JP2011504742A - 抗原結合性構築物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
Xは、定常重鎖ドメイン2および定常重鎖ドメイン3を含む定常抗体領域を表し、
R1、R4、R7およびR8は、エピトープ結合性ドメインから独立に選択されるドメインを表し、
R2は、定常重鎖1、およびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
R3は、対になったVHおよびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
R5は、定常軽鎖およびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
R6は、対になったVLおよびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
nは、0、1、2、3および4から独立に選択される整数を表し、
mは、0および1から独立に選択される整数を表し、
定常重鎖1ドメインと定常軽鎖ドメインとが結合しており、
少なくとも1つのエピトープ結合性ドメインが存在し、
R3が対になったVHドメインを表す場合、R6は対になったVLドメインを表し、それにより該2つのドメインは一緒になって抗原に結合することが可能である。
本明細書において使用される場合、用語「タンパク質足場」は、免疫グロブリン(Ig)足場、例えばIgG足場を含むが、これらに限定されず、これは、4つの鎖もしくは2つの鎖の抗体であってもよく、またはこれは、抗体のFc領域だけを含んでいてもよく、またはこれは、抗体に由来する1以上の定常領域を含んでいてもよく、この定常領域は、ヒトもしくは霊長動物起源のものであってもよく、またはこれは、ヒトおよび霊長動物の定常領域の人工キメラであってもよい。そのようなタンパク質足場は、1以上の定常領域に加えて抗原結合性部位を含んでいてもよく、例えば、タンパク質足場は、全IgGを含む。そのようなタンパク質足場は、他のタンパク質ドメイン、例えば、抗原結合性部位を有するタンパク質ドメイン、例えばエピトープ結合性ドメインまたはScFvドメインに連結することが可能であろう。
Xは、定常重鎖ドメイン2および定常重鎖ドメイン3を含む定常抗体領域を表し、
R1、R4、R7およびR8は、エピトープ結合性ドメインから独立に選択されるドメインを表し、
R2は、定常重鎖1、およびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
R3は、対になったVHおよびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
R5は、定常軽鎖およびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
R6は、対になったVLおよびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
nは、0、1、2、3および4から独立に選択される整数を表し、
mは、0および1から独立に選択される整数を表し、
定常重鎖1ドメインと定常軽鎖ドメインとが結合しており、
少なくとも1つのエピトープ結合性ドメインが存在し、
R3が対になったVHドメインを表す場合、R6は対になったVLドメインを表し、それにより該2つのドメインは一緒になって抗原に結合することが可能である。
(a)抗原結合性構築物の重鎖をコードする第1のベクターを提供するステップ、
(b)抗原結合性構築物の軽鎖をコードする第2のベクターを提供するステップ、
(c)上述の第1および第2のベクターを用いて哺乳動物宿主細胞(例えばCHO)を形質転換するステップ、
(d)上述の培養培地への上述の宿主細胞からの抗原結合性構築物の分泌を促す条件下でステップ(c)の宿主細胞を培養するステップ、
(e)ステップ(d)の、分泌された抗原結合性構築物を回収するステップ
を含む方法が提供される。
エピトープ結合性ドメインまたはドメインの集団は、任意の適した方法を使用して、レパートリーまたはライブラリー(例えばディスプレイ系における)から選択、回収および/または単離することができる。例えば、ドメインは、選択可能な特徴(例えば物理的特徴、化学的特徴、機能的特徴)に基づいて選択または単離される。適した選択可能な機能的特徴は、レパートリーにおけるペプチドまたはポリペプチドの生物活性、例えばジェネリックリガンド(例えばスーパー抗原)への結合、標的リガンド(例えば抗原、エピトープ、基質)への結合、抗体への結合(例えばペプチドまたはポリペプチド上に発現されるエピトープを通しての)、および触媒活性を含む(例えばTomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655を参照されたい)。
プロテアーゼエピトープ結合性ドメインをコードおよび/または含有するライブラリーは、任意の適した方法を使用して調製し、または得ることができる。ライブラリーは、対象となるドメインまたは足場(例えばライブラリーから選択されたドメイン)に基づいて、ドメインをコードするように設計することができ、または本明細書において記載される方法を使用して、他のライブラリーから選択することができる。例えば、ドメインで豊富なライブラリーを、適したポリペプチドディスプレイ系を使用して調製することができる。
その特異的な抗原またはエピトープへのドメインの結合は、当業者らによく知られており、ELISAを含む方法によって試験することができる。一例において、結合は、モノクローナルファージELISAを使用して試験される。
dAbが、例えば本明細書において記載されるファージディスプレイ技術を使用して選択されたV遺伝子レパートリーから選択される場合には、これらの可変ドメインは、ユニバーサルフレームワーク領域を含み、それらは、本明細書において定義されるような特異的なジェネリックリガンドによって認識されてもよい。ユニバーサルフレームワーク、ジェネリックリガンドなどの使用は、WO99/20749において記載されている。
i.主鎖高次構造の選択
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーはすべて、それらのポリペプチド鎖について類似の折り畳み部分を共有する。例えば、抗体は、それらの一次配列の点から高度に多様であるが、配列および結晶学的な構造の比較は、予想に反して、抗体の6つの抗原結合性ループのうちの5つ(H1、H2、L1、L2、L3)は、限られた数の主鎖高次構造または基本的な構造を取ることを明らかにした(Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877)。したがって、ループ長および重要な残基の分析は、大多数のヒト抗体において見つけられるH1、H2、L1、L2、およびL3の主鎖高次構造の予測を可能にした(Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220)。H3領域は、配列、長さ、および構造の点からはるかに、より多様であるが(Dセグメントの使用により)、それはまた、ループおよび抗体フレームワークにおける重要な位置の特定の残基の長さおよび存在または残基のタイプに依存する短いループ長のために、限られた数の主鎖高次構造を形成する(Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1)。
いくつかの知られている主鎖高次構造または単一の知られている主鎖高次構造を選択したら、dAbは、構造的なおよび/または機能的な多様性を有するレパートリーを生成するために、分子の結合部位を変えることによって構築することができる。これは、変異体が一連の活性を提供することができるように、それらが、それらの構造および/またはそれらの機能において十分な多様性を持つようにそれらが生成されることを意味する。
nn≦xn-(xn・y)、
[式中、nnは、ヌクレオチド改変の数であり、xnは、配列番号122におけるヌクレオチドの合計数であり、yは、50%については0.50、60%については0.60、70%については0.70、80%については0.80、85%については0.85、90%については0.90、95%については0.95、97%については0.97、もしくは100%については1.00であり、xnおよびyのいかなる非整数の積も、xnからそれを引く前に、最も近い整数まで切り捨てられる]によって決定される。配列番号122のポリヌクレオチド配列の改変は、このコード配列において、ナンセンス、ミスセンス、またはフレームシフト突然変異を生じさせてもよく、それによって、そのような改変に続いて、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを改変する。
na≦xa-(xa・y)、
[式中、naは、アミノ酸改変の数であり、xaは、配列番号26によってコードされるポリペプチド配列におけるアミノ酸の合計数であり、yは、例えば、70%については0.70、80%については0.80、85%については0.85等であり、xaおよびyのいかなる非整数の積も、xaからそれを引く前に、最も近い整数まで切り捨てられる]によって決定される。
ELISAによる大腸菌発現組換えヒトIL-13との結合
mAbdAb分子を、直接結合ELISAにおいて組換え大腸菌発現ヒトIL-13との結合に関して評価した。簡潔には、5μg/mlの組換え大腸菌発現ヒトIL-13(GSKで作製および精製)を96ウェルELISAプレートにコーティングした。ウェルを室温で1時間ブロッキングし、次いでmAbdAb構築物をプレートで滴定した(通常約3倍希釈液中に100nM〜約0.01nM)。結合は抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼ結合抗体(カタログ番号A7164、Sigma-Aldrich)の適切な希釈液、または抗ヒトIgGγ鎖特異的ペルオキシダーゼ結合検出抗体(カタログ番号A6029、Sigma-Aldrich)の適切な希釈液を使用して検出した。
ELISAによる大腸菌発現組換えヒトIL-4との結合
mAbdAb構築物を、直接結合ELISAにおいて組換え大腸菌発現ヒトIL-4との結合に関して評価した。簡潔には、5μg/mlの組換え大腸菌発現ヒトIL-4(GSKで作製および精製)を96ウェルELISAプレートにコーティングした。ウェルを室温で1時間ブロッキングし、次いでmAbdAb構築物をプレートで滴定した(通常約3倍希釈液中に100nM〜約0.01nM)。結合はヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼ結合抗体(カタログ番号A7164、Sigma-Aldrich)の適切な希釈液、または抗ヒトIgGγ鎖特異的ペルオキシダーゼ結合検出抗体(カタログ番号A6029、Sigma-Aldrich)の適切な希釈液を使用して検出した。
ELISAによる大腸菌発現組換えヒトIL-18との結合
mAbdAb構築物を、直接結合ELISAにおいて組換え大腸菌発現ヒトIL-18との結合に関して評価した。簡潔には、5μg/mlの組換え大腸菌発現ヒトIL-18(GSKで作製および精製)を96ウェルELISAプレートにコーティングした。ウェルを室温で1時間ブロッキングし、次いでmAbdAb構築物をプレートで滴定した(通常約3倍希釈液中に100nM〜約0.01nM)。結合は抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼ結合抗体(カタログ番号A7164、Sigma-Aldrich)の2000倍希釈液、または抗ヒトIgGγ鎖特異的ペルオキシダーゼ結合検出抗体(カタログ番号A6029、Sigma-Aldrich)の2000倍希釈液を使用して検出した。
大腸菌発現組換えヒトIL-13との結合に関するBiacore(商標)の結合親和性評価
組換え大腸菌発現ヒトIL-13に関するmAbdAb構築物の結合親和性を、Biacore(商標)分析によって評価した。分析はプロテインAまたは抗ヒトIgG捕捉を使用して実施した。簡潔には、プロテインAまたは抗ヒトIgGを、製造者の推奨に従い第1級アミンカップリングによってCM5チップ上に結合させた。次いでmAbdAb構築物をこの表面上に捕捉し、ヒトIL-13(GSKで作製および精製)を定義した濃度で与えた。表面は弱酸性溶出条件(100mMリン酸など)を使用して再度プロテインA表面に再生し、これは後のIL-13結合事象に関して抗体を捕捉する能力に有意に影響を与えなかった。抗ヒトIgG表面は、プロテインA表面と同様の条件の使用、または3MのMgCl2の使用のいずれかによって再生した。作業はBiacore(商標)3000、および/またはT100機器で実施し、データは機器において評価ソフトウェアを使用して分析し、1:1結合モデルに適合させた。Biacore(商標)の作業は25℃または37℃で実施した。
大腸菌発現組換えヒトIL-4との結合に関するBiacore(商標)の結合親和性評価
組換え大腸菌発現ヒトIL-4に関するmAbdAb構築物の結合親和性を、Biacore(商標)分析によって評価した。分析はプロテインAまたは抗ヒトIgG捕捉を使用して実施した。簡潔には、プロテインAまたは抗ヒトIgGを、製造者の推奨に従い第1級アミンカップリングによってCM5チップ上に結合させた。次いでmAbdAb構築物をこの表面上に捕捉し、ヒトIL-4(GSKで作製および精製)を定義した濃度で与えた。表面は弱酸性溶出条件(100mMリン酸など)を使用して再度プロテインA表面に再生し、これは後のIL-4結合事象に関して抗体を捕捉する能力に有意に影響を与えなかった。抗ヒトIgG表面は、プロテインA表面と同様の条件の使用、または3MのMgCl2の使用のいずれかによって再生した。作業はBiacore(商標)3000、および/またはT100および/またはA100機器で実施し、データは機器において評価ソフトウェアを使用して分析し、1:1結合モデルに適合させた。Biacore(商標)の作業は25℃または37℃で実施した。
大腸菌発現組換えヒトIL-18との結合に関するBiacore(商標)の結合親和性評価
組換え大腸菌発現ヒトIL-18に関するmAbdAb構築物の結合親和性を、Biacore(商標)分析によって評価した。分析はプロテインAまたは抗ヒトIgG捕捉を使用して実施した。簡潔には、プロテインAまたは抗ヒトIgGを、製造者の推奨に従い第1級アミンカップリングによってCM5チップ上に結合させた。次いでmAbdAb構築物をこの表面上に捕捉し、ヒトIL-18(GSKで作製および精製)を定義した濃度で与えた。表面は弱酸性溶出条件(100mMリン酸など)を使用して再度プロテインA表面に再生し、これは後のIL-18結合事象に関して抗体を捕捉する能力に有意に影響を与えなかった。抗ヒトIgG表面は、プロテインA表面と同様の条件の使用、または3MのMgCl2の使用のいずれかによって再生した。作業はBiacore(商標)3000、および/またはT100および/またはA100機器で実施し、データは機器において評価ソフトウェアを使用して分析し、1:1結合モデルに適合させた。Biacore(商標)の作業は25℃で実施した。
(Biacore(商標)を使用した)IL-13、IL-4またはIL-18に対するmAbdAb二重特異性抗体または三重特異性抗体の化学量論的評価
抗ヒトIgGは、第1級アミンカップリングによってCM5バイオセンサーチップ上に固定化した。mAbdAb構築物をこの表面上に捕捉し、その後、単一濃度のIL-13、IL-4またはIL-18サイトカインを与え、この濃度は結合表面を飽和するのに十分であり、観察した結合シグナルは完全R-maxに達した。次いで化学量論値を以下の式を使用して計算した:
化学量論値=Rmax*Mw(リガンド)/Mw(アナライト)*R(固定化または捕捉されたリガンド)
上式で、化学量論値を同時に2つ以上のアナライト結合に関して計算し、異なるサイトカインを飽和サイトカイン濃度で連続的に与え、化学量論値は前述のように計算した。作業はHBS-EPランニングバッファーを使用して25℃でBiacore3000において実施した。
TF-1細胞増殖バイオアッセイにおける大腸菌発現組換えヒトIL-13の中和
TF-1細胞は、ヒトIL-13を含めたいくつかの異なるサイトカインに応答して増殖する。したがってIL-13に関するこれらの細胞の増殖性応答を使用してIL-13の生物活性を測定することができ、後にアッセイを開発してmAbdAb構築物のIL-13中和効力(IL-13の生物活性の阻害)を決定した。
TF-1細胞増殖バイオアッセイにおける大腸菌発現組換えヒトIL-4の中和
TF-1細胞は、ヒトIL-4を含めたいくつかの異なるサイトカインに応答して増殖する。したがってIL-4に関するこれらの細胞の増殖性応答を使用してIL-4の生物活性を測定することができ、後にアッセイを開発してmAbdAb構築物のIL-4中和効力(IL-4の生物活性の阻害)を決定した。
TF-1細胞増殖バイオアッセイにおける大腸菌発現組換えヒトIL-13と大腸菌発現組換えヒトIL-4の二重中和
TF-1細胞は、ヒトIL-13およびヒトIL-4を含めたいくつかの異なるサイトカインに応答して増殖する。したがってIL-13およびヒトIL-4に関するこれらの細胞の増殖性応答を使用してIL-13およびヒトIL-4の生物活性を同時に測定することができ、後にアッセイを開発してmAbdAb構築物のIL-13およびヒトIL-4二重中和効力(IL-13およびIL-4生物活性の二重阻害)を決定した。
Sf21-発現組換えヒトIL-5との結合に関するBiacore(商標)の結合親和性評価
組換えSf21-発現ヒトIL-5に関するmAbdAb分子の結合親和性を、Biacore(商標)分析によって評価した。分析はプロテインAまたは抗ヒトIgG捕捉を使用して実施した。簡潔には、プロテインAまたは抗ヒトIgGを、製造者の推奨に従い第1級アミンカップリングによってCM5チップ上に結合させた。次いでmAbdAb分子をこの表面上に捕捉し、ヒトIL-5(GSKで作製および精製)を定義した濃度で与えた。表面は弱酸性溶出条件(100mMリン酸など)を使用して再度プロテインA表面に再生し、これは後のIL-5結合事象に関して抗体を捕捉する能力に有意に影響を与えなかった。抗ヒトIgG表面は、プロテインA表面と同様の条件の使用、または3MのMgCl2の使用のいずれかによって再生した。作業はBiacore(商標)3000、T100およびA100機器で実施し、データは機器において評価ソフトウェアを使用して分析し、1:1結合モデルに適合させた。Biacore(商標)の作業は25℃で実施した。
VEGF受容体結合アッセイ
このアッセイはVEGF165とVEGFR2(VEGF受容体)の結合、およびこの相互作用を阻害する試験分子の能力を測定する。ELISAプレートはVEGF受容体(R&D Systems、カタログ番号357-KD-050)(0.2M炭酸ナトリウム重炭酸ナトリウムpH9.4中に0.5μg/mlの最終濃度)で一晩コーティングし、PBSに溶かした2%BSAで洗浄しブロッキングした。VEGF(R&D Systems、カタログ番号293-VE-050)および(0.1%BSAを溶かした0.05%Tween20(商標)PBSに希釈した)試験分子を、プレートに加える前に(3ng/mlのVEGF最終濃度)1時間プレインキュベートした。VEGFとVEGF受容体の結合は、ビオチン化抗VEGF抗体(0.5μg/mlの最終濃度)(R&D Systems、カタログ番号BAF293)およびペルオキシダーゼ結合抗ビオチン二次抗体(5000倍希釈)(Stratech、カタログ番号200-032-096)を使用して検出し、等体積の1MのHClで反応を停止させた後に発色基質(Sure Blue TMBペルオキシダーゼ基質、KPL)を使用してOD450で可視化した。
EGFRキナーゼアッセイ
EGFとのその相互作用を介してA431細胞の表面で発現されたEGFRの活性化は、受容体のチロシンキナーゼリン酸化をもたらす。EGFRのチロシンキナーゼリン酸化の低下を測定して、試験分子の効力を決定した。A431細胞は96ウェルの組織培養プレートに一晩接着させ、次いで試験分子を加え、1時間放置し、次いでEGF(300ng/mlで)(R&D Systemsカタログ番号236-EG)と共に10分間インキュベートした。細胞を溶解し、溶解調製物は抗EGFR抗体(1ug/mlで)(R&D Systemsカタログ番号AF231)でコーティングしたELISAプレートに移した。溶解細胞溶液中に存在したリン酸化EGFRと非リン酸化EGFRの両方を捕捉した。非結合物質を洗浄除去した後、HRP結合抗ホスホチロシン抗体(2000倍希釈)(Upstate Biotechnology、カタログ番号16-105)を使用してリン酸化EGFRを特異的に検出した。結合は発色基質を使用して可視化した。
MRC-5/TNFアッセイ
ヒトTNFR1とのヒトTNF-aの結合を妨げてIL-8分泌を中和する試験分子の能力を、ヒト肺線維芽細胞MRC-5細胞を使用して決定した。希釈系の試験サンプルはTNF-a(500pg/ml)(Peprotech)と1時間インキュベートした。次いでこれをMRC-5細胞の懸濁液(ATCC、カタログ番号CCL-171)(5×103個の細胞/ウェル)で2倍に希釈した。一晩のインキュベーション後、サンプルは10倍に希釈し、IL-8の放出はIL-8 ABI 8200細胞検出アッセイ(FMAT)を使用して決定し、この場合IL-8濃度は抗IL-8(R&D systems、カタログ番号208-IL)コーティングポリスチレンビーズ、ビオチン化抗IL-8(R&D systems、カタログ番号BAF208)およびストレプトアビジンAlexafluor647(Molecular Probes、カタログ番号S32357)を使用して決定した。アッセイの読み出し値は647nmでの局所蛍光発光であり、未知のIL-8濃度はアッセイ中に含まれたIL-8標準曲線を使用して内挿した。
MRC-5/IL-1アッセイ
ヒトIL1-RとのヒトIL-1aの結合を妨げてIL-8分泌を中和する試験分子の能力を、ヒト肺線維芽細胞MRC-5細胞を使用して決定した。MRC-5細胞(ATCC、カタログ番号CCL-171)をトリプシン処理し、次いで懸濁液としての試験サンプルと1時間インキュベートした。IL-1a(200pg/mlの最終濃度)(R&D Systemsカタログ番号200-LA)を次いで加えた。一晩のインキュベーション後、IL-8の放出は抗IL-8コーティングELISAプレート、ビオチン化抗IL-8およびストレプトアビジンHRPを用いてIL-8定量化ELISAキット(R&D Systems)を使用して決定した。アッセイの読み出し値は450nmでの比色吸光度であり、未知のIL-8濃度はアッセイ中に含まれたIL-8標準曲線を使用して内挿した。
全血ホスホ-STAT6バイオアッセイにおける大腸菌発現組換えヒトIL-13またはIL-4の中和効力
全血細胞は組換え大腸菌発現ヒトIL-4(rhIL-14)またはIL-13(rhIL-13)を用いてex-vivoで刺激して、ホスホSTAT6(pSTAT6)を発現させることが可能である。このアッセイはpSTAT6を定量的に測定し、したがってmAbdAb構築物の中和効力(IL-4またはIL-13生物活性の阻害)を決定するために開発した。
ELISAによる大腸菌発現組換えカニクイザルIL-13との結合
mAbdAb分子を、直接結合ELISAにおいて組換え大腸菌発現カニクイザルIL-13との結合に関して評価した。簡潔には、5μg/mlの組換え大腸菌発現カニクイザルIL-13(GSKで作製および精製)を96ウェルELISAプレートにコーティングした。ウェルを室温で1時間ブロッキングし、次いでmAbdAb分子をプレートで滴定した(通常約3倍希釈液中に100nM〜約0.01nM)。結合は抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼ結合抗体(カタログ番号A7164、Sigma-Aldrich)の適切な希釈液、または抗ヒトIgGγ鎖特異的ペルオキシダーゼ結合検出抗体(カタログ番号A6029、Sigma-Aldrich)の適切な希釈液を使用して検出した。
使用せず。
ELISAによるヒトIL4受容体α(IL4Rα)とのヒトIL-4の結合の阻害
特に明記しない限り、すべての試薬は、使用の直前にブロッキング溶液(4%ウシ血清アルブミン、トリス緩衝生理食塩水および0.05%Tween20中)中に必要とされる濃度に希釈した。ELISAプレートは、リン酸緩衝生理食塩水に溶かした5μg/mlの組換えヒトIL4Rα-Fcキメラ(R&D Systems、カタログ番号604-4R)を用いて4℃において一晩コーティングした。すべての後のステップは室温で実施した。プレートは、ブロッキング溶液中で2時間ブロッキングした後に、0.02μg/mlの組換えヒトIL-4(GSKで作製)と事前に混合した50μlの様々な濃度のmAbdAb(または陽性対照mAbsもしくはdAb)を加えた。プレートを1時間インキュベートした後に、洗浄バッファー(トリス緩衝生理食塩水および0.05%Tween20)中で4回洗浄した。ビオチン化抗ヒトIL-4(R&D Systems、カタログ番号BAF204)の0.5μg/ml溶液50μlをそれぞれのウェルに加え、1時間インキュベートした。プレートは洗浄バッファー中で4回洗浄した後に、50μl/ウェルの2000倍希釈のエクストラバジン(Sigma、カタログ番号E2886)を加えた。1時間後、プレートは4回洗浄し、比色シグナルは(Sigmaからの)OPDペルオキシダーゼ基質とのインキュベーションによって検出し、反応は停止溶液(3MのH2SO4酸)を用いて停止させ、吸光度データは490nmでのプレートリーダーにおける読み取りによって得た。平均吸光度と標準誤差をGraphPad Prismでプロットし、IC50値はCambridge Soft BioAssayを使用して計算した。
TF-1細胞増殖バイオアッセイにおける大腸菌発現組換えカニクイザルIL-13の中和
TF-1細胞は、カニクイザルIL-13を含めたいくつかの異なるサイトカインに応答して増殖する。したがってIL-13に関するこれらの細胞の増殖性応答を使用してIL-13の生物活性を測定することができ、後にアッセイを開発してmAbdAb構築物のIL-13中和効力(IL-13の生物活性の阻害)を決定した。
TF-1細胞増殖バイオアッセイにおける大腸菌発現組換えカニクイザルIL-4の中和
TF-1細胞は、カニクイザルIL-4を含めたいくつかの異なるサイトカインに応答して増殖する。したがってIL-4に関するこれらの細胞の増殖性応答を使用してIL-4の生物活性を測定することができ、後にアッセイを開発してmAbdAb構築物のIL-4中和効力(IL-4の生物活性の阻害)を決定した。
ELISAによるヒトIL-13受容体α2(IL13Rα2)とのヒトIL-13の結合の阻害
特に明記しない限り、すべての試薬は、使用の直前にブロッキング溶液(1%ウシ血清アルブミン、トリス緩衝生理食塩水および0.05%Tween20中)中に必要とされる濃度に希釈した。ELISAプレートは、コーティングバッファー(0.05M重炭酸塩pH9.6、Sigma C-3041)の溶液中の5μg/mlのSf21細胞中で発現された組換えヒトIL13Rα2/Fcキメラ(R&D Systems、カタログ番号614-IR)を用いて4℃において一晩コーティングした。プレートは、ブロッキング溶液(1%BSA、TBST中)中で室温において1時間ブロッキングした後に、30ng/mlの組換えヒトIL-13(GSKで作製)と37℃で30分間プレインキュベートした様々な濃度のmAbdAb(または陽性対照mAbsもしくはdAb)を加えた。プレートを1時間インキュベートした後に、洗浄バッファー(トリス緩衝生理食塩水および0.05%Tween20)中で3回洗浄した。ビオチン化抗ヒトIL-13(R&D Systems、カタログ番号BAF213)の0.5μg/ml溶液50μlをそれぞれのウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートは洗浄バッファー中で3回洗浄した後に、適切な希釈のエクストラバジン(Sigma、カタログ番号E2886)を加えた。1時間後、プレートを洗浄し、比色シグナルは(Sigmaからの)OPDペルオキシダーゼ基質とのインキュベーションによって検出し、反応は停止溶液(3Mの酸)を用いて停止させ、吸光度データは490nmでのプレートリーダーにおける読み取りによって得た。平均吸光度と標準誤差をエクセルシートでプロットし、IC50値はマイクロソフトエクセルからRobosageソフトウェアを使用して計算した。
大腸菌発現組換えカニクイザルIL-13との結合に関するBiacore(商標)の結合親和性評価
組換え大腸菌発現カニクイザルIL-13に関するmAbdAb(またはmAb)分子の結合親和性を、Biacore(商標)分析によって評価した。分析はプロテインAまたは抗ヒトIgG捕捉を使用して実施した。簡潔には、プロテインAまたは抗ヒトIgGを、製造者の推奨に従い第1級アミンカップリングによってCM5チップ上に結合させた。次いでmAbdAb(またはmAb)分子をこの表面上に捕捉し、カニクイザルIL-13(GSKで作製および精製)を定義した濃度で与えた。表面は弱酸性溶出条件を使用して再度プロテインA表面に再生し、これは後のIL-13結合事象に関して抗体を捕捉する能力に有意に影響を与えなかった。作業はBIAcore(商標)3000、および/またはT100機器で実施し、データは機器において評価ソフトウェアを使用して分析し、1:1結合モデルに適合させた。BIAcore(商標)の作業は25℃または37℃で実施した。
大腸菌発現組換えカニクイザルIL-4との結合に関するBiacore(商標)の結合親和性評価
組換え大腸菌発現カニクイザルIL-4に関するmAbdAb(またはmAb)分子の結合親和性を、BIAcore(商標)分析によって評価した。分析はプロテインAまたは抗ヒトIgG捕捉を使用して実施した。簡潔には、プロテインAまたは抗ヒトIgGを、製造者の推奨に従い第1級アミンカップリングによってCM5チップ上に結合させた。次いでmAbdAb(またはmAb)分子をこの表面上に捕捉し、カニクイザルIL-4(GSKで作製および精製)を定義した濃度で与えた。表面は弱酸性溶出条件(100mMリン酸など)を使用して再度プロテインA表面に再生し、これは後のIL-4結合事象に関して抗体を捕捉する能力に有意に影響を与えなかった。抗ヒトIgG表面は、プロテインA表面と同様の条件の使用、または3MのMgCl2の使用のいずれかによって再生した。作業はBIAcore(商標)3000および/またはT100および/またはA100機器で実施し、データは機器において評価ソフトウェアを使用して分析し、1:1結合モデルに適合させた。BIAcore(商標)の作業は25℃または37℃で実施した。
IL-13細胞ベースの中和アッセイ
IL13に対する特異性を有するmAbdAbの効力を、遺伝子操作したレポーター細胞株HEK Blue-STAT6を使用してIL-13細胞アッセイにおいてアッセイした。
1. 二重標的化mAbdAbの作製
表1〜4に述べる二重標的化mAbdAbは以下の方法で構築した。発現構築物は、発現時にdAbが重鎖または軽鎖のC末端と結合するように、ドメイン抗体をコードする配列をモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖(または両方)をコードする配列に移植することによって作製した。いくつかの構築物用に、リンカー配列を使用してドメイン抗体を重鎖CH3または軽鎖Cκに連結した。他の構築物では、ドメイン抗体をリンカー配列なしで重鎖または軽鎖と直接連結する。これらのmAbdAb構築物の一般的な略図は図8に示す(mAb重鎖は灰色で描き、mAb軽鎖は白色で描き、dAbは黒色で描く)。
モノクローナル抗体(mAb)
複数のモノクローナル抗体(mAbs)
ドメイン抗体(dAb)
複数のドメイン抗体(dAbs)
重鎖(H鎖)
軽鎖(L鎖)
重鎖可変領域(VH)
軽鎖可変領域(VL)
ヒトIgG1定常重鎖領域1(CH1)
ヒトIgG1定常重鎖領域2(CH2)
ヒトIgG1定常重鎖領域3(CH3)
ヒトκ軽鎖定常領域(Cκ)。
二重特異性抗IL13 mAb-抗IL4 dAbを前に記載したのと同様に構築した。いくつかの異なるリンカーを使用して、抗IL4ドメイン抗体とモノクローナル抗体を連結した。いくつかの構築物はリンカーを有していなかった。
二重特異性抗IL4 mAb-抗IL13 dAbを前に記載したのと同様に構築した。いくつかの異なるリンカーを使用して、抗IL13ドメイン抗体とモノクローナル抗体を連結した。いくつかの構築物はリンカーを有していなかった。
mAbdAbを作製するために使用したモノクローナル抗体(mAb)、ドメイン抗体(dAb)およびリンカーに関する配列番号を以下の表5に示す。
実施例1に記載したmAbdAb発現構築物を、1つまたは複数のCHOK1細胞、CHOE1a細胞またはHEK293-6E細胞にトランスフェクトし、小規模(約3ml)または中規模(約50ml〜100ml)または大規模(約1リットル)で発現させ、次いでいくつかの構築物は固定化プロテインAカラムを使用して精製し、280nmで吸光度を読み取ることによって定量化した。
複数のmAbdAbは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)およびドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分析した。いくつかのこれらの分子(PascoH-G4S-474、PascoL-G4S-474、PascoH-474およびPascoHL-G4S-474)に関する代表的なデータは、それぞれ図9、10、11および12に示す。除去した「GS」モチーフを有するこれらの分子に関するSECおよびSDS-PAGE分析を示す代表的なデータは図90〜98に示す。
ELISAによるmAbdAbとヒトIL-13およびヒトIL-4の結合
2.1 抗IL13 mAb-抗IL-4 dAbとIL-13およびIL-4の結合
mAbdAb上清を、(方法1に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてヒトIL-13との結合に関して試験した。これらのデータは図13に示す。
mAbdAb上清を、(方法2に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおけるヒトIL-4との結合に関して試験した。これらのデータは図17に示す(いくつかのサンプルを調製し、二連で試験し、これはサンプル1およびサンプル2として注記した)。
表面プラズモン共鳴(BIAcore(商標))によるmAbdAbとヒトIL-13およびヒトIL-4の結合
3.1 BIAcore(商標)による抗IL13 mAb-抗IL4 dAbとIL-13およびIL-4の結合
mAbdAb(CHO細胞上清中、セクション1.5中に記載したのと同様に調製)を、(方法4に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)を使用してヒトIL-13との結合に関して試験した。このデータセット用に、2つのIL-13濃度曲線(100nMおよび1nM)を評価し、(およそ)1000と1300の間の相対的な応答捕捉レベルをそれぞれのmAbdAb構築物に関して得た。使用した限られた数の濃度のIL-13のため、生成したデータは正確な反応速度測定より構築物をランク付けするのにより適している。これらのデータは表6に示す。
mAbdAb(CHO細胞上清中、セクション1.5中に記載したのと同様に調製)を、(方法5に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)を使用してヒトIL-4との結合に関して試験した。これらのデータは表9に示す(いくつかのサンプルを二連で調製および試験し、これはサンプル1およびサンプル2として注記した)。このデータセット用に、4つのIL-4濃度曲線(100nM、10nM、1nMおよび0.lnM)を評価し、試験したそれぞれのmAbdAbに関するおよその相対的な応答捕捉レベルをこの表中に示す。(無関係な抗原に対する特異性を有する)アイソタイプ適合mAbも、このアッセイ中のIL-4との結合の陰性対照として含めた。
精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAbは、(方法7に記載したのと同様に)BIAcore(商標)を使用してIL-13およびIL-4に関する結合の化学量論値に関して評価した。これらのデータは表12に示す。
IL-13およびIL-4バイオアッセイにおけるmAbdAbの中和効力
4.1 抗IL13 mAb-抗IL4 dAb
精製抗IL13 mAb-抗IL4 dAbを、(方法8に記載したのと同様に)TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトIL-13の中和に関して試験した。これらのデータは図24に示す。
精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAb、PascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474およびPascoHL-G4S-474は、(方法9に記載したのと同様に)TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトIL-4の中和に関して試験した。これらのデータは図26に示す。
dAbのSEC-MALLS分析
抗原特異的dAbを、SEC-MALLS(サイズ排除クロマトグラフィー-マルチアングルレーザー光散乱測定)によりそれらの溶液中状態によって特徴付け、結果は表13に示す。DOM10-53-474、dAbは溶液中にモノマーとして存在し、一方すべてのDOM9 dAb(DOM9-112-210、DOM9-155-25、DOM9-155-147およびDOM9-155-154)は安定した二量体(およびいくつかの場合は四量体)を形成することができる。
サンプルを精製し、適切なバッファー、例えばPBSに透析した。透析後にサンプルを濾過し、濃度を決定した(0.43mg/mlのDOM-155-25)、(1.35mg/mlのDOM9-155-147)および1.4mg/mlのDOM9-155-159)。DOM10-53-474およびDOM9-112-210は1mg/mlに調節した。
BSAはSigmaから購入し、さらに精製せず使用した。
オートサンプラー(SIL-20A)およびSPD-20A Prominence UV/Vis検出器を有するShimadzu LC-20AD Prominence HPLCシステムを、Wyatt Mini Dawn Treos(MALLS、マルチアングルレーザー光散乱検出器)およびWyatt Optilab rEX DRI(示差屈折率)検出器に接続した。検出器は以下の順: LS-UV-RIで接続した。RIとLS装置の両方を488nmの波長で操作した。いずれもpH7.4での50mMリン酸バッファー(塩なし)、または1×PBSの移動相を有する、TSK2000(Tosoh corporation))カラムを使用した(シリカ系HPLCカラム)。使用した流速は0.5または1ml/分であり、作業の時間を調節して異なる流速を反映し(45分または23分)、分子の分離に対して有意な影響を有するとは予想しなかった。タンパク質はバッファー中で1mg/mlの濃度に調製し、注入体積は100ulであった。
光散乱検出器を、製造者の説明書に従いトルエンを用いて調整した。
UV検出器アウトプットおよびRI検出器アウトプットを、全3個の検出器からのシグナルをWyatt ASTRAソフトウェアで同時に回収することが可能であるように、光散乱測定装置に接続した。PBSの移動相中へのBSAの数回の注入(1ml/分)は、Tosoh TSK2000カラムならびにWyattソフトウェアによって回収したUV、LSおよびRIシグナルで実施する。次いでASTRAソフトウェアを使用して痕跡を分析し、シグナルは正常アラインメント化し、製造者の説明書に従いバンド拡大を補正する。次いでキャリブレーション定数を平均化し、後のサンプル実験に使用する鋳型にインプットする。
100ulのそれぞれのサンプルを適切な予め平衡化したカラムに注入した。
・cは溶媒中の溶質分子の質量濃度(g/mL)であり、
・Mは重量平均モル質量(g/mol)であり、
・A2は第2ビリアル係数(mol mL/g2)であり、
・K*=4p2n0 2(dn/dc)2l0 -4NA -1は光学定数であり、n0は入射放射線(真空)波長における溶媒の屈折率であり、l0はナノメートルで表した入射放射線(真空)波長であり、NAは6.022×1023mol-1に等しいアボガドロ数であり、かつdn/dcはmL/gで表した溶質濃度の変化に対する溶媒-溶質溶液の示差屈折率の増加であり(この因子はdRI検出器を使用して別個に測定しなければならない)、
・P(q)は、
・Rqは過剰なレイリー比(cm-1)である。
Rq/K*c vs.sin2(q/2)に適合するZimm適合法で計算を実施するために、本発明者らは等式1の一次数cの逆数を展開する必要がある:
溶液中でのモノマー状態を示す約14kDaとして定義した平均モル質量を有する単一ピークを図29に示す。
溶液中での二量体状態を示す30kDaとして定義したモル質量を有する単一ピークを図30に示す。
美しい対称ピーク、ただしバッファーフロントで実施。ピークの中央部分をモル質量の決定に使用した(全3個のシグナルの重複に関しては以下の図参照)。モル質量は二量体dAbを表す28kDaであり、図31に示す。全3個のシグナルの重ね合わせ(図32)。
主要ピークはピークの右部分において26kDaのモル質量に割り当て、ピークの左部分において53kDaまで急激に増大する。このピークは、迅速平衡中の二量体およびごくわずかな四量体を表す可能性が最も高い。7.6分で溶出したはるかに小さなピークは、51kDaのモル質量を有する四量体タンパク質を表す(図33)。
約28kDaで割り当てた平均モル質量を有する1つの対称ピークとして現れたタンパク質は、溶液中で二量体状態を示す(図34)。
前述のそれぞれの実験に関する各BSAの実施は、予想MW、例えば67および145kDa(モノマーおよび二量体)のモル質量を有する2ピークをもたらした(図35)。
三重特異性mAbdAbの作製
アセンブリーPCRによってVHおよびVL配列を作製し次いでそれらを既存のmAbdAb発現ベクターにクローニングすること、または発現時に三重特異性mAbdAbが重鎖と軽鎖の両方のC末端と結合したdAbを有するように、mAb発現ベクターから既存のmAbdAb発現ベクターに既存のVHおよびVL領域をサブクローニングすることのいずれかによって、三重特異性mAb-dAbを構築した。
(IL18 mAb-210-474としても知られる)三重特異性抗IL18 mAb-抗IL4 dAb-抗IL13 dAbを、抗ヒトIL-4ドメイン抗体(DOM9-112-210)をコードする配列を重鎖をコードする配列に、および抗IL13ドメイン抗体(DOM10-53-474)をコードする配列を抗ヒトIL-18ヒト化モノクローナル抗体の軽鎖をコードする配列に移植することによって構築した。G4Sリンカーを使用して抗IL4ドメイン抗体をモノクローナル抗体の重鎖に連結した。G4Sリンカーをさらに使用して、抗IL13ドメイン抗体をモノクローナル抗体の軽鎖に連結した。
(Mepo-210-474としても知られる)三重特異性抗IL5 mAb-抗IL4 dAb-抗IL13 dAbを、抗ヒトIL-4ドメイン抗体DOM9-112-210をコードする配列(配列番号4)を抗ヒトIL-5ヒト化モノクローナル抗体の重鎖をコードする配列(配列番号65)に移植することによって、および抗IL13ドメイン抗体DOM10-53-474をコードする配列(配列番号5)を抗ヒトIL-5ヒト化モノクローナル抗体の軽鎖をコードする配列(配列番号66)に移植することによって構築した。G4Sリンカーを使用して抗IL4ドメイン抗体をモノクローナル抗体の重鎖に連結した。G4Sリンカーをさらに使用して、抗IL13ドメイン抗体をモノクローナル抗体の軽鎖に連結した。
三重特異性mAbdAbを作製するために使用した(または以下の例証中で対照試薬として使用した)モノクローナル抗体、ドメイン抗体およびリンカーに関する配列を以下の表14に示す。
三重特異性mAbdAb分子をコードするDNA配列を、標準的な分子生物学の技法を使用して哺乳動物発現ベクター(RIn、RIdまたはpTT)にクローニングした。三重特異性mAbdAb発現構築物はCHOK1またはHEK293-6E細胞の一方または両方に一時的にトランスフェクトし、小規模(3mls〜150mls)で発現させた。三重特異性mAbdAbを作製するために使用した発現手順は、モノクローナル抗体を発現させるために通常使用される手順と同じであった。
ELISAによる三重特異性mAbdAbとヒトIL-4、ヒトIL-13およびヒトIL-18の結合
7.1 ELISAによるIL-l8 mAb-210-474とIL-4、IL-13およびIL-18の結合
実施例6に記載したのと同様に調製した三重特異性mAbdAbIL18 mAb-210-474(上清)(配列番号69および70)を、(方法1、2および3に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてヒトIL-18、ヒトIL-13およびヒトIL-4との結合に関して試験し、これらのデータはそれぞれ図37、38および39に示す(IL18 mAb-210-474を調製し、数回試験し、これはサンプル1、サンプル2、サンプル3などとして図中に注記した)。
セクション1に記載したのと同様に調製した三重特異性mAbdAbMepo-210-474(上清)(配列番号71および72)を、(それぞれ方法1および2に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてヒトIL-13およびヒトIL-4との結合に関して試験し、これらのデータはそれぞれ図40および41に示す(Mepo-210-474を調製し、四連で試験し、これはサンプル1、サンプル2、サンプル3およびサンプル4として図中に注記した)。
表面プラズモン共鳴(BIAcore(商標))による三重特異性mAbdAbとヒトIL-4、ヒトIL-5、ヒトIL-13およびヒトIL-18の結合
8.1 BIAcore(商標)によるIL-18mAb-210-474とIL-4、IL-13およびIL-18の結合
実施例6.1に記載したのと同様に調製した三重特異性mAbdAbIL18Ab-210-474(上清)(配列番号69および70)を、(それぞれ方法4、5および6に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)を使用してヒトIL-4、ヒトIL-13およびヒトIL-18との結合に関して試験した。応答捕捉レベルは約400〜850応答単位の範囲内であった。それぞれのアナライトの3種類の濃度を試験した(256、32および4nM)。生成したデータは表15に示す(サンプルを調製し、三連で試験し、これはサンプル1、サンプル2、およびサンプル3として注記した)。
実施例6.2中に記載したのと同様に調製した三重特異性mAbdAbMepo-210-474(上清)(配列番号71および72)を、(それぞれ方法5、11および4に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)を使用してヒトIL-4、ヒトIL-5およびヒトIL-13との結合に関して試験した。応答捕捉レベルは約550〜900応答単位の範囲内であった。IL-4およびIL-13結合に関して、各アナライトの5つの濃度を試験した(256、64、16、4および1nM)。IL-5結合に関して、各アナライトの4つの濃度を試験した(64、16、4および1nM)。生成したデータは表16に示す。
化学量論
9.1 BIAcore(商標)を使用したIL-4、IL-13およびIL-18とIL-18mAb-210-474の結合の化学量論値
IL18 mAb-210-474(CHO細胞上清中、セクション1に記載したのと同様に調製した)(配列番号69および70)を、(方法7に記載したのと同様に)BIAcore(商標)を使用したIL-4、IL-13およびIL-18の結合の化学量論値に関して評価した。これらのデータは表17に示す(R-maxは飽和結合応答性であり、方法7に与えた式の通り、これは化学量論値を計算するのに必要とされる)。それぞれのサイトカインの濃度は500nMであった。注入部位は、それぞれのサイトカインを加えた順序を指す。
10.1 二重標的化抗TNF/抗EGFR mAbdAbの作製
この二重標的化mAbdAbは、mAb重鎖のC末端とdAbの融合によって構築した。抗TNF mAb重鎖および軽鎖発現カセットを事前に構築した。クローニングに使用した制限部位を以下に示す(図42)。
抗TNF/抗EGFR mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプルのSDS-PAGE分析(図43)は約170kDaで実施した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約25および約60kDaの対応する軽鎖およびdAb融合重鎖で実施した2つのバンドを示す。
EGFRおよびTNFに対する結合親和性を、それぞれ方法13および14に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。このmAbdAbの抗EGFR効力(図45)は39.1nMであると算出され、一方で対照、抗EGFR mAbは3.4nMのEC50値を得た。抗TNFバイオアッセイ(図46)において、mAbdAbの効力は3pM(0.0028nM)であり、一方抗TNF対照mAbは104pMのEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例10の構築物、二重標的化抗TNF/抗EGFR mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。
この分子をラットでのそのin vivo薬物動態特性に関して試験した。抗TNF/抗EGFR mAbdAbを3匹のラットに静脈内投与し、7日間(168時間)で血清サンプルを回収した。投与後の様々な時点で残存した薬剤の濃度は、TNFとEGFRの両方に対するELISAによって評価した。結果は図125に示す。
11.1 二重標的化抗TNF/抗VEGF mAbdAbの作製
抗TNF/抗VEGF mAbdAbを、実施例10に関して記載したのと同様の戦略を利用して生成した。重鎖発現カセットの構築用に、実施例10の重鎖をコードするベクターDNAを出発地点として得た。制限酵素SalIおよびHindIIIを使用して抗EGFR dAbを切除した。DOM15-26-593、抗VEGF dAbは、PCRによって(SalIおよびHindIII末端をコードするプライマーを使用して)増幅し、同じ制限部位を使用して切除した抗EGFR dAbを前に有していたベクター骨格に連結させ、mAbとdAbの間に「STG」(セリン、スレオニン、グリシン)のリンカーをもたらした。
抗TNF/抗VEGF mAbdAb(DMS4000と称する)を、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプルのSDS-PAGE分析(図47)は約170kDaで実施した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約25および約60kDaの対応する軽鎖およびdAb融合重鎖で実施した2つのバンドを示す。
VEGFおよびTNFに対する結合親和性を、それぞれ方法12および14に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。このmAbdAbの抗VEGF効力(図49)は57pMであると計算し、一方で対照、抗VEGF mAbは366pMのEC50値を得た。抗TNFバイオアッセイ(図50)において、効力は10pMであり、一方抗TNF対照mAbは22pMのEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例11の分子、二重標的化抗TNF/抗VEGF mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。
この分子をラットでのそのin vivo薬物動態特性に関して試験した。抗TNF/抗VEGF mAbdAbを3匹のラットに静脈内投与し、10日間(240時間)で血清サンプルを回収した。投与後の様々な時点で残存した薬剤の濃度は、TNFとEGFRの両方に対するELISAによって評価した。結果は図126に示す。
別の抗TNF/抗VEGF mAbdAbを、STGリンカーを使用して重鎖のC末端上のVEGF dAbと連結した同じ抗TNF mAbを使用して、実施例11.1で前に記載した方法と同様の方法で構築した。この場合使用した抗VEGF dAbはDOM15-10-11であった。軽鎖と重鎖(配列番号73および185)の共トランスフェクションにより一過性トランスフェクション技法を使用して、哺乳動物HEK293-6E細胞中でこの分子を発現させた。この分子を発現させて、実施例11.2に記載したのと同様の発現レベルのmAbdAbを与えたが、しかしながら、実施例11.3に記載したのと同じVEGFアッセイ中で効力に関して試験すると、このアッセイでVEGF受容体とのVEGF結合の検出不能レベルの阻害があったことが分かった。
12.1 二重標的化抗VEGF/抗IL1R1 dAb伸長IgGの作製
2つの二重標的化dAb伸長IgG分子を、dAbと両鎖の定常領域の間へのダミーVドメインコード領域の挿入の戦略に従い、標準的な分子生物学の技法を使用して構築した。
両方の抗IL1R1/抗VEGF dAb伸長IgG分子を、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。DMS2090に関するSDS-PAGE分析は図52中に示し、DMS2091に関するSDS-PAGE分析は図53に示す。両方の精製サンプルは190kDaで実施した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれdAb伸長軽鎖および重鎖に対応する35および60kDaで実施した2つのバンドを示す。
VEGFおよびIL1R1に対する結合親和性を、それぞれ方法12および15に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。DMS2090の抗VEGF効力(図57)は158.4pMであると算出され、一方で対照、抗VEGF mAbは689.2pMのEC50値を得た。DMS2091の抗VEGF効力(図56)は55pMであると算出され、一方で対照、抗VEGF mAbは766pMのEC50値を得た。
この分子をラットでのそのin vivo薬物動態特性に関して試験した。抗IL1R1/抗VEGF dAb伸長IgGAを3匹のラットに静脈内投与し、7日間(168時間)で血清サンプルを回収した。投与後の様々な時点で残存した薬剤の濃度は、IL1R1とVEGFの両方に対するELISAによって評価した。結果は図127に示す。
13.1 三重標的化抗TNF/抗VEGF/抗EGFR mAbdAbの作製
三重標的化mAbを、標準的な分子生物学の技法を使用して、dAbと両鎖の定常領域の間のmAb Vドメインコード領域の挿入の戦略に従い構築した。
抗TNF/抗VEGF/抗EGFR mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプルのSDS-PAGE分析(図61)は190kDaで実施した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれdAb伸長軽鎖および重鎖に対応する35および60kDaで実施した2つのバンドを示す。
VEGF、EGFRおよびTNFに対する結合親和性を、それぞれ方法12、13および14に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。このmAbdAbの抗VEGF効力(図62)は1.885mMであると算出され、一方で対照、抗VEGF mAbは0.145nMのEC50値を得た。
IGF-1R/VEGF mAbdAb
14.1 IGF-1R/VEGF mAbdAbの構築
抗IGF-1R可変重鎖および可変軽鎖遺伝子配列を、重複オリゴヌクレオチドのPCRからde novoで最初に構築した。これらの領域を、標準的な分子生物学の技法を使用して哺乳動物発現ベクターにおいてヒトIgG1またはκ定常領域と融合させた。抗VEGFドメイン抗体の遺伝子配列を重複オリゴヌクレオチドを使用したPCRによって同様に構築し、前に記載した抗IGF-1R成分の重鎖または軽鎖のいずれかの遺伝子の3'末端と融合させた。この融合体は、抗体とドメイン抗体成分の間に2つのアミノ酸(GS)リンカーまたは8アミノ酸(TVAAPSGS)リンカーのいずれかを取り込んだ。抗体重鎖および軽鎖もドメイン抗体およびリンカー配列なしで構築した。製造者のプロトコルに従いEndofree Qiagen Maxiprepキットを使用した大規模なDNA調製用に配列を確認したクローンを選択した。
IGF-1R/VEGF mAbdAbの発現、精製およびSECプロファイル
重鎖ベクターと軽鎖ベクターの組合せを、HEK293-6Eの一過性トランスフェクションにおいて発現させた。簡潔には、50mlのHEK293-6E細胞を1.5×106個細胞/mlで、293fectin試薬(Invitrogen#51-0031)と事前にインキュベートした25μgの重鎖および25μgの軽鎖プラスミドでトランスフェクトした。細胞は振とうインキュベーター、37℃、5%CO2、および95%相対湿度中に置いた。24時間後、トリプトン供給培地を加え、細胞をはさらに72時間増殖させた。上清を遠心分離、次に0.22μmフィルターを使用した濾過によって回収した。発現したタンパク質はプロテインAセファロースカラムを使用して精製し、PBSに透析した。精製したタンパク質はサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって分析し、それは図65に示す。
IGF-1R結合ELISA
結合ELISAを実施して、精製抗IGF-1R/VEGF mAbdAbとIGF-1Rの結合を試験した。簡潔には、1μg/mlの抗ポリヒスチジン(AbCam AB9108)でコーティングしブロッキング溶液(4%BSA、トリス緩衝生理食塩水)でブロッキングしたELISAプレートに、PBSに溶かした400ng/mlの組換えヒトIGF-1R-hisタグ(R&D Systems 305-GR)をロードした。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBS+0.05%Tween20(TBST)中で洗浄した。ブロッキング溶液中に希釈した、様々な濃度の精製mAbdAb、および抗IGF-1Rモノクローナル抗体(H0L0)および無関係なmAbdAb(BPC1601)を加えた。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。ブロッキング溶液中に1000倍希釈でのペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(SigmaA7164)の添加によって結合を検出した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。プレートはOPD基質(SigmaP9187)の添加によって発色させ、発色は3MのH2SO4の添加によって停止させた。吸光度はプレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度をプロットした。
VEGF結合ELISA
結合ELISAを実施して、精製抗IGF-1R/VEGF二重特異性抗体とVEGFの結合を試験した。ELISAプレートはPBSに溶かした400ng/mlの組換えヒトVEGF(GSK)でコーティングし、次いでブロッキング溶液(4%BSA、TBS中)でブロッキングした。ブロッキング溶液中に希釈した様々な濃度の精製mAbdAbを加え、mAbdAb BPC1601は陰性対照として含めた。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。ブロッキング溶液中に1000倍希釈でのペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(SigmaA7164)の添加によって結合を検出した。プレートは室温で40分間インキュベートした後、TBS中で洗浄した。プレートはOPD基質(SigmaP9187)の添加によって発色させ、発色は3MのH2SO4の添加によって停止させた。吸光度はプレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度をプロットした。
VEGFとの結合の反応速度
ヒトIgG(BiacoreBR-1008-39)に対するマウスモノクローナルを、第1級アミンカップリングによってCM5バイオセンサーチップに固定化した。抗体構築物はこの表面を使用して捕捉した。捕捉後、VEGFはその表面を通過させ、それは次いで3MのMgCl2を使用して再生した。反応速度を生成するために使用したVEGFの濃度は256、64、16、4、1および0.25nMであり、二重参照に使用した捕捉表面にはバッファーのみを注入した。実験は25℃において1×HBS-EPバッファー(BR-1006-69)を使用してBiacoreT100機器で実施した。データはその分析ソフトウェア中で機器に固有の1:1モデルにフィッティングした。表19に示すデータは2つの独立した実験からのデータである。
受容体とのVEGF結合の阻害
mAbdAbの活性を、方法12に記載したのと同様にVEGF受容体結合アッセイを使用して測定した。VEGFR2とのVEGFの結合の阻害に関してこのアッセイ中で得たIC50は以下の通りである:
BPC1603(0.037nM)
BPC1604(0.010nM)
BPC1605(0.167nM)
BPC1606(0.431nM)
これらの結果によって、全4個の抗原結合性構築物が受容体とのリガンド結合を阻害することが確認される。
IGF-1R受容体リン酸化の阻害
3T3/LISN c4細胞を10000個細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートにプレートし、完全DMEM(DMEM-Hepes修飾+10%FCS)中で一晩インキュベートした。精製mAbdAbを細胞に加え、1時間インキュベートした。rhIGF-1を処理した細胞に加え50ng/mlの最終濃度を得て、さらに30分間インキュベートして受容体リン酸化を刺激した。培地を吸引し、次いでRIPA溶解バッファー(150mMのNaCl、50mMのTrisHCl、6mMのデオキシコール酸ナトリウム、1%のTween20)およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche 11697498001)の添加によって細胞を溶解した。プレートは一晩凍結した。解凍後、それぞれのウェルからの溶解物を、2μg/mlの抗IGF-1R捕捉抗体2B9(GSK)でプレコーティングし4%のBSA/TBSでブロッキングした96ウェルELISAプレートに移した。プレートはTBST(TBS+0.1%Tween20)で洗浄し、4%のBSA/TBS中に2500倍希釈したユーロピウム標識抗ホスホチロシン抗体(PerkinElmer DELFIA Eu-N1 PT66)をそれぞれのウェルに加えた。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、DELFIA Enhancement(PerkinElmer1244-105)溶液を加えた。10分間のインキュベーション後、ユーロピウム時間分解蛍光(TRF)を測定するために設定したプレートリーダーを使用して受容体リン酸化のレベルを決定した。
抗CD20/IL-13抗原結合タンパク質
実施例15.1
分子生物学
配列番号117および120で述べる抗CD20 mAbの重鎖および軽鎖配列をコードする哺乳動物発現ベクターを、PCRベースの手法および標準的な分子生物学の技法を使用してde novoで構築した。二重特異性抗CD20 mAb-抗IL13 dAb重鎖および軽鎖は、抗CD20 mAb重鎖および軽鎖可変領域をコードする配列を、抗ヒトIL-13ドメイン抗体(DOM10-53-474)と融合したヒト抗体定常領域を含有する哺乳動物発現ベクターにクローニングすることによって構築した。
ヒトIL-13との結合の反応速度
ヒトIL-13に対するmAbdAb構築物の結合親和性をBIAcore(商標)分析によって評価した。分析は抗ヒトIgG捕捉で実施した。簡潔には、抗ヒトIgG(BiacoreBR-1008-39)を、第1級アミンカップリングによってCM5チップに固定化した。次いでMAbdAb構築物をこの表面に捕捉し、ヒトIL-13(GSKで作製および精製)を定義した濃度で通過させた。3MのMgCl2を使用してその表面を再度抗ヒトIgG表面に再生した。この処理は後のIL-13結合事象に関して抗体を捕捉する能力に有意に影響を与えなかった。この作業はBiacore(商標)T100機器で、HBS-EPバッファーを使用して25℃で実施した。データは機器において評価ソフトウェアを使用して分析し、1:1結合モデルにフィッティングした。分析の結果は表48に表し、すべてのmAbdAb構築物に関して、IL-13との結合の反応速度が比較可能であることを確認する。
抗CD20/IL-13二重特異性抗体を用いたADCCアッセイ
ADCCアッセイは、Boyd et al.(1995)J.Imm.Meth.184:29-38の公開済みの方法に基づいた。簡潔には、Raji細胞(標的)を以下のようにユーロピウムで標識した。細胞を採取し、計数し15mlのファルコンチューブ中に1×107の最終密度に調製し、Hepesバッファー(50mMのHEPES、83mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのMgCl2、H20、pH7.4)で1回洗浄した。細胞をペレット状にし、1mlの氷冷ユーロピウム標識バッファー(HEPESバッファーおよび600μMのEuCl3、3mMのDTPAおよび25mg/mlの硫酸デキストラン)をそれぞれのチューブに加えた。細胞懸濁液を標識開始時、および次いで氷上での30分のインキュベーション時間中10分毎に激しく攪拌した。10mlの氷冷した回復バッファー(294mg/mlのCaCl2.2H20、1.8g/lのD-グルコース、pH7.4を含有するHepesバッファー)を加え、細胞は氷上でさらに10分間インキュベートした。次いで細胞を遠心分離にかけ、上清をデカントし、回復バッファーで2回、および次いで完全培地で1回洗浄した。次いで標識細胞を計数し、2×105個細胞/mlで無血清培地に再懸濁し、氷上に保存した。
抗CD20/IL-13二重特異性抗体を用いたCDCアッセイ
WEIN細胞(標的)を以下のようにユーロピウムで標識した。簡潔には、細胞を採取し、計数し15mlのファルコンチューブ中に1×107の最終密度に調製し、Hepesバッファー(50mMのHEPES、83mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのMgCl2、H20、pH7.4)で1回洗浄した。細胞をペレット状にし、1mlの氷冷ユーロピウム標識バッファー(HEPESバッファーおよび600μMのEuCl3、3mMのDTPAおよび25mg/mlの硫酸デキストラン)をそれぞれのチューブに加えた。細胞懸濁液を標識開始時、および次いで氷上での30分のインキュベーション時間中10分毎に激しく攪拌した。10mlの氷冷した回復バッファー(294mg/mlのCaCl2.2H20、1.8g/lのD-グルコース、pH7.4を含有するHepesバッファー)を加え、細胞は氷上でさらに10分間インキュベートした。次いで細胞を遠心分離にかけ、上清をデカントし、回復バッファーで2回、および次いで完全培地で1回洗浄した。次いで標識細胞を計数し、2×105個細胞/mlで無血清培地に再懸濁し、氷上に保存した。
16.1 代替足場から構成されるエピトープ結合ドメインを含む抗原結合タンパク質の設計および構築
以下に挙げた5つの代替足場をモノクローナル抗体と組み合わせて、mAb-代替足場二重特異性分子を得た:
・抗VEGF涙液リポカリン(TLPC)
・抗HER2 Affibody(AFFI)
・抗HER2 DARPin(DRPN)
・抗ニワトリ卵白リゾチーム(NARV)
・抗RNaseAラクダVHH。
96ウェル高結合プレートをPBSに溶かした1μg/mlの抗hisタグ抗体(Abcam、ab9108)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5%BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。0.4μg/mlのrhIGF-1R(R&D systems)をウェル当たり50μLでそれぞれのウェルに加えた。プレートは室温で1時間インキュベートし、次いで洗浄した。精製抗原結合タンパク質/抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
96ウェル高結合プレートを0.4μg/mlのhVEGF165(R&D Systems)でコーティングし、4℃において一晩インキュベートした。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5%BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。精製抗原結合タンパク質/抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
96ウェル高結合プレートを1μg/mlのHER2(R&D Systems)でコーティングし、4℃において一晩インキュベートした。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5%BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。精製抗原結合タンパク質/抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
96ウェル高結合プレートをPBSに溶かした5μg/mlのヒトIL-4でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5%BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。精製抗原結合タンパク質/抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma、A7164)をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
PBSに希釈した1ug/mLのRNAseA(Qiagen、19101)50uLを、96ウェルCostarプレートのそれぞれのウェルに加えた。プレートは室温で2時間インキュベートし、次いでそれぞれのウェルへの200uLの4%BSA/PBSブロックの添加前にPBSTで洗浄した。プレートは1時間インキュベートし、サンプルの添加前に洗浄した。精製抗体および抗原結合タンパク質BPC1809はカラム1のウェル中に2ug/mLの濃度で加え、次いでブロッキング溶液中プレートに2倍に連続希釈した。プレートは1時間インキュベートし、次いで洗浄した。50ul/ウェルのヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma、A7164)は1000倍希釈で加えた。プレートは1時間インキュベートし、次いで洗浄した。50uLのOPDをそれぞれのウェルに加え、15〜30分後に3M硫酸を用いて反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
96ウェル高結合プレートをPBSに溶かした5μg/mlのHEL(ニワトリ卵リゾチーム、Sigma L6876)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5%BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。精製抗体はブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma、A7164)をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
17.1 アドネクチンから構成されるエピトープ結合ドメインを含む抗原結合タンパク質の設計および構築
CT01アドネクチンは、VEGFR2に特異的である(さらなる情報に関してはWO2005/056764を参照)。CT01アドネクチンのタンパク質配列はDNAに逆翻訳しコドン最適化した。N末端におけるBamHI部位およびC末端におけるEcoR1部位を含めてクローニングを容易にした。
96ウェル高結合プレートをPBSに溶かした1μg/mlの抗hisタグ抗体(Abcam、ab9108)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5%BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。0.4μg/mlのrhIGF-1R(R&D systems)をウェル当たり50μLでそれぞれのウェルに加えた。プレートは室温で1時間インキュベートし、次いで洗浄した。精製抗原結合タンパク質/抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
96ウェル高結合プレートを0.4μg/mlのVEGFR2(R&D Systems)でコーティングし、4℃において一晩インキュベートした。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5%BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。上清または精製抗体はブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
96ウェル高結合プレートを5μg/mlのヒトIL-4でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5%BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。上清または精製抗体/抗原結合タンパク質はブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma、A7164)をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
96ウェル高結合プレートをPBSに溶かした0.4μg/mlの組換えヒトTNF-α(RnD Systems、210-TA-050/CF)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5%BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。上清または精製抗体はブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma、A7164)をブロッキング溶液中に1μg/mLに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
96ウェル高結合プレートをPBSに溶かした0.67μg/mlの組換えヒトEGFRタンパク質でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5%BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。抗原結合タンパク質/抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma、A7164)をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
「G」および「S」アミノ酸残基を除去したIL-13/IL-4 mAbdAbの結合活性データ
18.1 mAbdAbの構築
(リンカー配列の隣の)GおよびSアミノ酸残基を除去したmAbdAbを構築した。標準的な分子生物学の技法を使用して発現プラスミドを構築した。これらのmAbdAbは表23中に記載する。それらをクローニングし、次いでHEK293-6E細胞、CHOK1細胞、またはCHOE1a細胞のうち1以上において発現させ、それらを精製し(それぞれ実施例1、1.3および1.5中に記載したのと同様に)、複数のIL-13およびIL-4活性アッセイ中で分析した。
これらのmAbdAbを精製し、SECおよびSDS-PAGEによって分析した。いくつかの精製調製物を作製し、図90〜98に示すSECおよびSDS-PAGEのデータはこれらの調製物の代表的なものである。
精製PascoH-474 GS除去およびPascoH-TVAAPS-474 GS除去を、方法2に記載したのと同様に直接結合ELISAにおいてヒトIL-4との結合に関して試験した(PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474およびPascoH-ELQLE-474もこのアッセイにおいて結合に関して試験した)。いくつかのELISAアッセイをこれらの分子に関して実施し、図99に示すデータはこれらのアッセイの代表的なものである。
精製PascoH-474 GS除去およびPascoH-TVAAPS-474 GS除去を、方法1中に記載したのと同様に直接結合ELISAにおいてヒトIL-13との結合に関しても試験した(PascoH-616およびPascoH-TVAAPS-616もこのアッセイにおいて結合に関して試験し、これらの分子の作製は実施例19中に記載する)。複数のELISAアッセイをこれらの分子に関して実施し、図100に示すデータは全アッセイの代表的なものである。
精製PascoH-474 GS除去、PascoH-TVAAPS-474 GS除去、PascoH-616およびPascoH-TVAAPS-616 mAbdAbは、(方法17に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてカニクイザルIL-13との結合に関しても試験した。複数のELISAアッセイをこれらの分子に関して実施し、図101に示すデータは全アッセイの代表的なものである。
精製mAbdAbは、(方法4および5に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)T100を使用して、ヒトIL-4およびヒトIL-13との結合に関して試験した。これらのデータは表24に示す。
精製mAbdAbは、(方法24および23に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)T100を使用して、カニクイザルIL-4およびカニクイザルIL-13との結合に関して試験した。これらのデータは表25に示す。約600の相対応答単位のmAbdAb捕捉レベルを得て、6個のIL-13濃度曲線(256、64、16、4、1、0.25nM)および5個のIL-4濃度曲線(64、16、4、1、0.25nM)を評価した。
IL-13およびIL-4 BIAcore(商標)結合アッセイを使用して、後のIL-13結合反応速度に対するPascoH-474 GS除去とのIL-4結合の影響およびその逆、および後のIL-4結合反応速度に対する586H-TVAAPS-210とのIL-13結合の影響およびその逆も調べた。mAbdAb(または陽性対照mAb)の抗ヒトIgG捕捉を使用して、分析は25℃においてBIAcore(商標)T100機器で実施した。簡潔には、製造者の推奨に従い、第1級アミンカップリングによってCM5チップに抗ヒトIgGを結合させた。次いでmAbdAb構築物(または陽性対照mAb)を(約250〜750RUで)この表面に捕捉し、第1アナライト(ヒトIL-13またはヒトIL-4のいずれか)は256nMで4分間通過させた。次いで第2アナライト(それぞれヒトIL-4またはヒトIL-13)を256nM、64nM、16nM、4nM、1nMおよび0.25nMの濃度で通過させ、および二重参照のために、バッファー注入液を捕捉抗体またはmAbdAb表面上に通過させた。機器において評価用ソフトウェアを使用して(1:1結合モデルにフィッティングし)データを分析した。次いで3Mの塩化マグネシウムを使用して表面を再生した。これらの実験からのデータは表27および28に示す。
方法19に記載したように、ELISAによりヒトIL-4RαとのヒトIL-4結合の阻害に関してmAbdAbを試験した。表28に示すすべての分子は1つの実験中で試験し、しかしながら、曲線プロット間を区別するためにデータは2つのグラフにプロットした(586H-TVAAPS-210は2回実施し、これはサンプル1およびサンプル2として表25に示す)。これらのデータは図102および103に示す。
いくつかの精製mAbdAbを、(それぞれ方法8および方法20に記載したのと同様に)TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトおよびカニクイザルIL-13の中和に関して試験した。それぞれの分子はこれらのアッセイ中で1回〜9回試験し、すべてのグラフは示さないが、図104および105は、それぞれヒトIL-13およびカニクイザルIL-13に関する中和データを示す代表的なグラフである。DOM10-53-474は、バイオアッセイにおけるヒトまたはカニクイザルIL-13の中和の陽性対照として含めた。無関係な抗原に対する特異性を有するdAb(陰性対照dAb)も、バイオアッセイにおけるヒトまたはカニクイザルIL-13の中和に関する陰性対照として含めた。
いくつかの精製mAbdAbを、(それぞれ方法9および方法21に記載したのと同様に)TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトおよびカニクイザルIL-4の中和に関しても試験した。それぞれの分子はこれらのアッセイ中で2回試験し、すべてのグラフは示さないが、図106および107は、それぞれヒトIL-4およびカニクイザルIL-4に関する中和データを示す(データセットからの)代表的なグラフである。抗IL-13 mAbは陰性対照として含め、パスコリツマブはバイオアッセイにおけるヒトまたはカニクイザルIL-4の中和に関する陽性対照として含めた。さらに、PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474およびPascoH-G4S-474も、これらのバイオアッセイにおいてヒトおよびカニクイザルIL-4の中和に関して試験した。
表30中に挙げた分子は、方法22中に記載したのと同様に、ELISAによるヒトIL-13Rα2とのヒトIL-13結合の阻害に関して試験した。すべての分子は1回の実験で試験した。データは図108に示す。
抗IL13 DOM10-53-616dAbを含有するmAbdAb
19.1 抗IL13 DOM10-53-616dAbを含有するmAbdAbの構築
表31に述べる2つの抗IL4 mAb-抗IL13 dAbを、実施例1に記載したのと同様に部位特異的突然変異誘発によって既存のベクターからクローニングした。
実施例1.3に記載したのと同様に、HEK293-6E細胞およびCHOE1a細胞中でこれらのmAbdAbを発現させた。
PascoH-616およびPascoH-TVAAPS-616精製mAbdAbを、(方法1に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてヒトIL-13との結合に関して試験した。これらのデータは図113に示す。
精製mAbdAbは、(方法4および5に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)T100を使用して、ヒトIL-4およびヒトIL-13との結合に関して試験した。これらのデータは表32に示す。
精製mAbdAbは、(方法30に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)T100を使用して、カニクイザルIL-13との結合に関しても試験した。これらのデータは表33に示す。約400の相対応答単位のmAbdAb捕捉レベルを得て、6個のIL-13濃度曲線(256、64、16、4、1、0.25nM)を評価した。抗IL13 mAbに関するただ1つのIL-13濃度曲線(256nM)が存在した。
精製mAbdAbを、(それぞれ方法8および方法20中に記載したのと同様に)TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトIL-13およびカニクイザルIL-13の中和に関して試験した。これらの分子はそれぞれのアッセイ中で3回試験し、図114は、ヒトIL-13に関する中和データを示す代表的なグラフである。図114aは、カニクイザルIL-13に関する中和データを示す代表的なグラフである。DOM10-53-616は、このバイオアッセイにおけるIL-13の中和に関する陽性対照として含めた。無関係な抗原に対する特異性を有するdAb(陰性対照dAb)も、このバイオアッセイにおけるIL-13の中和に関する陰性対照として含めた。
ヒト全血ホスホSTAT6バイオアッセイにおけるヒトIL-13またはIL-4を中和するmAbdAbの能力
ヒト全血ホスホSTAT6バイオアッセイにおけるヒトIL-13またはIL-4を中和するmAbdAbの能力を、方法16に記載したのと同様に実施した。2つのmAbdAb構築物(精製抗IL13 mAb-抗IL4 dAb、586H-TVAAPS-210;および精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAb、PascoH-474 GS除去)のIL-4またはIL-13の中和効力(すなわち、IL-4またはIL-13の生物活性の阻害)を決定した。精製抗ヒトIL4 mAb単独(パスコリツマブ)および精製抗IL4 dAb(DOM9-112-210)は、このアッセイにおけるrhIL-4の中和に関する陰性対照として含めた。精製抗ヒトIL-13 mAbおよび精製抗IL13 dAb(DOM10-53-474)は、rhIL-13の中和に関する陰性対照として含めた。(いずれも無関係な抗原に対する特異性を有する)dAbと混合したアイソタイプ適合mAbは、rhIL-4またはrhIL-13の中和に関する陰性対照として含めた。それぞれの分子は、異なるドナー由来の血液を使用して少なくとも2回試験した。図115〜124は代表的なデータを示すグラフである。
二重標的化抗IL4/抗IL13 mAbdAbのラットPK試験
PascoH-G4S-474、PascoL-G4S-474、586H-TVAAPS-210および586H-TVAAPS-154を(表35.1に要約したように)ラットPK試験において評価した。簡潔には、オスのSprague-Dawleyラット(体重約200グラム〜220グラム)に、2mg/kgの標的用量レベルでmAbdAbを単回静脈内(i/v)投与した。割り当てた時点(0時間〜312時間)で、100μlの血液サンプルを除去し、血漿に処理した。ラット血漿サンプルは、ヒトIgG検出アッセイ、および/またはIL-13リガンド結合アッセイ、および/またはIL-4リガンド結合アッセイにおいて試験分子の存在に関して評価した。さらに、(ラット中の)パスコリツマブに関する血漿中のPKプロファイルも評価した。この場合ラット血漿サンプルは、ヒトIgG検出アッセイおよびIL-4リガンド結合アッセイにおいてパスコリツマブの存在に関して評価した。
カニクイザルPK試験
PK試験をカニクイザルにおいて実施した。この動物に、1mg/kgの標的用量レベルで単回静脈内投与した。割り当てた時点で、500μlの血液サンプルを採取し血漿に加工した。次いでカニクイザルの血漿サンプルを、IL-13リガンド結合アッセイ、IL-4リガンド結合アッセイおよびIL-13/IL-4架橋アッセイにおいて試験分子の存在に関して評価した。
23.1 二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの作製
この二重標的化mAbdAbは、mAb重鎖のC末端とdAbの融合によって構築した。抗EGFR mAb重鎖および軽鎖発現カセットを事前に構築した。クローニングに使用した制限部位は、実施例10で述べた制限部位と同じである(SalIおよびHindIII)。
この二重標的化mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプル(DMS4010と称する)のSDS-PAGE分析(図128)は約170kDaで泳動した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約25および約60kDaの対応する軽鎖およびdAb融合重鎖で泳動した2つのバンドを示す。
VEGFおよびEGFRを中和する分子の能力を、それぞれ方法12および13に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。このmAbdAb(DMS4010と称する)の抗EGFR効力(図130)は4.784nMであると算出され、一方で対照、抗EGFR mAbは4.214nMのEC50値を得た。抗VEGF受容体結合アッセイ(図131)において、mAbdAb(DMS4010と称する)のEC50は58pM(0.058nM)であり、一方で抗VEGF対照mAbは214.1pM(0.2141nM)のEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例23の構築物、二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。
二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAb(DMS4010と称する)の薬物動態プロファイルを、カニクイザルへの投与後に決定した。化合物は5mg/kgの用量で静脈内投与し、投与後の多数の時点での血清中の薬剤レベルを、別のELISAアッセイにおいてEGFRとVEGFの両方との結合によって決定した。図132は、mAbsセツキシマブ(抗EGFR)およびベバシツマブ(抗VEGF)に関して生成した復元データとそのデータを比較した、このアッセイに関する結果を示す。さらなる詳細は表36に示す。
別の抗EGFR/抗VEGF mAbdAbを、STGリンカーを使用し重鎖のC末端上のVEGF dAbと連結した同じ抗EGFR mAbを使用して、実施例11.1中で前に記載した方法と類似した方法で構築した。この場合使用した抗VEGF dAbはDOM15-10-11であった。軽鎖と重鎖(配列番号165および186)の共トランスフェクションによる一過性トランスフェクション技法を使用して、この分子をHEK293-6E細胞中で発現させたが、しかしながら、発現の有意に低下したレベルを実施例23.2中に記載した分子の発現と比較して得た。実施例23.3中に記載したのと同様に同じVEGFアッセイにおいて効力に関して試験したとき、このアッセイにおいてVEGF受容体とのVEGF結合の検出不能なレベルの阻害があることが分かった。
24.1 リンカーを含まない二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの作製
dAbとmAbのCH3ドメインの間の「STG」リンカーを除去した、実施例23中で前に記載したmAbdAbの誘導体を作製した。SDMを使用して、重鎖をコードするプラスミドからSTGリンカーをコードする残基を欠失させた。それぞれ軽鎖および重鎖の配列を確認したクローン(配列番号243および174)を選択し、製造者のプロトコルに従いQiagen Mega Prepキットを使用して大規模DNA調製物を作製した。軽鎖と重鎖(配列番号175および137)の共トランスフェクションにより一過性トランスフェクション技法を使用して、哺乳動物細胞HEK293-6E細胞中でmAbdAbを発現させた。
この二重標的化mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプル(DMS4011と称する)のSDS-PAGE分析(図133)は約170kDaで泳動した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約25および約60kDaの対応する軽鎖およびdAb融合重鎖で泳動した2つのバンドを示す。
VEGFおよびEGFRを中和する分子の能力を、それぞれ方法12および13に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。このmAbdAb(DMS4011と称する)の抗EGFR効力(図135)は3.529nMであると計算し、一方で対照、抗EGFR mAbは3.647nMのEC50値を得た。抗VEGF受容体結合アッセイ(図136)において、mAbdAb(DMS4011と称する)のEC50は342.9pM(0.3429nM)であり、一方で抗VEGF対照mAbは214.1pM(0.2141nM)のEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例24の構築物、リンカーを含まない二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。
25.1 長いリンカーを有する二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの作製
dAbとmAbのCH3ドメインの間のリンカーが重鎖をコードするプラスミドへの柔軟性「GGGGS」モチーフの1つまたは2つの反復単位の挿入によって延長した、実施例23中で前に記載したmAbdAbの誘導体を作製した。
これらの二重標的化mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプルDMS4023およびDMS4024のSDS-PAGE分析(図137)は約170kDaで泳動した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約25および約60kDaの対応する軽鎖およびdAb融合重鎖で泳動した2つのバンドを示す。
VEGFおよびEGFRを中和する分子の能力を、それぞれ方法12および13に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。mAbdAb DMS4023の抗EGFR効力(図140)は7.066nMであると算出され、mAbdAb DMS4024の効力は6.420nMであると算出され、一方で対照、抗EGFR mAbは7.291nMのEC50値を得た。抗VEGF受容体結合アッセイ(図141)において、mAbdAb DMS4023のEC50は91.79pM(0.091nM)であり、mAbdAb DMS4024のEC50は90pM(0.0906nM)であり、一方で抗VEGF対照mAbは463.2pM(0.4632nM)のEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例25の構築物、長いリンカーを有する二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。
26.1 二重標的化抗VEGF/抗EGFR mAbdAbの作製
この二重標的化mAbdAbは、mAb重鎖のC末端とdAbの融合によって構築した。抗VEGF mAb重鎖および軽鎖発現カセットを事前に構築した。クローニングに使用した制限部位は、実施例10中で述べた制限部位と同じである(SalIおよびHindIII)。
これらの二重標的化mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプル(DMS4009と称する)のSDS-PAGE分析(図142)は約170kDaで泳動した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約25および約60kDaの対応する軽鎖およびdAb融合重鎖で泳動した2つのバンドを示す。
VEGFおよびEGFRを中和する分子の能力を、それぞれ方法12および13に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。mAbdAb DMS4009の抗EGFR効力(図144)は132.4nMであると算出され、一方で対照、抗EGFR mAbは6.585nMのEC50値を得た。抗VEGF受容体結合アッセイ(図145)において、mAbdAbのEC50は539.7pM(0.5397nM)であり、一方で抗VEGF対照mAbは380.5pM(0.3805nM)のEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例26の構築物、二重標的化抗VEGF/抗EGFR mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。
27.1 二重標的化抗EGFR/抗IL-13 mAbdAbの作製
この二重標的化mAbdAbは、mAb重鎖のC末端とdAbの融合によって構築した。抗EGFR mAb重鎖および軽鎖発現カセットを事前に構築した。クローニングに使用した制限部位は、実施例10で述べた制限部位と同じである(SalIおよびHindIII)。
これらの二重標的化mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプル(DMS4029と称する)のSDS-PAGE分析(図146)は約170kDaで泳動した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約25および約60kDaの対応する軽鎖およびdAb融合重鎖で泳動した2つのバンドを示す。
EGFRおよびIL-13を中和する分子の能力を、それぞれ方法13および25に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。mAbdAb DMS4029の抗EGFR効力(図148)は9.033nMであると算出され、一方で対照、抗EGFR mAbは8.874nMのEC50値を得た。IL-13細胞ベースの中和アッセイ(図149)において、mAbdAbのEC50は1.654nMであり、一方で抗IL-13対照dAbは0.996nMのEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例27の構築物、二重標的化抗EGFR/抗IL-13 mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。
28.1 dAbが軽鎖上に位置する二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの作製
二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbを、mAb軽鎖のC末端とdAbの融合によって構築した。抗EGFR mAb重鎖および軽鎖発現カセットを事前に構築した。
これらの二重標的化mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプルDMS4013およびDMS4027のSDS-PAGE分析(図150)は約170kDaで泳動した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約38および約50kDaの対応するdAb融合軽鎖および重鎖で泳動した2つのバンドを示す。
VEGFおよびEGFRを中和する分子の能力を、それぞれ方法12および13に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。mAbdAb DMS4013の抗EGFR効力(図153)は7.384nMであると算出され、mAbdAb DMS4027の効力は7.554nMであると算出され、一方で対照である抗EGFR mAbは7.093nMのEC50値を得た。抗VEGF受容体結合アッセイ(図154)において、mAbdAb DMS4013のEC50は1.179nMであり、mAbdAb DMS4027のEC50は0.1731nMであり、抗VEGF対照mAbは0.130nMのEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例28の構築物、dAbが軽鎖上に位置する二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。
二重標的化抗EGFR/抗VEGFおよび抗TNF/抗VEGF mAbdAbのBiacore分析
実施例11(抗TNF/抗VEGF mAbdAb)および実施例23、24、25および28(抗EGFR/抗VEGF mAbdAb)中に記載したmAbdAbにBIAcore分析を施して、それらの対応する抗原との結合に関する反応速度結合定数および解離定数を決定した。分析はBIAcore(商標)3000機器で実施した。機器の温度は25℃に設定した。HBS-EPバッファーはランニングバッファーとして使用した。実験データは機器に関して最高の考えられる割合で回収した。実験用CM5チップ上の1つのフローセルは、製造者の説明書に従い標準的なアミンカップリング化学法を使用してプロテインAでコーティングし、第2のフローセルを同様に処理したが、プロテインAの代わりにバッファーを使用して参照表面を生成した。次いでプロテインAでコーティングしたフローセルを使用してmAbdAbを捕捉した。表37中に詳述するように、抗原は2倍連続希釈系として注入した。数回の希釈を二連で実施した。リガンドの代わりにバッファーのみの注入は、バックグラウンドサブトラクションに使用した。機器ソフトウェアに固有な反応速度ウィザードを使用して、サンプルはランダムな順序で注入した。10mMグリシン、pH1.5を注入することによって、それぞれのサイクルの最後に表面を再生した。データ処理と反応速度フィッティングの両方をBIA評価ソフトウェア4.1を使用して実施した。(同じ実験からの)二連の結果の平均を示すデータを表37に示す。DMS4010に関して示した多数の値は別時に実施した2回の実験を表す。分析したリガンドの濃度のため、787nMの値はおそらく親和性を過大評価する。
二重特異性抗体足場と融合した単鎖ドメイン抗体を含む三重特異性抗体
30.1 構築
IL-18およびIL-12抗原に対して特異性を有する二重特異性抗体分子の可変重鎖および軽鎖ドメインをコードする遺伝子(さらなる情報に関してはWO2007/024715を参照)を適切な制限酵素部位を用いてde novoで構築し、シグナル配列を加えた。標準的な分子生物学の技法を使用して、可変重鎖ドメインを、定常領域のC末端でTVAAPSリンカーを介して抗IL4ドメイン抗体DOM9-112-210(配列番号4)と融合したIgG1重鎖定常領域を含有する発現ベクターにクローニングした。軽鎖可変ドメインを同様に、Ck定常領域配列を含有する発現ベクターにクローニングした。構築および発現した抗体は表38中に挙げる。
簡潔には、25mlのHEK293細胞を1.5×106個細胞/mlで、293fectin試薬(Invitrogen#51-0031)と事前にインキュベートした重鎖および軽鎖発現プラスミドで共トランスフェクトした。細胞は振とうインキュベーター、37℃、5%CO2、および95%相対湿度中に置いた。24時間後、トリプトン供給培地を加え、細胞はさらに48時間増殖させた。上清は遠心分離によって回収し、IgGレベルはELISAによって定量化した。生成したmAbdAbはBPC1616(配列番号193および194)と称した。
トランスフェクションからの細胞上清を組換えヒトIL-12との結合に関して評価した。簡潔には、ELISAプレートを2μg/mlで抗ヒトIL-12(R&D Systems AF219NA)を用いてコーティングし、ブロッキング溶液(4%BSA、トリス緩衝生理食塩水中)でブロッキングした。次いでプレートに、ブロッキング溶液に溶かした25ng/mlの組換えヒトIL-12(PeproTech #200-12)をロードした。TBS+0.05%Tween20(TBST)中で洗浄する前に、プレートは室温で1時間インキュベートした。ブロッキング溶液に希釈した様々な希釈の細胞上清、ならびに無関係な対照抗体(パスコリツマブおよびアイソタイプ適合対照hIgG)を加えた。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。ブロッキング溶液中に1000倍希釈でのペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(SigmaA7164)の添加によって結合を検出した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。プレートはOPD基質(SigmaP9187)の添加によって発色させ、発色は3MのH2SO4の添加によって停止させた。吸光度はプレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度をプロットした。
トランスフェクションからの細胞上清を組換えヒトIL-18との結合に関して評価した。簡潔には、ELISAプレートを1μg/mlでヒトIL-18(GSKで作製)を用いてコーティングし、ブロッキング溶液(4%BSA、トリス緩衝生理食塩水中)でブロッキングした。ブロッキング溶液に希釈した様々な希釈の細胞上清、ならびに無関係な抗体(パスコリツマブおよびアイソタイプ適合対照ヒトIgG)を加えた。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBS+0.05%Tween20(TBST)中で洗浄した。ブロッキング溶液中の1000倍希釈のペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(SigmaA7164)の添加によって結合を検出した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。プレートはOPD基質(SigmaP9187)の添加によって発色させ、発色は3MのH2SO4の添加によって停止させた。吸光度はプレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度をプロットした。結果は図156中に表し、BPC1616は組換えヒトIL-18と結合し、一方2つの対照抗体は結合を示さなかったことを示す。
トランスフェクションからの細胞上清を組換えヒトIL-4との結合に関して評価した。簡潔には、ELISAプレートを1μg/mlでヒトIL-4(GSKで作製)を用いてコーティングし、ブロッキング溶液(4%BSA、トリス緩衝生理食塩水中)でブロッキングした。ブロッキング溶液に希釈した様々な希釈の細胞上清、ならびに抗IL-4モノクローナル抗体(パスコリツマブ)および無関係な抗体(アイソタイプ適合対照hIgG)を加えた。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBS+0.05%Tween20(TBST)中で洗浄した。ブロッキング溶液中に1000倍希釈でのペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(SigmaA7164)の添加によって結合を検出した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。プレートはOPD基質(SigmaP9187)の添加によって発色させ、発色は3MのH2SO4の添加によって停止させた。吸光度はプレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度をプロットした。
モノクローナル抗体のC末端に直列に融合した2つの単鎖ドメイン抗体を含む三重特異性mAbdAb
31.1 構築
2つの単鎖ドメイン抗体がモノクローナル抗体の重鎖のC末端に直列に融合した、3つの三重特異性抗体(mAbdAb-dAb)を構築した。
BPC1008、BPC1009およびBPC1010の重鎖および軽鎖をコードする発現プラスミドは、293fectin(Invitrogen、12347019)を使用してHEK2936E細胞に一過的に共トランスフェクトした。トリプトン供給培地を翌日に細胞培養物に加え、上清材料は最初のトランスフェクションから約2〜6日後に採取した。結合アッセイ中で試験する前にプロテインAカラムを使用して、抗体を精製した。
96ウェル高結合プレートをコーティングバッファー(0.05M重炭酸塩、pH9.6、Sigma C-3041)3に溶かした5μg/mlのヒトIL-4(GSK)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20(TBST)で2回洗浄した。100μLのブロッキング溶液(1%BSA、TBSTバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。精製抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを3回洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(SigmaA7164)をブロッキング溶液中に2000倍に希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、次いでOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって5分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
96ウェル高結合プレートをコーティングバッファー(0.05M重炭酸塩、pH9.6)に溶かした5.9μg/mlのヒトIL-5(GSK)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20(TBST)で2回洗浄した。100μLのブロッキング溶液(1%BSA、TBSTバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。精製抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを3回洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma A7164)をブロッキング溶液中に2000倍に希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、次いでOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって5分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
96ウェル高結合プレートをコーティングバッファー(0.05M重炭酸塩pH9.6、SigmaC-3041)3に溶かした5μg/mlのヒトIL-13(GSK)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20(TBST)で2回洗浄した。100μLのブロッキング溶液(1%BSA、TBSTバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。精製抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを3回洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(SigmaA7164)をブロッキング溶液中に2000倍に希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、次いでOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって5分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
一価抗体足場と融合した単鎖ドメイン抗体を含むmAbdAb
32.1 mAbdAbの構築
一価抗体(さらなる情報に関してはWO2006015371およびWO2007059782を参照)とドメイン抗体DOM-15-26-293の融合体を含む二重特異性抗体を以下のように構築した。抗c-Met Knob-into-hole重鎖(配列番号202および203)をコードするDNA配列は、PCRベースの戦略、次に部位特異的突然変異誘発を使用して構築した。抗-c-Met Unibody重鎖(配列番号204)をコードするDNA配列は、PCRベースの戦略、次にPCRベースの手法によるヒンジ領域の除去を使用して構築した。さらに、融合構築物用に、BamHIおよびEcoRI制限部位を重鎖発現カセットのC末端に含めて、既存のベクターからBamHI-EcoRI断片として、抗VEGF-Aドメイン抗体(DOM-15-26-593)(配列番号75のアミノ酸455〜570をコードする)DNA配列の後のクローニングを容易にした。生成する発現ベクターは、GSリンカー(配列番号198、199および201)を介して重鎖のC末端と融合した抗VEGFAドメイン抗体をコードする。抗c-Met軽鎖(配列番号200)をコードするDNA配列は、PCRベースの戦略によって構築した。
BPC1017、BPC1018、BPC1019およびBPC1020の重鎖をコードする発現プラスミドは、293fectin(Invitrogen、12347019)を使用してHEK2936E細胞に共トランスフェクトした。トリプトン供給培地を翌日に細胞培養物に加え、上清材料は最初のトランスフェクションから約2〜6日後に採取した。結合アッセイ中で試験する前にプロテインAカラムを使用して抗体を精製した。
96ウェル高結合プレートをコーティングバッファー(0.05M重炭酸塩、pH9.6、Sigma C-3041)3に溶かした5μg/mlの組換えヒトHGFR(c-MET)/Fcキメラ(R&D system、カタログ番号:358-MT/CF)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20(TBST)で2回洗浄した。100μLのブロッキング溶液(1%BSA、TBSTバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも30分間インキュベートした。プレートは3回洗浄した。次いで精製抗体をブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。室温で1時間のインキュベーション後、プレートを3回洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma A7164)をブロッキング溶液中に2000倍に希釈し、それぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。これを3回洗浄し、次いでOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって5分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
96ウェル高結合プレートをPBSに溶かした0.4μg/mlのヒトVEGF(GSK)でコーティングし、4℃において一晩インキュベートした。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05%のTween-20(TBST)で2回洗浄した。100μLのブロッキング溶液(4%BSA、TBSTバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。次いで精製抗体をブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。室温で1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体をブロッキング溶液中に2000倍に希釈し、それぞれのウェルに加えた。プレートは室温で1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップの後、OPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって5分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。
抗IL13 dAb DOM10-53-546 dAbおよびDOM10-53-567を含有するmAbdAb
33.1 構築、発現および精製
(それぞれ実施例1、1.3および1.5に記載したのと同様に)表41に示す抗IL4 mAb-抗IL13 dAbをクローニングし、HEK2936E細胞中で一時的に発現させ、精製した。
精製PascoH-TVAAPS-546およびPascoH-TVAAPS-567は、(方法4および5に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)T100を使用して、ヒトIL-13およびヒトIL-4との結合に関して試験した。これらのデータは表42に示す。
精製PascoH-TVAAPS-546とPascoH-TVAAPS-567を、(それぞれ方法8および方法20に記載したのと同様に)TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトIL-13およびカニクイザルIL-13の中和に関して試験した。図167および168は、それぞれ(TF-1細胞バイオアッセイ中の)ヒトIL-13およびカニクイザルIL-13に関する中和データを示す。DOM10-53-616は、これらのバイオアッセイ中のIL-13の中和に関する陽性対照として含めた。無関係な抗原に対する特異性を有するdAb(陰性対照dAb)も、IL-13の中和に関する陰性対照として含めた。さらに、PascoH-616およびPascoH-TVAAPS-616も、これらのバイオアッセイにおいて試験した。
IgG2、IgG4およびIgG4PE重鎖定常領域を有するmAbdAb
34.1 mAbdAbの構築
ヒト抗体アイソタイプIgG2、IgG4および変異体IgG4(IgG4PE)遺伝子の重鎖定常領域を、PCRによって既存の構築物から増幅し、標準的な分子生物学の技法を使用してPascoH-GS-474重鎖(配列番号48)をコードする発現ベクターにクローニングした。設計および試験したmAbdAb抗体は表45に挙げる。
表45に述べるmAbdAbを、BPC1000と称するPascoH-GS-474(配列番号48および15)と共に発現させた。簡潔には、750μlのHEK293細胞を1.5×106個細胞/mlで、293fectin試薬(Invitrogen#51-0031)と事前にインキュベートした重鎖および軽鎖発現プラスミドで共トランスフェクトした。これらを振とうインキュベーター、37℃、5%CO2、および95%相対湿度中に置いた。1時間後、トリプトン供給培地を加え、細胞はさらに72時間増殖させた。上清は遠心分離によって回収した。
これらのmAbdAbを含有する上清を組換えヒトIL-4との結合に関して評価した。簡潔には、ELISAプレートを1μg/mlでヒトIL-4(GSKで作製)を用いてコーティングし、ブロッキング溶液(4%BSA、トリス緩衝生理食塩水中)でブロッキングした。様々な希釈の細胞上清、抗IL-4モノクローナル抗体(パスコリツマブ)および無関係な特異性の抗体(586抗IL-13)を加えた。すべてのサンプルはブロッキング溶液中に希釈した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBS+0.05%Tween20(TBST)中で洗浄した。ブロッキング溶液中の1000倍希釈のペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(Sigma A7164)の添加によって結合を検出した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。プレートはOPD基質(SigmaP9187)の添加によって発色させ、発色は3MのH2SO4の添加によって停止させた。吸光度はプレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度をプロットした。
これらのmAbdAbを含有する上清を組換えヒトIL-13との結合に関して評価した。簡潔には、ELISAプレートを5μg/mlでヒトIL-13(GSKで作製)を用いてコーティングし、ブロッキング溶液(4%BSA、トリス緩衝生理食塩水中)でブロッキングした。様々な希釈の細胞上清、抗IL-13モノクローナル抗体(586)および無関係な特異性の抗体(パスコリツマブ抗IL-4)を加えた。すべてのサンプルはブロッキング溶液中に希釈した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBS+0.05%Tween20(TBST)中で洗浄した。ブロッキング溶液中に1000倍希釈でのペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(SigmaA7164)の添加によって結合を検出した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。プレートはOPD基質(SigmaP9187)の添加によって発色させ、発色は3MのH2SO4の添加によって停止させた。吸光度はプレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度をプロットした。
別の抗IL-13/IL-4 mAbdAb
35.1 別の可変領域配列を有する抗IL-13/IL-4 mAbdAbの構築
標準的な分子生物学の技法を使用して、「C1」および「D1」と称する別の重鎖可変領域抗IL-13 mAbをコードするDNA配列を、既存の構築物から、定常領域のC末端でTVAAPSGSリンカーを介して抗IL-4ドメイン抗体(DOM9-112-210)と融合した、hIgG1定常領域をコードするDNAを含有する発現ベクターに移した。「M0」および「N0」と称するIL-13 mAbの別の軽鎖可変領域をコードするDNA配列をde novoで構築し、ヒトCk定常領域を含有する発現ベクターにクローニングした。これらの別の重鎖および軽鎖抗体可変領域は、配列番号12および13中に記載した抗IL-13抗体と同じCDR領域を、ただし他のヒト化可変フレームワーク領域と共に含む。
標準的な分子生物学の技法を使用して、ヒト化抗IL-13 mAb「656」の重鎖可変領域をコードするDNA配列を既存の構築物から移し、定常領域のC末端でTVAAPSリンカーを介して抗IL-4ドメイン抗体(DOM9-112-210)と融合した、hIgG1定常領域をコードするDNAを含有する発現ベクターにクローニングした。可変軽鎖領域をコードするDNA配列は既存の構築物から移し、ヒトCk定常領域を含有する発現ベクターにクローニングした。
簡潔には、25mlのHEK293細胞を1.5×106個細胞/mlで、293fectin試薬(Invitrogen#51-0031)と事前にインキュベートした重鎖および軽鎖発現プラスミドと共トランスフェクトした。これらを振とうインキュベーター、37℃、5%CO2、および95%相対湿度中に置いた。24時間後、トリプトン供給培地を加え、細胞はさらに72時間増殖させた。上清は遠心分離によって回収し、IgGのレベルはELISAによって定量化した。構築および発現した抗体は表46に挙げる。
IL-13とのmAbdAbの結合活性をELISAによって評価した。簡潔には、5μg/mlの組換え大腸菌発現ヒトIL-13(GSKで作製および精製)を96ウェルELISAプレートにコーティングした。ウェルを室温で2時間ブロッキングし、次いでmAbdAb構築物をプレートで滴定した。1000倍希釈の抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼ結合抗体(カタログ番号A7164、Sigma-Aldrich)を使用して結合を検出した。
HEK細胞トランスフェクションからの細胞上清を、(方法4に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)を使用して、組換え大腸菌発現ヒトIL-13との結合に関しても試験した。BPC1601は精製タンパク質として試験した。表47に示す結合親和性によって、すべての抗体がヒトIL-13に対して高い親和性結合を示すことを確認する。
ヒトIL-5およびヒトIL-13に対する特異性を有するmAbdAbの作製
36.1 mAbdAbの構築および発現
配列番号65に示す重鎖および配列番号72に示す軽鎖を有するmAbdAb分子を、HEK2936E細胞中で発現させた。これはメポリズマブL-G4S-474またはBPC1021と称した。
(細胞上清中の)このmAbdAbを、(方法1に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてヒトIL-13との結合に関して試験した。これらのデータは図173に示す。サンプルはトランスフェクトし、二連で試験し、これはサンプルAおよびサンプルBとして注記した。
注記:「太字」テキスト中の配列の下線部はリンカーに対応する。「GS」アミノ酸残基(そのコード配列をBamHIクローニング部位として用いた)は「太字」テキストに入っていないが、下線を引いてある。
Claims (49)
Xは定常重鎖ドメイン2および定常重鎖ドメイン3を含む定常抗体領域を表し、
R1、R4、R7およびR8は、独立に、エピトープ結合性ドメインから選択されるドメインを表し、
R2は、定常重鎖1、およびエピトープ結合性ドメインからなる群より選択されるドメインを表し、
R3は、対になったVHおよびエピトープ結合性ドメインからなる群より選択されるドメインを表し、
R5は、定常軽鎖、およびエピトープ結合性ドメインからなる群より選択されるドメインを表し、
R6は、対になったVLおよびエピトープ結合性ドメインからなる群より選択されるドメインを表し、
nは、独立に、0、1、2、3および4より選択される整数を表し、
mは、独立に、0および1より選択される整数を表し、
定常重鎖1ドメインと定常軽鎖ドメインとが結合しており、
少なくとも1つのエピトープ結合性ドメインが存在し、
R3が対になったVHドメインを表す場合、R6は対になったVLドメインを表し、それにより該2つのドメインは一緒に抗原に結合することが可能である]
の2つ以上の構造を含む少なくとも1つのホモ二量体を含む、抗原結合性構築物。
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IL (1) | IL205906A (ja) |
MA (1) | MA31940B1 (ja) |
MX (1) | MX2010005927A (ja) |
PE (1) | PE20091234A1 (ja) |
TW (1) | TW200944231A (ja) |
UY (1) | UY31504A1 (ja) |
WO (1) | WO2009068649A2 (ja) |
ZA (1) | ZA201003850B (ja) |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012509658A (ja) * | 2008-11-26 | 2012-04-26 | グラクソ グループ リミテッド | Il−13に結合するリガンド |
JP2015024994A (ja) * | 2013-07-26 | 2015-02-05 | 三星電子株式会社Samsung Electronics Co.,Ltd. | DARPinを含む二重特異キメラ蛋白質 |
JP2015522525A (ja) * | 2012-05-10 | 2015-08-06 | ザイムワークス,インコーポレイテッド | Fcドメインに突然変異を有する免疫グロブリン重鎖のヘテロ多量体構築物 |
JP2018526369A (ja) * | 2015-08-24 | 2018-09-13 | グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、(ナンバー2)、リミテッドGlaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited | バイオ医薬組成物 |
JP2018533017A (ja) * | 2015-10-02 | 2018-11-08 | ティージーアール バイオサイエンシス ピーティーワイ エルティーディー. | 多基体による検体検出 |
JP2019510812A (ja) * | 2016-02-26 | 2019-04-18 | イミュネクサス・ピーティーワイ・リミテッド | 多重特異性分子 |
JP2019524693A (ja) * | 2016-07-20 | 2019-09-05 | ナンジン レジェンド バイオテック カンパニー,リミテッドNanjing Legend Biotech Co.,Ltd. | 多重特異性抗原結合タンパク質及びその使用方法 |
JP2020202829A (ja) * | 2013-02-26 | 2020-12-24 | ロシュ グリクアート アーゲー | 二重特異性t細胞活性化抗原結合分子 |
JP2021502801A (ja) * | 2017-09-29 | 2021-02-04 | 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 | Il−5抗体、その抗原結合フラグメント、およびそれらの医薬適用 |
JP2021510521A (ja) * | 2018-01-15 | 2021-04-30 | ナンジン レジェンド バイオテック カンパニー,リミテッドNanjing Legend Biotech Co.,Ltd. | Pd−1に対する単一ドメイン抗体及びその変異体 |
US11905327B2 (en) | 2017-12-28 | 2024-02-20 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Single-domain antibodies and variants thereof against TIGIT |
Families Citing this family (205)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009519983A (ja) * | 2005-12-20 | 2009-05-21 | アラーナ・テラピューティクス・リミテッド | 部分的な新世界ザル結合領域を有するキメラ抗体 |
NZ569988A (en) | 2006-02-01 | 2011-09-30 | Cephalon Australia Pty Ltd | Domain antibody construct which binds to human TNF-alpha and contains a modified hinge region sequence and a truncated CH1 domain |
US10118970B2 (en) * | 2006-08-30 | 2018-11-06 | Genentech, Inc. | Multispecific antibodies |
WO2009040562A1 (en) | 2007-09-26 | 2009-04-02 | Ucb Pharma S.A. | Dual specificity antibody fusions |
GB2468232B (en) * | 2007-11-30 | 2012-10-24 | Glaxo Group Ltd | Antigen-bindng constructs |
EP2237797A4 (en) | 2008-01-03 | 2012-11-07 | Scripps Research Inst | TARGETING ANTIBODIES BY MODULAR RECOGNITION DOMAIN |
US8557243B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-10-15 | The Scripps Research Institute | EFGR antibodies comprising modular recognition domains |
US8557242B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-10-15 | The Scripps Research Institute | ERBB2 antibodies comprising modular recognition domains |
US8454960B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-06-04 | The Scripps Research Institute | Multispecific antibody targeting and multivalency through modular recognition domains |
US8574577B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-11-05 | The Scripps Research Institute | VEGF antibodies comprising modular recognition domains |
CA2734905A1 (en) * | 2008-09-03 | 2010-03-11 | Jenny M. Bostrom | Multispecific antibodies |
SI2334705T1 (sl) | 2008-09-26 | 2017-05-31 | Ucb Biopharma Sprl | Biološki produkti |
US8268314B2 (en) | 2008-10-08 | 2012-09-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies |
GB0904214D0 (en) * | 2009-03-11 | 2009-04-22 | Ucb Pharma Sa | Biological products |
EP2435075A2 (en) * | 2009-05-28 | 2012-04-04 | Glaxo Group Limited | Antigen-binding proteins |
WO2010136508A2 (en) * | 2009-05-28 | 2010-12-02 | Glaxo Group Limited | Stem cell targeting |
EP2435482B1 (en) * | 2009-05-28 | 2019-04-03 | Glaxo Group Limited | Antigen-binding proteins |
JP2012527878A (ja) * | 2009-05-28 | 2012-11-12 | グラクソ グループ リミテッド | 抗原結合タンパク質 |
US20100303821A1 (en) | 2009-05-28 | 2010-12-02 | Glaxo Group Limited | Immunoglobulins |
JP5680087B2 (ja) * | 2009-09-22 | 2015-03-04 | シャンハイ・イージェー・バイオテクノロジー・カンパニー、リミテッドShanghai Yijie Biotechnology Co.,Ltd | 特異的結合タンパク質およびその使用 |
EP2308897A1 (en) * | 2009-10-09 | 2011-04-13 | Pierre Fabre Medicament | Chimeric antibodies specific for CD151 and use thereof in the treatment of cancer |
ES2728115T3 (es) | 2009-10-30 | 2019-10-22 | Janssen Biotech Inc | Antagonistas de IL-17A |
TW201120210A (en) | 2009-11-05 | 2011-06-16 | Hoffmann La Roche | Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates |
WO2011057347A1 (en) | 2009-11-12 | 2011-05-19 | Tgr Biosciences Pty Ltd | Analyte detection |
SG182783A1 (en) * | 2010-02-09 | 2012-09-27 | Glaxo Group Ltd | Treatment of a metabolic disorder |
EA201270713A1 (ru) | 2010-02-18 | 2013-01-30 | Бристол-Майерс Сквибб Компани | Белки на основе фибронектина с каркасными доменами, которые связывают ил-23 |
TWI426920B (zh) | 2010-03-26 | 2014-02-21 | Hoffmann La Roche | 雙專一性、雙價抗-vegf/抗-ang-2抗體 |
CA2796932A1 (en) | 2010-04-21 | 2011-10-27 | Glaxo Group Limited | Binding domains |
WO2011143624A2 (en) * | 2010-05-14 | 2011-11-17 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Humanized and chimeric monoclonal antibodies to cd47 |
BR112012029280A2 (pt) | 2010-05-20 | 2016-11-29 | Glaxo Group Ltd | variante de domínio variável único de imunoglobulina antialbumina sérica, imunoglobulina anti-sa, ligando multiespecífico, proteína de fusão, composição, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira isolada, e, uso de uma variante, ligando multiespecífico ou proteína de fusão |
TWI488966B (zh) * | 2010-07-09 | 2015-06-21 | 優普生物科技股份有限公司 | Dna疫苗 |
WO2012009705A1 (en) | 2010-07-15 | 2012-01-19 | Zyngenia, Inc. | Ang-2 binding complexes and uses thereof |
EP3578205A1 (en) | 2010-08-06 | 2019-12-11 | ModernaTX, Inc. | A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof |
JP2013538566A (ja) | 2010-08-13 | 2013-10-17 | グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド | 改良された抗血清アルブミン結合変異体 |
BR112013003899A2 (pt) | 2010-08-20 | 2016-06-07 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | domínio variável único da imunoglobina anti-albumina sérica (sa), ligando multiespecífico, proteína de fusão, composição, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira isolada, e, método de tratar ou previnir uma doença ou distúrbio em um paciente |
CA3162352A1 (en) | 2010-10-01 | 2012-04-05 | Modernatx, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
JP6167040B2 (ja) | 2010-11-05 | 2017-07-19 | ザイムワークス,インコーポレイテッド | Fcドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計 |
WO2012069557A1 (en) | 2010-11-24 | 2012-05-31 | Glaxo Group Limited | Multispecific antigen binding proteins targeting hgf |
ES2842895T3 (es) * | 2010-12-06 | 2021-07-15 | Seagen Inc | Anticuerpos humanizados contra LIV-1 y uso de los mismos para tratar el cáncer |
WO2012088006A1 (en) * | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin based scaffold domain proteins that bind il-23 |
US20120195900A1 (en) * | 2010-12-22 | 2012-08-02 | Abbott Laboratories | Tri-variable domain binding proteins and uses thereof |
US20120189633A1 (en) | 2011-01-26 | 2012-07-26 | Kolltan Pharmaceuticals, Inc. | Anti-kit antibodies and uses thereof |
EP2670778A1 (en) | 2011-02-02 | 2013-12-11 | Glaxo Group Limited | Novel antigen binding proteins |
CN102251013A (zh) * | 2011-02-22 | 2011-11-23 | 北京市肿瘤防治研究所 | 一个识别肿瘤起始细胞的抗体和抗原及其应用 |
EP2686014A1 (en) * | 2011-03-16 | 2014-01-22 | Sanofi | Uses of a dual v region antibody-like protein |
DE12722942T1 (de) | 2011-03-31 | 2021-09-30 | Modernatx, Inc. | Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren |
US20140023655A1 (en) * | 2011-04-07 | 2014-01-23 | Glaxosmithkline Llc | Formulations with reduced viscosity |
EP2714738B1 (en) | 2011-05-24 | 2018-10-10 | Zyngenia, Inc. | Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses |
US20140193408A1 (en) * | 2011-06-16 | 2014-07-10 | Novartis Ag | Soluble proteins for use as therapeutics |
US11492383B2 (en) * | 2011-06-24 | 2022-11-08 | Stephen D. Gillies | Light chain immunoglobulin fusion proteins and methods of use thereof |
EP2546268A1 (en) * | 2011-07-13 | 2013-01-16 | F-Star Biotechnologische Forschungs - und Entwicklungsges. M.B.H. | Internalising immunoglobulin |
GB201112429D0 (en) * | 2011-07-19 | 2011-08-31 | Glaxo Group Ltd | Antigen-binding proteins with increased FcRn binding |
EP2736925A2 (en) * | 2011-07-27 | 2014-06-04 | Glaxo Group Limited | Anti-vegf single variable domains fused to fc domains |
EP2987806A3 (en) | 2011-08-17 | 2016-07-13 | Glaxo Group Limited | Modified single variable domain antibodies with reduced binding to anti-drug-antibodies |
US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
PT3682905T (pt) | 2011-10-03 | 2022-04-07 | Modernatx Inc | Nucleósidos, nucleótidos e ácidos nucleicos modificados e respetivas utilizações |
WO2013063702A1 (en) | 2011-11-04 | 2013-05-10 | Zymeworks Inc. | Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain |
LT2791160T (lt) | 2011-12-16 | 2022-06-10 | Modernatx, Inc. | Modifikuotos mrnr sudėtys |
EP2812443B1 (en) | 2012-02-06 | 2019-05-29 | Inhibrx, Inc. | Cd47 antibodies and methods of use thereof |
GB2502127A (en) * | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
US9303079B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-04-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
CA2868996A1 (en) | 2012-04-02 | 2013-10-10 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of proteins |
US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
US20130280282A1 (en) * | 2012-04-24 | 2013-10-24 | Daiichi Sankyo Co., Ltd. | Dr5 ligand drug conjugates |
EP2841093A4 (en) * | 2012-04-27 | 2016-04-06 | Cytomx Therapeutics Inc | ACTIVATABLE ANTIBODIES FOR BINDING THE RECEPTOR OF THE EPIDERMAL GROWTH FACTOR AND USE THEREOF |
CN102676569A (zh) * | 2012-05-08 | 2012-09-19 | 百泰生物药业有限公司 | 一种新型噬菌粒展示载体pCANTAB5M |
US9499634B2 (en) | 2012-06-25 | 2016-11-22 | Zymeworks Inc. | Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells |
MX2014015825A (es) * | 2012-06-28 | 2015-08-10 | Molecular Partners Ag | Proteinas de repeticion de anquirina diseñadas que se unen al factor de crecimiento derivado de plaquetas. |
MY183712A (en) | 2012-07-13 | 2021-03-09 | Roche Glycart Ag | Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases |
ES2673847T3 (es) | 2012-07-25 | 2018-06-26 | Celldex Therapeutics, Inc. | Anticuerpos anti KIT y usos de los mismos |
WO2014029752A1 (en) | 2012-08-22 | 2014-02-27 | Glaxo Group Limited | Anti lrp6 antibodies |
JP6581505B2 (ja) | 2012-10-03 | 2019-09-25 | ザイムワークス,インコーポレイテッド | 重鎖および軽鎖ポリペプチドの対を定量化する方法 |
PL2922554T3 (pl) | 2012-11-26 | 2022-06-20 | Modernatx, Inc. | Na zmodyfikowany na końcach |
US9914785B2 (en) | 2012-11-28 | 2018-03-13 | Zymeworks Inc. | Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof |
US10077298B2 (en) | 2012-11-28 | 2018-09-18 | Zymeworks Inc. | Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof |
WO2014111550A1 (en) | 2013-01-17 | 2014-07-24 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Modified anti-serum albumin binding proteins |
WO2014118220A1 (en) | 2013-01-31 | 2014-08-07 | Glaxo Group Limited | Method of producing a protein |
KR102170196B1 (ko) * | 2013-02-06 | 2020-10-26 | 인히브릭스, 인크. | 비-혈소판 및 비-적혈구 세포 격감성 cd47 항체 및 이를 이용하는 방법 |
MX2015013163A (es) | 2013-03-15 | 2016-04-04 | Zyngenia Inc | Complejos multiespecificos multivalente y monovalentes y sus usos. |
US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
US10087248B2 (en) | 2013-05-22 | 2018-10-02 | Metabolic Engineering Laboratories Co., Ltd. | Anti-TNF-α/CXCL10 double-targeting antibody and use thereof |
CN104341504B (zh) * | 2013-08-06 | 2017-10-24 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 双特异性抗体 |
EP3052106A4 (en) | 2013-09-30 | 2017-07-19 | ModernaTX, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
JP2016538829A (ja) | 2013-10-03 | 2016-12-15 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドModerna Therapeutics,Inc. | 低密度リポタンパク質受容体をコードするポリヌクレオチド |
US9540440B2 (en) | 2013-10-30 | 2017-01-10 | Cytomx Therapeutics, Inc. | Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof |
CN105940113A (zh) | 2013-11-13 | 2016-09-14 | 酵活有限公司 | 靶向egfr和/或her2的单价抗原结合构建体及其用途 |
KR102357906B1 (ko) | 2013-11-27 | 2022-02-03 | 자임워크스 인코포레이티드 | Her2를 표적화하는 이중특이성 항원-결합 작제물 |
WO2015089283A1 (en) | 2013-12-11 | 2015-06-18 | Cytomx Therapeutics, Inc. | Antibodies that bind activatable antibodies and methods of use thereof |
TW201609805A (zh) | 2013-12-23 | 2016-03-16 | 美國禮來大藥廠 | 結合egfr及met之多功能抗體 |
WO2015095972A1 (en) * | 2013-12-23 | 2015-07-02 | The Centre For Drug Research And Development | Antibodies comprising c-terminal light chain polypeptide extensions and conjugates and methods of use thereof |
WO2015104406A2 (en) * | 2014-01-13 | 2015-07-16 | Pieris Ag | Multi-specific polypeptide useful for localized tumor immunomodulation |
JOP20200094A1 (ar) | 2014-01-24 | 2017-06-16 | Dana Farber Cancer Inst Inc | جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها |
JOP20200096A1 (ar) | 2014-01-31 | 2017-06-16 | Children’S Medical Center Corp | جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها |
MX2016011993A (es) | 2014-03-14 | 2016-12-09 | Novartis Ag | Moleculas de anticuerpo que se unen a lag-3 y usos de las mismas. |
ES2939760T3 (es) | 2014-03-15 | 2023-04-26 | Novartis Ag | Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico para antígenos |
CA3177027A1 (en) | 2014-05-28 | 2015-12-03 | Zymeworks Inc. | Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof |
US9884921B2 (en) | 2014-07-01 | 2018-02-06 | Pfizer Inc. | Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof |
KR102272213B1 (ko) * | 2014-07-08 | 2021-07-01 | 삼성전자주식회사 | 표적화 부위, 절단 부위, 및 세포막 투과 부위를 포함하는 융합 단백질 및 그의 용도 |
WO2016014553A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Novartis Ag | Sortase synthesized chimeric antigen receptors |
BR112017001183A2 (pt) | 2014-07-21 | 2017-11-28 | Novartis Ag | tratamento de câncer usando receptor de antígeno quimérico anti-bcma humanizado |
KR102594343B1 (ko) | 2014-07-21 | 2023-10-26 | 노파르티스 아게 | Cd33 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 |
JP2017528433A (ja) | 2014-07-21 | 2017-09-28 | ノバルティス アーゲー | 低い免疫増強用量のmTOR阻害剤とCARの組み合わせ |
ES2781175T3 (es) | 2014-07-31 | 2020-08-31 | Novartis Ag | Subconjunto optimizado de células T que contienen un receptor de antígeno quimérico |
CA2958200A1 (en) | 2014-08-14 | 2016-02-18 | Novartis Ag | Treatment of cancer using a gfr alpha-4 chimeric antigen receptor |
CN107108744B (zh) | 2014-08-19 | 2020-09-25 | 诺华股份有限公司 | 抗cd123嵌合抗原受体(car)用于癌症治疗 |
BR112017005390A2 (pt) | 2014-09-17 | 2017-12-12 | Novartis Ag | células citotóxicas alvo com receptores quiméricos para imunoterapia adotiva |
GB201416832D0 (en) | 2014-09-24 | 2014-11-05 | Glaxosmithkline Plc | Methods of treatment |
RU2609627C2 (ru) * | 2014-09-26 | 2017-02-02 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Высокоаффинные и агрегационно стабильные антитела на основе вариабельных доменов vl и производного vhh |
EP4245376A3 (en) | 2014-10-14 | 2023-12-13 | Novartis AG | Antibody molecules to pd-l1 and uses thereof |
WO2016090034A2 (en) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | Novartis Ag | Methods for b cell preconditioning in car therapy |
WO2016135041A1 (en) * | 2015-02-26 | 2016-09-01 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Fusion proteins and antibodies comprising thereof for promoting apoptosis |
WO2016164731A2 (en) | 2015-04-08 | 2016-10-13 | Novartis Ag | Cd20 therapies, cd22 therapies, and combination therapies with a cd19 chimeric antigen receptor (car) - expressing cell |
WO2016172583A1 (en) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Novartis Ag | Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker |
RU2727165C2 (ru) | 2015-05-04 | 2020-07-21 | ПИЕРИС ФАРМАСЬЮТИКАЛС ГмбХ | Слитый полипептид с противораковой активностью |
WO2017015623A2 (en) | 2015-07-23 | 2017-01-26 | Inhibrx Lp | Multivalent and multispecific gitr-binding fusion proteins |
DK3317301T3 (da) | 2015-07-29 | 2021-06-28 | Immutep Sas | Kombinationsterapier omfattende antistofmolekyler mod lag-3 |
WO2017019897A1 (en) | 2015-07-29 | 2017-02-02 | Novartis Ag | Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3 |
WO2017049139A2 (en) * | 2015-09-17 | 2017-03-23 | The Scripps Research Institute | Dual variable domain immunoconjugates and uses thereof |
EP3359576A4 (en) | 2015-10-08 | 2019-08-28 | Zymeworks Inc. | ANTIGENBINDING POLYPEPTIDE CONSTRUCTS WITH KAPPA AND LAMBDA LIGHT CHAINS AND USES THEREOF |
WO2017106810A2 (en) | 2015-12-17 | 2017-06-22 | Novartis Ag | Combination of c-met inhibitor with antibody molecule to pd-1 and uses thereof |
MX2018007423A (es) | 2015-12-17 | 2018-11-09 | Novartis Ag | Moleculas de anticuerpo que se unen a pd-1 y usos de las mismas. |
EP3851457A1 (en) | 2016-01-21 | 2021-07-21 | Novartis AG | Multispecific molecules targeting cll-1 |
CN109153714A (zh) | 2016-03-04 | 2019-01-04 | 诺华股份有限公司 | 表达多重嵌合抗原受体(car)分子的细胞及其用途 |
MA45324A (fr) | 2016-03-15 | 2019-01-23 | Seattle Genetics Inc | Polythérapie utilisant un adc-liv1 et un agent chimiothérapeutique |
US11549099B2 (en) | 2016-03-23 | 2023-01-10 | Novartis Ag | Cell secreted minibodies and uses thereof |
CA3021027A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Novartis Ag | Compositions and methods for selective expression of chimeric antigen receptors |
US20210177896A1 (en) | 2016-06-02 | 2021-06-17 | Novartis Ag | Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells |
CN106084067A (zh) * | 2016-06-15 | 2016-11-09 | 无锡市人民医院 | 具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白及其制备方法 |
JP7219376B2 (ja) | 2016-07-15 | 2023-02-08 | ノバルティス アーゲー | キメラ抗原受容体をキナーゼ阻害薬と併用して使用したサイトカイン放出症候群の治療及び予防 |
KR20190034588A (ko) | 2016-07-28 | 2019-04-02 | 노파르티스 아게 | 키메라 항원 수용체 및 pd-1 억제제의 조합 요법 |
EP3490590A2 (en) | 2016-08-01 | 2019-06-05 | Novartis AG | Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule |
BR112019006781A2 (pt) | 2016-10-07 | 2019-07-30 | Novartis Ag | receptores de antígeno quiméricos para o tratamento de câncer |
WO2018068201A1 (en) | 2016-10-11 | 2018-04-19 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4 |
TW201829462A (zh) * | 2016-11-02 | 2018-08-16 | 英商葛蘭素史克智慧財產(第二)有限公司 | 結合蛋白 |
US11535662B2 (en) | 2017-01-26 | 2022-12-27 | Novartis Ag | CD28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy |
CN108456250A (zh) * | 2017-02-17 | 2018-08-28 | 科济生物医药(上海)有限公司 | 靶向il-13ra2的抗体及其应用 |
WO2018160731A1 (en) | 2017-02-28 | 2018-09-07 | Novartis Ag | Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy |
AU2018250641A1 (en) | 2017-04-11 | 2019-10-31 | Inhibrx, Inc. | Multispecific polypeptide constructs having constrained CD3 binding and methods of using the same |
US20200179511A1 (en) | 2017-04-28 | 2020-06-11 | Novartis Ag | Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor |
WO2018201056A1 (en) | 2017-04-28 | 2018-11-01 | Novartis Ag | Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor |
WO2018226339A1 (en) * | 2017-06-06 | 2018-12-13 | Glaxosmithkline Llc | Biopharmaceutical compositions and methods for pediatric patients |
WO2018232357A1 (en) | 2017-06-15 | 2018-12-20 | Modernatx, Inc. | Rna formulations |
AU2018290237A1 (en) | 2017-06-22 | 2020-01-16 | Novartis Ag | Antibody molecules to CD73 and uses thereof |
CA3066747A1 (en) | 2017-06-27 | 2019-01-03 | Novartis Ag | Dosage regimens for anti-tim-3 antibodies and uses thereof |
CA3069438A1 (en) | 2017-07-11 | 2019-01-17 | Compass Therapeutics Llc | Agonist antibodies that bind human cd137 and uses thereof |
GB201711208D0 (en) | 2017-07-12 | 2017-08-23 | Iontas Ltd | Ion channel inhibitors |
CN111163798A (zh) | 2017-07-20 | 2020-05-15 | 诺华股份有限公司 | 用于抗lag-3抗体的给药方案及其用途 |
WO2019028367A1 (en) | 2017-08-04 | 2019-02-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | METHODS OF TREATING ESOPHAGITIS WITH ACTIVE EOSINOPHILES |
JP7275111B2 (ja) | 2017-08-31 | 2023-05-17 | モデルナティエックス インコーポレイテッド | 脂質ナノ粒子の生成方法 |
WO2019089798A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Novartis Ag | Anti-car compositions and methods |
WO2019089753A2 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Compass Therapeutics Llc | Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof |
US20200277378A1 (en) | 2017-11-16 | 2020-09-03 | Novartis Ag | Combination therapies |
EP3713961A2 (en) | 2017-11-20 | 2020-09-30 | Compass Therapeutics LLC | Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof |
CN111836832A (zh) * | 2018-01-08 | 2020-10-27 | 南京传奇生物科技有限公司 | 多特异性抗原结合蛋白及其使用方法 |
CA3090249A1 (en) | 2018-01-31 | 2019-08-08 | Novartis Ag | Combination therapy using a chimeric antigen receptor |
US20210147547A1 (en) | 2018-04-13 | 2021-05-20 | Novartis Ag | Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof |
EP3784351A1 (en) | 2018-04-27 | 2021-03-03 | Novartis AG | Car t cell therapies with enhanced efficacy |
TW202003580A (zh) | 2018-05-21 | 2020-01-16 | 美商坎伯斯治療有限責任公司 | 用於增強nk細胞對標靶細胞之殺死之組合物及方法 |
WO2019226658A1 (en) | 2018-05-21 | 2019-11-28 | Compass Therapeutics Llc | Multispecific antigen-binding compositions and methods of use |
EP3801769A1 (en) | 2018-05-25 | 2021-04-14 | Novartis AG | Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies |
WO2019232244A2 (en) | 2018-05-31 | 2019-12-05 | Novartis Ag | Antibody molecules to cd73 and uses thereof |
US20210198370A1 (en) * | 2018-05-31 | 2021-07-01 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Bi-specific antibodies and use thereof |
BR112020025048A2 (pt) | 2018-06-13 | 2021-04-06 | Novartis Ag | Receptores de antígeno quimérico de bcma e usos dos mesmos |
MX2020013798A (es) | 2018-06-19 | 2021-08-11 | Atarga Llc | Moléculas de anticuerpo de componente de complemento 5 y sus usos. |
AR116109A1 (es) | 2018-07-10 | 2021-03-31 | Novartis Ag | Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos |
WO2020021465A1 (en) | 2018-07-25 | 2020-01-30 | Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. | Method of treatment of neuroendocrine tumors |
GB2576914A (en) * | 2018-09-06 | 2020-03-11 | Kymab Ltd | Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains produced in mammals |
AU2019379576A1 (en) | 2018-11-13 | 2021-06-03 | Compass Therapeutics Llc | Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof |
CN113271945A (zh) | 2018-12-20 | 2021-08-17 | 诺华股份有限公司 | 包含3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物的给药方案和药物组合 |
JP2022514280A (ja) | 2018-12-20 | 2022-02-10 | ノバルティス アーゲー | Mdm2阻害剤のための延長低用量レジメン |
KR20210134321A (ko) * | 2019-02-01 | 2021-11-09 | 노바록 바이오테라퓨틱스 리미티드 | 항-클라우딘 18 항체 및 이의 이용 방법 |
WO2020165833A1 (en) | 2019-02-15 | 2020-08-20 | Novartis Ag | 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof |
US10871640B2 (en) | 2019-02-15 | 2020-12-22 | Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh | Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects |
JP2022520448A (ja) | 2019-02-15 | 2022-03-30 | ノバルティス アーゲー | 置換3-(1-オキソイソインドリン-2-イル)ピペリジン-2,6-ジオン誘導体及びその使用 |
WO2020172553A1 (en) | 2019-02-22 | 2020-08-27 | Novartis Ag | Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors |
AU2020231343A1 (en) | 2019-03-06 | 2021-10-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | IL-4/IL-13 pathway inhibitors for enhanced efficacy in treating cancer |
SG11202109002XA (en) | 2019-03-21 | 2021-09-29 | Regeneron Pharma | Combination of il-4/il-13 pathway inhibitors and plasma cell ablation for treating allergy |
US20220185876A1 (en) | 2019-03-29 | 2022-06-16 | Atarga, Llc | Anti fgf23 antibody |
EP3980131A4 (en) * | 2019-06-06 | 2023-06-28 | Janux Therapeutics, Inc. | Compositions and methods relating to tumor activated t cell engagers |
CA3158298A1 (en) | 2019-10-21 | 2021-04-29 | Novartis Ag | Combination therapies with venetoclax and tim-3 inhibitors |
KR20220087498A (ko) | 2019-10-21 | 2022-06-24 | 노파르티스 아게 | Tim-3 억제제 및 그의 용도 |
EP4065158A2 (en) | 2019-11-26 | 2022-10-05 | Novartis AG | Chimeric antigen receptors binding bcma and cd19 and uses thereof |
CA3165399A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Novartis Ag | Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases |
US20210222244A1 (en) | 2020-01-17 | 2021-07-22 | Becton, Dickinson And Company | Methods and compositions for single cell secretomics |
AU2021207348A1 (en) | 2020-01-17 | 2022-08-11 | Novartis Ag | Combination comprising a TIM-3 inhibitor and a hypomethylating agent for use in treating myelodysplastic syndrome or chronic myelomonocytic leukemia |
JP2023515211A (ja) | 2020-02-27 | 2023-04-12 | ノバルティス アーゲー | キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法 |
IL298262A (en) | 2020-06-23 | 2023-01-01 | Novartis Ag | A dosage regimen that includes derivatives of 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione |
TWI818276B (zh) * | 2020-06-30 | 2023-10-11 | 大陸商和鉑醫藥(上海)有限責任公司 | Fab-HCAb結構的結合蛋白 |
BR112023000482A2 (pt) | 2020-07-16 | 2023-01-31 | Novartis Ag | Anticorpos antibetacelulina, fragmentos dos mesmos e moléculas de ligação multiespecíficas |
WO2022026592A2 (en) | 2020-07-28 | 2022-02-03 | Celltas Bio, Inc. | Antibody molecules to coronavirus and uses thereof |
EP4188549A1 (en) | 2020-08-03 | 2023-06-07 | Novartis AG | Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof |
EP4204020A1 (en) | 2020-08-31 | 2023-07-05 | Advanced Accelerator Applications International S.A. | Method of treating psma-expressing cancers |
WO2022043557A1 (en) | 2020-08-31 | 2022-03-03 | Advanced Accelerator Applications International Sa | Method of treating psma-expressing cancers |
JP2023547499A (ja) | 2020-11-06 | 2023-11-10 | ノバルティス アーゲー | 抗体Fc変異体 |
JP2023549504A (ja) | 2020-11-13 | 2023-11-27 | ノバルティス アーゲー | キメラ抗原受容体(car)発現細胞との組合せ療法 |
WO2022162569A1 (en) | 2021-01-29 | 2022-08-04 | Novartis Ag | Dosage regimes for anti-cd73 and anti-entpd2 antibodies and uses thereof |
TW202304979A (zh) | 2021-04-07 | 2023-02-01 | 瑞士商諾華公司 | 抗TGFβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途 |
AR125874A1 (es) | 2021-05-18 | 2023-08-23 | Novartis Ag | Terapias de combinación |
WO2023044483A2 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-23 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer |
WO2023092004A1 (en) | 2021-11-17 | 2023-05-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders |
WO2023130010A1 (en) | 2021-12-30 | 2023-07-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for attenuating atopic march by administering an il-4/il-13 antagonist |
WO2023150778A1 (en) | 2022-02-07 | 2023-08-10 | Visterra, Inc. | Anti-idiotype antibody molecules and uses thereof |
WO2023220695A2 (en) | 2022-05-13 | 2023-11-16 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer |
WO2024030976A2 (en) | 2022-08-03 | 2024-02-08 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for crossing the blood brain barrier |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007066106A1 (en) * | 2005-12-06 | 2007-06-14 | Domantis Limited | Ligands that have binding specificity for egfr and/or vegf and methods of use therefor |
WO2007082815A1 (en) * | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Ciba Holding Inc. | Multipurpose additive for low voc solvent based coatings |
WO2007085814A1 (en) * | 2006-01-24 | 2007-08-02 | Domantis Limited | Fusion proteins that contain natural junctions |
Family Cites Families (49)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0307434B2 (en) | 1987-03-18 | 1998-07-29 | Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. | Altered antibodies |
US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
DE69233745D1 (de) | 1991-12-02 | 2008-10-23 | Cambridge Antibody Tech | Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken |
US5733743A (en) | 1992-03-24 | 1998-03-31 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
EP0656064B1 (en) * | 1992-08-17 | 1997-03-05 | Genentech, Inc. | Bispecific immunoadhesins |
GB9221657D0 (en) * | 1992-10-15 | 1992-11-25 | Scotgen Ltd | Recombinant bispecific antibodies |
GB9225453D0 (en) * | 1992-12-04 | 1993-01-27 | Medical Res Council | Binding proteins |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
GB9424449D0 (en) | 1994-12-02 | 1995-01-18 | Wellcome Found | Antibodies |
US5702892A (en) | 1995-05-09 | 1997-12-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Phage-display of immunoglobulin heavy chain libraries |
ES2176484T3 (es) | 1995-08-18 | 2002-12-01 | Morphosys Ag | Bancos de proteinas/(poli)peptidos. |
EP1019496B1 (en) | 1997-07-07 | 2004-09-29 | Medical Research Council | In vitro sorting method |
DE19742706B4 (de) | 1997-09-26 | 2013-07-25 | Pieris Proteolab Ag | Lipocalinmuteine |
GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
GB9809839D0 (en) | 1998-05-09 | 1998-07-08 | Glaxo Group Ltd | Antibody |
EP1078051B1 (en) | 1998-05-13 | 2007-12-12 | Domantis Limited | Phage-display system for the selection of correctly folded proteins |
IL127127A0 (en) | 1998-11-18 | 1999-09-22 | Peptor Ltd | Small functional units of antibody heavy chain variable regions |
US6818418B1 (en) | 1998-12-10 | 2004-11-16 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
US7115396B2 (en) | 1998-12-10 | 2006-10-03 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
GB9900298D0 (en) | 1999-01-07 | 1999-02-24 | Medical Res Council | Optical sorting method |
EP1252319A2 (en) | 2000-02-03 | 2002-10-30 | Domantis Limited | Combinatorial protein domains |
US6846486B1 (en) * | 2000-02-24 | 2005-01-25 | Advanced Biotherapy Concepts, Inc. | Method of treating allergy by administering an anti-histamine antibody |
IL151853A0 (en) * | 2000-04-11 | 2003-04-10 | Genentech Inc | Multivalent antibodies and uses therefor |
CA2421447C (en) | 2000-09-08 | 2012-05-08 | Universitat Zurich | Collections of repeat proteins comprising repeat modules |
WO2002092771A2 (en) | 2001-05-11 | 2002-11-21 | Ludwig Institute For Cancer Research | Specific binding proteins and uses thereof |
EP2281837B1 (en) | 2001-08-10 | 2016-10-05 | Aberdeen University | Antigen binding domains from fish |
US20050142539A1 (en) * | 2002-01-14 | 2005-06-30 | William Herman | Targeted ligands |
US7317091B2 (en) * | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
US7993650B2 (en) | 2003-07-04 | 2011-08-09 | Affibody Ab | Polypeptides having binding affinity for HER2 |
AU2003275958A1 (en) | 2003-08-25 | 2005-03-10 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of tear lipocalin |
CA2552435A1 (en) | 2003-12-05 | 2005-06-23 | Compound Therapeutics, Inc. | Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors |
US7767792B2 (en) | 2004-02-20 | 2010-08-03 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Antibodies to EGF receptor epitope peptides |
AR049390A1 (es) * | 2004-06-09 | 2006-07-26 | Wyeth Corp | Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos |
ZA200701656B (en) | 2004-08-05 | 2008-09-25 | Genentech Inc | Humanized anti-cment antagonists |
US7563612B2 (en) * | 2004-09-27 | 2009-07-21 | Cornell Research Foundation, Inc. | Recombinant bifunctional protein of human lutropin receptor and human chorionic gonadotropin B-subunit and uses thereof |
MY169746A (en) | 2005-08-19 | 2019-05-14 | Abbvie Inc | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
US7612181B2 (en) * | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
US7820165B2 (en) * | 2005-11-21 | 2010-10-26 | Merck Serono, S.A. | Compositions and methods of producing hybrid antigen binding molecules and uses thereof |
KR20080090406A (ko) | 2005-11-28 | 2008-10-08 | 젠맵 에이/에스 | 재조합 1가 항체 및 그의 제조 방법 |
JP2009526857A (ja) | 2006-02-15 | 2009-07-23 | イムクローン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 機能性抗体 |
JP2009529339A (ja) * | 2006-03-13 | 2009-08-20 | アブリンクス エン.ヴェー. | Il−6を標的とするアミノ酸配列およびそれを含みil−6介在シグナル伝達に関連する疾患および疾病を治療するポリペプチド |
EP1958957A1 (en) | 2007-02-16 | 2008-08-20 | NascaCell Technologies AG | Polypeptide comprising a knottin protein moiety |
CN101802197A (zh) * | 2007-05-14 | 2010-08-11 | 比奥根艾迪克Ma公司 | 单链FC(ScFc)区、包含其的结合多肽及与其相关的方法 |
EP2050764A1 (en) * | 2007-10-15 | 2009-04-22 | sanofi-aventis | Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof |
GB2468232B (en) * | 2007-11-30 | 2012-10-24 | Glaxo Group Ltd | Antigen-bindng constructs |
US8524244B2 (en) * | 2008-02-14 | 2013-09-03 | Bristol-Myers Squibb Company | Targeted therapeutics based on engineered proteins that bind EGFR |
ES2813398T3 (es) * | 2009-10-20 | 2021-03-23 | Abbvie Inc | Aislamiento y purificación de anticuerpos anti-IL-13 usando cromatografía de afinidad a Proteína A |
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2015
- 2015-06-15 US US14/739,099 patent/US20160207993A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007066106A1 (en) * | 2005-12-06 | 2007-06-14 | Domantis Limited | Ligands that have binding specificity for egfr and/or vegf and methods of use therefor |
WO2007082815A1 (en) * | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Ciba Holding Inc. | Multipurpose additive for low voc solvent based coatings |
WO2007085814A1 (en) * | 2006-01-24 | 2007-08-02 | Domantis Limited | Fusion proteins that contain natural junctions |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6013029654; Journal of Immunological Methods Vol.318, 200701, p.65-74 * |
Cited By (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012509658A (ja) * | 2008-11-26 | 2012-04-26 | グラクソ グループ リミテッド | Il−13に結合するリガンド |
JP2015522525A (ja) * | 2012-05-10 | 2015-08-06 | ザイムワークス,インコーポレイテッド | Fcドメインに突然変異を有する免疫グロブリン重鎖のヘテロ多量体構築物 |
JP2020202829A (ja) * | 2013-02-26 | 2020-12-24 | ロシュ グリクアート アーゲー | 二重特異性t細胞活性化抗原結合分子 |
JP7057801B2 (ja) | 2013-02-26 | 2022-04-20 | ロシュ グリクアート アーゲー | 二重特異性t細胞活性化抗原結合分子 |
JP2015024994A (ja) * | 2013-07-26 | 2015-02-05 | 三星電子株式会社Samsung Electronics Co.,Ltd. | DARPinを含む二重特異キメラ蛋白質 |
US11459384B2 (en) | 2015-08-24 | 2022-10-04 | Glaxosmithkline Intellectual Property (No. 2) Limited | Biopharmaceutical compositions |
JP2018526369A (ja) * | 2015-08-24 | 2018-09-13 | グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、(ナンバー2)、リミテッドGlaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited | バイオ医薬組成物 |
JP2020033351A (ja) * | 2015-08-24 | 2020-03-05 | グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、(ナンバー2)、リミテッドGlaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited | バイオ医薬組成物 |
JP7463070B2 (ja) | 2015-08-24 | 2024-04-08 | グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、(ナンバー2)、リミテッド | バイオ医薬組成物 |
US11299541B2 (en) | 2015-08-24 | 2022-04-12 | Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited | Biopharmaceutical compositions |
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US11274148B2 (en) | 2015-08-24 | 2022-03-15 | Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited | Biopharmaceutical compositions |
JP2018533017A (ja) * | 2015-10-02 | 2018-11-08 | ティージーアール バイオサイエンシス ピーティーワイ エルティーディー. | 多基体による検体検出 |
US11345736B2 (en) | 2016-02-26 | 2022-05-31 | Imunexus Therapeutics Limited | Multi-specific molecules |
JP2019510812A (ja) * | 2016-02-26 | 2019-04-18 | イミュネクサス・ピーティーワイ・リミテッド | 多重特異性分子 |
JP7115991B2 (ja) | 2016-07-20 | 2022-08-09 | ナンジン レジェンド バイオテック カンパニー,リミテッド | 多重特異性抗原結合タンパク質及びその使用方法 |
JP2019524693A (ja) * | 2016-07-20 | 2019-09-05 | ナンジン レジェンド バイオテック カンパニー,リミテッドNanjing Legend Biotech Co.,Ltd. | 多重特異性抗原結合タンパク質及びその使用方法 |
JP2021502801A (ja) * | 2017-09-29 | 2021-02-04 | 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 | Il−5抗体、その抗原結合フラグメント、およびそれらの医薬適用 |
JP7307720B2 (ja) | 2017-09-29 | 2023-07-12 | 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 | Il-5抗体、その抗原結合フラグメント、およびそれらの医薬適用 |
US11905327B2 (en) | 2017-12-28 | 2024-02-20 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Single-domain antibodies and variants thereof against TIGIT |
JP2021510521A (ja) * | 2018-01-15 | 2021-04-30 | ナンジン レジェンド バイオテック カンパニー,リミテッドNanjing Legend Biotech Co.,Ltd. | Pd−1に対する単一ドメイン抗体及びその変異体 |
US11713353B2 (en) | 2018-01-15 | 2023-08-01 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Single-domain antibodies and variants thereof against PD-1 |
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