JP5901517B2 - 抗原結合性タンパク質 - Google Patents

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Description

本発明は、抗原結合性タンパク質において用いるのに好適なリンカー、ある特定の抗原結合性タンパク質、ならびにこのようなタンパク質の作製方法およびその使用に関する。
抗体を治療用途に用いることは周知である。
抗体は、少なくとも２つの重鎖と２つの軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。ＩｇＭを除いて、通常、インタクト抗体は約１５０Ｋｄａのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）により構成される。通常、各軽鎖は１つの共有結合性ジスルフィド結合により重鎖と結合するが、免疫グロブリンアイソタイプによって重鎖間のジスルフィド結合の数は変化する。それぞれ重鎖と軽鎖は鎖内ジスルフィド架橋も有している。各重鎖には、一端に可変ドメイン（ＶＨ）があり、続いていくつかの定常領域がある。各軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）と、他端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と並び、また、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでいる。ほとんどの脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパとラムダと呼ばれる２つのタイプの１つに割り当てられる。ヒト抗体は、重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、５つの異なるクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに割り当てられる。ＩｇＧとＩｇＡは、さらにサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびにＩｇＡ１、ＩｇＡ２に細分化することができる。種変異体はマウスとラットで認められ、少なくともＩｇＧ２ａとＩｇＧ２ｂがある。可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特別の変異性を示す特定の領域によって、抗体に結合特異性を付与する。可変領域の中で、より保存される領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。インタクトな重鎖と軽鎖の可変ドメインはそれぞれ３つのＣＤＲによって連結されている４つのＦＲを含む。各鎖の中のＣＤＲはＦＲ領域によって互いに接近して置かれ、他方の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関係しないが、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への関与、Ｆｃγ受容体への結合による食作用、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）による半減期／クリアランス速度、および補体カスケードのＣ１ｑコンポーネントによる補体依存性細胞毒性、等種々のエフェクター機能を示す。
２つの抗原結合部位があり、その両方が同じエピトープに特異的であるのが、ＩｇＧ抗体の構造の特徴である。従って、それらは一重特異性である。
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性がある抗体である。そのような抗体を作る方法は、当業者には既知である。本来、二重特異性抗体の組み換え産生は、２つのＨ鎖が異なる結合特異性を有する２つの免疫グロブリンＨ鎖Ｌ鎖ペアの同時発現に基づいている。Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３０５ ５３７−５３９ （１９８３）， ＷＯ９３／０８８２９ ａｎｄ Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ ＥＭＢＯ， １０， １９９１, ３６５５‐３６５９参照。ＨとＬ鎖の任意組み合わせが可能なために、組み合わせ可能な１０種の異なる抗体構造の混合物が産生され、その内の１つだけが所望の結合特異性を有する。別のアプローチでは、少なくともヒンジ部、ＣＨ２およびＣＨ３領域の一部を含む重鎖定常領域に、所望の結合特異性を備えた可変ドメインを融合させる方法が含まれる。軽鎖結合に必要な部位を含んでいるＣＨ１領域が、少なくとも１つの融合体中に存在するのが好ましい。ＤＮＡコードしたこれらの融合体、また、所望ならそのＬ鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物へ同時導入する。しかし２つあるいは３つすべての鎖のコード配列を１つの発現ベクトルに挿入することも可能である。１つのアプローチでは、二重特異性抗体は、１つのアーム中に一つ目の結合特異性を有するＨ鎖と、他方のアーム中に二つ目の結合特異性を提供するＨ−Ｌ鎖ペアとで構成される。ＷＯ９４／０４６９０参照。また、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１, ２１０, １９８６も参照のこと。別のアプローでチは、単一ドメイン結合部位を含む抗体分子を含んでいる（ＷＯ２００７／０９５３３８に記述）。
本発明は、特に、１つまたは複数のエピトープ結合ドメインに連結されたタンパク質足場を含む抗原結合性タンパク質に関し、この抗原結合性タンパク質は少なくとも２つの抗原結合部位を有し、そのうちの少なくとも１つがエピトープ結合ドメインに由来し、少なくとも１つがペアード（対になった）ＶＨ／ＶＬドメインに由来する。
本発明はさらに、２つ以上の式Ｉ：
Figure 0005901517
の構造を含む少なくとも１つのホモ二量体を含む抗原結合性タンパク質に関し、
式中、Ｘは、定常重鎖ドメイン２および定常重鎖ドメイン３を含む定常抗体領域を表し；
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ７およびＲ８はエピトープ結合ドメインから独立に選択されたドメインを表し；
Ｒ２は、定常重鎖１およびエピトープ結合ドメインからなる群から選択されたドメインを表し；
Ｒ３は、ペアードＶＨおよびエピトープ結合ドメインからなる群から選択されたドメインを表し；
Ｒ５は、定常軽鎖およびエピトープ結合ドメインからなる群から選択されたドメインを表し；
Ｒ６は、ペアードＶＬおよびエピトープ結合ドメインからなる群から選択されたドメインを表し；
ｎは、０、１、２、３および４から独立に選択された整数を表し；
ｍは、０および１から独立に選択された整数を表し、
定常重鎖１および定常軽鎖ドメインが会合しており、
少なくとも１つのエピトープ結合ドメインが存在し、
さらに、Ｒ３がペアードＶＨドメインを表す場合は、Ｒ６はペアードＶＬドメインを表して、２つのドメインが一緒になって抗原に結合できるようにし；
さらに、エピトープ結合ドメインが本発明のリンカーによって該分子の残りの部分に連結される。
本発明は、モノクローナル抗体、または１つもしくは複数の１つ以上のドメイン抗体に連結された断片を含む構造に基づくＩｇＧ、ならびにそのようなタンパク質の作製方法およびその使用に関する。
また、本発明は、本明細書記載のうちのいずれかの抗原結合性タンパク質の重鎖をコードしたポリヌクレオチド配列、および本明細書記載のうちのいずれかの抗原結合性タンパク質の軽鎖をコードしたポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、等価のポリペプチド配列に対応するコード配列を示すが、このポリヌクレオチド配列を、開始コドン、適切なシグナル配列および停止コドンと共に発現ベクターに挿入することができることは理解されるであろう。本発明はさらに組み換え型の形質転換または形質移入した宿主細胞を提供し、この宿主細胞は本明細書記載のいずれかの抗原結合性構築物の重鎖、および軽鎖をコードした１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。
さらに、本発明は本明細書記載のいずれかの抗原結合性タンパク質物の産生方法を提供し、この方法は、第１および第２のベクターを含む宿主細胞を無血清培地中で培養するステップを含み、前記第１のベクターが本明細書記載のいずれかの抗原結合性タンパク質の重鎖をコードしたポリヌクレオチドを含み、前記第２のベクターが本明細書記載のいずれかの抗原結合性タンパク質の軽鎖をコードしたポリヌクレオチドを含む。
本発明はさらに本明細書記載の抗原結合性タンパク質および製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明はまた、配列番号８５で示される重鎖配列と配列番号３で示される軽鎖配列、または配列番号８６で示される重鎖配列と配列番号３で示される軽鎖配列、または配列番号２で示される重鎖配列と配列番号８７で示される軽鎖配列、または配列番号２で示される重鎖配列と配列番号８８で示される軽鎖配列、または配列番号８５で示される重鎖配列と配列番号８７で示される軽鎖配列、または配列番号８５で示される重鎖配列と配列番号８８で示される軽鎖配列、または配列番号８６で示される重鎖配列と配列番号８７で示される軽鎖配列、または配列番号８６で示される重鎖配列と配列番号８８で示される軽鎖配列を含むｍＡｂｄＡｂを提供する。
定義
本明細書で使われる用語「タンパク質足場」は、限定されるものではないが、免疫グロブリン（Ｉｇ）足場、例えば、ＩｇＧ足場を含み、これは４鎖または２鎖抗体であってもよく、または抗体のＦｃ領域のみを含んでもよく、あるいは１つまたは複数の抗体由来の定常領域を含んでもよい。また、この定常領域は、ヒトまたは霊長類起源であっても、ヒトまたは霊長類定常領域の人工キメラであってもよい。このようなタンパク質足場は、１つまたは複数の定常領域の他に抗原結合性部位を含んでもよい。例えば、タンパク質足場がＩｇＧ全体を含む場合もある。このようなタンパク質足場は、他のタンパク質ドメイン、例えばエピトープ結合ドメインまたはＳｃＦｖドメイン、等の抗原結合部位を有するタンパク質ドメインに結合可能である。
「ドメイン」は、他のタンパク質とは独立した三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。通常、ドメインは領域タンパク質の多様な機能特性の原因であり、多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残りの部分の機能を失うことなく、他のタンパク質に付加、除去または移動可能である。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む、折り畳みポリペプチド領域である。従って、これは完全抗体可変ドメイン、および、例えば、１つまたは複数のループが抗体可変ドメインの特徴を有しない配列、または切断された抗体可変ドメインやＮやＣ末端延長部を含む抗体可変ドメインにより置換された修飾可変ドメイン、ならびに少なくとも全長領域の結合活性と特異性を保持している可変ドメインの折り畳まれた断片を含む。
語句「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、別の可変領域またはドメインとは独立に、抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の異なる可変領域または可変ドメインと共に、ある種のフォーマット（例えば、ホモまたはヘテロ多量体）で存在できる。この場合、他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合には要求されていない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは新たな可変ドメインとは独立に抗原に結合する）。本明細書で使われる場合、「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、抗原に結合が可能な「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってもよいが、例えばげっ歯類（例はＷＯ００／２９００４で開示）、テンジクザメおよびラクダのＶＨＨｄＡｂ、等他の種由来の単一抗体可変ドメインを含んでもよい。ラクダＶＨＨはラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコ等の種由来の免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、これは元々軽鎖の欠けた重鎖抗体を産生する。このＶＨＨ領域は、当業者に利用可能な標準的な方法によりヒト化されてもよく、この領域も本発明による「ドメイン抗体」と考えられる。本明細書で使われる「ＶＨ」はラクダＶＨＨドメインを含む。ＮＡＲＶは、テンジクザメを含む軟骨魚類で特定された別のタイプの免疫グロブリン単一可変ドメインである。また、これらの領域は、新規抗原受容体可変領域（通常、Ｖ（ＮＡＲ）またはＮＡＲＶと省略）としても知られる。詳細は、Ｍｏｌ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ４４, ６５６−６６Ｖ （２００６）およびＵＳ２００５００４３５１９Ａ参照。
用語「エピトープ結合ドメイン」は、別の可変領域またはドメインとは独立に、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを指す。これは、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばヒト、ラクダ（ナノボディ）またはサメの免疫グロブリン単一可変ドメインであってもよく、または非免疫グロブリンドメイン、例えば、下記を含む群から選択された足場の誘導体であってもよい：ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）；リポカリン；プロテインＡ由来分子、例えばプロテインＡのＺ−領域（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａ−領域（アビマー／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ））；熱ショックタンパク質、例えばＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳ；トランスフェリン（トランスボディ（Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ））；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ−タイプレクチン領域（テトラネクチン）；ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン（ａｆｆｉｌｉｎ）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ））；これらは天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われたものである。
ＣＴＬＡ−４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４）は主にＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様Ｉｇ折畳を有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異種の配列と置換することにより異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ−４分子は、Ｅｖｉｂｏｄｙとして知られている。詳細は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８ （１‐２）， ３１−４５ （２００１）を参照のこと。
リポカリンは細胞外タンパク質ファミリーで、ステロイド、ビリン、レチノイドおよび脂質、等の小さな疎水性の分子を輸送する。これらは、円錐形構造の開口端に多くのループがある強固なβ−シート二次構造を有し、これは別の標的抗原に結合するように操作できる。アンチカリンはサイズが１６０−１８０アミノ酸で、リポカリン由来である。詳細は、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８２： ３３７−３５０ （２０００）， ＵＳ７２５０２９７Ｂ１およびＵＳ２００７０２２４６３３を参照のこと。
アフィボディは、黄色ブドウ球菌のプロテインＡ由来の足場で、抗原結合するように操作できる。このドメインは約５８のアミノ酸からなる３つのらせん状束で構成される。ライブラリは表面残基の無作為化により生成されている。詳細は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ.Ｓｅｌ.１７, ４５５−４６２ （２００４）およびＥＰ１６４１８１８Ａ１を参照のこと。
アビマーは、Ａ−ドメイン足場ファミリー由来の多ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の未変性ドメインは、明確なジスルフィド結合構造をとっている。多様性は、Ａ−ドメインファミリー中の天然突然変異の混ぜ合わせにより生成されている。詳細は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２）, １５５６−１５６１ （２００５） ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １６（６）, ９０９−９１７ （Ｊｕｎｅ ２００７）を参照のこと。
トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは許容表面ループに挿入する操作により別の標的抗原に結合させることができる。操作したトランスフェリン足場の例には、トランスボディがある。詳細は、Ｊ. Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ ２７４, ２４０６６−２４０７３ （１９９９）参照。
設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、膜内在性タンパク質の細胞骨格への連結を媒介するタンパク質ファミリーであるアンキリン由来である。アンキリンの一つの繰り返し単位は３３残基のモチーフで、２つのα−螺旋とβ−回転とで構成される。これらは、各繰り返し中の一つ目のα−らせんとβ−回転の残基を無作為化することにより標的抗原に結合するよう操作できる。これらの結合面は、分子の数を増やすことにより増加させることができる（親和性成熟の方法）。詳細は、Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ３３２, ４８９−５０３ （２００３）, ＰＮＡＳ １００（４）, １７００−１７０５ （２００３）とＪ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ３６９, １０１５−１０２８ （２００７）およびＵＳ２００４０１３２０２８Ａ１参照。
フィブロネクチンは、抗原に結合させるように操作可能な足場である。アドネクチンは、ヒトＩＩＩ型フィブロネクチン（ＦＮ３）における１５繰り返し単位のうちの１０番目のドメインの天然アミノ酸配列骨格からなる。β−サンドイッチの一端の３つのループは操作によりアドネクチンに特異的に治療標的を認識させることができる。詳細は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ. Ｄｅｓ. Ｓｅｌ. １８, ４３５−４４４ （２００５）, ＵＳ２００８０１３９７９１, ＷＯ２００５０５６７６４およびＵＳ６８１８４１８Ｂ１参照。
ペプチドアプタマーはコンビナトリアル認識分子で、定常性足場タンパク質で構成され、このタンパク質の典型的例には、活性部位に挿入された制限付き可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）がある。詳細は、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ.Ｂｉｏｌ. Ｔｈｅｒ. ５, ７８３−７９７ （２００５）参照。
ミクロボディは、長さ２５−５０アミノ酸の自然発生のマイクロタンパク質由来で、３−４システインブリッジを含む。マイクロタンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢ１、コノトキシンおよびノッティンがある。マイクロタンパク質は、ループを有し、これは、マイクロタンパク質全体の折り畳みに影響を与えないで２５アミノ酸まで含有するように操作できる。操作されたノッティンドメインの詳細については、ＷＯ２００８０９８７９６参照。
他のエピトープ結合ドメインには、別の標的抗原の結合特性を操作するための足場として使われてきたタンパク質、例えばヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン（ａｆｆｉｌｉｎ）、ヒトプロテアーゼ阻害剤のｋｕｎｉｔｚタイプドメイン、Ｒａｓ−結合タンパク質ＡＦ−６のＰＤＺドメイン、サソリ毒（カリブドトキシン）、Ｃ−タイプレクチンドメイン（テトラネクチン）がある（これらは、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （２００７, ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓｔｅｆａｎ Ｄｕｂｅｌ）の７章Ｎｏｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＳｃａｆｆｏｌｄｓおよびＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５：１４−２７ （２００６）でレビューされている）。本発明のエピトープ結合ドメインは、これらの代替タンパク質ドメインに由来してもよい。
本明細書で使われる用語「ペアードＶＨドメイン」、「ペアードＶＬドメイン」、および「ペアードＶＨ／ＶＬドメイン」は、それらのパートナー可変ドメインペアとペアの場合のみ抗原に特異的に結合する抗体可変ドメインを指す。いずれの対形成でも常に１つのＶＨと１つのＶＬがあり、用語「ペアードＶＨドメイン」はＶＨパートナーを指し、用語「ペアードＶＬドメイン」はＶＬパートナーを指し、用語「ペアードＶＨ／ＶＬドメイン」は２つのドメインを一緒に表す。
本発明の一実施形態では、抗原結合部位は、少なくとも、Ｋｄ値１ｍＭで抗原に結合し、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）、例えば実施例７に記載されているＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）で測定してＫｄ値１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、で各抗原に結合する。
本明細書で使われる用語「抗原結合部位」は、抗原に特異的に結合可能なタンパク質上の部位を指し、単一ドメイン、例えばエピトープ結合ドメインであっても、標準的抗体上に認められるペアードＶＨ／ＶＬドメインであってもよい。本発明の一部の態様では、単一鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）ドメインは抗原結合性部位を提供できる。
用語「ｍＡｂ／ｄＡｂ」および「ｄＡｂ／ｍＡｂ」は、本明細書では本発明の抗原結合性タンパク質を指す。この２つの用語は、本明細書では相互に置き換え可能な使い方が可能で、同じ意味が意図されている。
用語「定常重鎖１」は本明細書では、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメインを指す。
用語「定常軽鎖」は本明細書では、免疫グロブリン軽鎖の定常ドメインを指す。
ＥＬＩＳＡで決定された、ＧＳおよびＧＳ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ＝１−４リンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２０１、２２０２、２２０３、２２０９およびＢＰＣ２２１０）の、ヒトＩＬ−４に対する結合を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡで決定された、ＧＳおよびＧＳ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ＝１−４リンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２０１、２２０２、２２０３、２２０９およびＢＰＣ２２１０）の、ヒトＩＬ−１３に対する結合を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡで決定された、（ＰＡＳ）ｎ＝１−３ＧＳおよび（Ｇ４Ｓ）ｎ＝１−３リンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２０４〜ＢＰＣ２２０８およびＢＰＣ２２２０）の、ヒトＩＬ−４に対する結合を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡで決定された、（ＰＡＳ）ｎ＝１−３ＧＳおよび（Ｇ４Ｓ）ｎ＝１−３リンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２０４〜ＢＰＣ２２０８およびＢＰＣ２２２０）の、ヒトＩＬ−１３に対する結合を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡで決定された、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ＝１−３ＧＳ、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ＝１−２ＧＳおよび（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ＝１−３ＧＳリンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２１１〜ＢＰＣ２２１５およびＢＰＣ２２１７〜ＢＰＣ２２１９）の、ヒトＩＬ−４に対する結合を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡで決定された、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ＝１−３ＧＳ、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ＝１−２ＧＳおよび（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ＝１−３ＧＳリンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２１１〜ＢＰＣ２２１５およびＢＰＣ２２１７〜ＢＰＣ２２１９）の、ヒトＩＬ−１３に対する結合を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡで決定された、ＧＳおよびＧＳ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ＝１−４、（ＰＡＳ）ｎ＝１−３ＧＳおよび（Ｇ４Ｓ）ｎ＝１−３リンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２２１〜ＢＰＣ２２３１）の、ヒトＩＬ−４に対する結合を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡで決定された、ＧＳおよびＧＳ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ＝１−４、（ＰＡＳ）ｎ＝１−３ＧＳおよび（Ｇ４Ｓ）ｎ＝１−３リンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２２１〜ＢＰＣ２２３１）の、ヒトＩＬ−１３に対する結合を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡで決定された、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ＝１−３ＧＳおよびＴＶＳＤＶＰＧＳおよび（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ＝２−３ＧＳリンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２３４〜ＢＰＣ２２３７、ＢＰＣ２２４１およびＢＰＣ２２４２）の、ヒトＩＬ−４に対する結合を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡで決定された、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ＝１−３ＧＳおよびＴＶＳＤＶＰＧＳおよび（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ＝２−３ＧＳリンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２３４〜ＢＰＣ２２３７、ＢＰＣ２２４１およびＢＰＣ２２４２）の、ヒトＩＬ−１３に対する結合を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡで決定された、精製ｍＡｂｄＡｂ（ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７）の、ヒトＩＬ−４に対する結合を示すグラフである。ＩＬ−４対照ｍＡｂは「パスコリズマブ」と表示されている。 ＴＦ−１細胞バイオアッセイにおける、ヒトＩＬ−４に対する精製ｍＡｂｄＡｂ（ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７）によるヒトＩＬ−４の中和を示すグラフである。ＩＬ−４対照ｍＡｂは「パスコリズマブ」と表示されている。 ＴＦ−１細胞バイオアッセイにおける、ヒトＩＬ−１３に対する精製ｍＡｂｄＡｂ（ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７）によるヒトＩＬ−１３の中和を示すグラフである。ＩＬ−４対照ｍＡｂは「パスコリズマブ」と表示されている。 ＥＬＩＳＡで決定された、ＢＰＣ２６５１、ＢＰＣ２６５２およびＢＰＣ２６５３のＴＮＦαに対する結合を示すグラフである。
本発明は、１つまたは複数のエピトープ結合ドメインに連結したタンパク質足場を含む抗原結合性タンパク質であって、少なくとも２つの抗原結合部位を有し、そのうちの少なくとも１つはエピトープ結合ドメインに由来し、少なくとも１つはペアードＶＨ／ＶＬドメインに由来する抗原結合性タンパク質に関する。
このような抗原結合性タンパク質は、タンパク質足場を含み、この足場は、例えばＩｇＧ等のＩｇ足場、例えば１つまたは複数のエピトープ結合ドメインに結合するモノクローナル抗体、例えばドメイン抗体を含み、結合タンパク質少なくとも２つの抗原結合部位を有し、そのうちの少なくとも１つがエピトープ結合ドメインに由来する。また、本発明はこれを産生する方法およびその使用、特に治療での使用に関する。
本発明の抗原結合性タンパク質はｍＡｂｄＡｂまたはｄＡｂｍＡｂとも呼ばれる。
一実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質のタンパク質足場は、Ｉｇ足場、例えばＩｇＧ足場またはＩｇＡ足場である。ＩｇＧ足場は、抗体の全てのドメイン（すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ、ＶＬ）を含んでもよい。本発明の抗原結合性タンパク質はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＧ４ＰＥから選択されたＩｇＧ足場を含んでもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質は少なくとも２つの抗原結合部位を有し、例えば２つの結合部位のうち、一つ目の結合部位は抗原上の第１のエピトープに特異性を有し、二つ目の結合部位は同じ抗原上の第２のエピトープに特異性を有する。さらなる実施形態では、４つの抗原結合部位、または６つの抗原結合部位、または８つの抗原結合部位、または１０個以上の抗原結合部位が存在する。一実施形態では、抗原結合性タンパク質は２つ以上の抗原、例えば２つの抗原、または３つの抗原、または４つの抗原に対して特異性を有する。
別の態様では、本発明は、２つ以上の式Ｉの構造を含むホモ二量体の少なくとも１つを含む抗原結合性タンパク質に関する：
Figure 0005901517
式中、Ｘは、定常重鎖ドメイン２および定常重鎖ドメイン３を含む定常抗体領域を表し；
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ７およびＲ８はエピトープ結合ドメインから独立に選択されたドメインを表し；
Ｒ２は、定常重鎖１およびエピトープ結合ドメインからなる群から選択されたドメインを表し；
Ｒ３は、ペアードＶＨおよびエピトープ結合ドメインからなる群から選択されたドメインを表し；
Ｒ５は、定常軽鎖およびエピトープ結合ドメインからなる群から選択されたドメインを表し；
Ｒ６は、ペアードＶＬおよびエピトープ結合ドメインからなる群から選択されたドメインを表し；
ｎは、０、１、２、３および４から独立に選択された整数を表し；
ｍは、０および１から独立に選択された整数を表し、
定常重鎖１および定常軽鎖ドメインが会合しており、
少なくとも１つのエピトープ結合ドメインが存在し、
さらに、Ｒ３がペアードＶＨドメインを表す場合は、Ｒ６はペアードＶＬドメインを表して、２つのドメインが一緒になって抗原に結合できるようにする。
一実施形態では、Ｒ６はペアードＶＬを表し、Ｒ３はペアードＶＨを表す。
さらなる実施形態では、Ｒ７とＲ８のどちらか、または両方がエピトープ結合ドメインを表す。
またさらなる実施形態では、Ｒ１とＲ４のどちらか、または両方がエピトープ結合ドメインを表す。
一実施形態では、Ｒ４が存在する。
一実施形態では、Ｒ１、Ｒ７およびＲ８はエピトープ結合ドメインを表す。
一実施形態では、Ｒ１、Ｒ７、Ｒ８およびＲ４はエピトープ結合ドメインを表す。
一実施形態では、（Ｒ１）ｎ、（Ｒ２）ｍ、（Ｒ４）ｍおよび（Ｒ５）ｍ＝０、すなわち存在せず、Ｒ３はペアードＶＨドメインであり、Ｒ６はペアードＶＬドメインであり、Ｒ８はＶＨｄＡｂであり、およびＲ７はＶＬｄＡｂである。
別の実施形態では、（Ｒ１）ｎ、（Ｒ２）ｍ、（Ｒ４）ｍおよび（Ｒ５）ｍは０、すなわち存在せず、Ｒ３はペアードＶＨドメインであり、Ｒ６はペアードＶＬドメインであり、Ｒ８はＶＨｄＡｂであり、および（Ｒ７）ｍ＝０すなわち存在しない。
別の実施形態では、（Ｒ２）ｍおよび（Ｒ５）ｍは０、すなわち存在せず、Ｒ１はｄＡｂであり、Ｒ４はｄＡｂであり、Ｒ３はペアードＶＨドメインであり、Ｒ６はペアードＶＬドメインであり、（Ｒ８）ｍと（Ｒ７）ｍ＝０、すなわち存在しない。
本発明の一実施形態では、エピトープ結合ドメインは免疫グロブリン単一可変ドメインである。
本明細書記載の抗原結合性タンパク質はいずれも１つまたは複数の抗原を中和することができることは、理解されるであろう。
本発明の抗原結合性タンパク質に関連して本明細書で使われる用語「中和する」およびその文法的変形体は、本発明の抗原結合性タンパク質の存在下、このような抗原結合性タンパク質の無い場合の標的の活性に比較して、全体的または部分的に標的の生物活性が低下することを意味する。限定されないが、中和は、リガンドのブロッキング、受容体を活性化するリガンドの阻害、受容体の発現低下、またはエフェクター機能への作用のうちの１つまたは複数であってもよい。
中和のレベルはいくつかの方法、例えば、下記の実施例および方法、例えば、受容体に対するリガンドの結合の阻害を測定するアッセイで示されるような任意のアッセイの使用により測定可能である。このようなアッセイでは、リガンドの中和は、中和作用のある抗原結合性タンパク質の存在下でリガンドとその受容体の間の結合性の低下を評価することにより測定することができる。
中和のレベルは、例えば、実施例４．３または４．４に記載されるように実施可能なＴＦ１アッセイで測定することができる。このアッセイでは、ＩＬ−４、ＩＬ−１３またはこれらサイトカインの両方の中和は、中和作用のある抗原結合性タンパク質の存在下でＴＦ１細胞増殖の阻害を評価することにより測定することができる。
中和を評価する他の方法、例えば中和する抗原結合性タンパク質の存在下、リガンドとその受容体間の結合低下を評価することにより測定する方法は、当業者には既知であり、例えば、ＥＬＩＳＡリガンド受容体阻害アッセイまたはＢｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイがある。
本発明の別の態様では、少なくとも実質的に本明細書で例示されているものと等価な中和活性を有する抗原結合性タンパク質、例えば、実施例２で示されるＩＬ−１３／４結合アッセイにおいてＢＰＣ２２０１、ＢＰＣ２２０２、ＢＰＣ２２０３、ＢＰＣ２２０９、ＢＰＣ２２１０、ＢＰＣ２２０４〜ＢＰＣ２２０８およびＢＰＣ２２２０の中和活性を保持する抗原結合性タンパク質が提供される。
本発明の抗原結合性タンパク質は、例えば、ＩＬ−１３に結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＩＬ−１３に結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むＩＬ−１３に対して特異性を有するものを含む。抗原結合性タンパク質はＩＬ−１３に結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質はＩＬ−１３に結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
一実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、例えば、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＬ−４から選択される２つ以上の抗原に結合可能な場合、ＩＬ−１３およびＩＬ−４に結合可能な場合、ＩＬ−１３およびＩＬ−５に結合可能な場合、またはＩＬ−５およびＩＬ−４に結合可能な場合のように２つ以上の抗原に対して特異性を有する。一実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、例えば、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＬ−４から選択される２つ以上の抗原に結合可能な場合、例えば、ＩＬ−１３およびＩＬ−４に同時に結合可能な場合、またはＩＬ−１３およびＩＬ−５に同時に結合可能な場合、またはＩＬ−５およびＩＬ−４に同時に結合可能な場合のように２つ以上の抗原に対して特異性を有する。
本明細書記載の抗原結合性タンパク質はいずれも、例えば実施例３に記載されたような適切なアッセイを使った化学量論的解析により測定することにより、同時に２つ以上の抗原に結合可能であってもよいことは理解されよう。
本発明の抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＩＬ−４に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＩＬ−４免疫グロブリン単一可変ドメインを有するＩＬ−１３抗体がある。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合した．ＩＬ−４エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１３抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１３抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１３抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１３抗体が含まれる。また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。本発明で用いられるＩＬ−１３抗体には、配列番号２８で示される重鎖配列および配列番号２７で示される軽鎖配列を含むものが含まれる。
このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＩＬ−１３に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインを有するＩＬ−４抗体がある。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−４抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−４抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−４抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−４抗体が含まれる。また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。
本発明で用いられるＩＬ−４抗体には、配列番号２で示される重鎖配列および配列番号３で示される軽鎖配列を含むものが含まれる。
このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＩＬ−５に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＩＬ−５免疫グロブリン単一可変ドメインを有するＩＬ−１３抗体がある。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−５エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１３抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−５エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１３抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−５エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１３抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−５エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１３抗体が含まれる。また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。
このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＩＬ−１３に対する特異性エピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインを有するＩＬ−５抗体がある。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。本発明で用いられるＩＬ−５抗体には、配列番号９１で示される重鎖配列および配列番号９２で示される軽鎖配列を含むものが含まれる。
このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＩＬ−５に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＩＬ−５免疫グロブリン単一可変ドメインを有するＩＬ−４抗体がある。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−５エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−４抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−５エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−４抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−５エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−４抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−５エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−４抗体が含まれる。また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。
このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＩＬ−４に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＩＬ−４免疫グロブリン単一可変ドメインを有するＩＬ−５抗体がある。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。
本発明はまた、ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−５に結合可能な三重特異性結合性タンパク質も提供する。
このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＩＬ−４に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＩＬ−４免疫グロブリン単一可変ドメイン、ならびに重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＩＬ−１３に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインを有するＩＬ−５抗体がある。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−５抗体が含まれる。
また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＩＬ−１８に対する特異性を有するもの、例えば、ＩＬ−１８に結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＩＬ−１８に結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。
抗原結合性タンパク質は、ＩＬ−１８に結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ＩＬ−１８に結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
本発明はまた、ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−１８に結合可能な三重特異性結合タンパク質も提供する。
このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端ＩＬ−１８に結合した、ＩＬ−４に対する特異性エピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＩＬ−４免疫グロブリン単一可変ドメイン、および重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＩＬ−１３に対する特異性エピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインを有する抗体がある。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１８抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１８抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１８抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１８抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１８抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１８抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１８抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１８抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１８抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および重鎖のＣ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１８抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および重鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１８抗体が含まれる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ−４エピトープ結合ドメイン、および軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ−１３エピトープ結合ドメインを有するＩＬ−１８抗体が含まれる。
また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＴＮＦαに対する特異性を有するもの、例えば、ＴＮＦαに結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＴＮＦαに結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。
抗原結合性タンパク質は、ＴＮＦαに結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ＴＮＦαに結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
一実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、例えば、ＴＮＦα、ＥＧＦＲおよびＶＥＧＦから選択される２つ以上の抗原に結合可能な場合、例えば、ＴＮＦαおよびＥＧＦＲに結合可能な場合、またはＴＮＦαおよびＶＥＧＦに結合可能な場合、またはＥＧＦＲおよびＶＥＧＦに結合可能な場合のうように２つ以上の抗原に対して特異性を有する。このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＥＧＦＲに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＥＧＦＲ免疫グロブリン単一可変ドメインを有するＴＮＦα抗体がある。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＥＧＦＲエピトープ結合ドメインを有するＴＮＦα抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＥＧＦＲエピトープ結合ドメインを有するＴＮＦα抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＥＧＦＲエピトープ結合ドメインを有するＴＮＦα抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＥＧＦＲエピトープ結合ドメインを有するＴＮＦα抗体が含まれる。また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＴＮＦαエピトープ結合ドメインを有するＥＧＦＲ抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＴＮＦαエピトープ結合ドメインを有するＥＧＦＲ抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＴＮＦαエピトープ結合ドメインを有するＥＧＦＲ抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＴＮＦαエピトープ結合ドメインを有するＥＧＦＲ抗体が含まれる。また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。
このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＶＥＧＦに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＶＥＧＦ免疫グロブリン単一可変ドメインを有するＴＮＦα抗体がある。
本発明の抗原結合性タンパク質は、例えばＴＮＦαに結合可能な場合にように２つ以上の抗原に対して、また、例えばＴＮＦαおよびＩＬ−４に結合可能な場合、またはＴＮＦαおよびＩＬ−１３に結合可能な場合、またはＴＮＦαおよびＩＬ−１３およびＩＬ−４に結合可能な場合のようにＩＬ−４およびＩＬ−１３から選択される一方または両方の抗原に対して特異性を有してもよい。このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＴＮＦαに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＴＮＦαアドネクチンを有するＩＬ−１３抗体がある。このような抗原結合性タンパク質の他の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＴＮＦαに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＴＮＦαアドネクチンを有するＩＬ−４抗体がある。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＶＥＧＦエピトープ結合ドメインを有するＴＮＦα抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＶＥＧＦエピトープ結合ドメインを有するＴＮＦα抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＶＥＧＦエピトープ結合ドメインを有するＴＮＦα抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＶＥＧＦエピトープ結合ドメインを有するＴＮＦα抗体が含まれる。また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＴＮＦαエピトープ結合ドメインを有するＶＥＧＦ抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＴＮＦαエピトープ結合ドメインを有するＶＥＧＦ抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＴＮＦαエピトープ結合ドメインを有するＶＥＧＦ抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＴＮＦαエピトープ結合ドメインを有するＶＥＧＦ抗体が含まれる。また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＣＤ−２０に対する特異性を有するもの、例えば、ＣＤ−２０に結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＣＤ−２０に結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。
抗原結合性タンパク質は、ＣＤ−２０に結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ＣＤ−２０に結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＩＬ１Ｒ１に対する特異性を有するもの、例えば、ＩＬ１Ｒ１に結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＩＬ１Ｒ１に結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。
抗原結合性タンパク質は、ＩＬ１Ｒ１に結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ＩＬ１Ｒ１に結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
一実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、例えば、ＩＬ１Ｒ１および第２の抗原に結合可能な場合、例えば、ＩＬ１Ｒ１およびＶＥＧＦに結合可能な場合のような２つ以上の抗原に対する特異性を有する。このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＶＥＧＦに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＶＥＧＦ免疫グロブリン単一可変ドメインを有するＩＬ１Ｒ１抗体がある。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＶＥＧＦエピトープ結合ドメインを有するＩＬ１Ｒ１抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＶＥＧＦエピトープ結合ドメインを有するＩＬ１Ｒ１抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＶＥＧＦエピトープ結合ドメインを有するＩＬ１Ｒ１抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＶＥＧＦエピトープ結合ドメインを有するＩＬ１Ｒ１抗体が含まれる。また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＮ末端に結合したＩＬ１Ｒ１エピトープ結合ドメインを有するＶＥＧＦ抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＮ末端に結合したＩＬ１Ｒ１エピトープ結合ドメインを有するＶＥＧＦ抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、重鎖のＣ末端に結合したＩＬ１Ｒ１エピトープ結合ドメインを有するＶＥＧＦ抗体が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質には、軽鎖のＣ末端に結合したＩＬ１Ｒ１エピトープ結合ドメインを有するＶＥＧＦ抗体が含まれる。また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＥＧＦＲに対する特異性を有するもの、例えば、ＥＧＦＲに結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＥＧＦＲに結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。
抗原結合性タンパク質は、ＥＧＦＲに結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ＥＧＦＲに結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
一実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、例えば、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦから選択される２つ以上の抗原に結合可能な場合、例えば、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒに結合可能な場合、またはＥＧＦＲおよびＶＥＧＦに結合可能な場合、またはＶＥＧＦおよびＩＧＦ−１Ｒに結合可能な場合、またはＥＧＦＲおよびＶＥＧＦＲ２に結合可能な場合、またはＩＧＦ−１ＲおよびＶＥＧＦＲ２に結合可能な場合、またはＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ２に結合可能な場合、またはＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１ＲおよびＶＥＧＦＲ２に結合可能な場合、またはＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１ＲおよびＶＥＧＦＲ２に結合可能な場合、またはＥＧＦＲ、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ２に結合可能な場合、またはＥＧＦＲ、ＶＥＧＦおよびＩＧＦ１Ｒに結合可能な場合のように２つ以上の抗原に対して特異性を有する。このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＶＥＧＦＲ２に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＶＥＧＦＲ２アドネクチンを有するＥＧＦＲ抗体がある。
このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＶＥＧＦに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＶＥＧＦ免疫グロブリン単一可変ドメインを有するＥＧＦＲ抗体がある。
このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＥＧＦＲに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＥＧＦＲ免疫グロブリン単一可変ドメインを有するＶＥＧＦ抗体がある。
このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＶＥＧＦに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＶＥＧＦリポカリンを有するＩＧＦ−１Ｒ抗体がある。
このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＶＥＧＦＲ２に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＶＥＧＦＲ２アドネクチを有するＩＧＦ−１Ｒ抗体がある。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＩＬ−２３に対する特異性を有するもの、例えば、ＩＬ−２３に結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＩＬ−２３に結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。
抗原結合性タンパク質は、ＩＬ−２３に結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ＩＬ−２３に結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
一実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、例えば、ＴＨ１７タイプのサイトカイン、例えば、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２またはＩＬ−２１から選択される２つ以上の抗原に結合可能な場合、例えば、ＩＬ−２３およびＩＬ−１７に結合可能な場合、またはＩＬ−２３およびＩＬ−２１に結合可能な場合、またはＩＬ−２３およびＩＬ−２２に結合可能な場合のように２つ以上の抗原に対して特異性を有する。このような抗原結合性タンパク質の例には、重鎖のＣ末端もしくはＮ末端、または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合した、ＩＬ−１７に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＩＬ−１７免疫グロブリン単一可変ドメインを有するＩＬ−２３抗体がある。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＰＤＧＦＲαに対する特異性を有するもの、例えば、ＰＤＧＦＲαに結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＰＤＧＦＲαに結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。抗原結合性タンパク質は、ＰＤＧＦＲαに結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ＰＤＧＦＲαに結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＦＧＦＲ１に対する特異性を有するもの、例えば、ＦＧＦＲ１に結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＦＧＦＲ１に結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。抗原結合性タンパク質は、ＦＧＦＲ１に結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ＦＧＦＲ１に結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＦＧＦＲ３に対する特異性を有するもの、例えば、ＦＧＦＲ３に結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、ＦＧＦＲ３に結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。抗原結合性タンパク質は、ＦＧＦＲ３に結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ＦＧＦＲ３に結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＶＥＧＦＲ２に対する特異性を有するもの、例えば、ＶＥＧＦＲ２に結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＶＥＧＦＲ２に結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。抗原結合性タンパク質は、ＶＥＧＦＲ２に結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ＶＥＧＦＲ２に結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＶＥＧＦＲ３に対する特異性を有するもの、例えば、ＶＥＧＦＲ３に結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＶＥＧＦＲ３と結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。抗原結合性タンパク質には、ＶＥＧＦＲ３に結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質には、ＶＥＧＦＲ３に結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＶＥカドヘリンに対する特異性を有するもの、例えば、ＶＥカドヘリンに結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＶＥカドヘリンと結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。抗原結合性タンパク質は、ＶＥカドヘリンに結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ＶＥカドヘリンに結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ニューロピリンに対する特異性を有するもの、例えば、ニューロピリンに結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはニューロピリンと結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。抗原結合性タンパク質は、ニューロピリンに結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ニューロピリンに結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、Ｆｌｔ−３に対する特異性を有するもの、例えば、Ｆｌｔ−３に結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＦｌｔ−３と結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。抗原結合性タンパク質は、Ｆｌｔ−３に結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、Ｆｌｔ−３に結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ｒｏｎに対する特異性を有するもの、例えば、ｒｏｎに結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはｒｏｎと結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。抗原結合性タンパク質は、ｒｏｎに結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ｒｏｎに結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、Ｔｒｐ−１に対する特異性を有するもの、例えば、Ｔｒｐ−１に結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＴｒｐ−１と結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。抗原結合性タンパク質は、Ｔｒｐ−１に結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、Ｔｒｐ−１に結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
一実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、癌に関連する２つ以上の抗原に結合可能な場合、例えば、ＰＤＧＦＲα、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲおよびＶＥＧＦ、ＶＥカドヘリン、ニューロピリン、Ｆｌｔ−３、ｒｏｎ、Ｔｒｐ−１、ＣＤ−２０から選択される２つ以上の抗原に結合可能な場合、例えば、ＰＤＧＦＲαおよびＦＧＦＲ１に結合可能な場合、またはＰＤＧＦＲαおよびＶＥＧＦに結合可能な場合、またはＰＤＧＦＲαおよびＦＧＦＲ３に結合可能な場合、またはＰＤＧＦＲαおよびＶＥＧＦＲ２に結合可能な場合、またはＰＤＧＦＲαおよびＶＥＧＦＲ３に結合可能な場合、またはＰＤＧＦＲαおよびＩＧＦ１Ｒに結合可能な場合、またはＰＤＧＦＲαおよびＥＧＦＲに結合可能な場合、またはＰＤＧＦＲαおよびＶＥＧＦに結合可能な場合、またはＰＤＧＦＲαおよびＶＥカドヘリンに結合可能な場合、またはＰＤＧＦＲαおよびニューロピリンに結合可能な場合、またはＰＤＧＦＲαおよびＦｌｔ−３に結合可能な場合、またはＰＤＧＦＲαおよびｒｏｎに結合可能な場合、またはＰＤＧＦＲαおよびＴｒｐ１に結合可能な場合、またはＰＤＧＦＲαおよびＣＤ−２０に結合可能な場合、またはＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３に結合可能な場合、またはＦＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２に結合可能な場合、またはＦＧＦＲ１およびＶＥＧＲ３に結合可能な場合、またはＦＧＦＲ１およびＩＧＦ１Ｒに結合可能な場合、またはＦＧＦＲ１およびＥＧＦＲに結合可能な場合、またはＦＧＦＲ１およびＶＥＧＦに結合可能な場合、またはＦＧＦＲ１およびＶＥカドヘリンに結合可能な場合、またはＦＧＦＲ１およびニューロピリンに結合可能な場合、またはＦＧＦＲ１およびＦｌｔ−３に結合可能な場合、またはＦＧＦＲ１およびｒｏｎに結合可能な場合、またはＦＧＦＲ１およびＴｒｐ−１に結合可能な場合、またはＦＧＦＲ１およびＣＤ−２０に結合可能な場合、またはＦＧＦＲ３およびＶＥＧＦＲ２に結合可能な場合、またはＦＧＦＲ３およびＶＥＧＦＲ３に結合可能な場合、またはＦＧＦＲ３およびＩＧＦ１Ｒに結合可能な場合、またはＦＧＦＲ３およびＥＧＦＲに結合可能な場合、またはＦＧＦＲ３およびＶＥＧＦに結合可能な場合、またはＦＧＦＲ３およびＶＥカドヘリンに結合可能な場合、またはＦＧＦＲ３およびニューロピリンに結合可能な場合、またはＦＧＦＲ３およびＦｌｔ−３に結合可能な場合、またはＦＧＦＲ３およびｒｏｎに結合可能な場合、またはＦＧＦＲ３およびＴｒｐ−１に結合可能な場合、またはＦＧＦＲ３およびＣＤ−２０に結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３に結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ２およびＩＧＦ１Ｒに結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ２およびＥＧＦＲに結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦに結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ２およびＶＥカドヘリンに結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ２およびニューロピリンに結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ２およびＦｌｔ−３に結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ２およびｒｏｎに結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ２およびＴｒｐ−１に結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ２およびＣＤ−２０に結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ３およびＩＧＦ−１Ｒに結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ３およびＥＧＦＲに結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ３およびＶＥＧＦに結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ３およびＶＥカドヘリンに結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ３およびニューロピリンに結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ３およびＦｌｔ−３に結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ３およびＴｒｐ−１に結合可能な場合、またはＶＥＧＦＲ３およびＣＤ−２０に結合可能な場合、またはＩＧＦ１ＲおよびＥＧＦＲに結合可能な場合、またはＩＧＦ１ＲおよびＶＥＧＦに結合可能な場合、またはＩＧＦ１ＲおよびＶＥカドヘリンに結合可能な場合、またはＩＧＦ１Ｒおよびニューロピリンに結合可能な場合、またはＩＧＦ１ＲおよびＦｌｔ−３に結合可能な場合、またはＩＧＦ１Ｒおよびｒｏｎに結合可能な場合、またはＩＧＦ１ＲおよびＴｒｐ−１に結合可能な場合、またはＩＧＦ１ＲおよびＣＤ−２０に結合可能な場合、またはＥＧＦＲおよびＶＥＧＦに結合可能な場合、またはＥＧＦＲおよびＶＥカドヘリンに結合可能な場合、またはＥＧＦＲおよびニューロピリンに結合可能な場合、またはＥＧＦＲおよびＦｌｔ−３に結合可能な場合、またはＥＧＦＲおよびｒｏｎに結合可能な場合、またはＥＧＦＲおよびＴｒｐ−１に結合可能な場合、またはＥＧＦＲおよびＣＤ−２０に結合可能な場合、またはＶＥＧＦおよびＶＥカドヘリンに結合可能な場合、またはＶＥＧＦおよびニューロピリンに結合可能な場合、またはＶＥＧＦおよびＦｌｔ−３に結合可能な場合、またはＶＥＧＦおよびｒｏｎに結合可能な場合、またはＶＥＧＦおよびＴｒｐ−１に結合可能な場合、またはＶＥＧＦおよびＣＤ−２０に結合可能な場合、またはＶＥカドヘリンおよびニューロピリンに結合可能な場合、またはＶＥカドヘリンおよびＦｌｔ−３に結合可能な場合、またはＶＥカドヘリンおよびｒｏｎに結合可能な場合、またはＶＥカドヘリンおよびＴｒｐ−１に結合可能な場合、またはＶＥカドヘリンおよびＣＤ−２０に結合可能な場合、またはニューロピリンおよびＦｌｔ−３に結合可能な場合、またはニューロピリンおよびｒｏｎに結合可能な場合、またはニューロピリンおよびＴｒｐ−１に結合可能な場合、またはニューロピリンおよびＣＤ−２０に結合可能な場合、またはＦｌｔ−３およびｒｏｎに結合可能な場合、またはＦｌｔ−３およびＴｒｐ−１に結合可能な場合、またはＦｌｔ−３およびＣＤ−２０に結合可能な場合、またはｒｏｎおよびＴｒｐ−１に結合可能な場合、またはｒｏｎおよびＣＤ−２０に結合可能な場合、およびまたはＴｒｐ−１およびＣＤ−２０に結合可能な場合などのように２つ以上の抗原に対して特異性を有する。
また、このような抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または、軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインをさらに有してもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、β−アミロイドに対する特異性を有するもの、例えば、β−アミロイドに結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはβ−アミロイドと結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。
抗原結合性タンパク質は、β−アミロイドに結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、β−アミロイドに結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＣＤ−３に対する特異性を有するもの、例えば、ＣＤ−３に結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＣＤ−３と結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。
抗原結合性タンパク質は、ＣＤ−３に結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ＣＤ−３に結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ｇｐＩＩＩｂ／ＩＩに対する特異性を有するもの、例えば、ｇｐＩＩＩｂ／ＩＩａに結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはｇｐＩＩＩｂ／ＩＩａと結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。
抗原結合性タンパク質は、ｇｐＩＩＩｂ／ＩＩａに結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ｇｐＩＩＩｂ／ＩＩａに結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＴＧＦβに対する特異性を有するもの、例えば、ＴＧＦβに結合可能なエピトープ結合ドメインを含むか、またはＴＧＦβと結合するペアードＶＨ／ＶＬを含むものが含まれる。
抗原結合性タンパク質は、ＴＧＦβに結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合性タンパク質は、ＴＧＦβに結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
本発明の一実施形態では、ＡＤＣＣおよび／または補体活性化またはエフェクター機能を低減させるような抗体となる、定常領域を含み本明細書記載の発明に従った抗原結合性タンパク質が提供される。このような一実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプの本来の無効化定常領域または変異ＩｇＧ１定常領域を含んでもよい。適切な修飾の例は、ＥＰ０３０７４３４に記載されている。一例では、位置２３５および２３７（ＥＵインデックスナンバリング）のアラニン残基の置換が含まれる。
一実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、例えばＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性の１つまたは両方が可能なＦｃ機能を保持する。このような抗原結合性タンパク質は、軽鎖上、例えば、軽鎖のＣ末端上にエピトープ結合ドメインを含んでもよい。
また、本発明は、エピトープ結合ドメインを抗体の軽鎖上、特に、エピトー結合ドメインを軽鎖のＣ末端上に配置することにより抗原結合性タンパク質のＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能を維持する方法を提供する。このようなＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能は、当業者に既知の任意の適切なアッセイによって測定可能である。
本発明は、また、エピトープ結合ドメインを抗体の重鎖上、特に、エピトー結合ドメインを重鎖のＣ末端上に配置することにより抗原結合性タンパク質のＣＤＣ機能を低減させる方法を提供する。このようなＣＤＣ機能は、当業者に既知の任意の適切なアッセイによって測定可能である。
さらなる実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１ＲおよびＥＧＦＲから選択される２つ以上の抗原に結合可能であり、例えば、ＥＧＦＲおよびＶＥＧＦ、またはＥＧＦＲおよびＩＧＦ１Ｒ、またはＩＧＦ１ＲおよびＶＥＧＦに結合可能であり、あるいは例えばＴＮＦおよびＩＬ１−Ｒに結合可能である。ＩＧＦ−１Ｒ結合部位を含む本発明の実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質のＩＧＦ−１Ｒ結合部位は、タンパク質足場にペアードＶＨ／ＶＬドメインを含んでもよい。
一実施形態では、抗原結合性タンパク質は、免疫グロブリン単一可変ドメインであるエピトープ結合ドメインを含み、例えば、エピトープ結合ドメインは、ヒトＶＨまたはヒトＶＬであっても、ラクダＶＨＨ（ナノボディ）またはサメｄＡｂ（ＮＡＲＶ）であってもよい。
一実施形態では、抗原結合性タンパク質は、下記の群から選択される非免疫グロブリン足場、例えば、非免疫グロブリンドメインの誘導体であるエピトープ結合ドメインを含む：ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）；リポカリン；プロテインＡ由来分子例えばプロテインＡのＺドメイン（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａドメイン（アビマー／マキシボディ）；ＧｒｏＥＬやＧｒｏＥＳ等の熱ショックタンパク質；トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ−タイプレクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン（ａｆｆｉｌｉｎ）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン）；これは天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われたものである。
本発明の抗原結合性タンパク質は、アドネクチンであるエピトープ結合ドメインに結合したタンパク質足場、例えば、重鎖のＣ末端に結合したアドネクチンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、またはアドネクチンに結合したタンパク質足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したアドネクチンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、アドネクチンに結合したタンパク質足場、例えば、軽鎖のＣ末端に結合したアドネクチンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、アドネクチンに結合したタンパク質足場、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したアドネクチンを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、タンパク質足場、例えばＣＴＬＡ−４であるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したＣＴＬＡ−４を有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したＣＴＬＡ−４を有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したＣＴＬＡ−４を有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したＣＴＬＡ−４を有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、タンパク質足場、例えばリポカリンであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したリポカリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したリポカリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したリポカリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したリポカリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、タンパク質足場、例えばＳｐＡであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したＳｐＡを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したＳｐＡを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したＳｐＡを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したＳｐＡを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、タンパク質足場、例えばアフィボディであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したアフィボディを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したアフィボディを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したアフィボディを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したアフィボディを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、タンパク質足場、例えばａｆｆｉｍｅｒであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したａｆｆｉｍｅｒを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したａｆｆｉｍｅｒを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したａｆｆｉｍｅｒを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したａｆｆｉｍｅｒを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、タンパク質足場、例えばＧｒｏＥＬであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したＧｒｏＥＬを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したＧｒｏＥＬを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したＧｒｏＥＬを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したＧｒｏＥＬを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、タンパク質足場、例えばトランスフェリンであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したトランスフェリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したトランスフェリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したトランスフェリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したトランスフェリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、タンパク質足場、例えばＧｒｏＥＳであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したＧｒｏＥＳを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したＧｒｏＥＳを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したＧｒｏＥＳを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したＧｒｏＥＳを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、タンパク質足場、例えばＤＡＲＰｉｎであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したＤＡＲＰｉｎを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したＤＡＲＰｉｎを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したＤＡＲＰｉｎを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したＤＡＲＰｉｎを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、タンパク質足場、例えばペプチドアプタマーであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したペプチドアプタマーを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したペプチドアプタマーを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したペプチドアプタマーを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したペプチドアプタマーを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
本発明の一実施形態では、４つのエピトープ結合ドメイン、例えば４つのドメイン抗体があり、２つのエピトープ結合ドメインが同じ抗原に対し特異性を有してもよく、あるいは抗原結合性タンパク質中に存在する全てのエピトープ結合ドメインが同じ抗原に対し特異性を有してもよい。
本発明のタンパク質足場は、リンカーを使ってエピトープ結合ドメインに連結される。適切なリンカーの例は、１アミノ酸〜１５０アミノ酸の長さ、または１アミノ酸〜１４０アミノ酸、例えば、１アミノ酸〜１３０アミノ酸、または１〜１２０アミノ酸、または１〜８０アミノ酸、または１〜５０アミノ酸、または１〜２０アミノ酸、または１〜１０アミノ酸、または５〜１８アミノ酸のアミノ酸配列であってもよい。このような配列は、それ自身の三次構造を有してもよく、例えば、本発明のリンカーが単一可変ドメインを含んでもよい。一実施形態では、リンカーのサイズは、単一可変ドメインと同等である。適切なリンカーは、サイズが１〜２０オングストロームであってもよく、例えば、１５オングストローム未満、または１０オングストローム未満、または５オングストローム未満であってもよい。
本発明の一実施形態では、少なくとも１つのエピトープ結合ドメインは、配列番号５１〜７８、１１２〜１１４で示されるもののいずれか１つを含むリンカー、またはこのようなリンカーの複合で、Ｉｇ足場に直接結合している。
別の実施形態では、少なくとも１つのエピトープ結合ドメインは、配列番号５３〜６０、配列番号６２〜７２、配列番号７４、配列番号７６〜７８、配列番号１１２〜１１４で示されるもののいずれか１つを含むリンカー、またはこのようなリンカーの複合で、Ｉｇ足場に直接結合している。
本発明の抗原結合性タンパク質で使用するリンカーは、単体でも他のリンカーとの組み合わせでも、１つまたは複数のＧＳ残基のセット、例えば、「ＧＳＰＡＳ」または「ＰＡＳＧＳ」または「ＧＳＰＡＳＧＳ」を含んでもよい。
一実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ」によりＩｇ足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＧＧＧＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ」によりＩｇ足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ」によりＩｇ足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ」によりＩｇ足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」によりＩｇ足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」によりＩｇ足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」によりＩｇ足場に結合している。この全ての実施形態で、ｎ＝１〜１０、およびｍ＝０〜４、およびｐ＝２〜１０である。
このようなリンカーの例には、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝１およびｍ＝１（配列番号５８））、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝１（配列番号５９））、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝１（配列番号６０））、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝１）、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝０）、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝０）、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝０）がある。
このようなリンカーの例には、（ＧＧＧＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝２およびｍ＝０（配列番号６２））、（ＧＧＧＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝３およびｍ＝０（配列番号６３）（、（ＧＧＧＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝４およびｍ＝０）がある。
このようなリンカーの例には、（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝２およびｍ＝１（配列番号１１２））、（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝３およびｍ＝１（配列番号１１３））、（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝４およびｍ＝１（配列番号１１４））、（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝２およびｍ＝０）、（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝３およびｍ＝０）、（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝４およびｍ＝０）がある。
このようなリンカーの例には、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ここでｐ＝２およびｍ＝１（配列番号５３））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ここでｐ＝３およびｍ＝１（配列番号５４））、または（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ここでｐ＝４およびｍ＝１（配列番号５５））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ここでｐ＝５およびｍ＝１（配列番号５６））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ここでｐ＝６およびｍ＝１（配列番号５７））がある。
このようなリンカーの例には、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝１およびｍ＝１（配列番号６４））、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝１（配列番号６５））、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝１（配列番号６６））、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝１）、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝０）、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝０）、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝０）がある。
このようなリンカーの例には、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝１およびｍ＝１（配列番号６７））、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝１（配列番号６８））、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝１（配列番号６９））、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝１）、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝０）、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝０）、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝０）がある。
このようなリンカーの例には、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝１およびｍ＝１（配列番号７０））、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝１（配列番号７１））、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝１（配列番号７２））、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝１）、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝０）、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝０）、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝０）がある。
一実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、ヒト血清アルブミンに結合可能な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含む。
一実施形態では、少なくとも３つの抗原結合部位があり、例えば４または５または６または８または１０抗原結合部位があり、この抗原結合性タンパク質は少なくとも３または４または５または６または８または１０抗原に結合可能であり、例えば、３または４または５または６または８または１０抗原に同時に結合可能である。
また、本発明は、配列番号８５で示される重鎖配列および配列番号３で示される軽鎖配列、または配列番号８６で示される重鎖配列および配列番号３で示される軽鎖配列、または配列番号２で示される重鎖配列および配列番号８７で示される軽鎖配列、または配列番号２で示される重鎖配列および配列番号８８で示される軽鎖配列、または配列番号８５で示される重鎖配列および配列番号８７で示される軽鎖配列、または配列番号８５で示される重鎖配列および配列番号８８で示される軽鎖配列、または配列番号８６で示される重鎖配列および配列番号８７で示される軽鎖配列、または配列番号８６で示される重鎖配列および配列番号８８で示される軽鎖配列を含むｍＡｂｄＡｂも提供する。配列番号８５〜８８に用いられるリンカーがいずれも、本明細書に記載の他の任意のリンカーまたはリンカーの組み合わせ、特に、リンカーの「ＧＳ」部分で置換することができる。
一実施形態では、本発明は、タンパク質足場に連結した際のエピトープ結合ドメインの効力を改善する方法を提供し、該エピトープ結合ドメインはリンカーを用いずにタンパク質足場に直接連結された場合に、裸のエピトープ結合ドメインとして、すなわち、タンパク質足場に連結されない場合の、その効力に比べて低い効力を有するものであり、該方法は、該タンパク質足場と該エピトープ(eptiope)結合ドメインの間にペプチドリンカーを付加する工程を含み、該ペプチドリンカーは少なくとも１０のアミノ酸を含むか、あるいはペプチドリンカーは１０アミノ酸〜５０アミノ酸の間、または１０アミノ酸〜４０アミノ酸の間、または１０アミノ酸〜３６アミノ酸の間、または１２アミノ酸〜５０アミノ酸の間、または１２〜４０アミノ酸の間、または１２〜３６アミノ酸の間である。一実施形態では、ペプチドリンカーは、リンカー「ＴＶＡＡＰＳ」の１回または複数回の繰り返し、例えば、「（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ」を含み、例えば、リンカーは、「（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ」（ここでｍ＝０〜４およびｐ＝２〜１０）、「（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ」（ここでｎ＝２〜１０およびｍ＝０〜４）、「（ＧＧＧＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ」（ここでｍ＝０〜４およびｐ＝２〜１０）、「（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」（ここでｎ＝２〜１０およびｍ＝０〜４）、「（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」（ここでｎ＝２〜１０およびｍ＝０〜４）、および「（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」（ここで、ｎ＝２〜１０およびｍ＝０〜４）から選択される。
本方法の一実施形態では、タンパク質足場はＩｇ足場である。Ｉｇ足場は、抗体のＦｃドメインを含んでもよい。本方法のこのような一実施形態では、タンパク質足場は抗体である。本方法のこのような別の実施形態では、タンパク質足場は免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む、ここで、重鎖はＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、軽鎖はＣＬを含む。本法補言うのこのようなさらに別の実施形態では、タンパク質足場は可溶性受容体、すなわち、抗体のＦｃドメインと融合した受容体であり、例えば、可溶性受容体は、Ｂ７に結合可能な分子であるＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと融合した免疫グロブリンから構成される融合タンパク質であるアバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａとして市販）；関節リウマチ（ＲＡ）および他の炎症性症状の医療で用いるために開発されている、哺乳動物細胞発現系で生産された可溶性組み換えヒトｐ７５腫瘍壊死因子ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）とヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分の融合タンパク質であるエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）；ならびにサイトカインＢｌｙＳおよびＡＰＲＩＬに結合し、それによって活性化される、Ｂリンパ球ＴＡＣＩ受容体の受容体部分を含む組み換え融合タンパク質であるアタシセプトから選択可能である。可溶性タンパク質は、ＴＡＣＩ受容体の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃ部分の融合物を含む。ＴＡＣＩ受容体は、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。アタシセプトは過剰量のＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬと結合してそれらのＢ細胞との結合を妨げ、それにより、Ｂ細胞の成熟および抗体生産を調節する。アタシセプトは自己免疫疾患の治療のために開発されている。
一実施形態では、エピトープ結合ドメインは、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば、ヒトｄＡｂ、またはラクダＶＨＨ単一可変ドメイン（ナノボディ）である。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、非Ｉｇドメイン、例えば、本明細書に記載の非Ｉｇドメインである。
一実施形態では、融合タンパク質に関してエピトープ結合ドメインの効力を改善する方法は、
（ｉ）裸のエピトープ結合ドメインの元の効力を測定する工程、
（ｉｉ）結合ドメインをタンパク質足場、例えば、抗体に結合させる工程、
（ｉｉｉ）タンパク質足場に直接結合されている際のエピトープ結合ドメインの効力を測定する工程、
（ｉｖ）タンパク質足場に結合されている際の効力が元の効力よりも低ければ、エピトープ結合ドメインとタンパク質足場の間に少なくとも１０アミノ酸を含むペプチドリンカーを付加する工程
を含む。
別の実施形態では、融合タンパク質に関してヒトｄＡｂの効力を改善する方法は、
（ｉ）裸のヒトｄＡｂの元の効力を測定する工程、
（ｉｉ）ヒトｄＡｂを抗体と遺伝的に融合させる工程、
（ｉｉｉ）タンパク質足場に直接結合されている際のエピトープ結合ドメインの効力を測定する工程、
（ｉｖ）タンパク質足場に結合されている際の効力が元の効力よりも低ければ、エピトープ結合ドメインとタンパク質足場の間に少なくとも１０アミノ酸を含むペプチドリンカーを付加する工程
を含む。
エピトープ結合ドメインの効力は、当技術分野で公知のアッセイ、例えば、実施例７に記載されているものなどのＢＩＡｃｏｒｅ（商標）アッセイによって評価可能な結合親和性、すなわち、エピトープ結合ドメインの抗原と結合する能力を評価することによって測定することができる。あるいは、エピトープ結合ドメインの効力は、好適な細胞に基づく中和アッセイ、例えば、実施例４．３または４．４に記載されるように実施可能なＴＦ１アッセイによって測定することもできる。このアッセイにおけるＩＬ−４、ＩＬ−１３またはこれらのサイトカインの両方の中和は、中和作用のある抗原結合性タンパク質の存在下でＴＦ１細胞増殖の阻害を評価することにより測定することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、タンパク質足場に結合した際の効力が、ＢＩＡｃｏｒｅまたは好適な細胞に基づく中和アッセイによって測定した場合に、元の効力の５０％以内となるように、エピトープ結合ドメインの効力を修復することができる。別の実施形態では、修復される効力は元の効力の４０％以内、または元の効力の３０％以内、または元の効力の２０％以内、または元の効力の２０％以内、または元の効力の１５％以内、または元の効力の１０％以内である。別の実施形態では、タンパク質足場に結合された際の結合親和性は、元の結合親和性と実質的に同じである。
本発明はまた、医療における使用のための、例えば、癌、または喘息、関節リウマチもしくは骨関節炎などの炎症性疾患を治療するための薬剤の製造における使用のための抗原結合性タンパク質を提供する。
本発明は、癌、または喘息、関節リウマチもしくは骨関節炎などの炎症性疾患に罹患した患者の治療方法を提供し、この方法には、本発明の抗原結合性タンパク質を治療量投与するステップを含む。
本発明の抗原結合性タンパク質は、癌、または喘息、関節リウマチもしくは骨関節炎などの炎症性疾患の治療に使用可能である。
本発明の抗原結合性タンパク質は、何らかのエフェクター機能を有しうる。例えば、タンパク質足場がエフェクター機能を有する抗体由来のＦｃ領域を含む場合、タンパク質足場がＩｇＧ１由来のＣＨ２およびＣＨ３を含む場合などである。エフェクター機能のレベルは、既知の技術、例えば、ＣＨ２ドメインの変異により変えてもよい。例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインが２３９および３３２および３３０から選択された位置に１つまたは複数の変異を有する場合、その抗体が強化されたエフェクター機能を有するように、例えば、その変異はＳ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌから選択され、および／または、例えば、本発明の抗原結合性タンパク質のグリコシレーションプロファイルを変えてＦｃ領域のフコシル化を減少させるように変えることができる。
本発明に使われるタンパク質足場は、抗体の全てのドメインを含む全モノクローナル抗体足場を含み、または、本発明のタンパク質足場は、一価抗体のような従来にない構造を含んでもよい。このような一価抗体は、重鎖のヒンジ部がホモ二量体化しないように修飾されたペアード重鎖と軽鎖を含んでもよい（このような一価抗体は、WO2007059782に記述されている）。他の一価抗体は、機能的可変領域とＣＨ１領域が欠けた第２の重鎖と二量体化するペアード重鎖／軽鎖を含んでもよい。この場合、ホモ二量体よりもヘテロ二量体を形成するように第１と第２の重鎖を修飾して、２つの重鎖と１つの軽鎖を有する一価抗体ができる（このような一価抗体は、WO2006015371に記載されている）。このような一価抗体は、本発明のエピトープ結合ドメインが結合できるタンパク質足場を提供可能である。
本発明に使われるエピトープ結合ドメインは、別の可変領域またはドメインと独立して、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインであり、これは、ドメイン抗体であっても、または下記の群から選択された足場の誘導体であるドメインであってもよい：ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）；リポカイン；プロテインＡ誘導分子、例えばプロテインＡのＺドメイン（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａドメイン（アビマー／マキシボディ）；熱ショックタンパク質、例えばＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ；トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃタイプレクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン（ａｆｆｉｌｉｎ）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン）：これらは天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われたものである。一実施形態では、これはドメイン抗体であってもよく、また他の適切なドメイン、例えば、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、アフィボディ、アビマー、ＧｒｏＥＬ、トランスフェリン、ＧｒｏＥＳおよびフィブロネクチンからなる群から選択されたドメインであってもよい。一実施形態では、これは免疫グロブリン単一可変ドメイン、アフィボディ、アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）およびアドネクチンから選択されてもよい。別の実施形態では、これは、アフィボディ、アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）およびアドネクチンから選択されてもよい。別の実施形態では、これは、ドメイン抗体、例えば、ヒト、ラクダまたはサメ（ＮＡＲＶ）のドメイン抗体から選択されたドメイン抗体であってもよい。
エピトープ結合ドメインは、１つまたは複数の位置でタンパク質足場に結合可能である。これらの位置には、タンパク質足場のＣ末端およびＮ末端、例えば、ＩｇＧの重鎖のＣ末端および／または軽鎖のＣ末端、または例えばＩｇＧの重鎖のＮ末端および／または軽鎖のＮ末端が挙げられる。
一実施形態では、第１のエピトープ結合ドメインがタンパク質足場に結合し、第２のエピトープ結合ドメインが第１のエピトープ結合ドメインに結合する。例えばタンパク質足場がＩｇＧ足場の場合は、第１のエピトープ結合ドメインはＩｇＧ足場の重鎖のＣ末端に結合してもよく、そのエピトープ結合ドメインがそのＣ末端の位置で第２のエピトープ結合ドメインに結合してもよい。または例えば、第１のエピトープ結合ドメインは、ＩｇＧ足場の軽鎖のＣ末端に結合してもよく、その第１のエピトープ結合ドメインは、そのＣ末端の位置で第２のエピトープ結合ドメインにさらに結合してもよい。または例えば、第１のエピトープ結合ドメインは、ＩｇＧ足場の軽鎖のＮ末端に結合してもよく、その第１のエピトープ結合ドメインはそのＮ末端の位置で第２のエピトープ結合ドメインにさらに結合してもよい。または例えば、第１のエピトープ結合ドメインは、ＩｇＧ足場の重鎖のＮ末端に結合してもよく、その第１のエピトープ結合ドメインは、そのＮ末端の位置で第２のエピトープ結合ドメインにさらに結合してもよい。
エピトープ結合ドメインがドメイン抗体である場合は、一部のドメイン抗体が足場内の特定の位置に適合することがある。
本発明で使用するドメイン抗体は、通常のＩｇＧの重鎖および／または軽鎖のＣ末端で結合可能である。さらに、一部の免疫グロブリン単一可変ドメインは、通常の抗体の重鎖および軽鎖の両方のＣ末端に結合できる。
免疫グロブリン単一可変ドメインのＮ末端が抗体定常ドメイン（ＣＨ３またはＣＬのいずれか）に融合している構築物の場合は、ペプチドリンカーは、免疫グロブリン単一可変ドメインが抗原に結合するのを支援することができる。事実、免疫グロブリン単一可変ドメインのＮ末端は、抗原結合活性に関わる相補性決定領域（ＣＤＲＳ）の近傍に配置される。従って、短いペプチドリンカーは、エピトープ結合ドメインおよびタンパク質足場に対する定常ドメインの間のスペーサーとして作用し、これにより免疫グロブリン単一可変ドメインＣＤＲをより容易に抗原に近づけることができ、従って高い親和性での結合が可能となる。
免疫グロブリン単一可変ドメインがＩｇＧに結合する環境は、融合しようとする抗体鎖によって異なる：
ＩｇＧ足場の抗体軽鎖のＣ末端で融合する場合は、各免疫グロブリン単一可変ドメインが抗体ヒンジとＦｃ部の近くに配置されることが期待される。このような免疫グロブリン単一可変ドメインは相互に大きく離れていると思われる。通常の抗体では、Ｆａｂ断片間の角度、および各Ｆａｂ断片とＦｃ部間の角度は非常に大きく変動する。ｍＡｂｄＡｂの場合はＦａｂ断片間の角度は大きくは異ならないが、一方、各ＦａｂとＦｃ部間の角度には、ある程度の角度制約が観察されることがある。
ＩｇＧ足場の抗体重鎖のＣ末端で融合した場合、各免疫グロブリン単一可変ドメインはＦｃ部のＣＨ３ドメインの近くに配置されることが期待される。これはＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＦｃＲｎ）へのＦｃ結合特性に影響することは期待できない。理由は、これらの受容体が、ＣＨ２ドメイン（ＦｃγＲＩ、ＩＩおよびＩＩＩクラスの受容体の場合）またはＣＨ２およびＣＨ３ドメイン間のヒンジ（例えば、ＦｃＲｎ受容体の場合）と結合しているからである。このような抗原結合性タンパク質の別の特徴は、両免疫グロブリン単一可変ドメインが相互に空間的に接近していることが期待され、適切なリンカーにより与えられた柔軟性があるという条件下、これらのｄＡｂはホモ二量体さえ形成でき、従って、Ｆｃ部の「ジップド（ｚｉｐｐｅｄ）」四次構造化を促進し、この抗原結合性タンパク質の安定性を高めることができる。
このような構造の考察は、エピトープ結合ドメインに結合する最も適切な位置、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインのタンパク質足場（例えば、抗体）上の位置、の選択の助けとなり得る。
抗原のサイズ、その局在化（血液中または細胞表面上）、その四次構造（単量体または多量体）は変動可能である。通常の抗体は、ヒンジ部が存在することによりアダプター構築物として機能するように元々設計されているが、Ｆａｂ断片の先端での２つの抗原結合部位の方向は大きく変動でき、従って抗原の分子特性とその環境への適応が可能である。対照的に、抗体または他のタンパク質足場に結合した免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばヒンジ部を有しない抗体を含むタンパク質足場は、直接的あるいは間接的に構造的柔軟性に乏しい場合がある。
免疫グロブリン単一可変ドメインの溶液中結合状態と方法の理解も有益である。インビトロでｄＡｂは単量体での存在が多く、溶液中ではホモ二量体か多量体が多いという根拠が蓄積されてきた（Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ. （１９９９） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９０ ｐ６８５−６９８； Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ （２００３） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２５, ｐ５３１−５５３, Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３７ ｐ８９３−９０３； Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２ ｐ１１６１−１１６５； Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ. １０ ｐ６０７−６１４； Ｓｅｐｕｌｖａｄａ ｅｔ ａｌ （２００３） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３３ ｐ３５５−３６５）。これはＩｇドメインに関してインビボで観察された多量体発生、例えば、ベンスジョーンズタンパク質（免疫グロブリン軽鎖の二量体（Ｅｐｐ ｅｔ ａｌ （１９７５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４ ｐ４９４３−４９５２； Ｈｕａｎ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３ ｐ１４８４８−１４８５７； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｍｏｌ ｉｍｍｕｎｏｌ ３４ ｐ１２９１−１３０１）およびアミロイド線維（Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ. （２００７） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ. ３６７：６０３−８）を強く想起させる。
例えば、溶液中では二量体化する傾向のｄＡｂを軽鎖のＣ末端よりもＦｃ部のＣ末端に結合させることが望ましいという可能性もある。Ｆｃ部のＣ末端への結合により本発明の抗原結合性タンパク質との関連で、これらのｄＡｂが二量体化するからである。
本発明の抗原結合性タンパク質は、単一抗原に特異的な抗原結合部位を含んでもよく、２つ以上の抗原または単一抗原上の２つ以上のエピトープに対し特異的な抗原結合部位を有してもよく、また、抗原結合部位のそれぞれが同じまたは異なる抗原上の別々のエピトープに対し特異的であってもよい。
抗原結合部位はそれぞれ、サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、成長因子受容体、酵素（例えば、プロテアーゼ）、酵素の補因子、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質および炭水化物を含むヒトまたは動物タンパク質などの抗原に対して結合特異性を有し得る。サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、成長因子受容体およびその他のタンパク質を含む好適な標的としては、限定されるものではないが：ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カルジオトロフィン−１、ＣＥＡ、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ５６、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、エオタキシン−２、エクソダス−２、ＦＡＰα、ＦＧＦ−酸性、ＦＧＦ−塩基性、繊維芽細胞成長因子−１０、ＦＬＴ３リガンド、フラクタルカイン（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−β１、ヒト血清アルブミン、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−１受容体１型、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２ａ．ａ．）、ＩＬ−８（７７ａ．ａ．）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、インヒビンα、インヒビンβ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト成長因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンホタクチン、ミュラー管阻害物質、単球コロニー阻害因子、単球走化性タンパク質、Ｍ−ＣＳＦ、ｃ−ｆｍｓ、ｖ−ｆｍｓＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−４、骨髄前駆体阻害因子−１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニュールツリン、神経成長因子、β−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１α、ＳＤＦ１β、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ受容体Ｉ、ＴＮＦ受容体ＩＩ、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ Ａ、ＶＥＧＦ Ｂ、ＶＥＧＦ Ｃ、ＶＥＧＦ Ｄ、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＶＥＧＦ受容体３、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ１、１−３０９、ＨＥＲ １、ＨＥＲ ２、ＨＥＲ ３、ＨＥＲ ４、血清アルブミン、ｖＷＦ、アミロイドタンパク質（例えば、アミロイドα）、ＭＭＰ１２、ＰＤＫ１、ＩｇＥおよび本明細書に開示される他の標的が挙げられる。当然のことながら、このリストはけして網羅的なものではない。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、肺組織の標的、例えば、ＴＮＦＲ１、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−８Ｒ、ＩＬ−９、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２５、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＡＬＫ５、ＥＧＦＲ、ＦｃＥＲ１、ＴＧＦｂ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１８、ＣＥＡ、ＣＲ８、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、キマーゼ、ＦＧＦ、フリン、エンドセリン−１、エオタキシン（例えば、エオタキシン、エオタキシン−２、エオタキシン−３）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ、ＩｇＥ、ＩＦＮａ、Ｉ−３０９、インテグリン、Ｌ−セレクチン、ＭＩＦ、ＭＩＰ４、ＭＤＣ、ＭＣＰ−１、ＭＭＰ、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、ＯＸ−４０、ＰＡＲＣ、ＰＤ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＦ、ＳＤＦ−１、ｓｉｇｌｅｃ８、ＴＡＲＣ、ＴＧＦｂ、トロンビン、Ｔｉｍ−１、ＴＮＦ、ＴＲＡＮＣＥ、トリプターゼ、ＶＥＧＦ、ＶＬＡ−４、ＶＣＡＭ、α４β７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、αｖβ６、αｖβ８、ｃＭＥＴ、ＣＤ８、ｖＷＦ、アミロイドタンパク質（例えば、アミロイドα）、ＭＭＰ１２、ＰＤＫ１およびＩｇＥからなる群から選択される標的に結合する。
特に、本発明の抗原結合性タンパク質は、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＬ−４に関連する疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、クローン病、ＣＯＰＤ、繊維性疾患または障害（特発性肺繊維症、進行性全身性硬化症、肝繊維症など）、肝肉芽腫、住血吸虫症、リーシュマニア症、細胞周期調節疾患（ホジキン病など）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病の治療に有用であり得、例えば、これらのタンパク質は喘息の治療の有用であり得る。
本発明の抗原結合性タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒ、ＶＥＧＦおよびＥＧＦＲなどの成長因子にカレンする疾患、例えば、癌または関節リウマチの治療に有用であり得、このような治療が有用であり得る癌のタイプの例としては、乳癌、前立腺癌(prostrate cancer)、肺癌および骨髄腫がある。
本発明の抗原結合性タンパク質は、ＴＮＦに関連する疾患、例えば、関節炎、例えば、関節リウマチまたは骨関節炎の治療に有用であり得る。
本発明の抗原結合性タンパク質は、ＩＬ１−Ｒに関連する疾患、例えば、関節炎、例えば、関節リウマチまたは骨関節炎の治療に有用であり得る。
本発明の抗原結合性タンパク質は、ＣＤ−２０に関連する疾患、例えば、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、神経変性疾患、例えば、多発性硬化症、好中球駆動性疾患、例えば、ＣＯＰＤ、ウェゲナー脈管炎、嚢胞性繊維症、シェーグレン症候群、慢性移植拒絶、１型糖尿病、移植片対宿主病、喘息、アレルギー性疾患、アトピー性皮膚炎、湿疹性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、他の自己免疫疾患（甲状腺炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ブドウ膜炎、多発性軟骨炎(polychonritis)もしくは硬皮症を含む）などの自己免疫疾患、または癌、例えば、Ｂ細胞リンパ腫または成熟Ｂ細胞新生物（ＣＬＬもしくはＳＬＬなど）の治療に有用であり得る。
本発明の抗原結合性タンパク質は、ＩＬ−１７およびＩＬ−２３に関連する疾患、例えば、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、神経変性疾患、例えば、多発性硬化症、好中球駆動性疾患、例えば、ＣＯＰＤ、ウェゲナー脈管炎、嚢胞性繊維症、シェーグレン症候群、慢性移植拒絶、１型糖尿病、移植片対宿主病、喘息、アレルギー性疾患、アトピー性皮膚炎、湿疹性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、他の自己免疫疾患（甲状腺炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ブドウ膜炎、多発性軟骨炎（ｐｏｌｙｃｈｏｎｒｉｔｉｓ）もしくは硬皮症を含む）の治療に有用であり得る。
本発明の抗原結合性タンパク質は、本発明の抗原結合性タンパク質のためのコード配列を含む発現ベクターを有する宿主細胞の形質移入により産生可能である。発現ベクターまたは組換えプラスミドは、宿主細胞での複製および発現、および／または宿主細胞からの分泌を制御できる通常の制御配列の操作環境にこれらの抗原結合性タンパク質のコード配列を置くことにより産生可能である。調節配列には、プロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーター、および他の既知抗体から得られるシグナル配列が含まれる。同様にして、相補的抗原結合性タンパク質の軽鎖または重鎖をコードしたＤＮＡ塩基配列を有する第２の発現ベクターを産生できる。特定の実施形態では、この第２の発現ベクターは、コード配列と選択可能なマーカーに関することを除いて第１の発現ベクターに同じであり、従って各ポリペプチド鎖が機能的に発現していることを可能な限り確実にする。あるいは、抗原結合性タンパク質のための重鎖と軽鎖コード配列を単一のベクター上、例えば、同じベクター中の２つの発現カセットに置いてもよい。
選択された宿主細胞は、第１と第２のベクターの両方を使って通常の技術により同時形質移入され（または、単純に単一のベクターで形質移入され）、組換えまたは合成された軽鎖と重鎖の両方を含む本発明の形質移入した宿主細胞が作られる。この形質移入した細胞は、次に通常の技術により培養され本発明の操作された抗原結合性タンパク質が産生される。組換え重鎖および／または軽鎖の会合を含む抗原結合性タンパク質はアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡやＲＩＡ、により培養物からスクリーニングされる。同様の通常の技術を採用して、他の抗原結合性タンパク質を構築することが可能である。
本方法で採用されたクローニングおよびサブクローニングステップのための適切なベクター、および、本発明の組成物の作成は当業者により選択され得る。例えば、通常のクローニングベクターのｐＵＣシリーズを使用可能である。１つのベクター、ｐＵＣ１９、は市販品で、Ａｍｅｒｓｈａｍ（バッキンガムシャー州、英国）またはＰｈａｒｍａｃｉａ（ウプサラ、スウェーデン）、等のサプライハウスから入手可能である。
さらに、容易に複製可能で、多くのクローニングサイトおよび選択可能な遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、容易に操作できる、いずれのベクターもクローニングの目的に使用可能である。従って、クローニングベクターの選択は本発明における制約因子ではない。
また、発現ベクターを、異種のＤＮＡ塩基配列、例えば哺乳動物のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）の発現を増幅するのに適した遺伝子により特徴づけることができる。他のベクター配列には、ポリＡシグナル配列、例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）由来の配列、およびβ‐グロビンプロモータ配列（ｂｅｔａｇｌｏｐｒｏ）が含まれる。本明細書で有用な発現ベクターは、当業者によく知られた技術により合成可能である。
このようなベクターの構成要素、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列、等、は市販または天然の入手源から入手してもよく、また、選択宿主中の組換えＤＮＡの生成物の発現および／または分泌の誘導に使用される既知手順により合成してもよい。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母、および真菌の発現に関して当業界で既知の多くのタイプの他の適切な発現ベクターもこの目的に選択してもよい。
また本発明は、本発明の抗原結合性タンパク質のコード配列を含む組換えプラスミドを形質移入された細胞株を包含する。これらクローニングベクターのクローニングと他の操作に有用な宿主細胞もまた従来からあるものである。しかし、種々の大腸菌株由来の細胞は、本発明の抗原結合性タンパク質作成におけるクローニングベクターや他のステップの複製に使うことができる。
本発明の抗原結合性タンパク質の発現のための適切な宿主細胞または細胞株には、哺乳動物細胞、例えば、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（例えば、ＤＧ４４）、ＣＯＳ、ＨＥＫ、繊維芽細胞（例えば、３Ｔ３）、および骨髄細胞が含まれる。例えば、これはＣＨＯまたは骨髄細胞中で発現させてもよい。ヒト細胞を使って、分子をグリコシレーションパターンで修飾させてもよい。あるいは、他の真核細胞株を採用してもよい。哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニングと生成物産生および精製の方法は、当業者には既知である。例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌを参照。
細菌細胞は、組換えＦａｂの発現のため、または本発明の他の実施形態のために適切な宿主細胞として有用であり得る（例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ, Ａ．, Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｒｅｖ．, １３０：１５１−１８８ （１９９２）参照）。しかし、細菌細胞で発現したタンパク質は、折り畳まれていないまたは不適切に折り畳まれた形式または非グリコシル化形式になる傾向があるため、細菌細胞中で産生されたいずれの組換えＦａｂも抗原結合能力の保持の観点でスクリーニングしなければならなくなる。細菌細胞で発現された分子が正しく折り畳まれた形式で産生された場合は、その細菌細胞は望ましい宿主となるだろう。あるいは、別の実施形態で、分子が細菌宿主中で発現され、その後再折畳みが可能である。例えば、発現に使われる種々の大腸菌株は、バイオテクノロジーの分野で宿主細胞としてよく知られている。種々の枯草菌、ストレプトマイセス属、他の桿菌等の株もまたこの方法に採用できる。
所望の場合は、当業者に既知の酵母細胞株もまた、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエと鱗翅類、およびウイルス発現システムと同様に、宿主細胞として入手可能である。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．, Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, ８：２７７−２９８, Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ （１９８６）、および本明細書に引用の文献を参照のこと。
ベクターが作成される一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するために必要な形質移入方法、およびこのような宿主細胞から本発明の抗原結合性タンパク質を産生するために必要な培養方法は全て従来からの技術であってもよい。典型的には、本発明の培養方法は無血清培養方法で、通常細胞を無血清懸濁液中で培養する。同様に、本発明の抗原結合性タンパク質を一度産生した後、細胞培養内容物を当分野の標準的手法、例えば、硫安塩析法、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法等により精製してもよい。このような技術は、当該分野の技術の範囲内にあり本発明を制限するものではない。例えば、改変抗体の調製に関しては、ＷＯ ９９／５８６７９およびＷＯ ９６／１６９９０に記載されている。
抗原結合性タンパク質のさらに別の発現法では、遺伝子組み換え動物中での発現を使用してもよい。この例は、Ｕ.Ｓ. Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ.４，８７３，３１６に記載されている。これは、動物カゼインプロモータを使った発現システムであり、このプロモーターは、遺伝子導入で哺乳動物に取り込んだ場合、雌のミルク中に所望の組換えタンパク質を産生させる。
本発明のさらなる態様では、本発明の抗体を産生する方法を提供し、この方法は本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖をコードしたベクターで形質転換または形質移入した宿主細胞を培養し、これにより産生された抗体を回収するステップを含む。
本発明に従って、本発明の抗原結合性タンパク質を産生する方法が提供され、この方法は、
（ａ）抗原結合性タンパク質の重鎖をコードした第１のベクターを提供するステップ；
（ｂ）抗原結合性タンパク質の軽鎖をコードした第２のベクターを提供するステップ；
（ｃ）哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）を前記第１と第２のベクターで形質転換するステップ；
（ｄ）抗原結合性タンパク質を前記宿主細胞から前記培地へ分泌を促す条件下で、ステップ（ｃ）の宿主細胞を培養するステップ；
（ｅ）分泌されたステップ（ｄ）の抗原結合性タンパク質を回収するステップ、
を含む。
所望の方法で発現された後、抗原結合性タンパク質物のインビトロ活性を適切なアッセイにより調査する。現在よく使われるＥＬＩＳＡアッセイ方式を採用し、標的に対する抗原結合性タンパク質の定性および定量評価を行う。さらに、他のインビトロアッセイを使って、通常のクリアランス機序にも拘らず体の中に残留している抗原結合性タンパク質を評価するために実施されるヒトの臨床試験の前に中和性能を確認してもよい。
治療の用量と持続時間は、ヒトの循環系における本発明の分子の相対的持続時間に関係しており、治療条件と患者の全体的健康状態に基づいて当業者により調節可能である。最大の治療効果を得るためには、長期間にわたる（例えば、４〜６ヶ月間）反復投薬（例えば、週一回または２週間に一回）が必要となる場合があることが想定される。
本発明の治療薬の投与方法は、宿主に薬剤を送達する任意の適切なルートであってよい。本発明の抗原結合性タンパク質、および医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下（ｓ．ｃ．）、髄腔内、腹腔内、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、または鼻腔内の投与に特に有用である。
本発明の治療薬は、有効量の本発明の抗原結合性タンパク質を製薬上許容可能な担体中の有効成分として含む医薬組成物として調製されてもよい。本発明の予防薬では、抗原結合性タンパク質を含む水性懸濁液または水溶液は、注射の準備ができた形で生理的ｐＨに緩衝させることができる。非経口投与用組成物は、通常、本発明の抗原結合性タンパク質の溶液、または製薬上許容可能な担体、例えば、水性担体、に溶解したその混合溶液を含む。種々の水性担体、例えば、０．９％食塩水、０．３％グリシン等を用いてもよい。これらの溶液は、無菌状態で、通常、粒子状物質の無い状態にされる。これらの溶液は、通常のよく知られた滅菌技術（例えば、濾過）により無菌にされる。組成物は、適切な生理学的条件に必要とされるｐＨ調節剤および緩衝剤等のような製薬上許容可能な補助物質を含んでもよい。このような製剤処方での本発明の抗原結合性タンパク質の濃度は様々であってよく、すなわち、重量％で約０．５％未満、通常、約１％または少なくとも約１％から１５〜２０％までになり、また選択された具体的な投与方法に従って主に流体容量、粘性、等に基づいて選択される。
従って、本発明の筋肉内注射用医薬組成物は、１ｍＬの無菌緩衝水、および約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、または約５ｍｇ〜約２５ｍｇ、の本発明の抗原結合性タンパク質を含むように調製され得る。同様に、本発明の点滴静注用医薬組成物は、約２５０ｍｌの無菌リンゲル液、および約１〜約３０ｍｇ、または約５ｍｇ〜約２５ｍｇの１ｍｌ当たりのリンゲル液中の本発明の抗原結合性タンパク質を含むように調製され得る。非経口投与組成物を調製する実際の方法は既知で、当業者には明らかであり、詳細は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ, １５ｔｈ ｅｄ．, Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ,イーストン、ペンシルベニア州、に記載されている。本発明の静脈内投与可能な抗原結合性タンパク質製剤の調製については、Ｌａｓｍａｒ Ｕ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓ Ｄ “Ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ”， Ｐｈａｒｍａ. Ｓｃｉ. Ｔｅｃｈ. ｔｏｄａｙ, ｐａｇｅ １２９−１３７, Ｖｏｌ.３ （３ｒｄ Ａｐｒｉｌ ２０００）, Ｗａｎｇ, Ｗ “Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ, ｓｔａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”, Ｉｎｔ. Ｊ. Ｐｈａｒｍ １８５ （１９９９） １２９−１８８, Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｐａｒｔ Ａ ａｎｄ Ｂ ｅｄ Ａｈｅｒｎ Ｔ.Ｊ．, Ｍａｎｎｉｎｇ Ｍ. Ｃ．, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, ＮＹ： Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ （１９９２）, Ａｋｅｒｓ, Ｍ. Ｊ.“Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ−Ｄｒｕｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”, Ｊ. Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９１ （２００２） ２２８３−２３００, Ｉｍａｍｕｒａ, Ｋ ｅｔ ａｌ “Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｒｉｅｄ ｓｔａｔｅ”, Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９２ （２００３） ２６６−２７４,Ｉｚｕｔｓｕ, Ｋｋｏｊｉｍａ, ｓ.“Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｄｕｒｉｎｇ ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ”, Ｊ Ｐｈａｒｍ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ, ５４ （２００２） １０３３−１０３９, Ｊｏｈｎｓｏｎ, Ｒ, “Ｍａｎｎｉｔｏｌ−ｓｕｃｒｏｓｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ−ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｆｏｒｍｕｌ ａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ”, Ｊ. Ｐｈａｒｍ. Ｓｃｉ, ９１ （２００２） ９１４−９２２, Ｈａ, Ｅ Ｗａｎｇ Ｗ, Ｗａｎｇ Ｙ. ｊ. “Ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ”, Ｊ. Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ, ９１, ２２５２−２２６４,（２００２）を参照のこと。この全内容は参照により本明細書に組み込まれ、具体的に参照される。
一実施形態では、医薬品として用いる場合、本発明の治療薬はユニット剤形として存在する。適切な治療有効量は当業者には容易に決定可能である。適切な用量は患者の体重により計算され、例えば、０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば１０〜２０ｍｇ／ｋｇまたは例えば１〜１５ｍｇ／ｋｇ、例えば１０〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。本発明を使用してヒトを有効に治療する条件は、適切な用量は０．０１〜１０００ｍｇ、例えば０．１〜１０００ｍｇ、例えば０．１〜５００ｍｇ、例えば５００ｍｇ、例えば０．１〜１００ｍｇ、または０．１〜８０ｍｇ、または０．１〜６０ｍｇ、または０．１〜４０ｍｇ、または例えば１〜１００ｍｇ、または１〜５０ｍｇ、の範囲内の本発明の抗原結合性タンパク質であってもよく、これらは非経口、例えば、皮下、静脈内、または筋肉内に投与できる。このような用量は必要なら、医師により選択された適切な時間間隔で反復してもよい。
本明細書記載の抗原結合性タンパク質は、貯蔵用に冷凍乾燥が可能で、使用に先立ち適切な担体中で再構成できる。この技術は、通常の免疫グロブリンで有効であることが示されており、既知技術の凍結乾燥と再構成技術を用いることができる。
当技術分野で既知のいくつかの方法を使って本発明に使われるエピトープ結合ドメインを見つけることが可能である。
用語「ライブラリ」は、異種のポリペプチドまたは核酸の混合物を指す。ライブラリは、それぞれ単一ポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーからなる。この点で、「ライブラリ」は「レパートリー」と同義である。ライブラリメンバー間の配列の差異は、ライブラリ中に存在する多様性の原因である。ライブラリはポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形を取ってもよく、また、核酸のライブラリで形質転換された生命体または細胞の形、例えば、細菌、ウイルス、動物、または植物等の形であってもよい。一実施例では、それぞれの生命体または細胞は１つのみまたは限られた数のライブラリメンバーを含む。核酸によってコードされたポリペプチドを発現させるためには、核酸が発現ベクターの中に組み込まれるのが好ましい。従って一態様では、ライブラリは宿主生物の集合体の形を取ることができ、各生命体は、対応するポリペプチドメンバーを産生するように発現可能な核酸形式で単一ライブラリメンバーを含む発現ベクターのコピーを１つまたは複数を含んでもよい。従って、この宿主生物の集合体は多様なポリペプチドの大きなレパートリーをコードする可能性を有している。
「ユニバーサルフレームワーク」は、Ｋａｂａｔの定義（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”,米国保健社会福祉省）の配列中に保存された抗体領域に対応する単一抗体フレームワーク配列、またはＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋの定義（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ, （１９８７） Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. １９６：９１０−９１７）によるヒト生殖細胞系列免疫グロブリンレパートリーまたは構造に対応する単一抗体フレームワーク配列である。これは、単一フレームワークでも、これらのフレームワークの集合体であってもよく、たとえ高頻度可変領域のみの変異であっても、実質的にあらゆる結合特異性の誘導も許容することが認められてきた。
本明細書で定義された、アミノ酸およびヌクレオチド配列の整合性と相同性、類似性または同一性は、一実施形態では、デフォルトのパラメーターを使ってＢＬＡＳＴ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅアルゴリズムにより調製および測定される（Ｔａｔｕｓｏｖａ, Ｔ. Ａ. ｅｔ ａｌ., ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ, １７４：１８７−１８８ （１９９９））。
エピトープ結合ドメインおよび抗原結合部位はそれぞれ、サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、成長因子受容体、酵素（例えば、プロテアーゼ）、酵素の補因子、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質および炭水化物を含むヒトまたは動物タンパク質などの一般リガンドまたは任意の所望の標的リガンドに対して結合特異性を有し得る。サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、成長因子受容体およびその他のタンパク質を含む好適な標的としては、限定されるものではないが：ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カルジオトロフィン−１、ＣＥＡ、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ５６、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、エオタキシン−２、エクソダス−２、ＦＡＰα、ＦＧＦ−酸性、ＦＧＦ−塩基性、繊維芽細胞成長因子−１０、ＦＬＴ３リガンド、フラクタルカイン（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−β１、ヒト血清アルブミン、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−１受容体１型、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２ａ．ａ．）、ＩＬ−８（７７ａ．ａ．）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、インヒビンα、インヒビンβ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト成長因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンホタクチン、ミュラー管阻害物質、単球コロニー阻害因子、単球走化性タンパク質、Ｍ−ＣＳＦ、ｃ−ｆｍｓ、ｖ−ｆｍｓＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−４、骨髄前駆体阻害因子−１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニュールツリン、神経成長因子、β−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１α、ＳＤＦ１β、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ受容体Ｉ、ＴＮＦ受容体ＩＩ、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ Ａ、ＶＥＧＦ Ｂ、ＶＥＧＦ Ｃ、ＶＥＧＦ Ｄ、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＶＥＧＦ受容体３、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ１、１−３０９、ＨＥＲ １、ＨＥＲ ２、ＨＥＲ ３、ＨＥＲ ４、血清アルブミン、ｖＷＦ、アミロイドタンパク質（例えば、アミロイドα）、ＭＭＰ１２、ＰＤＫ１、ＩｇＥおよび本明細書に開示される他の標的が挙げられる。当然のことながら、このリストはけして網羅的なものではない。
いくつかの実施形態では、結合は、例えば、ＴＮＦＲ１、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−８Ｒ、ＩＬ−９、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２５、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＡＬＫ５、ＥＧＦＲ、ＦｃＥＲ１、ＴＧＦｂ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１８、ＣＥＡ、ＣＲ８、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、キマーゼ、ＦＧＦ、フリン、エンドセリン−１、エオタキシン（例えば、エオタキシン、エオタキシン−２、エオタキシン−３）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ、ＩｇＥ、ＩＦＮａ、Ｉ−３０９、インテグリン、Ｌ−セレクチン、ＭＩＦ、ＭＩＰ４、ＭＤＣ、ＭＣＰ−１、ＭＭＰ、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、ＯＸ−４０、ＰＡＲＣ、ＰＤ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＦ、ＳＤＦ−１、ｓｉｇｌｅｃ８、ＴＡＲＣ、ＴＧＦｂ、トロンビン、Ｔｉｍ−１、ＴＮＦ、ＴＲＡＮＣＥ、トリプターゼ、ＶＥＧＦ、ＶＬＡ−４、ＶＣＡＭ、α４β７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、αｖβ６、αｖβ８、ｃＭＥＴ、ＣＤ８、ｖＷＦ、アミロイドタンパク質（例えば、アミロイドα）、ＭＭＰ１２、ＰＤＫ１およびＩｇＥからなる群から選択される標的などの、肺組織の標的に対するものである。
ディスプレイシステム（例えば、核酸のコード化機能、および、核酸によりコードされたペプチドまたはポリペプチドの機能特性とリンクしたディスプレイシステム）が、本明細書記載の方法中、例えば、ｄＡｂまたは他のエピトープ結合ドメインの選択において使われた場合、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードした核酸のコピー数を増幅または増大することは、好都合なことが多い。これは、本明細書記載の方法や他の適切な方法を使って追加のラウンドのため、あるいは、追加のレパートリー（例えば、親和性成熟レパートリー）を調製するために、十分な量の核酸および／またはペプチドまたはポリペプチドを得る効率的な手段を提供する。従って、一部の実施形態では、エピトープ結合ドメイン選択方法は、ディスプレイシステム（例えば、ファージディスプレイのような、核酸のコーディング機能および核酸によりコードされたペプチドまたはポリペプチドの機能特性とリンクしたディスプレイ）の使用を含み、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードした核酸のコピー数を増幅または増大するステップをさらに含む。核酸は、任意の適切な方法、例えば、ファージ増幅、細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応、を使って増幅可能である。
一実施例では、この方法は核酸のコーディング機能および核酸によりコードされたポリペプチドの物理的、化学的、および／または機能的特性にリンクしたディスプレイシステムを用いる。このようなディスプレイシステムは、複数の複写可能な遺伝子パッケージ（ｇｅｎｅｔｉｃ ｐａｃｋａｇｅ）、例えば、バクテリオファージまたは細胞（細菌）を含むことができる。ディスプレイシステムは、ライブラリ、例えば、バクテリオファージディスプレイライブラリを含んでもよい。バクテリオファージディスプレイはディスプレイシステムの一例である。
多くの適切なバクテリオファージディスプレイシステム（例えば、一価のディスプレイおよび多価のディスプレイシステム）が記載されている（例えばＧｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ., Ｕ.Ｓ. Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ. ６，５５５，３１３ Ｂ１（参照により本明細書に組み込まれる）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ., Ｕ.Ｓ. Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ. ５，７３３，７４３（参照により本明細書に組み込まれる）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ., Ｕ.Ｓ. Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ. ５，９６９，１０８（参照により本明細書に組み込まれる）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ−Ｋｅｈｏｅ, Ｕ.Ｓ. Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ. ５，７０２，８９２（参照により本明細書に組み込まれる）； Ｗｉｎｔｅｒ, Ｇ. ｅｔ ａｌ., Ａｎｎｕ. Ｒｅｖ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １２：４３３−４５５ （１９９４）； Ｓｏｕｍｉｌｌｉｏｎ, Ｐ. ｅｔ ａｌ., Ａｐｐｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ４７（２−３）：１７５−１８９ （１９９４）； Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ, Ｌ. ｅｔ ａｌ., Ｃｏｍｂ. Ｃｈｅｍ. Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ, ４（２）：１２１−１３３ （２００１）、参照)。バクテリオファージディスプレイシステムで表示されるペプチドまたはポリペプチドは、あらゆる適切なバクテリオファージ、例えば、線状ファージ（例えば、ｆｄ、Ｍ１３、Ｆ１）、溶菌ファージ（例えば、Ｔ４、Ｔ７、ラムダ）、またはＲＮＡファージ（例えば、ＭＳ２）、上でも表示可能である。
通常、適切なファージコートタンパク質（例えば、ｆｄ ｐＩＩＩタンパク質）との融合タンパク質としてペプチドまたはファージポリポリペプチドのレパートリーを表示するファージライブラリが作成または提供される。融合タンパク質は、ペプチドまたはポリペプチドファージコートタンパク質の先端、または所望なら内部位置にペプチドまたはポリペプチドを表示できる。例えば、表示されたペプチドまたはポリペプチドは、ｐＩＩＩのアミノ末端からドメイン１まで存在可能である（ｐＩＩＩのドメイン１はＮ１とも呼ばれる）。表示されたポリペプチドは、直接ｐＩＩＩに（例えば、ｐＩＩＩのドメイン１のＮ末端）またはリンカーを使ってｐＩＩＩに融合可能である。所望なら、融合体はタグ（例えば、ｍｙｃエピトープ、Ｈｉｓタグ）をさらに含むこともできる。ファージコートタンパク質との融合タンパク質として表示されたペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むライブラリは、任意の適切な方法を用いて制作可能である。例えば、表示されたペプチドまたはポリペプチドをコードしたファージベクターライブラリやファージミドベクターを、適切な宿主細菌中に導入し、その結果得られた細菌を培養して（例えば、適切なヘルパーファージを使って、または必要ならプラスミドを補完して）ファージを産生する。ファージライブラリは、培養物から任意の適切な方法、例えば、沈降法および遠心分離法、により回収可能である。
ディスプレイシステムは任意の多様な所望量を含むペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むこともできる。例えば、このレパートリーは生命体、生命体のグループ、所望組織または所望細胞型により発現された自然発生のポリペプチドに対応するアミノ酸配列のペプチドまたはポリペプチドを含むことも、または、ランダムなアミノ酸配列またはランダム化されたアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含むこともできる。希望するなら、このポリペプチドは、共通のコアまたは足場を共有することができる。例えば、レパートリーまたはライブラリ中の全ポリペプチドが、プロテインＡ、プロテインＬ、プロテインＧ、フィブロネクチンドメイン、アンチカリン、ＣＴＬＡ４、所望の酵素（例えば、ポリメラーゼ、セルラーゼ）、または免疫グロブリンスーパーファミリー由来のポリペプチド、例えば、抗体または抗体断片（例えば、抗体可変ドメイン）から選択された足場をベースにすることも可能である。このようなレパートリーやライブラリ中のポリペプチドは、ランダムなアミノ酸配列またはランダム化されたアミノ酸配列の規定領域および共通アミノ酸配列の領域を含むことができる。特定の実施形態では、レパートリー中の全てまたは実質的に全てのポリペプチドが所望のタイプ、例えば、所望の酵素（例えば、ポリメラーゼ）または所望の抗体の抗原結合断片（例えば、ヒトＶＨまたはヒトＶＬ）、である。一部の実施形態では、ポリペプチドディスプレイシステムはポリペプチドのレパートリーを含み、その中の各ポリペプチドは抗体可変ドメインを含む。例えば、レパートリー中の各ポリペプチドはＶＨ、ＶＬまたはＦｖ（例えば、単鎖Ｆｖ）を含んでもよい。
アミノ酸配列の多様性を、任意の適切な方法を使って、ペプチドまたはポリペプチドまたは足場の任意の所望の領域に導入可能である。例えば、アミノ酸配列の多様性は、任意の適切な変異誘発性（例えば、低忠実性ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド媒介または部位特異的変異、ＮＮＫコドンを使った多様化）または任意の他の適切な方法を使って、多様化ポリペプチドをコードした核酸ライブラリを調製することにより、標的部位、例えば抗体可変ドメインの相補性決定領域または疎水性ドメインに導入可能である。所望なら、多様化すべきポリペプチドの領域をランダム化できる。
レパートリーを構成するポリペプチドのサイズは、概して選択可能であり、均一なポリペプチドサイズは必要ではない。レパートリー中のポリペプチドは、少なくとも三次構造を有する（少なくとも１つのドメインを形成する）ことができる。
選択／単離／回収
エピトープ結合ドメインまたはドメインの集合体は、適切な方法を使って、レパートリーまたはライブラリ（例えば、ディスプレイシステム中の）から選択、単離、および／または回収可能である。例えば、ドメインは選択可能な特性（例えば、物理的特性、化学的特性、機能特性）に基づいて選択または単離される。適切な選択可能な特性には、レパートリー中のペプチドまたはポリペプチドの生物活性、例えば、一般的リガンド（例えば、スーパー抗原）に対する結合性、標的リガンド（例えば、抗原、エピトープ、基質）に対する結合性、抗体に対する結合性（例えば、ペプチドまたはポリペプチド上に発現したエピトープ経由）、および触媒能力が含まれる（例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ., ＷＯ ９９／２０７４９； ＷＯ ０１／５７０６５； ＷＯ ９９／５８６５５参照）。
一部の実施形態では、実質的に全てのドメインが共通の選択可能特性を共有するペプチドまたはポリペプチドのライブラリまたはレパートリーから、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドが選択および／または単離される。例えば、ドメインは、実質的に全てのドメインに共通の一般的リガンドに結合するライブラリまたはレパートリー、共通の標的リガンドに結合するライブラリまたはレパートリー、共通の抗体に結合する（またはそれによって結合される）ライブラリまたはレパートリー、または共通の触媒能力を有するライブラリまたはレパートリーから選択することができる。このタイプの選択は、所望の生物活性を有する親ペプチドまたはポリペプチドに基づいたレパートリーまたはドメインを調製する際、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインの親和性成熟を行う場合、特に有用である。
共通の一般的リガンドへの結合性に基づいた選択では、元のライブラリまたはレパートリーの要素である全てまたは実質的に全てのドメインを含むドメインコレクションまたは集合体が得られる。例えば、標的リガンドまたは一般的リガンドに結合しているドメイン、例えばプロテインＡ、プロテインＬまたは抗体は、パニングまたは適切な親和性マトリックスを使って選択、単離、および／または回収できる。パニングは、リガンド（例えば、一般的リガンド、標的リガンド）の溶液を適切な容器（例えば、チューブ、ペトリ皿）に加え、リガンドを容器の壁表面上に沈着または被覆させることにより達成できる。過剰リガンドを洗い流し、ドメインを容器に加え、この容器をペプチドまたはポリペプチドが固定化されたリガンドと結合するのに適した条件下で維持する。非結合ドメインは、洗い流され、結合ドメインは、任意の適切な方法、例えば、削り取りやｐＨを下げることによって回収できる。
適切なリガンド親和性マトリックスは、通常、固体担体またはビーズ（例えば、アガロース）を含み、これにリガンドを共有結合的または非共有結合的に連結させる。親和性マトリックスは、ドメインがマトリックス上のリガンドに結合するための適切な条件下、バッチプロセス、カラムプロセスまたは任意の他の適切なプロセスを使って、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼとインキュベートされたレパートリー）と結合させることができる。親和性マトリックスと結合しないドメインは洗い流し、結合したドメインは、低ｐＨバッファー、マイルドな変性剤（例えば、尿素）、またはリガンドとの結合で競合するペプチドまたはドメインで溶出等の任意の適切な方法で溶出し、回収できる。一実施例では、ビオチン化した標的リガンドは、レパートリー中のドメインが標的リガンドに結合するための適切な条件下、レパートリーと結合する。結合ドメインは、固定化されたアビジンストレプトアビジン（例えば、ビーズ上の）を使って回収される。
一部の実施形態では、一般的または標的リガンドは、抗体またはその抗体の抗原結合断片である。ライブラリまたはレパートリーのペプチドまたはポリペプチド中で実質的に保存されたペプチドまたはポリペプチドの構造的特徴と結合する抗体または抗原結合断片は、特に一般的リガンドとして有用である。プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドの単離、選択および／または回収のためのリガンドとしての使用に適した抗体と抗原結合断片は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、任意の適切な方法で調製できる。
ライブラリ／レパートリー
プロテアーゼエピトープ結合ドメインをコードおよび／または含むライブラリは、任意の適切な方法を使って調製または入手可能である。ライブラリは、目的のドメインまたは足場（例えば、ライブラリから選択されたドメイン）に基づいてドメインをコードするように設計することも、本明細書記載の方法を使って別のライブラリから選択することも可能である。例えば、ドメインが豊富なライブラリは、適切なポリペプチドディスプレイシステムを使って調製可能である。
所望のタイプのドメインのレパートリーをコードしたライブラリは、任意の適切な方法を使って容易に作成可能である。例えば、所望のタイプのポリペプチド（例えば、免疫グロブリン可変ドメイン）をコードした核酸配列を得ることができ、例えば、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムを使ってまたは化学的変異誘発により（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２６９：９５３３ （１９９４））、または細菌の突然変異誘発株を使って（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２６０：３５９ （１９９６））核酸を増幅することにより、それぞれが１つまたは複数の変異を含む核酸のコレクションが調整可能である。
他の実施形態では、核酸の特定の領域を多様化の標的にすることができる。選択位置を変異させる方法も当業者にはよく知られており、これには、例えば、ＰＣＲを使ってまたは使わないで、ミスマッチなオリゴヌクレオチドまたは変性オリゴヌクレオチドを使用する場合が含まれる。例えば、合成抗体ライブラリは、抗原結合ループに対する変異を標的にして作られている。ランダム化または半ランダム化抗体Ｈ３およびＬ３領域を、生殖細胞系列免疫グロブリンＶ遺伝子セグメントに付加して、変異フレームワーク領域を有する大ライブラリが構築されている（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ （１９９２） ｓｕｐｒａ； Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ. （１９９４） ｓｕｐｒａ； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ. （１９９４） ｓｕｐｒａ； ＤｅＫｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ. （１９９５） ｓｕｐｒａ）。このような多様化は、他の抗原結合ループを一部または全て含むまでに拡張されている（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ. （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ., ２：１００； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ. （１９９５） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, １３：４７５； Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ, ＷＯ ９７／０８３２０, ｓｕｐｒａ）。他の実施形態では、核酸の特定の領域を多様化の標的にでき、例えば、２段階ＰＣＲ戦略では１回目のＰＣＲ生成物を「メガプライマー」として用いる（例えば、Ｌａｎｄｔ, Ｏ. ｅｔ ａｌ., Ｇｅｎｅ ９６：１２５−１２８ （１９９０）参照）。標的の多様化は、例えば、ＳＯＥ ＰＣＲを使っても達成できる（例えば、Ｈｏｒｔｏｎ, Ｒ.Ｍ. ｅｔ ａｌ., Ｇｅｎｅ ７７：６１−６８ （１９８９）参照）。
選択位置での配列多様性は、ポリペプチドの配列を特定するコード配列を変え、多くのアミノ酸（例えば２０全部またはそのサブセット）をその位置に組み込むことにより得ることができる。ＩＵＰＡＣ命名法を使って説明すると、最も用途の広いコドンはＮＮＫであり、これはＴＡＧ停止コドンならびに全アミノ酸をコードする。ＮＮＫコドンは、必要な多様性を導入するために使用可能である。同じ目的を有する他のコドン例えばＮＮＮも使用でき、これは追加の停止コドンＴＧＡとＴＡＡを作成する。このような標的化手法は、標的領域中の全配列空間を調査対象にすることができる。
一部のライブラリは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるドメイン（例えば、抗体またはその一部）を含む。例えば、ライブラリは既知の主鎖構造を有するドメインを含むことができる（例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ., ＷＯ９９／２０７４９参照）。ライブラリは適切なプラスミドまたはベクター中で調製できる。本明細書で使われるベクターは、異種のＤＮＡを細胞の中に導入し、その発現および／または複製をするのに使われる個別要素を指す。任意の適切なベクターを使うことができ、これにはプラスミド（例えば、細菌性プラスミド）、ウイルスまたはバクテリオファージベクター、人工染色体、およびエピソームベクターが含まれる。このようなベクターは、単純クローニングおよび突然変異生成のために使うことができ、または、発現ベクターは、ライブラリの発現を促進するために使うことができる。ベクターおよびプラスミドは、通常１つまたは複数のクローニング部位（例えば、ポリリンカー）、複製開始点、および少なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子を含む。発現ベクターは、ポリペプチドの転写と翻訳を促進するエレメント、例えば、エンハンサー、プロモーター、転写終結信号、シグナル配列、等をさらに含むことができる。これらのエレメントは、かかる発現ベクターが発現に適切な条件下で維持された場合（例えば、適切な宿主細胞中で）に、ポリペプチドが発現し、産生されるように、ポリペプチドをコードしたクローン化挿入断片に作動可能にリンクして配置することが可能である。
クローニングおよび発現ベクターは、通常、１つまたは複数の選択宿主細胞中でベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。典型的には、クローニングベクター中では、これは、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立に複製するのを可能にし、しかも複製開始点または自己複製配列を含む配列である。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスでよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点は、大抵のグラム陰性細菌に対し適切で、２ミクロンプラスミド開始点は、酵母に適切であり、また種々のウイルス開始点（例えば、ＳＶ４０、アデノウイルス）は、哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用である。コス細胞のような高レベル複製が可能な哺乳動物細胞で使われるのでなければ、通常、複製開始点は哺乳動物の発現ベクターには必要でない。
クローニングまたは発現ベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。このようなマーカー遺伝子は、選択培養培地中で成長した形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードしている。従って、選択遺伝子を含むベクターで形質転換されなかった宿主細胞は、その倍地中で生存しないことになる。典型的な選択遺伝子は、抗生物質と他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに耐性を付与し、栄養要求性欠如を補完し、または成長培地中で得られない重要な栄養素を補給するタンパク質をコードしている。
適切な発現ベクターは多くの要素を含むことができる。例えば、複製開始点、選択可能マーカー遺伝子、１つまたは複数の発現調節エレメント、例えば、転写調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）および／または１つまたは複数の翻訳信号、シグナル配列またはリーダー配列、等を含むことができる。発現調節エレメントおよび信号またはリーダー配列は、もしそれが存在するならば、ベクターまたは他のソースから供給を受けることができる。例えば、抗体鎖をコードしたクローン化核酸の転写および／または翻訳調節配列は、発現促進に使用可能である。
プロモーターは、所望の宿主細胞中での発現のために組み込んでもよい。プロモーターは、構成的であっても誘導可能であってもよい。例えば、プロモーターは、核酸の転写を命令できるように、抗体、抗体鎖またはその一部をコードした核酸に作動可能にリンクされてもよい。種々の適切な原核生物用プロモーター（例えば、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、大腸菌用のｌａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）および真核生物（例えば、シミアンウイルス４０初期または後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ＥＧ−１ａプロモーター）宿主が入手可能である。
さらに、発現ベクターは、通常、ベクターを保持している宿主細胞の選択に用いる選択可能マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合には、複製開始点を含む。抗生物質または薬剤耐性を付与する産物をコードした遺伝子は、共通の選択可能マーカーであり、原核生物（例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性用Ｔｅｔ遺伝子）および真核細胞（例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８またはジェネテシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはヒグロマイシン耐性遺伝子）で使用可能である。ジヒドロ葉還元酵素標識遺伝子は、種々の宿主中でメトトレキサートの選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードした遺伝子（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）は、酵母中の選択可能マーカーとして使われることが多い。ウイルス（例えば、バキュロウイルス）またはファージベクター、および宿主細胞のゲノムに統合可能なベクター、例えば、レトロウイルスベクター、の使用もまた意図されている。
原核生物（例えば、大腸菌等の細菌細胞）または哺乳動物細胞中での発現に適切な発現ベクターには、例えば、ｐＥＴベクター（例えば、ｐＥＴ−１２ａ、ｐＥＴ−３６、ｐＥＴ−３７、ｐＥＴ−３９、ｐＥＴ−４０、Ｎｏｖａｇｅｎ他）、ファージベクター（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＲＩＴ２Ｔ（プロテインＡ融合ベクター、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＥＦ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ｐＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ, Ｌａ Ｊｏｌｌａ, ＣＡ）, ｐＣＤＥＦ３ （Ｇｏｌｄｍａｎ, Ｌ.Ａ., ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ, ２１：１０１３−１０１５ （１９９６）），ｐＳＶＳＰＯＲＴ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、ｐＥＦ−Ｂｏｓ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ, ｓ．, ｅｔ ａｌ．, Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．, １８：５３２２ （１９９０））等、が挙げられる。種々の発現宿主、例えば、原核細胞（大腸菌）、昆虫細胞（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２細胞、Ｓｆ９）、酵母（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および哺乳動物細胞（例えば、コス細胞）での使用に適切な発現ベクターが入手可能である。
ベクターのいくつかの例は、ポリペプチドライブラリメンバーに対応するヌクレオチド配列の発現を可能とする発現ベクターである。従って、一般的および／または標的リガンドの選択は、ポリペプチドライブラリメンバーを発現する単一クローンの別々の増殖と発現により行われる。上述のように、具体的な選択ディスプレイシステムは、バクテリオファージディスプレイである。従って、ファージまたはファージミドベクターは使用可能である。例えば、ベクターは大腸菌複製開始点（二本鎖複製用）および、ファージ複製起点（一本鎖ＤＮＡの産生用）を有するファージミドベクターであってもよい。このようなベクターの操作および発現は、当業者にはよく知られている（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ （１９９２） ｓｕｐｒａ； Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ. （１９９４） ｓｕｐｒａ）。簡単に述べれば、ベクターは、ファージミドおよび発現カセット上流のラックプロモーターに選択性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むことができる。この遺伝子は、適切なリーダー配列、多重クローニング部位、１つまたは複数のペプチドタグ、１つまたは複数のＴＡＧ停止コドンおよびファージタンパク質ｐＩＩＩを含むことができる。従って、ベクターは、大腸菌の種々の抑制因子および非抑制因子株を使って、また、グルコース、イソ−プロピルチオ−β−Ｄガラクトシド（ｉｓｏ−ｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）（ＩＰＴＧ）またはＶＣＳＭ１３等のヘルパーファージを添加して、発現のないプラスミドとして複製することができ、大量のポリペプチドライブラリメンバーのみ、または産物ファージ（この内の一部はポリペプチド−ｐＩＩＩ融合体で、その表面に少なくとも１つのコピーを含む）、を産生することができる。
抗体可変ドメインは、標的リガンド結合部位および／または一般的リガンド結合部位を含んでもよい。特定の実施形態では、一般的リガンド結合部位は、プロテインＡ、プロテインＬまたはプロテインＧ等のスーパー抗原のための結合部位である。可変ドメインは、任意の所望の可変ドメイン、例えば、ヒトＶＨ（例えば、ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６）、ヒトＶλ（例えば、Ｖλｌ、Ｖλｌｌ、Ｖλｌｌｌ、ＶλｌＶ、ＶλＶ、ＶλＶＩまたはＶκ１）またはヒトＶＫ（例えば、Ｖκ２、Ｖκ３、Ｖκ４、Ｖκ５、Ｖκ６、Ｖκ７、Ｖκ８、Ｖκ９またはＶκ１０）に基づくものであってもよい。
またさらなる技術カテゴリーには、人工区分によるレパートリーの選択が含まれ、これは遺伝子とその遺伝子産物との結びつきを可能にする。例えば、所望の遺伝子産物をコードした核酸が油中水乳剤を使って形成されたマイクロカプセル中で選択できる選択システムが、ＷＯ９９／０２６７１, ＷＯ００／４０７１２およびＴａｗｆｉｋ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６（７）, ６５２‐６に記載されている。所望の活性を有する遺伝子産物をコードした遺伝因子がマイクロカプセル中に区分けされ、次に、転写、および／または翻訳されてそれぞれの遺伝子産物（ＲＮＡまたはタンパク質）をマイクロカプセル内に産生する。引き続き、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝因子が選別される。この手法によって、種々の方法で所望の活性を検出することにより目的の遺伝子産物を選択できる。
エピトープ結合ドメインの特徴づけ
ＥＬＩＳＡを含む当業者に周知の方法によって、特異的抗原またはエピトープへのドメインの結合を試験することができる。一例として、結合は、モノクローナルファージＥＬＩＳＡを用いて試験される。
ファージＥＬＩＳＡは、任意の適切な手順に従って行われ得る。例示的なプロトコルを以下に説明する。
各選別で産出したファージ集団は、「ポリクローナル」ファージ抗体を同定するため、選択した抗原またはエピトープへの結合についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。これら集団由来の単一の感染バクテリアコロニーからのファージを、「モノクローナル」ファージ抗体を同定するため、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。抗原またはエピトープへの結合に関して可溶性抗体断片のスクリーニングもまた所望され、これもまた、例えばＣ−またはＮ−末端タグに対する試薬を用いてＥＬＩＳＡによって実施することができる（例えばＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ. （１９９４） Ａｎｎ. Ｒｅｖ. Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２, ４３３〜５５およびそこで引用された文献を参照のこと）。
ＰＣＲ産物のゲル電気泳動（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ. １９９１,上記；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ.１９９４,上記)、プロービング（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ., １９９２ Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ２２７, ７７６）またはベクターＤＮＡのシークエンスにより、選択したファージモノクローナル抗体の多様性を評価することができる。
Ｅ．ｄＡｂの構造
ｄＡｂが、本明細書に記載したファージディスプレイ技術に用いて選択したＶ遺伝子レパートリーから選択される場合には、これらの可変ドメインは普遍的なフレームワーク領域を含み、本明細書で定義したような特定の一般的リガンドによって認識されるようになる。普遍的なフレームワーク、一般的リガンドなどの使用については国際公開第９９／２０７４９に記載されている。
Ｖ遺伝子レパートリーが使用される場合には、ポリペプチド配列における多様性が可変ドメインの構造的ループ内に局在する場合もある。それぞれの可変ドメインとその相補対との相互作用を高めるために、ＤＮＡシャッフリングまたは変異生成によって、各可変ドメインのポリペプチド配列を変化させてもよい。ＤＮＡシャッフリングは当業者に周知であり、例えばＳｔｅｍｍｅｒ, １９９４, Ｎａｔｕｒｅ, ３７０：３８９〜３９１および米国特許第６、２９７、０５３号に記載され、この両方は引用することにより本明細書に組み入れられる。突然変異生成のその他の方法もまた当業者に周知である。
ｄＡｂ構築物作成で使用される足場
ｉ．主鎖構造の選択
免疫グロブリンスーパーファミリーの全てのメンバーは、ポリペプチド鎖について類似した折り畳み部分を共有する。例えば、抗体はそれらの一次配列に関しては高度に多様化しているが、配列の比較および結晶学的な構造は予想に反して、６つの抗体の抗原結合ループのうちの５つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）が限られた数の主鎖構造、または標準的な構造をとることを明らかにした（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７） Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. １９６：９０１； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ. （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ, ３４２：８７７）。ループ長および鍵となる残基の解析はさらに、大部分のヒト抗体に見られるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖構造の予測を可能にした（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ.（１９９２）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ., ２２７：７９９； Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ.（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ., １４：４６２８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ.（１９９６）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ., ２６４：２２０）。Ｈ３領域は、（Ｄセグメントの使用により）配列、長さおよび構造においてはより多様であるが、ループおよび抗体フレームワークの鍵となる位置における特定の残基の長さおよび存在または残基の型次第では、短いループ長においてはＨ３領域もまた限られた数の主鎖構造を形成する（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ.（１９９６）Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２６３：８００； Ｓｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ. （１９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ, ３９９：１）。
ｄＡｂはＶＨドメインライブラリおよび／またはＶＬドメインライブラリなどのドメインライブラリから有利に構築される。１つの態様においては、メンバーの主鎖構造が分かるように特定のループ長および鍵となる残基を選択して、ドメインライブラリを設計する。都合の良いことに、これらは天然に見られる免疫グロブリンスーパーファミリーの実際の構造であり、上記で議論されたような機能を果たさない可能性を最小限にする。生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントは、抗体またはＴ細胞受容体ライブラリを構築するための１つの好適な基礎フレームワークとして機能するが、その他の配列もまた有用である。変異も低頻度で生じ得るが、機能性メンバーの少数が、その機能に影響を及ぼさない程度に変化した主鎖構造を有する可能性がある程度である。
標準的な構造の理論も、リガンドによってコードされる異なる主鎖構造の数の評価、リガンド配列に基づく主鎖構造の予測、および標準的な構造に影響を及ぼさない多様化のための残基の選択に役立つ。ヒトＶκドメインにおいては、Ｌ１ループは４つの標準的な構造のうちの１つをとることができ、Ｌ２ループは単一の標準的な構造を有し、ヒトＶκドメインの９０％がＬ３ループのために４つまたは５つの標準的な構造のうちの１つをとることができることが知られている（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ. （１９９５）上記）；従って、Ｖκドメインのみにおいて、異なる標準的な構造が結合し、異なる種類の主鎖構造を作り出すことが可能である。ＶλドメインがＬ１、Ｌ２およびＬ３ループの異なる種類の標準的な構造をコードし、ＶκおよびＶλドメインがＨ１およびＨ２ループのいくつかの標準的な構造をコードする任意のＶＨドメインと対合することが可能なので、これら５つのループで見られる標準的な構造の組み合わせの数は非常に多くなる。このことは、様々な種類の結合特異性を生産するためには、主鎖構造の多様性の生成が必須である可能性を示唆する。しかしながら、予想に反し、実質的に全ての抗原を標的とするのに十分な多様性を生成するには、主鎖構造における多様性は必要ではないことが、単一の既知の主鎖構造に基づいて抗体ライブラリを構築することにより見いだされた。さらに驚くべきことに、単一の主鎖構造はコンセンサス構造である必要もなく、単一の天然に生じる構造を全ライブラリの基礎として用いることが可能である。従って、一つの特定の態様においては、ｄＡｂは単一の既知の主鎖構造を有する。
選択された単一の主鎖構造が、問題となる免疫グロブリンスーパーファミリータイプの分子間ではありふれたものであってもよい。その構造をとる膨大な数の天然に生じる分子が観察される場合、その構造はありふれたものとなる。従って、１つの態様においては、天然に生じる免疫グロブリンドメインのそれぞれの結合ループについて異なる主鎖構造を個別に検討し、その後、主鎖構造の所望の組み合わせを有する天然に生じる可変ドメインが異なるループのために選択される。何も得られかった場合には、最も近似した等価物を選択することができる。異なるループにおける主鎖構造の所望の組み合わせは、所望の主鎖構造をコードする生殖細胞系遺伝子セグメントを選択することにより作成できる。一例として、選択した生殖細胞系遺伝子セグメントは、天然にしばしば発現するものであり、特に、全ての天然の生殖細胞系遺伝子セグメント中で最も頻繁に発現するものであってもよい。
ライブラリの設計においては、６つの抗原結合ループそれぞれについて異なる主鎖構造の頻度を個別に検討してもよい。Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３においては、天然に生じる分子の抗原結合ループの２０％から１００％の範囲の特定の構造が選択される。典型的には、その観察される頻度は３５％超（すなわち３５％から１００％の間）、理想的には、５０％超または６５％超である。Ｈ３ループの大部分が標準的な構造を有さないため、標準的な構造を示すかかるループ間でありふれた主鎖構造を選択するのが好ましい。従って、ループのそれぞれにおいては、天然のレパートリーにおいて最も頻繁に観察される構造が選択される。ヒト抗体においては、それぞれのループにおける最も一般的な標準的な構造（ＣＳ）は以下の通りである：Ｈ１−ＣＳ１（発現レパートリーの７９％）、Ｈ２−ＣＳ３（４６％）、Ｌ１−ＶκのＣＳ２（３９％）、Ｌ２−ＣＳ１（１００％）、Ｌ３−ＶκのＣＳ１（３６％）（計算ではκ：λ率が７０：３０であると推定される。Ｈｏｏｄｅｔ ａｌ.（１９６７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ. Ｑｕａｎｔ. Ｂｉｏｌ., ４８：１３３）。標準的な構造を有するＨ３ループについては、９４番の残基から１０１番の残基である塩橋を有する７つの残基のＣＤＲ３の長さ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ. （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ, Ｕ. Ｓ. Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）が最も一般的であることが見いだされた。ＥＭＢＬデータライブラリには、この構造を形成するために必要とされる長さのＨ３および鍵となる残基を有するヒト抗体配列が少なくとも１６あり、およびタンパク質データバンク中には、抗体モデリングの基礎として使用可能な少なくとも２つの結晶学的な構造が存在する（２ｃｇｒおよび１ｔｅｔ）。最も頻繁に発現する生殖細胞系遺伝子セグメントの標準的な構造の組み合わせは、ＶＨセグメント３−２３（ＤＰ−４７）、ＪＨセグメントＪＨ４ｂ、ＶκセグメントＯ２／Ｏ１２（ＤＰＫ９）およびＪκセグメントＪκ１である。ＶＨセグメントＤＰ４５およびＤＰ３８もまた適している。これらのセグメントをさらに、所望の単一の主鎖構造を有するライブラリを構築するための基礎として、組み合わせることによって使用することができる。
また別の方法としては、単離において、それぞれの結合ループについて天然に生じる異なる主鎖構造の頻度に基づいて単一の主鎖構造を選択する代わりに、天然に生じる主鎖構造の組み合わせの頻度が、単一の主鎖構造を選択するための基礎として使用される。抗体の場合には、例えば、任意の２つ、３つ、４つ、５つ、６つの抗原結合ループについて、天然に生じる標準的な構造の組み合わせの頻度を決定することができる。ここで、選択される構造は天然に生じる抗体においてありふれたものであってもよく、かつ、天然のレパートリーにおいて最も頻繁に見られるものであってもよい。従って、ヒト抗体においては、例えば、５つの抗原結合ループであるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の天然の組み合わせについて検討する場合には、最も頻繁にみられる標準的な構造の組み合わせを決定し、その後、単一の主鎖構造を選択するための基礎として、Ｈ３ループにおける最も一般的な構造とそれを組み合わせる。
標準的な配列の多様化
選択された複数の既知の主鎖構造または単一の既知の主鎖構造を選択したので、分子の結合部位を多様化することによりｄＡｂを構築し、構造的および／または機能的多様性を有するレパートリーを生成することができる。このことは、構造および／又機能の面で十分な多様性を有する変異が生成され、幅のある活性を提供することができることを意味する。
所望の多様性は、典型的には、１つ以上の位置において選択した分子を多様化することにより生成される。変化させる位置は、ランダムであってもよいし、または選択してもよい。多様化は、内在性アミノ酸を任意のアミノ酸または、天然若しくは合成のアナログにより置換し、ランダム化によって非常に膨大な数の変異を生成するか、または内在性アミノ酸を１つ以上の定義されたアミノ酸サブセットにより置換し、限定数の変異を生成することにより達成できる。
それらの変異を導入する様々な方法が報告されている。分子をコードする遺伝子中にランダムな突然変異を導入するためには、変異性ＰＣＲ（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ.（１９９２）Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２２６：８８９）、化学的突然変異生成（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ. （１９９４） Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２６９：９５３３）またはバクテリアの突然変異誘発遺伝子株（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ. （１９９６） Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２６０：３５９）を用いることができる。選択した位置に変異を導入するための方法も当該分野においては周知であり、これらにはＰＣＲの使用を介したまたは介さない、ミスマッチオリゴヌクレオチドまたは変性オリゴヌクレオチドの使用が含まれる。例えば、複数の合成抗体ライブラリが抗原結合ループに対するターゲティング突然変異によって作出された。ヒト破傷風トキソイド結合ＦａｂのＨ３領域が、新しい種類の結合特性を作出するためにランダム化された（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ, ８９：４４５７）。変異のないフレームワーク領域を有する巨大ライブラリを生産するために、Ｈ３およびＬ３領域のランダム化またはセミランダム化が生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントに付加された（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｗｉｎｔｅｒ （１９９２） Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ．, ２２７：３８１； Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ. （１９９２） Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ, ８９：４４５７； Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ. （１９９４） ＥＭＢＯＪ．, １３：６９２； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ. （１９９４） ＥＭＢＯＪ．, １３：３２４５； Ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ Ａｌ. （１９９５） Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ．, ２４８：９７）。それらの変異は、いくつかまたは全てのその他の抗原結合ループを含むように拡大された（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ. （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．, ２：１００； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ. （１９９５） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １３：４７５； Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ,国際公開第９７／０８３２０号、上記）。
ループランダム化はＨ３だけで約１０１５を超える構造を作り出し、その他の５つのループについても類似した数の変異を生成する可能性があるため、全ての可能な組み合わせを発現するライブラリを構築するのに現在の形質転換技術を用いることも、無細胞系を用いることさえも適してはいない。例えば、これまでに構築された最も巨大なライブラリのうちの１つにおいては、この設計のライブラリにおいて可能な多様性のただ１つの画分である、６ｘ１０１０の異なる抗体が生成された（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ. （１９９４）上記）。
１つの実施形態においては、分子の所望の機能を作り出すまたは変化させることに直接関係している残基のみが多様化される。多くの分子においては、その機能は標的に結合させることであり、従って多様性は、分子の全体的パッキングまたは選択した主鎖構造の維持にとって重要な残基を変化させるのを避けながら、標的結合部位に集中させる必要がある。
１つの態様においては、抗原結合部位におけるそれらの残基のみが多様化されたｄＡｂライブラリが使用される。これらの残基は特にヒト抗体レパートリーにおいて多様であり、かつ、高品質な抗体／抗原複合体と接触することが知られている。例えば、Ｌ２においては、５０および５３番目の位置は天然に生じる抗体で多様であり、抗原との結合が観察されることが知られている。これとは対照的に、標準的な方法では、Kabat et al.(1991, 上記)によって定義された対応する相補性決定領域（ＣＤＲ１）において全ての残基、すなわちライブラリにおいて２つが変化したのに対し７残基余りを多様化させなければならないだろう。これは、抗原結合特性の範囲を作り出すのに必要な機能的多様性の面で、大幅な改善である。
天然においては、抗体の多様性は、生殖細胞系Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの体細胞組換えによるナイーブ初代レパートリーの作成（いわゆる生殖細胞系および接合多様性）、ならびにその結果生じた再構成Ｖ遺伝子の体細胞超変異という２つの過程の結果である。ヒト抗体配列の解析により、初代レパートリーにおける多様性が抗原結合部位の中心に集中していること、一方で体細胞超変異は初代レパートリーにおいて高度に保存される抗原結合部位の末端の領域にまで多様性を広げることが示された（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ. （１９９６） Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ．, ２５６：８１３を参照のこと）。この相補性はおそらく配列間隔を探すための効果的な方法として発展したものであろう。これは明かに抗体に特有なものではあるが、他のポリペプチドレパートリーに対しても容易に適用可能である。多様化した残基は、標的への結合部位を形成する残基のサブセットである。標的結合部位における異なる（重複を含む）残基のサブセットは、必要に応じて選択の異なる段階において多様化される。
抗体レパートリーの例においては、初代「ナイーブ」レパートリーは、抗原結合部位のいくつかの（しかし全てではない）残基が多様化された場合に作り出される。この文脈で本明細書で使用される場合、「ナイーブ」または「ダミー」という用語は、予め決められた標的を有さない抗体分子を意味する。これらの分子は、多様な抗原刺激に曝されていない胎児および新生児患者の場合と同様に、免疫多様化を受けていない患者の免疫グロブリン遺伝子によってコードされる分子に類似する。このレパートリーはその後、抗原またはエピトープの種類によって選択される。必要に応じて、さらなる多様性をその後、最初のレパートリーにおいて多様化された領域の外側に導入することができる。この成熟したレパートリーは、改変した機能、特異性または親和性用に選択できる。
本明細書において記載された配列は、実質的に同一な配列、例えば少なくとも９０％同一な配列、本明細書で記載された配列と例えば少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一な配列を含むことを理解されたい。
核酸については、「実質的な同一性」という用語は、２つの核酸またはその指示された配列を、最適にアラインメントまたは比較した場合に、適切なヌクレオチドの挿入または欠損を含めて、少なくとも約８０％のヌクレオチドが、通常は少なくとも約９０％から９５％、少なくとも約９８％から９９．５％のヌクレオチドが同一であることを示す。また、実質的な同一性は、選択的なハイブリダイゼーションの条件下でセグメントが相補鎖にハイブリダイズする場合にも存在する。
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列については、「同一」という用語は、適切な挿入または欠損を含めて最適にアラインメントおよび比較した場合の２つの核酸またはアミノ酸配列の同一性の度合いを意味する。また、実質的な同一性は、選択的なハイブリダイゼーションの条件下でＤＮＡセグメントが相補鎖にハイブリダイズする場合にも存在する。
２つの配列間の同一性のパーセンテージは、その２つの配列を最適にアライメントするために導入が必要とされるギャップおよびそれぞれのギャップの長さを考慮した場合に、その配列が共有している同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／全位置の数ｘ１００）。２つの配列間の配列の比較および同一性のパーセンテージの決定は、以下の限定しない実施例に記載した数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。
２つのヌクレオチド配列間の同一性のパーセンテージは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェートおよび１、２、３、４、５、または６の長さウェートを使用してＧＣＧソフトウェア中のＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージもまたＡＬＩＧＮｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれたＥ.Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ. Ｍｉｌｌｅｒ （Ｃｏｍｐｕｔ. Ａｐｐｌ. Ｂｉｏｓｃｉ．, ４：１１〜１７（１９８８））のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０ウェート残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージはＧＣＧソフトウェア中のＧＡＰプログラム中に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ４８：４４４〜４５３（１９７０））のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかおよび１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェートと１、２、３、４、５、または６の長さウェートを使用して決定することができる。
一例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、参照配列と同一、すなわち１００％同一であってもよく、または参照配列と比較した特定の整数までのヌクレオチド変異を含んでもよい。それらの変異は、少なくとも１つのヌクレオチド欠損、転位および塩基転換を含む置換、または挿入からなる群から選択される。ここで前記変異は、参照ヌクレオチド配列の５’末端もしくは３’末端の位置に存在してもよいし、または参照配列中のヌクレオチド間に個々に、またはこれらの末端間のいずれかの位置に、参照配列内の１以上の隣接した群に散在して存在してもよい。ヌクレオチド変異の数は、参照配列中のヌクレオチドの総数とそれぞれの同一性パーセンテージの数字上のパーセンテージ（１００で割る）とを掛け、その積を参照配列中のヌクレオチドの総数から引くことによって求める。すなわち：
Figure 0005901517
式中、ｎｎはヌクレオチド変異の数、ｘｎは参照配列中のヌクレオチドの総数、およびｙは、５０％の場合には０．５０、６０％の場合には０．６０、７０％の場合には０．７０、８０％の場合には０．８０、８５％の場合には０．８５、９０％の場合には０．９０、９５％の場合には０．９５、９７％の場合には０．９７、または１００％の場合には１．００であり、ここでｘｎとｙの積が整数でない場合には、ｘｎから引く前に、最も近い整数まで切り捨てる。参照配列のポリヌクレオチド配列の変異は、このコード配列中にナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を作り出す場合があり、これにより、そのような変異の後にはそのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが変化する。
同様に、別の例では、本発明のポリペプチド配列は、配列番号５によってコードされる参照配列と同一、すなわち１００％同一であってもよく、または同一性のパーセンテージが１００％未満になるように、参照配列と比較した特定の整数までのアミノ酸変異を含んでもよい。それらの変異は、少なくとも１つのアミノ酸欠損、保存的置換および非保存的置換を含む置換、またはは挿入からなる群から選択される。ここで前記変異は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置に存在してもよいし、または参照配列中のアミノ酸間に個々に、またはこれらの末端間のいずれかの位置に、参照配列内の１以上の隣接した群に散在して存在してもよい。指定された同一性のパーセンテージにおけるアミノ酸変異の数は、配列番号５によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数とそれぞれの同一性のパーセンテージの数字上のパーセンテージ（１００で割る）とを掛け、その積を、配列番号５によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の数から引くことによって求める。すなわち：
Figure 0005901517
式中、ｎａはアミノ酸変異の数、ｘａは配列番号５によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数、およびｙは、例えば７０％の場合には０．７０、８０％の場合には０．８０、８５％の場合には０．８５などであり、ここでｘａとｙの積が整数でない場合には、ｘａから引く前に、最も近い整数まで切り捨てる。
実施例１：種々のリンカーを用いた二重特異性抗原結合性タンパク質の設計および構築
抗ＩＬ−１３ ｄＡｂ ＤＮＡ配列（ＤＯＭ１０−５３−６１６、配列番号１）を、クローニングを助けるために５’末端にＢａｍＨＩ部位を、そして３’末端にＥｃｏＲＩ部位を含むように、ＰＣＲによって改変した。このＰＣＲ産物を抗ＩＬ４抗体の重鎖をコードしている哺乳動物発現ベクター中にクローニングし、抗ＩＬ−１３ ｄＡｂを、ＧＳリンカーを介して重鎖のＣ末端に融合させた（配列番号４、二重特異性抗体ＢＰＣ２２０１の重鎖）。
ＴＶＡＡＰＳリンカーをコードしているフォワードおよびリバースプライマーを、上記のベクターのＢａｍＨＩ部位へのクローニングを助けるために、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ付着末端を用いて設計した。この方法により、ＣＨ３ドメインのＣ末端とＤＯＭ−１０−５３−６１６抗ＩＬ−１３ドメイン抗体のＮ末端の間にＴＶＡＡＰＳＧＳリンカー配列を連続的に導入することができた。得られた発現ベクターは配列番号５および配列番号６（それぞれＢＰＣ２２０２およびＢＰＣ２２０３の重鎖）をコードしている。
抗ＩＬ−４ ｍＡｂ重鎖のＤＮＡ配列の３’末端を、種々のリンカー配列を組み込むためにＰＣＲによって改変した。得られたＰＣＲ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで制限酵素処理し、これもまたＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで制限酵素処理した配列番号４をコードしている発現ベクター中にクローニングした。得られた哺乳動物発現ベクターは、種々のリンカーでＤＯＭ−１０−５３−６１６に、ＣＨ３ドメインのＣ末端とＤＯＭ１０−５３−６１６抗ＩＬ−１３ ｄＡｂのＮ末端の間で融合された抗ＩＬ−４ ｍＡｂの重鎖をコードしている。この方法で、ＢＰＣ２２０４−２２１５およびＢＰＣ２２１７−２２２０の重鎖（配列番号７〜８および１１〜２１および２３〜２５）をコードする発現ベクターを生成した。
ＢＰＣ２２０１−２２１０およびＢＰＣ２２２０の重鎖（配列番号４〜８および１１〜１６）をコードしているプラスミドを基本構築物として用い、別の構築物を生成した。第１段階で、ＤＯＭ−１０−５３−６１６抗ＩＬ−１３ドメイン抗体（配列番号１）をコードしているＤＮＡ配列を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いた制限酵素クローニングにより、ＤＯＭ−９−１５５−１５４抗ＩＬ−４ ｄＡｂ（配列番号２６）をコードしているＤＮＡ配列で置換した。第２段階で、抗ＩＬ４抗体の重鎖可変ドメインをコードしているＤＮＡ配列を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩを用いた制限酵素クローニングにより、抗ＩＬ１３抗体の可変ドメインをコードしているＤＮＡ配列で置換した。得られた発現ベクターは重鎖−ドメイン抗体融合タンパク質配列番号２９〜３３および３６〜４１をコードしている。
ＢＰＣ２２１１−２２１４、２２１８および２２１９の重鎖（配列番号１７〜２０、２４および２５）をコードしているプラスミドを基本構築物として用い、別の構築物を生成した。第１段階で、ＤＯＭ−１０−５３−６１６抗ＩＬ−１３ドメイン抗体（配列番号１）をコードしているＤＮＡ配列を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いた制限酵素クローニングにより、ＤＯＭ−９−１５５−１５４抗ＩＬ−４ ｄＡｂ（配列番号２６）をコードしているＤＮＡ配列で置換した。第２段階で、抗ＩＬ４抗体の重鎖可変ドメインをコードしているＤＮＡ配列を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩを用いた制限酵素クローニングにより、抗ＩＬ１３抗体の可変ドメインをコードしているＤＮＡ配列で置換した。得られた発現ベクターは、重鎖−ドメイン抗体融合タンパク質配列番号４２〜４５、４９および５０をコードしている。
重鎖のＣＨ３ドメインとドメイン抗体の間に種々のリンカーを含む、別の重鎖−ドメイン抗体融合タンパク質を設計した。これらを配列番号９、１０、２２、３４〜３５および４２〜５０に挙げる。別の抗ＩＬ−４ドメイン抗体配列を配列番号８０〜８２に示す。別の抗ＩＬ−１３ドメイン抗体配列を配列番号８３に示す。リンカーを、配列番号５１〜７８および１１２〜１１４に挙げる。
Figure 0005901517
Figure 0005901517
表１に示される二重特異性抗原結合性タンパク質の重鎖および相当する軽鎖をコードしている発現プラスミドを、２９３−ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３４７０１９）を用いてＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞中に一過的に同時形質移入した。形質移入２４時間後まで各細胞培養に栄養としてトリプトンを添加し、３〜７日後に細胞を回収した。場合によっては、この上清を結合アッセイおよびＢＩＡｃｏｒｅにおいて試験品として用いた。他の場合では、結合実験を行う前にプロテインＡカラムを用いて二重特異性抗原結合性タンパク質を精製した。
上清をＧｙｒｏｓまたはＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＩＭＭＡＧＥ比濁計で定量した。
実施例２：ＩＬ−４およびＩＬ−１３結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェル高結合プレートを重炭酸水中５μｇ／ｍｌのＩＬ−４またはＩＬ−１３のいずれかでコーティングし、４℃で一晩保存した。このプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）で２回洗った。２００μＬのブロッキング溶液（ＰＢＳ緩衝液中に３％ＢＳＡ）をそれぞれのウェルに加え、そしてこのプレートを室温で少なくとも１時間インキュベートした。その後、再び洗浄工程を行った。上清または精製抗体（ｍＡｂ）をプレート間で、ブロッキング溶液で連続的に希釈した。１時間インキュベートした後、プレートを洗った。ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ７１６４）をブロッキング溶液で１μｇ／ｍＬとなるように希釈し、５０μＬをそれぞれのウェルに加えた。プレートを１時間〜１時間半の間インキュベートした。再度洗浄工程を行った後、５０μｌのＯＰＤ（σ−フェニレンジアミン二塩酸塩）ＳｉｇｍａＦａｓｔ基質溶液をそれぞれのウェルに加え、そして１５分後に、２５μＬの３Ｍ硫酸を加えることによって反応を停止させた。ＶｅｒｓａＭａｘ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用し、標準的なエンドポイントプロトコールを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。
図１および図２は、ＥＬＩＳＡによってそれぞれ測定された、ヒトＩＬ−４およびヒトＩＬ−１３に対する、ＧＳおよびＧＳ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ＝１−４リンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２０１、２２０２、２２０３、２２０９およびＢＰＣ２２１０）のいくつかの独立したアッセイの結合結果を示す。ＢＰＣ１００１（ＩＬ−１３およびＩＬ−４に結合する陽性対照二重特異性抗原結合性タンパク質）は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３に対する結合を示した。対照的に、陰性対照抗体（ＩＬ−４もＩＬ−１３も認識しない標識されたハイブリッド）は、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−１３には結合しないことを示した。この実験では、二重特異性抗原結合性タンパク質は全て、ヒトＩＬ−４およびヒトＩＬ−１３に対して同等の結合活性を示す。
図３および図４は、ＥＬＩＳＡによってそれぞれ測定された、ヒトＩＬ−４およびヒトＩＬ−１３に対する、（ＰＡＳ）ｎ＝１−３ＧＳおよび（Ｇ４Ｓ）ｎ＝１−３リンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２０４〜ＢＰＣ２２０８およびＢＰＣ２２２０）のいくつかの独立したアッセイの結合結果を示す。ＢＰＣ１００１（ＩＬ−１３およびＩＬ−４に結合する陽性対照二重特異性抗原結合性タンパク質）は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３に対する結合を示した。対照的に、陰性対照抗体（ＩＬ−４もＩＬ−１３も認識しない標識されたハイブリッド）は、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−１３には結合しないことを示した。この実験では、二重特異性抗原結合性タンパク質は全て、ヒトＩＬ−４およびヒトＩＬ−１３に対して同等の結合活性を示す。
図５および図６は、ＥＬＩＳＡによってそれぞれ測定された、ヒトＩＬ−４およびヒトＩＬ−１３に対する、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ＝１−３ＧＳ、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ＝１−２ＧＳおよび（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ＝１−３ＧＳリンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２１１〜ＢＰＣ２２１５およびＢＰＣ２２１７〜ＢＰＣ２２１９）の結合結果を示す。ＢＰＣ１００１（ＩＬ−１３およびＩＬ−４に結合する陽性対照二重特異性抗原結合性タンパク質）は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３に対する結合を示した。対照的に、陰性対照抗体（ＩＬ−４もＩＬ−１３も認識しない標識されたハイブリッド）は、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−１３には結合しないことを示した。この実験では、二重特異性抗原結合性タンパク質は全て、ヒトＩＬ−４およびヒトＩＬ−１３に対して同等の結合活性を示す。
図７および８は、ＥＬＩＳＡによってそれぞれ測定された、ヒトＩＬ−４およびヒトＩＬ−１３に対する、ＧＳおよびＧＳ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ＝１−４、（ＰＡＳ）ｎ＝１−３ＧＳおよび（Ｇ４Ｓ）ｎ＝１−３リンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２２１〜２２３１）の結合結果を示す。ＢＰＣ１００１（ＩＬ−１３およびＩＬ−４に結合する陽性対照二重特異性抗原結合性タンパク質）は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３に対する結合を示した。対照的に、陰性対照抗体（ＩＬ−４もＩＬ−１３も認識しない標識されたハイブリッド）は、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−１３には結合しないことを示した。この実験では、二重特異性抗原結合性タンパク質は全て、ヒトＩＬ−１３に対して同等の結合活性を示す。これに比べ、ＧＳ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）１リンカーからＧＳ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）２−４リンカーへとリンカーサイズが大きくなった場合、ＩＬ−４に対するこのｄＡｂ部分の結合に有意な増加が見られた。
図９および１０は、ＥＬＩＳＡによってそれぞれ測定された、ヒトＩＬ−４およびヒトＩＬ−１３に対する、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ＝１−３ＧＳおよびＴＶＳＤＶＰＧＳおよび（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ＝２−３ＧＳリンカーを有する精製二重特異性抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ２２３４〜ＢＰＣ２２３７、ＢＰＣ２２４１およびＢＰＣ２２４２）の結合結果を示す。ＢＰＣ１００１（ＩＬ−１３およびＩＬ−４に結合する陽性対照二重特異性抗原結合性タンパク質）は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３に対する結合を示した。対照的に、陰性対照抗体（ＩＬ−４もＩＬ−１３も認識しない標識されたハイブリッド）は、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−１３には結合しないことを示した。この実験では、二重特異性抗原結合性タンパク質は全て、ヒトＩＬ−１３に対して同等の結合活性を示す。これに比べ、ヒトＩＬ−４結合ＥＬＩＳＡでは、リンカーが長くなるにつれ、ＩＬ−４に対する二重特異性抗原結合性タンパク質のｄＡｂ部分の結合活性が高まる傾向が見られた。
実施例３：抗原結合性タンパク質の化学量論性評価（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）を用いる）
この実施例は予測上のものである。この実施例は、本発明の抗原結合性タンパク質が試験可能な付加的アッセイを行うための指針となる。
抗ヒトＩｇＧを、最初にアミンカップリングによってＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定化する。抗原結合性タンパク質をこの表面上に捕捉する。その後、単一濃度のＩＬ−１３またはＩＬ−４を通過させる。この濃度は、結合表面および観察される結合シグナルを最大のＲ−ｍａｘに達するまで飽和させるのに十分な濃度である。その後、化学量を下記の式を用いて算出する：
Figure 0005901517
同時に１つ以上の被分析物の結合について化学量を算出する場合には、異なる抗原を飽和抗原濃度で順番に通過させ、その後上述の通りに化学量を算出する。この試験はＢｉａｃｏｒｅ３０００を利用し、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファーを用いて２５℃で行うことができる。
実施例４：ＣＤＲＨ３変異体抗ＩＬ−１３ ｍＡｂおよび突然変異ｄＡｂを含む抗原結合性タンパク質（ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７）の構築および試験
４．１ 構築および発現
抗ＩＬ−１３ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−４ ｄＡｂからなる重鎖をコードしているプラスミドを基本構築物として用い、別のプラスミド構築物を生成した。２段階のクローニング法が必要であった。第１段階で、Ｈ鎖の抗ＩＬ１３ ｍＡｂ成分のＶＨをコードしているＤＮＡ配列を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩを用いた制限酵素クローニングにより、別のヒト化抗ＩＬ１３抗体のＶＨ（配列番号９３）をコードしているＤＮＡ配列で置換した。第２段階で、このｍＡｂｄＡｂの抗ＩＬ４ ｄＡｂ（ＤＯＭ９−１５５−１５４、配列番号２６）成分におけるＫａｂａｔ８９番のロイシンをコードしているコドンを、グルタミンへの部位特異的突然変異誘発によって変異させた。結果として生成された重鎖ＤＮＡ配列の全てを配列番号９８〜１００に示す。表２は構築および発現された分子の一覧を示す。
Figure 0005901517
ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７ ｍＡｂｄＡｂをコードしている重鎖および軽鎖発現プラスミドを、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３４７０１９）を用いてＨＥＫ ２９３６Ｅ細胞中に同時形質移入した。２４時間後に各細胞培養に栄養としてトリプトンを添加し、７２時間後に細胞を回収した。結合アッセイで試験する前にプロテインＡカラムを用いて抗体を精製した。
ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７ ｍＡｂｄＡｂを、プロテインＡアフィニティーを用いて精製した。ＡＫＴＡ Ｘｐｒｅｓｓシステムにて１ｍｌプロテインＡカラムを用い（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、カラムをＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で平衡化し、Ｐｉｅｒｃｅ ＩｇＧ ｅｌｕｔｅを用いて抗体を溶出した。溶出した画分を１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（一般に５〜１０％ｖ／ｖ）を用いて中和した。溶出した抗体画分をプールし、サイズ排除クロマトグラフィーにより凝集を分析し、分光光度計を用いてＯＤ２８０ｎｍで読み取りを行うことにより定量した。
これらを、表３に記載されている等価物ｍＡｂｄＡｂ（２２２２、２２２３、２２３０および２２３１）と比較した。これらは、
ｉ）８９番が、ＢＰＣ２２２２、ＢＰＣ２２２３、ＢＰＣ２２３０およびＢＰＣ２２３１では「Ｌ」であり、ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７では「Ｑ」であること以外、ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７に用いたものと同一のｄＡｂ、
ｉｉ）同じリンカー、
ｉｉｉ）１００Ｂが、ＢＰＣ２２２２、ＢＰＣ２２２３、ＢＰＣ２２３０およびＢＰＣ２２３１では「Ｙ」であり、ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７では「Ｖ」であること以外、ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７に用いたものと同一のＩＬ−１３ ｍＡｂ配列
を含む。
Figure 0005901517
ＢＰＣ２２２２、２２２３、２２３０および２２３１ ｍＡｂｄＡｂを、プロテインＡ親和性を用いて精製した。ＡＫＴＡ Ｘｐｒｅｓｓシステムにて１ｍｌプロテインＡカラムを用い（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、カラムをＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で平衡化し、Ｐｉｅｒｃｅ ＩｇＧ ｅｌｕｔｅを用いて抗体を溶出した。溶出した画分を１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（一般に５〜１０％ｖ／ｖ）を用いて中和した。溶出した抗体画分をプールし、サイズ排除クロマトグラフィーにより凝集を分析し、分光光度計を用いてＯＤ２８０ｎｍで読み取りを行うことにより定量した。
ＢＰＣ２２２２、２２２３、２２３０および２２３１は、１０分前に溶出する凝集材料で３０〜４０％の間の凝集を示した。
ＢＰＣ２２２２、２２２３、２２３０および２２３１に比べ、構築物ＢＰＣ１０８５、１０８６および１０８７は、サイズ排除クロマトグラフィーによって評価した場合、低レベルの凝集を示した。
４．２ ＩＬ−４結合ＥＬＩＳＡ
以下の方法に従った直接的結合ＥＬＩＳＡで、精製ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７ ｍＡｂｄＡｂの、ＩＬ−４に対する結合を調べた。
９６ウェル高結合プレートを、ＮａＨＣＯ３中５μｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４（ＧＳＫにて作製）でコーティングし、４℃で一晩保存した。このプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）を含むトリス緩衝食塩水で２回洗った。１００μＬのブロッキング溶液（ＴＢＳＴ緩衝液中に１％ＢＳＡ）をそれぞれのウェルに加え、そしてこのプレートを室温で少なくとも１時間インキュベートした。精製ｍＡｂｄＡｂをプレート間で、ブロッキング溶液で連続的に希釈した。１時間インキュベートした後、プレートを３回洗った。ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体（Ｓｉｇｍａ Ａ７１６４）をブロッキング溶液で１μｇ／ｍＬとなるように希釈し、５０μＬをそれぞれのウェルに加えた。プレートを１時間インキュベートした。再度３回洗浄工程を行った後、５０μｌのＯＰＤ（σ−フェニレンジアミン二塩酸塩）ＳｉｇｍａＦａｓｔ基質溶液をそれぞれのウェルに加え、そして約１５分後に、２５μＬの３Ｍ硫酸を加えることによって反応を停止させた。ＶｅｒｓａＭａｘ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用し、標準的なエンドポイントプロトコールを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。
実験は、精製材料であった陽性対照（抗ＩＬ−４ ｍａｂ）および抗ＩＬ１３陰性対照ｍＡｂ以外は、組織培養上清から直接ｍＡｂｄＡｂを用いて行った。
これらのデータを図１１に示す。ＥＬＩＳＡの結果から、これらの精製ｍＡｂｄＡｂがＩＬ−４と結合することが確認された。また、陽性対照抗ＩＬ−４ ｍＡｂおよびＢＰＣ２２３１もＩＬ−４と結合することが示されたが、陰性対照ｍＡｂ（抗ＩＬ−１３ ｍＡｂ）はＩＬ−４と結合しないことが示された。このことから、このＥＬＩＳＡにおいて、ＧＳ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）からＧＳ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）２−４へとリンカー長が増すと、ｄＡｂ効力が高まることが示唆された。
４．３ ＴＦ−１細胞増殖バイオアッセイにおけるＩＬ−４の中和
精製ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７ ｍＡｂｄＡｂを、ＴＦ−１細胞バイオアッセイにおいてヒトＩＬ−４の中和に関して試験した。
ＴＦ−１細胞は、ヒトＩＬ−４を含むいくつかの異なるサイトカインに応答して増殖する。従って、これらの細胞のＩＬ−４に対する応答を用いてＩＬ−４の生物活性を測定することができ、続いて、ｍＡｂｄＡｂのＩＬ−４中和効力（ＩＬ−４生物活性の阻害）を測定するためのアッセイが開発された。
このアッセイは、無菌条件下、９６ウェル組織培養プレートで行い、全ての試験を２回行った。組み換え大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）により発現されたヒトＩＬ−４およそ２．２ｎｇ／ｍｌを種々の希釈率のｍＡｂｄＡｂ（通常、３倍希釈で滴定された５６０ｎＭ〜０．００９ｎＭ）とともの総量１２０μｌで、３７℃にて１時間プレインキュベートした。陰性対照として無関連特異性の抗体も同様に滴定した（抗ＩＬ１３ ｍＡｂ）。次に、これらのサンプル５０μｌを、無菌９６ウェル組織培養プレートにて、５０μｌのＴＦ−１細胞（濃度２ｘ１０５細胞／ｍｌ）に加えた。従って、最終１００μｌアッセイ量には、種々の希釈率のｍＡｂｄＡｂ（３倍希釈で滴定された終濃度２７０ｎＭ〜０．００５ｎＭ）、組み換え大腸菌により発現されたヒトＩＬ−４（終濃度１．１ｎｇ／ｍｌ）およびＴＦ−１細胞（終濃度１ｘ１０５細胞／ｍｌ）が含まれた。アッセイプレートを、加湿ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にておよそ４日間インキュベートした。次に、細胞増殖の量をＰｒｏｍｅｇａからの「ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ」（カタログ番号Ｇ４１００）を用い、製造業者の説明書の通りに測定した。９６ウェルプレート内のサンプルの吸光度を５７０ｎｍで読み取った。これらのデータをＥｘｃｅｌスプレッドシートに入力し、２反復の試験ウェルの値の平均を求め、平均バックグラウンド値（ｍＡｂ−ｄＡｂ無し、ＩＬ−４無しの試験ウェル）を差し引いた。
組み換え大腸菌により発現されたヒトＩＬ−４の生物活性を中和するｍＡｂｄＡｂの能力は、定義された量のヒトＩＬ−４（１．１ｎｇ／ｍｌ）の生物活性を５０％中和するのに必要なｍＡｂ−ｄＡｂの濃度（＝ＮＤ５０）として表した。必要なｍＡｂｄＡｂの濃度が低いほど、中和能は高い。本明細書に示されるＮＤ５０データ（表４）は、ＥｘｃｅｌのＲｏｂｏｓａｇｅ機能を用いて算出した。これらのデータを図１２にグラフで示す。
抗ＩＬ−４ ｍＡｂおよびＤＯＭ９−１５５−１５４（配列番号２６）を、ＴＦ−１細胞バイオアッセイにおけるヒトおよびカニクイザルＩＬ−４の中和に関する陽性対照として含めた。さらに、無関連の抗原に対して特異性を有するｄＡｂ（ダミーｄＡｂ）も、ＴＦ−１細胞バイオアッセイにおけるヒトまたはカニクイザルＩＬ−４の中和に関する陰性対照として含めた。
これらを数回繰り返し、図１２にこれらの実験のうち１つの結果を示す。このデータセットからＮＤ５０値を算出した。ＮＤ５０値は、ＩＬ−４の生物活性を５０％中和することができるｍＡｂｄＡｂまたはｍＡｂまたはｄＡｂの濃度である。平均ＮＤ５０値および試験回数（ｎ）を表４に示す。
Figure 0005901517
これらのデータから、精製ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７ ｍＡｂｄＡｂが、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−４の生物活性を中和したことが確認される。抗ＩＬ−４ ｍＡｂおよびＤＯＭ９−１５５−１５４はまたヒトおよびカニクイザルＩＬ−４の生物活性も中和したが、同じバイオアッセイにおいて、陰性ｄＡｂ（ダミーｄＡｂ）は中和しないことが示された。
３種類のｍＡｂｄＡｂは全て良好な効力を示し、この効力の違いを採取できないより粗雑なＥＬＩＳＡにもかかわらず、この中和アッセイから、リンカー長が増すほどｄＡｂ効力が増すという明白な傾向があることが明らかであった。陰性対照抗ＩＬ−４ ｍＡｂは、同じバイオアッセイで中和を示さなかった。
４．４ ＴＦ−１細胞増殖バイオアッセイにおけるヒトＩＬ−１３の中和
精製ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７ ｍＡｂｄＡｂを、ＴＦ−１細胞バイオアッセイにおいてヒトＩＬ−１３の中和に関して以下のように試験した。
ＴＦ−１細胞は、ヒトＩＬ−１３を含むいくつかの異なるサイトカインに応答して増殖する。従って、これらの細胞のＩＬ−１３に対する応答を用いてＩＬ−１３の生物活性を測定することができ、続いて、ｍＡｂｄＡｂのＩＬ−１３中和効力（ＩＬ−１３生物活性の阻害）を測定するためのアッセイが開発された。
このアッセイは、無菌条件下、９６ウェル組織培養プレートで行い、全ての試験を２回行った。組み換え大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）により発現されたヒトＩＬ−１３およそ１４ｎｇ／ｍｌを種々の希釈率のｍＡｂｄＡｂ（通常、３倍希釈で滴定された５６０ｎＭ〜０．００９ｎＭ）とともの総量１２０μｌで、３７℃にて１時間プレインキュベートした。陰性対照として無関連特異性の抗体およびｄＡｂも同様に滴定した（それぞれ抗ＩＬ−４ ｍＡｂおよびＤＯＭ９−１５５−１５４）。次に、これらのサンプル５０μｌを、無菌９６ウェル組織培養プレートにて、５０μｌのＴＦ−１細胞（濃度２ｘ１０５細胞／ｍｌ）に加えた。従って、最終１００μｌアッセイ量には、種々の希釈率のｍＡｂｄＡｂ（３倍希釈で滴定された終濃度２７０ｎＭ〜０．００５ｎＭ）、組み換え大腸菌により発現されたヒトＩＬ−１３（終濃度７ｎｇ／ｍｌ）およびＴＦ−１細胞（終濃度１ｘ１０５細胞／ｍｌ）が含まれた。アッセイプレートを、加湿ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にておよそ４日間インキュベートした。次に、細胞増殖の量をＰｒｏｍｅｇａからの「ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ」（カタログ番号Ｇ４１００）を用い、製造業者の説明書の通りに測定した。９６ウェルプレート内のサンプルの吸光度を５７０ｎｍで読み取った。これらのデータをＥｘｃｅｌスプレッドシートに入力し、２反復の試験ウェルの値の平均を求め、平均バックグラウンド値（ｍＡｂ−ｄＡｂ無し、ＩＬ−１３無しの試験ウェル）を差し引いた。
組み換え大腸菌により発現されたヒトＩＬ−１３の生物活性を中和するｍＡｂｄＡｂの能力は、定義された量のヒトＩＬ−１３（７ｎｇ／ｍｌ）の生物活性を５０％中和するのに必要なｍＡｂ−ｄＡｂの濃度（＝ＮＤ５０）として表した。必要なｍＡｂｄＡｂの濃度が低いほど、中和能は高い。本明細書に示されるＮＤ５０データ（表５）は、ＥｘｃｅｌのＲｏｂｏｓａｇｅ機能を用いて算出した。これらのデータを図１２にグラフで示す。
抗ＩＬ−１３ ｍＡｂを、ＴＦ−１細胞バイオアッセイにおけるヒトＩＬ−１３の中和に関する陽性対照として含めた。さらに、抗ＩＬ−４ ｍＡｂも陰性対照として含めた。
図１３は、ＴＦ−１細胞中和アッセイの結果を示す。このデータセットからＮＤ５０値を算出した。ＮＤ５０値は、ＩＬ−１３の生物活性を５０％中和することができるｍＡｂｄＡｂ、ｍＡｂまたはｄＡｂの濃度である。平均ＮＤ５０値および試験回数を表５に示す。
Figure 0005901517
これらのデータから、精製ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７ ｍＡｂｄＡｂが、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３の生物活性を中和したことが確認される。陰性対照抗ＩＬ−４ ｍＡｂは同じバイオアッセイにおいて中和しないことが示された。
実施例５：ＤＯＭ１０−５３−６１６ ｄＡｂを含むｍＡｂｄＡｂ
５．１ 抗ＩＬ１３ ｍＡｂ−抗ＩＬ４ ｄＡｂの発現分析
実施例１に記載のようにＢＰＣ２２０２、ＢＰＣ２２０３、ＢＰＣ２２０９およびＢＰＣ２２１０をコードする重鎖および軽鎖発現プラスミドを、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３４７０１９）を用いてＨＥＫ ２９３６Ｅ細胞に同時形質移入し、小規模に発現させて抗体分子を生産した。分子を組織培養上清から直接評価し、Ｇｙｒｏｌａｂワークステーションを用いて定量した。
ＢＰＣ２２０２、ＢＰＣ２２０３、ＢＰＣ２２０９およびＢＰＣ２２１０は全て十分に発現した。
本発明者らは、別の抗ＩＬ−１３ ｄＡｂ配列（ＤＯＭ１０−１７６−５３５−配列番号９７）を用いて等価なｍＡｂｄＡｂの作製を試みた。しかしながら、発現すると、これらの分子は凝集性が高かったことから、さらなる試験に用いるには十分でなかった。
５．２ ＤＯＭ１０−５３−６１６を含むｍＡｂｄＡｂのストレッサー試験
ＢＰＣ２２０２、ＢＰＣ２２０３、ＢＰＣ２２０９、ＢＰＣ２２１０をＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸緩衝液に入れ、３７℃で最大１４日間インキュベートした。次に、それらを目に見える沈殿の存在、可溶性凝集塊および溶液中での分子の濃度の維持に関して分析した。
その後の分析では、ＰＢＳおよび酢酸溶液の両方で、これらの分子の溶液中でのタンパク質濃度の低下が示唆され、これはエッペンドルフ管の壁面にタンパク質が吸着したためであると思われた。
ＢＰＣ２２１０もまた酢酸緩衝溶液中ではタンパク質濃度の低下を示したが、ＰＢＳ溶液中で２週間インキュベートした後のタンパク質濃度はやや増加していた（これは、細菌の混入によるものであった可能性がある）。
実施例６：種々のリンカー長を有する抗ＩＬ４／抗ＴＮＦα ｍＡｂ−ｄＡｂ構築物の設計および構築
抗ＴＮＦα ｄＡｂ ＤＮＡ配列を、オーバーラッピングオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲにより生成した。ＰＣＲ産物を、抗ＩＬ４抗体の重鎖を含む哺乳動物発現ベクター中にクローニングし、抗ＴＮＦα ｄＡｂを、ＴＶＡＡＰＳＧＳリンカーを介して重鎖のＣ末端に融合させた（配列番号１０３および１０４、ＢＰＣ２６２６の重鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列）。ＢＰＣ２６２６の重鎖を基本構築物として用い、種々のリンカー（ＴＶＡＡＰＳＧＳｘ２、ＴＶＡＡＰＳＧＳｘ３、ＴＶＡＡＰＳＧＳｘ４）をクローニングし、それぞれＢＰＣ２６５１、ＢＰＣ２６５２およびＢＰＣ２６５３の重鎖を生成した（配列番号１０６および１０７、１０８および１０９、１１０および１１１、それぞれＢＰＣ２６５１、ＢＰＣ２６５２およびＢＰＣ２６５３のＤＮＡおよびタンパク質配列）。
ＢＰＣ２６２６、ＢＰＣ２６５１、ＢＰＣ２６５２およびＢＰＣ２６５３の重鎖および対応する軽鎖をコードする発現プラスミドを、ＨＥＫ ２９３−６Ｅ細胞中に一過的に同時形質移入した。形質移入２４時間に各細胞培養に栄養としてトリプトンを添加し、３〜７日後に細胞を回収した。活性を評価する前に、プロテインＡカラムを用いてｍＡｂｄＡｂを精製した。作製および発現した構築物を表６に示す。
Figure 0005901517
６．１ ＴＮＦα結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェル高結合プレートをリン酸緩衝食塩水中１μｇ／ｍｌのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２１０−ＴＡ−０１０／ＣＦ）でコーティングし、４℃で一晩保存した。このプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水で２回洗った。１００μＬのブロッキング溶液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０緩衝液を含むトリス緩衝食塩水中に）をそれぞれのウェルに加え、そしてこのプレートを室温で少なくとも１時間インキュベートした。その後、再び洗浄工程を行った。精製二重特異性抗体および陰性対照抗体をプレート間で、ブロッキング溶液で連続的に希釈した。１時間インキュベートした後、プレートを洗った。ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体Ｈ２３（Ｓｉｇｍａ、Ａ７１６４）をブロッキング溶液で１μｇ／ｍＬとなるように希釈し、５０μＬをそれぞれのウェルに加えた。プレートを１時間〜１時間半の間インキュベートした。再度洗浄工程を行った後、５０μｌのＯＰＤ（σ−フェニレンジアミン二塩酸塩）ＳｉｇｍａＦａｓｔ基質溶液をそれぞれのウェルに加え、そして１５分後に、２５μＬの３Ｍ硫酸を加えることによって反応を停止させた。ＶｅｒｓａＭａｘ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用し、標準的なエンドポイントプロトコールを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。
図１４はＴＮＦα結合ＥＬＩＳＡの結果を示し、これにより、ＢＰＣ２６２６、ＢＰＣ２６５１、ＢＰＣ２６５２およびＢＰＣ２６５３がＴＮＦαに結合し、結合活性の増大がリンカー長の増加に相関していたことが確認される。陰性対照抗体は標的に対する結合を示さなかった。リンカー長が増すほどｄＡｂ効力が増大する傾向が見て取れた。
６．２ ＩＬ４結合ＥＬＩＳＡ
これらの構築物をＩＬ−４に対する結合に関して試験したが、このアッセイの技術的問題のために、それらが全て結合したということが、本発明者らが示すことができる唯一の結論である。
実施例７：ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）分析により評価した際の、種々のリンカー長を有するｍＡｂｓｄＡｂ（ＢＰＣ２２２１〜２２３１）の、ＩＬ−１３およびＩＬ−４に対する親和性
方法
抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ｂｉａｃｏｒｅ）を、第一級アミンカップリングによってＣＭ５チップ上に固定化し、この表面を供試抗体分子の捕捉面として用いた。組み換え大腸菌により発現されたヒトＩＬ４およびヒトＩＬ１３を２５６、６４、１６、４および１ｎＭで用い、０ｎＭ（すなわち緩衝液のみ）を結合曲線の二重参照に用いた。抗ヒトＩｇＧ表面の再生では、１００ｍＭリン酸を注入した後、３Ｍ ＭｇＣｌ２を注入した。アッセイは、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰを用いて２５℃で行った。データをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００分析ソフトウェアに固有の１：１モデルに当てはめた。
ヒトＩＬ１３に対する結合の結果を表７に示し、ヒトＩＬ４に対する結合の結果を表８に示す。
Figure 0005901517
Figure 0005901517
ＩＬ４の結合では、実施の質が全体的に低く、最高濃度においてチップ表面への非特異的結合があったということで分析が適切でなかった。
実施例８：ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）分析により評価した際の、６１６ ｄＡｂを含むｍＡｂｄａｂの、ＩＬ−１３およびＩＬ−４に対する結合親和性
それぞれＤＯＭ１０−５３−６１６抗ＩＬ−１３ドメイン抗体（配列番号１）を含むｍＡｂｄＡｂ ＢＰＣ２２０１〜２２１５、ＢＰＣ２２１７〜２２２０およびＢＰＣ２２４３をＢＩＡｃｏｒｅによって試験した。全てのｍＡｂｄＡｂがＩＬ−１３およびＩＬ−４の両方に結合したが、結合が極めて強固で解離速度が測定できなかった。
実施例９：ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）分析により評価した際の、種々のリンカー長を有するｍＡｂｄＡｂ（ＢＰＣ２２１１〜２２３１およびＢＰＣ２２３４〜２２３７およびＢＰＣ２２４１−２２４２）の、ＩＬ−１３およびＩＬ−４に対する結合親和性
方法
抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ｂｉａｃｏｒｅ）を、第一級アミンカップリングによってＣＭ５チップ上に固定化し、この表面を供試抗体分子の捕捉面として用いた。組み換え大腸菌により発現されたヒトＩＬ４は２５６、６４、１６、４および１ｎＭで用い、組み換え大腸菌により発現されたヒトＩＬ１３は２５６ｎＭのみで用い、０ｎＭ（すなわち緩衝液のみ）をＩＬ４結合とＩＬ１３結合の両方の結合曲線の二重参照に用いた。抗ヒトＩｇＧ表面の再生では、１００ｍＭリン酸を注入した後、３Ｍ ＭｇＣｌ２を注入した。アッセイは、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰを用いて２５℃で行った。データをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００分析ソフトウェアに固有の１：１モデルに当てはめた。
ヒトＩＬ１３およびヒトＩＬ４に対する結合の結果を表９に示す。
Figure 0005901517
最高濃度の組み換え大腸菌により発現されたヒトＩＬ４でいくらかの非特異的結合が見られ、これがデータの質に影響した。
実施例１０：ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）分析により評価した際の、種々のリンカー長を有する原型ＩＬ−１３ ｍＡｂ ＣＤＲＨ３を含むｍＡｂｄＡｂ（ＢＰＣ２２２２、ＢＰＣ２２２３およびＢＰＣ２２３０−２２３１）の、ＩＬ−１３およびＩＬ−４に対する結合親和性
方法
プロテインＡを、第一級アミンカップリングによってＣ１チップ上に固定化し、この表面を供試抗体分子の捕捉面として用いた。組み換え大腸菌により発現されたヒトＩＬ１３は２５６、６４、１６、４および１ｎＭで用い、組み換え大腸菌により発現されたヒトＩＬ４は６４、１６、４、１および０．２５ｎＭで用い、０ｎＭ（すなわち緩衝液のみ）をＩＬ４結合とＩＬ１３結合の両方の結合曲線の二重参照に用いた。プロテインＡ表面の再生には１００ｍＭリン酸を用いた。アッセイは、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰを用いて２５℃で行った。データをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００分析ソフトウェアに固有の１：１モデルに当てはめた。
ヒトＩＬ１３に対する結合の結果を表１０に示し、ヒトＩＬ４に対する結合の結果を表１１に示す。
Figure 0005901517
Figure 0005901517
実施例１１：ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）分析により評価した際の、種々のリンカー長を有する原型ＩＬ−１３ ｍＡｂ ＣＤＲＨ３を含むｍＡｂｄＡｂ（ＢＰＣ２２２２、ＢＰＣ２２３１）および種々のリンカー長を有する変異体抗ＩＬ−１３ ｍＡｂ ＣＤＲＨ３を含むｍＡｂｄＡｂ（ＢＰＣ１０８５〜１０８７）の、ＩＬ−１３およびＩＬ−４に対する結合親和性
方法
プロテインＡを、第一級アミンカップリングによってＣＭ５チップ上に固定化し、この表面を供試抗体分子の捕捉面として用いた。組み換え大腸菌により発現されたヒトＩＬ１３は２５６ｎＭのみで用い、組み換え大腸菌により発現されたヒトＩＬ４は６４、１６、４および１ｎＭで用い、０ｎＭ（すなわち緩衝液のみ）をＩＬ４結合とＩＬ１３結合の両方の結合曲線の二重参照に用いた。プロテインＡ表面の再生には、５０ｍＭ ＮａＯＨを用いた。アッセイは、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰを用いて２５℃で行った。データをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００分析ソフトウェアに固有の１：１モデルに当てはめた。
ヒトＩＬ１３に対する結合を表１２に示し、ヒトＩＬ４に対する結合の結果を表１３に示す。
Figure 0005901517
ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７の結合速度はＢｉａｃｏｒｅの感度を超えているが、本発明者らがこのデータを正確に分析できないという事実は、ＩＬ４との相互作用が速い結合速度を持った高親和性である可能性があることを示唆する。
Figure 0005901517
実施例１２：ｍＡｂｄＡｂのストレッサー試験
いくつかのｍＡｂｄＡｂをＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸緩衝液中に入れ、最大１４日間３７℃でインキュベートした。次に、それらを目に見える沈殿の存在、可溶性凝集塊および溶液中での分子の濃度の維持に関して分析した。
これらの結果は、突然変異型ｄＡｂを含むｍＡｂｄＡｂ（ＢＰＣ１０８５、１０８６、１０８７）が非変異型ｄＡｂを含むｍＡｂｄＡｂ（ＢＰＣ２２２２、２２２３、２２３０、２２３１）と同様に挙動し、両カテゴリーのｍＡｂｄＡｂが、溶液中のタンパク質濃度に変化が無いことで示されるように、ＰＢＳおよび酢酸緩衝液の両方で、３７℃にて２週間のインキュベーション期間にわたって安定であると思われた。さらに、溶液中での凝集レベル関する変化は全く、またはほとんど見られず、沈殿も見られなかった。
実施例１３：ラットおよびカニクイザルＰＫに対するリンカー長の効果
ＢＰＣ１０８５、ＢＰＣ１０８６およびＢＰＣ１０８７の薬物動態を、ラットへのＩＶ投与の後に独立した試験で調べた。また、カニクイザルでもＩＶ投与後にＢＰＣ１０８５のＰＫを調べた。
ラットにおける３種類の分子全てのＰＫおよびサルにおけるＢＰＣ１０８５のＰＫは、標準的なｍＡｂのＰＫと一致することが分かった。
実施例１４
いくつかの異なる長さのリンカーを有する、異なる標的に対するｍＡｂｄａｂのパネルを発現させた。未同定の上清を数種のＥＬＩＳＡ結合実験にかけたところ、これらの予備的結果は、リンカー長の違いによって本明細書に記載されているものと同様の傾向を示唆する。
いくつかの異なる長さのリンカーを有する、異なる標的に対するｍＡｂｄａｂの第２のパネルを発現させた。未同定の上清を数種のＥＬＩＳＡ結合実験にかけたところ、これらの予備的結果は、ｄＡｂおよびリンカー長の違いによる変動を示唆する。
Figure 0005901517
Figure 0005901517
Figure 0005901517
配列番号１
ＧＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＶＦＰＷＹＤＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＤＷＨＧＫＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＡＥＤＥＰＧＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２
ＱＶＴＬＲＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＲＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＲＥＴＶＦＹＷＹＦＤＶＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３
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配列番号４
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配列番号１７
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配列番号３１
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配列番号３２
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配列番号３３
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配列番号４３
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配列番号４４
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配列番号４６
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配列番号５０
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配列番号５１
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配列番号７９＝５８６Ｈ−ＴＶＡＡＰＳ−１５４（Ｈ鎖）
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配列番号８１＝ＤＯＭ９−１５５−１４７
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配列番号８２＝ＤＯＭ９−１１２−２１０
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配列番号８３＝ＤＯＭ１０−５３−４７４
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配列番号８４（実施例シグナルペプチド配列）
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配列番号８５＝６１６−ＴＶＡＡＰＳ−抗ヒトＩＬ−４ ｍＡｂ重鎖
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配列番号８６＝６１６−ＡＳＴＫＧ−抗ヒトＩＬ−４ ｍＡｂ重鎖
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配列番号８７＝６１６−ＧＳＴＶＡＡＰＳ−抗ヒトＩＬ−４ ｍＡｂ軽鎖
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配列番号８８＝６１６−ＧＳＡＳＴＫＧ− 抗ヒトＩＬ−４ ｍＡｂ軽鎖
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配列番号８９＝抗ヒトＩＬ−４ ｍＡｂ軽鎖−ＴＶＡＡＰＳ−６１６
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配列番号９０＝抗ヒトＩＬ−４ ｍＡｂ重鎖−ＴＶＡＡＰＳ−６１６（重鎖）
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配列番号９１＝抗ＩＬ−５ ｍＡｂ重鎖
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配列番号９２＝抗ＩＬ−５ ｍＡｂ軽鎖
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配列番号９３
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配列番号９４＝（８２９Ｈ−（ＴＶＡＡＰＳ） ２ ＧＳ−１５４ Ｌ８９Ｑ）
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配列番号９５＝８２９Ｈ−（ＴＶＡＡＰＳ） ３ ＧＳ−１５４ Ｌ８９Ｑ
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配列番号９６＝８２９Ｈ−（ＴＶＡＡＰＳ） ４ ＧＳ−１５４ Ｌ８９Ｑ
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配列番号９７
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配列番号９８
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配列番号９９
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配列番号１００
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配列番号１０１
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＲＰＩＳＤＷＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＡＷＡＳＳＬＱＧＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＥＧＷＧＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号１０２
ＱＱＥＧＷＧＰＰＴ
配列番号１０３ ＢＰＣ２６２６重鎖のポリヌクレオチド配列
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配列番号１０４ ＢＰＣ２６２６重鎖のタンパク質配列
ＱＶＴＬＲＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＲＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＲＥＴＶＦＹＷＹＦＤＶＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＴＶＡＡＰＳＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＤＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＥＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＶＶＷＲＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号１０５ 軽鎖のポリヌクレオチド配列
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配列番号１０６ ＢＰＣ２６５１重鎖のポリヌクレオチド配列
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配列番号１０７ ＢＰＣ２６５１重鎖のタンパク質配列
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配列番号１０８ ＢＰＣ２６５２重鎖のポリヌクレオチド配列
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配列番号１０９ ＢＰＣ２６５２重鎖のタンパク質配列
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配列番号１１０ ＢＰＣ２６５３重鎖のポリヌクレオチド配列
ＣＡＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＴＴＴＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＡＣＣＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＣＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＣＣＣＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＣＧＴＣＴＴＣＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＡＴＣＴＡＣＣＧＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＧＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＡＧＴＡＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＣＡＧＴＡＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＧＡＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＧＴＧＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧ
配列番号１１１ ＢＰＣ２６５３重鎖のタンパク質配列
ＱＶＴＬＲＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＲＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＲＥＴＶＦＹＷＹＦＤＶＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＤＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＥＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＶＶＷＲＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号１１２
ＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＧＳ
配列番号１１３
ＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＧＳ
配列番号１１４
ＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＧＳ

Claims (15)

  1. １つ以上のエピトープ結合ドメインに連結したタンパク質足場を含む抗原結合性タンパク質であって、該抗原結合性タンパク質は少なくとも２つの抗原結合部位を有し、そのうちの少なくとも１つはエピトープ結合ドメインに由来し、少なくとも１つはＶＨ／ＶＬドメイン対に由来し、該エピトープ結合ドメインが、配列番号７８で示される配列またはその複合（multiples）を含むペプチドリンカーによって該タンパク質足場に連結された、抗原結合性タンパク質。
  2. 該リンカーが（ＴＧＬＤＳＰ）n（ＧＳ）m（ここで、ｎ＝１〜１０、かつ、ｍ＝０〜４）である、請求項１に記載の抗原結合性タンパク質。
  3. 少なくとも１つのエピトープ結合ドメインが免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）である、請求項１または２に記載の抗原結合性タンパク質。
  4. 該免疫グロブリン単一可変ドメインがヒトｄＡｂである、請求項３に記載の抗原結合性タンパク質。
  5. 該抗原結合性タンパク質が２つ以上の抗原に対する特異性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗原結合性タンパク質。
  6. 第１の結合部位が抗原上の第１のエピトープに対する特異性を有し、第２の結合部位が同じ抗原上の第２のエピトープに対する特異性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗原結合性タンパク質。
  7. 該抗原結合性タンパク質がＩＬ−１３に結合可能な、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗原結合性タンパク質。
  8. 該抗原結合性タンパク質がＩＬ−１３およびＩＬ−４に結合可能な、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗原結合性タンパク質。
  9. 該タンパク質足場がＩｇ足場である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗原結合性タンパク質。
  10. 該エピトープ結合ドメインのうちの少なくとも１つがヒト血清アルブミンに結合する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗原結合性タンパク質。
  11. 医療における使用のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗原結合性タンパク質。
  12. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗原結合性タンパク質の重鎖および軽鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、形質転換またはトランスフェクトされた単離された組換え宿主細胞。
  13. 請求項１２に記載の宿主細胞を培養して前記抗原結合性タンパク質を単離する工程を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗原結合性タンパク質の生産方法。
  14. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗原結合性タンパク質および製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
  15. タンパク質足場に連結した際のエピトープ結合ドメインの結合親和性を改善する方法であって、該エピトープ結合ドメインはリンカーを用いずにタンパク質足場に直接連結された場合に、裸のエピトープ結合ドメインとしてのその結合親和性に比べて低い結合親和性を有するものであり、該タンパク質足場と該エピトープ結合ドメインの間にペプチドリンカーを付加する工程を含み、該ペプチドリンカーが配列番号７８で示される配列またはその複合（multiples）を含む、方法。
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