40 “C a 80 ºC, por exemplo, 50ºC, 55ºC, 60ºC, 65ºC, ou 70ºC, e um pH adequado como 4 a 9, por exemplo, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, ou 7,0.

[0076] Polinucleotídeo heterólogo: Oo termo “polinucleotídeo heterólogo” é definido aqui como um polinucleotídeo que não é nativo da célula hospedeira; um polinucleotídeo nativo no qual modificações estruturais foram feitas na região de codificação; um polinucleotídeo nativo cuja expressão está quantitativamente alterada como resultado de uma manipulação do DNA por técnicas de DNA recombinantes, por exemplo, um promotor diferente (estranho); ou um polinucleotídeo nativo em uma célula hospedeira que tem uma ou mais cópias extras do polinucleotídeo para alterar quantitativamente a expressão. Um “gene heterólogo” é um gene que compreende um polinucleotídeo heterólogo.

[0077] Condições de estringência alta: O termo “condições de estringência elevada” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 ºC em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 50%, que seguem os procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes durante 15 minutos cada com o uso de 0.2X SSC, SDS a 0,2% a 65 ºC.

[0078] Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que seja suscetível à transformação, transfecção, transdução e similares com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. O termo “célula recombinante” é definido no presente documento como uma célula hospedeira de ocorrência não natural que compreende um ou mais (por exemplo, dois, vários) polinucleotídeos heterólogos.

[0079] Condições de estringência baixa: O termo "condições de estringência baixa" significa para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 ºC em 5X SSPE, 0,3% de SDS, 200 microgramas/ml raspados e DNA de esperma de salmão desnaturado, e 25% formamida, após procedimentos de Southern blotting padrão por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes, cada um, por 15 minutos com o uso de 0.2X SSC, 0,2% de SDS a 50ºC.

[0080] CONDIÇÕES DE ESTRINGÊNCIA MÉDIA: O termo "condições de alta estringência de meio" significa para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos in comprimento, pré-hibridização e hibridização em 42 ºC em 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 microgramas/ml raspados e DNA de esperma de salmão desnaturado, e 35% de formamida, após procedimentos de Southern blotting padrão para 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes, cada um, por 15 minutos com o uso de 0.2X SSC, 0,2% de SDS a 55"C.

[0081] “CONDIÇÕES DE ESTRINGÊNCIA MÉDIA ALTA: O termo "condições de alta estringência de meio" significa para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos in comprimento, pré-hibridização e hibridização em 42ºC em 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 microgramas/ml raspados e DNA de esperma de salmão desnaturado, e 35% de formamida, após procedimentos de Southern blotting padrão para 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes, cada um, por 15 minutos com o uso de 0.2X SSC, 0,2% de SDS a 60ºC.

[0082] “Construto de ácido nucleico: O termo "construto de ácido nucleico" significa um polinucleotídeo que compreende uma ou mais (por exemplo, duas, várias) sequências de controle. O polinucleotídeo pode ser de filamento simples ou filamento duplo e pode ser isolado de um gene de ocorrência natural, modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que não existiria de outro modo na natureza, ou sintético.

[0083] Operacionalmente ligado: Oo termo “operacionalmente ligada” designa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificadora de um polinucleotídeo, de tal forma que a sequência de controle direciona a expressão da sequência codificadora.

[0084] Pentose: O termo "pentose" significa um monossacarídeo de cinco carbonos (por exemplo, xilose, arabinose, ribose, lixose, ribulose, e xilulose). Pentoses, como D-xilose e L-arabinose, podem ser derivadas, por exemplo, através de sacarificação de um polissacarídeo de parede celular de planta.

[0085] Palha de milho pré-tratada: O termo "Palha de Milho Pré-tratada" ou "PCS" designa um material celulósico derivado de palha de milho por tratamento com calor e ácido sulfúrico diluído, pré-tratamento alcalino, pré-tratamento neutro, ou qualquer pré-tratamento conhecido na técnica.

[0086] Identidade de Sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro "identidade de sequência".

[0087] Para propósitos descritos no presente documento, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinado com o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48, 443-453) como implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: O Conjunto de Software Europeu Aberto de Biologia Molecular Software, Rice et al., Trends Genet 2000, 16, 276-277), preferencialmente versão 3.0.0 ou superior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUMG6?2 (versão EMBOSS de BLOSUM62). A emissão de "identidade mais longa" rotulada de Needle (obtida com o uso da —opção de não sumário) é usada como a identidade de percentual e é calculada como a seguir: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento da Sequência Referenciada — Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[0088] Paraos propósitos descritos aqui, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: O Conjunto de Software Europeu Aberto de Biologia Molecular, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 3.0.0 ou superior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição

EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUCA4.4). A emissão de "identidade mais longa" rotulada de Needle (obtida com o uso da -opção de não sumário) é usada como a identidade de percentual e é calculada como a seguir: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento da Sequência Referenciada — Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[0089] “Condições de estringência muito alta: O termo "condições de estringência muito alta" significa para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos in comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42ºC em 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 microgramas/ml raspados e DNA de esperma de salmão desnaturado, e 50% de formamida, após procedimentos de Southern blotting padrão para 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes, cada um, por 15 minutos com o uso de 0.2X SSC, 0,2% de SDS a 70ºC.

[0090] Condições de estringência muito baixa: O termo “condições de estringência muito baixa” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 ºC em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 25%, que seguem os procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes, cada um, por 15 minutos com o uso de 0.2X SSC, 0,2% de SDS a 45ºC.

[0091] Xilanase: O termo "xilanase" designa uma 1,4-beta-D- xilano-xiloidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanas. A atividade de xilanase pode ser determinada com AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em TRITONº X-100 a 0,01% e fosfato de sódio a 200 mM pH 6 a 37 ºC. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 umol de azurina produzida por minuto a 37 ºC, pH 6 a partir de AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em fosfato de sódio a 200 mM e pH 6.

[0092] Isomerase de Xilose: O termo "Xilose Isomerase" ou "XI" significa uma enzima que pode catalisar D-xilose em D-xilulose in vivo, e converter D-glicose em D-frutose in vitro. Xilose isomerase é também conhecida como "glicose isomerase" e é classificada como E.C. 5.3.1.5. Como a estrutura da enzima é muito estável, a sequência de codificação de xilose isomerase é um dos bons modelos para estudar as relações entre a estrutura e as funções das proteínas (Karimaki et al., Protein Eng Des Sel, 12004, 17 (12):861-869). Além disso, o valor de aplicação industrial extremamente importante faz com que a sequência de codificação de xilose isomerase seja vista como enzima industrialmente importante como protease e amilase (Tian Shen et al., Microbiology Bulletin, 2007, 34 (2): 355-358; Bhosale et al., Microbiol Rev, 1996, 60 (2): 280-300). Os cientistas mantêm grande preocupação e realizaram uma extensa pesquisa sobre a sequência de codificação de xilose isomerase. Desde 1970, as aplicações da sequência de codificação de xilose isomerase têm focado na produção de xarope rico em frutose e etanol para combustível. Nos últimos anos, os cientistas descobriram que sob certas condições, a sequência de codificação de xilose isomerase pode ser utilizada para produzir muitos açúcares raros importantes, que são os materiais de produção na indústria farmacêutica, tais como ribose, manose, arabinose e lixose (Karlmaki et al., Protein Eng Des Se, 12004, 17 (12): 861-869). Estas constatações trazem nova vitalidade na pesquisa sobre a sequência de codificação de xilose isomerase.

[0093] Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro no presente documento inclui modalidades que são direcionadas a esse valor ou parâmetro por si só. Por exemplo, descrição que se refere a "cerca de X" inclui a modalidade "X". Quando usado em combinação com valores medidos, "cerca de" inclui uma faixa que engloba pelo menos a incerteza associada ao método de medição do valor particular, e pode incluir uma faixa de mais ou menos dois desvios padrão em torno do valor referido.

[0094] Tal como usado no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um(a)", "ou" e "o/a" incluem referentes plurais, salvo se o contexto ditar claramente o contrário. É entendido que as modalidades descritas no presente documento incluem "que consiste em" e/ou "que consiste essencialmente em" modalidades.

[0095] A menos que definidos de outro modo ou claramente indicado pelo contexto, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comummente entendido por um com perícia ordinária na técnica.

Descrição Detalhada

[0096] São descritas no presente documento, entre outros, células recombinantes, como levedura, tem capacidade de simultaneamente converter hexoses e pentoses em etanol, por exemplo, em processos como descrito abaixo. O Requerente constatou que expressão adequada do transportador de hexose HXT2 em uma célula, como levedura Saccharomyces cerevisiae, também expressa uma sequência de codificação de xilose isomerase mostra surpreendentemente alto crescimento em xilose, consumo de xilose aumentado na presença de glicose, consumo de glicose aumentado e produção melhorada de etanol mediante condições de crescimento anaeróbico.

[0097] Em um aspecto é uma célula recombinante (por exemplo, levedura) que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose, e em que a célula de levedura tem capacidade de fermentar xilose.

[0098] Em uma modalidade, o transportador de hexose compreende ou consiste na sequência de aminoácidos do transportador HXT2 de SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, o transportador de hexose é um fragmento do polipeptídeo de transportador de HXT2 de SEQ ID NO: 2 (por exemplo, em que o fragmento tem atividade de transportador de hexose). Em uma modalidade, o número de resíduos de aminoácido no fragmento é pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, ou 95% do número de resíduos de aminoácido na SEQ ID NO: 2.

[0099] O transportador de hexose pode ser uma variante do transportador HXT2 da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, o transportador de hexose tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para o transportador HXT2 da SEQ ID NO: 2.

[0100] Em uma modalidade, a sequência de transportador de hexose difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, por não mais de cinco aminoácidos, em não mais de quatro aminoácidos, em não mais de três aminoácidos, em não mais de dois aminoácidos, ou em um aminoácido da sequência de aminoácidos do transportador HXT2 da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, o transportador de hexose tem uma substituição, deleção e/ou inserção de aminoácido de um ou mais (por exemplo, dois, diversos) de sequência de aminoácidos do transportador HXT2 da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido não é mais de 10, por exemplo, não mais de 9, 8, 7,6,5,4,3,2,0u1

[0101] Asmudanças de aminoácidos são geralmente de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até cerca de 20 a 25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação mediante a mudança da carga líquida ou outra função, como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0102] Os exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que, em geral, não alteram atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, /n, The Proteins, Academic Press, Nova lorque. As trocas que ocorrem mais comumente são Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/íVal, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

[0103] De modo alternativo, as alterações de aminoácido são de tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, alterações de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do transportador de hexose, alterar a especificidade de substrato, alterar o pH ideal e similares.

[0104] Aminoácidos essenciais podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese dirigida a sítio ou mutagênese de varrimento da alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, mutações de alanina simples em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Consulte também, Hilton et a/., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo ou outra interação biológica também pode ser determinado por análise física de estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron, ou rotulação por fotoafinidade, em combinação com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Consulte, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306 a 312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et a/., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades de aminoácidos essenciais também podem ser inferidas a partir de análise de identidades com outros transportadores de hexose que estão relacionados ao transportador de hexose citado.

[0105] Orientação adicional na relação de atividade de estrutura dos transportadores de hexose no presente documento pode ser determinada com o uso de múltiplas técnicas de alinhamento de sequência (MSA) bem conhecidas na técnica. Com base nos ensinamentos no presente documento, o indivíduo versado na técnica poderia realizar alinhamentos similares com qualquer número de transportadores de hexose descritos no presente documento ou conhecidos na técnica. Tais alinhamentos auxiliam o indivíduo versado na técnica para determinar domínios potencialmente relevantes (por exemplo, domínios de ligação ou domínios catalíticos), bem como quais resíduos de aminoácido são conservados e não conservados dentre as diferentes sequências de transportador de hexose. É observado na técnica que alterar um aminoácido que é conservado em uma posição particular entre polipeptídeos revelados, provavelmente, resultará em uma alteração em atividade biológica (Bowie et a/., 1990, Science 247: 1306- 1310: “Resíduos que são diretamente envolvidos em funções de proteína como ligação ou catálise, certamente estarão dentre os mais conservados"). Em contrapartida, substituir um aminoácido que não é altamente conservado dentre os polipeptídeos provavelmente não irá alterar ou alterar significativamente a atividade biológica.

[0106] Substituições múltiplas ou únicas, deleções, e/ou inserções de aminoácido podem ser realizadas e testadas com o uso de métodos de mutagênese conhecidos, recombinação, e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de varredura relevante, como aquele revelado por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53 a 57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; documento WO 95/17413; ou documento WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propenso a erro, exibição de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10.832 a 10.837; patente nº U.S. 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese sítio-dirigida (Derbyshire et a/., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0107] Métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com alto volume de processamento, métodos de varredura automatizados para detectar atividade de polipeptídeos clonados, com mutagênese expressados por células hospedeiras (Ness et a/., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de DNA com mutagênese que codificam transportadores de hexose ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas com o uso de métodos padrão na técnica. Esses métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos individuais de aminoácido em um polipeptídeo.

[0108] Em outra modalidade, o polinucleotídeo heterólogo que codifica o transportador de hexose compreende uma sequência de codificação que têm pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.

[0109] Emuma modalidade, o polinucleotídeo heterólogo que codifica o transportador de hexose compreende ou na sequência de codificação de SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, o polinucleotídeo heterólogo que codifica o transportador de hexose compreende uma subsequência da sequência de codificação de SEQ ID NO: 1 (por exemplo, em que a subsequência codifica um polipeptídeo que têm atividade de transportador de hexose). Em uma outra modalidade, o número de resíduos de nucleotídeos na subsequência de codificação é pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% do número da sequência de codificação referenciada.

[0110] A sequência de codificação referenciada de qualquer aspecto ou modalidade relacionada descrita no presente documento pode ser a sequência de codificação nativa ou uma sequência degenerada, como uma sequência de codificação otimizada por códon projetada para uma célula hospedeira particular.

[0111] Asequência de codificação de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, ou uma sua subsequência, bem como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, ou um seu fragmento, pode ser usado para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA que codifica um genitor a partir de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos de transferência Southern padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente no mesmo. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35 ou pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. De preferência, a sonda de ácido nucleico é pelo menos de 100 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com ??P, 3H, *S, biotina ou avidina).

[0112] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA, preparada a partir de tais outras cepas, pode ser examinada quanto ao DNA que se hibridiza com as sondas descritas acima e codifica um genitor. O DNA genômico ou outro tipo de DNA de tais outras cepas podem ser separados por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que se hibridiza com SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência do mesmo, o material carreador é usado em um Southern blot.

[0113] Em uma modalidade, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que compreende SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência do mesmo. Em outra modalidade, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2; ou um fragmento do mesmo.

[0114] Com propósitos das sondas descritas acima, a hibridização indica que o polinucleotídeo se hibridiza com uma sonda de um ácido nucleico marcada, ou o filamento complementar de comprimento total do mesmo, ou uma subsequência das anteriores; sob condições de estringência muito baixa a muito alta. As moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico se hibridiza sob essas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X. As condições de estringência e lavagem são definidas conforme descrito supra.

[0115] Em uma modalidade, o transportador de hexose é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza mediante pelo menos condições de estringência baixa, por exemplo, condições de alta estringência de meio, condições de estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com o filamento complementar de comprimento total de SEQ ID NO: 1. (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edição, Cold Spring Harbor, New York).

[0116] Otransportador de hexose pode ser obtido a partir de microrganismos de qualquer gênero adequado, incluindo aqueles prontamente disponíveis dentro do banco de dados de UniProtKB (www.uniprot.org).

[0117] Otransportador de hexose pode ser um transportador de hexose bacteriano. Por exemplo, o transportador de hexose pode ser um polipeptídeo bacteriano Gram-positivo como um Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, ou transportador de hexose Streptomyces, ou um polipeptídeo bacteriano Gram-negativo como um transportador de hexose Campylobacter, E. coli Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, ou Ureaplasma.

[0118] Em uma modalidade, o transportador de hexose é um transportador de hexose Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis.

[0119] Em outra modalidade, o transportador de hexose é um transportador de hexose Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[0120] Em outra modalidade, o transportador de hexose é um transportador de hexosesStreptomyces achromogenes, Streptomyces avermiítilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans.

[0121] Otransportador de hexose pode ser um transportador de hexose fúngico. Por exemplo, o transportador de hexose pode ser um transportador de hexose de levedura como um transportador de hexose Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia ou Issatchenkia; ou um transportador de hexose fúngico de filamentos como um transportador de hexose Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xylaria.

[0122] Em outra modalidade, o transportador de hexose é um transportador de hexose Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, “Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces Kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis.

[0123] Em outramodalidade, o transportador de hexose é de Saccharomyces, como o transportador de hexose Saccharomyces cerevisiae de SEQ ID NO: 2.

[0124] Em outra modalidade, o transportador de hexose é um transportador de hexose Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus Jjaponicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, —Chrysosporium —merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, —Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, — Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[0125] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos,

independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Aqueles versados na técnica irão prontamente reconhecer a identidade de equivalentes apropriados.

[0126] As cepas dessas espécies são prontamente acessíveis para o público em diversas coletas de cultura, como American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0127] As estirpes destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em várias coleções de culturas, como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0128] Os transportadores de hexose também podem ser identificados e obtidos de outras fontes, incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, silagem, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, compostos, água, silagem, etc.) com o uso das sondas mencionadas acima. Técnicas para isolamento de micro-organismos e DNA diretamente de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. O polinucleotídeo que codifica um transportador de hexose pode, então, ser derivado por varrer de modo similar uma biblioteca de cDNA ou genômica de outro microrganismo ou amostra de DNA misturada.

[0129] Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um transportador de hexose é detectado com uma sonda adequada como descrito no presente documento, a sequência pode ser isolada ou clonada utilizando-se técnicas que são conhecidas como aquelas de habilidade comum na técnica (consulte, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). As técnicas usadas para isolar ou clonar polinucleotídeos que codificam transportadores de hexose incluem isolamento de DNA genômico, preparação de cDNA, ou uma combinação dos mesmos. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de tal DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo, com o uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) bem conhecida, ou examinação de anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com características estruturais compartilhadas. Ver, p.ex., Innis et a/., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova lorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação baseada em sequências de nucleotídeos (NASBA).

[0130] O transportador de hexose pode ser um polipeptídeo fundível ou polipeptídeo de fusão clivável no qual outro polipeptídeo é fundido no terminal N ou no terminal C do transportador de hexose. Um polipeptídeo fundível pode ser produzido por fusão de um polinucleotídeo que codifica outro polipeptídeo para um polinucleotídeo que codifica o transportador de hexose. São conhecidos na técnica procedimentos para a produção de polipeptídeos de fusão e que incluem a ligação das sequências de codificação que codificam os polipeptídeos de modo que fiquem em quadro e que a expressão do polipeptídeo fundido esteja sob controle do mesmo promotor (ou promotores) e terminador. As proteínas de fusão podem ser também construídas usando tecnologia de inteína na qual são criadas fusões pós-tradução (Cooper et a/., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776 a 779).

[0131] Em um aspecto, a célula recombinante (por exemplo,

célula de levedura) ainda compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma sequência de codificação de xilose isomerase (XI). A sequência de codificação de xilose isomerase pode ser qualquer sequência de codificação de xilose isomerase que é adequada para as células hospedeiras e os métodos descritos no presente documento, como uma sequência de codificação de xilose isomerase de ocorrência natural ou uma variante da mesma que retém atividade de sequência de codificação de xilose isomerase. Em uma modalidade, a sequência de codificação de xilose isomerase está presente no citosol das células hospedeiras.

[0132] Em algumas modalidades, as células recombinantes que compreendem um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma sequência de codificação de xilose isomerase têm um nível aumentado de atividade de sequência de codificação de xilose isomerase em comparação com as células hospedeiras sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica a sequência de codificação de xilose isomerase, quando cultivado mediante as mesmas condições. Em algumas modalidades, as células hospedeiras têm um nível aumentado de atividade de sequência de codificação de xilose isomerase de pelo menos 5%, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, ou em 500% em comparação com as células hospedeiras sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica a sequência de codificação de xilose isomerase, quando cultivado mediante as mesmas condições.

[0133] As xilose isomerases adequadas exemplificativas que podem ser usadas com as células hospedeiras recombinantes e métodos de uso descrito no presente documento incluem, porém, sem limitação, Xls do fungo Piromyces sp. (WO2003/062430) ou outras fontes (Madhavan et al., 2009, Appl Microbiol Biotechnol. 82(6), 1067-1078) foram expressadas em células hospedeiras de S. cerevisiae. Ainda outras Xls adequadas para expressão em levedura foram descritas no documento U.S. 2012/0184020 (uma XI de Ruminococcus flavefaciens), documento WO2011/078262 (diversas Xls de Reticulitermes speratus e Mastotermes darwiniensis) e documento WO2012/009272 (células fúngicas e construtos que contêm uma XI de Abiotrophia defectiva). O documento U.S. 8.586.336 descreve uma célula hospedeira S. cerevisiae que expressa uma XI obtida por fluido de rúmen bovino (mostrado no presente documento como SEQ ID NO: 18).

[0134] Os polinucleotídeos adicionais que codificam xilose isomerases adequadas podem ser obtidos de microrganismos de qualquer gênero, incluindo aqueles prontamente disponíveis dentro do banco de dados de UniProtKB (www.uniprot.org). Em uma modalidade, as xilose isomerases adequadas é uma bacteriana, uma levedura, ou uma sequência de codificação de xilose isomerase fúngica filamentosa, por exemplo, obtidas de qualquer um dos microrganismos descritos no presente documento, como descrito supra mediante as seções relacionadas com transportadores de hexose.

[0135] As sequências de codificação de sequência de codificação de xilose isomerase também podem ser usadas para projetar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA que codifica xilose isomerases adequadas de cepas de gênero ou espécies diferentes, como descrito supra.

[0136] Os polinucleotídeos que codificam xilose isomerases adequadas também podem ser identificados e obtidos de outras fontes incluindo microrganismos isolados de natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, compostos, água, etc,) como descrito supra.

[0137] As técnicas usadas para isolar ou clonar polinucleotídeos que codificam xilose isomerases adequadas são descritas supra.

[0138] Em uma modalidade, a sequência de codificação de xilose isomerase tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% identidade de sequência para qualquer sequência de codificação de xilose isomerase descrita no presente documento (por exemplo, a sequência de codificação de xilose isomerase de SEQ ID NO: 18). Em um aspecto, a sequência de codificação de xilose isomerase sequência difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, por não mais de cinco aminoácidos, por não mais de quatro aminoácidos, por não mais de três aminoácidos, por não mais de dois aminoácidos, ou por um aminoácido de qualquer sequência de codificação de xilose isomerase descrita no presente documento (por exemplo, a sequência de codificação de xilose isomerase de SEQ ID NO: 18). Em uma modalidade, a sequência de codificação de xilose isomerase compreende ou na sequência de aminoácidos de qualquer sequência de codificação de xilose isomerase descrita no presente documento (por exemplo, a sequência de codificação de xilose isomerase de SEQ ID NO: 18), variante alélica, ou um fragmento da mesma que têm atividade de sequência de codificação de xilose isomerase. Em uma modalidade, a sequência de codificação de xilose isomerase tem um substituição, deleção, e/ou inserção de aminoácido de um ou mais (por exemplo, dois, diversos) aminoácidos. Em algumas modalidades, o número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido não é mais de 10, por exemplo, não mais de 9, 8, 7, 6, 5,4,3,2, ou 1.

[0139] Em algumas modalidades, a sequência de codificação de xilose isomerase tem pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% da atividade de sequência de codificação de xilose isomerase de qualquer sequência de codificação de xilose isomerase descrita no presente documento (por exemplo, a sequência de codificação de xilose isomerase de SEQ ID NO: 18) mediante as mesmas condições.

[0140] Em uma modalidade, a sequência de codificação de xilose isomerase sequência de codificação hibridiza mediante pelo menos condições de estringência baixa, por exemplo, condições de alta estringência de meio, condições de estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com o filamento complementar de comprimento total da sequência de codificação de qualquer sequência de codificação de xilose isomerase descrita no presente documento (por exemplo, a sequência de codificação de xilose isomerase de SEQ ID NO: 18). Em uma modalidade, a sequência de codificação de xilose isomerase sequência de codificação tem pelo menos 65%, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de codificação de qualquer sequência de codificação de xilose isomerase descrita no presente documento (por exemplo, a sequência de codificação de xilose isomerase de SEQ ID NO: 18).

[0141] Emuma modalidade, o polinucleotídeo heterólogo que codifica a sequência de codificação de xilose isomerase compreende a sequência de codificação de qualquer sequência de codificação de xilose isomerase descrita no presente documento (por exemplo, a sequência de codificação de xilose isomerase de SEQ ID NO: 18). Em uma modalidade, o polinucleotídeo heterólogo que codifica a sequência de codificação de xilose isomerase compreende uma subsequência da sequência de codificação de qualquer sequência de codificação de xilose isomerase descrita no presente documento, em que a subsequência codifica um polipeptídeo que têm atividade de sequência de codificação de xilose isomerase. Em uma modalidade, o número de nucleotídeos reside na subsequência é pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, ou 95% de o número da sequência de codificação citada.

[0142] As xilose isomerases adequadas também podem incluem polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão clivável, como descrito supra.

[0143] Em um aspecto, a célula recombinante (por exemplo, célula de levedura) ainda compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma xilulocinase (XK). Uma xilulocinase, como usado no presente documento, fornece atividade enzimática para converter D-xilulose em xilulose 5-fosfato. A xilulocinase pode ser qualquer xilulocinase que é adequada para as células hospedeiras e os métodos descritos no presente documento, como uma xilulocinase de ocorrência natural ou uma variante da mesma que retém atividade de xilulocinase. Em uma modalidade, a xilulocinase está presente no citosol das células hospedeiras.

[0144] Em algumas modalidades, as células recombinantes que compreendem um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma xilulocinase têm um nível aumentado de atividade de xilulocinase em comparação com as células hospedeiras sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica a xilulocinase, quando cultivado mediante as mesmas condições. Em algumas modalidades, as células hospedeiras têm um nível aumentado de atividade de sequência de codificação de xilose isomerase de pelo menos 5%, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, ou em 500% em comparação com as células hospedeiras sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica a xilulocinase, quando cultivado mediante as mesmas condições.

[0145] As xiluloquinases exemplificativas adequadas que podem ser usadas com as células hospedeiras recombinantes e métodos de uso descritos no presente documento incluem, porém, sem limitação, a xilulocinase Saccharomyces cerevisiaee de SEQ ID NO: 22. Os polinucleotídeos adicionais que codificam xiluloquinases exemplificativas adequadas podem ser obtidos a partir de microrganismos de qualquer gênero, incluindo aquele prontamente disponível dentro do banco de dados de UniProtKB (www.uniprot.org). Em uma modalidade, as xiluloquinases exemplificativas adequadas é uma xilulocinase bacteriana, uma levedura, ou fúngica de filamentos, por exemplo, obtidas de qualquer um dos microrganismos descritos no presente documento, como descrito supra mediante as seções relacionadas a transportadores de hexose.

[0146] As sequências de codificação de xilulocinase também podem ser usadas para projetar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA que codifica xiluloquinases exemplificativas adequadas de cepas de gênero ou espécies diferentes, como descrito supra.

[0147] Os polinucleotídeos que codificam xiluloquinases exemplificativas adequadas também podem ser identificados e obtidos de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, compostos, água, etc,) como descrito supra.

[0148] As técnicas usadas para isolar ou clonar polinucleotídeos que codificam xiluloquinases exemplificativas adequadas são descritas supra.

[0149] Em uma modalidade, a xilulocinase tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para qualquer xilulocinase descrita no presente documento (por exemplo, a xilulocinase Saccharomyces cerevisiae de SEQ ID NO: 22). Em uma modalidade, a sequência de xilulocinase difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em não mais de cinco aminoácidos, em não mais de quatro aminoácidos, em não mais de três aminoácidos, em não mais de dois aminoácidos, ou em um aminoácido de qualquer xilulocinase descrita no presente documento (por exemplo, a xilulocinase Saccharomyces cerevisiae de SEQ ID NO: 22). Em uma modalidade, a xilulocinase compreende ou na sequência de aminoácidos de qualquer xilulocinase descrita no presente documento (por exemplo, a xilulocinase Saccharomyces cerevisiaede SEQ ID NO: 22), variante alélica, ou um fragmento da mesma que têm atividade de xilulocinase. Em uma modalidade, a xilulocinase tem uma substituição, deleção, e/ou inserção de aminoácido de um ou mais (por exemplo, dois, diversos) aminoácidos. Em alguns aspectos, o número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos é não maior do que 10, por exemplo, não maior do que 9, 8, 7, 6,5,4,3,20u1.

[0150] Em algumas modalidades, a xilulocinase tem pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% da atividade de xilulocinase de qualquer xilulocinase descrita no presente documento (por exemplo, a xilulocinase Saccharomyces cerevisiae de SEQ ID NO: 22) mediante as mesmas condições.

[0151] Em uma modalidade, a sequência de xilulocinase de codificação hibridiza mediante pelo menos condições de estringência baixa, por exemplo, condições de alta estringência de meio, condições de estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com o filamento complementar de comprimento total da sequência de codificação de qualquer xilulocinase descrita no presente documento (por exemplo, a xilulocinase Saccharomyces cerevisiae de SEQ ID NO: 22). Em uma modalidade, a sequência de xilulocinase de codificação tem pelo menos 65%, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de codificação de qualquer xilulocinase descrita no presente documento (por exemplo, a xilulocinase Saccharomyces cerevisiae de SEQ ID NO: 22).

[0152] Em uma modalidade, o polinucleotídeo heterólogo que codifica a xilulocinase compreende a sequência de codificação de qualquer xilulocinase descrita no presente documento (por exemplo, a xilulocinase Saccharomyces cerevisiae de SEQ ID NO: 22). Em uma modalidade, o polinucleotídeo heterólogo que codifica a xilulocinase compreende uma subsequência da sequência de codificação de qualquer xilulocinase descrita no presente documento, em que a subsequência codifica um polipeptídeo que tem atividade de xilulocinase. Em uma modalidade, o número de resíduos de nucleotídeos na subsequência é pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, ou 95% do número da sequência de codificação citada.

[0153] —Asxiluloquinases exemplificativas adequadas também podem incluir polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão clivável, como descrito supra.

[0154] Em um aspecto, a célula recombinante (por exemplo, célula de levedura) ainda compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma ribulose 5 fosfato 3-epimerase (RPE1). Uma ribulose 5 fosfato 3-epimerase, como usado no presente documento, fornece atividade enzimática para converter L-ribulose 5-fosfato em L-xilulose 5-fosfato (EC

5.1.3.22). A RPE1 pode ser qualquer RPE1 que é adequada para as células hospedeiras e os métodos descritos no presente documento, como uma RPE1 de ocorrência natural ou uma variante da mesma que retém atividade de RPE1. Em uma modalidade, a RPE1 está presente no citosol das células hospedeiras.

[0155] Em uma modalidade, a célula recombinante compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma ribulose 5 fosfato 3-epimerase (RPE1), em que a RPE1 é RPE1 de Saccharomyces cerevisiae, ou uma RPE1 que têm pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para a RPE1 de Saccharomyces cerevisiae.

[0156] Em um aspecto, a célula recombinante (por exemplo, célula de levedura) ainda compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma ribulose 5 fosfato isomerase (RKI1). Uma ribulose 5 fosfato isomerase, como usado no presente documento, fornece atividade enzimática para converter ribose-5-fosfato em ribulose 5-fosfato. A RKI1 pode ser qualquer RKI1 que é adequada para as células hospedeiras e os métodos descritos no presente documento, como uma RKI1 de ocorrência natural ou uma variante da mesma que retém atividade de RKI1. Em uma modalidade, a RKI1 está presente no citosol das células hospedeiras.

[0157] Em uma modalidade, a célula recombinante compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma ribulose 5 fosfato isomerase (RKI1), em que a RKI1 é uma RKI1 de Saccharomyces cerevisiae, ou uma RKI1 que têm pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma RKI1 de Saccharomyces cerevisiae.

[0158] Em um aspecto, a célula recombinante (por exemplo, célula de levedura) ainda compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma transcetolase (TKL1). A TKL1 pode ser qualquer TKL1 que é adequada para as células hospedeiras e os métodos descritos no presente documento, como uma TKL1 de ocorrência natural ou uma variante da mesma que retém atividade de TKL1. Em uma modalidade, a TKL1 está presente no citosol| das células hospedeiras.

[0159] Em uma modalidade, a célula recombinante compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma transcetolase (TKL1), em que a TKL1 é uma TKL1 de Saccharomyces cerevisiae, ou uma TKL1 que têm pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma TKL1 de Saccharomyces cerevisiae.

[0160] Em um aspecto, a célula recombinante (por exemplo, célula de levedura) ainda compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma transaldolase (TAL1). A TAL1 pode ser qualquer TAL1 que é adequada para as células hospedeiras e os métodos descritos no presente documento, como uma TAL1 de ocorrência natural ou uma variante da mesma que retém atividade de TAL1. Em uma modalidade, a TAL1 está presente no citoso| das células hospedeiras.

[0161] Em uma modalidade, a célula recombinante compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma transcetolase (TAL1), em que a TAL1 é uma TAL1 de Saccharomyces cerevisiae, ou uma TAL1 que têm pelo menos 60%, por exemplo, em least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% identidade de sequência para uma TAL1 de Saccharomyces cerevisiae.

[0162] Emum aspecto, as células recombinantes descritas no presente documento (por exemplo, uma célula que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose descrito no presente documento e sequência de codificação de xilose isomerase) melhorou crescimento anaeróbico em uma pentose (por exemplo, xilose). Em uma modalidade, a célula recombinante tem capacidade de taxa maior de crescimento anaeróbico em uma pentose (por exemplo, xilose) em comparação com a mesma célula sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose em cerca de ou após 4 dias de incubação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 2).

[0163] Emum aspecto, as células recombinantes descritas no presente documento (por exemplo, uma célula que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose descrito no presente documento e sequência de codificação de xilose isomerase) têm maior consumo de pentose (por exemplo, xilose). Em uma modalidade, a célula recombinante tem capacidade de maior consumo de pentose (por exemplo, xilose) em comparação com a mesma célula sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose em cerca de ou após 40 horas fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 3). Em uma modalidade, a célula recombinante tem capacidade de consumir mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de pentose (por exemplo, xilose) no meio em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 4). Em uma modalidade, a célula recombinante tem capacidade de consumir mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de glicose no meio em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 4). Em uma modalidade, a célula recombinante tem capacidade de consumir mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de pentose (por exemplo, xilose) no meio, e tem capacidade de consumir mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de glicose no meio, em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 4).

[0164] Emum aspecto, as células recombinantes descritas no presente documento (por exemplo, uma célula que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose descrito no presente documento e sequência de codificação de xilose isomerase) têm maior produção de etanol. Em uma modalidade, a célula recombinante tem capacidade de maior produção de etanol em comparação com a mesma célula sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose em cerca de ou após 40 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 3).

Rupturas de Genes

[0165] As células recombinantes descritas no presente documento também podem compreender uma ou mais (por exemplo, duas, diversas) rupturas de gene, por exemplo, para redirecionar metabolismo de açúcar de produtos indesejados para etanol. Em alguns aspectos, as células hospedeiras recombinantes produzem uma quantidade maior de etanol em comparação com a célula sem a uma ou mais rupturas quando cultivadas mediante condições idênticas. Em alguns aspectos, um ou mais dos genes endógenos interrompidos são inativados.

[0166] Em determinadas modalidades, as células recombinantes fornecidas no presente documento compreendem uma ruptura de um ou mais genes endógenos que codificam enzimas envolvidas na produção de produtos fermentativos alternados como glicerol ou outros subprodutos como acetato ou dióis. Por exemplo, as células fornecidas no presente documento podem compreender uma ruptura de uma ou mais dentre glicerol 3-fosfato desidrogenase (GPD, catalisar reação de diidroxiacetona fosfato para glicerol 3-fosfato), glicerol 3-fosfatase (GPP, catalisa conversão de glicerol-3 fosfato para glicerol), glicerol quinase (catalisa conversão de glicerol 3-fosfato para glicerol), diidroxiacetona quinase (catalisa conversão de diidroxiacetona fosfato para diidroxiacetona), glicerol desidrogenase (catalisa conversão de diidroxiacetona para glicerol), e aldeído desidrogenase (ALD, por exemplo, converte acetaldeído em acetato).

[0167] A análisede modelagem pode ser usada para projetar rupturas de gene que otimizam adicionalmente utilização da trajetória. Um método computacional exemplificativo para identificar e projetar alterações metabólicas favorecendo biossíntese de um produto desejado é a estrutura computacional OptKnock, Burgard et a/l., 2003, Biotechnol. Bioeng. 84: 647-

657.

[0168] As células recombinantes que compreendem uma ruptura de gene podem ser construídas com o uso de métodos bem conhecidos na técnica, incluindo aqueles métodos descritos no presente documento. Uma porção do gene pode ser submetida a ruptura, tal como a região de codificação ou uma sequência de controle necessária para a expressão da região de codificação. Uma tal sequência de controle do gene pode ser uma sequência promotora ou uma sua parte funcional da mesma, isto é, uma parte que é suficiente para afetar a expressão do gene. Por exemplo, uma sequência promotora pode ser inativada, resultando em nenhuma expressão, ou um promotor mais fraco pode ser substituído pela sequência promotora nativa para reduzir a expressão da sequência de codificação. Outras sequências de controle para possível modificação incluem, mas sem limitação, um líder, sequência de pró-peptídeos, sequência sinal, terminador de transcrição e ativador de transcrição.

[0169] As células recombinantes que compreendem uma ruptura de gene podem ser construídas por técnicas de deleção de gene para eliminar ou reduzir expressão do gene. As técnicas de deleção de genes possibilitam a remoção parcial ou completa do gene, eliminando, assim, a sua expressão. Em tais métodos, a deleção do gene é alcançada por recombinação homóloga com o uso de um plasmídeo que foi construído para conter contiguamente as regiões 5' e 3' que flanqueiam o gene.

[0170] As células recombinantes que compreendem uma ruptura de gene também podem ser construídas introduzindo-se, substituindo-se e/ou removendo-se um ou mais (por exemplo, dois, diversos) nucleotídeos no gene ou uma sequência de controle do mesmo necessária para a transcrição ou tradução do mesmo. Por exemplo, os nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos para a introdução de um códon de terminação, a remoção do códon de início, ou uma alteração da fase de leitura aberta. Uma tal modificação pode ser realizada por mutagênese sítio- dirigida ou mutagênese gerada por PCR de acordo com métodos conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Botstein e Shortle, 1985, Science 229: 4719; Lo et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.-S.A. 81: 2285; Higuchi et al., 1988, Nucleic Acids Res 16: 7351; Shimada, 1996, Meth. Mol. Biol. 57: 157;

Ho et a/., 1989, Gene 77: 61; Horton et al., 1989, Gene 77: 61; e Sarkar e Sommer, 1990, Bio Techniques 8: 404.

[0171] As células recombinantes que compreendem uma ruptura de gene também podem ser construídas inserindo-se no gene um construto de ácido nucleico disruptivo que compreende um fragmento de ácido nucleico homólogo ao gene que irá criar uma duplicação da região de homologia e incorporar DNA de construto entre as regiões duplicadas. Uma tal ruptura de gene pode eliminar a expressão do gene se o construto inserido separar o promotor do gene da região de codificação ou interromper a sequência de codificação de modo que resulte em um produto de gene não funcional. Um construto de ruptura pode ser simplesmente um gene marcador selecionável acompanhado por regiões 5' e 3' homólogas ao gene. O marcador selecionável possibilita a identificação de transformantes que contêm o gene rompido.

[0172] As células recombinantes que compreendem uma ruptura de gene também podem ser construídas pelo processo de conversão de gene (consulte, por exemplo, Iglesias e Trautner, 1983, Molecular General Genetics 189: 73-76). Por exemplo, no método de conversão de gene, uma sequência de nucleotídeos que corresponde ao gene é mutagenizada in vitro para produzir uma sequência de nucleotídeos defeituosa que, então, é transformada na estirpe recombinante para produzir um gene defeituoso. Por recombinação homóloga, a sequência de nucleotídeos defeituosa substitui o gene endógeno. Pode ser desejável que a sequência de nucleotídeos defeituosa compreenda também um marcador para seleção de transformantes que contêm o gene defeituoso.

[0173] As células recombinantes que compreendem uma ruptura de gene podem ser ainda construídas por mutagênese aleatória ou específica com o uso de métodos bem conhecidos na técnica, incluindo,

porém, sem limitação, mutagênese química (consulte, por exemplo, Hopwood, The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology (J.R. Norris e D.W. Ribbons, eds.) pp. 363-433, Academic Press, Nova lorque, 1970). À modificação do gene pode ser realizada subpmetendo-se a estirpe genitora à mutagênese e examinando-se as estirpes mutantes nas quais a expressão do gene foi reduzida ou inativada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória, pode ser realizada, por exemplo, com o uso de um agente de mutagenização físico ou químico adequado, com o uso de um oligonucleotídio adequado ou submetendo-se a sequência de DNA à mutagênese gerada por PCR. Além disso, a mutagênese pode ser realizada com o uso de qualquer combinação desses métodos de mutagenização.

[0174] Exemplos de um agente de mutagênese físico ou químico adequado para o presente propósito incluem irradiação ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), N-metil-N'- nitrosogaunidina (NTG) O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, sulfanato de etil metano (EMS), bissulfato de sódio, ácido fórmico, e análogos de nucleotídeo. Quando tais agentes são usados, a mutagênese é tipicamente realizada incubando-se a estirpe genitora a ser mutagenizada na presença do agente de mutagenização de escolha sob condições adequadas, e selecionando-se os mutantes que exibem expressão reduzida ou nula do gene.

[0175] Pode ser usada uma sequência de nucleotídeos homóloga ou complementar a um gene descrito neste documento, de outras fontes microbianas para submeter a disrupção o correspondente gene em uma estirpe recombinante de eleição.

[0176] Em um aspecto, a modificação de um gene na célula recombinante é não marcada com um marcador selecionável. A remoção do gene marcador selecionável pode ser alcançada cultivando-se os mutantes em um meio de contrasseleção. Quando o gene marcador selecionável contiver repetições que flanqueiem as suas extremidades 5' e 3, as repetições faciltarão a saída do gene marcador selecionável por recombinação homóloga quando a estirpe mutante para submetida à contrasseleção. O gene marcador selecionável também pode ser removido por recombinação homóloga introduzindo-se na estirpe mutante um fragmento de ácido nucleico que compreende regiões 5' e 3º do gene defeituoso, mas que carece do gene marcador selecionável, seguido pela seleção no meio de contrasseleção. Por recombinação homóloga, o gene defeituoso que contém o gene marcador selecionável é substituído pelo fragmento do ácido nucleico que carece do gene marcador selecionável. Outros métodos conhecidos na técnica também podem ser usados. Células Hospedeiras e Métodos Recombinantes

[0177] As células recombinantes descritas no presente documento podem ser selecionadas a partir de qualquer célula hospedeira que tem capacidade de fermentação de etanol. Os indivíduos versados na técnica entenderão que as alterações genéticas, incluindo as modificações metabólicas exemplificadas no presente documento, podem ser descritas em referência a um organismo hospedeiro adequado e suas reações metabólicas correspondentes ou a um organismo de origem adequado para material genético desejado, tal como genes para uma via metabólica desejada. Entretanto, dado o sequenciamento de genoma completo de uma ampla variedade de organismos e o alto nível de habilidade na área de genoma, os indivíduos versados na técnica podem aplicar os ensinamentos e orientações fornecidas no presente documento a outros organismos. Por exemplo, as alterações metabólicas exemplificadas no presente documento podem prontamente ser aplicadas a outras espécies incorporando-se o mesmo ácido nucleico de codificação ou um ácido nucleico de codificação análogo de espécies diferentes das espécies referenciadas.

[0178] As células hospedeiras para preparar as células recombinantes descritas no presente documento podem ser de qualquer hospedeiro adequado, como uma cepa de levedura, incluindo, porém, sem limitação, uma célula de Saccharomyces, Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Rhodosporidium, Candida, Yarrowia, Lipomyces, Cryptococcus, ou Dekkera sp.. Em particular, células hospedeiras de Saccharomyces são contempladas, como células de Saccharomyces cerevisiae, bayanus ou carlsbergensis.

De preferência, a célula de levedura é uma célula de Saccharomyces cerevisiae.

As células adequadas podem, por exemplo, ser derivadas de cepas comercialmente disponíveis e cepas industriais aneuploides ou poliploides, incluindo porém, sem limitação aquelas dentre Superstart"”, THERMOSACCO, C5 FUELTYV, XyloFermO, etc. (Lalemand) RED STAR e ETHANOL REDO (Fermentis/Lesaffre); FALI (AB Mauri); Bakers Best Yeast, Baker's Compressed Yeast, etc. (Fleishmann's Yeast); BIOFERM AFT, XP, CF, e XR (North American Bioproducts Corp.); Turbo Yeast (Gert Strand AB); e FERMIOLO (DSM Specialties). Outras cepas de levedura úteis são disponível a partir de depositores biológicos como a American Type Culture Collection (ATCC) ou o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), como, por exemplo, BY4741 (por exemplo, ATCC 201388); Y108-1 (ATCC PTA.10567) e NRRL YB-1952 (ARS Culture Collection). Ainda outras cepas de S. cerevisiae adequadas como células hospedeiras DBY746, [Alpha][Eta]22, S150-2B, GPY55-15Ba, CEN.PK, USM21, TMB3500, TMB3400, VTT-A-63015, VTT-A-85068, VTT-c-79093 e seus derivados, bem como Saccharomyces sp. 1400, 424A (LNH-ST), 259A (LNH-ST) e derivados do mesmo.

Em uma modalidade, a célula recombinante é um derivado de uma cepa Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositada sob Acessão No.

NRRL Y-50973 no Agricultural

Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 U.S.A.).

[0179] As células recombinantes descritas no presente documento podem utilizar vetores de expressão que compreendem a sequência de codificação de um ou mais (por exemplo, dois, diversos) genes heterólogos ligados a uma ou mais sequências de controle que direcionam expressão em uma célula adequada mediante condições compatíveis com a sequência (ou sequências) de controle. Tais vetores de expressão podem ser usados em qualquer uma das células e métodos descritos no presente documento. Os polinucleotídeos descritos no presente documento podem ser manipulados de uma variedade de formas para fornecer a expressão de um polipeptídeo desejado. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando os métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[0180] Um construto ou vetor (ou múltiplos construtos ou vetores) que compreende o um ou mais (por exemplo, dois, diversos) genes heterólogos podem ser introduzidos em uma célula de modo que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossómico ou como um vetor extra-cromossomo de autorreplicação como descrito anteriormente.

[0181] As várias sequências de nucleotídeos e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais (por exemplo, dois, vários) locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) pode ser expresso inserindo-se o polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) ou um construto de ácido nucleico que compreende a sequência em um vetor apropriado para expressão. Ao criar o vetor de expressão, a sequência de codificação está localizada no vetor de modo que a sequência de codificação seja ligada de modo operável às sequências de controle apropriadas para expressão.

[0182] O vetorde expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e possa promover a expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[0183] O vetor pode ser um vetor de replicação autônomo, isto é, um vetor que existe como um entidade extra-cromossômica, a replicação a qual é independente de replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extra-cromossômico, um mini-cromossomo, ou um cromossomo artificia. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o cromossomo (ou cromossomos) no qual foi integrado. Além disso, um vetor único, ou plasmídeo, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula, ou em uma transpóson, podem ser usados.

[0184] O vetorde expressão pode conter qualquer sequência de promotores adequada que é reconhecida por uma célula para expressão de um gene descrito no presente documento. A sequência promotora contém sequências de controle transcricionais que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula de escolha, incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido a partir de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares, homólogos ou heterólogos, na célula.

[0185] Cada polinucleotídeo heterólogo descrito no presente documento pode ser operavelmente ligado a um promotor que é estranho ao polinucleotídeo. Por exemplo, em uma modalidade, o polinucleotídeo heterólogo que codifica o transportador de hexose é ligado de modo operável a um promotor estranho para o polinucleotídeo. Os promotores podem ser idênticos ou compartilhar um alto grau de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99%) com um promotor nativo selecionado.

[0186] Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição dos construtos de ácido nucleico em células de levedura, incluem, mas sem limitação, os promotores obtidos a partir dos genes da enolase, (por exemplo, enolase de S. cerevisiae ou enolase de /. orientalis (ENO1)), galactoquinase (por exemplo, galactoquinase de S. cerevisiae ou galactoquinase de /. orientalis (GAL1)), álcool desidrogenase/gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase (por exemplo, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase de S. cerevisiae ou álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de /. orientalis (ADH1, ADH2/GAP)), triose fosfato isomerase (por exemplo, triose fosfato isomerase de S. cerevisiae e triose fosfato isomerase de /. orientalis (TPI)), metalotioneína (por exemplo, metalotioneíina de S. cerevisiae ou metalotioneína de /. orientalis (CUP1)), 3-fosfoglicerato quinase (por exemplo, 3-fosfoglicerato quinase de S. cerevisiae ou 3-fosfoglicerato quinase de /. orientalis (PGK)), genes de PDC1, xilose redutase (XR), xilitol desidrogenase (XDH), L-(+)-lactato-citocromo c oxidorredutase (CYB2), fator de alongamento de tradução-1 (TEF1), fator de alongamento de tradução-2 (TEF2), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e orotidina 5'-fosfato descarboxilase (URA3). Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et a/., 1992, Yeast 8: 423-488.

[0187] A sequência de controle também pode ser uma sequência terminadora de transcrição adequada, que é reconhecida por uma célula hospedeira por terminar a transcrição. A sequência terminadora é ligada de modo operacional à terminação 3' do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador que seja funcional pode ser usado na célula de levedura de escolha. O terminador pode ser idêntico ou compartilhar um alto grau de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99%) com o terminador nativo selecionado.

[0188] Os terminadores adequados para levedura células hospedeiras podem ser obtidos a partir dos genes para enolase (por exemplo, citocromo C de enolase de S. cerevisiae ou |. orientalis (por exemplo, citocromo de S. cerevisiae ou |. orientalis (CYC1)), gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (por exemplo, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de S. cerevisiae ou |. orientalis (gpd)), PDC1, XR, XDH, transaldolase (TAL), transcetolase (TKL), ribose 5-fosfato cetol-isomerase (RKI), CYB2, e a família galactose de genes (especialmente o terminador GAL10). Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[0189] A sequência de controle também pode ser uma região estabilizante de MRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência de codificação de um gene que aumenta a expressão do gene.

[0190] Exemplos de regiões de estabilizante de mMRNA adequadas são obtidos a partir de um gene de Bacillus thuringiensis crylIIA (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[0191] A sequência de controle também pode ser uma sequência líder adequada, quando transcrita é uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução pela célula hospedeira. À sequência líder é ligada de modo operacional à terminação 5' do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer sequência líder que seja funcional na célula de levedura de escolha pode ser usada.

[0192] Os líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes da enolase (por exemplo, enolase de S. cerevisiae ou |. orientalis (ENO-1)), 3-fosfoglicerato quinase (por exemplo, 3-fosfoglicerato quinase de S. cerevisiae ou |. orientalis), fator alfa (por exemplo, fato alfa de S. cereviísiae ou | orientalis) e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (por exemplo, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de S. cerevisiae ou |. orientalis (ADH2/GAP)).

[0193] A sequência de controle também pode ser uma sequência de poliadenilação; uma sequência ligada de modo operacional à terminação 3' do polinucleotídeo e que, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mMRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada. As sequências de poliadenilação úteis para células de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[0194] Também pode ser desejável adicionar sequências reguladoras que permitem a regulação da expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Os sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores /ac, tac e tro. Em levedura, o sistema ADH2 ou sistema GAL1 pode ser usado.

[0195] Os vetores podem conter um ou mais (por exemplo, dois, vários) marcadores selecionáveis que permitem a fácil seleção de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou semelhantes. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares. Marcadores adequados para levedura células hospedeiras incluem, porém, sem limitação, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URAS3.

[0196] Os vetores podem conter um ou mais (por exemplo, dois, vários) elementos que permitem a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[0197] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma localização (ou localizações) precisa no cromossomo (ou cromossomos). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização específica, os elementos de integração devem conter uma quantidade suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequência em relação à sequência-alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que é homóloga com a sequência-

alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga. Os locais de integração potenciais incluem aqueles descritos na técnica (por exemplo, consultar o documento nº US2012/0135481).

[0198] Parareplicação autônoma, o vetor pode compreender, ainda, uma origem de replicação que possibilita que o vetor se replique autonomamente na célula de levedura. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” significa um polinucleotídeo que possibilita que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo. Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARSA4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

[0199] “Maisdo que uma cópia de um polinucleotídeo descrito no presente documento podem ser inseridas em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento na quantidade de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula de levedura ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo, em que células que contêm cópias amplificadas do gene marcador selecionável e, desse modo, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando-se as células na presença do agente selecionável apropriado.

[0200] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes descritos no presente documento são bem conhecidos pelos indivíduos versados na técnica (consultar, por exemplo, Sambrook et a/., 1989, supra).

[0201] Procedimentos e técnicas adicionais conhecido na técnica para a preparação de células recombinantes para fermentação de etanol, são descritos, por exemplo, no documento WO 2016/045569, cujo conteúdo é incorporado ao presente documento a título de referência. Processos de Produção de Etanol

[0202] As células recombinantes descritas no presente documento podem ser usadas para a produção de etanol. Um aspecto é um método para produzir etanol, que compreende cultivar uma célula recombinante descrita no presente documento em um meio fermentável sob condições adequadas para produzir etanol. Em outro aspecto é um processo para produzir etanol que compreende (a) sacarificação de um material celulósico e/ou que contém amido com uma composição de enzima; (b) fermentar o material sacarificado da etapa (a) com qualquer uma das células recombinantes descritas no presente documento (por exemplo, uma célula que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose descrito no presente documento e sequência de codificação de xilose isomerase). Em uma modalidade, o processo compreende recuperar o etanol do meio de fermentação.

[0203] O processamento do material que contém amido e/ou celulósico pode ser realizado com o uso de métodos convencionais na técnica. Ademais, os processos podem ser implantados com o uso de qualquer aparelho de processamento de amido e/ou biomassa convencional configurado para realizar os processos.

[0204] Sacarificação (isto é, hidrólise) e fermentação, separadas ou simultâneas, incluem mas não estão limitadas a hidrólise e fermentação separadas (SHF); sacarificação e fermentação simultâneas

(SSF); sacarificação e cofermentação simultâneas (SSCF); hidrólise e fermentação híbridas (HHF); hidrólise e cofermentação separadas (SHCF); hidrólise e cofermentação híbridas (HHCF).

[0205] A SHF usa etapas de processo separadas para hidrolisar enzimaticamente em primeiro lugar o material celulósico em açúcares fermentáveis, por exemplo, glicose, celobiose e monômeros de pentose, e depois fermentar os açúcares fermentáveis em etanol. Na SSF, a hidrólise enzimática do material celulósico e a fermentação de açúcares em etanol são combinadas em uma etapa (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179 a 212). A SSCF envolve a cofermentação de múltiplos açúcares (Sheehan e Himmel, 1999, Biotechnol. Prog. 15: 817 a 827). A HHF envolve uma etapa de hidrólise separada e adicionalmente uma etapa de sacarificação e hidrólise simultâneas, que podem ser executadas no mesmo reator. Os passos em um processo de HHF podem ser levados a cabo a diferentes temperaturas, isto é, sacarificação enzimática a elevada temperatura seguida por SSF a uma temperatura mais baixa que o organismo da fermentação possa tolerar. É entendido no presente documento que qualquer método conhecido na técnica que compreende pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), fermentação, ou uma combinação dos mesmos, pode ser usado na prática dos processos descritos no presente documento.

[0206] Um dispositivo convencional pode incluir um reator agitado alimentado em descontínuo, um reator agitado descontínuo, um reator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração e/ou um reator de coluna de fluxo em pistão contínuo (de Castilhos Corazza et al., 2003, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov e Sinitsyn, 1985, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu e Lee, 1983, Biotechnol.

Bioeng. 25: 53 a 65). Os tipos de reator adicionais incluem reatores de leito fluidizado, de manta de fluxo ascendente, imobilizados e reatores do tipo extrusora para hidrólise e/ou fermentação. Pré-tratamento Celulósico

[0207] Em uma modalidade, o material celulósico é pré- tratado antes da sacarificação na etapa (a).

[0208] Na prática, os processos descritos no presente documento, qualquer processo de pré-tratamento conhecido na técnica, podem ser usados para romper componentes de parede celular de planta do material celulósico (Chandra et al., 2007, Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 67-93; Galbe e Zacchi, 2007, Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 41 a 65; Hendriks e Zeeman, 2009, Bioresource Technology 100: 10 a 18; Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673 a 686; Taherzadeh e Karimi, 2008, Int. J. Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang e Wyman, 2008, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr. 2: 26 a 40).

[0209] O material celulósico pode ser também sujeito a redução do tamanho das partículas, crivagem, pré-embebição, umedecimento, lavagem, e/ou condicionamento antes do pré-tratamento usando métodos conhecidos na técnica.

[0210] Os pré-tratamentos convencionais incluem, mas não se limitam a, pré-tratamento com vapor (com ou sem explosão), pré- tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com água quente, pré- tratamento alcalino, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, explosão úmida, explosão de fibras com amônia, pré-tratamento com organosolv e pré- tratamento biológico. Pré-tratamentos adicionais incluem pré-tratamentos de percolação com amônia, ultrassons, eletroporação, micro-ondas, CO, supercrítico, H2O supercrítica, ozônio, líquido iônico e irradiação gama.

[0211] Em uma modalidade, o material celulósico é pré-

tratado antes da sacarificação (isto é, hidrólise) e/ou fermentação. O pré- tratamento é preferencialmente realizado antes da hidrólise. Alternativamente, o pré-tratamento pode ser executado simultaneamente com hidrólise de enzimas para liberar açúcares fermentáveis, tais como glicose, xilose, e/ou celobiose. Na maioria dos casos, a própria etapa de pré- tratamento resulta em alguma conversão da biomassa em açúcares fermentáveis (mesmo na ausência de enzimas).

[0212] Em uma modalidade, o material celulósico é pré- tratado com vapor. No pré-tratamento com vapor, o material celulósico é aquecido para desagregar os componentes de paredes celulares de plantas, incluindo lignina, hemicelulose, e celulose para tornar a celulose e outras frações, por exemplo, hemicelulose, acessíveis a enzimas. O material celulósico é passado para ou através de um vaso reacional no qual vapor é injetado para aumentar a temperatura até à temperatura e pressão requeridas e aí retido durante o tempo de reação desejado. O pré-tratamento com vapor é preferencialmente realizado a 140 a 250 ºC, por exemplo, 160 a 200 ºC ou 170 a 190 ºC, em que a faixa de temperaturas ideais depende da adição opcional de um catalisador químico. O tempo de residência para o pré-tratamento com vapor é preferencialmente de 1 a 60 minutos, por exemplo, 1 a 30 minutos, 1 a 20 minutos, 3 a 12 minutos ou 4 a 10 minutos, em que o tempo de residência ótimo depende da temperatura e da adição opcional de um catalisador químico. O pré-tratamento com vapor permite cargas de sólidos relativamente elevadas, tal que o material celulósico seja geralmente somente umedecido durante o pré-tratamento. O pré-tratamento com vapor é frequentemente combinado com uma descarga explosiva do material após o pré-tratamento, que é conhecida como explosão a vapor, isto é, expansão rápida até à pressão atmosférica e fluxo turbulento do material para aumentar a área superficial acessível por fragmentação (Duff e Murray,

1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe e Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; Pedido de Patente nº US. 2002/0164730). Durante o pré-tratamento com vapor, os grupos acetila da hemicelulose são clivados e o ácido resultante autocatalisa a hidrólise parcial da hemicelulose em monossacarídeos e oligossacarídeos. A lignina é removida em uma extensão limitada apenas.

[0213] Em uma modalidade, o material celulósico é submetido a um pré-tratamento químico. O termo "tratamento químico" se refere a qualquer pré-tratamento químico que promova a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina. Um tal pré-tratamento pode converter celulose cristalina em celulose amorfa. Exemplos de processos de pré-tratamento químico adequados incluem, por exemplo, pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, expansão de fibras com amônia/congelamento (AFEX), percolação com amônia (APR), líquido iônico, e pré-tratamentos com organosolv.

[0214] Um catalisador químico, tal como H2SO., ou SO> (tipicamente 0,3 a 5% p/p), é por vezes adicionado antes do pré-tratamento com vapor, o que diminui o tempo e a temperatura, aumenta a recuperação e melhora a hidrólise enzimática (Ballésteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129 a 132: 496 a 508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113 a 116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Miíicrob. Technol. 39: 756 a 762). No pré-tratamento com ácido diluído, o material celulósico é misturado com ácido diluído, tipicamente H2SOa, e água para formar uma pasta, aquecido por vapor até à temperatura desejada, e após um tempo de residência expandido até à pressão atmosférica. O pré- tratamento com ácido diluído pode ser realizado com um número de desenhos de reatores, por exemplo, reatores de fluxo de pistão, reatores contracorrente, ou reatores contracorrente contínuos com encolhimento do leito (Duff e Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1 a 33; Schell et al., 2004, Bioresource Technology 91: 179-188; Lee et a/., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93 a 115). Em uma modalidade específica, o pré- tratamento com ácido diluído de material celulósico é realizado utilizando ácido sulfúrico a 4% p/p a 180 ºC durante 5 minutos.

[0215] Podem ser também usados vários métodos de pré- tratamento sob condições alcalinas. Estes pré-tratamentos alcalinos incluem, mas não se limitam a, pré-tratamento com hidróxido de sódio, cal, oxidação úmida, percolação com amônia (APR), e expansão de fibras com amônia/congelamento (AFEX).

[0216] O pré-tratamento com cal é realizado com óxido de cálcio ou hidróxido de cálcio a temperaturas de 85 a 150 ºC e tempos de residência de 1 hora a vários dias (Wyman et a/., 2005, Bioresource Technol. 96: 1.959 a 1.966; Mosier et a/., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686). Os documentos nºº WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900 e WO 2006/110901 divulgam métodos de pré-tratamento usando amônia.

[0217] A oxidação úmida é um pré-tratamento térmico realizado tipicamente em 180 a 200 ºC por 5 a 15 minutos com adição de um agente oxidante como peróxido de hidrogênio ou sobrepressão de oxigênio (Schmidt e Thomsen, 1998, Bioresource Technology 64: 139 a 151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1 a 17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567 a 574; Martin et a/l., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). O pré-tratamento é realizado preferencialmente com matéria seca a 1 a 40%, por exemplo, matéria seca a 2 a 30% ou matéria seca a 5 a 20%, e frequentemente o pH inicial é aumentado pela adição de um composto alcalino como carbonato de sódio.

[0218] Uma modificação do método de pré-tratamento de oxidação úmida, conhecido como explosão úmida (combinação de oxidação úmida e explosão a vapor) pode manipular matéria seca até 30%. Na explosão úmida, o agente oxidante é introduzido durante o pré-tratamento após um certo tempo de residência. O pré-tratamento é então finalizado por expansão até à pressão atmosférica (WO 2006/032282).

[0219] A expansão de fibras com amônia (AFEX) envolve tratamento do material celulósico com amônia líquida ou gasosa a temperaturas moderadas tais como 90 a 150 ºC e pressão elevada, tal como 1,7 a 2 MPa (17 a 20 bar) durante 5 a 10 minutos, em que o teor de matéria seca pode ser tão elevado quanto 60% (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23 a 35; Chundawat et a/l., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219 a 231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1.133 a 1.141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technology 96: 2014-2018). Durante o pré-tratamento com AFEX, a celulose e as hemiceluloses permanecem relativamente intactas. Os complexos de lignina-carboidrato são clivados.

[0220] O pré-tratamento com organosolv deslignifica o material celulósico por extração com o uso de etanol aquoso (etanol a 40 a 60%) a 160 a 200 ºC durante 30 a 60 minutos (Pan et a/l., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473 a 481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851 a 861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). O ácido sulfúrico é normalmente adicionado como catalisador. No pré-tratamento com organosolv, a maioria da hemicelulose e lignina é removida.

[0221] Outros exemplos de métodos de pré-tratamento adequados são descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem. Biotechnol. 105 a 108: 69 a 85, e Mosier et a/., 2005, Bioresource Technology 96: 673 a 686, e Pedido Publicado nº U.S. 2002/0164730.

[0222] Em uma modalidade, o pré-tratamento químico é realizado como um tratamento de ácido diluído e, mais preferencialmente, como um tratamento de ácido diluído contínuo. O ácido é tipicamente ácido sulfúrico, mas também podem ser usados outros ácidos, tais como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloreto de hidrogênio, ou suas misturas. O tratamento com ácido suave é conduzido na faixa de pH preferencialmente de 1 a 5, por exemplo, 1a4ou1a2,5. Em um aspecto, a concentração de ácido está na faixa de preferencialmente 0,01 a 10% em peso de ácido, por exemplo, 0,05 a 5% em peso de ácido ou 0,1 a 2% em peso de ácido. O ácido é contatado com o material celulósico e mantido a uma temperatura preferencialmente na faixa de 140 a 200 “ºC, por exemplo, 165 a 190 ºC, durante períodos que variam de 1 a 60 minutos.

[0223] Em uma outra modalidade, o pré-tratamento decorre em uma suspensão aquosa. Em aspectos preferenciais, o material celulósico está presente durante o pré-tratamento em quantidades preferencialmente entre 10 a 80% por peso, por exemplo, 20 a 70% por peso ou 30 a 60% por peso, tal como cerca de 40% por peso. O material celulósico pré-tratado pode não ser lavado ou ser lavado usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, lavado com água.

[0224] Em uma modalidade, o material celulósico é submetido a pré-tratamento físico ou mecânico. O termo “pré-tratamento mecânico” ou “pré-tratamento físico” se refere a qualquer pré-tratamento que promova a redução do tamanho das partículas. Por exemplo, tal pré- tratamento pode envolver vários tipos de trituração ou moagem (por exemplo, moagem a seco, moagem úmida, ou moagem com bolas vibratórias).

[0225] O material celulósico pode ser pré-tratado fisicamente (mecanicamente) e quimicamente. O pré-tratamento mecânico ou físico pode ser acoplado com tratamento com vapor/explosão a vapor, hidrotermólise, tratamento com ácido diluído ou fraco, tratamento a elevada temperatura, elevada pressão, irradiação (por exemplo, irradiação de micro-ondas), ou suas combinações. Em um aspecto, elevada pressão significa pressão na faixa de preferencialmente cerca de 0,69 a cerca de 2,76 MPa (cerca de 100 a cerca de 400 psi), por exemplo, cerca de 1,03 a cerca de 1,72 MPa (cerca de 150 a cerca de 250 psi). Em outro aspecto, elevada temperatura significa temperaturas na faixa de cerca de 100 a cerca de 300 ºC, por exemplo, cerca de 140 a cerca de 200 ºC. Em um aspecto preferencial, o pré-tratamento mecânico ou físico é realizado em um processo descontínuo usando um sistema hidrolisador de pistola a vapor que usa elevada pressão e elevada temperatura como definido acima, por exemplo, um Hidrolisador Sunds disponível da Sunds Defibrator AB, Suécia. Os pré-tratamentos físico e químico podem ser levados a cabo sequencialmente ou simultaneamente, como desejado.

[0226] —Consequentemente, em uma modalidade, o material celulósico é submetido a pré-tratamento químico ou físico (mecânico), ou qualquer combinação dos mesmos, para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina.

[0227] Em uma modalidade, o material celulósico é submetido a um pré-tratamento biológico. O termo "pré-tratamento biológico" se refere a qualquer pré-tratamento biológico que promova a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina do material celulósico. Técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver aplicação de micro- organismos e/ou enzimas solubilizadores de lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179 a 212; Ghosh e Singh, 1993, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295 a 333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, em Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., e Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American

Chemical Society, Washington, DC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed, Springer-Verlag Berlim Heidelberga, Alemanha, 65: 207 a 241; Olsson e Hahn-Hagerdal, 1996, Enz. Microb. Tech. 18: 312 a 331; e Vallander e Eriksson, 1990, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

Sacarificação

[0228] Na etapa de sacarificação (isto é, etapa de hidrólise), o material celulósico e/ou que contém amido, por exemplo, pré-tratado, é hidrolisado para quebrar celulose, hemicelulose, e/ou amido para açúcares fermentáveis, como glicose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose, e/ou oligossacarídeos solúveis. A hidrólise é realizada enzimaticamente. por exemplo, por uma composição de enzima celulolítica. As enzimas das composições podem ser adicionadas simultaneamente ou sequencialmente.

[0229] A hidrólise enzimática pode ser realizada em um ambiente aquoso adequado mediante condições que podem ser prontamente determinadas por um indivíduo versado na técnica. Em um aspecto, a hidrólise é realizada sob condições adequadas para a atividade da enzima (ou enzimas), isto é, ótimas para a enzima (ou enzimas). À hidrólise pode ser realizado como uma batelada de alimentação ou processo contínuo em que o material celulósico e/ou que contém amido é alimentado gradualmente para, por exemplo, uma solução de hidrólise que contém enzima.

[0230] A sacarificação é geralmente realizada em reatores ou fermentadores de tanque agitado sob condições controladas de pH, temperatura, e mistura. Condições adequadas de tempo de processo, temperatura e pH podem ser prontamente determinadas por um perito na técnica. Por exemplo, a sacarificação pode durar até 200 horas, mas tipicamente é realizada durante preferencialmente cerca de 12 a cerca de 120 horas, p.ex., cerca de 16 a cerca de 72 horas ou cerca de 24 a cerca de 48 horas. A temperatura está na faixa de preferencialmente cerca de 25 ºC a cerca de 70 ºC, por exemplo, cerca de 30 ºC a cerca de 65 ºC, cerca de 40 ºC a cerca de 60 ºC, ou cerca de 50 ºC a cerca de 55 ºC. O pH está na faixa de preferencialmente cerca de 3 a cerca de 8, por exemplo, cerca de 3,5 a cerca de 7, cerca de 4 a cerca de 6, ou cerca de 4,5 a cerca de 5,5. O conteúdo de sólidos secos está preferencialmente na gama de cerca de 5 a cerca de 50% em peso, p.ex., cerca de 10 a cerca de 40% em peso ou cerca de 20 a cerca de 30% em peso.

[0231] A sacarificação na etapa (a) pode ser realizada com o uso de uma composição de enzima celulolíticaa Tais composições enzimáticas são descritas abaixo na seção "Composição de Enzimas Celulolíticas" abaixo. As composições de enzima celulolítica podem compreender qualquer proteína útil na degradação do material celulósico. Em um aspecto, a composição de enzimas celulolíticas compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (p.ex, várias) proteínas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, um polipeptídeo AA9 (GH61), uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma enzima ligninolítica, uma oxidorreductase, uma pectinase, uma protease e uma swolenina.

[0232] Em uma outra modalidade, a celulase é preferencialmente uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma endoglucanase, uma celobioidrolase, e uma beta- glucosidase.

[0233] Em outra modalidade, a hemicelulase é, de preferência, uma ou mais (por exemplo, diversas) enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma esterase de ácido coumárico, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glicuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase. Em outra modalidade, a oxirredutase é uma ou mais (por exemplo, diversas) enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma catalase, uma lacase e uma peroxidase.

[0234] As enzimas ou composições enzimáticas usadas em uns processos da presente invenção podem estar em qualquer forma adequada para uso, tal como, por exemplo, uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células, um lisado celular com ou sem detritos celulares, uma preparação de enzimas semipurificada ou purificada, ou uma célula hospedeira como uma fonte das enzimas. A composição de enzima pode ser um pó seco ou granulado, um granulado de não pulverização, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida estabilizada. As preparações de enzima líquida podem, por exemplo, ser estabilizadas adicionando-se estabilizantes como um açúcar, um álcool de açúcar ou outro poliol, e/ou ácido lático ou outro ácido orgânico de acordo com processos estabelecidos.

[0235] Em uma modalidade, uma quantidade eficaz de composição celulolítica ou hemi-celulolítica de enzima para o material celulósico é cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, por exemplo, cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, ou cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g do material celulósico.

[0236] Em uma modalidade, um tal composto é adicionado a uma razão molar entre o composto e unidades de glucosila de celulose de cerca de 10º a cerca de 10, p.ex., cerca de 10 a cerca de 7,5, cerca de 10

6 a cerca de 5, cerca de 10º a cerca de 2,5, cerca de 10 a cerca de 1, cerca de 10º a cerca de 1, cerca de 10º a cerca de 10, cerca de 10º a cerca de 107), cerca de 10 a cerca de 10", ou cerca de 10º a cerca de 10?. Em outro aspecto, uma quantidade eficaz de um tal composto é cerca de 0,1 uM a cerca de 1 M, por exemplo, cerca de 0,5 uM a cerca de 0,75 M, cerca de 0,75 UM a cerca de 0,5 M, cerca de 1 uM a cerca de 0,25 M, cerca de 1 uM a cerca de 0,1 M, cerca de 5 UM a cerca de 50 mM, cerca de 10 UM a cerca de mM, cerca de 50 UM a cerca de 25 mM, cerca de 10 UM a cerca de 10 MM, cerca de 5 uM a cerca de 5 mM, ou cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM.

[0237] O termo "licor" designa a fase de solução, aquosa, orgânica ou uma combinação das mesmas, proveniente do tratamento de um material lignocelulósico e/ou hemicelulósico em uma suspensão, ou monossacarídeos do mesmo, por exemplo, xilose, arabinose, manose, etc., sob as condições descritas no documento nº WO 2012/021401 e o conteúdo solúvel do mesmo. Um licor para intensificação celulolítica de um polipeptídeo polipeptídeo AA9 GH61) pode ser produzido por tratamento de um material (ou matéria-prima) de lignocelulose ou hemicelulose por aplicação de calor e/ou pressão, opcionalmente na presença de um catalisador, p.ex., ácido, opcionalmente na presença de um solvente orgânico, e opcionalmente em combinação com disrupção física do material, e depois separação da solução dos sólidos residuais. Tais condições determinam o grau de intensificação celulolítica obtenível através da combinação de licor e um polipeptídeo AAS9 durante hidrólise de um substrato celulósico por uma preparação de enzimas celulolíticas. O licor pode ser separado do material tratado usando um método padrão na técnica, tal como filtração, sedimentação ou centrifugação.

[0238] Em uma modalidade, uma quantidade eficaz de licor em relação à celulose é de cerca de 10º a cerca de 10 g por g de celulose,

p.ex.o, cerca de 10º a cerca de 7,5 g, cerca de 10º a cerca de 5 g, cerca de a cerca de 2,5 g, cerca de 10 a cerca de 1 g, cerca de 10º a cerca de 1 g, cerca de 10º a cerca de 10 g, cerca de 10º a cerca de 10 g, cerca de 10? a cerca de 10 g, ou cerca de 10º a cerca de 10º? g por g de celulose. Composição de Enzimas Celulolíticas

[0239] Uma composição de enzima celulolítica pode estar presente ou adicionada durante sacarificação na etapa (a). Uma composição de enzimas celulolíticas é uma preparação de enzimas contendo uma ou mais (p.ex., várias) enzimas que hidrolisam material celulósico. Tais enzimas incluem —endoglucanase, celobiohidrolase, beta-glucosidase, e/ou respectivas combinações.

[0240] A composição de enzima celulolítica pode ser de qualquer origem. Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é derivada de uma estirpe de Trichoderma, tal como uma estirpe de Trichoderma reesei; uma estirpe de Humicola, tal como uma estirpe de Humicola insolens, e/ou uma estirpe de Chrysosporium, tal como uma estirpe de Chrysosporium lucknowense. Em uma modalidade preferencial, a preparação de enzimas celulolíticas é derivada de uma estirpe de Trichoderma reesei.

[0241] A composição de enzima celulolítica pode compreender adicionalmente um ou mais dos seguintes polipeptídeos, tais como enzimas: O polipeptídeo AAS9 (polinucleotídeo GH61) com atividade celulolítica intensificadora, beta-glucosidase, xilanase, beta-xilosidase, CBH 1, CBH Il, ou uma mistura de dois, três, quatro, cinco ou seis desses.

[0242] O(s) polipeptídeo(s) adicionais (p.ex., polipeptídeo AAS9) e/ou enzima(s) (p.ex., beta-glucosidase, xilanase, beta-xilosidase, CBH | e/ou CBH II) pode(m) ser estranho(s) ao organismo produtor da composição de enzimas celulolíticas (p.ex., Trichoderma reesei).

[0243] Em uma modalidade, a preparação de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo AA9 com atividade celulolítica aumentada e uma beta-glucosidase.

[0244] Em uma outra modalidade, a preparação de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo AA9 com atividade celulolítica intensificadora, uma beta-glucosidase, e uma CBH |.

[0245] Em uma outra modalidade, a preparação de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo AA9 com atividade celulolítica intensificadora, uma beta-glucosidase, uma CBH |, e uma CBH Il.

[0246] Outras enzimas, tais como endoglucanases, também podem estar compreendidas na composição de enzimas celulolíticas.

[0247] “Como mencionado acima, a composição de enzimas celulolíticas pode compreender alguns polipeptídeos diferentes, incluindo enzimas.

[0248] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica é uma composição de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que compreende ainda polipeptídeo de Thermoascus aurantiacus AA9 (GH61A) que tem atividade de melhoramento celulolítico (por exemplo, documento WO 2005/074656), e proteína de fusão de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (por exemplo, uma revelado no documento WO 2008/057637, em particular, mostrada como SEQ ID NOs: 59 e 60).

[0249] Em uma outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo AA9 (GH61A) de Thermoascus aurantiacus com atividade celulolítica intensificadora (p.ex. SEQ ID NO: 2 no documento WO 2005/074656), e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (por exemplo, SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499).

[0250] Em outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo adicionalmente polipeptídeo AA9 (GH61A) com atividade celulolítica aumentada de Penicillium emersonii, em particular o divulgado em WO 2011/041397, e a beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499).

[0251] Em outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo adicionalmente polipeptídeo AA9 (GH61A) com atividade celulolítica aumentada de Penicillium emersonii, em particular o divulgado em WO 2011/041397, e a beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (p.ex., SEQ ID NO: 2 do documento WO 2005/047499) ou uma variante revelada no documento WO 2012/044915 (incorporado ao presente documento a título de referência), em particular, aquele que compreende uma ou mais como todas as substituições a seguir: F100D, S283G, N456E, F512Y.

[0252] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo adicionalmente polipeptídeo AA9 (GH61A) com atividade celulolítica aumentada, em particular o derivado de uma estirpe de Penicillium emersonii (SEQ ID NO: 2 no documento WO 2011/041397), variante de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (por exemplo, SEQ ID NO: 2 no documento WO 2005/047499) com uma ou mais, em particular, todas as substituições a seguir: F100D, S283G, N456E, F512Y e divulgada em WO 2012/044915; CBH1 Cel7A de Aspergillus fumigatus, p.ex., a divulgada como SEQ ID NO: 6 no documento WO2011/057140 e Aspergillus fumigatus CBH Il, por exemplo, aquele revelado como SEQ ID NO: 18 no documento WO 2011/057140.

[0253] Em uma modalidade preferencial, a composição de enzima celulolítica é uma Trichoderma reesei, composição de enzima celulolítica, que compreende ainda uma composição de enzima de hemicelulase ou hemicelulolítica, como uma xilanase de Aspergillus fumigatus e beta-xilosidase de Aspergillus fumigatus.

[0254] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende também uma xilanase (p.ex., derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, em particular Aspergillus aculeatus ou Aspergillus fumigatus; ou uma estirpe do gênero Talaromyces, em particular Talaromyces leycettanus) e/ou uma beta- xilosidase (p.ex., derivada de Aspergillus, em particular Aspergillus fumigatus, ou uma estirpe de Talaromyces, em particular Talaromyces emersonii).

[0255] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica é uma composição de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que compreende ainda polipeptídeo de Thermoascus aurantiacus AA9 (GH61A) que tem atividade de melhoramento celulolítico (por exemplo, documento WO 2005/074656), proteína de fusão de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (por exemplo, uma revelado no documento WO 2008/057637, em particular, como SEQ ID NOs: 59 e 60), e xilanase de Aspergillus aculeatus (por exemplo, Xyl 1l no documento WO 94/21785).

[0256] Em outra modalidade, a preparação de enzimas celulolíticas compreende uma preparação celulolítica de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente polipeptidecoo GH61A de Thermoascus aurantiacus com atividade celulolítica aumentada (p.ex., SEQ ID NO: 2 no documento WO 2005/074656), variante de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (por exemplo, SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499) e xilanase de Aspergillus aculeatus (Xyl Il divulgada em WO 94/21785).

[0257] Em uma outra modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende uma composição de enzimas celulolíticas de

Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo AA9 (GH61A) de Thermoascus aurantiacus com atividade celulolítica intensificadora (p.ex. SEQ ID NO: 2 no documento WO 2005/074656), variante de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (por exemplo, SEQ ID NO: 2 do documento WO 2005/047499) e xilanase de Aspergillus aculeatus (por exemplo, Xyl Il revelada no documento WO 94/21785).

[0258] Em outra modalidade, a composição de enzima celulolítica é uma composição de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que compreende ainda polipeptídeo de Penicillium emersonii AA9 (GH61A) que têm atividade de melhoramento celulolítico, em particular, aquele revelado no documento WO 2011/041397, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (por exemplo, SEQ ID NO: 2 do documento WO 2005/047499) e xilanase de Aspergillus fumigatus (por exemplo, Xyl Ill no documento WO 2006/078256).

[0259] Em outra modalidade, a composição de enzima celulolítica compreende uma composição de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que compreende ainda polipeptídeo de Penicillium emersonii AA9 (GH61A) que têm atividade de melhoramento celulolítico, em particular, aquele revelado no documento WO 2011/041397, beta- glucosidase de Aspergillus fumigatus (por exemplo, SEQ ID NO: 2 do documento WO 2005/047499), xilanase de Aspergillus fumigatus (por exemplo, Xyl Ill no documento WO 2006/078256), e CBH | de Aspergillus fumigatus, em particular, Cel7A CBH1 revelado como SEQ ID NO: 2 em WO2011/057140.

[0260] Em outra modalidade, a composição de enzima celulolítica é uma composição de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que compreende ainda polipeptídeo de Penicillium emersonii AA9 (GH61A) que têm atividade de melhoramento celulolítico, em particular, aquele revelado no documento WO 2011/041397, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (por exemplo, SEQ ID NO: 2 do documento WO 2005/047499), xilanase de Aspergillus fumigatus (por exemplo, Xyl Ill no documento WO 2006/078256), CBH | de Aspergillus fumigatus, em particular, Cel7A CBH1 revelado como SEQ ID NO: 2 no documento WO 2011/057140, e CBH Il derivado de Aspergillus fumigatus, em particular, aquele revelado como SEQ ID NO: 4 no documento WO 2013/028928.

[0261] Em outra modalidade, a composição de enzima celulolítica é uma composição de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que compreende ainda polipeptídeo de Penicillium emersonii AA9 (GH61A) que têm atividade de melhoramento celulolítico, em particular, aquele revelado no documento WO 2011/041397, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (por exemplo, SEQ ID NO: 2 do documento WO 2005/047499) ou variante da mesma com uma ou mais, em particular, todas as substituições a seguir: F100D, S283G, N456E, F512Y; xilanase de Aspergillus fumigatus (por exemplo, Xyl Ill no documento WO 2006/078256), CBH | de Aspergillus fumigatus, em particular, Cel7A CBH | revelado como SEQ ID NO: 2 no documento WO 2011/057140, e CBH Il derivado de Aspergillus fumigatus, em particular, aquele revelado no documento WO 2013/028928.

[0262] Em outra modalidade, a composição de enzima celulolítica é uma composição de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que compreende o CBH | (GENSEQP Acessão No. AZYA49536 (WO2012/103293); um CBH Il (GENSEQP Acessão No. AZY49446 (WO2012/103288); uma variante de beta-glucosidase (GENSEQP Acessão No. AZU67153 (WO 2012/44915)), em particular, com uma ou mais, em particular, todas as substituições a seguir: F100D, S283G, N456E, F512Y; e AA9 (GH61 polipeptídeo) (GENSEQP Acessão No. BAL61510 (WO 2013/028912)).

[0263] Em outra modalidade, a composição de enzima celulolítica é uma composição de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que compreende um CBH | (GENSEQP Acessão No. AZY49536 (WO2012/103293))); um CBH Il (GENSEQP Acessão No. AZY49446 (WO2012/103288); uma xilanase de GH10 (GENSEQP Acessão No. BAK46118 (WO 2013/019827)); e uma beta-xilosidase (GENSEQP Acessão No. AZIO4896 (WO 2011/057140)).

[02684] Em outra modalidade, a composição de enzima celulolítica é uma composição de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que compreende um CBH | (GENSEQP Acessão No. AZY49536 (WO2012/103293)); um CBH Il (GENSEQP Acessão No. AZY49446 (WO2012/103288)); e um AA9 (GH61 polipeptídeo; GENSEQP Acessão No. BAL61510 (WO 2013/028912)).

[0265] Em outra modalidade, a composição de enzima celulolítica é uma composição de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que compreende um CBH | (GENSEQP Acessão No. AZY49536 (WO2012/103293)); um CBH Il (GENSEQP Acessão No. AZY49446 (WO2012/103288)), um AA9 (GH61 polipeptídeo; GENSEQP Acessão No. BAL61510 (WO 2013/028912)), e uma catalase (GENSEQP Acessão No. BAC11005 (WO 2012/130120)).

[0266] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica é uma composição de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que compreende um CBH | (GENSEQP Acessão No. AZYA49446 (WO2012/103288),; um CBH Il (GENSEQP Acessão No. AZY49446 (WO2012/103288)), uma variante de beta-glucosidase (GENSEQP Acessão No. AZU67153 (WO 2012/44915)), com uma ou mais, em particular, todas as substituições a seguir: F100D, S283G, N456E, F512Y; um AA9 (GH61 polipeptídeo; GENSEQP Acessão No. BAL61510 (WO 2013/028912)), um

GH10 xilanase (GENSEQP Acessão No. BAK46118 (WO 2013/019827)), e uma beta-xilosidase (GENSEQP Acessão No. AZIO4896 (WO 2011/057140)).

[0267] Em uma modalidade, a composição celulolítica é uma preparação de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que compreende um EG | (Swissprot Acessão No. P07981), EG Il (EMBL Acessão No. M19373), CBH | (supra); CBH II (supra); variante de beta-glucosidase (supra) com as substituições a seguir: F100D, S283G, N456E, F512Y; um AA9 (GH61 polipeptídeo; supra), GH10 xilanase (supra); e beta-xilosidase (supra).

[0268] Todas as composições de enzimas celulolíticas divulgadas em WO 2013/028928 são também contempladas e deste modo incorporadas a título de referência.

[0269] —Acomposição de enzimas celulolíticas compreende ou pode compreender adicionalmente uma ou mais (várias) proteínas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, um polipeptídeo AA9 (isto é, GH61) com atividade celulolítica aumentada, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina.

[0270] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição comercial de enzimas celulolíticas. Exemplos de composições comerciais de enzimas celulolíticas adequadas para uso em um processo da invenção incluem: CELLIC& CTec (Novozymes A/S), CELLICO CTec2 (Novozymes A/S), CELLIC& CTec3 (Novozymes A/S), CELLUCLAST'" (Novozymes A/S), SPEZYME'Y CP (Genencor |nt.), ACCELLERASET!Y 1000, ACCELLERASE 1500, ACCELLERASET!Y TRIO (DuPont), FILTRASES NL (DSM); METHAPLUSO S/L 100 (DSM), ROHAMENT'Y 7069 W (Róhm GmbH), ou ALTERNAFUELO CMAX3TV

(Dyadic International, Inc.). A composição de enzimas celulolíticas pode ser adicionada em uma quantidade eficaz de cerca de 0,001 a cerca de 5,0% em peso de sólidos, p.ex., cerca de 0,025 a cerca de 4,0% em peso de sólidos ou cerca de 0,005 a cerca de 2,0% em peso de sólidos.

[0271] As enzimas composições adicionais dos mesmos podem ser constatadas no documento WO2016/0455569 (cujo conteúdo é incorporado ao presente documento em sua totalidade).

Fermentação

[0272] Os açúcares fermentáveis obtidos do material celulósico hidrolisado e/ou que contém amido podem ser fermentados por um ou mais (por exemplo, diversos) microrganismos de fermentação descritos no presente documento que têm capacidade de fermentar os açúcares direta ou indiretamente no etanol. "Fermentação" ou "processo de fermentação" se refere a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo compreendendo uma etapa de fermentação.

[0273] Na etapa de fermentação, açúcares, liberados do material celulósico e/ou que contém amido, por exemplo, como resultado das etapas de pré-tratamento e hidrólise enzimática, são fermentados para etanol, por um organismo de fermentação, como levedura descrita no presente documento. A hidrólise (sacarificação) e fermentação podem ser separadas ou simultâneas.

[0274] Qualquer material hidrolisado adequado que contém amido e/ou celulósico pode ser usado na etapa de fermentação na prática dos processos descritos no presente documento. Tais matérias-primas incluem, porém, sem limitação carboidratos (por exemplo, lignocelulose, xilanos, celulose, amido, etc.). O material é geralmente selecionado com base na economia, isto é, nos custos por potencial de açúcar equivalente, e resistência à conversão enzimática.

[0275] A produção de etanol por um microrganismo de fermentação com o uso de material celulósico resulta do metabolismo de açúcares (monossacarídeos). A composição de açúcar do material celulósico hidrolisado e a capacidade do microrganismo de fermentação para utilizar os açúcares diferentes têm um impacto direto em rendimentos de processo. Antes Da revelação do Requerente no presente documento, cepas conhecidas na técnica utilizam glicose de modo eficaz, mas não (ou muito limitadamente) metabolizam pentoses como xilose, um monossacarídeo comumente encontrado em material hidrolisado.

[0276] As composições dos meios de fermentação e condições de fermentação dependem do organismo de fermentação e podem ser facilmente determinadas por um indivíduo versado na técnica. Tipicamente, a fermentação ocorre mediante condições conhecidas como sendo adequadas para gerar o produto de fermentação. Em algumas modalidades, o processo de fermentação é realizado mediante condições aeróbicas ou microaerofílicas (isto é, em que a concentração de oxigênio é menor que aquela no ar), ou condições anaeróbicas. Em algumas modalidades, fermentação é conduzida mediante condições anaeróbicas (isto é, nenhum oxigênio detectável), ou menor que cerca de 5, cerca de 2,5, ou cerca de 1 mmol/l/h de oxigênio. Na ausência de oxigênio, o NADH produzido em glicólise não pode ser oxidado por fosforilação oxidativa. Mediante condições anaeróbicas, piruvato ou um derivado do mesmo pode ser utilizado pela célula hospedeira como um receptor de hidrogênio e elétron a fim de gerar NAD+.

[0277] O processo de fermentação é tipicamente realizado em uma temperatura que é ideal para a célula fúngica recombinante. Por exemplo, em algumas modalidades, o processo de fermentação é realizado em uma temperatura na faixa de cerca de 25 “*C a cerca de 42ºC.

Tipicamente, o processo é realizado em uma temperatura que é menor que cerca de 38 ºC, menor que cerca de 35 ºC, menor que cerca de 33 ºC, ou menor que cerca de 38 ºC, mas pelo menos cerca de 20 ºC, 22 ºC, ou 25ºC.

[0278] Um estimulador de fermentação pode ser usado em um processo descrito no presente documento para melhorar ainda a fermentação, e em particular, o desempenho do organismo de fermentação, como, aperfeiçoamento de taxa e rendimento de produto (por exemplo, rendimento de etanol). Um "estimulador da fermentação" se refere a estimuladores do crescimento dos organismos fermentadores, em particular levedura. Estimuladores da fermentação preferenciais para crescimento incluem vitaminas e minerais. Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inosito|, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzoico, ácido fólico, riboflavina e Vitaminas A, B/ C, De E. Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é deste modo incorporado a título de referência. Exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem fornecer nutrientes compreendendo P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn, e Cu.

[0279] O produto de fermentação, isto é, etanol, pode ser opcionalmente recuperado do meio de fermentação usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo mas não se limitando a cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação, ou extração. Por exemplo, o álcool é separado do material celulósico fermentado e purificado por métodos convencionais de destilação. Pode ser obtido etanol com uma pureza até cerca de 96% por volume, que pode ser usado como, por exemplo, etanol para combustível, etanol potável, isto é, bebidas alcoólicas neutras potáveis, ou etanol industrial.

[0280] Em alguns aspectos dos métodos, o etanol após que é recuperado é substancialmente puro. Em relação aos métodos de produzir etanol, "substancialmente puro" se destina a preparação recuperada que contém não mais de 15% de impureza, em que impureza se refere a outros compostos além de etanol. Em uma variação, é fornecida uma preparação substancialmente pura em que a preparação contém não mais do que 25% de impurezas, ou não mais do que 20% de impurezas, ou não mais do que 10% de impurezas, ou não mais do que 5% de impurezas, ou não mais do que 3% de impurezas, ou não mais do que 1% de impurezas ou não mais do que 0,5% de impurezas.

[0281] Em algumas modalidades dos métodos descritos no presente documento, a etapa de fermentação (b) consome uma quantidade aumentada de glicose e pentose (por exemplo, xilose) em comparação com fermentação com o uso de uma célula idêntica sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose mediante as mesmas condições (por exemplo, em cerca de ou após 40 horas de fermentação, como as condições descritas no Exemplo 3).

[0282] Em uma modalidade dos métodos descritos no presente documento, mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de xilose no meio é consumida em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 4).

[0283] Em uma modalidade dos métodos descritos no presente documento, mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de glicose no meio é consumida em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 4).

[0284] Em uma modalidade dos métodos descritos no presente documento, mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de pentose (por exemplo, xilose) no meio é consumida, e mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de glicose no meio é consumida, em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 4).

[0285] Em algumas modalidades dos métodos descritos no presente documento, a fermentação da etapa (b) fornece maior produção de etanol em comparação com fermentação com o uso de uma célula idêntica sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose mediante as mesmas condições (por exemplo, em cerca de ou após 40 horas de fermentação, como as condições descritas no Exemplo 3).

[0286] Ensaios adequados para testar a produção de etanol e contaminantes, e consumo de açúcar podem ser realizados com o uso de métodos conhecido na técnica. Por exemplo, produto de etanol, bem como outros compostos orgânicos, podem ser analisados por métodos como HPLC (Cromatografia Líquida de Alto Desempenho), GC-MS (Espectroscopia de Massa de Cromatografia a Gás) e LC-MS (Espectroscopia de Massa de Cromatografia Líquida) ou outros métodos analíticos adequados com o uso de procedimentos de rotina bem conhecidos na técnica. A liberação de etanol no caldo de fermentação também pode ser testada com o sobrenadante de cultura. Subprodutos e açúcar residual no meio de fermentação (por exemplo, glicose ou xilose) podem ser quantificados por HPLC com o uso de, por exemplo, um detector de índice refratário para glicose e álcoois, e um detector de UV para ácidos orgânicos (Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775 -779 (2005)), ou usando outros ensaios e métodos de detecção adequados bem conhecidos na técnica.

[0287] A invenção pode ainda ser descritas nos parágrafos numerados a seguir:

[0288] Parágrafo [1]. Uma célula de levedura recombinante que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose, em que o transportador tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2; e em que a célula de levedura tem capacidade de fermentar xilose.

[0289] Parágrafo [2]. A célula recombinante do parágrafo [1], em que o polinucleotídeo heterólogo codifica um transportador de hexose que difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em não mais de cinco aminoácidos, em não mais de quatro aminoácidos, em não mais de três aminoácidos, em não mais de dois aminoácidos, ou em um aminoácido da SEQ ID NO: 2.

[0290] Parágrafo [3]. A célula recombinante do parágrafo [1], em que o polinucleotídeo heterólogo codifica um transportador de hexose que têm uma sequência de aminoácidos que compreende ou que na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0291] Parágrafo [4]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1]-[3], em que o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose compreende uma sequência de codificação que têm pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1.

[0292] Parágrafo [5]. A célula recombinante do parágrafo [4], em que o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose tem uma sequência de codificação que consiste em SEQ ID NO: 1.

[0293] Parágrafo [6]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1]-[5], em que o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose compreende uma sequência de codificação que hibridiza mediante pelo menos condições de estringência baixa, por exemplo, condições de alta estringência de meio, condições de estringência média- alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com o filamento complementar de comprimento total de SEQ ID NO: 1.

[0294] “Parágrafo [7]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos das reivindicações [1] a [6], que compreende ainda um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma sequência de codificação de xilose isomerase.

[0295] Parágrafo [8]. A célula recombinante do parágrafo [7], em que a sequência de codificação de xilose isomerase tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 18.

[0296] Parágrafo [9]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1] a [8], em que a cepa tem uma taxa maior de crescimento anaeróbico em uma pentose (por exemplo, xilose) em comparação com a mesma célula sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose em cerca de ou após 4 dias de incubação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 2).

[0297] — Parágrafo [10]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1] a [9], em que a cepa tem um consumo de pentose maior (por exemplo, xilose) em comparação com a mesma célula sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose em cerca de ou após 40 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 3).

[0298] Parágrafo [11]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1] a [10], em que a cepa tem uma maior produção de etanol em comparação com a mesma célula sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose em cerca de ou após 40 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 3).

[0299] Parágrafo [12]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1] a [11], que compreende ainda um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma xilulocinase (XK).

[0300] Parágrafo [13]. A célula recombinante do parágrafo

[12], em que a xilulocinase (XK) é a Saccharomyces cerevisiae XK, ou uma XK que têm pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 22.

[0301] Parágrafo [14]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1] a [13] que compreende ainda um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma ribulose 5 fosfato 3-epimerase (RPE1).

[0302] Parágrafo [15]. A célula recombinante do parágrafo

[14], em que a ribulose 5 fosfato 3-epimerase (RPE1) é uma RPE1 de Saccharomyces cerevisiae, ou uma RPE1 que têm pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para a RPE1 de Saccharomyces cerevisiae.

[0303] Parágrafo [16]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1] a [15] que compreende ainda um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma ribulose 5 fosfato isomerase (RKI1).

[0304] Parágrafo [17]. A célula recombinante do parágrafo

[16], em que a ribulose 5 fosfato isomerase (RKI1) é uma RKI1 de Saccharomyces cerevisiae, ou uma RKI1 que têm pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para a RKI1 de Saccharomyces cerevisiae.

[0305] Parágrafo [18]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1] a [17], que compreende ainda um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma transcetolase (TKL1).

[0306] Parágrafo [19]. A célula recombinante do parágrafo

[18], em que a transcetolase (TKL1) é uma TKL1 de Saccharomyces cerevisiae, ou uma TKL1 que têm pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma TKL1 de Saccharomyces cerevisiae.

[0307] Parágrafo [20]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1] a [19], que compreende ainda um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma transaldolase (TAL1).

[0308] Parágrafo [21]. A célula recombinante do parágrafo

[20], em que a transaldolase (TAL1I1) é uma TAL1I de Saccharomyces cerevisiae, ou uma TAL1 que têm pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma TAL1 de Saccharomyces cerevisiae.

[0309] Parágrafo [22]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1] a [21], compreende ainda uma ruptura para um gene endógeno que codifica uma glicerol 3-fosfato desidrogenase (GPD).

[0310] Parágrafo [23]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1] a [23], compreende ainda uma ruptura para um gene endógeno que codifica uma glicerol 3-fosfatase (GPP).

[0311] Parágrafo [24]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1]a [23], que é uma célula de Saccharomyces, Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Rhodosporidium, Candida, Yarrowia, Lipomyces, Cryptococcus, ou Dekkera sp..

[0312] Parágrafo [25]. A célula recombinante de qualquer um dos objetivos de parágrafos [1] a [24], que é uma célula de Saccharomyces cerevisiae.

[0313] Parágrafo [26]. A célula recombinante do parágrafo

[25], em que a Saccharomyces cerevisiae é um derivado de uma cepa de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositada sob Acessão No. NRRL Y-50973 no Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 U.S.A.).

[0314] Parágrafo [27]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1] a [26], em que a célula tem capacidade de consumir mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de pentose (por exemplo, xilose) no meio em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 4).

[0315] Parágrafo [28]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1] a [27], em que a célula tem capacidade de consumir mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de glicose no meio em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 4).

[0316] Parágrafo [29]. A célula recombinante de qualquer um dos parágrafos [1] a [28], em que a célula tem capacidade de consumir mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de pentose (por exemplo, xilose) no meio, e tem capacidade de consumir mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de glicose no meio, em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 4).

[0317] Parágrafo [30]. Um processo para produzir etanol, que compreende cultivar a célula recombinante, de qualquer um dos parágrafos

[1] a [29], em um meio fermentável sob condições adequadas para produzir etanol.

[0318] Parágrafo [31]. O processo do parágrafo [30], em que cultivo é conduzido mediante condições de baixo oxigênio (por exemplo, anaeróbico).

[0319] Parágrafo [32]. O processo do parágrafo [31] ou [32], em que uma quantidade aumentada de glicose e pentose (por exemplo, xilose) é consumida em comparação com o processo com o uso de uma célula idêntica sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose mediante as mesmas condições (por exemplo, em cerca de ou após 40 horas de fermentação, como as condições descritas no Exemplo 3).

[0320] Parágrafo [33]. O processo de qualquer um dos parágrafos [30] a [32], em que mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de pentose (por exemplo, xilose) no meio é consumida, e mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de glicose no meio é consumida, em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, mediante condições descritas no Exemplo 4).

[0321] Parágrafo [34]. O processo de qualquer um dos parágrafos [30] a [33], em que os processos resultam em maior produção de etanol em comparação com o processo com o uso de uma célula idêntica sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose mediante as mesmas condições (por exemplo, em cerca de ou após 40 horas de fermentação, como as condições descritas no Exemplo 3).

[0322] Parágrafo [35]. O processo de qualquer um dos parágrafos [30] a [34], que compreende recuperar o produto de fermentação da fermentação.

[0323] Parágrafo [36]. O processo de qualquer um dos parágrafos [30] a [35], que compreende sacarificação de um material celulósico e/ou que contém amido com uma composição de enzima para produzir o meio fermentável.

[0324] Parágrafo [37]. O processo do parágrafo [36], em que sacarificação ocorre em um material celulósico, e em que o material celulósico é pré-tratado.

[0325] Parágrafo [38]. O processo do parágrafo [37], em que o pré-tratamento é um pré-tratamento de ácido diluído.

[0326] Parágrafo [39]. O processo de qualquer um dos parágrafos [36] a [38], em que sacarificação ocorre em um material celulósico, e em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas a partir de uma celulase, um polipeptídeo AA9, uma hemicelulase, uma CIP, uma esterase, uma expansina, uma enzima ligninolítica, uma oxirredutase, uma pectinase, uma protease, e uma swollenina.

[0327] Parágrafo [40]. O processo do parágrafo [39], em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas a partir de uma endoglucanase, uma celobio-hidrolase, e uma beta-glucosidase.

[0328] Parágrafo [41]. O processo do parágrafo [39] ou [40], em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas a partir de uma xilanase, uma acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase.

[0329] Parágrafo [42]. O processo de qualquer um dos parágrafos [36] a [41], em que fermentação e sacarificação são realizadas simultaneamente um uma sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

[0330] Parágrafo [43] O processo de qualquer um dos parágrafos [36] a [41], em que fermentação e sacarificação são realizadas sequencialmente (SHF).

[0331] Ainvenção descrita e reivindicada aqui não é para ser limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, uma vez que estes aspectos são pretendidos como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, diversas modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas no presente documento se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica da descrição supracitada. Tais modificações também se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação incluindo definições prevalecerá.

[0332] Diversas referências são citadas no presente documento, cujas revelações são incorporadas a título de referência em suas totalidades.

Exemplos

[0333] Os produtos químicos usados como tampões e substratos foram produtos comerciais pelo menos de grau reagente. Cepas

[0334] Ethanol Redº é uma cepa de S. cerevisiae industrial usada em toda a indústria de biocombustível e foi esporolada de acordo com o método de Herskowitz (1988) para gerar haploides. Um dos haploides, YGTAO, foi usado como um modelo para amplificação de PCR do promotor TEF1 (PreF1-Sc), gene hxt2 e sequências de terminador de TIP1 (TriP1).

[0335] Acepade 85. cerevisiae JG169 (WO2008/008967) foi usada como um modelo para amplificação dos flancos esquerdo e direito em plasmídeo pFYD1092.

[0336] A cepa de S. cerevisiae FYD853 (Consulte WOZ2016/045569, cepa CIBTS1260) é uma cepa geneticamente modificada que expressa sequência de codificação de xilose isomerase usada como um modelo para amplificação dos flancos esquerdo e direito em plasmídeo pFYD1497 e como hospedeiro para expressão de HXT2.

[0337] Acepade Ss. cerevisiae CIBTS1260 foi depositada por

Novozymes A/S sob os termos do Tratado de Budapeste com o Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 U.S.A.) e atribuído o seguinte número de acesso: Depósito Número de Acesso Data de Depósito CIBTS1260 NRRL Y-50973 5 de setembro de 2014

[0338] AcepasS. cerevisiae MBG4982 foi produzida a partir de S. cerevisiae FYD853 com o uso de métodos similares àqueles descritos no documento WOZ2005/121337 correlacionando-se haploides que tem capacidade de crescimento anaeróbico em meio mínimo de xilose com haploides complementares derivados de uma cultura a longo prazo de levedura selecionada para sua resistência a inibidores constatados em hidrolisados celulósicos. As cepas híbridas foram esporoladas e haploides germinaram em meio mínimo de xilose mediante condições anaeróbicas. Uma cultura cruzada de massa foi produzida a partir desses haploides e submetida a diversos rodadas de seleção para a capacidade crescer em xilose e a capacidade de tolerar hidrolisados. Após a seleção, MBG4982 foi identificado com base na capacidade de fermentar xilose e tolerar os inibidores em meio hidrolisado.

Meios e Soluções

[0339] Meio de LB+amp foi composto por 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl, água desionizada para 1 | e 100 mg/l de ampicilina. Para placas de ágar de LB+amp, 15 g/| de ágar bacto foi usado e a concentração de ampicilina foi aumentada em 150 mg/l.

[0340] Meio de YPD foi composto por 10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona, 20 g de glicose e água desionizada para 1 |. Para placas, 20 g/I| de ágar bacto foi usado e higromicina B foi adicionada a 200 mg/l quando apropriado.

[0341] Meio de 2xYPD foi composto por 20 g de extrato de levedura, 40 g de peptona, 40 g de glicose e água desionizada para 1 |.

[0342] 1M de tampão de K2HPO;, foi composto por 228,23 g de K2HPO, x 3 H2O e água desionizada para 1 |.

[0343] 1M de tampão de KH2PO;, foi composto por 136,09 g de KH2PO, e água desionizada para 1 |.

[0344] 1Mde tampão de fosfato (pH = 6,0) foi composto por 132 ml de 1 M de K2HPO, e 868 ml! de 1 M de KH2PO..

[0345] Meio de SD2 foi composto por 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 100 ml de 1 M de tampão de fosfato (pH = 6,0), 20 g de glicose e água desionizada para 1 |. Para placas, 20 g/I de ágar bacto foi adicionado.

[0346] Meio de SX2 foi composto por 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 100 ml de 1 M de tampão de fosfato (pH = 6,0), 20 g de xilose (BioUltra, Sigma-Aldrich) e água desionizada par a1 |. Para placas, 20 g/| de ágar bacto foi adicionado.

[0347] Meio de SX2.5 foi composto por 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 100 ml de 1 M de tampão de fosfato (pH = 6,0), 25 g de xilose (BioUltra, Sigma-Aldrich) e água desionizada para

11.

[0348] Meiode SD5X2.5 foi composto por 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 100 ml de 1 M de tampão de fosfato (pH = 6,0), 50 g de glicose, 25 g de xilose (BioUltra, Sigma-Aldrich) e água desionizada para 1 |.

[0349] Meio de SX1/SD1 foi composto 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 100 ml de 1 M de tampão de fosfato (pH = 6,0), 10 g de glicose, 10 g de xilose (BioUltra, Sigma-Aldrich) e água desionizada para 1 |.

[0350] Meio de SX6 foi composto 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 100 ml de 1 M de tampão de fosfato (pH = 6,0), 60 g de xilose (BioUltra, Sigma-Aldrich) e água desionizada para 1 |.

[0351] Meio de SD6 foi composto 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 100 ml de 1 M de tampão de fosfato (pH = 6,0), 60 g de glicose (BioUltra, Sigma-Aldrich) e água desionizada para 1 |.

[0352] Meio de SX3/SD3 foi composto 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 100 ml de 1 M de tampão de fosfato (pH = 6,0), 30 g de glicose, 30 g de xilose (BioUltra, Sigma-Aldrich) e água desionizada para 1 |.

[0353] Tampão de TBE foi composto por 10,8 g de base Tris, 5,5 g de ácido bórico, 4 m! de 0,5 M de EDTA, pH = 8,0, e água desionizada para 11. Tabela 1. Sequências de iniciador Identificador Sequência (5 > 3') SEQ

ID

NO OY796 ACATTATACGAAGTTATTTAATTAACATATA | 4 Cn momento o | OY1476 ATTCAGACATTTTGTAATTAAAACTTAGATT | 5

AGATTGCTATGC M OY1477 TAATTACAAAATGTCTGAATTCGCTACTAG vcs OY1478 AGGTTCCCTTTTATTCCTCGGAAACTCOTTT 7 A meme | | OY1479 CGAGGAATAAAAGGGAACCTTTTACAACA me o ||

OY1481 CGTCAAGGCCGCATGCGGCCGCGGAATA Cn loreemeramee OY1482 TGCTATACGAAGTTATGTTTAAACCTAAAC | 10 ne hwemescameo OY1483 AATATGGGCGCGATCGCTAAGTACAGACG | 11 Ps Oo OY1484 CCCATGAGGCCCAGGGCGCGCCCTACAG | 12 nr eme OY1485 TTAGCGATCGCGCCCATATTTAGCTCGTTT | 13 ce MH OY2357 TGCTATACGAAGTTATGTTTAAACCTAAMAC | 15 Cn leegaeo O0Y2394 TGATCTGCAGTAGAATCAGTGG 1222570 TAGACGCAGTACAAGGACGC XII-2 externo | TGCAATTCAATAAATGGGATGTGATTG 25 quais PCT CSOrAAtA E XII-2 externo | GAGCGAACGTAAGAGAGGTTAATGTCCTC | 26

EPA A 1220142 GATGATCGAGCCGGTAGTTAAC 1221475 GCCATTAGTAGTGTACTCAAACGAATTATT | 31 o M 1221471 TCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTIT | 32 O feMeem

1221756 TAGCGTGTTACGCACCCAAAC 1221473 ACAGAAGACGGGAGACACTAGC 1221470 TTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAACT | 35 Cs Mm 1221746 AGTTGATTGTATGCTTGGTATAGCTTGAAA | 36 TATTG [ 1221754 TGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAGATAAT | 37 CC o memeementetere o) | 1221472 TTTGTTTTTTGTTTTCTTCTAATTGATTTITT | 38 A meme o | Protocolo de HPLC

[0354] O teor de acetato, glicose, xilose, glicerol e etanol foi determinado por meio de um Alliance 2695 HPLC (Waters Corp.) com Waters 2414 RI detector (Waters Corp.) e controlado por Empower'" 3 software (Waters Corp.). Ajustes instrumentais estão listados na Tabela 2 abaixo. Tabela 2. Ajustes de instrumento de HPLC usados para analisar amostras nos exemplos a seguir. Coluna Ácido H+ Rezex ROA- ag Dimensões de 300 x 7,8 mm ão [O Tamanho de 8 um peso [| Proteção SecurityGuard'Y Carbo- Co ga Dimensões de 4x3,0 mm ao [O

Fabricante Phenomenex Volume de 10 ul mo Tempo de 25 min. anão Exemplo 1: Construção de cepa de levedura FYD1547

[0355] Esse exemplo descreve a construção de cepa de levedura FYD1547 que expressa uma sequência de codificação de xilose isomerase, também contendo uma cópia do gene hxt2 (que compreende a sequência de codificação de SEQ ID NO: 1, que codifica o transportador de hexose 2 de SEQ ID NO: 2), sob o controle do promotor TEF1 (PrerF1-Sc) integrado ao loco de CHR XI-1 no genoma FYD1547.

[0356] Plasmídeo pFYD1090 (Figura 1; SEQ ID NO: 19), que contém um marcador de resistência de higromicina (hph) e flancos para ruptura do gene GAL71, foi ordenado como um gene sintético de GeneArt (Thermo Fisher Scientific).

[0357] A primeira etapa de clonagem foi substituir as regiões de homologia “GAL1 a montante" e "GAL1 a jusante" em pFYD1090 (Figura 1; SEQ ID NO: 19) com as regiões de flanqueamento 5' CHR XI-1 e 3' CHR Xl-1 em pFYD1090 e inserir o promotor TEF1 (Prer1-Sc), gene hxt2 e terminador TIP1 (Trip1) para gerar pFYD1092. As regiões de homologia GAL 1 a montante e a jusante junto com locais de restrição adicionais e flanquamento de DNA para clonagem foram amplificadas com os conjuntos de iniciador OY1481+O0Y1482 e OY1483+OY1484, respectivamente.

As reações de amplificação foram realizadas com o uso de Phusionº DNA Polimerase Hot Start Flex (New England Biolabs) de acordo com as Instruções do fabricante.

Cada PCR para as regiões de GAL1 a montante e a jusante foi composto por 1 ul de uma preparação genômica de JG169 DNA, tampão 1xHF, 200 uM de cada dNTP, 500 nM de iniciador anterior, 500 nM de iniciador reverso e 1 unidade de Phusionº DNA Polimerase Hot Start Flex.

O promotor TEF1 (Prer1-Sc), gene hxt2 e terminador TIP1 (Trie1) junto com flanqueamento adicional de DNA para clonagem foram amplificados com os conjuntos de iniciador OY796+O0Y1476, OY147/7+0Y1478 e OY1479+O0Y1485, respectivamente.

As reações de amplificação foram realizadas com o uso de Phusionº Hot Start Flex DNA Polymerase (New England Biolabs) de acordo com as Instruções do fabricante.

Cada PCR foi composto por 1 ul de uma preparação genômica de YGT40 DNA, tampão 1xHF, 200 uM de cada dNTP, 500 nM de iniciador anterior, 500 nM de iniciador reverso e 1 unidade de Phusionº DNA Polimerase Hot Start Flex.

As reações foram incubadas em um Bio-Rad C1000 Touch!“ Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories) programado para 1 ciclo a 98 ºC por 3 minutos; 35 ciclos, cada, a 98 ºC por 10 segundos, 55 ºC por 30 segundos e 72 ºC por 1,5 minuto; e um ciclo a 72 ºC por 5 minutos.

Após a termociclagem, os produtos de PCR foram separados por 1% de eletroforese de gel de agarose em tampão de TBE e as bandas (569 bp, 603 bp, 557 bp, 1646 bp e 331 bp) que correspondem aos produtos de PCR diferentes (GAL 1 a montante, GAL 1 a jusante, PreF1-Sc, hxt2 e Tn, respectivamente) foram excisados do gel e purificados com o uso de um Kit de Purificação de Banda de Gel e DNA de PCR de GFX ilustra (GE Healthcare Life Sciences) de acordo com as Instruções do fabricante.

O plasmídeo pFY D1090 foi digerido com Ascil/Notl- HF/Pacl/Pmel e as bandas de digestão de enzima de restrição foram separadas por 1% de eletroforese de gel de agarose em tampão de TBE. O fragmento 2349 bp Ascl/Notl que corresponde à estrutura principal de plasmídeo e o fragmento 1781 bp Pacl/Pmel que corresponde ao cassete de resistência de higromicina foram excisados do gel e purificados com o uso de um Kit de Purificação de Banda de Gel e DNA de PCR de GFX ilustra (GE Healthcare Life Sciences) de acordo com as Instruções do fabricante. Os dois fragmentos de digestão de enzima de restrição e os produtos de PCR foram unidos com o uso de um In-Fusionº HD EcoDry"Y Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.) em um volume total de 10 ul de composto por 45 ng do fragmento 2349 bp Ascl/Notl pFYD1090, 68 ng do fragmento 1781 bp Pacl/Pmel, 21 ng de produto de PCR PrerF1-Sc, 63 ng de produto de PCR de hxt2 e 13 ng de produto de PCR de Tr1. A reação foi incubada a 37 ºC por minutos, 50 ºC por 15 minutos e, então, colocada no gelo. A reação foi usada para transformar Células Competentes Stellar'V (Clontech Laboratories, Inc.) de acordo com as Instruções do fabricante. A reação de transformação foi espalhada em duas placas de LB+amp e incubada a 37 ºC de um dia para o outro. As colônias transformadoras putativas foram isoladas das placas de seleção e DNA de plasmídeo foi preparado de cada um com o uso de um QlAprep 96 Turbo Kit (Qiagen) e varridas para inserção apropriada dos fragmentos por digestão com Pvull. Um plasmídeo que produz os tamanhos de banda desejados foi confirmado como estando correto por sequenciamento de DNA e pFYD1092 designado (Figura 2; SEQ ID NO: 20).

[0358] Para garantir integração correta do cassete de expressão de hxt2 em FYD853, plasmídeo pFYD1497 (Figura 3; SEQ ID NO: 21) foi preparado trocando-se as regiões de flanqueamento 5' CHR XI-1 e 3' CHR XI-1 de JG169 em pFYD1092 (supra) pelas regiões correspondentes de FYD853. As regiões de flanqueamento 5' CHR XI-1 e 3' CHR XI-1 junto com locais de restrição adicionais e flanqueamento de DNA para clonagem foram amplificadas com os conjuntos de iniciador OY1481+0Y2357 e OY1483+OY1484, respectivamente.

As reações de amplificação foram realizadas com o uso de Phusionº DNA Polimerase Hot Start Flex (New England Biolabs) de acordo com as Instruções do fabricante.

Cada PCR para as regiões de flanqueamento 5' CHR XI-1 e 3' CHR XI-1 foi composto por 1 pl de uma preparação de DNA genômico de FYD853, tampão 1xHF, 200 uM de cada dNTP, 500 nM de iniciador anterior, 500 nM de iniciador reverso e 1 unidade de Phusionº DNA Polimerase Hot Start Flex.

As reações foram incubadas em um Bio-Rad C1000 Touch!" Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories) programado para 1 ciclo a 98 ºC por 30 segundos; 30 ciclos, cada, a 98 ºC por 10 segundos, 55 ºC por 30 segundos e 72 ºC por 2 minuto; e um ciclo a 72 ºC por 10 minutos.

Após a termociclagem, os produtos de PCR foram separados por 1 % de eletroforese de gel de agarose em tampão de TBE e as bandas (561 bp e 598 bp) que correspondem às regiões de flanqueamento 5' CHR XI-1 e 3' CHR XI-1 foram excisados do gel e purificados com o uso de um Kit de Purificação de Banda de Gel e DNA de PCR de GFX ilustra (GE Healthcare Life Sciences) de acordo com as Instruções do fabricante.

O plasmídeo pFYD1092 foi digerido com Ascl/AsiS|/Notl-HF/Pmel e as bandas de digestão de enzima de restrição foram separadas por 1 % de eletroforese de gel de agarose em tampão de TBE.

O fragmento 2349 bp Ascl/Notl que corresponde à estrutura principal de plasmídeo e o fragmento 4227 bp AsiSI/Pmel que corresponde ao cassete de resistência de higromicina e ao cassete de expressão de hxt2 foram excisados do gel e purificados com o uso de um Kit de Purificação de Banda de Gel e DNA de PCR de GFX ilustra (GE Healthcare Life Sciences) de acordo com as Instruções do fabricante.

Os dois fragmentos de digestão de enzima de restrição e os produtos de PCR foram unidos com o uso de um Kit de Clonagem In-Fusionº HD EcoDry"Y (Clontech Laboratories, Inc.) em um volume total de 10 ul composto por 57 ng do fragmento 2349 bp Ascl/Notl pFYD1092, 207 ng do fragmento 4227 bp AsiSI/Pmel, 27 ng do produto de PCR 5' CHR XI-1 e 29 ng do produto de PCR 3' CHR XI-1. A reação foi incubada a 37 ºC por 15 minutos, 50 ºC por 15 minutos e, então, colocada no gelo. A reação foi usada para transformar Células Competentes Stellar! (Clontech Laboratories, Inc.) de acordo com as Instruções do fabricante. À reação de transformação foi espalhada em duas placas de LB+amp e incubada a 37 “C de um dia para o outro. As colônias transformadoras putativas foram isoladas das placas de seleção e DNA de plasmídeo foi preparado de cada um com o uso de um QlAprep 96 Turbo Kit (Qiagen) e varridas para inserção apropriada dos fragmentos por digestão com Hindlll- HF/Pmll. Um plasmídeo que abriga os tamanhos de banda desejados foi confirmado como estando correto por sequenciamento de DNA e pFYD1497 designado (Figura 3; SEQ ID NO: 21).

[0359] As células FYD853 competentes foram preparadas de acordo com o protocolo descrito em Gietz & Schiestl (2008), exceto pelo fato de que meio de 2xYPD foi usado em vez de meio de 2xYPAD. O plasmídeo pFYD1497 foi digerido com Notl-HF e Ascl e aproximadamente 2 ug de DNA foi usado para transformar células de FYD853 competentes. Após a transformação, as células foram peletizadas a 15.000 x g por 30 segundos. As células foram novamente suspensas em 1 ml de meio 2xYPD e incubadas a 30 ºC em um termomisturador com agitação por 4,5 horas. As células foram espalhadas em placas de higromicina YPD+200 ug/ml (200 ul de células foram espalhadas por placa) e incubadas a 30 ºC por dois dias. Os transformantes putativos foram infiltrados em novas placas de higromicina de YPD+200 ug/ml e incubados a 30 ºC por três dias. Os transformadores foram varridos para integração correta do cassete de expressão de hxt2 por PCR com o uso de conjuntos de iniciador OY2394+OY474 (verificação de flanco

5' CHR XI-1) e OY1492+0Y2395 (verificação de flanco 3' CHR XI-1). As reações de amplificação foram realizadas com o uso de um Misturador Phire Plant Direct PCR Master (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as Instruções do fabricante e transformadores corretos deveriam produzir uma banda de 1094 bp para o PCR de OY2394+OY474 5' CHR X|-1 e uma banda de 795 bp para o PCR de OY1492+0Y2395 3' CHR XlI-1. Quatro transformadores com os tamanhos de amplicon desejados foram salvos para teste futuro e referenciados como FYD1547t1-4. Exemplo 2: Avaliação de crescimento anaeróbico de cepas geneticamente modificadas que compreendem um polinucleotídeo heterólogo que expressa HXT2

[0360] A fim de testar utiização de xilose e crescimento anaeróbico, a cepa de FYD853 e os transformadores de FYD1547 (*t1-4) do Exemplo 1 foram infiltrados em placas de ágar de YPD frescas e incubados a 30 ºC por 2 dias. Culturas de YDP de 5 ml independentes foram preparadas para 4 colônias de FYD853 e para 1 colônia de cada um dos candidatos de cepa de FYD1547 e incubadas de um dia para o outro com agitação a 30 ºC. No dia seguinte, células de 1 ml de cultura de YPD de um dia para o outro foram coletadas por centrifugação (7.000x g por 3 minutos) e novamente suspensas em 1 ml de meio SX2.5. A densidade óptica a 600 nm (ODsoonm) foi registrada para cada uma das suspensões de célula e 15 ml de meio SX2.5 foram inoculados para ODgeoonm = 0,1. Diluições em série de dez dobras foram preparadas a partir de cada uma das suspensões de célula até ODçoonm = 0,0001 (1.000x diluição) e 2 ul de cada diluição incl. O ODgeoonm = 0,1 de matéria foi manchado em placas de ágar de SD2 e SX2. Uma vez que o líquido foi absorvido, as placas foram colocadas em recipientes plásticos vedados junto com sachês Oxoid'Y AnaeroGen'"Y de 2,5 | e indicadores anaeróbicos Oxoid'Y Resazurin (Thermo Scientific, Oxoid Microbiology

Products) e incubadas a 30 ºC. Os recipientes foram inspecionados todos os dias para garantir que as condições permaneceram anaeróbicas. Imagens foram feitas das placas nos dias 4, 5, 6 e 7. Uma vez que as imagens foram feitas, as placas foram imediatamente colocadas nos recipientes plásticos e novos sachês Oxoid'M AnaeroGen'Y de 2,5 | e indicadores anaeróbicos Oxoid'!M Resazurin (Thermo Scientific, Oxoid Microbiology Products) foram adicionados e a incubação foi finalizada a 30 ºC.

[0361] Como mostrado na Figura 4, a expressão constitutiva do transportador de HXT2 em FYD1547 aumentou amplamente a utilização de xilose e crescimento dos isolados de FYD1547 em comparação com a cepa FYD853 parental (ausência do cassete de expressão hxt2). No dia 5, os isolados de FYD1547 demonstraram crescimento significativo enquanto os de FYD853 mostraram muito pouco crescimento. No dia 7, três dos isolados de FYD1547 formaram colônias grandes em todos os locais da série de diluições enquanto a cepa de FYD853, em geral, apenas mostrou crescimento visível nos locais das duas primeiras diluições.

Exemplo 3: Avaliação de utilização de xilose anaeróbica de cepas geneticamente modificadas que compreendem um polinucleotídeo heterólogo que expressa HXT2

[0362] Para testar como a expressão constitutiva do transportador de HXT2 pode afetar a utilização de xilose em cultura líquida mediante condições anaeróbicas, a cepa de FYD853 e os isolados de FYD1547 (tt1-4) foram infiltrados em placas de ágar de YPD e incubados a ºC por 2 dias. Culturas de YDP de 5 ml independentes foram preparadas para 4 colônias de FYD853 e para 1 colônia de cada um dos isolados de FYD1547 e incubadas de um dia para o outro com agitação a 30 ºC. No dia seguinte, células de 1 ml de cultura de YPD de um dia para o outro foram coletadas por centrifugação (7.000x g por 3 minutos) e novamente suspensas em 1 ml de meio SX2.5. A densidade óptica a 600 nm (ODgoonm) foi registrada para cada uma das suspensões de célula e 15 ml de meio SX2.5 foram inoculados para ODçoonm = 0,1. Para cada isolado, 4 seringas de BD Plastipak"" Plastic Concentric Luer-Lock de 50 ml (Fisher Scientific) que contêm 3 ml de suspensão de célula de SX2.5 foram preparadas. Antes de cada inoculação, o pistão de cada seringa foi removido e 3 ml de suspensão de célula de SX2.5 foram adicionados. O pistão foi, então, cuidadosamente inserido novamente e ar residual foi removido pressionando-se o êmbolo até que um menisco de líquido fosse visível na ponta da seringa. A seringa foi, então, vedada com um plugue Luer-Lock de BD'T“ Combi'“Y (Fisher Scientific). As seringas inoculadas foram incubadas a ºC com 200 rpm de agitação. As amostras foram retiradas para análise de HPLC no início do experimento (O horas) e após 40,6 horas, 52,9 horas e 67,6 horas. Nos pontos de tempo designados, o caldo de cultivo foi filtrado através de uma Unidade de Filtro de Seringa Millex-GP Med de 0.22 um com uma membrana de PES (Merck Millipore) e coletado em um tubo Eppendorf de 1,5 ml. Para análise de HPLC, o caldo de cultura filtrado foi misturado em uma razão de 1:1 com 5 mM de H2SO;. e enviado para análise de HPLC no departamento para Analytical Development em Novozymes A/S, Dinamarca.

[0363] Os resultados da análise de HPLC são mostrados na Tabela 3 abaixo e graficamente na Figura 5. A expressão constitutiva do transportador de HXT2 em FYD1547 melhorou amplamente o consumo de xilose e produção de etanol (EtOH) uma vez que mais de 50 % da xilose foi consumida pelos isolados de FYD1547 por 40,6 horas em comparação com aproximadamente 5 % consumidos para a cepa de FYD853 que não possui o transportador de HXT2 constitutivamente expressado. Os isolados de FYD1547 consumiram toda a xilose ao final do experimento, enquanto 0,6 g/I de xilose (valor médio) foi ainda deixado nas fermentações de FYD853.

Tabela 3. Fermentações de seringa anaeróbicas em meio SX2.5. Cepa Tempo o 40,6 [52,9 |67,6 mo ge PA jo SO [sets [2540 [20571040 [050 FYD853 | Rendimento |- - 0,36 [9/9]* EtoH [9/] o0** Jja478 |6,69 8,47 | FYD1547 | Rendimento 0,36 [9/9]* * Rendimento de EtOH é calculado como g de EtOH por 9g de xilose consumida. **Nenhum EtOH foi detectado. *** Nenhuma xilose foi detectada. Exemplo 4: Avaliação de xilose anaeróbica e utilização de glicose de cepas “geneticamente modificadas que compreendem um polinucleotídeo heterólogo que expressa HXT2

[0364] Para testar como expressão constitutiva do transportador de HXT2 pode afetar utilização de xilose e desempenho de fermentação em um meio líquido que contém glicose e xilose em aproximadamente a mesma razão como espigas de milho pré-tratadas (PCS), um meio sintético que contém 50 g/de | glicose e 25 g/I de xilose foi preparado (que corresponde a aproximadamente 11% de sólidos totais de NREL PCS). A cepa de FYD853 e os isolados de FYD1547 (41-44) foram infiltrados em placas de ágar de YPD frescas e incubadas a 30 ºC por 2 dias.

Culturas de YDP de 5 ml independentes foram preparadas para 4 colônias de FYD853 e para 1 colônia de cada um dos isolados de FYD1547 e incubadas de um dia para o outro com agitação a 30 ºC.

No dia seguinte, células de 1 ml de cultura de YPD de um dia para o outro foram coletadas por centrifugação (7.000x g por 3 minutos) e novamente suspensas em 1 ml de meio SD5X2.5. A densidade óptica a 600 nm (ODeoonm) foi registrada para cada uma das suspensões de célula e 10 ml de meio SD5X2.5 foram inoculados para ODçeoonm = 0,1. Para cada isolado, 4 seringas de BD Plastipak's Plastic Concentric Luer-Lock de 50 ml (Fisher Scientific) que contêm 2 ml de suspensão de célula de SD5X2.5 foram preparadas.

Antes de cada inoculação, o pistão de cada seringa foi removido e 2 ml de suspensão de célula de SD5X2.5 foram adicionados.

O pistão foi, então, cuidadosamente inserido novamente e ar residual foi removido pressionando-se o êmbolo até que um menisco de líquido fosse visível na ponta da seringa.

A seringa foi, então, vedada com um plugue Luer-Lock de BD'TY Combi'“Y (Fisher Scientific). As seringas inoculadas foram incubadas a ºC com 200 rpm de agitação.

As amostras foram retiradas para análise de HPLC no início do experimento (0 horas) e após 19,9 horas, 28,8 horas, 41,6 horas, 52 horas e 66,3 horas.

Nos pontos de tempo designados, o caldo de cultivo foi filtrado através de uma Unidade de Filtro de Seringa Millex-GP Med de 0.22 um com uma membrana de PES (Merck Millipore) e coletado em um tubo Eppendorf de 1,5 ml.

Para ganhar cobertura suficiente das cinéticas de fermentação, apenas 2 dos 4 isolados de cada cepa foram amostrados em 28,8 horas, 41,6 horas, 52 horas e 66,3 horas (em O horas e a 19,9 horas todos os isolados foram amostrados). Para análise de HPLC, o caldo de cultura filtrado foi misturado em uma razão de 1:1 com 5 mM de H2SO, e enviado para análise de HPLC no departamento para Analytical Development em Novozymes A/S, Dinamarca.

[0365] Os resultados da análise de HPLC são mostrados na Tabela 4 abaixo e graficamente na Figura 6. A expressão de HXT2 constitutiva melhorou consumo de xilose nas fermentações SD5X2.5 uma vez que apenas 4,37 g/| de xilose foi deixado nas fermentações de FYD1547 pelo fim do experimento (66,3 horas) em comparação com 8,17 g/| para as fermentações de FYD853.

Tabela 4. Fermentações de seringa anaeróbicas em meio SX2.5.

[essa Temo lhaes [0 T159 Tana Tato Ts Tess | ice lat] — [2300 [22:14 [1792 [1956 [1097 [617 Rendimento 0,35 semana [obama o ógg Gleose 61 Rendimento - 0,35 seo [obama o ggs | * Rendimento de EtOH é calculado como g de EtOH por g de xilose consumida.

**Nenhum EtOH foi detectado.

*** Nenhuma xilose foi detectada.

Exemplo 5: Construção de cepas de levedura McTs1084-1087

[0366] Esse exemplo descreve a construção de cepas de levedura McTs1084, McTs1085, McTs1086 e McTs1087 que expressam uma sequência de codificação de xilose isomerase e contêm uma cópia do gene de hxt2 sob controle do promotor de TEF2 integrado em ambos os XI1I-2 loci na cepa diploide.

[0367] O DNA sintético que contém o flanco de 50 bp 5' para o locus XIl-2, promotor de TEF2 (SEQ ID NO: 50), gene hxt2, terminador TIP1 (SEQ ID NO: 51) e flanco 50bp 3' par ao locus XII-3 foi ordenado como um DNA linear String de ThermoFisher e designado como 17AAPWNP (SEQ ID NO: 29). O DNA sintético foi amplificado por PCR com o uso de acionadores 1222569 e 1222570. A reação de amplificação de PCR foi realizada com o uso de DNA Polimerase PhusionO Hot Start (Thermo Fisher) pelas Instruções do fabricante. Cada PCR foi composto por 5 ng de 17AAPWNP (SEQ ID NO: 29) DNA linear sintético como modelo, 50 pmol de acionador 1225569, 50 pmol de acionador 1225570, 0,1 mM de cada dATP, dGTP, dCTP, dTTP, Tampão 1X Phusion HF , e 2 unidades de DNA Polimerase Phusion Hot Start em um volume final de 50 ul. O PCR foi realizado em um Termociclador T100'Y (Bio-Rad Laboratories, Inc.) programado para um ciclo a 98 ºC por 3 minutos seguido por 10 ciclos, cada, a 98 ºC por 10 segundos, 50 ºC por 20 segundos, e 72 ºC por 2 minutos seguido por 25, cada, a 98 ºC por 10 segundos, 58 ºC por 20 segundos, e 72 ºC por 2 minutos com uma extensão final a 72 ºC por 5 minutos. Após a termociclagem, o produto de reação de PCR de 2,7 kb foi isolado por gel e limpo com o uso do kit de limpeza NucleoSpin Gel e PCR (Machery-Nagel).

[0368] A cepa de levedura S. cerevisiae MBG4982 foi transformada com o DNA de 17AAPWNP amplificado por PCR. Para auxiliar recombinação homóloga do hxt2 que contém cassete no locus XIl-2, um plasmídeo que contém Cas9 e RNA-guia específico para XIl 2 (pMIBa359) foi também usado na transformação. O plasmídeo e DNA de 17AAPWNP amplificado por PCR foram transformados em cepa MBG4982 de S. cerevisiae com o uso de um protocolo de eletroporação de levedura. Os transformadores foram selecionados em YPD+cloNAT para selecionar para transformadores que contêm o plasmídeo pMIBA359 CRISPR/Cas9.

[0369] Para garantir integração correta do cassete de expressão de hxt2 no MBG4982 de locus XlIl-2, PCR através do locus foi realizado. Para gerar DNA de modelo genômico de transformadores, uma colônia foi novamente suspensa em 10 ul de água estéril, então, 40 ul de tampão de Y-lise (Zymo Research) e 2 ul de zimoliase (Zymo Research) foram adicionados. As amostras foram incubadas a 37 ºC por 30 minutos, então, 1 ul das células lisadas foi usado na reação de PCR a seguir. A reação de amplificação de PCR foi realizada com o uso de DNA Polimerase Phusion& Hot Start (Thermo Fisher) pelas Instruções do fabricante. Cada PCR foi composto por 1 ul de células tratadas com zimoliase como modelo de DNA, 50 pmol de acionador XIIl-2 externo anterior, 50 pmol de acionador XIl-2 externo reverso, 0,1 mM de cada dATP, dGTP, dCTP, dTTP, Tampão 1X Phusion HF, e 2 unidades de DNA Polimerase Phusion Hot Start em um volume final de 50 ul. O PCR foi realizado em um Termociclador T1007Y (Bio- Rad Laboratories, Inc.) programado para um ciclo a 98 ºC por 3 minutos seguido por 32 ciclos, cada, a 98 ºC por 10 segundos, 54ºC por 20 segundos, e 72 ºC por 2 minutos com uma extensão final a 72 ºC por 5 minutos. Após a termociclagem, 5 ul de cada reação de PCR foram visualizados em um gel de agarose de 0,7% de TBE com brometo de etídeo. A colônia com o produto de PCR de tamanho correto de 3,8 kb foi Sanger sequenciada com o uso de acionadores 1220142 e 1222570. Quatro isolados que tinham o cassete de integração correta por sequenciamento foram selecionados e denominados McTs1084, McTs1085, McTs1086 e McTs1087.

Exemplo 6: Avaliação de crescimento aeróbico de cepas geneticamente modificadas que compreendem um polinucleotídeo heterólogo que expressa HXT2

[0370] Para avaliar a utiização de xilose em crescimento anaeróbico, as cepas dos Exemplos 1 e 5 foram infiltradas em placas de ágar de YPD frescas e incubadas a 30 ºC por 2 dias. Três ml de culturas de YPD foram preparados para cada cepa, então, 150 ul dessa cultura de YPD inoculada foram adicionados a 10 a 11 poços de uma Microplaca de Poliestireno de Fundo Plano Claro de 96 Poços (Corning). A placa foi cultivada por 3 dias a 32 ºC com agitação a 300 rpm. Uma cópia da placa foi feita inoculando-se 150 ul de YPD fresca em Microplaca Não Tratada de Poliestireno de Fundo Plano Claro com 96 Poços (Corning) com 4 ul da placa anterior. A nova cópia placa foi incubada por 1 dias a 32 ºC com agitação a 300 rpm. Essa placa foi usada para inocular placas de 96 poços que contêm 150 ul de meio com xilose (SX2), glicose (SD2) ou xilose+glicose (SX1/SD1) como a única fonte de carbono. O meio foi dispensado em cada placa com o uso de um sistema robótico Beckman Coulter. Para cada meios, três placas replicadas foram produzidas da mesma maneira. As placas foram incubadas a 32 ºC com agitação a 300 rpm por O h, 21,5 hr, ou 27,5 hr. Em cada ponto no tempo, o crescimento dos poços foi avaliado por OD5s95snm em um leito de placa de Detector Multimodal Beckman Coulter DTX 880.

[0371] A média de poços replicados dentro da placa para cepas de levedura FYD853 e FYD1547 em cada ponto no tempo é mostrada nas Figuras 7 a 9 (para meio SD2, SX1/SD1, e SX2, respectivamente). No meio SX2, a cepa FYD1547 que contém o cassete hxt2 heterólogo tem um crescimento aumentado em relação a sua cepa FYD853 precursora de 18% a 21,5 horas e 11% e 27,5 horas.

[0372] Os resultados para cepas McTs1084-1087 e MBG4982 são mostrados nas Figuras 10 a 12. A faixa média de aprimoramento para os quatro isolados com o cassete hxt2 heterólogo foi 5 a 11% a 21,5 horas e 3,9 a 5,5% a 27,5 horas em relação à cepa MBG4982 precursora. Exemplo 7: Fermentação de cepas geneticamente modificadas que compreende um polinucleotídeo heterólogo que expressa HXT2

[0373] Para avaliar utilização de xilose para etanol produção em fermentações anaeróbicas, cepas foram infiltradas em placas de ágar de YPD frescas e incubadas a 30 ºC por 2 dias. Três ml de culturas de YPD foram preparados para cada cepa, então, 150 ul dessa cultura de YPD inoculada foram adicionados a 10 a 11 poços de uma Microplaca de Poliestireno de Fundo Plano Claro de 96 Poços (Corning). A placa foi cultivada por 3 dias a 32 ºC com agitação a 300 rpm. Uma cópia da placa foi feita inoculando-se 150 ul de YPD fresca em Microplaca Não Tratada de Poliestireno de Fundo Plano Claro com 96 Poços (Corning) com 4 ul da placa anterior. A nova cópia placa foi incubada por 1 dias a 32 “C com agitação a 300 rpm. Essa placa foi usada para inocular placas profundas de 96 poços que contêm 500 ul de meio com 6% de xilose (SX6), 6% de dextrose (SD6) ou xilose+dextrose (SX3/SD3) como a única fonte de carbono. O meio foi dispensado em cada placa com o uso de um sistema robótico Beckman Coulter. As placas foram cobertas com uma cobertura sanduíche de liberação de CO> (Enzyscreen), presas e incubadas a 32 ºC a 50 hr sem agitação. A fermentação foi interrompida pela adição de 100 ul de 8 % de H2SO3, seguida por centrifugação a 3.000 rom por 10 min. Etanol e xilose no sobrenadante foram analisados por HPLC.

[0374] A Figura 13 mostra os títulos de etanol das fermentações em meio SD6, SX6, SX3/SD3 para cepas FYD853 e FYD1547. A cepa que contém o cassete hxt2 heterólogo, FYD1547, mostrou um título de etanol aumentado em 35% no meio de 6% de xilose (meio SX6) em comparação com cepa FYD853 precursora que não tem o cassete hxt2 heterólogo.

[0375] A Figura 14 mostra os títulos de etanol das fermentações em meio SD6, SX6, SX3/SD3 para cepas McTs1084-1087 e MBG4982. As cepas que contêm o cassete hxt2 heterólogo mostraram um título de etanol com aumento de 3 a 12% em comparação com cepa MBG4982 precursora.

[0376] A Tabela5 mostra o aumento em consumo de xilose para cepas que contêm o cassete hxt2 heterólogo acima de sua cepa precursora sem que contenha o cassete hxt2 heterólogo. A cepa FYD1547 teve um aumento consumo de xilose de 18,4% e as cepas McTs1084-1087 na faixa de 4,1% a 12,7% acima da cepa precursora dependendo do isolado. Tabela 5. Consumo de xilose em fermentações anaeróbicas.

Cepa Xilose Média | Desvio Padrão |N | Consumo (9/1) de xilose acima de cepa precursora McTs1084 | 21,211 McTs1086 | 21,297 McTs1101 | 46,644

McTs1103 | 46,537 McTs1104 | 47,489 Exemplo 8: Construção de cepas de levedura que expressam trajetória de utilização de xilose XR/XDH

[0377] Esse exemplo descreve a construção de cepas de levedura P51-F11, P52-B02, P55-H01 que não têm uma sequência de codificação de xilose isomerase, mas contêm a trajetória de utilização de xilose de D-xilose redutase/desidrogenase de xilitol (XR/XDH) em ambos os locus X-3 na cepa diploide Ethano!l Red.

[0378] Uma trajetória de utilização de xilose que contém uma D-xilose redutase (XR), desidrogenase de xilitol (XDH), xilulocinase (XK), transaldolase (TAL), e fosfoglucomutase (PGM2 de Saccharomyces cerevisiae) foi integrada em ambos os locus X-3 da cepa diploide Ethanol Red. Os promotores usados para expressar cada gene foram: Promotor TDH3 para desidrogenase de xilitol, promotor ADH1 para xilulocinase, PGK1 para D-xilose redutase, RPL18B para transaldolase, e TEF2 (SEQ ID NO: 50), para fosfoglucomutase. Três cepas foram projetadas P51-F11, P52-B02 e P55-H01, que contêm gentes XR, XDH, XK e ou TAL diferentes. A cepa P55-H01 continha os seguintes genes em ambos os locus X-3 na cepa diploide Ethanol Red: TAL de Saccharomyces cerevisiae (que codifica SEQ ID NO: 40), XDH de Spathaspora girioi (que codifica SEQ ID NO: 43), XK de Pseudomonas fluorescens (que codifica SEQ ID NO: 45), e XR de Aspergillus niger (que codifica SEQ ID NO: 47). A cepa P51-F11 contém os seguintes genes em ambos os locus X-3 na cepa diploide Ethanol Red: TAL de Candida glabrate (que codifica SEQ ID NO: 41), XDH de Spathaspora girioi (que codifica SEQ ID NO: 43), XK de Scheffersomyces stipitis (que codifica SEQ ID NO: 46), XR de Aspergillus oryzae (que codifica SEQ ID NO: 48). A cepa P52-B02 contém os seguintes genes em ambos os locus X-3 na cepa diploide Ethanol Red: TAL de Saccharomyces dairenensis (que codifica SEQ ID NO: 42), XDH de Candida tenuis (que codifica SEQ ID NO: 44), XK de Scheffersomyces stipitis (que codifica SEQ ID NO: 46), XR de Aspergillus niger (que codifica SEQ ID NO: 47). Todas as cepas também têm o gene fosfoglucomutatase de Saccharomyces cerevisiae (que codifica SEQ ID NO: 49) em ambos os locus X-3 na cepa diploide Ethanol Red.

[0379] As cepas que contêm a trajetória de cinco genes, XR, XDH, XK, TAL e PGM?2, foram produzidas com o uso de DNA sintético que codifica cada promotor, gene e terminador. O DNA sintético que contém os fragmentos de promotor e terminador foram ordenados como DNA clonado de GeneArt em plasmídeos e são como indicado na tabela abaixo. 16ACZJXP (flanco 500bp 5' para local X-3 e promotor TDH3), 16ACT3QP (terminador PDC6 e promotor ADH1), 16ACZJWP (terminador TEF1 e promotor PGK1), e 16ACZJVP (terminador ADH3 e promotor RPL18B). O fragmento que contém o gene PGM?2 foi também ordenado como DNA clonado e denominado 16ACZJYP. Esse plasmídeo continha o terminador PRM9, promotor TEF2, gene PGM2, terminador ENO2 e DNA de flanqueamento 300bp 3' X-3. Os fragmentos lineares para transformação foram gerados por PCR com oligos indicados na Tabela 6. Tabela 6. Oligos de PCR usados para amplificação de fragmentos usados em cepas de levedura que expressam trajetória de xilose de XR/XDH.

o amei 16ACZJX | 1221575 1221470 nc cs 16ACT3Q | 1221475 1221746 nn cs 16ACZJ |1221471 1221754 e DC 16ACZJV | 1221756 1221472 nn vv 16ACZJY |1221473 1221747 po AE ASS

[0380] Além dos cinco fragmentos de DNA linear gerados por PCR a partir de plasmídeos de DNA sintético, quatro DNAs adicionais foram usados na transformação para integrar a trajetória de cinco genes em ambos os locus X-3 em Ethanol Red. Para cada transformação, um fragmento de TAL, XDH, XK, e XR foi usado em combinação com as cinco peças de ligante acima. Os fragmentos tinham homologia nas extremidades 5' e 3' a seu fragmento contíguo. O plasmídeo Cas9 de CRISPR pMcTs442 que contém um gRNA para local X-3 e Cas9 foi usado para auxiliar em recombinação de homologia dos nove fragmentos de DNA em ambos os locus X-3 em Ethanol Red dipoloide com o uso de um protocolo de eletroporação de levedura. Os transformadores foram selecionados em YPD+cloNAT para selecionar para transformadores que contêm o plasmídeo pMcTs442 CRISPR/Cas9. Os transformadores foram varridos para integração da trajetória por PCR e confirmados por sequenciamento. As Tabelas 7 e 8 mostram detalhes dos genes de trajetória e cepas correspondentes. Tabela 7. Colunas de DNA linear que codificam genes usados para cepas de levedura geradas que expressam trajetória de xilose de XR/XDH.

Nome de | promotor | ID de Tipo Organismo terminador coluna Gene de de fonte de GeneArt enzima | codificação 16ACZY |RPLI8B |/P43YZ8 |TAL Saccharomyc | PRM9 EP (SEQ ID es cerevisiae NO: 40) 16ACZY |RPLIS8B |Q6FXG5 |TAL Candida PRM9 GP (SEQ ID glabrata NO: 41) 16ACZY |RPLI8B |GOWHO |TAL Saccharomyc | PRM9 HP 2 es (SEQ ID dairenensis NO: 42) 16ACZY |TDH3 AOA1I73 | XDH Spathaspora | PDC6 VP DUJ8 girioi (SEQ ID NO: 43) 16ACZY |TDH3 G3B9C7 | XDH Candida PDC6 xP (SEQ ID tenuis NO: 44) 16ACZY | ADH1 Q4KC52 | XK Pseudomona | TEF1 RP (SEQ ID S fluorescens NO: 45) 16ACZY | ADH1 ASGF74 | XK Scheffersomy | TEF1 SP (SEQ ID ces stipitis NO: 46)

NP (SEQ ID niger A e 16ACZY |PGK1 EFP2C7 | XR Aspergillus ADH3 MP GSO0 oryzae (SEQ ID NO: 48) Tabela 8. Cepas de levedura de trajetória de XR/XDH. Nome |TAL XDH XK XR [nem P55- P43YzZ8 AOA173DUJ8 | Q4KC52 A2Q8B5 HO1 (SEQ ID NO: | (SEQ ID NO: | (SEQ ID NO: | SEQ ID NO: 40) 43) 45) 47) P51- Q6FXG5 AOA1I73DUJ8 | ASGF74 EFP2C7GSO0 FI (SEQ ID NO: | (SEQ ID NO: | (SEQ ID NO: |(SEQ ID NO: 41) 43) 46) 48) P52- GOWHO02 G3B9C7 ASGF74 A2Q8B5 BO2 (SEQ ID NO: |(SEQ ID NO: | (SEQ ID NO: | SEQ ID NO: 42) 44) 46) 47) Exemplo 9: Construção de cepas de levedura que expressam trajetória de utilização de xilose XR/XDH e que compreendem um polinucleotídeo heterólogo que expressa HXT2

[0381] Esse exemplo descreve a construção das cepas de levedura McTs1100, McTs1101, McTs1102, McTs1103, McTs1104, McTs1105, McTs1106, McTs1107, McTs1108 que contêm um polinucleotídeo heterólogo que expressa o gene hxt2 sob controle do promotor TEF2 integrado em ambos os locus XIl-2 nas cepas P51-F11, P52-

BO2 e P55-H01 de trajetória de xilose de XR/XDH.

[0382] As cepas de levedura P51-F11, P52-B02, e P55-H01 MBG4982 foram transformadas com o DNA de 17AAPWNP de PCR amplificado (supra). Para auxiliar recombinação homóloga do hxt2 que contém cassete no locus XIl-2, um plasmídeo que contém Cas9 e RNA-guia específico para XIl-2 (pMIBa359) foi também usado na transformação. O plasmídeo e DNA de 17AAPWNP amplificado por PCR foram transformados em cepas P51-F11, P52-B02 e P55-H1 de S. cerevisiae com o uso de um protocolo de eletroporação de levedura. Os transformadores foram selecionados em YPD+cloNAT para selecionar para transformadores que contêm o plasmídeo pMIBa359 CRISPR/Cas9.

[0383] Para garantir integração correta do cassete de expressão de hxt2 heterólogo no MBG4982 de locus XIl-2, PCR através do locus foi realizado. Para gerar DNA de modelo genômico de transformadores, uma colônia foi novamente suspensa em 10 ul de água estéril, então, 40 ul de tampão de Y-lise (Zymo Research) e 2 ul de zimoliase (Zymo Research) foram adicionados. As amostras foram incubadas a 37 ºC por 30 minutos, então, 1 ul das células lisadas foi usado na reação de PCR a seguir. A reação de amplificação de PCR foi realizada com o uso de DNA Polimerase PhusionO Hot Start (Thermo Fisher) pelas Instruções do fabricante. Cada PCR foi composto por 1 ul de células tratadas com zimoliase como modelo de DNA, 50 pmol de acionador XIl-2 externo anterior, 50 pmol de acionador XIl-2 externo reverso, 0,1 mM de cada dATP, dGTP, dCTP, dTTP, Tampão 1X Phusion HF, e 2 unidades de DNA Polimerase Phusion Hot Start em um volume final de 50 ul. O PCR foi realizado em um Termociclador T1007Y (Bio- Rad Laboratories, Inc.) programado para um ciclo a 98 ºC por 3 minutos seguido por 32 ciclos, cada, a 98 ºC por 10 segundos, 54ºC por 20 segundos, e 72 ºC por 2 minutos com uma extensão final a 72 ºC por 5 minutos. Após a termociclagem, 5 ul de cada reação de PCR foram visualizados em um gel de agarose de 0,7% de TBE com brometo de etídeo. A colônia com o produto de PCR de tamanho correto de 3,8 kb foi Sanger sequenciada com o uso de acionadores 1220142 e 1222570. Os isolados que tinham o cassete de integração correta por sequenciamento para cada um dos três antecedentes de cepa foram selecionados. Os três isolados de cepa P51-F11 o cassete hxt2 foram nomeados McTs1100, McTs1101, McTs1102. Os três isolados de P52-B02 com o cassete hxt2 foram nomeados McTs1103, McTs1104, McTs1105. Os três isolados de antecedente de cepa P55-H01 com o cassete hxt2 foram nomeados McTs1106, McTs1107, McTs1108. Exemplo 10: Avaliação de crescimento anaeróbico de cepas geneticamente modificadas que expressam trajetória de utilização de xilose XR/XDH e que compreendem um polinucleotídeo heterólogo que expressa HXT2

[0384] Para avaliar a utiização de xilose em crescimento anaeróbico, as cepas do Exemplo 9 foram infiltradas em placas de ágar de YPD frescas e incubadas a 30 ºC por 2 dias. Três ml de culturas de YPD foram preparados para cada cepa, então, 150 ul dessa cultura de YPD inoculada foram adicionados a 10 a 11 poços de uma Microplaca de Poliestireno de Fundo Plano Claro de 96 Poços (Corning). A placa foi cultivada por 3 dias a 32 ºC com agitação a 300 rpm. Uma cópia da placa foi feita inoculando-se 150 ul de YPD fresca em Microplaca Não Tratada de Poliestireno de Fundo Plano Claro com 96 Poços (Corning) com 4 ul da placa anterior. A nova cópia placa foi incubada por 1 dias a 32 ºC com agitação a 300 rpm. Essa placa foi usada para inocular placas de 96 poços que contêm 150 ul de meio com 2% de xilose (SX2), 2% de dextrose (SD2) ou 1% de xilose + 1% glicose (SX1/SD1) como a única fonte de carbono. O meio foi dispensado em cada placa com o uso de um sistema robótico Beckman

Coulter. Para cada meios, cinco placas replicadas foram produzidas da mesma maneira. As placas foram incubadas a 32 ºC com agitação a 300 rpm por O h, 21,5 hr, ou 27,5 hr, 45 hr ou 52 hr. Em cada ponto no tempo, o crescimento dos poços foi avaliado por ODsasnm em um leito de placa de Detector Multimodal Beckman Coulter DTX 880.

[0385] A média de poços replicados dentro da placa em cada ponto no tempo e cada uma das três medias são mostradas nas Figuras 15 a 17 para antecedente de cepa P51-F11. Diferente dos resultados acima para cepas que compreendem um polinucleotídeo heterólogo que expressa HXT2 com uma sequência de codificação de xilose isomerase (XI), não houve melhora no crescimento para cepas que compreendem o polinucleotídeo heterólogo que expressa HXT2 com a trajetória de utilização de xilose XR/XDH (McTs1100, McTs1101, McTs1102) em comparação com P51-F11 precursor em meio SD2, SX1/SD1 ou SX2 em qualquer um dos pontos no tempo.

[0386] De modo similar, as Figuras 18 a 20 não mostraram benefício no crescimento para cepas que compreendem um polinucleotídeo heterólogo que expressa HXT2 quando expressado com a trajetória de utilização de xilose XR/XDH (McTs1103, McTs1104, McTs1105) em comparação com P52-B02 precursor.

[0387] De modo similar, as Figuras 21 a 23 não mostraram benefício no crescimento para cepas que compreendem um polinucleotídeo heterólogo que expressa HXT2 quando expressado com a trajetória de utilização de xilose XR/XDH (McTs1106, McTs1107, McTs1108) em comparação com P55-H01 precursor.

[0388] Adicionalmente, como mostrado na Tabela 5, não houve aumento em consumo de xilose em meio SX2 para cepas que compreendem um polinucleotídeo heterólogo que expressa HXT2 quando expressado com a trajetória de utilização de xilose XR/XDH em comparação com cepas precursoras que não têm o polinucleotídeo heterólogo.

[0389] Embora o supracitado tenha sido descrito em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo, com o objetivo de clareza de compreensão, é evidente para os indivíduos versados na técnica que qualquer aspecto ou modificação equivalente pode ser praticado. Portanto, a descrição e os exemplos não devem ser interpretados como limitativos do escopo da invenção.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Célula de levedura recombinante que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose e um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma isomerase de xilose, sendo que o transportador de hexose tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; e em que a célula de levedura tem capacidade para fermentar xilose.

2. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucleotídeo heterólogo codifica um transportador de hexose que difere em não mais que dez aminoácidos, por exemplo, em não mais que cinco aminoácidos, em não mais que quatro aminoácidos, em não mais que três aminoácidos, em não mais que dois aminoácidos ou em um aminoácido da SEQ ID NO: 2.

3. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucleotídeo heterólogo codifica um transportador de hexose que tem uma sequência de aminoácidos que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

4, Célula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, em que o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose compreende uma sequência codificante que tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.

5. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 4, em que o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose tem uma sequência codificante que consiste na SEQ ID NO: 1.

6. Célula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, em que o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose compreende uma sequência codificante que hibridiza pelo menos sob condições de baixa estringência, por exemplo, condições de média estringência, condições de estringência média-alta, condições de alta estringência ou condições de estringência muito alta com a fita complementar de comprimento completo da SEQ ID NO: 1.

7. Célula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, em que a cepa tem uma taxa de crescimento anaeróbico superior em uma pentose (por exemplo, xilose) em comparação com a mesma célula sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose em cerca de ou após 4 dias de incubação (por exemplo, sob as condições descritas no Exemplo 2).

8. Célula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, em que a cepa tem um consumo de pentose superior (por exemplo, xilose) em comparação com a mesma célula sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose em cerca de ou após 40 horas de fermentação (por exemplo, sob as condições descritas no Exemplo 3).

9. Célula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, em que a cepa tem uma produção de etanol superior em comparação com a mesma célula sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose em cerca de ou após 40 horas de fermentação (por exemplo, sob as condições descritas no Exemplo 3).

10. Célula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, que é uma célula Saccharomyces, Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Rhodosporidium, Candida, Yarrowia, Lipomyces, Cryptococcus, ou Dekkera sp.

11. Célula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, que é uma célula Saccharomyces cerevisiae,

12. Célula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, em que a célula tem capacidade para consumir mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de pentose (por exemplo, xilose) no meio em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, sob as condições descritas no Exemplo 4).

13. Célula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, em que a célula tem capacidade para consumir mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de glicose no meio em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, sob as condições descritas no Exemplo 4).

14. Célula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, em que a célula tem capacidade para consumir mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de pentose (por exemplo, xilose) no meio, e tem capacidade para consumir mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de glicose no meio, em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, sob as condições descritas no Exemplo 4).

15. Processo para produzir etanol que compreende: a) cultivar a célula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14, em um meio fermentável sob condições adequadas para produzir etanol; e b) recuperar o produto de fermentação da fermentação.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, em que o cultivo é conduzido sob condições de baixo teor de oxigênio (por exemplo, anaeróbicas).

17. Processo, de acordo com a reivindicação 15, em que o cultivo é conduzido sob condições aeróbicas.

18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, 16 ou 17, em que uma quantidade aumentada de glicose e pentose (por exemplo, xilose) é consumida em comparação com o processo que usa uma célula idêntica sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose sob as mesmas condições (por exemplo, em cerca de ou após 40 horas de fermentação, tal como as condições descritas no Exemplo 3).

19. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, 16, 17 ou 18, em que mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de pentose (por exemplo, xilose) no meio é consumida, e mais de 65%, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de glicose no meio é consumida, em cerca de ou após 66 horas de fermentação (por exemplo, sob as condições descritas no Exemplo 4).

20. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, 16, 17, 18 ou 19, em que o processo é resulta em rendimento de etanol superior em comparação com o processo que usa uma célula idêntica sem o polinucleotídeo heterólogo que codifica um transportador de hexose sob as mesmas condições (por exemplo, em cerca de ou após 40 horas de fermentação, tal como as condições descritas no Exemplo 3)