ES2842895T3 - Anticuerpos humanizados contra LIV-1 y uso de los mismos para tratar el cáncer - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo humanizado contra LIV-1 que comprende una región variable de cadena pesada madura que comprende las tres CDR de Kabat de la SEQ ID NO: 53 y que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 53 siempre que la posición H27 esté ocupada por L, la posición H29 esté ocupada por I, la posición H30 esté ocupada por E y la posición H94 esté ocupada por V y una región variable de cadena ligera madura que comprende las tres CDR de Kabat de la SEQ ID NO: 60 y que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 60 siempre que la posición L36 esté ocupada por Y y la posición L46 esté ocupada por P.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos humanizados contra LIV-1 y uso de los mismos para tratar el cáncer
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud no es provisional y reclama el beneficio de 61/420.291, presentada el lunes, 6 de diciembre de 2010, y 61/446.990, presentada el viernes, 25 de febrero de 2011.
Antecedentes
LIV-1 es un miembro de la subfamilia de proteínas transportadoras de zinc LZT (transportadores de zinc LIV-1-ZIP). Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 1611:16-30 (2003). El análisis informático de la proteína LIV-1 revela un posible motivo de metaloproteasa, que se ajusta a la secuencia de consenso para el motivo catalítico del sitio de unión a zinc de la metaloproteasa de zinc. El ARNm de LIV-1 se expresa principalmente en el tejido de la mama, próstata, glándula pituitaria y cerebro.
La proteína LIV-1 también se ha relacionado con determinadas afecciones cancerosas, por ejemplo, cáncer de mama y cáncer de próstata. La detección de LIV-1 está asociada con el cáncer de mama con receptor de estrógeno positivo, McClelland et al., Br. J. Cancer 77:1653-1656 (1998), y la diseminación metastásica de estos cánceres a los ganglios linfáticos regionales. Manninget al., Eur. J. Cancer 30A:675-678 (1994).
Los anticuerpos contra Liv-1 se conocen por los documentos WO2004067564 y US2008171039.
Sumario
La materia objeto de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.
La divulgación proporciona un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 53 siempre que la posición H27 esté ocupada por L, la posición H29 esté ocupada por I, H30 por E y H94 por V y una región variable de cadena ligera madura al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 60 siempre que la posición L36 esté ocupada por Y y la posición L46 por P. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado comprende tres CDR de la SEQ ID NO: 53 y tres c Dr de la SEQ ID NO: 60. Estas CDR se muestran en la Figura 16. Opcionalmente, la posición H76 está ocupada por N. Opcionalmente, el humanizado comprende una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 53 y una región variable de cadena ligera madura al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 60. Opcionalmente, la región variable de cadena pesada madura se fusiona con una región constante de cadena pesada y la región variable de cadena ligera madura se fusiona con una región constante de cadena ligera. Opcionalmente, la región constante de cadena pesada es una forma mutante de la región constante humana natural que tiene una unión reducida a un receptor Fcgamma en relación con la región constante humana natural. Opcionalmente, la región constante de cadena pesada es del isotipo IgG1. Opcionalmente, la región constante de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 44 y la región constante de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 42. Opcionalmente, la región constante de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 46 (S239C) y la región constante de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 42. En algunos de dichos anticuerpos humanizados, cualquier diferencia en las CDR de la región variable de cadena pesada madura y la región variable ligera madura de las SEQ ID NO. 52 y 60 residen, respectivamente, en las posiciones H60-H65. En algunos de dichos anticuerpos humanizados, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos denominada SEQ ID NO: 52 o 53 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos denominada SEQ ID NO: 59 o 60. En algunos de dichos anticuerpos humanizados, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos denominada SEQ ID NO: 53 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos denominada SEQ ID NO: 60. Algunos de dichos anticuerpos humanizados se conjugan con un agente citotóxico o citostático. Algunos de dichos anticuerpos humanizados tienen una constante de asociación para LIV-1 humano o de macaco cangrejero de 0,5 a 2 x 109 M-1.
La divulgación también proporciona un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada madura que comprende las tres CDR de Kabat de la SEQ ID NO: 52, en donde la posición H27 está ocupada por L, la posición H29 esté ocupada por I, H30 por E, H76 por N, y H94 por V y una región variable de cadena ligera madura que comprende las tres CDR de Kabat de la SEQ ID NO: 60 siempre que la posición L36 esté ocupada por Y y la posición L46 por P. La divulgación también proporciona un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada madura y/o una región variable de cadena ligera madura de cualquiera de los anticuerpos humanizados definidos anteriormente.
La divulgación proporciona además un método para tratar a un paciente que tiene o está en riesgo de padecer cáncer, que comprende administrar al paciente un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos humanizados definidos anteriormente. El cáncer puede ser, por ejemplo, un cáncer de mama, cáncer de cuello de útero, melanoma o un cáncer de próstata.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado de la invención.
La divulgación proporciona además métodos para tratar a un sujeto afectado por un melanoma que expresa la proteína LIV-1 mediante la administración al sujeto de un anticuerpo específico de LIV-1 o un conjugado de fármaco-anticuerpo LIV-1, en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento de las células cancerosas de melanoma.
La divulgación proporciona además métodos para tratar a un sujeto afectado por un cáncer de cuello del útero que expresa la proteína LIV-1 mediante la administración al sujeto de un anticuerpo específico de LIV-1 o un conjugado de fármaco-anticuerpo LIV-1, en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento de las células cancerosas del cuello uterino.
La divulgación proporciona además un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a HB (SEQ ID NO: 10) y una región variable de cadena ligera madura al menos un 90 % idéntica a LB (SEQ ID NO: 15). Opcionalmente, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a HB y una región variable de cadena ligera madura al menos un 95 % idéntica a LB. Opcionalmente, en cualquier anticuerpo de este tipo, las posiciones H29, H30 y H76 están ocupadas por I, E y N, y L36 está ocupada por Y. Opcionalmente, cualquier diferencia en los marcos de la región variable de la región variable de cadena pesada madura y la SEQ ID NO: 10 se selecciona(n) del grupo que consiste en H27 ocupada por F, H28 ocupada por N, H48 ocupada por I, H66 ocupada por K, H67 ocupada por A, H71 ocupada por A, H76 ocupada por N, H93 ocupada por N, H94 ocupada por V, L37 ocupada por L, L39 ocupada por K, L45 ocupada por K y L46 ocupada por L. Opcionalmente, las 3 CDR de la región variable de cadena pesada madura son aquellas de SEQ ID NO. 10 y las 3 CDR de la región variable de cadena ligera madura son aquellas de SEQ ID NO: 15. Las CDR se muestran en la Figura 1. Opcionalmente, la región variable de cadena pesada madura se fusiona con una región constante de cadena pesada y la región variable de cadena ligera madura se fusiona con una región constante de cadena ligera. Opcionalmente, la región constante de cadena pesada es una forma mutante de la región constante humana natural que tiene una unión reducida a un receptor Fcgamma en relación con la región constante humana natural. Opcionalmente, la región constante de cadena pesada es del isotipo IgG1. Opcionalmente, la región constante de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 6 y la región constante de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 4. Opcionalmente, la región constante de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 8 (S239C) y la región constante de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 4. Opcionalmente, cualquier diferencia en las CDR de la región variable de cadena pesada madura y la región variable ligera madura de las SEQ ID NO. 10 y 15 residen, respectivamente, en las posiciones H60-H65. Opcionalmente, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 10 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 15. Opcionalmente, el anticuerpo se conjuga con un agente citotóxico o citostático. Anticuerpos humanizados preferidos tienen mayor afinidad por LIV-1 que el anticuerpo BR2-14a. En otro aspecto, el anticuerpo humanizado tiene una constante de asociación para LIV-1 humana o de macaco cangrejero de 0,5 a 2 x 109 M-1.
La divulgación proporciona además un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada madura que comprende las 3 CDR de la SEQ ID NO: 10 y en donde las posiciones H29, H30 y H76 están ocupadas por I, E y N respectivamente, y una región variable de cadena ligera madura que comprende las 3 CDR de la SEQ ID NO: 15, y en donde la posición L36 está ocupada por Y.
La divulgación proporciona además un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada madura y/o una región variable de cadena ligera madura de cualquiera de los anticuerpos humanizados descritos anteriormente.
La divulgación proporciona además un método para tratar a un paciente que tiene o está en riesgo de padecer cáncer, que comprende administrar al paciente un régimen eficaz de un anticuerpo humanizado como se describió anteriormente. Opcionalmente, el cáncer es cáncer de mama, cáncer de cuello de útero, melanoma o un cáncer de próstata.
La divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado como se describió anteriormente.
La divulgación proporciona además un método para tratar a un paciente que tiene o está en riesgo de cáncer de mama triple negativo, que comprende administrar al paciente un régimen eficaz de un anticuerpo que se une específicamente a LIV-1. Opcionalmente, en dichos métodos, el anticuerpo se conjuga con un agente citotóxico o citostático.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos del AcM murino parental (denominado BR214a) con las regiones variables de cadena pesada (dos paneles superiores) y ligera (dos paneles inferiores) de LIV-1 humanizadas.
La Figura 2 muestra las curvas de unión para los AcM LIV-1 humanizados y el anticuerpo murino parental (denominado BR2-14a).
La Figura 3 muestra los resultados de estudios de unión por competencia de los AcM LIV-1 humanizados y el anticuerpo murino parental (denominado BR2-14a). Los números entre paréntesis después de cada variante indican el número de mutaciones inversas.
La Figura 4 muestra los resultados de estudios de unión por saturación en células MCF7. BR2-14a-AF se refiere al anticuerpo murino parental marcado con AF. hLIV-14 se refiere al anticuerpo HBLB marcado con AF, un anticuerpo humanizado que se une específicamente a LIV-1.
La Figura 5 muestra los resultados de estudios de unión por competencia en células CHO que expresan proteína LIV-1 recombinante. BR2-14a se refiere al anticuerpo murino parental. hLIV-14 HBLB TS se refiere al anticuerpo HBLB. hLIV-14 HBLB S239C se refiere al anticuerpo HBLB que tiene sustituciones de serina por cisteína en esa posición de la cadena pesada.
La Figura 6 muestra un análisis de expresión de la proteína LIV-1 mediante IHC en muestras de pacientes con cáncer de mama posteriores a tratamiento hormonal.
La Figura 7 muestra un análisis de expresión de la proteína LIV-1 mediante IHC en muestras de pacientes con cáncer de próstata metastásico resistente a hormonas.
La Figura 8 muestra un análisis de expresión de la proteína LIV-1 mediante IHC en muestras de pacientes con cáncer de mama triple negativo.
La Figura 9 muestra los resultados de ensayos de citotoxicidad en conjugados de fármaco-anticuerpo hLIV-14, es decir, el AcM HBLB conjugado con vcMMAE (1006) o mcMMAF (1269), así como conjugados de anticuerpos de control murinos (mIgG) y humanos (hIgG). hLIV-14-SEA-1006 se refiere a una forma no fucosilada del AcM HBLB conjugado con vcMMAE (1006).
La Figura 10 muestra los resultados de un ensayo de ADCC in vitro en células MCF7 usando células NK humanas (donante 1; V/V). hLIV-14 TS se refiere al AcM HBLB. hLIV-14 SEA se refiere a la forma no fucosilada del AcM HBLB. hLIV-14 mcMMAF se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco del AcM HBLB conjugado con mcMMAF. hLIV-14 vcMMAE se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco del AcM HBLB conjugado con vcMMAE. hLIV-14 SEA vcMMAE se refiere a una forma no fucosilada del conjugado de anticuerpo-fármaco AcM HBLB-vcMMAE.
La Figura 11 muestra los resultados de un ensayo de ADCC in vitro en células MCF7 utilizando células NK humanas (donante 2). hLIV-14 TS se refiere al AcM HBLB. hLIV-14 SEA se refiere a la forma no fucosilada del AcM HBLB. cLIV-14 SEA se refiere a la forma no fucosilada del anticuerpo murino parental quimérico. hLIV-14 mcF(4) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco del AcM HBLB con un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco mcMMAF por anticuerpo. hLIV-14 vcE(4) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco del AcM HBLB con un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco vcMMAE por anticuerpo. hLIV-14 vcE(4) SEA se refiere a una forma no fucosilada del conjugado de fármaco-anticuerpo AcM HBLB-vcMMAE que tiene un promedio de cuatro moléculas enlazadoras de fármaco vcMMAE por anticuerpo. hIgG se refiere a la IgG humana de control. H00-mcF(4) se refiere a un conjugado de fármaco-anticuerpo de control de un anticuerpo que no se une con un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco mcMMAF por anticuerpo. H00-vcE(4) se refiere a un conjugado de fármaco-anticuerpo de control de un anticuerpo que no se une con un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco vcMMAE por anticuerpo.
La Figura 12 muestra los resultados de un estudio de xenoinjerto de la línea de cáncer de mama MCF7 en ratones atímicos. cLIV-14-mcMMAF(4) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco de la forma quimérica del anticuerpo murino parental que tiene un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco mcMMAF por anticuerpo. cLIV-14-vcMMAE(4) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco de la forma quimérica del anticuerpo murino parental que tiene un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco vcMMAE por anticuerpo. H00-mcMMAF(4) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco de un anticuerpo de control que no se une que tiene un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco mcMMAF por anticuerpo. H00-vcMMAE(4) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco de un anticuerpo de control que no se une que tiene un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco vcMMAE por anticuerpo. La dosis y hora de administración indicada en la figura. La Figura 13 muestra los resultados de un estudio de xenoinjerto de la línea de cáncer de próstata PC3 en ratones atímicos machos. cLIV-14-vcMMAE(4) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco de la forma quimérica del anticuerpo murino parental que tiene un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco vcMMAE por anticuerpo. hBU12-vcMMAE(4) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco de un anticuerpo anti-CD19 que tiene un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco vcMMAE por anticuerpo. La dosis y hora de administración indicada en la figura.
La Figura 14 muestra los resultados de un estudio de xenoinjerto de la línea de cáncer de mama MCF7 en ratones atímicos. hLIV-14-vcMMAE(4) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco del anticuerpo HBLB que tiene un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco vcMMAE por anticuerpo. hLIV-14d-vcMMAE(2) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco del anticuerpo HBLB que tiene un promedio de 2 moléculas enlazadoras de fármaco vcMMAE por anticuerpo, cada una conjugada en la posición S239C de cada cadena pesada. H00-vcMMAE(4) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco de un anticuerpo de control que no se une que tiene un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco vcMMAE por anticuerpo. La dosis y hora de administración indicada en la figura.
La Figura 15 muestra los resultados de un estudio de xenoinjerto de la línea de cáncer de próstata PC3 en ratones atímicos machos. hLIV-14-vcMMAE(4) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco del anticuerpo HBLB que tiene un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco vcMMAE por anticuerpo. hLIV-14-mcMMAF(4) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco del anticuerpo HBLB que tiene un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco mcMMAF por anticuerpo. hLIV-14d-vcMMAE(2) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco del anticuerpo HBLB que tiene un promedio de 2 moléculas enlazadoras de fármaco vcMMAE por anticuerpo, cada una conjugada en la posición S239C de cada cadena pesada. hLIV-14d-mcMMAF(2) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco del anticuerpo HBLB que tiene un promedio de 2 moléculas enlazadoras de fármaco mcMMAF por anticuerpo, cada una conjugada en la posición S239C de cada cadena pesada. H00-vcMMAE(4) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco de un anticuerpo de control que no se une que tiene un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco vcMMAE por anticuerpo. H00-mcMMAF(4) se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco de un anticuerpo de control que no se une que tiene un promedio de 4 moléculas enlazadoras de fármaco mcMMAF por anticuerpo. La dosis y hora de administración indicada en la figura.
Las Figuras 16A y 16B muestran alineaciones de regiones variables maduras de cadena pesada (Figura 16A) y cadena ligera (Figura 16B) humanizadas con las de ratón BR2-22a.
La Figura 17 muestra ensayos de unión por competencia de diferentes permutaciones de cadenas pesadas humanizadas HA-HF y cadenas ligeras humanizadas LA-LF procedentes del anticuerpo monoclonal murino anti LIV-1 BR2-22a. El número total de mutaciones inversas murinas en cada cadena ligera o pesada se muestra entre paréntesis. Solo HELF mostró suficiente retención de unión.
La Figura 18 muestra una variación sistemática de las cadenas HE y LF para probar la contribución de las mutaciones inversas individuales a la unión a antígeno. Los sitios de posible hipermutación somática están entre paréntesis. Los restos de ratón están subrayados. Los restos restantes son restos de la línea germinal humana. La Figura 19 muestra la unión por competencia de las variantes LF en la parte superior de la figura. Las mutaciones inversas probadas se muestran en la parte inferior de la figura. Los restos de ratón están subrayados. Los restos restantes son restos de la línea germinal humana.
La Figura 20 muestra la unión por competencia de las variantes HE en la parte superior de la figura. Las mutaciones inversas probadas se muestran en la parte inferior de la figura. Los restos de ratón están subrayados. Los restos restantes son restos de la línea germinal humana.
La Figura 21 muestra la unión por competencia de diferentes permutaciones de HE, HF, HG y LF y LG.
La Figura 22 muestra la unión por saturación del anticuerpo LIV14 humanizado y el anticuerpo LIV22 humanizado en LIV-1 humana y de macaco cangrejero expresada a partir de células CHO.
La Figura 23 muestra actividad citotóxica de LIV22-vcMMAE humanizado en células MCF-7 después de 144 horas de tratamiento. h00-1006 es un anticuerpo de control conjugado con un fármaco.
La Figura 24 muestra actividad citotóxica de hLIV22-mcMMAF en células MCF-7 después de 144 horas de tratamiento. h00-1269 es un anticuerpo de control conjugado con un fármaco.
La Figura 25 muestra la actividad del anticuerpo hLIV22 en el modelo de carcinoma de próstata PC3 (DSMZ) en ratones atímicos hembra. Los días de dosis se indican mediante triángulos en el eje X.
La Figura 26 muestra esa actividad del anticuerpo hLIV22 sobre tumores de carcinoma de mama MCF7 (NCI) en ratones atímicos.
La Figura 27 compara la actividad de hLIV22 y hLIV14 en el mismo modelo que la Figura 26.
La Figura 28 muestra un análisis de expresión de la proteína LIV-1 mediante IHC en muestras de pacientes con cáncer de melanoma.
Definiciones
Los anticuerpos monoclonales se proporcionan normalmente en forma aislada. Esto significa que un anticuerpo es normalmente al menos un 50 % p/p puro de proteínas interferentes y otros contaminantes que surgen de su producción o purificación, pero no excluye la posibilidad de que el anticuerpo monoclonal se combine con un exceso de vehículo(s) farmacéuticamente aceptable(s) u otro vehículo destinado a facilitar su uso. A veces, los anticuerpos monoclonales son al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 o 99 % p/p puros de proteínas interferentes y contaminantes de la producción o purificación.
La unión específica de un anticuerpo monoclonal a su antígeno diana significa una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109, o 1010 M-1. La unión específica es, de manera detectable, de mayor magnitud y se puede distinguir de la unión no específica que se produce en al menos una diana no relacionada. La unión específica puede ser el resultado de la formación de enlaces entre grupos funcionales particulares o un ajuste espacial particular (por ejemplo, tipo cerradura y llave), mientras que la unión no específica suele ser el resultado de fuerzas de van der Waals. Sin embargo, la unión específica no implica necesariamente que un anticuerpo monoclonal se una a una y solo una diana.
La unidad estructural básica del anticuerpo es un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero incluye dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. Esta región variable se expresa inicialmente unida a un péptido señal escindible. La región variable sin el péptido señal a veces se denomina región variable madura. Por tanto, por ejemplo, una región variable madura de cadena ligera, significa una región variable de cadena ligera sin el péptido señal de cadena ligera. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora.
Las cadenas ligeras se clasifican en kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isotipo de anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de cadenas ligeras y pesadas, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. (Véase generalmente, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y., 1989, cap. 7).
Las regiones variables maduras de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión a anticuerpo. Por tanto, un anticuerpo inalterado tiene dos sitios de unión. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son los mismos. Todas las cadenas muestran la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también determinadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean mediante las regiones marco, lo que permite la unión a un epítopo específico. De N-terminal a C-terminal, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de los aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1987 y 1991)) o Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989). Kabat también proporciona una convención de numeración ampliamente utilizada (numeración de Kabat) en la que se asigna el mismo número a los restos correspondientes entre diferentes cadenas pesadas o entre diferentes cadenas ligeras.
El término "anticuerpo" incluye anticuerpos inalterados y fragmentos de unión de los mismos. Normalmente, los fragmentos de anticuerpo compiten con el anticuerpo inalterado del que proceden por la unión específica a la diana, incluyendo las cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras Fab, Fab', F(ab')2 , F(ab)c, diacuerpos, Dab, nanocuerpos y Fv. Los fragmentos pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante separación enzimática o química de inmunoglobulinas inalteradas. El término "anticuerpo" también incluye un diacuerpo (fragmento Fv homodimérico) o un minicuerpo (Vl-Vh-Ch3), un anticuerpo biespecífico o similar. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes (véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)). El término "anticuerpo" incluye un anticuerpo por sí mismo (anticuerpo no marcado) o un anticuerpo conjugado con un fármaco citotóxico o citostático.
El término "epítopo" se refiere a un sitio sobre un antígeno al que se une un anticuerpo. Un epítopo pueden formarse a partir de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una o más proteínas. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente están preservados frente a la exposición a disolventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario normalmente se pierden tras el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, en Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).
Los anticuerpos que reconocen los mismos epítopos o epítopos solapantes pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para competir por la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana. El epítopo de un anticuerpo también puede definirse mediante cristalografía de rayos X del anticuerpo unido a su antígeno para identificar restos de contacto. Alternativamente, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos solapantes si algunas mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
La competencia entre anticuerpos se determina mediante un ensayo en el que un anticuerpo en prueba inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res.
50:1495, 1990). Un anticuerpo de prueba compite con un anticuerpo de referencia si un exceso de un anticuerpo de prueba (por ejemplo, al menos 2x, 5x, 10x, 20x o 100x) inhibe la unión del anticuerpo de referencia en al menos un 50 % pero preferentemente un 75 %, 90 % o 99 %, según se mide en un ensayo de unión por competencia. Los anticuerpos identificados mediante ensayo por competencia (anticuerpos competidores) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo unido mediante el anticuerpo de referencia para que se produzca un impedimento estérico.
El término "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.
Con el fin de clasificar las sustituciones de aminoácidos como conservadoras o no conservadoras, los aminoácidos se agrupan de la siguiente manera: Grupo I (cadenas laterales hidrófobas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (restos que influyen en la orientación de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras implican sustituciones entre aminoácidos de la misma clase. Las sustituciones no conservadoras constituyen el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra.
El porcentaje de identidades de secuencia se determinan con secuencias de anticuerpos alineadas al máximo mediante la convención de numeración de Kabat. Después de la alineación, si se compara una región de anticuerpo en cuestión (por ejemplo, la región variable madura completa de una cadena pesada o ligera) con la misma región de un anticuerpo de referencia, el porcentaje de identidad de secuencia entre las regiones del anticuerpo sujeto y de referencia es el número de posiciones ocupadas por el mismo aminoácido en la región del anticuerpo sujeto y de referencia dividido por el número total de posiciones alineadas de las dos regiones, con huecos no contados, multiplicado por 100 para convertir a porcentaje.
Las composiciones o métodos "que comprenden" uno o más elementos enumerados pueden incluir otros elementos no enumerados específicamente. Por ejemplo, una composición que comprende un anticuerpo puede contener el anticuerpo solo o en combinación con otros ingredientes.
La designación de un intervalo de valores incluye todos los números enteros dentro o que definen el intervalo.
Una función efectora de anticuerpo se refiere a una función a la que contribuye un dominio(s) Fc de una Ig. Dichas funciones pueden ser, por ejemplo, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos o citotoxicidad dependiente del complemento. Dicha función puede efectuarse mediante, por ejemplo, la unión de un dominio o dominios efectores Fc a un receptor Fc en una célula inmunitaria con actividad fagocítica o lítica o mediante la unión de un dominio o dominios efectores Fc a componentes del sistema del complemento. Normalmente, el efecto o efectos mediados por las células de unión a Fc o componentes del complemento dan como resultado la inhibición y/o agotamiento de la célula dirigida a LIV-1. Las regiones Fc de los anticuerpos pueden reclutar células que expresan el receptor Fc (FcR) y yuxtaponerlas con células diana recubiertas de anticuerpos. Las células que expresan FcR de superficie para IgG, incluyendo FcyRIII (CD16), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD64) pueden actuar como células efectoras para la destrucción de células recubiertas de IgG. Dichas células efectoras incluyen monocitos, macrófagos, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y eosinófilos. La participación de FcyR mediante IgG activa la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) o la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP, por sus siglas en inglés). La ADCC está mediada por células efectoras CD16+ a través de la secreción de proteasas y proteínas formadoras de poros de la membrana, mientras que la fagocitosis está mediada por células efectoras CD32+ y CD64+ (véase Fundamental Immunology, 4a ed., Paul ed., Lippincott-Raven, N.Y., 1997, Capítulos 3, 17 y 30; Uchida et al., 2 0 O4 , J. Exp. Med. 199:1659-69; Akewanlop et al., 2001, Cancer Res. 61:4061-65; Watanabe et al., 1999, Breast Cancer Res. Treat. 53:199-207). Además de la ADCC y la ADCP, las regiones Fc de los anticuerpos unidos a células también pueden activar la ruta clásica del complemento para provocar citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). El C1q del sistema del complemento se une a las regiones Fc de los anticuerpos cuando forman complejos con antígenos. La unión de C1q a anticuerpos unidos a células puede iniciar una cascada de acontecimientos que implican la activación proteolítica de C4 y C2 para generar la C3 convertasa. La escisión de C3 a C3b mediante C3 convertasa permite la activación de componentes del complemento terminal, incluyendo C5b, C6, C7, C8 y C9. En conjunto, estas proteínas forman complejos poros de ataque de la membrana en las células recubiertas de anticuerpos. Estos poros alteran la integridad de la membrana celular, destruyen la célula diana (véase Immunobiology, 6a ed., Janeway et al., Garland Science, N. Y., 2005, Capítulo 2).
La expresión "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o ADCC, es un mecanismo para inducir la muerte celular que depende de la interacción de células diana recubiertas de anticuerpos con células inmunitarias que poseen actividad lítica (también denominadas células efectoras). Dichas células efectoras incluyen linfocitos citolíticos naturales, monocitos/macrófagos y neutrófilos. Las células efectoras se unen a un dominio o dominios efectores Fc de Ig unido a células diana a través de sus sitios de combinación de antígenos. La muerte de la célula diana recubierta de anticuerpo se produce como resultado de la actividad de la célula efectora.
La expresión "fagocitosis celular dependiente de anticuerpos", o ADCP, se refiere al proceso mediante el cual se internalizan células recubiertas de anticuerpos, en su totalidad o en parte, mediante células inmunitarias fagocíticas (por ejemplo, macrófagos, neutrófilos y células dendríticas) que se unen a un dominio(s) efector Fc de Ig.
La expresión "citotoxicidad dependiente del complemento" o CDC, se refiere a un mecanismo para inducir la muerte celular en el que un dominio(s) efector Fc de un anticuerpo unido a la diana activa una serie de reacciones enzimáticas que culminan en la formación de agujeros en la membrana de la célula diana. Normalmente, los complejos de antígenoanticuerpo, tales como los de las células diana recubiertas de anticuerpos, se unen y activan el componente C1q del complemento, que a su vez activa la cascada del complemento que conduce a la muerte de la célula diana. La activación del complemento también puede dar como resultado el depósito de componentes del complemento en la superficie de la célula diana que facilitan la ADCC mediante la unión a los receptores del complemento (por ejemplo, c R3) en los leucocitos.
Un "efecto citotóxico" se refiere al agotamiento, eliminación y/o destrucción de una célula diana. Un "agente citotóxico" se refiere a un agente que tiene un efecto citotóxico en una célula. Los agentes citotóxicos pueden conjugarse con un anticuerpo o administrarse en combinación con un anticuerpo.
Un "efecto citostático" se refiere a la inhibición de la proliferación celular. Un "agente citostático" se refiere a un agente que tiene un efecto citostático en una célula, inhibiendo así el crecimiento y/o expansión de un subconjunto específico de células. Los agentes citostáticos pueden conjugarse con un anticuerpo o administrarse en combinación con un anticuerpo.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado o aprobable por parte de un organismo de control del gobierno federal o estatal, o que está listada en la Farmacopea de Estados Unidos o en otra farmacopea reconocida de forma general para usar en animales y, más particularmente, en seres humanos. La expresión "ingrediente farmacéuticamente compatible" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo farmacéuticamente aceptable con el que se administra un anticuerpo anti-LIV-1.
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable", se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un anticuerpo anti-LIV-1 o conjugado del mismo o agente administrado con un anticuerpo anti-LIV-1. Sales ilustrativas incluyen sales de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato de ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato de ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1,1' metilen bis-(2 hidroxi 3 naftoato)). Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula tal como un ion acetato, un ion succinato u otro contraión. El contraión puede ser cualquier resto orgánico o inorgánico que estabilice la carga del compuesto precursor. Adicionalmente, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Los casos en los que múltiples átomos cargados son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden tener múltiples contraiones. Por tanto, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/ uno o más contraiones.
A menos que resulte evidente de otro modo por el contexto, el término "aproximadamente" abarca valores dentro de una desviación estándar de un valor establecido.
Descripción detallada
I. General
La invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a LIV-1. Los anticuerpos son útiles para el tratamiento y diagnóstico de varios cánceres, así como para detectar LIV-1.
II. Moléculas diana
A menos que se indique de otro modo, LIV-1 significa una LIV-1 humana. A una secuencia humana ilustrativa se le asigna el número de referencia Swiss Prot Q13433. Q13433 se incluye en el presente documento como SEQ ID NO: 83. Se conocen tres isoformas variantes y un polimorfismo. Una segunda versión de la proteína LIV-1 humana, número de referencia AAA96258.2, se incluye en el presente documento como SEQ ID NO: 84. Cuatro dominios extracelulares están unidos mediante los restos 29-325, 377-423, 679-686 y 746-755 de Q13433 respectivamente.
A menos que sea evidente de otra manera a partir de la referencia de contexto, LIV-1 significa al menos un dominio extracelular de la proteína y normalmente la proteína completa distinta de un péptido señal escindible (aminoácidos 1­ 28 de Q13433).
III. Anticuerpos
A. Especificidad de unión y propiedades funcionales
La divulgación proporciona anticuerpos humanizados procedentes de dos anticuerpos de ratón, BR2-14a y BR2-22a. A menos que se indique específicamente de otra manera, las presentes divulgaciones se refieren a ambos anticuerpos. Los dos anticuerpos de ratón muestran un 94 % y un 91 % de identidad de secuencia entre sí en las regiones variables maduras de cadena pesada y ligera. Los dos anticuerpos se unen a los mismos epítopos o epítopos solapantes en LIV-1 humana. Sin embargo, el anticuerpo BR2-22a tiene aproximadamente diez veces más afinidad por LIV-1 humana y aproximadamente 3 veces más afinidad por LIV-1 de macaco cangrejero que BR2-14a como se muestra en la figura 22.
La afinidad de las formas humanizadas del anticuerpo BR2-14a de ratón (es decir, Ka) está preferentemente dentro de un factor de cinco o un factor de dos de la del anticuerpo BR2-14a de ratón por LIV-1 humana. Los anticuerpos BR2-14a humanizados se unen específicamente a LIV-1 humana en forma nativa y/o se expresan de forma recombinante a partir de células CHO como lo hace el anticuerpo de ratón del que proceden. Los anticuerpos BR2-14a humanizados preferidos tienen una afinidad igual o mayor que (es decir, mayor que más allá del margen de error en la medición) la de BR2-14a por la LIV-1 humana (por ejemplo, 1,1-5 veces, 1,1 a 3 veces, 1,5 a 3 veces, 1,7 a 2,3 veces o 1,7-2,1 veces la afinidad o aproximadamente el doble de la afinidad de BR2-14a). Los anticuerpos BR2-14a humanizados preferidos se unen al mismo epítopo y/o compiten con BR2-14a por unirse a LIV-1 humana. Los anticuerpos BR2-14a humanizados preferidos también se unen al homólogo de LIV-1 de macaco cangrejero, lo que permite realizar pruebas clínicas previas en primates no humanos.
La afinidad de las formas humanizadas del anticuerpo BR2-22a de ratón (es decir, Ka) por la LIV-1 humana, expresada de forma nativa o expresada a partir de células c Ho , está preferentemente dentro de un factor de cinco o un factor de dos de la del anticuerpo BR2-22 de ratón. Algunos anticuerpos BR2-22a humanizados tienen una constante de asociación que es esencialmente la misma que la de BR2-22a (es decir, dentro del error experimental). Algunos anticuerpos BR2-22a humanizados tienen una constante de asociación dentro de un intervalo de 0,5 a 1 o 0,5-1,5 de la constante de asociación del anticuerpo BR2-22a. Los anticuerpos BR2-22a humanizados preferidos tienen una constante de asociación superior a 5 x108 M-1, o en un intervalo de 0,5 a 2 x 109 M'1 o aproximadamente de 0,8 x109 M'1 (+/- error en la medición) para LIV-1 humana expresada a partir de células CHO. En el presente documento como en otras partes de esta solicitud, las afinidades se pueden medir de acuerdo con los métodos de los Ejemplos. Los anticuerpos BR2-22a humanizados preferidos se unen al mismo epítopo y/o compiten con BR2-22a por unirse a LIV-1 humana. Los anticuerpos BR2-22a humanizados se unen al homólogo de LIV-1 de macaco cangrejero así como a la LIV-1 humana. Los anticuerpos BR2-22a humanizados preferidos se unen esencialmente con la misma constante de asociación a LIV-1 humana y de macaco cangrejero, ambas expresadas a partir de células CHO (dentro del error experimental), lo que permite y aumenta la precisión predictiva de pruebas clínicas previa en primates no humanos.
Los anticuerpos preferidos (tanto BR2-14a humanizados como BR2-22a humanizados) inhiben el cáncer (por ejemplo, crecimiento de células, metástasis y/o letalidad para los organismos) como se muestra en células cancerosas que se propagan en cultivo, en un modelo animal o ensayo clínico. Pueden formarse modelos animales mediante el implante de líneas celulares tumorales humanas que expresan LIV-1 en cepas de roedores inmunodeficientes apropiadas, por ejemplo, ratones atímicos desnudos o ratones SCID. Estas líneas de células tumorales pueden establecerse en hospedadores roedores inmunodeficientes como tumor sólido mediante inyecciones subcutáneas o como tumores diseminados mediante inyecciones intravenosas. Una vez establecido dentro de un hospedador, estos modelos tumorales se pueden aplicar para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos anti-LIV-1 o formas conjugadas de los mismos como se describe en los Ejemplos.
B. Anticuerpos humanizados
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo modificado genéticamente en el que las CDR de un anticuerpo "donante" no humano se injertan en secuencias de anticuerpo "aceptor" humano (véase, por ejemplo, Queen, documentos US 5.530.101 y 5.585.089; Winter, documento US 5.225.539; Carter, documento US 6.407.213; Adair, documento US 5.859.205; y Foote, documento US 6.881.557). Las secuencias de anticuerpos aceptores pueden ser, por ejemplo, una secuencia de anticuerpos humanos maduros, un compuesto de dichas secuencias, una secuencia consenso de secuencias de anticuerpos humanos o una secuencia de región de la línea germinal. Una secuencia aceptora preferida para la cadena pesada es el exón Vh de la línea germinal Vh1-2 (también denominada en la bibliografía como HV1-2) (Shin et al., 1991, EMBO J. 10:3641-3645) y para la región de bisagra (Jh), exón Jh-6 (Mattila et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25:2578-2582). Para la cadena ligera, una secuencia aceptora preferida es el exón VK2-30 (también denominado en la bibliografía como KV2-30) y para la región bisagra el exón Jk-4 (Hieter et al., 1982, J. Biol. Chem.
257:1516-1522). Por tanto, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que tiene algunas o todas las CDR total o sustancialmente de un anticuerpo donante y secuencias marco de región variable y regiones constantes, si están presentes, total o sustancialmente a partir de secuencias de anticuerpos humanos. De manera similar, una cadena pesada humanizada tiene al menos una, dos y normalmente las tres CDR total o sustancialmente de una cadena pesada de anticuerpo donante, y una secuencia marco de la región variable de cadena pesada y una región constante de cadena pesada, si están presentes, sustancialmente de un marco de la región variable de cadena pesada humana y secuencias de la región constante. De manera similar, una cadena ligera humanizada tiene al menos una, dos y normalmente las tres CDR total o sustancialmente de una cadena ligera de anticuerpo donante, y una secuencia marco de la región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera, si están presentes, sustancialmente a partir del marco de la región variable de cadena ligera humana y de las secuencias de la región constante. Aparte de nanocuerpos y dAb, un anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada humanizada y una cadena ligera humanizada. Una CDR en un anticuerpo humanizado es sustancialmente de una CDR correspondiente en un anticuerpo no humano cuando al menos un 60 %, 85 %, 90 %, 95 % o el 100 % de los restos correspondientes (según la definición de Kabat) son idénticos entre las respectivas CDR. Las secuencias marco de la región variable de una cadena de anticuerpo o la región constante de una cadena de anticuerpo son sustancialmente de una secuencia marco de la región variable humana o de una región constante humana respectivamente cuando al menos un 85 %, 90 %, 95 % o el 100 % de los restos correspondientes definidos por Kabat son idénticos.
Aunque los anticuerpos humanizados a menudo incorporan las seis CDR (preferentemente según la definición de Kabat) de un anticuerpo de ratón, también se pueden hacer con menos de todas las CDR (por ejemplo, al menos 3, 4 o 5) CDR de un anticuerpo de ratón (por ejemplo, Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432-1441,2000).
Determinados aminoácidos de los restos de marco de región variable humana se pueden seleccionar para sustitución basándose en su posible influencia en la conformación y/o la unión a antígeno de la CDR. La investigación de dichas posibles influencias se realiza mediante modelos, examen de las características de los aminoácidos en ubicaciones concretas o la observación empírica de los efectos de la sustitución o la mutagénesis de aminoácidos particulares.
Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre un resto de marco de región variable murina y un resto de marco de región variable humana seleccionada, puede sustituirse el aminoácido del marco humano por el aminoácido del marco equivalente del anticuerpo de ratón, cuando se espera razonablemente que el aminoácido:
(1) se une de manera no covalente al antígeno de manera directa,
(2) es adyacente a una región CDR,
(3) de otra manera interactúa con una región CDR (por ejemplo, está dentro de aproximadamente 6 A de una región CDR); o
(4) media la interacción entre las cadenas pesada y ligera.
La divulgación proporciona formas humanizadas del anticuerpo BR2-14a de ratón que incluyen cinco regiones variables maduras de cadena pesada humanizadas ejemplificadas (HA-HE) y seis regiones variables maduras de cadena ligera humanizadas ejemplificadas (LA-LF). Las permutaciones de estas cadenas que tienen la unión más fuerte (CE50 más baja) son HBLB, HBLF, HCLB, HCLF, HDLB, HDLF, HELE y HELF. De estas permutaciones, se prefiere HBLB (también conocida como hLIV14) porque tiene la unión más fuerte, aproximadamente 2 veces más fuerte que el anticuerpo donante de ratón y tiene la menor cantidad de mutaciones inversas (cuatro).
La divulgación proporciona variantes del anticuerpo humanizado HBLB en las que la región variable madura de cadena pesada humanizada muestra al menos un 90 %, 95 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 10 y la región variable madura de cadena ligera humanizada muestra al menos un 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 15. Preferentemente, en dichos anticuerpos se retienen algunas o todas las mutaciones inversas en HBLB. En otras palabras, al menos 1, 2 o preferentemente las 3 posiciones de cadena pesada H29, H30 y H76 están ocupados por I, E y N, respectivamente. Asimismo, la posición L36 está ocupada preferentemente por Y. Las regiones CDR de dichos anticuerpos humanizados son preferentemente sustancialmente idénticas a las regiones CDR de HBLB, que son las mismas que las del anticuerpo donante de ratón. Las regiones CDR pueden definirse mediante cualquier definición convencional (por ejemplo, Chothia) pero son preferentemente las definidas por Kabat. En un aspecto, el anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada que comprende las 3 CDR de la SEQ ID NO: 10 y marcos de la región variable con al menos un 95 % de identidad con los marcos de la región variable de la SEQ ID NO: 10. En otro aspecto, el anticuerpo humanizado comprende una cadena ligera que comprende las 3 CDR de la SEQ ID NO: 15 y marcos de la región variable con al menos un 95 % de identidad con marcos de la región variable de la SEQ ID NO: 15. En un aspecto adicional, el anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada que comprende las 3 CDR de la SEQ ID NO: 10 y marcos de la región variable con al menos un 95 % de identidad con los marcos de la región variable de la SEQ ID NO: 10, y una cadena ligera que comprende las 3 CDR de la SEQ ID NO: 15, y marcos de la región variable con al menos un 95 % de identidad con los marco de la región variable de la SEQ ID NO: 15.
En la medida en que los anticuerpos humanizados muestren alguna variación del anticuerpo humanizado HBLB ejemplificado, una posibilidad para dicha variación adicional son las mutaciones inversas adicionales en los marcos de la región variable. También se puede hacer cualquiera o todas las posiciones mutadas de manera inversa en otras regiones variables maduras de cadena ligera o pesada humanizadas ejemplificadas (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o las 9 de H27 ocupada por F, H28 ocupada por N, H48 ocupada por I, H66 ocupada por K, H67 ocupada por A, H71 ocupada por A, H76 ocupada por N, H93 ocupada por N y H94 ocupada por V en la cadena pesada y 1, 2, 3, 4 o las 5 de L37 ocupada por L, L39 ocupada por K, L45 ocupada por K y L46 ocupada por L en la cadena ligera. Sin embargo, dichas mutaciones inversas adicionales no se prefieren porque en general no mejoran la afinidad y la introducción de más restos de ratón puede aumentar el riesgo de inmunogenicidad.
La divulgación proporciona formas humanizadas del anticuerpo BR2-22a de ratón que incluyen tres regiones variables maduras de cadena pesada humanizadas ejemplificadas (HE, HF y HG) y dos cadenas ligeras humanizadas ejemplificadas (LF y lG) que se pueden combinar en diferentes permutaciones con unión adecuada (véase la Figura 21). De estas permutaciones, se prefiere HGLG (también conocida como hLIV22) porque tiene la mejor combinación de propiedades de unión (esencialmente las mismas que el anticuerpo BR2-22a de ratón dentro del error experimental) y la menor cantidad de mutaciones inversas (siete).
La divulgación proporciona variantes del anticuerpo humanizado HGLG en el que la región variable madura de cadena pesada humanizada muestra al menos un 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 53 y la región variable madura de cadena ligera humanizada muestra al menos un 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 60. Preferentemente, en dichos anticuerpos se retienen algunas o todas las mutaciones inversas en HGLG. En otras palabras, al menos 1, 2, 3, 4 o preferentemente las 5 posiciones de cadena pesada H27, H29, H30, H76 y H94 están ocupadas por L, I, E, N y V (aquí, como en otras partes de esta solicitud, la numeración de Kabat se usa para describir posiciones en las regiones variables maduras de cadena pesada y ligera). De estas mutaciones inversas, H94 contribuye la que más a la retención de la afinidad de unión y H76 la que menos. Asimismo, las posiciones L36 y L46 están preferentemente ocupadas por Y y P respectivamente. Las regiones CDR de dichos anticuerpos humanizados son preferentemente sustancialmente idénticas a las regiones CDR de HGLG, que son las mismas que las del anticuerpo donante de ratón. Las regiones CDR pueden definirse mediante cualquier definición convencional (por ejemplo, Chothia) pero son preferentemente las definidas por Kabat. En una realización, el anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada que comprende las 3 CDR de la SEQ ID NO: 53 y marcos de la región variable con al menos un 95 % de identidad con los marcos de la región variable de la SEQ ID NO: 53, y una cadena ligera que comprende las 3 CDR de la SEQ ID NO: 60, y marcos de la región variable con al menos un 95 % de identidad con los marco de la región variable de la SEQ ID NO: 60.
En la medida en que los anticuerpos BR2-22a humanizados muestren cualquier variación del anticuerpo humanizado HGLG ejemplificado, una posibilidad para dicha variación adicional son las mutaciones inversas adicionales en los marcos de la región variable. También se puede hacer cualquiera o todas las posiciones mutadas de manera inversa en otras regiones variables maduras de cadena ligera o pesada humanizadas ejemplificadas (es decir, 1, 2, 3, 4, 5 o las 6, de H28 ocupada por N, H48 ocupada por I, H66 ocupada por K, H67 ocupada por A, H71 ocupada por A, H93 ocupada por T en la cadena pesada y 1 o, 2 de L37 ocupada por L37, y L45 ocupada por K. Sin embargo, dichas mutaciones inversas adicionales no se prefieren porque en general no mejoran la afinidad y la introducción de más restos de ratón puede aumentar el riesgo de inmunogenicidad.
Otra posible variación es sustituir determinados restos en las CDR del anticuerpo de ratón con los restos correspondientes de las secuencias de las CDR humanas, normalmente de las CDR de las secuencias aceptoras humanas utilizadas en el diseño de los anticuerpos humanizados ejemplificados. En algunos anticuerpos, solo parte de las CDR, a saber, el subconjunto de restos de CDR necesarios para la unión, denominados SDR, son necesarios para retener la unión en un anticuerpo humanizado. Los restos de CDR que no entran en contacto con el antígeno y que no están en los SDR se pueden identificar basándose en estudios previos (por ejemplo, los restos H60-H65 en CDR H2 a menudo no son necesarios), de regiones de CDR de Kabat que se encuentran fuera de los bucles hipervariables de Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), mediante modelado molecular y/o empíricamente, o como se describe en Gonzales etal., Mol. Immunol. 41: 863 (2004). En dichos anticuerpos humanizados en posiciones en las que uno o más restos de CDR de donante están ausentes o en las que se omite una CDR de donante completa, el aminoácido que ocupa la posición puede ser un aminoácido que ocupa la posición correspondiente (por numeración de Kabat) en la secuencia del anticuerpo aceptor. El número de dichas sustituciones de aminoácidos aceptores por donantes en las CDR a incluir refleja un equilibrio de consideraciones por competencia. Dichas sustituciones son potencialmente ventajosas para disminuir el número de aminoácidos de ratón en un anticuerpo humanizado y, en consecuencia, disminuyen la posible inmunogenicidad. Sin embargo, las sustituciones también pueden provocar cambios de afinidad, y preferentemente se evitan reducciones significativas en la afinidad. En una variación adicional, uno o más restos en una CDR de un anticuerpo BR2-22a humanizado (que de otro modo sería la misma que la CDR del anticuerpo BR2-22a de ratón) se pueden reemplazar por los restos correspondientes de una CDR del anticuerpo BR2-14a de ratón (o viceversa). Las posiciones para la sustitución dentro de CDR y los aminoácidos a sustituir también pueden seleccionarse empíricamente.
Aunque no se pueden hacer otras sustituciones de aminoácidos preferidas, por ejemplo, en restos de marco que no están en contacto con las CDR, o incluso algunos posibles aminoácidos de restos en contacto con las CDR dentro de las CDR. A menudo, los reemplazos realizados en las secuencias humanizadas variantes son conservadores con respecto a los aminoácidos HBLB reemplazados (en el caso de BR2-14a humanizado) o aminoácidos HGLG (en el caso de BR2-22 humanizado). Preferentemente, los reemplazos relativos a HBLB o HGLG (sean o no conservadores) no tienen un efecto sustancial sobre la afinidad o potencia de unión del AcM humanizado, es decir, su capacidad para unirse a LIV-1 humana e inhibir el crecimiento de células cancerosas.
Las variantes normalmente difieren de las secuencias de región variable madura de cadena pesada y ligera de HBLB (hLIV14) o HGLG (hLIV22) en un pequeño número (por ejemplo, normalmente no más de 1, 2, 3, 5 o 10 en la región variable madura de cadena ligera o pesada cadena, o ambas) de reemplazos, eliminaciones o inserciones.
C. Selección de región constante
Las regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos humanizados se pueden unir a al menos una parte de una región constante humana. La elección de la región constante depende, en parte, de si se desea citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos y/o citotoxicidad dependiente del complemento. Por ejemplo, los isótopos humanos IgG1 e IgG3 tienen una fuerte citotoxicidad dependiente del complemento, el isotipo humano IgG2 tiene citotoxicidad dependiente del complemento débil e IgG4 humana carece de citotoxicidad dependiente del complemento. Las IgG1 e IgG3 humanas también inducen funciones efectoras mediadas por células más fuertes que las IgG2 e IgG4 humanas. Las regiones constantes de cadena ligera pueden ser lambda o kappa. Los anticuerpos pueden expresarse en forma de tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, en forma de cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, en forma de Fab, Fab', F(ab')2 y Fv o en forma de anticuerpos monocatenarios en los que los dominios variables de cadena pesada y ligera están unidos a través de un separador.
Las regiones constantes humanas muestran variación alotípica y variación isoalotípica entre diferentes individuos, es decir, las regiones constantes pueden diferir en diferentes individuos en una o más posiciones polimórficas. Los isoalotipos difieren de los alotipos en que los sueros que reconocen un isoalotipo se unen a una región no polimórfica de uno o más de otros isotipos.
Uno o varios aminoácidos en el extremo amino o carboxilo de la cadena ligera y/o pesada, tal como la lisina C-terminal de la cadena pesada, pueden faltar o derivatizarse en una proporción o en todas las moléculas. Se pueden realizar sustituciones en las regiones constantes para reducir o aumentar la función efectora, tal como la citotoxicidad mediada por el complemento o ADCC (véanse, por ejemplo, Winter et al., la patente de Estados Unidos n.° 5.624.821; Tso et al., la patente de Estados Unidos n.° 5.834.597; y Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), o para prolongar la semivida en seres humanos (véase, por ejemplo, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004).
Una sustitución ilustrativa incluye la sustitución de aminoácidos del aminoácido nativo por un resto de cisteína que se introduce en la posición de aminoácido 234, 235, 237, 239, 267, 298, 299, 326, 330 o 332, preferentemente una mutación S239C en un isotipo IgG1 humano (documento US 20100158909). La presencia de un resto de cisteína adicional permite la formación de enlaces disulfuro entre cadenas. Dicha formación de enlaces disulfuro entre cadenas puede causar un impedimento estérico, reduciendo así la afinidad de la interacción de unión de la región Fc-FcyR. El resto o restos de cisteína introducidos en o cerca de la región Fc de una región constante de IgG también pueden servir como sitios para la conjugación con agentes terapéuticos (es decir, acoplando fármacos citotóxicos usando reactivos específicos de tiol tales como derivados de fármacos maleimidas. La presencia de un agente terapéutico provoca impedimento estérico, reduciendo así aún más la afinidad de la interacción de unión de la región Fc-FcyR. Otras sustituciones en cualquiera de las posiciones 234, 235, 236 y/o 237 reducen la afinidad por los receptores Fcy, particularmente por el receptor FcyRI (véase, por ejemplo, los documentos US 6.624.821, US 5.624.821).
La semivida in vivo de un anticuerpo también puede afectar sus funciones efectoras. La semivida de un anticuerpo se puede aumentar o disminuir para modificar sus actividades terapéuticas. El FcRn es un receptor que es estructuralmente similar al antígeno del MHC de clase I que se asocia de forma no covalente con la p2-microglobulina. FcRn regula el catabolismo de las IgG y su transcitosis a través de los tejidos (Ghetie y Ward, 2000, Annu. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie y Ward, 2002, Immunol. Res. 25:97-113). La interacción IgG-FcRn tiene lugar a pH 6,0 (pH de vesículas intracelulares) pero no a pH 7,4 (pH de sangre); esta interacción permite que las IgG se reciclen de nuevo a la circulación (Ghetie y Ward, 2000, Ann. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie y Ward, 2002, Immunol. Res.
25:97-113). Se ha mapeado la región de la IgG1 humana implicada en la unión a FcRn (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). Sustituciones de alanina en las posiciones Pro238, Thr256, Thr307, Gln311, Asp312, Glu380, Glu382 o Asn434 de IgG1 humana mejoran la unión a FcRn (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). Las moléculas de IgG1 que albergan estas sustituciones tienen semividas en suero más prolongadas. Por consiguiente, estas moléculas de IgG1 modificadas son capaces de llevar a cabo sus funciones efectoras y, por tanto, ejercer su eficacia terapéutica, durante un período de tiempo más largo en comparación con IgG1 sin modificar. Otras sustituciones ilustrativas para aumentar la unión a FcRn incluyen un Gln en la posición 250 y/o una Leu en la posición 428. La numeración de la UE se utiliza para todas las posiciones en la región constante.
Los oligosacáridos unidos covalentemente a Asn297 conservado están implicados en la capacidad de la región Fc de una IgG para unirse a FcyR (Lund et al., 1996, J. Immunol. 157:4963-69; Wright y Morrison, 1997, Trends Biotechnol.
15:26-31). La genomanipulación de esta glucoforma en IgG puede mejorar significativamente la ADCC mediada por IgG. La adición de modificaciones de N-acetilglucosamina bisectantes (Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotech. Bioeng. 74:288-94) a esta glucoforma o la eliminación de fucosa (Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-40; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:6591-604; Niwa et al., 2004, Cancer Res.
64:2127-33) de esta glucoforma son dos ejemplos de genomanipulación de Fc de IgG que mejora la unión entre Fc de IgG y FcyR, mejorando así la actividad de ADCC mediada por Ig.
Una sustitución sistémica de los aminoácidos expuestos al disolvente de la región Fc de IgG1 humana ha generado variantes de IgG con afinidades de unión a FcyR alteradas (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). Cuando se compara con la IgG1 parental, un subconjunto de estas variantes que implica sustituciones en Thr256/Ser298, Ser298/Glu333, Ser298/Lys334 o Ser298/Glu333/Lys334 a Ala demuestran un aumento en la afinidad de unión hacia FcyR y la actividad de a Dc C (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604; Okazaki et al., 2004, J. Mol. Biol.
336:1239-49).
La actividad de fijación del complemento de los anticuerpos (tanto la unión a C1q como la actividad de CDC) se puede mejorar mediante sustituciones en Lys326 y Glu333 (Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166:2571-2575). Las mismas sustituciones en una cadena principal de IgG2 humana pueden convertir un isotipo de anticuerpo que se une pobremente a C1q y es severamente deficiente en la actividad de activación del complemento en uno que puede unirse a C1q y mediar la CDC (Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166:2571-75). También se han aplicado varios otros métodos para mejorar la actividad de fijación del complemento de los anticuerpos. Por ejemplo, el injerto de una pieza de cola en el extremo carboxilo de 18 aminoácidos de IgM en el extremo carboxilo de IgG mejora enormemente su actividad CDC. Esto se observa incluso con IgG4, que normalmente no tiene actividad CDC detectable (Smith et al., 1995, J. Immunol. 154:2226-36). Además, la sustitución Ser444 ubicada cerca del extremo carboxilo de la cadena pesada de IgG1 con Cys indujo la dimerización de cola a cola de IgG1 con un aumento de 200 veces de la actividad CDC sobre la IgG1 monomérica (Shopes et al., 1992, J. Immunol. 148:2918-22). Asimismo, una construcción de diacuerpo biespecífica con especificidad para C1q también confiere actividad CDC (Kontermann et al., 1997, Nat. Biotech. 15:629-31).
La actividad del complemento se puede reducir mediante la mutación de al menos uno de los restos de aminoácidos 318, 320 y 322 de la cadena pesada a un resto que tenga una cadena lateral diferente, tal como Ala. Otros restos no iónicos sustituidos con alquilo, tal como Gly, Ile, Leu, o Val, o dichos restos aromáticos no polares como Phe, Tyr, Trp y Pro en lugar de uno cualquiera de los tres restos también reducen o anulan la unión a C1q. Ser, Thr, Cys y Met se pueden usar en los restos 320 y 322, pero no en 318, para reducir o anular la actividad de unión a C1q. El reemplazo del resto 318 (Glu) por un resto polar puede modificar pero no anular la actividad de unión a C1q. El reemplazo del resto 297 (Asn) con Ala da como resultado la eliminación de la actividad lítica pero solo reduce ligeramente (aproximadamente tres veces más débil) la afinidad por C1q. Esta alteración destruye el sitio de glucosilación y la presencia de hidratos de carbono necesarios para la activación del complemento. Cualquier otra sustitución en este sitio también destruye el sitio de glucosilación. Las siguientes mutaciones y cualquier combinación de las mismas también reducen la unión a C1q: D270A, K322A, P329A y P311S (véase el documento WO 06/036291).
La referencia a una región constante humana incluye una región constante con cualquier alotipo natural o cualquier permutación de restos que ocupan posiciones polimórficas en alotipos naturales. Además, pueden estar presentes hasta 1, 2, 5 o 10 mutaciones en relación con una región constante humana natural, tales como las indicadas anteriormente para reducir la unión al receptor Fcgamma o aumentar la unión a FcRN.
D. Expresión de anticuerpos recombinantes
Los anticuerpos humanizados se producen normalmente mediante expresión recombinante. Las construcciones de polinucleótidos recombinantes normalmente incluyen una secuencia de control de la expresión unida operativamente a las secuencias codificantes de cadenas de anticuerpos, incluyendo regiones promotoras asociadas de manera natural o heterólogas. Preferentemente, las secuencias de control de la expresión son sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células hospedadoras eucariotas. Una vez que el vector se ha incorporado al hospedador apropiado, el hospedador se mantiene en condiciones adecuadas para un alto nivel de expresión de las secuencias de nucleótidos y la recogida y purificación de los anticuerpos de reacción cruzada.
Las células de mamífero son un hospedador preferido para expresar segmentos de nucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas. Véase Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). En la técnica se han desarrollado varias líneas de células hospedadoras adecuadas capaces de secretar proteínas heterólogas inalteradas, e incluye líneas de células CHO (por ejemplo, DG44), varias líneas de células COS, células HeLa, células HEK293, células L y mielomas que no producen anticuerpos, incluyendo Sp2/0 y NS0. Preferentemente, las células no son humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen etal., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) y los sitios de procesado de la información necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras transcripcionales. Las secuencias de control de la expresión preferidas son promotores procedentes de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino y similares. Véase Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).
Una vez expresados, los anticuerpos se pueden purificar de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, incluyendo la purificación por HPLC, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares (véase, en general, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).
IV. Ácidos nucleicos
La invención proporciona además ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las cadenas pesada y ligera humanizadas descritas anteriormente. Normalmente, los ácidos nucleicos también codifican un péptido señal fusionado con las cadenas pesada y ligera maduras. Las secuencias codificantes de ácidos nucleicos se pueden enlazar operativamente con secuencias reguladoras para asegurar la expresión de las secuencias codificantes, tales como un promotor, potenciador, sitio de unión a ribosomas, señal de terminación de la transcripción y similares. Los ácidos nucleicos que codifican cadenas pesada y ligera pueden presentarse en forma aislada o pueden clonarse en uno o más vectores. Los ácidos nucleicos se pueden sintetizar mediante, por ejemplo, síntesis en estado sólido o PCR de oligonucleótidos solapantes. Los ácidos nucleicos que codifican cadenas pesada y ligera se pueden unir como un ácido nucleico contiguo, por ejemplo, dentro de un vector de expresión, o pueden estar separados, por ejemplo, cada uno clonado en su propio vector de expresión.
V. Conjugados de fármaco anticuerpo
Los anticuerpos anti-LIV-1 se pueden conjugar con fracciones citotóxicas o citostáticas (incluyendo sales farmacéuticamente compatibles de las mismas) para formar un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés). Las fracciones particularmente adecuadas para la conjugación con anticuerpos son agentes citotóxicos (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos), enzimas convertidoras de profármacos, isótopos o compuestos radioactivos, o toxinas (estas fracciones se denominan colectivamente agentes terapéuticos). Por ejemplo, un anticuerpo anti-LIV-1 se puede conjugar con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, o una toxina (por ejemplo, un agente citostático o citocida tal como, por ejemplo, abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica).
Se puede conjugar un anticuerpo anti-LIV-1 con una enzima convertidora de profármacos. La enzima convertidora de profármacos puede fusionarse de forma recombinante con el anticuerpo o conjugarse químicamente al mismo usando métodos conocidos. Ejemplos de enzimas convertidoras de profármacos son la carboxipeptidasa G2, betaglucuronidasa, penicilina-V-amidasa, penicilina-G-amidasa, p-lactamasa, p-glucosidasa, nitrorreductasa y carboxipeptidasa A.
Técnicas de conjugación de agentes terapéuticos con proteínas y, en particular, con anticuerpos, son bien conocidas. (Véanse, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Dekker, Inc., 2a ed. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985); y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58. Véase también, por ejemplo, la publicación PCT WO 89/12624).
El agente terapéutico se puede conjugar de una manera que reduzca su actividad a menos que se escinda del anticuerpo (por ejemplo, por hidrólisis, por degradación de anticuerpos o por un agente de escisión). Dicho agente terapéutico se une al anticuerpo con un enlazador escindible que es sensible a la escisión en el entorno intracelular de la célula cancerosa que expresa LIV-1 pero no es sustancialmente sensible al entorno extracelular, de manera que el conjugado se escinde del anticuerpo cuando se internaliza mediante la célula cancerosa que expresa LIV-1 (por ejemplo, en el endosoma o, por ejemplo, en virtud de la sensibilidad al pH o la sensibilidad a las proteasas, en el entorno lisosomal o en el entorno caveolar).
Normalmente, el ADC comprende una región enlazadora entre el agente terapéutico y el anticuerpo anti-LIV-1. Como se ha señalado anteriormente, normalmente, el enlazador es escindible en condiciones intracelulares, de manera que la escisión del enlazador libera el agente terapéutico del anticuerpo en el entorno intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola). El enlazador puede ser, por ejemplo, un enlazador de peptidilo que se escinde por una enzima peptidasa o proteasa intracelular, incluyendo una proteasa lisosomal o endosomal. Normalmente, el enlazador peptídico es de al menos dos aminoácidos de longitud o de al menos tres aminoácidos de longitud. Los agentes de escisión pueden incluir catepsina B y D y plasmina (véase, por ejemplo, Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Los más típicos son enlazadores de peptidilo que son escindibles por enzimas que están presentes en células que expresan LIV-1. Por ejemplo, puede usarse un enlazador de peptidilo que es escindible por la proteasa catepsina B dependiente de tiol, que se expresa altamente en tejido canceroso (por ejemplo, un enlazador que comprende un péptido Phe-Leu o Gly-Phe-Leu-Gly). Se describen otros enlazadores de este tipo, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 6.214.345. En realizaciones específicas, el enlazador de peptidilo escindible por una proteasa intracelular comprende un enlazador de Val-Cit o un dipéptido de Phe-Lys (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 6.214.345, que describe la síntesis de doxorrubicina con el enlazador Val-Cit). Una ventaja del uso de la escisión proteolítica intracelular del agente terapéutico es que el agente normalmente se atenúa cuando se conjuga y la estabilidad en suero de los conjugados es normalmente elevada.
El enlazador escindible puede ser sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a determinados valores de pH. Normalmente, el enlazador sensible al pH es hidrolizable en condiciones ácidas. Por ejemplo, puede usarse un enlazador lábil al ácido que es hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal, o similares). ("Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661.) Dichos enlazadores son relativamente estables en condiciones de pH neutro, tales como las de la sangre, pero son inestables a un pH inferior a 5,5 o 5,0, el pH aproximado del lisosoma. En determinadas realizaciones, el enlazador hidrolizable es un enlazador de tioéter (tal como, por ejemplo, un tioéter unido al agente terapéutico a través de un enlace de acilhidrazona (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.622.929)).
Otros enlazadores son escindibles en condiciones reductoras (por ejemplo, un enlazador disulfuro). Los enlazadores disulfuro incluyen aquellos que se pueden formar usando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridiltio)butirato) y SMPT (N-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno), SPDB y SMPT. (Véanse, por ejemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., en Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Véase también la Patente de Estados Unidos n.° 4.880.935).
El enlazador también puede ser un enlazador de malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), un enlazador de maleimidobenzoílo (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304) o un análogo de 3'-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12).
El enlazador también puede ser un enlazador no escindible, tal como un enlazador maleimido-alquileno- o maleimidaarilo que se une directamente al agente terapéutico (por ejemplo, un fármaco). Un fármaco-enlazador activo se libera mediante degradación del anticuerpo.
Normalmente, el enlazador no es sustancialmente sensible al entorno extracelular, lo que significa que no más de aproximadamente un 20 %, normalmente no más de aproximadamente un 15 %, más normalmente no más de aproximadamente un 10 % y aún más normalmente no más de aproximadamente un 5 %, no más de aproximadamente un 3 %, o no más de aproximadamente un 1 % de los enlazadores en una muestra del ADC se escinde cuando el ADC está presente en un entorno extracelular (por ejemplo, en plasma). Puede determinarse si un enlazador no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular, por ejemplo, mediante la incubación independiente con plasma de tanto (a) el ADC (la "muestra de ADC") como (b) una cantidad molar igual de anticuerpo no conjugado o agente terapéutico (la "muestra de control") durante un período de tiempo predeterminado (porejemplo, 2, 4, 8, 16 o 24 horas) y luego la comparación de la cantidad de anticuerpo no conjugado o agente terapéutico presente en la muestra de ADC con la presente en la muestra de control, como se mide, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento.
El enlazador también puede promover internalización celular. El enlazador puede promover internalización celular cuando se conjuga con el agente terapéutico (es decir,, en el medio de la fracción de agente terapéutico-enlazador del ADC o derivado de ADC como se describe en el presente documento). Alternativamente, el enlazador puede promover internalización celular cuando se conjuga tanto con el agente terapéutico como con el anticuerpo anti-LIV-1 (es decir,, en el medio del ADC como se describe en el presente documento).
Una variedad de enlazadores que se pueden usar con las presentes composiciones se describen en el documento WO 2004-010957 y tienen la forma
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en donde:
-A- es una unidad ensanchadora;
a es 0 o 1;
cada -W- es independientemente una unidad de aminoácido;
w es independientemente un número entero comprendido entre 0 y 12;
-Y- es una unidad separadora; e
y es 0, 1 o 2.
Las unidades ensanchadoras representativas se representan gráficamente entre los corchetes de las fórmulas (Ia) y (Ib; véase más abajo), en donde A-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se ha definido anteriormente, y R1 se selecciona de alquileno C1-C10, -carbociclo C3-C8 , -O-(alquilo C1-C8), -arileno-, -alquilen C1-C10-arileno, -arilen-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8 , -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -(CH2CH2OV- y -(CH2CH2OV-CH2-; y r es un número entero comprendido entre 1-10. Ac es anticuerpo.
La carga del fármaco está representada por p, el número de moléculas de fármaco-enlazador por anticuerpo. Dependiendo del contexto, p puede representar el número medio de moléculas fármaco-enlazador por anticuerpo, también denominado como la carga media de fármaco. P varía de 1 a 20 y preferentemente de 1 a 8. En algunas realizaciones preferidas, cuando p representa la carga media de fármaco, p varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. En algunas realizaciones, p es aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4 o aproximadamente 5. El número promedio de fármacos por anticuerpo en una preparación se puede caracterizar por medios convencionales tales como espectroscopía de masas, ensayo ELISA y HPLC.
La unidad de aminoácido (-W-), si está presente, conecta la unidad ensanchadora (-A-) a la unidad separadora (-Y-) si la unidad separadora está presente, y conecta la unidad ensanchadora al agente citotóxico o citostático (unidad de fármaco; D) si la unidad separadora está ausente.
Si está presente, -Ww- es preferentemente un dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido.
La unidad separadora (-Y-), cuando está presente, conecta una unidad de aminoácidos con la unidad de fármaco. Las unidades separadoras son de dos tipos generales: autodestructivas y no autodestructivas. Una unidad separadora no autodestructiva es aquella en la que parte o toda la unidad separadora permanece unida a la unidad de fármaco después de la escisión enzimática de una unidad de aminoácidos del conjugado anticuerpo anti-LIV-1-enlazadorfármaco o el compuesto fármaco-enlazador. Los ejemplos de una unidad separadora no autodestructiva incluyen una unidad separadora (glicina-glicina) y una unidad separadora de glicina. Cuando un conjugado anticuerpo anti-LIV-1-enlazador-fármaco que contiene una unidad separadora de glicina-glicina o una unidad separadora de glicina experimenta escisión enzimática mediante una proteasa asociada a una célula tumoral, una proteasa asociada a una célula cancerosa o una proteasa asociada a linfocito, una fracción de glicina-glicina-fármaco o una fracción de glicinafármaco se escinde del Ac-Aa-Ww-. Para liberar el fármaco, debe tener lugar una reacción de hidrólisis independiente dentro de la célula diana para escindir el enlace de la unidad de fármaco-glicina.
Alternativamente, un conjugado de fármaco anticuerpo anti-LIV-1 que contiene una unidad separadora autodestructiva puede liberar el fármaco (D) sin la necesidad de una etapa de hidrólisis separada. En algunas de estas realizaciones, -Y- es una unidad de alcohol p-aminobencílico (PAB) que está unido a -Ww- mediante el átomo de nitrógeno del amino del grupo PAB, y conectado directamente a -D mediante un grupo carbonato, carbamato o éter. Otros ejemplos de separadores autodestructivos incluyen compuestos aromáticos que son electrónicamente equivalentes al grupo PAB, tales como los derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (véase Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237 por ejemplo) y orto o para-aminobencilacetales. Pueden usarse separadores que experimenten una ciclación fácil tras la hidrólisis del enlace amida, tales como amidas del ácido 4-aminobutírico sustituidas y no sustituidas (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), sistemas de anillo biciclo[2.2.1] y biciclo[2.2.2] adecuadamente sustituidos (Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) y amidas del ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). La eliminación de fármacos que contienen amina que están sustituidos en la posición a de la glicina (Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447) son también ejemplos de estrategias separadoras autodestructivas que se pueden aplicar a los conjugados anticuerpo anti-LlV-1-enlazador-fármaco. Alternativamente, la unidad separadora es una unidad ramificada de bis(hidroximetil)estireno (BHMS), que se puede utilizar para incorporar fármacos adicionales.
Las clases útiles de agentes citotóxicos para conjugar con anticuerpos anti-LIV-1 incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, agentes aglutinantes de la ranura menor de ADN, inhibidores de la replicación del ADN, sensibilizantes de quimioterapia o similares. Otras clases ilustrativas de agentes citotóxicos incluyen antraciclinas, auristatinas, camptotecinas, duocarmicinas, etopósidos, maitansinoides y alcaloides de la vinca. Algunos agentes citotóxicos ilustrativos incluyen auristatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE), aglutinantes de la ranura menor del ADN (por ejemplo, enediynes y lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel), alcaloides de la vinca, doxorrubicina, morfolino-doxorrubicina y cianomorfolino-doxorrubicina.
El agente citotóxico puede ser un quimioterapéutico tal como, por ejemplo, doxorrubicina, paclitaxel, melfalán, alcaloides de la vinca, metotrexato, mitomicina C o etopósido. El agente también puede ser un análogo de CC-1065, caliqueamicina, maitansina, un análogo de dolastatina 10, rizoxina o palitoxina.
El agente citotóxico también puede ser una auristatina. La auristatina puede ser un derivado auristatina E, por ejemplo, un éster formado entre auristatina E y un cetoácido. Por ejemplo, puede hacerse reaccionar auristatina E con ácido paraacetil benzoico o ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otras auristatinas normales incluyen AFP, MMAF, y MMAE. La síntesis y estructura de varias auristatinas se describen en, por ejemplo, los documentos US 2005-0238649 y US2006-0074008.
El agente citotóxico puede ser un agente aglutinante de la ranura menor de ADN. (Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.130.237). Por ejemplo, el agente aglutinante de la ranura menor puede ser un compuesto CBI o un enediyne (por ejemplo, caliqueamicina).
El agente citotóxico o citostático puede ser un agente antitubulina. Ejemplos de agentes antitubulina incluyen taxanos (por ejemplo, Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik), alquiloides de la vincapor ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina) y auristatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB). (Ejemplos de auristatinas se muestran a continuación en las fórmulas MI-XMI). Otros agentes antitubulina adecuados incluyen, por ejemplo, derivados de la bacatina, análogos de taxanospor ejemplo, epotilones A y B ), nocodazol, colchicina y colcimida, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, combretastatinas, discodermólido y eleuterobina.
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El agente citotóxico puede ser un maitansinoide, otro grupo de agentes antitubulina. Por ejemplo, el maitansinoide puede ser maitansina o un enlazador de fármaco que contiene maitansina tal como DM-1 o DM-4 (ImmunoGen, Inc.; véase también Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131).
Los conjugados de anticuerpo-fármaco ilustrativos incluyen conjugados de anticuerpo-fármaco vcMMAE y mcMMAF de la siguiente manera, en donde p y Ac son como se describieron previamente en el presente documento:
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o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
VI. Otros anticuerpos contra LIV-1
Además de las formas humanizadas de los anticuerpos BR2-14a y BR2-22a discutidos anteriormente, otros anticuerpos que se unen a un dominio extracelular de LIV-1 se pueden usar en algunos de los métodos de la invención, particularmente en el tratamiento de cánceres de mama triple negativos. En el documento US20080175839 se describe una colección de anticuerpos de ratón contra LIV-1. Estos anticuerpos incluyen 1.1F10, 1.7A4, BR2-10b, BR2-11a, BR2-13a, BR2-14a, BR2-15a, BR2-16a, BR2-17a, BR2-18a, BR2-19a, BR2-20a, BR2-21a, BR2-22a, BR2-23a, BR2-24a y BR2-25a, de los cuales se prefieren BR2-19a producido por el hibridoma n.° de referencia de ATCC PTA-5706 o BR2-23a producido por el hibridoma n.° de referencia de ATCC PTA-5707 además de BR2-14a y BR2-22a. Las formas humanizadas, quiméricas o rechapadas de estos anticuerpos se pueden preparar mediante métodos convencionales que se resumen a continuación.
Se pueden preparar de novo otros anticuerpos contra LIV-1 mediante inmunización con LIV-1 o uno o más dominios extracelulares de la misma. La producción de otros anticuerpos monoclonales no humanos, por ejemplo, murino, de cobaya, de primate, de conejo o rata, contra un inmunógeno puede realizarse según lo descrito por Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (incorporado como referencia para todos los fines). Dicho inmunógeno puede obtenerse de una fuente natural, mediante síntesis peptídica o mediante expresión recombinante.
Se pueden preparar formas humanizadas, quiméricas o rechapadas de anticuerpos no humanos. La metodología general para producir anticuerpos humanizados se describe en Queen, documentos US 5.530.101 y 5.585.089; Winter, documento US 5.225.539; Carter, documento US 6.407.213; Adair, documento US 5.859.205; y Foote, documento US 6.881.557). Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo en el que las regiones variables maduras de cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo no humano (por ejemplo, un ratón) se combinan con regiones constantes de cadenas ligeras y pesadas humanas. Dichos anticuerpos retienen sustancial o totalmente la especificidad de unión del anticuerpo de ratón y son aproximadamente dos tercios de secuencia humana. Un anticuerpo rechapado es un tipo de anticuerpo humanizado que retiene algunas y generalmente todas las CDR y algunos de los restos de marcos de la región variable no humana de un anticuerpo no humano, pero reemplaza otros restos de marcos de la región variable que pueden contribuir a epítopos de linfocitos B o T, por ejemplo, restos expuestos (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) con restos de las posiciones correspondientes de una secuencia de anticuerpo humano. El resultado es un anticuerpo en el que las c Dr son total o sustancialmente de un anticuerpo no humano y los marcos de la región variable del anticuerpo no humano se vuelven más similares a los humanos mediante las sustituciones.
Los anticuerpos humanos contra LIV-1 pueden proporcionarse mediante una variedad de técnicas que se describen a continuación. Los métodos para producir anticuerpos humanos incluyen el método de trioma de Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, la patente de Estados Unidos N.° 4.634.664; y Engleman et al., patente de Estados Unidos 4.634.666; uso de ratones transgénicos, incluyendo genes de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, Lonberg et al., los documentos WO93/12227 (1993); US 5.877.397, US 5.874.299, US 5.814.318, US 5.789.650, US 5.770.429, US 5.661.016, US 5.633.425, US 5.625.126, US 5.569.825, US 5.545.806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, documento WO 91/10741 (1991) y métodos de presentación de fagos (véanse, por ejemplo, Dower et al., documento WO 91/17271 y McCafferty et al., documentos WO 92/01047, US 5.877.218, US 5.871.907, US 5.858.657, US 5.837.242, US 5.733.743 y US 5.565.332.
Cualquiera de los anticuerpos puede seleccionarse para tener la misma especificidad de epítopo o solapamiento que un anticuerpo ilustrativo, tal como el anticuerpo BR2-14a, mediante un ensayo de unión por competencia o de otro modo.
VII. Aplicaciones terapéuticas
Los anticuerpos humanizados de la invención, solos o como conjugados de fármaco-anticuerpo LIV-1 de los mismos, se pueden utilizar para tratar el cáncer. Algunos de estos cánceres muestran niveles detectables de LIV-1 medidos en la proteína (por ejemplo, mediante inmunoensayo usando uno de los anticuerpos ejemplificados) o en el nivel de ARNm. Algunos de estos cánceres muestran niveles elevados de LIV-1 en relación con el tejido no canceroso del mismo tipo, preferentemente del mismo paciente. Un nivel ilustrativo de LIV-1 en células cancerosas susceptibles de tratamiento es 5000-150000 moléculas de LIV-1 por célula, aunque se pueden tratar niveles más altos o más bajos. Opcionalmente, se mide un nivel de LIV-1 en un cáncer antes de realizar el tratamiento.
Ejemplos de cánceres asociados con la expresión de LIV-1 y susceptibles de tratamiento incluyen cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, de cuello del útero, hígado, gástricos, carcinomas de riñón y de células escamosas (por ejemplo, vejiga, cabeza, cuello y pulmón), cánceres de piel, por ejemplo, melanoma, carcinoma microcítico de pulmón o carcinoide de pulmón. El tratamiento se puede aplicar a pacientes que tienen tumores primarios o metastásicos de este tipo. El tratamiento también se puede aplicar a pacientes que son resistentes a tratamientos convencionales (por ejemplo, hormonas, tamoxifeno, herceptin), o que hayan recaído después de una respuesta a dichos tratamientos. Los métodos también se pueden utilizar en cánceres de mama triple negativos. Un cáncer de mama triple negativo es una expresión de la técnica para un cáncer que carece de receptores detectables de estrógeno y progesterona y que carece de sobreexpresión de HER2/neu cuando se tiñe con un anticuerpo para cualquiera de estos receptores, tales como los que se describen en los ejemplos. La tinción se puede realizar en relación con un anticuerpo de control irrelevante y se muestra la falta de expresión a partir de un nivel de fondo de tinción igual o similar al del control dentro del error experimental. Asimismo, la falta de sobreexpresión se muestra mediante la tinción al mismo nivel o similar dentro del error experimental del tejido mamario no canceroso, preferentemente obtenido del mismo paciente. Como alternativa, o adicionalmente, los cánceres de mama nativos triples se caracterizan por la falta de respuesta a las hormonas que interactúan con estos receptores, un comportamiento agresivo y un patrón distinto de metástasis. Los anticuerpos hLIV14 pueden usarse para tratar cánceres que expresan LIV-1. Los anticuerpos hLIV22 pueden usarse para tratar cánceres que expresan LIV-1. En una realización, se usa un anticuerpo hLIV22 para tratar a un sujeto con un cáncer de mama que expresa LIV-1. En otra realización, se usa un anticuerpo hLIV22 para tratar a un sujeto con un cáncer de próstata que expresa LIV-1. En otra realización, se usa un anticuerpo hLIV22 para tratar a un sujeto con un melanoma que expresa LIV-1. En otra realización, se usa un anticuerpo hLIV22 para tratar a un sujeto con un cáncer de ovario que expresa LIV-1. En otra realización, se usa un anticuerpo hLIV22 para tratar a un sujeto con un cáncer de endometrio que expresa LIV-1. En otra realización, se usa un anticuerpo hLIV22 para tratar a un sujeto con un cáncer de cuello uterino que expresa LIV-1. En otra realización, se usa un anticuerpo hLIV22 para tratar a un sujeto con un cáncer de hígado que expresa LIV-1. En otra realización, se usa un anticuerpo hLIV22 para tratar a un sujeto con un cáncer gástrico que expresa LIV-1. En otra realización, se usa un anticuerpo hLIV22 para tratar a un sujeto con un cáncer de riñón que expresa LIV-1. En otra realización, se usa un anticuerpo hLIV22 para tratar a un sujeto con carcinomas de células escamosas que expresan LIV-1 (por ejemplo, vejiga, cabeza, cáncer de cuello y pulmón). En otra realización, se usa un anticuerpo hLIV22 para tratar a un sujeto con un cáncer de mama que expresa LIV-1. En otra realización, se usa un anticuerpo hLIV22 para tratar a un sujeto con un cáncer de piel que expresa LIV-1. En otra realización, se usa un anticuerpo hLIV22 para tratar a un sujeto con un carcinoma microcítico de pulmón o un carcinoide pulmonar que expresa LIV-1. Esta solicitud proporciona la primera divulgación de que la proteína LIV-1 se expresa en la superficie de células de melanoma. Por tanto, los anticuerpos que se unen a LIV-1 se pueden usar para tratar pacientes que padecen melanomas que expresan LIV-1. Dichos anticuerpos incluyen anticuerpos divulgados en el presente documento, por ejemplo, hLIV14 y hLIV22, pero no se limitan a los anticuerpos divulgados en el presente documento.
Anticuerpos humanizados, solos o como conjugados de los mismos, se administran en un régimen eficaz, es decir, una dosis, vía de administración y frecuencia de administración que retrasa el inicio, reduce la intensidad, inhibe un mayor deterioro y/o mejora al menos un signo o síntoma de cáncer. Si un paciente ya padece cáncer, el régimen puede denominarse régimen terapéuticamente eficaz. Si el paciente tiene un riesgo elevado de padecer cáncer en relación con la población general, pero aún no presenta síntomas, el régimen puede denominarse régimen profilácticamente eficaz. En algunos casos, la eficacia terapéutica o profiláctica se puede observar en un paciente individual en relación con los controles históricos o la experiencia pasada en el mismo paciente. En otros ejemplos, la eficacia terapéutica o profiláctica se puede demostrar en un ensayo preclínico o clínico en una población de pacientes tratados en relación con una población de control de pacientes no tratados.
Dosis ilustrativas de un anticuerpo monoclonal son de 0,1 mg/kg a 50 mg/kg del peso corporal del paciente, más normalmente de 1 mg/kg a 30 mg/kg, de 1 mg/kg a 20 mg/kg, de 1 mg/kg a 15 mg/kg, de 1 mg/kg a 12 mg/kg, o de 1 mg/kg a 10 mg/kg, o de 2 mg/kg a 30 mg/kg, de 2 mg/kg a 20 mg/kg, de 2 mg/kg a 15 mg/kg, de 2 mg/kg a 12 mg/kg, o de 2 mg/kg a 10 mg/kg, o de 3 mg/kg a 30 mg/kg, de 3 mg/kg a 20 mg/kg, de 3 mg/kg a 15 mg/kg, de 3 mg/kg a 12 mg/kg, o de 3 mg/kg a 10 mg/kg. Dosis ilustrativas para un anticuerpo monoclonal o conjugados de anticuerpo-fármaco del mismo son de 1 mg/kg a 7,5 mg/kg, o 2 mg/kg a 7,5 mg/kg o 3 mg/kg a 7,5 mg/kg del peso corporal del sujeto, o 0,1-20, o 0,5-5 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg) o 10-1500 o 200-1500 mg como dosis fija. En algunos métodos, al paciente se le administra una dosis de al menos 1,5 mg/kg, al menos 2 mg/kg o al menos 3 mg/kg, administrada una vez cada tres semanas o más. La dosis depende de la frecuencia de administración, afección del paciente y respuesta al tratamiento previo, en caso de que lo hubiera, si el tratamiento es profiláctico o terapéutico y si el trastorno es agudo o crónico, entre otros factores.
La administración puede ser parenteral, intravenosa, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, tópica, intranasal o intramuscular. La administración también puede localizarse directamente en un tumor. Se prefiere la administración en la circulación sistémica mediante administración intravenosa o subcutánea. La administración intravenosa puede ser, por ejemplo, mediante infusión durante un período de 30 a 90 minutos o mediante una única inyección en bolo.
La frecuencia de administración depende de la semivida del anticuerpo o conjugado en la circulación, la afección del paciente y la vía de administración entre otros factores. La frecuencia puede ser diaria, semanalmente, mensualmente, trimestralmente, o en intervalos irregulares en respuesta a cambios en la afección del paciente o progresión del cáncer que se está tratando. Una frecuencia ilustrativa para la administración intravenosa es entre dos veces por semana y trimestralmente durante un curso continuo de tratamiento, aunque también es posible una dosificación más o menos frecuente. Otras frecuencias ilustrativas para la administración intravenosa se encuentran entre semanalmente o tres de cada cuatro semanas durante un curso continuo de tratamiento, aunque también es posible una dosificación más o menos frecuente. Para administración subcutánea, una frecuencia de dosificación ilustrativa es diaria a mensual, aunque también es posible una dosificación más o menos frecuente.
El número de dosis administradas depende de la naturaleza del cáncer (por ejemplo, si presenta síntomas agudos o crónicos) y la respuesta del trastorno al tratamiento. Para trastornos agudos o empeoramiento agudo de un trastorno crónico, a menudo son suficientes entre 1 y 10 dosis. A veces, una sola dosis de bolo, opcionalmente en forma dividida, es suficiente para un trastorno agudo o un empeoramiento agudo de un trastorno crónico. El tratamiento puede repetirse en caso de recaída de un trastorno agudo o empeoramiento agudo. Para los trastornos crónicos, se puede administrar un anticuerpo a intervalos regulares, por ejemplo, semanalmente, quincenal, mensualmente, trimestralmente, cada seis meses durante al menos 1, 5 o 10 años, o la vida del paciente.
Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral son preferentemente estériles y sustancialmente isotónicas y se fabrican en condiciones GMP. Las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar en forma de dosis unitaria (es decir, la dosis para una sola administración). Las composiciones farmacéuticas se pueden formular usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables. La formulación depende de la vía de administración elegida. Para inyección, los anticuerpos se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o solución salina fisiológica o tampón de acetato (para reducir las molestias en el lugar de la inyección). La solución puede contener agentes formulatorios, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, los anticuerpos pueden estar en forma liofilizada para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril exenta de pirógenos, antes de su uso. La concentración de anticuerpo en una formulación líquida puede ser, por ejemplo, 1-100 mg/ml, tal como 10 mg/ml.
El tratamiento con anticuerpos de la invención se puede combinar con quimioterapia, radiación, tratamiento con células madre, cirugía u otros tratamientos eficaces contra el trastorno que se está tratando. Las clases útiles de otros agentes que se pueden administrar con anticuerpos humanizados contra LIV-1 incluyen, por ejemplo, anticuerpos contra otros receptores expresados en células cancerosas, agentes antitubulina (por ejemplo, auristatinas), aglutinantes de la ranura menor del ADN, inhibidores de la replicación del ADN, agentes alquilantes (por ejemplo, complejos de platino tales como c/s-platino, mono(platino), bis(platino) y complejos de platino trinucleares y carboplatino), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizantes de quimioterapia, duocarmicinas, etopósidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureas, platinoles, compuestos preformados, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizantes de la radiación, esteroides, taxanos, inhibidores de la topoisomerasa, alcaloides de la vinca y similares.
El tratamiento con el anticuerpo anti-LIV-1 humanizado, opcionalmente en combinación con cualquiera de los otros agentes o regímenes descritos anteriormente solo o como un conjugado de anticuerpo-fármaco, puede aumentar la mediana de supervivencia libre de progresión o el tiempo de supervivencia general de los pacientes con tumores (por ejemplo, mama, próstata, melanoma), especialmente cuando recae o es resistente, en al menos un 30 % o un 40 % pero preferentemente un 50 %, de un 60 % a un 70 % o incluso el 100 % o más, en comparación con el mismo tratamiento (por ejemplo, quimioterapia) pero sin un anticuerpo anti-LIV-1 solo o como conjugado. Además, o como alternativa, el tratamiento (por ejemplo, quimioterapia estándar) que incluye el anticuerpo anti-LIV-1 solo o como un conjugado puede aumentar la tasa de respuesta completa, tasa de respuesta parcial, o tasa de respuesta objetiva (completa parcial) de pacientes con tumores en al menos un 30 % o un 40 % pero preferentemente un 50 %, de un 60 % a un 70 % o incluso el 100% en comparación con el mismo tratamiento (por ejemplo, quimioterapia) pero sin el anticuerpo anti-LIV-1.
Normalmente, en un ensayo clínico (por ejemplo, un ensayo de fase II, fase II/NI o fase III), los aumentos antes mencionados en la mediana de supervivencia libre de progresión y/o tasa de respuesta de los pacientes tratados con la terapia estándar más el anticuerpo anti-LIV-1 humanizado, en relación con el grupo de control de pacientes que reciben terapia estándar sola (o más placebo), son estadísticamente significativos, por ejemplo, en el nivel p = 0,05 o 0,01 o incluso 0,001. Las tasas de respuesta completa y parcial se determinan por criterios objetivos que se utilizan comúnmente en ensayos clínicos para el cáncer, por ejemplo, según lo enumerado o aceptado por el National Cancer Institute and/or Food and Drug Administration.
VIII. Otras aplicaciones
Los anticuerpos humanizados anti-LIV-1 se pueden usar para detectar LIV-1 en el contexto del diagnóstico o tratamiento clínico o en investigación. La expresión de LIV-1 en un cáncer proporciona una indicación de que el cáncer es susceptible de tratamiento con los anticuerpos de la presente invención. Los anticuerpos también se pueden vender como reactivos de investigación para la investigación de laboratorio en la detección de células portadoras de LIV-1 y su respuesta a diversos estímulos. En dichos usos, los anticuerpos monoclonales se pueden marcar con moléculas fluorescentes, moléculas marcadas por rotación, enzimas o radioisotipos, y se pueden proporcionar en forma de kit con todos los reactivos necesarios para realizar el ensayo de LIV-1. Los anticuerpos descritos en el presente documento, BR2-14a, BR2-22a y versiones humanizadas de los mismos, por ejemplo, hLIV14 y hLIV22, pueden usarse para detectar la expresión de la proteína LIV-1 y determinar si un cáncer es susceptible de tratamiento con ADC LIV-1. A modo de ejemplo, BR2-14a, BR2-22a y versiones humanizadas de los mismos, por ejemplo, hLIV14 y hLIV22 se pueden utilizar para detectar la expresión de LIV-1 en células de cáncer de mama, células de melanoma, células de cáncer de cuello uterino o células de cáncer de próstata. Los anticuerpos también se pueden usar para purificar LIV-1, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad.
IX. LIV-1 de macaco cangrejero
La divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos para LIV-1 de macaco cangrejero (CY LIV-1, por sus siglas en inglés) en la SEQ ID NO: 85 con o sin un péptido señal, que ocupa aproximadamente los restos 1-28 de la SEQ ID NO: 85, así como los ácidos nucleicos que codifican esas secuencias de aminoácidos. También se incluyen variantes que difieren en hasta 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, eliminaciones o inserciones siempre que las variantes de CY no incluyan una secuencia de LIV-1 humana natural. De forma análoga a LIV-1 humana, la referencia a CY-LIV-1 significa al menos un dominio extracelular de la proteína y normalmente la proteína completa distinta de un péptido señal escindible (aminoácidos 1-28). La divulgación proporciona además anticuerpos que se unen específicamente a la SEQ ID NO: 85 con o sin unión específica a LIV-1 humana (es decir, se unen a LIV-1 humana a nivel de anticuerpo irrelevante de control negativo). La divulgación proporciona además anticuerpos que se unen preferentemente a CY-LIV-1 sobre LIV-1 humana y viceversa. Unión preferencial significa una asociación superior al error experimental y preferentemente al menos 2, 3 o 4 veces mayor. La divulgación proporciona además anticuerpos que muestran el mismo perfil de unión a CY LIV-1 y LIV-1 humana dentro del error experimental que cualquiera de los anticuerpos ejemplificados que se describen a continuación. La divulgación proporciona además métodos para analizar la unión de un anticuerpo a CY LIV-1. Dichos métodos implican poner en contacto un anticuerpo con CY LIV-1, determinar si el anticuerpo se une específicamente a CY LIV-1 y, opcionalmente, determinar una medida de fuerza de unión, tal como una constante de asociación.
Si diferentes versiones de una secuencia están asociadas con un número de referencia en diferentes momentos, se entiende la versión asociada con el número de referencia en la fecha de entrada en vigor de presentación de esta solicitud. La fecha de entrada en vigor de presentación significa la primera entre la fecha de presentación real o la fecha de presentación de una solicitud de prioridad que se refiere al número de referencia, si corresponde. Asimismo, si diferentes versiones de una publicación, sitio web o similares se publican en diferentes momentos, se entiende la versión publicada más recientemente en la fecha de entrada en vigor de presentación de la solicitud, a menos que se indique lo contrario. Cualquier característica, etapa, elemento, realización o aspecto de la invención se puede usar en combinación con cualquier otro a menos que se indique específicamente lo contrario. Aunque la presente invención se ha descrito con cierto nivel de detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad de entendimiento, será evidente que pueden practicarse ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
I. Humanización de BR2-14a
Materiales
Las líneas celulares descritas en los siguientes ejemplos se mantuvieron en cultivo de acuerdo con las condiciones especificadas por la American Type Culture Collection (ATCC), el National Cancer Institute (NCI) o el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania (DMSZ). Los reactivos de cultivo celular se obtuvieron de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) u otros proveedores.
Metodologías:
Ensayos de unión por saturación
1x105 células que expresan antígenos (células MCF7 (ATCC) que expresan LIV-1 humana, una línea celular CHO transfectada que expresa LIV-1 humana o una línea celular CHO transfectada que expresa LIV-1 de macaco cangrejero) se dividieron en alícuotas por pocillo de placas con fondo en V de 96 pocillos. AcM murino LIV-1 marcado con AlexaFluor-647, por ejemplo, BR2-14a, se añadió en concentraciones que varían entre 0,66 pM y 690 nM y se incubó en hielo durante 30 minutos. Las células se sedimentaron y se lavaron 3X con PBS/BSA. A continuación, las células se sedimentaron y se resuspendieron en 125 pl de PBS/BSA. La fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo, utilizando el porcentaje de señal fluorescente saturada para determinar el porcentaje unido y posteriormente calcular la Kd aparente.
Ensayos de unión por competencia
1x105 células CHO que expresan LIV-1 humana recombinante en PBS/BSA se dividieron en alícuotas en cada pocillo de placas de fondo en V de 96 pocillos sobre hielo. Las células se incubaron durante 1 hora con AcM murino LIV-1 parental marcado con AlexaFluor-647 (AF) 5 nM y concentraciones crecientes (de 0,038 nM a 600 nM) de AcM humanizado LIV-1 sin marcar, combinaciones de cadenas ligeras humanizadas LA-LF y cadenas pesadas humanizadas HA-HE. Las células se sedimentaron y se lavaron 3 veces con PBS/BSA. Las células se sedimentaron y se resuspendieron en 125 pl de PBS/BSA. La fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo, usando el porcentaje de señal fluorescente saturada para determinar el porcentaje de AcM murino LIV-1 marcado unido y posteriormente extrapolar la CE50 mediante el ajuste de los datos a una curva dosis-respuesta sigmoidea con pendiente variable.
1x105 células MCF7 que expresan LIV-1 en PBS/BSA se dividieron en alícuotas en cada pocillo de placas con fondo en V de 96 pocillos sobre hielo. Las células se incubaron durante 1 hora con AcM murino LIV-1 marcado con AlexaFluor-647 5 nM y concentraciones crecientes (de 0,038 nM a 600 nM) de AcM humanizado LIV-1 sin marcar, combinaciones de cadenas ligeras humanizadas LA-LF y cadenas pesadas humanizadas HA-HE. Las células se sedimentaron y se lavaron 3 veces con PBS. Las células se sedimentaron y se resuspendieron en 125 |jl de PBS/BSA. La fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo, usando el porcentaje de señal fluorescente saturada para determinar el porcentaje de AcM murino LIV-1 marcado unido y posteriormente extrapolar la CE50 mediante el ajuste de los datos a una curva dosis-respuesta sigmoidea con pendiente variable.
1x105 células CHO que expresan LIV-1 de macaco cangrejero recombinante en PBS se dividieron en alícuotas en cada pocillo de placas de fondo en V de 96 pocillos sobre hielo. Las células se incubaron durante 1 hora con AcM murino LIV-1 marcado con AlexaFluor-647 5 nM y concentraciones crecientes (de 0,038 nM a 600 nM) de AcM humanizado LIV-1 sin marcar, combinaciones de cadenas ligeras humanizadas LA-LF y cadenas pesadas humanizadas HA-HE. Las células se sedimentaron y se lavaron 3 veces con PBS. Las células se sedimentaron y se resuspendieron en 125 j l de PBS/BSA. La fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo, usando el porcentaje de señal fluorescente saturada para determinar el porcentaje de AcM murino LIV-1 marcado unido y posteriormente extrapolar la CE50 mediante el ajuste de los datos a una curva dosis-respuesta sigmoidea con pendiente variable.
Análisis de citometría de flujo cuantitativo
La cuantificación del número de copias de LIV-1 en las superficies celulares se determinó utilizando AcM murino LIV-1 como anticuerpo primario y el ensayo indirecto de citometría de flujo DAKO QiFiKit como lo describe el fabricante (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca) y se evaluó con un citómetro de flujo Becton Dickinson FACS®can.
Ensayo de citotoxicidad
Se incubaron células tumorales con conjugados de fármaco-anticuerpo LIV-1 durante 96-144 horas a 37 °C. Se utilizó un ADC que no se une (H00) como control negativo. La viabilidad celular se midió mediante resazurina (Sigma) a la concentración final de 50 jM . Las células se incubaron durante cuatro a seis horas a 37 °C. La señal fluorescente se midió en un lector de placas fluorescentes Fusion HT (Perkin Elmer, Waltham, MA). Los resultados se informan como CI50, la concentración de compuesto necesaria para producir una reducción de un 50 % en la viabilidad en comparación con las células tratadas con vehículo (control = 100 %).
Producción de conjugados de anticuerpo-fármaco
Se prepararon conjugados de anticuerpo-fármaco de los anticuerpos LIV-1 como se describe en el documento US20050238649. Los enlazadores de fármacos vcMMAE (también denominados 1006) y mcMMAF (denominados 1269) se describen ambos en el documento US20050238649. La preparación de mutantes de cisteína de anticuerpos IgG1 se describe en general en el documento US20100158919. Los documentos US20050238649 y US20100158919 se incorporan en el presente documento como referencia para todos los fines.
Producción de AcM anti-LIV-1 no fucosilado
Una línea celular CHO DG44 que produce el anticuerpo monoclonal anti-LIV-1 IgG1 humanizado, AcM HBLB (hLIV-14), se cultivó a 3,0 x 105 células por ml en 30 ml de medio de cultivo CHO a 37 °C, CO2 al 5 % y agitación a 100 RPM en un matraz de agitación de 125 ml. Los medios se complementaron con factor de crecimiento similar a la insulina (IGF, por sus siglas en inglés), penicilina, estreptomicina y peracetato de 2-fluorofucosa 65 jM (SGD-2084) (véase el documento US20090317869). Los cultivos se alimentaron el día 3 con un volumen de medio de alimentación al 2 %. En el día cuatro, el cultivo se dividió 1:4 en medios de cultivo nuevos. Los cultivos se alimentaron con un volumen de medio de alimentación de producción al 6 % los días 5, 7, 9 y 10. El medio acondicionado se recogió el día 13 pasando el cultivo a través de un filtro de 0,2 jm . La purificación del anticuerpo se realizó mediante la aplicación del medio acondicionado a una columna de proteína A equilibrada previamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) IX, pH 7,4.
Después de lavar la columna con 20 volúmenes de columna de PBS IX, los anticuerpos se eluyeron con 5 volúmenes de columna de tampón de elución Immunopure IgG (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Se añadió un volumen al 10 % de Tris 1 M pH 8,0 a la fracción eluida. La muestra se dializó durante la noche en PBS 1x.
Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)
La actividad de ADCC se midió utilizando el ensayo de liberación de 51Cr estándar. En resumen, las células tumorales diana MCF-7 se marcaron con 100 jC i de Na51CrO4, se lavaron y se incubaron previamente con anticuerpos de prueba antes de la adición de linfocitos efectores (linfocitos citolíticos naturales, NK). se prepararon células NK (CD16+ CD56+) a partir de células mononucleares de sangre periférica no adherentes (PBMC, por sus siglas en inglés) obtenidas de donantes normales FcyRIIIA 158V/V (Lifeblood, Memphis, TN) con perlas inmunomagnéticas (EasySep, StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá). Se añadieron células NK viables a las células diana en una relación de efector a célula diana de 10:1. Se usó una IgG1K humana (Ancell, Bayport, MN) como control negativo en este ensayo. Después de 4 horas de incubación, los sobrenadantes se recogieron y se secaron durante la noche en placas Luma.
La radiación gamma emitida por las células MCF-7 lisadas se detectó luego utilizando el contador de centelleo y luminiscencia de microplacas TopCount (Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts). La actividad de ADCC se informa como % de lisis específica.
Estudio de actividad in vivo
A ratones atímicos (nu/nu) (7-8 animales/grupo) se les implantaron células tumorales cultivadas en cultivo: MCF-7 de NCI (5x106 células en matrigel al 25 %), Pc 3 de ATCC (2,5 x 106 células en matrigel al 25 %) y PC3 de DSMZ (5 x 105 en matrigel al 25 %). Para el crecimiento in vivo de células MCF-7, los ratones hembras también recibieron complementos de estrógeno mediante la implantación de una pildorita de estrógeno de liberación lenta (liberación de 90 días). La dosificación con ADC LIV-1 quimérico o humanizado o ADC de control que no se une (3 mg/kg) comenzó cuando los tumores alcanzaron los 100 mm3 (q4d x 4 inyecciones intraperitoneales). Los volúmenes tumorales se controlaron con calibradores y los animales se sacrificaron cuando el volumen tumoral alcanzó ~ 800 mm3. Se continuaron los gráficos del volumen medio del tumor para cada grupo hasta que se sacrificaron uno o más animales. Todos los procedimientos con animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en una instalación acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio.
Tinción inmunohistoquímica (IHC) de LIV-1
Método
Se obtuvieron micromatrices de tumores (TMA, por sus siglas en inglés) y muestras de tumores individuales de fuentes comerciales. Se adquirieron micromatrices de tejido de tejidos normales o tumorales fijados con formalina e incluidos en parafina (FFPE, por sus siglas en inglés) de US Biomax Inc. o Cybrdi. Se adquirió una matriz congelada de BioChain. Se compraron secciones individuales de NDRI, Asterand, Solución de tejido o CHTN. El Dr. R. Vessella, del Departamento de Cáncer Genitourinario de la Universidad de Washington, proporcionó un conjunto de 25 muestras incluidas en parafina de cáncer de próstata metastásico resistente a hormonas (sitios metastásicos correspondientes en huesos y tejidos blandos). Todas las muestras se procesaron en el aparato para tinción automático Bond-Max™ (Leica).
Tinción IHC de tejidos FFPE:
Los portaobjetos de FFPE o TMA seccionados en portaobjetos de vidrio se desparafinaron usando una solución Bond™ Dewax (Leica, n.° de catálogo AR9222) a 72 °C y se rehidrataron. La recuperación del antígeno se realizó usando la solución 2 de recuperación de epítopos Bond™ basada en EDTA (Leica, n.° de catálogo AR9640) durante 20 minutos a 95-100 °C antes de la incubación con el AcM murino LIV-1 primario (1-2 pg/ml para 30-45 minutos a 25 °C). La IgG1 murina de isotipo coincidente (Sigma; n.° de catálogo M5284) se usó como control negativo para la tinción de fondo. Para la tinción iHc automatizada se utilizó un kit Refine DAB o un kit de detección basado en fosfatasa alcalina: kit de detección de rojo Bond™ Polymer AP (Leica, n.° de catálogo DS9305). Los portaobjetos se incubaron con anticuerpos monoclonales primarios murinos contra AcM murino LIV-1 durante 45 minutos a 1 pg/ml con un bloqueo de proteína preliminar de 30 minutos (DAKO n.° de catálogo X0909). Después del desarrollo del cromógeno, las secciones se contratiñeron con hematoxilina y se cubrieron con cubreobjetos. Los portaobjetos se evaluaron y puntuaron mediante un patólogo y las imágenes se tomaron con un microscopio Zeiss Axiovert 200M (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, Nueva York).
IHC de tejidos congelados:
Se fijaron con acetona secciones de 5 pm de muestras congeladas/OCT durante 10 minutos, se secaron al aire durante 30 minutos y se trataron previamente durante 20 minutos con 1x Morphosave a temperatura ambiente. Los portaobjetos se cargaron en el aparato de tinción automática Bond-Max™ (Leica) y se tiñeron durante 45 minutos con anticuerpo primario con bloqueo de proteína preliminar de 30 minutos (DAKO n.° de catálogo X0909). Se usó IgG1 de ratón (BD Pharmingen n.° de catálogo 550878) como control negativo. Para la detección utilizamos el kit Bond Polymer Refine basado en DAB (Leica, n.° de catálogo DS9800). Después del desarrollo del cromógeno, las secciones se contratiñeron con hematoxilina y se cubrieron con cubreobjetos. Los portaobjetos se evaluaron y puntuaron por un patólogo.
Resultados
1. Unión del anticuerpo de ratón
La Kd para el anticuerpo monoclonal murino LIV-1, el anticuerpo BR2-14a (Documento US2004141983), se determinó para LIV-1 humana expresada como una proteína endógena en una línea celular de cáncer de mama humano o como una proteína recombinante en una línea celular CHO. La Kd para el anticuerpo Br2-14a murino LIV-1 también se determinó para LIV-1 de macaco cangrejero expresada como una proteína recombinante en una línea celular CHO. MCF7 es una línea celular de cáncer de mama humano. 293F es una línea celular de riñón embrionario humano. La Tabla 1 muestra que el anticuerpo tenía una constante de disociación aproximadamente 5 veces menor para LIV-1 no recombinante expresada a partir de una línea celular humana que LIV-1 recombinante, ya sea humana (hLIV-1) o de macaco cangrejero (cyLIV-1).
Tabla 1
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2. Diseño y prueba de anticuerpos humanizados
El punto de partida o anticuerpo donante para la humanización en este ejemplo es el anticuerpo de ratón BR2-14a producido por el hibridoma que tiene el número de referencia de ATCC PTA-5705A y se describe en el documento US2004141983. Las secuencias aceptoras humanas adecuadas son secuencias genómicas proporcionadas por VH1-02 y JH5 para la cadena pesada y por VK2-30 y Jk4 para la cadena ligera. Las secuencias aceptoras humanas muestran un 68 y un 85 por ciento de identidad con las secuencias donantes en los marcos de la región variable. Las CDR de cadena ligera de las secuencias aceptoras humanas son del mismo tipo canónico que las CDR de las secuencias donantes. Por el contrario, las CDR de cadena pesada de las secuencias aceptoras humanas diferían en su tipo canónico (la línea germinal era 1-3 frente a 1-2 para el donante murino).
La alineación de las secuencias donantes identificó once posiciones en la cadena pesada (H27, H28, H29, H30, H48, H66, H67, H71, H76, H93 y H94) y cinco posiciones en la cadena ligera (L36, L37, L45, L46 y L39) en las que la secuencia aceptora humana difiere de la secuencia donante y que puede afectar la unión del anticuerpo como resultado del contacto directo con el antígeno, afectando la conformación de las CDR o afectando el empaquetamiento entre cadenas pesadas y ligeras. Se hicieron cinco cadenas pesadas humanizadas y seis cadenas ligeras humanizadas mediante la incorporación de mutaciones inversas en diferentes permutaciones de estas posiciones (Figura 1 (alineación de secuencia) y Tabla 2).
Tabla 2: Mutaciones inversas
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Luego se expresaron anticuerpos humanizados que representan cada permutación de estas cadenas (30 posibilidades) de las cadenas pesada y ligera humanizadas. Las curvas de unión para LIV-1 humana recombinante expresada a partir de células CHO se muestran en la Figura 2. Las CE50 se resumen en la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3: CE50 para anticuerpos AcM LIV-1 humanizados, procedentes de BR2-14a, en LIV-1 humana expresada en células CHO
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Estos datos indican una variación considerable de CE50 entre los 30 anticuerpos humanizados probados con HBLB y HELE que muestran al menos dos veces mejor unión que el siguiente anticuerpo humanizado HBLF y márgenes más grandes sobre la mayoría de los anticuerpos humanizados. Las curvas de unión de la Figura 2 muestran que tanto HBLB como HELE tenían una unión más fuerte que el anticuerpo de ratón original.
El anticuerpo HBLB se seleccionó como el mejor de los anticuerpos humanizados porque tiene (junto con HELE) la unión más fuerte pero tiene menos mutaciones inversas en comparación con HELE, habiendo cuatro mutaciones inversas en HBLB y doce en HELE.
Se determinaron las CE50 para el AcM LIV-1 humanizado que se unía a LIV-1 humana expresada en células CHO para LIV-1 humana expresada como una proteína nativa en una línea celular MCF7 (Figura 3). De nuevo, se determinaron que AcM LIV-1 HBLB y HELE eran los aglutinantes más firmes.
La Kd para HBLB para LIV-1 humana en la línea celular MCF7 se determinó a partir del promedio de varias curvas de unión por saturación como 1,5 nM mientras que para el anticuerpo de ratón es 2,9 nM. En otras palabras, el anticuerpo HBLB tiene aproximadamente el doble de afinidad por LIV-1 humana nativa que el anticuerpo de ratón. La curva de unión por saturación que se muestra en la Figura 4 es un ejemplo representativo.
Se compararon dos formas de HBLB para la unión a LIV-1 humana expresada de forma recombinante a partir de células CHO. Una forma se expresó con IgG1 humana de tipo silvestre y regiones constantes kappa. La otra forma era la misma excepto por una mutación S239C (numeración EU) en la cadena pesada de IgG1 (denominada LIV-14d o HBLB S239C), que reduce la unión del anticuerpo a los receptores Fc gamma. Las curvas de unión y las CE50 de estos anticuerpos en comparación con el anticuerpo donante de ratón se muestran en la Figura 5. Las CE50 de ambas formas de HBLB eran similares entre sí (dentro del error del estudio) y ambas eran más fuertes que el anticuerpo de ratón.
Las CE50 para el AcM LIV-1 humanizado HBLB y HBLB S239C también se determinaron para LIV-1 de macaco cangrejero expresada como una proteína recombinante en una línea celular CHO. Ambos anticuerpos se unieron con igual afinidad (mejor que el AcM murino LIV-1).
Datos de expresión para LIV-1
Se utilizaron AcM murinos LIV-1 (al menos 2 para la concordancia) para el análisis inmunohistoquímico de varios tipos de tumores utilizando tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina.
Tabla 4: Sumario de los datos de ex resión de LIV-1 en muestras tumorales
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Se observó una menor positividad de IHC de LIV-1 en estudios realizados con micromatrices de tejido en comparación con grandes secciones de tejido. La diferencia en la expresión es altamente significativa, lo que sugiere que se prefiere el análisis de la expresión de LIV-1 en secciones de tejido más grandes. Hubo una buena concordancia de expresión usando al menos 2 AcM anti-LIV-1 diferentes. Las Figuras 6 y 7 muestran un alto nivel de expresión de LIV-1 en tumores de mama y de próstata posteriores a tratamiento hormonal (inhibidores de aromatasa o tamoxifeno), lo que proporciona una fuerte justificación para dirigirse a estos tumores usando un ADC LIV-1. La Figura 8 muestra la expresión detectable de LIV-1 en tejidos de cáncer de mama triple negativo (ER-, PgR-, Her2-). El nivel de expresión de LIV-1 en el cáncer de mama triple negativo mediante tinción inmunohistoquímica fue comparable al nivel en el modelo animal PC3, donde se demostró actividad antitumoral de ADC LIV-1. Los cánceres de mama triple negativos son, por tanto, una posible población diana, particularmente los cánceres de mama triple negativos que se ha encontrado que expresan LIV-1.
Actividad antitumoral in vitro de AcM hLIV-14 como ADC y AcM mejorado con función efectora (SEA)
La actividad antitumoral de los ADC LIV-1 in vitro se midió usando ensayos de citotoxicidad (Figura 9) y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Figuras 10 y 11). En primer lugar, se realizó un estudio de la expresión de LIV-1 en varias líneas celulares mediante análisis cuantitativo FACS. La línea celular de cáncer de mama MCF-7 de ATCC tenía el nivel más alto de célula/sitios de unión a LIV-1, en comparación con la línea celular MCF-7 de otras fuentes (datos no mostrados). Se usó esta línea celular para ambos ensayos in vitro. En referencia a la Figura 9, varios ADC hLIV-14 (el anticuerpo HBLB conjugado con vcMMAE (denominado 1006) o mcMMAF (denominado 1269) (ambas moléculas pequeñas y/o enlazadores descritos en el documento US20050238649)) fueron altamente eficaces para destruir células MCF-7, en comparación con los conjugados sin unión y de control murino (mIgG-1006, mIgG-1269, hIgG-1006 y hIgG-1269). Asimismo, los ADC LIV-14d mutantes de cisteína, que tenían un promedio de dos enlazadores de fármaco por anticuerpo también fueron muy eficaces en la destrucción de células MCF-7 según se midió mediante el ensayo citotóxico. En referencia a las figuras 10 y 11, en los ensayos de ADCC, la actividad de los ADC y AcM fucosilados/de tipo silvestre (TS) se comparó con las versiones mejoradas de función efectora (ADC y AcM no fucosilados, denominados SEA). Los resultados demostraron que los ADC y AcM LIV-1 mejorados con función efectora tienen una buena actividad de ADCC contra células MCF-7, en comparación con ADC o AcM mejorados con función no efectora (se compara, por ejemplo, la Figura 10 hLIV-1 SEA vcMMAE con hLIV-1 vcMMAE). En referencia nuevamente a la Figura 9, un ADC LIV-1 mejorado con función efectora (indicado como SEA) también tenía un nivel similar de actividad citotóxica como los ADC de tipo silvestre (no fucosilados) (se compara hLIV-1 SEA 1006 (vcMMAE) con hLIV-1 1006 (vcMMAE)). Por tanto, la citotoxicidad puede verse afectada tanto por la función efectora como por la acción conjugada.
Actividad antitumoral in vivo de ADC hLIV-14
Usando modelos de cáncer de mama (MCF-7) y cáncer de próstata (PC-3), se determinó la actividad antitumoral de los ADC LIV-1 (AcM quiméricos y humanizados (HBLB) con un promedio de 4 fármacos por anticuerpo) in vivo (Figuras 12-15). Los ADC LIV-1 conjugados con vcMMAE mostraron un retraso tumoral significativo en comparación con ADC no tratados y de control. Se observó al menos una regresión completa (RC) en todos los estudios que utilizaron LIV-1-vcMMAE a 3 mg/kg con varios animales que tenían tumores estáticos o que crecían lentamente en comparación con los controles. En referencia a la Figura 12, una forma quimérica del anticuerpo murino parental conjugado con vcMMAE dio como resultado regresiones completas en 3 de cada 7 ratones. En referencia a la Figura 13, el mismo ADC quimérico produjo una regresión completa en 1 de cada 8 ratones. En referencia a la Figura 14, un ADC humanizado (HBLB) conjugado con vcMMAE (hLIV-14-vcMMAE(4)) produjo una regresión completa en 1 de cada 8 ratones. Asimismo, una forma mutante de cisteína del anticuerpo HBLB, un enlazador de fármaco vcMMAE conjugado con cada cadena pesada en la posición 239, la producción de un conjugado con una carga de fármaco promedio de 2 enlazadores de fármaco por anticuerpo; denominado hLIV-14d-vcMMAE(2)) exhibió una actividad similar a la forma cargada con 4. En referencia a la Figura 15, el ADC humanizado (HBLB) conjugado con vcMMAE (hLIV-14-vcMMAE(4)) produjo una regresión completa en 1 de cada 8 ratones en un modelo de carcinoma de próstata. Por el contrario, la actividad de los dos mutantes de cisteína cargados no fue tan pronunciada en este modelo (se compara hLIV-14-vcMMAE(4) con hLIV-14d-vcMMAE(2) y hLIV-14-mcMMAF(4) con hLIV-14d-mcMMAF(2). En resumen, estos estudios demuestran que ADC LIV-1 puede detener o retrasar el crecimiento de cánceres que expresan LIV-1, incluyendo los de mama y próstata.
II. Humanización de BR2-22a
BR2-22a, a veces también denominado AcM2, es un anticuerpo monoclonal de ratón del isotipo IgG1 Kappa.
Metodologías:
A menos que se indique lo contrario a continuación, los métodos descritos para la humanización y prueba de BR2-14a también son aplicables a BR2-22.
Ensayos de unión por saturación
1 x 105 células que expresan antígeno (ya sea células MCF7 que expresan LIV-1 humana, células 293F, una línea celular CHO transfectada que expresa LIV-1 humana o una línea celular CHO transfectada que expresa LIV-1 de macaco cangrejero) se dividieron en alícuotas por pocillo de placas con fondo en V de 96 pocillos. Se añadió BR2-22a murino marcado con AlexaFluor-647 en concentraciones que variaban entre 0,66 pM y 690 nM y se incubó en hielo durante 30 minutos. Las células se sedimentaron y se lavaron 3X con PBS/BSA. A continuación, las células se sedimentaron y se resuspendieron en 125 pl de PBS/BSA. La fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo, utilizando el porcentaje de señal fluorescente saturada para determinar el porcentaje unido y posteriormente calcular la Kd aparente.
Ensayos de unión por competencia
1x105 células CHO que expresan LIV-1 recombinante en PBS se dividieron en alícuotas en cada pocilio de placas de fondo en V de 96 pocillos sobre hielo. Las células se incubaron durante 1 hora con BR2-22a parental marcado con AlexaFluor-647 (AF) 5 nM y concentraciones crecientes (de 0,038 nM a 600 nM) de anticuerpo BR2-22a humanizado sin marcar en todas las combinaciones de cadenas ligeras humanizadas LA-LG y cadenas pesadas humanizadas HA-HG. Las células se sedimentaron y se lavaron 3 veces con PBS. A continuación, las células se sedimentaron y se resuspendieron en 125 pl de PBS/BSA. La fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo, utilizando el porcentaje de señal fluorescente saturada para determinar el porcentaje de anticuerpo BR2-22a humanizado marcado unido y posteriormente extrapolar la CE50 ajustando los datos a una curva de dosis-respuesta sigmoidea con pendiente variable.
Estudio de actividad in vivo
A ratones atímicos (nu/nu) (7-8 animales/grupo) se les implantaron células tumorales cultivadas en cultivo: MCF-7 (NCI) a 5x106 en matrigel al 25%, PC3 de ATCC (2,5 x 106 células en matrigel al 25 %) y PC3 de DSMZ (5 x 105 en matrigel al 25 %). Para el crecimiento in vivo de células MCF-7, los ratones hembras también recibieron complementos de estrógeno mediante la implantación de una pildorita de estrógeno de liberación lenta (liberación de 90 días). La dosificación con ADC LIV-1 quimérico o humanizado o ADC de control que no se une (3 mg/kg) comenzó cuando los tumores alcanzaron los 100 mm3 (q4d x 4 inyecciones intraperitoneales). Los volúmenes tumorales se controlaron con calibradores y los animales se sacrificaron cuando el volumen tumoral alcanzó ~ 800 mm3. Se continuaron los gráficos del volumen medio del tumor para cada grupo hasta que se sacrificaron uno o más animales. Todos los procedimientos con animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en una instalación acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio.
Sumario de resultados y discusión
Unión por saturación
BR2-22a muestra un 94 % de identidad con BR2-14a en la región variable de cadena pesada madura y un 91 % de identidad en la región variable de cadena ligera madura. Se determinó la KD para el Liv1 murino de BR2-22a (Tabla 5) para LIV-1 humana expresada como una proteína endógena en una línea celular de cáncer de mama humano, en células 293F o como proteína recombinante en una línea celular CHO. También se determinó la KD para BR2-22a para LIV-1 de macaco cangrejero expresado como una proteína recombinante en una línea celular CHO.
T abla 5: M i fini BR2-22 r LIV-1 h m n hLIV-1 m n r r yLIV-1).
Figure imgf000030_0001
Estrategia de humanización
El anticuerpo BR2-22a se humanizó utilizando una secuencia aceptora de la línea germinal JH5 VH1-02 para la cadena pesada y una secuencia aceptora de JK4 VK2-30 para la cadena ligera. Estas secuencias aceptoras se eligieron basándose en que tenían la mayor identidad de secuencia con los marcos de la región variable madura de las cadenas pesada y ligera de BR2-22A. Inicialmente se construyeron cinco variantes de cadenas pesadas. Cada una incluía los tres CDR de Kabat de la cadena pesada de BR2-22a, las cadenas difieren en tener de cero (VA) a 11 (VE) mutaciones inversas. Inicialmente se construyeron seis variantes de cadenas ligeras. Cada una incluía las tres CDR de Kabat de la cadena ligera de BR2-22a y de cero (LA) a cuatro mutaciones inversas (LF). Estas mutaciones inversas se eligieron como resultado de modelar el anticuerpo BR2-22A para identificar posiciones con posibilidades para interactuar con el antígeno directamente, afectan la conformación de la CDR o afectan la interfaz entre las cadenas pesada y ligera y se basan en la experiencia previa en la humanización de BR2-14a debido a la alta identidad de secuencia entre BR2-14a y BR2-22a. De hecho, las mismas once posiciones en la cadena pesada y las mismas cuatro posiciones en la cadena ligera se consideraron para la mutación inversa tanto en BR2-14a como en BR2-22a (L39 no se consideró en BR2-22a porque el resto de ratón es el mismo que el resto humano). Las mutaciones inversas presentes en cada variante de BR2-22a humanizado se muestran en las Tablas 6 y 7 a continuación.
Tabla 6
variante de Vh secuencia aceptora de exón de VH restos de marco de donante
hVH A VH1-02 Ninguno
hVH B VH1-02 H29, H30, H76
hVH C VH1-02 H66, H67, H71
hVH D VH1-02 H27, H93, H94
hVH E VH1-02 H27, H28, H29, H30, H48, H66, H67, H71, H76, H93, H94 hVH F VH1-02 H27, H29, H30, H94
hVH G VH1-02 H27, H29, H30, H76, H94
Tabla 7
variante de Vl secuencia aceptora de exón de VL restos de marco de donante hVK A VK2-30 Ninguno
Figure imgf000031_0001
La secuencia completa de la región variable madura de cada variante se muestra en las Figuras 16A y 16B.
Todas las permutaciones de estas cinco cadenas pesadas y seis cadenas ligeras se probaron luego en un ensayo por competencia en comparación con BR2-22a (véase la Figura 17). Sorprendentemente, en vista de la experiencia con el anticuerpo BR2-14a en el que se obtuvo una unión mejorada en relación con el anticuerpo de ratón con solo cuatro mutaciones inversas y otras mutaciones inversas no necesariamente mejoraron la afinidad de unión, la única combinación de cadenas humanizadas que mostró una afinidad de unión cercana a la de BR2-22a fue HELF con 15 mutaciones inversas. Las otras permutaciones mostraron una unión pobre o no significativa a LIV-1. Las CE50 de las diferentes permutaciones se muestran en la Tabla 8 a continuación.
T l : E r n i r BR2-22 h m niz s
Figure imgf000031_0002
(continuación)
Figure imgf000032_0001
Aunque HELF muestra una unión satisfactoria, el anticuerpo contiene un total de 15 mutaciones inversas, un número mayor que el ideal con respecto a la posible inmunogenicidad. Por lo tanto, las cadenas HE y LF se variaron sistemáticamente para probar el efecto de eliminar mutaciones inversas individuales. La figura 18 muestra las variantes probadas. LF-1 a LF-4 difieren de LF en que cada una carece de una mutación inversa diferente presente en LF. De manera similar, HE-1 a HE-11 carecen de una de las mutaciones inversas presentes en HE. La Figura 19 compara LF-1 a LF-4 (cada una emparejada con HE). La Figura 19 muestra que LF-2 y LF-3 pierden una afinidad de unión sustancial en relación con Lf (indicado como HELF de control histórico en el gráfico), mientras que LF-1 y LF-4 no lo hacen. Se concluye que las mutaciones inversas L36 y L46 contribuyen sustancialmente a la retención de la afinidad de unión, mientras que se puede prescindir de las mutaciones inversas en las posiciones L37 y L45 sin un efecto significativo sobre la unión. La Figura 20 muestra curvas de unión similares para las variantes de HE. La Figura 20 muestra que HE-11 perdió la mayor parte de su unión, lo que indica que la mutación inversa en la posición H94 tiene el mayor efecto sobre la afinidad de unión de las mutaciones inversas probadas. La pérdida de mutaciones inversas en las posiciones H27, H29 y H30 también provocó una pérdida significativa de afinidad. El papel de H30 puede ser racionalizado por el resto de ratón como resultado de una mutación somática. La pérdida de una mutación inversa en la posición h 76 provocó cierta pérdida de afinidad. Podría prescindirse de las otras mutaciones inversas en las posiciones H28, H48, H66, H67, H71 y H93 con poco o ningún efecto sobre la afinidad de unión.
A la luz de estos experimentos, las cadenas pesadas HF y HG se construyeron al igual que la cadena ligera LG. HF incluye mutaciones inversas en H27, H29, H30 y H94 y h G incluye estas mutaciones y una mutación inversa en H76. LG contiene mutaciones inversas en L36 y L46. Varias permutaciones de HF, HG, LE y LF se probaron para determinar la unión por competencia como se muestra en la Figura 21 y todas mostraron unión dentro de un factor de tres del de BR2-22a de ratón.
A la luz de este experimento, se seleccionó HGLG para experimentos adicionales por representar la mejor combinación de afinidad de unión y la menor cantidad de mutaciones inversas. Este anticuerpo se denomina en lo sucesivo hLIV22. La afinidad de unión por saturación de hLIV22 por LIV-1 humana y de macaco cangrejero expresada a partir de células CHO se muestra en la Figura 22 en comparación con la de hLIV14. La Figura 22 muestra que hLIV22 tiene aproximadamente cuatro veces más afinidad (inversa de la constante de disociación) por LIV-1 humana que hLIV14. Adicionalmente, la afinidad de hLIV22 por LIV-1 humana es la misma dentro del error experimental que su afinidad por LIV-1 de macaco cangrejero, mientras que hLIV14 muestra el doble de afinidad por LIV-1 humana que por LIV-1 de macaco cangrejero. La afinidad de hLIV22 por LIV-1 humana es la misma dentro del error experimental que la del anticuerpo de ratón parental, BR2-22a.
Actividad antitumoral in vitro de ADC hLIV22
La actividad antitumoral de ADC hLIV22 in vitro se midió utilizando ensayos de citotoxicidad. En primer lugar, se realizó un estudio de la expresión de LIV-1 en varias líneas celulares mediante análisis cuantitativo FACS. La línea celular de cáncer de mama MCF-7 de ATCC tenía el nivel más alto de célula/sitios de unión a LIV-1, en comparación con la línea celular MCF-7 de otras fuentes (datos no mostrados). Se usó esta línea celular para ensayos in vitro. Se observó que varios ADC hLIV22 (conjugados con vcMMAE (denominados 1006) o mcMMAF (denominados 1269) (ambas moléculas pequeñas descritas en el documento US 2005-0238649)) fueron altamente eficaces para destruir células MCF-7 según lo medido por el ensayo citotóxico in vitro. Las Figuras 23 y 24 comparan hLIV22 conjugado con 1006 o 1269 con un anticuerpo de control que no se une conjugado con 1006 o 1269.
Actividad antitumoral in vivo de ADC LIV-1
Usando modelos de cáncer de próstata (PC-3) y cáncer de mama (MCF-7) como se muestra en las Figuras 25 y 26, se determinó la actividad antitumoral de ADC hLIV22 (con un promedio de 4 fármacos por anticuerpo) in vivo. Los ADC hLIV22 conjugados con vcMMAE mostraron un retraso tumoral significativo en comparación con ADC no tratados y de control. Se observaron múltiples regresiones completas en el estudio MCF-7 utilizando hLIV22-vcMMAE a 3 mg/kg. Además, en todos los estudios hubo varios animales que tenían tumores estáticos o que crecían lentamente en comparación con los controles. Estos estudios demuestran que ADC hLIV22 puede detener o retrasar el crecimiento de cánceres que expresan LIV-1, incluyendo de mama y próstata. La Figura 27 compara la actividad de los ADC hLIV22 y hLIV14 en el modelo MCF-7. Aunque ambos anticuerpos fueron eficaces, hLIV22 fue ligeramente más eficaz. Los ADC hLIV22 también se probaron en un modelo de cáncer de cuello uterino. Para el ensayo se utilizó un modelo de xenoinjerto de células HeLA. Después de que los tumores crecieron hasta un tamaño apropiado, se administró hLIV22 conjugado con vcMMAE a animales a 3 mg/kg y 1 mg/kg. Se administró un conjugado de anticuerpo de control a 3 mg/kg. Se observó regresión completa y parcial en animales que recibieron 3 mg/kg de conjugado hLIV22 vcMMAE. (No se muestran los datos). Por tanto, Pueden usarse anticuerpos LIV-1 y conjugados de anticuerpo-fármaco para tratar cánceres de cuello uterino que expresan LIV-1.
III. Tratamiento de cáncer de piel usando anticuerpos anti-LIV-1
Expresión de la proteína LIV-1 en muestras de tumores de melanoma
Las muestras de melanoma de los pacientes se evaluaron para determinar la expresión de LIV-1, utilizando tinción IHC. Los portaobjetos de FFPE se desparafinaron usando una solución Bond™ Dewax (Leica, n.° de catálogo AR9222) a 72 °C. La recuperación de antígeno se realizó usando la Solución 2 de Recuperación de Epítopo Bond™ basada en EDTA (Leica, n.° de catálogo AR9640) durante 20 minutos a 100 °C. Para la tinción IHC se usó un kit de detección basado en fosfatasa alcalina: kit de detección de rojo Bond™ Polymer Refine (Leica, n.° de catálogo DS9390). Los portaobjetos se incubaron con anticuerpos monoclonales primarios murinos contra LIV-1 (BR2-14a) durante 45 minutos a 1 pg/ml con un bloqueo de proteína preliminar de 30 minutos (DAKO n.° de catálogo X0909). Se usó IgG de ratón (Sigma, n.° de catálogo M5284) como control negativo. Después del desarrollo del cromógeno, las secciones se contratiñeron con hematoxilina y se cubrieron con cubreobjetos. Los portaobjetos se evaluaron y puntuaron por un patólogo.
Los resultados se muestran en la Figura 28. El setenta y dos por ciento de las muestras de pacientes con melanoma analizadas (21/29) fueron positivas para la expresión de LIV-1. Esto indica que los inhibidores de LIV-1, por ejemplo, anticuerpos anti-LIV-1, se puede utilizar para tratar cánceres de melanoma.
Actividad antimelanoma in vivo de ADC LIV-1
Se implantan ratones atímicos (nu/nu) (7-8 animales/grupo) con 10x106 células SK-MEL-5 (una línea celular procedente de un tumor de melanoma) cultivadas en cultivo. Se deja que los tumores crezcan in vivo hasta que tengan 100 mm3, medido con un calibre. Los ADC LIV-1 humanizados, por ejemplo, hLIV14 o hLIV22, se administran a 3 mg/kg. Los conjugados de fármacos son, por ejemplo, vcMMAE o mcMMAF. Los ADC de control también se administran a los animales de control a 3 mg/kg. Los ADC se administran en forma de q4d x 4 inyecciones intraperitoneales. Los volúmenes tumorales se controlan con calibradores y los animales se sacrifican cuando el volumen tumoral alcanza ~ 800 mm3. La administración de ADC hLIV14 o ADC hLIV22 reduce en gran medida el crecimiento tumoral en animales en comparación con aquellos animales que recibieron ADC de control.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo humanizado contra LIV-1 que comprende una región variable de cadena pesada madura que comprende las tres CDR de Kabat de la SEQ ID NO: 53 y que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 53 siempre que la posición H27 esté ocupada por L, la posición H29 esté ocupada por I, la posición H30 esté ocupada por E y la posición H94 esté ocupada por V y una región variable de cadena ligera madura que comprende las tres CDR de Kabat de la SEQ ID NO: 60 y que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 60 siempre que la posición L36 esté ocupada por Y y la posición L46 esté ocupada por P.
2. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 53 y una región variable de cadena ligera madura al menos un 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 60; o
que comprende una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 53 y una región variable de cadena ligera madura al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 60.
3. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la región variable de cadena pesada madura se fusiona con una región constante de cadena pesada y la región variable de cadena ligera madura se fusiona con una región constante de cadena ligera, opcionalmente en donde la región constante de cadena pesada es una forma mutante de una región constante humana natural que tiene una unión reducida a un receptor Fcgamma en relación con la región constante humana natural.
4. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 3, en donde la región constante de cadena pesada es de isotipo IgG1.
5. El anticuerpo humanizado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo se conjuga con un agente citotóxico o citostático.
6. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 5, en donde el anticuerpo humanizado se conjuga con el agente citotóxico o citostático a través de un enlazador, opcionalmente en donde el enlazador es un enlazador peptídico escindible, en donde el enlazador es escindible en condiciones intracelulares.
7. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 6, en donde el enlazador es un enlazador peptídico escindible que tiene la fórmula: -Aa-Ww-Yy-, en donde:
-A- es una unidad ensanchadora;
a es 0 o 1 ;
cada -W- es independientemente una unidad de aminoácido;
w es independientemente un número entero que varía entre 0 y 12;
-Y- es una unidad separadora; e
y es 0, 1 o 2.
8. El anticuerpo humanizado de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en donde el agente citotóxico o citostático es un agente antitubulina, o en donde el agente citotóxico o citostático es una auristatina, opcionalmente en donde la auristatina es monometil auristatina F o monometil auristatina E.
9. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 8, en donde el enlazador está unido a monometil auristatina E formando un conjugado anticuerpo-fármaco que tiene la estructura:
Figure imgf000114_0001
en donde p indica el número promedio de moléculas fármaco-enlazador por anticuerpo en una población del conjugado anticuerpo-fármaco, en donde p varía de 1 a 8 y Ac designa el anticuerpo humanizado, opcionalmente en donde p es 4.
10. Un ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican una región variable de cadena pesada madura y una región variable de cadena ligera madura como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
11. Un vector que comprende el ácido nucleico o ácidos nucleicos de la reivindicación 10, opcionalmente en donde el vector es un vector de expresión.
12. Una célula hospedadora eucariota que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 10 o el vector de la reivindicación 11, opcionalmente en donde la célula hospedadora es una célula de ovario de hámster chino (CHO).
13. Un método para producir un anticuerpo anti-LIV-1 que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 12 en una condición adecuada para la producción del anticuerpo anti-LIV-1, opcionalmente en donde el método comprende además aislar el anticuerpo anti-LIV-1 producido por la célula hospedadora.
14. Un método para producir un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-LIV-1 que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 12 en una condición adecuada para la producción de un anticuerpo anti-LIV-1; aislar el anticuerpo anti-LIV-1 producido a partir de la célula hospedadora; y conjugar el anticuerpo anti-LIV-1 con un agente citotóxico o citostático.
15. Un anticuerpo humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para usar en el tratamiento de un paciente que tiene o está en riesgo de cáncer, en donde el uso comprende administrar el anticuerpo humanizado al paciente, opcionalmente en donde el cáncer es un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de cuello uterino o un melanoma, opcionalmente en donde el cáncer de mama es un cáncer de mama triple negativo.
16. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
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