ES2673847T3

ES2673847T3 - Anticuerpos anti KIT y usos de los mismos

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Publication number: ES2673847T3
Application number: ES13745296.7T
Authority: ES
Inventors: Yaron Hadari; Elizabeth M. MANDEL-BAUSCH; Francis Joseph Carr; Timothy David Jones; Laura Clare Alexandra PERRY
Original assignee: Celldex Therapeutics Inc
Current assignee: Celldex Therapeutics Inc
Priority date: 2012-07-25
Filing date: 2013-07-24
Publication date: 2018-06-26
Anticipated expiration: 2033-07-24
Also published as: CN116574185A; SG11201500489YA; NZ630363A; AU2013295848A1; KR102268351B1; KR20150038278A; NZ731881A; DK3381943T3; JP2023062063A; AU2013295848B2; US20240150493A1; BR112015001459B1; BR112015001459A2; JP7230095B2; EP2877493B1; CN104812775B; JP2015531752A; EP3381943A1; US20220010027A1; WO2014018625A1

Abstract

Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano, comprendiendo dicho anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo: (i) (a) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos: **Fórmula** en la que XK1 es un aminoácido con una cadena lateral aromática o hidroxilo alifática, XK2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática o hidroxilo alifática, XK3 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática, XK4 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática o es P, XK5 es un aminoácido con una cadena lateral cargada o ácida, y XK6 es un aminoácido con una cadena lateral aromática; y (b) una VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, respectivamente; (ii) (a) una VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21, respectivamente; y (b) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos: **Fórmula** en la que XH1 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, XH2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, XH3 es un aminoácido con una cadena lateral polar o básica, XH4 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, XH5 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, XH6 es un aminoácido con una cadena lateral ácida, XH7 es un aminoácido con una cadena lateral ácida o de derivación 20 amídica, y XH8 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática; o (iii) (a) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos: **Fórmula** en la que XK1 es un aminoácido con una cadena lateral aromática o hidroxilo alifática, XK2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática o hidroxilo alifática, XK3 es un aminoácido con una cadena 25 lateral hidroxilo alifática, XK4 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática o es P, XK5 es un aminoácido con una cadena lateral cargada o ácida, y XK6 es un aminoácido con una cadena lateral aromática; y (b) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos: **Fórmula** en la que XH1 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, XH2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, XH3 es un aminoácido con una cadena lateral polar o básica, XH4 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, XH5 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, XH6 es un aminoácido con una cadena lateral ácida, XH7 es un aminoácido con una cadena lateral ácida o de derivación amídica, y XH8 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática, inhibiendo el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, la fosforilación de la tirosina de KIT con una CI50 de aproximadamente 600 pM o menor determinada por ELISA, e induciendo el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, la internalización del receptor KIT.

Description

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DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti KIT y usos de los mismos

1. Campo

En la presente memoria se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente con un polipéptido KIT, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, conjugados de tales anticuerpos, polinucleótidos que codifican tales anticuerpos, vectores y células anfitrionas para producir tales anticuerpos, equipos de reactivos y composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno de kIt, usos y métodos para el tratamiento o la gestión de un trastorno asociado con KIT, y métodos de diagnóstico.

2. Antecedentes

KIT (o c-Kit) es un receptor tirosina quinasa de tipo III codificado por el gen c-kit. KIT comprende cinco dominios extracelulares tipo de inmunoglobulina (Ig), una sola región transmembranal, un dominio yuxtamembranal citoplasmático inhibidor y un dominio quinasa citoplasmático escindido separado por un segmento de insertos de quinasa (véanse, por ejemplo, Yarden et al., Nature, 1986, 323:226-232; Ullrich y Schlessinger, Cell, 1990, 61:203- 212; Clifford et al., J. Biol. Chem., 2003, 278:31461-31464). El gen c-kit humano que codifica el receptor KIT ha sido clonado según describen Yarden et al., EMBO J., 1987, 6:3341-3351. KIT también es denominado CD117 o receptor del factor de células madre (“SCFR”), porque es el receptor para el ligando del factor de células madre (“SCF”) (también denominado Factor de Steel o Ligando Kit). El ligando SCF que se une a los tres primeros dominios extracelulares de tipo Ig de KIT induce la dimerización del receptor y, por ello, activa la actividad intrínseca de la tirosina quinasa mediante la fosforilación de residuos específicos de tirosina en los dominios yuxtamembranal y quinasa (véanse, por ejemplo, Weiss y Schlessinger, Cell, 1998, 94:277-280; Clifford et al., J. Biol. Chem., 2003, 278:31461-31464). Se ha demostrado que los miembros de los sistemas de señalización Stat, Src, ERK y AKT están aguas abajo de los transductores de señales de la señalización KIT.

Se cree que los dominios extracelulares de tipo Ig cuarto (D4) y quinto (D5) de KIT arbitran la dimerización del receptor (véanse, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2008/153926; Yuzawa et al., Cell, 2007, 130:323-334).

Se ha detectado la expresión de KIT en diversos tipos de células, tales como mastocitos, células madre, células cerebrales, melanoblastos, células ováricas y células cancerosas (por ejemplo, células de leucemia). Los estudios de mutaciones de KIT con pérdida de función indican que KIT es importante para el desarrollo normal de células progenitoras hematopoyéticas, mastocitos, melanocitos, células germinales primordiales y las células intersticiales de Cajal (véanse, por ejemplo, Besmer, P., Curr. Opin. Cell Biol., 1991, 3:939-946; Lyman et al., Blood, 1998, 91:1101-1134; Ashman, L. K., Int. J. Biochem. Cell Biol., 1999, 31:1037-1051; Kitamura et al., Mutat. Res., 2001, 477:165-171; Mol et al., J. Biol. Chem., 2003, 278:31461-31464). Además, KIT desempeña un importante papel en la hematopoyesis, la melanogénesis y la gametogénesis (véase Ueda et al., Blood, 2002, 99:3342-3349).

Se ha implicado a la actividad anormal de KIT en conexión con varios cánceres. Por ejemplo, se encuentran mutaciones de KIT con ganancia de función en una activación constitutiva independiente del SCF de KIT en ciertas células cancerosas y están asociadas con ciertos cánceres, tales como la leucemia (por ejemplo, leucemia mieloide crónica) y tumores estromales gastrointestinales (véase, por ejemplo, Mol et al., J. Biol. Chem., 2003, 278:31461- 31464).

El documento WO 2011/119948 describe anticuerpos anti KIT humano.

El documento WO2007/127317 describe un anticuerpo antagonista humanizado anti KIT humano.

El documento EP 0787743 describe un anticuerpo murino anti KIT humano.

El documento WO 92/17505 describe un anticuerpo murino anti KIT humano.

Blechman et al., Cell, vol. 80, n° 1, 1995-01-13, páginas 103-113, describen el uso de anticuerpos anti KIT al dominio extracelular.

Ashman et al., Journal of Cellular Physiology, vol. 158, n° 3, 1994-03-01, páginas 545-554, describen tres anticuerpos KIT: YB5.B8, 17F11 y SR-1.

El documento WO 2012/103165 describe el anticuerpo murino 37M anti KIT humano.

El documento WO 2012/154480 describe el anticuerpo humano CK6 anti KIT humano.

3. Compendio

En la presente memoria se proporcionan, en general, anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y conjugados de los mismos, que se unen inmunoespecíficamente a un dominio 4 (D4) (o región D4) del dominio

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extracelular de KIT (por ejemplo, KIT humano) e inhiben la actividad del KIT, así como composiciones, reactivos y métodos relacionados.

Específicamente, la invención proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano, comprendiendo dicho anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo:

(i) (a) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos:

DWMTQSPSXkjLSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXkiLIYSASYR YSGVPDRFXk3GSGSGTDFTLTISSLQXK4EDFAXk.5YXk6CQQYNSYPRTFGGGTKVEI K (SEQ ID NO:12),

en la que Xki es un aminoácido con una cadena lateral aromática o hidroxilo alifática, Xk2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática o hidroxilo alifática, Xk3 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática, Xk4 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática o es P, Xks es un aminoácido con una cadena lateral cargada o ácida, y Xk6 es un aminoácido con una cadena lateral aromática; y

(b) una VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que tienen las secuencias de

aminoácidos de sEq ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, respectivamente;

(ii) (a) una VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que tienen las secuencias de

aminoácidos de sEq ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID No: 21, respectivamente; y

(b) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos:

QVQLVQSGAEXhiKKPGASVKXhiSCKASGYTFTDYYINWVXhíQAPGRGLEWIARIY PGSGNTYYXEKFKGRXh4TXhsTAXh*KSTSTAYMXh7LSSLRSEDXh8AVYFCARGVY YFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:11),

en la que Xhi es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh3 es un aminoácido con una cadena lateral polar o básica, Xh4 es un aminoácido con una cadena

lateral alifática, Xhs es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh6 es un aminoácido con una cadena

lateral ácida, Xh7 es un aminoácido con una cadena lateral ácida o de derivación amídica, y Xhs es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática; o

(iii) (a) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos:

DIVMTQSPSXkiLSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXkiLIYSASYR YSGVPDRFXk3GSGSGTDFTLTISSLQXk4EDFAXk5YXk6CQQYNSYPRTFGGGTKVEI K (SEQ ID NO:12),

(b) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos:

QVQLVQSGAEXHiKKPGASVKXmSCKASGYTFTDYYlNWVXraQAPGKGLEWIARIY

PGSGNTYYNEKFKGRXhíTXhsTAXhsKSTSTAYMXhtLSSLRSEDXhsAVYFCARGVY

YFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:11),

en la que Xhi es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh3 es un aminoácido con una cadena lateral polar o básica, Xh4 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xhs es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh6 es un aminoácido con una cadena lateral ácida, Xh7 es un aminoácido con una cadena lateral ácida o de derivación amídica, y Xhs es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática,

inhibiendo el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, la fosforilación de la tirosina de KIT con una CI50 de aproximadamente 600 pM o menor determinada por ELISA, e

induciendo el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, la internalización del receptor KIT.

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Además, la invención proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano, comprendiendo dicho anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo:

(i): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 4; de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y la VH comprende la secuencia de

(ii): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 3; de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y la VH comprende la secuencia de

(iii): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 6; de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y la VH comprende la secuencia de

(iv): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 5; de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la VH comprende la secuencia de

(v): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 2; de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la VH comprende la secuencia de

(vi): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 3; de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la VH comprende la secuencia de

(vii): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 4; de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la VH comprende la secuencia de

(viii): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 6; de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la VH comprende la secuencia de

(ix): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 2; de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y la VH comprende la secuencia de

(x): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 3; de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y la VH comprende la secuencia de

(xi): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 5; de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y la VH comprende la secuencia de

(xii): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 2; de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y la VH comprende la secuencia de

(xiii): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 3; de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y la VH comprende la secuencia de

(xiv): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 4; de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y la VH comprende la secuencia de

(xv): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 5; de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y la VH comprende la secuencia de

(xvi): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 6; de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y la VH comprende la secuencia de

(xvii): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 2; de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y la VH comprende la secuencia de

(xviii): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 4; de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y la VH comprende la secuencia de

(xix): la VL comprende la aminoácidos de SEQ secuencia ID NO: 5; o de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y la VH comprende la secuencia de

(xx): la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y la VH comprende la secuencia de

aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

La invención también proporciona un conjugado que comprende el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención ligado a un agente.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, o el conjugado de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona un polinucleótido o una combinación de polinucleótidos que comprende secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, un vector o una combinación de vectores que comprende el polinucleótido o la combinación de dichos polinucleótidos, así como una célula anfitriona que comprende el vector o el polinucleótido o la combinación de dichos polinucleótidos.

La invención también proporciona un equipo de reactivos que comprende el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, o el conjugado de la invención.

La invención también proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, o el conjugado de la invención, para ser usado en un método de tratamiento o gestión del cáncer, el asma, una afección inflamatoria o la fibrosis.

La invención también proporciona un método in vitro para el diagnóstico de un sujeto con un trastorno asociado con KIT, comprendiendo el método poner las células o la muestra obtenidas del sujeto en contacto con el anticuerpo, o el

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fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención y detectar el nivel de expresión de KIT en las células o la muestra.

La invención también proporciona un método de creación de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano, comprendiendo dicho método cultivar y/o expresar el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo usando la célula de la invención.

Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano puede comprender:

(i) una región de cadena ligera variable (“VL”) que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y sEq ID NO: 21, respectivamente; y

(ii) una región de cadena pesada variable (“VH”) que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, respectivamente.

En una realización, la VL y la VH de un anticuerpo proporcionadas en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno de las mismas son no inmunogénicas en un ser humano. En una realización particular, el anticuerpo puede estar expresado en células de ovario de hámster chino (CHO) con una concentración de al menos 0,45 pg/mL. En una realización particular, el anticuerpo puede estar expresado en células de ovario de hámster chino (CHO) con una concentración de al menos 0,3 pg/mL, al menos 0,6 pg/mL, al menos 0,75 pg/mL, o al menos 1 pg/mL.

En cierto aspecto, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo, que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano, que comprende:

una región de cadena ligera variable (“VL”) que comprende la secuencia de aminoácidos: DIVMTQSPSXk1LSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXk2LIYS

ASYRYSGVPDRFXk3GSGSGTDFTLTISSLQXk4EDFAXk5YXk6CQQYNSYPRTFG GGTKVEIK (SEQ ID NO:12), en la que Xk1 es un aminoácido con una cadena lateral aromática o hidroxilo alifática, Xk2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática o hidroxilo alifática, Xk3 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática, Xk4 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática o es P, Xk5 es un aminoácido con una cadena lateral cargada o ácida, y Xk6 es un aminoácido con una cadena lateral aromática; y

una región de cadena pesada variable (“VH”) que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, respectivamente.

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (o un fragmento del mismo o un conjugado del mismo), que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano, que comprende:

(i) una VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21, respectivamente; y

(ii) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos: QVQLVQSGAEXh1KKPGASVKXh2SCKASGYTFTDYYINWVXhsQAPGKGLEWI ARIYPGSGNTYYNEKFKGRXh4TXh5TAXh6KSTSTAYMXh7LSSLRSEDXhbAVY

FCARGVYYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:11), en la que Xh1 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh3 es un aminoácido con una cadena lateral polar o básica, Xh4 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh5 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh6 es un aminoácido con una cadena lateral ácida, Xh7 es un aminoácido con una cadena lateral ácida o de derivación amídica, y Xhs es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática.

En una realización particular, Xk1 es el aminoácido F o S, Xk2 es el aminoácido A o S, Xk3 es el aminoácido T o S, Xk4 es el aminoácido S o P, Xk5 es el aminoácido D o T, y Xk6 es el aminoácido F o Y.

En cierta realización, Xk1 es el aminoácido S, Xk2 es el aminoácido A, Xk3 es el aminoácido T, Xk4 es el aminoácido P, Xk5 es el aminoácido D, y Xk6 es el aminoácido F.

En una realización particular, Xk1 es el aminoácido F, Xk2 es el aminoácido A, Xk3 es el aminoácido T, Xk4 es el aminoácido S, Xk5 es el aminoácido D, y Xk6 es el aminoácido F.

En una realización particular, Xk1 es el aminoácido F o S, Xk2 es el aminoácido A, Xk3 es el aminoácido T, Xk4 es el aminoácido S o P, Xk5 es el aminoácido D, y Xk6 es el aminoácido F.

En una realización particular, Xki es el aminoácido S, Xk2 es el aminoácido A, Xk3 es el aminoácido T, Xk4 es el aminoácido P, Xk5 es el aminoácido D, y Xk6 es el aminoácido F.

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En una realización particular, Xk1 es el aminoácido S, Xk2 es el aminoácido S, Xk3 es el aminoácido S, Xk4 es el aminoácido P, Xk5 es el aminoácido T, y Xk6 es el aminoácido Y.

En una realización, Xh1 es el aminoácido L o V, Xh2 es el aminoácido L o V, Xh3 es el aminoácido K o R, Xh4 es el aminoácido V o A, Xh5 es el aminoácido L o I, Xh6 es el aminoácido E o D, Xh7 es el aminoácido Q o E, y Xh8 es el aminoácido S o T.

En una realización específica, Xh1 es el aminoácido V, Xh2 es el aminoácido L o V, Xh3 es el aminoácido R o Q, Xh4 es el aminoácido A, Xh5 es el aminoácido L o I, Xh6 es el aminoácido D, Xh7 es el aminoácido Q o E, y Xh8 es el aminoácido T.

En una realización específica, Xh1 es el aminoácido V, Xh2 es el aminoácido L, Xh3 es el aminoácido R, Xh4 es el aminoácido A, Xh5 es el aminoácido L, Xh6 es el aminoácido D, Xh7 es el aminoácido Q, y Xh8 es el aminoácido T.

En cierta realización, Xh1 es el aminoácido V, Xh2 es el aminoácido V, Xh3 es el aminoácido R, Xh4 es el aminoácido A, Xh5 es el aminoácido I, Xh6 es el aminoácido D, Xh7 es el aminoácido E, y Xh8 es el aminoácido T.

En cierta realización, Xh1 es el aminoácido L, Xh2 es el aminoácido L, Xh3 es el aminoácido K, Xh4 es el aminoácido A, Xh5 es el aminoácido L, Xh6 es el aminoácido E, Xh7 es el aminoácido Q, y Xh8 es el aminoácido S.

En cierta realización, Xh1 es el aminoácido V, Xh2 es el aminoácido L, Xh3 es el aminoácido K, Xh4 es el aminoácido A, Xh5 es el aminoácido L, Xh6 es el aminoácido E, Xh7 es el aminoácido Q, y Xh8 es el aminoácido T.

En cierta realización, Xh1 es el aminoácido V, Xh2 es el aminoácido V, Xh3 es el aminoácido R, Xh4 es el aminoácido V, Xh5 es el aminoácido I, Xh6 es el aminoácido D, Xh7 es el aminoácido E, y Xh8 es el aminoácido T.

En una realización particular, Xk1 a Xk6 es un aminoácido definido en la Tabla 6A, y/o Xh1 a Xh8 es un aminoácido definido en la Tabla 6B.

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo, que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano, que comprende:

i) una VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 7, al menos un 88% idéntica a la SEQ ID NO: 8, al menos un 87% idéntica a la SEQ ID NO: 9, o al menos un 84% idéntica a la SEQ ID NO: 10; y

ii) una VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 93% idéntica a la SEQ ID NO: 2, al menos un 92% idéntica a la SEQ ID NO: 3, al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4, al menos un 87% idéntica a la SEQ ID NO: 5, o al menos un 86% idéntica a la SEQ ID NO: 6.

i) una región de cadena ligera variable (“VL”) que comprende la secuencia de aminoácidos: DIVMTQSPSXkiLSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXk

2LIYSASYRYSGVPDRFXk3GSGSGTDFTLTISSLQXk4EDFAXk5YXkbCQQ YNSYPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:12), en la que Xki es un aminoácido con una cadena lateral aromática o hidroxilo alifática, Xk2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática o hidroxilo alifática, Xk3 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática, Xk4 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática o es P, Xk5 es un aminoácido con una cadena lateral cargada o ácida, y Xk6 es un aminoácido con una cadena lateral aromática; y

ii) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos:

QVQLVQSGAEXhiKKPGASVKXh2SCKASGYTFTDYYINWVXh3QAPGK GLEWIARIYPGSGNTYYNEKFKGRXh4TXh5TAXh6KSTSTAYMXh7LSSL

RSEDXhsAYYFCARGVYYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:11), en la que Xhi es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh3 es un aminoácido con una cadena lateral polar o básica, Xh4 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh5 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh6 es un aminoácido con una cadena lateral ácida, Xh7 es un aminoácido con una cadena lateral ácida o de derivación amídica, y Xhs es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática.

En una realización particular, Xk1 a Xk6 es un aminoácido definido en la Tabla 6A, y/o Xh1 a Xhs es un aminoácido definido en la Tabla 6B.

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En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria se une específicamente a células CHO expresando de manera recombinante el KIT de la forma natural con una CE50 de aproximadamente 150 pM o menor determinada por citometría de flujo. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria se une específicamente a una región recombinante D4/D5 del KIT humano con una CE50 de aproximadamente 600 pM o menor, o entre aproximadamente 250 pM y aproximadamente 600 pM, determinada por citometría de flujo. En cierta realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria inhibe la fosforilación de la tirosina de KIT con una CI50 de aproximadamente 600 pM o menor determinada por ELISA.

En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria puede ser expresado en células CHO con una concentración de al menos 1,0 pg/mL, o al menos 1,1 pg/mL o al menos 1,2 pg/mL.

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria comprende, además, una región constante de cadena ligera humana y una región constante de cadena pesada humana. En una realización, la región constante de cadena ligera humana de un anticuerpo descrito en la presente memoria es una región constante de cadena ligera kappa humana. En una realización particular, la región constante de cadena pesada humana de un anticuerpo descrito en la presente memoria es una región constante de cadena pesada gamma humana.

En cierta realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria es un anticuerpo IgG1 o IgG4 humano. En cierta realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria es un fragmento de unión a antígeno o un fragmento Fab. En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria es un fragmento de unión a antígeno o un fragmento Fab. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria es un anticuerpo biespecífico. En cierta realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria está internalizado por una célula.

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un conjugado que comprende un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento de unión al KIT del mismo, ligado a un agente. En una realización específica, el agente es una toxina. En cierta realización, la toxina es abrina, ricina A, exotosina pseudomonas, toxina del cólera o toxina de la difteria. En una realización, el conjugado está internalizado por una célula.

En cierto aspecto, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado descrito en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo descrito en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un polinucleótido que comprende secuencias de nucleótidos que codifican una región de cadena VH, una región de cadena VL, o tanto una región de cadena VL como una región de cadena VH, de un anticuerpo descrito en la presente memoria.

En una realización específica, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) proporcionado en la presente memoria comprende la SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25 o 26 que codifica una VH. En cierta realización, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) proporcionado en la presente memoria comprende la SEQ ID NO: 27, 28, 29 o 30 que codifica una VL. En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la SEQ Id nO: 22, 23, 24, 25 o 26 que codifica una VH y la SEQ ID No: 27, 28, 29 o 30 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 22 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 27 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 22 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 28 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 22 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 29 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 22 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 30 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 23 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 27 que codifica una VL.

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En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 23 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 28 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 23 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 29 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 23 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 30 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 24 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 27 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 24 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 28 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 24 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 29 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 24 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 30 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la SEQ ID NO: 25 que codifica una VH y la SEQ ID NO: 27 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la SEQ ID NO: 25 que codifica una VH y la SEQ ID NO: 28 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 25 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 29 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 25 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 30 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 26 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 27 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 26 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 28 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 26 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 29 que codifica una VL.

En una realización particular, un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) o una población de polinucleótidos (por ejemplo, una población de polinucleótidos aislados) proporcionados en la presente memoria comprende la sEq ID NO: 26 que codifica una vH y la SEQ ID NO: 30 que codifica una VL.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un vector que comprende un polinucleótido descrito en la presente memoria para expresar un anticuerpo anti KIT o un fragmento del mismo. En cierta realización, un vector proporcionado en la presente memoria es un vector de expresión en mamíferos.

En cierto aspecto, en la presente memoria se proporciona una célula anfitriona que comprende un vector proporcionado en la presente memoria o uno o más polinucleótidos proporcionados en la presente memoria para expresar un anticuerpo anti KIT o un fragmento del mismo.

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En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona una célula que produce un anticuerpo descrito en la presente memoria. En una realización, una célula proporcionada en la presente memoria comprende uno o más polinucleótidos descritos en la presente memoria, pudiendo expresar la célula un anticuerpo que se une específicamente a una región D4 del KIT humano. En cierta realización, la célula comprende un vector descrito en la presente memoria.

En un aspecto específico, en la presente memoria se proporciona un equipo de reactivos que comprende un anticuerpo (o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo) descrito en la presente memoria. En una realización particular, un equipo de reactivos comprende un conjugado descrito en la presente memoria.

En cierto aspecto, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo proporcionado en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo para su uso en un método para el tratamiento o la gestión de un trastorno asociado con KIT (por ejemplo, cáncer)

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado descrito en la presente memoria para su uso en un método para el tratamiento o la gestión de un trastorno asociado con KIT.

En una realización particular, el trastorno asociado con KIT es cáncer, una afección inflamatoria o fibrosis. En una realización específica, el cáncer es leucemia, leucemia mieloide crónica, cáncer de pulmón, cáncer microcítico de pulmón o tumores estromales gastrointestinales. En una realización, el cáncer es refractario al tratamiento con un inhibidor de la tirosina quinasa. En una realización adicional, el inhibidor de la tirosina quinasa es mesilato de imatinib o SU11248.

En cierta realización, un método proporcionado en la presente memoria comprende, además, la administración de un segundo agente. En una realización específica, el segundo agente es un agente quimioterapéutico, inhibidor de la tirosina quinasa, un inhibidor de la histona deacetilasa, un anticuerpo o una citoquina. En una realización particular, el inhibidor de la tirosina quinasa es mesilato de imatinib o SU11248.

En un aspecto específico, en la presente memoria se proporciona un método in vitro para el diagnóstico de un sujeto con un trastorno asociado con KIT que comprende poner las células o la muestra obtenidas del sujeto en contacto con un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo) y detectar el nivel de expresión de KIT en las células o la muestra. Por ejemplo, la detección de la unión de un anticuerpo descrito en la presente memoria a un antígeno de KIT presente en la célula o la muestra puede estar correlacionada con el nivel de expresión de KIT en la célula o la muestra. En una realización particular, el anticuerpo está conjugado con una molécula detectable. En cierta realización, la molécula detectable es una enzima, una molécula fluorescente, una molécula luminiscente o una molécula radiactiva.

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un método para inhibir la actividad del KIT en una célula que expresa el KIT que comprende poner la célula en contacto con una cantidad eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo).

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un método para inducir o potenciar la apoptosis en una célula que expresa el KIT que comprende poner la célula en contacto con una cantidad eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo).

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un método para inducir la diferenciación celular que comprende poner una célula que expresa el KIT con una cantidad eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo). En una realización particular, la célula es una célula madre.

En cierto aspecto, en la presente memoria se proporciona un método de creación de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano que comprende cultivar una célula o célula anfitriona descrita en la presente memoria. En cierto aspecto, en la presente memoria se proporciona un método de creación de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano que comprende expresar el anticuerpo usando una célula o célula anfitriona descrita en la presente memoria. En una realización particular, la célula es una célula aislada. En una realización particular, el método comprende, además, la etapa de purificar el anticuerpo obtenido de la célula o célula anfitriona.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo:

(i) una región de cadena ligera variable (“VL”) que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL seleccionadas del grupo definido en las Tablas 10-12; y

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(ii) una región de cadena pesada variable (“VH”) que comprende Una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH seleccionadas del grupo definido en las Tablas 13-15.

En cierto aspecto, en la presente memoria se describe un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo:

(i) una VL que comprende una FR1 VL, una FR2 VL, una FR3 VL y una FR4 VL seleccionadas del grupo definido en las Tablas 20-23; y

(ii) una VH que comprende una FR1 VH, una FR2 VH, una FR3 VH y una FR4 VH seleccionadas del grupo definido en las Tablas 16-19.

En un aspecto particular, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno descrito en la presente memoria comprende una región Fc con una modificación de aminoácidos. En cierto aspecto, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno descrito en la presente memoria comprende una región Fc que es un isotipo IgG1 o un isotipo IgG4. En un aspecto, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno descrito en la presente memoria es un anticuerpo humanizado. En un aspecto particular, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria es un anticuerpo biespecífico.

En cierto aspecto, en la presente memoria se describe un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que está conjugado con otro agente.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona una composición que comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria.

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un polinucleótido que comprende secuencias de nucleótidos que codifican una región de cadena VH, una región de cadena VL, o tanto una región de cadena VL como una región de cadena VH, de un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las secuencias definidas en las Tablas 10-15). También se proporciona un vector que comprende el polinucleótido descrito en la presente memoria. En un aspecto, el vector es un vector de expresión en mamíferos.

En cierto aspecto, en la presente memoria se proporciona una célula anfitriona que comprende un vector de uno o más polinucleótidos descritos en la presente memoria. En un aspecto, en la presente memoria se proporciona una célula que produce un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las secuencias definidas en las Tablas 10-15).

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un equipo de reactivos que comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las secuencias definidas en las Tablas 1015).

En cierto aspecto, en la presente memoria se proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las secuencias definidas en las Tablas 10-15) para su uso en un método de tratamiento o gestión de un trastorno asociado con KIT. En una realización, el trastorno asociado con KIT es cáncer, una afección inflamatoria o fibrosis. En una realización particular, el cáncer es leucemia, leucemia mieloide crónica, cáncer de pulmón, cáncer microcítico de pulmón o tumores estromales gastrointestinales.

En un aspecto particular, el método para el tratamiento o la gestión de un trastorno asociado con KIT descrito en la presente memoria comprende, además, la administración de un segundo agente. En una realización particular, el segundo agente es un agente quimioterapéutico, un inhibidor de la tirosina quinasa, un inhibidor de la histona deacetilasa, un anticuerpo, una citoquina, un inhibidor HSP90, un inhibidor PGP o un inhibidor de proteosomas.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un método in vitro para el diagnóstico de un sujeto con un trastorno asociado con KIT que comprende poner las células o la muestra obtenidas del sujeto en contacto con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las secuencias definidas en las Tablas 1015) y detectar el nivel de expresión de KIT en las células o la muestra. En cierta realización, el anticuerpo está conjugado con una molécula detectable.

En cierto aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para inhibir la actividad del KIT en una célula que expresa el KIT que comprende poner la célula en contacto con una cantidad eficaz de un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las secuencias definidas en las Tablas 10-15).

Un método para inducir o potenciar la apoptosis en una célula que expresa el KIT comprende poner la célula en contacto con una cantidad eficaz de un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la

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presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las secuencias definidas en las Tablas 10-15).

Un método de creación de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano que comprende cultivar y/o expresar el anticuerpo usando una célula descrita en la presente memoria.

4. Breve descripción de las Figuras

La Fig. 1 representa la secuencia de aminoácidos del KIT humano de longitud máxima (SEQ ID NO: 1), Número de entrada en GenBank™ AAC50969. Se indican los dominios extracelulares del primero al quinto de tipo Ig (es decir, D1, D2, D3, D4 y D5); “{“ representa el residuo amino terminal de cada dominio y “}” representa el residuo carboxilo terminal de cada dominio. El dominio D1 está representado de P34 a r112, el dominio D2 está representado de D113 a P206, el dominio D3 está representado de A207 a D309, el dominio D4 está representado de K310 a N410 (SEQ ID NO: 15), la región bisagra entre D4 y D5 está situada entre V409 y N410, y el dominio D5 está representado de T411 a K509. Además, la región bisagra D1/D2 está situada entre D113 y L117; la región bisagra D2/D3 está situada entre P206 y A210; y la región bisagra D3/D4 está situada entre D309 y G311. La región bisagra D4/D5 comprende de K310 a K509. El dominio transmembranal comprende los residuos F525 a Q545, y el dominio quinasa comprende los residuos K589 a S933.

La Fig. 2 representa la secuencia de aminoácidos de un KIT recombinante D4/D5. Los aminoácidos del KIT humano V308 a H515 (SEQ ID NO: 73) están representados en negrita. El polipéptido representado (SEQ ID NO: 14) contiene (i) los primeros 33 aminoácidos (es decir, M1 a E33) del terminal amino del KIT humano (incluyendo el péptido señal, subrayado, no en negrita), (ii) la región D4/D5 del KIT humano (en negrita), y (iii) una etiqueta 5xHis (en cursiva) en el terminal carboxilo.

La Fig. 3A representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) del dominio H1 VH, y un ADN (SEQ ID NO:22) que codifica la secuencia de aminoácidos. Se indican las regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4), y las CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). Se indica tanto la numeración de Kabat como la numeración numérica de los residuos de aminoácido indicados.

La Fig. 3B representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) del dominio H2 VH y un ADN (SEQ ID NO:23) que codifica la secuencia de aminoácidos. Se indican las regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4), y las CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). Se indica tanto la numeración de Kabat como la numeración numérica de los residuos de aminoácido indicados.

La Fig. 3C representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) del dominio H3 VH y un ADN (SEQ ID NO:24) que codifica la secuencia de aminoácidos. Se indican las regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4), y las CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). Se indica tanto la numeración de Kabat como la numeración numérica de los residuos de aminoácido indicados.

La Fig. 3D representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) del dominio H4 VH y un ADN (SEQ ID NO:25) que codifica la secuencia de aminoácidos. Se indican las regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4), y las CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). Se indica tanto la numeración de Kabat como la numeración numérica de los residuos de aminoácido indicados.

La Fig. 3E representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) del dominio H5 VH y un ADN (SEQ ID NO:26) que codifica la secuencia de aminoácidos. Se indican las regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4), y las CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). Se indica tanto la numeración de Kabat como la numeración numérica de los residuos de aminoácido indicados.

La Fig. 3F representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) del dominio L1 VL y un ADN (SEQ ID NO:27) que codifica la secuencia de aminoácidos. Se indican las regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4), y las CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). Se indica tanto la numeración de Kabat como la numeración numérica de los residuos de aminoácido indicados.

La Fig. 3G representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) del dominio L2 VL y un ADN (SEQ ID NO:28) que codifica la secuencia de aminoácidos. Se indican las regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4), y las CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). Se indica tanto la numeración de Kabat como la numeración numérica de los residuos de aminoácido indicados.

La Fig. 3H representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) del dominio L3 VL y un ADN (SEQ ID NO:29) que codifica la secuencia de aminoácidos. Se indican las regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4), y las CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). Se indica tanto la numeración de Kabat como la numeración numérica de los residuos de aminoácido indicados.

La Fig. 3I representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) del dominio L4 VL y un ADN (SEQ ID NO:30) que codifica la secuencia de aminoácidos. Se indican las regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4), y

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las CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). Se indica tanto la numeración de Kabat como la numeración numérica de los residuos de aminoácido indicados.

La Fig. 4A representa la secuencia de consenso (SEQ ID NO:11) de un dominio VH. Xh1-h8 indican aminoácidos que pueden ser un aminoácido cualquiera.

La Fig. 4B representa la secuencia de consenso (SEQ ID NO:12) de un dominio VL. Xk1-k6 indican aminoácidos que pueden ser un aminoácido cualquiera.

La Fig. 5 representa la actividad de unión de los anticuerpos Hum17, Hum8, Hum4 y Hum10, así como una quimera del anticuerpo 37M (“quimera”), a un polipéptido recombinante de la región D4/D5 del KIT humano determinada por ELISA en fase sólida. Se indica el valor CE50 para cada anticuerpo.

La Fig. 6 representa un gráfico de los resultados de ensayos de unión realizados por citometría de flujo con células CHO que expresan de manera recombinante el KIT humano de la forma natural para calificar la actividad de unión al KIT de los anticuerpos Hum17, Hum8, Hum4 y Hum10, en comparación con una quimera del anticuerpo 37M (“quimera”). Se indica el valor CE50 para cada anticuerpo.

La Fig. 7 representa un gráfico de los resultados de ensayos de inhibición de la fosforilación del KIT realizados por ELISA con células CHO que expresan de manera recombinante el KIT de la forma natural para calificar la actividad de bloqueo de la fosforilación de los anticuerpos Hum17, Hum8, Hum4 y Hum10, en comparación con una quimera del anticuerpo 37M (“quimera”). Se indica los valores CI50 para cada anticuerpo.

5. Descripción detallada

A no ser que se defina algo distinto, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado comúnmente entendido por una persona con un dominio normal de la técnica.

Según se usan en la presente memoria, los términos “alrededor de” o “aproximadamente” significan dentro de más o menos un 10% de un valor o un intervalo dado.

En la presente memoria se proporcionan anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, un polipéptido KIT que contenga un dominio D4 del KIT humano), y conjugados de los mismos. También se proporcionan ácidos nucleicos aislados (polinucleótidos) que codifican tales anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Además, se proporcionan vectores (por ejemplo, vectores de expresión) y células (por ejemplo, células anfitrionas) que comprenden ácidos nucleicos que codifican tales anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. También se proporcionan métodos de creación de tales anticuerpos en células, por ejemplo, células anfitrionas. También se proporcionan en la presente memoria uno o más anticuerpos descritos en la presente memoria, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos o un conjugado de los mismos para su uso en métodos y usos para el tratamiento o la gestión de un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria o fibrosis) o uno o más efectos de tal trastorno o enfermedad asociado con KIT. En la presente memoria también se proporcionan métodos in vitro para el diagnóstico de un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria o fibrosis) que comprende poner una muestra en contacto con uno o más anticuerpos (o un fragmento de unión a antígeno de los mismos) descritos en la presente memoria y determinar el nivel de expresión de KIT en la muestra con respecto a una muestra de referencia (por ejemplo, una muestra de control). En la presente memoria también se proporcionan métodos y usos para inhibir la actividad del KIT en una célula que expresa el KIT que comprende poner la célula en contacto con una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En la presente memoria también se proporcionan métodos para inducir o potenciar la diferenciación celular o la apoptosis en una célula que expresa el KIT que comprende poner la célula en contacto con una cantidad eficaz de un anticuerpo o anticuerpos descritos en la presente memoria.

La presente invención proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano, comprendiendo dicho anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo:

(i) (a) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos:

DIVMTQSPSXk1LSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXk2LIYSASYR YSGVPDRFXksGSGSGTDFTLTISSLQXmEDFAXksYXksCQQYNSYPRTFGGGTKVEI K(SEQ ID NO:1 2),

en la que Xk1 es un aminoácido con una cadena lateral aromática o hidroxilo alifática, Xk2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática o hidroxilo alifática, Xk3 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo

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alifática, Xk4 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática o es P, Xks es un aminoácido con una cadena lateral cargada o ácida, y Xk6 es un aminoácido con una cadena lateral aromática; y

(b) una VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que tienen las secuencias de aminoácidos de sEq ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, respectivamente;

(b) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos:

QVQLVQSGAEXihKKPGASVKXh2SCKASGYTFTDYYINWVXh3QAPGK.GLEWIAR.IY PGSGNTYYNEKFKGRXh4TXH5TAXh6KSTSTAYMXh7LSSLRSEDXhsAVYFCARGVY YFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:11),

en la que Xhi es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh3 es un aminoácido con una cadena lateral polar o básica, Xh4 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xhs es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh6 es un aminoácido con una cadena lateral ácida, Xh7 es un aminoácido con una cadena lateral ácida o de derivación amídica, y Xhs es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática; o

(iii) (a) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos:

DIVMTQSPSXkiLSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXkíLIYSASYR YSGVPDRFXksGSGSGTDFTLTISSLQXkíEDFAXksYXksCQQYNSYPRTFGGGTKVEI K (SEQ ID NO:12),

(b) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos:

QVQLVQSGAEXhiKKPGASVKXhzSCKASGYTFTDYYJNWVXhíQAPGKGLLWIARIY

PGSGNTYYNEKFKGRXh4TXH5TAXH6KSTSTAYMXh7LSSLRSEDXh8AVYFCARGVY

YFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:11),

(i) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;

(ii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(iii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

(iv) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5;

(v) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

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(vi) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(vii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y aminoácidos de SEQ ID NO: 4;

(viii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

(ix) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(x) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(xi) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y aminoácidos de SEQ ID NO: 5;

(xii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(xiii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(xiv) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y aminoácidos de SEQ ID NO: 4;

(xv) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y aminoácidos de SEQ ID NO: 5;

(xvi) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

(xvii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(xviii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y aminoácidos de SEQ ID NO: 4;

(xix) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y aminoácidos de SEQ ID NO: 5; o

(xx) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

La invención también proporciona un método in vitro para el diagnóstico de un sujeto con un trastorno asociado con KIT, comprendiendo el método poner las células o una muestra obtenidas del sujeto en contacto con el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención y detectar el nivel de expresión de KIT en las células o la muestra.

Según son usadas en la presente memoria, las expresiones “región D4/D5” o “dominio D4/D5” se refieren a una región dentro de un polipéptido KIT que abarca el cuarto dominio extracelular (“D4”) de tipo Ig, el quinto dominio extracelular (“D5”) de tipo Ig, y la región bisagra entre los dominios D4 y D5 (“región bisagra D4-D5”), de KIT, en el siguiente orden desde el terminal amino hasta el terminal carboxilo: D4, región bisagra D4-D5, y D5. Según se usan en la presente memoria, se considera a los aminoácidos V308 a H515 de la Figura 1 y al polipéptido representado en la Figura 2 en la presente memoria ejemplos de una región o dominio D4/D5.

la VH comprende la VH comprende la VH comprende la VH comprende la VH comprende la VH comprende la VH comprende la VH comprende la VH comprende la VH comprende la VH comprende la VH comprende la VH comprende la VH comprende la VH comprende

la secuencia de la secuencia de la secuencia de la secuencia de la secuencia de la secuencia de la secuencia de la secuencia de la secuencia de la secuencia de la secuencia de la secuencia de la secuencia de la secuencia de la secuencia de

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Según se usan en la presente memoria, las expresiones “KIT” o “receptor KIT” o “polipéptido KIT” se refieren a cualquier forma del KIT de longitud máxima incluyendo, sin limitación, KIT nativo, una isoforma de KIT, un homólogo interespecie de KIT, o una variante de KIT que se dé, por ejemplo, de forma natural (por ejemplo, una variante alélica o de empalme, o un mutante, por ejemplo, un mutante somático) o una variante construida artificialmente (por ejemplo, una variante recombinante o modificada químicamente). KIT es un receptor tirosina quinasa de tipo III codificado por el gen c-kit (véanse, por ejemplo, Yarden et al., Nature, 1986, 323:226-232; Ullrich y Schlessinger, Cell, 1990, 61:203-212; Clifford et al., J. Biol. Chem., 2003, 278:31461-31464; Yarden et al., EMBO J., 1987, 6:3341- 3351; Mol et al., J. Biol. Chem., 2003, 278:31461-31464). El número de entrada en GenBank™ NM_000222 proporciona una secuencia ejemplar de aminoácidos del KIT humano. los números de entrada en GenBank™ NP_001087241, P10721 y AAC50969 proporcionan secuencias ejemplares de aminoácidos del KIT humano. El número de entrada en GenBank™ AAH75716 proporciona una secuencia ejemplar de aminoácidos del KIT murino. El KIT nativo comprende cinco dominios extracelulares (D1, D2, D3, D4, D5) de tipo inmunoglobulina (Ig), una única región transmembranal, un dominio yuxtamembranal citoplasmático inhibidor y un dominio quinasa citoplasmático escindido separado por un segmento de insertos de quinasa (véanse, por ejemplo, Yarden et al., Nature, 1986, 323:226-232; Ullrich y Schlessinger, Cell, 1990, 61:203-212; Clifford et al., J. Biol. Chem., 2003, 278:31461-31464). En la Figura 1, se proporciona una secuencia ejemplar de aminoácidos de la región D4/D5 del KIT humano en los residuos de aminoácido V308 a H515. En una realización específica, el KIT es KIT humano. En una realización particular, el KIT puede existir como un monómero, un dímero, un multímero, una forma nativa o una forma desnaturalizada.

En el contexto de un péptido o un polipéptido, el término “fragmento” usado en la presente memoria se refiere a un péptido o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que no llega a ser completa. Tal fragmento puede surgir, por ejemplo, de un truncamiento en el terminal amino, de un truncamiento en el terminal carboxi, y/o de una deleción interna de uno o varios residuos de la secuencia de aminoácidos. Los fragmentos pueden ser resultado, por ejemplo, de un empalme alternativo del ARN o de la actividad de la proteasa in vivo. En ciertas realizaciones, los fragmentos de KIT o los fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT) incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de al menos 5 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 10 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 15 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 20 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 25 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 40 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 50 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 60 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 70 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 80 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 90 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 100 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 125 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 150 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 175 residuos de aminoácido contiguos, de al menos 200 residuos de aminoácido contiguos, o de al menos 250 residuos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido KIT o de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo que se una inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT), respectivamente. En una realización específica, un fragmento de un polipéptido KIT o un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT) retiene al menos 1, al menos 2 o al menos 3 funciones del polipéptido o del anticuerpo.

Según es usada en el presente documento, la expresión “célula anfitriona” se refiere a una célula particular que comprende una molécula exógena de ácido nucleico; por ejemplo, una célula que haya sido transfectada o transformada con una molécula de ácido nucleico, y la progenie o la progenie potencial de tal célula precursora. La progenie de tal célula puede no ser idéntica a la célula precursora debido a mutaciones o a influencias medioambientales que se producen en las sucesivos generaciones o a la integración de la molécula de ácido nucleico en el genoma de la célula anfitriona.

5.1 Anticuerpos

Según son usados en la presente memoria, los términos “anticuerpo” e “inmunoglobulina” e “Ig” son términos de la técnica y pueden ser usados de manera intercambiable en la presente memoria y se refieren a una molécula con un sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno.

Según se usa en la presente memoria, un “antígeno” es un resto o molécula que contiene un epítopo y, como tal, también se le une específicamente un anticuerpo. En una realización específica, el antígeno, al que se une un anticuerpo descrito en la presente memoria, es KIT (por ejemplo, KIT humano), o un fragmento del mismo —por ejemplo, un dominio extracelular de KIT (por ejemplo, KIT humano) o una región D4 de KIT (por ejemplo, KIT humano) —.

Según se usa en la presente memoria, “epítopo” es un término de la técnica y se refiere a una región localizada de un antígeno al que puede unirse específicamente un anticuerpo. Una región o un polipéptido que contribuya a un epítopo pueden ser aminoácidos contiguos del polipéptido, o un epítopo puede estar agrupado de dos o más regiones no contiguas del polipéptido.

Según se usan en la presente memoria, las expresiones “dominio de unión a antígeno”, “región de unión a antígeno”, “fragmento de unión a antígeno” y términos similares se refieren a una porción de una molécula de anticuerpo que comprende los residuos de aminoácido que interactúan con un antígeno y confieren a la molécula del anticuerpo su

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especificidad para el antígeno (por ejemplo, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR)). La región de unión a antígeno puede estar derivada de cualquier especie animal, tal como roedores (por ejemplo, ratón, rata o hámster) y seres humanos. Las CDR de una molécula de anticuerpo pueden ser determinadas mediante cualquier método bien conocido para un experto en la técnica. En particular, las CDR pueden ser determinadas según el sistema de numeración de Kabat (véase Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5a ed.). En ciertos aspectos, las CDR de un anticuerpo pueden ser determinadas según (i) el esquema de numeración de Clothia, al que se hará referencia en la presente memoria como las “CDR de Clothia” (véanse, por ejemplo, Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917; Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948; y la patente estadounidense n° 7.709.226); o (ii) el sistema de numeración IMGT, según se describe, por ejemplo, en Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7:132-136 y en Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212.

Según se usan en la presente memoria, un “epítopo conformacional” o “epítopo no lineal” o “epítopo discontinuo” se refiere a uno comprendido por al menos dos aminoácidos que no son aminoácidos consecutivos en una sola cadena proteínica. Por ejemplo, un epítopo conformacional puede estar comprendido por dos o más aminoácidos que estén separados por un tramo de aminoácidos intermedios, pero que sean lo bastante cercanos para ser reconocidos por un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT), descritos en la presente memoria como un solo epítopo. Como ejemplo adicional, los aminoácidos que están separados por aminoácidos intermedios en una única cadena proteínica, o los aminoácidos que existan en cadenas proteínicas separadas, pueden ser llevados a una proximidad mutua debido a la forma conformacional de un complejo o estructura proteínico, convirtiéndose en un epítopo conformacional al que se puede unir un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria. Un experto en la técnica apreciará que, en general, un epítopo lineal al que se une un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria puede ser dependiente o no de una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria del receptor KIT. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria se une a un grupo de aminoácidos con independencia de si están plegados en una estructura proteína tridimensional natural. En otras realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria no reconoce los residuos individuales de aminoácido que componen el epítopo, y requieren una conformación particular (doblarse, retorcerse, girarse o plegarse) para reconocer el epítopo y unirse a él.

Según se usa en la presente memoria, la expresión “región constante” o “dominio constante” se refiere a una porción de anticuerpo —por ejemplo, una porción del terminal carboxilo de una cadena ligera y/o de una pesada— que no está directamente implicada en la unión de un anticuerpo al antígeno, pero que presenta diversas funciones efectoras, tales como la interacción con el receptor Fc. Las expresiones se refieren a una porción de una molécula de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos generalmente más conservada con respecto a un dominio variable de inmunoglobulina.

Según se usa en la presente memoria, la expresión “cadena pesada”, cuando es usada con referencia a un anticuerpo, se refiere a tipos diferenciados cualesquiera —por ejemplo, alfa (a), delta (ó), épsilon (s), gamma (y) y mu (p), en función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante— que dan origen a las clases de anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluyendo las subclases de IgG —por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4—. En una realización específica, la cadena pesada es una cadena pesada humana.

Según son usados en la presente memoria, las expresiones “se une inmunoespecíficamente”, “reconoce inmunoespecíficamente”, “se une específicamente” y reconoce específicamente” son expresiones análogas en el contexto de los anticuerpos y se refieren a moléculas que se unen a un antígeno (por ejemplo, un epítopo o un complejo inmunitario), según es entendida tal unión por un experto en la técnica. Por ejemplo, una molécula que se una específicamente a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos, generalmente con menor afinidad, determinada, por ejemplo, por inmunoensayos, Biacore™, un instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, Idaho) u otros ensayos conocidos en la técnica. En una realización específica, las moléculas que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno se unen al antígeno con una Ka que es al menos 2 magnitudes logarítmicas, 2,5 magnitudes logarítmicas, 3 magnitudes logarítmicas, 4 magnitudes logarítmicas, o más, mayor que la Ka cuando las moléculas se unen a otro antígeno. En otra realización específica, las moléculas que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno no presentan reactividad cruzada con otras proteínas. En otra realización específica, las moléculas que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno no presentan reactividad cruzada con otras proteínas no de KIT.

Según se usa en la presente memoria, un anticuerpo “aislado” o “purificado” está sustancialmente libre de material celular o de otras proteínas contaminantes de la célula o de la fuente tisular de la que se deriva el anticuerpo, o sustancialmente libre de precursores químicos o de otros productos químicos cuando es sintetizado químicamente.

En la técnica se reconoce que la expresión “numeración de Kabat” y expresiones similares se refieren a un sistema de numeración de residuos de aminoácido en las regiones variables pesada y ligera de un anticuerpo, o de una porción de unión a antígeno del mismo (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391, y Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Usando el sistema de numeración de Kabat, las CDR dentro de una molécula de la cadena pesada del anticuerpo están normalmente presentes en las posiciones de aminoácidos 31 a 35 (“CDR1”), en las

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posiciones de aminoácidos 50 a 65 (“CDR2”), y en las posiciones de aminoácidos 95 a 102 (“CDR3”). Usando el sistema de numeración de Kabat las CDR dentro de una molécula de la cadena ligera del anticuerpo están normalmente presentes en las posiciones de aminoácidos 24 a 34 (CDR1), en las posiciones de aminoácidos 50 a 56 (CDR2), y en las posiciones de aminoácidos 89 a 97 (CDR3).

Según se usa en la presente memoria, la expresión “cadena ligera”, cuando es usada con referencia a un anticuerpo, se refiere a tipos diferenciados cualesquiera; por ejemplo, kappa (k) o lambda (A), en función de la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera son bien conocidas en la técnica. En realizaciones específicas, la cadena ligera es una cadena ligera humana.

Según es usado en la presente memoria, la expresión “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo obtenida de una población de anticuerpos homogéneos o sustancialmente homogéneos, y, normalmente, cada anticuerpo monoclonal reconocerá un único epítopo en el antígeno. El término “monoclonal” no está limitado a ningún métod o particular de creación del anticuerpo. Generalmente, células, una población de células o una línea celular pueden generar una población de anticuerpos monoclonales. En realizaciones específicas, un “anticuerpo monoclonal”, según se usa en la presente memoria, es un anticuerpo producido por un único hibridoma o por otra célula (por ejemplo, una célula anfitriona que produzca un anticuerpo recombinante), uniéndose inmunoespecíficamente el anticuerpo a un epítopo KIT (por ejemplo, un epítopo de una región D4 del KIT humano) según se determina, por ejemplo, mediante ELISA u otro ensayo de unión a antígeno o de unión competitiva conocido en la técnica o en los Ejemplos proporcionados en la presente memoria. Los anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria pueden ser creados, por ejemplo, por el método del hibridoma descrito en Kohler et al.; Nature, 256:495 (1975), pueden ser aislados partiendo de bibliotecas de fagos usando, por ejemplo, las técnicas descritas en el presente documento. En la técnica son bien conocidos otros métodos para la preparación de líneas celulares clonales y de anticuerpos monoclonales expresados por ellas (véase, por ejemplo, el capítulo 11 de Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5a ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, Nueva York).

Según es usada en la presente memoria, la expresión “anticuerpos policlonales” se refiere a una población de anticuerpos que incluye una variedad de anticuerpos diferentes dirigidos a epítopos iguales y diferentes dentro de uno o varios antígenos. En la técnica se conocen métodos para producir anticuerpos policlonales (véase, por ejemplo, el capítulo 11 de Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5a ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, Nueva York).

Según es usada en la presente memoria, la expresión “anticuerpo humano recombinante” incluye anticuerpos humanos que son aislados, preparados, expresados o creados por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado a una célula anfitriona, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón, un conejo, una cabra o una vaca) que es transgénico y/o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique la creación, por ejemplo, mediante síntesis, ingeniería genética de secuencias de ADN que codifican secuencias de inmunoglobulina humana, o el empalme de secuencias que codifican inmunoglobulinas humanas —por ejemplo, secuencias de genes de inmunoglobulina humana— en otras secuencias tales. Tales anticuerpos humanos recombinantes pueden tener regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas realizaciones, las secuencias de aminoácidos de tales anticuerpos humanos recombinantes han sido modificadas de tal forma que las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y/o VL de los anticuerpos recombinantes sean secuencias que, aunque se deriven de secuencias VH y VL de la línea germinal humana y estén relacionadas con las mismas, no existen de forma natural dentro del repertorio de líneas germinales de anticuerpos humanos in vivo. Como ejemplo no limitante, se puede obtener un anticuerpo humano recombinante ensamblando varios fragmentos de secuencias humanas en una secuencia humana compuesta de un anticuerpo humano recombinante.

Según son usadas en la presente memoria, las expresiones “región variable” o “dominio variable” se refieren a una porción de un anticuerpo, generalmente una porción de una cadena ligera o pesada, normalmente aproximadamente los 110 a 120 aminoácidos amino terminales en la cadena pesada madura y aproximadamente 90 a 100 aminoácidos en la cadena ligera madura, que difieren mucho en secuencia entre anticuerpos y son usados en la unión y la especificidad de un anticuerpo particular para su antígeno particular. La variabilidad en secuencia se concentra en las regiones denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), mientras que las regiones más altamente conservadas en el dominio variable se denominan regiones marco (FR). Sin desear estar circunscritos a ningún mecanismo particular ni a ninguna teoría, se cree que las CDR de las cadenas ligera y pesada son principalmente responsables de la interacción del anticuerpo con el antígeno. En una realización específica, la numeración de posiciones de aminoácidos de los anticuerpos descritos en la presente memoria es según el Índice EU, como en Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición (U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (“Kabat et al."). En ciertos aspectos, las CDR de un anticuerpo pueden ser determinadas según (i) el esquema de numeración de Clothia, al que se hará referencia en la presente memoria como las “CDR de Clothia” (véanse, por ejemplo, Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917; Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948; y la patente estadounidense n° 7.709.226); o (ii) el sistema de numeración IMGT, según se describe, por ejemplo, en Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7:132-136 y en

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Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212. En ciertas realizaciones, la región variable es una región variable humana. En ciertas realizaciones, la región variable comprende CDR de roedores o murinas y regiones marco (FR) humanas. En realizaciones particulares, la región variable es una región variable de primate (por ejemplo, un primate no humano). En ciertas realizaciones, la región variable comprende CDR de roedores o murinas y regiones marco (FR) de primate (por ejemplo, un primate no humano). Como ejemplo no limitante, se obtiene una región variable descrita en la presente memoria ensamblando dos o más fragmentos de secuencias humanas creando una secuencia humana compuesta.

En aspectos específicos, en la presente memoria se proporcionan anticuerpos (incluyendo fragmentos de unión a antígeno de los mismos), tales como anticuerpos humanizados, que se unen inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano y a una región D4/D5 del KIT, por ejemplo, del KIT humano. Los residuos de aminoácido V308 a H515 (SEQ ID NO: 73) de las Figuras 1 y 2 representan una región ejemplar D4/D5 del KIT humano, y los aminoácidos K310 a N410 (SEQ ID NO: 15), representados en las Figuras 1 y 2, representan una región ejemplar D4 del KIT humano. En otra realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se une inmunoespecíficamente a un dominio D5 del KIT, por ejemplo, del KIT humano, con menor afinidad que a un dominio D4 del KIT, por ejemplo, del KIT humano. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se une inmunoespecíficamente a un dominio d4 del KIT, por ejemplo, del KIT humano, con mayor afinidad que a un dominio D5 del KIT, por ejemplo, del KIT humano; por ejemplo, la mayor afinidad es al menos 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces, determinada por métodos conocidos en la técnica; por ejemplo, ensayos ELISA o Biacore.

En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se une inmunoespecíficamente a una región D4 o D4/D5 del KIT, por ejemplo, del KIT humano, y tiene mayor afinidad hacia un antígeno de KIT que consista en esencia únicamente en un dominio D4 que hacia un antígeno de KIT que consista en esencia únicamente en un dominio D5. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se une inmunoespecíficamente a una región D4 o D4/D5 del KIT, por ejemplo, del KIT humano, y tiene al menos 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces mayor afinidad hacia un antígeno de KIT que consista en esencia únicamente en un dominio D4 que hacia un antígeno de KIT que consista en esencia únicamente en un dominio D5. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se une inmunoespecíficamente a una región D4 o D4/D5 del KIT, por ejemplo, del KIT humano, y tiene mayor afinidad de unión (por ejemplo, una afinidad aproximadamente de 2 veces a 3 veces mayor) hacia un antígeno de KIT que consista en esencia únicamente en un dominio D4 o únicamente en una región D4/D5 que hacia un antígeno de KIT que consista en esencia únicamente en un dominio D5.

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se une inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT que comprende o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15. En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se une inmunoespecíficamente a un dominio D4 del KIT, por ejemplo, del KIT humano. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria se une inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT que comprende o consiste esencialmente en una región D4 del KIT humano. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se une inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT que comprende o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o 73.

En aspectos particulares, en la presente memoria se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, a una región D4 de KIT, por ejemplo, del KIT humano, por ejemplo, la SEQ ID NO: 15 [una secuencia D4 humana]) y comprenden una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria.

En aspectos específicos, en la presente memoria se describen anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanos o humanizados), incluyendo fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden:

(i) CDR VH de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31 (QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIARIYPG

SGNTYYNEKFKGKATLTAEKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGVYYFDYWGQ GTTLTVSS) o SEQ ID NO: 69

(QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIARIYPG SGNTYYNEKFKGKATLTAEKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGVYYFDYWGQ GTTLTVSA), y

(ii) CDR VL de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32 (DIVMTQSQKFMSTSVGDRVS

VTCKASQNVRTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTI

SNVQSEDLADYFCQQYNSYPRTFGGGTKLEIKR).

En una realización específica, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT

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humano), comprende las CDR VH (SEQ ID NOs: 16-18) y las CDR VL (SEQ ID NOs: 19-21) descritas en la Tabla 1. En una realización específica, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende las CDR VH y las CDR VL descritas en la Tabla 2 (por ejemplo, el conjunto 1 o el conjunto 2). 5 En cierta realización, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende las CDR VH y las CDR VL descritas en la Tabla 3 (CDR de AbM o CDR de contacto).

Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de CDR

: secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:

CDR1 VL: KASQNVRTNVA 19

CDR2VL: SASYRYS 20

CDR3VL: QQYNSYPRT 21

CDR1 VH: DYYIN 16

CDR2VH: RIYPGSGNTYYNEKFKG 17

CDR3VH: GVYYFDY 18

Tabla 2: Secuencias de aminoácidos de CDR

: Conjunto 1 Conjunto 2

: secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:

CDR1 VL: KASQNVRTNVA 19 SQNVRTN 59

CDR2VL: SASYRYS 20 SAS 60

CDR3VL: QQYNSYPRT 21 YNSYPR 61

CDR1VH: GYTFTDY 56 GYTFTDY 56

CDR2VH: YPGSGN 57 PGSG 62

CDR3VH: GVYYFDYW 58 VYYFDY 63

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Tabla 3

Secuencias de aminoácidos de CDR

: AbM Contacto

: secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:

CDR1 VL: KASQNVRTNVA 19 RTNVAWY 66

CDR2VL: SASYRYS 20 ALIYSASYRY 67

CDR3VL: QQYNSYPRT 21 QQYNSYPR 68

CDR1VH: GYTFTDYYIN 64 TDYYIN 70

CDR2VH: RIYPGSGNTY 65 WIARIYPGSGNTY 71

CDR3VH: GVYYFDYW 58 ARGVYYFDY 72

Tabla 4: Dominios VL y VH de los anticuerpos Hum1-20

Dominio VH ►: H1 (SEQ ID NO: 2) H2 (SEQ ID NO: 3) H3 (SEQ ID NO: 4) H4 (SEQ ID NO: 5) H5 (SEQ ID NO: 6)

Dominio VL ▼

L1 (SEQ ID NO: 7): Hum1 Hum2 Hum3 Hum4 Hum5

L2 (SEQ ID NO: 8): Hum6 Hum7 Hum8 Hum9 Hum10

L3 (SEQ ID NO: 9): Hum11 Hum12 Hum13 Hum14 Hum15

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Dominio VL ▼

L4 (SEQ ID NO: 10): Hum16 Hum17 Hum18 Hum19 Hum20

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporcionan dominios VH (por ejemplo, H1, H2, H3, H4 y H5, que comprenden las SEQ ID NOs: 2-6, respectivamente) y dominios VL (por ejemplo, L1, L2, L3 y L4, que comprenden las SEQ ID NOs: 7-10, respectivamente). En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan anticuerpos que comprenden tales dominios VH y VL, según se define, por ejemplo, en la Tabla 4 (es decir, anticuerpos Hum1-Hum20). En realizaciones particulares, estos anticuerpos comprenden las CDR VH 1-3 y las CDR VL 1-3 que comprenden las SEQ ID NOs: 16-18 y 19-21, respectivamente.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de cadena ligera variable (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria; por ejemplo, una cualquiera de las SEQ ID NOs: 7-10 (véanse, por ejemplo, las Figuras 3F-3I) o la SEQ ID NO: 12.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de cadena pesada variable (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria; por ejemplo, una cualquiera de las SEQ ID NOs: 2-6 (véanse, por ejemplo, las Figuras 3A-3E) o la SEQ ID NO: 11.

Por ejemplo, en la presente memoria se describe un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano) y comprende (i) el dominio VH H1 (SEQ ID NO: 2), H2 (SEQ ID NO: 3), H3 (SEQ ID NO: 4), H4 (SEQ ID NO: 5) o H5 (SEQ ID NO: 6) y/o (ii) el dominio VL L1 (SEQ ID NO: 7), L2 (SEQ iD NO: 8), L3 (SEQ ID NO: 9) o L4 (SEQ iD NO: 10). En un ejemplo particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede unirse inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano) y comprender un dominio VH y/o un dominio VL de uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20 (véase la Tabla 4). En un ejemplo particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio VH y/o un dominio VL de uno cualquiera de los anticuerpos Hum4, Hum8, Hum10 o Hum17.

En una realización particular, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H1 (SEQ ID NO: 2) y L1 (SEQ ID NO: 7). En una realización particular, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H1 (SEQ ID NO: 2) y L2 (SEQ ID NO: 8). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H1 (SEQ ID NO: 2) y L3 (SEQ ID NO: 9). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H1 (SEQ ID NO: 2) y L4 (SEQ ID NO: 10). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H2 (SEQ ID NO: 3) y L1 (SEQ ID NO: 7). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H2 (SEQ ID NO: 3) y L2 (SEQ ID NO: 8). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H2 (SEQ ID NO: 3) y L3 (SEQ ID NO: 9). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H2 (SEQ ID NO: 3) y L4 (SEQ ID NO: 10). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H3 (SEQ ID NO: 4) y L1 (SEQ ID NO: 7). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H3 (SEQ ID NO: 4) y L2 (SEQ ID NO: 8). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H3 (SEQ ID NO: 4) y L3 (SEQ ID NO: 9). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H3 (SEQ ID NO: 4) y L4 (SEQ ID NO: 10). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H4 (SEQ ID NO: 5) y L1 (SEQ ID NO: 7). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H4 (SEQ ID NO: 5) y L2 (SEQ ID NO: 8). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H4 (SEQ ID NO: 5) y L3 (SEQ ID NO: 9). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H4 (SEQ ID NO: 5) y L4 (SEQ ID NO: 10). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H5 (SEQ ID NO: 6) y L1 (SEQ ID NO: 7). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H5 (SEQ ID NO: 6) y L2 (SEQ ID NO: 8). En una realización específica, un anticuerpo, que se une

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inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H5 (SEQ ID NO: 6) y L3 (SEQ ID NO: 9). En una realización específica, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende H5 (SeQ ID NO: 6) y L4 (SeQ ID NO: 10).

En ciertos aspectos, un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, es no inmunogénico en un ser humano. En una realización particular, una secuencia de aminoácidos no inmunogénica está desprovista de epítopos que han sido identificados como enlazadores con moléculas humanas MHC de clase II; por ejemplo, epítopos que son enlazadores de líneas germinales no humanas con moléculas humanas MHC de clase II; en una realización particular, secuencias de aminoácidos sustancialmente desprovistas de epítopos que han sido identificados como enlazadores con moléculas humanas MHC de clase II —por ejemplo, epítopos que son enlazadores de líneas germinales no humanas con moléculas humanas MHC de clase II—. Por ejemplo, se han desarrollado herramientas in silico para identificar la ubicación de epítopos de las células tanto B como T y para evaluar el potencial de inmunogenicidad, y tales herramientas proporcionan una alternativa a los ensayos de inmunogenicidad in vitro o in vivo. Por ejemplo, se han desarrollado métodos informatizados de predicción de epítopos y bases de datos mantenidas manualmente que contienen datos de epítopos deducidos experimentalmente (véase Bryson et al., Biodrugs, 2010, 24(1): 1-8). Ejemplos no limitantes de bases de datos de epítopos incluyen la Immune Epitope Database (IEDB) y la patentada T Cell Epitope Database™ (TCED™). Tales bases de datos de epítopos pueden ser usadas solas o en combinación con ensayos in vitro descritos en la técnica; por ejemplo, ensayos de unión al MHC de clase II y ensayos de activación o proliferación de células T. Alternativamente, tales ensayos in vitro pueden ser usados independientemente de tales bases de datos de epítopos. En la técnica se han descrito métodos para determinar la inmunogenicidad de un agente, tal como un anticuerpo, o para eliminar o reducir la inmunogenicidad de un agente, tal como un anticuerpo; véanse, por ejemplo, Altschul et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402; Baker et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 2007, 10:219; Hill et al., Arthritis Res. Ther., 2003, 1:R40-R48; Jones et al., J. Thromb. Haemost., 2005, 3:991-1000; Holgate et al., IDrugs, 2009, 12:233-237; Jones et al., Methods Mol. Biol., 2009, 525:405-423; y Baker et al., Curr. Drug Saf., 2010, 5:308-313. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano comprende un dominio VH y un dominio VL que no son inmunogénicos, según determina la T Cell Epitope Database™ (TCED™). En cierta realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano, y comprende un dominio VH y un dominio VL que no son inmunogénicos, según se determina en un ensayo in vitro descrito en la técnica; véanse, por ejemplo, Wang et al., 2008, PLoS Computational Biology, 2008, 4(4):e1000048; y Arnold et al., 2002, J. Immunol., 169:739-749.

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende un dominio VH que tiene una identidad de secuencias de al menos un 93% con respecto a H1 (SEQ ID NO: 2). En una realización particular, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que tiene una identidad de secuencias de al menos el 94%, o al menos el 95%, o al menos el 96%, o al menos el 97%, o al menos el 98% o al menos el 99% con respecto a H1 (SEQ ID NO: 2). En una realización particular, el dominio VH es no inmunogénico, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende un dominio VH que tiene una identidad de secuencias de al menos un 92% con respecto a H2 (SEQ ID NO: 3). En una realización particular, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio VH que tiene una identidad de secuencias de al menos el 93%, al menos el 94%, o al menos el 95%, o al menos el 96%, o al menos el 97%, o al menos el 98% o al menos el 99% con respecto a H2 (SEQ ID NO: 3). En una realización particular, el dominio VH es no inmunogénico, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende un dominio VH que tiene una identidad de secuencias de al menos un 90% con respecto a H3 (SEQ ID NO: 4). En una realización particular, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que tiene una identidad de secuencias de al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, o al menos el 95%, o al menos el 96%, o al menos el 97%, o al menos el 98% o al menos el 99% con respecto a H3 (SEQ ID NO: 4). En una realización particular, el dominio VH es no inmunogénico, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de

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epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende un dominio VH que tiene una identidad de secuencias de al menos un 87% con respecto a H4 (SEQ ID NO: 5). En una realización particular, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que tiene una identidad de secuencias de al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, o al menos el 95%, o al menos el 96%, o al menos el 97%, o al menos el 98% o al menos el 99% con respecto a H4 (SEQ ID NO: 5). En una realización particular, el dominio VH es no inmunogénico, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende un dominio VH que tiene una identidad de secuencias de al menos un 86% con respecto a H5 (SEQ ID NO: 6). En una realización particular, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que tiene una identidad de secuencias de al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, o al menos el 95%, o al menos el 96%, o al menos el 97%, o al menos el 98% o al menos el 99% con respecto a H5 (SEQ ID NO: 6). En una realización particular, el dominio VH es no inmunogénico, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende un dominio VL que tiene una identidad de secuencias de al menos un 90% con respecto a L1 (SEQ ID NO: 7). En una realización particular, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que tiene una identidad de secuencias de al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, o al menos el 95%, o al menos el 96%, o al menos el 97%, o al menos el 98% o al menos el 99% con respecto a L1 (SEQ ID NO: 7). En una realización particular, el dominio VL es no inmunogénico, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19-21, respectivamente.

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende un dominio VL que tiene una identidad de secuencias de al menos un 88% con respecto a L2 (SEQ ID NO: 8). En una realización particular, un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que tiene una identidad de secuencias de al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, o al menos el 95%, o al menos el 96%, o al menos el 97%, o al menos el 98% o al menos el 99% con respecto a L2 (SEQ ID NO: 8). En una realización particular, el dominio VL es no inmunogénico, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19-21, respectivamente.

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende un dominio VL que tiene una identidad de secuencias de al menos un 87% con respecto a L3 (SEQ ID NO: 9). En una realización particular, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que tiene una identidad de secuencias de al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, o al menos el 95%, o al menos el 96%, o al menos el 97%, o al menos el 98% o al menos el 99% con respecto a L3 (SEQ ID NO: 9). En una realización particular, el dominio VL es no inmunogénico, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio

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VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19-21, respectivamente.

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende un dominio VL que tiene una identidad de secuencias de al menos un 84% con respecto a L4 (SEQ ID NO: 10). En una realización particular, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que tiene una identidad de secuencias de al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, o al menos el 95%, o al menos el 96%, o al menos el 97%, o al menos el 98% o al menos el 99% con respecto a L4 (SEQ ID NO: 10). En una realización particular, el dominio VL es no inmunogénico, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19-21, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 93%, o al menos el 95% con respecto a H1 (SEQ ID NO: 2); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90%, o al menos el 92% con respecto a L1 (SEQ ID NO: 7). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 92%, o al menos el 94% con respecto a H2 (SEQ ID NO: 3); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90%, o al menos el 92% con respecto a L1 (SEQ ID NO: 7). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90%, o al menos el 92% con respecto a H3 (SEQ ID NO: 4); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90%, o al menos el 92% con respecto a L1 (SEQ ID NO: 7). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 87%, o al menos el 90% con respecto a H4 (SEQ ID NO: 5); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90%, o al menos el 92% con respecto a L1 (SEQ ID NO: 7). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un

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polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 86%, o al menos el 88% con respecto a H5 (SEQ ID NO: 6); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una

identidad de secuencias de al menos el 90%, o al menos el 92% con respecto a L1 (SEQ ID NO: 7). En una

realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 93%, o al menos el 95% con

respecto a H1 (SEQ ID NO: 2); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una

identidad de secuencias de al menos el 88%, o al menos el 90% con respecto a L2 (SEQ ID NO: 8). En una

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 92%, o al menos el 94% con respecto a H2 (SEQ ID NO: 3); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 88%, o al menos el 90% con respecto a L2 (SEQ ID NO: 8). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90%, o al menos el 92% con respecto a H3 (SEQ ID NO: 4); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 87%, o al menos el 90% con

respecto a H4 (SEQ ID NO: 5); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 86%, o al menos el 88% con respecto a H5 (SEQ ID NO: 6); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 88%, o al menos el 90% con respecto a L2 (SEQ ID NO: 8). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el

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MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 93%, o al menos el 95% con respecto a H1 (SEQ ID NO: 2); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 87%, o al menos el 90% con respecto a L3 (SEQ ID NO: 9). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 92%, o al menos el 94% con respecto a H2 (SEQ ID NO: 3); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 87%, o al menos el 90% con respecto a L3 (SEQ ID NO: 9). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90%, o al menos el 92% con respecto a H3 (SEQ ID NO: 4); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 87%, o al menos el 90% con respecto a L3 (SEQ ID NO: 9). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 87%, o al menos el 90% con respecto a H4 (SEQ ID NO: 5); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 87%, o al menos el 90% con respecto a L3 (SEQ ID NO: 9). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 86%, o al menos el 88% con respecto a H5 (SEQ ID NO: 6); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 87%, o al menos el 90% con respecto a L3 (SEQ ID NO: 9). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

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polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 93%, o al menos el 95% con respecto a H1 (SEQ ID NO: 2); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 84%, o al menos el 86% con respecto a L4 (SEQ ID NO: 10). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 92%, o al menos el 94% con respecto a H2 (SEQ ID NO: 3); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 84%, o al menos el 86% con respecto a L4 (SEQ ID NO: 10). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90%, o al menos el 92% con respecto a H3 (SEQ ID NO: 4); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 84%, o al menos el 86% con respecto a L4 (SEQ ID NO: 10). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

identidad de secuencias de al menos el 84%, o al menos el 86% con respecto a L4 (SEQ ID NO: 10). En una realización particular, los dominios VL y VH son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II. En cierta realización, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VL 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y las CDR VH 1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende (i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos el 86%, o al menos el 88% con

respecto a H5 (SEQ ID NO: 6); y (ii) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una

Para determinar la identidad porcentual de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias son alineadas con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de un primer aminoácido o de una primera secuencia de ácidos nucleicos para su alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos. A continuación, se comparan los residuos de aminoácido o los nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o las posiciones de nucleótidos. Entonces, cuando una posición de la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la correspondiente posición de la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición. La identidad porcentual entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las

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secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones superpuestas idénticas/número total de posiciones * 100%). En una realización, las dos secuencias son de la misma longitud. En cierta realización, la identidad porcentual se determina en toda la longitud de una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos.

También se puede lograr la determinación de identidad porcentual entre dos secuencias (por ejemplo, secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos) usando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferente no limitante de algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268, modificado como en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877. Tal algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos con BLAST se pueden llevar a cabo con los parámetros del programa de nucleótidos NBLAST puestos, por ejemplo, a puntuación=100, longitud_de_palabra=12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente memoria. Las búsquedas de proteínas con BLAST se pueden llevar a cabo con los parámetros del programa de nucleótidos XBLAST puestos, por ejemplo, a puntuación 50, longitud_de_palabra=3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a la molécula proteínica descrita en la presente memoria. Para obtener alineamientos con huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST según se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402. Alternativamente, puede usarse PSI BLAST para efectuar una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre moléculas (íd.). Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI Blast, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, de XBLAST y NBLAST) (véase, por ejemplo, National Center for Biotechnology Information (NCBI) en Internet, ncbi.nlm.nih.gov). Otro ejemplo preferente no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Tal algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete de soporte lógico de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, pueden usarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12, y una penalización de hueco de 4.

La identidad porcentual entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a las recién descritas, permitiendo huecos o no. En el cálculo de la identidad porcentual, normalmente solo se cuentan las coincidencias exactas.

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende: (i) un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente, y una, dos, tres o cuatro regiones marco de H1, H2, H3, H4 o H5 (véase la Tabla 5A); y/o (ii) un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19-21, respectivamente, y una, dos, tres o cuatro regiones marco de L1, L2, L3 o L4 (véase la Tabla 5B).

En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente, y una región marco fR1 de H1, H2, H3, H4 o H5. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente, y una región marco FR2 de H1, H2, H3, H4 o H5. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente, y una región marco FR3 de H1, H2, H3, H4 o H5. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente, y una región marco FR4 de H1, H2, H3, H4 o H5.

En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente, y regiones marco FR1 y FR2 de H1, H2, H3, H4 o H5. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de sEq ID NOs: 16-18, respectivamente, y regiones marco FR1, FR2 y FR3 de H1, H2, H3, H4 o H5. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SeQ ID Nos: 16-18, respectivamente, y regiones marco FR1, Fr2, FR3 y FR4 de H1, H2, H3, H4 o H5.

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En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente, y regiones marco FR1 y FR4 de H1, H2, H3, H4 o H5.

En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente, y regiones marco FR1, FR2 y FR4 de H1, H2, H3, H4 o H5.

En una realización, un anticuerpo humano o humanizado descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nos: 16-18, respectivamente, y regiones marco FR2 y FR3 de H1, H2, H3, H4 o H5. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente, y regiones marco FR2, FR3 y FR4 de H1, H2, H3, H4 o H5.

En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente, y regiones marco FR3 y FR4 de H1, H2, H3, H4 o H5.

En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y una región marco FR1 de L1, L2, L3 o L4. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de sEq ID NOs: 19-21, respectivamente, y una región marco FR2 de L1, L2, L3 o L4. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y una región marco FR3 de L1, L2, L3 o L4. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de sEq ID NOs: 19-21, respectivamente, y una región marco FR4 de L1, L2, L3 o L4.

En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y regiones marco FR1 y FR2 de L1, L2, L3 o L4. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y regiones marco FR1, fR2 y FR3 de L1, L2, L3 o L4. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nos: 19-21, respectivamente, y regiones marco FR1, fR2, FR3 y FR4 de L1, L2, L3 o L4.

En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y regiones marco FR1 y FR3 de L1, L2, L3 o L4. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden

28

5

10

15

20

25

30

35

40

45

las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y regiones marco FR1, FR3 y FR4 de L1, L2, L3 o L4.

En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y regiones marco FR1 y FR4 de L1, L2, L3 o L4.

En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y regiones marco FR1, FR2 y FR4 de L1, L2, L3 o L4.

En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y regiones marco FR2 y FR3 de L1, L2, L3 o L4. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y regiones marco FR2, fR3 y FR4 de L1, L2, L3 o L4.

En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente, y regiones marco FR3 y FR4 de L1, L2, L3 o L4.

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende: (i) un dominio VH que comprende una CdR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente, y regiones marco FR1-FR4 de uno cualquiera de los dominios VH HH257-HH281 (véase la Tabla 5C); y (ii) un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19-21, respectivamente, y FR1-FR4 de uno cualquiera de los dominios VL LL65-LL76 (véase la Tabla 5D).

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende: (i) un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden una combinación de secuencias de aminoácidos definidas en la Tabla 2 o 3, y regiones marco FR1-FR4 de uno cualquiera de los dominios VH H1-H5 (Tabla 5A) y HH257-HH281 (véase la Tabla 5C); y (ii) un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden una combinación de secuencias de aminoácidos definidas ya sea en la Tabla 2 (conjunto 1 o conjunto 2) o en la 3 (las CDR de AbM o de contacto), respectivamente, y FR1-FR4 de uno cualquiera de los dominios VL L1-L4 (Tabla 5B) y LL65-LL76 (véase la Tabla 5D).

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende: (i) un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden una combinación de secuencias de aminoácidos definidas en la Tabla 2 o 3, y correspondientes regiones marco FR1- FR4 que comprenden secuencias que flanquean las CDR VH, según se representa, por ejemplo, en una cualquiera de las Figuras 3A-3I; y (ii) un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden una combinación de secuencias de aminoácidos definidas ya sea en la Tabla 2 (conjunto 1 o conjunto 2) o en la 3 (las CDR de AbM o de contacto), respectivamente, y correspondientes regiones marco FR1-FR4 que comprenden secuencias que flanquean las CDR VL, según se representa, por ejemplo, en una cualquiera de las Figuras 3A-3I.

Tabla 5A: Regiones marco (FR) del dominio VH

: FR1 VH FR2 VH FR3 VH FR4 VH

H1: QVQLVQSGAELK KPGASVKLSCKA SGYTFT (SEQ ID NO: 33) WVKQAPGKGLE W1A (SEQ ID NO: 34) RATLTAEKSTSTA YMQLS SLRSED S AVYFCAR (SEQ ID NO: 35) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 36)

: FR1 VH FR2 VH FR3 VH FR4 VH

H2: QVQLVQSGAEVK KPGASVKLSCKA SGYTFT (SEQ ID NO: 37) WVKQAPGKGLE W1A (SEQ ID NO: 34) RATLTAEKSTSTA YMQLSSLRSEDT AVYFCAR (SEQ ID NO: 38) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 36)

H3: QVQLVQSGAEVK KPGASVKLSCKA SGYTFT (SEQ ID NO: 37) WVRQAPGKGLE WIA (SEQ ID NO: 39) RATLTADKSTST AYMQLSSLRSED TAVYFCAR (SEQ TD NO: 40) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 36)

H4: QVQLVQSGAEVK KPGASVKVSCKA SGYTFT (SEQ ID NO: 41) WVRQAPGKGLE WIA (SEQ ID NO: 39) RATITADKSTSTA YMELSSLRSEDTA VYFCAR (SEQ TD NO: 42) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 36)

H5: QVQLVQSGAEVK KPGASVKVSCKA SGYTFT (SEQ ID NO: 41) WVRQAPGKGLE WIA (SEQ ID NO: 39) RVTITADKSTSTA YMEESSLRSEDTA VYFCAR (SEQ TD NO: 43) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 36)

Tabla 5B: Regiones marco (FR) del dominio VL

: FR1 VL FR2 VL FR3 VL FR4 VL

L1: DI VMT QSPSFLSAS VGDRVTITC (SEQ ID NO: 44) WY QQKPGKAPKA LIY (SEQ ID NO: 45) GVPDRFTGSGSGTD FTLTISSLQSEDFAD YFC (SEQ TD NO: 46) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 47)

L2: DIVMTQSPSSLSAS VGDRVTITC (SEQ ID NO: 48) WY QQKPGKAPKA LIY (SEQ ID NO: 45) GVPDRFTGSGSGTD FTLTISSLQPEDFAD YFC (SEQ ID NO: 49) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 47)

L3: DIVMTQSPSSLSAS VGDRVTITC (SEQ ID NO: 48) WY QQKPGKAPKA LIY (SEQ ID NO: 45) GVPDRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFAD YFC (SEQ ID NO: 50) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 47)

L4: DIVMTQSPSSLSAS VGDRVTITC (SEQ ID NO: 48) WY QQKPGKAPKS LIY (SEQ ID NO: 51) GVPDRFSGSGSGTD FTLTIS SLQPEDF AT YYC (SEQ ID NO: 52) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 47)

Tabla 5C: Secuencias de región marco de los dominios VH HH257 a HH281

Dominio VH: FR1 VH FR2 VH FR3 VH FR4 VH

HH257: SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36

HH258: SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 36

HH259: SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 36

HH260: SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 36

HH261: SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 36

HH262: SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 36

HH263: SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 36

HH264: SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 36

HH265: SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 36

HH266: SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36

HH267: SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36

HH268: SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 36

HH269: SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 36

HH270: SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 36

HH271: SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 36

HH272: SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 36

HH273: SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 36

HH274: SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36

HH275: SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36

HH276: SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 36

HH277: SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 36

HH278: SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 36

HH279: SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 36

HH280: SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 36

HH281: SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 36

Tabla 5D: Secuencias de región marco de los dominios VL LL65 a LL76

Dominio VL: FR1 VL FR2 VL FR3 VL FR4 VL

LL65: SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 47

LL66: SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 47

LL67: SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 47

LL68: SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 47

LL69: SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 47

LL70: SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 47

LL71: SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 47

LL72: SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 47

LL73: SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 47

LL74: SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 47

LL75: SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 47

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Dominio VL: FR1 VL FR2 VL FR3 VL FR4 VL

LL76: SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 47

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende: (i) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos:

QVQLVQSGAEXhiKKPGASVKXh2SCKASGYTFTDYYINWVXh3QAPGKGLEWIARIYPGS GNTYYNEKFKGRXh4TXh5TAXh6KSTSTAYMXh7LSSLRSEDXhsAVYFCARGVYYFDYW gqgttvtvss

(SEQ ID NO: 11), seleccionándose independientemente Xh1 en la posición Kabat 11, Xh2 en la posición Kabat 20, Xh3 en la posición Kabat 38, Xh4 en la posición Kabat 67, Xh5 en la posición Kabat 69, Xh6 en la posición Kabat 72, Xh7 en la posición Kabat 81, y Xhs en la posición Kabat 87 de cualquier aminoácido; y/o (ii) un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos DIVMTQSPSXki,LSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXk2LIYSASYRYSG VPDRFXk3GSGSGTDFTLTISSLQXk4DFAXk5YXk6CQQYNSYPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 12), seleccionándose independientemente Xk1 en la posición Kabat 10, Xk2 en la posición Kabat 46, Xk3 en la posición Kabat 63, Xk4 en la posición Kabat 80, Xk5 en la posición Kabat 85, y Xk6 en la posición Kabat 87 de cualquier aminoácido. En una realización particular, el dominio VH y/o el VL son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el MHC de clase II.

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), que comprende: (i) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos:

(SEQ ID NO: 11), seleccionándose Xh1 en la posición Kabat 11, Xh2 en la posición Kabat 20, Xh3 en la posición Kabat 38, Xh4 en la posición Kabat 67, Xh5 en la posición Kabat 69, Xh6 en la posición Kabat 72, Xh7 en la posición Kabat 81, y Xhs en la posición Kabat 87 de la combinación de aminoácidos definida en la Tabla 6B; y/o (ii) un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos: DIVMTQSPSXkiLSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXk2LIYSASYRYSG VPDRFXk3GSGSGTDFTLTISSLQXk4DFAXk5YXk6CQQYNSYPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 12), seleccionándose Xk1 en la posición Kabat 10, Xk2 en la posición Kabat 46, Xk3 en la posición Kabat 63, Xk4 en la posición Kabat 80, Xk5 en la posición Kabat 85, y Xk6 en la posición Kabat 87 de la combinación de aminoácidos definida en la Tabla 6A. En una realización particular, el dominio VH y/o el VL son no inmunogénicos, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de epítopos que se unan al MHC de clase II; por ejemplo, enlazadores de líneas germinales no humanas con el mHc de clase II.

En una realización, Xh1 en la posición Kabat 11 es un aminoácido con una cadena lateral alifática (por ejemplo, un aminoácido de cadenas ramificadas (BCAA) de cadena lateral hidrófoba o cadena lateral no polar), tal como L o V. En una realización, Xh2 en la posición Kabat 20 es un aminoácido con una cadena lateral alifática (por ejemplo, aminoácido de cadenas ramificadas (BCAA) de cadena lateral hidrófoba o cadena lateral no polar), tal como L o V. En una realización, Xh3 en la posición Kabat 38 es un aminoácido con una cadena lateral polar (por ejemplo, una cadena lateral hidrófila, una cadena lateral básica o una cadena lateral cargada; por ejemplo, una cadena lateral cargada positivamente o una cadena lateral cargada negativamente), tal como K o R. En una realización, Xh4 en la posición Kabat 67 es un aminoácido con una cadena lateral alifática (por ejemplo, un aminoácido de cadenas ramificadas (BCAA) de cadena lateral hidrófoba o cadena lateral no polar), tal como V o A. En una realización, Xh5 en la posición Kabat 69 es un aminoácido con una cadena lateral alifática (por ejemplo, un aminoácido de cadenas ramificadas (BCAA) de cadena lateral hidrófoba o cadena lateral no polar), tal como L o I. En una realización, Xh6 en la posición Kabat 72 es un aminoácido con una cadena lateral ácida, tal como E o D. En una realización, Xh7 en la posición Kabat 81 es un aminoácido con una cadena lateral ácida o su derivado amídico, tal como Q (derivado no cargado/amídico de E) o E. En una realización, Xhs en la posición Kabat 87 es un aminoácido con un grupo hidroxilo alifático o una cadena lateral hidrófila, tal como S o T.

En una realización, Xh1 en la posición Kabat 11 es un aminoácido alifático, tal como un aminoácido de cadenas ramificadas (BCAA), por ejemplo V; Xh2 en la posición Kabat 20 es un aminoácido alifático, tal como un aminoácido de cadenas ramificadas (BCAa), por ejemplo L; Xh3 en la posición Kabat 38 es un aminoácido con una cadena lateral polar, tal como R; Xh4 en la posición Kabat 67 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, tal como A; Xh5 en la posición Kabat 69 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, tal como L; Xh6 en la posición Kabat 72 es un aminoácido con una cadena lateral polar, tal como D; Xh7 en la posición Kabat 81 es un aminoácido con un derivado amídico de un aminoácido ácido, tal como Q; y Xhs en la posición Kabat 87 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática, tal como T.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

En una realización, Xhi en la posición Kabat 11 es un aminoácido alifático, tal como un aminoácido de cadenas ramificadas (BCAA), por ejemplo V; Xh2 en la posición Kabat 20 es un aminoácido alifático, tal como un aminoácido de cadenas ramificadas (BCAa), por ejemplo V; Xh3 en la posición Kabat 38 es un aminoácido con una cadena lateral polar, tal como R; Xh4 en la posición Kabat 67 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, tal como A; Xh5 en la posición Kabat 69 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, tal como I; Xh6 en la posición Kabat 72 es un aminoácido con una cadena lateral polar, tal como D; Xh7 en la posición Kabat 81 es un aminoácido ácido, tal como E; y Xhs en la posición Kabat 87 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática, tal como T.

En una realización específica, Xk1 en la posición Kabat 10 es un aminoácido aromático tal como F o un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática tal como S. En cierta realización, Xk2 en la posición Kabat 46 es un aminoácido con una cadena lateral alifática (por ejemplo, un aminoácido hidrófobo) tal como A o un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática tal como S. En una realización, Xk3 en la posición Kabat 63 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática tal como T o S. En una realización específica, Xk4 en la posición Kabat 80 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática tal como S o un aminoácido aromático tal como P. En cierta realización, Xk5 en la posición Kabat 85 es un aminoácido ácido tal como D o un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática tal como T. En una realización, Xk6 en la posición Kabat 87 es un aminoácido aromático tal como F o Y.

En una realización específica, Xk1 en la posición Kabat 10 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática tal como S; Xk2 en la posición Kabat 46 es un aminoácido con una cadena lateral alifática (por ejemplo, un aminoácido hidrófobo) tal como A; Xk3 en la posición Kabat 63 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática tal como T; Xk4 en la posición Kabat 80 es un aminoácido aromático, tal como P; Xk5 en la posición Kabat 85 es un aminoácido ácido tal como D; y Xk6 en la posición Kabat 87 es un aminoácido aromático tal como F.

En una realización específica, Xk1 en la posición Kabat 10 es un aminoácido aromático tal como F; Xk2 en la posición Kabat 46 es un aminoácido con una cadena lateral alifática (por ejemplo, un aminoácido hidrófobo) tal como A; Xk3 en la posición Kabat 63 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática tal como T; Xk4 en la posición Kabat 80 es una cadena lateral hidroxilo alifática tal como S; Xk5 en la posición Kabat 85 es un aminoácido ácido tal como D; y Xk6 en la posición Kabat 87 es un aminoácido aromático tal como F.

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende: (i) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos:

(SEQ ID NO: 11), en la que Xh1 en la posición Kabat 11 es un aminoácido con una cadena lateral alifática tal como V, Xh2 en la posición Kabat 20 es un aminoácido con una cadena lateral alifática tal como L, Xh3 en la posición Kabat 38 es un aminoácido con una cadena lateral polar tal como K, Xh4 en la posición Kabat 67 es un aminoácido con una cadena lateral alifática tal como A, Xh5 en la posición Kabat 69 es un aminoácido con una cadena lateral alifática tal como L, Xh6 en la posición Kabat 72 es un aminoácido ácido tal como D, Xh7 en la posición Kabat 81 es un aminoácido ácido o un derivado amídico del mismo tal como Q, y Xh8 en la posición Kabat 87 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática tal como T; y (ii) un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos DIVMTQSPSXkiLSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPXk2LIYSASYRYSG VPDRFXk3GSGSGTDFTLTISSLQXk4DFAXk5YXk6CQQYNSYPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 12), en la que Xk1 en la posición Kabat 10 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática tal como S, Xk2 en la posición Kabat 46 es un aminoácido con una cadena lateral alifática tal como A, Xk3 en la posición Kabat 63 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática tal como T, Xk4 en la posición Kabat 80 es un aminoácido aromático, tal como P, Xk5 en la posición Kabat 85 es un aminoácido ácido tal como D, y Xk6 en la posición Kabat 87 es un aminoácido aromático tal como F.

QVQLVQSGAEXhiKKPGASVKXh2SCKASGYTFTDYYINWVXh3QAPGKGLEWIARIYPGS

GNTYYNEKFKGRXh4TXh5TAXh6KSTSTAYMXh7LSSLRSEDXhsAVYFCARGVYYFDYW GQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 11), en la que Xh1 en la posición Kabat 11 es un aminoácido con una cadena lateral alifática tal como V, Xh2 en la posición Kabat 20 es un aminoácido con una cadena lateral alifática tal como V, Xh3 en la posición Kabat 38 es un aminoácido con una cadena lateral polar tal como R, Xh4 en la posición Kabat 67 es un aminoácido con una cadena lateral alifática tal como A, Xh5 en la posición Kabat 69 es un aminoácido con una cadena lateral alifática tal como I, Xh6 en la posición Kabat 72 es un aminoácido ácido tal como D, Xh7 en la posición Kabat 81 es un aminoácido ácido tal como E, y Xh8 en la posición Kabat 87 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática tal como T; y (ii) un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos

DIVMTQSPSXkiLSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXk2LIYSASYRYSG

VPDRFXk3GSGSGTDFTLTISSLQXk4EDFAXk5YXk6CQQYNSYPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 12), en la que Xk1

5

10

15

20

25

30

35

en la posición Kabat 10 es un aminoácido aromático tal como F, Xk2 en la posición Kabat 46 es un aminoácido con una cadena lateral alifática tal como A, Xk3 en la posición Kabat 63 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática tal como T, Xk4 en la posición Kabat 80 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática tal como S, Xk5 en la posición Kabat 85 es un aminoácido ácido tal como D, y Xk6 en la posición Kabat 87 es un aminoácido aromático tal como F.

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende (i) un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una cDR2 Vh y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente; y (ii) un dominio VL que comprende la SEQ ID NO: 7, 8, 9 o 10.

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende (i) un dominio VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ Id NOs: 16-18, respectivamente; y (ii) un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos DIVMTQSPSXkiLSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXk2LIYSASYRYSG VPDRFXk3GSGSGTDFTLTISSLQXk4DFAXk5YXkbCQQYNSYPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 12), seleccionándose Xk1 en la posición Kabat 10, Xk2 en la posición Kabat 46, Xk3 en la posición Kabat 63, Xk4 en la posición Kabat 80, Xk5 en la posición Kabat 85, y Xk6 en la posición Kabat 87 de la combinación de aminoácidos definida en la Tabla 6A.

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende (i) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4 o 5; y (ii) un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente.

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende (i) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos:

(SEQ ID NO: 11), seleccionándose Xh1 en la posición Kabat 11, Xh2 en la posición Kabat 20, Xh3 en la posición Kabat 38, Xh4 en la posición Kabat 67, Xh5 en la posición Kabat 69, Xh6 en la posición Kabat 72, Xh7 en la posición Kabat 81, y Xhs en la posición Kabat 87 de la combinación de aminoácidos definida en la Tabla 6B; y (ii) un dominio VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente.

Tabla 6A: Sustituciones de aminoácidos en el dominio VK

: Xk1 Xk2 Xk3 Xk4 Xk5 Xk6

Posición Kabat: 10 46 63 80 85 87

Posición numérica de SEQ ID NO: 12: 10 46 63 80 85 87

Cadena lateral de aminoácido: Aromática o hidroxilo alifática Alifática o hidroxilo alifática Hidroxilo alifática Prolínica o hidroxilo alifática Cargada o ácida Aromática

L1: F A T S D F

L2: S A T p D F

L3: S A T p D F

L4: S S S p T y

LL1: S A T S D F

LL2: F S T S D F

LL3: S S T S D F

LL4: F A S S D F

LL5: S A S S D F

: Xk1 Xk2 Xk3 Xk4 Xk5 Xk6

Posición Kabat: 10 46 63 80 85 87

Posición numérica de SEQ ID NO: 12: 10 46 63 80 85 87

LL6: F S S S D F

LL7: S S S S D F

LL8: F A T P D F

LL9: S A T P D F

LL10: F S T P D F

LL11: S S T P D F

LL12: F A S P D F

LL13: S A S P D F

LL14: F S S P D F

LL15: S S S P D F

LL16: F A T S T F

LL17: S A T S T F

LL18: F S T S T F

LL19: S S T S T F

LL20: F A S S T F

LL21: S A S S T F

LL22: F S S S T F

LL23: S S S S T F

LL24: F A T P T F

LL25: S A T P T F

LL26: F S T P T F

LL27: S S T P T F

LL28: F A S P T F

LL29: S A S P T F

LL30: F S S P T F

LL31: S S S P T F

LL32: S A T S D Y

LL33: F S T S D Y

LL34: S S T S D Y

LL35: F A S S D Y

LL36: S A S S D Y

LL37: F S S S D Y

LL38: S S S S D Y

LL39: F A T P D Y

LL40: S A T P D Y

: Xk1 Xk2 Xk3 Xk4 Xk5 Xk6

Posición Kabat: 10 46 63 80 85 87

Posición numérica de SEQ ID NO: 12: 10 46 63 80 85 87

LL41: F S T P D Y

LL42: S S T P D Y

LL43: F A S P D Y

LL44: S A S P D Y

LL45: F S S P D Y

LL46: S S S P D Y

LL47: F A T S T Y

LL48: S A T S T Y

LL49: F S T S T Y

LL50: S S T S T Y

LL51: F A S S T Y

LL52: S A S S T Y

LL53: F S S S T Y

LL54: S S S S T Y

LL55: F A T P T Y

LL56: S A T P T Y

LL57: F S T P T Y

LL58: S S T P T Y

LL59: F A S P T Y

LL60: S A S P T Y

LL61: F S S P T Y

LL62: S S S P T Y

Tabla 6B: Sustituciones de aminoácidos en el dominio VH

: Xhi Xh2 Xh3 Xh4 Xh5 Xh6 Xh7 Xh8

Posición Kabat: 11 20 38 67 69 72 81 87

Posición numérica de SEQ ID NO: 11: 11 20 38 68 70 73 82 91

Cadena lateral de aminoácido: Alifática Alifática Polar o básica Alifática Alifática Ácida Ácida o derivada amídica Hidroxilo alifática

H1: L L K A L E Q S

H2: V L K A L E Q T

: Xh1 Xh2 Xh3 Xh4 Xh5 Xh6 Xh7 Xh8

Posición Kabat: 11 20 38 67 69 72 81 87

Posición numérica de SEQ ID NO: 11: 11 20 38 68 70 73 82 91

H3: V L R A L D Q T

H4: V V R A I D E T

H5: V V R V I D E T

HH1: L L K A L E Q S

HH2: V L K A L E Q S

HH3: L V K A L E Q S

HH4: V V K A L E Q S

HH5: L L R A L E Q S

HH6: V L R A L E Q S

HH7: L V R A L E Q S

HH8: V V R A L E Q S

HH9: L L K V L E Q S

HH10: V L K V L E Q S

HH11: L V K V L E Q S

HH12: V V K V L E Q S

HH13: L L R V L E Q S

HH14: V L R V L E Q S

HH15: L V R V L E Q S

HH16: V V R V L E Q S

HH17: L L K A I E Q S

HH18: V L K A I E Q S

HH19: L V K A I E Q S

HH20: V V K A I E Q S

HH21: L L R A I E Q S

HH22: V L R A I E Q S

HH23: L V R A I E Q S

HH24: V V R A I E Q S

HH25: L L K V I E Q S

HH26: V L K V I E Q S

HH27: L V K V I E Q S

HH28: V V K V I E Q S

: Xh1 Xh2 Xh3 Xh4 Xh5 Xh6 Xh7 Xh8

Posición Kabat: 11 20 38 67 69 72 81 87

Posición numérica de SEQ ID NO: 11: 11 20 38 68 70 73 82 91

HH29: L L R V I E Q S

HH30: V L R V I E Q S

HH31: L V R V I E Q S

HH32: V V R V I E Q S

HH33: L L K A L D Q S

HH34: V L K A L D Q S

HH35: L V K A L D Q S

HH36: V V K A L D Q S

HH37: L L R A L D Q S

HH38: V L R A L D Q S

HH39: L V R A L D Q S

HH40: V V R A L D Q S

HH41: L L K V L D Q S

HH42: V L K V L D Q S

HH43: L V K V L D Q S

HH44: V V K V L D Q S

HH45: L L R V L D Q S

HH46: V L R V L D Q S

HH47: L V R V L D Q S

HH48: V V R V L D Q S

HH49: L L K A I D Q S

HH50: V L K A I D Q S

HH51: L V K A I D Q S

HH52: V V K A I D Q S

HH53: L L R A I D Q S

HH54: V L R A I D Q S

HH55: L V R A I D Q S

HH56: V V R A I D Q S

HH57: L L K V I D Q S

HH58: V L K V I D Q S

HH59: L V K V I D Q S

HH60: V V K V I D Q S

: Xh1 Xh2 Xh3 Xh4 Xh5 Xh6 Xh7 Xh8

Posición Kabat: 11 20 38 67 69 72 81 87

Posición numérica de SEQ ID NO: 11: 11 20 38 68 70 73 82 91

HH61: L L R V I D Q S

HH62: V L R V I D Q S

HH63: L V R V I D Q S

HH64: V V R V I D Q S

HH65: L L K A L E E S

HH66: V L K A L E E S

HH67: L V K A L E E S

HH68: V V K A L E E S

HH69: L L R A L E E S

HH70: V L R A L E E S

HH71: L V R A L E E S

HH72: V V R A L E E S

HH73: L L K V L E E S

HH74: V L K V L E E S

HH75: L V K V L E E S

HH76: V V K V L E E S

HH77: L L R V L E E S

HH78: V L R V L E E S

HH79: L V R V L E E S

HH80: V V R V L E E S

HH81: L L K A I E E S

HH82: V L K A I E E S

HH83: L V K A I E E S

HH84: V V K A I E E S

HH85: L L R A I E E S

HH86: V L R A I E E S

HH87: L V R A I E E S

HH88: V V R A I E E S

HH89: L L K V I E E S

HH90: V L K V I E E S

HH91: L V K V I E E S

HH92: V V K V I E E S

: Xh1 Xh2 Xh3 Xh4 Xh5 Xh6 Xh7 Xh8

Posición Kabat: 11 20 38 67 69 72 81 87

Posición numérica de SEQ ID NO: 11: 11 20 38 68 70 73 82 91

HH93: L L R V I E E S

HH94: V L R V I E E S

HH95: L V R V I E E S

HH96: V V R V I E E S

HH97: L L K A L D E S

HH98: V L K A L D E S

HH99: L V K A L D E S

HH100: V V K A L D E S

HH101: L L R A L D E S

HH102: V L R A L D E S

HH103: L V R A L D E S

HH104: V V R A L D E S

HH105: L L K V L D E S

HH106: V L K V L D E S

HH107: L V K V L D E S

HH108: V V K V L D E S

HH109: L L R V L D E S

HH110: V L R V L D E S

HH111: L V R V L D E S

HH112: V V R V L D E S

HH113: L L K A I D E S

HH114: V L K A I D E S

HH115: L V K A I D E S

HH116: V V K A I D E S

HH117: L L R A I D E S

HH118: V L R A I D E S

HH119: L V R A I D E S

HH120: V V R A I D E S

HH121: L L K V I D E S

HH122: V L K V I D E S

HH123: L V K V I D E S

HH124: V V K V I D E S

: Xh1 Xh2 Xh3 Xh4 Xh5 Xh6 Xh7 Xh8

Posición Kabat: 11 20 38 67 69 72 81 87

Posición numérica de SEQ ID NO: 11: 11 20 38 68 70 73 82 91

HH125: L L R V I D E S

HH126: V L R V I D E S

HH127: L V R V I D E S

HH128: V V R V I D E S

HH129: L L K A L E Q T

HH130: V L K A L E Q T

HH131: L V K A L E Q T

HH132: V V K A L E Q T

HH133: L L R A L E Q T

HH134: V L R A L E Q T

HH135: L V R A L E Q T

HH136: V V R A L E Q T

HH137: L L K V L E Q T

HH138: V L K V L E Q T

HH139: L V K V L E Q T

HH140: V V K V L E Q T

HH141: L L R V L E Q T

HH142: V L R V L E Q T

HH143: L V R V L E Q T

HH144: V V R V L E Q T

HH145: L L K A I E Q T

HH146: V L K A I E Q T

HH147: L V K A I E Q T

HH148: V V K A I E Q T

HH149: L L R A I E Q T

HH150: V L R A I E Q T

HH151: L V R A I E Q T

HH152: V V R A I E Q T

HH153: L L K V I E Q T

HH154: V L K V I E Q T

HH155: L V K V I E Q T

HH156: V V K V I E Q T

: Xh1 Xh2 Xh3 Xh4 Xh5 Xh6 Xh7 Xh8

Posición Kabat: 11 20 38 67 69 72 81 87

Posición numérica de SEQ ID NO: 11: 11 20 38 68 70 73 82 91

HH157: L L R V I E Q T

HH158: V L R V I E Q T

HH159: L V R V I E Q T

HH160: V V R V I E Q T

HH161: L L K A L D Q T

HH162: V L K A L D Q T

HH163: L V K A L D Q T

HH164: V V K A L D Q T

HH165: L L R A L D Q T

HH166: V L R A L D Q T

HH167: L V R A L D Q T

HH168: V V R A L D Q T

HH169: L L K V L D Q T

HH170: V L K V L D Q T

HH171: L V K V L D Q T

HH172: V V K V L D Q T

HH173: L L R V L D Q T

HH174: V L R V L D Q T

HH175: L V R V L D Q T

HH176: V V R V L D Q T

HH177: L L K A I D Q T

HH178: V L K A I D Q T

HH179: L V K A I D Q T

HH180: V V K A I D Q T

HH181: L L R A I D Q T

HH182: V L R A I D Q T

HH183: L V R A I D Q T

HH184: V V R A I D Q T

HH185: L L K V I D Q T

HH186: V L K V I D Q T

HH187: L V K V I D Q T

HH188: V V K V I D Q T

: Xh1 Xh2 Xh3 Xh4 Xh5 Xh6 Xh7 Xh8

Posición Kabat: 11 20 38 67 69 72 81 87

Posición numérica de SEQ ID NO: 11: 11 20 38 68 70 73 82 91

HH189: L L R V I D Q T

HH190: V L R V I D Q T

HH191: L V R V I D Q T

HH192: V V R V I D Q T

HH193: L L K A L E E T

HH194: V L K A L E E T

HH195: L V K A L E E T

HH196: V V K A L E E T

HH197: L L R A L E E T

HH198: V L R A L E E T

HH199: L V R A L E E T

HH200: V V R A L E E T

HH201: L L K V L E E T

HH202: V L K V L E E T

HH203: L V K V L E E T

HH204: V V K V L E E T

HH205: L L R V L E E T

HH206: V L R V L E E T

HH207: L V R V L E E T

HH208: V V R V L E E T

HH209: L L K A I E E T

HH210: V L K A I E E T

HH211: L V K A I E E T

HH212: V V K A I E E T

HH213: L L R A I E E T

HH214: V L R A I E E T

HH215: L V R A I E E T

HH216: V V R A I E E T

HH217: L L K V I E E T

HH218: V L K V I E E T

HH219: L V K V I E E T

HH220: V V K V I E E T

: Xh1 Xh2 Xh3 Xh4 Xh5 Xh6 Xh7 Xh8

Posición Kabat: 11 20 38 67 69 72 81 87

Posición numérica de SEQ ID NO: 11: 11 20 38 68 70 73 82 91

HH221: L L R V I E E T

HH222: V L R V I E E T

HH223: L V R V I E E T

HH224: V V R V I E E T

HH225: L L K A L D E T

HH226: V L K A L D E T

HH227: L V K A L D E T

HH228: V V K A L D E T

HH229: L L R A L D E T

HH230: V L R A L D E T

HH231: L V R A L D E T

HH232: V V R A L D E T

HH233: L L K V L D E T

HH234: V L K V L D E T

HH235: L V K V L D E T

HH236: V V K V L D E T

HH237: L L R V L D E T

HH238: V L R V L D E T

HH239: L V R V L D E T

HH240: V V R V L D E T

HH241: L L K A I D E T

HH242: V L K A I D E T

HH243: L V K A I D E T

HH244: V V K A I D E T

HH245: L L R A I D E T

HH246: V L R A I D E T

HH247: L V R A I D E T

HH248: V V R A I D E T

HH249: L L K V I D E T

HH250: V L K V I D E T

HH251: L V K V I D E T

HH252: V V K V I D E T

5

10

15

20

25

30

35

: Xh1 Xh2 Xh3 Xh4 Xh5 Xh6 Xh7 Xh8

Posición Kabat: 11 20 38 67 69 72 81 87

Posición numérica de SEQ ID NO: 11: 11 20 38 68 70 73 82 91

HH253: L L R V I D E T

HH254: V L R V I D E T

HH255: L V R V I D E T

HH256: V V R V I D E T

En una realización específica, la posición (es decir, el límite) de una región de cadena VL descrita en la presente memoria relativa con respecto a la región constante puede cambiar en una, dos, tres o cuatro posiciones de aminoácidos siempre y cuando se mantenga la unión inmunoespecífica a KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano) (por ejemplo, que se mantenga sustancialmente; por ejemplo, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%). En una realización específica, la posición (es decir, el límite) de una región de cadena VH descrita en la presente memoria relativa con respecto a la región constante puede cambiar en una, dos, tres o cuatro posiciones de aminoácidos siempre y cuando se mantenga la unión inmunoespecífica a KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano) (por ejemplo, que se mantenga sustancialmente; por ejemplo, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%).

En aspectos específicos, en la presente memoria se proporciona un resto que comprende las CDR VH y/o las CDR VL descritas en la presente memoria —por ejemplo según se define en las Tablas 1-3 y 10-15—, estando dispuestas las CDR VH y las CDR VL en una orientación espacial que confiere una unión específica a una región D4 del KIT humano.

En aspectos específicos, en la presente memoria se proporciona un resto que comprende las CDR VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-18 y las CDR VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19-21, las CDR VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 56, 62 y 63 y las CDR VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 59-61, las CDR VH que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 70-72 y las CDR VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 66-68, estando dispuestas las CDR VH y las CDR VL en una orientación espacial que confiere una unión específica a una región D4 del KIT humano. En ciertas realizaciones, el resto es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización particular, el resto es una proteína, tal como una proteína de fusión que comprenda una región Fc.

En aspectos específicos, en la presente memoria se proporciona un resto que comprende las CDR VH seleccionadas de las Tablas 13-15 y/o las CDR VL seleccionadas de las Tablas 10-12, estando dispuestas las CDR VH y las CDR VL en una orientación espacial que confiere una unión específica a una región D4 del KIT humano. En ciertas realizaciones, el resto es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización particular, el resto es una proteína, tal como una proteína de fusión que comprenda una región Fc.

En aspectos específicos, en la presente memoria se proporciona un resto, tal como un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende las CDR VH 1-3 y las CDR VL 1-3 seleccionadas de las presentadas en las Tablas 10-15, estando dispuestas las CDR VH y las CDR VL en una orientación espacial que confiere una unión específica a una región D4 del KIT humano. En aspectos particulares, un resto descrito en la presente memoria comprende conectores, tales como conectores de péptidos, que unen las CDR VH 1-3 y/o las CDR VL 1-3 en la orientación espacial que confiere una unión específica a una región D4 del KIT humano.

En aspectos particulares, un resto descrito en la presente memoria comprende conectores, tales como conectores de péptidos, que unen las CDR VH y/o las CDR VL en una orientación espacial que confiere una unión específica a una región D4 del KIT humano.

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las CDR VL 1-3 y las cDr VH 1-3 seleccionadas de las presentadas en las Tablas 10-15,

uniéndose inmunoespecíficamente el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, a una región D4 de KIT, tal como KIT humano.

En una realización específica, el aminoácido “X” de una CDR en una cualquiera de las Tablas 10-15 es cualquier aminoácido que se dé de forma natural que mantenga una afinidad de unión específica a una región D4 del KIT 5 humano. En una realización específica, el aminoácido “X” de una CDR en una cualquiera de las Tablas 10-15 es un aminoácido no natural que mantiene una afinidad de unión específica a una región D4 del KIT humano. En una realización específica, el aminoácido “X” de una CDR en una cualquiera de las Tablas 10-15 es una sustitución conservadora del correspondiente aminoácido de las que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1621, manteniéndose la afinidad de unión específica a una región D4 del KIT humano.

10 En una realización específica, el aminoácido “X” de una CDR en una cualquiera de las Tablas 10-15 es, independientemente, un aminoácido A, G, T, K o L. En una realización particular, el aminoácido “X” de una CDR en una cualquiera de las Tablas 10-15 es un aminoácido A, G, T, Y, C o S. En ciertos aspectos de estas realizaciones, se mantiene la afinidad de unión específica a una región D4 del KIT humano.

En cierta realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo 15 comprende las CDR VH y/o las CDR VL seleccionadas de las presentadas en las Tablas 10-15.

En una realización particular, una CDR, tal como una cualquiera de las CDR VL 1-3 y las CDR VH 1-3 representadas en las Tablas 10-15, comprende uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) aminoácidos “X”, pudiendo ser cada aminoácido “X” cualquier aminoácido que pueda mantener una unión específica del anticuerpo o el fragmento del mismo a una región D4 del KIT humano.

20 Tabla 10: CDR1 VL

CDR1 VL: SEQ ID NO:

K A S Q N V R T N V A: 19

X A S Q N V R T N V A: 74

K X S Q N V R T N V A: 75

K A X Q N V R T N V A: 76

K A S X N V R T N V A: 77

K A S Q X V R T N V A: 78

K A S Q (A/G/T/Y/C/S) V R T N V A: 79

K A S Q N X R T N V A: 80

K A S Q N V X T N V A: 81

K A S Q N V R X N V A: 82

K A S Q N V R T X V A: 83

K A S Q N V R T (A/G/T/Y/C/S) V A: 84

K A S Q N V R T N X A: 85

K A S Q N V R T N V X: 86

C K A S Q N V R T N V: 87

I C K A S Q N V R T N: 88

A S Q N V R T N V A W: 89

S Q N V R T N V A W Y: 90

Q N V R T N V A W Y Q: 91

Tabla 11: CDR2 VL

CDR2VL: SEQ ID NO:

S A S Y R Y S: 20

X A S Y R Y S: 92

S X S Y R Y S: 93

CDR2VL: SEQ ID NO:

S A X Y R Y S: 94

S A S X R Y S: 95

S A S Y X Y S: 96

S A S Y R X S: 97

S A S Y R Y X: 98

Y S A S Y R Y: 99

I Y S A S Y R: 100

L I Y S A S Y: 101

A S Y R Y S G: 102

S Y R Y S G V: 103

Y R Y S G V P: 104

Tabla 12: CDR3 VL

CDR3VL: SEQ ID NO:

Q Q Y N S Y P R T: 21

Q X Y N S Y P R T: 105

Q Q X N S Y P R T: 106

Q Q Y X S Y P R T: 107

Q Q Y N X Y P R T: 108

Q Q Y N S X P R T: 109

Q Q Y N S Y X R T: 110

Q Q Y N S Y P X T: 111

Q Q Y N S Y P R X: 112

Q Q Y N S Y P R: 113

C Q Q Y N S Y P: 114

F C Q Q Y N S Y: 115

Y F C Q Q Y N S: 116

Q Y N S Y P R F: 117

Y N S Y P R F G: 118

S Y P R F G G: 119

Tabla 13: CDR1 VH

CDR1 VH: SEQ ID NO:

D Y Y I N: 16

X Y Y I N: 120

D X Y I N: 121

D Y X I N: 122

D Y Y X N: 123

D Y Y I X: 124

T D Y Y I: 125

CDR1 VH: SEQ ID NO:

F T D Y Y: 126

T F T D Y: 127

Y Y I N W: 128

Y Y I N W V: 129

I N W V R: 130

Tabla 14: CDR2 VH

CDR2VH: SEQ ID NO:

R I Y P G S G N T Y Y N E K F K G: 17

X I Y P G S G N T Y Y N E K F K G: 131

R X Y P G S G N T Y Y N E K F K G: 132

R I X P G S G N T Y Y N E K F K G: 133

R I Y X G S G N T Y Y N E K F K G: 134

R I Y P X S G N T Y Y N E K F K G: 135

R I Y P G X G N T Y Y N E K F K G: 136

R I Y P G S X N T Y Y N E K F K G: 137

R I Y P G S G X T Y Y N E K F K G: 138

R I Y P G S G N X Y Y N E K F K G: 139

R I Y P G S G N T X Y N E K F K G: 140

R I Y P G S G N T Y X N E K F K G: 141

R I Y P G S G N T Y Y X E K F K G: 142

R I Y P G S G N T Y Y N X K F K G: 143

R I Y P G S G N T Y Y N E X F K G: 144

R I Y P G S G N T Y Y N E K X K G: 145

R I Y P G S G N T Y Y N E K F X G: 146

R I Y P G S G N T Y Y N E K F K X: 147

A R I Y P G S G N T Y Y N E K F: 148

I A R I Y P G S G N T Y Y N E K: 149

W I A R I Y P G S G N T Y Y N E: 150

I Y P G S G N T Y Y N E K F K G R: 151

Y P G S G N T Y Y N E K F K G R A: 152

P G S G N T Y Y N E K F K G R A T: 153

Tabla 15: CDR3 VH

CDR3VH: SEQ ID NO:

G V Y Y F D Y: 18

X V Y Y F D Y: 154

G X Y Y F D Y: 155

G V X Y F D Y: 156

G V Y X F D Y: 157

CDR3VH: SEQ ID NO:

G V Y Y X D Y: 158

G V Y Y F X Y: 159

G V Y Y F D X: 160

R G V Y Y F D: 161

A R G V Y Y F: 162

C A R G V Y Y: 163

G V Y Y F D Y W: 164

V Y Y F D Y W G: 165

Y Y F D Y W G Q: 166

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las FR VL 1-4 seleccionadas de las presentadas en las Tablas 20-23 y/o las FR VH 1-4 seleccionadas de las presentadas en las Tablas 16-19, uniéndose inmunoespecíficamente el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, a una región D4 de KIT, tal como KIT humano.

5 En una realización específica, el aminoácido “X” de una FR en una cualquiera de las Tablas 16-23 es cualquier aminoácido que se dé de forma natural que mantenga una afinidad de unión específica a una región D4 del KIT humano. En una realización específica, el aminoácido “X” de una CDR en una cualquiera de las Tablas 16-23 es un aminoácido no natural que mantiene una afinidad de unión específica a una región D4 del KIT humano. En una realización específica, el aminoácido “X” de una CDR en una cualquiera de las Tablas 16 -23 es una sustitución 10 conservadora del correspondiente aminoácido de las que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1621, manteniéndose la afinidad de unión específica a una región D4 del KIT humano.

En una realización específica, el aminoácido “X” de una CDR en una cualquiera de las Tablas 16-23 es un aminoácido A, G, T, K o L. En una realización particular, el aminoácido “X” de una CDR en una cualquiera de las Tablas 16-23 es un aminoácido A, G, T, Y, C o S. En ciertos aspectos de estas realizaciones, se mantiene la afinidad 15 de unión específica a una región D4 del KIT humano.

En cierta realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las CDR VH y/o las CDR VL seleccionadas de las presentadas en las Tablas 16-23.

En una realización particular, una FR, tal como una cualquiera de las FR VL 1-4 y las FR VH 1-4 representadas en las Tablas 16-23, comprende uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) aminoácidos “X”, pudiendo ser cada 20 aminoácido “X” cualquier aminoácido que pueda mantener una unión específica del anticuerpo o el fragmento del mismo a una región D4 del KIT humano.

Tabla 16: FR1 VH

: FR1 VH SEQ ID NO:

H1: QVQLVQSGAELKKPGASVKLSCKASGYTFT 33

H2/H3: QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFT 37

H4/H5: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 41

: XVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 167

: QXQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 168

: QVXLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 169

: QVQXVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 170

: QVQLXQSGAE(LN)KKPGASVK(L/)SCKASGYTFT 171

: QVQLVXSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 172

: QVQLVQXGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 173

: QVQLVQSXAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 174

: QVQLVQSGXE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 175

: FR1 VH SEQ ID NO:

: QVQLVQSGAX(L/V)KKPGASVK(L/V)SKASGYTFT 176

: QVQLVQSGAEXKKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 177

: QVQLVQSGAE(L/V)XKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 178

: QVQLVQSGAE(L/V)KXPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 179

: QVQLVQSGAE(L/V)KKXGASVK(L/V)SCKASGYTFT 180

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPXASVK(L/V)SCKASGYTFT 181

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGXSVK(L/V)SCKASGYTFT 182

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGAXVK(L/V)SCKASGYTFT 183

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASXK(L/V)SCKASGYTFT 184

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVX(L/V)SCKASGYTFT 185

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVKXSCKASGYTFT 186

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)XCKASGYTFT 187

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SXKASGYTFT 188

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCXASGYTFT 189

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKXSGYTFT 190

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKAXGYTFT 191

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASXYTFT 192

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGXTFT 193

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYXFT 194

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTXT 195

: QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFX 196

Tabla 17: FR2 VH

: FR2 VH SEQ ID NO:

H1/H2: WVKQAPGKGLEWIA 34

H3/H4/H5: WVRQAPGKGLEWIA 39

: XV(R/K)QAPGKGLEWIA 197

: WX(R/K)QAPGKGLEWIA 198

: WVXQAPGKGLEWIA 199

: WV(R/K)XAPGKGLEWIA 200

: WV(R/K)QXPGKGLEWIA 201

: WV(R/K)QAXGKGLEWIA 202

: WV(R/K)QAPXKGLEWIA 203

: WV(R/K)QAPGXGLEWIA 204

: WV(R/K)QAPGKXLEWIA 205

: WV(R/K)QAPGKGXEWIA 206

: WV(R/K)QAPGKGLXWIA 207

: WV(R/K)QAPGKGLEXIA 208

: WV(R/K)QAPGKGLEWXA 209

: WV(R/K)QAPGKGLEWIX 210

: FR3 VH SEQ ID NO:

H1: RATLTAEKSTSTAYMQLSSLRSEDSAVYFCAR 35

H2: RATLTAEKSTSTAYMQLSSLRSEDTAVYFCAR 38

H3: RATLTADKSTSTAYMQLSSLRSEDTAVYFCAR 40

H4: RATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAR 42

H5: RVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAR 43

: X (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 211

: RXT (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 212

: R (A/V) X (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 213

: R (A/V) TXTADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 214

: R (A/V) T (I/L) XADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 215

: R (A/V) T (I/L) TXDKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 216

: R (A/V) T (I/L) TAXKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 217

: R (A/V) T (I/L) TADXSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 218

: R (A/V) T (I/L) TADKXTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 219

: R (A/V) T (I/L) TADKSXSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 220

: R (A/V) T (I/L) TADKSTXTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 221

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSXAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 222

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTXYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 223

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAXM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 224

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYX (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAR 225

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYMXLSSLRSED (S/T) AVYFCAR 226

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) XSSLRSED (S/T) AVYFCAR 227

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LXSLRSED (S/T) AVYFCAR 228

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSXLRSED (S/T) AVYFCAR 229

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSXRSED (S/T) AVYFCAR 230

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLXSED (S/T) AVYFCAR 231

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRXED (S/T) AVYFCAR 232

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSXD (S/T) AVYFCAR 233

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSEX (S/T) AVYFCAR 234

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSEDXAVYFCAR 235

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) XVYFCAR 236

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AXYFCAR 237

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVXFCAR 238

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYXCAR 239

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFXAR 240

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCXR 241

: R (A/V) T (I/L) TADKSTSTAYM (E/Q) LSSLRSED (S/T) AVYFCAX 242

: FR4 VH SEQ ID NO:

H1-H5: WGQGTTVTVSS 36

: XGQGTTVTVSS 243

: WXQGTTVTVSS 244

: WGXGTTVTVSS 245

: WGQXTTVTVSS 246

: WGQGXTVTVSS 247

: WGQGTXVTVSS 248

: WGQGTTXTVSS 249

: WGQGTTVXVSS 250

: WGQGTTVTXSS 251

: WGQGTTVTVXS 252

: WGQGTTVTVSX 253

Tabla 20: FR1 VL

: FR1 VL SEQ ID NO:

L1: DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC 44

L2/L3/L4: DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITC 48

: XIVMTQSPS (F/S) LSASVGDRVTITC 254

: DXVMTQSPS (F/S) LSASVGDRVTITC 255

: DIXMTQSPS (F/S) LSASVGDRVTITC 256

: DIVXTQSPS (F/S) LSASVGDRVTITC 257

: DIVMXQSPS (F/S) LSASVGDRVTITC 258

: DIVMTXSPS (F/S) LSASVGDRVTITC 259

: DIVMTQXPS (F/S) LSASVGDRVTITC 260

: DIVMTQSXS (F/S) LSASVGDRVTITC 261

: DIVMTQSPX (F/S)LSASVGDRVTITC 262

: DIVMTQSPSXLSASVGDRVTITC 263

: DIVMTQSPS (F/S) XSASVGDRVTITC 264

: DIVMTQSPS (F/S) LXASVGDRVTITC 265

: DIVMTQSPS (F/S) LSXSVGDRVTITC 266

: DIVMTQSPS (F/S) LSAXVGDRVTITC 267

: DIVMTQSPS (F/S) LSASXGDRVTITC 268

: DIVMTQSPS (F/S) LSASVXDRVTITC 269

: DIVMTQSPS (F/S) LSASVGXRVTITC 270

: DIVMTQSPS (F/S) LSASVGDXVTITC 271

: DIVMTQSPS (F/S) LSASVGDRXTITC 272

: DIVMTQSPS (F/S) LSASVGDRVXITC 273

: DIVMTQSPS (F/S) LSASVGDRVTXTC 274

: DIVMTQSPS (F/S) LSASVGDRVTIXC 275

: FR1 VL SEQ ID NO:

: DIVMTQSPS (F/S) LSASVGDRVTITX 276

Tabla 21: FR2 VL

: FR2 VL SEQ ID NO:

L1/L2/L3: WYQQKPGKAPKALIY 45

L4: WYQQKPGKAPKSLIY 51

: XYQQKPGKAPK (S/A) LIY 277

: WXQQKPGKAPK (S/A) LIY 278

: WYXQKPGKAPK (S/A) LIY 279

: WYQXKPGKAPK (S/A) LIY 280

: WYQQXPGKAPK (S/A) LIY 281

: WYQQKXGKAPK (S/A) LIY 282

: WYQQKPXKAPK (S/A) LIY 283

: WYQQKPGXAPK (S/A) LIY 284

: WYQQKPGKXPK (S/A) LIY 285

: WYQQKPGKAXK (S/A) LIY 286

: WYQQKPGKAPX (S/A) LIY 287

: WYQQKPGKAPKXLIY 288

: WYQQKPGKAPK (S/A) XIY 289

: WYQQKPGKAPK (S/A) LXY 290

: WYQQKPGKAPK (S/A) LIX 291

Tabla 22: FR3 VL

: FR3 VL SEQ ID NO:

L1: GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQSEDFADYFC 46

L2: GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFC 49

L3: GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFC 50

L4: GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 52

: XVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQ(P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y)C 292

: GXPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 293

: GVXDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 294

: GVPXRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 295

: GVPDXF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 296

: GVPDRX (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 297

: GVPDRFXGSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFA(D/T)Y (F/Y)C 298

: GVPDRF (S/T) XSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 299

: GVPDRF (S/T) GXGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 300

: GVPDRF (S/T) GSXSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 301

: GVPDRF (S/T) GSGXGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 302

: GVPDRF (S/T) GSGSXTDFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 303

: FR3 VL SEQ ID NO:

: GVPDRF (S/T) GSGSGXDFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 304

: GVPDRF (S/T) GSGSGTXFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 305

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDXTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 306

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFXLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 307

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTXTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 308

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLXISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 309

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTXSSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 310

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTIXSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 311

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISXLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 312

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSXQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 313

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLX (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) C 314

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQXEDFA(D/T)Y(F/Y)C 315

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) XDFA (D/T) Y (F/Y) C 316

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EXFA (D/T) Y (F/Y) C 317

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDXA (D/T) Y (F/Y) C 318

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFX (D/T) Y (F/Y) C 319

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFAXY (F/Y) C 320

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) X (F/Y) C 321

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) YXC 322

: GVPDRF (S/T) GSGSGTDFTLTISSLQ (P/S) EDFA (D/T) Y (F/Y) X 323

Tabla 23: FR4 VL

: FR4 VL SEQ ID NO:

L1-L4: FGGGTKVEIK 47

: XGGGTKVEIK 324

: FXGGTKVEIK 325

: FGXGTKVEIK 326

: FGGXTKVEIK 327

: FGGGXKVEIK 328

: FGGGTXVEIK 329

: FGGGTKXEIK 330

: FGGGTKVXIK 331

: FGGGTKVEXK 332

: FGGGTKVEIX 333

En un aspecto, un anticuerpo descrito en la presente memoria comprende una región Fc que comprende una o más deleciones, adiciones y/o modificaciones de aminoácidos.

Una “región Fc”, según se usa en la presente memoria, incluye polipéptidos que comprenden una región constante 5 de un anticuerpo que excluye el primer dominio de inmunoglobulina de la región constante y, así, se refiere a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de la región constante, de IgA, IgD e IgG, los tres últimos dominios de inmunoglobulina de la región constante de IgE e IgM, y el N-terminal de la bisagra flexible a estos dominios. Para la IgA y la IgM, una región Fc puede incluir la cadena J. Para la IgG, una región Fc puede comprender dominios de inmunoglobulina Cgamma2 y Cgamma3 (Cy2 y Cy3) y la bisagra entre Cgammal (Cy1) y Cgamma2 (Cy2). Aunque 10 los límites de una región Fc pueden variar, la región Fc de cadena pesada de la IgG humana generalmente

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comprende residuos C226 o P230 a su terminal carboxilo, siendo la numeración según el Índice EU, como en Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Virginia). El “índice EU definido en Kabat” se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo EU de la IgG1 humana según se describe en Kabat et al. supra. En cierta realización, una región Fc comprende una región Fc que no se da de forma natural. En ciertos aspectos, hay presentes uno o más polimorfismos en una o más posiciones de Fc, incluyendo, sin limitación, Kabat 270, 272, 312, 315, 356 y 358.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo, descrito en la presente memoria, que se une específicamente a una región D4 de KIT, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región Fc que tiene propiedades de unión alteradas para un ligando de Fc (por ejemplo, un receptor Fc, tal como C1q) con respecto a un anticuerpo comparable (por ejemplo, uno que tenga la misma secuencia de aminoácidos, salvo en que tiene una región Fc de la forma natural).

Las afinidades y las propiedades de unión de una región Fc para su ligando pueden ser determinadas mediante diversos métodos de ensayo in vitro (ensayos de tipo bioquímico o inmunológico) conocidos en la técnica para determinar las interacciones Fc-FcyR, es decir, la unión específica de una región Fc a una FcyR, incluyendo, sin limitación, métodos de equilibrio (por ejemplo, el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), o el radioinmunoensayo (RIA)), o la cinética (por ejemplo, análisis BIACORE®), y otros métodos, tales como ensayos de unión indirecta, ensayos de inhibición competitiva, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), electroforesis y cromatografía en gel (por ejemplo, filtración en gel). Estos y otros métodos pueden utilizar un marcador en uno o más de los componentes que se estén examinando y/o emplear diversos métodos de detección, incluyendo, sin limitación, marcadores cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes o isotópicos.

En una realización, una región Fc de un anticuerpo descrito en la presente memoria tiene una unión mejorada a uno o más ligandos de Fc con respecto a una molécula comparable. En una realización específica, una región Fc de un anticuerpo descrito en la presente memoria tiene una unión mejorada a un receptor Fc. En otra realización específica, una región Fc de un anticuerpo descrito en la presente memoria tiene una unión mejorada al receptor Fc FcyRIIIA. En una realización específica, una región Fc de un anticuerpo descrito en la presente memoria tiene una unión mejorada al receptor Fc FcRn. En otra realización específica, una región Fc de un anticuerpo descrito en la presente memoria tiene una unión mejorada a C1q con respecto a una molécula comparable.

En cierto aspecto, la vida media sérica de las proteínas que comprenden regiones Fc puede ser aumentada incrementando la afinidad de unión de la región Fc hacia FcRn. En una realización, una región Fc de un anticuerpo descrito en la presente memoria tiene una vida media sérica mejorada con respecto a una molécula comparable.

“Citotoxicidad arbitrada por células dependiente de anticuerpos” o “ADCC” se refiere a una forma de citotoxicidad en la que la Ig segregada unida a los receptores Fc (FcRs) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas (NK), neutrófilos y macrófagos) permite que estas células citotóxicas se unan específicamente a una célula diana portadora de un antígeno y, posteriormente, maten a la célula diana con citotoxinas. Anticuerpos específicos de IgG de alta afinidad dirigidos a la superficie de las células diana “arman” las células citotóxicas para tal muerte. La lisis de la célula diana implica un contacto directo entre células, y no implica complemento. Se contempla que, además de anticuerpos, otras proteínas que comprendan regiones Fc, específicamente proteínas de fusión de Fc, que tengan la capacidad de unirse específicamente a una célula diana portadora de un antígeno, puedan efectuar la citotoxicidad arbitrada por células. En aras de la simplicidad, la citotoxicidad arbitrada por células resultante de la actividad de una proteína de fusión de Fc también es denominada en la presente memoria actividad ADCC.

Se puede someter a ensayo la capacidad de cualquier proteína particular —por ejemplo, un anticuerpo— que comprenda una región Fc para arbitrar la lisis de la célula diana por ADCC. Para evaluar la actividad ADCC de una región Fc, se añade un anticuerpo de unión a células diana que comprende la región Fc a células diana en combinación con células efectoras inmunitarias, que pueden ser activadas por los complejos antígeno-anticuerpo, dando como resultado la citólisis de la célula diana. La citólisis se detecta generalmente por la liberación del marcador (por ejemplo, sustratos radiactivos, tinciones fluorescentes o proteínas intercelulares naturales) de las células lisadas. Células efectoras útiles para tales ensayos incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células asesinas (NK). Ejemplos específicos de ensayos de ADCC in vitro aparecen descritos en Wisecarver et al., 1985 79:277-282; Bruggemann et al., 1987, J Exp. Med. 166:1351-1361; Wilkinson et al., 2001, J Immunol. Methods 258:183-191; Patel et al., 1995 J Immunol. Methods 184:29-38. Alternativamente, o además, la actividad ADCC de una proteína que comprende una región Fc puede ser evaluada in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el dado a conocer en Clynes et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656.

En una realización, una proteína —por ejemplo, un anticuerpo descrito en la presente memoria— que comprende una región Fc tiene mayor actividad ADCC con respecto a una proteína comparable —por ejemplo, un anticuerpo—. En otra realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria que comprende una región Fc tiene una unión mejorada al receptor Fc FcyRIIIA y tiene mayor actividad ADCC con respecto a un anticuerpo a comparable. En algunas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria que comprende una región Fc tiene tanto mayor actividad ADCC como mayor vida media sérica en comparación con un anticuerpo comparable.

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“Citotoxicidad dependiente de complemento” y “CDC” se refiere al lisado de una célula diana en presencia de un complemento. El sistema de activación del complemento es iniciado por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) con una molécula —por ejemplo, un anticuerpo— que forma un complejo con un antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, puede llevarse a cabo, por ejemplo, un ensayo de CDC, según se describe en Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria que comprende una región Fc tiene mayor actividad CDC en comparación con un anticuerpo comparable. En otras realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria que comprende una región Fc tiene tanto mayor actividad CDC como mayor vida media sérica en comparación con un anticuerpo comparable.

En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria comprende una región Fc que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución una deleción o una adición) o un residuo de aminoácido que no se dé de forma natural en una o más posiciones (por ejemplo, en una, dos, tres o cuatro posiciones) seleccionadas del grupo constituido por 234, 235, 236, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 252, 254, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 332, 333 y 334 según numera el índice EU definido en Kabat. Opcionalmente, la región Fc puede comprender una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución una deleción o una adición) o un residuo de aminoácido que no se dé de forma natural en posiciones adicionales y/o alternativas conocidas para un experto en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.624.821; 6.277.375; 6.737.056; las publicación de patentes de PCT WO 01/58957; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752 y WO 05/040217, en particular para la divulgación de tales modificaciones). En una realización adicional, una o más funciones de una región Fc son mantenidas (por ejemplo, sustancialmente mantenidas; por ejemplo, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%) por la región Fc que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución una deleción o una adición) o un residuo de aminoácido que no se dé de forma natural en una o más posiciones. Por ejemplo, tales funciones Fc pueden incluir una función efectora, tal como CDC o ADCC, o la afinidad de unión a un receptor Fc. En cierta realización, la región Fc, que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución una deleción o una adición) o un residuo de aminoácido que no se dé de forma natural en una o más posiciones, presenta al menos uno o más de una mayor actividad Fc —por ejemplo, mayor vida media— o una función efectora, tal como ADCC o CDC, mejorada. En una realización particular, la región Fc, que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución una deleción o una adición) o un residuo de aminoácido que no se dé de forma natural en una o más posiciones, presenta una menor actividad Fc —por ejemplo, menor estabilidad/vida media— o una función efectora, tal como ADCC o CDC, disminuida.

En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria comprende una región Fc, comprendiendo la región Fc al menos una (por ejemplo, una, dos, tres o cuatro) modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución una deleción o una adición) o al menos un residuo de aminoácido que no se dé de forma natural (por ejemplo, uno, dos, tres o cuatro) seleccionadas del grupo constituido por 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241Y, 241E, 241 R. 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247V, 247G, 252Y, 254T, 256E, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 269H, 269Y, 269F, 269R, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 313F, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y y 332A según numera el índice EU definido en Kabat. Opcionalmente, la región Fc puede comprender residuos de aminoácido adicionales y/o alternativos o que no se den de forma natural conocidos para un experto en la técnica (véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.624.821; 6.277.375; 6.737.056; las publicaciones de patentes de PCT WO 01/58957; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752 y WO 05/040217).

En cierto aspecto, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc, comprendiendo la región Fc al menos un aminoácido que no se da de forma natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo constituido por 239, 330 y 332, según numera el índice EU definido en Kabat. En una realización específica, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc, comprendiendo la región Fc al menos un aminoácido que no se da de forma natural seleccionado del grupo constituido por 239D, 330L y 332E, según numera el índice EU definido en Kabat. Opcionalmente, la región Fc puede comprender, además, un aminoácido adicional que no se da de forma natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo constituido por 252, 254 y 256, según numera el índice EU definido en Kabat. En una realización específica, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc, comprendiendo la región Fc al menos un aminoácido que no se da de forma natural seleccionado del grupo constituido por 239D, 330L y 332E, según numera el índice EU definido en Kabat y al menos un aminoácido que no se da de forma natural en una o más posiciones, que se seleccionan del grupo constituido por 252Y, 254T y 256E, según numera el índice EU definido en Kabat. En una realización, una región Fc que comprende tal secuencia presenta una o más actividades Fc; por ejemplo, afinidad de unión a un receptor Fc o función efectora, tal como ADCC o CDC. En una realización específica, una región Fc que comprende tal secuencia presenta una actividad Fc reducida; por ejemplo, afinidad de unión reducida a un receptor Fc o función efectora, tal como ADCC o CDC,

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reducida. En una realización particular, una región Fc que comprende tal secuencia presenta una actividad Fc mejorada; por ejemplo, mayor vida media, afinidad de unión mejorada a un receptor Fc, o función efectora, tal como ADCC o CDC, mejorada.

Ghetie et al., 1997, Nat Biotech. 15:637-40; Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J. Immunol 147:2657-2662; Lund et al, 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferis et al, 1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al, 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al, 2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddy et al, 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al, 2001, J Immunol 166:2571 - 2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490); las patentes estadounidenses nos 5.624.821; 5.885.573; 5.677.425; 6.165.745; 6.277.375; 5.869.046; 6.121.022; 5.624.821; 5.648.260; 6.528.624; 6.194.551; 6.737.056; 6.821.505, 6.277.375; 8.163.882; 7.355.008; 7.960.512; 8.039.592; 8.039.359; 8.101.720; 7.214.775; 7.682.610; 7.741.442; la publicación de patente estadounidense n° 2004/0002587 y las publicaciones PCT WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351 proporcionan ejemplos no limitantes de modificaciones de la región Fc.

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria comprende una o más (por ejemplo, una, dos, tres o cuatro) modificaciones a una región Fc de IgG1, tal como una región Fc IgG1 humana. En cierta realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria comprende una o más (por ejemplo, una, dos, tres o cuatro) modificaciones a una región Fc de IgG2, tal como una región Fc IgG2 humana. En una realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria comprende una o más (por ejemplo, una, dos, tres o cuatro) modificaciones a una región Fc de IgG4, tal como una región Fc IgG4 humana.

En algunos aspectos, un anticuerpo descrito en la presente memoria comprende una región Fc, comprendiendo la región Fc una o más (por ejemplo, una, dos, tres o cuatro) modificaciones de glucoformas (por ejemplo, la eliminación o la sustitución de una o más glucoformas), tales como glucoformas de diseño; es decir, una composición de hidrato de carbono que está covalentemente unida a una molécula que comprende una región Fc. Las glucoformas de diseño pueden ser útiles para diversos fines, incluyendo, sin limitación, potenciar o reducir la función efectora. Las glucoformas de diseño pueden ser generadas por cualquier método conocido para un experto en la técnica; por ejemplo usando cepas de diseño o de expresión variante, mediante coexpresión con una o más enzimas —por ejemplo DI N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTI11)—, expresando una molécula que comprende una región Fc en diversos organismos o líneas celulares de diversos organismos, o modificando uno varios hidratos de carbono después de que la molécula que comprende la región Fc haya sido expresada. En la técnica se conocen métodos para la generación de glucoformas de diseño, e incluyen, sin limitación, los descritos en Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473), la patente estadounidense n° 6.602.684; la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2003/0157108 A1; la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2003/0003097 A1; el documento PCT WO 00/61739A1; el documento PCT WO 01/292246A1; el documento PCT WO 02/311140A1; el documento PCT WO 02/30954A1; el documento WO 00061739; el documento US 20030115614; y Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49. En la técnica se describen métodos para generar glucoformas modificadas de un anticuerpo descrito en la presente memoria, e incluyen, sin limitación, los escritos en la patente estadounidense n° 7.517.670; en la patente estadounidense n° 8.021.856; en la patente estadounidense n° 8.080.415; en la patente estadounidense n° 8.084.222; en la patente estadounidense n° 7.700.321; y en la patente estadounidense n° 8.071.336.

En una realización particular, glucosilación de una región Fc puede ser modificada para aumentar o disminuir la función efectora. En consecuencia, en una realización, una región Fc de un anticuerpo descrito en la presente memoria comprende glucosilación modificada de residuos de aminoácido. En otra realización, la glucosilación modificada de residuos de aminoácido da lugar a una función efectora, tal como ADCC o CDC, disminuida. En otra realización, la glucosilación modificada de los residuos de aminoácido da lugar a una función efectora incrementada. En algunas realizaciones, los patrones de glucosilación de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria son modificados para potenciar la función efectora de ADCC y CDC (véanse, por ejemplo, Shields et al., (2002) JBC. 277:26733; Shinkawa et al., (2003) JBC. 278:3466 y Okazaki et al., (2004) J. Mol. Biol., 336: 1239). En una realización específica, tal glucosilación modificada es diferente de la glucosilación de una región Fc encontrada de forma natural in vivo, o tal glucosilación modificada es una glucosilación que no se da de forma natural de una región Fc. Por ejemplo, puede lograrse la glucosilación modificada de una región Fc modificando un aminoácido o expresando la proteína o el anticuerpo en una célula que ha sido diseñada para que contenga una maquinaria de glucosilación diferente de la de su célula progenitora que no ha sido modificada. En este sentido, tal célula puede ser diseñada para que no exprese cierta enzima de glucosilación o para que exprese cierta enzima de glucosilación que no está presente en la célula progenitora.

En la técnica se conocen métodos para generar regiones Fc que no se dan de forma natural. Por ejemplo, pueden generarse sustituciones y/o deleciones de aminoácidos por métodos de mutagénesis, incluyendo, sin limitación, una mutagénesis dirigida al sitio (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)), mutagénesis por PCR (Higuchi,

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en “PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”, Academic Press, San Diego, pp. 177-183 (1990)), y mutagénesis por inserción de un casete (Wells et al., Gene 34:315-323 (1985)). La mutagénesis dirigida al sitio se puede llevar a cabo por el método de PCR de superposición y extensión (Higuchi, en “PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification”, Stockton Press, Nueva York, pp. 61-70 (1989)). Alternativamente, puede usarse la técnica de PCR de superposición y extensión (Higuchi, ibíd.) para introducir cualquier mutación o mutaciones cualesquiera en una secuencia diana (el ADN de partida). En la técnica se conocen otros métodos útiles para la generación de modificaciones en la región Fc (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos 5.624.821; 5.885.573; 5.677.425; 6.165.745; 6.277.375; 5.869.046; 6.121.022; 5.624.821; 5.648.260; 6.528.624; 6.194.551; 6.737.056; 6.821.505; 6.277.375; la publicación de patente estadounidense n° 2004/0002587 y las publicaciones PCT WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351).

En una realización específica, la región Fc tiene fucosilación reducida. En otra realización, la región Fc está afucosilada (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n° 2005/0226867).

En cierto aspecto, un anticuerpo descrito en la presente memoria es un anticuerpo no fucosilado; por ejemplo, a una región Fc del anticuerpo no contiene cadenas de azúcar con una fucosa —por ejemplo, una fucosa unida a N- acetilglucosaminas (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos 7.214.775; 7.682.610; y 7.741.442)—. En la técnica se conocen métodos para hacer anticuerpos no fucosilados (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n° 7,708,992. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos no fucosilados usando células anfitrionas de diseño; véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos 6.946.292; 7.425.446; 8.067.232; 7.846.725; y 7.393.683. También se han descrito animales con genes bloqueados para generar anticuerpos no fucosilados; véase, por ejemplo, la patente estadounidense n° 7.737.325. En una realización particular, un anticuerpo no fucosilado descrito en la presente memoria, que se une específicamente a una región D4 del KIT humano, presenta mayor ADCC.

En un aspecto particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria comprende un contenido de fucosa inferior al 100%, por ejemplo, inferior al 65%, con respecto al contenido de fucosa de un anticuerpo de referencia (véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos 7.931.895 y 7.846.434). En cierta realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria se caracteriza por un contenido de fucosa en el que al menos aproximadamente el 60% de los oligosacáridos de enlace N —por ejemplo, oligosacáridos de enlace N en los dominios con derivación CH2— no contiene fucosa alguna. En realizaciones específicas, el porcentaje de oligosacáridos de enlace N —por ejemplo, oligosacáridos de enlace N en los dominios con derivación CH2— que no contiene fucosa alguna es de al menos aproximadamente el 65%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95% o más, y presenta una función efectora alterada; por ejemplo, mayor ADCC o ADCC reducida. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une específicamente a una región D4 del KIT humano, comprende un contenido de fucosa inferior al 65% y presenta mayor ADCC.

En aspectos particulares, un anticuerpo descrito en la presente memoria comprende una región Fc con una actividad de unión alterada de FcyR que presenta una unión reducida a una FcyR y comprende una modificación de aminoácidos en una o más (por ejemplo, una, dos, tres o cuatro) posiciones cualesquiera de aminoácidos 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 o 439 de la región Fc, siendo la numeración de los residuos en la región Fc la del índice EU como en Kabat (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n° 7.183.387). Por ejemplo, un anticuerpo descrito en la presente memoria que comprende una región Fc presenta una unión reducida a una FcyR y comprende una modificación de aminoácidos en una o más (por ejemplo, una, dos, tres o cuatro) posiciones cualesquiera de aminoácidos 238, 265, 269, 270, 327 o 329 de la región Fc, siendo la numeración de los residuos en la región Fc la del índice EU como en Kabat.

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria que comprende una región Fc presenta una unión reducida a una FcyRII y comprende una modificación de aminoácidos en una o más (por ejemplo, una, dos, tres o cuatro) posiciones cualesquiera de aminoácidos 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 o 439 de la región Fc, siendo la numeración de los residuos en la región Fc la del índice EU como en Kabat.

En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria que comprende una región Fc presenta una unión reducida a una FcyRIII y comprende una modificación de aminoácidos en una o más (por ejemplo, una, dos, tres o cuatro) posiciones cualesquiera de aminoácidos 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 o 437 de la región Fc, siendo la numeración de los residuos en la región Fc la del índice EU como en Kabat.

En ciertos aspectos, la vida media sérica de una proteína, tal como un anticuerpo descrito en la presente memoria, que comprende una región Fc, se incrementa aumentando la afinidad de unión de una región Fc hacia FcRn.

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En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano) con un valor de CE50 (máxima concentración media efectiva) de aproximadamente 50 nM o menor determinado por ELISA.

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano) con un valor CE50 de aproximadamente 150 pM o menor determinado por FACS con células CHO-WT-KIT (células CHO diseñadas para expresar de forma recombinante el KIT humano de la forma natural).

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), es capaz de bloquear la fosforilación de KIT con un valor de CI50 (concentración de inhibición del 50%) de aproximadamente 600 pM o menos.

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), es expresado de forma recombinante en células CHO con una concentración media de al menos 0,5 pg/mL. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), es expresado de forma recombinante en células CHO con una concentración media de al menos 1,0 pg/mL.

En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano), comprende un dominio VH y un dominio VL que son no inmunogénicos; por ejemplo, el dominio VH y el dominio VL no contienen epítopos de células T.

En realizaciones particulares, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno

del mismo) no se une al sitio de KIT de unión a ligandos extracelulares; por ejemplo, el sitio de KIT de unión al SCF.

del mismo) no inhibe la unión de ligandos a KIT; por ejemplo, no inhibe que un ligando de KIT (por ejemplo, el SCF)

se una a KIT.

En aspectos específicos, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanos o humanizados) descritos en la presente memoria son anticuerpos inhibidores; es decir, anticuerpos que inhiben (por ejemplo, que inhiben parcialmente) la actividad del KIT; es decir, una o más actividades de KIT. En una realización específica, una inhibición parcial de una actividad del KIT da lugar, por ejemplo, a una inhibición de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 65% o el 75%. En una realización específica, una inhibición parcial de una actividad del KIT da lugar, por ejemplo, a una inhibición de aproximadamente el 35% a aproximadamente el 85% o el 95%. Ejemplos no limitantes de actividades de KIT incluyen la dimerización del KIT, la fosforilación del KIT (por ejemplo, la fosforilación de la tirosina), la señalización aguas abajo del KIT (por ejemplo, la señalización Stat, AKT, MAPK, o Ras), la inducción o la potenciación de la transcripción génica (por ejemplo, c-Myc), la inducción o la potenciación de la proliferación celular o de la supervivencia celular. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria inhibe la fosforilación del KIT (por ejemplo, la fosforilación inducida por ligandos). En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria inhibe la fosforilación de la tirosina de KIT en el dominio citoplasmático de KIT. En otra realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria inhibe la proliferación celular. En otra realización particular adicional, un anticuerpo descrito en la presente memoria inhibe la supervivencia celular. En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria induce la apoptosis. En otra realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria induces la diferenciación celular; por ejemplo, la diferenciación celular en una célula que expresa el KIT; por ejemplo, del KIT humano. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria inhibe actividad del KIT, pero no inhibe la dimerización del KIT. En otra realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria inhibe la actividad del KIT y no inhibe la unión de ligandos al KIT; por ejemplo, no inhibe que un ligando de KIT (por ejemplo, el SCF) se una a KIT, pero sí inhibe la dimerización del KIT.

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria inhibe una actividad del KIT, tal como la fosforilación de la tirosina inducida por ligandos de un dominio citoplasmático de KIT, en aproximadamente entre un 25% y aproximadamente un 65% o un 75%, según determina un ensayo de fosforilación de tipo celular bien conocido en la técnica; por ejemplo, el ensayo de fosforilación a base de células descrito en la presente memoria. En cierta realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria inhibe una actividad del KIT, tal como la fosforilación de la tirosina inducida por ligandos de un dominio citoplasmático de KIT, en aproximadamente entre un 35% y aproximadamente un 85% o un 95%, según determina un ensayo de fosforilación a base de células bien conocido en la técnica; por ejemplo, el ensayo de fosforilación a base de células descrito en la presente memoria. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo, inhibe una actividad del KIT, tal como la fosforilación de la tirosina inducida por ligandos de un dominio citoplasmático de KIT, con una concentración de inhibición del 50% (CI50) inferior a aproximadamente 600 pM, o inferior a aproximadamente 500 pM, o inferior a aproximadamente 250 pM, según determina un ensayo de fosforilación a base de células bien conocido en la técnica; por ejemplo, el ensayo de

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fosforilación a base de células descrito en la presente memoria. En una realización específica, la CI50 es inferior a aproximadamente 550 pM o a 200 pM. En una realización específica, la CI50 está en el intervalo de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 225 pM, o en el intervalo de 100 pM a aproximadamente 600 pM. En una realización específica, la CI50 está en el intervalo de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 550 pM, o de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 600 pM, o de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 550 pM.

En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo, (i) se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT que comprende la región D4 del KIT humano, (ii) inhibe la fosforilación del KIT (por ejemplo, la fosforilación de la tirosina), y (iii) no afecta que el ligando de KIT (por ejemplo, el SCF) se una al KIT. En otra realización específica adicional, tal anticuerpo no inhibe la dimerización del KIT. En otra realización específica adicional, tal anticuerpo puede ser expresado de forma recombinante por células CHO con una concentración media de al menos 0,5 pg/mL, por ejemplo al menos 1,0 pg/mL. En una realización específica adicional, tal anticuerpo comprende un dominio VH y un dominio VL que son no inmunogénicos; por ejemplo, el dominio VH y el dominio VL no contienen epítopos de células T.

En otras realizaciones específicas, un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo, se une inmunoespecíficamente a una forma monomérica de KIT (por ejemplo, del KIT humano). En realizaciones particulares, un anticuerpo descrito en la presente memoria no se une inmunoespecíficamente a una forma monomérica de KIT (por ejemplo, del KIT humano). En realizaciones específicas, un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo, se une inmunoespecíficamente a una forma dimérica de KIT (por ejemplo, del KIT humano). En realizaciones específicas, un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo, no se une a una forma monomérica de KIT y se une específicamente a una forma dimérica de KIT o a una forma multimérica de KIT. En ciertas realizaciones, un anticuerpo tiene mayor afinidad hacia un monómero de KIT que hacia un dímero de KIT. En ciertas realizaciones, un anticuerpo tiene mayor afinidad hacia un monómero de KIT que hacia un multímero de KIT.

En realizaciones específicas, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo) se une específicamente a una isoforma nativa o una variante nativa de KIT (es decir, una isoforma o una variante de KIT que se den de forma natural en un animal (por ejemplo, mono, ratón, cabra, asno, perro, gato, conejo, cerdo, rata, un ser humano, o rana o un ave) que pueda ser aislada de un animal, preferentemente un ser humano). En realizaciones particulares, un anticuerpo descrito en la presente memoria se une inmunoespecíficamente a KIT humano o un fragmento del mismo. En realizaciones específicas, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo) se une específicamente a KIT humano o un fragmento del mismo y no se une específicamente a un KIT no humano (por ejemplo, de mono, ratón, cabra, asno, perro, gato, conejo, cerdo, rata o ave) o un fragmento del mismo. En realizaciones específicas, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo) se une específicamente a KIT humano o un fragmento del mismo y no se une específicamente a KIT murino. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria se une específicamente a KIT humano o un fragmento del mismo (por ejemplo, a una región D4 del KIT humano) y a KIT canino (de perro) y de primate no humano (por ejemplo, mono). En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria se une específicamente a KIT humano o un fragmento del mismo (por ejemplo, a una región D4 del KIT humano) y a KIT canino (de perro). En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria se une específicamente a KIT humano o un fragmento del mismo (por ejemplo, a una región D4 del KIT humano) y a KIT de un primate no humano (por ejemplo, mono). En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria se une específicamente a KIT humano o un fragmento del mismo (por ejemplo, a una región D4 del KIT humano) y a KIT canino (de perro) y de primate no humano (por ejemplo, mono), pero no se une específicamente a KIT murino o un fragmento del mismo (por ejemplo, una región D4 de KIT murino).

En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un dominio extracelular del KIT humano que comprende una mutación; por ejemplo, una mutación somática asociada con el cáncer (por ejemplo, GIST), tal como una mutación en el exón 9 del KIT humano en la que están duplicados los residuos Ala y Tyr en las posiciones 502 y 503. En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un dominio extracelular del KIT humano de la forma natural y a un dominio extracelular del KIT humano que comprende una mutación, por ejemplo una mutación somática asociada con el cáncer (por ejemplo, GIST), tal como una mutación en el exón 9 del KIT humano en la que están duplicados los residuos Ala y Tyr en las posiciones 502 y 503 (véanse, por ejemplo, Marcia et al., (2000) Am. J. Pathol. 156(3):791-795; y Debiec-Rychter et al., (2004) European Journal of Cáncer. 40:689- 695, que describen mutaciones de KIT).

En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un dominio extracelular del KIT humano que está glucosilado. En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une a dos formas glucosiladas diferentes de un dominio extracelular del KIT humano. Por ejemplo, por inmunotransferencia se han

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observado dos formas del KIT humano con diferentes pesos moleculares, lo que indica diferentes patrones de glucosilación. En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria puede unirse específicamente a estos dos formas del KIT humano que tienen diferentes patrones de glucosilación; por ejemplo, una forma está más glucosilada que la otra. En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un dominio extracelular del KIT humano que no está glucosilado.

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria no se une inmunoespecíficamente aun epítopo de KIT descrito por la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2008/153926; por ejemplo un epítopo constituido esencialmente por la secuencia de aminoácidos SELHLTRLKGTEGGTYT (SEQ ID NO: 38) o LTRLKGTEGG (SEQ ID NO: 39).

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria no es un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por: anticuerpo SR-1 (véanse la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2007/0253951 A1; la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2007/127317); anticuerpo anti KIT obtenido de líneas celulares de hibridoma DSM ACC 2007, DSM ACC 2008, o DSM ACC 2009, que han sido depositadas en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSM, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braumschweig, Alemania (véanse la patente estadounidense n° 5,545,533; la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 92/ 021766); anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma DSM ACC 2247 (o A3C6E2; depósito n° DSM ACC 2247, en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSM, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braumschweig, Alemania) (véase la patente estadounidense n° 5,808,002); y anticuerpos anti KIT designados K27, K44, K45, K49, K57, K69 y K94 (véanse, por ejemplo, Blechman et al., Stem Cells, 1993, 11:12-21; Blechman et al., Cell, 1995, 80:103-113; Lev et al., Mol. Cell. Biol., 1993, 13:2224-2234; y la publicación de solicitud de patente europea n° EP0548867 A2). En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria no comprende una CDR de un anticuerpo seleccionado de tal grupo. En realizaciones particulares, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria no comprende una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis) CDR (por ejemplo, 3 CDR VL y/o 3 CDR VH) de un anticuerpo seleccionado de tal grupo. En otra realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria no es bloqueado de forma competitiva (por ejemplo, bloqueado de forma competitiva en una manera dependiente de la dosis) por uno de esos anticuerpos, según determinan, por ejemplo, ensayos de unión de competición (por ejemplo, los ELISA). En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria no es un anticuerpo Ab1 o Ab21, que es descrito en la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2011/119948 A1. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria no es un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por: Ab1 Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20 y Ab21, descritos en la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2011/119948 A1 ni de Ab24-Ab192, descritos en la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2011/119948. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria no comprende una CDR, o una o más CDR (por ejemplo, 3 CDR VL y/o 3 CDR VH), de un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por: Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20 y Ab21, descritos en la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2011/119948 A1, y Ab24-Ab192, descritos en la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2011/119948. En realizaciones particulares, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria no comprende una CDR, o una o más CDR (por ejemplo, 3 CDR VL y/o 3 CDR VH), región de cadena VL, o región de cadena VH de un anticuerpo seleccionado de los anticuerpos (por ejemplo, los anticuerpos Ab1-Ab21 y Ab24-Ab192) descritos en la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2011/119948 A1 o la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2011/119948. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria no es un anticuerpo Ab1 o Ab21, o un anticuerpo que comprende CDR (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR) del anticuerpo Ab1 o Ab21, descrito en la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2011/119948 A1. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria no es un anticuerpo 37M o 37C descrito en la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2012/103165. En cierta realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria no comprende un dominio VL que comprende la SEQ ID NO: 32 o un dominio VH que comprende la SEQ ID NO: 31.

En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 de KIT, por ejemplo, del KIT humano), no comprende una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis) CDR (por ejemplo, CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, una CDR1 VH, una CDr2 vH y una CDR3 VH) de un anticuerpo descrito en la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2008/0287309; por ejemplo, el anticuerpo 36C1, 84H7, 63C10 o 65A12.

En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria no es una versión humana o humanizada de un anticuerpo producido por el hibridoma (BA7.3C.9) que tiene el número de entrada HB10716 en la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo (ATCC), descrito, por ejemplo, en la patente estadounidense n° 5.919.911 o en la patente estadounidense n° 5.489.516. En otra realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria no comprende las CDR (por ejemplo, la CDR1 VL, la CDR2 VL, la CDR3 VL, la CDR1 VH, la CDR2 VH, y/o la CDR3 VH) del anticuerpo producido por el hibridoma (BA7.3C.9) que tiene el número de entrada HB10716 en la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo (ATCC), descrito, por ejemplo, en la patente estadounidense n° 5.919.911 o en la patente estadounidense n° 5.489.516. En otra realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria no comprende las CDR del anticuerpo SR-1 descrito, por ejemplo, en la

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patente estadounidense n° 5.919.911 o en la patente estadounidense n° 5.489.516 o la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2007/0253951 A1 (véanse, por ejemplo, el fl [0032] o el fl [0023]). En una realización adicional, un anticuerpo descrito en la presente memoria no es un anticuerpo del anticuerpo producido por el hibridoma (BA7.3C.9) que tiene el número de entrada HB10716 en la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo (ATCC), descrito, por ejemplo, en la patente estadounidense n° 5.919.911 o en la patente estadounidense n° 5.489.516.

En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria no son los anticuerpos humanizados del anticuerpo SR-1 descrito en la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2007/0253951 A1. En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria no comprende una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo constituido por: sEq ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10, referenciadas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2007/0253951 A1. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria no comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 4 o de SEQ ID NOs: 2 y 6, referenciadas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2007/0253951 A1. En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria no comprende una o más secuencias de aminoácidos que son al menos un 90% idénticas a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10, referenciadas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2007/0253951 A1. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria no comprende una o más CDR descritas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2007/0253951 A1; por ejemplo, los aminoácidos 44 a 58 de SEQ ID NO: 8 (CDr1 VL del anticuerpo SR-1; RASESVDIYGNSFMH), los aminoácidos 74 a 80 de SEQ ID NO: 8 (CDR2 VL del anticuerpo SR-1; LASNLES), los aminoácidos 111 a 121 de SEQ ID NO: 8 (CDR3 VL del anticuerpo SR-1; QQNNEDPYT), los aminoácidos 50 a 54 de SEQ ID NO: 10 (CDR1 VH del anticuerpo SR-1; SYnMh), los aminoácidos 69 a 85 de SEQ ID NO: 10 (CDR2 VH del anticuerpo SR-1; VIYSGNGDTSYNQKFKG), y/o los aminoácidos 118 a 125 de SEQ ID NO: 10 (CDR3 VH del anticuerpo SR-1; RDTRFGN), siendo las sEq ID NOs: 8 y 10 las referenciadas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2007/0253951 A1 (véase, por ejemplo, el fl [0032] o el fl [0023]). En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria no comprende una o más CDR descritas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2007/0253951 A1; por ejemplo, los aminoácidos 43 a 58 de SEQ ID NO: 2 (CDR1 VL), los aminoácidos 74 a 80 de SEQ ID NO: 2 (CDR2 VL), los aminoácidos 113 a 121 de SEQ ID NO: 2 (CDR3 VL), los aminoácidos 50 a 54 de SEQ ID NO: 4 (CDR1 VH), los aminoácidos 69 a 85 de SEQ ID NO: 4 (CDR2 VH), y/o los aminoácidos 118 a 125 de SEQ ID NO: 4 (CDR3 VH), siendo las SEQ ID NOs: 2 y 4 las referenciadas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2007/0253951 A1. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria no es un anticuerpo del anticuerpo SR-1 descrito en la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2007/0253951 A1.

En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria no es un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por: anticuerpo Anti-S100, ACK2, y ACK4 descritos en la patente estadounidense n° 6.989.248 o en la patente estadounidense n° 7.449.309. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria no es una versión humana o humanizada de un anticuerpo seleccionado de tal grupo. En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria no es un anticuerpo que comprenda una o más CDR (por ejemplo, 3 CDR VL y/o 3 CDR VH) de un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por: anticuerpo Anti-S100, ACK2 y ACK4, descritos en la patente estadounidense n° 6.989.248 o en la patente estadounidense n° 7.449.309.

En ciertos aspectos, se pueden usar ensayos de unión de competición para contribuir a identificar un epítopo diana de un anticuerpo o a determinar si un anticuerpo está bloqueado de forma competitiva, por ejemplo, de manera dependiente de la dosis, por otro anticuerpo; por ejemplo, un anticuerpo que se una esencialmente al mismo epítopo, o a epítopos superpuestos, como anticuerpo de referencia, cuando los dos anticuerpos reconocen epítopos idénticos o estéricamente superpuestos en ensayos de unión de competición, tales como ensayos ELISA de competición, que pueden ser configurados en todo tipo de formatos diferentes, usando ya sea antígeno marcado o anticuerpo marcado. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva; por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición sándwich (véase Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (véase Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614); ensayo marcado directo en fase sólida, ensayo sándwich marcado directo en fase sólida (véase Harlow y Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA marcado directo en fase sólida usando marcador I-125 (véase Morel et al., (1988) Mol. Immunol. 25(1):7); EiA de biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung et al., (1990) Virology 176:546); y RIA marcado directo (Moldenhauer et al., (1990) Scand J. Immunol. 32:77). Normalmente, tal ensayo implica el uso de un antígeno purificado (por ejemplo, KIT, tal como un dominio extracelular de KIT o una región D4 de KIT) unido a una superficie sólida o a células que porten cualquiera de estas dos: una inmunoglobulina de ensayo no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva puede medirse determinando la cantidad de marcador unida a la superficie sólida o a células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Habitualmente, la inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso. En ciertos aspectos, cuando un anticuerpo competitivo está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos un 50-55%, un 55-60%, un 60-65%, un 65-70% un 70-75% o más. En una versión común de este ensayo, el antígeno es inmovilizado en una placa de 96 pocillos. A continuación, se mide la

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capacidad de los anticuerpos no marcados de bloquear la unión de anticuerpos marcados al antígeno usando marcadores radiactivos o enzimáticos. Para detalles adicionales, véanse, por ejemplo, Wagener et al., J. Immunol., 1983, 130:2308-2315; Wagener et al., J. Immunol. Methods, 1984, 68:269-274; Kuroki et al., Cáncer Res., 1990, 50:4872-4879; Kuroki et al., Immunol. Invest., 1992, 21:523-538; Kuroki et al., Hybridoma, 1992, 11:391-407, y Using Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow y David Lane, editores (Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, Nueva York, 1999), pp. 386-389.

En ciertos aspectos, un anticuerpo descrito en la presente memoria que se une inmunoespecíficamente a una región D4 de un polipéptido KIT (por ejemplo, un polipéptido KIT humano) puede estar descrito por su región de cadena VL (por ejemplo, una cualquiera de las SEQ ID NOs: 7-10) o por su región de cadena VH (por ejemplo, una cualquiera de las SEQ ID NOs: 2-6), o por sus 3 CDR VL o sus 3 CDR VH. Véase, por ejemplo, Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 8910-8915, que describe la humanización del anticuerpo anti-avp3 murino identificando una cadena ligera o una cadena pesada complementarias de una biblioteca de cadenas ligeras o cadenas pesadas humanas, respectivamente, dando como resultado variantes de anticuerpos humanizados que tienen afinidades tan altas o más que la afinidad del anticuerpo original. Véase también Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628, que describe métodos de producción de anticuerpos que se unen a un antígeno específico usando un dominio específico VL (o VH) y realizando una búsqueda de los dominios variables complementarios en una biblioteca. La búsqueda produjo 14 nuevos socios para un dominio VH específico y 13 nuevos socios para un dominio VL específico, que eran enlazadores potentes, según determinó ELISA.

Así, en ciertos aspectos, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a una región D4 de un polipéptido KIT (por ejemplo, un polipéptido KIT humano), que comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 u 8. En algunas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo, que se une inmunoespecíficamente a una región D4 de un polipéptido KIT (por ejemplo, un polipéptido KIT humano), que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o 5.

En ciertos aspectos, las CDR de un anticuerpo descrito en la presente memoria se determinan según el método de Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917, al que se hará referencia en la presente memoria como las “CDR de Chothia” (véase también, por ejemplo, patente estadounidense n° 7,709,226). Usando el sistema de numeración de Kabat de numeración de residuos de aminoácido en la región de cadena VH y en la región de cadena VL, las CDR de Clothia dentro de la molécula de cadena pesada de un anticuerpo están normalmente presentes en las posiciones de aminoácidos 26 a 32 (“CDR1”), en las posiciones de aminoácidos 53 a 55 (“CDR2”), y en las posiciones de aminoácidos 96 a 101 (“CDR3”). Usando el sistema de numeración de Kabat de numeración de residuos de aminoácido en la región de cadena VH y en la región de cadena VL, las CDR de Clothia dentro de la molécula de cadena ligera de un anticuerpo están normalmente presentes en las posiciones de aminoácidos 26 a 33 (CDR1), en las posiciones de aminoácidos 50 a 52 (CDR2), y en las posiciones de aminoácidos 91 a 96 (CDR3).

En una realización específica, la posición de una CDR a lo largo de las regiones VH y/o VL de un anticuerpo descrito en la presente memoria puede variar en una, dos, tres o cuatro posiciones de aminoácidos siempre y cuando se mantenga (por ejemplo, se mantenga sustancialmente, por ejemplo, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%) la unión inmunoespecífica a KIT (por ejemplo, la región D4 del KIT humano). Por ejemplo, en una realización, la posición que define una CDR de un anticuerpo descrito en la presente memoria puede cambiar corriendo los límites N-terminal y/o C-terminal de la CDR en uno, dos, tres o cuatro, aminoácidos, con respecto a la posición de la CDR representada en las Figuras 3A-3I, siempre y cuando se mantenga (por ejemplo, se mantenga sustancialmente, por ejemplo, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%) la unión inmunoespecífica a KIT (por ejemplo, la región D4).

En aspectos específicos, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo que comprende la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo; por ejemplo, una cadena ligera y una cadena pesada separadas. Con respecto a la cadena ligera, en una realización específica, la cadena ligera de un anticuerpo descrito en la presente memoria es una cadena ligera kappa. En otra realización específica, la cadena ligera de un anticuerpo descrito en la presente memoria es una cadena ligera lambda. En otra realización específica adicional, la cadena ligera de un anticuerpo descrito en la presente memoria es una cadena ligera kappa humana o una cadena ligera lambda humana. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, un polipéptido KIT que comprende una región D4 de KIT, por ejemplo KIT humano (por ejemplo, la SEQ ID NO: 15)) comprende una cadena ligera en la que la secuencia de aminoácidos de la región de cadena VL comprende cualquier secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria (por ejemplo, la SEQ ID NO: 7, 8, 9 o 10), y en la que la región constante de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera kappa humana. En la técnica se han descrito ejemplos no limitantes de secuencias de regiones constantes de cadena ligera humana; véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n° 5.693.780 y Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, U.S. Department of Health and Human Services, NiH Publication No. 91-3242.

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Con respecto a la cadena pesada, en una realización específica, la cadena pesada de un anticuerpo descrito en la presente memoria puede ser una cadena pesada alfa (a), delta (ó), épsilon (e), gamma (y) o mu (p). En otra realización específica, la cadena pesada de un anticuerpo descrito puede comprender una cadena pesada alfa (a), delta (ó), épsilon (e), gamma (y) o mu (p) humana. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, un polipéptido KIT que comprende una región D4 de KIT, por ejemplo KIT humano (por ejemplo, la SEQ ID NO: 15)), comprende una cadena pesada en la que la secuencia de aminoácidos de la región de cadena VH puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOs: 2-6), y en la que la región constante de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de la cadena pesada gamma (y) humana. En la técnica se han descrito ejemplos no limitantes de secuencias de regiones constantes de cadena pesada humana; véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n° 5.693.780 y Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242.

En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, una región D4 de KIT, por ejemplo KIT humano) comprende una región de cadena VL y una región de cadena VH que comprenden cualquier secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria, y en el que las regiones constantes comprenden las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de una molécula de inmunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY, o de una molécula de inmunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY humana. En otra realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, una región D4 de KIT, por ejemplo KIT humano) comprende una región de cadena VL y una región de cadena VH que compren de cualquier secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria, y en el que las regiones constantes comprenden las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de una molécula de inmunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY, cualquier clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), o cualquier subclase (por ejemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de inmunoglobulina. En una realización particular, las regiones constantes comprenden las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de una molécula de inmunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY humana, cualquier clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), o cualquier subclase (por ejemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de inmunoglobulina.

En otra realización específica adicional, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, una región D4 de KIT, por ejemplo KIT humano), comprende una región de cadena VL y una región de cadena VH que comprenden cualquier secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria (por ejemplo, una cualquiera de las SEQ ID NOs: 2-6 y/o una cualquiera de las SEQ ID NOs: 7-10), y en el que las regiones constantes comprenden las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de una IgG1 humana o una IgG4 humana. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, una región D4 de KIT, por ejemplo KIT humano) comprende una región de cadena VL y una región de cadena VH que comprenden cualquier secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria, y en el que las regiones constantes comprenden las secuencias de aminoácidos de la región constante de una IgG1 humana.

En realizaciones específicas, un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT, por ejemplo, un polipéptido KIT humano, por ejemplo, una región D4 de KIT (por ejemplo, del KIT humano, por ejemplo la SEQ ID NO: 15), comprende regiones marco (por ejemplo, regiones marco del dominio VL y/o del dominio VH) que son regiones marco humanas o derivadas de regiones marco humanas. En la técnica se describen ejemplos no limitantes de human regiones marco; véase, por ejemplo, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. En cierta realización, un anticuerpo descrito en la presente memoria comprende regiones marco (por ejemplo, regiones marco del dominio VL y/o del dominio VH) que son regiones marco de primate (por ejemplo, un primate no humano) o derivadas de regiones marco de primate (por ejemplo, un primate no humano).

En ciertos ejemplos, un anticuerpo descrito en la presente memoria comprende regiones marco (por ejemplo, regiones marco del dominio VL y/o del dominio VH) que no son regiones marco de primate (por ejemplo, un primate no humano; por ejemplo, un simio, tal como un simio del Viejo Mundo) o derivadas de regiones marco de primate (por ejemplo, un primate no humano).

En ciertos ejemplos, con respecto a cualquiera de estos anticuerpos descritos en la presente memoria, la región de cadena VL no comprende regiones marco de primate no humano (por ejemplo, un simio, tal como un simio del Viejo Mundo) ni está derivada de regiones marco de un primate no humano (por ejemplo, un simio, tal como un simio del Viejo Mundo). En ciertas otras realizaciones, la región de cadena VH no comprende regiones marco de primate no humano (por ejemplo, un simio, tal como un simio del Viejo Mundo) ni está derivada de regiones marco de primate no humano (por ejemplo, un simio, tal como un simio del Viejo Mundo).

Ejemplos no limitantes de regiones marco de primate no humano incluyen los de simios del Viejo Mundo; por ejemplo, Pan troglodytes, Pan paniscus o Gorilla gorilla; chimpancé Pan troglodytes; monos del Viejo Mundo, tales como monos del Viejo Mundo del género Macaca; y el mono cangrejero Macaca cynomolgus. En la publicación de

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solicitud de patente estadounidense n° US 2005/0208625 se describen ejemplos no limitantes de secuencias marco de primate no humano.

En ciertos aspectos, en la presente memoria también se proporcionan anticuerpos, que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, una región D4 de KIT, por ejemplo KIT humano), que comprenden una o más sustituciones de residuos de aminoácido, por ejemplo, en la región de cadena VL o en la región de cadena VH; por ejemplo, las CDR o las FR. En realizaciones específicas, ninguna de las sustituciones de residuos de aminoácido está situada dentro de las CDR. En realizaciones específicas, todas las sustituciones de aminoácidos están en las FR (véanse, por ejemplo, las Tablas 5A-6B). En cierta realización, una sustitución de aminoácidos es una sustitución de aminoácidos conservadora.

Según se usa en la presente memoria, una “sustitución de aminoácidos conservadora” es aquella en la que el residuo de aminoácido es sustituido con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales con cargas similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

En realizaciones particulares, se modifica la glucosilación de anticuerpos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, puede crearse un anticuerpo aglucosilado (es decir, un anticuerpo que carece de glucosilación) o puede crearse un anticuerpo que comprenda una mutación o sustitución en uno o más sitios de glucosilación para eliminar la glucosilación en los uno o más sitios de glucosilación. La glucosilación puede ser alterada, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo hacia un antígeno diana (por ejemplo, del KIT humano; por ejemplo, una región D4 del KIT humano). Tales modificaciones de hidratos de carbono pueden lograrse, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, pueden realizarse una o más sustituciones de aminoácidos que den lugar a la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de regiones variables (por ejemplo, las CDR VL y/o VH o las FR VL y/o VH) para eliminar con ella la glucosilación en ese sitio. Tal aglucosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo hacia el antígeno (por ejemplo, del KIT humano; por ejemplo, una región D4 del KIT humano). Tal planteamiento es descrito con detalle adicional en las patentes estadounidenses nos 5.714.350 y 6.350.861.

La glucosilación puede ocurrir mediante glucosilación de enlace N (o enlace de asparagina) o glucosilación de enlace O. La glucosilación de enlace N implica la modificación de hidratos de carbono en el grupo NH2 de la cadena lateral de un aminoácido asparagina en un polipéptido. La glucosilación de enlace O implica la modificación de hidratos de carbono en el grupo hidroxilo de la cadena lateral de un aminoácido serina, treonina, o hidroxilisina.

En realizaciones específicas, un residuo de asparagina (N) dentro de una región VH (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 o 6) o VL (por ejemplo, SEQ ID NO: 7, 8, 9 o 10) de un anticuerpo descrito en la presente memoria es sustituido con una serina (S) u otro aminoácido (por ejemplo, alanina, glicina, glutamina, treonina, tirosina, cisteína). En otras realizaciones específicas, un residuo de asparagina (N) dentro de una CDR VH (por ejemplo, CDR1 VH, CDR2 VH y/o CDR3 VH que comprendan las secuencias de SEQ ID NOs: 16-18, respectivamente) y/o una CDR VL (por ejemplo, CDR1 VL, CDR2 VL, y/o CDR3 VL que comprendan las secuencias de SEQ ID NOs: 19-21, respectivamente) de un anticuerpo descrito en la presente memoria es sustituido con una serina (S) u otro aminoácido (por ejemplo, alanina, glicina, glutamina, treonina, tirosina, cisteína). En otras realizaciones específicas, un residuo de asparagina (N) dentro de una FR VH (por ejemplo, FR1 VH, Fr2 VH, FR3 VH y/o FR4 VH, definidas en las Tablas 5A, 5C y 6B) y/o una FR VL (por ejemplo, FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL, y/o Fr4 VL, definidas en las Tablas 5B, 5D y 6A) de un anticuerpo descrito en la presente memoria es sustituido con una serina (S) u otro aminoácido (por ejemplo, alanina, glicina, glutamina, treonina, tirosina, cisteína).

En ciertas realizaciones, pueden producirse anticuerpos aglucosilados en células bacterianas que carecen de la necesaria maquinaria de glucosilación. En la técnica se han descrito células con maquinaria de glucosilación alterada y pueden ser usadas como células anfitrionas en las que expresar anticuerpos recombinantes descritos en la presente memoria para producir con ello un anticuerpo con glucosilación alterada. Véanse, por ejemplo, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, así como la patente europea n° EP 1.176.195; y las publicaciones PCT WO 03/035835; WO 99/54342.

En ciertas realizaciones, pueden hacerse una o más modificaciones a la región Fc de un anticuerpo aquí descrito, generalmente, para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la vida media sérica, fijación del complemento, unión al receptor Fc, y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Estas modificaciones se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2008/153926 A2.

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En realizaciones específicas, un residuo de asparagina (N) dentro de la región constante de una cadena pesada y/o de la región constante de un región ligera de un anticuerpo descrito en la presente memoria es sustituido con una serina (S) u otro aminoácido (por ejemplo, alanina, glicina, glutamina, treonina, tirosina, cisteína).

En realizaciones específicas, un residuo de asparagina (N) dentro de una cadena pesada y/o de una región ligera de un anticuerpo descrito en la presente memoria es sustituido con una serina (S) u otro aminoácido (por ejemplo, alanina, glicina, glutamina, treonina, tirosina, cisteína).

En la presente memoria se proporcionan anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a antígeno de KIT y que pueden modular la actividad del KIT. En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT —por ejemplo, un polipéptido KIT humano— e inhibe una actividad del KIT. La actividad del KIT puede estar relacionada con cualquier actividad del KIT conocida o descrita en la técnica; por ejemplo, la dimerización del receptor KIT, la fosforilación del receptor KIT (fosforilación de la tirosina), la señalización aguas abajo del receptor KIT (por ejemplo, señalización AKT, mApK/ERK, Ras, Stat1, Stat3 o Stat5), regulación transcripcional inducida por ligandos KIT (por ejemplo, SCF) (por ejemplo, la activación transcripcional de c-Myc inducida por SCF), la inducción o potenciación de la proliferación celular, o la supervivencia celular. Actividad del KIT o de la función del KIT son usadas de forma intercambiable en la presente memoria. En ciertos aspectos, la actividad del KIT es inducida por un ligando KIT (por ejemplo, SCF) que se une al receptor KIT. En aspectos particulares, la actividad del kIt puede ser inducida o potenciada por mutaciones con ganancia de función que pueden dar lugar, por ejemplo, a la dimerización y, consecutivamente, a la señalización activa de KIT (véanse, por ejemplo, Mol et al., J. Biol. Chem, 2003, 278:31461-31464; Hirota et al., J. Pathology, 2001, 193:505-510). Tal ganancia de función puede permitir que la dimerización del receptor KIT y la señalización de KIT ocurran en ausencia de un ligando KIT (por ejemplo, SCF) que se una al receptor KIT. En ciertas realizaciones, puede ocurrir un aumento en la actividad o la señalización del KIT, en ausencia de un ligando KIT (por ejemplo, SCF) que se una al receptor KIT, debido a la alta expresión (o sobreexpresión) de los receptores KIT. La alta expresión o sobreexpresión de KIT en una célula se refiere a un nivel de expresión que es al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% más que el nivel de expresión de una célula de referencia que se sabe que tiene una expresión del KIT o una actividad del KIT normales o a un nivel de expresión del KIT por encima de la media en una población de células o muestras que se sabe que tienen una expresión del KIT o una actividad del KIT normales. Los niveles de expresión del KIT pueden ser evaluados por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, inmunoelectrotransferencia o inmunohistoquímica). En realizaciones particulares, una actividad del KIT que es mayor que la actividad normal del KIT puede llevar a transformación celular, neoplasia y tumorogénesis. En realizaciones particulares, una actividad del KIT que es mayor que la actividad normal del KIT puede llevar a otros trastornos o enfermedades asociados con el KIT.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria no bloquea o inhibe la unión de un ligando KIT (por ejemplo, SCF) al receptor KIT. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria inhibe o reduce la unión de un ligando KIT (por ejemplo, SCF) al receptor KIT solo de forma insignificante (por ejemplo, menos de aproximadamente el 2% o el 3%). En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria no induce o potencia la disociación de un ligando KIT (por ejemplo, sCf) del receptor KIT. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria induce o potencia la disociación de un ligando KIT (por ejemplo, SCF) del receptor KIT solo de forma insignificante (por ejemplo, menos de aproximadamente el 2% o el 3%).

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria no bloquea o inhibe la dimerización del receptor KIT. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria inhibe o reduce la dimerización del receptor KIT solo de forma insignificante (por ejemplo, menos de aproximadamente el 2% o el 3% o dentro de un error o desviación típico). En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria no induce o potencia la disociación dimérica del receptor KIT. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria induce o potencia la disociación dimérica del receptor KIT solo de forma insignificante (por ejemplo, menos de aproximadamente el 2% o el 3% o dentro de un error o desviación típico). En una realización particular, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria puede unirse específicamente a un dímero receptor KIT y no bloquear o inhibir la dimerización del receptor KIT. En una realización particular, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria puede unirse específicamente a un monómero receptor KIT y no bloquear o inhibir la dimerización del receptor KIT.

En ciertos aspectos, como inhibidor de la actividad del KIT, un anticuerpo descrito en la presente memoria puede bloquear o inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la dimerización del KIT. Generalmente, se induce la dimerización del receptor KIT cuando un ligando de KIT se une a KIT. Así, en realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente a KIT y bloquean o inhiben (por ejemplo, inhiben parcialmente) la dimerización de receptores KIT en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluado por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica —por ejemplo, el ensayo de inmunoprecipitación— con respecto a la dimerización de receptores KIT en presencia de estimulación de ligandos de KIT sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En una realización específica, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen

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específicamente a KIT e inhiben parcialmente la dimerización de los receptores KIT en aproximadamente entre un 25% y un 75%. El bloqueo o inhibición (por ejemplo, la inhibición parcial) de la dimerización de receptores KIT por anticuerpos descritos en la presente memoria puede ser evaluado en presencia de estimulación de ligandos de KIT. Por ejemplo, células que expresan KIT son puestas en contacto con un ligando de KIT en presencia o ausencia de anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria, y se determina el nivel de la dimerización del receptor KIT. En ciertas realizaciones, la dimerización inducida por un ligando KIT del receptor KIT en ausencia de anticuerpo anti KIT es al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces mayor que la dimerización del receptor KIT en presencia de anticuerpo anti KIT evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, ensayos de inmunoprecipitación). La fosforilación de la tirosina de uno o más residuos en el dominio citoplasmático de KIT puede ser un indicador de la dimerización del receptor KIT. En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria puede inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la actividad del KIT en al menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria y/o conocidos para un experto en la técnica, con respecto a la actividad del KIT en presencia de estimulación de ligandos de KIT sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria puede inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la actividad del KIT en al menos aproximadamente 25% a aproximadamente 65% evaluada por métodos descritos en la presente memoria y/o conocidos para un experto en la técnica, con respecto a la actividad del KIT en presencia de estimulación de ligandos de KIT sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). Ejemplos no limitantes de la actividad del KIT pueden incluir la fosforilación del receptor KIT, la señalización del receptor KIT, la proliferación celular arbitrada por ligandos de KIT (por ejemplo, SCF), la supervivencia celular arbitrada por ligandos de KIT (por ejemplo, SCF) y la activación transcripcional de un gen diana kIt (por ejemplo, c-Myc).

Como inhibidor de la actividad del KIT, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo) puede bloquear (por ejemplo, bloquear parcialmente) o inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la fosforilación del KIT, específicamente la fosforilación de la tirosina de uno o más residuos en el dominio citoplasmático de KIT. Generalmente, se induce la dimerización y la fosforilación del receptor KIT cuando un ligando de KIT se une a KIT. Sin embargo, en ciertos aspectos, la dimerización y/o la fosforilación del receptor KIT pueden ocurrir independientemente de la unión de ligandos de KIT al receptor KIT. Por ejemplo la dimerización y/o la fosforilación del receptor KIT pueden ocurrir debido a mutaciones con ganancia de función o sobreexpresión de KIT.

Ejemplos no limitantes de residuos de tirosina en el dominio citoplasmático de KIT murino que pueden ser fosforilados, por ejemplo, tras la estimulación de ligandos, incluyen 544, 546, 552, 567, 569, 577, 608, 645, 671, 674, 702, 719, 728, 745, 772, 821, 844, 853, 868, 878, 898 y 934 (véase Ueda et al., Blood, 2002, 99:3342-3349). Se pueden determinar fácilmente los correspondientes residuos de tirosina en el dominio citoplasmático del KIT humano. Ejemplos no limitantes de residuos de tirosina en el dominio citoplasmático del KIT humano (por ejemplo, el n° de entrada en GenBank P10721) que pueden ser fosforilados —por ejemplo, tras la estimulación de ligandos— incluyen los residuos 568, 570, 703, 721, 730, 747, 823, 900 y 936. En una realización específica, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria puede inhibir la fosforilación del receptor en el residuo de tirosina 719 de KIT murino. En otra realización específica, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria puede inhibir la fosforilación del receptor en el residuo de tirosina 703 o 721 del KIT humano.

Así, en realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, o un conjugado de los mismos) se unen específicamente a KIT y bloquean o inhiben la fosforilación de la tirosina en el dominio citoplasmático de KIT en al menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica, por ejemplo, el ensayo ELISA, descrito en la sección 6, o el ensayo de inmunotransferencia, con respecto a la fosforilación en presencia de estimulación de ligandos de KIT sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En realizaciones particulares, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente a KIT y bloquean o inhiben la fosforilación de la tirosina en el dominio citoplasmático de KIT en al menos aproximadamente 25%, opcionalmente a aproximadamente 65% o 75%, evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica, por ejemplo, el ensayo ELISA, descrito en la sección 6, o el ensayo de inmunotransferencia. En ciertas realizaciones, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente a KIT y bloquean o inhiben la fosforilación de la tirosina del dominio citoplasmático de KIT en al menos aproximadamente 25% a aproximadamente 80% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica, por ejemplo, el ensayo ELISA, descrito en la sección 6, o el ensayo de inmunotransferencia. En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente a KIT y bloquean o inhiben la fosforilación de la tirosina del dominio citoplasmático de KIT con una CI50 inferior a aproximadamente 600 pM, o inferior a aproximadamente 550 pM, o inferior a aproximadamente 500 pM, o inferior a aproximadamente 400 pM o inferior a aproximadamente 300 pM evaluada por métodos descritos en la presente memoria (por ejemplo, el ensayo de inhibición de la fosforilación con células CHO que expresan un KIT

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de la forma natural, según se describe posteriormente en la Sección 6) o conocidos para un experto en la técnica. En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente a KIT y bloquean o inhiben la fosforilación de la tirosina del dominio citoplasmático de KIT con una CI50 inferior a aproximadamente 600 pM. En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente a KIT y bloquean o inhiben la fosforilación de la tirosina del dominio citoplasmático de KIT con una CI50 inferior a aproximadamente 550 pM. En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente a KIT y bloquean o inhiben la fosforilación de la tirosina del dominio citoplasmático de KIT con una CI50 en el intervalo de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 25 pM a aproximadamente 550 pM, o de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 600 pM, o de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 350 pM. Por ejemplo, puede determinarse la CI50 para la inhibición de la fosforilación de la tirosina sometiendo a ensayo a lisados de células, por ejemplo, células CHO, que expresen el KIT de forma recombinante, en ELISA que detecte la fosforilación de la tirosina, según se describe, por ejemplo, en la Sección 6 más abajo. En ciertas realizaciones, se clasifican las células —por ejemplo, células CHO— que expresan el KIT de forma recombinante; clasifican, por ejemplo, para seleccionar las células que expresen el KIT con gran intensidad, antes de su uso en los ensayos de inhibición de la fosforilación. En algunas realizaciones, las células no son clasificadas antes de su uso en los ensayos de inhibición de la fosforilación.

En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, o un conjugado de los mismos) se unen específicamente al KIT y reducen la fosforilación de la tirosina del dominio citoplasmático de KIT en al menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica —por ejemplo, el ensayo ELISA, descrito en la sección 6, o el ensayo de inmunotransferencia— con respecto a la fosforilación en presencia de estimulación de ligandos de KIT sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, o un conjugado de los mismos) se unen específicamente al KIT y reducen la fosforilación de la tirosina del dominio citoplasmático de KIT en al menos aproximadamente un 25% o un 35%, opcionalmente a aproximadamente 75% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica —por ejemplo, el ensayo ELISA, descrito en la sección 6, o el ensayo de inmunotransferencia— con respecto a la fosforilación en presencia de estimulación de ligandos de KIT sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT).

En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente a KIT y bloquean o inhiben la fosforilación de uno o más residuos de tirosina en el dominio citoplasmático de KIT en al menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica —por ejemplo, el ensayo de inmunotransferencia— con respecto a la fosforilación en presencia de estimulación de ligandos de KIT sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En realizaciones específicas, el bloqueo o inhibición (por ejemplo, la inhibición parcial) de la fosforilación de uno o más residuos de tirosina del dominio citoplasmático del KIT por anticuerpos descritos en la presente memoria puede ser evaluado tras la estimulación de ligandos de KIT. Por ejemplo, células que expresan KIT son puestas en contacto con un ligando de KIT en presencia o ausencia de anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria, y puede determinarse el nivel de la fosforilación de uno o más residuos de tirosina en el dominio citoplasmático de KIT. En ciertas realizaciones, en la fosforilación inducida por ligandos de KIT de uno o más residuos de tirosina del dominio citoplasmático del KIT la ausencia de anticuerpo anti KIT es al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces,

3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces mayor que la fosforilación inducida por ligandos de KIT de uno o más residuos de tirosina del dominio citoplasmático del KIT en presencia de anticuerpo anti KIT, evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, ensayos de inmunotransferencia), con respecto a la fosforilación en presencia de estimulación de ligandos de KIT sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT).

En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, o un conjugado de los mismos) se unen específicamente al KIT e inducen o potencian la internalización del receptor KIT en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica, con respecto a la internalización en presencia de un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, o un conjugado de los mismos) se unen específicamente al KIT e inducen o potencian la internalización del receptor KIT en al menos aproximadamente un 25% o un 35%, opcionalmente a aproximadamente un 75%, evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica, con respecto a la internalización en presencia de un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En

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realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT e inducen o potencian la internalización del receptor KIT en al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces,

1.5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica, con respecto a la internalización en presencia de un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En la técnica son bien conocidas técnicas para la cuantificación o la visualización de los receptores de la superficie celular, e incluyen diversas técnicas fluorescente y radiactivas. Por ejemplo, un método implica la incubación de las células con un anticuerpo antirreceptor radiomarcado. Alternativamente, el ligando natural del receptor puede ser conjugado con una molécula fluorescente o un marcador radiactivo e incubado con las células. En la técnica son bien conocidos ensayos adicionales de internalización de los receptores, y están descritos, por ejemplo, en Jiménez et al., Biochemical Pharmacology, 1999, 57:1125-1131; Bernhagen et al., Nature Medicine, 2007, 13:587-596; y Conway et al., J. Cell Physiol., 2001, 189:341-55.

En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT e inducen o potencian la renovación del receptor KIT en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo de radiomarcado por pulso radiactivo y seguimiento), con respecto a la renovación en presencia de un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, o un conjugado de los mismos) se unen específicamente al KIT e inducen o potencian la renovación del receptor KIT en al menos aproximadamente un 25% o un 35%, opcionalmente a aproximadamente un 75%, evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo de radiomarcado por pulso radiactivo y seguimiento), con respecto a la renovación en presencia de un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT e inducen o potencian la renovación del receptor KIT en al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces,

3.5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo de radiomarcado por pulso radiactivo y seguimiento), con respecto a la renovación en presencia de un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En la técnica son bien conocidos métodos para la determinación de la renovación de receptores. Por ejemplo, las células que expresan KIT pueden ser marcadas por pulso radiactivo usando la mezcla de marcado proteínico 35S-EXPRESS (NEG772, NEN Life Science Products), lavadas y ser objeto de seguimiento con un medio no marcado durante un periodo de tiempo antes de que se inmunoprecipiten los lisados proteínicos de las células marcadas usando un anticuerpo anti KIT y resueltas mediante SDS-PAGE y visualizadas (por ejemplo, expuestas a una pantalla PhosphoImager (Molecular Dynamics), escaneadas usando el escáner Typhoon8600 (Amersham), y analizadas usando el soporte lógico ImageQuant (Molecular Dynamics)) (véase, por ejemplo, Chan et al., Development, 2004, 131:5551-5560).

En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT e inducen o potencian la degradación del receptor KIT en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, ensayos de radiomarcado por pulso radiactivo y seguimiento), con respecto a la degradación en presencia de un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT e inducen o potencian la degradación del receptor KIT en al menos aproximadamente un 25% o un 35%, opcionalmente a aproximadamente un 75%, evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, ensayos de radiomarcado por pulso radiactivo y seguimiento), con respecto a la degradación en presencia de un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT e inducen o potencian la degradación del receptor KIT en al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, ensayos de radiomarcado por pulso radiactivo y seguimiento), con respecto a la degradación en presencia de un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En la técnica son bien conocidas técnicas para la cuantificación o la monitorización de la ubiquitinación y/o la degradación (por ejemplo, la cinética o la tasa de degradación) de los receptores de la superficie celular e implican diversas técnicas fluorescentes y radiactivas (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2008/153926 A2). Por ejemplo, se pueden llevar a cabo experimentos de radiomarcado por pulso radiactivo y seguimiento o experimentos usando ligandos radiomarcados tales como 125I-SCF para medir cuantitativamente la degradación del KIT.

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Además, la señalización de eventos aguas abajo de la fosforilación del receptor KIT puede servir de indicadora de la actividad del KIT. Por ejemplo, que un ligando de KIT (por ejemplo, SCF) se una a su receptor KIT estimula varios sistemas de señalización diferenciados, incluyendo, por ejemplo, miembros de las quinasas de la familia Src, 3- quinasas de fosfatidilinositol (PI) y la proteína quinasa activada por mitógenos Ras (MAPK) (véase Munugalavadla et al., Mol. Cell. Biol., 2005, 25:6747-6759). Las tirosinas fosforiladas en el dominio citoplasmático de KIT pueden proporcionar sitios para proteínas que contengan el dominio SH2, que incluyen, sin limitación, proteínas del sistema de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) p21Ras, la subunidad p85 de la 3-quinasa de PI, la fosfolipasa C-gamma1, la proteína adaptadora Grb2, las quinasas de la familia Src (SFK), Cbl, CRKL, p62Dok-1, SHP1 y SHP2 (véase Ueda et al., Blood, 2002, 99:3342-3349).

Así, en ciertos aspectos, anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria que actúan como inhibidores de la actividad del KIT pueden inhibir la señalización de un miembro de las quinasas de la familia Src, de las 3 quinasas de PI, o de la Ras-MAPK. En realizaciones particulares, anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria que actúan como inhibidores de la actividad del KIT pueden inhibir la unión (o inhibir la interacción) con el dominio citoplasmático del KIT, de una o más proteínas que contengan el dominio SH2, tales como proteínas del sistema p21Ras-MAPK, la subunidad p85 de la 3-quinasa de PI, la fosfolipasa C-gamma1, la proteína adaptadora Grb2, un miembro de SFK, Cbl, CRKL, p62Dok-1, SHP1 y SHP2. En ciertas realizaciones, anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria que actúan como inhibidores de la actividad del KIT pueden inhibir la activación por el KIT de una o más proteínas que contengan el dominio SH2, tales como proteínas del sistema p21Ras-MAPK, la subunidad p85 de la 3-quinasa de PI, la fosfolipasa C-gamma1, la proteína adaptadora Grb2, un miembro de SFK, Cbl, CRKL, p62Dok-1, SHP1 y SHP2.

En realizaciones particulares, anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria que actúan como inhibidores de la actividad del KIT pueden inhibir la señalización aguas abajo, tal como la fosforilación de MAPK, la fosforilación de AKT, o la fosforilación de Stat1, Stat3, o Stat5. Así, en ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria puede inhibir o reducir la fosforilación de MAPK (por ejemplo, la fosforilación de MAPK inducida por ligandos de KIT (por ejemplo, SCF)) en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica, por ejemplo, inmunoelectrotransferencia o ensayo ELISA, según se describe en la Sección 6, o el ensayo de inmunotransferencia, con respecto a la fosforilación en presencia de estimulación de ligandos de KIT sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria puede inhibir o reducir la fosforilación de AKT (por ejemplo, la fosforilación de AKT inducida por ligandos de KIT (por ejemplo, SCF)) en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica, por ejemplo, inmunoelectrotransferencia o ensayo ELISA, según se describe en la Sección 6, o el ensayo de inmunotransferencia, con respecto a la fosforilación en presencia de estimulación de ligandos de KIT sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En realizaciones particulares, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria puede inhibir o reducir la fosforilación de Stat3 (por ejemplo, la fosforilación de Stat3 inducida por ligandos de KIT (por ejemplo, SCF)) en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica, por ejemplo, inmunoelectrotransferencia o ensayo ELISA, según se describe en la Sección 6, o el ensayo de inmunotransferencia, con respecto a la fosforilación en presencia de estimulación de ligandos de KIT sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT). En realizaciones particulares, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria puede inhibir o reducir la fosforilación de Stat1 o Stat5 (por ejemplo, la fosforilación inducida por ligandos de KIT (por ejemplo, SCF)) en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica, por ejemplo, inmunoelectrotransferencia o ensayo ELISA, según se describe en la Sección 6, o el ensayo de inmunotransferencia, con respecto a la fosforilación en presencia de estimulación de ligandos de KIT sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a KIT).

En ciertos aspectos, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria que puede actuar como inhibidor de la actividad del KIT puede inhibir la proliferación celular de las células (por ejemplo, células cancerosas tales como células TF-1) que expresan KIT y que responden a la señalización KIT (por ejemplo, células que proliferan en respuesta a la estimulación de ligandos de KIT y a la señalización de KIT). Los ensayos de proliferación celular son descritos en la técnica y pueden ser llevados a cabo fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, la proliferación celular puede ser evaluada midiendo la incorporación de la bromodesoxiuridina (BrdU) (véanse, por ejemplo, Hoshino et al., 1986, Int. J. Cáncer 38, 369; Campana et al., 1988, J. Immunol. Meth. 107:79) o la incorporación de (3H) timidina (véanse, por ejemplo, Blechman et al., Cell, 1995, 80:103-113; Chen, J., 1996, Oncogene 13:1395-403; Jeoung, J., 1995, J. Biol. Chem. 270:18367 73), por recuento celular directo a intervalos temporales diversos (por ejemplo, intervalos de 12 horas o de 24 horas), o detectando cambios en la transcripción, la traducción o la actividad celular de genes conocidos, tales como protooncogenes (por ejemplo, fos, myc) o marcadores del ciclo celular (Rb, cdc2, ciclina A, D1, D2, D3, E, etc.). Los niveles de tal proteína y ARNm y de tal

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actividad pueden determinarse mediante cualquier método bien conocido en la técnica. Por ejemplo, proteína puede ser cuantificada mediante métodos inmunodiagnósticos conocidos, tales como ELISA, inmunoelectrotransferencia o inmunoprecipitación usando anticuerpos, incluyendo anticuerpos disponibles comercialmente. El ARNm puede ser cuantificado usando métodos que son bien conocidos y rutinarios en la técnica; por ejemplo, usando análisis de tipo Northern, protección de la RNasa, o reacción en cadena de la polimerasa en conexión con la transcripción inversa.

En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT e inhiben la proliferación celular en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo de incorporación de la BrdU). En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT e inhiben la proliferación celular en al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo de incorporación de la BrdU).

En ciertos aspectos, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria, que puede actuar como inhibidor de la actividad del KIT, puede reducir o inhibir la supervivencia de células que expresan KIT y que responden a la señalización KIT (por ejemplo, células que proliferan en respuesta a la estimulación de ligandos de KIT y a la señalización de KIT). En la técnica se describen ensayos de supervivencia celular y pueden ser llevados a cabo fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, la viabilidad celular puede ser evaluada usando tinción de azul de tripano u otros marcadores de muerte o viabilidad celular conocidos en la técnica. En una realización específica, se mide el nivel de ATP celular para determinar la viabilidad celular. En realizaciones específicas, la viabilidad celular es medida en periodos de tres días y de siete días usando un ensayo estándar en la técnica, tal como el CellTiter- Glo Assay Kit (Promega), que mide los niveles de ATP intracelular. Una reducción en el ATP celular es indicativa de un efecto citotóxico. En otra realización específica, la viabilidad celular puede ser medida en el ensayo de absorción de rojo neutro. En otras realizaciones, la observación visual en busca de cambios morfológicos puede incluir agrandamiento, granularidad, células con bordes irregulares, aspecto lechoso, esfericidad, desprendimiento de la superficie del pocillo u otros cambios. Estos cambios reciben la designación de T (100% tóxico), PVH (parcialmente tóxico-muy pesado-80%), PH (parcialmente tóxico-pesado-60%), P (parcialmente tóxico-40%), Ps (parcialmente tóxico-ligero-20%), o 0 (sin toxicidad-0%), conforme al grado de citotoxicidad visto. Se determina una concentración inhibitoria (citotóxica) de células del 50% (CI50) mediante análisis de regresión de estos datos.

En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT e inhiben (por ejemplo, inhiben parcialmente) la supervivencia celular (por ejemplo, de células cancerosas) en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo de exclusión de azul de tripano). En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT e inhiben la supervivencia celular (por ejemplo, de células cancerosas) en al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo con azul de tripano).

En ciertos aspectos, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria, que puede actuar como inhibidor de la actividad del KIT, es capaz de inducir la apoptosis (es decir, la muerte celular programada) de células (por ejemplo, células cancerosas, tales como células MO7E) que expresan KIT y que responden a la señalización KIT (por ejemplo, células que proliferan en respuesta a la estimulación de ligandos de KIT y a la señalización de KIT). La apoptosis es descrita en la técnica y puede ser llevada a cabo fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, puede usarse citometría de flujo para detectar la caspasa 3 activada, una enzima que media en la apoptosis, en células sometidas a apoptosis, o puede usarse inmunoelectrotransferencia para detectar la escisión de la poli(ADP- ribosa) polimerasa (pArP) (véase, por ejemplo, Smolich et al., Blood, 2001, 97:1413-1421). La escisión de PARP es un indicador de la apoptosis. En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT e inducen o potencian apoptosis en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, citometría de flujo para detectar la caspasa 3 activada). En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT e inducen o potencian apoptosis en al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, citometría de flujo para detectar la caspasa 3 activada).

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En ciertos aspectos, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria, que puede actuar como inhibidor de la actividad del KIT, es capaz de inhibir o disminuir el desarrollo celular independiente del anclaje (por ejemplo, la formación de colonias) por parte de células (por ejemplo, células H526 o células CHO que expresen KIT exógeno) que expresan KIT y que responden a la señalización KIT (por ejemplo, células que proliferan en respuesta a la estimulación de ligandos de KIT y a la señalización de KIT), medido por métodos comúnmente conocidos en la técnica; por ejemplo, el ensayo en agar blando. En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, o un conjugado de los mismos) se unen específicamente al KIT e inhiben o disminuyen el desarrollo celular independiente del anclaje en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluado por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo en agar blando). En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, o un conjugado de los mismos) se unen específicamente al KIT e inhiben o disminuyen el desarrollo celular independiente del anclaje en al menos aproximadamente un 25% o un 35%, opcionalmente a aproximadamente un 75%, evaluado por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo en agar blando). En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT e inhiben o disminuyen el desarrollo celular independiente del anclaje en al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces evaluado por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo en agar blando).

Células y líneas celulares que son apropiadas para su uso en los ensayos descritos en la presente memoria relacionados con la actividad del KIT están fácilmente disponibles (por ejemplo, ATCC) o pueden ser fácilmente identificadas usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células y/o las líneas celulares que expresen KIT de forma endógena o que posean señalización o actividad KIT son conocidas para un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, las células o las líneas celulares que son apropiadas para su uso en los ensayos descritos en la presente memoria pueden expresar KIT, ya sea de forma endógena o recombinante. En realizaciones particulares, las células o las líneas celulares para su uso en ensayos de proliferación celular pueden expresar KIT, de forma endógena o recombinante, y proliferar o aumentar la proliferación en respuesta a la estimulación de los ligandos de KIT (por ejemplo, SCF). Las células o las líneas celulares para su uso en ensayos de viabilidad celular pueden expresar KIT, de forma endógena o recombinante, y ejercer cambios en la viabilidad celular en respuesta a la estimulación de los ligandos de KIT (por ejemplo, SCF). Las células o las líneas celulares para su uso en ensayos de apoptosis pueden expresar KIT, de forma endógena o recombinante, y ejercer cambios en la apoptosis en respuesta a la estimulación de los ligandos de KIT (por ejemplo, SCF).

Ejemplos no limitantes de células que pueden ser usadas en los métodos y los ensayos descritos en la presente memoria incluyen células primarias, células cancerosas, células transformadas, células madre, mastocitos, células germinales primordiales, oocitos, espermatocitos, células madre embrionarias, células hematopoyéticas, células eritroleucémicas (por ejemplo, líneas celulares F36P y TF-1), líneas celulares de la leucemia mielógena humana, tales como células MO7E; líneas celulares de tumores estromales gastrointestinales, tales como ST-882, GIST-T1, GIST48, GIST48B, GIST430 y GIST882; líneas celulares de neuroblastoma, tales como SK-N-SH, SK-SY5Y, HEP1, SK-N-BE(2), SK-N-BE(ZkM17), SK-N-BE(2)C, LA-N-1 o LA-N-1-5s; líneas celulares del sarcoma de Ewing, tales como TC71, TC32, RD-ES, 5838, A4573, EWS-925, NCI-EWS-94 y NCI-EWS-95; y líneas celulares de carcinoma microcítico de pulmón, tales como H526, ECC12, TMK1, MKN7, GCIY y HGC27.

Alternativamente, las células y las líneas celulares que expresan KIT —por ejemplo, KIT humano— pueden ser generadas rutinariamente de forma recombinante. Ejemplos no limitantes de células que pueden ser diseñadas para que expresen KIT de manera recombinante incluyen células COS, células HEK 293, células CHO, fibroblastos (por ejemplo, fibroblastos humanos), tales como células NIH3T3, y MEFS. En una realización específica, las células para su uso en los métodos descritos en la presente memoria son células CHO, por ejemplo células CHO del CHO GS System™ (Lonza). En una realización particular, estas células diseñadas expresan de manera exógena el KIT humano de longitud máxima (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1).

En ciertos aspectos, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria, que puede actuar como inhibidor de la actividad del KIT, es capaz de inhibir el desarrollo de tumores o inducir la regresión de tumores en estudios de modelos murinos. Por ejemplo, pueden introducirse líneas celulares tumorales en ratones desnudos, y pueden administrarse a los ratones anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria una o más veces, y el avance del tumor de las células tumorales inyectadas puede ser monitorizado a lo largo de un periodo de semanas y/o meses. En algunos casos, la administración de anticuerpos anti KIT a los ratones desnudos puede ocurrir antes de la introducción de las líneas celulares tumorales. Puede usarse cualquier línea celular tumoral apropiada (por ejemplo, una línea celular tumoral que exprese KIT) en los modelos murinos de xenotrasplante descritos en la presente memoria. Ejemplos no limitantes de líneas celulares tumorales para su uso en estos modelos murinos de xenotrasplante incluyen líneas celulares de leucemia megacarioblástica, tales como MO7e; líneas celulares de tumores estromales gastrointestinales, tales como ST-882, GIST-T1, GIST430, GIST48, GIST48B y GIST882; líneas celulares eritroleucémicas humanas, tales como HEL y TF-1; la línea celular de la leucemia promielocítica, HL60;

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líneas celulares de neuroblastoma, tales como SK-N-SH, SK-SY5Y, H-EP1, SK-N-BE(2), SK-N-BE(ZkM17), SK-N- BE(2)C, LA-N-1 o LA-N- 1-5s; líneas celulares del sarcoma de Ewing, tales como TC71, TC32, RD-eS, 5838, A4573, EWS-925, NCI-EWS-94 y NCI-EWS-95; y líneas celulares de carcinoma microcítico de pulmón, tales como H526, DMS153, DMS79, ECC12, TMK1, MKN7, GCIY y HGC27. En una realización específica, una línea celular tumoral para su uso en un modelo murino de xenotrasplante es la línea celular GIST882, GIST430, GIST48, GIST48B, HEL, HL60, H526, DMS153 o DMS79. En ciertas realizaciones, pueden generarse de manera recombinante líneas celulares adecuadas para su uso en modelos tumorales de xenotrasplante que expresen KIT en la célula. En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, o un conjugado los mismos) se unen específicamente al KIT e inhiben el crecimiento tumoral o inducen la regresión del tumor en un modelo murino en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica. En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, o un conjugado de los mismos) se unen específicamente al KIT e inhiben el crecimiento tumoral o inducen la regresión del tumor en un modelo murino en al menos aproximadamente un 25% o un 35%, opcionalmente a aproximadamente un 75%, evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica. En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT e inhiben el crecimiento tumoral o inducen la regresión del tumor en un modelo murino en al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica. La determinación del desarrollo tumoral o de la regresión del tumor puede ser evaluada monitorizando el tamaño del tumor a lo largo de un periodo de tiempo, tal como mediante la medicación física de tumores palpables, u otros métodos de detección visual. Por ejemplo, pueden generarse líneas celulares tumorales para expresar de manera recombinante un agente de visualización, tal como la proteína fluorescente verde (GFP) o la luciferasa; luego puede realizarse una visualización in vivo de la GFP por microscopía, y la visualización in vivo de la luciferasa puede realizarse administrando sustrato de luciferasa a los ratones xenotrasplantados y detectar la luminiscencia debida a la enzima luciferasa procesando el sustrato de luciferasa. El grado o nivel de detección de GFP o luciferasa está correlacionado con el tamaño del tumor en los ratones xenotrasplantados.

En ciertos aspectos, anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria se unen específicamente a antígeno de KIT y pueden aumentar la supervivencia de animales en modelos de xenotrasplante tumoral. En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, o un conjugado de los mismos) se unen específicamente al KIT y aumentan la supervivencia de ratones en modelos de xenotrasplante tumoral en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica. En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo) se unen específicamente al KIT y aumentan la supervivencia de ratones en modelos de xenotrasplante tumoral en al menos aproximadamente un 25% o un 35%, opcionalmente a aproximadamente un 75%, evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica. En realizaciones específicas, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen específicamente al KIT y aumentan la supervivencia de ratones en modelos de xenotrasplante tumoral en al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica. Se puede determinar la supervivencia trazando una curva de supervivencia del número de ratones supervivientes con respecto al tiempo (por ejemplo, días o semanas) tras la inyección de la línea celular tumoral.

En la presente memoria se proporcionan anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente un polipéptido KIT —por ejemplo, un polipéptido KIT humano; por ejemplo, una región D4 de KIT; por ejemplo, del KIT humano— con una afinidad particular.

La “afinidad” de un anticuerpo descrito en la presente memoria hacia un epítopo (por ejemplo, un epítopo de KIT) es un término bien entendido en la técnica y se refiere al grado o intensidad de la unión de un anticuerpo a un epítopo. La afinidad puede ser medida y/o expresada de varias maneras conocidas en la técnica, incluidas, sin limitación, la constante de disociación de equilibrio (Kd o Kd), la constante de disociación de equilibrio aparente (Kd' o Kd'), y la CI50 (cantidad necesaria para efectuar una inhibición del 50% en un ensayo de competición). Se entiende que, para los fines descritos en la presente memoria, una afinidad es una afinidad media para una población dada de anticuerpos que se unen a un epítopo. Los valores de Kd' descritos en la presente memoria en términos de miligramos (mg) de Ig por mL o mg/mL indican mg de Ig por mL de suero, aunque puede usarse plasma. Cuando se usa la afinidad de anticuerpos como base de la administración de los métodos de tratamiento descritos en la presente memoria, o para la selección para los métodos de tratamiento descritos en la presente memoria, la afinidad de los anticuerpos puede ser medida antes y/o durante el tratamiento, y los valores pueden ser usados por un clínico para evaluar si un paciente humano es un candidato apropiado para el tratamiento.

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En aspectos específicos, en la presente memoria se proporcionan anticuerpos (o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, o conjugados de los mismos) que tienen una afinidad de unión elevada (por ejemplo, anticuerpos que tienen una Kd inferior a 250 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM, 100 pM o 50 pM) hacia un antígeno de KIT, preferentemente un antígeno de KIT humano, en particular la región D4/D5 de un KIT humano.

En realizaciones específicas, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo) se une inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT (por ejemplo, a una región D4/D5 de KIT; por ejemplo, KIT humano), y tiene una constante de disociación (Kd) inferior a 500.000 pM (500 nM), inferior a 100.000 pM (100 nM), inferior a 50.000 pM (50 nM), inferior a 10.000 pM (10 nM), inferior a 3.000 pM (3 nM), inferior a 2,500 pM (2,5 nM), inferior a 2.000 pM, inferior a 1,500 pM, inferior a 1.000 pM, inferior a 750 pM, inferior a 500 pM, inferior a 250 pM, inferior a 200 pM, inferior a 150 pM, inferior a 100 pM, inferior a 75 pM evaluada usando un ensayo descrito en la presente memoria o conocido para un experto en la técnica (por ejemplo, un ensayo Biacore™) (Biacore™ International AB, Uppsala, Suecia). En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo) se une inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT (por ejemplo, a una región D4/D5 de KIT; por ejemplo, KIT humano), y tiene una Kd en el intervalo de 25 a 100.000 pM, de 25 a 75.000 pM, de 25 a 50.000 pM, de 25 a 40.000 pM, de 25 a

30.000 pM, de 25 a 20.000 pM, de 25 a 10.000 pM, de 25 a 1.000 pM, de 25 a 500 pM, de 25 a 250 pM, de 25 a 100 pM o de 25 a 50 pM evaluada usando métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, un ensayo Biacore™, un ensayo usando un instrumento KinExA 3000). En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo) se une inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT (por ejemplo, a una región D4 de KIT, por ejemplo KIT humano), y tiene una Kd de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 250 nM, o cualquier valor intermedio, evaluada usando métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, un ensayo Biacore™, un ensayo usando un instrumento KinExA 3000).

En realizaciones específicas, un anticuerpo anti KIT (o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo) se une inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT (por ejemplo, a una región D4 de KIT, por ejemplo KIT humano), y tiene una concentración en una unión del 50% al antígeno inferior a 3000 pM (3 nM), inferior a 2500 pM (2,5 nM), inferior a 2000 pM, inferior a 1500 pM, inferior a 1000 pM, inferior a 750 pM, inferior a 500 pM, inferior a 250 pM, inferior a 200 pM, inferior a 150 pM, inferior a 100 pM, inferior a 75 pM evaluada usando un ensayo descrito en la presente memoria o conocido para un experto en la técnica (por ejemplo, ELISA en fase sólida, según se describe en la Sección 6). En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo) se une inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT (por ejemplo, a una región D4 de KIT, por ejemplo KIT humano), y tiene una concentración en una unión del 50% al antígeno en el intervalo de 25 a 500.000 pM (500 nM), 25 a 250.000 pM (250 nM), 25 a 100.000 pM (100 nM), 25 a 75.000 pM (75 nM), 25 a 50.000 pM (50 nM), 25 a 40.000 pM (40 nM), 25 a 30.000 pM (30 nM), 25 a

20.000 pM (20 nM), 25 a 10.000 pM (10 nM), 25 a 1.000 pM (1 nM), 25 a 500 pM, 25 a 250 pM, 25 a 100 pM, o 25 a

50 pM evaluada usando métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, ELISA en fase sólida, según se describe en la Sección 6). En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo) se une inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT (por ejemplo, a una región D4 de KIT, por ejemplo KIT humano), y tiene una concentración en una unión del 50% al antígeno de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 25 nM, o cualquier valor intermedio, evaluada usando métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, ELISA en fase sólida, según se describe en la Sección 6). En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo) se une inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT (por ejemplo, a una región D4 de KIT, por ejemplo KIT

humano), y tiene una concentración en una unión del 50% al antígeno de aproximadamente 50 pM a

aproximadamente 500 pM, o cualquier valor intermedio, evaluada usando métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, ELISA en fase sólida, según se describe en la Sección 6). En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo) se une inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT (por ejemplo, a una región D4 de KIT; por ejemplo, KIT humano), y tiene una concentración en una unión del 50% de aproximadamente 0,5 nM, 0,25 nM, 0,1 nM, 1 nM, 1,5 nM, 2 nM, 2,5 nM, 3 nM, 3,5 nM, 4 nM, 4,5 nM, 5 nM, 5,5 nM, 6 nM, 6,5 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 10 nM, 11 nM, 12 nM, 13 nM, 14 nM, 15 nM, 16 nM, 17 nM, 18 nM, 19 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM o 500 nM, o menor, evaluada usando métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, ELISA en fase sólida, según se describe en la Sección 6). En una realización particular, anticuerpos descritos en la presente memoria se unen inmunoespecíficamente a antígeno de KIT (por ejemplo, a una región D4 de KIT; por ejemplo, KIT humano), y tienen una concentración en una unión del 50% de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 10 nM, evaluada usando métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, ELISA, un ensayo usando el instrumento KinExA 3000, o un ensayo Biacore™).

En la técnica son fácilmente disponibles y se describen métodos para determinar la afinidad de un anticuerpo hacia su antígeno diana. Por ejemplo, las afinidades y las propiedades de unión de un anticuerpo hacia su antígeno diana pueden determinarse mediante diversos métodos de ensayo in vitro (ensayos basados en la bioquímica o la inmunología) conocidos en la técnica, tales como métodos de equilibrio (por ejemplo, el ensayo por inmunoabsorción

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ligado a enzimas (ELISA), o un radioinmunoensayo (RIA)), o métodos cinéticos (por ejemplo, análisis Biacore™) y otros, tales como ensayos de unión indirecta, ensayos de inhibición competitiva, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), inmunoprecipitación, electroforesis y cromatografía en gel (por ejemplo, filtración en gel). Estos y otros métodos pueden utilizar un marcador en uno o más de los componentes que se estén examinando y/o emplear diversos métodos de detección, incluyendo, sin limitación, marcadores cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes o isotópicos. En ciertas realizaciones, no es necesario el uso de marcadores; por ejemplo, los sistemas Biacore™ utilizan el fenómeno natural de la resonancia plasmónica de superficie (SPR) para suministrar datos en tiempo real, sin el uso de marcadores. Puede encontrarse una descripción detallada de las afinidades y la cinética de unión en Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4a ed. (Lippincott-Raven, Filadelfia 1999), que se centra en las interacciones anticuerpo-inmunógeno.

En ciertos aspectos, la afinidad de un anticuerpo descrito en la presente memoria hacia un antígeno de KIT —por ejemplo, del KIT humano; por ejemplo hacia una región D4 de KIT (por ejemplo, del KIT humano)— puede ser calificada indirectamente usando ensayos a base de células. Por ejemplo, células que expresen KIT en la superficie de su membrana celular pueden ser puestas en contacto con anticuerpos anti KIT, y pueden determinarse las actividades celulares aguas abajo del KIT usando ensayos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la fosforilación del dominio citoplasmático del KIT puede ser determinada por inmunotransferencia (o inmunoelectrotransferencia) tras la puesta en contacto de las células con un anticuerpo anti KIT; se obtienen y procesan extractos celulares para la inmunotransferencia (por ejemplo, sometiendo los extractos celulares a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y transfiriendo las proteínas separadas en el gel a una membrana (por ejemplo, de nitrocelulosa o fluoruro de polivinilideno (PVDF)) con un anticuerpo que se une específicamente a una tirosina fosforilada en el dominio citoplasmático de KIT, pero no se una a una tirosina no fosforilada.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria se une específicamente a un antígeno de KIT —por ejemplo, del KIT humano; por ejemplo a una región D4 de KIT (por ejemplo, del KIT humano)— e induce o potencia la dimerización y la fosforilación del KIT, en presencia o ausencia del ligando de KIT SCF. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria puede inhibir o disminuir la unión de ligandos de KIT —por ejemplo, SCF— a KIT (es decir, un anticuerpo anti KIT puede competir con un ligando de KIT —por ejemplo, SCF— para la unión a KIT). En tal caso, las células pueden ser puestas en contacto con un anticuerpo anti KIT y un ligando de KIT, y se puede determinar el grado de inhibición de la fosforilación de KIT como una indicación del grado en el que el anticuerpo anti KIT compite con el ligando de KIT para la unión a KIT.

Los anticuerpos incluyen, sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos producidos de forma recombinante, anticuerpos multiespecíficos (incluyendo anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos sintéticos, anticuerpos tetraméricos que comprenden una molécula con dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, un monómero de cadena ligera de anticuerpo, un monómero de cadena pesada de anticuerpo, un dímero de cadena ligera de anticuerpo, un dímero de cadena pesada de anticuerpo, una pareja de cadena ligera de anticuerpo-cadena pesada de anticuerpo, intracuerpos, anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos de un único dominio, anticuerpos monovalentes, anticuerpos monocatenarios o Fv monocatenarios (scFv) (incluyendo, por ejemplo, los monoespecíficos, los biespecíficos, etc.), anticuerpos camélidos, aficuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fv con enlace disulfuro (sdFv), anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-anti-Id), y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. En ciertas realizaciones, los anticuerpos descritos en la presente memoria se refieren a poblaciones de anticuerpos policlonales. Los anticuerpos pueden ser cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY), cualquier clase (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi o IgA2), o cualquier subclase (por ejemplo, IgG2a o IgG2b) de molécula de inmunoglobulina. En ciertas realizaciones, los anticuerpos descritos en la presente memoria son anticuerpos IgG, o una clase (por ejemplo, IgGi o IgG4 humanas) o subclase de los mismos. En realizaciones específicas, un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo producido por un solo hibridoma u otra célula, uniéndose inmunoespecíficamente el anticuerpo se une a una región D4 del epítopo del KIT humano, según se determina, por ejemplo, mediante ELISA u otro ensayo de unión a antígeno o de unión competitiva conocido en la técnica o en los Ejemplos proporcionados en la presente memoria. El término “monodonal” no está limitado a ningún método particular de creación del anticuerpo.

En una realización particular, un anticuerpo en la presente memoria se proporciona un fragmento Fab que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT, tal como la región D4 de KIT. En una realización específica, los anticuerpos descritos en la presente memoria son anticuerpos monoclonales o anticuerpos monoclonales aislados. En otra realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria es un anticuerpo monoclonal humanizado. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria es un anticuerpo recombinante; por ejemplo, un anticuerpo humano recombinante, un anticuerpo humanizado recombinante o un anticuerpo monoclonal recombinante. En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria contiene secuencias no humanas de aminoácidos; por ejemplo, CDR no humanas o residuos de marco no humanos (por ejemplo, de un primate no humano).

En realizaciones particulares proporcionadas en la presente memoria, se pueden aislar, preparar, expresar o crear anticuerpos recombinantes por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado a una célula anfitriona, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos

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combinatorios recombinantes, o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique la creación, por ejemplo, mediante síntesis, ingeniería genética de secuencias de ADN que codifiquen secuencias de inmunoglobulina humana, o el empalme de secuencias que codifican inmunoglobulinas humanas — por ejemplo, secuencias de genes de inmunoglobulina humana— a otras secuencias de ese tipo. En ciertas realizaciones, las secuencias de aminoácidos de tales anticuerpos recombinantes han sido modificadas de modo que las secuencias de aminoácidos de tales anticuerpos —por ejemplo, regiones VH y/o VL— son secuencias que no existen de forma natural dentro del repertorio de líneas germinales de anticuerpos de un organismo in vivo; por ejemplo un repertorio de líneas germinales murinas o humanas. En una realización particular, se puede obtener un anticuerpo recombinante ensamblando varios fragmentos de secuencias que existen de forma natural en un organismo (por ejemplo, un primate, tal como un ser humano) creando una secuencia compuesta de un anticuerpo recombinante, no existiendo la secuencia compuesto de forma natural dentro de un organismo (por ejemplo, un primate, tal como un ser humano).

Los anticuerpos proporcionados en la presente memoria incluyen moléculas de inmunoglobulina de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. En una realización específica, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria es un anticuerpo de IgG (por ejemplo, un anticuerpo de IgG humana), o una clase (por ejemplo, IgG1 o IgG4 humana) o una subclase del mismo. En otra realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria es un anticuerpo de IgG1 (por ejemplo, de IgG1 humana (isotipo a, z o f)) o de IgG4. En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria es un anticuerpo completo o entero; por ejemplo, un anticuerpo humano, humanizado completo o entero o humano compuesto.

Los anticuerpos proporcionados en la presente memoria pueden incluir fragmentos de anticuerpos que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno; por ejemplo, a un epítopo de KIT (por ejemplo, un epítopo de KIT dentro de un polipéptido KIT que contiene una región D4 del KIT humano). En una realización específica, los fragmentos incluyen fragmentos Fab (un fragmento de anticuerpo que contiene el dominio de unión al antígeno y comprende una cadena ligera y parte de una cadena pesada (es decir, los dominios VH y CH1 de una cadena pesada) puenteadas por un enlace disulfuro); Fab' (un fragmento de anticuerpo que contiene un solo dominio de unión a antígeno que comprende un Fab y una porción adicional de la cadena pesada hasta la región bisagra); F(ab')2 (dos moléculas Fab' unidas por enlaces disulfuro intercatenarios en las regiones bisagra de las cadenas pesadas; las moléculas Fab' pueden ser dirigidas hacia epítopos iguales o diferentes); un Fab biespecífico (una molécula Fab que tiene dos dominios de unión a antígeno, cada uno de los cuales puede ser dirigido a un epítopo diferente); una cadena Fab monocatenaria que comprende una región variable, también denominada sFv (la región variable determinativa de la unión a antígenos de una sola cadena ligera y una sola cadena pesada de un anticuerpo ligadas entre sí por una cadena de 10-25 aminoácidos); un Fv ligado por disulfuro, o dsFv (la región variable determinativa de la unión a antígenos de una sola cadena ligera y una sola cadena pesada de un anticuerpo ligadas entre sí por un enlace disulfuro); una VH camelizada (la región variable determinativa de la unión a antígenos de una sola cadena pesada de un anticuerpo en la que algunos aminoácidos en la interfaz VH son los encontrados en la cadena pesada de anticuerpos de camello que se dan de forma natural); un sFv biespecífico (una molécula de sFv o de dsFv que tiene dos dominios de unión a antígenos, cada uno de los cuales puede ser dirigido a un epítopo diferente); un diacuerpo (un sFv dimerizado formado cuando el dominio VH de un primer sFv se ensambla con el dominio VL de un segundo sFv y el dominio VL del primer sFv se ensambla con el dominio VH del segundo sFv; las dos regiones de unión a antígenos del diacuerpo pueden ser dirigidas hacia epítopos iguales o diferentes); y un triacuerpo (un sFv trimerizado, formado de manera similar a un diacuerpo, pero en el cual se crean tres dominios de unión a antígenos en un único complejo; los tres dominios de unión a antígeno pueden ser dirigidos hacia epítopos iguales o diferentes). Los anticuerpos proporcionados en la presente memoria también pueden incluir una o más secuencias de CDR de un anticuerpo. Las secuencias de CDR pueden ser ligadas entre sí en un supercóntigo cuando hay presentes dos o más secuencias de CDR. En ciertas realizaciones, un anticuerpo comprende un Fv monocatenario (“scFv”). Los scFv son fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, estando presentes estos dominios en una sola cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido del scFv comprende, además, un conector de polipéptidos entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una reseña de los scFv, véase a Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore ed. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994). Sin limitación a ninguna teoría particular, las moléculas de Fv pueden ser capaces de penetrar tejidos debido a su pequeño tamaño. Un anticuerpo completo puede ser escindido enzimáticamente por pepsina para producir un fragmento F(ab')2 , o puede ser escindido enzimáticamente por papaína para producir dos fragmentos Fab.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos descritos en la presente memoria son anticuerpos monoclonales humanos, humanos compuestos o humanizados. En una realización particular, un anticuerpo descrito en la presente memoria es un anticuerpo diseñado; por ejemplo, un anticuerpo producido por métodos recombinantes. En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria es un anticuerpo humanizado que comprende una o más CDR no humanas (por ejemplo, de roedor o murinas) y una o más regiones marco (FR) humanas, y, opcionalmente, una región constante de cadena pesada y/o una región constante de cadena ligera humanas. En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria comprende una o más regiones marco de primate (o de primate no humano). En una realización específica, un anticuerpo descrito en la presente memoria no comprende regiones marco de primate no humano.

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Los anticuerpos proporcionados en la presente memoria pueden incluir anticuerpos que comprenden modificaciones químicas; por ejemplo, anticuerpos que han sido modificados químicamente; por ejemplo, por unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo. Por ejemplo, pero no a título de limitación, un anticuerpo anti KIT puede ser glucosilado, acetilado, pegilado, fosforilado o amidado, puede ser derivatizado por medio de grupos protectores/de bloqueo, o puede comprender, además, un ligando celular u otra proteína o péptido, etc. Por ejemplo, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria puede ser modificado químicamente; por ejemplo, por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, vinculación de un ligando celular o a otra proteína, etc. Además, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

En una realización particular, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo anti KIT que ha sido modificado de una manera adecuada para su fabricación a gran escala; por ejemplo, en la plataforma de fabricación de Lonza (Basilea, Suiza). Por ejemplo, puede usarse la plataforma de tecnología BI-HEX® (Boehringer Ingelheim, Alemania) para adaptar los anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria para una fabricación adecuada a gran escala en sistemas de expresión de células de mamífero recombinantes. Tal adaptación puede implicar la clonación de secuencias de polinucleótidos que codifiquen los dominios necesarios de un anticuerpo anti KIT, tales como una o más CDR o FR, en un vector adecuado de expresión que también contenga secuencias de polinucleótidos que codifiquen regiones constantes adecuadas, para que se produzca un anticuerpo entero. Las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por los vectores de expresión son secuencias de nucleótidos que pueden ser optimizadas para maximizar la producción y la estabilidad de los anticuerpos para las condiciones y los procedimientos de purificación del cultivo celular.

5.1.1. Conjugados

En algunas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanos o humanizados), o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, conjugados o fusionados de forma recombinante con un agente diagnóstico, detectable o terapéutico o a cualquier otra molécula. Los anticuerpos conjugados o fusionados de forma recombinante pueden ser útiles, por ejemplo, para monitorizar o pronosticar la aparición, el desarrollo, el avance y/o la gravedad de un trastorno o enfermedad asociado con KIT; por ejemplo, como parte de un procedimiento de prueba clínica, tal como determinar la eficacia de una terapia particular. Los anticuerpos conjugados o fusionados de forma recombinante pueden ser útiles, por ejemplo, para el tratamiento o la gestión de un trastorno asociado con KIT (por ejemplo, cáncer), o para el tratamiento o la gestión de los efectos de un trastorno asociado con KIT (por ejemplo, cáncer). Los anticuerpos descritos en la presente memoria también pueden ser conjugados con una molécula (por ejemplo, polietilenglicol) que puedan afectar a una o más propiedades biológicas y/o moleculares de los anticuerpos; por ejemplo, la estabilidad (por ejemplo, en suero), la vida media, la solubilidad y la antigenicidad.

En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un conjugado que comprende un agente (por ejemplo, un agente terapéutico) ligado a un anticuerpo descrito en la presente memoria (o a un fragmento de unión a antígeno del mismo), anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano (por ejemplo, la SEQ ID NO: 15). En una realización específica, un anticuerpo conjugado se une específicamente a una región D4 de KIT (por ejemplo, del KIT humano), y comprende un anticuerpo que comprende las CDR definidas en la Tabla 1, la Tabla 2 o la Tabla 3. En una realización específica, un anticuerpo conjugado se une específicamente a una región D4 de KIT (por ejemplo, del KIT humano) y comprende una región de cadena VL que comprenden una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 20 y 21, respectivamente, y/o una región de cadena VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente. En una realización específica, un anticuerpo conjugado se une específicamente a una región d4 de KIT (por ejemplo, del KIT humano), y comprende uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20. En una realización específica, un anticuerpo conjugado proporcionado en la presente memoria se une específicamente a una región D4 de KIT (por ejemplo, del KIT humano), y comprende un anticuerpo que comprende una VL y/o una VH que comprenden CDR seleccionadas de la Tabla 1, la Tabla 2 o la Tabla 3, y Fr seleccionadas de las Tablas 5A-5D. En una realización específica, un anticuerpo conjugado proporcionado en la presente memoria se une específicamente a una región D4 de KIT (por ejemplo, del KIT humano), y comprende un anticuerpo que comprende una VL que comprende la SEQ ID NO: 12 y/o una Vh que comprende la SEQ ID NO: 11. En una realización, un anticuerpo que está conjugado es aquel que se une a una región D4 del KIT humano con una afinidad —por ejemplo, una CE50— de aproximadamente 200 pM o menos. En otra realización, un anticuerpo que está conjugado es aquel que inhibe una actividad biológica de KIT. En realizaciones específicas, un conjugado comprende un anticuerpo descrito en la presente memoria y una molécula (por ejemplo, un resto terapéutico o farmacológico), estando ligado el anticuerpo directamente a la molécula, o por medio de uno o más conectores. En ciertas realizaciones, un anticuerpo está conjugado covalentemente con una molécula. En una realización particular, un anticuerpo está conjugado de forma no covalente con una molécula. En realizaciones específicas, un anticuerpo descrito en la presente memoria —por ejemplo, un anticuerpo conjugado con un agente— se une al KIT humano de la forma natural. En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria —por ejemplo, un anticuerpo conjugado con un agente— se une a un dominio extracelular del KIT humano que comprende una mutación; por ejemplo una mutación somática asociada con el cáncer (por ejemplo,

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GIST), tal como una mutación en el exón 9 del KIT humano en la que están duplicados los residuos Ala y Tyr en las posiciones 502 y 503.

Tal diagnóstico y tal detección pueden lograrse, por ejemplo, emparejando el anticuerpo con moléculas o sustancias detectables incluyendo, sin limitación, diversas enzimas, tales como, sin limitación, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos protésicos, tales como, sin limitación, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, sin limitación, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, sin limitación, luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, sin

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limitación, luciferasa, luciferina y aequorina; materiales radiactivos, tales como, sin limitación, iodo (I, I, I e 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, e 111In), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd). molibdeno (99Mo). xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se

metales emisores de positrones usando diversas tomografías de emisión positrónica, e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.

175-

Yb,

166Ho, 90Y,

113Sn y 117Sn; y

Se proporcionan anticuerpos descritos en la presente memoria, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, conjugados o fusionados de forma recombinante con un resto terapéutico (o a uno o más restos terapéuticos) y usos de tales anticuerpos. El anticuerpo puede estar conjugado o fusionado de forma recombinante con un resto terapéutico, tal como una citotoxina; por ejemplo, un agente citoestático o citocida, un ion metálico radiactivo; por ejemplo, emisores de partículas alfa. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los restos terapéuticos incluyen, sin limitación, auristatina o un derivado de la misma —por ejemplo, monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), auristatina PYE y auristatina E (Ae) (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n° 7.662.387 y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense nos 2008/0300192 y 2008/0025989)—; un agente disruptor de microtúbulos —por ejemplo, maitansina o un derivado de la misma; por ejemplo, maitansinoide DM1 (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos 7.851.432, 7.575.748 y 5.416.064)—; un profármaco —por ejemplo, un profármaco de un análogo de CC-1065 (raquelmicina)—; antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil dacarbazina); agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diaminodicloroplatino (II) (DDP) y cisplatino); agentes alquilantes de unión al surco menor; antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina); antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)); moléculas de auristatina (por ejemplo, auristatina PHE, briostatina 1, y solastatina 10; véanse Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 46:3802-8 (2002), Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580-4 (2001), Mohammad et al., Anticancer Drugs 12:735-40 (2001), Wall et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76-80 (1999), Mohammad et al., Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999); hormonas (por ejemplo, glucocorticoides, progestinas, andrógenos y estrógenos), inhibidores de la enzima reparadora del ADN (por ejemplo, etopósido o topotecán), inhibidores de las quinasas (por ejemplo, el compuesto ST1571, mesilato de imatinib (Kantarjian et al., Clin Cancer Res. 8(7):2167-76 (2002)); agentes citotóxicos (por ejemplo, paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantraceno diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dihidrotestosterona, glucorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos, y los compuestos dados a conocer en las patentes estadounidenses nos 6.245.759, 6.399.633, 6.383.790, 6.335.156, 6.271.242, 6.242.196, 6.218.410, 6.218.372, 6.057.300, 6.034.053, 5.985.877, 5.958.769, 5.925.376, 5.922.844, 5.911.995, 5.872.223, 5.863.904, 5.840.745, 5.728.868, 5.648.239, 5.587.459); inhibidores de la farnesiltransferasa (por ejemplo, R115777, BMS-214662, y los dados a conocer, por ejemplo, por las patentes estadounidenses nos 6.458.935, 6.451.812, 6.440.974, 6.436.960, 6.432.959, 6.420.387, 6.414.145, 6.410.541, 6.410.539, 6.403.581, 6.399.615, 6.387.905, 6.372.747, 6.369.034,

6.362.188, 6.342.765, 6.342.487, 6.300.501, 6.268.363, 6.265.422, 6.248.756, 6.239.140, 6.232.338, 6.228.865,

6.228.856, 6.225.322, 6.218.406, 6.211.193, 6.187.786, 6.169.096, 6.159.984, 6.143.766, 6.133.303, 6.127.366,

6.124.465, 6.124.295, 6.103.723, 6.093.737, 6.090.948, 6.080.870, 6.077.853, 6.071.935, 6.066.738, 6.063.930,

6.054.466, 6.051.582, 6.051.574 y 6.040.305); inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo, camptotecina; irinotecán; SN-38; topotecán; 9-aminocamptotecina; GG-211 (GI 147211); DX-8951f; iSt-622; rubitecán; pirazoloacridina; XR-5000; saintopina; UCE6; UCE1022; TAN-1518A; TAN 1518B; KT6006; KT6528; ED-110; NB- 506; ED-110; NB-506 y rebecamicina); bulgareína; enlazadores al surco menor del ADN, como la tinción 33342 de Hoescht y la tinción 33258 de Hoescht; nitidina; fagaronina; epiberberina; coralina; beta-lapacona; BC-4-1; bisfosfonatos (por ejemplo, alendronato, cimadronato, clodronato, tiludronato, etidronato, ibandronato, neridronato, olpandronato, risedronato, piridronato, pamidronato, zolendronato); inhibidores de la HMG-CoA reductasa (por ejemplo, lovastatina, simvastatina, atorvastatina, pravastatina, fluvastatina, estatina, cerivastatina, lescol, lupitor, rosuvastatina y atorvastatina); oligonucleótidos no codificantes (por ejemplo, los datos a conocer en las patentes estadounidenses nos 6.277.832, 5.998.596, 5.885.834, 5.734.033 y 5.618.709); inhibidores de la adenosín desaminasa (por ejemplo, fosfato de fludarabina y 2-clorodesoxiadenosina); ibritumomab tiuxetano (Zevalin®); tositumomab (Bexxar®)) y sales farmacéuticamente aceptables, solvatos, clatratos y profármacos de los mismos. En una realización, un anticuerpo que está conjugado con tal resto terapéutico/farmacológico es aquel que se una a una región D4 del KIT humano con una afinidad inferior a aproximadamente 200 pM. En otra realización, un anticuerpo que está conjugado con tal resto terapéutico/farmacológico es aquel que inhibe una actividad biológica de KIT. En

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una realización específica, un anticuerpo que está conjugado con tal resto terapéutico/farmacológico es aquel que comprende las CDR definidas en la Tabla 1 (por ejemplo, CDR1 VL, CDR2 VL y CDR3 VL que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 20 y 21, respectivamente, y/o una región de cadena VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 Vh que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente), o en la Tabla 2 o la Tabla 3. En una realización específica, un anticuerpo que está conjugado con tal resto terapéutico/farmacológico es aquel que comprende una VL que comprende la SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 o 12 o una secuencia definida en las Tablas 5B y 5D, y/o una VH que comprende la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 u 11 o una secuencia definida en las Tablas 5A y 5C.

En realizaciones particulares, un resto terapéutico o resto farmacológico es un fármaco antitubulina, tal como una auristatina o un derivado de la misma. Ejemplos no limitantes de auristatinas incluyen monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), auristatina PYE y auristatina E (AE) (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n° 7.662.387 y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense nos 2008/0300192 y 2008/0025989). En ciertas realizaciones, un resto terapéutico o resto farmacológico es un agente disruptor de microtúbulos, tal como maitansina o un derivado de la misma; por ejemplo, maitansinoide DM1 o DM4 (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos 7.851.432, 7.575.748 y 5.416.064). En ciertas realizaciones, un resto terapéutico o resto farmacológico es un profármaco; por ejemplo, un profármaco de un análogo de CC-1065 (raquelmicina) (véanse, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n° 2008/0279868, y las publicaciones de solicitud de patente internacional PCT nos WO 2009/017394, WO 2010/062171 y WO 2007/089149). En una realización, un anticuerpo que está conjugado con tal resto terapéutico/farmacológico es aquel que se une a una región D4 del KIT humano con una afinidad inferior a aproximadamente 200 pM. En otra realización, un anticuerpo que está conjugado con tal resto terapéutico/farmacológico es aquel que inhibe una actividad biológica de KIT. En una realización específica, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) que está conjugado con tal resto terapéutico/farmacológico es aquel que comprende las CDR definidas en la Tabla 1 (por ejemplo, CDR1 VL, CDR2 VL y CDR3 VL que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 20 y 21, respectivamente, y/o una región de cadena VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 Vh que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente), o en la Tabla 2 o la Tabla 3. En una realización específica, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) que está conjugado con tal resto terapéutico/farmacológico es aquel que comprende una Vl que comprende la SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 o 12 o una secuencia definida en las Tablas 5B y 5D, y/o una VH que comprende la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 u 11 o una secuencia definida en las Tablas 5A y 5C.

En una realización específica, el anticuerpo y el agente terapéutico/farmacológico están conjugados por medio de uno o más conectores. En otra realización específica, el anticuerpo y el agente terapéutico/farmacológico están conjugados directamente.

En realizaciones específicas, ejemplos no limitantes de restos terapéuticos o restos farmacológicos para la conjugación con un anticuerpo descrito en la presente memoria incluyen calicheamicinas (por ejemplo, el complejo LL-E33288; por ejemplo, la gamma-calicheamicina; véase, por ejemplo, la patente estadounidense n° 4,970,198) y derivados de las mismas (por ejemplo, los derivados de la hidrazida de gamma calicheamicina), ozogamicinas, duocarmicinas y derivados de las mismas (por ejemplo, CC-1065 (NSC 298223), o un análogo aquiral de la duocarmicina (por ejemplo AS-1-145 o centanamicina)), taxanos y derivados de los mismos, y enediínas y derivados de las mismas (véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente internacional PCT nos WO 2009/017394, WO 2010/062171, WO 2007/089149, WO 2011/021146, WO 2008/150261, WO 2006/031653, WO 2005/089809, WO 2005/089807 y WO 2005/089808). En una realización específica, un anticuerpo que está conjugado con tal resto terapéutico/farmacológico es aquel que comprende las CDR definidas en la Tabla 1 (por ejemplo, CDR1 VL, CDR2 VL y CDR3 VL que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 21 y 22, respectivamente, y/o una región de cadena Vh que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, 24 y 25, respectivamente). En una realización específica, un anticuerpo que está conjugado con tal resto terapéutico/farmacológico es aquel que comprende una VL que comprende la SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 o 12 o una secuencia definida en las Tablas 5B y 5d, y/o una VH que comprende la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 u 11 o una secuencia definida en las Tablas 5A y 5C. En una realización específica, el anticuerpo y el agente terapéutico están conjugados por medio de uno o más conectores. En otra realización específica, el anticuerpo y el agente terapéutico están conjugados directamente.

Ejemplos no limitantes de calicheamicinas adecuadas para la conjugación con un anticuerpo descrito en la presente memoria son dados a conocer, por ejemplo, en las patentes estadounidenses nos 4.671.958; 5.053.394; 5.037.651; 5.079.233; y 5.108.912; y en las publicaciones de solicitud de patente internacional PCT nos WO 2011/021146, WO 2008/150261, WO 2006/031653, WO 2005/089809, WO 2005/089807 y WO 2005/089808. En realizaciones particulares, estos compuestos pueden contener un metilsulfuro que reacciona con los tioles apropiados para formar disulfuros, y, al mismo tiempo, introduce un grupo funcional tal como una hidrazida u otro grupo funcional que pueda ser útil para conjugar la calicheamicina con un anticuerpo descrito en la presente memoria. En ciertas realizaciones, la estabilización del enlace disulfuro que está presente en conjugados de calicheamicina añadiendo sustituyentes de dimetilo puede producir un conjugado anticuerpo/fármaco mejorado. En realizaciones específicas, el derivado de calicheamicina es N-acetil gamma calicheamicina dimetil hidrazida o NAc-gamma DMH (CL-184,538), como uno de los derivados optimizados para la conjugación. Las patentes estadounidenses nos 5.606.040 y 5.770.710, por

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ejemplo, describen análogos de disulfuro de la calicheamicina que pueden ser conjugados con un anticuerpo descrito en la presente memoria. En cierta realización, un resto (por ejemplo, calicheamicina o un derivado de la misma) es conjugado con un anticuerpo por un conector. En una realización particular, un resto (por ejemplo, calicheamicina o un derivado de la misma) es hidrolizado a partir de un conjugado anticuerpo-fármaco en el conector. En una realización, un resto (por ejemplo, calicheamicina o un derivado de la misma) es hidrolizado a partir de un conjugado de anticuerpo en el conector entre aproximadamente un pH de 3,0 y un pH de 4,0 durante 1-24 horas a una temperatura de 20 a 50°C, preferentemente 37°C.

En realizaciones específicas, ejemplos no limitantes de restos terapéuticos o restos farmacológicos para la conjugación con un anticuerpo descrito en la presente memoria incluyen pirrolobenzodiazepinas (PBD) y derivados de las mismas; por ejemplo, dímeros de PBD (por ejemplo, SJG-136 o SG2000), dímeros de PBD C2-insaturados, dímeros de pirrolobenzodiazepina portadores de sustituciones arílicas C2 (por ejemplo, SG2285), profármaco dimérico de PBD que se activa por hidrólisis (por ejemplo, SG2285), y polipirrol-PBD (por ejemplo, SG2274) (véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente internacional PcT nos WO 2000/012507, WO 2007/039752, WO 2005/110423, WO 2005/085251 y WO 2005/040170, y la patente estadounidense n° 7.612.062). En una realización específica, un anticuerpo que está conjugado con tal resto terapéutico/farmacológico es aquel que comprende las CDR definidas en la Tabla 1 (por ejemplo, CDR1 VL, CDR2 VL y CDR3 VL que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 20 y 21, respectivamente, y/o una región de cadena VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 Vh que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente), o en la Tabla 2 o la Tabla 3. En una realización específica, un anticuerpo que está conjugado con tal resto terapéutico/farmacológico es aquel que comprende una VL que comprende la SEQ iD NO: 7, 8, 9, 10 o 12 o una secuencia definida en las Tablas 5B y 5D, y/o una VH que comprende SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 u 11 o una secuencia definida en las Tablas 5A y 5C. En una realización específica, el anticuerpo y el agente terapéutico están conjugados por medio de uno o más conectores.

Además, un anticuerpo descrito en la presente memoria puede estar conjugado o fusionado de forma recombinante con un resto terapéutico o resto farmacológico que modifique una respuesta biológica dada. No se debe interpretar que los restos terapéuticos o restos farmacológicos estén limitados a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto farmacológico puede ser una proteína, un péptido o un polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotosina pseudomonas, toxina del cólera o toxina de la difteria; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, el interferón y, el interferón a, el factor de crecimiento nervioso, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el activador tisular del plasminógeno, un agente apoptótico —por ejemplo, TNF-y, TNF-y, AIM I (véase la publicación internacional n° WO 97/33899)—, AIM II (véase la publicación internacional n° WO 97/34911), el ligando Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567-1574), y VEGF (véase la publicación internacional n° Wo 99/23105), un agente anti angiogénico —por ejemplo, angiostatina, endostatina o un componente del sistema de coagulación (por ejemplo, un factor tisular); o un modificador de la respuesta biológica, tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interferón gamma, interleucina-1 (“IL-1”), interleucina-2 (“IL-2”), interleucina-5 (“IL-5”), interleucina-6 (“IL-6”), interleucina-7 (“IL-7”), interleucina 9 (“IL-9”), interleucina-10 (“IL-10”), interleucina-12 (“IL-12”), interleucina-15 (“IL- 15”), interleucina-23 (“IL-23”), el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (“GM-CSF”), y el factor estimulante de colonias de granulocitos (“G-CSF”)), o un factor de crecimiento (por ejemplo, la hormona de crecimiento (“GH”)), o un agente de coagulación (por ejemplo, calcio, vitamina K, factores tisulares, tales como, sin limitación, el factor de Hageman (factor XII), el quininógeno de alto peso molecular (HMWK), la precalicreína (PK), proteínas-factores II de coagulación (protrombina), factores V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, XIa, IX, IXa, X, fosfolípidos y monómeros de fibrina.

En la presente memoria se proporcionan anticuerpos fusionados de forma recombinante o conjugados químicamente (conjugaciones covalentes o no covalentes) con un polipéptido o proteína heterólogo (o a un fragmento del mismo, preferentemente a un polipéptido de aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o aproximadamente 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. En particular, en la presente memoria se proporcionan proteínas de fusión que comprenden un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab)2, un dominio VH, una CDR Vh, un dominio VL o una CDR VL) y un polipéptido, péptido o proteína heterólogo. En una realización, el polipéptido, péptido o proteína heterólogo al que está fusionado el anticuerpo es útil para dirigir el anticuerpo a un tipo particular de célula, tal como una célula que exprese KIT. Por ejemplo, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un receptor de la superficie de la célula expresado por un tipo particular de célula (por ejemplo, una célula inmunitaria) puede ser fusionado o conjugado con un anticuerpo modificado descrito en la presente memoria. En realizaciones específicas, el polipéptido o proteína heterólogo (o un fragmento del mismo) se une a una segunda diana (por ejemplo, una diana distinta de KIT) (véanse, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional PCT n° WO 2009/088805 y la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2009/0148905).

En la presente memoria se proporciona una proteína conjugada o de fusión que comprende cualquier anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un polipéptido heterólogo (por ejemplo, a polipéptido distinto de KIT). En una realización, una proteína conjugada o de fusión descrita en la

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presente memoria comprende un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria, y un polipéptido heterólogo. En otra realización, una proteína conjugada o de fusión proporcionada en la presente memoria comprende un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria, y un polipéptido heterólogo. En otra realización, una proteína conjugada o de fusión descrita en la presente memoria comprende un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los dominios VH de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria, y/o un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los dominios VL de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria, y un polipéptido heterólogo. En otra realización, una proteína conjugada o de fusión descrita en la presente memoria comprende una o más CDR VH que tienen la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 16, 17 y 18 (véase, por ejemplo, la Tabla 1), o la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR definidas en la Tabla 2 o 3, y un polipéptido heterólogo. En otra realización, una proteína conjugada o de fusión comprende una o más CDR VL que tienen la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR VL de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria (por ejemplo, las CDR VL de la Tabla 1, las SEQ ID NOs: 19, 20 y 21, o las CDR VL de la Tabla 2 o la Tabla 3), y un polipéptido heterólogo. En otra realización, una proteína conjugada o de fusión descrita en la presente memoria comprende al menos un dominio VH y al menos un dominio VL de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria, y un polipéptido heterólogo. En otra realización, una proteína conjugada o de fusión descrita en la presente memoria comprende al menos un dominio VH y al menos un dominio VL que comprende la SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 o 12 o una secuencia definida en las Tablas 5B y 5D, y/o un dominio VH que comprende la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 u 11 o una secuencia definida en las Tablas 5A y 5C, y un polipéptido heterólogo. En otra realización más, una proteína conjugada o de fusión descrita en la presente memoria comprende al menos una CDR VH y al menos una CDR VL de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria (por ejemplo, las CDR VL y las CDR VH de la Tabla 1 o de la Tabla 2 o de la Tabla 3), y un polipéptido heterólogo.

Además, un anticuerpo descrito en la presente memoria puede ser conjugado con restos terapéuticos tales como iones metálicos radiactivos, tales como emisores de partículas alfa tales como 213Bi o quelantes macrocíclicos útiles

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para conjugar radioiones metálicos, incluyendo, sin limitación, In, LU, Y, Ho, Sm, con polipéptidos. En ciertas realizaciones, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N,N',N",Nm-tetraacético (DOTA), que puede unirse al anticuerpo por medio de una molécula conectora. Tales moléculas conectoras son comúnmente conocidas en la técnica y están descritas en Denardo et al., 1998, Clin Cáncer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, está conjugado con una o más moléculas (por ejemplo, un resto terapéutico o farmacológico) directa o indirectamente por medio de una o más moléculas conectoras. En realizaciones particulares, un conector es un conector escindible por enzimas o un conector de disulfuro. En una realización específica, el conector escindible es escindible por medio de una enzima tal como una aminopeptidasa, una aminoesterasa, una dipeptidil carboxi peptidasa, o una proteasa de la cascada de coagulación de la sangre. En realizaciones particulares, un conector comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 20 residuos de aminoácido. En ciertas realizaciones, un conector consiste en de 1 a 10 residuos de aminoácido, de 1 a 15 residuos de aminoácido, de 5 a 20 residuos de aminoácido, de 10 a 25 residuos de aminoácido, de 10 a 30 residuos de aminoácido, o de 10 a 50 residuos de aminoácido.

En ciertas realizaciones, hay un resto conjugado con un anticuerpo por medio de uno o más conectores. En una realización particular, un resto está hidrolizado del conjugado anticuerpo-fármaco en el conector. En una realización, un resto es hidrolizado del conjugado de anticuerpos en el conector entre aproximadamente un pH de 3,0 y un pH 4,0 durante aproximadamente 1-24 horas, y a una temperatura entre aproximadamente 20 y 50°C, preferentemente 37°C. En una realización específica, un conector es estable en el torrente sanguíneo, pero libera el resto conjugado una vez está dentro de las células seleccionadas como diana. En ciertas realizaciones, un resto es conjugado con un anticuerpo descrito en la presente memoria por medio de uno o más conectores que contienen triazol (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2007/018431). Ejemplos no limitantes de conectores y espaciadores para su incorporación en conjugados anticuerpo-fármaco descritos en la presente memoria son dados a conocer en las publicaciones de solicitud de patente internacional PCT nos WO 2007/018431, WO 2004/043493 y WO 2002/083180.

Además, los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden ser fusionados con secuencias marcadoras, tales como un péptido, para facilitar su purificación. En realizaciones preferentes, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc.), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Según se describe, por ejemplo, en Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, la hexa-histidina permite una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, sin limitación, la etiqueta de la hemaglutinina (“HA”), que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), y la etiqueta “FLAG”.

Los métodos para fusionar o conjugar restos terapéuticos (incluyendo polipéptidos) con anticuerpos son bien conocidos; véanse, por ejemplo, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy”, en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (ed.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985);

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Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, en Controlled Drug Delivery (2a ed.), Robinson et al. (ed.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review”, en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (ed.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (ed.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58; las patentes estadounidenses nos 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851, 5.723.125, 5.783.181, 5.908.626, 5.844.095 y 5.112.946; los documentos EP 307.434; EP 367.166; EP 394.827; las publicaciones PCT WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631 y WO 99/04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539, 1991; Traunecker et al., Nature, 331:84-86, 1988; Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600, 1995; Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341, 1992.

Se pueden generar proteínas de fusión, por ejemplo, mediante las técnicas de transposición de genes, transposición de motivos, transposición de exones y/o transposición de codones (denominadas colectivamente “transposición de ADN”). La transposición de ADN puede ser empleada para alterar las actividades de anticuerpos descritos en la presente memoria (por ejemplo, anticuerpos con afinidades mayores y tasas de disociación menores). Véanse, en general, las patentes estadounidenses nos 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252 y 5.837.458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313. Los anticuerpos, o los anticuerpos codificados, pueden ser alterados sometiéndolos a mutagénesis aleatoria por una PCR propensa a errores, inserción aleatoria de nucleótidos u otros métodos antes de la recombinación. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo descrito en la presente memoria puede ser recombinado con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.

Un anticuerpo descrito en la presente memoria también puede ser conjugado con un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado según se describe en la patente estadounidense n° 4,676,980.

El resto terapéutico o fármaco conjugado o fusionado de forma recombinante con un anticuerpo descrito en la presente memoria que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT puede ser escogido para lograr el o los efectos profilácticos o terapéuticos deseados; por ejemplo, reducir el tamaño o la carga de un tumor, reducir el desarrollo o la proliferación de células cancerosas o inducir la muerte de las células cancerosas. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo modificado. Un clínico u otro personal médico deberían considerar lo siguiente cuando se decide sobre qué resto terapéutico o fármaco conjugar o fusionar de forma recombinante con un anticuerpo descrito en la presente memoria: la naturaleza de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la condición del sujeto.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria también se pueden unir a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o para la purificación del antígeno diana. Tales soportes incluyen, sin limitación, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.

En cierto aspecto, un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo es un conjugado de fármaco extracelular (ECD) que comprende un anticuerpo conectado a un fármaco, opcionalmente por un conector (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional PCT n° WO 2011/031870). El fármaco puede actuar fuera de la célula y, así, no se requiere la internalización del conjugado. Después de que un ECD se une a una célula diana, el fármaco envía una señal al interior de la célula.

En una realización, el conector del ECD es un conector no escindible. Ejemplos de conectores no escindibles incluyen conectores que contienen cadenas de polietilenglicol o cadenas de polietileno que no son sensibles a ácidos o bases (tales como conectores que contienen hidrazona), no son sensibles a agentes reductores u oxidantes (tales como los que contienen enlaces disulfuro), y no son sensibles a enzimas que puedan encontrarse en las células o el aparato circulatorio. Ejemplos específicos de conectores no escindibles incluyen el conector SMCC (publicación de solicitud de patente estadounidense n° 20090202536). Con fines ilustrativos, ejemplos de conectores escindibles incluyen conectores que contienen disulfuros no impedidos sensibles al glutatión, ésteres, secuencias de péptidos sensibles a las peptidasas, tales como catepsina o plasmina, hidrazonas sensibles al pH (véase Bioconjugate Chem., 2010, 21 (1), pp. 5-13) y el conector no impedido de disulfuro SPP (publicación de solicitud de patente estadounidense n° 20090202536).

En ciertos aspectos, un ECD comprende un fármaco o agente que es un glucósido cardiaco; por ejemplo, proscilaridina o una proscilaridina con potenciación de azúcar. En una realización, el agente está compuesto a partir de un glucósido cardiaco que anula un azúcar. En diversas realizaciones, el glucósido cardiaco es un compuesto identificado en la publicación PCT n° WO 2010/017480 (PCT/US2009/053159).

5.2 Polinucleótidos

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporcionan polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) descrito en la presente memoria o un fragmento del mismo (por ejemplo, una región de cadena ligera variable y/o una región de cadena pesada variable) que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT, y vectores; por ejemplo, vectores que

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comprenden tales polinucleótidos para su expresión recombinante en células anfitrionas (por ejemplo, E. coli y células de mamífero). En la presente memoria se proporcionan polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria, así como vectores que comprenden tales secuencias de polinucleótidos —por ejemplo, vectores de expresión— para su expresión eficiente en células anfitrionas; por ejemplo, células de mamífero. En la presente memoria también se proporcionan polinucleótidos que codifican antígenos de KIT (por ejemplo, la SEQ ID NO: 14 o 15) para generar anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria.

Según se usa en la presente memoria, una molécula “aislada” de polinucleótidos o ácido nucleico es aquella que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural (por ejemplo, en un ser humano) de la molécula de ácido nucleico. Además, una molécula “aislada” de ácido nucleico, tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o caldo de cultivo, cuando es producida mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando es sintetizada químicamente. El lenguaje “sustancialmente libre” incluye, por ejemplo, preparaciones de moléculas de polinucleótidos o ácido nucleico que tienen menos de aproximadamente 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% (en particular, menos de aproximadamente un 10%) de otro material; por ejemplo, material celular, caldo de cultivo, otras moléculas de ácido nucleico, precursores químicos y/u otros productos químicos. En una realización específica, una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo descrito en la presente memoria están aisladas o purificadas.

En aspectos particulares, en la presente memoria se proporcionan polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos (por ejemplo, un anticuerpo humanizado) o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, la región D4 de KIT, por ejemplo, del KIT humano) y comprenden una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria, así como anticuerpos que compite con tales anticuerpos para su unión a un polipéptido KIT (por ejemplo, en una manera dependiente de la dosis), o que se une al mismo epítopo que el de tales anticuerpos.

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporcionan polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo descrito en la presente memoria. Los polinucleótidos pueden comprender secuencias de nucleótidos que codifican una cadena ligera que comprende las FR VL y las CDR de anticuerpos descritos en la presente memoria (véanse, por ejemplo, las Tablas 1 y 5B). Los polinucleótidos pueden comprender secuencias de nucleótidos que codifican una cadena pesada que comprende las FR VH y las CDR de anticuerpos descritos en la presente memoria (véanse, por ejemplo, las Tablas 1 y 5A). En realizaciones específicas, un polinucleótido descrito en la presente memoria codifica una región de cadena VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8, 9 o 10. En realizaciones específicas, a polinucleótido descrito en la presente memoria codifica una región de cadena VH que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 2-6.

En realizaciones particulares, un polinucleótido descrito en la presente memoria codifica una región de cadena VL, comprendiendo el polinucleótido la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 27, 28, 29 o 30. En realizaciones particulares, un polinucleótido descrito en la presente memoria codifica una región de cadena VH, comprendiendo el polinucleótido la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25 o 26. En realizaciones particulares, un polinucleótido codifica un anticuerpo descrito en la presente memoria, comprendiendo el polinucleótido la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 28 que codifica una región L2 de la cadena VL y la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 24 que codifica una región H3 de la cadena VH. En realizaciones particulares, uno o más polinucleótidos comprenden la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 28 que codifica una región de cadena VL y la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 24 que codifica una región de cadena VH. En realizaciones particulares, un polinucleótido codifica un anticuerpo descrito en la presente memoria, comprendiendo el polinucleótido la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 27 que codifica una región L1 de cadena VL y la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 25 que codifica una región H4 de cadena VH. En realizaciones particulares, uno o más polinucleótidos comprenden la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 27 que codifica una región de cadena VL y la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 25 que codifica una región de cadena VH. En realizaciones particulares, un polinucleótido descrito en la presente memoria codifica una región de cadena VL, comprendiendo el polinucleótido una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% idéntica a la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 27, 28, 29 o 30. En realizaciones particulares, un polinucleótido descrito en la presente memoria codifica una región de cadena VH, comprendiendo el polinucleótido una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% idéntica a la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25 o 26.

En realizaciones particulares, en la presente memoria se proporcionan polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti KIT que comprende una región de cadena VL que contiene, por ejemplo, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, que comprenden secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria (por ejemplo, véanse las Tablas 1, 5A-5B y 6A-6B). En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporcionan polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti KIT que comprende una región de cadena VH que contiene, por ejemplo, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-

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FR4, que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria (por ejemplo, véanse las Tablas 1, 5A-5B y 6A-6B).

En ciertas realizaciones, un polinucleótido descrito en la presente memoria comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo proporcionado en la presente memoria que comprende una región de cadena ligera variable (VL) que comprende un aminoácido descrito en la presente memoria (véanse, por ejemplo, las Figuras 3A- 3I), uniéndose el anticuerpo inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT; por ejemplo, un polipéptido KIT humano, por ejemplo, a una región D4 de KIT (por ejemplo, del KIT humano); por ejemplo, a la SEQ ID NO: 15.

En ciertas realizaciones, un polinucleótido descrito en la presente memoria comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo proporcionado en la presente memoria que comprende una región de cadena pesada variable (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria (véanse, por ejemplo, las Figuras 3A-3I), uniéndose el anticuerpo inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT; por ejemplo, a un polipéptido KIT humano; por ejemplo, a una región D4 de KIT (por ejemplo, del KIT humano); por ejemplo a la SEQ ID NO: 15.

En ciertos aspectos, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) descrito en la presente memoria que comprende una región de cadena VL que comprende una o más FR VL que tienen la secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria (por ejemplo, véanse las Tablas 5B y 5D), uniéndose el anticuerpo inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT; por ejemplo, a un polipéptido KIT humano; por ejemplo, a una región D4 de KIT (por ejemplo, del KIT humano); por ejemplo la SEQ ID NO: 15. En ciertos aspectos, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en la presente memoria que comprende una región de cadena VH que comprende una o más FR VH que tienen la secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria (por ejemplo, véanse las Tablas 5A y 5C), uniéndose el anticuerpo inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT; por ejemplo, a un polipéptido KIT humano; por ejemplo, a una región D4 de KIT (por ejemplo, del KIT humano); por ejemplo a la SEQ ID NO: 15.

En realizaciones específicas, un polinucleótido proporcionado en la presente memoria comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) descrito en la presente memoria que comprende: regiones marco (por ejemplo, regiones marco del dominio VL y del dominio VH) que son regiones marco humanas, uniéndose el anticuerpo inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT, por ejemplo, a un polipéptido KIT humano; por ejemplo, a una región D4 de KIT (por ejemplo, del KIT humano; por ejemplo a la SEQ ID NO: 15).

En aspectos específicos, en la presente memoria se proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo que comprende una cadena ligera y una cadena pesada; por ejemplo, una cadena ligera y una cadena pesada separadas. Con respecto a la cadena ligera, en una realización específica, un polinucleótido proporcionado en la presente memoria comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera kappa. En otra realización específica, un polinucleótido proporcionado en la presente memoria comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera lambda. En otra realización específica adicional, un polinucleótido proporcionado en la presente memoria comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en la presente memoria que comprende una cadena ligera kappa humana o una cadena ligera lambda humana. En una realización particular, un polinucleótido proporcionado en la presente memoria comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, un polipéptido KIT que comprende una región D4 de KIT, por ejemplo KIT humano (por ejemplo, la SEQ ID NO: 15)), en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera, y en el que la secuencia de aminoácidos de la región de cadena VL puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria (por ejemplo, la SEQ ID NO: 7, 8, 9 o 10 o 12), y en el que la región constante de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera kappa humana. En una realización particular, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En otra realización particular, un polinucleótido proporcionado en la presente memoria comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, un polipéptido KIT que comprende un polipéptido KIT que comprende una región D4 de KIT, por ejemplo KIT humano (por ejemplo, la SEQ ID NO: 15)), y comprende una cadena ligera, en el que la secuencia de aminoácidos de la región de cadena VL puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria (por ejemplo, la SEQ ID NO: 7, 8, 9 o 10 o 12), y en el que la región constante de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera lambda humana. Las secuencias de regiones constantes humanas pueden ser, por ejemplo, las descritas en la patente estadounidense n° 5.693.780.

En una realización particular, un polinucleótido proporcionado en la presente memoria comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en la presente memoria, que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, un polipéptido KIT que comprende un polipéptido KIT que comprende una región D4 de KIT; por ejemplo KIT humano (por ejemplo, la SEQ ID NO: 15)), en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada, en el que la secuencia de aminoácidos de la región de cadena VH puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 o 6 u 11), y en el que la región

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constante de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de la cadena pesada gamma (y) humana.

En otra realización específica adicional, un polinucleótido proporcionado en la presente memoria comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo), que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido KIT (por ejemplo, a una región D4 de KIT; por ejemplo, KIT humano), en el que el anticuerpo comprende una región de cadena VL y una región de cadena VH que comprende cualquier secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria, y en el que las regiones constantes comprenden las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de una IgG1 humana (por ejemplo, el isotipo a, z, o f) o una IgG4 humana.

En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti KIT, o un fragmento de unión a antígeno o un dominio del mismo, designado en la presente memoria; véanse, por ejemplo, las Tablas 1-6B y las Figuras 3A-3I; por ejemplo, los anticuerpos Hum1-Hum20.

En la presente memoria también se proporcionan polinucleótidos que codifican un anticuerpo anti KIT o un fragmento del mismo que están optimizados; por ejemplo, mediante optimización de codones/ARN, sustitución con secuencias señal heterólogas y eliminación de elementos de inestabilidad del ARNm. Pueden llevarse a cabo métodos para generar ácidos nucleicos optimizados que codifican un anticuerpo anti KIT o un fragmento del mismo (por ejemplo, una cadena ligera, una cadena pesada, un dominio VH o un dominio VL) para la expresión recombinante introduciendo cambios en codones y/o eliminando regiones inhibidoras en el ARNm adaptando en consecuencia los métodos de optimización descritos, por ejemplo, en las patentes estadounidenses nos 5.965.726; 6.174.666; 6.291.664; 6.414.132 y 6.794.498. Por ejemplo, los sitios de empalme potencial y los elementos de inestabilidad (por ejemplo, elementos ricos en A/T o A/U) dentro del ARN pueden ser mutados sin alterar los aminoácidos codificados por las secuencias de ácidos nucleicos para aumentar la estabilidad del ARN para una expresión recombinante. Las alteraciones utilizan la degeneración del código genético, usando, por ejemplo, un codón alternativo para un aminoácido idéntico. En algunas realizaciones, puede ser deseable alterar uno o más codones para codificar una mutación conservadora; por ejemplo, un aminoácido similar con estructura química y propiedades y/o función similares al aminoácido original. Tales métodos pueden aumentar la expresión de un anticuerpo anti KIT o de un fragmento del mismo en al menos 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces o más con respecto a la expresión de un anticuerpo anti KIT codificado por polinucleótidos que no han sido optimizados.

En ciertas realizaciones, una secuencia de polinucleótidos optimizada que codifica un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria o un fragmento del mismo (por ejemplo, un dominio VL y/o un dominio VH) puede hibridarse con un polinucleótido no codificante (por ejemplo, complementario) de una secuencia de polinucleótidos no optimizada que codifica un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria o un fragmento del mismo (por ejemplo, un dominio VL y/o un dominio VH). En realizaciones específicas, una secuencia de polinucleótidos optimizada que codifica un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria o un fragmento se hibrida en condiciones muy rigurosas con un polinucleótido no codificante de una secuencia de polinucleótidos no optimizada que codifica un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria o un fragmento del mismo. En una realización específica, una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria o un fragmento del mismo se hibrida en condiciones muy rigurosas, intermedias o de menor rigor, con un polinucleótido no codificante de una secuencia de nucleótidos no optimizada que codifica un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria o un fragmento del mismo. Se ha descrito información sobre condiciones de hibridación; véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2005/0048549 (por ejemplo, los párrafos 72-73).

En ciertas realizaciones, una secuencia de polinucleótidos optimizada que codifica una región VL de un anticuerpo descrito en la presente memoria es al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98% idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 27, 28, 29 o 30. En ciertas realizaciones, una secuencia de polinucleótidos optimizada que codifica una región VH de un anticuerpo descrito en la presente memoria es al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98% idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25 o 26.

Los polinucleótidos pueden ser obtenidos, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos ser determinada, por cualquier método conocido en la técnica. Las secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos descritos en la presente memoria —por ejemplo, los anticuerpos descritos en las Tablas 1-6B y en las Figuras 3A-3I, y versiones modificadas de estos anticuerpos— pueden ser determinadas usando métodos bien conocidos en la técnica; es decir, se ensamblan codones de nucleótidos que se sabe que codifican aminoácidos particulares de tal manera que generen un ácido nucleico que codifique el anticuerpo. Tal polinucleótido codificante del anticuerpo puede ser ensamblado a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, según se describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), lo que, sucintamente, implica la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, la hibridación y la ligadura de esos oligonucleótidos, y luego la amplificación por PCR de los oligonucleótidos ligados.

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Alternativamente, se puede generar un polinucleótido que codifica un anticuerpo descrito en la presente memoria a partir de ácido nucleico procedente de una fuente adecuada (por ejemplo, un hibridoma) usando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, PCR y otros métodos de clonación molecular). Por ejemplo, se puede llevar a cabo una amplificación por pCr usando cebadores sintéticos hibridables con los extremos 3' y 5' de una secuencia conocida usando ADN genómico obtenido de células de hibridoma que producen el anticuerpo de interés. Pueden usarse tales métodos de amplificación por PCR para obtener ácidos nucleicos que comprenden la secuencia que codifica la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo. Tales métodos de amplificación por PCR pueden ser usados para obtener ácidos nucleicos que comprenden la secuencia que codifica la región de cadena ligera variable y/o la región de cadena pesada variable de un anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados pueden ser clonados formando vectores para su expresión en células anfitrionas y para clonación adicional; por ejemplo, para generar anticuerpos quiméricos y humanizados.

Si no hay disponible un clon que contenga un ácido nucleico que codifique un anticuerpo particular, pero la secuencia de la molécula del anticuerpo es conocida, puede sintetizarse u obtenerse químicamente un ácido nucleico que codifique la inmunoglobulina a partir de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpos o¡ una biblioteca de ADNc generada de cualquier tejido o de células que expresen el anticuerpo, o de ácido nucleico, preferentemente poli A+ARN, aislado de los mismos, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo descrito en la presente memoria) mediante amplificación por PCR usando cebadores sintéticos hibridables con los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación usando una sonda de oligonucleótidos específica para la secuencia particular de genes para identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. A continuación, los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden ser clonados formando vectores duplicables de clonación usando cualquier método bien conocido en la técnica.

El ADN que codifica anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria puede ser fácilmente aislado y secuenciado usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que sean capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos anti KIT). Las células de hibridoma pueden servir de fuente de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser puesto en vectores de expresión, que luego son transfectados en células anfitrionas tales como células de E. coli, células COS simiescas, células de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, células CHO del CHO GS System™ (Lonza)), o células de mieloma que, en todo caso, no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos anti KIT en las células anfitrionas recombinantes.

Para generar anticuerpos completos, pueden usarse cebadores PCR que incluyan secuencias de nucleótidos VH o VL, un sitio de restricción y una secuencia flanqueante para proteger el sitio de restricción para amplificar las secuencias VH o VL en los clones de scFv. Utilizando técnicas de clonación conocidas para los expertos en la técnica, los dominios VH amplificados por PCR pueden ser clonados formando vectores que expresan una región constante de cadena pesada; por ejemplo, la región constante gamma 4 humana, y los dominios VL amplificados por PCR pueden ser clonados formando vectores que expresan una región constante de cadena ligera; por ejemplo, regiones constantes kappa o lambda humanas. En ciertas realizaciones, los vectores para la expresión de los dominios VH o VL comprenden un promotor EF-1a, una señal de secreción, un sitio de clonación para el dominio variable, dominios constantes y un marcador de selección tal como la neomicina. Los dominios VH y VL también pueden ser clonados en un vector que exprese las regiones constantes necesarias. A continuación, se cotransfectan los vectores de conversión de cadena pesada y los vectores de conversión de cadena ligera en líneas celulares para generar líneas celulares estables o transitorias que expresen anticuerpos de longitud máxima —por ejemplo, IgG— usando técnicas conocidas para los expertos en la técnica.

El ADN también puede ser modificado, por ejemplo, sustituyendo los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas con la secuencia codificante en lugar de las secuencias murinas, o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina la totalidad o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no de inmunoglobulina.

También se proporcionan polinucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación de gran rigor, o de rigor intermedio o menor con polinucleótidos que codifican un anticuerpo descrito en la presente memoria. En realizaciones específicas, los polinucleótidos descritos en la presente memoria se hibridan en condiciones de hibridación de gran rigor, o de rigor intermedio o menor con polinucleótidos que codifican una región de cadena VH (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 o 6) y/o una región de cadena VL (por ejemplo, la SEQ ID NO: 7, 8, 9 o 10) proporcionadas en la presente memoria. En realizaciones específicas, los polinucleótidos descritos en la presente memoria se hibridan en condiciones de hibridación de gran rigor o de rigor intermedio con polinucleótidos que son complementos de los polinucleótidos que codifican una región de cadena VH (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3 o 5) y/o una región de cadena VL (por ejemplo, una SEQ ID NO: 2) proporcionadas en la presente memoria.

En realizaciones específicas, los polinucleótidos descritos en la presente memoria se hibridan en condiciones de hibridación de gran rigor, o de rigor intermedio o menor con polinucleótidos que son complementos de un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO: 27, 28, 29 o 30 que codifica un dominio VL. En realizaciones específicas, los polinucleótidos descritos en la presente memoria se hibridan en condiciones de hibridación de gran

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rigor o de rigor intermedio con polinucleótidos que son complementos de un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25 o 26 que codifica un dominio VH.

En la técnica se han descrito, y son conocidas para un experto en la técnica, las condiciones de hibridación. Por ejemplo, la hibridación en condiciones rigurosas puede implicar la hibridación con ADN unido a un filtro en cloruro sódico/citrato sódico (SSC) 6* a aproximadamente 45°C seguida por uno o más lavados en 0,2*SSC/0,1% SDS a aproximadamente 50-65°C; la hibridación en condiciones sumamente rigurosas puede implicar la hibridación con ácido nucleico unido a un filtro en 6*SSC a aproximadamente 45°C seguida por uno o más lavados en 0,1*SSC/0,2% SDS a aproximadamente 68°C. La hibridación en otras condiciones rigurosas de hibridación es conocida para los expertos en la técnica y ha sido descrita; véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., ed., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en las páginas 6.3.1-6.3.6 y 2.10.3.

5.3 Células anfitrionas y expresión recombinante de anticuerpos

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporcionan células anfitrionas que expresan de forma recombinante los anticuerpos descritos en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno de los mismos) y vectores de expresión relacionados. En la presente memoria se proporcionan vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos anti KIT o un fragmento para su expresión recombinante en células anfitrionas, preferentemente en células de mamífero. En la presente memoria también se proporcionan células anfitrionas que comprenden tales vectores para expresar de forma recombinante anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado). En un aspecto particular, en la presente memoria se proporcionan métodos para producir un anticuerpo descrito en la presente memoria, que comprende la expresión de tal anticuerpo a partir de una célula anfitriona.

La expresión recombinante de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo de longitud máxima, las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo, o un anticuerpo monocatenario descritos en la presente memoria) que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT implica la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo, unas cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo, o un fragmento del mismo (que contenga preferente, pero no necesariamente, el dominio variable de las cadenas pesada y/o ligera) descrito en la presente memoria ha sido obtenido, el vector para la producción de la molécula del anticuerpo puede ser producido mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. Así, en la presente memoria se describen métodos para preparar una proteína expresando un polinucleótido que contenga un anticuerpo que codifica una secuencia de nucleótidos. Pueden usarse métodos que son bien conocidos para los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen secuencias de codificación de anticuerpos y señales apropiadas de control transcripcional y de traducción. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. También se proporcionan vectores duplicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo descrita en la presente memoria, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o un fragmento del mismo, o una CDR de cadena pesada o ligera, ligados operativamente a un promotor. Tales vectores pueden incluir, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifican la región constante de la molécula del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales nos WO 86/05807 y WO 89/01036; y la patente estadounidense n° 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo puede ser clonado en tal vector para la expresión de toda la cadena pesada, de toda la cadena ligera o de las cadenas pesada y ligera enteras.

Un vector de expresión puede ser transferido a una célula (por ejemplo, una célula anfitriona) mediante técnicas convencionales, y las células resultantes pueden ser cultivadas a continuación mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento del mismo. Así, en la presente memoria se proporcionan células anfitrionas que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo descrito en la presente memoria o fragmentos del mismo, o una cadena pesada o ligera del mismo, o un fragmento del mismo, o un anticuerpo monocatenario descrito en la presente memoria, ligado operativamente a un promotor para la expresión de tales secuencias en la célula anfitriona. En ciertas realizaciones, para la expresión de anticuerpos de doble cadena, los vectores que codifican tanto la cadena pesada como la ligera, individualmente, pueden ser coexpresados en la célula anfitriona para la expresión de toda la molécula de inmunoglobulina, según se detalla posteriormente. En ciertas realizaciones, una célula anfitriona contiene un vector que comprende un polinucleótido que codifica tanto la cadena pesada como la cadena ligera de un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento del mismo. En realizaciones específicas, una célula anfitriona contiene dos vectores diferentes: un primer vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada de un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento del mismo, y un segundo vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera de un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento del mismo. En otras realizaciones, una primera célula anfitriona comprende un primer vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada de un anticuerpo descrito en la presente memoria, o un fragmento del mismo, y una segunda célula

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anfitriona comprende un segundo vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera de un anticuerpo descrito en la presente memoria.

Pueden utilizarse diversos sistemas de vectores de anfitrión-expresión para expresar moléculas de anticuerpos descritas en la presente memoria (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n° 5.807.715). Tales sistemas de vectores de anfitrión-expresión representan vehículos mediante los cuales pueden producirse y, subsiguientemente, purificarse las secuencias codificantes de interés, pero también representan células que pueden expresar in situ, cuando son transformadas o transfectadas con las secuencias apropiadas de codificación de nucleótidos, una molécula de anticuerpo, descrita en la presente memoria. Estas incluyen, sin limitación, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN cosmídico que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levadura (por ejemplo, Saccharomyces Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales (por ejemplo, algas verdes tales como Chlamydomonas reinhardtii) infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor, CaMV; el virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa y NIH 3T3) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, el promotor metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del vaccinia virus). En una realización específica, las células para expresar anticuerpos descritos en la presente memoria (por ejemplo, Hum1-Hum20) o un fragmento de unión a antígeno de los mismos son células CHO; por ejemplo, células CHO del CHO GS System™ (Lonza). En una realización específica, un vector de expresión en mamíferos es pOptiVEC™ o pcDNA3.3. Preferentemente, se usan células bacterianas tales como Escherichia coli, y, más preferentemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante completo para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO), en unión con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermedio principal del citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; y Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). En ciertas realizaciones, los anticuerpos descritos en la presente memoria son producidos por células CHO o células NS0. En una realización específica, la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos descritos en la presente memoria que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT es regulada por un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor específico a tejidos.

En sistemas bacterianos, se pueden seleccionar ventajosamente varios vectores de expresión, dependiendo del uso previsto para la molécula del anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando ha de producirse una gran cantidad de tal anticuerpo, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden resultar deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos proteínicos de fusión que sean fácilmente purificados. Tales vectores incluyen, sin limitación, el vector de expresión pUR278 de E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791), en el que la secuencia codificante del anticuerpo puede ser ligada individualmente en el vector en el marco con la región codificante lac Z para que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye e Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke y Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. También se pueden usar vectores pGEX para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutatión 5-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden ser purificadas fácilmente a partir de células lisadas por adsorción y unión a perlas de agarosa de glutatión matricial seguido por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de proteasa de trombina o factor Xa para que se pueda liberar del resto GST el producto génico diana.

En un sistema de insectos, se usa el virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes foráneos. El virus se desarrolla en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante del anticuerpo puede ser clonada individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen polihedrina) del virus y puesta bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo el promotor polihedrina).

En células anfitrionas de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus. En casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante del anticuerpo de interés puede estar ligada a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus; por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. El gen quimérico puede ser insertado entonces en el genoma de adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, la región E1 o E3) dará lugar a un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula del anticuerpo en anfitriones infectados (véase, por ejemplo, Logan y Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359). También pueden requerirse señales de iniciación específicas para una traducción eficaz de las secuencias codificantes de anticuerpos insertadas. Estas incluyen el codón de iniciación de ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar la traducción del inserto completo. Estas señales exógenas de control de traducción y estos codones de iniciación pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede ser potenciada por la inclusión

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de elementos apropiados potenciadores de la transcripción, terminadores de transcripción, etc. (véase, por ejemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544).

Además, puede elegirse una cepa de células anfitrionas que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico de la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y tal procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteínicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células anfitrionas tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación de proteínas y productos génicos con posterioridad a la traducción. Pueden escogerse líneas celulares o sistemas anfitriones apropiados para garantizar una modificación y un procesamiento correctos de la proteína foránea expresada. Con este fin, pueden usarse células anfitrionas eucariotas que poseen la maquinaria celular para el debido procesamiento del transcrito primario, la glucosilación y la fosforilación del producto génico. Tales células anfitrionas de mamífero incluyen, sin limitación, células CHO, VERO, BHK, Hela, COS, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no produce de manera endógena ninguna cadena de inmunoglobulina), CRL7O3O y HsS78Bst. En ciertas realizaciones, se producen en células de mamífero, tales como células CHO, anticuerpos monoclonales anti KIT humanizados descritos en la presente memoria.

Para una producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden diseñar líneas celulares que expresen de manera estable la molécula de anticuerpo. En vez de usar vectores de expresión que contienen los orígenes víricos de la duplicación, se pueden transformar células anfitrionas con ADN controlado por elementos apropiados de control de la expresión (por ejemplo, secuencias promotoras potenciadoras, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Tras la introducción de ADN foráneo, se puede permitir que las células diseñadas se desarrollen durante 1-2 días en un caldo enriquecido, y luego se las pasa a un caldo selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y que se desarrollen formando focos que, a su vez, pueden ser clonados y expandidos en líneas celulares. Este método puede ser usado ventajosamente para diseñar líneas celulares que expresen la molécula del anticuerpo. Tales líneas celulares diseñadas pueden ser particularmente útiles en la selección y la evaluación de composiciones que interactúen directa o indirectamente con la molécula del anticuerpo.

Pueden usarse varios sistemas de selección, incluyendo, sin limitación, genes de timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantinaguanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17) en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. También puede usarse la resistencia antimetabolitos como base de selección de los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; mayo de 1993, TIB TECH 11 (5):155-2 15); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Los métodos comúnmente conocidos en la especialidad de la tecnología de ADN recombinante pueden ser aplicados de manera rutinaria para seleccionar el clon recombinante deseado, y tales métodos están descritos, por ejemplo, en Ausubel et al. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, Nueva York (1990); y en los capítulos 12 y 13 de Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, Nueva York (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1.

Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden ser aumentados por amplificación de vectores (para una reseña, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el anticuerpo que expresa el sistema vectorial es amplificable, el aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula anfitriona aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, también aumentará la producción del anticuerpo (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).

La célula anfitriona puede ser cotransfectada con dos o más vectores de expresión descritos en la presente memoria, codificando el primer vector un polipéptido derivado de la cadena pesada y codificando el segundo vector un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permitan una expresión igual de polipéptidos de las cadenas pesada y ligera. Las células anfitrionas pueden ser cotransfectadas con cantidades diferentes de dos o más vectores de expresión. Por ejemplo, las células anfitrionas pueden ser transfectadas con una cualquiera de las siguientes proporciones entre un primer vector de expresión y un segundo vector de expresión: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 o 1:50.

Alternativamente, puede usarse un único vector que codifique y sea capaz de expresar polipéptidos tanto de la cadena pesada como de la ligera. En tales situaciones, la cadena ligera debería ser puesta antes de la cadena

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pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; y Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197-2199). Las secuencias codificantes para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico. El vector de expresión puede ser monocistrónico o multicistrónico. Un constructo multicistrónico de ácidos nucleicos puede codificar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, o en el intervalo de 2-5, 5-10 o 10-20 genes/secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, un constructo bicistrónico de ácidos nucleicos puede comprender, en el siguiente orden, un promotor, un primer gen (por ejemplo, la cadena pesada de un anticuerpo descrito en la presente memoria), y un segundo gen (por ejemplo, la cadena ligera de un anticuerpo descrito en la presente memoria). En tal vector de expresión, la transcripción de ambos genes puede ser impulsada por el promotor, mientras que la traducción del ARNm del primer gen puede ser un mecanismo de barrido dependiente del casquete y la traducción del ARNm del segundo gen puede ser un mecanismo de barrido independiente del casquete; por ejemplo, un IRES.

Una vez que una molécula de anticuerpo descrita en la presente memoria ha sido producida por expresión recombinante, puede ser purificada por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina; por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, cromatografía por intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad hacia el antígeno específico después de la proteína A, y en columna de exclusión molecular), centrifugación, solubilidad diferencia o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden fusionarse con secuencias de polipéptidos heterólogos descritas en la presente memoria o, si no, conocidas en la técnica para facilitar la purificación.

En realizaciones específicas, un anticuerpo descrito en la presente memoria es aislado o purificado. Generalmente, un anticuerpo aislado es aquel que está sustancialmente libre de otros anticuerpos con especificidades antigénicas diferentes de las del anticuerpo aislado. Por ejemplo, en una realización particular, una preparación de un anticuerpo descrito en la presente memoria está sustancialmente libre de material celular y/o de precursores químicos. El lenguaje “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de un anticuerpo en las cuales el anticuerpo está separado de los componentes celulares de las células de las cuales es aislado o producido de forma recombinante. Así, un anticuerpo que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de anticuerpo que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% (en peso seco) de proteína heteróloga (también denominada “proteína contaminante” en la presente memoria) y/o variantes de un anticuerpo, por ejemplo, diferentes formas de un anticuerpo modificadas después de la traducción u otras versiones diferentes de un anticuerpo (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos). Cuando el anticuerpo es producido de forma recombinante, generalmente también está sustancialmente libre de caldo de cultivo; es decir, el caldo de cultivo representa menos de aproximadamente un 20%, 10%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% del volumen de la preparación proteínica. Cuando el anticuerpo es producido por síntesis química, generalmente está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos; es decir, está separado de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En consecuencia, tales preparaciones del anticuerpo tienen menos de aproximadamente un 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) of precursores químicos o de compuestos distintos del anticuerpo de interés. En una realización específica, anticuerpos descritos en la presente memoria están aislados o purificados.

5.4 Métodos de producción de anticuerpos

Los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanos o humanizados) descritos en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno de los mismos) que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT pueden ser producidos por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos; por ejemplo, por síntesis química o por técnicas de expresión recombinante. Los métodos descritos en la presente memoria emplean, a no ser que se indique algo distinto, técnicas convencionales en biología molecular, microbiología, análisis genético, ADN recombinante, química orgánica, bioquímica, PCR, síntesis y modificación de oligonucleótidos, hibridación de ácidos nucleicos y campos relacionados dentro del dominio de la técnica. Estas técnicas están descritas en las referencias citadas en la presente memoria y están plenamente explicadas en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 y actualizaciones anuales); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 y actualizaciones anuales) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos humanizados usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, sin limitación, el injerto de CDR (patente europea n° EP 239.400; publicación internacional n° WO 91/09967; y las patentes estadounidenses nos 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), recubrimiento o reafloramiento (patentes europeas nos EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973), transposición de cadenas (patente estadounidense n° 5.565.332), y técnicas dadas a conocer, por ejemplo, en la patente estadounidense n°

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6.407.213, la patente estadounidense n° 5.766.886, el documento WO 9317105, Tan et al., J. Immunol. 169:1119 25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267 79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895 904 (1996), Couto et al., Cáncer Res. 55 (23 Sup):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995), Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994), y Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994). Véase también la publicación de patente estadounidense n° US 2005/0042664 A1 (24 de febrero de 2005).

En aspectos específicos, un anticuerpo humanizado es capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una región marco, que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana, y las CDR, que tienen sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, una inmunoglobulina murina). En realizaciones particulares, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. Un anticuerpo humanizado puede ser seleccionado de cualquier case de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y de cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la especialidad, incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de expresión de fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales usando técnicas de hibridoma, incluyendo las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, Nueva York, 1981). La expresión “anticuerpo monoclonal”, según es usada en la presente memoria, no está limitada a anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridomas. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales mediante tecnología recombinante; por ejemplo, anticuerpos recombinantes monoclonales expresados por una célula anfitriona, tal como una célula anfitriona de mamífero.

Los métodos para producir y seleccionar anticuerpos específicos usando tecnología de hibridomas son rutinarios y bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, en el método del hibridoma, se vacuna a un ratón o a otro animal anfitrión apropiado, tal como una oveja, una cabra, un conejo, una rata, un hámster o un mono macaco, para suscitar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente a la proteína (por ejemplo, una región D4 del KIT humano) usada para la vacunación. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. A continuación, los linfocitos se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Además, puede usarse una técnica de RIMMS (sitios múltiples de inmunización repetitiva) para inmunizar a un animal (Kilptrack et al., 1997 Hybridoma 16:381-9).

Ejemplos no limitantes de líneas celulares de mieloma incluyen líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE. UU., y células SP-2 o X63-Ag8.653 disponibles en la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland, EE. UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos humanos monoclonales (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

Los anticuerpos descritos en la presente memoria incluyen fragmentos de anticuerpos que reconocen antígenos específicos de KIT y pueden ser generados mediante cualquier técnica conocida para los expertos en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 descritos en la presente memoria pueden ser producidos mediante la escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Un fragmento Fab corresponde a uno de los dos brazos idénticos de una molécula de anticuerpo y contiene la cadena ligera completa emparejada con los dominios VH y CH1 de la cadena pesada. Un fragmento F(ab')2 contiene los dos brazos de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo ligados por enlaces disulfuro en la región bisagra.

En un aspecto, para generar anticuerpos completos, pueden usarse cebadores de PCR, incluyendo secuencias de nucleótidos VH o VL, un sitio de restricción y una secuencia flanqueante para proteger el sitio de restricción para amplificar las secuencias VH o VL de una plantilla; por ejemplo, clones scFv. Utilizando técnicas de clonación conocidas para los expertos en la técnica, los dominios VH amplificados por PCR pueden ser clonados en vectores que expresan una región constante VH, y los dominios VL amplificados por PCR pueden ser clonados en vectores que expresan una región constante VL; por ejemplo, regiones constantes kappa o lambda humanas. Los dominios Vh y VL también pueden ser clonados en un vector que exprese las regiones constantes necesarias. A continuación, los vectores de la cadena pesada y los vectores de la cadena ligera son cotransfectados en líneas celulares para generar líneas celulares estables o transitorias que expresan anticuerpos de longitud máxima —por ejemplo, IgG— usando técnicas conocidas para los expertos en la técnica.

Pueden producirse anticuerpos de un solo dominio —por ejemplo, anticuerpos que carecen de las cadenas ligeras— mediante métodos bien conocidos en la técnica. Véanse Riechmann et al., 1999, J. Immunol. 231:25-38; Nuttall et

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al., 2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3):253-263; Muylderman, 2001, J. Biotechnol. 74(4):277302; la patente estadounidense n° 6.005.079; y las publicaciones internacionales nos WO 94/04678, WO 94/25591 y WO 01/44301.

En ciertos aspectos, los anticuerpos descritos en la presente memoria, tales como anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos monocatenarios, y anticuerpos biespecíficos, pueden ser producidos a través de tecnología recombinante conocida en la técnica. Por ejemplo, células anfitrionas de mamífero que comprenden vectores que expresan un anticuerpo descrito en la presente memoria son cultivadas en condiciones adecuadas para la producción de anticuerpos.

Además, los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT pueden ser utilizados, a su vez, para generar anticuerpos antiidiotípicos que “imitan” un antígeno usando técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, Greenspan y Bona, 1989, FASEB J. 7(5):437-444; y Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8):2429-2438).

5.5 Composiciones farmacéuticas y equipos de reactivos

En la presente memoria se proporcionan composiciones, composiciones farmacéuticas, y equipos de reactivos que comprenden uno o más anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanizados) descritos en la presente memoria, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, o conjugados de los mismos. En aspectos particulares, las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser para usos in vitro, in vivo o ex vivo. En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humanizado) descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Según se la usa en la presente memoria, la expresión “farmacéuticamente aceptable” significa estar autorizado por un organismo regulador del gobierno federal o estatal, o enumerado en la farmacopea estadounidense, la farmacopea europea u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y, más en particular, en seres humanos.

Pueden prepararse formulaciones terapéuticas que contienen uno o más anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanizados) proporcionados en la presente memoria para su almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a ed. (2006) Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y las concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

Las formulaciones, tales como las descritas en la presente memoria, también pueden contener más de un compuesto activo (por ejemplo, moléculas; por ejemplo, un anticuerpo o anticuerpos descritos en la presente memoria), según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando. En ciertas realizaciones, las formulaciones comprenden un anticuerpo proporcionado en la presente memoria y uno o más compuestos activos con actividades complementarias que no se afectan mutuamente de forma adversa. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto. Por ejemplo, un anticuerpo descrito en la presente memoria puede combinarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales (por ejemplo, un inhibidor de la tirosina quinasa tal como imatinib mesilado o sunitinib, o un inhibidor de la histona deacetilasa, tal como vorinostat). Tal terapia de combinación puede ser administrada al paciente en serie o simultáneamente o en secuencia.

Las formulaciones para ser usadas para la administración in vivo pueden ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración; por ejemplo, a través de membranas de filtración estériles.

En aspectos específicos, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente memoria contienen cantidades terapéuticamente efectivas de uno o más de los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanizados) proporcionados en la presente memoria y, opcionalmente, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas son útiles en la prevención, el tratamiento, la gestión o la mejora de un trastorno o enfermedad asociado con KIT, tal como cáncer (por ejemplo, GIST) o una enfermedad inflamatoria intestinal o uno o más de los síntomas de los mismos.

Los vehículos farmacéuticos adecuados para la administración de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria incluyen cualquier vehículo de ese tipo que los expertos en la técnica saben que es adecuado para el modo particular de administración.

Además, los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden ser formulados como el único ingrediente farmacéuticamente activo en la composición o pueden ser combinados con otros ingredientes activos (tales como uno o más agentes profilácticos o terapéuticos adicionales).

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Las composiciones pueden contener uno o más anticuerpos proporcionados en la presente memoria. En una realización, los anticuerpos están formulados en preparaciones farmacéuticas adecuadas, tales como soluciones, suspensiones, comprimidos, comprimidos dispersables, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida o elixires, para la administración oral, o en soluciones o suspensiones estériles para la administración parenteral, así como una preparación para parches transdérmicos y en inhaladores de polvo seco.

En las composiciones, uno o más anticuerpos proporcionados en la presente memoria (o conjugados de los mismos) son mezclados con un vehículo farmacéutico adecuado. Las concentraciones del anticuerpo o de los anticuerpos en las composiciones pueden ser efectivas, por ejemplo, para la distribución de una cantidad, tras su administración, que trata, previene o mejora un trastorno o enfermedad asociado con KIT o un síntoma del mismo. En realizaciones particulares, las concentraciones de un conjugado anticuerpo-fármaco o de conjugados anticuerpo-fármaco en las composiciones pueden ser eficaces, por ejemplo, para la distribución de una cantidad de uno o varios fármacos, tras su administración, que tratan, previenen o mejoran un trastorno o enfermedad asociado con KIT o un síntoma del mismo.

En una realización, las composiciones son formuladas para una administración en una única dosificación. Para formular una composición, la fracción de peso del compuesto es disuelta, suspendida, dispersada o mezclada de otra forma en un vehículo seleccionado en una concentración efectiva, de modo que se alivie o prevenga la condición tratada, o mejoren uno o más síntomas.

En ciertos aspectos, se incluye un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humanizado) proporcionado en la presente memoria (o un conjugado anticuerpo-fármaco del mismo) en el vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en ausencia efectos secundarios no deseados o con efectos secundarios mínimos o insignificantes en el paciente tratado. Una concentración terapéuticamente eficaz puede ser determinada empíricamente sometiendo a ensayo a los compuestos en sistemas in vitro e in vivo usando métodos rutinarios y luego extrapolando de ellos las dosis para seres humanos.

La concentración de anticuerpo en la composición farmacéutica dependerá, por ejemplo, de las características físico- químicas del anticuerpo, de la posología, de la cantidad administrada, así como de otros factores conocidos para los expertos en la técnica. En ciertos aspectos, la concentración de conjugado anticuerpo-fármaco en la composición farmacéutica dependerá, por ejemplo, de las características físico-químicas del anticuerpo y/o del fármaco, de la posología, de la cantidad administrada, así como de otros factores conocidos para los expertos en la técnica.

En una realización, una dosificación terapéuticamente efectiva produce una concentración sérica de anticuerpo entre aproximadamente 0,1 ng/ml y aproximadamente 50-100 pg/ml. Las composiciones farmacéuticas, en otra realización, proporcionan una dosificación entre aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente 2000 mg de anticuerpo por kilogramo de peso corporal para la administración durante un periodo de tiempo; por ejemplo, cada día, cada semana, cada 2 semanas o cada 3 semanas. Pueden prepararse formas posológicas farmacéuticas unitarias para proporcionar entre aproximadamente 0,01 mg y aproximadamente 2000 mg, y en una realización entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 500 mg del anticuerpo y/o una combinación de otros ingredientes esenciales opcionales por forma posológica unitaria.

En una realización particular, se administra un conjugado anticuerpo-fármaco descrito en la presente memoria a una dosis efectiva de entre aproximadamente 1 y 100 mg de conjugado anticuerpo-fármaco por kilogramo de peso corporal para su administración durante un periodo de tiempo; por ejemplo, cada día, cada semana, cada 2 semanas o cada 3 semanas.

El anticuerpo puede ser administrado de una vez, o puede ser dividido en varias dosis menores para ser administrado a intervalos de tiempo. Se entiende que la dosificación y la duración precisas del tratamiento son una función de la enfermedad que está siendo tratada y que pueden ser determinadas empíricamente usando protocolos de prueba conocidos o mediante extrapolación de datos de ensayo in vivo o in vitro. Ha de hacerse notar que las concentraciones y los valores de dosificación también pueden variar con la gravedad de la afección que haya de paliarse. Ha de entenderse, además, que, para cualquier sujeto particular, pueden ajustarse posologías específicas con el paso del tiempo según la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración definidos en la presente memoria son únicamente ejemplares y que no se pretende que limiten el alcance o la puesta en práctica de las composiciones reivindicadas.

Tras la mezcla o la adición del anticuerpo, la mezcla resultante puede ser una solución, una suspensión, una emulsión o similares. La forma de la mezcla resultante depende de varios factores, incluyendo el modo previsto y la solubilidad del compuesto en el excipiente o vehículo seleccionado. La concentración efectiva es suficiente para paliar los síntomas del trastorno, enfermedad o afección tratado y puede ser determinada empíricamente.

Las composiciones farmacéuticas son proporcionadas para su administración a seres humanos y animales en formas posológicas unitarias, tales como soluciones parenterales (por ejemplo, intravenosas) estériles o suspensiones que contienen cantidades adecuadas de los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. También se proporcionan composiciones farmacéuticas para su administración a seres humanos y

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animales en forma posológica unitaria, tales como comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, gránulos y soluciones o suspensiones orales, y emulsiones oleosas-acuosas que contienen cantidades adecuadas de los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. En una realización, el anticuerpo está formulado y es administrado en formas posológicas unitarias o en formas posológicas múltiples. Las formas posológicas unitarias, según se usan en la presente memoria, se refieren a unidades físicamente diferenciadas adecuadas para sujetos humanos y animales y envasadas individualmente como se conoce en la técnica. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada del anticuerpo suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente requerido. Ejemplos de formas posológicas unitarias incluyen ampollas y jeringas y comprimidos o cápsulas envasados individualmente. Las formas posológicas unitarias pueden ser administradas en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma posológica múltiple es una pluralidad de formas posológicas unitarias idénticas envasadas en un solo recipiente para ser administradas en forma posológica unitaria segregada. Ejemplos de formas posológicas múltiples incluyen viales, frascos de comprimidos o cápsulas o botellas de pintas o galones. Por ende, la forma posológica múltiple es un múltiplo de dosis unitarias que no está segregada en el envasado.

En ciertas realizaciones, uno o más anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria se encuentran en una formulación farmacéutica líquida. Las composiciones líquidas administrables farmacéuticamente pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, dispersando o mezclando de otro modo un compuesto activo definido anteriormente y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un vehículo, tal como, por ejemplo, agua, suero fisiológico, dextrosa acuosa, glicerol, glicoles, etanol y similares, para formar con ello una solución o una suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica que ha de ser administrada también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como humectantes, emulsionantes, solubilizantes y tampones de pH y similares.

Los métodos reales de preparación de tales formas posológicas son conocidos, o serán evidentes, para los expertos en esta técnica; véanse, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a ed. (2006) Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland.

Pueden prepararse formas posológicas o composiciones que contienen anticuerpo en el intervalo del 0,005% al 100%, estando constituido el resto por un vehículo no tóxico. Los expertos en la técnica conocen métodos para la preparación de estas composiciones.

En la presente memoria también se contempla la administración parenteral, en una realización, que se caracteriza por la inyección, ya sea de forma subcutánea, intramuscular o intravenosa. Los inyectables pueden prepararse de formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, en formas sólidas para su solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Los inyectables, las soluciones y las emulsiones también contienen uno o más excipientes. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, suero fisiológico, dextrosa, glicerol o etanol. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas que han de ser administradas también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como humectantes o emulsionantes, tampones de pH, estabilizantes, potenciadores de la solubilidad y otros agentes de ese tipo. Otras vías de administración pueden incluir la administración entérica, la administración intracerebral, la administración nasal, la administración intraarterial, la administración intracardiaca, la perfusión intraósea, la administración intratecal y la administración intraperitoneal.

Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones estériles listas para su inyección, productos solubles secos estériles, tales como polvos liofilizados, listos para ser combinados con un disolvente inmediatamente antes de su uso, incluyendo comprimidos hipodérmicos, suspensiones estériles listas para su inyección productos insolubles secos estériles listos para ser combinados con un vehículo inmediatamente antes de su uso y emulsiones estériles. Las soluciones pueden ser acuosas o no acuosas.

Si son administrados de forma intravenosa, los vehículos adecuados incluyen suero fisiológico o suero fisiológico con tampón fosfato (PBS) y soluciones que contienen espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas de los mismos.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables usados en preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, tampones, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersantes, emulsionantes, inhibidores o quelantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables.

Los vehículos farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol para vehículos miscibles con agua; e hidróxido sódico, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para el ajuste del pH.

De manera ilustrativa, la perfusión intravenosa o intraarterial de una solución acuosa estéril que contiene un compuesto activo es un modo efectivo de administración. Otra realización es una solución o suspensión acuosa u oleosa estéril que contiene un material activo inyectado según sea necesario para producir el efecto farmacológico deseado.

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El anticuerpo puede ser suspendido de forma micronizada o de otra forma adecuada. La forma de la mezcla resultante depende del varios factores, incluyendo el modo previsto de administración y la solubilidad del compuesto en el excipiente o vehículo seleccionado. La concentración efectiva es suficiente para paliar los síntomas de la afección y puede ser determinada empíricamente.

En otras realizaciones, las formulaciones farmacéuticas son polvos liofilizados, que pueden ser reconstituidos para su administración como soluciones, emulsiones y otras mezclas. También pueden ser reconstituidas y formuladas como sólidos o geles.

El polvo liofilizado se prepara disolviendo un anticuerpo proporcionado en la presente memoria en un disolvente adecuado. En algunas realizaciones, el polvo liofilizado es estéril. El disolvente puede contener un excipiente que mejora la estabilidad u otro componente farmacológico del polvo o de la solución reconstituida preparada a partir del polvo. Excipientes que pueden usarse incluyen, sin limitación, dextrosa, sorbitol, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa u otro agente adecuado. El disolvente también puede contener un tampón, tal como citrato, fosfato sódico o potásico u otro tampón de ese tipo conocido para los expertos en la técnica, en una realización, a aproximadamente un pH neutro. La filtración estéril subsiguiente de la solución, seguida por la liofilización en condiciones estándar conocidas para los expertos en la técnica proporciona la formulación deseada. En una realización, la solución resultante será distribuida en viales para su liofilización. Cada vial contendrá una sola dosis o múltiples dosis del compuesto. El polvo liofilizado puede ser almacenado en condiciones apropiadas, tales como entre aproximadamente 4°C y la temperatura ambiente.

La reconstitución de este polvo liofilizado con agua para su inyección proporciona una formulación para ser usada en la administración parenteral. Para su reconstitución, el polvo liofilizado es añadido a agua estéril o a otro vehículo adecuado. La cantidad precisa depende del compuesto seleccionado. Tal cantidad puede ser determinada empíricamente.

Los anticuerpos proporcionados en la presente memoria pueden ser formulados para una aplicación local o tópica, tal como para una aplicación tópica a la piel y las membranas mucosas, tal como en el ojo, en forma de geles, cremas y lociones, y para su aplicación al ojo o para una aplicación intracisternal o intraespinal. Se contempla la administración tópica para la administración transdérmica y también para la administración a los ojos o la mucosa, para para terapias de inhalación. También se pueden administrar soluciones nasales del compuesto activo por sí solo o en combinación con otros excipientes farmacéuticamente aceptables.

Los anticuerpos y otras composiciones proporcionados en la presente memoria también pueden ser formulados para que seleccionen como diana un tejido, un receptor u otra área particular del cuerpo del sujeto que ha de ser tratado. Los expertos en la técnica conocen bien muchos métodos de direccionamiento de ese tipo. En la presente memoria están contemplados todos los métodos de direccionamiento de ese tipo para su uso en las presentes composiciones. Para ejemplos no limitantes de métodos de direccionamiento, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos 6.316.652, 6.274.552, 6.271.359, 6.253.872, 6.139.865, 6.131.570, 6.120.751, 6.071.495, 6.060.082, 6.048.736, 6.039.975, 6.004.534, 5.985.307, 5.972.366, 5.900.252, 5.840.674, 5.759.542 y 5.709.874. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria son dirigidos (o administrados de otra manera) a la médula ósea, tal como en un paciente que tenga leucemia o corra el riesgo de tenerla. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria son dirigidos (o administrados de otra manera) al tracto gastrointestinal, tal como en un paciente que tenga tumores estromales gastrointestinales o corra el riesgo de tenerlos. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria son dirigidos (o administrados de otra manera) a los pulmones, tal como en un paciente que tenga cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer microcítico de pulmón) o corra el riesgo de tenerlo. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria son dirigidos (o administrados de otra manera) al cerebro, tal como en un paciente que tenga neuroblastoma o corra el riesgo de tenerlo. En realizaciones específicas, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria es capaz de cruzar la barrera sangre-cerebro.

En la presente memoria se proporciona un estuche farmacéutico o equipo de reactivos que comprende uno o más recipientes llenos de uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria, tales como uno o más anticuerpos proporcionados en la presente memoria. Opcionalmente asociada con tal recipiente o tales recipientes puede haber una nota en la forma recomendada por un organismo gubernamental regulando la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, nota que refleje la autorización por parte del organismo de la fabricación, el uso o la venta para la administración a seres humanos.

En la presente memoria también se proporcionan equipos de reactivos que pueden ser usados en los anteriores métodos. En una realización, un equipo de reactivos comprende un anticuerpo descrito en la presente memoria, preferentemente un anticuerpo purificado, en uno o más recipientes. En una realización específica, los equipos de reactivos descritos en la presente memoria contienen un antígeno de KIT sustancialmente aislado como control. En otra realización específica, los equipos de reactivos descritos en la presente memoria comprenden, además, un anticuerpo de control que no reacciona con el antígeno de KIT. En otra realización específica, los equipos de reactivos descritos en la presente memoria contienen uno o más elementos para detectar la unión de un anticuerpo modificado a un antígeno de KIT (por ejemplo, el anticuerpo puede ser conjugado con un sustrato detectable, tal como un compuesto fluorescente, un sustrato enzimático, un compuesto radiactivo o un compuesto luminiscente, o

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un segundo anticuerpo que reconoce al primer anticuerpo puede ser conjugado con un sustrato detectable). En realizaciones específicas, el equipo de reactivos puede incluir un antígeno de KIT producido de forma recombinante o sintetizado químicamente. El antígeno de KIT proporcionado en el equipo de reactivos también puede estar unido a un soporte sólido. En una realización más específica, el medio de detección del equipo de reactivos anteriormente descrito incluye un soporte sólido al que está unido el antígeno de KIT. Tal equipo de reactivos también puede incluir un anticuerpo anti humano no unido marcado por indicador. En esta realización, la unión del anticuerpo al antígeno de KIT puede ser detectada por la unión de dicho anticuerpo marcado por indicador.

5.6 Métodos

En la presente memoria se proporcionan anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria para su uso en métodos para impedir, prevenir, tratar y/o gestionar un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer). Tales métodos comprenden administrar a un sujeto necesitado de ello una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria (por ejemplo, anticuerpos humanizados, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, o conjugados de los mismos). En ciertos aspectos, en la presente memoria también se proporcionan anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria para su uso en métodos para prevenir, impedir, tratar o gestionar uno o más síntomas de un trastorno o enfermedad asociado con KIT.

Según se usa en la presente memoria, “administrar” o “administración” se refiere al acto de inyectar o distribuir físicamente de otro modo una sustancia (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado proporcionado en la presente memoria o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un conjugado del mismo) a un sujeto o a un paciente (por ejemplo, humano), tal como por administración por las mucosas, tópica, intradérmica, intravenosa, intramuscular y/o por cualquier otro método de distribución física descrito en la presente memoria o conocido en la técnica.

Según se usa en la presente memoria, los términos “cantidad efectiva” o “cantidad terapéuticamente efectiva” se refieren a una cantidad de una terapia (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o una composición farmacéutica proporcionada en la presente memoria) que es suficiente para reducir y/o paliar la gravedad y/o la duración de una enfermedad dada y/o un síntoma relacionado con la misma. Estos términos también abarcan una cantidad necesaria para la reducción o la mejoría en el avance o progreso de una enfermedad dada, la reducción o la mejoría de la recurrencia, el desarrollo o la aparición de una enfermedad dado, y/o para mejorar o potenciar el o los efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia (por ejemplo, una terapia distinta de un anticuerpo anti KIT proporcionada en la presente memoria). En algunas realizaciones, “cantidad efectiva”, tal como se usa en la presente memoria, también se refiere a la cantidad de un anticuerpo descrito en la presente memoria para lograr un resultado especificado (por ejemplo, la inhibición (por ejemplo, la inhibición parcial) de la actividad biológica KIT de una célula, tal como la inhibición de la proliferación celular o de la supervivencia celular, o la potenciación o la inducción de la apoptosis o la diferenciación celular).

Según se la usa en la presente memoria, la expresión “en combinación”, en el contexto de la administración de otras terapias, se refiere al uso de más de una terapia. El uso de la expresión “en combinación” no restringe el orden en el que se administran las terapias. Las terapias pueden ser administradas, por ejemplo, en serie, secuencial, concurrente o concomitantemente.

Según se usan en la presente memoria, los términos “gestionar”, “gestionando” y “gestión” se refieren a los efectos beneficiosos que un sujeto deriva de una terapia (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico), que no da como resultado la curación de un trastorno o enfermedad asociado con KIT. En ciertas realizaciones, se administran a un sujeto una o más terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos, tales como un anticuerpo descrito en la presente memoria) para “gestionar” una enfermedad asociada con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria o fibrosis) o uno o más síntomas de la misma, para prevenir el avance o en empeoramiento de la enfermedad.

Según se usan en la presente memoria, los términos “impedir” o “impidiendo”, en el contexto de un trastorno o enfermedad asociado con KIT, se refieren a la inhibición total o parcial (por ejemplo, menos del 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o 5%) o al bloqueo del desarrollo, la recurrencia, la aparición o la propagación de una enfermedad asociada con KIT y/o de un síntoma relacionado con la misma, resultante de la administración de una terapia o una combinación de terapias proporcionadas en la presente memoria (por ejemplo, una combinación de agentes profilácticos o terapéuticos, tales como un anticuerpo descrito en la presente memoria).

Según se la usa en la presente memoria, la expresión “agente profiláctico” se refiere a cualquier agente que pueda inhibir total o parcialmente el desarrollo, la recurrencia, la aparición o la propagación de una enfermedad asociada con KIT y/o un síntoma relacionado con la misma en un sujeto. En ciertas realizaciones, la expresión “agente profiláctico” se refiere a un anticuerpo descrito en la presente memoria. En ciertas otras realizaciones, la expresión “agente profiláctico” se refiere a un agente distinto de un anticuerpo descrito en la presente memoria. Generalmente, un agente profiláctico es un agente que se sabe que es útil o que ha sido o es usado en la actualidad para prevenir una enfermedad asociada con KIT y/o un síntoma relacionado con la misma o impide la aparición, el desarrollo, el avance y/o la gravedad de una enfermedad asociada con KIT y/o un síntoma relacionado con la misma. En realizaciones específicas, el agente profiláctico es un anticuerpo anti KIT humano, tal como un anticuerpo monoclonal anti-KIT humanizado o plenamente humano.

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Según se la usa en la presente memoria, la expresión “efectos secundarios” abarca efectos no queridos y adversos de una terapia (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico). Los efectos no queridos no son necesariamente adversos. Un efecto adverso de una terapia (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico) puede ser dañino o incómodo o suponer un riesgo. Ejemplos de efectos secundarios incluyen diarrea tos, gastroenteritis, sibilancia, náusea, vómito, anorexia, calambres abdominales, fiebre, dolor, pérdida de peso corporal, deshidratación, alopecia, disnea, insomnio, mareo, mucositis, efectos nerviosos y musculares, fatiga, sequedad de boca y pérdida del apetito, sarpullidos o hinchazones en el sitio de administración, síntomas de tipo gripal, tales como fiebre, escalofríos y fatiga, problemas del tracto digestivo y reacciones alérgicas. Los efectos no deseados adicionales experimentados por los pacientes son numerosos y conocidos en la técnica. Muchos están descritos en la obra Physician’s Desk Reference (63a ed., 2009).

Según se usan en la presente memoria, los términos “sujeto” y “paciente” son usados de manera intercambiable. Según se usa en la presente memoria, un sujeto es, preferentemente, un mamífero, tal como un no primate (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, cabras, conejos, ratas, ratones, etc.) o un primate (por ejemplo, un mono o un ser humano), siendo lo más preferible que sea un ser humano. En una realización, el sujeto es un mamífero, preferentemente un ser humano, que tiene un trastorno o enfermedad asociado con KIT. En otra realización, el sujeto es un mamífero, preferentemente un ser humano, con riesgo de desarrollar un trastorno o enfermedad asociado con KIT. En otra realización, el sujeto es un primate no humano. En una realización específica, el sujeto es un sujeto humano adulto de al menos 18 años de edad.

Según se usan en la presente memoria, los términos “terapias” y “terapia” pueden referirse a uno o varios protocolos, a uno o varios métodos, a composiciones, formulaciones, y/o a uno o varios agentes cualesquiera que pueden ser usados en la prevención, el tratamiento, la gestión o la mejoría de una afección o trastorno o síntoma de los mismos (por ejemplo, cáncer o uno o más síntomas o afecciones asociados con el mismo; afección inflamatoria o uno o más síntomas o afecciones asociados con la misma; fibrosis o uno o más síntomas o afecciones asociados con la

misma). En ciertas realizaciones, los términos “terapias” y “terapia” se refieren a una terapia farmacológica, a una

terapia adyuvante, a radiación, a cirugía, a una terapia biológica, a una terapia de apoyo y/o a otras terapias útiles en el tratamiento, la gestión, la prevención o la mejoría de una afección o trastorno o a uno o más síntomas del mismo (por ejemplo, cáncer o uno o más síntomas o afecciones asociados con el mismo; afección inflamatoria o uno o más síntomas o afecciones asociados con la misma; fibrosis o uno o más síntomas o afecciones asociados con la

misma). En ciertas realizaciones, el término “terapia” se refiere a una terapia distinta de un anticuerpo anti KIT

descrito en la presente memoria o de composiciones farmacéuticas del mismo. En realizaciones específicas, una “terapia adicional” y “terapias adicionales” se refieren a una terapia distinta de un tratamiento que use un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria o de una composición farmacéutica. En una realización específica, una terapia incluye el uso de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria como terapia adyuvante. Por ejemplo, el uso de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria junto con una terapia farmacológica, una terapia biológica, cirugía y/o una terapia de apoyo.

Según se la usa en la presente memoria, la expresión “agente terapéutico” se refiere a cualquier agente que pueda ser usado en el tratamiento, la gestión o la mejoría de una enfermedad asociada con KIT y/o de un síntoma relacionado con la misma. En ciertas realizaciones, la expresión “agente terapéutico” se refiere a un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20), a un fragmento de unión a antígeno del mismo, o a un conjugado del mismo. En ciertas otras realizaciones, la expresión “agente terapéutico” se refiere a un agente distinto de un anticuerpo descrito en la presente memoria. Preferentemente, un agente terapéutico es un agente que se sabe que es útil o que ha sido o es usado en la actualidad para el tratamiento, la gestión o la mejora de una enfermedad asociada con KIT o de uno o más síntomas relacionados con la misma. En realizaciones específicas, el agente profiláctico es un anticuerpo anti KIT humano, tal como un anticuerpo monoclonal anti-KIT plenamente humano.

Según se usan en la presente memoria, las expresiones “trastorno asociado con KIT” o “enfermedad asociada con KIT” son usadas de manera intercambiable y se refieren a cualquier enfermedad que esté causada completa o parcialmente por la expresión y/o la actividad de KIT o la ausencia de las mismas, o esté asociado con las mismas o sea el resultado de las mismas. En un aspecto, un trastorno o enfermedad asociado con KIT puede ser conocido para un experto en la técnica o puede ser constatado por un experto en la técnica. En cierta realización, un trastorno o enfermedad asociado con KIT está asociado con la expresión y/o la actividad de KIT. Por ejemplo, la expresión y/o la actividad de KIT puede contribuir, en combinación con uno o más factores adicionales (por ejemplo, la mutación o la expresión y/o la actividad de otro gen), al desarrollo y/o el avance de un trastorno o a enfermedad asociado con KIT. En cierta realización, un trastorno o a enfermedad asociado con KIT está asociado con una o más mutaciones de KIT.

En ciertas realizaciones, una enfermedad asociada con KIT es fibrosis o un trastorno inflamatorio; por ejemplo, una enfermedad inflamatoria intestinal (EII), tal como la enfermedad de Crohn (CD) o la colitis ulcerosa (UC). En otras realizaciones, una enfermedad asociada con KIT es cáncer, tal como cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer microcítico de pulmón), leucemia, neuroblastoma, melanoma, sarcoma (por ejemplo, el sarcoma de Ewing) o tumor estromal gastrointestinal (GIST).

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Según se usan en la presente memoria, los términos “tratar”, “tratamiento” y “tratando” se refieren a la reducción o mejoría del avance, la gravedad y/o la duración de una enfermedad asociada con KIT (por ejemplo, cáncer, trastorno inflamatorio o fibrosis) resultante de la administración de u na o más terapias (incluyendo, sin limitación, la administración de uno o más agentes profilácticos o terapéuticos, tales como un anticuerpo proporcionado en la presente memoria).

En realizaciones específicas, los métodos descritos en la presente memoria para tratar un trastorno o enfermedad asociado con KIT permiten la reducción o la mejoría del avance, la gravedad y/o la duración de un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria o fibrosis) resultante de la administración de una o más terapias (incluyendo, sin limitación, la administración de uno o más agentes profilácticos o terapéuticos, tales como un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria). En realizaciones específicas adicionales, los métodos descritos en la presente memoria para tratar un trastorno o enfermedad asociado con KIT están relacionados con la reducción de uno o más síntomas de un trastorno o enfermedad asociado con KIT. En realizaciones específicas, un anticuerpo descrito en la presente memoria —por ejemplo uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20; por ejemplo, el anticuerpo Hum8 o Hum4 o Hum17 o Hum10, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo— es para su uso en el tratamiento o la gestión de un trastorno asociado con KIT (por ejemplo, cáncer). En una realización particular, un trastorno o a enfermedad asociado con KIT que está siendo tratada o gestionada con un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo, está asociado con la expresión y/o la actividad de KIT; por ejemplo, implica células que expresan el KIT y/o presentan la actividad del KIT, pero no es causado por la expresión o la actividad del KIT ni es el resultado de la misma.

En una realización particular, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado), por ejemplo uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, o Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo, para su uso en el tratamiento o la gestión de un trastorno asociado con KIT (por ejemplo, cáncer), en el que el anticuerpo comprende (i) una región de cadena VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8, 9 o 10, y/o (ii) una región de cadena VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 o 6. En otra realización particular, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso en el tratamiento o la gestión de un trastorno asociado con KIT (por ejemplo, cáncer), en el que el anticuerpo comprende una combinación del dominio VH (por ejemplo, H1-H5, sEq ID nOs: 2-6) y del dominio VL (L1-L4, SEQ ID Nos: 7-10) seleccionados del grupo presentado en la Tabla 4. En una realización particular, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tales como Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo, para su uso en el tratamiento o la gestión de un trastorno asociado con KIT (por ejemplo, cáncer), en el que el anticuerpo comprende (i) una región de cadena VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (véase, por ejemplo, la Figura 4B), y/o (ii) una región de cadena VH que comprende la secuencia de aminoácidos de consenso de la SEQ ID NO: 11 (véase, por ejemplo, la Figura 4A). En una realización particular, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo, para su uso en el tratamiento o la gestión de un trastorno asociado con KIT (por ejemplo, cáncer), en el que el anticuerpo comprende (i) una región de cadena VL que comprende una secuencia de aminoácidos definida en la Tabla 6A (por ejemplo, L1-L4 y LL1-LL62), y/o (ii) una región de cadena VH que comprende la secuencia de aminoácidos definida en la Tabla 6B (por ejemplo, H1-H5 y HH1-HH256).

En una realización específica, el anticuerpo usado en los métodos descritos en la presente memoria es internalizado por la célula a la que se une. En una realización particular, se usa un conjugado en los métodos descritos en la presente memoria, comprendiendo el conjugado un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado, por ejemplo Hum4 o Hum8), o un fragmento de unión al KIT del mismo. En una realización específica, el conjugado comprende un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión al KIT del mismo, ligado, covalente o no covalentemente, a un agente terapéutico, tal como una toxina. En cierta realización, el conjugado usado en los métodos descritos en la presente memoria es internalizado en una célula a la que se une.

En ciertas realizaciones, el KIT es expresado por las células de forma aberrante (por ejemplo, mucho); por ejemplo, el KIT es sobreexpresado. En realizaciones particulares, la expresión del KIT (por ejemplo, en la superficie celular) es al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% mayor que la expresión del KIT en la superficie de una célula de control (por ejemplo, una célula que exprese niveles normales de KIT; por ejemplo, un mastocito, una célula madre, una célula cerebral, un melanoblasto, o una célula ovárica normales, por ejemplo humanos). En realizaciones particulares, la expresión de KIT produce una expresión de KIT en la superficie celular al menos aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% mayor que la expresión media de KIT en la superficie de una población de células de control (por ejemplo, una población de células que expresan niveles normales de KIT; por ejemplo, una población de mastocitos, una población de células madre, una población de células cerebrales, una población de melanoblastos o una población de células ováricas normales; por ejemplo, humanas). En realizaciones específicas, tales células de control pueden ser obtenidas o

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derivadas de un individuo sano (por ejemplo, un ser humano sano). En algunas realizaciones, el KIT puede ser regulado aberrantemente al alza en un tipo particular de célula, sea expresado aberrantemente o no el KIT en la superficie celular. En realizaciones particulares, la señalización o la actividad de KIT puede ser regulada aberrantemente al alza en un tipo particular de célula, sea expresado aberrantemente o no el KIT en la superficie celular. En realizaciones particulares, la señalización del KIT es al menos aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% mayor que la señalización del KIT de una célula de control (por ejemplo, una célula que contenga una señalización de KIT normal; por ejemplo, un mastocito, una célula madre, una célula cerebral, un melanoblasto o una célula ovárica). En realizaciones particulares, la señalización de KIT es al menos aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% mayor que la señalización media de KIT de una población de células de control (por ejemplo, una población de células que presentan una señalización normal de KIT; por ejemplo, una población de mastocitos, una población de células madre, una población de células cerebrales, una población de melanoblastos o una población de células ováricas normales; por ejemplo, humanas). En ciertas realizaciones, una señalización celular normal, aberrante o excesiva es causada por la unión de KIT a un ligando de KIT. En otras realizaciones, una señalización celular aberrante o excesiva se produce con independencia de la unión de KIT a un ligando de KIT.

En ciertos aspectos, un trastorno o enfermedad asociado con KIT puede ser caracterizado por una actividad del KIT, un aumento en la actividad del KIT o una sobreexpresión de KIT con ganancia de función. En una realización, un trastorno o enfermedad asociado con KIT es causado completa o parcialmente por la actividad o expresión del KIT —por ejemplo, la sobreexpresión de KIT— con ganancia de función, o es resultado de la misma. En ciertas realizaciones, la actividad del KIT con ganancia de función puede ocurrir con independencia del ligando de KIT (por ejemplo, SCF) se una al receptor de KIT. En aspectos particulares, la alta expresión o sobreexpresión de KIT en una célula se refiere a un nivel de expresión que es al menos aproximadamente 35%, 45%, 55% o 65% más que el nivel de expresión de una célula de referencia que se sabe que tiene una expresión del KIT o una actividad del KIT normales o a un nivel de expresión del KIT por encima de la media en una población de células o muestras que se sabe que tienen una expresión del KIT o una actividad del KIT normales. Los niveles de expresión del KIT pueden ser evaluados por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, inmunoelectrotransferencia o inmunohistoquímica). En realizaciones particulares, un trastorno o enfermedad asociado con KIT está caracterizado por una actividad del KIT que es mayor que la actividad normal del KIT y contribuye a la transformación celular, a la neoplasia y a la tumorogénesis. En aspectos particulares, una actividad del KIT alta, o un aumento de la misma, en una célula se refiere a un nivel de la actividad del KIT que es al menos aproximadamente 35%, 45%, 55% o 65% mayor que el nivel de expresión de célula de referencia que se sabe que tiene una actividad normal del KIT o mayor que el nivel medio de la actividad del KIT en una población de células o muestras que se sabe que tienen una actividad normal del KIT. Ejemplos no limitantes de una actividad del KIT incluyen la fosforilación de la tirosina del dominio citoplasmático de KIT, y la señalización aguas debajo de KIT, tal como señalización de Stat o Akt.

Ejemplos no limitantes de trastornos o de trastornos o enfermedades asociados con KIT incluyen cánceres tales como el cáncer de mama, la leucemia (por ejemplo, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mastocítica), el cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer microcítico de pulmón), el neuroblastoma, tumores estromales gastrointestinales (GIST), melanoma, cáncer colorrectal, sarcoma (por ejemplo, sarcoma de Ewing), y tumores de células germinales (por ejemplo, seminoma). En una realización particular, un cáncer que es tratado o gestionado por los métodos proporcionados en la presente memoria se caracteriza por una mutación de KIT con ganancia de función o una sobreexpresión de KIT.

Según la invención, un método descrito en la presente memoria es para tratar cáncer (por ejemplo, GIST, cáncer de pulmón o sarcoma (por ejemplo, sarcoma de Ewing)), comprendiendo dicho método la administración a un sujeto necesitado del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo. En ciertos aspectos, los métodos para prevenir, tratar o gestionar uno o más síntomas of cáncer pueden comprender la administración a un sujeto necesitado del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado), por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo. En una realización específica, un anticuerpo para su uso en los métodos de tratamiento del cáncer descritos en la presente memoria comprende un dominio vL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (L2), y/o un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (H3). En una realización específica, un anticuerpo para su uso en los métodos de tratamiento del cáncer descritos en la presente memoria comprende un dominio Vl que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (L1), y/o un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (H4).

En una realización específica, un método descrito en la presente memoria es para tratar GIST, comprendiendo dicho método la administración a un sujeto necesitado del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo. En ciertos aspectos, en la presente memoria también se

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proporcionan los métodos para prevenir, tratar o gestionar uno o más síntomas of GIST, comprendiendo dichos métodos la administración a un sujeto necesitado del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo. En una realización específica, un anticuerpo para su uso en los métodos de tratamiento de GIST descritos en la presente memoria comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (L2), y/o un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (H3). En una realización específica, un anticuerpo para su uso en los métodos de tratamiento de GIST descritos en la presente memoria comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (L1), y/o un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (H4).

Según la invención, un método descrito en la presente memoria es para tratar cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma microcítico de pulmón), comprendiendo dicho método la administración a un sujeto necesitado del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo. En ciertos aspectos, los métodos para prevenir, tratar o gestionar uno o más síntomas of cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma microcítico de pulmón) pueden comprender la administración a un sujeto necesitado del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo. En una realización específica, un anticuerpo para su uso en los métodos de tratamiento del cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer microcítico de pulmón) comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de sEq ID NO: 8 (L2), y/o un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (H3). En una realización específica, un anticuerpo para su uso en los métodos de tratamiento del cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer microcítico de pulmón) comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (L1), y/o un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (H4).

Según la invención, un método descrito en la presente memoria es para tratar melanoma, comprendiendo dicho método la administración a un sujeto necesitado del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo. En ciertos aspectos, los métodos para prevenir, tratar o gestionar uno o más síntomas of melanoma pueden comprender la administración a un sujeto necesitado del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo. En una realización específica, un anticuerpo para su uso en los métodos de tratamiento del melanoma descritos en la presente memoria comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (L2), y/o un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (H3). En una realización específica, un anticuerpo para su uso en los métodos de tratamiento del melanoma descritos en la presente memoria comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (L1), y/o un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (H4).

En realizaciones específicas, un cáncer tratado según los métodos descritos en la presente memoria puede ser cualquier tipo de cáncer que comprenda células cancerosas o tumorales que expresen KIT en la superficie celular o una forma mutada del mismo, lo que puede ser confirmado por cualquier método histológico o citológico conocido para un experto en la técnica.

En ciertas realizaciones, un cáncer es metastásico. En ciertas realizaciones, un cáncer es un cáncer avanzado que se ha propagado fuera del sitio o el órgano de origen, ya sea por invasión local o metástasis.

En realizaciones particulares, un cáncer es un cáncer recurrente que ha vuelto a desarrollarse, ya sea en el sitio inicial o en un sitio distante, después de una respuesta a la terapia inicial (por ejemplo, después de cirugía para extirpar el tumor y de terapia adyuvante tras la cirugía). En algunas realizaciones, un cáncer es un cáncer refractario que avanza aunque se administre o se haya administrado un antitumoral, tal como un agente quimioterapéutico, al paciente de cáncer. Un ejemplo no limitante de cáncer refractario es aquel que es refractario a un inhibidor de la tirosina quinasa, tal como GlEeVEC® (mesilato de imatinib), SUTENT® (SU11248 o sunitinib), IRESSA™ (gefitinib), TARCEVA® (erlotinib), NEXAVAR® (sorafenib) o VOTRIENT™ (pazopanib). En algunas realizaciones, un cáncer es un cáncer refractario que avanza aunque se administre o se haya administrado radiación o quimioterapia al paciente de cáncer.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporcionan anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria para su uso en métodos para tratar un cáncer refractario en un paciente necesitado de ello que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria, siendo el cáncer refractario resistente o refractario a un agente anticancerígeno tal como un inhibidor de la tirosina

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quinasa (por ejemplo, GLEEVEC® (mesilato de imatinib) o SUTENT® (SU11248 o Sunitinib)). Otros ejemplos no limitantes de inhibidores de la tirosina quinasa incluyen 706 y AMNI07 (nilotinib), RAD00I, PKC412, gefitinib (IRESSA™), erlotinib (TARCEVA®), sorafenib (NEXAVAR®), pazopanib (VOTRIENT™), axitinib, bosutinib, cediranib (RECENTIN®), SPRYCEL® (dasatinib), lapatinib (TYKERB®), lestaurtinib, neratinib, nilotinib (TASIGNA®), semaxanib, toceranib (PALLADIA™), vandetanib (ZACTIMA™) y vatalanib. En ciertas realizaciones, el cáncer refractario fue inicialmente sensible a un agente anticancerígeno, tal como un inhibidor de la tirosina quinasa (por ejemplo, GLEEVEC® o SU11248 (es decir, sunitinib)), pero ha desarrollado resistencia al agente anticancerígeno. En ciertas realizaciones, un sujeto tiene una o más mutaciones en el KIT que confieren resistencia a un agente anticancerígeno tal como un inhibidor de la tirosina quinasa.

En realizaciones particulares, se administra un anticuerpo descrito en la presente memoria a un paciente que ha recibido previamente, o esté recibiendo en ese momento, una o más terapias anticancerígenas; por ejemplo, un agente quimioterapéutico, o un inhibidor de la tirosina quinasa (por ejemplo, GLEEVEC® (mesilato de imatinib), SUTENT® (SU11248 o sunitinib), IRESSA™ (gefitinib), TARCEVA® (erlotinib), NEXAVAR® (sorafenib), o VOTRIENT™ (pazopanib)) o un inhibidor de la histona deacetilasa (por ejemplo, vorinostat o ácido suberoilanidido hidroxámico (SAHA)). En otras realizaciones particulares, se administra un anticuerpo descrito en la presente memoria a un paciente que es o se sospecha que es resistente o refractario a una terapia anticancerígena; por ejemplo, un inhibidor de la tirosina quinasa, por ejemplo, GLEEVEC® (mesilato de imatinib), SUTENT® (SU11248 o sunitinib), IRESSA™ (gefitinib), TARCEVA® (erlotinib), NEXAVAR® (sorafenib), o VOTRIENT™ (pazopanib).

En realizaciones particulares, un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión a KIT del mismo), o un conjugado del mismo) es administrado a un paciente que ha recibido previamente, o esté recibiendo en ese momento, una o más terapias anticancerígenas; por ejemplo, un anticuerpo anti receptor del factor de crecimiento (por ejemplo, el anticuerpo anti-HER2, el anticuerpo anti-EGFR, el anticuerpo anti-VEGFR, o un anticuerpo anti KIT), o un anticuerpo anti factor de crecimiento (por ejemplo, el anticuerpo anti-EGF, el anticuerpo anti-VEGF). En otras realizaciones particulares, un anticuerpo descrito en la presente memoria es administrado a un paciente que es o se sospecha que es resistente o refractario a una terapia anticancerígena; por ejemplo, un anticuerpo anti receptor del factor de crecimiento (por ejemplo, el anticuerpo anti-HER2, el anticuerpo anti-EGFR, el anticuerpo anti-VEGFR, o un anticuerpo anti KIT) o un anticuerpo anti factor de crecimiento (por ejemplo, el anticuerpo anti-EGF, el anticuerpo anti-VEGF).

Según la invención, un método descrito en la presente memoria para el tratamiento o la gestión de cáncer en un sujeto necesitado de ello, puede lograr al menos uno, dos, tres, cuatro o más de los siguientes efectos debido a la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria: (i) la reducción o la mejoría de la gravedad del cáncer (por ejemplo, leucemia, cáncer de pulmón o cáncer estromal gastrointestinal) y/o uno o más síntomas asociados con el mismo; (ii) la reducción en la duración de uno o más síntomas asociados con un cáncer (por ejemplo, leucemia, cáncer de pulmón o cáncer estromal gastrointestinal); (iii) la prevención en la recurrencia de un tumor (por ejemplo, un tumor de pulmón o un tumor estromal gastrointestinal); (iv) la regresión de un cáncer (por ejemplo, leucemia, cáncer de pulmón o tumor estromal gastrointestinal) y/o uno o más síntomas asociados con el mismo; (v) la reducción en la hospitalización de un sujeto; (vi) la reducción en la duración de la hospitalización; (vii) el aumento en la supervivencia de un sujeto; (viii) la inhibición del avance de un cáncer (por ejemplo, leucemia, cáncer de pulmón o tumor estromal gastrointestinal) y/o de uno o más síntomas asociados con el mismo; (ix) la potenciación o mejora del efecto terapéutico de otra terapia (por ejemplo, cirugía, radiación, quimioterapia u otro inhibidor de la tirosina quinasa); (x) una reducción en la población de células cancerosas o su eliminación (por ejemplo, la población de células de leucemia, la población de células de cáncer de pulmón, la población de células de tumor estromal gastrointestinal); (xi) una reducción en el crecimiento de un tumor o neoplasma; (xii) una disminución en el tamaño del tumor (por ejemplo, del volumen o el diámetro); (xiii) una reducción en la formación de tumores recién formados; (xiv) erradicación, eliminación o control de cáncer primario, regional y/o metastásico; (xv) facilitación en la extirpación de un tumor reduciendo el tumor y/o la vascularización relacionada con el edema antes de la cirugía; (xvi) una disminución en el número o el tamaño de las metástasis; (xvii) una reducción en mortalidad; (xviii) un aumento en la tasa de supervivencia libre de tumor de pacientes; (xvix) un aumento en la supervivencia libre de recaídas; (xx) un aumento en el número de pacientes en remisión; (xxi) una disminución en la tasa de hospitalización; (xxii) el tamaño del tumor se mantiene y no aumenta o aumenta menos que el aumento de un tumor después de la administración de una terapia estándar medido por métodos convencionales disponibles para un experto en la técnica, tal como el escáner de tomografía computarizada (TC), la formación de imágenes por resonancia magnética (IRM), IRM mejorada por contraste dinámico (DCE-MRI), o un escáner de tomografía por emisión de positrones (PET); (xxiii) la prevención del desarrollo o la aparición de uno o más síntomas asociados con el cáncer; (xxiv) un aumento en la duración de la remisión en los pacientes; (xxv) la reducción en el número de síntomas asociados con el cáncer; (xxvi) un aumento en la supervivencia libre de síntomas de pacientes con cáncer; (xxvii) una disminución en la concentración de uno o más mediadores inflamatorios (por ejemplo, citoquinas o interleucinas) en muestras biológicas (por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, orina o cualquier otro biofluido) de un sujeto con un cáncer (por ejemplo, leucemia, cáncer de pulmón o cáncer estromal gastrointestinal); (xxviii) una disminución en las células tumorales circulantes (CTC) en la sangre de un sujeto con cáncer (por ejemplo, leucemia, cáncer de pulmón o cáncer estromal gastrointestinal); (xxix)

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la inhibición (por ejemplo, la inhibición parcial) o la disminución en el metabolismo o perfusión tumoral; y (xxx) mejora en la calidad de vida evaluada por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, cuestionarios.

En ciertos aspectos, los métodos para matar células cancerosas en un individuo pueden comprender administrar a un individuo necesitado de ello una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo. En ciertos aspectos, los métodos para inhibir el desarrollo o la proliferación de células cancerosas en un individuo pueden comprender administrar a un individuo necesitado de ello una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo. En ciertas realizaciones, se logra una inhibición parcial del desarrollo o de la proliferación de células cancerosas; por ejemplo, una inhibición de al menos aproximadamente 20% a aproximadamente 55% del desarrollo o la proliferación de células cancerosas.

En ciertos aspectos, los métodos para reducir el tamaño o la carga tumoral en un individuo necesitado de ello pueden comprender administrar a dicho individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1- Hum20, tal como Hum17, Hum10, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo.

Otros ejemplos no limitantes de trastornos o enfermedades asociados con KIT incluyen trastornos sistémicos de mastocitos (por ejemplo, mastocitosis), trastornos hematológicos, fibrosis (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática (TPF), esclerodermia o mielofibrosis) y afecciones inflamatorias tales como asma, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal e inflamación alérgica.

Según la invención, un método descrito en la presente memoria para el tratamiento o la gestión de un trastorno asociado con KIT, por ejemplo, fibrosis o una afección inflamatoria (por ejemplo, asma, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal e inflamación alérgica), en un sujeto necesitado de ello, puede lograr al menos uno, dos, tres, cuatro o más de los siguientes efectos debido a la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria: (i) la reducción o la mejoría de la gravedad de la fibrosis o de una afección inflamatoria (por ejemplo, asma, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal e inflamación alérgica) y/o de uno o más síntomas asociados con la misma; (ii) la reducción en la duración de uno o más síntomas asociados con la fibrosis o una afección inflamatoria (por ejemplo, asma, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal e inflamación alérgica); (iii) la prevención en la recurrencia de la fibrosis o de una afección inflamatoria (por ejemplo, asma, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal e inflamación alérgica); (iv) la reducción en la hospitalización de un sujeto; (v) la reducción en la duración de la hospitalización; (vi) la inhibición (por ejemplo, la inhibición parcial) del avance de la fibrosis o de una afección inflamatoria (por ejemplo, asma, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal e inflamación alérgica) y/o de uno o más síntomas asociados con la misma; (vii) la potenciación o la mejora del efecto terapéutico de otra terapia (por ejemplo, una terapia antiinflamatoria tal como esteroides); (viii) un aumento en el número de pacientes en remisión (es decir, un periodo de tiempo caracterizado por carencia de síntomas o síntomas mínimos asociados con la afección inflamatoria); (ix) un aumento en la duración de la remisión en los pacientes; (x) una disminución en la tasa de hospitalización; (xi) la reducción en el número de síntomas asociados con la fibrosis o con una afección inflamatoria (por ejemplo, asma, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal e inflamación alérgica); (xii) una disminución en la concentración de uno o más mediadores inflamatorios (por ejemplo, citoquinas o interleucinas) en muestras biológicas (por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, orina, o cualquier otro biofluido) de un sujeto con fibrosis o una afección inflamatoria (por ejemplo, asma, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal e inflamación alérgica); y (xiii) mejora en la calidad de vida evaluada por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, cuestionarios.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria puede ser administrado por cualquier método adecuado a un sujeto necesitado del mismo. Ejemplos no limitantes de métodos de administración incluyen la administración por las mucosas, intradérmica, intravenosa, intratumoral, subcutánea, intramuscular y/o por cualquier otro método de distribución física descrito en la presente memoria o conocido en la técnica. En una realización, un anticuerpo anti KIT o una composición farmacéutica del mismo es administrado sistémicamente (por ejemplo, parenteralmente) a un sujeto necesitado de ello. En otra realización, un anticuerpo anti KIT o una composición farmacéutica del mismo es administrado localmente (por ejemplo, intratumoralmente) a un sujeto necesitado de ello. Cada dosis puede ser administrada o no por una vía idéntica de administración. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria puede ser administrado a través de múltiples vías de administración simultánea o subsiguientemente a otras dosis del mismo anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria o de uno diferente.

Cuando se está tratando una enfermedad, o un síntoma de la misma, la administración de la sustancia se produce normalmente después de la aparición de la enfermedad o de los síntomas de la misma. Cuando se están previniendo una enfermedad o síntomas de la misma, la administración de la sustancia se produce normalmente

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antes de la aparición de la enfermedad o de los síntomas de la misma. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria es administrado profiláctica o terapéuticamente a un sujeto. Un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria puede ser administrado profiláctica o terapéuticamente a un sujeto para prevenir, aminorar o mejorar un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis) o síntomas del mismo.

La dosificación y la frecuencia de administración de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria o de una composición farmacéutica del mismo administrado a un sujeto necesitado de ello según los métodos para tratar un trastorno o enfermedad asociado con KIT proporcionados en la presente memoria serán eficaces a la vez que minimizarán los efectos secundarios. La dosificación exacta de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria que ha de ser administrada a un sujeto particular, o de una composición farmacéutica del mismo, puede ser determinada por un médico, teniendo en cuenta factores relativos al sujeto que requiere el tratamiento. Los factores que pueden ser tomados en cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad y el peso del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la o las combinaciones con otros agentes terapéuticos o fármacos, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. La dosificación y la frecuencia de administración de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria o de una composición farmacéutica del mismo puede ser ajustada en el transcurso del tiempo para permitir niveles suficientes del anticuerpo anti KIT o para mantener el efecto deseado.

La dosis precisa que ha de emplearse en la formulación también dependerá de la vía de administración, y de la gravedad del trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis), y debería decidirse sobre ella según el criterio del médico y según las circunstancias de cada paciente.

En una realización, para los anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria, la dosificación administrada a un paciente, para gestionar un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis) es normalmente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Generalmente, los anticuerpos humanos tienen mayor vida media dentro del cuerpo humano que los anticuerpos procedentes de otras especies, debido a la respuesta inmunitaria a los polipéptidos foráneos. Así, a menudo son posibles dosificaciones menores de anticuerpos humanos y una administración menos frecuente. Además, la dosificación y la frecuencia de administración de los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden ser reducidas potenciando la captura de los anticuerpos y su penetración en los tejidos mediante modificaciones tales como, por ejemplo, la lipidación.

En una realización, entre aproximadamente 0,001 mg/kg (mg de anticuerpo por kg de peso de un sujeto) y aproximadamente 500 mg/kg de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria es administrada para gestionar un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis).

En algunas realizaciones, una cantidad efectiva de un anticuerpo proporcionado en la presente memoria está entre aproximadamente 0,01 mg y aproximadamente 1.000 mg. En realizaciones específicas, una “cantidad efectiva” de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria se refiere a una cantidad de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria que es suficiente para lograr al menos uno, dos, tres, cuatro o más de los siguientes efectos: (i) la reducción o la mejoría de la gravedad de un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis) y/o uno o más síntomas asociados con el mismo; (ii) la reducción en la duración de uno o más síntomas asociados con un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis); (iii) la prevención en la recurrencia de un tumor (por ejemplo, tumor estromal gastrointestinal); (iv) la regresión de un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis) y/o de uno o más síntomas asociados con el mismo; (v) la reducción en la hospitalización de un sujeto; (vi) la reducción en la duración de la hospitalización; (vii) el aumento en la supervivencia de un sujeto; (viii) la inhibición (por ejemplo, la inhibición parcial) del avance de un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis) y/o de uno o más síntomas asociados con el mismo; (ix) la potenciación o la mejora del efecto terapéutico de otra terapia; (x) una reducción en la población de células cancerosas o su eliminación (por ejemplo, la población de células de leucemia, la población de células de cáncer de pulmón, la población de células de cáncer estromal gastrointestinal); (xi) una reducción en el crecimiento de un tumor o neoplasma; (xii) una disminución en el tamaño del tumor (por ejemplo, del volumen o el diámetro); (xiii) una reducción en la formación de tumores recién formados; (xiv) erradicación, eliminación o control de cáncer primario, regional y/o metastásico; (xv) facilitación en la extirpación de un tumor reduciendo el tumor y/o la vascularización relacionada con el edema antes de la cirugía; (xvi) una disminución en el número o el tamaño de las metástasis; (xvii) una reducción en mortalidad; (xviii) un aumento en la tasa de supervivencia libre de tumor de pacientes; (xvix) un aumento en la supervivencia libre de recaídas; (xx) un aumento en el número de pacientes en remisión; (xxi) una disminución en la tasa de hospitalización; (xxii) el tamaño del tumor se mantiene y no aumenta o aumenta menos que el aumento de un tumor después de la administración de una terapia estándar medido por métodos convencionales disponibles para un experto en la técnica, tal como el escáner de tomografía computarizada (TC), la formación de imágenes por resonancia magnética (IRM), IRM mejorada por contraste dinámico (DCE-MRI), o un escáner de tomografía por emisión de positrones (PET); (xxiii) la prevención del desarrollo o la aparición de uno o más síntomas asociados con el cáncer; (xxiv) un aumento en la duración de la remisión en los pacientes; (xxv) la reducción en el número de síntomas asociados con el cáncer; (xxvi) un aumento en la supervivencia libre de síntomas de pacientes con cáncer; (xxvii) una disminución en la concentración de uno o más mediadores inflamatorios (por ejemplo, citoquinas o

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interleucinas) en muestras biológicas (por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, orina, o cualquier otro biofluido) de un sujeto con un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis); (xxviii) una disminución en las células tumorales circulantes (CTC) en la sangre de un sujeto con cáncer; (xxix) la inhibición (por ejemplo, la inhibición parcial) o la disminución en el metabolismo o perfusión tumoral; y (xxx) mejora en la calidad de vida evaluada por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, cuestionarios. En algunas realizaciones, “cantidad efectiva”, según se usa en la presente memoria, también se refiere a la cantidad de un anticuerpo descrito en la presente memoria para lograr un resultado especificado (por ejemplo, la inhibición de una o más actividades biológicas de KIT de una célula, tales como la inhibición de la proliferación celular).

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria es administrado, según sea necesario; por ejemplo, semanalmente, bisemanalmente (es decir, una vez cada dos semanas), mensualmente, bimensualmente, trimensualmente, etc., según determine el médico.

En algunas realizaciones, se administra una o más veces a un paciente una sola dosis de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria para impedir, prevenir, gestionar, tratar y/o mejorar un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis).

En realizaciones particulares, se administra a un sujeto, en ciclos, un anticuerpo anti KIT o una composición farmacéutica del mismo según los métodos para tratar un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis) presentado en la presente memoria, administrándose el anticuerpo anti KIT o la composición farmacéutica durante un periodo de tiempo, seguido por un periodo de reposo (es decir, el anticuerpo anti KIT o la composición farmacéutica no es administrado durante un periodo de tiempo).

En la presente memoria también se presentan terapias de combinación para el tratamiento de un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis) que implican la administración de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum10, Hum17, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión a KIT del mismo), o un conjugado de anticuerpos del mismo en combinación con una o más terapias adicionales (por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un inhibidor de la tirosina quinasa, inhibidores de PGP, inhibidores de HSP-90, inhibidores de proteosomas o un inhibidor de la histona desacetilasa) a un sujeto necesitado de ello. En una realización específica, en la presente memoria se presentan terapias de combinación para el tratamiento de un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis) que implican la administración de una cantidad (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad subóptima) de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria en combinación con una cantidad (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad subóptima) de otra terapia (por ejemplo, agente quimioterapéutico, inhibidor de la tirosina quinasa o un inhibidor de la histona desacetilasa) a un sujeto necesitado de ello.

En las terapias de combinación, uno o más anticuerpos anti KIT proporcionados en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum10, Hum17, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, un fragmento de unión a KIT de los mismos), o un conjugado de anticuerpos de los mismos pueden ser administrados antes de la administración, concurrentemente con ella o subsiguientemente a ella, de una o más terapias adicionales (por ejemplo, agentes, cirugía o radiación) para su uso en el tratamiento, la gestión y/o la mejoría de un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis). El uso de la expresión “en combinación” no restringe el orden en el que uno o más anticuerpos anti KIT y una o más terapias adicionales son administrados a un sujeto. En realizaciones específicas, las terapias pueden ser administradas en serie o secuencialmente.

En realizaciones específicas, uno o más anticuerpos anti KIT proporcionados en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum10, Hum17, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, un fragmento de unión a KIT de los mismos), o un conjugado de anticuerpos de los mismos pueden ser administrados antes de la administración, concurrentemente con ella o subsiguientemente a ella, of una o más terapias adicionales, tales como agentes —por ejemplo, inhibidores de la tirosina quinasa (por ejemplo, mesilato de imatinib (Gleevec®) o sunitinib (SUTENT), o inhibidores de la histona desacetilasa (por ejemplo, vorinostat o ácido suberoilanidido hidroxámico (SAHA))— para tratar, gestionar, y/o mejorar un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, por ejemplo, GIST, melanoma o cáncer de pulmón).

En otra realización específica, en la presente memoria se presentan terapias de combinación para el tratamiento de un trastorno o enfermedad asociado con KIT (por ejemplo, cáncer, afección inflamatoria, fibrosis) que implican la administración de una cantidad de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum10, Hum17, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión a KIT del mismo), o un conjugado de anticuerpos del mismo en combinación con una cantidad de otra terapia (por ejemplo, agente quimioterapéutico, inhibidor de la tirosina quinasa o un inhibidor de la histona desacetilasa) a un sujeto

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necesitado de ello. En una realización específica, las terapias de combinación dan lugar a un efecto sinérgico. En ciertas realizaciones, las terapias de combinación dan lugar a un efecto aditivo.

En una realización específica, en la presente memoria se presentan terapias de combinación para el tratamiento del cáncer que implican la administración de una cantidad de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria en combinación con una cantidad de otra terapia (por ejemplo, cirugía, radiación, trasplante de células madre o quimioterapia) a un sujeto necesitado de ello. En una realización específica, las terapias de combinación dan lugar a un efecto sinérgico. En otra realización específica, las terapias de combinación dan lugar a un efecto aditivo.

En una realización específica, en la presente memoria se presentan terapias de combinación para el tratamiento de una afección inflamatoria que implican la administración de una cantidad de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria en combinación con una cantidad de otra terapia (por ejemplo, terapia antiinflamatoria; por ejemplo, terapia con esteroides) a un sujeto necesitado de ello. En una realización específica, las terapias de combinación dan lugar a un efecto sinérgico. En otra realización específica, las terapias de combinación dan lugar a un efecto aditivo.

Ejemplos no limitantes de otra terapia para su uso en combinación con anticuerpos descritos en la presente memoria incluyen: otro anticuerpo anti KIT que se une inmunoespecíficamente a un epítopo diferente de KIT, uno o más anticuerpos adicionales (por ejemplo, el anticuerpo anti-HER2, el anticuerpo anti-EGFR, el anticuerpo anti-VEGF), terapia antiinflamatoria, quimioterapia (por ejemplo, bloqueador de la despolimerización de microtúbulos, antimetabolito, inhibidor de la topisomerasa, y reticulante o agente lesional de ADN), radiación, cirugía, inhibidores de PGP (por ejemplo, ciclosporina A, Verapamil), inhibidores de HSP-90 (por ejemplo, 17-AAG, STA-9090), inhibidores de proteosomas (por ejemplo, Bortezomib) e inhibidores de la tirosina quinasa (por ejemplo, mesilato de imatinib (GLEEVEC®), sunitinib (SUTENT® o SU11248), gefitinib (IRESSA™), erlotinib (TARCEVA®), sorafenib (NEXAVAR®), pazopanib (VOTRIENT™), axitinib, bosutinib, cediranib (RECENTIN®), SPRYCEL® (dasatinib), lapatinib (TyKeRB®), lestaurtinib, neratinib, nilotinib (TASIGNA®), semaxanib, toceranib (PALLADIA™), vandetanib (ZACTIMA™) y vatalanib). En una realización específica, otra terapia para su uso en combinación con anticuerpos descritos en la presente memoria es mesilato de imatinib.

Otros ejemplos no limitantes de otra terapia para su uso en combinación con anticuerpos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1- Hum20, tal como Hum10, Hum17, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, un fragmento de unión a KIT de los mismos), o un conjugado de anticuerpos de los mismos incluyen un inhibidor de la histona deacetilasa, tal como vorinostat o ácido suberoilanidido hidroxámico (SAHA) o un compuesto que tenga la fórmula química (I), (II) o (III) según se define a continuación. En una realización específica, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en un método para tratar cáncer (por ejemplo, GIST o cáncer de pulmón) que comprende (i) administrar un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum10, Hum17, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión a KIT del mismo), o un conjugado de anticuerpos del mismo; y (ii) un inhibidor de la histona deacetilasa, por ejemplo, vorinostat o ácido suberoilanidido hidroxámico (SAHA) o un compuesto que tenga la fórmula química (I), (II) o (III) según se define a continuación.

En una realización, en la presente memoria se proporcionan para su uso en los métodos descritos en la presente memoria en combinación con anticuerpos anti KIT compuestos de Fórmula (I)

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o una sal, un hidrato o un solvato farmacéuticamente aceptables de la misma, en la que R1 es hidroxilamino;

cada uno de R2 y R3 son, independientemente, iguales o diferentes entre sí, sustituidos o insustituidos, ramificados o no ramificados, y son hidrógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, cicloalquilo, arilo, alquiloxi, ariloxi, arilalquiloxi o piridina; o R2 and R3 están unidos entre sí formando una piperidina; y n es un número entero de 5 a 7.

En una realización, R2 es un átomo de hidrógeno y R3 es fenilo sustituido o insustituido. En cierta realización, R3 es fenilo sustituido con metilo, ciano, nitro, trifluorometilo, amino, aminocarbonilo, metilciano, cloro, fluoro, bromo, iodo, 2,3-difluoro, 2,4-difluoro, 2,5-difluoro, 3,4-difluoro, 3,5-difluoro, 2,6-difluoro, 1,2,3-trifluoro, 2,3,6-trifluoro, 2,4,6-

trifluoro, 3,4,5-trifluoro, 2,3,5,6-tetrafluoro, 2,3,4,5,6-pentafluoro, azido, hexilo, t-butilo, fenilo, carboxilo, hidroxilo, metoxi, feniloxi, benciloxi, fenilaminooxi, fenilaminocarbonilo, metoxicarbonilo, metilaminocarbonilo, dimetilamino, dimetilaminocarbonilo o hidroxilaminocarbonilo. En otra realización, R3 es fenilo insustituido. En una realización adicional, n es 6.

5 En una realización, en la presente memoria se proporcionan para su uso en los métodos descritos en la presente memoria en combinación con anticuerpos anti KIT compuestos de Fórmula (II)

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o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables de la misma, en la que n es un número entero entre 5 y 8. En una realización, n es 6.

En una realización, en la presente memoria se proporciona para su uso en los métodos descritos en la presente 10 memoria en combinación con anticuerpos anti KIT un compuesto de Fórmula (III) (SAHA)

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o una sal, un hidrato o un solvato farmacéuticamente aceptables de la misma.

Los compuestos de Fórmulas I-III pueden ser sintetizados según los métodos descritos en la patente estadounidense expedida en reemplazo n° RE38.506 y en la patente estadounidense n° 6.087.367.

En una realización, en la presente memoria se proporciona para su uso en los métodos descritos en la presente 15 memoria en combinación con anticuerpos anti KIT un polimorfo de Forma I de SAHA caracterizado por un patrón de difracción de rayos X sustancialmente similar al definido en la Figura 13A de la patente estadounidense n° 7.456.219. En una realización el polimorfo de la Forma I de SAHA se caracteriza por un patrón de difracción de rayos X que incluye picos característicos a aproximadamente 9,0, 9,4, 17,5, 19,4, 20,0, 24,0, 24,4, 24,8, 25,0, 28,0 y 43,3 grados 20, medidos con un difractómetro automatizado de polvo Siemens D500 (intervalo: 4-40 grados 20; 20 fuente: Cu; A=1,54 Angstrom, 50kV, 40mA).

En cierta realización, el polimorfo de la Forma I de SAHA se caracteriza por un termograma de calorimetría de barrido diferencial (DSC) que tiene un único valor máximo a aproximadamente 164,4±2,0°C, medido por un instrumento Perkins Elmer DSC 6 a una tasa de calentamiento de 10°C/min desde 50°C hasta al menos 30°C por encima de la temperatura observada de fusión.

25 El polimorfo de la Forma I de SAHA puede ser sintetizado según los métodos descritos en la patente estadounidense n° 7.456.219.

En una realización, en la presente memoria se proporciona una composición cristalina que comprende lisina y SAHA caracterizada por un patrón de difracción de rayos X sustancialmente similar al definido en la Figura 1 de la publicación de solicitud de patente internacional n° WO2008/042146. En otra realización, la composición cristalina se 30 caracteriza por un patrón de difracción de rayos X que incluye picos característicos a aproximadamente 6,8, 20,1 y 23,2 grados 20, medidos con un difractómetro de polvo de rayos X PANanalytical X'Pert Pro (intervalo: 2-40 grados 20; fuente: Cu Ka1 y Ka2). En otra realización, la composición cristalina se caracteriza por un patrón de difracción de rayos X que incluye picos característicos a aproximadamente 6,8, 12,6, 18,7, 20,1 23,2 y 24,0 grados 20, medidos con un difractómetro de polvo de rayos X PANanalytical X'Pert Pro (intervalo: 2-40 grados 20; fuente: Cu Ka1 y Ka2). 35 En otra realización, la composición cristalina se caracteriza por un patrón de difracción de rayos X que incluye picos característicos a aproximadamente 6,8, 12,0, 12,6, 16,4, 18,7, 20,1 23,2, 24,0, 29,3 grados 20, medidos con un difractómetro de polvo de rayos X PANanalytical X'Pert Pro (intervalo: 2-40 grados 20; fuente: Cu Ka1 y Ka2).

En cierta realización, la composición cristalina que comprende lisina y SAHA se caracteriza por un termograma de calorimetría de barrido diferencial (DSC) en el que la endoterma de la composición cristalina presenta una

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temperatura inicial extrapolada de aproximadamente 182°C, medida por un calorímetro de barrido diferencial TA Instruments Q1000 a una tasa de calentamiento de 10°C/min desde la temperatura ambiente hasta 300°C.

La composición cristalina que comprende lisina y SAHA puede ser sintetizada según los métodos descritos en la publicación de solicitud de patente internacional n° WO2008/042146.

En ciertas realizaciones, las terapias de combinación descritas en la presente memoria dan lugar a sinergia o a un efecto sinérgico. En una realización específica, un efecto sinérgico de una terapia de combinación permite el uso de menores dosis (por ejemplo, dosis subóptimas) de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria y/o de una terapia adicional y/o una administración menos frecuente de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria o de una terapia adicional a un sujeto. En ciertas realizaciones, la capacidad de utilizar menores dosis de un anticuerpo anti KIT y/o de una terapia adicional y/o de administrar un anticuerpo anti KIT o dicha terapia adicional menos frecuentemente reduce la toxicidad asociada con la administración de un anticuerpo anti KIT o de dicha terapia adicional, respectivamente, a un sujeto sin reducir la eficacia de un anticuerpo anti KIT o de dicha terapia adicional, respectivamente, en el tratamiento de un trastorno o enfermedad asociado con KIT. En algunas realizaciones, un efecto sinérgico da como resultado una mayor eficacia de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria y/o de dichas terapias adicionales en el tratamiento de un trastorno o enfermedad asociado con KIT. En algunas realizaciones, un efecto sinérgico de una combinación de un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria y de una o más terapias adicionales evita o reduce efectos secundarios adversos o no deseados asociados con el uso de cualquier terapia aislada.

En la presente memoria se proporcionan métodos para inhibir la actividad del KIT en una célula que expresa el KIT que comprenden poner la célula en contacto con una cantidad eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1- Hum20, tal como Hum10, Hum17, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, un fragmento de unión a KIT de los mismos), o un conjugado de anticuerpos de los mismos. En la presente memoria también se proporcionan métodos para inducir o potenciar la apoptosis en una célula que expresa el KIT que comprende poner la célula en contacto con una cantidad eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria. En la presente memoria también se proporcionan métodos para inducir o potenciar la diferenciación celular en una célula que expresa el KIT que comprenden poner la célula en contacto con una cantidad eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria.

La actividad del KIT y, por ejemplo, el efecto de un anticuerpo en la actividad del KIT pueden ser evaluados de forma rutinaria usando, por ejemplo, ensayos a base de células, tales como los descritos en la presente memoria.

Ejemplos no limitantes de actividad del KIT que puede ser inhibida por los métodos proporcionados en la presente memoria pueden incluir cualquier actividad de KIT que se conozca o esté descrita en la técnica; por ejemplo, la dimerización del receptor KIT, la fosforilación del receptor KIT (fosforilación de la tirosina), la señalización aguas abajo del receptor KIT (por ejemplo, señalización Stat, AKT, MAPK o Ras), la regulación transcripcional inducida por ligandos de KIT (por ejemplo, SCF) (por ejemplo, la activación transcripcional de c-Myc inducida por SCF), la inducción o potenciación de la proliferación celular o la supervivencia celular.

En ciertas realizaciones, un método para inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la actividad del KIT en una célula que expresa el KIT comprende poner la célula en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum10, Hum17, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, un fragmento de unión a KIT de los mismos), o un conjugado de anticuerpos de los mismos, suficiente para inhibir o antagonizar la actividad del KIT en al menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria y/o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, ELISA). En ciertas realizaciones, un método para inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la actividad del KIT en una célula que expresa el KIT

comprende poner la célula en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria

(por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum10, Hum17, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, un fragmento de unión a KIT de los mismos), o un conjugado de anticuerpos de los mismos, suficiente para inhibir o antagonizar la actividad del KIT en al menos aproximadamente 25%, 35%, 45%, 50%, 55% o 65%, evaluada por métodos descritos en la presente memoria y/o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, ELISA). Ejemplos no limitantes de la actividad del KIT pueden incluir la fosforilación del receptor KIT, la señalización del receptor KIT, la proliferación celular arbitrada por ligandos KIT (por ejemplo, SCF), la supervivencia celular arbitrada por ligandos KIT (por ejemplo, SCF) y la activación transcripcional de un gen diana de KIT (por ejemplo, c-Myc).

En una realización particular, un método para inhibir la actividad del KIT en una célula que expresa el KIT

(por ejemplo, un anticuerpo anti KIT humanizado); por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, tal como Hum10, Hum17, Hum8 o Hum4, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, un fragmento de unión a KIT de los mismos), o un conjugado de anticuerpos de los mismos, suficiente para inhibir (por

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ejemplo, inhibir parcialmente) o antagonizar aguas abajo la señalización de KIT; por ejemplo, la señalización de un miembro de las quinasas de la familia Src, las quinasas PI3 o Ras-MAPK.

En otra realización particular, un método para inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) una o más actividades de KIT en una célula que expresa el KIT, comprende poner la célula en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inhibir o antagonizar aguas abajo la señalización de KIT, tal como la fosforilación de MAPK, la fosforilación de AKT, o la fosforilación de Stat1, Stat3, o Stat5.

En ciertas realizaciones, un método para inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la actividad del KIT en una célula que expresa el KIT comprende poner la célula en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inhibir o reducir la fosforilación de AKT (por ejemplo, la fosforilación de AKT inducida por ligandos de KIT (por ejemplo, SCF)) en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica, por ejemplo, inmunoelectrotransferencia o ensayo ELISA, según se describe en la Sección 6, o el ensayo de inmunotransferencia. En ciertas realizaciones, un método para inhibir por ejemplo, inhibir parcialmente) la actividad del KIT en una célula que expresa el KIT comprende poner la célula en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inhibir o reducir la fosforilación de AKT (por ejemplo, la fosforilación de AKT inducida por ligandos de KIT (por ejemplo, SCF)) en al menos aproximadamente 25%, 35%, 45%, 55% o 65%, evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica, por ejemplo, inmunoelectrotransferencia o ensayo ELISA, según se describe en la Sección 6, o el ensayo de inmunotransferencia.

En ciertos aspectos, un método para inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la actividad del KIT en una célula (por ejemplo, una célula cancerosa) que expresa KIT comprende poner la célula en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inhibir la proliferación de la célula. Los ensayos de proliferación celular son descritos en la técnica y pueden ser llevados a cabo fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, la proliferación celular puede ser evaluada midiendo la incorporación de la bromodesoxiuridina (BrdU) (véanse, por ejemplo, Hoshino et al., 1986, Int. J. Cáncer 38, 369; Campana et al., 1988, J. Immunol. Meth. 107:79) o la incorporación de (3H) timidina (véanse, por ejemplo, Blechman et al., Cell, 1995, 80:103-113; Chen, J., 1996, Oncogene 13:1395-403; Jeoung, J., 1995, J. Biol. Chem. 270:18367 73), por recuento celular directo a intervalos temporales diversos (por ejemplo, intervalos de 12 horas o de 24 horas), o detectando cambios en la transcripción, la traducción o la actividad celular de genes conocidos tales como protooncogenes (por ejemplo, fos, myc) o marcadores del ciclo celular (Rb, cdc2, ciclina A, D1, D2, D3, E, etc.). Los niveles de tal proteína y del ARNm y de actividad pueden ser determinados por cualquier método bien conocido en la técnica. Por ejemplo, la proteína puede ser cuantificada mediante métodos inmunodiagnósticos conocidos tales como ELISA, inmunoelectrotransferencia o inmunoprecipitación usando anticuerpos, incluyendo anticuerpos disponibles comercialmente. El ARNm puede ser cuantificado usando métodos que son bien conocidos y rutinarios en la técnica; por ejemplo, usando análisis de tipo Northern, protección de la RNasa, o reacción en cadena de la polimerasa en conexión con la transcripción inversa.

En realizaciones específicas, un método para inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la actividad del KIT en células (por ejemplo, células cancerosas) que expresan KIT comprende poner las células en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inhibir la proliferación celular en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo de incorporación de la BrdU). En realizaciones específicas, un método para inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la actividad del KIT en células que expresan KIT comprende poner las células en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inhibir la proliferación celular en al menos aproximadamente 25%, 35%, 45%, 55% o 65%, evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo de incorporación de la BrdU). En realizaciones específicas, un método para una inhibición o una antagonización de la actividad del KIT en células que expresan KIT comprende poner las células en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inhibir la proliferación celular en al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo de incorporación de la BrdU).

En ciertos aspectos, un método proporcionado en la presente memoria para inhibir la actividad del KIT en una célula (por ejemplo, una célula cancerosa) que expresa KIT comprende poner la célula en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para reducir o inhibir la supervivencia de la célula. En la técnica se describen ensayos de supervivencia celular y pueden ser llevados a cabo fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, la viabilidad celular puede ser evaluada usando tinción de azul de tripano u otros marcadores de muerte o viabilidad celular conocidos en la técnica. En una realización específica, se mide el nivel de ATP celular para determinar la viabilidad celular. En realizaciones específicas, la viabilidad celular es medida en periodos de tres días y de siete días usando un ensayo estándar en la técnica, tal como el CellTiter-Glo Assay Kit (Promega), que mide los niveles de ATP intracelular. Una reducción en el ATP celular es indicativa de un efecto

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citotóxico. En otra realización específica, la viabilidad celular puede ser medida en el ensayo de absorción de rojo neutro. En otras realizaciones, la observación visual en busca de cambios morfológicos puede incluir agrandamiento, granularidad, células con bordes irregulares, aspecto lechoso, esfericidad, desprendimiento de la superficie del pocillo u otros cambios. Estos cambios reciben la designación de T (100% tóxico), PVH (parcialmente tóxico-muy pesado-80%), PH (parcialmente tóxico-pesado-60%), P (parcialmente tóxico-40%), Ps (parcialmente tóxico-ligero- 20%), o 0 (sin toxicidad-0%), conforme al grado de citotoxicidad visto. Se determina una concentración inhibitoria (citotóxica) de células del 50% (CI50) mediante análisis de regresión de estos datos.

En realizaciones específicas, un método proporcionado en la presente memoria para inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la actividad del KIT en células que expresan KIT comprende poner las células en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para reducir o inhibir la supervivencia de las células en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo de exclusión de azul de tripano). En realizaciones

específicas, un método proporcionado en la presente memoria para inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la

actividad del KIT en células que expresan KIT comprende poner las células en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para reducir o inhibir la supervivencia de las células en al menos aproximadamente 25%, 35%, 45%, 55% o 65%, evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo de exclusión de azul de tripano). En realizaciones

específicas, un método proporcionado en la presente memoria para inhibir la actividad del KIT en células que

expresan KIT comprende poner las células en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para reducir o inhibir la supervivencia de las células en al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, el ensayo con azul de tripano).

En una realización específica, un método proporcionado en la presente memoria para inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la actividad del KIT en células que expresan KIT comprende poner las células en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inducir apoptosis (es decir, la muerte celular programada). En la técnica se describen métodos para detectar la apoptosis y pueden ser llevados a cabo fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, puede usarse citometría de flujo para detectar la caspasa 3 activada, una enzima que media en la apoptosis, en células sometidas a apoptosis, o puede usarse inmunoelectrotransferencia para detectar la escisión de la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) (véase, por ejemplo, Smolich et al., Blood, 2001, 97:1413-1421). La escisión de PARP es un indicador de la apoptosis. En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un método para inhibir o antagonizar la actividad del KIT en células que expresan KIT que comprende poner las células en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inducir o potenciar la apoptosis en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, citometría de flujo para detectar caspasas 3 activadas). En realizaciones específicas, un método proporcionado en la presente memoria para inhibir o antagonizar la actividad del KIT en células que expresan KIT comprende poner las células en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inducir o potenciar la apoptosis en al menos aproximadamente 25%, 35%, 45%, 55% o 65%, evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, citometría de flujo para detectar caspasas 3 activadas). En realizaciones específicas de anticuerpos, un método proporcionado en la presente memoria para inhibir la actividad del KIT en células que expresan KIT comprende poner las células en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inducir o potenciar la apoptosis en al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, citometría de flujo para detectar la caspasa 3 activada).

En una realización específica, un método proporcionado en la presente memoria para inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la actividad del KIT en una célula que expresa el KIT comprende poner las células en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inducir la diferenciación. En la técnica se describen métodos para detectar la diferenciación y pueden ser llevados a cabo fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, puede usarse citometría de flujo para detectar la expresión de uno o más marcadores de diferenciación, o la falta de expresión de uno o más marcadores indiferenciados, en una célula puesta en contacto con un anticuerpo descrito en la presente memoria. De modo similar, también puede usarse la inmunoelectrotransferencia para detectar marcadores de diferenciación. Se han descrito marcadores de diferenciación y marcadores indiferenciados adecuados y son conocidos para un experto en la técnica.

En realizaciones específicas, un método proporcionado en la presente memoria para inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la actividad del KIT en células que expresan KIT comprende poner las células en contacto con una

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cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inducir la diferenciación en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, citometría de flujo). En realizaciones específicas, un método proporcionado en la presente memoria para inhibir (por ejemplo, inhibir parcialmente) la actividad del KIT en células que expresan KIT comprende poner las células en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inducir la diferenciación en al menos aproximadamente 25%, 35%, 45%, 55% o 65%, evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, citometría de flujo). En realizaciones específicas, un método proporcionado en la presente memoria para inhibir la actividad del KIT en células que expresan KIT comprende poner las células en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito en la presente memoria suficiente para inducir la diferenciación en al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces evaluada por métodos descritos en la presente memoria o conocidos para un experto en la técnica (por ejemplo, citometría de flujo).

Ejemplos no limitantes de células que pueden ser diferenciadas por los métodos descritos en la presente memoria incluyen células madre (por ejemplo, células madre embrionarias, células madre hematopoyéticas) y células progenitoras marcadores ejemplares de células madre hematopoyéticas incluyen CD38, CD34, CD59, CD133, Sca-1 y ABCG2. Ejemplos no limitantes de marcadores de células madre neurales incluyen nestina, PSA-NCAM, p75 neurotrofina R y vimentina. Otros ejemplos no limitantes de marcadores de células madre incluyen Oct4, Sox2, Klf4, LIN28, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, Notch y Wnt.

5.7 Métodos diagnósticos

Se pueden usar anticuerpos marcados o detectables de otra manera que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno de KIT (por ejemplo, a la región D4 de KIT; por ejemplo, del KIT humano) con fines diagnósticos para detectar, diagnosticar o monitorizar una enfermedad asociada con KIT.

En la presente memoria se proporcionan métodos para detectar la expresión de KIT en muestras obtenidas de pacientes con un trastorno o enfermedad asociado con KIT. En una realización particular, un método para detectar la expresión de KIT en una muestra obtenida de un paciente comprende poner la muestra en contacto con un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria y detectar el nivel de expresión de KIT en las muestras, por ejemplo, correlacionando la unión de anticuerpo anti KIT al KIT con niveles de expresión de KIT. Los métodos para la detección son conocidos para un experto en la técnica.

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporcionan métodos para diagnosticar a un paciente con un trastorno o enfermedad asociado con KIT. En cierto aspecto, un método para diagnosticar a un sujeto con un trastorno o enfermedad asociado con KIT comprende poner en contacto una muestra, obtenida del sujeto, con un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) y detectar el nivel de expresión de KIT en la muestra. En ciertas realizaciones, un método para diagnosticar a un paciente con un trastorno o enfermedad asociado con KIT es un método in vitro. En realizaciones particulares, un método para diagnosticar a un paciente con un trastorno o enfermedad asociado con KIT es un método ex vivo.

En ciertos aspectos, en la presente memoria se proporcionan métodos para la detección de una enfermedad asociada con KIT que comprende: (a) someter a ensayo la expresión de un antígeno de KIT en células o en una muestra tisular de un sujeto usando uno o más anticuerpos descritos en la presente memoria; y (b) comparar el nivel del antígeno de KIT con un nivel de control —por ejemplo, niveles en muestras tisulares normales (por ejemplo, procedentes de un paciente que no tiene una enfermedad asociada con KIT, o del mismo paciente antes de la aparición de la enfermedad)—, por lo que un aumento en el nivel objeto de ensayo del antígeno de KIT con respecto al nivel de control del antígeno de KIT es indicativo de una enfermedad asociada con KIT.

Los métodos para la detección son conocidos para un experto en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo anti KIT puede ser conjugado con una molécula detectable (por ejemplo, según se describe en la sección 5.1.1), y la molécula detectable puede ser visualizada usando técnicas estándar (por ejemplo, microscopía). Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden ser usados para someter a ensayo los niveles de antígeno de KIT en una muestra biológica usando métodos inmunohistológicos clásicos descritos en la presente memoria o conocidos para los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; y Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión génica en proteínas incluyen inmunoensayos, tales como ELISA y el radioinmunoensayo (RIA). En la técnica se conocen marcadores adecuados de ensayo de anticuerpos e incluyen marcadores enzimáticos, tales como la glucosa oxidasa; radioisótopos, tales como yodo (125I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (121In) y tecnecio (99Tc); marcadores luminiscentes, tales como luminol; y marcadores fluorescentes, tales como la fluoresceína, la rodamina y la biotina. En realizaciones específicas, los métodos diagnósticos descritos en la presente memoria implican el uso de anticuerpos desnudos o no marcados no conjugados con un marcador detectable, y los anticuerpos desnudos o no marcados son detectados indirectamente; por ejemplo, usando un anticuerpo secundario, que puede estar marcado.

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En ciertas realizaciones, la expresión elevada de KIT en una muestra con respecto a una muestra normal de control (por ejemplo, una muestra obtenida de un paciente sano que no padece un trastorno o enfermedad asociado con KIT) indica que el paciente padece un trastorno o enfermedad asociado con KIT.

Un método in vitro para diagnosticar a un paciente con un trastorno o enfermedad asociado con KIT, tal como cáncer, en una muestra obtenida de un paciente, comprende poner la muestra en contacto con un anticuerpo anti KIT descrito en la presente memoria y detectar el nivel de expresión de KIT en la muestra. En ciertas realizaciones, la expresión elevada de KIT en una muestra con respecto a una muestra normal de control (por ejemplo, una muestra obtenida de un paciente sano que no padece un trastorno o enfermedad asociado con KIT) indica que el paciente padece un trastorno o enfermedad asociado con KIT.

En ciertas realizaciones, una muestra puede ser una muestra tumoral derivada del tumor de un paciente o que comprende células tumorales del mismo. En la presente memoria, ejemplos de muestras tumorales incluyen, sin limitación, biopsias de tumores, células tumorales circulantes, proteínas plasmáticas circulantes, líquido ascítico, cultivos de células o líneas celulares primarias derivadas de tumores o que presentan propiedades de tipo tumoral, así como muestras tumorales conservadas, tales como muestras tumorales fijadas en formol incrustadas en parafina o muestras tumorales congeladas. En ciertas realizaciones, una muestra es una muestra tumoral fijada que ha sido conservada histológicamente usando un fijador. En algunas realizaciones, una muestra es una muestra tumoral fijada con formol que ha sido conservada usando formaldehído como fijador. En ciertas realizaciones, una muestra es una muestra tumoral incrustada que está rodeada por un medio firme y generalmente duro, tal como parafina, cera, celoidina o una resina. La incrustación hace posible el corte de secciones delgadas para un análisis microscópico o para la generación de micromatrices tisulares (TMA). En realizaciones particulares, una muestra es una muestra tumoral incrustada en parafina que está rodeada por una mezcla purificada de hidrocarburos sólidos derivados del petróleo. En ciertas realizaciones, una muestra es una muestra tumoral congelada que está o ha sido congelada. En una realización específica, se secciona una muestra; por ejemplo, una muestra incrustada en parafina o una muestra congelada.

En ciertos aspectos, una muestra cancerosa o biológica que presenta la expresión, la amplificación o la activación del KIT es aquella que, en una prueba diagnóstica expresa (incluyendo sobreexpresa) un receptor KIT, tiene un gen KIT amplificado, y/o demuestra de otro modo la activación o la fosforilación de un receptor KIT.

En la presente memoria también se proporciona la detección y el diagnóstico de una enfermedad asociada con KIT en un ser humano. En una realización, el diagnóstico comprende: a) administrar (por ejemplo, parenteral, subcutánea o intraperitonealmente) a un sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo marcado descrito en la presente memoria; b) esperar un intervalo de tiempo tras la administración para permitir que el anticuerpo marcado se concentre preferentemente en sitios en el sujeto en el que se expresa el antígeno de KIT (y a que la molécula marcada no unida se aclare hasta el nivel del segundo plano); c) determinar el nivel del segundo plano; y d) detectar el anticuerpo marcado en el sujeto, de modo que la detección del anticuerpo marcado por encima del nivel del segundo plano indique que el sujeto tiene una enfermedad arbitrada por KIT. El nivel del segundo plano puede ser determinado por diversos métodos, incluyendo la comparación de la cantidad de molécula marcada detectada con un valor estándar determinado previamente para un sistema particular.

En la técnica, se entenderá que el tamaño del sujeto y del sistema de formación de imágenes usado determinará la cantidad del resto de formación de imágenes necesario para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de un resto radioisotópico, para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada oscilará normalmente entre aproximadamente 5 y 20 milicurios de 99Tc. El anticuerpo marcado se acumulará, preferentemente, en la ubicación de las células que contienen la proteína específica. La formación de imágenes de tumores in vivo es descrita en S. W. Burchiel et al., “Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments” (capítulo 13 de Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cáncer, S. W. Burchiel y B. A. Rhodes, ed., Masson Publishing Inc. (1982)).

Dependiendo de varias variables, incluyendo el tipo de marcador usado y del modo de administración, el intervalo de tiempo que sigue a la administración para permitir que el anticuerpo marcado se concentre preferentemente en sitios en el sujeto y para que el anticuerpo marcado no unido se aclare hasta el nivel del segundo plano es de 6 a 48 horas o de 6 a 24 horas o de 6 a 12 horas. En otra realización, el intervalo de tiempo que sigue a la administración es de 5 a 20 días o de 5 a 10 días.

En una realización, la monitorización de una enfermedad arbitrada por KIT se lleva a cabo repitiendo el método para diagnosticar la enfermedad arbitrada por KIT, por ejemplo, un mes después del diagnóstico inicial, seis meses después del diagnóstico inicial, un año después del diagnóstico inicial, etc.

La presencia de la molécula marcada puede ser detectada en el sujeto usando métodos conocidos en la técnica para el escaneo in vivo. Estos métodos dependen del tipo de marcador usado. Los expertos podrán determinar el método apropiado para detectar un marcador particular. Los métodos y los dispositivos que pueden ser usados en los métodos diagnósticos de la invención incluyen, sin limitación, la tomografía computarizada (TC), un escáner de todo el cuerpo, tal como la tomografía de emisión positrónica (PET), la formación de imágenes por resonancia magnética (IRM) y la sonografía.

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En una realización específica, la molécula es marcada con un radioisótopo y es detectada en el paciente usando un instrumento quirúrgico sensible a la radiación (Thurston et al., patente estadounidense n° 5.441.050). En otra realización, la molécula es marcada con un compuesto fluorescente y es detectada en el paciente usando un instrumento de escaneo sensible a la fluorescencia. En otra realización, la molécula es marcada con un metal emisor de positrones y es detectada en el paciente usando tomografía de emisión positrónica. En otra realización adicional, la molécula es marcada con un marcador paramagnético y es detectada en un paciente usando la formación de imágenes por resonancia magnética (IRM).

6. Ejemplos

Los ejemplos de esta sección (es decir, la sección 6) son ofrecidos a título de ilustración, y no a título de limitación.

6.1 Ejemplo 1: Generación de anticuerpos anti KIT

Los anticuerpos anti KIT fueron diseñados usando tecnología Composite Human Antibody™ (Antitope Ltd., Cambridge, Reino Unido) y la secuencia de aminoácidos del anticuerpo murino 37M (publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2012/0189633 A1) que se une inmunoespecíficamente a una región D4 de KIT humano, para producir anticuerpos anti KIT con secuencias humanas de aminoácidos, uniéndose los anticuerpos a una región D4 de KIT humano. Cinco secuencias de la región variable de cadena pesada (H1, H2, H3, H4 y H5) y cuatro secuencias de la región variable de cadena ligera (L1, L2, L3 y L4) fueron seleccionadas para ser usadas para la síntesis génica, la expresión en células de mamífero y el ensayo en busca de la unión directa a dominios de KIT recombinante, así como de la actividad en el factor de bloqueo de la fosforilación inducida por células madre (SCF). En las Figuras 3A-3I se muestran las secuencias de aminoácidos para H1-H5, L1-L4 y las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de la región variable H (de cadena pesada) y L (de cadena ligera) fueron clonadas directamente en vectores de expresión para las cadenas VH humanas y las cadenas Vk humanas de la IgG1. Todos los constructos fueron confirmados por secuenciación. Los vectores que codifican las cadenas VH (H1-H5) y Vk (L1-L4) de IgG1 fueron transfectados a células CHO (por ejemplo, células CHOdhfr-) en diferentes combinaciones para producir veinte anticuerpos (véase la Tabla 4, anticuerpos Hum1-Hum20). Los vectores que codifican el anticuerpo quimérico 37C, un anticuerpo quimérico con dominios constantes humanos y dominios variables murinos 37M (publicación de solicitud de patente estadounidense n° US 2012/0189633 A1) también fueron transfectados a células CHO. Las células transfectadas de forma transitoria con ADN no linealizado fueron incubadas durante cuatro días antes de recoger los sobrenadantes que fueron usados directamente en ensayos o para la purificación. Las transfecciones estables para establecer líneas celulares que expresaran los anticuerpos se llevaron a cabo usando ADN linealizado y fueron seleccionadas subsiguientemente por fármacos. Los sobrenadantes de colonias resistentes a fármacos para cada constructo fueron sometidos a ensayo para una concentración de IgG usando un ELISA de IgG1, y se seleccionaron las líneas con mejor expresión en función de una concentración de IgG en el sobrenadante por encima del segundo plano (habitualmente >0,1 pg/ml), y se expandieron en presencia de una selección de fármacos a través de placas de 24 pocillos y 6 pocillos, matraces de cultivos tisulares T75 y T175, con selección de la expresión de IgG en cada etapa. Las concentraciones de 0,1-1 pg/ml son típicas para líneas celulares CHOdhfr- no optimizadas. La expresión de anticuerpos fue confirmada mediante SDS-PAGE tincionada con azul de Coomassie.

En estas células particulares, la mayoría de los anticuerpos fue expresada con una concentración en el intervalo de 0,1 -1,0 pg/ml y, en particular, el anticuerpo Hum4 fue expresado a una concentración de 1,2 pg/ml.

6.2 Ejemplo 2: Afinidad de unión a los dominios D4/D5 de tipo Ig del KIT humano

La afinidad de unión de los anticuerpos anti KIT a los dominios D4/D5 de tipo Ig del KIT del antígeno diana fue evaluada para un ELISA de unión directa. Una serie de disoluciones (tres veces) del anticuerpo quimérico 37C y de anticuerpos Hum1-Hum20 de aproximadamente 1*10'8 M a 4,7*10'13 M fue incubada durante 1 hora a temperatura ambiente en una placa de microtitulación de fondo plano recubierta de antemano con dominios D4/D5 de tipo Ig de c-Kit recombinante a 50 ng/pocillo (véase la Figura 2) diluidas en tampón borato y prebloqueadas durante 1 hora con BSA al 1%. El anticuerpo unido fue detectado con Ig-HRP antihumana seguido por una detección usando un sustrato de TMB. Los resultados son presentados a continuación en la Tabla 7.

Tabla 7: Catalogación de la unión de anticuerpos anti KIT.

Anticuerpo: Ensayo n° 1 de actividad de unión relativa (sob) Ensayo n° 2 de actividad de unión relativa (sob) Ensayo n° 3 de actividad de unión relativa (purificado) Ensayo n° 4 de actividad de unión relativa (purificado)

Hum1: 0,64

Hum2: 0,79

Hum3: 0,88

Hum4: 0,91 1,07 0,83

Hum5: 0,93

Hum6: 1,15 0,70

Hum7: 1,12 0,80

Hum8: 1,02 0,62 0,89 0,75

Hum9: 1,08 1,00 0,85

Hum10: 1,10 0,88 0,87 0,72

Hum11: 0,74

Hum12: 1,23 0,72

Hum13: 1,11 0,78

Hum14: 1,14 1,03 0,74

Hum15: 0,87 0,76 0,87

Hum16: 1,2 1,02

Hum17: 1,17 0,76 0,98 0,72

Hum18: 1,22 0,79 0,99

Hum19: 1,11 1,05 0,95 0,85

Hum20: 0,80 0,70

CE50 (pM) quimérica (duplicados): 380,74±18,3 (*4) 411,66±183,7 (*5) 462,35±28 (*2) 567,76 (*1)

Se calcularon valores de CE50 (pM) para anticuerpos anti KIT Hum1-20, y los valores para los anticuerpos fueron normalizados con los del anticuerpo quimérico 37C en el correspondiente experimento. Los valores mayores indican mayor actividad de unión. Los valores reales de CE50 para el anticuerpo quimérico en cada experimento son mostrados al pie de la tabla junto con el número de duplicados promediados para lograr ese valor. (sob) = sobrenadante que contiene el anticuerpo; (purificado) = anticuerpo purificado del sobrenadante.

La actividad de unión de algunos de los anticuerpos, así como el anticuerpo quimérico 37C, fue catalogada, además, por ELISA en fase sólida usando un antígeno que contiene la región D4/D5 (véase la Figura 2) del KIT humano. A continuación, se describe el protocolo general usado para los experimentos de ELISA en fase sólida.

Materiales:

5 • Antígeno recombinante: Dominios cuatro y cinco de IG recombinante de la región extracelular de KIT

• TBS-T: 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20

• TBS: 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl

• Solución de bloqueo: Albúmina de suero bovino 1 (BSA) al 1% en TBS

• Tampón de disolución: BSA al 1% en TBS-T

10 • Solución de anticuerpos de detección: Anticuerpo de HRP de cabra anti IgG de ratón y conjugado de Pierce

de cabra específico anti F(ab')2 humano con peroxidasa de rábano picante (Thermo scientific 31414)

• Sustrato de detección: Equipo de reactivos de sustrato de TMB (3,3',5,5' - tetrametilbencidina) (Thermo scientific n° 34021)

El antígeno recombinante correspondiente a la región D4/D5 del dominio extracelular de KIT (véase la Figura 2) fue 15 absorbido en placas de microtitulación de 96 pocillos. En particular, se diluyó antígeno recombinante (5 pg) en 10 mL de tampón borato, y se añadieron 100 pL de la solución de antígeno a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y fueron incubados a 4°C de un día para otro.

Se prepararon disoluciones en serie de muestras de anticuerpos con tampón de disolución para ELISA.

ELISA: Tras un enjuague con TBS-T, se añadió tampón de bloqueo (200 pL) a cada pocillo de la placa con el 20 antígeno adsorbido y se incubó a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, se retiró el tampón de

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bloqueo, y se añadieron a la placa las disoluciones diluidas en serie de anticuerpos de prueba y controles en un volumen de 50 pL y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Las disoluciones de anticuerpos fueron retiradas, y la placa fue lavada tres veces con 100 pL de tampón de lavado en una lavadora de microplacas. Después del último lavado, la placa fue secada con papel secante. Una solución secundaria de anticuerpos fue diluida a 1:8000 y fue añadida a cada pocillo en un volumen de 100 pL y dejada incubar durante una hora a temperatura ambiente. La solución secundaria de anticuerpos fue retirada, y la placa fue lavada tres veces con 100 pL de tampón de lavado en una lavadora de microplacas. A continuación, se añadió sustrato de TMB recién mezclado a cada pocillo en un volumen de 100 pL y se dejó incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Subsiguientemente, se añadieron 100 pL de 2N H2SO4 a cada pocillo e inmediatamente se leyó en el lector de placas. Un anticuerpo irrelevante hizo de control negativo, y un anticuerpo anti KIT contra los dominios D4 y/o D5 de la región extracelular de KIT hizo de control positivo. Se obtuvieron valores OD con una longitud de onda de 450 nm.

Los resultados fueron analizados usando GraphPad Prism y Excel para obtener la concentración de anticuerpos en una unión del 50% al antígeno.

La Figura 5 representa un gráfico que traza OD450 en función de la concentración (M) logarítmica de anticuerpos anti KIT. Se calculó que la concentración efectiva en una unión del 50% (CE50) para la afinidad de unión de una quimera del anticuerpo 37M y los anticuerpos Hum17, Hum8, Hum4 y Hum10 a la región D4/D5 del KIT humano era aproximadamente 12 pM, 6,6 pM, 11 pM, 7,5 pM y 23 pM, respectivamente.

Los resultados presentados en la Figura 5 muestran que las afinidades de unión de una quimera del anticuerpo 37M y de los anticuerpos Hum17, Hum8, Hum4, and Hum10 son comparables.

Ensayos de unión adicionales demostraron que Hum17, Hum8, Hum4 y Hum10 presentaban unión específica al KIT canino y al KIT de mono, además de al KIT humano, pero no presentaban unión específica al KIT murino.

6.3 Ejemplo 3: Afinidad de unión de anticuerpos anti KIT hacia el KIT humano expresado en células CHO

Para confirmar que los anticuerpos anti KIT pueden unirse al KIT expresado en la superficie de las células, se llevaron a cabo ensayos de citometría de flujo usando células CHO que expresan (CHO/KIT-WT) y no expresan (células precursoras CHO) exógenamente el receptor KIT humano de longitud máxima de la forma natural. Sucintamente, se lavaron e incubaron células CHO y células CHO/KIT-WT con 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM o 10 nM de un anticuerpo quimérico (humano-murino) 37M, anticuerpo Hum17, Hum8, Hum4 o Hum10, un anticuerpo IgG isotípico de control negativo o un anticuerpo comercial anti KIT como control positivo. Las muestras fueron procesadas para su análisis por citometría de flujo. Más específicamente, las células fueron retiradas de los matraces de cultivo usando EDTa, y lavadas con pBs. A continuación, las células fueron resuspendidas en caldos y contadas. Cada muestra, que contenía aproximadamente de 200.000 a 250.000 células, fue centrifugada, se retiraron los caldos y las células fueron resuspendidas en tampón FC (1% BSA, 0,01% azida de sodio en 1*PBS) para la etapa de bloqueo. Las células fueron incubadas en tampón FC durante 1 hora sobre hielo. A continuación, se añadió anticuerpo primario (por ejemplo, un anticuerpo quimérico (humano-murino) 37M, Hum17, Hum8, Hum4, Hum10, un anticuerpo anti KIT de control positivo, o un anticuerpo de control negativo) a las células en tampón FC según se ha descrito anteriormente. Las muestras fueron mezcladas e incubadas sobre hielo durante 1 hora, seguido por el lavado de las células con 0,5-1 mL de tampón FC. El tampón FC fue eliminado por centrifugación de las células a 1200 rpm durante 3 minutos a 4°C, decantando el líquido. Los sedimentos celulares fueron resuspendidos en 200 pL de tampón FC, y se añadió anticuerpo secundario (DyLight 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG Jackson Laboratories) a las células en una disolución 1:1000 a 1:2000. Las muestras fueron mezcladas e incubadas sobre hielo durante 1 hora, y luego lavadas según se ha descrito anteriormente. Las muestras fueron pasadas por una máquina de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (Accuri FlowCytometer C6). Las muestras fueron analizadas siguiendo el canal FLA-1 para las muestras conjugadas con DyLight.

La Figura 6 resume los resultados del análisis por citometría de flujo. Se calculó que la concentración efectiva en una unión del 50% (CE50) para la afinidad de unión de una quimera (humana-murina) del anticuerpo 37M y los anticuerpos Hum17, Hum8, Hum4 y Hum10 a la región D4/D5 del KIT humano era aproximadamente 47 pM, 139 pM, 83 pM, 106 pM y 132 pM, respectivamente.

Los resultados presentados en la Figura 6 muestran que las afinidades de unión del anticuerpo quimérico 37M y de los anticuerpos Hum17, Hum8, Hum4 y Hum10 hacia el KIT humano expresado en la superficie celular son comparables.

6.4 Ejemplo 4: Inhibición de la fosforilación del KIT inducida por SCF en ensayos de fosfo-KIT de tipo celular

La inhibición de la fosforilación del KIT de la superficie celular arbitrada por el factor de células madre (SCF) por parte del anticuerpo quimérico 37M anti KIT y ciertos anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria fue evaluada como sigue en un ensayo de tipo celular: se cultivaron de un día para otro células CHO-KIT, clasificadas buscando una alta expresión de antígeno en la superficie celular, en placas de 24 pocillos o de 96 pocillos en ausencia de suero antes de la adición de una serie de triple disolución de 1*10'8 M - 1,4*10'11 M de anticuerpo de

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prueba (anticuerpos quiméricos o anti KIT descritos en la presente memoria purificados del sobrenadante) o de anticuerpo de bloqueo de control (BioLegend, clon A3C6E2).

Tras una incubación durante 2 horas a 37°C, las células fueron estimuladas con 30 ng/mL de SCF (R&D Systems, n° cat. 255-SC/CF) durante 10 min a 37°C, lisadas en presencia de inhibidores de la proteasa y la fosfatasa, y la proteína KIT fue capturada de los lisados enteros en placas Maxisorp de 96 pocillos de paredes blancas recubiertas de antemano con anticuerpo de captura de KIT (Thermo Scientific, n° cat. LVMS289-PABX). Para el formato de 96 pocillos, se dispusieron pocillos duplicados para cada condición y fueron lisados y transfectados por separado a la placa de captura mientras que, para el formato de 24 pocillos, las muestras duplicadas de lisado fueron tomadas del mismo pocillo. Tras una incubación de un día para otro a 4°C y un lavado exhaustivo de la placa se detectó KIT fosforilado con tirosina usando el clon 4G10 anti-fosfotirosina (Millipore, n° cat. 16-105) conjugado con HRP y sustrato quimioluminiscente West PICO (Fisher, n° cat. PN34087). Los resultados se presentan en la Tabla 8 a continuación.

Tabla 8: Ensayos de bloqueo

Anticuerpo: Actividad de bloqueo relativo, ensayo n° 1 (24 pocillos) Actividad de bloqueo relativo, ensayo n° 2 (24 pocillos) Actividad de bloqueo relativo, ensayo n° 3 (96 pocillos) Actividad de bloqueo relativo, ensayo n° 4 (96 pocillos)

Hum4: 1,2 0,86

Hum8: 1,01 1,12

Hum9: 1,05

Hum10: 0,82 0,86

Hum13: 1,00

Hum14: 0,94

Hum15: 0,98 0,99

Hum17: 1,39 1,07

Hum18: 1,22

Hum19: 1,09 0,98 1,40

Se calcularon valores CI50 (pM) para estos anticuerpos y los valores para los anticuerpos fueron normalizados con los del anticuerpo quimérico 37M en el correspondiente experimento. Los valores mayores indican mayor actividad de bloqueo. “(96 pocillos)” se refiere a ensayos llevados a cabo en un formato de placa de 96 pocillos, en contraposición con el formato de 24 pocillos (24 pocillos).

Los resultados de la Tabla 8 muestran que las actividades de bloqueo de los anticuerpos Hum4, Hum8, Hum9, Hum10, Hum13, Hum14, Hum15, Hum17, Hum18 y Hum19 son comparables a la actividad de bloqueo de una quimera del anticuerpo 37M.

Para caracterizar adicionalmente el efecto de estos anticuerpos en la actividad del KIT, específicamente, de la fosforilación de la tirosina del dominio citoplasmático de KIT inducida por SCF, se llevaron a cabo como sigue ensayos fosfo-KIT de tipo celular.

Materiales:

• Células CHO transfectadas de manera estable con un plásmido que codifica el KIT humano de longitud máxima (véase la Figura 1), que fue clonado de una biblioteca de ADNc de ovario humano (OriGene, Rockville, Maryland)

• Caldos completos de cultivo celular (véase la Tabla 9)

• Caldos de inanición: Caldos de cultivo celular descritos en la Tabla 9 sin FBS

• Tripsina-EDTA

• PBS

• Solución de SCF: rhSCF (RD Systems 255-SC/CF); concentración final 30 ng/mL

• Tampón de lisis: 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, cóctel inhibidor de la

proteasa libre de EDTA (Roche Diagnostics 04693132001), 1 mM NaVO4

• TBS-T: 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20

• Solución de bloqueo: Albúmina de suero bovino (BSA) al 5% en TBS-T

• Tampón de disolución : BSA al 1% en TBS-T que contiene 1 mM NaVO4

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• Solución de anticuerpos de detección: anticuerpo anti-fosfo-tirosina conjugado con peroxidasa de rábano picante (Millipore, 4G10); factor de disolución 1:500

• Anticuerpo de captura: anticuerpo anti KIT Ab3 de Thermo Scientific (MS-289-PABX)

Tabla 9: Medios de cultivo celular

Línea celular: CHO (precursora o transfectada con KIT)

Caldo básico: Mezcla nutriente Gibco F12 (Ham) 1X 11765

Penicilina/estreptomicina (Cellgro 30-001- CI): 50 IU/mL penicilina

50 pg/mL estreptomicina

100X GlutaMAX™-I (Gibco 35050): 1X GlutaMAX™

Geneticina (Invitrogen 10131027): 1 mg/mL geneticina (únicamente para la selección de células transfectadas)

Paso de las células CHO/KIT-WT: Las células confluentes fueron lavadas una vez con PBS estéril, incubadas con Tripsina-EDTA al 0,25% a temperatura ambiente hasta que las células se separaron de las placas plásticas de cultivo tisular. Se añadió a la placa caldo completo de cultivo, que contiene FBS, para finalizar la digestión tríptica.

Recuento de células: Se mezclaron 10 pL de suspensión celular con 10 pL de azul de tripano al 0,4%. La mitad de esta mezcla (10 pL) fue transferida a una cámara de recuento celular (Invitrogen), y las células fueron contadas. Las células (200.000 por pocillo) fueron transferidas a una placa de cultivo celular de 24 pocillos, y fueron cultivadas en un caldo completo (Tabla 9) durante 24 horas en condiciones normales de cultivo celular (es decir, en aire humectado al 95% y en una atmósfera con un 5% de CO2 a 37°C).

Tratamiento de las células: Después de que las células fueron puestas en las placas de 24 pocillos y cultivadas de un día para otro, el medio fue retirado, y la monocapa de células fue lavada una vez con un caldo de inanición. A continuación, las células fueron cultivadas durante 24 horas en el caldo de inanición en condiciones normales de cultivo celular. Acto seguido, las células fueron tratadas con un anticuerpo quimérico (humano-murino) 37M, soluciones de anticuerpo Hum4, Hum8, Hum10, Hum17 o de control durante 2 horas en condiciones normales de cultivo celular. La concentración final para la solución de anticuerpos fue de 100 nM (5 pg/mL) o menos. Subsiguientemente, se añadió una solución de SCF a las células pretratadas con anticuerpos anti KIT o con anticuerpo de control a una concentración final de 30 ng/mL durante 10 minutos en condiciones normales de cultivo celular.

Controles:

• Controles negativos: células sometidas a inanición, no tratadas y no estimuladas

• Control positivo: células sometidas a inanición, no tratadas y estimuladas con SCF

• Control farmacológico: células sometidas a inanición, tratadas con 1 pM de Gleevec y estimuladas con SCF

• Control de anticuerpos: células sometidas a inanición, tratadas con 100 nM de anticuerpo de bloqueo (anticuerpo murino purificado anti KIT humano (BioLegend A3C6E2) que se une al sitio de unión del SCF)

Preparación de lisados celulares: Tras la estimulación, las células de la placa de 24 pocillos fueron puesta sobre hielo inmediatamente; las células fueron lavadas una vez con PBS frío, y lisadas con 100 pL de tampón de lisis frío.

Preparación de una placa ELISA de 96 pocillos con anticuerpo de captura: Se diluyó un anticuerpo de captura (5 pL) en 10 mL de tampón borato 50 mM, y la solución de anticuerpo de captura (100 pL o 50 ng/pocillo) fue añadida a cada pocillo de la placa ELISA de 96 pocillos. La placa de 96 pocillos fue incubada a temperatura ambiente durante 5-6 horas o de un día para otro a 4°C. La solución de anticuerpo de captura fue retirada antes de la etapa de bloqueo. El bloqueo se llevó a cabo añadiendo 100 pL de solución de bloqueo a cada pocillo y dejando incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de bloqueo fue retirada, los pocillos fueron lavados una vez con tampón de disolución, y se añadieron a cada pocillo 50 pL de tampón de disolución.

Ensayo de fosfo-KIT: Se transfirieron 50 pL de los lisados celulares de cada muestra desde un pocillo de la placa de 24 pocillos a 1 pocillo de la placa preparada de 96 pocillos que contenía 50 pL de tampón de disolución, y la placa de 96 pocillos fue incubada de un día para otro a 4°C. Tras la incubación durante la noche, el sobrenadante fue retirado, y la placa fue lavada 3 veces (con una incubación de 5 minutos cada vez) con TBS-T. Se añadió una disolución de anticuerpos de detección (100 pL) a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. La placa fue lavada 3 veces con TBS-T, lavada una vez con TBS, y el TBS fue retirado. Se mezclaron (1:1) los reactivos del “SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate” (Thermo Scientific), y se añadieron a cada pocillo 100 pL de la mezcla.

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Se detectó la luminiscencia en el lector de placas ELISA usando el protocolo “Luminescence Glow” de GEN5™ y los datos fueron analizados usando Microsoft Excel.

La Figura 7 muestra un gráfico que representa los datos de estos experimentos. El gráfico es un trazado de unidades de luminiscencia arbitrarias en función de la concentración logarítmica (M) ya sea de una quimera (humana-murina) del anticuerpo 37M o de anticuerpo Hum17, Hum8, Hum4 o Hum10. Se calculó que las concentraciones de inhibición al 50% (CI50) de la quimera 37M y de los anticuerpos Hum17, Hum8, Hum4 y Hum10 eran aproximadamente 344 pM, 510 pM, 542 pM, 470 pM y 510 pM, respectivamente. Los resultados indican que los anticuerpos Hum17, Hum8, Hum4 y Hum10, como el anticuerpo quimera 37M, son inhibidores efectivos de la fosforilación de la tirosina del dominio citoplasmático de KIT inducida por un ligando (SCF).

Estos anticuerpos anti KIT pueden ser expresados en diversos tipos de células diferentes sin afectar sustancialmente a las propiedades del anticuerpo; por ejemplo, a la actividad de unión y a la actividad de bloqueo. Por ejemplo, se expresaron anticuerpos anti KIT Hum17, Hum8, Hum4 y Hum10 en un sistema de expresión recombinante diferente basado en células HEK293-Freestyle (293F), y presentaron actividad de bloqueo según determinaron ensayos de inhibición de la fosforilación del KIT. Estos resultados indican que se pueden usar diversos sistemas celulares para expresar los anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria, tales como anticuerpos Hum1-Hum20, sin comprometer la actividad de los anticuerpos.

6.5 Ejemplo 5: Internalización de anticuerpos por células CHO que expresan el KIT de la forma natural

Se llevaron a cabo ensayos de tinción de inmunofluorescencia para evaluar la internalización de anticuerpos Hum4, Hum10, Hum17 y Hum8 por células CHO que expresaban el KiT de la forma natural (“CHO/KIT-WT”).

Los ensayos de tinción de inmunofluorescencia fueron llevados a cabo esencialmente según se describe a continuación. Los materiales y los reactivos para los ensayos de inmunofluorescencia incluyeron lo siguiente:

• Anticuerpos primarios: anticuerpos Hum4, Hum8, Hum10, Hum17, 37M y anticuerpo monoclonal (mAb) de conejo p-Tubulina (9F3) (Cell Signaling n° 2128).

• Anticuerpos secundarios: anticuerpo de cabra anti ratón conjugado con Oregon Green® 488 (Invitrogen n° 011038), anticuerpo de cabra anti conejo conjugado con Texas Red (Invitrogen n° T2767), y anticuerpo de cabra anti humano conjugado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen n° A11013).

• Fijador: paraformaldehído (PFA) al 4% (almacenar PFA de calidad de microscopía al 40% en la nevera y diluir 1:10 con PBS inmediatamente antes de su uso)

• Solución de permeabilización: PBS con Triton X-100 al 0,1% y BSA al 0,5%, filtrado de forma estéril

• Solución de bloqueo/disolución: BSA al 2% en PBS, filtrado de forma estéril

• Medios de montaje: reactivo antipérdida de fluorescencia ProLong® Gold con DAPI (P36931 Invitrogen) (4',6-diamidino-2-fenilindol)

• Células CHO diseñadas para expresar KIT humano exógeno del tipo natural (longitud máxima) (“CHO/KIT- WT”)

Se sembraron células CHO (por ejemplo, 75.000 células por pocillo) en una placa de cultivos tisulares de 24 pocillos que contenía un cubreobjetos redondo de vidrio por pocillo. Las células fueron cultivadas durante al menos 6 horas antes de someterlas a inanición de un día para otro en caldo que no contenía nada de suero fetal bovino. Tras el sometimiento a inanición, se retiró de las células el caldo de cultivo y el anticuerpo 37M, Hum4, Hum10, Hum17 o Hum8 diluido hasta 33,3 nM en caldo de inanición que contenía un 1% de albúmina de suero bovino, fue transferida a la capa celular en el instante 0 minutos, 30 minutos, 45 minutos o 55 minutos para generar una evolución temporal. Las células fueron incubadas durante los tiempos indicados en condiciones estándar de cultivo (37°C y 5% de CO2). Las capas de células fueron lavadas una vez con PBS (a temperatura ambiente) de 5 a 60 minutos después de la adición del anticuerpo. Las capas de células fueron fijadas durante 20 minutos con PFA al 4% a temperatura ambiente, y fueron lavadas 3 veces con PBS. Las membranas celulares fueron permeabilizadas mediante la adición de una solución de permeabilización durante 3 minutos seguido por 3 lavados con PBS. Se añadió solución de bloqueo a cada pocillo, y las células fueron bloqueadas durante 20 minutos a temperatura ambiente. El mAb de conejo p-Tubulina (9F3) fue diluido a 1:100 en solución de disolución e incubado con las capas celulares durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por 2 lavados con PBS y uno con la solución de bloqueo. Ambos anticuerpos secundarios fueron diluidos juntos a 1:200 en una solución de disolución antes de ser añadidos a las células. Las células fueron incubadas en anticuerpo secundario en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora seguido por 3 lavados con PBS. Las células de los cubreobjetos fueron montadas en los portaobjetos de vidrio usando una gota de reactivo antipérdida de fluorescencia ProLong® Gold con DAPI y fueron mantenidas a temperatura ambiente de un día para otro. La internalización del anticuerpo fue analizada por microscopía por fluorescencia en diversos momentos; por ejemplo, 5 minutos y 60 minutos de exposición al anticuerpo 37M, Hum4, Hum10, Hum17 o Hum8.

Los ensayos de tinción de inmunofluorescencia demostraron que, en células CHO/KIT-WT, los anticuerpos Hum4, Hum10, Hum17 y Hum8, de forma similar al anticuerpo 37M, se unían a la superficie de estas células, y eran internalizados por estas células. En particular, las imágenes de células expuestas a estos anticuerpos muestran la tinción de estructuras asociadas con la membrana en momentos tempranos, tales como 5 minutos después de la

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exposición a anticuerpos anti KIT, y muestran la tinción de estructuras internas (por ejemplo, vesículas) en momentos posteriores, tales como 60 minutos después de la exposición al anticuerpo. En cambio, las imágenes de células expuestas con anticuerpo anti-p-Tubulina, como control, mostraban una tinción de estructuras alargadas en todo el citoplasma de las células. Estos resultados indican que los anticuerpos Hum4, Hum10, Hum17 y Hum8 son internalizados por las células que expresan KIT. La internalización efectiva de anticuerpos es útil, por ejemplo, para suministrar toxinas a células —por ejemplo, células cancerosas— que expresan KIT.

6.6 Ejemplo 6: Datos de estabilidad

El desarrollo con éxito de anticuerpos terapéuticos depende, en parte, de la calificación de la estabilidad de los anticuerpos in vivo. Con este fin, se calificó la estabilidad térmica relativa y la estabilidad relativa en condiciones fisiológicas imitadas (es decir, suero, 37°C) de un subconjunto de anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria.

Calorimetría de barrido diferencial:

La calorimetría de barrido diferencial (DSC) es una técnica termoanalítica usada para determinar el punto en el que una muestra de interés experimenta una transición de fase, tal como la fusión o la cristalización. Por lo tanto, la DSC es una herramienta útil para comparar la estabilidad térmica relativa de múltiples anticuerpos. Con este fin, se analizó un subconjunto de anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria (por ejemplo, anticuerpos Hum1-Hum20) usando DSC, y se determinaron las temperaturas de fusión de estos anticuerpos. Los perfiles de fusión de cada anticuerpo anti KIT revelaron un pico principal de fusión, y uno o dos picos menores. Los puntos de fusión preponderantes oscilaban entre 85,7°C y 86,6°C, mientras que se calculó que los de los picos menores estaban en 71,6°C-71,9°C. Estos resultados, que muestran que las temperaturas de fusión son significativamente superiores a 37°C, indican que estos anticuerpos anti KIT pueden ser estables en un contexto terapéutico; por ejemplo, a 37°C.

Estabilidad sérica:

Para entender mejor la estabilidad de los anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria en condiciones fisiológicas, la actividad de los anticuerpos fue evaluada tras una incubación a largo plazo en suero fetal bovino a 37°C. Sucintamente, los anticuerpos anti KIT fueron diluidos hasta 0,2 mg/mL en caldo libre de suero o en caldo que contenía suero fetal bovino al 50%. Las muestras fueron incubadas a 37°C durante 1, 2 y 3 semanas, momento en el que se compararon partes alícuotas con un anticuerpo almacenado a 4°C durante la misma duración en ensayos tanto ELISA de unión como de fosforilación celular, según se ha descrito en ejemplos anteriores. Usando el anticuerpo a 4°C como referencia, los ensayos ELISA de unión revelaron que, tras una semana, el cambio máximo en el valor CE50 era de 4 veces, pero podía bajar hasta 1,1 veces, mientras que, después de dos semanas, el cambio máximo era de 4 veces, usando el anticuerpo a 4°C como control. Sistemáticamente, los valores CI50 en los ensayos de fosforilación celular para estos mismos anticuerpos anti KIT almacenados a 37°C con o sin suero variaron en menos de dos veces de los de los anticuerpos almacenados a 4°C.

Juntos, estos datos sugieren una estabilidad a largo plazo de los anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria, ya que la actividad de unión y de bloqueo de cada anticuerpo se mantiene tras la incubación tanto en suero como a temperatura elevada. Estos resultados indican que los anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria (por ejemplo, Hum1-Hum20) pueden presentar una actividad mantenida y pueden ser usados, por ejemplo, en una posología menos frecuente.

6.7 Ejemplo 7: Bloqueo de la fosforilación de AKT inducida por ligandos

Los anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria (por ejemplo, Hum1-Hum20) son sometidos a ensayo para encontrar su capacidad de inhibir o bloquear la fosforilación de AKT, que es un evento de señalización aguas debajo de la señalización de KIT. El ensayo se lleva a cabo según se ha descrito anteriormente con las modificaciones siguientes. En primer lugar, se inmoviliza un anticuerpo murino anti AKT en placas ELISA como anticuerpo de captura. En segundo lugar, la detección de la fosforilación de AKT (fosfo-AKT) se lleva a cabo usando un método en dos etapas. Después de la incubación de los lisados celulares con la placa ELISA recubierta, se añade a cada pocillo un anticuerpo monoclonal murino biotinilado que reconoce fosfo-AKT (Ser473) durante 1 hora a temperatura ambiente con una disolución de 1:500. Tras esta incubación y los posteriores lavados, el anticuerpo fosfo-AKT es detectado con anticuerpo Protein Western C Streptavidin-HRP (BioRad) a una disolución de 1:2500. La etapa de detección final con solución de sustrato de TMB se lleva a cabo según se ha descrito en la presente memoria (por ejemplo, en las secciones 6.2 y 6.4).

6.8 Ejemplo 8: Estudio de modelo animal de anticuerpos anti KIT en el tratamiento del cáncer

Los efectos antitumorales de los anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria se confirman usando modelos murinos, tales como modelos murinos de xenotrasplante, de tumores humanos. Se han descrito diversos modelos murinos para el estudio del cáncer (véase, por ejemplo, Fernández et al., J. Clin. Invest., 2007, 117(12):

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4044-4054). Más abajo, se describen modelos murinos —por ejemplo, modelos murinos de xenotrasplante— derivados de diversas líneas celulares humanas derivadas de pacientes. Más abajo también se describen modelos murinos para evaluar la toxicidad.

Tumor estromal gastrointestinal (GIST)

Se han descrito modelos murinos de GIST; véase, por ejemplo, Fernández et al, J. Clin. Invest., 2007, 117(12): 4044-4054. Por ejemplo, se recogen células de GIST de cultivos subconfluentes mediante una breve exposición a tripsina-EDTA (Invitrogen) al 0,05%. Se detiene la tripsinización con un caldo que contiene FBS al 10%. Las células son entonces lavadas dos veces en caldo libre de suero y resuspendidas en HBSS libre de suero (Invitrogen). Para las inyecciones se usan suspensiones monocelulares con una viabilidad superior al 95%, determinada por exclusión de azul de tripano. Para producir tumores, se inyectan subcutáneamente de 1*105 a 1*107 células de GIST, por ejemplo 6 x 106 células de GIST por cada 100 pl en el costado unilateral de cada ratón SCID (por ejemplo, ratones C.B-17/IcrHsd-PrkdcSCID hembra comprados en Harlan Sprague Dawley Inc.; alojados en instalaciones autorizadas por la Asociación Estadounidense para la Evaluación y la Acreditación del Cuidado Animal en Laboratorios, el Departamento de Agricultura de Estados Unidos, el Departamento de Salud y Servicios Sociales de los Estados Unidos y los NIH, y según los criterios de esos organismos; y usados según directrices institucionales). Se usan de cinco a diez ratones por grupo en los grupos de vehículo y de anticuerpos anti KIT. Una vez que los tumores son palpables (por ejemplo, aproximadamente a las 8-11 semanas desde la inyección), se pone a los ratones en una terapia con inyecciones de suero fisiológico normal (vehículo) o de anticuerpos anti KIT (por ejemplo, anticuerpos Hum1-Hum20 o conjugados anticuerpo-fármaco de los mismos); por ejemplo, inyecciones intraperitoneales diarias, semanales o bisemanales. El tratamiento continúa un periodo de tiempo —por ejemplo, aproximadamente 6 semanas— con mediciones bidimensionales semanales del tamaño del tumor. También se pueden usar métodos de formación de imágenes para detectar el tamaño del tumor; por ejemplo, IRM. Todos los ratones son sacrificados cuando el tamaño del tumor se acerca aproximadamente a 1,5 cm en el grupo de control. Los tumores son recogidos, fijados en formol, y son analizados por tinción con H&E. Se toman imágenes representativas de cada tumor usando un microscopio óptico con x40 y x100 aumentos.

Se genera un gráfico del tamaño o el volumen del tumor de cada ratón trazado en función del tiempo (por ejemplo, días o semanas) después de la inyección del tumor para comprobar el efecto de los anticuerpos anti KIT en el desarrollo del tumor en los ratones con respecto al control negativo del vehículo.

Ejemplos no limitantes de células de GIST que pueden usarse en estos modelos murinos incluyen células GIST 430 (células GIST humanas que expresan un KIT mutado que tiene una deleción del exón 11 (V560-L576) y una mutación de V654A en el exón 13) y células GIST882 (células GIST inmortales que posee una mutación de aminoácido en el exón homocigótico 13 (es decir, K642E) en KIT (véase, por ejemplo, Tuveson et al., Oncogene, 2001, 20: 5054 -5058)).

Leucemia

Para estudiar los efectos de los anticuerpos anti KIT en la leucemia, se establece un modelo murino de xenotrasplante usando células de leucemia humana (por ejemplo, células K562, HEL o HL60) esencialmente como se ha descrito más arriba, salvo que se inyectan células de leucemia (por ejemplo, células K562, HEL o HL60) en los ratones en lugar de células GIST. En particular, las células tumorales son recogidas de suspensiones subconfluentes. Para producir tumores, se inyectan subcutáneamente de 1x105 a 1x107 células tumorales por cada 100 pl en cada ratón SCID. A continuación, los ratones son distribuidos de forma aleatoria en los siguientes grupos (n = 5-10 por grupo): (a) suero fisiológico normal a diario; y (b) anticuerpos anti KIT (por ejemplo, anticuerpos Hum1- Hum20 o conjugados anticuerpo-fármaco de los mismos). Se pone a los ratones en una terapia (por ejemplo, el día 0, 7 o 14 o cuando los tumores sean detectables) con inyecciones de suero fisiológico normal (vehículo) o anticuerpos anti KIT (por ejemplo, inyecciones intraperitoneales diarias, semanales o bisemanales). El tratamiento continúa un periodo de tiempo —por ejemplo, aproximadamente 6 semanas— con mediciones bidimensionales semanales del tamaño del tumor. También se pueden usar métodos de formación de imágenes para detectar el tamaño del tumor; por ejemplo, IRM. Los tumores son medidos semanalmente durante el tratamiento y en la necropsia.

También se pueden generar modelos murinos de la leucemia humana inyectando células de leucemia humana en ratones desnudos o ratones irradiados, a través de otras vías, tales como la vía intravenosa, y monitorizando la muerte del animal como una indicación del avance de la leucemia en presencia o ausencia de tratamiento con anticuerpos anti KIT. Se genera una curva de supervivencia para cada ratón para comprobar el efecto de los anticuerpos anti KIT en la supervivencia.

Cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer microcítico de pulmón)

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Se establece un modelo murino de xenotrasplante usando células cancerosas de pulmón humano —por ejemplo, células de carcinoma microcítico de pulmón humano (por ejemplo, células H526, células WBA o células NCI-H209)— esencialmente según se ha descrito anteriormente, salvo algunas modificaciones. Por ejemplo, en los ratones se inyectan células cancerosas de pulmón (por ejemplo, células de cáncer microcítico de pulmón) en lugar de células GIST. Se recogen células cancerosas de pulmón —por ejemplo, células tumorales H526— y se inyectan de 1 x 105 a 1 x 107 células cancerosas de pulmón por cada 100 pl en cada ratón (por ejemplo, ratones SCID). A continuación, los ratones son distribuidos de forma aleatoria en los siguientes grupos (n = 5-10 por grupo): (a) suero fisiológico normal a diario; y (b) anticuerpos anti KIT (por ejemplo, anticuerpos Hum1-Hum20 o conjugados anticuerpo-fármaco de los mismos). Se pone a los ratones en una terapia (por ejemplo, el día 0, 7 o 14 o cuando los tumores sean detectables) con inyecciones (por ejemplo, inyecciones intraperitoneales diarias, semanales o bisemanales) de suero fisiológico normal (vehículo) o anticuerpos anti KIT. El tratamiento continúa un periodo de tiempo (por ejemplo, aproximadamente 6 semanas o más), con mediciones bidimensionales semanales del tamaño del tumor. También se pueden usar métodos de formación de imágenes para detectar el tamaño del tumor; por ejemplo, IRM. Los tumores son medidos semanalmente durante el tratamiento y en la necropsia.

Se genera un gráfico del tamaño o el volumen del tumor de cada ratón trazado en función del tiempo (por ejemplo, días o semanas) después de la inyección del tumor para comprobar el efecto de los anticuerpos anti KIT en el desarrollo del tumor en los ratones con respecto al control negativo del vehículo. Se genera una curva de supervivencia para comprobar el efecto de los anticuerpos anti KIT (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un conjugado del mismo) en la supervivencia de los animales.

Se han descrito modelos murinos para el cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer microcítico de pulmón) (véanse, por ejemplo, Garton et al., 2006, Cáncer Res. 66(2):1015-24; y Wolff et al., 2004, Clin Cáncer Res. 10:3528-3534), y pueden ser adaptados en consecuencia para estudiar los efectos de anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria.

Sarcoma

Se establecen modelos de xenotrasplante usando líneas celulares derivadas de la familia de tumores de Ewing, tales como RD-ES, SK-ES-1 o SK-N-MC, o rabdomiosarcomas, tales como A-673. Las líneas celulares están disponibles en la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo (ATCC; Manassas, Virginia). Generalmente, se utilizan métodos similares a los descritos anteriormente. Por ejemplo, 2,5-5 x 106 células son suspendidas con tripsina/EDTA o resuspendidas en 100-200pL de caldo de cultivo e implantadas subcutáneamente en el costado de ratones inmunodeficientes (NuNu, SCID) de 6-8 semanas de edad (Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts). Se usan de cinco a diez ratones por grupo tanto en los grupos de vehículo con en los de anticuerpos anti KIT. Una vez que los tumores son palpables o han alcanzado 100-200 mm3, se pone a los ratones en una terapia con inyecciones (por ejemplo, inyecciones intraperitoneales diarias, semanales o bisemanales) de suero fisiológico normal (vehículo) o anticuerpos anti KIT (por ejemplo, anticuerpos Hum1-Hum20 o conjugados anticuerpo-fármaco de los mismos). El tratamiento continúa un periodo de tiempo —por ejemplo, aproximadamente 6 semanas o más—, y el tamaño del tumor es evaluado (por ejemplo, dos veces por semana mediante mediciones bidimensionales). Se pueden usar métodos de formación de imágenes para detectar el tamaño del tumor; por ejemplo, IRM. Los ratones son sacrificados cuando el tamaño del tumor se aproxima a cierto tamaño (por ejemplo, aproximadamente 1,5 cm) en el grupo de control. Los tumores son recogidos, fijados en formol y analizados por tinción con H&E. Se toman imágenes representativas de cada tumor usando un microscopio óptico con, por ejemplo, x40 y x100 aumentos.

Se han descrito modelos murinos para el sarcoma(por ejemplo, sarcoma de Ewing); véase, por ejemplo, la siguiente lista de publicaciones, y pueden ser adaptados en consecuencia para evaluar los efectos de anticuerpos anti KIT (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos Hum1-Hum20):

González et al., 2004, Clin Cáncer Res. 10(2):751-61;

Landuzzi et al., 2000, Am J Pathol. 157(6):2123-31 (células 6647);

Merchant et al., 2002, JNCI 94(22):1673-1679 (células TC71);

Sturla et al., 2000, Cáncer Res. 60(21):6160-70 (células TC32 y RD-ES);

Powis et al., 2006, Mol Cáncer Ther. 5(3):630-636 (células A-673);

Watanabe et al., 2008, Hum Gene Ther. 19(3):300-10 (células A-673);

Rouleau et al., 2008, Clin Cancer Res. 14(22):7223-7236 (células A-673);

Karmakar et al, 2011, World J Oncol. 2(2):53-63 (células RD-ES y SK-N-MC);

Wang et al., 2009, In vivo 23(6):903-9 (células TC71); y

Ikeda et al., 2010, Mol Cancer Ther. (3):653-60 (células TC71 y células A4573).

Modelo murino humanizado

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Se realizan estudios con anticuerpos anti KIT, incluyendo conjugados de fármacos y anticuerpos anti KIT, por ejemplo, anticuerpos Hum1-Hum20, incluyendo conjugados anticuerpo-fármaco de los mismos, con modelos murinos generados por trasplante a ratones inmunodeficientes de componentes del sistema inmunitario humano; por ejemplo a ratones NSG humanizados (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine). Los ratones NSG humanizados son ratones NOD scid con bloqueo de la cadena gamma del receptor IL-2 (NSG) trasplantados con células madre hematopoyéticas humanas (células hCD34+) para reconstituir un sistema inmunitario humano.

Estos ratones pueden servir de plataforma para el estudio de la toxicidad de anticuerpos anti KIT. Por ejemplo, grupos de ratones (por ejemplo, 1-5 ratones) son inyectados con diversas concentraciones de anticuerpos anti KIT durante un periodo de tiempo (por ejemplo, 4-16 semanas). Los ratones son evaluados en busca de indicadores de toxicidad; por ejemplo, peso corporal, duración de la supervivencia.

6.9 Ejemplo 9: Inhibición de la formación de colonias por células CHO que expresan KIT en ensayos en agar blando

Los anticuerpos anti KIT descritos en la presente memoria —por ejemplo Hum1-Hum20— son sometidos a ensayo en busca de su capacidad de inhibir el desarrollo celular independiente del anclaje en ensayos en agar blando de células CHO/KIT-Wt. El ensayo en agar blando para la formación de colonias es un ensayo de desarrollo independiente del anclaje, el cual es un ensayo útil para detectar una transformación maligna de las células. La transformación in vitro está asociada con ciertos cambios fenotípicos, tales como pérdida de la inhibición del contacto (las células pueden crecer una sobre otra) e independencia de anclaje (las células forman colonias en agar blando). En general, las células no transformadas lo logran desarrollarse cuando son suspendidas en un fluido viscoso o gel (por ejemplo, agar o agarosa); sin embargo, cuando estas células están transformadas, son capaces de crecer en un fluido viscoso o gel y se vuelven independientes del anclaje. Se supone que el proceso por el cual se producen estos cambios está estrechamente relacionado con los procesos carcinogénicos in vivo.

Los ensayos en agar blando se llevan a cabo como sigue. Se añade una capa base de agar (que contiene agar y caldo de cultivo celular) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Sobre la capa base de agar se añade la capa de agar celular (que contiene agar, caldo de cultivo celular y una suspensión de células). Se diluyen anticuerpos anti KIT en el caldo de cultivo celular y se echan con pipeta encima de las capas. Las muestras de control no contienen ningún anticuerpo. Las placas son incubadas a 37°C y con un 5% de CO2 durante 5-8 días en presencia o ausencia de 30 ng/mL de SCF. El ligando SCF y los anticuerpos anti KIT (100 nM) son añadidos concurrentemente al agar.

Cuando se completa el tratamiento, el agar es solubilizado y las células son lisadas. Se mezcla la tinción fluorescente verde Cyquant® GR con los lisados. Esta tinción presenta fluorescencia cuando está unida a ácidos nucleicos celulares. La fluorescencia se mide con una excitación de 480 nm y una emisión de 520 nm.

Según se usan en esta memoria y en las reivindicaciones, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen las formas plurales, a no ser que el contenido dicte claramente algo distinto. Así, por ejemplo, una referencia a “un anticuerpo” incluye una mezcla de dos o más anticuerpos de ese tipo y similares.

Claims

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1. Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano, comprendiendo dicho anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo:

(i) (a) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos:

DIVMTQSPSXkiLSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKX kzLIYSASYRYSGVPDRFXksGSGSGTDFTLTISSLQXkíEDFAXksYXkéC QQYNSYPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 12),

en la que Xki es un aminoácido con una cadena lateral aromática o hidroxilo alifática, Xk2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática o hidroxilo alifática, Xk3 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática, Xk4 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática o es P, Xks es un aminoácido con una cadena lateral cargada o ácida, y Xk6 es un aminoácido con una cadena lateral aromática; y

(b) una VH que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ iD NO: 18, respectivamente;

(ii) (a) una VL que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL que tienen las secuencias de

aminoácidos de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21, respectivamente; y

(b) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos:

QVQLVQSGAEXi„KKPGASVKX„2SCKASGYTFTDYY]NWVX„:,QAPG KGLEWIARIYPGSGNTYYNEKFKGRXh4TXh5TAXh6KSTSTAYMXH7LS SLRSEDXhsAVYFCARGVYYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 11),

en la que Xhi es un aminoácido con una cadena lateral alifática, XH2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh3 es un aminoácido con una cadena lateral polar o básica, Xh4 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xhs es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh6 es un aminoácido con una cadena lateral ácida, Xh7 es un aminoácido con una cadena lateral ácida o de derivación amídica, y Xhs es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática; o

(iii) (a) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos:

DIVMTQSPSXkiLSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKX kjLIYSASYRYSGVPDRFXk^GSGSGTDFTLTISSLQXkíEDFAXksYXkéC QQYNSYPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 12),

en la que Xk1 es un aminoácido con una cadena lateral aromática o hidroxilo alifática, Xk2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática o hidroxilo alifática, Xk3 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática, Xk4 es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática o es P, Xks es un aminoácido con una cadena lateral cargada o ácida, y Xk6 es un aminoácido con una cadena lateral aromática; y

(b) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos:

QVQLVQSGAEXhiKKPGASVKXhíSCKASGYTFTDYYINWVXhsQAPG KGLEWlARIYPGSGNTYYNEKFKGRXH4TXH5TAXHfiKSTSTAYMXH7LS SLRSEDX„sAVYFCARGVYYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 11),

en la que Xhi es un aminoácido con una cadena lateral alifática, XH2 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh3 es un aminoácido con una cadena lateral polar o básica, Xh4 es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xhs es un aminoácido con una cadena lateral alifática, Xh6 es un aminoácido con una cadena lateral ácida, Xh7 es un aminoácido con una cadena lateral ácida o de derivación amídica, y Xhs es un aminoácido con una cadena lateral hidroxilo alifática,

inhibiendo el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, la fosforilación de la tirosina de KIT con una CI50 de aproximadamente 600 pM o menor determinada por ELISA, e

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induciendo el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, la internalización del receptor KIT.
2. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 en el que:

(i) Xki es el aminoácido F o S, Xk2 es el aminoácido A o S, Xk3 es el aminoácido T o S, Xk4 es el aminoácido S o P, Xks es el aminoácido D o T, y Xk6 es el aminoácido F o Y;

(ii) Xhi es el aminoácido L o V, XH2 es el aminoácido L o V, Xh3 es el aminoácido K o R, Xh4 es el aminoácido V o A, Xhs es el aminoácido L o I, Xh6 es el aminoácido E o D, Xh7 es el aminoácido Q o E, y Xhs es el aminoácido S o T; o

(iii) Xki es el aminoácido F o S, Xk2 es el aminoácido A o S, Xk3 es el aminoácido T o S, Xk4 es el aminoácido S o P, Xks es el aminoácido D o T, Xk6 es el aminoácido F o Y, Xhi es el aminoácido L o V, Xh2 es el aminoácido L o V, Xh3 es el aminoácido K o R, Xh4 es el aminoácido V o A, Xhs es el aminoácido L o I, Xh6 es el aminoácido E o D, Xh7 es el aminoácido Q o E, y Xhs es el aminoácido S o T.
3. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 2 en el que:

(i) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 88% idéntica a la SEQ ID NO: 8 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4;

(ii) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 84% idéntica a la SEQ ID NO: 10 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 92% idéntica a la SEQ ID NO: 3;

(iii) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 88% idéntica a la SEQ ID NO: 8 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 86% idéntica a la SEQ ID NO: 6;

(iv) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 7 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87% idéntica a la SEQ ID NO: 5;

(v) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 7 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 93% idéntica a la SEQ ID NO: 2;

(vi) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 7 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 92% idéntica a la SEQ ID NO: 3;

(vii) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 7 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4;

(viii) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 7 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 86% idéntica a la SEQ ID NO: 6;

(ix) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 88% idéntica a la SEQ ID NO: 8 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 93% idéntica a la SEQ ID NO: 2;

(x) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 88% idéntica a la SEQ ID NO: 8 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 92% idéntica a la SEQ ID NO: 3;

(xi) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 88% idéntica a la SEQ ID NO: 8 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87% idéntica a la SEQ ID NO: 5;

(xii) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87% idéntica a la SEQ ID NO: 9 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 93% idéntica a la SEQ ID NO: 2;

(xiii) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87% idéntica a la SEQ ID NO: 9 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 92% idéntica a la SEQ ID NO: 3;

(xiv) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87% idéntica a la SEQ ID NO: 9 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4;

(xv) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 9 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87% idéntica a la SEQ ID NO: 5;

(xvi) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 9 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 86% idéntica a la SEQ ID NO: 6;

(xvii) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 84% idéntica a la SEQ ID NO: 10 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 93% idéntica a la SEQ ID NO: 2;

(xviii) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 84% idéntica a la SEQ ID NO: 10 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4;

(xix) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 84% idéntica a la SEQ ID NO: 10 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87% idéntica a la SEQ ID NO: 5; o

(xx) la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 84% idéntica a la SEQ ID NO: 10 y la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 86% idéntica a la SEQ ID NO: 6.
4. Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a una

región D4 del KIT humano, comprendiendo dicho anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo:

(i) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;

(ii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(iii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

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(iv) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 5;

(v) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(vi) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(vii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 4;

(viii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

(ix) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(x) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(xi) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 5;

(xii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(xiii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(xiv) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 4;

(xv) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 5;

(xvi) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

(xvii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(xviii) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 4;

(xix) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 5; o

(xx) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y la aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

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5. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera humana y una región constante de cadena pesada humana.
6. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 5 en el que la región constante de cadena pesada humana es una región constante de cadena pesada gamma humana.
7. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 5 en el que la región constante de cadena ligera humana es una región constante de cadena ligera kappa humana.
8. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 5 en el que la región constante de cadena pesada humana es una región constante de cadena pesada gamma humana y la región constante de cadena ligera humana es una región de cadena ligera kappa humana.
9. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 5-8 en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgG1 humano.
10. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
11. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en el que el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.
12. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en el que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo está fusionado a un polipéptido heterólogo.
13. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en el que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud máxima.
14. Un conjugado que comprende el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 ligado a un agente.

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15. El conjugado de la reivindicación 14 en el que el agente es una toxina.
16. El conjugado de la reivindicación 15 en el que la toxina es abrina, ricina A, exotosina pseudomonas, toxina del cólera o toxina de la difteria.
17. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, o el conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 14-17, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. Un polinucleótido o una combinación de polinucleótidos que comprende secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
19. Un vector o una combinación de vectores que comprende el polinucleótido o la combinación de polinucleótidos de la reivindicación 18.
20. El vector de la reivindicación 19 en el que el vector es un vector de expresión en mamíferos.
21. Una célula anfitriona que comprende el vector de la reivindicación 19 o 20 o el polinucleótido o la combinación de polinucleótidos de la reivindicación 18.
22. Un equipo de reactivos que comprende el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o el conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 14-16.
23. Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, o el conjugado según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 14-16, para ser usado en un método de tratamiento o gestión del cáncer, el asma, una afección inflamatoria o la fibrosis.
24. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para ser usado, o el conjugado para ser usado, de la reivindicación 23, en la que el cáncer es leucemia, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica, cáncer de pulmón, cáncer microcítico de pulmón o tumores estromales gastrointestinales; o el cáncer es refractario al tratamiento con un inhibidor de la tirosina quinasa.
25. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo para ser usado, o el conjugado para ser usado, de la reivindicación 24, en el que el inhibidor de la tirosina quinasa es mesilato de imatinib o SU11248.
26. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo para ser usado, o el conjugado para ser usado, de una cualquiera de las reivindicaciones 23-25 en el que dicho método comprende, además, la administración de un segundo agente terapéutico.
27. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo para ser usado, o el conjugado para ser usado, de la reivindicación 26 en el que dicho segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico, un inhibidor de la histona deacetilasa, un anticuerpo, una citoquina o un inhibidor de la tirosina quinasa.
28. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo para ser usado, o el conjugado para ser usado, de la reivindicación 27 en el que el inhibidor de la tirosina quinasa es mesilato de imatinib o SU11248.
29. Un método in vitro para el diagnóstico de un sujeto con un trastorno asociado con KIT, comprendiendo el método poner las células o la muestra obtenidas del sujeto en contacto con el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, y detectar el nivel de expresión de KIT en las células o la muestra.
30. Un método de creación de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une inmunoespecíficamente a una región D4 del KIT humano, comprendiendo dicho método cultivar y/o expresar el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo usando la célula de la reivindicación 21.
31. El método de la reivindicación 30 que, además, comprende purificar el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, obtenido de dicha célula.

imagen1

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Antígeno D4/D5 del KIT (SEQ ID NO: 14): M1-E33 + V308-H515 (SEQ ID NO: 73) + 5 x His

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248

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40 SO SO

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310 320

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10 20 30

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40 50 60

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251

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40 50 «O

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210 220 230 240 250 250 270 280 280 OSO

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80 00 100

80 90 100

70

76

310 320

aGCACCAAGgTGGAAATCAAA G T K V £ X K i 0 2 a 107

Fig. 31

252

QVQLVQSGAEXH1KKPGASVKXH2SCKASGYTFTDYYINWVXH3QAPGKGLEWIARIYPGSGNTYYNEK] KG RXH4 TXh5 T AXh a KS T S TAYMXH7 LSSLRSEDXHgAVYF C ARGVYYFD YWGQGT TVT VS S

Fig. 4A

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SGSGTDFTLTISSLQXK4EDFAXK5YXksCQQYNSYPRTFGGGTKVEIK

Fig. 4B

253

Unión a D4/D5 del KIT

imagen2

log[Anticuerpo] (M)

imagen3

t CE50Hum8 = 11 pM 1 CE50 Hum4 = 7,5pM A CE50Hum17 = 6,6pM f CE50 Hum10 = 23pM ♦ CE50 quimera = 12pM

254

KIT de CHO-WT

.cu

0 E

<

1

_i

LL

imagen4

[og[Anticuerpo] (nM)

Fig. 6

■ CE50 quimera = 47pM

* CE50Hum17 = 139pM ▼ CE50 Hum8 = 83pM

♦ CE50 Hum4 = 106pM + CE50 Hum10 = 132pM

—I

100

ULA

ro

en

en

Fosforilación del KIT de CHO-WT

imagen5

log[Anticuerpo] (M)

# Cl50quimera

M CI50Hum8 =

A Cl50 Hum10 : w CI50Hum17:

# Cl50 Hum4 =

= 344pM 542pM = 510pM = 510pM 470pM