MX2013011827A

MX2013011827A - Metodos para mejorar la degradacion o conversion de material celulosico.

Info

Publication number: MX2013011827A
Application number: MX2013011827A
Authority: MX
Inventors: Tarana Shaghasi; Brett Mcbrayer
Original assignee: Novozymes Inc
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2014-01-08
Also published as: CN103797126A; EP2702162A1; BR112013027463A2; US9624518B2; US20140127758A1; US9790530B2; DK2702162T3; WO2012149344A9; US20170198319A1; US10036049B2; WO2012149344A1; EP2702162B1; US20180044704A1

Abstract

La presente invención se relaciona con métodos para degradar o convertir un material celulósico y para producir substancias del material celulósico bajo condiciones de alta temperatura.

Description

METODOS PARA MEJORAR LA DEGRADACION O CONVERSION DE MATERIAL CELULOSICO Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos para degradar o convertir un material celulósico y para producir sustancias del material celulósico.

Antecedentes de la Invención La celulosa es un polímero de la glucosa de azúcar simple unida covalentemente por enlaces beta- 1,4. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan glucanos beta-unidos. Estas enzimas incluyen endoglucanasas , celobiohidrolasas y beta-glucosidasas . Las endoglucanasas digieren el polímero de celulosa en ubicaciones al azar, abriéndolo para atacar mediante celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas liberan secuencialmente moléculas de celobiosa de los extremos del polímero de celulosa. La celobiosa es un dímero de glucosa de enlace beta-1,4 hidrosoluble . Las beta-glucosidasas hidrolizan celobiosa a glucosa.

La conversión de materias primas celulósicas en etanol tiene las ventajas de la disponibilidad de grandes cantidades de materia prima, la conveniencia de evitar la quema o el vertido de los materiales y la limpieza del combustible de etanol. La madera, los residuos agrícolas, los brotes Ref. 244044 herbáceos y los residuos sólidos municipales han sido considerados materias primas para la producción de etanol . Estos materiales consisten principalmente de celulosa, hemicelulosa y lignina. Una vez que la celulosa se convierte en glucosa, la glucosa es fácilmente fermentada por levadura en etanol .

WO 2005/074647, WO 2008/148131, y WO 2011/035027 describen polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad celulolítica mejorada y los polinucleótidos de los mismos de Thielavia terrestris . WO 2005/074656 y WO 2010/065830 describen polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad celulolítica mejorada y los polinucleótidos de los mismos de Thermoascus aurantiacus. WO 2007/089290 describe polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad celulolítica mejorada y los polinucleótidos de los mismos de Trichoderma reesei . WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864 y WO 2009/085868 describen polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad celulolítica mejorada y los polinucleótidos de los mismos de Myceliophthora thermophila. WO 2010/138754 describe polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad celulolítica mejorada y los polinucleótidos de los mismos de Aspergillus fumigatus. WO 2011/005867 describe polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad celulolítica mejorada y polinucleótidos de los mismos de Penicillium pinophilum. WO 2008/151043 describe métodos de incremenar la actividad de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada mediante la adición de un catión metálico divalente de acción soluble a a una composición que comprende el polipéptido.

Banergee et al, 2010, Bioresource Technology 101:9097-9105, describen mezclas de enzimas de múltiples componentes sintéticas para la deconstrucción de la biomasa lignocelulósica a 50°C. Viikari et al., 2007, Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol . 108: 121-145, describe enzimas termoestables en hidrólisis de lignocelulosa .

Hay una necesidad en el arte previo de nuevas composiciones enzimáticas para aumentar la eficiencia y para proporcionar soluciones enzimáticas rentables para alta temperatura de sacarificación de material celulósico.

La presente invención proporciona polipéptidos aislados que tienen actividad celulolítica mejorada y secuencias de ácidos nucleicos aislados que codifican los polipéptidos para mejorar la conversión de materias primas celulósicas a temperaturas más altas.

Sumario de la Invención La presente invención se relaciona con métodos para degradar o convertir un material celulósico, que comprende: tratar el material celulósico bajo condiciones de alta temperatura con una composición enzimática en la presencia de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipeptido GH61 que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO : 2 ; (b) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo por lo menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii); (c) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1 o la secuencia de ADNc de los mismos; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido GH61 de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celulolítica mejorada.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un producto de fermentación, que comprende: (a) sacarificar un material celulósico bajo condiciones a alta temperatura con una composición enzimática en la presencia de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada; (b) fermentar el material celulósico sacarificado con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos de fermentación para producir el producto de fermentación, y (c) recuperar el producto de fermentación de la fermentación; en donde el polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada es seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido GH61 que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO : 2 ; (b) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo por lo menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; (c) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO:l o la secuencia de ADNc de los mismos; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en uno o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido GH61 de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celulolítica mejorada.

La presente invención también se refiere a métodos de fermentar un material celulósico, que comprende: fermentar el material celulósico con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos de fermentación, en donde el material celulósico se sacarifica bajo condiciones de alta temperatura con una composición enzimática en la presencia de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada seleccionada del grupo que consiste de: (a) un polipéptido GH61 que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO : 2 ; (b) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo por lo menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO : 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii); (c) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO : 1 o la secuencia de ADNc del mismo; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido GH61 de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celulolítica mejorada.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la secuencia de ADN genómico (SEC ID NO: 1) y secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 2) de un gen Trichoderma reesei RutC30 que codifica un polipéptido GH61A que tiene actividad celulolítica mejorada. La secuencia de señal está subrayada y la secuencia intrónica está en cursiva.

La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pAJ223.

La Figura 3 muestra el efecto de polipéptidos GH61 que tienen actividad celulolítica mejorada en la actividad de hidrolización de PCS de una composición de celulasa a base de Trichoderma Reesei y una composición enzimática de alta temperatura .

Descripción Detallada de la Invención Definiciones Acetilxilan esterasa: El término "acetilxilan esterasa" significa una carboxilesterasa (CE 3.1.1.72) que cataliza la hidrólisis de grupos acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, acetato de alfa-naft ilo, y acetato de p-nitrofenilo . Para los propósitos de la presente invención, la actividad acetilxilan esterasa se determina utilizando 0.5 mM de p-nitrofenilacetato como sustrato en 50 mM de acetato de sodio pH 5.0 que contiene 0.01% de T EEN™ 20 (monolaurato de polioxiet ileno sorbitán) . Una unidad de acetilxilan esterasa se define como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 µp??? de anión de p-nitrofenolato por minuto a pH 5, 25 °C.

Variante alélica: El término "variante alélica" significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de mutación, y puede resultar en polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

Alfa-L-arabinofuranosidasa : El término "alfa-L-arabinofuranosidasa" significa una arabinofuranohidrolasa alfa-L-arabinofuranósido (CE 3.2.1.55) que cataliza la hidrólisis de residuos alfa-L-arabinofuranósido no reductor terminal en alfa-L-arabinósidos . La enzima actúa en alfa-L-arabinofuranosidos, alfa-L-arabinanos que contienen enlaces (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos , y arabinogalactanos . Alfa-L-arabinofuranosidasa es también conocida como arabinosidasa, alfa-arabinosidasa, alfa-L-arabinosidasa, alfa-arabinofuranosidasa , polisacárido alfa-L-arabinofuranosidasa, alfa-L-arabinofuranósido hidrolasa, L-arabinosidasa , o alfa-L-arabinanasa. Para los propósitos de la presente invención, la actividad alfa-L-arabinofuranosidasa se determina utilizando 5 mg de arabinoxilano de trigo de viscosidad media (Megazyme Internacional Irlanda, Ltd., Bray, Co . Wicklow, Irlanda) por mi de 100 mM de acetato de sodio pH 5 en un volumen total de 200 µ? durante 30 minutos a 40°C seguido por análisis de arabinosa por cromatografía en columna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, USA) .

Alfa-glucuronidasa: El término "alfa-glucuronidasa" significa un alfa-D-glucosiduronato glucuronohidrolasa (CE 3.2.1.139) que cataliza la hidrólisis de un alfa-D-glucuronosido a D-glucuronato y un alcohol. Para los propósitos de la presente invención, la actividad alfa-glucuronidasa se determina de acuerdo con de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. Una unidad de alfa-glucuronidasa es igual a la cantidad de enzima capaz de liberar 1 ymol de ácido glucurónico o 4 -O-metilglucurónico por minuto a pH 5, 40°C.

Beta-glucosidasa : El término "beta-glucosidasa" significa un beta-D-glucósido glucohidrolasa (CE 3.2.1.21) que cataliza la hidrólisis de residuos de beta-D-glucosa no reductora terminal con la liberación de beta-D-glucosa. Para los propósitos de la presente invención, la actividad de beta-glucosidasa se determina usando p-nitrofenil -beta-D-glucopiranósido como sustrato de acuerdo con el procedimiento de Venturi et al., 2002, beta-D-glucosidasa extracelular de Chaetomium thermophilum var. coprophilum: producción, purificación y algunas propiedades bioquímicas, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Una unidad de beta-glucosidasa se define como 10.0 ymol de anión p-nitrofenolato producido por minuto a 25°C, H 4.8 de 1 mM de p-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido como sustrato en 50 mM de citrato de sodio que contiene Tween® 20 al 0.01%.

Beta-xilosidasa : El término "beta-xilosidasa" significa una beta-D-xilósido xilohidrolasa (CE 3.2.1.37) que cataliza la exo-hidrólisis de xilooligosacáridos beta- (4) cortos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos desde el extremo no reductor. Para los propósitos de la presente invención, una unidad de beta-xilosidasa se define como 1.0 µ???? del anión p-nitrofenolato producido por minuto a 40°C, pH 5 desde 1 mM de p-nitrofenil-beta-D-xilósido como sustrato en 100 mM de citrato de sodio que contiene Tween® 20 al 0.01%.

Celobiohidrolasa: El término "celobiohidrolasa" significa una 1, 4-beta-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.91 y E.C. 3.2.1.176) que cataliza la hidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en celulosa, celooligosacáridos , o cualquier glucosa de enlace beta-1,4 que contiene polímero, liberando celobiosa de los extremos reductores o no reductores de la cadena (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases , Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem. Soc . Trans . 26: 173-178) . La actividad de celobiohidrolasa se determina de acuerdo con los procedimientos descritos por Lever et al., 1972, Anal.

Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288, y Blank et al, 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581. En la presente invención, el método de Tomme et al. puede ser utilizado para determinar la actividad de celobiohidrolasa .

Enzima celulolítica o celulasa: El término "enzima celulolítica" o "celulasa" se refiere a una o más (por ejemplo, varias) enzimas que hidrolizan un material celulósico. Tales enzimas incluyen endoglucanasa (s) , celobiohidrolasa (s) , beta-glucosidasa (s) , o combinaciones de los mismos. Los dos acercamientos básicos para medir la actividad celulolítica incluyen: (1) medir la actividad celulolítica total y (2) medir las actividades celulolíticas individuales (endoglucanasas , celobiohidrolasas y beta-glucosidasas) tal como fue revisado en Zhang et al, Outlook for cellulase improvement : Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. La actividad celulolítica total se mide por lo general utilizando sustratos insolubles, incluyendo papel filtro Whatman N°l, celulosa microcristalina, celulosa bacteriana, celulosa de algas, algodón, lignocelulosa pretratada, etc. El ensayo de actividad celulolítica total más común es el ensayo de papel filtro utilizando papel de filtro Whatman N°l como el sustrato. El ensayo fue establecido por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC, por sus siglas en inglés) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Puré Ap l . Chem. 59 : 257-68) .

Para los propósitos de la presente invención, la actividad de la enzima celulolítica se determina midiendo el incremento en la hidrólisis de un material celulósico por la enzima celulolítica bajo las siguientes condiciones: 1-50 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulosa en PCS (u otro material celulósico pretratado) durante 3-7 días a una temperatura apropiada, por ejemplo, 50°C, 55°C, 60°C, o 65°C, comparado con una hidrólisis de control sin adición de proteína de enzima celulolítica. Las condiciones típicas son reacciones de 1 mi, PCS lavadas o sin lavar, 5% de sólidos insolubles, 50 mM de acetato de sodio pH 5 , 1 mM de MnS04 , 50°C, 55°C, 60°C o 65°C, 72 horas, análisis de azúcar por columna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, USA) .

Material celulósico: El término "material celulósico" significa cualquier material que contiene celulosa. El polisacárido predominante en la pared celular primaria de biomasa es celulosa, el segundo más abundante es la hemicelulosa , y el tercero es la pectina. La pared celular secundaria, producida después de que la célula ha dejado de crecer, también contiene polisacáridos y se refuerza por lignina polimérica reticulada de manera covalente a la hemicelulosa . La celulosa es un homopolímero de anhidrocelobiosa y por lo tanto un beta- (1-4) -D-glucano lineal, mientras que las hemicelulosas incluyen una variedad de compuestos, tales como xilanos, xiloglucanos , arabinoxilanos , y mananos en estructuras ramificadas complejas con un espectro de sustituyentes . Aunque generalmente es polimorfa, la celulosa se encuentra en el tejido de plantas principalmente como una matriz cristalina insoluble de cadenas de glucano paralelas. Las hemicelulosas usualmente unen hidrógeno a celulosa, así como a otras hemicelulosas, que ayudan a estabilizar la matriz de la pared celular.

La celulosa se encuentra generalmente, por ejemplo, en tallos, hojas, cáscaras, vainas, y mazorcas de plantas u hojas, ramas y madera de los árboles. El material celulósico puede ser, pero no se limitan a, residuos agrícolas, material herbáceo (incluidos cultivos energéticos), residuos sólidos municipales, pulpa y residuo de fábrica de papel, papel de desecho, y madera (incluido el residuo forestal) (ver, por ejemplo, iselogel et al, 1995, en Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.105-1 18, Taylor & Francis, Washington D . C . ; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics , in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volume 65, p.23-40, Springer-Verlag, New York). Se entiende en este documento que la celulosa puede estar en la forma de lignocelulosa, un material de pared celular de plantas que contiene lignina, celulosa, y hemicelulosa en una matriz mixta. En un aspecto preferido, el material celulósico es cualquier material de biomasa. En otro aspecto preferido, el material celulósico es lignocelulosa, que comprende celulosa, hemicelulosa, y lignina.

En un aspecto, el material celulósico es de residuos agrícolas. En otro aspecto, el material celulósico es material herbáceo (incluyendo cultivos energéticos) . En otro aspecto, el material celulósico es de residuos sólidos municipales. En otro aspecto, el material celulósico es pulpa y residuo de fábricas de papel. En otro aspecto, el material celulósico es papel de desecho. En otro aspecto, el material celulósico es madera (incluyendo residuo forestal) .

En otro aspecto, el material celulósico es arundo. En otro aspecto, el material celulósico es bagazo. En otro aspecto, el material celulósico es bambú. En otro aspecto, el material celulósico es la mazorca de maíz. En otro aspecto, el material celulósico es la fibra de maíz. En otro aspecto, el material celulósico es el rastrojo de maíz. En otro aspecto, el material celulósico es miscanto. En otro aspecto, el material celulósico es cáscara de naranja. En otro aspecto, el material celulósico es paja de arroz. En otro aspecto, el material celulósico es pasto alto. En otro aspecto, el material celulósico es paja de trigo.

En otro aspecto, el material celulósico es aspen. En otro aspecto, el material celulósico es eucalipto. En otro aspecto, el material celulósico es abeto. En otro aspecto, el material celulósico es de pino. En otro aspecto, el material celulósico es álamo. En otro aspecto, el material celulósico es abeto. En otro aspecto, el material celulósico es sauce.

En otro aspecto, el material celulósico es celulosa de algas. En otro aspecto, el material celulósico es celulosa bacteriana. En otro aspecto, el material celulósico es linter de algodón. En otro aspecto, el material celulósico es papel de filtro. En otro aspecto, el material celulósico es celulosa microcristalina . En otro aspecto, el material celulósico es celulosa tratada con ácido fosfórico.

En otro aspecto, el material celulósico es una biomasa acuática. Como se usa en este documento, el término "biomasa acuática" significa biomasa producida en un ambiente acuático por un proceso de fotosíntesis. La biomasa acuática puede ser algas, plantas emergentes, plantas de hojas flotantes o plantas sumergidas.

El material celulósico puede ser utilizado como está o puede ser sometido a tratamiento previo, usando métodos convencionales conocidos en el arte previo, como se describe en este documento. En un aspecto preferido, el material celulósico es pretratado.

ADNc : El término "ADNc" se refiere a una molécula de ADN que puede ser preparada por transcripción inversa de una molécula de ARNm empalmada, madura, obtenida de una célula eucariótica o procariótica . ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcripto de ARN inicial primario es un precursor de ARNm que es procesado a través de una serie de pasos, incluyendo empalme, antes de aparecer como ARNm maduro empalmado.

Secuencia de codificación: El término "secuencia de codificación" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia de codificación se determinan generalmente por un marco de lectura abierto, que comienza con un codón de inicio, tal como, ATG, GTG o TTG y termina con un codón de detención tal como TAA, TAG, o TGA. La secuencia de codificación puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético, o una combinación de los mismos.

Secuencias de control: El término "secuencias de control" significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (en este caso, del mismo gen) o exogena (en este caso, de un gen diferente) para el polinucleótido que codifica el polipéptido o nativo o exógeno uno de otro. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal, y terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de detención transcripcionales y traduccionales. Las secuencias de control pueden ser proporcionadas con enlaces con el fin de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la ligadura de las secuencias de control con la región de codificación del polinucleótido que codifica un polipéptido.

Endoglucanasa : El término "endoglucanasa" significa una endo-1 , 4 - ( 1 , 3 , 1 , 4 ) -beta-D-glucano 4 -glucanohidrolasa (E.C. 3.2.1.4) que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en celulosa, derivados de celulosa (tales como carboximetilcelulosa e hidroxietil celulosa) , liquenina, enlaces beta- 1,4 en beta- 1,3 glucanos mezclados tales como beta-D-glucanos o xiloglucanos de cereales y otro material de plantas que contiene componentes celulósicos. La actividad endoglucanasa puede ser determinada mediante la reducción de medición en la viscosidad de sustrato o incremento en la reducción de extremos determinados por un ensayo de azúcar reductor (Zhang et al, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481) . Para los propósitos de la presente invención, la actividad endoglucanasa es determinada utilizando carboximetil celulosa (CMC) como sustrato de acuerdo con el procedimiento de Ghose, 1987, Puré and Appl . Chem. 59: 257-268, a pH 5, 40°C.

Expresión: El término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción de un polipéptido incluyendo, pero no limitado a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional , y secreción.

Vector de expresión: El término "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y está unido operativamente a secuencias de control que proporcionan su expresión.

Familia 61 de glicósido hidrolasa: El término "familia 61 de glicósido hidrolasa" o "familia GH61" o "GH61" significa un polipéptido que cae dentro de la Familia 61 de glucósido hidrolasa de acuerdo Henrissat B., 1991 , A classificat ion of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities , Biochem. J. 280: 309-316, and Henrissat B., and Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. Las enzimas de esta familia se clasificaron originalmente como una familia de glucósido hidrolasa con base en la medición de actividad de endo- 1 , 4 -beta-D-glucanasa muy débil en un miembro de la familia. La estructura y el modo de acción de estas enzimas son no canónicas y no pueden ser consideradas como glicosidasas auténticas. Sin embargo, se mantienen en la clasificación CAZy en la base de su capacidad para mejorar la descomposición de lignocelulosa cuando se utiliza junto con una celulasa o una mezcla de celulasas.

Feruloil esterasa: El término "feruloil esterasa" significa una hidrolasa 4 -hidroxi-3 -metoxicinamoil-azúcar (EC 3.1.1.73) que cataliza la hidrólisis de grupos 4 -hidroxi-3 -metoxicinamoil (feruloil) del azúcar esterificado, que es generalmente arabinosa en sustratos de biomasa naturales, para producir ferulato de (4-hidroxi-3-metoxicinamato) . Feruloil esterasa también se conoce como esterasa de ácido ferúlico, hidroxicinamoil esterasa, FAE-III, cinamoil éster hidrolasa, FAEA, cinnAE, FAE-I, o FAE-II. Para los propósitos de la presente invención, la actividad feruloil esterasa se determina utilizando 0.5 mM de p-nitrofenilferulato como sustrato en 50 mM de acetato de sodio pH 5.0. Una unidad de feruloil esterasa es igual a la cantidad de enzima capaz de liberar 1 ymol de anión p-nitrofenolato por minuto a pH 5, 25° C.

Fragmento: El término "fragmento" significa un polipéptido o un dominio del mismo que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes del extremo amino y/o carboxilo de un polipéptido maduro o un dominio de los mismos, en donde el fragmento tiene actividad celulolítica mejorada o actividad de unión a celulosa. En un aspecto, un fragmento contiene por lo menos 280 residuos de aminoácidos, por ejemplo, por lo menos 295 residuos de aminoácidos o por lo menos 310 residuos de aminoácidos del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2.

Enzima hemicelulolítica o hemicelulasa : El término "enzima hemicelulolítica" o "hemicelulasa" significa una o más (por ejemplo, varias) enzimas que hidrolizan un material hemicelulósico . Ver, por ejemplo, Shallom, D. and Shoham, Y. Microbial hemicellulases . Current Opinión In Microbiology, 2003, 6(3) : 219-228) . Las hemicelulasas son componentes clave en la degradación de la biomasa de plantas. Ejemplos de hemicelulasas incluyen, pero no se limitan a, una acetilmanano esterasa, una acetilxilan esterasa, una arabinanasa, una arabinofuranosidasa , una esterasa de ácido cumárico, una feruloil esterasa, una galactosidasa , una glucuronidasa, una glucuronoil esterasa, una mananasa, una manosidasa, una xilanasa, y una xilosidasa. Los sustratos de estas enzimas, las hemicelulosas , son un grupo heterogéneo de polisacáridos ramificados y lineales que están unidos a través de enlaces de hidrógeno a las microfibrillas de celulosa en la pared celular de plantas, reticulandolas en una red robusta. Las hemicelulosas también están unidas covalentemente a lignina, formando junto con la celulosa una estructura altamente compleja. La estructura variable y la organización de hemicelulosas requieren la acción concertada de muchas enzimas para su degradación completa. Los módulos catalíticos de hemicelulasas son ya sea glucósido hidrolasas (GHs) que hidrolizan los enlaces glicosídicos , o esterasas de carbohidratos (CEs) , que hidrolizan los enlaces éster de acetato o grupos laterales de ácido ferúlico. Estos módulos catalíticos, con base en la homología de su secuencia primaria, pueden ser asignados en familias GH y CE. Algunas familias, con un pliegue similar total, pueden ser agrupadas además en clanes, marcadas alfabéticamente (por ejemplo, GH-A) . Una clasificación más informativa y actualizada de estas y otras enzimas activas de carbohidratos está disponible en la base de datos de enzimas activas en carbohidratos (CAZy, por sus siglas en inglés) . Las actividades de las enzimas hemicelulolíticas se pueden medir de acuerdo con Ghose and Bisaría, 1987, Puré & Appl . Chem. 59: 1739-52, a una temperatura apropiada, por ejemplo, 50°C, 55°C, 60°C, o 65°C.

Condiciones de alta astringencia: El término "condiciones de alta astringencia" significa sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0.3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y formamida al 50%, siguiendo los procedimientos de Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS al 0.2% a 65°C.

Célula huésped: El término "célula huésped" significa cualquier tipo de célula que es susceptible a transformación, transfección, transducción, o similar, con un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula madre que no es idéntica a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación.

Aislado: El término "aislado" significa una sustancia en una forma o medio ambiente que no ocurre en la naturaleza. Ejemplos no limitantes de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia de origen no natural, (2) cualquier sustancia, incluyendo, pero no limitado a, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se elimina por lo menos parcialmente de uno o más (por ejemplo, varios) o la totalidad de los constituyentes presentes en la naturaleza con el que está asociado en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre con respecto a la sustancia que se encuentra en la naturaleza, o (4) cualquier sustancia modificada mediante el aumento de la cantidad de la sustancia en relación con otros componentes con los que se asocia de forma natural (por ejemplo, la producción recombinante en una célula huésped; múltiples copias de un gen que codifica la sustancia, y el uso de un promotor más fuerte que el promotor asociado naturalmente con el gen que codifica la sustancia) .

Condiciones de baja astringencia: El término "condiciones de baja astringencia" significa sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0.3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y formamida al 25%, siguiendo los procedimientos de Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS al 0.2% a 50°C.

Polipéptido maduro: El término "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final después de la traducción y cualquier modificación post- traduccional , tal como el procesamiento de N- terminal, truncamiento C- terminal, glicosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro son los aminoácidos 22-344 de la SEC ID NO: 2 basado en el programa SignalP (Nielsen et al, 1997, Protein Engineering 10:. 1-6) que predice que los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO: 2 son un péptido señal. Se sabe en el arte previo que una célula huésped puede producir una mezcla de dos o más diferentes polipéptidos maduros (en este caso, con un aminoácido C- terminal y/o N-terminal diferente) expresados por el mismo polinucleót ido . También se sabe en el arte previo que diferentes células huésped procesan polipéptidos de manera diferente, y por lo tanto, una célula huésped que expresa un polinucleótido puede producir un polipéptido maduro diferente (por ejemplo, que tiene un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) en comparación a otra célula huésped que expresa el mismo polinucleótido.

Secuencia de codificación del polipéptido maduro: El término "secuencia de codificación del polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido GH61 maduro que tiene actividad celulolítica mejorada. En un aspecto, la secuencia que codifica un polipéptido maduro son los nucleótidos 64 a 1086 de la SEC ID NO: 1 o la secuencia de ADNc del mismo con base en el programa SignalP (Nielsen et al, 1997, supra.) que predice que los nucleótidos 1 a 63 de la SEC ID NO: 1 codifican un péptido señal.

Condiciones de astringencia media: El término "condiciones de astringencia media" significa sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, SDS al 0.3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y formamida al 35%, siguiendo los procedimientos de Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS al 0.2% a 55°C.

Condiciones de astringencia media-alta: El término "condiciones de astringencia media-alta" significa sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0.3%, 200 micrograraos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y formamida al 35%, siguiendo los procedimientos de Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS al 0.2% a 60°C.

Constructo de ácido nucleico: El término "constructo de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, ya sea de hebra simple o hebra doble, que es aislada de un gen de origen natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de lo contrario no existiría en la naturaleza o que es sintético, que comprende una o más secuencias de control.

Unido operativamente: El término "unido operativamente" significa una configuración en la que se coloca una secuencia de control en una posición apropiada con respecto a la secuencia de codificación de un polinucleót ido de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia de codificación .

Polipeptido que tiene actividad celulolítica mejorada: El término "polipéptido que tiene actividad celulolítica mejorada" significa un polipéptido GH61 que cataliza el mejoramiento de la hidrólisis de un material celulósico mediante enzimas que tiene actividad celulolítica. Para los propósitos de la presente invención, la actividad celulolítica mejorada se determina midiendo el aumento en la reducción de azúcares o el aumento del total de celobiosa y glucosa a partir de la hidrólisis de un material celulósico mediante enzima celulolítica en las siguientes condiciones: 1-50 mg del total de proteína/g de celulosa en PCS, en donde la proteína total se compone de 50 a 99.5% peso/peso de proteína de enzima celulolítica y 0.5-50% peso/peso de proteína de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada por 1-7 días a una temperatura apropiada, por ejemplo, 50°C, 55°C, o 60°C, en comparación con una hidrólisis de control con carga de proteínas total igual sin actividad celulolítica mejorada (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulosa en PCS) . En un aspecto preferido, una mezcla de 1.5 L de Celluclast® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) en la presencia de 2-3% del peso de proteínas total de beta-glucosidasa Aspergillus oryzae (producida de forma recombinante en Aspergillus oryzae de acuerdo con WO 02/095014) o 2-3% del peso de proteínas total de beta-glucosidasa Aspergillus fumigatus (producido de forma recombinante en Aspergillus oryzae como se describe en documento WO 2002/095014) de carga de proteína celulasa se utiliza como la fuente de la actividad celulolítica.

Los polipéptidos GH61 que tienen actividad celulolítica mejorada mejoran la hidrólisis de un material celulósico catalizado por la enzima que tiene actividad celulolítica mediante la reducción de la cantidad de enzima celulolítica requerido para alcanzar el mismo grado de hidrólisis preferiblemente por lo menos 1.01 veces, por ejemplo, por lo menos 1.05 veces, por lo menos 1.10 veces, por lo menos 1.25 veces, por lo menos 1.5 veces, por lo menos 2 veces, por lo menos 3 veces, por lo menos 4 veces, por lo menos 5 veces, por lo menos 10 veces, o por lo menos 20 veces.

Los polipéptidos de la presente invención tienen por lo menos 20%, por ejemplo, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, y por lo menos 100% de la actividad celulolítica mejorada del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2.

Rastrojo de maíz pretratado: El término "PCS" o "rastrojo de maíz pretratado" , significa un material celulósico derivado del rastrojo de maíz, mediante tratamiento con calor y ácido sulfúrico, diluido, pretratamiento alcalino o pretratamiento neutro .

Identidad de secuencia: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos es descrita por el parámetro "identidad de secuencia" .

Para los propósitos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol Biol . 48: 443-453) como es implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. , 2000, Trends Genet . 16: 276-277), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son penalización de apertura de hueco de 10, penalización de extensión de hueco 0.5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62) . La salida de Needle etiquetada "identidad más larga" (obtenida usando la opción-no breve) se utiliza como la identidad de porcentaje y se calcula de la siguiente manera: (Residuos idénticos x 100) / (Longitud de Alineamiento - Número total de huecos en alineación) Para los propósitos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina usando el algoritmo de Needleman- unsch (Needleman and Wunsch, 1970, supra) como es implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son penalización de apertura de hueco 10, penalización de extensión de hueco 0.5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (EMBOSS versión de NCBI NUC4.4 ) . La salida de Needle etiquetada "identidad más larga" (obtenida usando la opción-no breve) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera: (Desoxirribonucleótidos idénticos x 100 )/( longitud de alineación - Número total de huecos en la alineación) Subsecuencia : El término "subsecuencia" significa un polinucleótido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) nucleótidos ausentes de los extremos 5' y/o 3' de una secuencia de codificación del polipéptido maduro; en donde la subsecuencia codifica un fragmento que tiene actividad celulolítica mejorada. En un aspecto, una subsecuencia contiene por lo menos 840 nucleótidos, por ejemplo, por lo menos 885 nucleótidos o por lo menos 930 nucleótidos de la SEC ID NO: 1, o la secuencia de ADNc de los mismos.

Variante: El término "variante" significa un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada que comprende una alteración, en este caso, una sustitución, inserción y/o supresión, en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. Una sustitución significa la sustitución del aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente; una supresión significa la eliminación del aminoácido que ocupa una posición, y una inserción agregar un aminoácido adyacente a e inmediatamente después del aminoácido que ocupa una posición.

Condiciones de astringencia muy alta: El término "condiciones de astringencia muy alta" significa sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, SDS al 0.3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y formamida al 50%, siguiendo los procedimientos de Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS al 0.2% a 70°C.

Condiciones de astringencia muy baja: El término "condiciones de astringencia muy baja" significa sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, SDS al 0.3%, 200 microgramos/ml ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y formamida al 25%, siguiendo los procedimientos de Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS al 0.2% a 45°C.

Actividad de degradación de xilano o actividad xilanolítica : El término "actividad de degradación de xilano" o "actividad xilanolítica" significa una actividad biológica que hidroliza el material que contiene xilano. Los dos acercamientos básicos para medir la actividad xilanolítica incluyen: (1) medición de la actividad xilanolítica total y (2) medición de las actividades xilanolíticas individuales (por ejemplo, endoxilanasas , beta-xilosidasas , arabinofuranosidasas , alfa-glucuronidasas , acetilxilan esterasas, feruloil esterasas y alfa-glucuronil esterasas) . Los recientes avances en los ensayos de enzimas xilanolíticas se resume en varias publicaciones incluyendo Biely and Puchard, Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11) : 1636-1647; Spanikova and Biely, 2006, Glucuronoyl esterase -Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely, and Kubicek, 1997, The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase , Biochemical Journal 321 : 375-381.

La actividad de degradación de xilano se puede medir mediante la determinación de los azúcares reductores formados de diversos tipos de xilano, incluyendo, por ejemplo, avena escanda, madera de haya, y xilanos de madera de alerce, o por determinación fotométrica de fragmentos de xilano teñidos liberados de varios xilanos teñidos covalentemente . El ensayo de actividad xilanolítica total más común se basa en la producción de azúcares reductores de 4-O-metil glucuronoxilano polimérico como se describe en Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. La actividad de xilanasa también se puede determinar con AZCL-arabinoxilano al 0.2% como sustrato en Tritón® al 0.01% X-100 (4- (1, 1, 3, 3-tetrametil-butil) fenil -polietilen glicol) y 200 mM de solución amortiguadora de fosfato de sodio pH 6 a 37°C. Una unidad de actividad de xilanasa se define como 1.0 pmoles de azurina producido por minuto a 37°C, pH 6 de AZCL-arabinoxilano al 0.2% como sustrato en 200 mM de solución amortiguadora de fosfato de sodio pH 6.

Para los propósitos de la presente invención, la actividad degradante de xilano se determina midiendo el incremento en la hidrólisis de xilano de madera de abedul (Sigma Chemical Co., Inc., S . Louis, MO, USA) por la enzima de degradación de xilano bajo las siguientes condiciones típicas: reacciones de 1 mi , 5 mg/ml de sustrato (sólidos totales) , 5 mg de proteína xilanolítica/g de sustrato, 50 mM de acetato de sodio pH 5, 50 °C, 24 horas, análisis de azúcar usando el ensayo de hidrazida del ácido p-hidroxibenzoico (PHBAH) como se describió por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47: 273-279.

Xilanasa: El término "xilanasa" significa una 1,4-beta-D-xilano-xilohidrolasa (EC 3.2.1.8) que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1 , 4-beta-D-xilosidicos en xilanos. Para los propósitos de la presente invención, la actividad xilanasa se determinó con AZCL-arabinoxilano al 0.2% como sustrato en Tritón® X-100 al 0.01% y 200 mM de solución amortiguadora de fosfato de sodio pH 6 a 37°C. Una unidad de actividad de xilanasa se define como 1.0 pmol de azurina producida por minuto a 37°C, pH 6 de AZCL-arabinoxilano al 0.2% como sustrato en 200 mM de solución amortiguadora de fosfato de sodio pH 6.

La presente invención se refiere a métodos para degradar o convertir un material celulósico, que comprende: tratar el material celulósico bajo condiciones de alta temperatura con una composición de enzima en la presencia de un polipéptido GH61que tiene actividad celulolítica mejorada seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido GH61 que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO : 2 ; (b) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que se híbrida por lo menos bajo condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; (c) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1 o la secuencia de ADNc del mismo; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido GH61 de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celulolítica mejorada.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un producto de fermentación, que comprende: (a) sacarificar un material celulósico bajo condiciones de alta temperatura con una composición enzimática en la presencia de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada; (b) fermentar el material celulósico sacarificado con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos de fermentación para producir el producto de fermentación, y (c) recuperar el producto de fermentación de la fermentación; en donde el polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polipéptido GH61 que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO : 2 ; (b) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo por lo menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; (c) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO : 1 o la secuencia de ADNc del mismo; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO : 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido GH61 de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celulolítica mejorada.

La presente invención también se refiere a métodos de fermentar un material celulósico, que comprende: fermentar el material celulósico con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos de fermentación, en donde el material celulósico se sacarifica bajo condiciones de alta temperatura con una composición enzimática en la presencia de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido GH61 que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO : 2 ; (b) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo por lo menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii); (c) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO : 1 o la secuencia de ADNc del mismo; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO : 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido GH61 de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celulolítica mejorada.

Los métodos de la presente invención pueden ser utilizados para sacarificar un material celulósico bajo condiciones a alta temperatura en azúcares fermentables y para convertir los azúcares fermentables para muchos productos de fermentación útiles, por ejemplo, combustible, etanol potable, y/o productos químicos de plataforma (por ejemplo, ácidos, alcoholes, cetonas, gases, y similares). La capacidad para llevar a cabo la sacarificación en la presencia de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada bajo condiciones de temperatura más alta que las usadas habitualmente , por ejemplo, 50°C, proporciona varias ventajas. Ejemplos no limitantes de tales ventajas incluyen un aumento en la eficiencia hidrolítica de las enzimas, reducción de viscosidad del material celulósico, riesgo reducido de contaminación microbiana, y efectividad de costo del material celulósico degradante.

Las condiciones a alta temperatura son preferiblemente una temperatura de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 70°C durante aproximadamente 6 hasta aproximadamente 168 horas a un pH de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 8 y un contenido de sólidos secos de un material celulósico de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50% en peso.

En un aspecto de las condiciones a alta temperatura, la temperatura está en el intervalo de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 70 °C. En otro aspecto, la temperatura está en el intervalo de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 65°C. En otro aspecto, la temperatura está en el intervalo desde aproximadamente 55 °C hasta aproximadamente 65 °C. En otro aspecto, la temperatura está en el intervalo desde aproximadamente 56°C hasta aproximadamente 65°C. En otro aspecto, la temperatura está en el intervalo desde aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 60 °C. En otro aspecto, la temperatura está en el intervalo desde aproximadamente 55°C hasta aproximadamente 60°C. En otro aspecto, la temperatura está en el intervalo desde aproximadamente 56 °C hasta aproximadamente 60°C. En otro aspecto, la temperatura es desde aproximadamente 54 °C, aproximadamente 55°C, aproximadamente 56°C, aproximadamente 57°C, aproximadamente 58°C, aproximadamente 59°C, aproximadamente 60 °C, aproximadamente 61°C, aproximadamente 62 °C, aproximadamente 63 °C, aproximadamente 64 °C, aproximadamente 65 °C, aproximadamente 66 °C, aproximadamente 67°C, aproximadamente 68 °C, aproximadamente 69°C, o aproximadamente 70°C. En otro aspecto, la temperatura es de por lo menos 54°C, por lo menos 55°C, por lo menos 56°C, por lo menos 57°C, por lo menos 58°C, por lo menos 59°C, por lo menos 60°C, por lo menos 61°C, por lo menos 62°C, por lo menos 63°C, por lo menos 64°C, por lo menos 65°C, por lo menos 66°C, por lo menos 67°C, por lo menos 68°C, por lo menos 69°C, o por lo menos 70°C.

En cada uno de los aspectos anteriores para la temperatura de las condiciones de alta temperatura, la sacarificación se realiza durante aproximadamente 6 hasta aproximadamente 168 horas , aproximadamente 6 hasta aproximadamente 144 horas , aproximadamente 6 hasta aproximadamente 120 horas , aproximadamente 6 hasta aproximadamente 96 horas , aproximadamente 6 hasta aproximadamente 72 horas , aproximadamente 6 hasta aproximadamente 48 horas , aproximadamente 6 hasta aproximadamente 24 horas , aproximadamente 6 hasta aproximadamente 12 horas , aproximadamente 6 horas , aproximadamente 12 hasta aproximadamente 168 horas , aproximadamente 12 hasta aproximadamente 144 horas , aproximadamente 12 hasta aproximadamente 120 horas , aproximadamente 12 hasta aproximadamente 96 horas , aproximadamente 12 hasta aproximadamente 72 horas , aproximadamente 12 hasta aproximadamente 48 horas , aproximadamente 12 hasta aproximadamente 24 horas , aproximadamente 12 horas , aproximadamente 24 hasta aproximadamente 168 horas , aproximadamente 24 hasta aproximadamente 144 horas , aproximadamente 24 hasta aproximadamente 120 horas , aproximadamente 24 hasta aproximadamente 96 horas , aproximadamente 24 hasta aproximadamente 72 horas , aproximadamente 24 hasta aproximadamente 48 horas , aproximadamente 24 horas , aproximadamente 48 hasta aproximadamente 168 horas , aproximadamente 48 hasta aproximadamente 144 horas , aproximadamente 48 hasta aproximadamente 120 horas , aproximadamente 48 hasta aproximadamente 96 horas , aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas , aproximadamente 48 horas , aproximadamente 72 hasta aproximadamente 168 horas , aproximadamente 72 hasta aproximadamente 144 horas , aproximadamente 72 hasta aproximadamente 120 horas , aproximadamente 72 hasta aproximadamente 96 horas , aproximadamente 72 horas , aproximadamente 96 hasta aproximadamente 168 horas , aproximadamente 96 hasta aproximadamente 144 horas , aproximadamente 96 hasta aproximadamente 120 horas , aproximadamente 96 horas , aproximadamente 120 hasta aproximadamente 168 horas , aproximadamente 120 hasta aproximadamente 144 horas , 120 horas aproximadamente, aproximadamente 144 hasta aproximadamente 168 horas , aproximadamente 144 horas, o aproximadamente 168 horas. En cada uno de los aspectos anteriores para la temperatura de las condiciones de alta temperatura, la sacarificación se realiza durante por lo menos 6 horas , por lo menos 12 horas, por lo menos 24 horas, por lo menos 4£ i horas, por lo menos 72 horas , por lo menos 96 horas, por lo menos 120 horas, por lo menos 144 horas, o por lo menos 168 horas.

En cada uno de los aspectos anteriores para la temperatura y el tiempo de sacarificación de las condiciones de alta temperatura, la sacarificación se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 8 , aproximadamente 3.5 hasta aproximadamente 7.5, aproximadamente 4 hasta aproximadamente 7, aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6.5, aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 6.5, aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 6, aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6, aproximadamente 5 hasta aproximadamente 6 , aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 5.5, o aproximadamente 5 hasta aproximadamente 5.5.

En cada uno de los aspectos anteriores para la temperatura, el tiempo de sacarificación, y el pH de sacarificación de las condiciones de alta temperatura, el contenido de sólidos secos del material celulósico es aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50% en peso, aproximadamente 10 hasta aproximadamente 40% en peso, aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso, aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30% en peso, o aproximadamente 25 hasta aproximadamente 30% en peso. En cada uno de los aspectos anteriores para la temperatura, el tiempo de sacarificación, y el pH de sacarificación de las condiciones de alta temperatura, el contenido de sólidos secos del material celulósico es de por lo menos 5% en peso, por lo menos 10% en peso, por lo menos 15% en peso, por lo menos 20% en peso, por lo menos 25% en peso, por lo menos 30% en peso, por lo menos 35% en peso, por lo menos 40% en peso, o por lo menos 45% en peso.

En una modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 65°C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 55 °C hasta aproximadamente 65°C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 56 °C hasta aproximadamente 65°C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 57°C hasta aproximadamente 65°C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 58 °C hasta aproximadamente 65 °C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso.

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 59 °C hasta aproximadamente 65°C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 60°C hasta aproximadamente 65°C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 61°C hasta aproximadamente 65 °C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 62 °C hasta aproximadamente 65°C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 63 °C hasta aproximadamente 65 °C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso.

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 64 °C hasta aproximadamente 65°C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 64 °C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 63 °C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 62 °C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 61°C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso.

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 60°C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 55 °C hasta aproximadamente 64 °C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 56 °C hasta aproximadamente 64 °C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 56 °C hasta aproximadamente 63 °C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 57 °C hasta aproximadamente 62 °C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso.

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 58 °C hasta aproximadamente 61°C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

En otra modalidad preferida, las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 59 °C hasta aproximadamente 60° C durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 y un contenido de sólidos secos del material celulósico de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso .

Polipéptidos que tienen actividad celulolítica mejorada y polinucleótidos de los mismos En una modalidad, los polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad celulolítica mejorada tienen una identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 de por lo menos 60%, por ejemplo, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, por lo menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, en menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o 100%; que tiene actividad celulolítica mejorada. En un aspecto, los polipéptidos GH61 difieren hasta en un 10 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2.

Un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada preferiblemente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o una variante alélica del mismo, o es un fragmento del mismo que tiene actividad celulolítica mejorada. En otro aspecto, el polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada comprende o consiste del polipéptido maduro de la SEC ID NO : 2. En otro aspecto, el polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada comprende o consiste de los aminoácidos 22 a 344 de la SEC ID NO : 2.

En otra modalidad, los polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad celulolítica mejorada son codificados por polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones de astringencia muy baja, condiciones de astringencia baja, condiciones de astringencia media, condiciones de astringencia media-alta, condiciones de astringencia alta o condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) (Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York) .

El polinucleótido de la SEC ID NO: 1, o una subsecuencia del mismo, así como el polipéptido de la SEC ID NO: 2, o un fragmento del mismo, se pueden usar para diseñar sondas de ácidos nucleicos para identificar y clonar ADN que codifican polipéptidos que tienen actividad celulolítica mejorada de cepas de diferentes géneros o especies de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte previo. En particular, tales sondas se pueden usar para la hibridación con el ADN genómico o ADNc de una célula de interés, siguiendo procedimientos de Southern Blot estándar, con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente en el mismo. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían ser de por lo menos 15, por ejemplo, por lo menos 25, por lo menos 35, o por lo menos 70 nucleótidos de longitud. Preferiblemente, la sonda de ácido nucleico es por lo menos 100 nucleótidos de longitud, por ejemplo, por lo menos 200 nucleótidos, por lo menos 300 nucleótidos, por lo menos 400 nucleótidos, por lo menos 500 nucleótidos, por lo menos 600 nucleótidos, por lo menos 700 nucleótidos, por lo menos 800 nucleótidos, o por lo menos 900 nucleótidos de longitud. Ambas sondas de ADN y ARN pueden ser utilizadas. Las sondas se marcan típicamente para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina, o avidina) . Tales sondas están comprendidas por la presente invención.

Un ADN genómico o blibliteca de ADNc preparados de tales otras cepas pueden ser examinados para ADN que se híbrida con las sondas descritas anteriormente y codifica un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada. El ADN genómico u otro ADN de tales otras cepas puede ser separado por agarosa o electroforesis en gel de poliacrilamida, u otras técnicas de separación. ADN de las bibliotecas o el ADN separado puede ser transfectado a, e inmovilizado en nitrocelulosa u otro material portador apropiado. Con el fin de identificar un clon o ADN que se híbrida con la SEC ID NO: 1 o una subsecuencia de la misma, el material portador se usa en una Southern Blot .

Para los propósitos de la presente invención, la hibridación indica que el polinucleótido se híbrida a una sonda de ácido nucleico marcada correspondiente a (i) SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO : 1, (iii) la secuencia ADNc del mismo, (iv) el complemento de longitud completa del mismo; o (v) una subsecuencia del mismo; bajo condiciones de astringencia muy baja o muy alta. Las moléculas a las que la sonda de ácido nucleico que se híbrida bajo estas condiciones pueden ser detectadas usando, por ejemplo, película de rayos X o cualquier otro medio de detección conocido en el arte previo.

En un aspecto, la sonda de ácido nucleico es un polinucleótido que codifica el polipéptido GH61 de la SEC ID NO: 2; el polipéptido maduro del mismo, o un fragmento del mismo. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es la SEC ID NO: 1, la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, o la secuencia de ADNc del mismo.

En otra modalidad, los polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad celulolítica mejorada están codificados por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia con la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, o la secuencia de ADNc del mismo, de por lo menos 60%, por ejemplo, por lo menos 65 %, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, por lo menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87 %, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97 %, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o 100%.

En otra modalidad, los polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad celulolítica mejorada son variantes del polipéptido maduro de la SEC ID N ° : 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En un aspecto, el número de sustituciones de aminoácidos, deleciones y/o inserciones introducidas en el polipéptido maduro de la SEC ID N O: 2 es de hasta 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10. Los cambios de aminoácidos pueden ser de una naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadores que no afectan significativamente el plegamiento y/o actividad de la proteína; deleciones pequeñas, típicamente de 1-30 aminoácidos; extensiones amino pequeñas o terminales carboxilo, tales como un residuo de metionina amino terminal, un péptido de enlace pequeño de hasta 20-25 residuos, o una extensión pequeña que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de poli-histidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina) , aminoácidos aromáticos ( fenilalanina, triptófano y tirosina) , y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) . Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas en el arte previo y se describen, por ejemplo, por H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

Alternativamente, los cambios de aminoácidos son de una naturaleza tal que las propiedades físico-químicas de los polipéptidos son alteradas. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, actividad térmica del polipéptido, alterar la especificidad de sustrato, cambiar el pH óptimo, y similares.

Los aminoácidos esenciales en un polipéptido pueden ser identificados de acuerdo con procedimientos conocidos en el arte previo, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la última técnica, mutaciones únicas de alanina se introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se prueban para actividad celulolítica mejorada para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton et al., 1996, J. Biol . Chem. 271:4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también puede ser determinado por análisis físico de la estructura, como se determina por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica o etiquetado por fotoafinidad, junto con mutación de aminoácidos de sitio de contacto putativo. Ver, por ejemplo, de Vos et al, 1992, Science 255: 306-312; Smith et al, 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al, 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también se puede inferir de una alineación con un polipéptido relacionado.

Sustituciones, deleciones y/o inserciones simples o múltiples de aminoácidos, pueden ser hechas y probadas utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación, y/o transposición, seguido de un procedimiento de cribado relevante, tales como los descritos por Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc . Nati. Acad. Ciencia. USA 86: 2152-2156; O 95/17413, o WO 95/22625. Otros métodos que pueden ser usados incluyen PCR propenso a errores, expresión en fago Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; U.S. Patent No. 5,223,409; WO 92/06204) , y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al, 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7:127) .

Los métodos de mutagénesis/transposición se pueden combinar con métodos de cribado automatizados de alto rendimiento para detectar actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por células huésped (Ness et al, 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896) . Moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células huésped y secuenciadas rápidamente usando métodos estándares en el arte previo. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido.

El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido en el que una región de un polipéptido se fusiona en el extremo N-terminal o el extremo C-terminal de una región de otro polipéptido .

El polipéptido puede ser un polipéptido de fusión o polipéptido de fusión hendible en el que otro polipéptido se fusiona en el extremo N-terminal o el extremo C-terminal del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce mediante la fusión de un polinucleótido que codifica otro polipéptido a un polinucleótido de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas en el arte previo, e incluyen ligar las secuencias de codificación que codifican los polipéptidos de modo que estén en marco y que la expresión del polipéptido de fusión está bajo el control del mismo promotor y terminador. Los polipéptidos de fusión también se pueden construir usando tecnología de inteína en la que los polipéptidos de fusión se crean después de la traducción (Cooper et al, 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al, 1994, Science 266: 776-779) .

Un polipéptido de fusión puede comprender además un sitio de división entre los dos polipéptidos. Durante la secreción de la proteína de fusión, el sitio es dividido liberando los dos polipéptidos. Ejemplos de sitios de división incluyen, pero no se limitan a, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol . Biotechnol . 3: 568-576; Svetina et al, 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al, 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493, Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; and Contreras et al, 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al, 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Cárter et al, 1989, Proteins: Structure, Function and Genetics 6: 240-248, and Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Fuentes de polipéptidos que tienen actividad celulolítica mej orada Un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada puede ser obtenido de microorganismos de cualquier género. Para los propósitos de la presente invención, el término "obtenido de" como se utiliza en este documento en relación con una fuente dada se entenderá que el polipéptido codificado por un polinucleótido es producido por la fuente o por una cepa en la que el polinucleótido de la fuente se ha insertado. En un aspecto, el polipéptido obtenido de una fuente dada es segregado extracelularmente.

El polipéptido puede ser un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido bacteriano gram-positivo tal como un polipéptido Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, o Streptomyces que tienen actividad [enzima] , o un polipéptido bacteriano gram-negativo tal comoun polipéptido Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, o Ureaplasma .

En un aspecto, el polipéptido es un polipéptido Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus egaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, o Bacillus thuringiensis .

El polipéptido puede ser un polipéptido fúngico. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido de levadura tal como Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia, o un polipéptido de hongo filamentoso, tal como un polipéptido Acremonium, Agaricus, Alternaría, Aspergillus, Aurantiporus, Aureobasidiu , Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella o Xylaria .

En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces norbensis, o Saccharomyces oviformis.

En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, trichothecioides Fusarium, Fusarium venenatum, Humicola grísea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido Trichoderma. En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido Trichoderma reesei. En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido Trichoderma reesei RutC30.

Se entenderá que para las especies mencionadas anteriormente la invención abarca tanto los estados perfectos e imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de la especie por el cual se les conoce. Las personas experimentadas en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de equivalentes apropiados .

Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en un número de colecciones de cultivo, tales como la Collection American Type Culture (ATCC) , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) , y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) .

El polipéptido puede ser identificado y obtenido de otras fuentes, incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) utilizando las sondas mencionadas anteriormente. Las técnicas para aislar microorganismos y el ADN directamente de hábitats naturales son bien conocidas en el arte previo. Un polinucleótido que codifica el polipéptido puede entonces obtenerse mediante el cribado de forma similar de un ADN genómico o biblioteca de ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mezclada. Una vez que un polinucleótido que codifica un polipéptido ha sido detectado con la sonda, el polinucleótido puede ser aislado o clonado utilizando técnicas que son conocidas por las personas experimentadas en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra) .

Polinucleótidos Los polinucleótidos que codifican polipéptidos GH61 que tienen actividad celulolítica mejorada pueden ser aislados y utilizados para practicar los métodos de la presente invención, tal como se describe en este documento.

Las técnicas usadas para aislar o clonar un polinucleótido se conocen en el arte previo e incluyen aislamiento de ADN genómico o ADNc, o una combinación de los mismos. La clonación de los polinucleótidos del ADN genómico puede ser efectuada, por ejemplo, mediante el uso de reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) bien conocida o cribado de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Ver, por ejemplo, Innis et al, 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Pueden ser usados otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos tales como reacción en cadena de ligasa (LCR, por sus siglas en inglés) , transcripción activada ligada (LAT, por sus siglas en inglés) y amplificación basada en polinucleótidos (NASBA) . Los polinucleótidos pueden ser clonados de una cepa de Trichoderma , o un organismo relacionado y por lo tanto, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de especies de la región que codifica el polipéptido del polinucleótido .

La modificación de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para sintizar polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas del polipéptido de origen no natural. Estos polipéptidos pueden diferir de alguna forma modificada genéticamente del polipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes que difieren en actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo, o similares. Las variantes se pueden construir sobre la base del polinucleótido presentada como la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1 o la secuencia de ADNc del mismo, por ejemplo, una subsecuencia del mismo, y/o por introducción de sustituciones de nucleótidos que no resultan en un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que corresponden al uso del codón del organismo huésped previsto para la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de sustitución de nucleótidos, ver, por ejemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107. Constructos de ácido nucleico Un polinucleótido que codifica un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada puede ser unido operativamente a una o más secuencias de control que dirige la expresión de la secuencia de codificación en una célula huésped apropiada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control .

El polinucleótido puede ser manipulado en una variedad de formas para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar los polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidos en el arte previo.

La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por una célula huésped para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. El promotor contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestra actividad transcripcional en la célula huésped incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y puede ser obtenido de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos o heterólogos a la célula huésped.

Ejemplos de promotores apropiados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped bacteriana son los promotores obtenidos del gen alfa-amilasa Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) , gen de alfa-amilasa Bacillus licheniformis (amyL) , gen de penicilinasa Bacillus licheniformis (penP) , gen de amilasa maltogénica Bacillus stearothermophilus (amyM) , gen de levansucrasa Bacillus subtilis (SacB) , genes xylA y xylB Bacillus subtilis, gen CryIIIA Bacillus thuringiensis (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), lac operón de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al, 1988,. Gene 69: 301 -315), gen de agarasa Streptomyces coelicolor (dagA) , y el gen de beta- lactamasa procariótica (Villa-Kamaroff et al, 1978, Proc Nati Acad Sci USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc Nati Acad. Sci. USA 80:21-25). Otros promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" in Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; and in Sambrook et al., 1989, supra . Ejemplos de promotores en tándem se describen en WO 99/43835.

Ejemplos de promotores apropiados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico en una célula huésped fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido Aspergillus niger, glucoamilasa (glaA) Aspergillus niger o Aspergillus awamori, amilasa TAKA Aspergillus oryzae, proteasa alcalina Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daría (WO00/56900 ) , Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), lipasa Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II Trichoderma reesei, endoglucanasa I Trichoderma reesei, endoglucanasa II Trichoderma reesei, endoglucanasa III Trichoderma reesei, endoglucanasa V Trichoderma reesei, xilanasa I Trichoderma reesei, xilanasa II Trichoderma reesei, xilanasa III Trichoderma reesei, beta-xilosidasa Trichoderma reesei, y factor de elongación de traducción Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado a partir de un gen de alfa-amilasa neutro Aspergillus en la que el líder no traducido ha sido sustituido por un líder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa Aspergillus; ejemplos no limitantes incluyen promotores modificados de un gen de alfa-amilasa neutro Aspergillus niger en el que el líder no traducido ha sido sustituido por un líder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae) , y promotores imitantes, truncados, híbridos de los mismos. Otros promotores se describen en la Patente Estadounidense NO 6,011,147.

En un huésped de levadura, se obtienen promotores útiles de los genes para enolasa Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , galactocinasa (GAL1) Saccharomyces cerevisiae, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) Saccharomyces cerevisia , triosa fosfato isomerasa (TPI) Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) Saccharomyces cerevisiae, y 3 -fosfoglicerato cinasa Saccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos et al, 1992, Yeast 8: 423-488.

La secuencia de control también puede ser un terminador de transcripción, que es reconocido por una célula huésped para terminar la transcripción. El terminador está operativamente unido al extremo 3' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped puede ser utilizado en la presente invención .

Los terminadores preferidos para las células huésped bacterianas se obtienen de los genes para proteasa alcalina (APRH) Bacillus clausii , alfa-amilasa (amyL) Bacillus licheniformis, y ARN ribosomal (rrnB) Escherichia coli .

Los terminadores preferidos para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para acetamidasa Aspergillus nidulans, antranilato sintasa Aspergillus nidulans, glucoamilasa Aspergillus niger, alfa-glucosidasa Aspergillus niger, amilasa TAKA Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina Fusarium oxysporum, beta-glucosidasa Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II Trichoderma reesei, endoglucanasa I Trichoderma reesei, endoglucanasa II Trichoderma reesei, endoglucanasa III Trichoderma reesei, endoglucanasa V Trichoderma reesei, xilanasa I Trichoderma reesei, xilanasa II Trichoderma reesei, xilanasa III Trichoderma reesei, beta-xilosidasa Trichoderma reesei, y factor de elongación de traducción Trichoderma reesei.

Los terminadores preferidos para células huéspedes de levadura se obtienen de los genes para enolasa Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) Saccharomyces cerevisiae, y gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa Saccharomyces cerevisiae . Otros terminadores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora AR m en dirección 3' de un promotor y en dirección 5' de la secuencia de codificación de un gen que aumenta la expresión del gen.

Ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm apropiadas se obtienen de un gen CryIIIA Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) y un gen SP82 Bacillus subtilis (Hue et al, 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465 a 3471).

La secuencia de control puede también ser un líder, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. El líder está unido operativamente al extremo 5' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Cualquier líder que es funcional en la célula huésped puede ser utilizado.

Líderes preferidos para células huéspedes filamentosas fúngicas se obtienen de los genes para Amilasa TAKA Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa Aspergillus nidulans .

Líderes apropiados para células huéspedes de levadura se obtienen de los genes para enolasa Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , 3 -fosfoglicerato cinasa Saccharomyces cerevisiae, factor alfa Saccharomyces cerevisiae, y alcohol deshidrogenasa /gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) Saccharomyces cerevisiae.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente unida al extremo 3' del polinucleótido y, cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como una señal para agregar residuos de poliadenosina a ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped puede ser utilizada.

Secuencias de poliadenilación preferidas para células huéspedes fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para antranilato sintasa Aspergillus nidulans, glucoamilasa Aspergillus niger, alfa-glucosidasa Aspergillus niger, amilasa TAKA Aspergillus oryzae, y proteasa similar a tripsina Fusarium oxysporum.

Secuencias de poliadenilación útiles para células huéspedes de levadura son descritas por Guo and Sherman, 1995, Mol. Biol. Celular. 15: 5983-5990.

La secuencia de control también puede ser una región de codificación del péptido señal que codifica un péptido señal unido al extremo N-terminal de un polipéptido y dirige el polipéptido en la vía de secreción celular. El extremo 5' de la secuencia de codificación del polinucleótido puede contener inherentemente una secuencia de codificación del péptido señal naturalmente unida en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia de codificación que codifica el polipéptido. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia de codificación puede contener una secuencia de codificación del péptido señal que es exogena a la secuencia de codificación. Una secuencia de codificación del péptido señal exógeno puede ser requerida en donde la secuencia de codificación no contiene naturalmente una secuencia que codifica el péptido señal. Alternativamente, una secuencia de codificación del péptido señal exógeno puede simplemente reemplazar la secuencia que codifica el péptido señal natural con el fin de aumentar la secreción del polipéptido. Sin embargo, se puede usar cualquier secuencia de codificación del péptido señal que dirige el polipéptido expresado en la vía de secreción de una célula huésped.

Secuencias de codificación del péptido señal eficaces para células huésped bacterianas son las secuencias que codifican el péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica NCIB 11837 Bacillus, subtilisina Bacillus licheniformis , beta- lactamasa Bacillus licheniformis, alfa-amilasa Bacillus stearother ophilus, proteasas neutras (nprT, nprS, NPRM) Bacillus stearothermophilus y Bacillus subtilis prsA. Otros péptidos señal son descritos por Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Secuencias de codificación del péptido señal eficaces para las células huéspedes fúngicas filamentosas son la secuencias de codificación del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa neutra Aspergillus niger, glucoamilasa Aspergillus niger, amilasa TAKA Aspergillus oryzae, celulasa Humicola insolens, endoglucanasa V Humicola insolens, lipasa Humicola lanuginosa y proteinasa aspártica Rhizomucor miehei.

Péptidos señal útiles para células huéspedes de levadura se obtienen de los genes para el factor alfa Saccharomyces cerevisiae e invertasa Saccharomyces cerevisiae . Otras secuencias de codificación del péptido señal útiles son descritas por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de codificación del propéptido que codifica un propéptido posicionado en el extremo N-terminal de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos) . Un propolipéptido está generalmente inactivo y puede ser convertido a un polipéptido activo por división catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La secuencia de codificación del propéptido puede ser obtenida de los genes para proteasa alcalina (aprE) Bacillus subtilis, proteasa neutra (nprT) Bacillus subtilis, lacasa Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) , proteinasa aspártica Rhizomucor miehei, y factor alfa Saccharomyces cerevisiae .

Cuando ambas las secuencias de péptido señal y propéptido están presentes, la secuencia de propéptido está situada junto al extremo N-terminal de un polipéptido y la secuencia del péptido señal está situada junto al extremo N-terminal de la secuencia del propéptido.

También puede ser deseable agregar secuencias reguladoras que regulan la expresión del polipéptido en relación al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de secuencias reguladoras son las que provocan que la expresión del gen sea activada o desactivada en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Las secuencias reguladoras en sistemas procarióticos incluyen los sistemas operadores lac, trp y tac. En la levadura, se pueden usar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En los hongos filamentosos, el promotor de glucoamilasa Aspergillus niger, promotor alfa-amilasa TAKA Aspergillus oryzae, y promotor de glucoamilasa Aspergillus oryzae, promotor de celobiohidrolasa I Trichoderma reesei , y promotor de celobiohidrolasa II Trichoderma reesei puede ser utilizado. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación de genes. En sistemas eucarióticos , estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa que se amplifica en la presencia de metotrexato, y los genes de metalo ioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido sería operativamente unido con la secuencia reguladora .

Vectores de Expresión Un polinucleótido que codifica un polipéptido GH61 y varios ácidos nucleicos y secuencias de control descritas en este documento puede unirse juntos para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido en tales sitios.

Alternativamente, el polinucleótido puede ser expresado mediante la inserción del polinucleótido o un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia de codificación se localiza en el vector de modo que la secuencia de codificación está operativamente unida con las secuencias de control apropiadas para expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y pueden provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que el vector se va a introducir. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado .

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación . Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el cromosoma en el que ha sido integrado. Además, se pueden utilizar un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total para ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

El vector contiene preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección fácil de células transformadas, transíectadas , transducidas , o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o viral, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares.

Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son genes Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis dal, o marcadores que confieren resistencia a los antibióticos tales como resistencia a la ampicilina, cloranfenicol , kanamicina, neomicina, espectinomicina, o tetraciclina . Los marcadores apropiados para células huéspedes de levadura incluyen, pero no se limitan a, ADE2 , HIS3 , LEU2 , LYS2 , MET3 , TRP1, y URA3. Los marcadores seleccionables para el uso en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, pero no se limitan a, AdeA (fosforibosilaminoimidazol-succinocarboxamida sintasa) , adeB (fosforribosil-aminoimidazol sintasa) , amdS (acetamidasa) , argB (ornitina carbamoiltransferasa) , bar ( fosfinotricina acetiltransferasa) , hph (higromicina fosfotransferasa) , niaD (nitrato reductasa) , pyrG (orotidina-5 '-fosfato decarboxilasa) , sC (sulfato adeniltransferasa) , y trpC (antranilato sintasa) , así como equivalentes de los mismos. Se prefieren para uso en una célula Aspergillus genes Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae amdS y pyrG y un gen Streptomyces hygroscopicus bar. Se prefieren para su uso en una célula Trichoderma genes adeA, adeB, amdS, hph, y pyrG.

El marcador seleccionable puede ser un sistema de marcador seleccionable dual tal como se describe en WO 2010/039889. En un aspecto, el marcador seleccionable dual es un sistema marcador seleccionable dual hph-tk.

El vector contiene preferiblemente un elemento que permite la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia de codificación del polinucleótido el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homologa en el genoma de la célula huésped en una ubicación precisa en el cromosoma. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tales como 100 a 10,000 pares de base, 400 a 10,000 pares de bases, y 800 hasta 10,000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que es homologa con la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser polinucleótidos no codificados o codificados. Por otro lado, el vector puede ser integrado en el genoma de la célula huésped por recombinación no homologa.

Para la replicación autónoma, el vector además puede comprender un origen de replicación que permite que el vector se replique de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plásmido que media la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "plásmido replicador" significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 permitiendo la replicación en E. coli, y PubllO, pE194, pTA1060, y ???ß? permitiendo la replicación en Bacillus .

Ejemplos de orígenes de replicación para uso en una célula huésped de levadura son los orígenes de replicación de 2 mieras, ARS1, ARS4 , la combinación de ARS1 y CEN3 , y la combinación de ARS4 y CEN6.

Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANSI (Gems et al, 1991, Gene 98: 61 -67; Cullen et al, 1987, Nucleic Acids Res. 15:9163-9175; WO 00/24883) . El aislamiento del gen AMA1 y construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se puede lograr de acuerdo con los métodos descritos en WO 00/24883.

Más de una copia de un polinucleótido de la presente invención se puede insertar en una célula huésped para aumentar la producción de un polipéptido. Un aumento en el número de copias del polinucleótido puede ser obtenido mediante la integración de por lo menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o mediante la inclusión de un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido en donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y de este modo copias adicionales del polinucleótido, pueden ser seleccionadas cultivando las células en la presencia del agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes son bien conocidos para una persona experimentada en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al . , 1989 , supra) .

Células huéspedes Las células huéspedes recombinantes que comprenden un polinucleótido GH61 que codifica un polipéptido que tiene actividad celulolítica mejorada unido operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción de un polipéptido que puede utilizarse ventajosamente en la producción recombinante del polipéptido. Un constructo o vector que comprende un polinucleótido es introducido en una célula huésped de modo que el constructo o vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante como se describió anteriormente. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula madre que no es idéntica a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped en gran parte dependerá del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de un polipéptido de la presente invención, por ejemplo, una procariota o eucariota.

La célula huésped procariótica puede ser cualquier bacteria Gram positiva o Gram negativa. Las bacterias Gram positivas incluyen, pero no se limitan a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, y Streptomyces . Las bacterias Gram negativas incluyen, pero no se limitan a, Campylobac er, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudo onas, Salmonella, y Ureaplasma .

La célula huésped bacteriana puede ser cualquier célula Bacillus, incluyendo, pero no limitado a, células Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis .

La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula Streptococcus incluyendo, pero no limitada a células, Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, y Streptococcus equi subs . zooepidemicus .

La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula Streptomyces, incluyendo, pero no limitado a células Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, y Streptomyces lividans.

La introducción de ADN en una célula de Bacillus puede ser efectuada por transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Chang and Cohén, 1979, Mol Gen. Genet 168: 111-115), transformación de células competentes (ver, por ejemplo, Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol 81:823-829, or Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol Biol. 56: 209-221), electroporacion (ver, por ejemplo, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (ver, por ejemplo, Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula E. coli puede ser efectuada por transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol Biol. 166:557-580) o electroporacion (ver, por ejemplo, Dower et al, 1988, Nucleic Acids Res. 16:6127-6145). La introducción de ADN en una célula Streptomyces puede ser efectuada por transformación de protoplastos, electroporacion (ver, por ejemplo, Gong et al, 2004, Folia Microbiol (Praha) 49:399-405), conjugación (ver, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol 171:. 3583-3585), o transducción (ver, por ejemplo, Burke et al, 2001, Proc Nati Acad Sci USA 98:6289-6294) . La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas se puede efectuar por electroporacion (ver, por ejemplo, Choi et al, 2006, J. Microbiol Methods 64:391-397) o conjugación (ver, por ejemplo, Pinedo and Smets, 2005, Appl . Environ. Microbiol. 71:51-57). La introducción de ADN en una célula Streptococcus puede ser efectuada por competencia natural (ver, por ejemplo, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporacion (ver, por ejemplo, Buckley et al, 1999, Appl Environ. Microbiol. 65:3800-3804), o conjugación (ver, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45:409-436). Sin embargo, cualquier método conocido en el arte previo para introducir ADN en una célula huésped se puede utilizar.

La célula huésped también puede ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta, o fúngica.

La célula huésped puede ser una célula fúngica. "Fúngica", como se usa en este documento incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota, así como Oomycota y todos los hongos mitospóricos (tal como se define por Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) .

La célula huésped fúngica puede ser una célula de levadura. "Levadura" como se usa en este documento incluye levadura ascosporogenea (Endomicetales) , levadura basidiosporogénea, y levadura que pertenece a los hongos imperfectos (Blastomicetes) . Puesto que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los propósitos de esta invención, la levadura será definida como se describió en Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc . App. Bacteriol . Symposium Series NO 9, 1980) .

La célula huésped de levadura puede ser una célula Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia tal como una célula Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, o Yarrowia lipolytica .

La célula huésped fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. "Fúngica filamentosa" incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumicota y Oomicota (como es definido por Hawksworth et al., 1995, supra) . Fúngicos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, ma ano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación hifal y catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es mediante gemación de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

La célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Corioli , Cryptococcus, Filibasidium, Fusahum, Humicola, Magnaporthe, Mucor Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladiu , Trametes, o Trichoderma.

Por ejemplo, la célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, bactridioides Fusahum, Fusahum cerealis, Fusahum crookwellense, Fusahum culmorum, Fusahum graminearum , Fusahum graminum, Fusahum heterosporum, Fusahum negundi, Fusahum oxysporum, Fusahum reticulatum, Fusahum roseum, Fusahum sambucinu , Fusahum sarcochroum, Fusahum sporotrichioides, Fusahum sulphureum, Fusahum torulosum, Fusahum trichothecioides, Fusahum venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata , Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride .

Las células fúngicas pueden ser transformadas por un proceso que implica la formación de protoplastos , transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared celular en una manera conocida per se. Procedimientos apropiados para la transformación de células huésped Aspergillus y Trichoderma están descritos en EP 238023, Yelton et al, 1984, Proc . Nati. Acad. Ciencia. USA 81: 1470-1474, and Christensen et al, 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Los métodos apropiados para transformar especies Fusahum se describen por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, y O 96/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker and Guarente, In Abelson, JN and Simón, .I., editors, Guide Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol . 153:163,- and Hinnen et al., 1978, Proc. Na i. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de Producción Un polipéptido GH61 de la presente invención se puede producir usando métodos que comprenden: (a) cultivar una célula, que en su forma de tipo silvestre produce el polipéptido, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido, y opcionalmente (b) recuperar el polipéptido. En un aspecto, la célula es una célula Trichoderma. En otro aspecto, la célula es una célula Trichoderma reesei. En otro aspecto, la célula es Trichoderma reesei RutC30.

Un polipéptido GH61 de la presente invención también puede ser producido utilizando métodos que comprenden: (a) cultivar una célula huésped recombinante de la presente invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido, y opcionalmente (b) recuperar el polipéptido.

Las células huésped se cultivan en un medio nutritivo apropiado para la producción del polipéptido usando métodos conocidos en el arte previo. Por ejemplo, las células se pueden cultivar mediante cultivo en matraz de agitación, o fermentación en pequeña escala o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lotes, por lote alimentado, o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales en un medio apropiado y bajo condiciones permitiendo que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo se lleva a cabo en un medio nutritivo apropiado que comprende fuentes de carbono o nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en el arte previo. Los medios apropiados están disponibles de proveedores comerciales o pueden ser preparados de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la Colección Americana de Cultivo Tipo) . Si el polipéptido es segregado en el medio nutritivo, el polipéptido puede ser recuperado directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado, puede ser recuperado de lisatos celulares.

El polipéptido puede ser detectado usando métodos conocidos en el arte previo que son específicos para los polipéptidos . Estos métodos de detección incluyen, pero no se limitan a, el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático, o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, un ensayo enzimático se puede utilizar para determinar la actividad del polipéptido.

El polipéptido puede ser recuperado mediante métodos conocidos en el arte previo. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitado a, colección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación. En un aspecto, un caldo de fermentación que comprende el polipéptido es recuperado .

El polipéptido puede ser purificado por una variedad de procedimientos conocidos en el arte previo, incluyendo, pero no limitado a, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad hidrofóbica, cromatoenfoque, y exclusión por tamaño) , procedimientos electroforáticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio) , SDS-PAGE, o extracción (ver, por ejemplo, Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros.

En un aspecto alternativo, el polipéptido no es recuperado, sino más bien una célula huésped de la presente invención que expresa el polipéptido ese utilizado como una fuente del polipéptido.

Formulaciones de caldo de fermentación o composiciones celulares La presente invención también se refiere a una formulación de caldo de fermentación o una composición celular que comprende un polipéptido GH61 de la presente invención. El producto de caldo de fermentación comprende además ingredientes adicionales utilizados en el proceso de fermentación, tales como, por ejemplo, células (incluyendo, las células huésped que contienen el gen que codifica el polipéptido de la presente invención que se utiliza para producir el polipéptido de interés), restos celulares, biomasa, medios de fermentación y/o productos de fermentación. En algunas modalidades, la composición es un caldo entero de células muertas que contiene ácido orgánico, células muertas y/o residuos de células, y medio de cultivo.

El término "caldo de fermentación" tal como se utiliza aquí, se refiere a una preparación producida por fermentación celular que no experimenta ninguna o mínima recuperación y/o purificación. Por ejemplo, los caldos de fermentación se producen cuando los cultivos microbianos se hacen crecer hasta la saturación, incubados bajo condiciones limitantes de carbono para permitir la síntesis de proteínas (por ejemplo, la expresión de enzimas por células huésped) y secreción en el medio de cultivo celular. El caldo de fermentación puede contener contenidos no fraccionados o fraccionados de los materiales de fermentación derivados al final de la fermentación. Típicamente, el caldo de fermentación es no fraccionado y comprende el medio de cultivo gastado y los restos de células presented después de que se retiran las células microbianas (por ejemplo, células de hongos filamentosos) , por ejemplo, por centrifugación. En algunas modalidades, el caldo de fermentación contiene medio de cultivo de células gastadas, enzimas extracelulares , y viables y/o células microbianas viables.

En una modalidad, la formulación del caldo de fermentación y composiciones celulares comprenden un primer componente de ácido orgánico que comprende por lo menos un ácido orgánico de 1-5 carbonos y/o una sal del mismo y un segundo componente de ácido orgánico que comprende por lo menos uno o más ácidos orgánicos de carbono y/o una sal del mismo. En una modalidad específica, el primer componente de ácido orgánico es ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, una sal del mismo, o una mezcla de dos o más de los anteriores y el segundo componente de ácido orgánico es ácido benzoico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, una sal del mismo, o una mezcla de dos o más de los anteriores.

En un aspecto, la composición contiene un ácido orgánico, y además opcionalmente contiene células muertas y/o restos de células. En una modalidad, las células muertas y/o residuos de células se retiran del caldo entero de células muertas para proporcionar una composición que está libre de estos componentes .

Las formulaciones de caldo de fermentación o composiciones celulares además pueden comprender un conservador y/o agente anti-microbiano (por ejemplo, bacteriostático) , incluyendo, pero no limitado a sorbitol, cloruro de de sodio, sorbato de potasio, y otros conocidos en el arte previo.

El caldo entero o composición de células muertas pueden contener los contenidos no fraccionados de los materiales de fermentación derivados al final de la fermentación. Típicamente, el caldo entero o composición de células muertas contienen el medio de cultivo gastado y restos de células presente después de las células microbianas (por ejemplo, células de hongos filamentosos) se hacen crecer hasta la saturación, se incubaron bajo condiciones limitantes de carbono para permitir la síntesis de proteínas. En algunas modalidades, el caldo entero o composición de células muertas contiene el medio de cultivo celular gastado, enzimas extracelulares , y células de hongos filamentosos muertos. En algunas modalidades, las células microbianas presentes en el caldo entero o composición de células muertas pueden ser permeabilizadas y/o lisadas usando métodos conocidos en el arte previo.

Un caldo enetero o composición de células como se describe en este documento es típicamente un líquido, pero pueden contener componentes insolubles, tales como células muertas, restos celulares, componentes de medios de cultivo, y/o enzimas insolubles. En algunas modalidades, los componentes insolubles pueden ser eliminados para proporcionar una composición líquida clarificada.

Las formulaciones de caldo entero y composiciones celulares de la presente invención se pueden producir por un método descrito en O 90/15861 o WO 2010/096673.

Composiciones enzimáticas La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido GH61 de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones se enriquecen en tal polipéptido. El término "enriquecido" indica que la actividad celulolítica mejorada de la composición ha sido aumentada, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de por lo menos 1.1.

Las composiciones pueden comprender un polipéptido GH61 de la presente invención como el componente enzimático principal, por ejemplo, una composición monocomponente . Alternativamente, las composiciones pueden comprender múltiples actividades enzimáticas, tales como una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una celulasa, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swollenina. Las composiciones también pueden comprender una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una hidrolasa, una isomerasa, una ligasa, una liasa, una oxidorreductasa , o una transferasa, por ejemplo, una alfa-galactosidasa, alfa-glucosidasa, aminopeptidasa, amilasa, beta-galactosidasa, beta-glucosidasa, beta-xilosidasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celobiohidrolasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, glucoamilasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa , enzima proteolítica , ribonucleasa, transglutaminasa, o xilanasa.

Las composiciones pueden ser preparadas de acuerdo con métodos conocidos en el arte previo y pueden estar en forma de un líquido o una composición seca. Las composiciones se pueden estabilizar de acuerdo con métodos conocidos en el arte previo .

Procesamiento de material celulósico El procesamiento de un material celulósico de acuerdo con los métodos de la presente invención puede llevarse a cabo usando procedimientos convencionales en el arte previo. Por otra parte, los métodos de la presente invención pueden ser implementados usando cualquier aparato de tratamiento de biomasa convencional configurado para operar de acuerdo con la invención. La producción de un producto de fermentación deseado en el material celulósico implica típicamente pretratamiento, hidrólisis enzimática (sacarificación) , y fermentación .

Hidrólisis (sacarificación) y fermentación, separadas o simultáneas, incluyen, pero no se limitan a, hidrólisis y fermentación separadas (SHF, por sus siglas en inglés) , sacarificación y fermentación simultáneas (SSF, por sus siglas en inglés) ; sacarificación y co-fermentación simultáneas (SSCF, por sus siglas en inglés) , hidrólisis híbrida y fermentación (HHF, por sus siglas en inglés) ; hidrólisis y co-fermentación separadas (SHCF, por sus siglas en inglés) ; hidrólisis híbrida y co- fermentación (HHCF, por sus siglas en inglés) , y conversión microbiana directa (DMC, por sus siglas en inglés) , también llamada algunas veces bioprocesamiento consolidado (CBP, por sus siglas en inglés) . SHF utiliza pasos de proceso separados para primero hidrolizar enzimáticamente el material celulósico en azúcares fermentables , por ejemplo, glucosa, celobiosa, y monómeros de pentosa, y después fermentar los azúcares fermentables en etanol . En SSF, la hidrólisis enzimática del material celulósico y la fermentación de los azúcares a etanol se combinan en un solo paso (Philippidis , G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol : Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212) . SSCF implica la co-fermentación de azúcares múltiples (Sheehan, J. , and Himmel, M. , 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy' s research and development activities for bioethanol, Biotechnol . Prog. 15: 817-827) . HHF implica un paso de hidrólisis separada, y además una sacarificación simultánea y la etapa de hidrólisis, que se puede llevar a cabo en el mismo reactor. Los pasos de un proceso de HHF pueden llevarse a cabo a diferentes temperaturas, en este caso, sacarificación enzimática a alta temperatura seguida de SSF a una temperatura inferior que la cepa de fermentación puede tolerar. DMC combina los tres procesos (producción de la enzima, hidrólisis y fermentación) en uno o más (por ejemplo, varios) pasos en los que se utiliza el mismo organismo para producir las enzimas para la conversión del material celulósico en azúcares fermentables y para convertir los azúcares fermentables en un producto final (Lynd, L. R. , Weimer, P. J. , van Zyl , W. H. , and Pretorius, I. S., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentáis and biotechnology, Microbiol . Mol. Biol . Reviews 66: 506-577) . Se entiende en este documento que cualquier método conocido en el arte previo que comprende el pretratamiento, hidrólisis enzimática (sacarificación) , la fermentación, o una combinación de los mismos, se puede utilizar en la práctica de los métodos de la presente invención.

Un aparato convencional puede incluir un reactor agitado por lote alimentado, un reactor agitado por lotes, un reactor agitado de flujo continuo con ultrafiltración, y/o un reactor de columna de flujo de tapón continuo (Fernanda de Castilhos Corazza, Flavio Faria de Moraes, Gisella María Zanin and Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V., and Sinitsyn, A. P.( 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz . icrob. Technol . 7: 346-352), an attrition reactor (Ryu, S. K. , and Lee, J. M. , 1983, Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor, Biotechnol . Bioeng. 25: 53-65), or a reactor with intensive stirring induced by an electromagnetic field (Gusakov, A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, 0. V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl . Biochem. Biotechnol. 56: 141-153) . Tipos de reactores adicionales incluyen: reactores de lecho fluidizado, manta de flujo ascendente, y tipo extrusor para hidrólisis y/o fermentación inmovilizados.

Pretratamiento . En la práctica de los métodos de la presente invención, cualquier proceso de tratamiento previo conocido en el arte previo puede ser utilizado para alterar los componentes de la pared celular de la planta del material celulósico (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment : The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics? Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol . 108: 67-93; Galbe and Zacchi, 2007, Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production, Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks and Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh and Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int. J. of Mol. Sci. 9: 1621-1651 ; Yang and Wyman, 2008, Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr . 2: 26-40) .

El material celulósico también puede ser sometido a reducción de tamaño de partícula, tamizado, pre-remojo, humectación, lavado, y/o acondicionamiento antes del pretratamiento usando métodos conocidos en el arte previo.

Pre-tratamientos convencionales incluyen, pero no se limitan a, pretratamiento de vapor (con o sin explosión) , pretratamiento con ácido diluido, pretratamiento de agua caliente, pretratamiento alcalino, pretratamiento de cal, oxidación húmeda, explosión húmeda, explosión de fibra de amonio, pretratamiento organosolv, y pretratamiento biológico. Pretratamientos adicionales incluyen percolación de amoníaco, ultrasonido, electroporación, microondas, C02 supercrítico, H20 supercrítico, ozono, líquido iónico, y pretratamientos de irradiación gama .

El material celulósico puede ser pretratado antes de la hidrólisis y/o fermentación. El pretratamiento se lleva a cabo preferiblemente antes de la hidrólisis. Alternativamente, el tratamiento previo puede llevarse a cabo simultáneamente con hidrólisis enzimática para liberar los azúcares fermentables , tales como glucosa, xilosa, y/o celobiosa. En la mayoría de los casos el paso de pretratamiento en sí resulta en alguna conversión de biomasa para azúcares fermentables (incluso en ausencia de enzimas) .

Pretratamiento de vapor. En pretratamiento de vapor, el material celulósico es calentado para alterar los componentes de la pared celular de plantas, incluyendo lignina, hemicelulosa y celulosa para hacer la celulosa y otras fracciones, por ejemplo, hemicelulosa, accesibles a las enzimas. El material celulósico se hace pasar a o a través de un recipiente de reacción en donde se inyecta vapor para aumentar la temperatura a la temperatura y presión requeridas y es retenido en el mismo para el tiempo de reacción deseado. El pretratamiento de vapor se realiza preferiblemente a 140-250°C, por ejemplo, 160-200°C o 170-190°C, en donde el intervalo de temperatura óptimo depende de la adición de un catalizador químico. El tiempo de residencia para el pretratamiento de vapor es preferiblemente 1-60 minutos, por ejemplo, 1-30 minutos, 1-20 minutos, 3-12 minutos, o 4-10 minutos, en donde el tiempo de residencia óptimo depende del intervalo de temperatura y la adición de un catalizador químico. El pretratamiento de vapor permite cargas de sólidos relativamente altas, de modo que el material celulósico es generalmente sólo húmedo durante el pretratamiento. El pretratamiento de vapor se combina frecuentemente con una descarga explosiva del material después del pretratamiento que se conoce como explosión de vapor, es decir, parpadeo rápido a presión atmosférica y flujo turbulento del material para aumentar el área superficial accesible mediante fragmentación (Duff and Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe and Zacchi, 2002, Ap l . Microbiol . Biotechnol . 59: 618-628; U.S. Patent Application No. 20020164730) . Durante el pretratamiento de vapor, los grupos de acetil hemicelulosa son dividios y el ácido resultante autocataliza hidrólisis parcial de la hemicelulosa a monosacáridos y oligosacáridos . La lignina se elimina solamente de manera limitada.

Pretratamiento químico: El término "tratamiento químico" se refiere a cualquier pretratamiento químico que promueve la separación y/o la liberación de la celulosa, hemicelulosa y/o lignina. Tal pretratamiento puede convertir la celulosa cristalina a celulosa amorfa. Ejemplos de procesos de pretratamiento químicos apropiados incluyen, por ejemplo, pretratamiento con ácido diluido, pretratamiento de cal, oxidación húmeda, explosión de fibras con amoniaco (AFEX, por sus siglas en inglés) , percolación de amoniaco (TAE, por sus siglas en inglés) , líquido iónico, y pretratamientos con organosolv.

Un catalizador tal como H2S04 o S02 (típicamente 0.3 hasta 5% peso/peso) se agrega frecuentemente antes del pretratamiento de vapor, que disminuye el tiempo y la temperatura, aumenta la recuperación, y mejora la hidrólisis enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl . Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al. , 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 1 13-1 16: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme icrob. Technol . 39: 756-762). En el pretratamiento con ácido diluido, el material celulósico se mezcla con ácido diluido, típicamente H2S04, y agua para formar una emulsión, calentado por vapor a la temperatura deseada, y después de un tiempo de residencia dirigido a la presión atmosférica. El pretratamiento con ácido diluido se puede realizar con un número de diseños de reactores, por ejemplo, reactores de flujo tapón, reactores contra corriente, o reactores de lecho retráctil contra corriente continuo (Duff and Murray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol . 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol . 65: 93-115).

Varios métodos de pretratamiento bajo condiciones alcalinas también se pueden utilizar. Estos pretratamientos alcalinos incluyen, pero no se limitan a hidróxido de sodio, cal, oxidación húmeda, percolación de amoniaco (APR) , explosión de fibras con amoniaco (AFEX) .

El pretratamiento de cal se realiza con óxido de calcio o hidróxido de calcio a temperaturas de 85-150°C y tiempos de residencia de 1 hora a varios días (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673-686). WO 2006/110891, WO 2006/110 899, WO 2006/110900, y WO 2006/110901 describen métodos de pretratamiento, usando amoniaco.

La oxidación en húmedo es un pretratamiento térmico realizado típicamente a 180-200°C durante 5-15 minutos con la adición de un agente oxidante tal como peróxido de hidrógeno o sobre-presión de oxígeno (Schmidt and Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl . Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). El pretratamiento se realiza preferiblemente a 1-40% de materia seca, por ejemplo, 2-30% de materia seca o 5-20% de materia seca, y frecuentemente el pH inicial se incrementa por la adición de álcali, tal como carbonato de sodio.

Una modificación del método de pretratamiento de oxidación en húmedo, conocido como explosión húmeda (combinación de oxidación húmeda y explosión de vapor) , puede manejar la materia seca hasta 30%. En explosión húmeda, se introduce el agente oxidante durante el pretratamiento después de un cierto tiempo de residencia. El pretratamiento se termina entonces mediante vaporización instantánea a presión atmosférica (WO 2006/032282) .

La explosión de fibra de amoníaco (AFEX) consiste en tratar el material celulósico con amoníaco líquido o gaseoso a temperaturas moderadas tales como 90-150°C y alta presión, tal como 17-20 bar durante 5-10 minutos, en donde el contenido de materia seca puede ser tan alta como 60% (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol . 98: 23-35; Chunda at et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1 133-1 141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol . 96: 2014-2018). Durante el pretratamiento de AFEX la celulosa y hemicelulosas se mantienen relativamente intactas. Complejos de lignina-carbohidratos son divididos .

El pretratamiento Organosolv deslignifica el material celulósico mediante extracción con etanol acuoso (etanol al 40-60%) a 160-200°C durante 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol . Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Ap l . Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). El ácido sulfúrico generalmente se agrega como un catalizador. En el pretratamiento organosolv, se elimina la mayor parte de hemicelulosa y lignina.

Otros ejemplos de métodos de pretratamiento adecuados se describen por Schell et al., 2003, Ap l. Biochem. y Biotechnol. Vol . 105-108, p. 69-85, y Mosier et al, 2005, Bioresource Technology 96:673-686, y U.S. Publishided Application 2002/0164730.

En un aspecto, el pretratamiento químico se lleva a cabo preferiblemente como un tratamiento con ácido diluido, y más preferiblemente como un tratamiento con ácido diluido continuo. El ácido es típicamente ácido sulfúrico, pero otros ácidos también se pueden utilizar, tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloruro de hidrógeno, o mezclas de los mismos. El tratamiento de ácido suave se lleva a cabo en el intervalo de pH de preferiblemente 1-5, por ejemplo, 1-4 o 1-2.5. En un aspecto, la concentración de ácido está en el intervalo de preferiblemente 0.01 hasta 10% en peso de ácido, por ejemplo, 0.05 a 5% en peso de ácido o 0.1 a 2% en peso de ácido. El ácido se pone en contacto con el material celulósico y se mantiene a una temperatura en el intervalo de preferiblemente 140-200°C, por ejemplo, 165-190°C, por periodos que se encuentran en el intervalo desde 1 hasta 60 minutos .

En otro aspecto, el pretratamiento se lleva a cabo en una suspensión acuosa. En aspectos preferidos, el material celulósico está presente durante el pretratamiento en cantidades preferiblemente entre 10-80% en peso, por ejemplo, 20-70% en peso o 30-60% en peso, tal como aproxiamdamente 40% en peso. El material celulósico pretratado puede estar sin lavar o lavado usando cualquier método conocido en el arte previo, por ejemplo, lavado con agua.

Pretratamiento mecánico o pretratamiento físico: El término "pretratamiento mecánico" o "pretratamiento físico" se refiere a cualquier pretratamiento que promueve la reducción del tamaño de las partículas. Por ejemplo, tal pretratamiento puede implicar diferentes tipos de trituración o molido (por ejemplo, molido en seco, molido en húmedo, o molino de bolas vibratorio) .

El material celulósico puede ser pretratado tanto físicamente (mecánicanicamente) y químicamente. El pretratamiento físico o mecánico puede ser acoplado con vaporización/explosión de vapor, hidrotermolisis , tratamiento con ácido diluido o suave, alta temperatura, tratamiento de alta presión, irradiación (por ejemplo, irradiación de microondas) , o combinaciones de los mismos. En un aspecto, alta presión significa presión en el intervalo de preferiblemente aproximadamente 100 hasta aproximadamente 400 psi (6.89-27.58 Bares), por ejemplo, aproximadamente 150 hasta aproximadamente 250 psi (10.34-17.24 Bares). En otro aspecto, alta temperatura significa temperaturas en el intervalo de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 300°C, por ejemplo, aproximadamente 140 hasta aproximadamente 200°C. En un aspecto preferido, el pretratamiento mecánico o físico se lleva a cabo en un proceso discontinuo utilizando un sistema hidrolizador de pistola de vapor que utiliza alta presión y alta temperatura tal como se definió anteriormente, por ejemplo, un hidrolizador Sunds disponible de Sunds Defibrator AB, Suecia. Los pretratamientos físicos y químicos pueden llevarse a cabo secuencialmente o simultáneamente, según se desee.

En consecuencia, en un aspecto preferido, el material celulósico se somete a pretratamiento físico (mecánico) o químico, o cualquier combinación de los mismos, para promover la separación y/o la liberación de celulosa, hemicelulosa y/o lignina .

Pretratamiento Biológico: El término "pretratamiento biológico" se refiere a cualquier pretratamiento biológico que promueve la separación y/o la liberación de celulosa, hemicelulosa y/o lignina del material celulósico. Técnicas de pretratamiento biológicos pueden involucrar aplicación de microorganismos solubilizantes de lignina y/o enzimas (ver, por ejemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol : Production and Utilization, Wyraan, C. E., ed. , Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh and Singh, 1993, Physicochemical and biological treatraents for enzymatic/microbial conversión of cellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversión of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. 0., and Overend, R. P., eds . , ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, C. S., Cao, N. J. , Du, J., and Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed. , Springer-Verlag Berlín Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson and Hahn-Hagerdal , 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz . Microb. Tech. 18: 312-331; and Vallander and Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng . /Biotechnol . 42: 63-95).

Sacarificación . En el paso de hidrólisis, también conocido como sacarificación, el material celulósico, por ejemplo, pretratado, es hidrolizado para descomponer la celulosa y/o hemicelulosa en azúcares fermentables , tales como glucosa, celobiosa, xilosa, xilulosa, arabinosa, mañosa, galactosa, y/u oligosacáridos solubles. La hidrólisis se lleva a cabo enzimáticamente por una composición de enzima en la presencia de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada de la presente invención. Las enzimas de las composiciones se pueden agregar simultáneamente o secuencialmente .

La hidrólisis enzimática se lleva a cabo preferiblemente en un ambiente acuoso apropiado bajo condiciones que se pueden determinar fácilmente por una persona experimentada en la técnica. En un aspecto, la hidrólisis se lleva a cabo en condiciones apropiadas para la actividad de la enzima, en este caso, óptimo para la enzima. La hidrólisis puede llevarse a cabo como un proceso por lote alimentado o continuo en el que el material celulósico se alimenta gradualmente a, por ejemplo, una enzima que contiene solución de hidrólisis.

La sacarificación se lleva a cabo generalmente en reactores de tanque agitado o fermentadores bajo condiciones de pH temperatura, y mezclado controladas. Condiciones de proceso, tiempo, temperatura y pH apropiadas pueden ser fácilmente determinadas por una persona experimentada en la técnica. Por ejemplo, la sacarificación puede durar hasta 200 horas, pero típicamente se realiza preferiblemente por aproximadamente 6 o aproximadamente 12 hasta aproximadamente 120 horas o aproximadamente 168 horas, por ejemplo, aproximadamente 24 hasta aproximadamente 168 horas, durante 16 hasta aproximadamente 72 horas, durante aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas, o aproximadamente 24 hasta aproximadamente 48 horas. La temperatura puede estar en el intervalo de aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 70°C, pero preferiblemente en un intervalo de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 70 °C tal como se define en este documento. El pH está en el intervalo de preferiblemente aproximadamente 3 hasta aproximadamente 8, por ejemplo, aproximadamente 3.5 hasta aproximadamente 7, aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6, aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 5.5, o aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 5.5. El contenido de sólidos secos está en el intervalo de preferiblemente aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50% en peso, por ejemplo, aproximadamente 10 hasta aproximadamente 40% en peso, aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30% en peso, o aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30% en peso.

Las composiciones enzimáticas pueden comprender cualquier proteína útil en la degradación o convertir el material celulósico en las condiciones de alta temperatura descritas en este documento.

En un aspecto, la composición enzimática comprende o además comprende una o más (por ejemplo, varias) proteínas seleccionadas del grupo que consiste de una celulasa, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica , una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swollenina. En otro aspecto, la celulasa es preferiblemente una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, y una beta-glucosidasa . En otro aspecto, la hemicelulasa es preferiblemente una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una acetilmanano esterasa, una acetilxilano esterasa, una arabinanasa, una arabinofuranosidasa, una esterasa de ácido cumárico, una feruloil esterasa, una galactosidasa , una glucuronidasa, una glucuronoil esterasa, una mananasa, una manosidasa, una xilanasa, y una xilosidasa.

En otro aspecto, la composición enzimática comprende una o más (por ejemplo, varias) enzimas celulolíticas . En otro aspecto, la composición enzimática comprende o además comprende una o más (por ejemplo, varias) enzimas hemicelulolíticas . En otro aspecto, la composición enzimática comprende una o más (por ejemplo, varias) enzimas celulolíticas y una o más (por ejemplo, varias) enzimas hemicelulolíticas. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo de enzimas celulolíticas y enzimas hemicelulolíticas. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una celobiohidrolasa. En otro aspecto, la composición comprende una enzima beta-glucosidasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa y una celobiohidrolasa . En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa y una beta-glucosidasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una celobiohidrolasa y una beta-glucosidasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, y una beta-glucosidasa.

En otro aspecto, la composición enzimática comprende una acetilmanano esterasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una acetilxilano esterasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una arabinanasa (por ejemplo, alfa-L-arabinanasa) . En otro aspecto, la composición comprende una enzima arabinofuranosidasa (por ejemplo, alfa-L-arabinofuranosidasa) . En otro aspecto, la composición enzimática comprende una esterasa de ácido cumárico. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una feruloil esterasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una galactosidasa (por ejemplo, alfa-galactosidasa y/o beta-galactosidasa) . En otro aspecto, la composición enzimática comprende una glucuronidasa (por ejemplo, alfa-D-glucuronidasa) . En otro aspecto, la composición enzimática comprende una glucuronoil esterasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una mananasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una manosidasa (por ejemplo, beta-manosidasa) . En otro aspecto, la composición enzimática comprende una xilanasa. En un aspecto preferido, la xilanasa es una xilanasa de la familia 10. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una xilosidasa (por ejemplo, beta-xilosidasa) .

En otro aspecto, la composición enzimática comprende una esterasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una expansina. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una lacasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una enzima ligninolítica . En un aspecto preferido, la enzima ligninolítica es una peroxidasa de manganeso. En otro aspecto preferido, la enzima ligninolítica es una peroxidasa de lignina. En otro aspecto preferido, la enzima ligninolítica es una enzima que produce H202. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una pectinasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una peroxidasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una proteasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una swollenina.

En los métodos de la presente invención, la enzima se puede agregar antes o durante la sacarificación, sacarificación y fermentación, o fermentación.

Uno o más (por ejemplo, varios) componentes de la composición enzimática pueden ser proteínas en estado natural, proteínas recombinantes , o una combinación de proteínas en estado natural y proteínas recombinantes. Por ejemplo, uno o más (por ejemplo, varios) componentes pueden ser proteínas nativas de una célula, que se usa como una célula huésped para expresar recombinantemente uno o más (por ejemplo, varios) otros componentes de la composición enzimática. Uno o más (por ejemplo, varios) componentes de la composición enzimática pueden ser producidos como monocomponentes, que después se combinan para formar la composición enzimática. La composición enzimática puede ser una combinación de preparaciones de proteína de componentes múltiples y monocomponentes.

Las enzimas utilizadas en los métodos de la presente invención pueden estar en cualquier forma apropiada para su uso, tales como, por ejemplo, una formulación de caldo de fermentación o una composición celular, un lisato celular con o sin desechos celulares, una preparación enzimática semi-purificada o purificada, o una célula huésped como una fuente de las enzimas. La composición enzimática puede ser un polvo seco o granulado, un granulado no espolvoreado, un líquido, un líquido estabilizado, o una enzima protegida estabilizada. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas agregando estabilizadores tales como un azúcar, un alcohol de azúcar u otro poliol, y/o ácido láctico u otro ácido orgánico de acuerdo con los procesos establecidos.

Las cantidades óptimas de las enzimas y polipéptidos que tienen actividad celulolítica mejorada dependen de varios factores, incluyendo, pero no limitado a, la mezcla de componentes de enzimas celulolíticas enzimas y/o enzimas hemicelulolíticas , el material celulósico, la concentración de material celulósico, el pretratamiento del material celulósico, temperatura, tiempo, pH, e inclusión del organismo de fermentación (por ejemplo, levadura para la sacarificación y fermentación simultáneas) .

En un aspecto, una cantidad eficaz de enzima celulolítica o hemicelulolitica para el material celulósico es aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 50 mg, por ejemplo. aproximadamente 0 .5 hasta aproximadamente 40 mg, aproximadamente 0 .5 hasta aproximadamente 25 mg, aproximadamente 0 .75 hasta aproximadamente 20 mg, aproximadamente 0 .75 hasta aproximadamente 15 mg, aproximadamente 0. 5 hasta aproximadamente 10 mg, o aproximadamente 2.5 hasta aproximadamente 10 mg por g de material celulósico.

En otro aspecto, una cantidad eficaz de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada para el material celulósico es aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 50.0 mg, por ejemplo, aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 40 mg, aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 30 mg, aproximadamente 0 .01 hasta aproximadamente 20 mg, aproximadamente 0 .01 hasta aproximadamente 10 mg, aproximadamente 0 .01 hasta aproximadamente 5 mg, aproximadamente 0. 025 hasta aproximadamente 1.5 mg, aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 1.25 mg, aproximadamente 0.075 hasta aproximadamente 1.25 mg, aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 1.25 mg, aproximadamente 0.15 hasta aproximadamente 1.25 mg, o aproximadamente 0.25 hasta aproximadamente 1.0 mg por g de material celulósico.

En otro aspecto, una cantidad eficaz de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada a la enzima celulolítica o ]nemicelulolitica es aproximadamente 0.005 hasta aproximadamente 1.0 g, por ejemplo, aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 1.0 aproximadamente 0.15 hasta aproximadamente 0.75 aproximadamente 0.15 hasta aproximadamente 0.5 g» aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 0.5 g, aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 0.25 9, o aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 0.2 g por g de enzima celulolítica o hemicelulolítica .

En los métodos de la presente invención, un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada de la presente invención se utiliza en la presencia de un catión metálico divalente de activación soluble de acuerdo con WO 2008/151043, por ejemplo, sulfato de manganeso.

En otro aspecto, el polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada se utiliza en la presencia de un compuesto dioxi, un compuesto bicíclico, un compuesto heterocíclico, un compuesto que contiene nitrógeno, un compuesto de quinona, un compuesto que contiene azufre, o un licor obtenido de un material celulósico pretratado tal como rastrojo de maíz pretratado (PCS, por sus siglas en inglés) .

El compuesto dioxi puede incluir cualquier compuesto apropiado que contiene dos o más átomos de oxígeno. En algunos aspectos, los compuestos dioxi contienen un resto arilo sustituido como se describe en este documento. Los compuestos dioxi pueden comprender uno o más (por ejemplo, varios) derivados de hidroxilo y/o hidroxilo, sino que también incluyen restos arilo sustituidos que carecen de derivados de hidroxilo e hidroxilo. Ejemplos no limitantes de los compuestos dioxi incluyen pirocatecol o catecol; ácido cafeico, ácido 3 , 4 -dihidroxibenzoico; 4-terc-butil-5-metoxi-1 , 2 -bencenodiol ; pirogalol, ácido gálico; metil-3,4,5-trihidroxibenzoato; 2 , 3 , 4 -trihidroxibenzofenona ; 2,6-dimetoxifenol ; ácido sinapínico; ácido 3 , 5-dihidroxibenzoico ; 4-cloro-l, 2 -bencenodiol , 4 -nitro- 1 , 2 -bencenodiol ; ácido tánico; galato de etilo, glicolato de metilo, ácido dihidroxifumárico ; 2-butino- 1 , 4 -diol ; (ácido crocónico; 1,3-propanodiol, ácido tartárico; 2 , 4 -pentanodiol , 3-etoxi-l,2-propanodiol; 2 , 4 , 4 -trihidroxibenzofenona ; cis-2 -buteno-1 , 4 -diol ; 3 , 4 -dihidroxi-3 -ciclobuteno- 1 , 2 -diona; dihidroxiacetona ; acetal de acroleína; metil -4 -hidroxibenzoato de metilo, ácido -hidroxibenzoico , y metil-3 , 5-dimetoxi-4-hidroxibenzoato; o una sal o solvato del mismo.

El compuesto bicíclico puede incluir cualquier sistema de anillo fusionado sustituido apropiado tal como se describe en este documento. Los compuestos pueden comprender uno o más (por ejemplo, varios) anillos adicionales, y no están limitados a un número específico de anillos a menos que se indique lo contrario. En un aspecto, el compuesto bicíclico es un flavonoide. En otro aspecto, el compuesto bicíclico es un isoflavonoide opcionalmente sustituido. En otro aspecto, el compuesto bicíclico es un ion flavilio opcionalmente sustituido, tal como una antocianina opcionalmente sustituida o antocianidina opcionalmente sustituida, o derivado de los mismos. Ejemplos no limitantes de los compuestos bicíclicos incluyen epicatequina; quercetina; miricetina; taxifolina; kaempferol; morina; acacetina; naringenina ; isoramnetina apigenina; cianidina; cianina; kuromanina; keracianina ; o una sal o solvato de los mismos.

El compuesto heterocíclico puede ser cualquier compuesto apropiado, tal como un anillo aromático o no aromático opcionalmente sustituido que comprende un heteroátomo, tal como se describe en este documento. En un aspecto, el heterocíclico es un compuesto que comprende un resto heterocicloalquilo opcionalmente sustituido o un resto heteroarilo opcionalmente sustituido. En otro aspecto, el resto heteroarilo opcionalmente sustituido o heterocicloalquilo opcionalmente sustituido es un heterocicloalquilo de 5 miembros opcionalmente sustituido o un resto heteroarilo de 5 miembros opcionalmente sustituido. En otro aspecto, el resto heteroarilo opcionalmente sustituido o heterocicloalquilo opcionalmente sustituido es un resto opcionalmente sustituido seleccionado de pirazolilo, furanilo, imidazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, oxazolilo, pirrolilo, piridilo, pirimidilo, piridazinilo, tiazolilo, triazolilo, tienilo, dihidrotieno-pirazolilo, tianaftenilo, carbazolilo, bencimidazolilo, benzotienilo, benzofuranilo, indolilo, quinolinilo, benzotriazolilo, benzotiazolilo, benzooxazolilo, bencimidazolilo, isoquinolinilo, isoindolilo, acridinilo, benzoisazolilo, dimetilhidantoína, pirazinilo, tetrahidrofuranilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, morfolinilo, indolilo, diazepinilo, azepinilo, tiepinilo, piperidinilo, y oxepinilo. En otro aspecto, el resto heteroarilo opcionalmente sustituido o heterocicloalquilo opcionalmente sustituido es un furanilo opcionalmente sustituido. Ejemplos no limitantes de los compuestos heterocíclicos incluyen (1 , 2 -dihidroxietil ) -3 , -dihidroxifuran-2 (5H) -ona; 4 -hidroxi-5 -metil-3 - furanona; 5-hidroxi-2 ( 5H) -furanona; [1 , 2 -dihidroxietil] furano-2 , 3 , 4 (5H) -triona; a-hidroxi -Y-butirolactona ; ?-lactona ribónica; ?-lactona del ácido aldohexuronicaldohexuronico, d-lactona del ácido glucónico; 4 -hidroxicumarina; dihidrobenzofurano; 5-(hidroximetil ) furfural ; furoina; 2 -(5H) -furanona; 5,6-dihidro- 2H-piran-2-ona y 5 , 6 -dihidro-4 -hidroxi -6-metil-2H-pirano-2 -ona, o una sal o solvato de los mismos.

El compuesto que contiene nitrógeno puede ser cualquier compuesto apropiado con uno o más (por ejemplo, varios) átomos de nitrógeno. En un aspecto, el compuesto que contiene nitrógeno comprende una amina, imina, hidroxilamina, o resto de nitróxido. Ejemplos no limitantes de los compuestos que contienen nitrógeno incluyen acetona oxima; ácido violúrico; piridina-2-aldoxima; 2-aminofenol ; 1 , 2 -bencenodiamina ; 2 , 2 , 6 , 6-tetrametil-l-piperidiniloxi ; 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina; 6 , 7-dimetil-5 , 6 , 7 , 8-tetrahidropterina, y ácido maleámico, o una sal o solvato de los mismos.

El compuesto de quinona puede ser cualquier compuesto apropiado que comprende un resto quinona tal como se describe en este documento. Ejemplos no limitantes de los compuestos de quinona incluyen 1 , 4 -benzoquinona ; 1, 4-naftoquinona; 2-hidroxi -1 , -naftoquinona ; 2 , 3 -dimetoxi - 5 -metil -1 , 4 -benzoquinona o coenzima Q0í- 2 , 3 , 5 , 6 -tetrametil -1 , 4-benzoquinona o duroquinona ; 1 , 4 -dihidroxiantraquinona ; 3-hidroxi-l-metil-5, 6 - indolinediona o adrenocromo ; 4-ter-butil-5 -metoxi - 1 , 2 -benzoquinona ; pirroloquinolina quinona, o una sal o solvato de los mismos.

El compuesto que contiene azufre puede ser cualquier compuesto apropiado que comprende uno o más (por ejemplo, varios) átomos de azufre. En un aspecto, el que contiene azufre comprende un resto seleccionado de tionilo, tioéter, sulfinilo, sulfonilo, sulfamida, sulfonamida, ácido sulfónico y éster sulfónico. Ejemplos no limitantes de los compuestos que contienen azufre incluyen etanotiol; 2-propanotiol ; 2-propeno-l-tiol , ácido 2 -mercaptoetanosulfónico; bencenotiol; benceno-1 , 2 -ditiol ; cisteína; metionina; glutatión; cistina, o un sal o solvato de los mismos.

En un aspecto, una cantidad eficaz de tal compuesto descrito anteriormente con respecto al material celulósico como una proporción molar de unidades de glucosilo de celulosa es aproximadamente 10"s hasta aproximadamente 10, por ejemplo, aproximadamente 10"6 hasta aproximadamente 7.5, aproximadamente 10~6 hasta aproximadamente 5, aproximadamente 10"5 hasta aproximadamente 2.5, aproximadamente 10"6 hasta aproximadamente 1, aproximadamente 10"5 hasta aproximadamente 1, aproximadamente 10"5 hasta aproximadamente 10"1, aproximadamente 10"4 hasta aproximadamente 10"1 , aproximadamente 10~3 hasta aproximadamente 10"1 , o aproximadamente 10"3 hasta aproximadamente 10"2. En otro aspecto, una cantidad eficaz de un compuesto como se ha descrito anteriormente es desde aproximadamente 0.1 µ? hasta aproximadamente 1 M, por ejemplo, aproximadamente 0.5 µ? hasta aproximadamente 0.75 M, aproximadamente 0.75 µ? hasta aproximadamente 0.5 M, aproximadamente 1 µ? hasta aproximadamente 0.25 M, aproximadamente 1 µ? hasta aproximadamente 0.1 M, aproximadamente 5 µ? hasta aproximadamente 50 mM, aproximadamente 10 µ? hasta aproximadamente 25 mM, aproximadamente 50 µ? hasta aproximadamente 25 mM, aproximadamente 10 µ? hasta aproximadamente 10 mM, aproximadamente 5 µ? hasta aproximadamente 5 mM, o aproximadamente 0.1 mM hasta aproximadamente 1 mM.

El término "licor" significa la fase de solución, ya sea acuosa, orgánica, o una combinación de las mismas, producidas por el tratamiento de un material de lignocelulosa y/o hemicelulosa en una suspensión, o monosacáridos de los mismos, por ejemplo, xilosa, arabinosa, mañosa, etc., bajo condiciones como se describen aquí, y los contenidos solubles de los mismos. Un licor para mejoramiento celulolítico de un polipéptido GH61 puede ser producido por el tratamiento de un material de lignocelulosa o hemicelulosa (o materia prima) mediante la aplicación de calor y/o presión, opcionalmente en la presencia de un catalizador, por ejemplo, ácido, opcionalmente en la presencia de un solvente orgánico, y opcionalmente en combinación con una alteración física del material, y después separar la solución de los sólidos residuales. Tales condiciones determinan el grado de mejoramiento celulolítico que se puede obtener a través de la combinación de licor y un polipéptido GH61 durante la hidrólisis de un sustrato celulósico por una preparación de celulasa. El licor puede ser separado del material tratado usando un método estándar en el arte previo, tal como filtración, sedimentación, o centrifugación.

En un aspecto, una cantidad eficaz del licor a la celulosa es aproximadamente 10"6 hasta aproximadamente 10 g por g de celulosa, por ejemplo, aproximadamente 10"6 hasta aproximadamente 7.5 9. aproximadamente 10"6 hasta aproximadamente 5 9, aproximadamente 10"6 hasta aproximadamente 2.5 9 aproximadamente 10"6 hasta aproximadamente 1 g. aproximadamente 10"5 hasta aproximadamente 1 g» aproximadamente 10"5 hasta aproxiamadamente 10" aproximadamente 10"4 hasta aproximadamente ío-1 g» aproximadamente 10~3 hasta aproximadamente 10"1 o aproximadamente IO'3 hasta aproximadamente 10"2 g por g de celulosa.

Los polipéptidos que tienen actividad de la enzima celulolítica o actividad de la enzima hemicelulolítica, así como otras proteínas/polipéptidos útiles en la degradación del material celulósico (colectivamente de aquí en adelante "polipéptidos que tienen actividad enzimática") pueden ser derivados u obtenidos de cualquier origen apropiado, incluyendo, origen bacteriano, fúngico, de levadura, de plantas, o de mamífero. El término "obtenido" también significa en este documento que la enzima puede haber sido producida de manera recombinante en un organismo huésped que emplea métodos descritos en este documento, en el que la enzima producida recombinantemente es ya sea nativa o exógena para el organismo huésped o tiene una secuencia de aminoácidos modificada, por ejemplo, que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos que son eliminados, insertados y/o sustituidos, en este caso, una enzima producida recombinantemente que es un mutante y/o un fragmento de una secuencia de aminoácidos nativa o una enzima producida por los procesos de transposición de ácido nucleico conocidos en el arte previo. Comprendidas dentro del significado de una enzima natural son variantes naturales y en el sentido de una enzima exogena son variantes obtenidas recombinantemente, como por mutagénesis dirigida en sitio o transposición.

Un polipéptido que tiene actividad enzimática puede ser un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido bacteriano Gram positivo tal como un polipéptido Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, Caldicellulosiruptor, Acidothermus, Thermobifidia, u Oceanobacillus que tiene actividad enzimática, o un polipéptido bacteriano Gram negativo tal como un polipéptido E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, llyobacter, Neisseria , o Ureaplasma que tiene actividad enzimática.

En un aspecto, el polipéptido es un polipéptido Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, o Bacillus thuringiensis que tiene actividad enzimática.

En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, o Streptococcus equi subsp. zooepidemicus que tiene actividad enzimática.

En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, o Streptomyces lividans que tiene actividad enzimática.

El polipéptido que tiene actividad enzimática también puede ser un polipéptido fúngico, y más preferiblemente un polipéptido de levadura tal como un polipéptido Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaecharomyces, o Yarrowia que tiene actividad enzimática, o más preferiblemente un polipéptido fungico filamentoso tal como polipéptido Acremonium, Agaricus, Alternaría, Aspergillus, Aureobasidiu , Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola , Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania , Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Ther oascus , Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, o Xylaria que tiene actividad enzimát ica .

En un aspecto, el polipéptido es un polipéptido Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces norbensis, o Saccharomyces oviformis que tiene actividad enzimática.

En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori , Aspergillus fu igatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans , Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, inops Chrysosporium, Chrysosporium pannicola , Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, trichothecioides Fusarium, Fusarium venenatum, Humicola grísea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora , Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride o Trichophaea saccata que tiene actividad enzimática.

También se pueden utilizar mutantes modificados genéticamente por proteínas o modificados químicamente de polipéptidos que tienen actividad enzimática.

Uno o más (por ejemplo, varios) componentes de la composición enzimática puede ser un componente recombinante , en este caso, producido por clonación de una secuencia de ADN que codifica el componente simple y la célula subsecuente transformada con la secuencia de ADN y expresada en un huésped (ver, por ejemplo, WO 91/17243 y WO 91/17244) . El huésped es preferiblemente un huésped heterologo (la enzima es exógena al huésped) , pero el huésped puede bajo ciertas condiciones también ser un huésped homólogo (la enzima es nativa al huésped) . Proteínas celulolíticas monocomponentes también pueden ser preparadas mediante la purificación de una proteína de un caldo de fermentación.

En un aspecto, uno o más (por ejemplo, varias) enzimas celulolíticas comprenden una preparación de enzima celulolítica comercial. Ejemplos de preparaciones de enzimas celulolíticas comerciales apropiadas para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, Cellic® Ctec2 (Novozymes A/S) , Cellic® CTec2 (Novozymes A/S) , Cellic® CTec3 (Novozymes A/S) , CELLUCLAST™ (Novozymes A/S) , NOVOZYM 188™ (Novozymes A/S) , CELLUZYME™ (Novozymes A/S) , CEREFLO™ (Novozymes A/S) , y ULTRAFLO™ (Novozymes A/S) , ACCELERASE™ (Genencor Int.), LAMINEX™ (Genencor Int.), SPEZYME™ CP (Genencor Int.), FILTRASE® NL (DSM) ; METHAPLUS® S/L 100 (DSM) , ROHAMENT™ 7069 (Rohm GmbH) , FIBREZYME® LDI (Dyadic International, Inc.), FIBREZYME® LBR (Dyadic International, Inc.), o VISCOSTAR® 150L (Dyadic International, Inc.). Las enzimas de celulasa son agregadas en catidades eficaces desde aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 5.0 % en peso de sólidos, por ejemplo, aproxiamdamente 0.025 hasta aproximadamente 4.0 % en peso de sólidos o aproximadamente 0.005 hasta aproximadamente 2.0 % en peso de sólidos.

Ejemplos de endoglucanasas bacterianas que se pueden utilizar en los métodos de la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, una endoglucanasa Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039, WO 93/15186, Patente Estadounidense NO 5,275,944, WO 96/02551; Patente Estadounidense NO 5,536,655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanasa III Thermobifida fusca (WO 05/093050) ; y endoglucanasa V Thermobifida fusca (WO 05/093050) .

Ejemplos de endoglucanasas fungicas que se pueden utilizar en la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, una endoglucanasa I Trichoderma reesei (Penttila et al, 1986, Gene 45: 253-263), endoglucanasa I Cel7B Trichoderma reesei (GENBANK ™ acceso No. M15665) , endoglucanasa II Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:1 1-22), endoglucanasa II Cel5A Trichoderma reesei (GENBANK™ No de acceso MI9373) , endoglucanasa III Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl Environ Microbiol 64: 555 a 563, GENBANK™ acceso No AB003694) , endoglucanasa V Trichoderma reesei (Saloheimo et al, 1994, Molecular Microbiology 13:219-228, GENBANK™ No acceso Z33381) , endoglucanasa Aspergillus aculeatus (Ooi et al, 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884), endoglucanasa Aspergillus kawachii (Sakamoto et al, 1995, Current Genetics 27:435-439), endoglucanasa Erwinia carotovara (Saarilahti et al, 1990., Gene 90: 9-14), endoglucanasa Fusarium oxysporum (GenBank™ No acceso L29381) , endoglucanasa Humicola gzisea var thermoidea (GenBank™ No acceso AB003107) , endoglucanasa Melanocarpus albomyces (GenBank™ No de acceso MAL515703), endoglucanasa Neurospora crassa (GENBANK™ No. acceso XM_324477) , endoglucanasa V Humicola insolens, endoglucanasa Myceliophthora thermophila CBS 117.65, endoglucanasa basidiomiceto CBS 495.95, endoglucanasa basidiomiceto CBS 494.95, endoglucanasa II Thermoascus aurantiacus, endoglucanasa Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6B, endoglucanasa Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6C, endoglucanasa Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7C, endoglucanasa Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7E, endoglucanasa Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7F, endoglucanasa Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A y endoglucanasa Trichoderma reesei cepa No. VTT-D-80133 (GENBANK™ No acceso M15665) .

Ejemplos de celobiohidrolasas útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, celobiohidrolasa II Aspergillus aculeatus (WO 2011/059740) , celobiohidrolasa II Aspergillus fumigatus, celobiohidrolasa I Chaetomium thermophilum, celobiohidrolasa II Chaetomium thermophilum, celobiohidrolasa I Humicola insolens , celobiohidrolasa II Myceliophthora thermophila (WO 2009/042871) , celobiohidrolasa I Penicillium emersonii, celobiohidrolasa II Thielavia hyrcanie (WO 2010/141325) , celobiohidrolasa II Thielavia terrestris (Cel6A, WO 2006/074435) , celobiohidrolasa I Trichoderma. reesei, celobiohidrolasa II Trichoderma reesei y celobiohidrolasa II Trichophaea saccata (WO 2010/057086) .

Ejemplos de beta-glucosidasas útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, beta-glucosidasas Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et al, 1996, Gene 173: 287-288) , Aspergillus fu igatus (WO 2005/047499) , Aspergillus niger (Dan et al, 2000, J. Biol . Chem. 275: 4973-4980), Aspergillus oryzae (WO 2002/095014), Penicillium brasilianum IBT 20888 (WO 2007/019442 y WO 2010/088387) , Thielavia terrestris (WO 2011/035029) , y Trichophaea saccata (WO 2007/019442) .

La beta-glucosidasa puede ser una proteína de fusión. En un aspecto, la beta-glucosidasa es una proteína de fusión BG variante beta-glucosidasa Aspergillus oryzae (WO 2008/057637) o una proteína de fusión de beta-glucosidasa Aspergillus oryzae (WO 2008/057637) .

Otras endoglucanasas útiles, celobiohidrolasas y beta-glucosidasas se describen en numerosas familias glicosil hidrolasa utilizando la clasificación de acuerdo con Henrissat Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities , Biochem. J. 280: 309-316, and Henrissat B., and Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

Otras enzimas celulolíticas que pueden ser utilizadas en la presente invención se describen en WO 98/13465, WO 98/015619, O 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, O 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/180521, O 2004/016760, WO 2004/043980, O 2004/048592, O 2005/001065, O 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, O 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, Patente Estadounidense No 5,457,046, Patente Estadounidense No 5,648,263, y Patente Estadounidense No 5,686,593.

En un aspecto, una o más (por ejemplo, varias) enzimas hemicelulolíticas comprenden una preparación de enzima comercial hemicelulolítica . Ejemplos de preparaciones de enzimas hemicelulolíticas comerciales apropiadas para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, SHEARZYME™ (Novozymes A/S) , Cellic® HTEC (Novozymes A/S) , Cellic® HTec2 (Novozymes A/S) , Cellic® HTec3 (Novozymes A/S) , Viscozyme® (Novozymes A/S) , ULTRAFLO® (Novozymes A/S) , Pulpzyme® HC (Novozymes A/S) , MULTIFECT® xilanasa (Genencor) , ACCELLERASE® XY (Genencor) , Accellerase® XC (Genencor) , ECOPULP® TX-200A (AB Enzymes) , Xilanasa HSP 6000 (DS ) , DEPOL™ 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK) , DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, UK) , y DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, Wales, UK) .

Ejemplos de xilanasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, xilanasas Aspergillus aculeatus (GeneSECP: AAR63790, O 94/21785), Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256) , Penicillium pinophilum (WO 2011/041405), Penicillium sp. (WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/079210) y Trichophaea saccata GH10 (WO 201 1/057083) .

Ejemplos de beta-xilosidasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, beta-xilosidasas de Neurospora crassa (SwissProt número de acceso Q7SO 4) , Trichoderma reesei (UniProtKB/TrEMBL número de acceso Q92458) , y Talaromyces emersonii (SwissProt número de acceso Q8X212) .

Ejemplos de acetilxian esterasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, acetilxilan esterasas de Aspergillus aculeatus (WO 2010/108918), Chaetomium globosum (Uniprot número de acceso Q2GWX4), Chaetomium gracile (GeneSECP número de acceso AAB82124) , Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709) , Hypocrea jecorina (WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (WO 2010/014880), Neurospora crassa (UniProt número de acceso q7s259) , Phaeosphaeria nodorum (Uniprot número de acceso Q0UHJ1) y Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/042846) .

Ejemplos de feruloil esterasas (esterasas de ácido ferúlico) útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, feruloil esterasas de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/076122) , Neosartorya fischeri (UniProt número de acceso Al D9T4), Neurospora crassa (UniProt número de acceso Q9HGR3) , Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/127729) y Thielavia terrestris (WO 2010/053838 y WO 2010/065448) .

Ejemplos de arabinofuranosidasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, arabinofuranosidasas de Aspergillus niger (GeneSECP número de acceso AAR94170) , Humicola insolens DSM 1800 (WO 2006/114 094 y WO 2009/073383) , y M. giganteus (WO 2006/114094) .

Ejemplos de alfa-glucuronidasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, alfa-glucuronidasas de Aspergillus clavatus (UniProt número de acceso alccl2), Aspergillus fumigatus (SwissProt número de acceso Q4WW45) , Aspergillus niger (número de acceso Uniprot Q96WX9 ) , Aspergillus terreus (SwissProt número de acceso Q0CJP9) , Humicola insolens (WO 2010/014706) , Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/068565) , Talaromyces e ersonii (UniProt número de acceso Q8X211) , y Trichoderma reesei (Uniprot número de acceso Q99024) .

En una modalida preferida, la composición enzimática es una composición a temperatura alta, en este caso, una composición que es capaz de hidrolizar un material celulósico en el intervalo de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 70°C. En otra modalidad preferida, la composición enzimática es una composición de alta temperatura, en este caso, una composición que es capaz de hidrolizar un material celulósico a una temperatura de aproximadamente 54 °C, aproximadamente 55 °C, aproximadamente 56°C, aproximadamente 57 °C, aproximadamente 58 °C, aproximadamente 59 °C, aproximadamente 60 °C, aproximadamente 61°C, aproximadamente 62 °C, aproximadamente 63 °C, aproximadamente 64 °C, aproximadamente 65 °C, aproximadamente 66 °C, aproximadamente 67 °C, aproximadamente 68°C, aproximadamente 69°C, o aproximadamente 70°C. En otra modalidad preferida, la composición enzimática es una composición de alta temperatura, en este caso, una composición que es capaz de hidrolizar un material celulósico a una temperatura de por lo menos 54°C, por lo menos 55°C, por lo menos 56°C, por lo menos 57°C, por lo menos 58°C, por lo menos 59°C, por lo menos 60 °C, por lo menos 61°C, por lo menos 62°C, por lo menos 63°C, por lo menos 64°C, por lo menos 65°C, por lo menos 66°C, por lo menos 67°C, por lo menos 68°C, por lo menos 69°C, o por lo menos 70°C.

En otra modalidad preferida, la composición enzimática es una composición de alta temperatura como se describe en PCT/US2010/055723 (WO 2011/057140) , que se incorpora aquí en su totalidad por referencia.

Los polipéptidos que tienen actividad enzimática utilizada en los procedimientos de la presente invención se pueden producir por fermentación de las cepas microbianas indicadas anteriormente en un medio nutriente que contiene fuentes de carbono y nitrógeno apropiadas y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en el arte previo (ver, por ejemplo, Bennett, JW y lasure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991) . Los medios apropiados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la Colección Amerciana de cultivos Tipo) . Los intervalos de temperatura y otras condiciones apropiadas para el crecimiento y la producción de enzimas son conocidos en el arte previo (ver, por ejemplo, Bailey, JE, y Ollis, DF, Biochemical Engineering Fundamentáis, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986) .

La fermentación puede ser cualquier método de cultivo de una célula que resulta en la expresión o aislamiento de una enzima o proteína. La fermentación puede, por lo tanto, ser entendida como que comprende el cultivo de matraz de agitación, o fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo continua, por lotes, por lote alimentado, o fermentaciones en estado sólido) en termentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio apropiado y en condiciones que permitan que la enzima sea expresada o aislada. Las enzimas resultantes producidas por los métodos descritos anteriormente pueden ser recuperadas del medio de fermentación y purificadas por procedimientos convencionales.

Fermentación. Los azúcares fermentables obtenidos a partir del material celulósico hidrolizado pueden ser fermentados por uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos de fermentación capaces de fermentar los azúcares directamente o indirectamente en un producto de fermentación deseado. "Fermentación" o "proceso de ermentación" se refiere a cualquier proceso de fermentación o cualquier proceso que comprende un paso de fermentación. Los procesos de fermentación también incluyen procesos de fermentación usados en la industria de alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), industria lechera (por ejemplo, productos lácteos fermentados) , industria de cuero e industria de tabaco. Las condiciones de fermentación dependen del producto de fermentación deseado y el organismo de fermentación y pueden ser fácilmente determinadas por una persona experimentada en el arte previo.

En el paso de fermentación, los azúcares, liberados del material celulósico como resultado del pretratamiento y pasos de hidrólisis enzimática, son fermentados a un producto, por ejemplo, etanol, mediante un organismo de fermentación, tal como levadura. La hidrólisis (sacarificación) y la fermentación pueden ser simultáneas o separadas, tal como se describe en este documento.

Cualquier material celulósico hidrolizado apropiado puede ser utilizado en el paso de fermentación en la práctica de la presente invención. El material se selecciona generalmente con base en el producto de fermentación deseado, en este caso, la sustancia que se ha obtenido a partir de la fermentación, y el proceso empleado, como es bien conocido en el arte previo.

El término "medio de fermentación" se entiende en este documento que se refiere a un medio de fermentación antes de que el microorganismo sea agregado, como por ejemplo, un medio que resulta de un proceso de sacarificación, así como un medio usado en un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) .

"Microorganismo de Fermentación" se refiere a cualquier microorganismo, incluyendo microorganismos bacterianos y fúngicos, apropiados para su uso en un proceso de fermentación deseado para producir un producto de fermentación. El organismo de fermentación pueden ser organismos de fermentación de hexosa y pentosa, o una combinación de los mismos. Tanto organismos de fermentación hexosa y pentosa son bien conocidos en el arte previo. Microorganismos de fermentación apropiados son capaces de fermentar, en este caso, convertir, azúcares, tales como glucosa, xilosa, xilulosa, arabinosa, maltosa, mañosa, galactosa, y/u oligosacáridos , directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado.

Ejemplos de organismos de fermentación bacterianos y fúngicos que producen etanol son descritos por Lin et al . , 2006, Appl . Microbiol . Biotechnol. 69: 627-642.

Ejemplos de microorganismos de fermentación que pueden fermentar azúcares de hexosa incluyen microorganismos bacterianos y fúngicos, tales como levadura. Levadura preferida incluye cepas de Candida, Kluyveromyces, y Saccharomyces, por ejemplo, Candida sonorensis, Kluyveromyces marxianus, y Saccharomyces cerevisiae .

Ejemplos de organismos de fermentación que pueden fermentar azúcares de pentosa en su estado nativo incluyen organismos bacterianos y fúngicos, tales como algunas levaduras. Levadura de fermentación de xilosa preferida incluye cepas de Candida, preferiblemente C sheatae o C. sonorensis, y cepas de Pichia, preferiblemente P. stipitis, tales como P. stipitis CBS 5773. Levaduras de fermentación de pentosa preferidas incluyen cepas de Pachysolen, preferiblemente P. tannophilus. Los organismos no capaces de fermentar azúcares de pentosa, tales como xilosa y arabinosa, pueden ser modificados genéticamente para hacerlo por métodos conocidos en el arte previo.

Ejemplos de bacterias que pueden fermentar de manera eficiente hexosa y pentosa a etanol incluyen, por ejemplo, Bacillus coagulans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermocellum, Clostridium phytofermentans, Geobacillus sp . , Thermoanaerobacter saccharolyticum, y Zymomonas mobilis (Philippidis , 1996, supra) .

Otros organismos de fermentación incluyen cepas de Bacillus, tales como Bacillus coagulans; Candida, tales como C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naedodendra, C. blankii, C. entomophilia, C. brassicae, C. pseudotropicalis, C. boidinii , C. utilis, y C. sce atae; Clostridium, tal como C. acetojbufcylicum, C. thermocellum, y C. phytofermentans; E. coli, especialmente cepas de E. coli que han sido genéticamente modificados para mejorar la rendimiento de etanol ; Geobacillus sp; . Hansenula, tal como Hansenula anómala, Klebsiella, tal como K. oxytoca; Kluyveromyces, tal como 2. marxianus, K. lactis, K. thermotolerans, y K. fragilis; Schizosaccharomyces, tal como S. pomje; Thermoanaerobacter, tal como Thermoanaerobacter saccharolyticum, y Zymomonas, tal como Zymomonas mobilis.

En un aspecto preferido, la levadura es un Bretannomyces. En un aspecto más preferido, la levadura es Bretannomyces clausenii. En otro aspecto preferido, la levadura es una Candida. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida sonorensis . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida boidinii. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida blankii. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida brassicae . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida diddensii. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida entomophiliia . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida pseudotropicalis . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida scehatae . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida utilis. En otro aspecto preferido, la levadura es una Clavispora. En otro aspecto más preferido, la levadura es Clavispora lusitaniae . En otro aspecto más preferido, la levadura es Clavispora opuntiae . En otro aspecto preferido, la levadura es un Kluyveromyces . En otro aspecto más preferido, la levadura es Kluyveromyces fragilis . En otro aspecto más preferido, la levadura es Kluyveromyces marxianus. En otro aspecto más preferido, la levadura es Kluyveromyces thermotolerans . En otro aspecto preferido, la levadura es una Pachysolen. En otro aspecto más preferido, la levadura es Pachysolen tannophilus. En otro aspecto preferido, la levadura es una Pichia. En otro aspecto más preferido, la levadura es una Pichia stipitis. En otro aspecto preferido, la levadura es una Saccharomyces spp. En otro aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces cerevisiae. En otro aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces distaticus . En otro aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces uvarum.

En un aspecto preferido, la bacteria es un Bacillus . En un aspecto más preferido, la bacteria es Bacillus coagulans . En otro aspecto preferido, la bacteria es un Clostridium. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Clostridium acetobutylicum. En otro aspecto más preferido, la bacteria es phytofermentans Clostridium. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Clostridium thermocellum. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Geobacilus sp. En otro aspecto más preferido, la bacteria es una Thermoanaerobacter. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Thermoanaerobacter saccharolyticum. En otro aspecto preferido, la bacteria es una Zymomonas . En otro aspecto más preferido, la bacteria es Zymomonas mobilis.

Levadura comercialmente disponible apropiada para la producción de etanol incluyen, por ejemplo, BIOFERM™ AFT y XR (NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, USA) , ETANOL RED™ levadura (Fermentis/Lesaffre , USA), FALI™ (Fleischmann' s Yeast, USA), FERMIOL™ (DSM Specialties) , GERT STRAND™ (Gert Strand AB, Suecia) y SUPERSTART™ y THERMOSACC™ levadura fresca (Ethanol Technology, WI , USA).

En un aspecto preferido, los microorganismos de fermentación se han modificado genéticamente para proporcionar la capacidad para fermentar azúcares de pentosa, tal como xilosa utilizando, arabinosa utilizando, microorgan smos que co-utilizan xilosa y arabinosa.

La clonación de genes heterólogos en varios microorganismos de fermentación ha conducido a la construcción de organismos capaces de convertir hexosas y pentosas en etanol (co-fermentación) (Chen y Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Ap l . Biochem. Biotechnol . 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Ap l . Environ. Microbiol . 64: 1852-1859; Kotter and Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol . 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase , Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principie, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991 , Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; O 2003/062430, xylose isomerase) .

En un aspecto preferido, el microorganismo de fermentación modificado genéticamente es Candida sonorensis . En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación modificado genéticamente es Escherichia coli. En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación modificado genéticamente es Klebsiella oxytoca. En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación modificado genéticamente es Kluyveromyces marxianus . En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación modificado genéticamente es Saccharomyces cerevisiae . En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación modificado genéticamente es Zymomonas mobilis.

Es bien conocido en el arte previo que los organismos descritos anteriormente también pueden ser usados para producir otras sustancias, como se describe en este documento.

El microorganismo de fermentación se agrega típicamente al material celulósico degradado o hidrolizado y la fermentación se lleva a cabo durante aproximadamente 8 hasta aproximadamente 96 horas, por ejemplo, aproximadamente 24 hasta aproximadamente 60 horas. La temperatura está típicamente entre aproximadamente 26 °C hasta aproximadamente 60°C, por ejemplo, aproximadamente 32°C o 50°C, y un pH de aproximadamente 3 hasta aproximadamente pH 8, por ejemplo, pH 4-5, 6, o 7.

En un aspecto, la levadura y/u otro microorganismo se aplican al material celulósico degradado y la fermentación se lleva a cabo durante aproximadamente 12 hasta aproximadamente 96 horas, tal como típicamente 24-60 horas. En otro aspecto, la temperatura está preferiblemente entre aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 60°C, por ejemplo, aproximadamente 25 °C hasta aproximadamente 50°C, aproximadamente 32 °C hasta aproximadamente 50°C, o aproximadamente 32°C hasta aproximadamente 50°C, y el pH es generalmente desde aproximadamente pH 3 hasta aproximadamente pH 7, por ejemplo, un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente pH 7. Sin embargo, algunos organismos de fermentación, por ejemplo, bacterias, tienen una mayor temperatura de fermentación óptima. La levadura u otro microorganismo se aplica preferiblemente en cantidades de aproximadamente 105 hasta 1012, preferiblemente desde aproximadamente 107 hasta 1010, especialmente aproximadamente 2 x 108 conteo de células viables por mi de caldo de fermentación. Además la orientación en relación con el uso de levaduras para fermentación se puede encontrar en, por ejemplo, "The Alcohol Textbook" (Editors K. Jacques, T.P. Lyons and D.R. Kelsall, Npttingham University Press, United Kingdom 1999), que es incorporado aquí por referencia .

Un estimulador de fermentación se puede utilizar en combinación con cualquiera de los procesos descritos en el presente documento para mejorar además el proceso de fermentación, y, en particular, el rendimiento del microorganismo de fermentación, tal como, mejoramiento de la velocidad y rendimiento de etanol . Un "estimulador de fermentación" se refiere a estimuladores para el crecimiento de microorganismos de fermentación, en particular, levadura. Estimuladores de fermentación preferidos para el crecimiento incluyen vitaminas y minerales. Ejemplos de vitaminas incluyen multivitaminas , biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzoico, ácido fólico, riboflavina, y vitaminas A, B, C, D, y E. Ver, por ejemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002) , que se incorpora aquí por referencia. Ejemplos de minerales incluyen minerales y sales minerales que pueden suministrar nutrientes que comprenden P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn, y Cu.

Productos de fermentación: Un producto de fermentación puede ser cualquier sustancia derivada de la fermentación. El producto de fermentación puede ser, sin limitación, un alcohol (por ejemplo, arabinitol, n-butanol, isobutanol, etanol, glicerol, metanol, etilenglicol , 1 , 3 -propanodiol [propilen glicol] , butanodiol, glicerina, sorbitol, y xilitol) ; un alcano (por ejemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano, y dodecano) , un cicloalcano (por ejemplo, ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano, y ciclooctano) , un alqueno (por ejemplo, penteno, hexeno, hepteno y octeno) ; un aminoácido (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, lisina, serina, y treonina) ; un gas (por ejemplo, metano, hidrógeno (H2) , dióxido de carbono (C02) , y monóxido de carbono (CO) ) ; isopreno; una cetona (por ejemplo, acetona), un ácido orgánico (por ejemplo, ácido acético, ácido acetónico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, 2,5-diceto-D-ácido glucónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutárico, ácido 3 -hidroxipropiónico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido málico, ácido malónico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiónico, ácido succínico , y ácido xilónico) y policétido. El producto de fermentación también puede ser la proteína como un producto de alto valor.

En un aspecto preferido, el producto de fermentación es un alcohol. Se entenderá que el término "alcohol" abarca una sustancia que contiene uno o más (por ejemplo, varios) restos hidroxilo. En un aspecto más preferido, el alcohol es n-butanol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es isobutanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es etanol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es metanol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es arabinitol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es butanodiol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es etilen glicol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es glicerina. En otro aspecto más preferido, el alcohol es glicerol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es 1 , 3 -propanodiol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es sorbitol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es xilitol. Ver, por ejemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., and Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed. , Springer- Verlag Berlín Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Silveira, M. M. , and Joñas, R. , 2002, The biotechnological production of sorbitol, Ap l . Microbiol . Biotechnol . 59: 400-408; Nigam, P., and Singh, D., 1995, Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 1 17-124; Ezeji, T. C, Qureshi, N. and Blaschek, H. P., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un alcano. El alcano puede ser un alcano no ramificado o ramificado. En otro aspecto más preferido, el alcano es pentano. En otro aspecto más preferido, el alcano es hexano . En otro aspecto más preferido, el alcano es heptano. En otro aspecto más preferido, el alcano es octano. En otro aspecto más preferido, el alcano es nonano. En otro aspecto más preferido, el alcano es decano. En otro aspecto más preferido, el alcano es undecano. En otro aspecto más preferido, el alcano es dodecano.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un cicloalcano . En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclopentano . En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclohexano . En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es cicloheptano . En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclooctano.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un alqueno. El alqueno puede ser un alqueno no ramificado o ramificado. En otro aspecto más preferido, el alqueno es penteno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es hexeno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es hepteno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es octeno.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un aminoácido. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido aspártico. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es ácido glutámico. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es glicina. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es lisina. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es serina. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es treonina. Ver, por ejemplo, Richard, A., and Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly (glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4) : 501-515.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un gas. En otro aspecto más preferido, el gas es metano. En otro aspecto más preferido, el gas es H2. En otro aspecto más preferido, el gas es C02. En otro aspecto más preferido, el gas es CO. Ver por ejemplo, Kataoka, N., A. Miya, and K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7) : 41 -47; and Gunaseelan V.N. in Biomass and Bioenergy, Vol . 13 (1-2), pp. 83-1 14, 1997, Anaerobic digestión of biomass for methane production: A review .

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es isopreno .

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es una cetona. Se entenderá que el término "cetona" abarca una sustancia que contiene uno o más (por ejemplo, varios) restos cetónicos . En otro aspecto más preferido, la cetona es acetona. Véase, por ejemplo, Qureshi and Blaschek, 2003, supra .

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un ácido orgánico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido acético. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido acetónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido adípico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido ascórbico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido cítrico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido 2,5- diceto-D-glucónico . En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido fórmico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido fumárico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucárico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucurónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glutárico. En otro aspecto preferido, el ácido orgánico es ácido 3 -hidroxipropiónico . En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido itacónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido láctico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido málico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido malónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido oxálico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido propiónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido succínico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido xilónico. Ver, por ejemplo, Chen, R., and Lee, Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl . Biochem. Biotechnol . 63-65: 435-448.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es policétido.

Recuperación . El producto de fermentación se puede recuperar opcionalmente del medio de fermentación mediante cualquier método conocido en el arte previo, incluyendo, pero no limitado a, cromatografía, procedimientos electroforéticos , solubilidad diferencial, destilación, o extracción. Por ejemplo, el alcohol se separa del material celulósico fermentado y se purifica por métodos convencionales de destilación. El etanol con una pureza de hasta aproximadamente 96% en vol . se puede obtener, el cual puede ser utilizado como, por ejemplo, etanol combustible, etanol potable, en este caso, alcoholes neutros potables o etanol industrial.

Composiciones detergentes Un Polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada de la presente invención puede ser agregado a y por lo tanto convertirse en un componente de una composición detergente .

La composición detergente de la presente invención se puede formular, por ejemplo, como una composición detergente de lavado a mano o máquina que incluye una composición de aditivo para lavandería apropiada para el pretratamiento de tejidos manchados y una composición suavizante de telas agregada al enjuague, o ser formulada como una composición detergente para uso en operaciones de limpieza de superficies duras del hogar generales, o ser formulada para operaciones de lavado de vajillas a mano o a máquina.

En un aspecto específico, la presente invención proporciona un aditivo detergente que comprende un polipéptido que tiene actividad celulolítica mejorada GH61 como se describe en este documento. El detergente aditivo así como la composición detergente pueden comprender una o más (por ejemplo, varias) enzimas tales como una proteasa, lipasa, cutinasa, una amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, por ejemplo, una lacasa, y/o peroxidasa.

En general las propiedades de la enzima seleccionada deben ser compatibles con el detergente seleccionado, (en este caso, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la enzima debería estar presente en cantidades eficaces.

Celulasas : Las celulasas apropiadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o modificados genéticamente de proteínas. Las celulasas apropiadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia , Acremonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritos en Patente Estadounidense No. 4,435,307, Patente Estadounidense No. 5,648,263, Patente Estadounidense No. 5,691,178, Patente Estadounidense No 5,776,757 y WO 89/09259.

Celulasas especialmente apropiadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios de cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en EP 0 495 257, EP 0 531 372, O 96/1 1262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como las descritas en WO 94/07998, EP 0 531 315, Patente Estadounidense No 5,457,046, Patente Estadounidense No 5,686,593, Patente Estadounidense No 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299.

Celulasas disponibles comercialmente incluyen CELLUZYME™ y CAREZYME™ (Novozymes A/S) , CLAZINASE™, y PURADAX HA™ (Genencor International Inc.), y KAC-500™ (B) (Kao Corporation) .

Proteasas : proteasas apropiadas incluyen las de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefieren las de origen microbiano. Se incluyen mutantes modificados químicamente o modificados genéticamente de proteínas. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa similar a tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas , especialmente las derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279) . Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270 y WO 94/25583.

Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, y O 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más (por ejemplo, varias) de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235, y 274.

Las enzimas proteasa comerciales preferidas incluyen ALCALASE™ , SAVINASE™, PRIMASE™, DURALASE™, ESPERASE™, y KA NASE™ (Novozymes A/S) , MAXATASE™, MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE™, PURAFECT™, PURAFECT OXP™, FN2™ y FN3™ (Genencor International Inc.).

Lipasas : Las lipasas apropiadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o modificados genéticamente de proteínas. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo Thermomyces) , por ejemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como se describe en EP 258 068 y EP 305 216 o de H. insolens como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo, de P. alcaligen.es o P. pseudoalcaligen.es (EP 218 272) , P. cepacia (EP 331 376) , P. stutzeri (GB 1, 372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp . cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012) , una lipasa de Bacillus, por ejemplo, de B. subtilis (Dartois et al, 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360) , B . stearothermophilus (JP 64/744992) o B . pumilus (WO 91/16422) .

Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como los descritos en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202.

Las enzimas de lipasas comerciales preferidas incluyen LIPOLASE™, LIPEX™, y LIPOLASE ULTRA ™ (Novozymes A/S) .

Amilasas : amilasas apropiadas (alfa y/o beta) incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o modificados genéticamente de proteínas. Las amilasas incluyen, por ejemplo, a-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de Bacillus licheniformis, descritas con más detalle en documento GB 1, 296,839.

Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más (por ejemplo, varias) de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444.

Amilasas comercialmente disponibles son Duramyl™, TERMAMYL™, Fungamyl™ y BAN™ (Novozymes A/S), y RAPIDASE™ y PURASTAR™ (de Genencor International Inc.).

Peroxidasas/oxidasas : peroxidasas/oxidasas apropiadas incluyen las de origen de plantas, bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o modificados genéticamente de proteínas. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. cinereus, y variantes de los mismos como los descritos en WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257.

Peroxidasas comercialmente disponibles incluyen GUARDZYME™ (Novozymes A/S) . La enzima detergente puede ser incluida en una composición detergente agregando aditivos separados que contienen una o más (por ejemplo, varias) enzimas, o agregando un aditivo combinado que comprende todas estas enzimas. Un aditivo detergente de la invención, en este caso, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede ser formulado, por ejemplo, como un granulado, líquido, suspensión, etc. Formulaciones de aditivos detergentes preferidas son granulados, en particular granulados sin polvo, líquidos, en particular líquidos estabilizados, o suspensiones .

Granulados sin polvo pueden ser producidos, por ejemplo, como se describe en la Patente Estadounidense No 4,106,991 y 4,661,452 y opcionalmente pueden ser revestidos por métodos conocidos en el arte previo. Ejemplos de materiales de revestimiento cerosos son productos de poli (óxido de etileno) (polietilenglicol , PEG) con pesos molares promedio de 1000 hasta 20,000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 y 50 unidades de óxido de etileno, alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene desde 12 hasta 20 átomos de carbono y en los que hay 15 hasta 80 unidades de óxido de etileno, alcoholes grasos, ácidos grasos, y mono-y di-y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento de formación de película apropiados para la aplicación por técnicas de lecho fluido se dan en GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas agregando un poliol tal como propilenglicol , un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico de acuerdo con los métodos establecidos. Las enzimas protegidas se pueden preparar de acuerdo con el método descrito en EP 238, 216.

Una composición detergente de la presente invención puede estar en cualquier forma apropiada, por ejemplo, una barra, una tableta, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente que contiene hasta 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso.

La composición detergente comprende uno o más (por ejemplo, varios) agentes tensioactivos , que pueden ser no iónicos incluyendo semipolares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos . Los tensioactivos están presentes típicamente en un nivel de 0.1% hasta 60% en peso.

Cuando se incluye en el mismo, el detergente normalmente contendrá desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 40% de un tensioactivo aniónico tal como alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso) , alcohol etoxisulfato, alcanosulfonato secundario, metil éster del ácido alfa-sulfo graso, ácido alquil- o alquenilsuccínico, o jabón.

Cuando se incluye en el mismo, el detergente normalmente contendrá desde aproximadamente 0.2% hasta aproximadamente 40% de tensioactivo no iónico tal como etoxilato de alcohol, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicósido, alquildimetilaminaoxido, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, polihidroxi alquil amida de ácido graso, o derivados de N-acil N-alquil de glucosamina ( "glucamidas" ) - El detergente puede contener 0-65% de un mej orador de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiaminotetraacético, ácido dietilentriaminopentaacético, ácido alquil-o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (por ejemplo, SKS-6 de Hoechst) .

El detergente puede comprender uno o más (por ejemplo, varios) polímeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, poli (vinilpirrolidona) , poli (etilenglicol ) , poli (vinil alcohol), poli (vinilpiridina-N-óxido) , poli (vinilimidazol ) , policarboxilatos tales como poliacrilatos , copolímeros de ácido maleico/acrílico y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico.

El detergente puede contener un sistema de blanqueamiento que puede comprender una fuente de H202 tal como perborato o percarbonato que se puede combinar con un activador de blanqueamiento que forma perácido tal como tetraacetiletilenodiamina o nonanoiloxibencenosulfonato . Alternativamente, el sistema de blanqueamiento puede comprender peroxiácidos de, por ejemplo, el tipo amida, imida, o sulfona.

La enzima de la composición detergente de la invención puede ser estabilizada usando agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster borato aromático, o un derivado de ácido fenil borónico tal como ácido 4 - formilfenil borónico, y la composición puede ser formulada como se describe en, por ejemplo, O 92/19709 y O 92/19708.

El detergente también puede contener otros ingredientes detergentes convencionales tales como, por ejemplo, acondicionadores de tejido incluyendo arcillas, realzador de espuma, supresores de espuma, agentes anti-corrosión, agentes de suspensión de suciedad, agentes anti-redeposición de manchas, colorantes, bactericidas, abrillantadores ópticos, hidrótropos, inhibidores de empañamiento, o perfumes.

En las composiciones detergentes, cualquier enzima puede ser agregada en una cantidad correspondiente a 0.01-100 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado, preferiblemente 0.05-5 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado, en particular 0.1-1 mg de enzima proteína por litro de licor de lavado.

En las composiciones detergentes, un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada se puede agregar en una cantidad correspondiente a 0.001-100 mg de proteína, preferiblemente 0.005-50 mg de proteína, más preferiblemente 0.01-25 mg de proteína, incluso más preferiblemente 0.05-10 mg de proteína, más preferiblemente 0.05-5 mg de proteína, e incluso más preferiblemente 0.01-1 mg de proteína por litro de licor de lavado.

Un polipéptido de la invención que tiene actividad celulolítica mejorada también se puede incorporar en las formulaciones detergentes descritas en WO 97/07202, que se incorpora aquí por referencia.

La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

Ej emplos Medios Placas de PDA fueron compuestas de 39 gramos de agar de dextrosa de patata y agua desionizada hasta 1 litro.

El medio M400 se compone de 50 g de maltodextrina , 2 g de MgS04-7H20, 2 g de KH2P0 , 4 g de ácido cítrico, 8 g de extracto de levadura, 2 g de urea, 0.5 mi de solución de metales traza AMG, 0.5 g de CaCl2, y agua desionizada hasta 1 litro .

La solución de metales traza AMG estaba compuesta por 14.3 g de ZnSO4-7H20, 2.5 g de CuS04-5H20, 0.5 g de NiCl2-6H20, 13.8 g de FeS04 -7H20, 8.5 g de MnS04-H20, 3 g de ácido cítrico, y agua desionizada hasta 1 litro.

Placas de medio mínimo se componen de 6 g de NaN03, 0.52 g de KCl, 1.52 g de KH2P0 , 1 mi de solución de elementos traza COVE, 20 g de agar Noble, 20 mi de glucosa al 50%, 2.5 mi de una solución de MgS04-7H2 al 20%, 20 mi de una solución de biotina al 0.02%, y agua desionizada hasta 1 litro.

Placas COVE fueron compuestas de 218 g de sorbitol, 20 g de agar, 20 mi de solución de sales COVE, 10 mM de acetamida, 15 mM de CsCl, y agua desionizada hasta 1 litro. La solución se ajustó a pH 7.0 antes de tratamiento en autoclave.

La solución de sales COVE fue compuesta de 26 g de KCl, 26 g de MgSO4-7H20, 76 g de KH2P04, 50 mi de solución de metales traza COVE, y agua desionizada hasta 1 litro.

La solución de elementos traza COVE se compone de 0.04 g de Na2B407- 10H2O, 0.4 g de CuS04-5H20, 1.2 g de FeS04-7H20, 0.7 g de MnS04-H20, 0.8 g de Na2mo02-2H20 , 10 g de ZnSC y 7H20, y agua desionizada hasta 1 litro.

El medio YPM se compone de 1% extracto de levadura, 2% de peptona, y maltodextrina al 2% esterilizada por filtración agregada después de la esterilización en autoclave.

Medio LB se compone de 10 g de Bacto-triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de cloruro de sodio, y agua desionizada hasta 1 litro.

Medio MDU2BP fue compuesto por 45 g de maltosa, 1 g de MgSC y 7H20, 1 g de NaCl, 2 g de K2S04, 12 g de KH2PO4, 7 g de extracto de levadura, 2 g de urea, 0.5 mi de solución de metales traza AMG, y agua desionizada hasta 1 litro, pH 5.0.

Solución de metales traza AMG 200X fue compuesta de 3 g de ácido cítrico, 14.3 g de ZnS04-7H20, 2.5 g de CuS04-5H20, 13.8 g de FeSC y 7H20, 8.5 g de MnSC y H20, y agua desionizada hasta 1 litro.

Placas 2XYT estaban compuestas de 16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 15 g de agar Noble, y agua desionizada hasta 1 litro.

Medio MY25 fue compuesto de 25 g de maltodextrina, 2 g de MgS04-7H20, 10 g de KH2P04, 2 g de ácido cítrico, 2 g de K2S04 , 2 g de urea, 10 g de extracto de levadura, 5 mi de solución de metales traza AMG, y agua desionizada hasta 1 litro, ajustado a pH 6.

Medio SY50 se compone de 50 g de sacarosa, 2 g de MgS04-7H20, 10 g de KH2P04 anhidro, 2 g de 2S04, 2 g de ácido cítrico, 10 g de extracto de levadura, 2 g de urea, 0.5 g de CaCl2-2H20, 0.5 g de solución de metales traza 200X AMG, y agua desionizada hasta 1 litro, pH 6.0.

Ejemplo 1: Clonación y expresión de la secuencia genómica del polipeptido GH61A Trichoderma reesei RutC30 La secuencia de codificación del polipéptido GH61A Trichoderma reesei se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de G. reesei RutC30 utilizando los cebadores que se muestran a continuación. El ADN genómico se aisló utilizando un kit DNEASY® Plant Maxi (QIAGEN inc, Valencia, CA, USA) . Cebador TrGH6l_infus .1S : 5 ' -caactggatttaccatgatccagaagctttcc-3 ' (SEC ID NO: 3) Cebador TrGH6l_infus .1A: 5 ' -cagtcacctctagttaattaactagttaaggcactgggc-3 ' (SEC ID NO: 4) La reacción de amplificación (50 µ?) se compone de una mezcla 10 mM de dATP, dTTP, dGTP, y dCTP, 275 ng de ADN genómico T. reesei RutC30, 50 pmoles de cebador TrGH61_infus .1S, 50 pmoles de cebador TrGH61_infus .1A y 10 µ? de Mezcla principal de PCR 5X PHUSION™ (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) . La reacción de amplificación fue incubada en un EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA) programado para 1 ciclo a 98°C durante 1 minuto, 30 ciclos cada uno a 98°C durante 15 segundos, 55 °C durante 30 segundos, y 72 °C durante 1 minuto, y un paso de extensión final a 72 °C durante 5 minutos.

Un producto de reacción PCR de 1124 pb fue visualizado mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% usando 40 mM de base Tris-20 mM acetato de sodio -1 mM de solución amortiguadora de EDTA de disodio (TAE) . El producto PCR de 1070 pb fue duigerido con Dpn I y después se purificó utilizando una columna de Extracto II NucleoSpin® (Clontech, Mountain View, CA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante .

El vector pAILo2 (WO 2004/099228) se linealizó mediante digestión con Ncol y Pací. El fragmento digerido se aisló por electroforesis en gel de agarosa al 1% usando solución amortiguadora TAE, dividido del gel y se purificó usando un PCR ADN GFX® y Kit de Purificación de Banda de Gel (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). La clonación del fragmento de PCR purificado en el vector pAILo2 linealizado purificado se realizó con un Kit de clonación IN-FUSION™ (Clontech Laboratories, Inc , Mountain View, CA, USA) . La reacción (10 µ?) se compone de 2 µ? de solución amortiguadora IX IN-FUSION™ (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA, USA), 1 µ? de enzima IN-FUSION™ (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA, USA) (diluido 1:10), 150 ng de pAILo2 digerido con Neo I y Pac I, y 150 ng de producto de PCR 1070 pb T reesei . El producto de plásmido final de la reacción IN-FUSION™ fue diseñado con el fin de recrear el sitio de restricción Pac I en el extremo 3' de la secuencia de codificación después de la inserción apropiada del fragmento de PCR en pAILo2, mientras que en el extremo 5' de la secuencia de codificación del sitio de restricción Neo I no fue preservado. Después la reacción fue incubada a 37°C durante 15 minutos y después a 50°C durante 15 minutos, se agregaron 40 µ? de 0.1 mM de EDTA-10 mM de solución amortiguadora Tris (TE) . Una muestra de 3 µ? de la reacción se utilizó para transformar células competentes E. coli XL10 GOLD® (Stratagene, Inc., Santa Clara, CA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de un periodo de recuperación, dos alícuotas de 100 µ? y 300 µ? de la reacción de transformación se sembraron en placas de 2xYT de 150 mm suplementado con 100 µg de ampicilina por mi. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. El ADN de plásmido de las colonias resultantes se preparó usando un BI0R0B0T® 9600 (QIAGEN Inc, Valencia, CA, USA) . Insertos de PCR subclonados se secuenciaron usando un Analizador genético Applied Biosystems 3130x1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) . El análisis de secuencia del plásmido de una sola colonia confirmó la identidad de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido GH61A Trichoderma reesei. Este plásmido fue designado pAJ223 (Figura 2) .

Ejemplo 2: Caracterización de la secuencia de codificación de polipéptido GH61A Trichoderma reesei RutC30 La secuencia de ADN genómico (SEC ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 2) de la secuencia de codificación del polipéptido GH61A Trichoderma reesei RutC30 se muestra en la Figura 1. La secuencia de ADN genómico de 1089 pb (incluyendo el codón de detención) contiene un intrón situado en los nucleótidos 187-240 de la SEC ID NO: 1. El fragmento de ADN genómico codifica un polipéptido de 344 aminoácidos. El contenido de %G + C de la secuencia de codificación del polipéptido maduro es 60%. Usando el programa de software SignalP (Nielsen et al, 1997, Protein Engineering 10: 1-6), un péptido señal de 21 residuos fue predecido. La predicción de SignalP está de acuerdo con la necesidad de tener una histidina residen en el extremo N-terminal para la unión del metal apropiado y por lo tanto la función de proteína ocurra (Ver Harris et al, 2010, Biochemistry 49:3305, and Quinlan et al., 2011, Proc Nati. Acad. Sci USA 108:15079) . La proteína madura predicha contiene 323 aminoácidos con una masa molecular predicha de 33.4 kDa y un punto isoeléctrico predicho de 5.09.

Ejemplo 3: Expresión heteróloga del polipéptido GH61A Trichoderma reesei en Aspergillus oryzae Protoplastos JaL250 Aspergillus oryzae (WO 99/61651) se prepararon de acuerdo con el método de Christensen et al, 1988, Bio/Technology 6:1419-1422, y se transformó con 5 pg de pAJ223. Veinticuatro transformantes se aislaron a placas de PDA individuales. Placas de PDA confluentes de los transformantes se lavaron con 8 mi de 0.01% de Tween® 20 para crear poblaciones de esporas. Veinte µ? de cada población de esporas se inocularon por separado en pozos de una placa de 24 pozos. Cada pozo contenía 1 mi de medio M400. La placa de 24 pozos se incubaron durante 120 horas a 34°C. Después de la incubación, una muestra de 12 µ? de caldo de cultivo de cada transformante JaL250 A. oryzae se analizó mediante SDS-PAGE usando un gel de 8-16% de Tris-glicina SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) . Un único transformante de A. oryzae fue identificado por la presencia de una banda de aproximadamente 55 kDa y designado A. oryzae AJ223-16.

Un cultivo de A. oryzae AJ223-16 fue cultivado en un matraz Fernbach 2800 que contiene 500 mi de medio M400 inoculado con 200 µ? de una población de esporas de A. oryzae AJ223-16. El cultivo en matraz Fernbach se hizo crecer a 34 °C con agitación a 250 rpm durante 120 horas. El caldo de cultivo se filtró después utilizando un filtro de membrana de 0.22 \im GP EXPRESs PLUS® (Millipore, Bedford, MA, USA) .

Ejemplo 4: Ensayo de hidrólisis rastrojo de maíz pretratado El rastrojo de maíz fue pretratado en el Departamento Nortemericano de Laboratorio de Energía Renovable Nacional (NREL, por sus siglas en inglés) utilizando 1.4% en peso de ácido sulfúrico a 165°C y 107 psi durante 8 minutos. Los sólidos insolubles en agua en el rastrojo de maíz pretratado (PCS) contenían 56.5% de celulosa, 4.6% de hemicelulosa , y 28.4% de lignina. La celulosa y la hemicelulosa fueron determinadas por una hidrólisis de ácido sulfúrico de dos etapas con análisis subsecuente de azúcares por cromatografía líquida de alto rendimiento usando procedimiento analítico estándar NREL #002. La lignina fue determinada gravimétricamente después de hidrolizar las fracciones de celulosa y hemicelulosa con ácido sulfúrico usando procedimiento analítico estándar NREL # 003.

PCS sin moler, sin lavar (suspensión entera de PCS) se preparó mediante el ajuste del pH del PCS hasta 5.0 por adición de NaOH 10 M y mezclado extensivo, y después, tratamiento en autoclave durante 20 minutos a 120°C. El peso en seco de la suspensión completa de PCS fue 29%. PCS molido sin lavar (peso seco 32.35%) se preparó moliendo la suspensión completa de PCS en un triturador de múltiples servicios en húmedo Cosmos CIJM 40 (EssEmm Corporation, Tamil Nadu, India) .

La hidrólisis de PCS se llevó a cabo usando placas de pozos profundos de 2.2 mi (Axygen, Union City, CA, USA) en un volumen de reacción total de 1.0 mi. La hidrólisis se realizó con 50 mg de sólidos de PCS insolubles por mi de solución amortiguadora de 50 mM de acetato de sodio, pH 5.0 que contiene 1 mM de sulfato de manganeso y varias cargas de proteína de varias composiciones enzimáticas (expresadas como mg de proteína por gramo de celulosa) . Composiciones enzimáticas fueron preparadas y después se agregan simultáneamente a todos los pozos en un volumen que se encuentra en el intervalo desde 50 µ? hasta 200 µ?, para un volumen final de 1 mi en cada reacción. La placa después se selló, utilizando un sellador térmico de placas ALPS-300™ (Abgene, Epsom, Reino Unido) , se mezcló vigorosamente, y se incubó a una temperatura específica durante 72 horas. Todos los experimentos descritos se realizaron por triplicado.

Después de la hidrólisis, las muestras se filtraron usando una placa de filtro de 96 pozos de 0.45 µ?? MULTISCREEN® (Millipore, Bedford, MA, USA) y los filtrados fueron analizados para el contenido de azúcar como se describe a continuación. Cuando no se utilizan inmediatamente, las alícuotas filtradas se congelaron a -20 °C. Las concentraciones de azúcar de las muestras diluidas en H2S04 0.005 M se midieron utilizando una columna HPX-87H de 4.6 x 250 mm AMINEX® (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, USA) por elución con 0.05% peso/peso de benzoico ácido-H2S0 0.005 M a 65°C a una velocidad de flujo de 0.6 mi por minuto, y la cuantificación mediante la integración de las señales de glucosa, celobiosa, y xilosa de la detección del índice de refracción (ChemStation® , AGI CUARESMA® 1100 HPLC, Agilent Tecnologías, Santa Clara, CA, USA) calibrada por las muestras de azúcar pura. Los equivalentes de glucosa y celobiosa resultantes se utilizaron para calcular el porcentaje de conversión de celulosa para cada reacción.

La glucosa, celobiosa, y xilosa se midieron de forma individual . Las concentraciones de azúcar medidas fueron ajustadas por el factor de dilución apropiado. En caso de PCS sin lavar, las concentraciones netas de los azúcares producidos enz imáticamente se determinaron mediante el ajuste de las concentraciones de azúcar medidas para las concentraciones de azúcar estándar correspondientes en PCS sin lavar en el punto de tiempo cero. Todo el procesamiento de datos HPLC fue realizado utilizando software MICROSOFT EXCEL™ (Microsoft, Richland, WA, USA) .

El grado de conversión de celulosa a glucosa se calculó utilizando la siguiente ecuación: % de conversión = (concentración de glucosa/concentración de glucosa en una digestión límite) x 100. Para calcular la conversión total de los valores de glucosa y celobiosa fueron combinados . La concentración de celobiosa se multiplica por 1.053 con el fin de convertir a equivalentes de glucosa y se agrega a la concentración de glucosa. El grado de conversión total de celulosa se calculó utilizando la siguiente ecuación: % de conversión = ([concentración de glucosa + 1.053 x (Concentración de celobiosa) ]/[ (concentración de glucosa + 1.053 x (concentración de celobiosa) en una digestión límite]) x 100. El factor 1.053 para celobiosa tiene en cuenta el aumento de la masa cuando celobiosa se convierte en glucosa. Para calcular el % de conversiónen, un punto de conversión de 100% se desarrolló con base en un control de celulasa (100 mg de celulasa Trichoderma reesei por gramo de celulosa) , y todos los valores se dividen por este número y después se multiplican por 100. Los puntos de datos por triplicado se promediaron y se calculó la desviación estándar.

Ejemplo 5: Preparación de celobiohidrolasa I GH7 Penicillium emersonii cepa NN051602 La celobiohidrolasa I Cel7 cepa Penicillium emersonii N 051602 (SEC ID NO : 5 [Secuencia de ADN] y SEC ID NO: 6 [secuencia de aminoácidos deducida] ) se obtuvo de acuerdo con el procedimiento descrito a continuación.

Penicillium emersonii se cultivó en una placa de PDA a 45 °C durante 3 días. Los micelios se recogieron directamente de la placa en un mortero esterilizado y se congelaron bajo nitrógeno líquido. Micelios congelados fueron molidos, por mortero y maja, a un polvo fino, y el ADN genómico se aisló utilizando un Mini Kit de Plantas DNeasy® (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) .

Los cebadores de oligonucleótidos , mostrados a continuación, fueron diseñados para amplificar el gen de celobiohidrolasa I GH7 del ADN genómico de Penicillium emersonii. Un Kit de clonación de PCR Seco IN-FUSION™ (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA) se utilizó para clonar el fragmento directamente en el vector de expresión pPFJ0355, sin la necesidad de una digestión y ligación de restricción.

Cebador sentido: 5 ' -ACACAACTGGGGATCCACCatgcttcgacgggctcttc-3' (SEC ID NO : 7) Cebador antisentido: 5 ' -GTCACCCTCTAGATCTCGCAGAGCAACTTCCGTCTACTTC-3 ' (SEC ID NO: 8) Las letras en negrita representan la secuencia de codificación (para el cebador sentido) o la secuencia en dirección de la región de codificación (para el cebador antisentido) . El resto de la secuencia fue homologa a los sitios de inserción de pPFJ0355.

El vector de expresión pPFJ0355 contiene el promotor de TAKA amilasa Aspergillus oryzae, elementos de terminación de glucoamilasa Aspergillus nige , secuencias derivadas pUC19 para la selección y propagación en E. coli derivados, y un gen pyrG Aspergillus nidulans , que codifica una descarboxilasa orotidina para la selección de un transformante de un mutante pyrG de la cepa Aspergillus.

Veinte picomoles de cada uno de los cebadores anteriores fueron usados en una reacción de PCR compuesta del ADN genómico Penicillium emersonii , 10 µ? de solución amortiguadora 5X GC (Finnzymes, Espoo, Finlandia), 1.5 µ? de DIVISO , 2.5 mM de cada uno de dATP, dTTP, dGTP, y dCTP, y 0.6 unidades de ADN polimerasa de alta fidelidad PHUSION™ (Finnzymes, Espoo, Finlandia) en un volumen final de 50 µ? . La amplificación se realizó con un termociclador Peltier (MJ Research Inc., South San Francisco, CA, USA) programado para la desnaturalización a 98°C durante 1 minuto; 8 ciclos de desnaturalización a 98°C durante 15 segundos, recocido a 65°C durante 30 segundos, con una disminución de 1°C por ciclo, y elongación a 72 °C durante 80 segundos; 23 ciclos cada uno a 98°C durante 15 segundos, 66 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 75 segundos; y una extensión final a 72 °C durante 7 minutos. El bloque de calor después se fue a un ciclo de remojo a 4°C.

Los productos de reacción se aislaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.0% utilizando 90 mM de Tris-borato y 1 mM de EDTA (TBE) en donde una banda de producto de aproximadamente de 1.4 kb fue dividida del gel, y se purificó usando un kit de purificación de banda de gel y ADN PCR ILUSTRAC® GFX® (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El plásmido PPFJ0355 fue digerido con Bam I y Bgl II, aislado por electroforesis en gel de agarosa al 1.0% usando solución amortiguadora TBE, dividido del gel y purificado usando un un kit de purificación de banda de gel y ADN PCR ILUSTRAC® GFX® de acuerdo con las instrucciones del abricante .

El fragmento de gen y el vector digerido se ligaron entre sí utilizando un Kit de Clonación de PCR seco IN-FUSION™ CF que resulta en pGH7ZY209383 en el que la transcripción del gen de celobiohidrolasa I GH7 emersonii Penicillium estaba bajo el control del promotor TAKA alfa-amilasa Aspergillus oryzae. En resumen, 30 ng de pPFJ0355 digerido con Bam I y Bgl II, y 60 ng del producto de PCR celobiohidrolasa I GH7 emersonii Penicillium a un vial de reacción y se resuspendieron en un volumen final de 10 µ? por la adición de agua desionizada. La reacción se incubó a 37°C durante 15 minutos y después 50 °C durante 15 minutos. Cinco µ? de la reacción se utilizaron para transformar células competentes TOP10 E. coli (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA) . Un transformante de E. coli que contiene pGH7ZY209383 se detectó mediante PCR de colonias y ADN plasmídico se preparó usando un kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN Inc, Valencia, CA, USA) . El inserto del gen de celobiohidrolasa I GH7 emersonii Penicillium en pGH7ZY209383 se confirmó por secuenciación de ADN usando un analizador de ADN 3730XL (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA) .

Los protoplastos HowBlOl Aspergillus oryzae ( O 95/35385) se prepararon de acuerdo con el método de Christensen et al, 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422 y transformados con 3 g de pGH7ZY209383. La transformación produjo aproximadamente 50 transformantes. Doce transformantes se aislaron a placas en medio mínimo individuales .

Cuatro transformantes se inocularon por separado en 3 mi de medio YPM en una placa de 24 pozos y se incubaron a 30°C con agitación a 150 rpm. Después de 3 días de incubación, 20 µ? de sobrenadante de cada cultivo se analizaron por SDS-PAGE usando un gel Bis-Tris 4-12% NUPAGE® Novex® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) con solución amortiguadora MES de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El gel resultante fue teñido con Azul INSTANT® (Expedeon Ltd. , Babraham Cambridge, UK) . Perfiles de SDS-PAGE de los cultivos mostraron que la mayoría de los transformantes tenía una banda manchada principal de aproximadamente 50 kDa. La cepa de expresión fue designada A. oryzae EXP03477.

Slants de A . oryzae EXP03477 se lavaron con 10 mi de medio YPM y se inocularon en varios matraces de 2 litros que contenían 400 mi de medio YPM para generar caldo para la caracterización de la enzima. Los cultivos se recogieron en el día 3 y se filtraron usando una membrana de 0.45 µ?? DURAPORE (Millipore, Bedford, MA, USA) .

Un volumen de 1600 mi del caldo filtrado de A. oryzae EXP03477 se precipitó con sulfato de amonio (80% de saturación) , se volvió a disolver en 100 mi de 25 mM de solución amortiguadora Bis-Tris de pH 6.5 , se dializó contra la misma solución amortiguadora, y se filtró a través de un filtro de 0.45 im. El volumen final fue de 200 mi. La solución se aplicó a una columna de Flujo rápido de 40 mi Q SEPHAROSE® (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada con 25 mM de Bis-Tris, pH 6.5 , y las proteínas se eluyeron con un gradiente de NaCl lineal (0-0.4 M) . Las fracciones con actividad contra celulosa hinchada con ácido fosfórico (PASC, por sus siglas en inglés) se recogieron y se aplicaron a una columna de HIC de 40 mi FENIL SEFAROSA™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada en 20 mM de PBS con solución amortiguadora (NH4)2S0 1.8 M pH 7, y las proteínas se eluyeron con 20 mM de PBS a pH 7. Las fracciones de la columna con actividad hacia PASC como sustrato fueron analizadas por SDS-PAGE usando un gel Bis-Tris 4-12% NUPAGE® Novex® con solución amortiguadora MES. Las fracciones con el peso molecular correcto se agruparon. Después, la solución agrupada se concentró por ultraf iltración . La proteína concentrada se dializó en 10 mM de acetato de sodio pH 5.0 utilizando un Cassette de Diálisis 10 kDa M CO Slide-A-Lyzer (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) . La concentración de proteína se determinó usando un Kit de ensayo de proteínas de microplacas BCA™ (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) en el que se utilizó albúmina de suero bovino como estándar de la proteína.

Ejemplo 6: Preparación de celobiohidrolasa II Aspergillus fumigatus Celobiohidrolasa II GH6A Aspergillus fumigatus NN055679 (CBHII) (SEC ID NO: 9 [secuencia de ADN] y SEC ID NO: 10 [secuencia de aminoácidos deducida] ) se preparó de acuerdo con el procedimiento siguiente.

Dos cebadores de oligonucleótidos sintéticos, mostrados más abajo, fueron diseñados para amplificar PCR del marco de lectura abierto de longitud completa del gen de celobiohidrolasa II fumigatus Aspergillus del ADN genómico. Un kit de clonación TOPO® (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA) se utilizó para clonar el producto de PCR. Un kit de clonación IN-FUSION™ se utilizó para clonar el fragmento en pAILo2.

Cebador directo: 51 -ACTGGATTTACCATGAAGCACCTTGCATCTTCCATCG- 3 ' (SEC ID NO: 1 1) Ejemplo inverso: 5 ' -TCACCTCTAGTTAATTAAAAGGACGGGTTAGCGT-3 ' (SEC ID NO : 12) Las letras en negrita representan la secuencia de codificación. La secuencia restante contiene la identidad de secuencia en comparación con los sitios de inserción de pAILo2.

Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores anteriores fueron usados en una reacción de PCR que contiene 500 ng de ADN genómico Aspergillus fumigatus, solución amortiguadora de reacción IX ThermoPol Taq (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) , 6 µ? de una mezcla de 10 mM de dAT , dTTP, dGTP, y dCTP, y 0.1 unidades de ADN polimerasa Taq (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) , en un volumen final de 50 µ?. Un EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 fue utilizado para amplificar el fragmento programado para 1 ciclo a 98°C durante 2 minutos, y 35 ciclos cada uno a 96°C durante 30 segundos, 61°C durante 30 segundos, y 72°C durante 2 minutos. Después de los 35 ciclos, la reacción se incubó a 72°C durante 10 minutos y después se enfrió a 10 °C hasta su procesamiento posterior. Para eliminar las colas A producidos por la ADN polimerasa Taq la reacción fue incubada durante 10 minutos a 68°C en la presencia de 1 unidad de ADN polimerasa Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) .

Un producto de reacción PCR de 1.3 kb se aisló por electroforesis en gel de GTG-agarosa al 0.8% (Cambrex Bioproducts, East Rutherford, NJ, USA) usando solución amortiguadora TAE y 0.1 g de bromuro de etidio por mi. La banda de ADN fue visualizada con la ayuda de un READER DARK™ (Clare Investigación Química, Dolores, CO) para evitar mutaciones inducidas por UV. La banda de ADN de 1.3 kb se dividió con una hoja de afeitar desechable y se purificó usando una copa giratoria ULTRAFREE®-DA (Millipore, Billerica, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El producto de PCR de 1.3 kb purificado se clonó en pCR® 4Blunt-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) . Dos µ? del producto de PCR purificado se mezclaron con 1 µ? de un cloruro de sodio 2 M y 1 µ? del vector. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos y después 2 µ? de la reacción se transformaron en células competentes TOP10 de E. coli de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dos alícuotas de 100 µ? cada una de la reacción de transformación se sembraron en dos placas 2xYT de 150 mm suplementadas con 100 g de ampicilina por mi y se incubaron durante la noche a 37°C.

Ocho colonias recombinantes se utilizaron para inocular cultivos líquidos que contienen 3 mi de medio LB suplementado con 100 g de ampicilina por mi. El ADN del plásmido se preparó a partir de estos cultivos usando un BIOROBOT® 9600. Los clones se analizaron por digestión de restricción. El ADN del plásmido de cada clon se digirió con Eco RI y se analizó por electroforesis en gel de agarosa como anteriormente. Seis de los ocho clones tenía el patrón de digestión de restricción esperado y de éstos, los clones 2, 4, 5, 6, 7 y 8 fueron seleccionados para ser secuenciados para confirmar que no había mutaciones en el inserto clonado. Análisis de secuencias de sus extremos 5' y 3' indicó que los clones 2, 6 y 7 tenían la secuencia correcta. Estos tres clones fueron seleccionados para la re-clonación en pAILo2. Un microlitro de alícuota de cada clon se mezcló con 17 µ? de EDTA 0.1 M-10 mM de Tris (TE) diluido 10 veces y 1 µ? de esta mezcla fue utilizada para volver a amplificar la región de codificación GH6A de Aspergillus fumigatus .

Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores anteriores fueron usados en una reacción de PCR que contenía 1 µL de la mezcla diluida de los clones 2, 6 y 7, solución amortiguadora de amplificación IX Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) , 6 µ? de una mezcla de 10 mM de dATP , dTTP , dGTP, y dCTP, 2.5 unidades de ADN polimerasa Pfx PLATINUM® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) , y 1 µ? de 50 mM de MgS04, en un volumen final de 50 µ? . Un EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 fue utilizado para amplificar el fragmento programado para 1 ciclo a 98°C durante 2 minutos, y 35 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 61 °C durante 30 segundos, y 68°C durante 1.5 minutos. Después de los 35 ciclos, la reacción se incubó a 68°C durante 10 minutos y después se enfrió a 10°C hasta su procesamiento posterior. Un producto de reacción de PCR de 1.3 kb se aisló por electroforesis en gel de GTG-agarosa al 0.8% usando solución amortiguadora TAE y 0.1 µg de bromuro de etidio por mi. La banda de ADN fue visualizada con la ayuda de un transiluminador DARKREADER™ para evitar mutaciones inducidas por UV. La banda de ADN de 1.0 kb se dividió con una hoja de afeitar desechable y fue purificada con una copa giratoria ULTRAFREE®-DA de acuerdo con las instrucciones del fabricante .

El vector pAILo2 fue linealizado por digestión con Neo I y Pac I. El fragmento fue purificado por electroforesis en gel y ultrafiltración como se describió anteriormente. La clonación del fragmento de PCR purificado en el vector pAILo2 linealizado y purificado fue realizada con un Kit de Clonación IN-FUSION™. La reacción (20 µ?) contenía 2 µ? de IX solución amortiguadora IN-FUSION™, IX BSA, 1 µ? de enzima IN-FUSION™ (diluido 1:10) , 100 ng de pAILo2 digerido con Neo I y Pac I y 50 ng del producto de PCR purificado Aspergillus fumigatus GH6A. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una muestra de 2 µ? de la reacción se utilizó para transformar células competentes TOP10 E. coli de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de un periodo de recuperación, dos alícuotas de 100 µ? de la reacción de transformación se sembraron en placas 2xYT de 150 mm suplementadas con 100 g de ampicilina por mi. Las placas se incubaron durante la noche a 37°C. Un conjunto de ocho clones recombinantes putativos fue seleccionado al azar de las placas de selección y el ADN del plásmido se preparó a partir de cada una usando un BI0R0B0T® 9600. Los clones fueron analizados por digestión de restricción Pst I . Siete de los ocho clones tenía el patrón de digestión de restricción esperado. Los clones 1, 2, y 3 fueron secuenciados para confirmar que no había mutaciones en el inserto clonado. El Clon #2 fue seleccionado y designado pAILo33.

Protoplastos Aspergillus oryzae JaL355se prepararon de acuerdo con el método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422, que se transformaron con 5 g del plásmido pAILo33. La transformación produjo aproximadamente 30 transformantes. Veintiséis transformantes se aislaron a placas de PDA individuales.

Placas de PDA confluentes de cuatro de los transformantes se lavaron con 8 mi de T EEN® 20 al 0.01% y se inocularon por separado en 1 mi de medio MDU2BP en placas de cultivo de tejidos estériles de 24 pozos y se incubaron a 34 °C. Tres días después de la incubación, 20 µ? de caldo recogido de cada cultivo se analizó usando geles de Tris-Glicina SDS-PAGE al 8-16% (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Perfiles de SDS-PAGE de los cultivos mostraron que varios transformantes tenían una nueva banda principal de aproximadamente 75 kDa . Un transformante fue designado Aspergillus oryzae JaL355 ALL033 (EXP03191) .

Se agregaron cien mi de medio a un matraz de agitación de 500 mi. El medio de matraz de agitación estaba compuesto de 50 g de sacarosa, 10 g de KH2P04, 0.5 g de CaCl2, 2 g de MgS04-7H20, 2 g de K2S0 ; 2 g de urea, 10 g de extracto de levadura, 2 g de ácido cítrico, 0.5 mi de solución de metales traza, y agua desionizada hasta 1 litro. La solución de metales traza estaba compuesta por 13.8 g de FeS04-7H20, 14.3 g de ZnS04-7H20, 8.5 g de MnS04-H20, 2.5 g de CuS04-5H20, 3 g de ácido cítrico, y agua desionizada hasta 1 litro. El matraz de agitación se inoculó con dos tapones de Aspergillus oryzae JaL355 ALL033 (EXP03191) de una placa de PDA y se incubaron a 34°C en un agitador orbital a 200 rpm durante 24 horas. Se utilizaron cincuenta mi del caldo de matraz de agitación para inocular un recipiente de fermentación de 3 litros.

Se agregó un total de 1.8 litros del medio de fermentación por lotes a un termentador revestido de vidrio de tres litros. El medio de fermentación por lotes fue compuesto por litro de 10 g de extracto de levadura, 24 g de sacarosa, 5 g de (NH4)2S04, 2 g de KH2P04, 0.5 g de CaCl2-2H20, 2 g de MgS04-7H20, 1 g de ácido cítrico, 2 g de K2S04, 0.5 mi de antiespumante , y 0.5 mi de solución de metales traza. La solución de metales traza fue compuesta por litro de 13.8 g de FeSO4-7H20, 14.3 g de ZnSO4-7H20, 8.5 g de MnSO4-H20, 2.5 g de CuS04-5H20, 3 g de ácido cítrico, y agua desionizada hasta 1 litro. El medio de alimentación de fermentación estaba compuesto de maltosa. El medio de alimentación de fermentación se dosificó a una velocidad de 0 hasta 4.4 g/l/h durante un período de 185 horas. El recipiente de fermentación se mantuvo a una temperatura de 34 °C y el pH se controló usando un sistema de control Applikon 1030 (Applikon Biotechnology Inc., Foster City, CA, USA) a un punto de ajuste de 6.1 +/- 0.1. Se agregó aire al recipiente a una velocidad de 1 wm y el caldo se agitó por un impulsor Rushton que gira a 1100 hasta 1300 rpm. Al final de la fermentación, el caldo entero se recogió del recipiente y se centrifugó a 3000 xg para eliminar la biomasa. El sobrenadante se esterilizó por filtración y se almacenó a 5 a 10 °C. El sobrenadante se filtró usando una membrana de 0.22 ym EXPRESS™ Plus (Millipore, Bedford, MA, USA) .

Un volumen de 100 mi de sobrenadante filtrado fue intercambiado a la solución amortiguadora en 20 mM de Tris, pH 8.0 usando una columna G-25 de 400 mi SEPHADEX™ (GE Healthcare, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las fracciones se agruparon y se ajustaron a sulfato de amonio 1.2 M -20 mM de Tris H 8.0. La proteína equilibrada se cargó en una columna de flujo rápido PHENYL SEPHAROSE™ 6 (alto sub) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada con 20 mM de Tris, pH 8.0 con sulfato de amonio 1.2 M, y las proteínas unidas se eluyeron con 20 mM de Tris pH 8.0 sin sulfato de amonio. Las fracciones se agruparon y la concentración de proteínas se determinó utilizando un kit de ensayo de proteína Microplate BCA™ en la que se utilizó albúmina de suero bovino como un estándar de proteína.

Ejemplo 7: Preparación de endoglucanasa II Cel5A Thermoascus aurantiacus CGMCC 0670 ADNc Thermoascus aurantiacus CGMCC 0670 que codifica la endoglucanasa Cel5A II (SEC ID NO: 13 [secuencia de ADN] y SEC ID NO: 14 [secuencia de aminoácidos deducida]) fue clonada de acuerdo con el procedimiento siguiente. La cepa G. aurantiacus fue cultivava en 80 mi de medio CBH1 (AVICEL® al 2.5%, glucosa al 0.5%, (NH4)2S04 al 0.14% en Matraces Erlenmeyer de 500 mi a 45 °C durante 3 días con agitación a 165 rpm. Los micelios se recogieron por centrif gación a 7000 rpm durante 30 minutos y se almacenaron a -80°C antes de su uso para extracción de ARN. Se aisló ARN de 100 mg de micelio usando un Mini Kit de plantas RNEASY® (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA).

El ADNc para la endoglucanasa Thermoascus aurantiacus fue aislado por RT PCR usando el sistema RACE 3' y el sistema RACE 5' (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) y cebadores BG025-1, BG025-2, BG025-3, y BG025-4 se muestran a continuación a los aminoácidos N-terminales .

Cebador BG025-1: 5 ' -AA- (T/C) GA (A/G) TC (T/C/A/G) GC (T/C/A/G) GC (T/C/AG) GAATT-3' (SEC ID NO: 15) Cebador BG025-2 : 5 ' -AA- (T/C) GA (A/G) TC (T/C/A/G) GG (T/C/A/G) GC (T/C/AG) GAGTT-3' (SEC ID NO: 16) Cebador BG025-3: 5' -AA- (T/C) GA(AG)AG (T/C) GG (T/C/AG) GC (T/C/A/G) GAATT-3' (SEC ID NO: 17) Cebador BG025-4: 5 ' -AA- (T/C) GA (AG) AG (T/C) GG (T/C/A/G) GC (T/C/AG) GAGTT-3 ' (SEC ID NO: 18) Los productos de RT PCR fueron ligados en el plásmido pGEM®-T usando un Sistema de vector pGEM®-T (Promega, Madison, Wl , USA) y se transformó en la cepa JM109 E. coli (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA) . Un solo clon que alberga un plásmido que contiene la endoglucanasa de ADNc se aisló y se nombró pBGC1009.

Los cebadores de PCR fueron diseñados para amplificar el ADNc que codifica la endoglucanasa T aurantiacus del plásmido pBGC1009. Sitios de enzima de restricción Bsp HI y Pac I se incorporaron para la clonación en marco en el plásmido de expresión Aspergillus oryzae pBM120a (Documento WO 2006/039 541) .

Cebador 996261: 5 ' -GATCTCATGAAGCTCGGCTCTCTCGT-3 ' (SEC ID NO: 19) Bsp HI Cebador 996167: 5 ' -TTAATTAATCAAAGATACGGAGTCAAAATAGG- 3 ' (SEC ID NO : 20) Pac I El fragmento de interés se amplificó por PCR usando un sistema PCR de alta fidelidad EXPAND™ (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) . La mezcla de reacción de amplificación de PCR contenía 1 µ? de 0.09 ug l pBGC1009, 1 µ? de cebador 996261 (50 pmol/µ?) , 1 µ? de cebador 996167 (50 pmol/µ?) , 5 µ? de solución amortiguadora 10X PCR (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) con 15 mM de MgCl2, 1 µ? de mezcla de dNTP (10 mM cada uno), 37.25 µ? de agua, y 0.75 µ? (3.5 U/µ?) de mezcla de ADN polimerasa. Un termociclador EPPENDORF® MASTERCYCLER® se utilizó para amplificar el fragmento programado para 1 ciclo a 94 °C durante 2 minutos; 10 ciclos cada uno a 94°C durante 15 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72 °C durante 1.5 minutos; 15 ciclos cada uno a 94 °C durante 15 segundos, 55°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1.5 minutos, más un alargamiento de 5 segundos en cada ciclo sucesivo; 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos, y mantenido a 4°C.

El producto PCR de 1008 pb se purificó por electroforesis en gel de agarosa al 1% usando solución amortiguadora TAE, dividido del gel y se purificó usando un kit de purificación de gel QIAQUICK® (QIAGEN Inc, Valencia, CA, USA) . El producto purificado se ligó directamente en pCR®2. I-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido resultante se nombró pBM124a.

El plásmido PBM124a fue digerido con Bsp HI y Pac I, purificado por electroforesis en gel de agarosa al 1% usando solución amortiguadora TAE, dividido del gel y se purificó usando un kit de purificación de Gel QIAQUICK®. El fragmento de plásmido se ligó al vector pBM120a, que se digirió con Neo I y Pac I. El plásmido de expresión resultante fue designado pBM123a. El plásmido PBM123a contiene un promotor NA2-tpi duplicado que maneja la expresión del clon de ADNc de la endoglucanasa Thermoascus aurantiacus, el terminador AMG, y amdS como un marcador seleccionable .

Protoplastos BECh2 Aspergillus oryzae (WO 2000/139322) se prepararon de acuerdo con el método de Christensen et al . , 1988, supra, y transformados con 6 pg de pB 123a. Los transformantes primarios se seleccionaron en placas COVE durante 5 días. Los transformantes fueron esporas purificadas dos veces antes del análisis del matraz de agitación.

Las esporas de los transformantes se inocularon en 25 mi de medio MY25 en 125 mi de matraces de agitación. Los cultivos se incubaron a 34 °C, 200 rpm en un agitador de plataforma durante cinco días. En el día 3 y el día 5, los sobrenadantes de cultivo se recogieron y se clarificaron por centrifugación para eliminar el micelio. Veinte microlitros de sobrenadante de tres transformantes se analizaron utilizando un gel SDS-PAGE gradiente 10-20% libre de teñido CRITERION® (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Perfiles de SDS-PAGE de los cultivos mostró que los transformantes tenían una nueva banda principal de aproximadamente 32 kDa. Un transformante fue seleccionado y llamado A. oryzae EXP00858.

Matraces de agitación de 500 mi de plástico, sin deflectores que contenían 100 mi de medio SY50 se inocularon con 0.1 mi de una población de esporas de A. oryzae EXP00858, y se incubaron a 34 °C, 200 rpm durante 24 horas para producir un cultivo de siembra. Se inocularon cincuenta mi del cultivo de siembra en un tanque de fermentación de 2 litros que contiene 2 litros de medio compuesto por litro de 0.5 g de ácido plurónico, 30 g de sacarosa, 2 g de MgS04-7H20, 2 g de KH2P04 anhidro, 1 g de ácido cítrico, 2 g de (NH4)2S04, 1 g de K2S04, 20 g de extracto de levadura, y 0.5 g de solución de metales traza 200X AMG, pH 5.0. La fermentación se alimentó con una alimentación de maltosa. El pH se controló utilizando H3PO4 5N y NH4OH al 15% y se mantuvo a 5.0 y después subió a 5.25. La temperatura se mantuvo a 34.0°C +/- 1°C. La agitación fue de 1000 rpm. El flujo de aire fue de 1.0 wm.

Un volumen de 200 mi de sobrenadante libre de células se diluyó a 1 litro con agua desionizada. El pH se ajustó a 8 y el filtro de muestra esterilizado usando un filtro de polietersulfona (PES) de 0.22 µp?. La muestra esterilizada del filtro se cargó en una columna de flujo rápido de 250 mi Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) pre-equilibrada con 25 mM de Tris pH 8. La enzima fue eluida de la columna con un gradiente NaOH de 0 a 1 M en la misma solución amortiguadora. Las fracciones que contenían endoglucanasa fueron reunidas (400 mi) y la concentración de la enzima calculada del coeficiente de extinción teórico y la absorbancia de la muestra a 280 nm.

Ejemplo 8: Preparación de beta-glucosidasa Cel3A Aspergillus fumigatus N 055679 Beta-glucosidasa Cel3A Aspergillus fumigatus NN055679 (SEC ID NO: 21 [secuencia de ADN] y SEC ID NO: 22 [secuencia de aminoácidos deducida] ) fue preparada recombinantemente de acuerdo con WO 2005/047499 usando Trichoderma reesei utC30 como un huésped.

El caldo se filtró usando una Membrana de 0.22 m EXPRESS™ Plus. El caldo filtrado fue concentrado y la solución amortiguadora intercambiada utilizando un concentrador de flujo tangencial (Pall Filtron, Northborough, MA, USA) equipado con una membrana de polietersulfona de 10 kDa (Pall Filtron, Northborough, MA, USA) y 20 mM de Tris-HCl, pH 8.5. La muestra se cargó en una columna de alto rendimiento Q SEPHAROSE® (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada con 20 mM de Tris, pH 8.0, y las proteínas unidas fueron eluidas con un gradiente lineal de 0-600 mM de cloruro de sodio. Las fracciones se concentraron y se cargaron en una columna HR 26/60 SUPERDEX® 75 de GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada con 20 mM de Tris-mM de 150 de cloruro de sodio pH 8.5. La concentración de proteína fue determinada usando un kit de ensayo de proteínaa Microplate BCA™ en el que se utilizó albúmina de suero bovino como un estándar de proteína.

Ejemplo 9: Preparación de xilanasa GH10 Aspergillus fumigatus NN055679 Xilanasa GH10 Aspergillus fumigatus NN055679 (xyn3) (SEC ID NO: 23 [secuencia de ADN] y la SEC ID NO: 24 [secuencia de aminoácidos deducida] ) fue preparada de forma recombinante de acuerdo con WO 2006/078256 usando Aspergillus oryzae BECh2 como un huésped.

El caldo fue filtrado usando una Membrana de 0.22 µp? EXPRESS™ Plus. Un volumen de 100 mi de caldo filtrado fue intercambiado en solución amor iguadora de 50 mM de acetato de sodio pH 5.0 utilizando una columna de G-25 400 de mi SEPHADEX® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de proteína se determinó usando un kit de ensayo de proteína Microplate BCA™ con albúmina de suero bovino como estándar de la proteína.

Ejemplo 10: Preparación de beta-xilosidasa GH3 Talaromyces emersonii CBS 393.64 Talaromyces emersonii CBS 393.64 (NN005049) beta-xilosidasa (SEC ID NO: 25 [secuencia de ADN] y SEC ID NO: 26 [secuencia de aminoácidos deducida] ) se preparó de forma recombinante de acuerdo con Rasmussen et al., 2006, Biotechnology and Bioingineering 94: 869-876 utilizando Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2003/070956) como un huésped.

El caldo se filtró usando una membrana de 0.22 µ?? EXPRESS™ Plus. Un volumen de 100 mi de caldo filtrado fue intercambiado en solución amortiguadora de 50 mM de acetato de sodio pH 5.0 utilizando una columna G-25 de 400 mi SEPHADEX™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de proteína se determinó usando un kit de ensayo de proteína Microplate BCA™ con albúmina de suero bovino como estándar de la proteína.

Ejemplo 11: Preparación de polipéptido GH61B Trichoderma reesei que tiene actividad celulolítica mejorada Polipéptido GH61B Trichoderma reesei que tiene actividad celulolítica mejorada (SEC ID NO: 27 [secuencia de ADN] y SEC ID NO: 28 [secuencia de aminoácidos deducida]) se preparó de forma recombinante de acuerdo con WO 2007/089290.

El caldo que contiene el polipéptido GH61B Trichoderma reesei se filtró usando una membrana de 0.22 µt? EXPRESS™ Plus. El caldo filtrado fue concentrado y la solución amortiguadora intercambiada utilizando un concentrador de flujo tangencial (Pall Filtron, Northborough, MA, USA) equipada con una membrana de polietersulfona de 10 kDa (Pall Filtron, Northborough, MA, USA) y 20 mM de Tris-HCl, pH 8.0 y después se purificó usando una columna de cromatografía de intercambio iónico HR 16/10 Mono Q® (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) en 20 mM de Tris-HCl, pH 8, usando un gradiente lineal de NaCl 0 a 1 M. Las fracciones que contienen el polipéptido GH61 B fueron mezcladas en base análisis de SDS-PAGE usando un gel SDS-PAGE libre de teñido 8-16% CRITERIO® (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) . La mezcla se purificó adicionalmente usando una columna de cromatografía de exclusión de tamaño HILOAD® 26/60 SUPERDEX® 75 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) en 20 mM de Tris-HCl, pH 8.0 que contiene 150 mM de NaCl . Las fracciones que contienen el polipéptido GH61B fueron combinadas con base en SDS-PAGE. La concentración de proteína se determinó usando un kit de ensayo de proteína Microplate BCA™ en la que se utilizó albúmina de suero bovino como estándar de la proteína.

Ejemplo 12: Efecto de Polipéptidos GH61 que tienen actividad celulolítica mejorada en actividad hidrolizante de PCS de una composición de celulasa basada en Trichoderma. reesei y una composición enzimática de alta temperatura Dos polipéptidos GH61 que tienen actividad celulolítica, mejorada de Trichoderma reesei GH61A y Trichoderma. reesei GH61B, fueron evaluados cada uno por su capacidad para mejorar la actividad hidrolizante de PCS de una composición de 95% de celulasa basada en Trichoderma Reesei [una mezcla de CELLUCLAST™ 1.5L FG (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y 5% de beta-glucosidasa Aspergillus fumigatus a base de proteínas] y una composición enzimática a alta temperatura (composición HT) usando PCS molido sin lavar a 50°C, 55°C, 60°C, y 65°C. Cada Polipéptido GH61 fue agregado por separado a 0.525 mg de proteína enzimática por gramo de celulosa a la composición de celulasa a base de Trichoderma Reesei (2.975 mg de proteína enzimática por gramo de celulosa) o la composición enzimática a alta temperatura (2.975 mg de proteína enzimática por gramo de celulosa) . La composición enzimática de alta temperatura incluyó 43.5% de celobiohidrolasa I Cel7A Penicillium emersonii, 29.4% de celobiohidrolasa II Cel6A Aspergillus fumigatus, 11.8% de endoglucanasa II Cel5A Thermoascus aurantiacus, 5.9% de beta-glucosidasa Cel3A Aspergillus fumigatus, 5.9% de xilanasa GH10 Aspergillus fumigatus, y 3.5 % de beta-xilosidasa GH3 Talaromyces emersonii. Los resultados se compararon con los resultados de la composición de celulasa con Trichoderma Reesei sin los polipéptidos GH61 que tienen actividad celulolítica mejorada de la composición enzimática de alta temperatura sin los polipéptidos GH61 que tienen actividad celulolítica mejorada.

El ensayo se realizó como se describió en el Ejemplo 4.

Las reacciones de 1 mi con 5% de PCS molido sin lavar se llevaron a cabo durante 72 horas en solución amortiguadora de 50 rtiM de acetato sódico, pH 5.0 que contiene 1 mM de sulfato de manganeso. Todas las reacciones se realizaron por triplicado e involucraron un solo mezclado al inicio de la hidrólisis .

Los resultados que se muestran en la figura 3 demostraron que a 50° C y 55°C, el polipéptido GH61A Trichoderma reesei y el polipéptido GH61B Trichoderma reesei fueron capaces de mejorar la hidrólisis de PCS de 72 horas por la composición de celulasa basada en Trichoderma Reesei. A 50°C y 55°C, el polipéptido GH61A Trichoderma reesei mejoró la hidrólisis de PCS de 72 horas por la composición de celulasa basada en Trichoderma Reesei en mayor grado que el polipéptido GH61B Trichoderma reesei. El mejoramiento óptimo por el polipéptido GH61A Trichoderma reesei y el polipéptido GH61B Trichoderma reesei cuando se agrega a la composición de celulasa basada en Trichoderma Reesei fue a 50° C y disminuyó significativamente a 55°C, 60°C, y 65°C. A 60°C y 65°C, la adición del polipéptido GH61A Trichoderma reesei o el polipéptido GH61B Trichoderma reesei a la composición de celulasa basada en Trichoderma Reesei produjo un mejoramiento mínimo de la hidrólisis de PCS de 72 horas en comparación con la composición de celulasas basada en Trichoderma Reesei en 2.975 mg de proteína por g de celulosa.

Cuando se agregaron ambos polipéptidos GH61 a la composición enzimática de alta temperatura, ambos mostraron actividad de mejoramiento de celulasa a 50°C y 55°C. Sin embargo, el polipéptido GH61A Trichoderma reesei mostró significativamente actividad de celulasa mejorada más alta a 50°C y 55°C en comparación con el polipéptido GH61B Trichoderma reesei. Mientras que el polipéptido GH61 B Trichoderma reesei mostró alguna mejora a 50°C y 55°C, se observó poca o ninguna mejora a 60°C y 65°C mientras que el polipéptido GH61A Trichoderma reesei mostró actividad de mejoramiento de celulasa significativa a 60°C y 65°C cuando se agrega a la composición enzimática de alta temperatura. En general, el polipéptido GH61A Trichoderma reesei mostró un rendimiento mejorado significativo en todas las temperaturas de 50-65°C cuando se agrega a la composición enzimática de alta temperatura.

Viikari et al., 2007, supra, describen que el sistema de celulasa Trichoderma reesei es inactivado rápidamente a temperaturas superiores a 45°C, y la temperatura óptima del sistema de celulasa Trichoderma reesei se considera generalmente que está por debajo de 45°C sobre sustratos lignocelulósicos que requieren tiempos de hidrólisis más largos. Por otra parte, Viikari et al., 2007, supra, describen que solamente la endoglucanasa GH45A Trichoderma reesei fue algo más resistente a la inactivación térmica y retuvo más actividad a temperaturas más altas, mientras que GH12A y GH61A, así como xilanasas y otras enzimas accesorias, se inactivaron .

El buen comportamiento del polipéptido GH61A T reesei en el intervalo de temperatura de 55°C a 65°C cuando se agrega a una composición de enzima celulolítica de alta temperatura en una hidrólisis de PCS de 72 horas fue inesperado considerando que la temperatura óptima del sistema de celulasa Trichoderma reesei está por debajo de 45°C para una hidrólisis de 72 horas de acuerdo con Viikari et al. Los resultados mostrados en este documento demostradon que la composición de celulasa basada en Trichoderma Reesei tuvo un mal desempeño por encima de 50°C si o no el polipéptido GH61A T reesei se agrega a la composición. Por otra parte, el rendimiento del polipéptido GH61B T reesei era pobre en el intervalo de temperatura de 55 °C a 65 °C en comparación con 50°C cuando se agrega a la composición de celulasa basada en Trichoderma Reesei o la composición de enzima celulolítica de alta temperatura en una hidrólisis de PCS de 72 horas. Por lo tanto, como los resultados demuestran en este documento, el polipéptido GH61A T reesei mostró sorprendente actividad de mejoramiento de celulasa cuando se agrega a una composición enzimática de alta temperatura en todas las temperaturas en particular en el intervalo de 55 °C hasta 65°C en una hidrólisis de PCS de 72 horas. En base a la baja temperatura óptima del sistema de celulasa Trichoderma reesei, los resultados de Viikari et al., y el bajo rendimiento del polipéptido GH61B T. reesei, fue sorprendente que el polipéptido GH61A T. reesei exhibió actividad de celulasa mejorada significativa a altas temperaturas.

La presente invención se describe además por los siguientes párrafos numerados: [1] Un método para degradar o convertir un material celulósico, que comprende: tratar el material celulósico bajo condiciones de alta temperatura con una composición enzimática en la presencia de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido GH61 que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2, (b) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo por lo menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) , (c) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1 o la secuencia de ADNc del mismo; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones, y (e) un fragmento del polipéptido GH61 de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celulolítica mejorada. [2] El método del párrafo 1, en donde el polipéptido GH61 tiene por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, por lo menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2. [3] El método del párrafo 1 ó 2, en donde el polipéptido GH61 es codificado por un polinucleót ido que se híbrida bajo condiciones de astringencia media-alta, condiciones de alta astringencia o condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) . [4] El método de cualquiera de los párrafos 1-3, en donde el polipéptido GH61 está codificado por un polinucleót ido que tiene por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, por lo menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia a la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO : 1 o la secuencia de ADNc del mismo. [5] El método de cualquiera de los párrafos 1-4, en donde el polipéptido GH61 comprende o consiste de la SEC ID NO: 2. [6] El método de cualquiera de los párrafos 1-4, en donde que el polipéptido GH61 comprende o consiste en el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2. [7] El método del párrafo 6, en donde el polipéptido maduro son los aminoácidos 22-344 de la SEC ID NO: 2. [8] El método de cualquiera de los párrafos 1-4, en donde que el polipéptido GH61 es una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. [9] El método de cualquiera de los párrafos 1-4, en donde el polipéptido GH61 es un fragmento de la SEC ID NO : 2, en donde el fragmento tiene actividad celulolítica mejorada. [10] El método de cualquiera de los párrafos 1-9, en donde el material celulósico es pretratado. [11] El método de cualquiera de los párrafos 1-10, en donde la composición enzimática comprende una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una celulasa, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swollenina. [12] El método del párrafo 11, en donde la celulasa es una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una endoglucanasa , una celobiohidrolasa, y una beta-glucosidasa . [13] El método del párrafo 11, en donde la hemicelulasa es una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una xilanasa, una acetilxilan esterasa, una feruloil esterasa, una arabinofuranosidasa , una xilosidasa, y una glucuronidasa . [14] El método de cualquiera de los párrafos 1-13, comprende además la recuperación del material celulósico degradado . [15] El método del párrafo 14, en donde el material celulósico degradado es un azúcar. [16] El método del párrafo 15, en donde el azúcar es seleccionado del grupo que consiste de glucosa, xilosa, mañosa, galactosa, y arabinosa. [17] El método de cualquiera de los párrafos 1-16, en el que la composición enzimática y/o el polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada están en la forma de un caldo de fermentación con o sin células. [18] El método de cualquiera de los párrafos 1-17, en donde las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 70°C durante aproximadamente 6 hasta aproximadamente 168 horas a un pH de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 8 y un contenido de sólidos seco de un material celulósico de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50% en peso. [19] Un método para producir un producto de fermentación, que comprende: (a) sacarificar un material celulósico en condiciones de alta temperatura con una composición enzimática en la presencia de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada; (b) fermentar el material celulósico sacarificado con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos de fermentación para producir el producto de fermentación, y (c) recuperar el producto de fermentación de la fermentación; en donde el polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada es seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido GH61 que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2, (b) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo por lo menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) , (c) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de codificación del polipeptido maduro de la SEC ID NO : 1 o la secuencia de ADNc de los mismos; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en uno o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido GH61 de (a), (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celulolítica mejorada. [20] El método del párrafo 19, en donde el polipéptido GH61 tiene por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, en menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, en menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2. [21] El método del párrafo 19 ó 20, en donde el polipéptido GH61 es codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo condiciones de astringencia media-alta, las condiciones de astringencia alta o condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) . [22] El método de cualquiera de los párrafos 19-21, en donde el polipéptido GH61 está codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, por lo menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia a la secuencia de codificación del polipéptido maduro de SEC ID NO: 1 o la secuencia de ADNc del mismo. [23] El método de cualquiera de los párrafos 19-22, en donde el polipéptido GH61 comprende o consiste en la SEC ID NO: 2. [24] El método de cualquiera de los párrafos 19-22, en donde el polipéptido GH61 comprende o consiste en el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2. [25] El método del párrafo 24, en donde el polipéptido maduro son los aminoácidos 22-344 de la SEC ID NO : 2. [26] El método de cualquiera de los párrafos 19-22, en donde el polipéptido GH61 es una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. [27] El método de cualquiera de los párrafos 19-22, en el que el polipéptido GH61 es un fragmento de la SEC ID NO: 2, en donde el fragmento tiene actividad celulolítica mejorada. [28] El método de cualquiera de los párrafos 19-27, en donde el material celulósico es pretratado. [29] El método de cualquiera de los párrafos 19-28, en donde la composición enzimática comprende una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una celulasa, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swollenina. [30] El método del párrafo 29, en donde la celulasa es una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, y una beta-glucosidasa . [31] El método del párrafo 29, en donde la hemicelulasa es una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una xilanasa, una acetilxilan esterasa, una feruloil esterasa, una arabinofuranosidasa , una xilosidasa, y una glucuronidasa . [32] El método de cualquiera de los párrafos 19-31, en donde las etapas (a) y (b) se realizan simultáneamente en una sacarificación y fermentación simultáneas. [33] El método de cualquiera de los párrafos 19-32, en donde el producto de fermentación es un alcohol, un ácido orgánico, una cetona, un aminoácido, un alcano, un cicloalcano, un alqueno, isopreno, policétido, o un gas. [34] El método de cualquiera de los párrafos 19-33, en donde la composición enzimática y/o el polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada están en la forma de un caldo de fermentación con o sin células. [35] El método de cualquiera de los párrafos 19-34, en donde las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 70°C durante aproximadamente 6 hasta aproximadamente 168 horas a un pH de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 8 y un contenido de sólidos seco de un material celulósico de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50% en peso. [36] Un método de fermentación de un material celulósico, que comprende: fermentar el material celulósico con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos de fermentación, en donde el material celulósico es sacarificado en condiciones de alta temperatura con una composición enzimática en la presencia de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido GH61 que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2, (b) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que se híbrida en por lo menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO:l( (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) , (c) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia a la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO : 1 o la secuencia de ADNc de los mismos,- (d) una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias posiciones) ; y (e) un fragmento del polipéptido GH61 de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celulolítica mejorada. [37] El método del párrafo 36, en donde el polipéptido GH61 tiene por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, en menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, en menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO : 2. [38] El método del párrafo 36 ó 37, en donde el polipéptido GH61 es codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo condiciones de astringencia media-alta, las condiciones de alta rigurosidad o condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) . [39] El método de cualquiera de los párrafos 36-38, en donde el polipéptido GH61 está codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, por lo menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia a la secuencia de codificación del polipéptido madura de la SEC ID NO: 1 o la secuencia de ADNc del mismo. [40] El método de cualquiera de los párrafos 36-39, en donde el polipéptido GH61 comprende o consiste en la SEC ID NO: 2. [41] El método de cualquiera de los párrafos 36-39, en donde el polipéptido GH61 comprende o consiste en el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2. [42] El método del párrafo 41, en donde el polipéptido maduro son los aminoácidos 22-344 de la SEC ID NO: 2. [43] El método de cualquiera de los párrafos 36-39, en donde el polipéptido GH61 es una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones . [44] El método de cualquiera de los párrafos 36-39, en donde el polipéptido GH61 es un fragmento de la SEC ID NO: 2, en donde el fragmento tiene actividad celulolítica mejorada. [45] El método de cualquiera de los párrafos 36-44, en donde el material celulósico es pretratado antes de la sacarificación. [46] El método de cualquiera de los párrafos 36-45, en donde la composición enzimática comprende una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una celulasa, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una s ollenina. [47] El método del párrafo 46, en donde la celulasa es una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una endoglucanasa, una celobiohidrolasa , y una beta-glucosidasa . [48] El método del párrafo 46, en donde la hemicelulasa es una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una xilanasa, una acetilxilan esterasa, una feruloil esterasa, una arabinofuranosidasa, una xilosidasa, y una glucuronidasa . [49] El método de cualquiera de los párrafos 36-48, en donde la fermentación del material celulósico produce un producto de fermentación. [50] El método del párrafo 49, comprende además recuperar el producto de fermentación de la fermentación. [51] El método del párrafo 49 ó 50, en donde el producto de fermentación es un alcohol, un ácido orgánico, una cetona, un aminoácido, un alcano, un cicloalcano, un alqueno, isopreno, policétido, o un gas. [52] El método de cualquiera de los párrafos 36-51, en donde la composición de enzima y/o el polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada está en la forma de un caldo de fermentación con o sin células. [53] El método de cualquiera de los párrafos 36-52, en donde las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 70°C durante aproximadamente 6 hasta aproximadamente 168 horas a un pH de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 8 y un contenido de sólidos secos de un material celulósico de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50% en peso. [54] Una composición detergente que comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada seleccionada del grupo que consiste de: (a) un polipéptido GH61 que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2, (b) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo por lo menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID N0:1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) , (c) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1 o la secuencia de ADNc de los mismos; (d) una variante polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones, y (e) un fragmento del polipéptido GH61 de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celulolítica mejorada. [55] La composición del párrafo 54, que comprende además una o más (por ejemplo, varias) de una celulasa, una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa. [56] La composición del párrafo 54 ó 55, que se formula como una barra, una tableta, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. [57] Un método para la limpieza o lavado de una superficie dura o de ropa sucia, el método comprende poner en contacto la superficie dura o la ropa sucia con la composición de cualquiera de los párrafos 54-56.

La invención descrita y reivindicada en el presente documento no está limitada en su alcance por los aspectos específicos descritos en esta invención, ya que estos aspectos están previstos como ilustraciones de varios aspectos de la invención. Cualquiera de los aspectos equivalentes está previsto que estén dentro del alcance de esta invención. De hecho, varias modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en este documento serán evidentes para las personas experimetadas en el arte previo a partir de la descripción anterior. Tales modificaciones también están previstas a ester dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, la presente descripción incluye las definiciones que controla.

Varias referencias se citan en este documento, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en su totalidad .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para degradar o convertir un material celulósico, caracterizado porque comprende: tratar el material celulósico bajo condiciones de alta temperatura con una composición enzimática en la presencia de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido GH61 que tiene por lo menos 60%, por ejemplo por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, por lo menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO : 2 ; (b) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo por lo menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; (c) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60%, por ejemplo por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, por lo menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1 o la secuencia de ADNc del mismo; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido GH61 de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celulolítica mejorada.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido GH61 comprende o consiste de la SEC ID NO: 2 o el polipéptido maduro del mismo.

3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la composición enzimática comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una celulasa, una hemicelulasa , una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swollenina.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque además comprende la recuperación del material celulósico degradado.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el material celulósico degradado es un azúcar .

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 70°C durante aproximadamente 6 hasta aproximadamente 168 horas a un pH de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 8 y un contenido de sólidos seco de un material celulósico de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50% en peso.

7. Un método para producir un producto de fermentación, caracterizado porque comprende: (a) sacarificar un material celulósico bajo condiciones de alta temperatura con una composición enzimática en la presencia de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada; (b) fermentar el material celulósico sacarificado con uno o más microorganismos de fermentación para producir el producto de fermentación; y (c) recuperar el producto de fermentación de la fermentación; en donde el polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada es seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido GH61 que tiene por lo menos 60%, por ejemplo por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, en menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, en menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 ; (b) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo por lo menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; (c) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60%, por ejemplo por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, en menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, en menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO : 1 o la secuencia de ADNc de los mismos; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido GH61 de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celulolítica mejorada.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el polipéptido GH61 comprende o consiste de la SEC ID NO: 2 o el polipéptido maduro del mismo.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque la composición enzimática comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una celulasa, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swollenina.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, caracterizado porque el producto de fermentación es un alcohol, un ácido orgánico, una cetona, un aminoácido, un alcano, un cicloalcano, un alqueno, isopreno, policétido, o un gas.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-10, caracterizado porque las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 70°C durante aproximadamente 6 hasta aproximadamente 168 horas a un pH de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 8 y un contenido de sólidos seco de un material celulósico de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50% en peso.

12. Un método de fermentación de un material celulósico, caracterizado porque comprende: fermentar el material celulósico con uno o más microorganismos de fermentación, en donde el material celulósico es sacarificado en condiciones de alta temperatura con una composición enzimática en la presencia de un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido GH61 que tiene por lo menos 60%, por ejemplo por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, en menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, en menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 ,- (b) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que se híbrida en por lo menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO : 1 , (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) (c) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60%, por ejemplo por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, en menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, en menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia a la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO:l o la secuencia de ADNc de los mismos; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido GH61 de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celulolítica mejorada.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polipéptido GH61 comprende o consiste en la SEC ID NO: 2 o el polipéptido maduro del mismo.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque la composición enzimática comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una celulasa, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swollenina.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-14, caracterizado porque la fermentación del material celulósico produce un producto de fermentación.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende además recuperar el producto de fermentación de la fermentación.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado porque el producto de fermentación es un alcohol, un ácido orgánico, una cetona, un aminoácido, un alcano, un cicloalcano, un alqueno, isopreno, policétido, o un gas.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-17, caracterizado porque las condiciones de alta temperatura son una temperatura de aproximadamente 54 °C hasta aproximadamente 70 °C durante aproximadamente 6 hasta aproximadamente 168 horas a un pH de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 8 y un contenido de sólidos secos de un material celulósico de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50% en peso.

19. Una composición detergente caracterizada porque comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad celulolítica mejorada seleccionada del grupo que consiste de: (a) un polipéptido GH61 que tiene por lo menos 60%, por ejemplo por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, en menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, en menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2; (b) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo por lo menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID N0:1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; (c) un polipéptido GH61 codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 60%, por ejemplo por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, en menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, en menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1 o la secuencia de ADNc de los mismos ; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido GH61 de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celulolítica mejorada.

20. Un método para la limpieza o lavado de una superficie dura o de ropa sucia, caracterizado porque comprende poner en contacto la superficie dura o la ropa sucia con la composición de conformidad con la reivindicación 19.