BRPI0819693A2 - Construção de ligação de antígeno, método para tratar um paciente que sofre de câncer ou uma doença inflamatória, sequência de polinucleotídeo, polinucleotídeo, célula hospedeira transformada ou transfectada recombinante, método para produziruma construção de ligação de antígeno, e, composição farmacêutica - Google Patents

Construção de ligação de antígeno, método para tratar um paciente que sofre de câncer ou uma doença inflamatória, sequência de polinucleotídeo, polinucleotídeo, célula hospedeira transformada ou transfectada recombinante, método para produziruma construção de ligação de antígeno, e, composição farmacêutica Download PDF

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Radha Shah
Michael Steward
Thil Batuwangala
Michael Neil Burden
Stephanie Jane Clegg
Rudolf Maria de Wildt
Jonathan Henry Ellis
Paul Andrew Hamblin
Farhana Hussain
Laurent Jespers
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Abstract

CONSTRUÇÃO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO, MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE CÂNCER OU UMA DOENÇA INFLAMATÓRIA, SEQUÊNCIA DE POLINUCLEOTÍDEO, POLINUCLEOTÍDEO, CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA OU TRANSFECTADA RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA CONSTRUÇÃO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A invenção diz respeito a construções de ligação de antígeno que compreende uma estrutura de proteína que é ligada a um ou mais domínios de ligação de epítopo em que a construção de ligação de antígeno tem pelo menos dois locais de ligação de antígeno, pelo menos um dos quais é de um domínio de ligação de epítopo é pelo menos um dos quais é de um domínio VH/VL em pares, métodos, métodos de realizar tais construções e seus usos.

Description

“CONSTRUÇÃO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO, MÉTODO PARA
TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE CÂNCER OU UMA DOENÇA INFLAMATÓRIA, SEQUÊNCIA DE POLINUCLEOTÍDEO, POLINUCLEOTÍDEO, CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA OU 5 TRANSFECTADA RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA CONSTRUÇÃO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA” Fundamentos Os anticorpos são bem conhecidos para o uso em aplicações terapêuticas. Os anticorpos são glicoproteínas heteromultiméricas que compreendem pelo menos duas cadeias pesadas e duas leves. Com a exceção de IgM, os anticorpos intactos são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150 Kda, compostas de duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Tipicamente, cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de bissulfeto covalente enquanto o número de ligação de bissulfeto entre as cadeias pesadas de isótipos de imunoglobulina diferentes varia. Cada cadeia pesada e leve também têm pontes de bissulfeto intracadeia. Cada cadeia pesada tem, em uma extremidade, um domínio variável (VH) seguido por diversas regiões constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável (VL) e uma região constante em sua outra extremidade; a região constante da cadeia leve é alinhada com uma primeira região constante da cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve é alinhado com um domínio variável de cadeia pesada. As cadeias leves de anticorpos da maioria das espécies de vertebrados podem ser designadas a um de dois tipos denominados Capa e Lambda com base na sequência de aminoácido de uma região constante. Dependendo da sequência de aminoácido de uma região constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos humanos podem ser designados a cinco classes diferentes, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
IgG e IgA ainda podem ser subdivididos em subclasses, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 e IgA1 e IgA2. As espécies variantes existem com o camundongo e o rato tendo pelo menos IgG2a, IgG2b.
O domínio variável do anticorpo confere especificidade de ligação ao anticorpo com certas regiões 5 apresentando variabilidade particular denominada regiões determinantes de complementaridade (CDRs). As porções mais conservadas da região variável são denominadas Regiões de estrutura (FR). Os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves intactas cada um compreendendo quatro FRs conectadas pelos três CDRs.
Os CDRs em cada cadeia são mantidos juntos em proximidade pelas compacta pelas regiões de FR e com os CDRs da outra cadeia contribuindo para a formação do local de ligação de antígeno de anticorpos.
As regiões constantes não estão diretamente envolvidas na ligação do anticorpo ao antígeno mas apresenta várias funções atuadoras, tais como participação na citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose por intermédio da ligação ao receptor Fcγ, taxa de vida média/liberação por intermédio do receptor Fc neonatal (FcRn) e citotoxicidade dependente complementar por intermédio do componente C1q da cascata complementar.
A natureza da estrutura de um anticorpo de IgG é tal que existem dois locais de ligação de antígeno, ambos os quais são específicos para o mesmo epítopo.
Estes são, portanto, monoespecíficos.
Um anticorpo biespecífico é um anticorpo tendo especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes.
Os métodos de fabricar tais anticorpos são conhecidos na técnica.
Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos está fundamentada na expressão de dois pares de cadeia H – cadeia L de imunoglobulina, onde as duas cadeias H têm especificidades de ligação diferentes ver Millstein et al, Nature 305 537-539 (1983), WO93/08829 e Traunecker et al EMBO, 10, 1991, 3655-3659. Por causa da classificação aleatória de cadeias H e L, uma mistura potencial de dez estruturas de anticorpo diferentes é produzida, das quais apenas uma tem a especificidade de ligação desejada.
Um método alternativo envolve fundir os domínios variáveis com as especificidades de ligação desejadas to cadeia 5 pesada região constante que compreende pelo menos parte da região de articulação, regiões CH2 e CH3. É preferido ter a região de CH1 contendo o local necessário para a ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões.
O DNA que codifica estas fusões e, se desejado, a cadeia L são inseridos nos vetores de expressão separados e são então cotransfectados em um organismo hospedeiro adequado.
Isto é possível, embora insira as sequências codificadoras nas duas ou todas as três cadeias em um vetor de expressão.
Em um método, um anticorpo biespecífico é composto de uma cadeia H com uma primeira especificidade de ligação em um membro e em um par de cadeia de H-L, fornecendo uma segunda especificidade de ligação no outro membro, ver WO94/04690. Também ver Suresh et al Methods in Enzymology 121, 210, 1986. Outros métodos incluem as moléculas de anticorpo que compreendem locais de ligação de domínio simples que são apresentados no WO2007/095338. Sumário da Invenção A presente invenção diz respeito a uma construção de ligação de antígeno que compreende uma estrutura de proteína que é ligada a um ou mais domínios de ligação de epítopo em que a construção de ligação de antígeno tem pelo menos dois locais de ligação de antígeno pelo menos um dos quais é de um domínio de ligação de epítopo é pelo menos um dos quais é de um domínio VH/VL em pares.
A invenção ainda diz respeito a construções de ligação de antígeno que compreende pelo menos um homodímero que compreende duas ou mais estruturas da fórmula I:
em que X representa uma região de anticorpo constante que compreende domínio pesado constante 2 e domínio pesado constante 3; R1, R4 , R7 e R8 representam um domínio independentemente 5 selecionado de um domínio de ligação de epítopo; R2 representa um domínio selecionado do grupo que consiste de cadeia pesada constante 1 e um domínio de ligação de epítopo; R3 representa um domínio selecionado do grupo que consiste de um domínio de VH em pares e um de ligação de epítopo; R5 representa um domínio selecionado do grupo que consiste de um domínio de cadeia leve constante e um de ligação de epítopo; R6 representa um domínio selecionado do grupo que consiste de um domínio VL em pares e um de ligação de epítopo; n representa um número inteiro independentemente selecionado de: 0, 1, 2, 3 e 4; m representa um número inteiro independentemente selecionado de: 0 e 1, em que os domínios de cadeia pesada constante 1 e os domínios de cadeia leve constantes são associados; em que pelo menos um domínio de ligação de epítopo está presente;
e quando R3 representa um domínio VH em pares, R6 representa um domínio VL em pares, de modo que os dois domínios são, juntos, capazes de, ligar o antígeno.
A invenção diz respeito a estruturas com base em IgG que 5 compreendem anticorpos monoclonais ou fragmentos ligados a um ou mais anticorpos de domínio e a métodos de realizar tais construções e seus usos, particularmente usos na terapia.
A invenção também fornece uma sequência de polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada de qualquer uma das construções de ligação de antígeno descritas neste e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve de qualquer uma das construções de ligação de antígeno descritas neste.
Tais polinucleotídeos representam a sequência codificadora que corresponde às sequências de polipeptídeo equivalentes, entretanto será entendido que tais sequências de polinucleotídeo podem ser clonadas em um vetor de expressão junto com um códon de partida, uma sequência sinalizadora apropriada e um códon de interrupção.
A invenção também fornece uma célula hospedeira transformada ou transfectada recombinante que compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam a cadeia pesada e uma cadeia leve de qualquer uma das construções de ligação de antígeno descritas neste.
A invenção ainda fornece um método para a produção de qualquer uma das construções de ligação de antígeno descritas neste cujo método compreende a etapa de cultivar uma célula hospedeira que compreende um primeiro e um segundo vetor, o dito primeiro vetor que compreende a polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada de qualquer uma das construções de ligação de antígeno descritas neste e o dito segundo vetor que compreende a polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve de qualquer uma das construções de ligação de antígeno descritas neste, em um meio de cultura isento de soro.
A invenção ainda fornece uma composição farmacêutica que compreende uma construção de ligação de antígeno como descrito neste um carregador farmaceuticamente aceitável.
A invenção também fornece um anticorpo de domínio que 5 compreende ou consiste da sequência de polipeptídeo apresentada na SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 3. Em um aspecto, a invenção fornece uma proteína que é expressada a partir da sequência de polinucleotídeo apresentada na SEQ ID N°: 60 ou SEQ ID N°: 61. Definições O termo ‘Estrutura de Proteína’ como usado neste inclui mas não limita-se a uma estrutura de imunoglobulina (Ig), por exemplo, uma estrutura de IgG, que pode ser um anticorpo e quatro cadeias ou de duas cadeias ou que pode compreender apenas a Região Fc de um anticorpo ou que pode compreender um ou mais regiões constantes de um anticorpo, cujas regiões constantes podem ser de origem humana ou primata ou que pode ser uma quimera artificial de regiões constantes humanas ou primatas.
Tais estruturas de proteína podem compreender locais de ligação de antígeno além de uma ou mais regiões constantes, por exemplo, onde a estrutura de proteína compreende um IgG total.
Tais estruturas de proteína serão capazes de serem ligadas a outros domínios de proteína, por exemplo, domínios de proteína que têm locais de ligação de antígeno, por exemplo, domínios de ligação de epítopo ou domínios ScFv.
Um “domínio” é uma estrutura de proteína dobrada que tem estrutura terciária independente do resto da proteína.
Em geral, os domínios são responsáveis pelas propriedades funcionais distintas de proteína e em muitos casos podem ser adicionadas, removidas ou transferidas a outras proteínas de uma perda da função do remanescente da proteína e/ou do domínio.
Um “domínio variável de anticorpo simples” é um domínio de polipeptídeo dobrado que compreende sequências características de domínios variáveis de anticorpo.
Portanto, este inclui domínios variáveis de anticorpo completos e domínios variáveis modificados, por exemplo, em que um ou mais arcos foram substituídos por sequências que não são características de domínios variáveis de anticorpo ou domínios variáveis de anticorpo que 5 foram truncados ou compreendem extensões de terminal N ou C, bem como fragmentos dobrados de domínios variáveis que retêm pelo menos a atividade de ligação e a especificidade do domínio de comprimento total.
A frase “domínio variável simples de imunoglobulina” refere- se a um domínio variável de anticorpo (VH, VHH, VL) que liga especificamente um antígeno ou epítopo independentemente de uma região ou domínio V diferentes.
Um domínio variável simples de imunoglobulina pode estar presente em um formato (por exemplo, homo- ou hetero-multímero) com outras regiões variáveis ou domínios variáveis diferentes onde as outras regiões ou domínios não são requeridos para a ligação de antígeno pelo domínio variável de imunoglobulina simples (isto é, onde o domínio variável simples de imunoglobulina liga o antígeno independentemente dos domínios variáveis adicionais). Um “anticorpo de domínio” ou “dAb” é o mesmo como um “domínio variável simples de imunoglobulina” que é capaz de ligar a um antígeno assim como o termo é usado neste.
Um domínio variável simples de imunoglobulina pode ser um domínio variável de anticorpo humano, mas também inclui domínios variáveis de anticorpo simples de outras espécies, tais como dAbs de VHH de roedor (por exemplo, como divulgado no WO 00/29004), tubarão lixa e Camelídeo.
O VHH de Camelídeo são polipeptídeos de domínio variável simples de imunoglobulina que são derivados de espécies incluindo camelo, lhama, alpaca, dromedário e guanaco, que produz anticorpos de cadeia pesada naturalmente desprovidos de cadeias leves.
Tais domínios VHH podem ser humanizados de acordo com as técnicas padrão disponíveis na técnica, e tais domínios ainda são considerados serem “anticorpos de domínio” de acordo com a invenção.
Como usado neste “VH inclui domínios VHH de camelídeo.
Os NARV são um outro tipo de domínio variável simples de imunoglobulina que foram identificados em peixes cartilaginosos incluindo o tubarão lixa.
Estes também são conhecidos como as Novas regiões variáveis de receptor de antígeno (comumente abreviados 5 como V(NAR) ou NARV). Para detalhes adicionais ver Mol.
Immunol. 44, 656-665 (2006) e US20050043519A.
O termo “Domínio de ligação de epítopo” refere-se a um domínio que liga especificamente um antígeno ou epítopo independentemente de uma região ou domínio V diferentes, este pode ser um anticorpo de domínio (dAb), por exemplo, um domínio variável simples de imunoglobulina humano, de camelídeo ou de tubarão ou este pode ser um domínio que é um derivado de uma estrutura selecionada do grupo que consiste de CTLA-4 (Evicorpo); lipocalina; moléculas derivadas de Proteína A, tais como domínio Z de Proteína A (Aficorpo, SpA), domínio A (Avímero/Maxicorpo); Proteínas de choque por calor tal como GroEl e GroES; transferrina (trans-corpo); proteína de repetição de ancirina (DARPin); aptâmero de peptídeo; domínio de lecitina tipo C (Tetranectina); y-cristalina humana e ubiquitina humana (afilinas); domínios PDZ; domínios tipo toxina kunitz de escorpião de inibidores da protease humana e fibronectina (adnectina); que foi submetido ao projeto de proteína a fim de obter ligação a outro ligando que não o ligando natural.
O CTLA-4 (antígeno associado ao linfócito de célula T 4) é um receptor de família CD28 expressado principalmente em células CD4+ T.
Seu domínio celular tem uma dobra de Ig semelhante ao domínio variável.
O arcos correspondentes aos CDRs de anticorpos podem ser substituídos por sequência heteróloga para conferir propriedades de ligação diferentes.
As moléculas de CTLA-4 projetadas para ter especificidades de ligação diferentes também são conhecidos como Evicorpos.
Para detalhes adicionais ver Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)
As lipocalinas são uma família de proteínas extracelulares que transportam moléculas hidrofóbicas pequenas, tais como esteróides, bilinas, retinóides e lipídeos.
Estes têm uma estrutura secundária rígida de lâmina β com diversos arcos na extremidade aberta da estrutura cônica que pode ser 5 projetado para a ligação de antígenos alvo diferentes.
As anticalines estão entre 160 e 180 de tamanho e são derivados de lipocalinas.
Para detalhes adicionais ver Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 e US20070224633 Um Aficorpo é uma estrutura derivada de uma Proteína A de Staphylococcus aureus que pode ser projetado para a ligação ao antígeno.
O domínio consiste de um feixe de três hélices de aproximadamente 58 aminoácidos.
As bibliotecas foram geradas pela aleatorização de resíduos de superfície.
Para detalhes adicionais ver Protein Eng.
Des.
Sel. 17, 455-462 (2004) e EP1641818A1 Os avímeros são proteínas de domínio múltiplo derivados da família de estrutura de domínio A. os domínios naturais de aproximadamente 35 aminoácidos adotam uma estrutura ligada por bissulfeto definida.
A diversidade é gerada pela mistura da variação natural apresentada pela família de domínios A. para detalhes adicionais ver Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) and Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909- 917 (junho de 2007) A transferrina é uma glicoproteína de transporte de soro monomérico.
As transferrinas podem ser projetadas para a ligação de antígenos alvo diferentes pela inserção de sequências de peptídeo em um arco de superfície permissivo.
Os exemplos de estruturas de transferrina projetada incluem o Trans-corpo.
Para detalhes ver J.
Biol.
Chem 274, 24066-24073 (1999). As proteínas de repetição de ancirinas projetadas (DARPins) são derivadas de Ancirina que é uma família de proteínas que mediam a ligação de proteínas de membrana integrais ao citoesqueleto.
Uma repetição de ancirina simples é um motivo de 33 resíduos que consistem de duas α- hélices e uma rotação β.
Estes podem ser projetados para a ligação de antígenos alvo diferentes pelos resíduos de aleatorização na primeira α-hélice 5 e uma rotação β de cada repetição.
A interface de ligação pode ser aumentada aumentando-se o número de módulos (um método de maturação por afinidade). Para detalhes adicionais ver J.
Mol.
Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) e J.
Mol.
Biol. 369, 1015-1028 (2007) e US20040132028A1. As Fibronectinas são uma estrutura que pode ser projetada para a ligação ao antígeno.
As adnectinas consistem de uma estrutura da sequência de aminoácido natural do 10° domínio das 15 unidades de repetição da fibronectina humana tipo III (FN3). Três arcos em uma extremidade aberta do β-sanduíche podem ser projetados para permitir que uma Adnectina reconheça especificamente um alvo terapêutico de interesse.
Para detalhes adicionais ver Protein Eng.
Des.
Sel. 18, 435-444 (2005), US20080139791, WO2005056764 e US6818418B1. Os aptâmeros de peptídeo são moléculas de reconhecimento combinatório que consistem de uma proteína de estrutura constante, tipicamente tioredoxina (TrxA) que contém um arco de peptídeo variável confinado no local ativo.
Para detalhes adicionais ver Expert Opin.
Biol.
Ther. 5, 783-797 (2005). Os microcorpos são derivados de microproteínas de ocorrência natural de 25 a 50 aminoácidos de comprimento que contém de 3 a 4 pontes de cisteína - os exemplos de microproteínas incluem KalataB1 e conotoxina e knottinas.
As microproteínas tem um arco que pode ser projetado para incluir até 25 aminoácidos sem afetar a dobra total da microproteína.
Para detalhes adicionais de domínios de knottina projetados, ver WO2008098796. Outros domínios de ligação de epítopo incluem proteínas que foram usadas como uma estrutura para projetar propriedades de ligação de antígeno diferentes incluem γ-cristalina humana e ubiquitina humana (afilinas), domínios tipo kunitz de inibidores da protease humana, domínios PDZda proteína de ligação de Ras AF-6, toxinas de escorpião (caribdotoxina), 5 domínio de lecitina tipo C (tetranectinas) são revistos no capítulo 7 - Non- Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dube!) e Protein Science 15:14-27 (2006). Os domínios de ligação de epítopo da presente invenção podem ser derivados de quaisquer domínios de proteína alternativos.
Como usado neste, os termos “domínio de VH em pares”, “domínio VL em pares” e “domínios VH/VL em pares” refere-se a domínios variáveis de anticorpo que ligam especificamente o antígeno apenas quando em pares com seu domínio variável parceiro.
Sempre existe um VH e um VL em qualquer par e o termo “domínio VH em pares” refere-se ao parceiro VH, o termo “domínio VL em pares” refere-se ao parceiro VL e o termo “domínios VH/VL em pares” refere-se aos dois domínios juntos.
Em uma forma de realização da invenção, o local de ligação de antígeno liga o antígeno com um Kd de pelo menos 1 mM, por exemplo, um Kd de 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200pM, 100pM, a cada antígeno medido por BiacoreTM, tal como o método BiacoreTM como descrito nos métodos 4 ou 5. Como usado neste, o termo “local de ligação de antígeno” refere-se a um local em uma construção que é capaz de ligar-se especificamente ao antígeno, este pode ser um domínio simples, por exemplo, um domínio de ligação de epítopo ou este pode ser domínios VH/VL em pares como pode ser observado em um anticorpo padrão.
Em alguns aspectos da invenção domínios Fv de cadeia simples (ScFv) podem fornecer locais de ligação de antígeno.
Os termos “mAb/dAb” e dAb/mAb” são usados neste para referir-se à construções de ligação de antígeno da presente invenção.
Os dois termos podem ser usados de maneira intercambeável e são pretendidos ter o mesmo significado como usado neste.
O termo “cadeia pesada constante 1” é usado neste para referir-se ao domínios CH1 de uma cadeia pesada de imunoglobulina. 5 O termo “cadeia leve constante” é usado aqui para referir-se ao domínio constante de uma cadeia leve de imunoglobulina.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção diz respeito a uma construção de ligação de antígeno que compreende uma estrutura de proteína que é ligada a um ou mais domínios de ligação de epítopo em que a construção de ligação de antígeno tem pelo menos dois locais de ligação de antígeno pelo menos um dos quais é de um domínio de ligação de epítopo é pelo menos um dos quais é de um domínio VH/VL em pares.
Tais construções de ligação de antígeno compreendem uma estrutura de proteína, por exemplo, uma estrutura de Ig, tal como IgG, por exemplo, um anticorpo monoclonal, que é ligado a um ou mais domínios de ligação de epítopo, por exemplo, um anticorpo de domínio, em que a construção de ligação tem pelo menos dois locais de ligação de antígeno, pelo menos um dos quais é de um domínio de ligação de epítopo e a métodos de produzir e seus usos, particularmente usos na terapia.
Alguns dos exemplos de construções de ligação de antígeno de acordo com a invenção são apresentados na Figura 1. As construções de ligação de antígeno da presente invenção também podem ser referidos como mAbdAbs.
Em uma forma de realização, a estrutura de proteína de uma construção de ligação de antígeno da presente invenção é uma estrutura de Ig, por exemplo, uma estrutura de IgG ou estrutura de IgA.
A estrutura de IgG pode compreender todos os domínios de um anticorpo (isto é, CH1, CH2, CH3, VH, VL). A construção de ligação de antígeno da presente invenção podem compreender uma estrutura de IgG selecionada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou IgG4PE.
A construção de ligação de antígeno da presente invenção tem pelo menos dois locais de ligação de antígeno, por exemplos, tem dois locais 5 de ligação, por exemplo, onde o primeiro local de ligação tem especificidade quanto a um primeiro epítopo ou um antígeno e um segundo local de ligação tem especificidade quanto a um segundo epítopo no mesmo antígeno.
Em uma outra forma de realização existem 4 locais de ligação de antígeno ou 6 locais de ligação de antígeno ou 8 locais de ligação de antígeno ou 10 ou mais locais de ligação de antígeno.
Em uma forma de realização a construção de ligação de antígeno tem especificidade para mais do que um antígeno, por exemplo, dois antígenos ou para os três antígenos ou para os quatro antígenos.
Em um outro aspecto a invenção diz respeito a uma construção de ligação de antígeno que compreende pelo menos um homodímero que compreende duas ou mais estruturas da fórmula I:
em que X representa uma região de anticorpo constante que compreende domínio pesado constante 2 e domínio pesado constante 3; R1, R4 , R7 e R8 representa um domínio independentemente selecionado de um domínio de ligação de epítopo;
R2 representa um domínio selecionado do grupo que consiste de cadeia pesada constante 1 e um domínio de ligação de epítopo; R3 representa um domínio selecionado do grupo que consiste de um domínio de VH em pares e um de ligação de epítopo; 5 R5 representa um domínio selecionado do grupo que consiste de um domínio de cadeia leve constante e um de ligação de epítopo; R6 representa um domínio selecionado do grupo que consiste de um Domínio VL em pares e um de ligação de epítopo; n representa um número inteiro independentemente selecionado de: 0, 1, 2, 3 e 4; m representa um número inteiro independentemente selecionado de: 0 e 1, em que os domínios de cadeia pesada constante 1 e de cadeia leve constante estão associados; em que pelo menos um domínio de ligação de epítopo está presente; e quando R3 representa um domínio VH em pares, R6 representa um Domínio VL em pares, de modo que os dois domínios são, juntos, capazes de, ligar o antígeno.
Em uma forma de realização R6 representa um VL em pares e R3 representa um VH em pares.
Em uma outra forma de realização um ou ambos de R7 e R8 representam um domínio de ligação de epítopo.
Ainda em uma outra forma de realização um ou ambos de R1 e R4 representam um domínio de ligação de epítopo.
Em uma forma de realização R4 está presente.
Em uma forma de realização R1, R7 e R8 representa um domínio de ligação de epítopo.
Em uma forma de realização R1 R7 e R8, e R4 representam um domínio de ligação de epítopo.
Em uma forma de realização (R1)n, (R2)m, (R4)m e (R5)m, = 0, isto é, não estão presentes, R3 é um domínio VH em pares, R6 é um Domínio VL em pares, R8 é um VH dAb, e R7 é um VL dAb. 5 Em uma outra forma de realização (R1)n, (R2)m, (R4)m e (R5)m, são 0, isto é, não estão presentes, R3 é um domínio VH em pares, R6 é um Domínio VL em pares, R8 é um VH dAb e (R7)m, = 0 isto é, não presentes.
Em uma outra forma de realização (R2)m, e (R5)m, são 0, isto é, não estão presentes, R1 é um dAb, R4 é um dAb, R3 é um domínio VH em pares, R6 é um Domínio VL em pares, (R8)m e (R7)m, = 0 isto é, não presentes.
Em uma forma de realização da presente invenção o domínio de ligação de epítopo é um dAb.
Será entendido que qualquer uma das construções de ligação de antígeno descritas neste serão capazes de neutralizar um ou mais antígenos.
O termo “neutralizar” e suas variações gramaticais como usado por toda a presente especificação em relação às construções de ligação de antígeno da invenção significa que uma atividade biológica do alvo é reduzida, total ou parcialmente, na presença das construções de ligação de antígeno da presente invenção em comparação com a atividade do alvo na ausência de tais construções de ligação de antígeno.
A neutralização pode ocorrer devido a, mas não limitado, a um ou mais de bloqueio de ligação de ligando, prevenção da ativação de ligando do receptor, sub-regulação do receptor ou afetação da funcionalidade atuadora.
Os níveis de neutralização podem ocorrer de diversas maneiras, por exemplo, pelo uso de qualquer um dos ensaios como apresentado nos exemplos e métodos abaixo, por exemplo, em um ensaio que mede a inibição da ligação de ligando ao receptor que pode ser realizado, por exemplo, como descrito em qualquer um dos Métodos 12, 19 ou 21 ou Exemplo 32. A neutralização de VEGF, IL-4, IL-13 ou HGF nestes ensaios é medida pela estimativa da ligação diminuída entre o ligando e seu receptor na presença de construção de ligação de antígeno de neutralização.
Os níveis de neutralização também podem ser medidos, por exemplo, em um ensaio TF1 que pode ser realizado, por exemplo, como 5 descrito no Método 8, 9, 10, 20 ou 21. A neutralização de IL-13, IL-4 ou ambas estas citocinas neste ensaio é medida pela estimativa da inibição da proliferação de célula TF1 na presença de construção de ligação de antígeno de neutralização.
Alternativamente, a neutralização pode ser medida em um ensaio de fosforilação que pode ser realizado, por exemplo, como descrito no Método 13. A neutralização de EGFR neste ensaio é medida pela estimativa da inibição da fosforilação da tirosina quinase do receptor na presença de construção de ligação de antígeno de neutralização.
Ou, a neutralização pode ser medida em um ensaio de secreção de IL-8 em células MRC-5 que podem ser realizada, por exemplo, como descrito no Método 14 ou 15. A neutralização de TNFα ou IL-1 R1 neste ensaio é medida pela estimativa da inibição da secreção de IL-8 na presença de construção de ligação de antígeno de neutralização.
Outros métodos de estimar a neutralização, por exemplo, pela estimativa da ligação diminuída entre o ligando e seu receptor na presença de construção de ligação de antígeno de neutralização são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaios BiacoreTM.
Em um aspecto alternativo da presente invenção, são fornecidas construções de ligação de antígeno que têm pelo menos atividade neutralizadora substancialmente equivalente aos anticorpos exemplificados neste, por exemplo, construções de ligação de antígeno que retêm a atividade neutralizadora de 586H-TVAAPS-210 ou PascoH-G4S-474 ou PascoH-474, PascoH-474 GS removido, PascoL-G4S-474 ou PascoHL-G4S-474 no ensaio de proliferação de célula TF1 ou inibição do ensaio de sinalização de pSTAT6 como apresentado nos Exemplos 4 e 20 respectivamente ou, por exemplo,
construções de ligação de antígeno que retêm a atividade neutralizadora de BPC1603, BPC1604, BPC1605, BPC1606 no ensaio de ligação de VEGFR ou inibição da fosforilação do receptor de IGF-1 R como apresentado na Exemplos 14.6 e 14.7. 5 As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a IL-13, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a IL-13 ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a IL-13. A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a IL-13. A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a IL-13. Em uma forma de realização a construção de ligação de antígeno da presente invenção tem especificidade para mais do que um antígeno, por exemplo, quando este é capaz de ligar dois ou mais antígenos selecionados de IL-13, IL-5 e IL-4, por exemplo, quando este é capaz de ligar IL-13 e IL-4 ou onde este é capaz de ligar IL-13 e IL-5 ou onde este é capaz de ligar IL-5 e IL-4. Em uma forma de realização a construção de ligação de antígeno da presente invenção tem especificidade para mais do que um antígeno, por exemplo, quando este é capaz de ligar dois ou mais antígenos selecionados de IL-13, IL-5 e IL-4, por exemplo, onde este é capaz de ligar IL-13 e IL-4 simultaneamente ou onde este é capaz de ligar IL-13 e IL-5 simultaneamente ou onde este é capaz de ligar IL-5 e IL-4 simultaneamente.
Será entendido que qualquer uma das construções de ligação de antígeno descritas neste podem ser capazes de ligar dois ou mais antígenos simultaneamente, por exemplo, como determinado pela análise de estequiometria usando-se um ensaio adequado, tal como aquele descrito na seção de Exemplos, método 7. Os exemplos de construções de ligação de antígeno da invenção incluem anticorpos IL-3 que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para IL-4, por exemplo, um dAb anti-IL-4, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve, por exemplo, o mAbdAb tendo a sequência de cadeia pesada 5 apresentada na SEQ ID N°: 16 a 39, SEQ ID N°: 41 a 43, SEQ ID N°: 87 a 90, SEQ ID N°: 151, SEQ ID N°: 152 ou SEQ ID N°: 155. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-3 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-3 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-3 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-3 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia leve. tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve.
Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos IL-4 que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para IL-13, por exemplo, um dAb anti-IL-13, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve, por exemplo, o mAbdAb tendo a sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID N°: 48 a 53, SEQ ID N°: 91 SEQ ID N°: 92, SEQ ID N°: 149, SEQ ID N°: 150, ou SEQ ID N°: 157 a 160 e/ou a sequência de cadeia leve apresentada na SEQ ID N°: 54 a 59. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-4 com um domínio de ligação de epítopo de IL-13 ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-4 com um domínio de ligação de epítopo de IL-13 ligado ao terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-4 com um 5 domínio de ligação de epítopo IL-13 ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-4 com um domínio de ligação de epítopo de IL-13 ligado ao terminal c da cadeia leve.
Tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligada ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve.
Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos IL-3 que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para IL-5, por exemplo, um dAb anti-IL-5, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-3 com um domínio de ligação de epítopo de IL-5 ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-3 com um domínio de ligação de epítopo de IL-5 ligado ao terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-3 com um domínio de ligação de epítopo de IL-5 ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-3 com um domínio de ligação de epítopo de IL-5 ligado ao terminal c da cadeia leve.
Tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve.
Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos IL-5 que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para IL-13, por exemplo, um dAb anti-IL-13, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve, por exemplo, o mAbdAb tendo a sequência de cadeia leve 5 apresentada na SEQ ID N°: 72. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo de IL-13 ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo de IL-13 ligado ao terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo de IL-13 ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo de IL-13 ligado ao terminal c da cadeia leve.
Tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve.
Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos IL-4 que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para IL-5, por exemplo, um dAb anti-IL-5, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve.. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-4 com um domínio de ligação de epítopo de IL-5 ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-4 com um domínio de ligação de epítopo de IL-5 ligado ao terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-4 com um domínio de ligação de epítopo de IL-5 ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-4 com um domínio de ligação de epítopo de IL-5 ligado ao terminal c da cadeia leve. tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade 5 de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve.
Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos IL-5 que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para IL-4, por exemplo, um dAb anti-IL-4, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve, por exemplo, o mAbdAb tendo a sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID N°: 71. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia leve.
Tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve.
A invenção também fornece uma construção de ligação tri- específica que é capaz de ligar-se a IL-4, IL-13 e IL-5. Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos IL-5 que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para IL-4, por exemplo, um dAb anti-IL-4, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve e um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para IL-13, por exemplo, um dAb anti-IL-13, ligado ao terminal c ou ao terminal n da 5 cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia pesada e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia pesada e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal c da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia pesada e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia leve e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal c da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia leve e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia leve e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia pesada e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal c da cadeia leve. 5 As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia pesada e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia pesada e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia leve e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia leve e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-5 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia leve e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal n da cadeia leve.
Tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a IL-18, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a IL-18 ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a IL-18. A construção de ligação de antígeno pode compreender um 5 anticorpo que é capaz de ligar-se a IL-18. A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a IL-18. A invenção também fornece uma construção de ligação tri- específica que é capaz de ligar-se a IL-4, IL-13 e IL-18. Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos IL-18 que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para IL-4, por exemplo, um dAb anti-IL-4, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve e um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para IL-13, por exemplo, um dAb anti-IL-13, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-18 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia pesada e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-18 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia pesada e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal c da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-18 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia pesada e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-18 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia leve e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal c da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-18 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado 5 ao terminal n da cadeia leve e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-18 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal n da cadeia leve e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-18 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia pesada e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal c da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-18 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia pesada e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-18 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia pesada e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-18 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia leve e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-18 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia leve e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL-18 com um domínio de ligação de epítopo IL-4 ligado ao terminal c da cadeia leve e um domínio de ligação de epítopo de IL-3 5 ligado ao terminal n da cadeia leve.
Tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a TNFα, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a TNFα ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a TNFα.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a TNFα.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a TNFα.
Em uma forma de realização a construção de ligação de antígeno da presente invenção tem especificidade para mais do que um antígeno, por exemplo, quando este é capaz de ligar dois ou mais antígenos selecionados de TNFα, EGFR e VEGF, por exemplo, onde este é capaz de ligar TNFα e EGFR ou onde este é capaz de ligar TNFα e VEGF ou onde este é capaz de ligar EGFR e VEGF.
Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos de TNFα que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para EGFR, por exemplo, um dAb anti-EGFR, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve, por exemplo, um mAbdAb tendo a sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID N°: 74 e/ou a sequência de cadeia leve apresentada na SEQ ID N°: 79. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos de TNFα com um EGFR domínio de ligação de epítopo ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos de TNFα com um EGFR domínio de ligação de epítopo ligado ao terminal n da cadeia leve.
As construções de 5 ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos de TNFα com um EGFR domínio de ligação de epítopo ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos de TNFα com um EGFR domínio de ligação de epítopo ligado ao terminal c da cadeia leve.
Tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos EGFR com um domínio de ligação de epítopo de TNFα ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos EGFR com um domínio de ligação de epítopo de TNFα ligado ao terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos EGFR com um domínio de ligação de epítopo de TNFα ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos EGFR com um domínio de ligação de epítopo de TNFα ligado ao terminal c da cadeia leve.
Tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve.
Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos de TNFα que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para VEGF, por exemplo, um dAb anti-VEGF, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve, por exemplo, um mAbdAb tendo a sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID N°: 75, 78 ou 185. A construção de ligação de antígeno da presente invenção pode ter especificidade para mais do que um antígeno, por exemplo, onde este 5 é capaz de ligar TNFα e um ou ambos antígenos selecionados de IL-4 e IL- 13, por exemplo, onde este é capaz de ligar TNFα e IL-4 ou onde este é capaz de ligar TNFα e IL-13 ou onde este é capaz de ligar TNFα e IL-13 e IL-4. Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos IL-3 que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para TNFα, por exemplo, uma adnectina anti-TNFα, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve, por exemplo, um mAbdAb tendo a sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID N°: 134 ou 135. Outros exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos IL-4 que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para TNFα, por exemplo, uma adnectina anti-TNFα, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve, por exemplo, um mAbdAb tendo a sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID N°: 146 ou 147. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos de TNFα com um VEGF domínio de ligação de epítopo ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos de TNFα com um VEGF domínio de ligação de epítopo ligado ao terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos de TNFα com um VEGF domínio de ligação de epítopo ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígenos da presente invenção incluem anticorpos de TNFα com um VEGF domínio de ligação de epítopo ligado ao terminal c da cadeia leve. tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos VEGF com um domínio de ligação de epítopo de TNFa 5 ligado ao terminal n da cadeia pesada. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos VEGF com um domínio de ligação de epítopo de TNFα ligado ao terminal n da cadeia leve. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos VEGF com um domínio de ligação de epítopo de TNFα ligado ao terminal c da cadeia pesada. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos VEGF com um domínio de ligação de epítopo de TNFα ligado ao terminal c da cadeia leve. Tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve. As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a CD-20, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a CD- 20 ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a CD-20. A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a CD-20, por exemplo, isto pode compreender um anticorpo tendo uma sequência de cadeia pesada e de cadeia leve de SEQ ID N°: 120 e
117. A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a CD-20. Os exemplos de mAbdAbs com especificidade para CD-20 são aqueles tendo a sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID N°: 116, 118 ou aqueles tendo a sequência de cadeia leve apresentada na SEQ ID N°: 119 ou 121. Tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a IL1 R1, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a IL1 5 R1 ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a IL1 R1. A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a IL1 R1. A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a IL1 R1. Em uma forma de realização a construção de ligação de antígeno da presente invenção tem especificidade para mais do que um antígeno, por exemplo, onde este é capaz de ligar IL1 R1 e um segundo antígeno, por exemplo, onde este é capaz de ligar IL1 R1 e VEGF.
Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos IL1 R1 que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para VEGF, por exemplo, um dAb anti-VEGF dAb, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve, por exemplo, um mAbdAb tendo a sequência de cadeia leve apresentada na SEQ ID N°: 77. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL1 R1 com um VEGF domínio de ligação de epítopo ligado ao terminal n da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL1 R1 com um VEGF domínio de ligação de epítopo ligado ao terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL1 R1 com um VEGF domínio de ligação de epítopo ligado ao terminal c da cadeia pesada.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos IL1 R1 com um VEGF domínio de ligação de epítopo ligado ao terminal c da cadeia leve. tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos VEGF com um domínio de ligação de epítopo IL1 R1 5 ligado ao terminal n da cadeia pesada. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos VEGF com um domínio de ligação de epítopo IL1 R1 ligado ao terminal n da cadeia leve. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos VEGF com um domínio de ligação de epítopo IL1 R1 ligado ao terminal c da cadeia pesada. As construções de ligação de antígeno da presente invenção incluem anticorpos VEGF com um domínio de ligação de epítopo IL1 R1 ligado ao terminal c da cadeia leve. tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve. As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a EGFR, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a EGFR ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a EGFR. A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a EGFR. A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a EGFR. Alguns exemplos de tal construção de ligação de antígeno serão capazes de ligar a um epítopo em EGFR que compreende SEQ ID N°: 103, por exemplo, uma construção de ligação de antígeno que compreende um ou mais dos CDRs apresentados na SEQ ID N°: 97 até a SEQ ID N°: 102 e SEQ ID N°: 104 até a SEQ ID N°:
107. Em uma forma de realização a construção de ligação de antígeno da presente invenção tem especificidade para mais do que um antígeno, por exemplo, quando este é capaz de ligar dois ou mais antígenos selecionados de EGFR, IGF-1 R, VEGFR2 e VEGF, por exemplo, onde este é capaz de ligar EGFR e IGF-1 R ou onde este é capaz de ligar EGFR e VEGF ou onde este é capaz de ligar VEGF e IGF-1 R ou onde este á capaz de ligar 5 EGFR e VEGFR2 ou onde este é capaz de ligar IGF-1 R e VEGFR2 ou onde este é capaz de ligar VEGF e VEGFR2 ou onde este é capaz de ligar EGFR, IGF-1 R e VEGFR2 ou onde este é capaz de ligar VEGF, IGF-1 R e VEGFR2 ou onde este é capaz de ligar EGFR, VEGF e VEGFR2 ou onde este é capaz de ligar EGFR, VEGF and IGF1R.
Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos EGFR que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para VEGFR2, por exemplo, uma adnectina anti-VEGFR2, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve, por exemplo, o mAbdAb tendo a sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID N°: 136, 140 ou 144 e/ou a sequência de cadeia leve apresentada na SEQ ID N°: 138, 142 ou 145. Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos EGFR que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para VEGF, por exemplo, um dAb anti-VEGF, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve, por exemplo, o mAbdAb tendo a sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID N°: 165, 174, 176, 178, 184 ou 186 e/ou a sequência de cadeia leve apresentada na SEQ ID N°: 188 ou 190. Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos VEGF que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para EGFR, por exemplo, um dAb anti-EGFR, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve, por exemplo, o mAbdAb tendo a sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID N°: 180. Tais mAbdAbs também podem compreender a sequência de cadeia leve apresentada na SEQ ID N°: 182. Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos IGF-1 R que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para VEGF, por exemplo, uma lipocalina anti-VEGF, 5 ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve, por exemplo, o mAbdAb tendo a sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID N°: 123 ou 125. Tais mAbdAbs também podem compreender a sequência de cadeia leve apresentada na SEQ ID N°: 113 Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos IGF-1 R que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para VEGFR2, por exemplo, uma adnectina anti- VEGFR2, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve, por exemplo, o mAbdAb tendo a sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID N°: 124 ou 133. Tais mAbdAbs também podem compreender a sequência de cadeia leve apresentada na SEQ ID N°: 113. As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a IL-23, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a IL-23 ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a IL-23. A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a IL-23. A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a IL-23. Em uma forma de realização a construção de ligação de antígeno da presente invenção tem especificidade para mais do que um antígeno, por exemplo, quando este é capaz de ligar dois ou mais antígenos selecionados de citocinas tipo TH17, por exemplo, IL-17, IL-22 ou IL-21, por exemplo, onde este é capaz de ligar IL-23 e IL-17 ou onde este é capaz de ligar IL-23 e IL-21 ou onde este é capaz de ligar IL-23 e IL-22. Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno incluem anticorpos IL-23 que têm um domínio de ligação de epítopo com uma especificidade para IL-17, por exemplo, um dAb anti-IL-17, ligado ao terminal c ou ao terminal n da cadeia 5 pesada ou ao terminal c ou terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a PDGFRα, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a PDGFRα ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a PDGFRα.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a PDGFRα.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a PDGFRα.
As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a FGFR1, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a FGFR1 ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a FGFR1. A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a FGFR1. A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a FGFR1. As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a FGFR3, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a FGFR3 ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a FGFR3. A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a FGFR3. A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a FGFR3. As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a VEGFR2, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a
VEGFR2 ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a VEGFR2. A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a VEGFR2. A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a VEGFR2. 5 As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a VEGFR3, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a VEGFR3 ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a VEGFR3. A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a VEGFR3. A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a VEGFR3. As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a VE caderina, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a VE caderina ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a VE caderina.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a VE caderina.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a VE caderina.
As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a neuropilina, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a neuropilina ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a neuropilina.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a neuropilina.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a neuropilina.
As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a Flt-3, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a Flt-3 ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a Flt-3. A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a Flt-3. A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a Flt-3. 5 As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a ron, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar ron ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a ron.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a ron.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a ron.
As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a Trp-1, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar Trp-1 ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a Trp-1. A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a Trp-1. A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a Trp-1. Em uma forma de realização a construção de ligação de antígeno da presente invenção tem especificidade para mais do que um antígeno, por exemplo, quando este é capaz de ligar dois ou mais antígenos que são implicados em câncer, por exemplo, quando este é capaz de ligar dois ou mais antígenos selecionados de PDGFRα, FGFR1, FGFR3, VEGFR2, VEGFR3, IGF1 R, EGFR e VEGF, VE caderina, neuropilina, Flt-3, ron, Trp- 1, CD-20 por exemplo, onde este é capaz de ligar PDGFRα e FGFR1 ou onde este é capaz de ligar PDGFRα e VEGF ou onde este é capaz de ligar PDGFRα e FGFR3 ou onde este é capaz de ligar PDGFRα e VEGFR2 ou onde este é capaz de ligar PDGFRα e VEGFR3 ou onde este é capaz de ligar PDGFRα e IGF1 R ou onde este é capaz de ligar PDGFRα e EGFR ou onde este é capaz de ligar PDGFRα e VEGF ou onde este é capaz de ligar PDGFRα e VE caderina ou onde este é capaz de ligar PDGFRα e neuropilina ou onde este é capaz de ligar PDGFRα e Flt-3 ou onde este é capaz de ligar PDGFRα e Ron ou onde este é capaz de ligar PDGFRα e Trpl ou onde este é 5 capaz de ligar PDGFRα e CD-20 ou onde este é capaz de ligar FGFR1 e FGFR3 ou onde este é capaz de ligar FGFR1 e VEGFR2 ou onde este é capaz de ligar FGFR1 and VEGR3 ou onde este é capaz de ligar FGFR1 e IGF1 R ou onde este é capaz de ligar FGFR1 e EGFR ou onde este é capaz de ligar FGFR1 e VEGF ou onde este é capaz de ligar FGFR1 e VE caderina ou onde este é capaz de ligar FGFR1 e neuropilina ou onde este é capaz de ligar FGFR1 e Flt-3 ou onde este é capaz de ligar FGFR1 e Ron ou onde este é capaz de ligar FGFR1 e Trp-1 ou onde este é capaz de ligar FGFR1 e CD-20 ou onde este é capaz de ligar FGFR3 e VEGFR2 ou onde este é capaz de ligar FGFR3 e VEGFR3 ou onde este é capaz de ligar FGFR3 e IGF1 R ou onde este é capaz de ligar FGFR3 e EGFR ou onde este é capaz de ligar FGFR3 e VEGF ou onde este é capaz de ligar FGFR3 e VE caderina ou onde este é capaz de ligar FGFR3 e neuropilina ou onde este é capaz de ligar FGFR3 e Flt-3 ou onde este é capaz de ligar FGFR3 e Ron ou onde este é capaz de ligar FGFR3 e Trp-1 ou onde este é capaz de ligar FGFR3 e CD-20 ou onde este é capaz de ligar VEGFR2 e VEGFR3 ou onde este é capaz de ligar VEGFR2 e IGF1 R ou onde este é capaz de ligar VEGFR2 e EGFR ou onde este é capaz de ligar VEGFR2 e VEGF ou onde este é capaz de ligar VEGFR2 e VE caderina ou onde este é capaz de ligar VEGFR2 e neuropilina ou onde este é capaz de ligar VEGFR2 e Flt-3 ou onde este é capaz de ligar VEGFR2 e Ron ou onde este é capaz de ligar VEGFR2 e Trp-1 ou onde este é capaz de ligar VEGFR2 e CD-20 ou onde este é capaz de ligar VEGFR3 e IGF-1 R ou onde este é capaz de ligar VEGFR3 e EGFR ou onde este é capaz de ligar VEGFR3 e VEGF ou onde este é capaz de ligar VEGFR3 e VE caderina ou onde este é capaz de ligar VEGFR3 e neuropilina ou onde este é capaz de ligar VEGFR3 e Flt-3 ou onde este é capaz de ligar VEGFR3 e Trp-1 ou onde este é capaz de ligar VEGFR3 e CD-20 ou onde este é capaz de ligar IGF1 R e EGFR ou onde este é capaz de ligar IGF1 R e VEGF ou onde este é capaz de ligar IGF1 R e VE caderina ou onde este é capaz de ligar IGF1 R e neuropilina ou onde 5 este é capaz de ligar IGF1 R e Flt-3 ou onde este é capaz de ligar IGF1 R e Ron ou onde este é capaz de ligar IGF1 R e Trp-1 ou onde este é capaz de ligar IGF1 R e CD-20 ou onde este é capaz de ligar EGFR e VEGF ou onde este é capaz de ligar EGFR e VE caderina ou onde este é capaz de ligar EGFR e neuropilina ou onde este é capaz de ligar EGFR e Flt-3 ou onde este é capaz de ligar EGFR e Ron ou onde este é capaz de ligar EGFR e Trp-1 ou onde este é capaz de ligar EGFR e CD-20 ou onde este é capaz de ligar VEGF e VE caderina ou onde este é capaz de ligar VEGF e neuropilina ou onde este é capaz de ligar VEGF e Flt-3 ou onde este é capaz de ligar VEGF e Ron ou onde este é capaz de ligar VEGF e Trp-1 ou onde este é capaz de ligar VEGF e CD-20 ou onde este é capaz de ligar VE caderina e neuropilina ou onde este é capaz de ligar VE caderina e Flt-3 ou onde este é capaz de ligar VE caderina e Ron ou onde este é capaz de ligar VE caderina e Trp-1 ou onde este é capaz de ligar VE caderina e CD-20 ou onde este é capaz de ligar neuropilina e Flt-3 ou onde este é capaz de ligar neuropilina e Ron ou onde este é capaz de ligar neuropilina e Trp-1 ou onde este é capaz de ligar neuropilina e CD-20 ou onde este é capaz de ligar Flt-3 e Ron ou onde este é capaz de ligar Flt-3 e Trp-1 ou onde este é capaz de ligar Flt-3 e CD-20 ou onde este é capaz de ligar ron e Trp-1 ou onde este é capaz de ligar ron e CD-20 e/ou onde este é capaz de ligar Trp-1 e CD-20. Tais construções de ligação de antígeno também podem ter um ou mais domínios de ligação de epítopo adicionais com a mesma especificidade de antígeno ou diferente ligado ao terminal c e/ou ao terminal n da cadeia pesada e/ou ao terminal c e/ou terminal n da cadeia leve.
As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a beta-amilóide, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a beta- amilóide ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a beta- amilóide. 5 A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a beta-amilóide.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a beta-amilóide.
As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a CD-3, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a CD-3 ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a CD-3. A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a CD-3. A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a CD-3. As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a gplllb/lla, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a gplllb/lla ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a gplllb/lla.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a gplllb/lla.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a gplllb/lla.
As construções de ligação de antígeno da invenção incluem aqueles que tem especificidade quanto a TGFbeta, por exemplo, que compreende um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar-se a TGFbeta ou que compreende um VH/VL em pares que liga-se a TGFbeta.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um anticorpo que é capaz de ligar-se a TGFbeta.
A construção de ligação de antígeno pode compreender um dAb que é capaz de ligar-se a TGFbeta.
Em uma forma de realização da presente invenção é fornecida uma construção de ligação de antígeno de acordo com a invenção descritas neste e que compreende a região constante tal que o anticorpo tenha ADCC reduzido e/ou ativação complementar ou funcionalidade atuadora.
Em uma tal forma de realização a região constante de cadeia pesada pode compreender 5 um uma região constante naturalmente incapacitada de isótipo IgG2 ou IgG4 ou uma região constante de IgG1 mutada.
Os exemplos de modificações adequadas são descritas em EP0307434. Um exemplo compreende as substituições de resíduos de alanina nas posições 235 e 237 (numeração de índice EU). Em uma forma de realização as construções de ligação de antígeno da presente invenção reterão a funcionalidade Fc, por exemplo, serão capazes de um ou ambos de atividade ADCC e CDC.
Tais construções de ligação de antígeno podem compreender um domínio de ligação de epítopo localizado na cadeia leve, por exemplo, no terminal c da cadeia leve.
A invenção também fornece um método de manter a função de ADCC e CDC de construções de ligação de antígeno pelo posicionamento do domínio de ligação de epítopo na cadeia leve do anticorpo em particular, pelo posicionamento do domínio de ligação de epítopo no terminal c da cadeia leve.
Tal função ADCC e CDC pode ser medida por qualquer ensaio adequado, por exemplo, o ensaio de ADCC apresentado no Exemplo 15.3 e o ensaio CDC apresentado no Exemplo 15.4. A invenção também fornece um método de reduzir a função de CDC de construções de ligação de antígeno pelo posicionamento do domínio de ligação de epítopo na cadeia pesada do anticorpo, em particular, pelo posicionamento do domínio de ligação de epítopo no terminal c da cadeia pesada.
Tal função de CDC pode ser medida por qualquer ensaio adequado, por exemplo, o ensaio CDC apresentado no Exemplo 15.4. Em uma outra forma de realização a construção de ligação de antígeno da presente invenção é capaz de ligar dois ou mais antígenos selecionados de VEGF, IGF-1 R e EGFR, por exemplo, isto é capaz de ligar EGFR e VEGF ou EGFR e IGF1 R ou IGF1 R e VEGF ou por exemplo, isto é capaz de ligar a TNF e IL1-R.
Nas formas de realização da invenção que compreendem um local de ligação de IGF-1 R, o local de ligação IGF-1 R de 5 uma construção de ligação de antígeno da invenção podem compreender um domínio VH/VL em pares na estrutura de proteína, cujo domínio VH/VL em pares pode compreender um ou mais dos CDRs selecionados a partir daqueles apresentados na SEQ ID N°: 80, SEQ ID N°: 81, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 83, SEQ ID N°: 84, SEQ ID N°: 85 e SEQ ID N°: 86, por exemplo, isto pode compreender pelo menos CDRH3 como apresentado na SEQ ID N°: 80, por exemplo, isto pode compreender todos os CDRs apresentados na SEQ ID N°: 80, SEQ ID N°: 81, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 83, SEQ ID N°: 85 e SEQ ID N°: 86. Nas formas de realização da invenção que compreendem um local de ligação de EGFR, a construção de ligação de antígeno da presente invenção pode ligar a um epítopo que compreende resíduos 273 a 501 da sequência de EGFR madura ou normal ou do tipo selvagem, por exemplo, isto pode ligar a um epítopo que compreende resíduos 287 a 302 do EGFR maduro ou normal ou do tipo selvagem (SEQ ID N°: 103). Em uma forma de realização, o local de ligação de EGFR de uma construção de ligação de antígeno da invenção podem compreender um domínio VH/VL em pares na estrutura de proteína, cujo domínio VH/VL em pares podem compreender um ou mais dos CDRs selecionados a partir daqueles apresentados na SEQ ID N°: 104, SEQ ID N°: 105, SEQ ID N°: 106, SEQ ID N°: 100, SEQ ID N°: 101 e SEQ ID N°: 102, por exemplo, estes podem compreender CDRH3 como apresentado na SEQ ID N°: 106 ou estes podem compreender todos os seis CDRs apresentados na SEQ ID N°: 104, SEQ ID N°: 105, SEQ ID N°: 106, SEQ ID N°: 100, SEQ ID N°: 101 e SEQ ID N°: 102. tal domínio VH/VL em pares ainda pode compreender resíduos adicionais, particularmente nos CDRs de cadeia pesada e em uma forma de realização, CDRH1 podem compreender SEQ ID N°: 104 mais até cinco resíduos adicionais, por exemplo, um ou mais dos cinco resíduos adicionais que são apresentados na SEQ ID N°: 97, CDRH2 podem compreender SEQ 5 ID N°: 105 mais até dois resíduos adicionais, por exemplo, um ou ambos dos dois resíduos adicionais que são apresentados na SEQ ID N°: 98 e SEQ ID N°: 107 e CDRH3 podem compreender SEQ ID N°: 106 mais até dois resíduos adicionais, por exemplo, um ou ambos dos dois resíduos adicionais que são apresentados na SEQ ID N°: 99. Em uma tal forma de realização, o VH/VL em pares compreende um ou mais dos CDRs apresentados na SEQ ID N°: 97, SEQ ID N°: 98, SEQ ID N°: 99, SEQ ID N°: 100, SEQ ID N°: 101 e SEQ ID N°: 102, por exemplo, isto pode compreender pelo menos CDRH3 como apresentado na SEQ ID N°: 99, por exemplo, isto pode compreender todos os seis CDRs apresentados na SEQ ID N°: 97, SEQ ID N°: 98, SEQ ID N°: 99, SEQ ID N°: 100, SEQ ID N°: 101 e SEQ ID N°: 102 (mais detalhes de anticorpos adequados podem ser encontrados em WO02/092771 e WO2005/081854). Em uma forma de realização, as construções de ligação de antígeno compreendem um domínio de ligação de epítopo que é um anticorpo de domínio (dAb), por exemplo, o domínio de ligação de epítopo pode ser um VH humano ou VL humano ou um VHH de camelídeo ou um dAb de tubarão (NARV). Em uma forma de realização as construções de ligação de antígeno compreendem um domínio de ligação de epítopo que é um derivado de uma estrutura selecionada do grupo que consiste de CTLA-4 (Evicorpo); lipocalina; moléculas derivadas de Proteína A tais como domínio Z de Proteína A (Aficorpo, SpA), domínio A (Avímero/Maxicorpo); Proteínas de choque por calor tais como GroEl e GroES; transferrina (trans-corpo); proteína de repetição de ancirina (DARPin); aptâmero de peptídeo; domínio de lecitina tipo C (Tetranectina); γ-cristalina humana e ubiquitina humana
(afilinas); domínios PDZ; domínios de toxina tipo kunitz de escorpião de inibidores da protease humana e fibronectina (adnectina); que foi submetido ao projeto de proteína a fim de obter ligação a outro ligando que não o ligando natural. 5 As construções de ligação de antígeno da presente invenção podem compreender uma estrutura de proteína ligada a um domínio de ligação de epítopo que é uma adnectina, por exemplo, uma estrutura de IgG com um adnectina ligada ao terminal c da cadeia pesada ou estes podem compreender uma estrutura de proteína ligada a um adnectina, por exemplo, uma estrutura de IgG com uma adnectina ligada ao terminal n da cadeia pesada ou estes podem compreender uma estrutura de proteína ligada a um adnectina, por exemplo, uma estrutura de IgG com um adnectina ligada ao terminal c da cadeia leve ou estes podem compreender uma estrutura de proteína ligada a um adnectina, por exemplo, uma estrutura de IgG com um adnectina ligada ao terminal n da cadeia leve.
Em outras formas de realização estes podem compreender uma estrutura de proteína, por exemplo, uma estrutura de IgG, ligada a um domínio de ligação de epítopo que é CTLA-4, por exemplo, uma estrutura de IgG com CTLA-4 ligado ao terminal n da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com CTLA-4 ligado ao terminal c da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com CTLA-4 ligado ao terminal n da cadeia leve ou estes podem compreender uma estrutura de IgG com CTLA-4 ligado ao terminal c da cadeia leve.
Em outras formas de realização estes podem compreender uma estrutura de proteína, por exemplo, uma estrutura de IgG, ligada a um domínio de ligação de epítopo que é uma lipocalina, por exemplo, uma estrutura de IgG com uma lipocalina ligada ao terminal n da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com uma lipocalina ligada ao terminal c da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com uma lipocalina ligada ao terminal n da cadeia leve ou estes podem compreender uma estrutura de IgG com uma lipocalina ligada ao terminal c da cadeia leve. 5 Em outras formas de realização estes podem compreender uma estrutura de proteína, por exemplo, uma estrutura de IgG, ligada a um domínio de ligação de epítopo que é um SpA, por exemplo, uma estrutura de IgG com um SpA ligado ao terminal n da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com um SpA ligado ao terminal c da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com um SpA ligado ao terminal n da cadeia leve ou estes podem compreender uma estrutura de IgG com um SpA ligado ao terminal c da cadeia leve.
Em outras formas de realização estes podem compreender uma estrutura de proteína, por exemplo, uma estrutura de IgG, ligada a um domínio de ligação de epítopo que é um Aficorpo, por exemplo, uma estrutura de IgG com um aficorpo ligado ao terminal n da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com um aficorpo ligado ao terminal c da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com um aficorpo ligado ao terminal n da cadeia leve ou estes podem compreender uma estrutura de IgG com um aficorpo ligado ao terminal c da cadeia leve.
Em outras formas de realização estes podem compreender uma estrutura de proteína, por exemplo, uma estrutura de IgG, ligada a um domínio de ligação de epítopo que é um afímero, por exemplo, uma estrutura de IgG com um afímero ligado ao terminal n da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com um afímero ligado ao terminal c da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com um afímero ligado ao terminal n da cadeia leve ou estes podem compreender uma estrutura de IgG com um afímero ligado ao terminal c da cadeia leve.
Em outras formas de realização estes podem compreender uma estrutura de proteína, por exemplo, uma estrutura de IgG, ligada a um 5 domínio de ligação de epítopo que é um GroEl, por exemplo, uma estrutura de IgG com um GroEl ligado ao terminal n da cadeia pesada ou este pode compreender, por exemplo, uma estrutura de IgG com um GroEl ligado ao terminal c da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com um GroEl ligado ao terminal n da cadeia leve ou estes podem compreender uma estrutura de IgG com um GroEl ligado ao terminal c da cadeia leve.
Em outras formas de realização estes podem compreender uma estrutura de proteína, por exemplo, uma estrutura de IgG, ligada a um domínio de ligação de epítopo que é a transferrina, por exemplo, uma estrutura de IgG com uma transferrina ligado ao terminal n da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com uma transferrina ligado ao terminal c da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com uma transferrina ligado ao terminal n da cadeia leve ou estes podem compreender uma estrutura de IgG com uma transferrina ligado ao terminal c da cadeia leve.
Em outras formas de realização estes podem compreender uma estrutura de proteína, por exemplo, uma estrutura de IgG, ligada a um domínio de ligação de epítopo que é a GroES, por exemplo, uma estrutura de IgG com um GroES ligado ao terminal n da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com um GroES ligado ao terminal c da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com um GroES ligado ao terminal n da cadeia leve ou estes podem compreender uma estrutura de IgG com um GroES ligado ao terminal c da cadeia leve.
Em outras formas de realização estes podem compreender uma estrutura de proteína, por exemplo, uma estrutura de IgG, ligada a um domínio de ligação de epítopo que é um DARPin, por exemplo, uma estrutura de IgG com um DARPin ligado ao terminal n da cadeia pesada ou estes 5 podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com um DARPin ligado ao terminal c da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com um DARPin ligado ao terminal n da cadeia leve ou estes podem compreender uma estrutura de IgG com um DARPin ligado ao terminal c da cadeia leve.
Em outras formas de realização estes podem compreender uma estrutura de proteína, por exemplo, uma estrutura de IgG, ligada a um domínio de ligação de epítopo que é a aptâmero de peptídeo, por exemplo, uma estrutura de IgG com um aptâmero de peptídeo ligado ao terminal n da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com um aptâmero de peptídeo ligado ao terminal c da cadeia pesada ou estes podem compreender por exemplo, uma estrutura de IgG com um aptâmero de peptídeo ligado ao terminal n da cadeia leve ou estes podem compreender uma estrutura de IgG com um aptâmero de peptídeo ligado ao terminal c da cadeia leve.
Em uma forma de realização da presente invenção existem quatro domínios de ligação de epítopos, por exemplo, quatro anticorpos de domínio, dois dos domínios de ligação de epítopo podem ter especificidade quanto ao mesmo antígeno ou todos do domínios de ligação de epítopo presentes na construção de ligação de antígeno podem ter especificidade quanto ao mesmo antígeno.
As estruturas de proteína da presente invenção podem ser ligadas aos domínios de ligação de epítopo pelo uso de ligantes.
Os exemplos de ligantes adequados incluem sequências de aminoácido que podem ser de 1 aminoácido a 150 aminoácidos em comprimento ou de 1 aminoácido a 140 aminoácidos, por exemplo, de 1 aminoácido a 130 aminoácidos ou de 1 a 120 aminoácidos ou de 1 a 80 aminoácidos ou de 1 a 50 aminoácidos ou de 1 a 20 aminoácidos ou de 1 a 10 aminoácidos ou de 5 a 18 aminoácidos.
Tais sequências podem ter sua estrutura terciária própria, por exemplo, um ligante 5 da presente invenção pode compreender um domínio variável simples.
O tamanho de um ligante em uma forma de realização é equivalente a um domínio variável simples.
Os ligantes adequados podem ser de um tamanho de 1 a 20 angstroms, por exemplo, menor do que 15 angstroms ou menor do que 10 angstroms ou menor do que 5 angstroms.
Em uma forma de realização da presente invenção pelo menos um dos domínios de ligação de epítopo é diretamente ligado à estrutura de Ig com um ligante que compreende de 1 a 150 aminoácidos, por exemplo, 1 a 20 aminoácidos, por exemplo, 1 a 10 aminoácidos.
Tais ligantes podem ser selecionados de qualquer um daqueles na SEQ ID N°: 6 a 11, ‘STG’ (serina, treonina, glicina), ‘GSTG’ ou ‘RS’, por exemplo, o ligante pode ser ‘TVAAPS’ ou o ligante pode ser ‘GGGGS’. Os ligantes de uso nas construções de ligação de antígeno da presente invenção podem compreender sozinhos ou além dos outros ligantes, uma ou mais séries de GS resíduos, por exemplo, ‘GSTVAAPS’ ou ‘TVAAPSGS’ ou ‘GSTVAAPSGS’. Em uma outra forma de realização, não existe ligante entre as domínio de ligação de epítopo, por exemplo, o dAb e a estrutura de Ig.
Em uma outra forma de realização o domínio de ligação de epítopo, por exemplo, um dAb, é ligado a uma estrutura de Ig pelo ligante ‘TVAAPS’. Em uma outra forma de realização, o domínio de ligação de epítopo, por exemplo, um dAb, é ligado a uma estrutura de Ig pelo ligante ‘TVAAPSGS’. Em uma outra forma de realização o domínio de ligação de epítopo, por exemplo, um dAb, é ligado a uma estrutura de Ig pelo ligante ‘GS’. Em uma forma de realização, a construção de ligação de antígeno da presente invenção compreende pelo menos um domínio de ligação de epítopo que é capaz de ligar albumina de soro humano.
Em uma forma de realização, existem pelo menos 3 locais de ligação de antígeno, por exemplo, existem 4 ou 5 ou 6 ou 8 ou 10 locais de ligação de antígeno e a construção de ligação de antígeno é capaz de ligar 5 pelo menos 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 8 ou 10 antígenos, por exemplo, isto é capaz de ligar 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 8 ou 10 antígenos simultaneamente.
A invenção também fornece as construções de ligação de antígeno para o uso em medicamento, por exemplo, para o uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer ou doenças inflamatórias tais como asma, artrite reumatóide ou osteoartrite.
A invenção fornece um método de tratar um paciente que sofre de câncer ou doenças inflamatórias tais como asma, artrite reumatóide ou osteoartrite, que compreende a administração de uma quantidade terapêutica de uma construção de ligação de antígeno da invenção.
As construções de ligação de antígeno da invenção podem ser usadas para o tratamento de câncer ou doenças inflamatórias tais como asma, artrite reumatóide ou osteoartrite.
As construções de ligação de antígeno da invenção podem ter alguma função atuadora.
Por exemplo, se a estrutura de proteína conter uma Região Fc derivado de um anticorpo com função atuadora, por exemplo, se a estrutura de proteína compreender CH2 e CH3 de IgG1. Os Níveis de função atuadora podem ser variados de acordo com as técnicas conhecidas, por exemplo, por mutações no domínio CH2, por exemplo, em que o domínio CH2 de IgG1 tem uma ou mais mutações nas posições selecionadas de 239 e 332 e 330, por exemplo, as mutações são selecionadas de S239D e 1332E e A330L tal que o anticorpo tenha função atuadora intensificada e/ou, por exemplo, alteração do perfil de glicosilação de uma construção de ligação de antígeno da invenção, tal que exista uma redução na fucosilação da Região Fc.
As estruturas de proteínas de uso na presente invenção incluem estruturas de anticorpo monoclonal que compreende todos os domínios de um anticorpo ou estrutura de proteínas da presente invenção pode compreender um estrutura de anticorpo não convencional, tal como um anticorpo 5 monovalente.
Tais anticorpos monovalentes podem compreender uma cadeia pesada e leve em pares em que a região de articulação da cadeia pesada é modificada de modo que a cadeia pesada não homodimerize, tal como o anticorpo monovalente descrito em WO2007059782. Outros anticorpos monovalentes podem compreender uma cadeia pesada e leve em pares que dimeriza com uma segunda cadeia pesada que está precisando de uma região variável funcional e região CH1, em que a primeira e a segunda cadeias pesadas são modificadas de modo que formarão heterodímeros em vez de homodímeros, resultando em um anticorpo monovalente com duas cadeias pesadas e uma cadeia leve, tal como o anticorpo monovalente descrito em WO2006015371. Tais anticorpos monovalentes pode fornecer a estrutura de proteína da presente invenção aos quais os domínios de ligação de epítopo podem ser ligados, por exemplo, tal como as construções de ligação de antígeno descritas no Exemplo 32. Os domínios de ligação de epítopo de uso na presente invenção são domínios que ligam-se especificamente a um antígeno ou epítopo independentemente de uma região ou domínio V diferentes, este pode ser um anticorpo de domínio ou pode ser um domínio que é um derivado de uma estrutura selecionada do grupo que consiste de CTLA-4 (Evicorpo); lipocalina; moléculas derivadas de Proteína A tais como domínio Z de Proteína A (Aficorpo, SpA), domínio A (Avímero/Maxicorpo); Proteínas de choque por calor, tais como GroEl e GroES; transferrina (trans-corpo); proteína de repetição de ancirina (DARPin); aptâmero de peptídeo; domínio de lecitina tipo C (Tetranectina); γ-crstalina humana e ubiquitina humana (afilinas); domínios PDZ; domínios de toxina tipo kunitz de escorpião de inibidores da protease humana; e fibronectina (adnectina); que foi submetido ao projeto de proteína a fim de obter ligação a outro ligando que não o ligando natural.
Em uma forma de realização este pode ser um anticorpo de domínio ou outros domínios adequados, tais como um domínio selecionado 5 do grupo que consiste de CTLA-4, lipocalina, SpA, um Aficorpo, um avímero, GroEl, transferrina, GroES e fibronectina.
Em uma forma de realização este pode ser selecionado de um dAb, um Aficorpo, uma proteína de repetição de ancirina (DARPin) e uma adnectina.
Em uma outra forma de realização este pode ser selecionado de um Aficorpo, uma proteína de repetição de ancirina (DARPin) e uma adnectina.
Em uma outra forma de realização este pode ser um anticorpo de domínio, por exemplo, um anticorpo de domínio selecionado de um anticorpo de domínio humano, de camelídeo ou tubarão (NARV). Os domínios de ligação de epítopo podem ser ligados à estrutura de proteína em uma ou mais posições.
Estas posições incluem o terminal C e o terminal N da estrutura de proteína, por exemplo, no terminal C da cadeia pesada e/ou um terminal C da cadeia leve de um IgG ou por exemplo, o terminal N da cadeia pesada e/ou a terminal N da cadeia leve de um IgG.
Em uma forma de realização, um primeiro domínio de ligação de epítopo é ligado à estrutura de proteína e um segundo domínio de ligação de epítopo é ligado ao primeiro domínio de ligação de epítopo, por exemplo, quando a estrutura de proteína é uma estrutura de IgG, um primeiro domínio de ligação de epítopo podem ser ligadas ao terminal c da cadeia pesada da estrutura de IgG e que domínio de ligação de epítopo pode ser ligado em seu terminal c a um segundo domínio de ligação de epítopo ou, por exemplo, um primeiro domínio de ligação de epítopo podem ser ligadas ao terminal c da cadeia leve da estrutura de IgG e que o primeiro domínio de ligação de epítopo ainda pode ser ligado em seu terminal c a um segundo domínio de ligação de epítopo ou por exemplo, um primeiro domínio de ligação de epítopo podem ser ligadas ao terminal n da cadeia leve da estrutura de IgG e que o primeiro domínio de ligação de epítopo ainda pode ser ligado em seu terminal n a um segundo domínio de ligação de epítopo ou por exemplo, um 5 primeiro domínio de ligação de epítopo podem ser ligadas ao terminal n da cadeia pesada da estrutura de IgG e que o primeiro domínio de ligação de epítopo ainda pode ser ligado em seu terminal n a um segundo domínio de ligação de epítopo.
Os exemplos de tais construções de ligação de antígeno são descritos no Exemplo 31. Quando o domínio de ligação de epítopo é um anticorpo de domínio, alguns anticorpos de domínio pode ser adaptado a posições particulares dentro da estrutura.
Os anticorpos de domínio de uso na presente invenção podem ser ligados à extremidade de terminal C da cadeia pesada e/ou uma cadeia leve de IgGs convencionais.
Além disso, alguns dAbs podem ser ligados às extremidades de terminal C tanto da cadeia pesada quanto da cadeia leve de anticorpos convencionais.
Nas construções onde o terminal N de dAbs são fundidos a um domínio constante de anticorpo (CH3 ou CL), um ligante de peptídeo pode ajudar o dAb a ligar-se ao antígeno.
De fato, a extremidade de terminal N de um dAb está localizado próximo às regiões determinantes de complementaridade (CDRS) envolvidas na atividade de ligação de antígeno.
Desta maneira um ligante de peptídeo curto atua como um espaçador entre a ligação de epítopo e o domínio constante para a estrutura de proteína, podendo permitir que os CDRs de dAb atinjam mais facilmente o antígeno, que, portanto, pode ligar-se com afinidade alta.
Os circundantes em que os dAbs são ligados ao IgG diferirão dependendo em que cadeia de anticorpo estes são fundidos a: Quando fundidos na extremidade de terminal C da cadeia leve de anticorpo de uma estrutura de IgG, cada dAb é esperado estar localizado na vicinidade da articulação do anticorpo e uma porção de Fc.
É provável que tais dAbs serão localizados à parte um do outro.
Em anticorpos convencionais, o ângulo entre os fragmentos Fab e o ângulo entre cada 5 fragmento Fab e a porção Fc pode variar muito significantemente.
É provável que - com mAbdAbs – o ângulo entre os fragmentos Fab não serão amplamente diferentes, enquanto algumas restrições angulares puderem ser observadas com o ângulo entre cada fragmento de Fab e a porção Fc.
Quando fundido na extremidade de terminal C do anticorpo cadeia pesada de uma estrutura de IgG, cada dAb é esperado estar localizado na vicinidade dos domínios CH3 da porção Fc.
Não é esperado que isto impacte nas propriedades de ligação de Fc aos receptores Fc (por exemplo, FcγRI, II, III um FcRn) quando estes receptores ligam-se com os domínios CH2 (para a classe FcγRI, II e III de receptores) ou com a articulação entre os domínios CH2 e CH3 (por exemplo, um receptor FcRn). Uma outra característica de tais construções de ligação de antígeno é que ambos os dAbs são esperados estarem espacialmente próximos um do outro e contanto que a flexibilidade seja fornecida pelo fornecimento de ligantes apropriados, estes dAbs ainda podem formar espécies homodiméricas, em consequência propagando a estrutura quaternária ‘zerada’ da porção Fc, que pode intensificar a estabilidade da construção.
Tais considerações estruturais podem auxiliar na escolha da posição mais adequada para a ligação a um domínio de ligação de epítopo, por exemplo, um dAb, a uma estrutura de proteína, por exemplo, um anticorpo.
O tamanho do antígeno, sua localização (no sangue ou na superfície celular), sua estrutura quaternária (monomérica ou multimérica) pode variar.
Os anticorpos convencionais são naturalmente projetados para funcionar como construções de adaptador devido à presença de uma região de articulação, em que a orientação dos dois locais de ligação de antígeno na ponta dos fragmentos Fab pode variar amplamente e em consequência adaptar à característica molecular do antígeno e seus circundantes.
Em contraste, os dAbs ligados a um anticorpo ou outra estrutura de proteína, por exemplo, uma 5 estrutura de proteína que compreende um anticorpo sem nenhuma região de articulação, pode ter menor flexibilidade estrutural direta ou indiretamente.
O entendimento do estado da solução e modo de ligação no dAb também é útil.
A evidência acumulou que o dAbs in vitro pode existir predominantemente nas formas monoméricas, homodiméricas ou multiméricas na solução (Reiter et al. (1999) J Mol Biol 290 p685-698; Ewert et al (2003) J Mol Biol 325, p531-553, Jespers et al (2004) J Mol Biol 337 p893-903; Jespers et al (2004) Nat Biotechnol 22 p1161-1165; Martin et al (1997) Protein Eng. 10 p607-614; Sepulvada et al (2003) J Mol Biol 333 p355-365). Isto é satisfatoriamente reminiscente aos eventos de multimerização observados in vivo com domínios Ig, tais como as proteínas de Bence-Jones (que são dímeros de cadeias leves de imunoglobulina (Epp et al (1975) Biochemistry 14 p4943-4952; Huan et al (1994) Biochemistry 33 p14848-14857; Huang et al (1997) Mol immunol 34 p1291-1301) e fibras amilóides (James et al. (2007) J Mol Biol. 367:603-8). Por exemplo, pode ser desejável ligar os anticorpos de domínio que tendem a dimerizar na solução na extremidade de terminal C da porção Fc em preferência à extremidade de terminal C da cadeia leve como ligação à extremidade de terminal C do Fc permitirá que aqueles dAbs dimerizem no contexto de uma construção de ligação de antígeno da invenção.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção podem compreender locais de ligação de antígeno específicos para um antígeno simples ou pode ter locais de ligação de antígeno específicos para dois ou mais antígenos ou para dois ou mais epítopos em um antígeno simples ou estes podem ser locais de ligação de antígeno cada um dos quais é específico para um epítopo diferente nos mesmos antígenos ou diferentes.
Os locais de ligação de antígeno podem, cada um, ter 5 especificidade de ligação para um antígeno, tais como proteínas humanas ou animais, incluindo citocinas, fatores de desenvolvimento, receptores de citocina, receptores do fator de desenvolvimento, enzimas (por exemplo, proteases), co-fatores para enzimas, Proteínas de ligação de DNA, lipídeos e carboidratos.
Alvos adequados, incluindo citocinas, fatores de desenvolvimento, receptores de citocina, receptores do fator de desenvolvimento e outras proteínas incluem mas não são limitadas a: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1, CEA, CD40, Ligando de CD40, CD56, CD38, CD138, EGF, Receptor de EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FAPa, FGF-ácido, FGF-básico, fator de desenvolvimento de fibroblasto-10, ligando FLT3, Fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM- CSF, GF-131, albumina de soro humano, insulina, IFN-γ , IGF-I, IGF-II, IL- 1α, IL-1β, receptor de IL-1, receptor de IL-1 tipo 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL- 15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inibina α, Inibina β, IP-10, fator-2 de desenvolvimento de queratinócito (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, substância inibidora Mullerian, fator inibidor da colônia de monócito, proteína atraente de monócito, M-CSF, cfms, v-fmsMDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, fator-1 inibidor de progenitor de mielóide (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, Fator de desenvolvimento de nervo, β-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, fator de célula tronco (SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, fator de necrose de tumor (TNF), TNF-α, TNF-β, receptor de TNF I, receptor de TNF
II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, Receptor de VEGF 1, Receptor de VEGF 2, Receptor de VEGF 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ , HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, albumina de soro, vWF, proteínas amilóides (por exemplo, amilóide alfa), MMP12, PDK1, 5 IgE e outros alvos divulgados neste. será estimado que esta lista de maneira alguma é exaustiva.
Em algumas formas de realização, o peptídeo ou polipeptídeo resistentes à protease liga-se a um alvo no tecido pulmonar, tal como um alvo selecionado do grupo que consiste de TNFR1, IL-1, IL-1R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12 IL-12R, IL-13, IL- 13Rα1, IL-13Rα2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL- 23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), quimase, FGF, Furina, Endothelina-1, Eotaxinas (por exemplo, Eotaxina, Eotaxina-2, Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM- 1, ICOS, IgE, IFNα, 1-309, integrinas, L-selectina, MIF, MIP4, MDC, MCP- 1, MMPs, neutrofil elastase, osteopontina, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, Trombina, Tim-1, TNF, TRANCE, Triptase, VEGF, VLA-4, VCAM, α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfavbeta6, alfavbeta8, cMET, CD8, vWF, proteínas amilóides (por exemplo, amilóide alfa), MMP12, PDK1 e IgE.
Em particular, as construções de ligação de antígeno da presente invenção podem ser úteis no tratamento de doenças associadas com IL-13, IL-5 e IL-4, por exemplo, dermatite atópica, rinite alérgica, doença de Crohn, COPD, doenças ou distúrbios fibróticos, tais como fibrose pulmonar idiopática, esclerose sistêmica progressiva, fibrose hepática, granulomas hepáticos, esquistosomiase, leishmaniose, doenças de regulação do ciclo celular, tais como doença de Hodgkins, leucemia linfocítica crônica de célula B, por exemplo, as construções podem ser úteis no tratamento de asma.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção podem ser úteis no tratamento de doenças associadas com fatores de desenvolvimento tais como IGF-1R, VEGF, e EGFR, por exemplo, câncer ou artrite reumatóide, os exemplos de tipos de câncer em que tais terapias podem 5 ser úteis são câncer de mama, câncer de próstata, câncer de pulmão e mieloma.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção podem ser úteis no tratamento de doenças associadas com TNF, por exemplo, artrite, por exemplo, artrite reumatóide ou osteoartrite.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção podem ser úteis no tratamento de doenças associadas com IL1-R, por exemplo, artrite, por exemplo, artrite reumatóide ou osteoartrite.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção podem ser úteis no tratamento de doenças associadas com CD-20, por exemplo, doenças autoimunes, tais como psoríase, doença do intestino inflamatória, colite ulcerativa, doença de Crohn, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, lúpus eritematoso sistêmico, doenças neurodegenerativas, por exemplo, esclerose múltipla, doenças conduzidas por neutrófilo, por exemplo, COPD, vasculite de Wegeners, fibrose cística, síndrome de Sjogrens, rejeição a transplante crônica, diabetes tipo 1, doença enxerto versus hospedeiro, asma, dermatite atópica de doenças alérgicas, dermatite eczematosa, rinite alérgica, outras doenças autoimunes incluindo tireoidite, espondiloartropatia, espondilite ancilosante, uveíte, policonrite ou escleroderma ou câncer, por exemplo, linfomas de célula B ou neoplasma de célula B madura, tais como CLL ou SLL.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção podem ser úteis no tratamento de doenças associadas com IL-17 e IL-23, por exemplo, psoríase, doença do intestino inflamatória, colite ulcerativa, doença de Crohns, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, lúpus eritematoso sistêmico, doenças neurodegenerativas, por exemplo, esclerose múltipla, doenças conduzidas por neutrófilo, por exemplo, COPD , vasculite de Wegeners, fibrose cística, síndrome de Sjogrens, rejeição a transplante crônica, diabetes tipo 1 doença enxerto versus hospedeiro, asma, dermatite 5 atópica de doenças alérgicas, dematite eczematosa, rinite alérgica, outras doenças autoimunes incluindo tireoidite, espondiloartropatia, espondilite ancilosante, uveíte, policonrite ou escleroderma.
As construções de ligação de antígeno da presente invenção podem ser produzidas pela transfecção de uma célula hospedeira com um vetor de expressão que compreende a sequência codificadora para a construção de ligação de antígeno da invenção.
Um vetor de expressão ou plasmídeo recombinante é produzido pela colocação destas sequências codificadoras para a construção de ligação de antígeno em associação de operação com sequências de controle reguladoras convencionais capazes de controlar a replicação e a expressão e/ou secreção de uma célula hospedeira.
As sequências reguladoras incluem sequências promotoras, por exemplo, promotor de CMV e sequências sinalizadoras que podem ser derivadas de outros anticorpos conhecidos.
Similarmente, um segundo vetor de expressão pode ser produzido tendo uma sequência de DNA que codifica uma cadeia leve ou pesada de construção de ligação de antígeno.
Em certas formas de realização, este segundo vetor de expressão é idêntico ao primeiro exceto na medida em que as sequências codificadoras e marcadores selecionáveis são relacionados, a fim de garantir tanto quanto o possível que cada cadeia de polipeptídeo seja funcionalmente expressada.
Alternativamente, as sequências codificadoras de cadeia pesada e leve para a construção de ligação de antígeno podem residir em um vetor simples, por exemplo, em dois cassetes de expressão no mesmo vetor.
Uma célula hospedeira selecionada é cotransfectada por técnicas convencionais tanto com um primeiro quanto com um segundo vetores (ou simplesmente transfectada por um vetor simples) para criar a célula hospedeira transfectada da invenção que compreende tanto as cadeias leves quanto pesadas recombinantes ou sintéticas.
A célula transfectada é então cultivada por técnicas convencionais para produzir a construção de 5 ligação de antígeno projetada da invenção.
A construção de ligação de antígeno que inclui a associação tanto da cadeia pesada quanto leve recombinantes é avaliada a partir da cultura pelo ensaio apropriado, tal como ELISA ou RIA.
As técnicas convencionais similares podem ser utilizadas para a construção de outras construções de ligação de antígeno.
Os vetores adequados para as etapas de clonagem e de subclonagem utilizados nos métodos e na construção das composições desta invenção podem ser selecionados por uma pessoa habilitada na técnica.
Por exemplo, a série pUC convencional de vetores de clonagem pode ser usada.
Um vetor, pUC19, está comercialmente disponível a partir de casas fornecedoras, tais como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) ou Pharmacia (Uppsala, Suécia). Adicionalmente, qualquer vetor que é capaz de se replicar facilmente, tem uma abundância de locais de clonagem e genes selecionáveis (por exemplo, resistência a antibiótico) e é facilmente manipulado pode ser usado para a clonagem.
Desta maneira, a seleção do vetor de clonagem não é um fator limitante nesta invenção.
Os vetores de expressão também podem ser caracterizados por genes adequados para a expressão de amplificação das sequências de DNA heterólogas, por exemplo, o gene de diidrofolato redutase de mamífero (DHFR). Outras sequências de vetor preferidas incluem uma sequência de sinal poli A, tal como de hormônio de crescimento bovino (BGH) e a sequência promotora de betaglobina (betaglopro). Os vetores de expressão úteis aqui podem ser sintetizados pelas técnicas bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
Os componentes de tais vetores, por exemplo, replicons, genes de seleção, intensificadores, promotores, sequências sinalizadoras e outros, podem ser obtidos a partir de fontes comerciais ou naturais ou sintetizados por procedimentos conhecidos para o uso no direcionamento da expressão e/ou secreção do produto do DNA recombinante em um hospedeiro selecionado. 5 Outros vetores de expressão apropriados dos quais numerosos tipos são conhecidos na técnica para a expressão em mamífero, bacteriana, em inseto, levedura e fungo também podem ser selecionados para este propósito.
A presente invenção também abrange uma linha celular transfectada com um plasmídeo recombinante contendo as sequências codificadoras das construções de ligação de antígeno da presente invenção.
As células hospedeiras úteis para a clonagem ou outras manipulações destes vetores de clonagem também são convencionais.
Entretanto, as células de várias cepas de E. coli podem ser usadas para a replicação dos vetores de clonagem e outras etapas na construção de construções de ligação de antígeno desta invenção.
As células hospedeiras adequadas ou linhas de células para a expressão das construções de ligação de antígeno da invenção incluem células de mamíferos, tais como NSO, Sp2/0, CHO (por exemplo, DG44), COS, HEK, uma célula de fibroblasto (por exemplo, 3T3) e células de mieloma, por exemplo, podem ser expressadas em um CHO ou uma célula de mieloma.
As células humanas podem ser usadas, desta maneira, permitindo que a molécula seja modificada com padrões de glicosilação humanos.
Alternativamente, outras linhas celulares eucarióticas podem ser usadas.
A seleção de células hospedeiras de mamífero adequadas e métodos para a transformação, cultura, amplificação, avaliação e produção e purificação do produto são conhecidos na técnica.
Ver, por exemplo, Sambrook et al., citados acima.
As células bacterianas podem mostrar-se úteis como células hospedeiras adequadas para a expressão de Fabs recombinantes ou outras formas de realização da presente invenção (ver, por exemplo, Pluckthun, A., Immunol.
Rev., 130:151-188 (1992)). Entretanto, devido à tendência de proteínas expressadas em células bacterianas a estarem em uma forma não dobrada ou dobrada indevidamente ou em uma forma não glicosilada, qualquer Fab recombinante produzido em uma célula bacteriana deve ser avaliado para a retenção da capacidade de ligação de antígeno.
Se a molécula 5 expressada pela célula bacteriana for produzida em uma forma apropriadamente dobrada, cuja célula bacteriana deve ser um hospedeiro desejável ou em formas de realização alternativas a molécula pode expressar no hospedeiro bacteriano e então ser subsequentemente dobrado novamente.
Por exemplo, várias cepas de E. coli usadas para a expressão são bem conhecidas como células hospedeiras no campo da biotecnologia.
Várias cepas de B. subtilis, Streptomyces, outros bacilos e outros também podem ser utilizados neste método.
Quando desejado, as cepas de células de levedura conhecidas por aqueles habilitados na técnica também estão disponíveis como células hospedeiras, bem como células de inseto, por exemplo, Drosofila e Lepidoptera e sistemas de expressão viral.
Ver, por exemplo, Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) e Referências citadas neste.
Os métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construídos, os métodos de transfecção requeridos para produzir as células hospedeiras da invenção e os métodos de cultura necessários para a produção da construção de ligação de antígeno da invenção a partir da qual a célula hospedeira podem ser todas as técnicas convencionais.
Tipicamente, o método de cultura da presente invenção é um método de cultura isento de soro, usualmente pelo cultivo de células isentas de soro na suspensão.
Da mesma maneira, uma vez produzidas, as construções de ligação de antígeno da invenção podem ser purificadas a partir dos teores de cultura de célula de acordo com procedimentos padrão da técnica, incluindo a precipitação de sulfato de amônia, colunas de afinidade, cromatografia de coluna, eletroforese em gel e outros.
Tais técnicas estão dentro da habilidade da técnica e não limitam esta invenção.
Por exemplo, a preparação de anticorpos alterados é descrito em WO 99/58679 e WO 96/16990. Ainda, um outro método de expressão das construções de 5 ligação de antígeno pode utilizar a expressão em um animal transgênico, tal como descrito na Patente U.
S.
N° 4.873.316. Isto diz respeito a um sistema de expressão que usa o promotor de caseína animal que quando transgenicamente incorporada em um mamífero permite que a fêmea produza a proteína recombinante desejada em seu leite.
Em um outro aspecto da invenção, é fornecido um método de produzir um anticorpo da invenção cujo método compreende a etapa de cultivar uma célula hospedeira transformada ou transfectada com um vetor que codifica a cadeia leve e/ou pesada do anticorpo da invenção e recupera o anticorpo desse modo produzido.
De acordo com a presente invenção é fornecido um método de produzir uma construção de ligação de antígeno da presente invenção cujo método compreende as etapas de; (a) fornecer um primeiro vetor que codifica a cadeia pesada de uma construção de ligação de antígeno; (b) fornecer um segundo vetor que codifica uma cadeia leve de uma construção de ligação de antígeno; (c) transformar uma célula hospedeira de mamífero (por exemplo, CHO) com o dito primeiro e segundo vetores; (d) cultivar a célula hospedeira da etapa (c) sob condições condutoras para a secreção de uma construção de ligação de antígeno a partir da dita célula hospedeira no dito meio de cultura; (e) recuperar a construção de ligação de antígeno secretada da etapa (d). Uma vez expressada pelo método desejado, a construção de ligação de antígeno é então examinada quanto à atividade in vitro pelo uso de um ensaio apropriado.
Presentemente, os formatos de ensaio de ELISA convencionais são utilizados para estimar a ligação qualitativa e quantitativa de uma construção de ligação de antígeno a seu alvo.
Adicionalmente, outros ensaios in vivo também podem ser usados para verificar a eficácia 5 neutralizadora antes dos estudos clínicos humanos subsequentes realizados para avaliar a persistência de uma construção de ligação de antígeno no corpo a despeito dos mecanismos de liberação usuais.
A dose e a duração do tratamento diz respeito à duração relativa das moléculas da presente invenção na circulação humana e podem ser ajustados por uma pessoa habilitada na técnica dependendo da condição sendo tratada e da saúde geral do paciente.
É considerado que dosagem repetida (por exemplo, uma vez por semana ou uma vez a cada duas semanas) por um período de tempo estendido (por exemplo, quatro a seis meses) pode ser requerida para atingir a eficácia terapêutica máxima.
O modo de administração do agente terapêutico da invenção pode ser qualquer via adequada que libere o agente ao hospedeiro.
As construções de ligação de antígeno e as composições farmacêuticas da invenção são particularmente úteis para a administração parenteral, isto é, subcutaneamente (s.c.), intratecalmente, intraperitonealmente, intramuscularmente (i.m.), intravenosamente (i.v.) ou intranasalmente.
Os agentes terapêuticos da invenção podem ser preparados como composições farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz de uma construção de ligação de antígeno da invenção como um ingrediente ativo em um carregador farmaceuticamente aceitável.
No agente profilático da invenção, uma suspensão ou solução aquosa contendo a construção de ligação de antígeno, preferivelmente tamponado em pH fisiológico, em uma forma pronta para a injeção é preferido.
As composições para a administração parenteral compreenderão comumente uma solução de uma construção de ligação de antígeno da invenção ou um coquetel deste dissolvido em um carregador farmaceuticamente aceitável, preferivelmente um carregador aquoso.
Uma variedade de carregadores aquosos pode ser utilizada, por exemplo, salmoura a 0,9 %, 0,3 % de glicina e outros.
Estas soluções podem ser tornadas estéreis e, em geral, isentas de material particulado.
Estas 5 soluções podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização bem conhecidas convencionais (por exemplo, filtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como requerido para se aproximar das condições fisiológicas, tais como ajuste de pH e agentes de tamponação, etc.
A concentração de uma construção de ligação de antígeno da invenção em tal formulação farmacêutica pode variar amplamente, isto é, de menos do que cerca de 0,5 %, usualmente em ou pelo menos cerca de 1 % a tanto quanto 15 ou 20 % em peso e será selecionado primariamente com base em volumes de fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de administração selecionado.
Desta maneira, uma composição farmacêutica da invenção para a injeção intramuscular pode ser preparada para conter 1 ml de água tamponada estéril e entre cerca de 1 ng a cerca de 100 mg, por exemplo, cerca de 50 ng a cerca de 30 mg ou mais preferivelmente, cerca de 5 mg a cerca de 25 mg, de uma construção de ligação de antígeno da invenção.
Similarmente, uma composição farmacêutica da invenção para a infusão intravenosa pode ser feita para conter cerca de 250 ml de solução de Ringer estéril e cerca de 1 a cerca de 30 e preferivelmente 5 mg a cerca de 25 mg de uma construção de ligação de antígeno da invenção por ml de solução de Ringer.
Os métodos reais para a preparação de composições parenteralmente administráveis são bem conhecidos ou estarão evidentes para aqueles habilitados na técnica e são descrito em mais detalhes em, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Science, 15° ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
Para a preparação de formulações de construção de ligação de antígeno administrável intravenosamente da invenção ver Lasmar U e Parkins D “The formulation of Biopharmaceutical products”, Pharma.
Sci.Tech.today, páginas 129-137, Vol.3 (3 de abril de 2000), Wang, W “Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals”, Int.
J.
Pharm 185 (1999) 129- 188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A e B ed Ahern T.J., Manning 5 M.C., New York, NY: Plenum Press (1992), Akers,M.J. “Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations”, J.Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K et al “Effects of tipos of sugar on stabilization of Protein in the dried state”, J Pharm Sci 92 (2003) 266-274,Izutsu, Kkojima, S. “Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying”, J Pharm.
Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, “Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyofilization”, J.
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Sci, 91 (2002) 914-922. Ha, E Wang W, Wang Y.j. “Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability”, J.
Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002) cujos conteúdos totais estão incorporados aqui por referência e aos quais o leitor é especificamente referido.
É preferido que o agente terapêutico da invenção, quando em uma preparação farmacêutica, esteja presente nas formas de dosagem unitárias.
A dose terapeuticamente eficaz apropriada será determinada facilmente por aqueles habilitados na técnica.
As doses adequadas podem ser calculadas para pacientes de acordo com seu peso, por exemplo, as doses adequadas podem estar na faixa de 0,01 a 20 mg/kg, por exemplo, 0,1 a 20 mg/kg, por exemplo, 1 a 20 mg/kg, por exemplo, 10 a 20 mg/kg ou por exemplo, 1 a 15 mg/kg, por exemplo, 10 a 15 mg/kg.
Para tratar eficazmente as condições de uso na presente invenção em um ser humano, as doses adequadas podem estar dentro da faixa de 0,01 a 1000 mg, por exemplo, 0,1 a 1000 mg, por exemplo, 0,1 a 500 mg, por exemplo, 500 mg, por exemplo, 0,1 a 100 mg ou 0,1 a 80 mg ou 0,1 a 60 mg ou 0,1 a 40 mg ou por exemplo, 1 a 100 mg ou 1 a 50 mg, de uma construção de ligação de antígeno desta invenção, que pode ser administrada parenteralmente, por exemplo,
subcutaneamente, intravenosamente ou intramuscularmente.
Tal dose pode, se necessário, ser repetida em intervalos de tempo apropriados selecionados como apropriados pelo médico.
As construções de ligação de antígeno descritas neste podem 5 ser liofilizadas para o armazenamento e reconstituídas de uma maneira adequada antes do uso.
Esta técnica foi mostrada ser eficaz com as imunoglobulinas convencionais e técnicas de liofilização e reconstituição conhecidas na técnica podem ser utilizadas.
Existem diversos métodos conhecidos na técnica que podem ser usados para encontrar domínios de ligação de epítopo de uso na presente invenção.
O termo “biblioteca” refere-se a uma mistura de polipeptídeos ou ácidos nucleicos heterogêneos.
A biblioteca é composta de membros, cada um dos quais tendo sequência de polipeptídeo ou de ácido nucleico simples.
Até certo ponto, “biblioteca” é sinônimo de “repertório”. As diferenças de sequência entre os membros de biblioteca são responsáveis pela diversidade presente na biblioteca.
A biblioteca pode tomar a forma de uma mistura simples de polipeptídeos ou ácidos nucleicos ou podem estar na forma de organismos ou células, por exemplo, bactérias, vírus, células animais ou vegetais e outras, transfomadas por uma biblioteca de ácidos nucleicos.
Em um exemplo, cada organismo ou célula individual contém apenas um ou um número limitado de membros de biblioteca.
Vantajosamente, os ácidos nucleicos são incorporados nos vetores de expressão, a fim de permitir a expressão dos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos.
M um aspecto, portanto, uma biblioteca pode tomar a forma de uma população de organismos hospedeiros, cada organismo contendo uma ou mais cópias de um vetor de expressão contendo um número simples da biblioteca na forma de ácido nucleico que pode ser expressada para a produção de seu membro de polipeptídeo correspondente.
Desta maneira, a população de organismos hospedeiros tem o potencial para codificar um repertório grande de polipeptídeos diversos.
Uma “estrutura de trabalho universal” é uma sequência de estrutura de trabalho de anticorpo simples correspondendo às regiões de um 5 anticorpo conservado na sequência como definido por Kabat (“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Department of Health and Human Services) ou correspondente ao repertório ou estrutura de imunoglobulina de linha germinativa humana como definido por Chothia and Lesk, (1987) J.
Mol.
Biol. 196:910-917. Pode existir uma estrutura de trabalho simples ou uma série de tais estruturas de trabalho, que foram observadas permitir a derivação, virtualmente, de qualquer especificidade de ligação através da variação nas regiões hipervariáveis apenas.
Os alinhamentos e homologia, similaridade ou identidade de sequência de aminoácido e de nucleotídeo, como definido neste estão em uma forma de realização preparada e determinada usando-se o as sequências BLAST 2 de algoritmo, usando-se parâmetros default (Tatusova, T.
A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999)). O domínio de ligação de epítopo(s) e locais de ligação de antígeno pode ter, cada um, uma especificidade de ligação para um ligando genérico ou qualquer ligando alvo desejado, tais como proteínas humanas ou animais, incluindo citocinas, fatores de desenvolvimento, receptores de citocina, receptores do fator de desenvolvimento, enzimas (por exemplo, proteases), co-fatores para enzimas, Proteínas de ligação de DNA, lipídeos e carboidratos.
Os alvos adequados, incluindo citocinas, fatores de desenvolvimento, receptores de citocina, receptores do fator de desenvolvimento e outras proteínas incluem mas não são limitadas a: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1, CEA, CD40, Ligando de CD40, CD56, CD38, CD138, EGF, Receptor de EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FAPα, FGF-ácido, FGF-básico, fator de desenvolvimento de fibroblasto-10, ligando FLT3, Fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM- CSF, GF-81, albumina de soro humano, insulina, IFN-γ , IGFI, IGF-11, IL- 1α, IL-18, receptor de IL-1, receptor de IL-1 tipo 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, 5 IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inibina a, Inibina 8, IP-10, fator-2 de desenvolvimento de queratinócito (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, substância inibidora Mullerian, fator inibidor da colônia de monócito, proteína atraente de monócito, M-CSF, c-fms, v-fmsMDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-38, MIP-4, fator-1 inibidor de progenitor de mielóide (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, Fator de desenvolvimento de nervo, 8-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGFAA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, fator de célula tronco (SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, fator de necrose de tumor (TNF), TNF-α, TNF-β, receptor de TNF I, receptor de TNF II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, Receptor de VEGF 1, Receptor de VEGF 2, Receptor de VEGF 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ , HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, albumina de soro, vWF, proteínas amilóides (por exemplo, amilóide alfa), MMP12, PDK1, IgE e outros alvos divulgados neste.
Será estimado que esta lista de maneira alguma é exaustiva.
Em algumas formas de realização, a ligação ocorre a um alvo em tecido pulmonar, tal como um alvo selecionado do grupo que consiste de TNFR1, IL-1, IL-1R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL- 9R, IL-10, IL-12 IL-12R, IL-13, IL-13Rα1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), quimase, FGF, Furina, Endothelina-1, Eotaxinas (por exemplo, Eotaxina,
Eotaxina-2, Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, 1-309, integrinas, L-selectina, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMPs, neutrofil elastase, osteopontina, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, Trombina, Tim-1, TNF, TRANCE, Triptase, VEGF, VLA-4, VCAM, 5 α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfavbeta6, alfavbeta8, cMET, CD8, vWF, proteínas amilóides (por exemplo, amilóide alfa), MMP12, PDK1 e IgE.
Quando um sistema de apresentação (por exemplo, um sistema de apresentação que liga a função codificadora de um ácido nucleico e características funcionais do peptídeo ou polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico) é usado nos métodos descritos neste, por exemplo, na seleção de um dAb ou outro domínio de ligação de epítopo, é frequentemente vantajoso amplificar ou aumentar o número de cópia dos ácidos nucleicos que codificam os peptídeos ou polipeptídeos selecionados.
Isto fornece uma maneira eficiente de obter quantidades suficientes de ácidos nucleicos e/ou peptídeos ou polipeptídeos para séries adicionais de seleção, usando-se os métodos descritos neste ou outros métodos adequados ou para a preparação de repertórios adicionais (por exemplo, repertórios de maturação por afinidade). Desta maneira, em algumas formas de realização, os métodos para selecionar domínios de ligação de epítopo compreendem usar um sistema de apresentação (por exemplo, que liga a função codificadora de um ácido nucleico e características funcionais do peptídeo ou polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico, tal como apresentação de fago) e ainda compreende amplificar ou diminuir o número de cópias de um ácido nucleico que codifica um peptídeo ou polipeptídeo selecionado.
Os ácidos nucleicos podem ser amplificados usando-se quaisquer métodos adequados, tal como pela amplificação de fago, desenvolvimento celular ou reação de cadeia de polimerase.
Em um exemplo, os métodos utilizam um sistema de apresentação que liga a função codificadora de um ácido nucleico e as características físicas, químicas e/ou funcionais do polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico.
Um tal sistema de apresentação pode compreender uma pluralidade de pacotes genéticos replicáveis, tais como bacteriófagos ou 5 células (bactérias). O sistema de apresentação pode compreender uma biblioteca, tal como uma biblioteca de apresentação de bacteriófago.
A apresentação de bacteriófago é um exemplo de um sistema de apresentação.
Diversos sistemas de apresentação de bacteriófago adequados (por exemplo, sistemas de apresentação monovalente e multivalente) foram descritos. (Ver, por exemplo, Griffiths et al., Patente U.
S.
N° 6.555.313 B1 (incorporado neste por referência); Johnson et al., Patente U.
S.
N° 5,733,743 (incorporado neste por referência); McCafferty et al., Patente U.
S.
N° 5,969,108 (incorporado neste por referência); Mulligan-Kehoe, Patente U.
S.
N° 5,702,892 (Incorporado neste por referência); Winter, G. et al., Annu.
Rev.
Immunol. 12:433-455 (1994); Soumillion, P. et al., Appl.
Biochem.
Biotechnol. 47(2-3):175-189 (1994); Castagnoli, L. et al., Comb.
Chem.
High Troughput Screen, 4(2):121-133 (2001).) Os peptídeos ou polipeptídeos apresentados em um sistema de apresentação de bacteriófago podem ser apresentados e qualquer bacteriófago adequado, tal como um fago filamentoso (por exemplo, fd, ML3, F1), um fago lítico (por exemplo, T4, T7, lambda) ou um fago de RNA (por exemplo, MS2), por exemplo.
Em geral, uma biblioteca de fago que apresenta um repertório de peptídeos ou fagopolipeptídeos, como proteínas de fusão com uma proteína de revestimento de fago adequada (por exemplo, proteína fd pIII), é produzida ou fornecida.
A proteína de fusão pode apresentar os peptídeos ou polipeptídeos na ponta da proteína de revestimento de fago ou, se desejado em uma posição interna.
Por exemplo, o peptídeo ou polipeptídeo apresentados podem estar presentes em uma que é de terminal amino para o domínio 1 de pIII. (Domínio 1 de pIII também é referido como N1.) O polipeptídeo apresentado pode ser diferentemente fundido a pIII (por exemplo, o terminal N de domínio 1 de pIII) ou fundido a pIII usando-se um ligante.
Se desejado, a fusão ainda pode compreender um rótulo (por exemplo, epítopo myc, rótulo His). As bibliotecas que compreendem um 5 repertório de peptídeos ou polipeptídeos que são apresentados como proteínas de fusão com uma proteína de revestimento de fago, podem ser produzidas usando-se quaisquer métodos adequados, tal como pela introdução de uma biblioteca de vetores de fago ou vetores de fagomida que codificam os peptídeos ou polipeptídeos apresentados em bactérias hospedeiras adequadas e cultivo das bactérias resultantes para produzir fago (por exemplo, usando-se um fago auxiliar adequado ou complementando o plasmídeo se desejado). A biblioteca de fago pode ser recuperada da cultura usando-se qualquer método adequado, tal como precipitação ou centrifugação.
O sistema de apresentação pode compreender um repertório de peptídeos ou polipeptídeos que contêm qualquer quantidade desejada de diversidade.
Por exemplo, o repertório pode conter peptídeos ou polipeptídeos que têm sequências de aminoácido que corresponde ao polipeptídeos de ocorrência natural expressados por um organismo, grupo de organismos, tipo de tecido desejado ou célula desejada ou pode conter peptídeos ou polipeptídeos que têm sequências aleatórias ou aleatorizadas de aminoácido.
Se desejado, os polipeptídeos podem dividir um núcleo ou estrutura comuns.
Por exemplo, todos os polipeptídeos no repertório ou biblioteca podem ser fundamentados em uma estrutura selecionada da proteína A, proteína L, proteína G, um domínio de fibronectina, uma anticalina, CTLA4, uma enzima desejada (por exemplo, uma polimerase, uma celulase) ou um polipeptídeo da superfamília de imunoglobulina, tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, um domínio variável de anticorpo). Os polipeptídeos em um tal repertório ou biblioteca pode compreender regiões definidas de sequência de aminoácido aleatória ou aleatorizada e regiões de sequência de aminoácido comum.
Em certas formas de realização, todos ou substancialmente todos os polipeptídeos em um repertório são de um tipo desejado, tal como uma enzima desejada (por exemplo, uma polimerase) ou um fragmento de ligação de antígeno desejado de um anticorpo (por exemplo, 5 VH humano ou VL humano). Em algumas formas de realização, o sistema de apresentação de polipeptídeo compreende um repertório de polipeptídeos em que cada polipeptídeo compreende um domínio variável de anticorpo.
Por exemplo, cada polipeptídeo no repertório pode conter um VH, um VL ou um Fv (por exemplo, um Fv de cadeia simples). A diversidade da sequência de aminoácido pode ser introduzida em qualquer região desejada de um peptídeo ou polipeptídeo ou estrutura usando-se qualquer método adequado.
Por exemplo, a diversidade de sequência de aminoácido pode ser introduzida em uma região alvo, uma tal região de determinação de complementaridade de um domínio variável de anticorpo ou um domínio hidrofóbico, pela preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos diversificados usando-se quaisquer métodos de mutagênese adequados (por exemplo, PCR de fidelidade baixa, mutagênese mediada por oligonucleotídeo ou mutagênse direcionada ao local, diversificação usando-se protocolos códons NNK) ou qualquer outro método adequado.
Se desejado, uma região de um polipeptídeo a ser diversificada pode ser aleatorizada.
O tamanho dos peptídeos que formam o repertório é grandemente uma matéria de escolha e o tamanho de polipeptídeo uniforme não é requerido.
Os polipeptídeos no repertório podem ter, pelo menos, estrutura terciária (forma pelo menos um domínio). Seleção/Isolamento/Recuperação Um domínio de ligação de epítopo ou população de domínios podem ser selecionados, isolados e/ou recuperados a partir de um repertório ou biblioteca (por exemplo, em um sistema de apresentação) usando-se qualquer método adequado.
Por exemplo, um domínio é selecionado ou isolado com base em uma característica selecionável (por exemplo, característica física, característica química, característica funcional). As características funcionais selecionáveis adequadas incluem atividades biológicas dos peptídeos ou polipeptídeos no repertório, por exemplo, ligação 5 a um ligando genérico (por exemplo, um superantígeno), ligação a um ligando alvo (por exemplo, um antígeno, um epítopo, um substrato), que liga-se a um anticorpo (por exemplo, através de um epítopo expressado em um peptídeo ou polipeptídeo) e atividade catalítica. (Ver, por exemplo, Tomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655.) Em algumas formas de realização, o peptídeo ou polipeptídeo resistentes à protease são selecionados e/ou isolados de uma biblioteca ou repertório de peptídeos ou polipeptídeos em que substancialmente todos os domínios dividem uma característica selecionável comum.
Por exemplo, o domínio pode ser selecionado de uma biblioteca ou repertório em que, substancialmente, todos os domínios em que substancialmente todos os domínios ligam um ligando genérico comum, ligam um ligando alvo comum, liga (ou são ligados por) um anticorpo comum ou possui uma atividade catalítica comum.
Este tipo de seleção é particularmente útil na preparação de um repertório de domínios que são fundamentados em um peptídeo ou polipeptídeo parental que tem uma atividade biológica desejada, por exemplo, quando realiza-se a maturação por afinidade de um domínio variável simples de imunoglobulina.
A seleção com base na ligação a um ligando genérico comum pode produzir uma coleção ou população de domínios que contém todos ou substancialmente todos os domínios que foram componentes da biblioteca ou repertório original.
Por exemplo, domínios que ligam a um domínio alvo ou um ligando genérico, tal como proteína A, proteína L ou um anticorpo, pode ser selecionado, isolado e/ou recuperado por extração ou usando-se uma matriz de afinidade adequada.
A extração pode ser realizada pela adição de uma solução de ligando (por exemplo, ligando genérico,
ligando alvo) a um recipiente adequado (por exemplo, tubo, placa de Petri) e deixando o ligando a ser depositado ou revestido nas paredes do recipiente.
O ligando em excesso pode ser lavado e os domínios podem ser adicionados ao recipiente e o recipiente mantido sob condições adequadas para os peptídeos 5 ou polipeptídeos para a ligação do ligando imobilizado.
Os domínios não ligados podem ser lavados e os domínios ligados podem ser recuperados usando-se qualquer método adequado, tal como fragmentação ou diminuição do pH, por exemplo.
As matrizes de afinidade de ligando adequadas, em geral, contém um suporte sólido ou pérola (por exemplo, agarose) ao qual um ligando é covalentemente ou não covalentemente ligado.
A matriz de afinidade pode ser combinada com peptídeos ou polipeptídeos (por exemplo, um repertório que foi incubado com protease) usando-se um processo de batelada, um processo de coluna ou qualquer outro processo adequado sob condições adequadas para a ligação de domínios ao ligando na matriz.
Os domínios que não ligam-se à matriz de afinidade podem ser lavados e os domínios ligados podem ser eluídos e recuperados usando-se qualquer método adequado, tal como eluição com tampão de pH inferior, com um agente de desnaturação branda (por exemplo, uréia) ou com um peptídeo ou domínio que compete com a ligação ao ligando.
Em um exemplo, um ligando alvo biotinilado é combinado com um repertório sob condições adequadas para os domínios no repertório para a ligação ao ligando alvo.
Os domínios ligados são recuperados usando-se avidina ou estreptavidina imobilizada (por exemplo, em uma pérola). Em algumas formas de realização, o ligando genérico ou alvo é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste.
Os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno que ligam-se a características estruturais de peptídeos ou polipeptídeos que são substancialmente conservados nos peptídeos ou polipeptídeos de uma biblioteca ou repertório são particularmente úteis como ligandos genéricos.
Os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno adequados para o uso como ligandos para o isolamento, seleção e/ou recuperação de peptídeos ou polipeptídeos resistentes à protease podem ser monoclonal ou policlonal e podem ser preparados usando-se quaisquer métodos adequados. 5 BIBLIOTECAS/REPERTÓRIOS As bibliotecas que codificam e/ou contêm domínios de ligação de epítopo de protease podem ser preparadas ou obtidas usando-se quaisquer métodos adequados.
Uma biblioteca pode ser projetada para codificar domínios com base em um domínio ou estrutura de interesse (por exemplo, um domínio selecionado de uma biblioteca) ou pode ser selecionado de outra biblioteca usando-se os métodos descritos neste.
Por exemplo, uma biblioteca enriquecida em domínios pode ser preparada usando-se um sistema de apresentação de polipeptídeo adequado.
As bibliotecas que codificam um repertório de um tipo desejado de domínio podem ser facilmente produzidas usando-se qualquer método adequado.
Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que codifica um tipo desejado de polipeptídeo (por exemplo, um domínio variável de imunoglobulina) pode ser obtido e uma coleção de ácidos nucleicos cada um contendo uma ou mais mutações pode ser preparada, por exemplo, pela amplificação do ácido nucleico usando-se um sistema de reação de cadeia de polimerase propensa ao erro (PCR), pela mutagênese química (Deng et al., J.
Biol.
Chem., 269:9533 (1994)) ou suando-se cepas mutadoras bacterianas (Low et al., J.
Mot.
Biol., 260:359 (1996)). Em outras formas de realização, as regiões particulares do ácido nucleico podem ser alvejadas para a diversificação.
Os métodos para a mutação de posições selecionadas também são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, o uso de oligonucleotídeos em desacordo ou oligonucleotídeos degenerados, com ou sem o uso de PCR.
Por exemplo, as bibliotecas de anticorpo sintético foram criadas pelo alvejamento das mutações aos arcos de ligação de antígeno.
As regiões de anticorpos aleatórios ou semi-aleatórios H3 e L3 foram anexadas aos segmentos do gene de imunoblulina V da linha germinativa para a produção de bibliotecas grandes com regiões de estrutura não mutadas (Hoogenboom e Winter (1992) 5 supra; Nissim et al. (1994) supra; Griffiths et al. (1994) supra; DeKruif et al. (1995) supra). Tal diversificação foi estendida para incluir alguns ou todos os outros arcos de ligação de antígeno (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2:100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13:475; Morphosys, WO 97/08320, supra). Em outras formas de realização, as regiões particulares do ácido nucleico pode ser alvejado para a diversificação, por exemplo, uma estratégia de PCR de duas etapas que utilizam o produto do primeiro PCR como um “mega-iniciador.” (Ver, por exemplo, Landt, O. et al., Gene 96:125- 128 (1990).) A diversificação alvejada também pode ser realizada, por exemplo, por SOE PCR. (Ver, por exemplo, Horton, R.M. et al., Gene 77:61- 68 (1989).) A diversidade da sequência em posições selecionadas pode ser atingida pela alteração de uma sequência codificadora que especifica a sequência do polipeptídeo tal que diversos aminoácidos possíveis (por exemplo, todos os 20 ou uma subsérie destes) pode ser incorporada naquela posição.
Usando-se a nomenclatura IUPAC, o códon mais versátil é o NNK, que codifica todos os aminoácidos bem como o códon de interrupção TAG.
O códon NNK pode ser usado a fim de introduzir a diversidade requerida.
Outros códons que atingem as mesmas extremidades também são de uso, incluindo o NNN, que leva à produção do códons de partida adicionais TGA e TAA.
Um tal método alvejado pode permitir o espaço de sequência total em uma área alvo a ser explorada.
Alguns bibliotecas compreendem os domínios que são membros da superfamília de imunoglobulina (por exemplo, anticorpos ou porções destes). Por exemplo, as bibliotecas podem compreender domínios que têm uma conformação de cadeia principal conhecida. (Ver, por exemplo, Tomlinson et al., WO 99/20749.) As bibliotecas podem ser preparadas em um plasmídeo ou vetor adequados.
Como usado neste, o vetor refere-se a um elemento distinto que é usado para a introdução de DNA heterólogo nas 5 células para a expressão e/ou replicação destes.
Qualquer vetor adequado pode ser usado, incluindo plasmídeos (por exemplo, plasmídeos bacterianos), vetores virais ou de bacteriófagos, cromossomos artificiais e vetores epissomais.
Tais vetores podem ser usadas para a clonagem e a mutagênese simples ou um vetor de expressão pode ser usado para conduzir a expressão da biblioteca.
Os vetores e os plasmídeos contém, usualmente um ou mais locais de clonagem (por exemplo, um poliligante), uma origem de replicação e pelo menos um gene marcador selecionável.
Os vetores de expressão ainda podem conter elementos para conduzir a transcrição e a tradução de um polipeptídeo, tal como um elemento intensificador, promotor, sinal de terminação de transcrição, sequências sinalizadoras e outros.
Estes elementos podem ser dispostos de uma tal maneira a fim de serem operacionalmente ligados a uma inserção clonada que codifica um polipeptídeo, tal que o polipeptídeo é expressado e produzido quando um tal vetor de expressão é mantido sob condições adequadas para a expressão (por exemplo, em uma célula hospedeira adequada). Os vetores de clonagem e de expressão, em geral, contém sequências de ácido nucleico que permitem que o vetor replique-se em uma ou mais células hospedeiras selecionadas.
Tipicamente, nos vetores de clonagem, esta sequência é uma que permite que o vetor replique-se independentemente do DNA cromossômico hospedeiro e inclui as origens de replicação ou sequência que se replicam de maneira autônoma.
Tas sequências são bem conhecidas por uma variedade de bactérias, levedura e vírus.
A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias de Gram-negativo, a origem de plasmídeo de 2 mícrons é adequada para a levedura e várias origens virais (por exemplo, SV40, adenovírus) são úteis para a clonagem de vetores em células de mamíferos.
Em geral, a origem de replicação não é necessária para os vetores de expressão de mamífero, a não ser que estes sejam usados em células de 5 mamíferos capazes de replicar altos níveis de DNA, tais como células COS.
Os vetores de clonagem e de expressão podem conter um gene de seleção também referido como marcador selecionável.
Tais genes marcadores codificam uma proteína necessária para a sobrevivência ou desenvolvimento de células hospedeiras transformadas em um meio de cultura seletivo.
As células hospedeiras não transformadas com o vetor contendo o gene de seleção, portanto, não sobreviverá no meio de cultura.
Os genes de seleção típicos codificam proteínas que conferem resistência aos antibióticos e outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, deficiências auxotróficas complementares ou fornece nutrientes críticos não disponíveis nos meios de desenvolvimento.
Tais vetores de expressão podem conter diversos componentes, por exemplo, uma origem de replicação, um gene marcador selecionável, um ou mais elementos de controle de expressão, tais como um elemento de controle de transcrição (por exemplo, promotor, intensificador, terminador) e/ou um ou mais sinais de tradução, uma sequência sinalizadora ou sequência líder e outros.
Os elementos de controle de expressão e uma sequência sinalizadora ou líder, se presente, pode ser fornecida pelo vetor ou outra fonte.
Por exemplo, as sequências de controle de transcrição e/ou tradução de um ácido nucleico clonado que codifica uma cadeia de anticorpo pode ser usada para direcionar a expressão.
Um promotor pode ser fornecido para a expressão em uma célula hospedeira desejada.
Os promotores podem ser constitutivos ou indutíveis.
Por exemplo, um promotor pode ser operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica um anticorpo, cadeia de anticorpo ou porção destes, tal que isto direciona a transcrição do ácido nucleico.
Uma variedade de promotores adequados para os hospedeiros procarióticos (por exemplo, os sistemas de promotor de β-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, o sistema de promotor de triptofano (trp), promotores lac, tac, T3, T7 para E. coli) e 5 eucarióticos (por exemplo, promotor precoce ou posterior de vírus símio 40, promotor de repetição de terminal longo do vírus do sarcoma de Rous, promotor de citomegalovírus, promotor posterior de adenovírus, promotor de EG-1a promoter) são disponíveis.
Além disso, os vetores de expressão tipicamente compreendem um marcador selecionável para a seleção de células hospedeiras que carregam o vetor, e, no caso de um vetor replicável de expressão, uma origem de replicação.
Os genes que codificam produtos que conferem resistência a antibiótico ou medicamento são marcadores selecionáveis comuns e podem ser usados em gene de β-lactamase procariótico (por exemplo, gene de β- lactamase (resistência a ampicilina), o gene Tet para a resistência de tetraciclina) células eucarióticas (por exemplo, neomicina (G418 ou geneticina), gpt (ácido micofenólico), genes de resistência a ampicilina ou higromicina). Os genes marcadores de diidrofolato redutase permitem a seleção com metotrexato em uma variedade de hospedeiros.
Os genes que codifica o produto de gene de marcadores auxotróficos do hospedeiro (por exemplo, LEU2, URA3, HIS3) são frequentemente usados como marcadores selecionáveis em levedura.
O uso de vetores virais (por exemplo, baculovírus) ou de fago e os vetores que são capazes de integrar no genoma da célula hospedeira, tais como vetores retrovirais, também são considerados.
Os vetores de expressão adequados para a expressão em células procarióticas (por exemplo, células bacterianas, tais como E. coli) ou células de mamífero incluem, por exemplo, um vetor pET (por exemplo, pET- 12a, pET-36, pET-37, pET-39, pET-40, Novagen e outros), um vetor de fago (por exemplo, pCANTAB 5 E, Pharmacia), pRIT2T (vetor de fusão de
Proteína A, Pharmacia), pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pCMVSCRIPT, pFB, pSG5, pXT1 (Stratagene, La Jolla, CA), pCDEF3 (Goldman, L.A., et al., Biotechniques, 21:1013-1015 (1996)), pSVSPORT (GibcoBRL, Rockville, MD), pEF-Bos 5 (Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)) e outros.
Os vetores de expressão que são adequados para o uso em vários hospedeiros de expressão, tais como células procarióticas (E. coli), células de inseto (células de Drosofila Schnieder S2, Sf9), levedura (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) e células de mamífero (por exemplo, células COS) são disponíveis.
Alguns dos exemplos de vetores são vetores de expressão que permitem a expressão de uma sequência de nucleotídeo que corresponde a um membro de biblioteca de polipeptídeo.
Desta maneira, a seleção com ligandos genéricos e/ou alvo pode ser realizada pela propagação separada e expressão de um clone simples que expressa o membro de biblioteca de polipeptídeo.
Como descrito acima, um sistema de apresentação de seleção particular é apresentação de bacteriófago.
Desta maneira, os vetores de fago ou de fagomida podem ser usados, por exemplo, os vetores podem ser vetores de fagomida que têm uma origem de E. coli de replicação (para a replicação de filamento duplo) e também uma origem de fago de replicação (para a produção de DNA de filamento duplo). A manipulação e a expressão de tais vetores é bem conhecido na técnica (Hoogenboom e Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra). Resumidamente, o vetor pode conter um gene de β-lactamase para conferir a seletividade no promotor de fagomida e lac a montante de um cassete de expressão que pode conter uma sequência líder adequada, um local de clonagem múltiplo, um ou mais rótulos de peptídeo, um ou mais códons de interrupção TAG e a proteína de fago pIII.
Desta maneira, usado-se várias cepas supressoras e não supressoras de E. coli e com a adição de glicose, iso-propil tio-13-D-galactosídeo (IPTG) ou um fago auxiliar, tal como VCS ML3, o vetor é capaz de se replicar como um plasmídeo sem nenhuma expressão, produz quantidades grandes do membro de biblioteca de polipeptídeo apenas ou fago do produto, alguns dos quais contém pelo menos uma cópia da fusão de polipeptídeo-pIII na sua superfície. 5 Os domínios variáveis de anticorpo pode compreender um local de ligação de ligando alvo e/ou um local de ligação de ligando genérico.
Em certas formas de realização, o local de ligação de ligando genérico é um local de ligação para um superantígeno, tal como proteína A, proteína L ou proteína G.
Os domínios variáveis podem ser fundamentados em qualquer domínio variável desejado, por exemplo, um VH humano (por exemplo, VH 1a, VH 1b, VH 2, VH 3, VH 4, VH 5, VH 6), um Va humano, (por exemplo, VM, V2JI, VMII, VMV, V2VI ou VK1) ou um VK humano (por exemplo, VK2, VK3, VK4, VK5, VK6, VK7, VK8, VK9 ou VK10). Ainda, uma outra categoria de técnicas envolve a seleção de repertórios em compartimentos artificiais, que permitem a ligação de um gene com seu produto de gene.
Por exemplo, um sistema de seleção em que os ácidos nucleicos que codificam produtos de gene desejáveis podem ser selecionáveis em microcápsulas formadas por emulsões de água-em-óleo é descrito em WO99/02671, WO00/40712 e Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6. Os elementos genéticos que codificam um produto de gene tendo uma atividade desejada são compartimentalizados em microcápsulas e então transcrito e/ou traduzido para a produção de seus produtos genéticos respectivos (RNA ou proteína) dentro das microcápsulas.
Os elementos genéticos que produzem o produto de gene tendo atividade desejada são subsequentemente classificados.
Este método seleciona os produtos genéticos de interesse pela detecção da atividade desejada por uma variedade de meios.
Caracterização dos domínios de ligação de epítopo.
A ligação de um domínio a seu antígeno ou epítopo específico pode ser testada pelos métodos que serão familiares para aqueles habilitados na técnica e incluem ELISA.
Em um exemplo, a ligação é testada usando-se o ELISA de fago monoclonal.
O ELISA de fago pode ser realizado de acordo com qualquer 5 procedimento adequado: um protocolo exemplar é apresentado abaixo.
As populações de fago produzidos em cada série de seleção podem ser avaliadas para a ligação por ELISA ao antígeno ou epítopo selecionado, para identificar os anticorpos de fago “policlonal”. O fago a partir das colônias bacterianas infectadas simples a partir destas populações podem ser então avaliadas por ELISA para identificar os anticorpos de fago “monoclonais”. Também é desejável avaliar os fragmentos de anticorpo solúvel para a ligação ao antígeno ou epítopo e isto também pode ser garantido por ELISA usando-se reagentes, por exemplo, contra um rótulo de terminal C ou N (ver, por exemplo, Winter et al. (1994) Ann.
Rev.
Immunology 12, 433-55 e referências citadas neste.
A diversidade dos anticorpos monoclonais de fago selecionados também podem ser estimados pela eletroforese em gel de produtos de PCR (Marks et al. 1991, supra; Nissim et al. 1994 supra), sondagem (Tomlinson et al., 1992) J.
Mol.
Biol. 227, 776) ou pelo sequenciamento do DNA do vetor.
E.
Estrutura de dAbs No caso que os dAbs são selecionados de repertórios de gene V selecionados, por exemplo, usando-se a tecnologia de apresentação de fago como descrito neste, então, estes domínios variáveis compreende uma região de estrutura universal, tal que estes podem ser reconhecidos por um ligando genérico específico como definido neste.
O uso de estruturas universais, ligandos genéricos e outros é descrito no WO99/20749. Quando os repertórios de gene V são usados, a variação na sequência de polipeptídeo pode estar localizada dentro dos arcos estruturais dos domínios variáveis.
As sequências de polipeptídeo do domínios variável pode ser alterada pelo embaralhamento do DNA ou por mutação a fim de intensificar a interação de cada domínio variável com seu par complementar.
O embaralhamento de DNA é conhecido na técnica e explicado, por exemplo, 5 por Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391 e Patente U.
S.
N° 6,297,053, ambos os quais são incorporados neste por referência.
Outros métodos de mutagênese são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
Estruturas para o uso na Construção de dAbs i.
Seleção da Conformação de cadeia principal Os membros da superfamília de imunoglobulina também dividem uma dobra similar para a sua cadeia de peptídeo.
Por exemplo, embora os anticorpos sejam altamente diversos em termos de sua sequência primária, comparação das sequências e estruturas cristalográficas que revelaram que, ao contrario da expectativa, cinco dos seis arcos de ligação de antígeno de anticorpos (H1, H2, L1, L2, L3) adotam um número limitado de conformações de cadeia principal ou estruturas canônicas (Chothia e Lesk (1987) J.
Mol.
Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877). A análise dos comprimentos de arco e resíduos chave permitiram, portanto, a predição das conformações de cadeia principal de H1, H2, L1, L2 e L3 encontrados na maioria dos anticorpos humanos (Chothia et al. (1992) J.
Mol.
Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J.
Mol.
Biol., 264: 220). Embora a região H3 seja muito mais diversa em termos de sequência, comprimento e estrutura (devido ao uso de D segmentos), isto forma um número limitado de conformações de cadeia pesada para comprimentos de arco curto que dependem do comprimento e da presença de resíduos particulares ou tipos de resíduos, em posições chave no arco e na estrutura do anticorpo (Martin et al. (1996) J.
Mol.
Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1). Os dAbs são vantajosamente montados a partir de bibliotecas de domínios, tais como bibliotecas de domínios VH e/ou bibliotecas de domínios VL.
Em um aspecto, as bibliotecas de domínios são projetadas em cada certo comprimento de arco e os resíduos chave foram escolhidos para garantir que a conformação de cadeia principal dos membros seja conhecida. 5 Vantajosamente, existem conformações reais de moléculas de superfamília de imunoglobulina encontradas em estado natural, para minimizar as chances de que estas sejam não funcionais como debatido acima. os segmentos genéticos V de linha germinativa servem como uma estrutura básica adequada para a construção de anticorpo ou bibliotecas receptoras de célula T outras sequências também são de uso.
As variações podem ocorrer em uma frequência baixa, tal que um pequeno número de membros funcionais podem possuir uma conformação de cadeia principal alterada, que não afeta sua função.
A teoria da estrutura canônica também é de uso para estimar diversas conformações de cadeia principal diferentes codificadas por ligandos, para predizer a conformação de cadeia principal com bases em sequências de ligando aos resíduos escolhidos para a diversificação que não afeta a estrutura canônica.
É conhecido que, no domínio de VK humano, o arco L1 pode adotar uma de quatro estruturas canônicas, o arco L2 tem uma estrutura canônica simples e que 90 % de domínios VK humanos adotam uma de quatro ou cinco estruturas canônicas para o arco L3 (Tomlinson et al. (1995) supra); desta maneira, no domínio de VK apenas, as estruturas canônicas diferentes podem combinar para a criação de uma faixa de conformações de cadeia principal.
Dando-se que o domínio Vλ codifica uma faixa diferente de estruturas canônicas para os arcos L1, L2 e L3 e que os domínios VK e Vλ podem formar pares com qualquer domínio VH que pode codificar diversas estruturas canônicas aos arcos H1 e H2, o número de combinações de estruturas canônicas observadas para estes cinco arcos é muito grande.
Isto implica que a geração de diversidade na conformação de cadeia pesada pode ser essencial para a produção de uma faixa ampla de especificidades de ligação.
Entretanto, por construção de uma biblioteca de anticorpo com base em uma conformação de cadeia principal conhecida simples foi observado, ao contrário da expectativa, que a diversidade na 5 conformação de cadeia principal não é requerida para gerar diversidade suficiente para alvejar substancialmente todos os antígenos.
Ainda mais surpreendentemente, a conformação de cadeia principal simples necessita ser uma estrutura de consenso – uma conformação de ocorrência natural simples pode ser usada como a base para uma biblioteca inteira.
Desta maneira, em um aspecto particular, o dAbs possui uma conformação de cadeia principal conhecida simples.
A conformação de cadeia principal simples que é escolhida pode ser corriqueira entre as moléculas da superfamília de imunoglobulina do tipo em questão.
Uma conformação é corriqueira quando um número significante de moléculas de ocorrência natural é observada adotá-la.
Consequentemente, em um aspecto, a ocorrência natural das conformações de cadeia principal diferente para cada arco de ligação de um domínio de imunoglobulina é considerada separadamente e então um domínio variável de ocorrência natural é escolhido possuindo a combinação desejada de conformações de cadeia principal para os arcos diferentes.
Se nenhum estiver disponível, o equivalente mais próximo pode ser escolhido.
A combinação desejada de conformações de cadeia principal para os arcos diferentes pode ser criada pela seleção dos segmentos de gene de linha germinativa que codifica as conformações de cadeia principal desejadas.
Em um exemplo, os segmentos de gene de linha germinativa selecionados são frequentemente expressados na natureza e, em particular, estes podem ser os mais frequentemente expressados de todos os segmentos genéticos de linha germinativa natural.
No projeto de bibliotecas, a incidência das conformações de cadeia principal diferentes para cada um dos seis arcos de ligação de antígeno podem ser considerados separadamente.
Para H1, H2, L1, L2 e L3, uma dada conformação que é adotada entre 20 % e 100 % dos arcos de ligação de antígeno de moléculas de ocorrência natural é escolhida.
Tipicamente, sua 5 incidência observada está acima de 35 % (isto é, entre 35 % e 100 %) e, idealmente, acima de 50 % ou ainda acima de 65 %. Visto que a vasta maioria de arcos H3 não têm estruturas canônicas, é preferível selecionar uma conformação de cadeia principal que é corriqueira entre aqueles arcos que apresentam estruturas canônicas.
Para cada um dos arcos, a conformação que é mais frequente no repertório natural é, portanto, selecionada.
Em anticorpos humanos, as estruturas canônicas mais populares (CS) para cada arco são como segue: H1 - CS 1 (79 % do repertório expressado), H2 - CS 3 (46 %), L1 - CS 2 de VK (39 %), L2 - CS 1 (100 %), L3 - CS 1 de VK(36 %) (o cálculo assume uma razão K:λ, razão de 70:30, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp.
Quant.
Biol., 48: 133). Para os arcos H3 que têm estruturas canônicas, um comprimento de CDR3 (Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S.
Department of Health and Human Services) de sete resíduos com uma ponte de sal do resíduo 94 ao resíduo 101 parece ser o mais comum.
Existem pelo menos 16 sequências de anticorpo humanas na biblioteca de dados EMBL com o comprimento H3 requerido e resíduos chave para formar esta conformação e pelo menos duas estruturas cristalográficas no banco de dados de proteína que podem ser usados com uma base para a modelagem de anticorpo (2cgr e 1tet). Os segmentos de gene de linha germinativa mais frequentemente expressados do que esta combinação de estruturas canônicas são o segmento VH 3-23 (DP- 47), o segmento JH JH4b, o segmento VK 02/012 (DPK9) o segmento JK 41. Os segmentos VH DP45 e DP38 também são adequados.
Estes segmentos podem, portanto, serem usados em combinação com uma base para a construção de uma biblioteca com a conformação de cadeia principal simples desejada.
Alternativamente, em vez de escolher uma conformação de cadeia principal simples com base na ocorrência natural das conformações de cadeia principal diferentes para cada um dos arcos de ligação em isolamento, 5 a ocorrência natural de combinações de conformações de cadeia é usada como a base para escolher a conformação de cadeia principal simples.
No caso de anticorpos, por exemplo, a ocorrência natural de combinações de estruturas canônicas para quaisquer dois, três, quatro, cinco ou para todos os seis dos arcos de ligação de antígeno pode ser determinada.
Aqui, a conformação escolhida pode ser corriqueira nos anticorpos de ocorrência natural e pode ser observada mais frequentemente no repertório natural.
Desta maneira, em anticorpos humanos, por exemplo, quando as combinações naturais dos cinco arcos de ligação de antígeno, H1, H2, L1, L2 e L3, são considerados, a combinação mais frequente de estruturas canônicas é determinada e então combinada com a conformação mais popular para o arco H3, como uma base para a escolha da conformação de cadeia principal simples.
Diversificação da sequência canônica Selecionando-se diversas conformações de cadeia principal conhecidas ou uma conformação de cadeia principal conhecida simples, os dAbs podem ser construídos pela variação do local de ligação da molécula a fim de gerar um repertório com dispersidade estrutural e/ou funcional.
Isto significa que as variantes são geradas, tal que estas possuem diversidade suficiente em sua estrutura e/ou em sua função de modo que estes sejam capazes de fornecer uma faixa de atividades.
A diversidade desejada é tipicamente gerada pela variação da molécula selecionada em uma ou mais posições.
As posições a serem mudadas podem ser escolhidas aleatoriamente ou estes podem ser selecionados.
A variação pode ser então atingida pela aleatorização, durante a qual, o aminoácido residente é substituído por qualquer aminoácido ou análogo deste, natural ou sintético, produzindo um número muito grande de variantes ou substituindo o aminoácido residente com um ou mais de uma sub-série definida de aminoácidos, produzindo um número mais limitado de variantes. 5 Vários métodos foram relatados para a introdução de tal diversidade.
O PCR propenso ao erro PCR (Hawkins et al. (1992) J.
Mol.
Biol., 226: 889), a mutagênese química (Deng et al. (1994) J.
Biol.
Chem., 269: 9533) ou cepas mutadoras bacterianas (Low et al. (1996) J.
Mol.
Biol., 260: 359) podem ser usadas para a introdução de mutações aleatórias nos genes que codificam as moléculas.
Os métodos para a mutação de posições selecionadas também são bem conhecidas na técnica e incluem o uso de oligonucleotídeos em desacordo ou oligonucleotídeos degenerados, com ou sem o uso de PCR.
Por exemplo, diversas bibliotecas de anticorpo sintéticas foram criadas pelo alvejamento de mutações aos arcos de ligação de antígeno.
A região H3 de um fab de ligação de toxóide do tétano humano foi aleatorizado para a criação de uma faixa de novas especificidades de ligação (Barbas et al. (1992) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA, 89: 4457). As regiões H3 e L3 aleatórias ou semi-aleatórias foram anexadas aos segmentos de gene V de linha germinativa para a produção de bibliotecas grandes com regiões de estrutura não mutadas (Hoogenboom & Winter (1992) J.
Mol.
Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J.
Mol.
Biol., 248: 97). Tal diversificação foi estendida para incluir alguns ou todos os outros arcos de ligação de antígeno (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO97/08320, supra). Visto que a aleatorização do arco tem potencial para a criação de aproximadamente mais do que 1015 estruturas para H3 sozinho e um número similarmente grande de variantes para os outros cinco arcos, não é praticável usar tecnologia de transformação corrente ou ainda usar sistemas isentos de células para produzir uma biblioteca que representa todas as combinações.
Por exemplo, em uma das maiores bibliotecas construídas até hoje, 6 x 1010 anticorpos diferentes, o que é apenas uma fração da diversidade 5 potencial para um biblioteca deste projeto, foram gerados (Griffiths et al. (1994) supra). Em uma forma de realização, apenas aqueles resíduos que estão diretamente envolvidos na criação ou modificação da função desejada da moléculas são diversificados.
Para muitas moléculas, a função será a ligação a um alvo e, portanto, a diversidade deve ser concentrada no local de ligação alvo, enquanto evita-se mudar os resíduos que são cruciais ao empacotamento total da molécula ou para manter a conformação de cadeia principal escolhida.
Em um aspecto, as bibliotecas de dAbs são usadas em que apenas aqueles resíduos no local de ligação de antígeno são variados.
Estes resíduos são extremamente diversos no repertório de anticorpo humano e são conhecidos para realizar os contatos em complexos de anticorpo/antígeno de resolução alta.
Por exemplo, em L2 é conhecido que as posições 50 e 53 são diversas em anticorpos de ocorrência natural e são observados fazer contato com o antígeno.
Em contraste, o método convencional deve ser para diversificar todos os resíduos na Região de Determinação de Complementaridade correspondente (CDR1) como definido por Kabat et al. (1991, supra), alguns dos sete resíduos em comparação com os dois diversificados na biblioteca.
Isto representa uma melhora significante em termos da diversidade funcional requerida para criar uma faixa de especificidade de ligação de antígeno.
Em estado natural, a diversidade do anticorpo é o resultado de dois processos: recombinação somática dos segmentos de gene V, D e J de linha germinativa para criar um repertório primário simples (denominada linha germinativa e diversidade funcional) e hipermutação somática dos genes V redispostos resultantes.
A análise de sequências de anticorpo humano mostrou que a diversidade no repertório de terapia no repertório primário está focalizada no centro do local de ligação de antígeno visto que a hipermutação 5 somática propaga diversidade a regiões na periferia do local de ligação de antígeno que são altamente conservadas no repertório primário (ver Tomlinson et al. (1996) J.
Mol.
Biol., 256: 813). Esta complementaridade evoluiu como uma estratégia eficiente para o espaço de sequência de pesquisa e, embora aparentemente único para os anticorpos, isto pode ser facilmente aplicado a outros repertórios de polipeptídeo.
Os resíduos que são variados são uma subsérie daqueles que formam o local de ligação para o alvo.
As subséries diferentes (incluindo sobreposição) de resíduos no local de ligação alvo são diversificados em estágios diferentes durante a seleção, se desejado.
No caso de um repertório de anticorpo, um repertório ‘simples’ inicial é criado onde alguns, mas não todos os resíduos no local de ligação de antígeno são diversificados.
Como usado neste contexto, o termo “simples” ou “fictício” refere-se a moléculas de anticorpo que não têm nenhum alvo predeterminado.
Estas moléculas assemelham-se àquelas que são codificadas pelos genes de imunoglobulina de um indivíduo que não sofreu a diversificação imune, como é o caso de indivíduos fetais ou recém- nascidos, cujos sistemas imunes ainda não foram desafiados por uma variedade de estímulos antigênicos.
Este repertório é então selecionado contra uma faixa de antígenos ou epítopos.
Se requerido, a diversidade adicional pode ser então introduzida fora da região diversificada no repertório inicial.
Este repertório maturado pode ser selecionado para função, especificidade ou afinidade modificadas.
Será entendido que as sequências descritas neste incluem sequências que são substancialmente idênticas, por exemplo, sequências que são pelo menos 90 % idênticas, por exemplo, que são pelo menos 91 % ou pelo menos 92 % ou pelo menos 93 % ou pelo menos 94 % ou pelo menos 95 % ou pelo menos 96 % ou pelo menos 97 % ou pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % idênticas às sequências descritas neste.
Para os ácidos nucleicos, o termo “identidade substancial” 5 indica que dois ácidos nucleicos ou sequências designadas destes, quando otimamente alinhados e comparados, são idênticos, com inserções ou anulações de nucleotídeo apropriadas, em pelo menos cerca de 80 % dos nucleotídeos, usualmente pelo menos cerca de 90 % a 95 % e mais preferivelmente pelo menos cerca de 98 % a 99,5 % dos nucleotídeos.
Alternativamente, a identidade substancial existe quando os segmentos se hibridizarão sob as condições de hibridização seletivas, ao complemento do filamento.
Para sequências de nucleotídeo e de aminoácido, o termo “idêntico” indica o grau de identidade entre os dois ácidos nucleicos ou sequências de aminoácido quando otimamente alinhado e comparado com inserções ou anulações apropriadas.
Alternativamente, a identidade substancial existe quando os segmentos de DNA se hibridizarem sob condições de hibridização seletivas ao complemento do filamento.
A identidade percentual entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas divididas pelas sequências (isto é % de identidade = # de posições idênticas/total # de posições vezes 100), levando em conta o número de fendas e o comprimento de cada fenda, que necessita ser introduzido para o alinhamento ótimo das duas sequências.
A comparação das sequências e a determinação da identidade percentual entre duas sequências pode ser realizada usando-se um algoritmo matemáticos, como descrito nos exemplos não limitantes abaixo.
A identidade percentual entre as duas sequências de nucleotídeo pode ser determinada usando-se o programa GAP no pacote de software GCG, usando-se uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de fenda de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A identidade percentual entre dois nucleotídeos ou sequências de aminoácido também pode ser determinadas usando-se o algoritmo de E.
Meyers e W.
Miller (Comput.
Appl.
Biosci., 4:11-17 (1988)) que foi incorporado no 5 programa ALIGN (versão 2.0), usando-se uma tabela de peso de resíduo PAML20, uma penalidade de comprimento de fenda de 12 e uma penalidade de fenda de 4. Além disso, a identidade percentual entre as duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch (J.
Mol.
Biol. 48:444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG, usando-se uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250 e um peso e fenda de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Por meio de exemplo, uma sequência de polinucleotídeo da presente invenção pode ser idêntica à sequência de referência da SEQ ID N°: 122, que deve ser 100 % idêntica ou esta pode incluir até um certo número inteiro de alterações de nucleotídeo em comparação com a sequência de referência.
Tais alterações são selecionadas do grupo que consiste de pelo menos uma anulação, substituição, incluindo transição e transversão ou inserção do nucleotídeo e em que as ditas alterações podem ocorrer nas posições de terminal 5’ ou 3’ da sequência de nucleotídeo de referência ou qualquer entre aquelas posições terminais, espalhadas individualmente entre os nucleotídeos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.
O número de alterações de nucleotídeo é determinado pela multiplicação do número total de nucleotídeos na SEQ ID N°: 122 pela porcentagem numérica da identidade percentual respectiva (dividido por 100) e subtraindo-se aquele produto do dito número total de nucleotídeos na SEQ ID N°: 122 ou; nn ≤ xn - (xn • y), em que nn é o número de alterações de nucleotídeo, xn é o número total de nucleotídeos na SEQ ID N°: 122 e y é 0,50 para 50 %, 0,60 para 60 %, 0,70 para 70 %, 0,80 para 80 %, 0,85 para 85 %, 0,90 para 90 %, 0,95 para 95 %, 0,97 para 97 % ou 1,00 para 100 % e em que qualquer produto não inteiro de xn e y é arredondado abaixo do número inteiro mais 5 próximo antes de subtraí-lo de xn.
As alterações da sequência de polinucleotídeo da SEQ ID N°: 122 pode criar mutações sem sentido, com sentido errado ou mudança de estrutura nesta sequência codificadora e desse modo altera o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo seguindo tais alterações.
Similarmente, em um outro exemplo, a sequência de polipeptídeo da presente invenção pode ser idêntica à sequência de referência pela SEQ ID N°: 26, que deve ser 100 % idêntica ou pode incluir até certos números inteiros de alterações de aminoácido em comparação com a sequência de referência tal que a % de identidade é menor do que 100 %. Tais alterações são selecionadas do grupo que consiste de pelo menos uma anulação, substituição, incluindo substituição ou inserção conservativa e não conservativa de aminoácido e em que as ditas alterações podem ocorrer nas posições de terminal amino ou carbóxi da sequência de polipeptídeo de referência ou em qualquer lugar entre aquelas posições terminais, espalhadas individualmente entre os aminoácidos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.
O número de alterações de aminoácido para uma dada % de identidade é determinada pela multiplicação do número total de aminoácidos na sequência de polipeptídeo codificado pela SEQ ID N°: 26 pela porcentagem numérica da identidade percentual respectiva (dividido por 100) e depois subtraindo-se aquele produto do dito número total de aminoácidos na sequência de polipeptídeo codificado pela SEQ ID N°: 26, ou na ≤ xa - (xa • y), em que na é o número de alterações de aminoácido, xa é o número total de aminoácidos na sequência de polipeptídeo codificado pela SEQ ID N°: 26 e y é, por exemplo, 0,70 para 70 %, 0,80 para 80 %, 0,85 para 85 % etc e em que qualquer produto não inteiro de xa e y é arredondado para baixo para o número inteiro mais próximo antes de subtraí-lo do xa. 5 Exemplos Os seguintes métodos foram usados nos exemplos descritos neste.
Método 1 Ligação a IL-13 humano recombinante expressado por E. coli por ELISA As moléculas mAbdAb foram estimadas quanto à ligação ao IL-13 humano recombinante expressado por E. coli em um ELISA de ligação direta.
Em síntese, 5 µg/ml de IL-13 humano recombinante expressado por E. coli (feito e purificado em GSK) foi revestido em uma placa de ELISA de 96 reservatórios.
Os reservatórios foram bloqueados por 1 hora em temperatura ambiente, as construções de mAbdAb foram então tituladas através da placa (usualmente em torno de 100 nM em diluições triplas em torno de 0,01 nM). A ligação foi detectada usando-se uma diluição apropriada de anticorpo conjugado por peroxidase de cadeia leve capa anti-humano (número de catálogo A7164, Sigma-Aldrich) ou uma diluição apropriada de anticorpo de detecção conjugado por peroxidades específica da cadeia γ de IgG anti- humano (número de catálogo A6029, Sigma-Aldrich). Método 2 Ligação a IL-4 recombinante expressado por E. coli por ELISA As construções de mAbdAb foram estimadas quanto à ligação ao IL-4 humano expressado por E. coli recombinante em um ELISA de ligação direta.
Em síntese, 5 µg/ml de IL-4 humano expressado por E. coli recombinante (feito e purificado em GSK) foi revestido em uma placa de ELISA de 96 reservatórios.
Os reservatórios foram bloqueados por 1 hora em temperatura ambiente, as construções de mAbdAb foram então tituladas através da placa (usualmente em torno de 100 nM em diluições triplas em torno de 0,01 nM). A ligação foi detectada usando-se uma diluição apropriada de conjugado de anticorpo de cabra por peroxidase de cadeia leve capa anti- humano (número de catálogo A7164, Sigma-Aldrich) ou uma diluição 5 apropriada de anticorpo de detecção conjugado por peroxidades específica da cadeia γ de IgG anti-humano (número de catálogo A6029, Sigma-Aldrich). Método 3 Ligação a IL-18 humano expressado por E. coli recombinante por ELISA As construções de mAbdAb foram estimadas quanto à ligação ao IL-18 humano expressado por E. coli recombinante em um ELISA de ligação direta.
Em síntese, 5 µg/ml de IL-18 humano expressado por E. coli recombinante (feito e purificado em GSK) foi revestido em uma placa de ELISA de 96 reservatórios.
Os reservatórios foram bloqueados por 1 hora em temperatura ambiente, as construções de mAbdAb foram então tituladas através da placa (usualmente em torno de 100 nM em diluições triplas em torno de 0,01 nM). A ligação foi detectada usando-se uma diluição de 1 em 2000 de anticorpo conjugado por peroxidase de cadeia leve capa anti-humano (número de catálogo A7164, Sigma-Aldrich) ou usando-se uma diluição de 1 em 2000 de anticorpo de detecção conjugado por peroxidades específica da cadeia γ de IgG anti-humano (número de catálogo A6029, Sigma-Aldrich). Método 4 Estimativa de afinidade de ligação BiacoreTM para a ligação ao IL-13 humano recombinante expressado por E. coli As afinidades de ligação de construção de mAbdAb para IL-13 humano expressado por E. coli recombinante foi estimada pela análise BiacoreTM.
As análises foram realizadas usando-se Proteína A ou captura de IgG anti-humano.
Resumidamente, a Proteína A ou IgG anti-humano foi ligado em um chip CM5 pela ligação de amina primária de acordo com as recomendações de fabricação.
As construções de mAbdAb foram então capturadas em sua superfície e o IL-13 humano (feito e purificado em GSK) passado sobre concentrações definidas.
A superfície foi regenerada novamente à superfície de Proteína A usando-se condições de eluição de ácido brandas (tal como 100 mM de ácido fosfórico), isto não afeta 5 significantemente a capacidade de capturar o anticorpo para um evento de ligação de IL-13 subsequente.
A superfície de IgG anti-humana foi gerada usando-se condições similares à superfície de Proteína A ou usando-se 3 M de MgCl2. O trabalho foi realizado no BiacoreTM 3000 e/ou uma máquina T100, os dados foram analisados usando-se o software de avaliação nas máquinas e adaptado ao modelo 1:1 de ligação.
As séries de BiacoreTM foram realizadas em 25 °C ou 37 °C.
Método 5 Estimativa de afinidade de ligação BiacoreTM para a ligação a IL-4 humano recombinante expressado por E. coli As afinidades de ligação de construção de mAbdAb para IL-4 humano expressado por E. coli recombinante foi estimada pela análise BiacoreTM.
As análises foram realizadas usando-se Proteína A ou captura de IgG anti-humano.
Resumidamente, a Proteína A ou IgG anti-humano foi ligado em um chip CM5 pela ligação de amina primária de acordo com as recomendações de fabricação.
As construções de mAbdAb foram então capturadas em sua superfície e IL-4 humano (feito e purificado em GSK) passado sobre concentrações definidas.
A superfície foi regenerada novamente à superfície de Proteína A usando-se condições de eluição de ácido brandas (tal como 100 mM de ácido fosfórico), isto não afeta significantemente a capacidade de capturar o anticorpo para um evento de ligação de IL-4 subsequente.
A superfície de IgG anti-humana foi gerada usando-se condições similares à superfície de Proteína A ou usando-se 3 M de MgCl2. O trabalho foi realizado em BiacoreTM 3000 e/ou na máquina T100 e/ou A100, os dados foram analisados usando-se o software de avaliação nas máquinas e adaptado ao modelo 1:1 de ligação.
As séries de BiacoreTM foram realizadas em 25 °C ou 37 °C.
Método 6 Estimativa de afinidade de ligação BiacoreTM para a ligação a IL-18 5 humano recombinante expressado por E. coli As afinidades de ligação de construção de mAbdAb para IL-18 humano expressado por E. coli recombinante foi estimado pela análise BiacoreTM.
As análises foram realizadas usando-se Proteína A ou captura de IgG anti-humano.
Resumidamente, Proteína A ou IgG anti-humano foi ligado em um chip CM5 pela ligação de amina primária de acordo com as recomendações de fabricação.
As construções de mAbdAb foram então capturadas em sua superfície e humano IL-18 (feito e purificado em GSK) passado sobre concentrações definidas.
A superfície foi regenerada novamente à superfície de Proteína A usando-se condições de eluição de ácido brandas (tal como 100 mM de ácido fosfórico), isto não afeta significantemente a capacidade de capturar o anticorpo para um evento de ligação de IL-18 subsequente.
A superfície de IgG anti-humana foi gerada usando-se condições similares à superfície de Proteína A ou usando-se 3 M de MgCl2. O trabalho foi realizado em BiacoreTM 3000 e/ou na máquina T100 e/ou A100, os dados foram analisados usando-se o software de avaliação nas máquinas e adaptado ao modelo 1:1 de ligação.
A série BiacoreTM foi realizada a 25 °C.
Método 7 Estimativa de estequiometria de anticorpos específicos de mAbdAb ou anticorpo triespecífico para IL-13, IL-4 ou IL-18 (usando-se BiacoreTM) O IgG anti-humano foi imobilizado em um chip de biossensor CM5 pela ligação de amina primária.
As construções de mAbdAb foram capturadas em sua superfície após o que uma concentração simples de citocina IL-13, IL-4 ou IL-18 foi passada, esta concentração foi o bastante para saturar a superfície de ligação e o sinal de ligação observado atingiu R- max total.
As estequiometrias foram então calculadas usando-se a dada fórmula: Estequiom=Rmax * Mw (ligando) / Mw (analito)* R (ligando imobilizado ou 5 capturado) Quando as estequiometrias foram calculadas para mais do que um analito, ligação ao mesmo tempo, as citocinas diferentes foram passadas sequencialmente na saturação da concentração de citocina e as estequiometrias calculadas como acima.
O trabalho foi realizado no Biacore 3000 e 25 °C usando-se tampão de funcionamento de HBS-EP.
Método 8 Neutralização de IL-13 humano recombinante expressado por E. coli em um ensaio de proliferação de célula TF-1 As células TF-1 proliferam-se em resposta a diversas citocinas diferentes incluindo IL-13 humano.
A resposta proliferativa destas células a IL-13 pode, portanto, serem usadas para medir a bioatividade de IL-13 e subsequentemente, um ensaio foi desenvolvido para determinar a potência de neutralização de IL-13 (inibição da bioatividade de IL-13) de construções de mAbdAb.
O ensaio foi realizado em placas de cultura de tecido de 96 reservatórios estéreis sob condições estéreis e todos os reservatórios de teste foram realizados em triplicata.
Aproximadamente 14 ng/ml de IL-13 humano recombinante expressado por E. coli foi pré-incubado com várias diluições de construções de mAbdAb (usualmente de 200 nM titulado em diluições triplas a 0,02 nM) em um volume total de 50 µl por 1 hora a 37 °C.
Estas amostras foram então adicionadas a 50 µ de células TF-1 (em uma concentração de 2 x 105 células por ml) em uma placa de cultura de tecido de 96 reservatório estéril.
Desta maneira o volume de ensaio de 100 µl final continha várias diluições de construções de mAbdAb (em uma concentração final de 100 nM titulado em diluições triplas a 0,01 nM), IL-13 humano recombinante expressado por E. coli (em uma concentração final de 7 ng/ml) e células TF-1 (em uma concentração final de 1 x 105 células por ml). A placa de ensaio foi incubada a 37 °C por aproximadamente 3 dias em uma incubadora de CO2 5 umidificada.
A quantidade da proliferação celular foi então determinada usando-se o ‘CellTitre 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay’ da Promega (número de catálogo G4100), como descrito nas instruções do fabricante.
A absorbância das amostras na placa de 96 reservatórios foi lida em um leitor de placa em 570 nM.
A capacidade das construções de mAbdAb neutralizar a bioatividade de IL-13 humano recombinante expressado por E. coli foi expressada como aquela concentração da construção de mAbdAb requerido para neutralizar a bioatividade da quantidade definida de IL-13 humano (7 ng/ml) por 50 % (= ND50). Quanto menor a concentração da construção de mAbdAb requerida, mais potente a capacidade de neutralização.
Os dados ND50 fornecidos aqui foram calculados manualmente ou usando-se o pacote de software Robosage que é inerente dentro do microsoft excel.
Método 9 Neutralização de IL-4 recombinante expressado por E. coli em um ensaio de proliferação de célula TF-1 As células TF-1 proliferam-se em resposta a diversas citocinas diferentes incluindo IL-4 humano.
A resposta proliferativa destas células a IL- 4 pode, portanto, serem usadas para medir a bioatividade de IL-4 e subsequentemente, um ensaio foi desenvolvido para determinar a potência de neutralização de IL-4 (inibição da bioatividade de IL-4) de construções de mAbdAb.
O ensaio foi realizado em placas de cultura de tecido de 96 reservatórios estéreis sob condições estéreis e todos os reservatórios de teste foram realizados em triplicata.
Aproximadamente 2,2 ng/ml de IL-4 humano expressado por E. coli recombinante foi pré-incubado com várias diluições de construções de mAbdAb (usualmente de 200 nM titulado em diluições triplas a 0,02 nM) em um volume total de 50 µl por 1 hora a 37 °C.
Estas amostras foram então adicionadas a 50 µl de células TF-1 (em uma concentração de 2 x 5 105 células por ml) em uma placa de cultura de tecido de 96 reservatório estéril.
Desta maneira o volume de ensaio de 100 µl final continha várias diluições de construções de mAbdAb (em uma concentração final de 100 nM titulado em diluições triplas a 0,01 nM), IL-4 humano expressado por E. coli recombinante (em uma concentração final de 1,1 ng/ml) e células TF-1 (em uma concentração final de 1 x 105 células por ml). A placa de ensaio foi incubada a 37 °C por aproximadamente 3 dias em uma incubadora de CO2 umidificada.
A quantidade da proliferação celular foi então determinada usando-se o ‘CellTitre 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay’ da Promega (número de catálogo G4100), como descrito nas instruções do fabricante.
A absorbância das amostras na placa de 96 reservatórios foi lida em um leitor de placa em 570 nM.
A capacidade das construções de mAbdAb para neutralizar a bioatividade de IL-4 humano expressado por E. coli recombinante foi expressada como aquela concentração da construção de mAbdAb requerido para neutralizar a bioatividade da quantidade definida de IL-4 humano (1,1 ng/ml) por 50 % (= ND50). Quanto menor a concentração da construção de mAbdAb requerida, mais potente a capacidade de neutralização.
Os dados ND50 fornecidos aqui foram calculados manualmente ou usando-se o pacote de software Robosage que é inerente dentro do microsoft excel.
Método 10 Neutralização dupla de IL-13 humano recombinante expressado por E. coli e IL-4 humano recombinante expressado por E. coli em um ensaio de proliferação de célula TF-1 As células TF-1 proliferam-se em resposta a diversas citocinas diferentes incluindo IL-13 humano e IL-4 humano.
A resposta proliferativa destas células a IL-13 e IL-4 pode, portanto, serem usadas para medir a bioatividade de IL-13 e IL-4 simultaneamente e subsequentemente, um ensaio foi desenvolvido para determinar a dual IL-13 e potência de neutralização de 5 IL-4 (inibição dupla de bioatividade de IL-13 e IL-4) de construções de mAbdAb.
O ensaio foi realizado em placas de cultura de tecido de 96 reservatórios estéreis sob condições estéreis e todos os reservatórios de teste foram realizados em triplicata.
Aproximadamente 14 ng/ml de IL-13 humano recombinante expressado por E. coli e aproximadamente 2,2 ng/ml de IL-4 humano expressado por E. coli recombinante foram pré-incubados com várias diluições de construções de mAbdAb (usualmente de 200 nM titulado em diluições triplas a 0,02 nM) em um volume total de 50 µl por 1 hora a 37 °C.
Estas amostras foram então adicionadas a 50 µl de células TF-1 (em uma concentração de 2 x 105 células por ml) em uma placa de cultura de tecido de 96 reservatório estéril.
Desta maneira o volume de ensaio de 100 µl final, continha várias diluições de construções de mAbdAb (em uma concentração final de 100 nM titulado em diluições triplas a 0,01nM), IL-13 humano expressado por E. coli recombinante (em uma concentração final de 7 ng/ml), IL-4 humano expressado por E. coli recombinante (em uma concentração final de 1.1ng/ml) e células TF-1 (em uma concentração final de 1 x 105 células por ml). A placa de ensaio foi incubada a 37 °C por aproximadamente 3 dias em uma incubadora de CO2 umidificada.
A quantidade da proliferação celular foi então determinada usando-se o ‘CellTitre 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay’ da Promega (número de catálogo G4100), como descrito nas instruções do fabricante.
A absorbância das amostras na placa de 96 reservatórios foi lida em um leitor de placa em 570 nM.
Método 11 Estimativa de afinidade de ligação BiacoreTM para a ligação a IL-5 humano recombinante expressado por Sf21 A afinidade de ligação de moléculas mAbdAb para IL-5 humano expressado por Sf21 recombinante foi estimado pela análise BiacoreTM.
As análises foram realizadas usando-se a Proteína A ou captura de 5 IgG anti-humano.
Resumidamente, a Proteína A ou IgG anti-humano foi ligado em um chip CM5 pela ligação de amina primária de acordo com as recomendações de fabricação.
As moléculas mAbdAb foram então capturadas em sua superfície e IL-5 humano (feito e purificado em GSK) passado sobre concentrações definidas.
A superfície foi regenerada novamente à superfície de Proteína A usando-se condições de eluição de ácido brandas (tal como 100 mM de ácido fosfórico), isto não afeta significantemente a capacidade de capturar o anticorpo para um evento de ligação de IL-5 subsequente.
A superfície de IgG anti-humana foi gerada usando-se condições similares à superfície de Proteína A ou usando-se 3 M de MgCl2. O trabalho foi realizado em máquinas de BiacoreTM 3000, T100 e A100, os dados foram analisados usando-se o software de avaliação nas máquinas e adaptado ao modelo 1:1 de ligação.
O BiacoreTM foi realizado a 25 °C.
Método 12 Receptor de Ensaio de ligação de VEGF.
Este ensaio mede a ligação de VEGF165 a VEGF R2 (Receptor de VEGF) e a capacidade das moléculas de teste bloquearem sua interação.
As placas de ELISA foram revestidas durante a noite com receptor de VEGF (R&D Systems, Cat N°: 357-KD-050) (0,5 µg/ml de concentração final em 0,2M de carbonato bicarbonato de sódio pH 9,4), lavado e bloqueado com 2 % de BSA em PBS.
VEGF (R&D Systems, Cat N° 293-VE-050) e as molécula de teste (diluídas em 0,1 % de BSA em 0,05 % de Tween 20TM PBS) foram pré-incubados por 1 hora antes da adição à placa (3 ng/ml de concentração final de VEGF). A ligação de VEGF ao receptor de VEGF foi detectada usando-se anticorpo anti-VEGF biotinilado (0,5 µg/ml de concentração final) (R&D Systems, Cat N° BAF293) e um anticorpo secundário anti-biotina conjugado por peroxidase (diluição 1:5000) (Stratech, Cat No: 200-032-096) e visualizado em OD450 usando-se um substrato colorimétrico (substrato de TMB peroxidase Sure Blue, KPL) após a 5 interrupção da reação com um volume igual de 1M de HCl.
Método 13 Ensaio de EGFR Quinase A ativação de EGFR expressada na superfície de células A431 através de sua interação com EGF leva à fosforilação de tirosina quinase do receptor.
A redução da fosforilação de EGFR tirosina quinase foi medida para determinar a potência das molécula de teste.
As células A431 foram deixadas aderir às placas de cultura de tecido de 96 reservatórios durante a noite, então, a molécula de teste foi adicionada e deixada 1 hora e depois incubada por 10 minutos com EGF (em 300 ng/ml) (R&D Systems número de catálogo 236- EG). As células foram lisadas e a preparação lisada transferida a placas de ELISA revestidas com o anticorpo anti-EGFR (em l µg/ml) (R&D Systems, cat # AF231). O EGFR tanto fosforilado quanto não fosforilado presente na solução de células lisadas foi capturado.
Após a lavagem do material não ligado, o EGFR fosforilado foi especificamente detectado usando-se um anticorpo anti-fosfotirosina conjugado por HRP (diluição 1:2000) (Upstate Biotechnology, cat # 16-105). A ligação foi visualizada usando-se um substrato colorimétrico.
Método 14 Ensaio de MRC-5/TNF A capacidade das moléculas de teste evitar a ligação de TNF-α humano ao TNFR1 humano e neutralizar a secreção de IL-8 foi determinada usando-se as células MRC-5 de fibroblasto de pulmão.
Uma série de diluição de amostras de teste foi incubada com TNF-α (500 µg/ml) (Peprotech) por 1 hora.
Isto foi então diluído 1 em 2 com uma suspensão de células MRC-5
(ATCC, Cat.# CCL-171) (5 x 103 células/reservatório). Após uma incubação durante a noite, as amostras foram diluídas 1 em 10 e a liberação de IL-8 foi determinada usando-se um ensaio de detecção celular IL-8 ABI 8200 (FMAT) onde a concentração de IL-8 foi determinada usando-se pérolas de 5 poliestireno revestidas com anti-IL-8 (R&D systems, Cat# 208-IL), anti-IL-8 biotinilado (R&D systems, Cat# BAF208) e estreptavidina Alexafluor 647 (Molecular Probes, Cat#532357). A leitura do ensaio localizou a emissão de fluorescência em 647 nm e as concentrações de IL-8 desconhecidas foram interpoladas usando-se uma curva padrão de IL-8 incluída no ensaio.
Método 15 Ensaio de MRC-5/IL-1. A capacidade das moléculas de teste evitarem a ligação de IL- 1a humano ao IL1-R humano e neutralizar a secreção de IL-8 foi determinada usando-se células MRC-5 de fibroblasto de pulmão humano.
As células MRC-5 (ATCC, Cat.# CCL-171) foram tripsinizadas e depois incubadas com as amostras de teste por uma hora como uma suspensão.
O IL-1a (200 µg/ml de concentração final) (R&D Systems cat n°: 200-LA) foi então adicionado.
Após uma incubação durante a noite a liberação de IL-8 foi determinada usando-se um kit ELISA de quantificação de IL- (R&D Systems) com placas de ELISA revestidas com anti-IL-8, anti-IL-8 biotinilado e estreptavidina- HRP.
A leitura do ensaio é por absorbância colorimétrica a 450 nM e as concentrações de IL-8 desconhecidas são interpoladas usando-se uma curva padrão de IL-8 incluída no ensaio.
Método 16 Potência de neutralização de IL-13 ou IL-4 humano recombinante expressado por E. coli em um bioensaio de fosfo-STAT6 de sangue total As células de sangue total podem ser estimuladas ex-vivo com IL-4 humano expressado por E. coli recombinante (rhIL-14) ou IL-13 (rhIL- 13) para expressar fosfo STAT6 (pSTAT6). Este ensaio foi desenvolvido para medir quantitativamente pSTAT6 e consequentemente determinar a potência de neutralização (inibição da bioatividade de IL-4 ou IL-13) de construções de mAbdAb.
O ensaio foi realizado em placas de cultura de tecido de 96 5 reservatórios estéreis sob condições estéreis e todos os reservatórios de teste foram realizados em triplicata. 12 ng/ml de rhIL-13 ou rhIL-4 foi preparado em meio de cultura de célula isento de soro e 31,24 adicionado a reservatórios de uma placa de 96 reservatórios.
Uma curva de diluição de 9 pontos de construções de mAbdAb ou isótipo controle foi preparado em 6x a concentração de ensaio final e 31,24 de cada diluição adicionada aos reservatórios contendo rhIL-4 ou rhIL-13. 125 µl de sangue total humano heparinizado foi adicionado a todos os reservatórios e misturados em um agitador por 30 segundos.
O volume de ensaio final continha várias diluições de construções de mAbdAb junto com rhIL-13 ou rhIL-4 em uma concentração final de 2 ng/ml.
A placa de ensaio foi incubada a 37 °C, 5 % de CO2 por 60 minutos.
As células foram então lisadas pela adição de 62,5 µl de 4x tampão de lise.
O tampão de lise continha concentrações de ensaio final de 50 mM de cloridreto de Tris, 300 mM de cloreto de sódio, 1 % de NP40, 0,5 % de desoxicolato de sódio, 50 mM de fluoreto de sódio, 1 mM de ortoanadato de sódio, 1 mM de EDTA e coquetel de inibidor de protease.
As placas foram então colocadas em gelo por 30 minutos e então congeladas a -80 °C até ser submetido ao ensaio por pSTAT6. A medição de pSTAT6 nas amostras de sangue total foi realizada usando-se um imuno-ensaio eletroquimioluminescente (Meso-Scale- Discovery, MSD). Em síntese, placas MSD de 96 reservatórios revestidas por avidina foram bloqueadas com 150 µl por reservatório de bloqueador MSD a 5 % A por 1 hora em temperatura ambiente em um agitador a 750 rpm.
A placa foi lavada 3 vezes com 150 µl por reservatório de tampão de lavagem de MSD Tris. 25 µl por reservatório de anticorpo de captura (anticorpo monoclonal STAT6 anti-humano de camundongo biotinilado) foi adicionado e as placas incubadas durante a noite a 4 °C. O anticorpo de captura foi diluído a 4 µg/ml em tampão d ensaio consistindo de 50 mM de Tris, 150 mM 5 de cloreto de sódio, 0,2 % de BSA, 0,5 % de Tween 20, 1 mM de EDTA. A placa foi lavada 3 vezes com tampão de lavagem de MSD tris então bloqueado com 150 µl de bloqueador MSD a 5 % A por 1 hora em temperatura ambiente em um agitador. As placas foram lavadas 3 vezes como estabelecido previamente, depois 25 µl de lisado de sangue total ou calibrador pSTAT6 adicionado por reservatório. As placas foram incubadas por 3 horas em temperatura ambiente em um agitador. As placas foram lavadas 3 vezes, depois 25 µl de anticorpo pSTAT6 anti humano de coelho (diluído 1 em 800 em tampão de ensaio) foi adicionado e então incubado por 1 hora em temperatura ambiente. Após a lavagem adicional, 25 µl por reservatório de uma diluição de 1 em 500 de anticorpo de IgG anti-coelho de cabra MSD TAG foi adicionado e então incubado por 1 hora em temperatura ambiente em um agitador. As placas foram lavadas novamente antes da adição de 150 µl por reservatórios de 2x tampão de leitura MSD T. As placas foram então lidas imediatamente em um formador de imagem MSD SECTOR. A capacidade das construções de mAbdAb neutralizarem a bioatividade de rhIL-13 ou rhIL-4 foi expressada como a concentração da construção de mAbdAb requerida para neutralizar 2 ng/ml de IL-4 humano ou IL-13 humano por 50 % (IC50). Quanto menor a concentração da construção de mAbdAb requerida, mais potente a capacidade de neutralização. Método 17 Ligação a IL-13 cinomolgo recombinante expressado por E. coli por
ELISA As moléculas mAbdAb foram estimadas quanto à ligação ao IL-13 cinomolgo recombinante expressado por E. coli em um ELISA de ligação direta.
Em síntese, 5 µg/ml de IL-13 cinomolgo expressado por E. coli recombinante (feito e purificado em GSK) foi revestido em uma placa de ELISA de 96 reservatórios.
Os reservatórios foram bloqueados por 1 hora em temperatura ambiente, as moléculas mAbdAb foram então tituladas através da 5 placa (usualmente em torno de 100 nM em diluições triplas em torno de 0,01 nM). A ligação foi detectada usando-se uma diluição apropriada de anticorpo conjugado por peroxidase de cadeia leve capa anti-humano (número de catálogo A7164, Sigma-Aldrich) ou uma diluição apropriada de anticorpo de detecção conjugado por peroxidades específica da cadeia γ de IgG anti- humano (número de catálogo A6029, Sigma-Aldrich). Método 18 Não usado Método 19 Inibição de ligação de IL-4 humano ao receptor alfa de IL4 humano (IL4Ra) por ELISA A não ser que estabelecido de outra maneira, todos os reagentes foram diluídos até a concentração requerida na solução de bloqueio (4 % de albumina de soro bovino em solução salina tamponada por tri e 0,05 % de Tween20) antes do uso.
Uma placa de ELISA foi revestida durante a noite a 4 °C com 5 µg/ml de quimera de IL4Ra-Fc humana recombinante (R&D Systems, Cat.
No. 604-4R) em solução salina tamponada por fosfato.
Todas as etapas subsequentes foram realizadas em temperatura ambiente.
A placa foi bloqueada por 2 horas em solução de bloqueio antes da adição de 50 µl de várias concentrações de mAbdAb (ou o controle positivo mAbs ou dAbs) que foram pré-misturados com 0,02 µg/ml de IL-4 humano recombinante (feito em GSK). As placas foram incubadas por 1 hora antes da lavagem 4 vezes em tampão de lavagem (solução salina tamponada por Tris e 0,05 % de Tween20). 50 µl de uma solução de 0,5 µg/ml de anti-IL-4 humano biotinilado (R&D Systems, Cat.
No.
BAF 204) foi adicionado a cada reservatório e incubado por 1 hora.
A placa foi lavada x4 em tampão de lavagem antes da adição de 50 µl/reservatório de uma diluição de 1/2000 de Extravadina (Sigma, Cat.
No.
E2886). Após uma hora, a placa foi lavada 4 vezes e um sinal colorimétrico foi detectado pela incubação com substrato de 5 peroxidase OPD (da Sigma), a reação foi interrompida com a solução de interrupção (3M de ácido H2SO4) e os dados de absorbância obtidos pela leitura em um leitor de placa em 490 nM.
A absorbância média e o erro padrão foram plotados em GraphPad Prism e os valores de IC50 foram calculados usando-se Cambridge Soft BioAssay.
Método 20 Neutralização de IL-13 cinomolgo recombinante expressado por E. coli em um ensaio de proliferação de célula TF-1 As células TF-1 proliferam-se em resposta a diversas citocinas diferentes incluindo cinomolgos IL-13. A resposta proliferativa destas células a IL-13 podem ser, portanto, usadas para medir a bioatividade de IL-13 e subsequentemente, um ensaio foi desenvolvido para determinar a potência de neutralização de IL-13 (inibição da bioatividade de IL-13) de construções de mAbdAb.
O ensaio foi realizado em placas de cultura de tecido de 96 reservatórios estéreis sob condições estéreis e todos os reservatórios de teste foram realizados em triplicata.
Aproximadamente 14 ng/ml de IL-13 cinomolgo expressado por E. coli recombinante foi pré-incubado com várias diluições de construções de mAbdAb (usualmente de 1000 nM ou 200 nM titulado em diluições triplas a 1 nM ou 0,02 nM) em um volume total de 50 µl por 1 hora a 37 °C.
Estas amostras foram então adicionadas a 50 µl de células TF-1 (em uma concentração de 2 x 105 células por ml) em uma placa de cultura de tecido de 96 reservatório estéril.
Desta maneira o volume de ensaio de 100 µl final continha várias diluições de construções de mAbdAb (em uma concentração final de 500 nM ou 100 nM titulado em diluições triplas a 0,5 nM ou 0,01 nM), IL-13 cinomolgo expressado por E. coli recombinante (em uma concentração final de 7 ng/ml) e células TF-1 (em uma concentração final de 1 x 105 células por ml). A placa de ensaio foi incubada a 37 °C por aproximadamente 3 dias em uma incubadora de CO2 umidificada.
A 5 quantidade da proliferação celular foi então determinada usando-se o ‘CellTitre 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay’ da Promega (número de catálogo G4100), como descrito nas instruções do fabricante.
A absorbância das amostras na placa de 96 reservatórios foi lida em um leitor de placa em 570 nM.
A capacidade das construções de mAbdAb neutralizar a bioatividade de IL-13 cinomolgo expressado por E. coli recombinante foi expressada como aquela concentração da construção de mAbdAb requerido para neutralizar a bioatividade da quantidade definida de IL-13 cinomolgo (7 ng/ml) por 50 % (= ND50). Quanto menor a concentração da construção de mAbdAb requerida, mais potente a capacidade de neutralização.
Os dados ND50 fornecidos aqui foram calculados manualmente ou usando-se o pacote de software Robosage que é inerente dentro do microsoft excel.
Método 21 Neutralização de IL-4 cinomolgo recombinante expressado por E. coli em um ensaio de proliferação de célula TF-1 As células TF-1 proliferam-se em resposta a diversas citocinas diferentes incluindo IL-4 cinomolgo.
A resposta proliferativa destas células a IL-4 pode, portanto, serem usadas para medir a bioatividade de IL-4 e subsequentemente, um ensaio foi desenvolvido para determinar a potência de neutralização de IL-4 (inibição da bioatividade de IL-4) de construções de mAbdAb.
O ensaio foi realizado em placas de cultura de tecido de 96 reservatórios estéreis sob condições estéreis e todos os reservatórios de teste foram realizados em triplicata.
Aproximadamente 2,2 ng/ml recombinante IL-
4 cinomolgo expressado por E. coli foi pré-incubado com várias diluições de construções de mAbdAb (usualmente de 200 nM titulado em diluições triplas a 0,02 nM) em um volume total de 50 µl por 1 hora a 37 °C.
Estas amostras foram então adicionadas a 50 µl de células TF-1 (em uma concentração de 2 x 5 105 células por ml) em uma placa de cultura de tecido de 96 reservatório estéril.
Desta maneira o volume de ensaio de 100 µl final continha várias diluições de construções de mAbdAb (em uma concentração final de 100 nM titulado em diluições triplas a 0,01 nM), IL-4 cinomolgo expressado por E. coli recombinante (em uma concentração final de 1,1 ng/ml) e células TF-1 (em uma concentração final de 1 x 105 células por ml). A placa de ensaio foi incubada a 37 °C por aproximadamente 3 dias em uma incubadora de CO2 umidificada.
A quantidade da proliferação celular foi então determinada usando-se o ‘CellTitre 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay’ da Promega (número de catálogo G4100), como descrito nas instruções do fabricante.
A absorbância das amostras na placa de 96 reservatórios foi lida em um leitor de placa em 570 nM.
A capacidade das construções de mAbdAb para neutralizar a bioatividade de IL-4 cinomolgo recombinante expressado por E. coli foi expressada como aquela concentração da construção de mAbdAb requerido para neutralizar a bioatividade da quantidade definida do IL-4 cinomolgo (1,1 ng/ml) por 50 % (= ND50). Quanto menor a concentração da construção de mAbdAb requerida, mais potente a capacidade de neutralização.
Os dados ND50 fornecidos aqui foram calculados manualmente ou usando-se o pacote de software Robosage que é inerente dentro do microsoft excel.
Método 22 Inibição de IL-13 humano ligação ao receptor IL13 humano alfa 2 (IL13Ra2) por ELISA A não ser de outra maneira testado todos os reagentes foram diluídos na concentração requerida na solução de bloco (1 % de albumina de soro bovino na solução de salina tamponada por tris e 0,05 % de Tween20) antes do uso.
Uma placa ELISA foi revestida durante a noite a 4 °C com 5 µg/ml de quimera IL13Ra2/Fc humano recombinante expressado em células Sf21 (sistema R&D, Cat.
N°. 614-IR) em uma solução de tampão de 5 revestimento (0,05M de bicarbonato pH9.6, Sigma C-3041). A placa foi bloqueada por 1 hora em temperatura ambiente na solução de bloco (1 % de BSA em TEST) antes da adição de várias concentrações de mAbdAb (ou mAbs de controle positivo ou dAbs) que foram pré-incubados com 30 ng/ml de IL-13 humano recombinante (fabricado em GSK) por 30 minutos a 37 °C.
As placas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem de 3 vezes em tampão de lavagem (solução salina tamponada por Tris e 0,05 % de Tween20). 50 µl de uma solução de 0,5 µg/ml de anti-IL-13 humano biotinilado (sistemas R&D, Cat.
N°. BAF 213) foi adicionado em cada reservatório e incubado por 1 hora em temperatura ambiente.
A placa foi lavada três vezes em tampão de lavagem antes da adição da diluição apropriada de Extravadina (Sigma, Cat.
No.
E2886). Após uma hora a placa foi lavada e um sinal colorimétrico foi detectado pela incubação com substrato de peroxidase OPD (de Sigma), a reação foi interrompida com a solução de interrupção (3M de ácido) e os dados de absorbância obtidos pela leitura de leitor de placa a 490 nM.
O meio de absorbância e erro padrão foi plotado em lâmina Excel e valores IC50 foram calculados usando o software Robosage de Microsoft Excel.
Método 23 Estimativa de afinidade de ligação BiacoreTM para a ligação de IL-13 cinomolgo recombinante expressado por E. coli A afinidade de ligação das moléculas de mAbdAb (ou mAb) para o IL-13 cinomolgo expressado por E. coli recombinante foi estimado pela análise BiacoreTM.
As análises foram realizadas usando-se a proteína A ou captura de IgG anti-humano.
Resumidamente, Proteína A ou IgG anti-
humano foi ligado em um chip CM5 pela ligação de amina primária de acordo com as recomendações de fabricação.
As moléculas mAbdAb (ou mAb) foram então capturadas em sua superfície e IL-13 cinomolgo (feito e purificado em GSK) passado sobre concentrações definidas.
A superfície foi 5 regenerada novamente à superfície de Proteína A usando-se condições de eluição de ácido brandas, isto não afeta significantemente a capacidade de capturar o anticorpo para um evento de ligação de IL-13 subsequente.
O trabalho foi realizado em BIAcoreTM 3000 e/ou a máquina T100, os dados foram analisados usando-se o software de avaliação nas máquinas e adaptado ao modelo 1:1 de ligação.
As séries de BIAcoreTM foram realizadas a 25 °C ou 37 °C.
Método 24 Avaliação de afinidade de ligação BIAcoreTM para a ligação a IL-4 cinomolgo recombinante expressado por E. coli A afinidade de ligação de moléculas mAbdAb (ou mAb) pelo cinomolgo IL-4 recombinante expressado por E. coli foram avaliados pela análise BIAcoreTM.
As análises foram realizadas usando a Proteína A ou captura de IgG anti-humano.
Resumidamente, Proteína A ou IgG anti-humano foi ligado em um chip CM5 pela ligação de amina primária de acordo com as recomendações de fabricação.
As moléculas mAbdAb (ou mAb) foram então capturadas em sua superfície e IL-4 cinomolgo (feito e purificado em GSK) passado sobre concentrações definidas.
A superfície foi regenerada novamente à superfície de Proteína A usando-se condições de eluição de ácido brandas (tal como 100 mM de ácido fosfórico), isto não afeta significantemente a capacidade de capturar o anticorpo para um evento de ligação de IL-4 subsequente.
A superfície de IgG anti-humana foi gerada usando-se condições similares à superfície de Proteína A ou usando-se 3M MgCl2. O trabalho foi realizado em BIAcoreTM 3000 e/ou na máquina T100 e/ou A100, os dados foram analisados usando-se o software de avaliação nas máquinas e adaptado ao modelo 1:1 de ligação. As séries BIAcoreTM foram realizadas a 25 °C ou 37 °C. Método 25 Ensaio de neutralização com base celular IL-13 5 A potência de mAbdAbs tendo a especificidade por IL13 foi submetido ao ensaio em um ensaio de célula IL-13 usando a linha celular receptora projetada HEK Blue-STAT6. O fator de transcrição STAT6 é ativado principalmente por duas citocinas com as funções biológicas de sobreposição, IL-4 e IL-13 que ligam-se ao complexo receptor composto de IL-4Ralfa e IL-13Ralfal. Na ligação do ligando, o complexo receptor ativa a quinase Janus associado ao receptor (JAK1 e Tyk2) conduzindo ao recrutamento de STAT6 e sua fosforilação. O STAT6 ativado forma um homodímero que transloca ao núcleo, induzindo a transcrição dos genes sob o controle do promotor responsável. A linha HEK Blue-STAT6 é projetada para expressar fosfatase alcalina embriogênica secretada (SEAP) sob o controle de um tal promotor. As células foram plotadas em placas de 96 reservatórios e incubadas por 20 a 24 horas com IL-13 humano pré-equilibrado e moléculas testadas. Após o período de incubação, a quantidade de SEAP produziu pelas células como um resultado do estímulo IL-13 foi então medido usando o sistema Quanti-blue (Invivogen). Exemplo 1
1. Geração de mAbdAbs de alvejamento duplo Os mAbdAbs de alvejamento duplo apresentados nas Tabelas 1 a 4 foram construídos na seguinte maneira. As construções de expressão foram geradas pelo enxerto de uma sequência codificadora de um domínio de anticorpo em uma sequência codificadora de uma cadeia pesada ou uma cadeia leve (ou ambas) de um anticorpo monoclonal tal que quando expressado o dAb é ligado ao terminal C da cadeia leve ou pesada. Para algumas construções, sequências ligadoras foram usadas para ligar o domínio de anticorpo à cadeia pesada CH3 ou cadeia leve CK.
Em outras construções o domínio de anticorpo é ligado diretamente à cadeia pesada ou leve com nenhuma sequência ligadora.
Um diagrama esquemático geral destas 5 construções mAbdAb são mostradas na Figura 8 (a cadeia pesada mAb é esboçado em cinza; a cadeia leve mAb é esboçado em branco; o dAb é esboçado em preto). Um exemplo do tipo 1 mAbdAb como apresentado nas Figura 8 deve ser PascoH-G4S-474. Um exemplo do tipo 2 mAbdAb como apresentado nas Figura 8 deve ser PascoL-G4S-474. Um exemplo do tipo 3 mAbdAb como apresentado nas Figura 8 deve ser PascoHL-G4S-474. Os tipos 1 e 2 mAbdAb são construções tetravalentes, tipo 3 mAbdAb é uma construção hexavalente.
Um diagrama esquemático que ilustra uma construção de uma cadeia pesada mAbdAb (ilustração da parte superior) ou uma cadeia leve mAbdAb (ilustração da parte funda) é mostrado abaixo.
A não ser de outra maneira estado, estes locais de restrição foram usados para construir os mAbdAbs descritos nas Tabelas 1 a 4
Nota-se que para a cadeia pesada o termo 'VH' é a sequência de cadeia pesada variável de anticorpo monoclonal; ‘CH1, CH2 e CH3’ são sequências de região constante de cadeia pesada IgG1 humano; ‘ligante’ é a sequência da região ligadora específica usada; ‘dAb’ é o domínio da sequência de anticorpo.
Para a cadeia leve o termo ‘VL’ é a sequência de cadeia leve variável de anticorpo monoclonal; ‘CK’ é a sequência de região constante de cadeia leve humana; ‘ligante’ é a sequência da região ligadora 5 específica usada; ‘dAb’ é o domínio da sequência de anticorpo.
Algumas construções de expressão de DNA foram feitas novamente pela construção oligo.
E outras construções de expressão de DNA foram derivadas de construções existentes (que foram feitas como descrito acima) pela clonagem de restrição ou mutagênese direcionada ao local.
Estas construções (cadeias leves ou pesadas mAbdAb) foram clonadas em vetores de expressão de mamíferos (séries de vetores Rln, Rln ou pTT) usando técnicas de biologia molecular padrão.
Uma sequência de sinal de aminoácido de mamífero (como mostrado na SEQ ID N°: 64) foi usada na construção destas construções.
Para a expressão de mAbdAbs onde o dAb é ligado à extremidade final do terminal C da cadeia pesada do anticorpo monoclonal, o vetor de expressão mAbdAb da cadeia pesada apropriada foi formado par com o vetor de expressão de cadeia leve apropriado para aquele anticorpo monoclonal.
Para a expressão de mAbdAbs onde o dAb é ligado à extremidade final do terminal C da cadeia leve do anticorpo monoclonal, o vetor de expressão mAbdAb da cadeia leve apropriada foi formado par com o vetor de expressão da cadeia pesada apropriada para aquele anticorpo monoclonal.
Para a expressão de mAbdAbs onde o dAb é ligado à extremidade final do terminal C da cadeia pesada do anticorpo monoclonal e onde o dAb é ligado à extremidade final do terminal C da cadeia leve do anticorpo monoclonal, o vetor de expressão mAbdAb da cadeia pesada apropriada foi formado par com o vetor de expressão mAbdAb da cadeia leve apropriada.
1.1 Nomenclatura e abreviações usadas Anticorpo monoclonal (mAb) Anticorpos monoclonais (mAbs) Domínio de anticorpo (dAb) 5 Anticorpos de domínio (dAbs) Cadeia pesada (cadeia H) Cadeia leve (cadeia L) Região variável de cadeia pesada (VH) Região variável de cadeia leve (VL) Região 1 pesada constante de IgG1 humano (CH1) Região 2 pesada constante de IgG1 humano (CH2) Região 3 pesada constante de IgG1 humano (CH3) Região constante de cadeia leve de capa humano (CK)
1.2 Anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs Os anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs biespecíficos foram construídos como descrito acima. Diversos ligantes diferentes foram usados para ligar os anticorpos de domínio anti-IL4 ao anticorpo monoclonal. Algumas construções não tem ligante. Nota-se que um local de clonagem BamHl (no qual os códigos para os resíduos de aminoácido G e S) foi usado clonar os ligantes e dAbs a CH3 da cadeia pesada mAb ou o CK da cadeia leve mAb. Deste modo em adição a sequência ligadora dada, os resíduos de aminoácido G e S adicionais são apresentados entre a sequência ligadora e o domínio de anticorpo para tanto as construções de expressão da cadeia pesada quanto a cadeia leve ou entre CH3 e a sequência ligadora em alguns mas não todas as construções de expressão da cadeia pesada. Entretanto, quando o ligante G4S foi colocado entre o mAb e dAb no formato mAbdAb, o local de clonagem BamHl já estava presente (devido aos resíduos de aminoácidos G e S inerentes dentro da sequência G4S ligadora) e deste modo os resíduos de aminoácido G e S adicionais não estavam presentes entre CH3 ou CK e o domínio de anticorpo nas construções usando este ligante.
Quando nenhuma sequência ligadora foi usada entre n o mAb e dAb no formato mAbdAb, o local de clonagem BamHl (e visto que os resíduos de aminoácidos G e S) ainda estão presentes entre 5 CH3 ou CK e o domínio de anticorpo.
Os detalhes totais nas sequências de aminoácido das cadeia leves e pesadas mAbdAb são apresentados na tabela 1. Diversos dos seguintes exemplos usam um IL-4 mAb como um anticorpo controle.
O IL-4 mAb de controle usado nestes exemplos serão o anticorpo tendo a sequência de cadeia pesada da SEQ ID N°: 14 e a sequência de cadeia leve da SEQ ID N°: 15, ou será o anticorpo tendo a sequência de cadeia pesada da SEQ ID N°: 166 e a sequência de cadeia leve da SEQ ID N°: 15. Ambos destes IL-4 mAbs formam os mesmos CDRs, e são esperados ligar-se na mesma maneira visto que ambos destes anticorpos são referidos como 'Pascolizumab' ou 'IL-4 mAb' nos seguintes exemplos.
Diversos dos seguintes exemplos usam um IL-5 mAb como um anticorpo controle.
O IL-5 mAb de controle usado nestes exemplos serão o anticorpo tendo a sequência de cadeia pesada da SEQ ID N°: 65 e a sequência de cadeia leve da SEQ ID N°: 66, ou o anticorpo tendo a sequência de cadeia pesada da SEQ ID N°: 191 e a sequência de cadeia leve da SEQ ID N°: 66. Ambos destes anticorpos IL-5 formam os mesmos CDRs, e são esperados ligar-se na mesma maneira visto que ambos destes anticorpos são referidos como 'Mepolizumab' ou 'IL-5 mAb' nos seguintes exemplos.
Os mAbdAbs apresentados na tabela 1 foram expressados transitoriamente nos sobrenadantes de célula CHOK1. Seguindo a quantificação mAbdAb este mAbdAb contendo os sobrenadantes foram analisados para a atividade em ELISAs de ligação IL-13 e IL-4. Tabela 1 Nome Descrição Sequência ID N°
Nome Descrição Sequência ID N° Cadeia H = cadeia pesada de mAb de IL-13 anti- 16 (= cadeia H) 586H-25 humano-GS-DOM9-155-25 dAb cadeia L = 13 (= cadeia L) cadeia leve de mAb de IL-3 anti-humano Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti- humano-G4S ligante-DOM9-155-25 dAb 20 (=Cadeia H) 586H-G4S-25 cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti-13 (= cadeia L) humano Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti- humano-TVAAPS ligante-GS-DOM9-155-25 24 (=Cadeia H) 586H-TVAAPS-25 dAb 13 (= cadeia L) cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti- humano-GS-ASTKGPT ligante-GS-DOM9- 28 (=Cadeia H) 586H-ASTKG-25 155-25 dAb 13 (= cadeia L) cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti- humano-GS-EPKSCDKTHTCPPCP ligante- 32 (=Cadeia H) 586H-EPKSC-25 GS-DOM9-155-25 dAb 13 (= cadeia L) cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti- humano-ELQLEESCAEAQDGELDG ligante- 36 (=Cadeia H) 586H-ELQLE-25 GS-DOM9-155-25 dAb 13 (= cadeia L) cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti- humano-GS-DOM9-155-147 dAb 17 (=Cadeia H) 586H-147 cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti-13 (= cadeia L) humano Cadeia H = cadeia pesada IL-13 mAb anti- humano-G4S ligante-DOM9-155-147 dAb 21 (=Cadeia H) 586H-G4S-147 cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti-13 (= cadeia L) humano Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti- humano-TVAAPS ligante-GS-DOM9-155-147 25 (=Cadeia H) 586H-TVAAPS-147 dAb 13 (= cadeia L) cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti- humano-GS-ASTKGPT ligante-DOM9-155-147 29 (=Cadeia H) 586H-ASTKG-147 dAb 13 (= cadeia L) cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-EPKSC-147 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-33 (=Cadeia H) humano-GS-EPKSCDKTHTCPPCP ligante-13 (= cadeia L) GS-DOM9-155-147 dAb cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-ELQLE-147 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-37 (=Cadeia H) humano-GS-ELQLEESCAEAQDGELDG 13 (= cadeia L) ligante-GS-DOM9-155-147 dAb cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-154 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-18 (=Cadeia H) humano-GS-DOM9-155-154 dAb 13 (= cadeia L) cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano
Nome Descrição Sequência ID N° 586H-G4S-154 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-22 (=Cadeia H) humano-G4S ligante-DOM9-155-154 dAb 13 (= cadeia L) cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-TVAAPS-154 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-26 (=Cadeia H) humano-TVAAPS ligante-GS-DOM9-155-154 13 (= cadeia L) dAb cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-ASTKG-154 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-30 (=Cadeia H) humano-GS-ASTKGPT ligante-GS-DOM9-155-13 (= cadeia L) 154 dAb cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-EPKSC-154 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-34 (=Cadeia H) humano-GS-EPKSCD-KTHTCPPCP ligante-13 (= cadeia L) GS-DOM9-155-154 dAb cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti-humano 586H-ELQLE-154 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-38 (=Cadeia H) humano-GS-ELQLEESCAEAQDGELDG 13 (= cadeia L) ligante-GS-DOM9-155-154 dAb cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-210 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-19 (=Cadeia H) humano-GS-DOM9-112-210 dAb 13 (= cadeia L) cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-G4S-210 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-23 (=Cadeia H) humano-G4S ligante-DOM9-112-210 dAb 13 (= cadeia L) cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-TVAAPS-210 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-27 (=Cadeia H) humano-TVAAPS ligante-GS-DOM9-112-210 13 (= cadeia L) dAb cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-ASTKG-210 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-31 (=Cadeia H) humano-GS-ASTKGPT ligante-GS-DOM9-13 (= cadeia L) 112-210 dAb cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-EPKSC-210 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-35 (=Cadeia H) humano-GS-EPKSCDKTHTCPPCP ligante-GS-13 (= cadeia L) DOM9-112-210 dAb cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-ELQLE-210 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-39 (=Cadeia H) humano-GS-ELQLEESCAEAQDGELDG 13 (= cadeia L) ligante-GS-DOM9-112-210 dAb cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-40 (=Cadeia H) humano-GS- 13 (= cadeia L) cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-ASTKG Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-41 (=Cadeia H) humano-GS-ASTKGPT ligante-GS 13 (= cadeia L) cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano
Nome Descrição Sequência ID N° 586H-EPKSC Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-42 (=Cadeia H) humano-GS-EPKSCDKTHTCPPCP ligante-GS 13 (= cadeia L) cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-ELQLE Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-43 (=Cadeia H) humano-GS-ELQLEESCAEAQDGELDG 13 (= cadeia L) ligante-GS cadeia L = Cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano
Os mAbdAbs apresentados na tabela 2 foram expressados em um ou ambos dos sobrenadantes de célula CHOK1 ou CHOE1a, purificado e analisado em um número de ensaios de atividades IL-13 e IL-4. Tabela 2 Nome Descrição Sequência ID No. 586H-TVAAPS-25 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-24 (=Cadeia H) humano-TVAAPS ligante-GS-DOM9-155-25 13 (= cadeia L) dAb cadeia L = cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-TVAAPS-154 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-26 (=Cadeia H) humano- 13 (= cadeia L) TVAAPS ligante-GS-DOM9-155-154 dAb cadeia L = cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano 586H-TVAAPS-210 Cadeia H = Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-27 (=Cadeia H) humano- 13 (= cadeia L) TVAAPS ligante-GS-DOM9-112-210 dAb cadeia L = cadeia leve de mAb de IL-3 anti- humano
5 1.3 Anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs Os anti-I L4mAb-anti-I L13dAbs específicos foram construídos como descritos acima.
Diversos ligantes diferentes foram usadas para ligar o domínio de anticorpo anti-IL13 ao anticorpo monoclonal.
Algumas construções não tem ligante.
Nota-se que um local de clonagem BamHl (no qual os códigos para os resíduos de aminoácido G e S) foi usado para clonar os ligantes e dAbs a CH3 da cadeia pesada mAb ou a CK da cadeia leve mAb.
Deste modo em adição a sequência ligadora dada, os resíduos de aminoácido G e S adicionais são apresentados entre a sequência ligadora e o domínio de anticorpo pelas construções de expressão tanto de cadeia pesada quanto de cadeia leve ou entre CH3 e a sequência ligadora em alguns mas não todas as construções de expressão da cadeia pesada.
Entretanto, quando o ligante G4S foi colocado entre o mAb e dAb no formato mAbdAb, o local de clonagem BamHl já estava presente (devido aos resíduos de aminoácidos G e S inerentes dentro da sequência G4S ligadora) e deste modo os resíduos de aminoácido G e S adicionais não estavam presentes entre CH3 ou CK e o 5 domínio de anticorpo nas construções usando neste ligante.
Quando nenhuma sequência ligadora foi usada entre n o mAb e dAb no formato mAbdAb, o local de clonagem BamHl (e visto que os resíduos de aminoácidos G e S) ainda estão presentes entre CH3 ou CK e o domínio de anticorpo.
Os detalhes totais nas sequências de aminoácido das cadeia leves e pesadas mAbdAb são apresentados na tabela 3. Os mAbdAbs apresentados na tabela 3 foram expressados transitoriamente nas sobrenadantes de célula CHOK1. Seguindo a quantificação mAbdAb este mAbdAb contendo os sobrenadantes foram analisados para a atividade em ELISAs de ligação IL-13 e IL-4. Tabela 3 Nome Descrição Sequência ID N° No.
PascoH-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-GS-48 (= cadeia H) DOML0-53-474 dAb 15 (= cadeia L) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab PascoH-G4S-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-G4S 49 (= cadeia H) ligante-DOML0-53-474 dAb 15 (= cadeia L) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab PascoH-TVAAPS-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-50 (= cadeia H) TVAAPS 15 (= cadeia L) ligante-GS-DOML0-53-474 dAb cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab PascoH-ASTKG-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-GS-51 (= cadeia H) ASTKGPT ligante-GS-DOML0-53-474 dAb 15 (= cadeia L) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab PascoH-EPKSC-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-GS-52 (= cadeia H) EPKSCDKTHTCPPCP ligante-GS-DOML0-53-15 (= cadeia L) 474 dAb cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab PascoH-ELQLE-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-GS- 53 (= cadeia H) ELQLEESCAEAQDGELDG ligante-GS-15 (= cadeia L) DOML0- 53-474 dAb cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab PascoL-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab 14 (= cadeia H) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab-GS-54 (= cadeia L) DOML0-53-474 dAb PascoL-G4S-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab 14 (= cadeia H) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab-G4S 55 (= cadeia L) ligante- DOML0-53-474 dAb
Nome Descrição Sequência ID N° No. PascoL-TVAAPS-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab 14 (= cadeia H) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab-56 (= cadeia L)
TVAAPS ligante-GS-DOML0-53-474 dAb PascoL-ASTKG-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab 14 (= cadeia H) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab-57 (= cadeia L)
ASTKGPT ligante-GS-DOML0-53-474 dAb PascoL-EPKSC-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab 14 (= cadeia H) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab- 58 (= cadeia L) EPKSCDKTHTCPPCP ligante-GS-DOML0- 53-474 dAb PascoL-ELQLE-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab 14 (= cadeia H) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab- 59 (= cadeia L) ELQLEESCAEAQDGELDG ligante-GS- DOML0- 53-474 dAb Os mAbdAbs apresentados na tabela 4 foram expressados em uma ou mais das células CHOK1, CHOE1a ou HEK293-6E. Tabela 4 Nome Descrição Sequência ID N° PascoH-G4S-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-49 (= cadeia H) G4S ligante-DOML0-53-474 dAb 15 (= cadeia L) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab PascoH-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-48 (= cadeia H) GS-DOML0-53-474 dAb 15 (= cadeia L) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab PascoL-G4S-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab 14 (= cadeia H) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab-G4S 55 (= cadeia L) ligante-DOML0-53-474 dAb PascoHL-G4S-474 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-49 (= cadeia H) G4S ligante-DOML0-53-474 dAb 55 (= cadeia L) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab-G4S ligante-DOML0-53-474 dAb
1.4 Sequência dos números ID para os anticorpos monoclonais, anticorpos de domínio e ligantes Sequência dos números ID para os anticorpos monoclonais (mAb), anticorpos de domínio (dAb) e ligantes usados para gerar os mAbdAbs são mostrados abaixo na Tabela 5. Tabela 5 Nome Especificidade Sequência ID N° Anticorpo monoclonal de IL-13 anti-humano IL-13 humano 12 (Cadeia H) (também conhecido como 586) 13 (cadeia L) Anticorpo monoclonal de IL-4 anti-humano IL-4 humano 14 (Cadeia H) (também conhecido como Pascolizumab) 15 (cadeia L) DOML0-53-474 anticorpo de domínio IL-13 humano 5 Anticorpo monoclonal de IL-13 anti-humano IL-13 humano 161 (Cadeia H) (também conhecido como 656) 156 (cadeia L) DOM9-112-210 anticorpo de domínio IL-4 humano 4 DOML0-53-616 anticorpo de domínio IL-13 humano 148
DOM9-155-25 anticorpo de domínio IL-4 humano 1 DOM9-155-147 anticorpo de domínio IL-4 humano 2 DOM9-155-154 anticorpo de domínio IL-4 humano 3 ASTKGPS sequência ligadora Derivado de IgG1 humano 9 Cadeia H (VH-CH1) ASTKGPT sequência ligadora Derivado de cadeia de IgG1 8 humano H (VH-CH1), onde o último resíduo de aminoácido na sequência natural (S) foi substituído por T EPKSCDKTHTCPPCP sequência ligadora Derivado de IgG1 humano 10 Cadeia H (CH1-CH2) TVAAPS sequência ligadora Derivado de cadeia K L7 humana (VL-CK) ELQLEESCAEAQDGELDG sequência ligadora Derivado de IgG1 humano 11 CH3 corrente GGGGS sequência ligadora Uma sequência ligadora6 publicada Sequência de aminoácido IL-13 humano maduro (sem sequência sinal) é dado na SEQ ID N°: 63. Sequência de aminoácido IL-4 humano maduro (sem sequência sinal) é dado na SEQ ID N°: 62. 5 1.5 Expressão e purificação de mAbdAbs As construções de expressão mAbdAb descritas no Exemplo 1 foram transfectadas em uma ou mais das células CHOK1, células CHOE1a ou células HEK293-6E, expressadas em pequenas (aproximadamente 3 ml) ou médias (aproximadamente 50 ml a 100 ml) ou grandes (aproximadamente 1 litro) escalas e então algumas das construções foram purificadas usando colunas de proteína A imobilizadas e quantificadas pela absorbância de leitura a 280 nm.
1.6 Análise de cromatografia de exclusão por tamanho dos mAbdAbs purificados Diversos mAbdAbs foram analisados pela cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e eletroforese em gel de poliacrilamida de sulfato de dodecila sódica (SDS PAGE). Os dados representativos para algumas destas moléculas (PascoH-G4S-474, PascoL-G4S-474, PascoH-474 e PascoHL-G4S-474.) são mostrados nas Figuras 9, 10, 11 e 12 respectivamente. Os dados representativos que mostram a análise SEC e SDS Page para estas moléculas com o motivo ‘GS’ removido são mostrados nas
Figuras 90 a 98. Em alguns casos SEC foi usado ainda para purificar estas moléculas para remover os agregados. Exemplo 2 5 Ligação de mAbdAbs a IL-13 humano e IL-4 humano por ELISA
2.1 Ligação de anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs a IL-13 e IL-4 Os sobrenadantes mAbdAb, foram testados pela ligação a IL- 13 humano em um ELISA de ligação direta (como descrito no método 1). Estes dados são mostrados na Figura 13. A Figura 13 mostra que todos destes anti-IL13mAb-anti- IL4dAbs ligam-se ao IL-13. A atividade de ligação destes mAbdAbs também foi aproximadamente equivalente (dentro de duas a 3 vezes) ao mAb IL13 anti-humano sozinho, que foi incluído neste ensaio como um controle positivo para a ligação IL-13 e a fim de comparar diretamente para os mAbdAbs. IL4 mAb anti-humano purificado (Pascolizumab) foi incluído como um controle negativo para a ligação IL-13. Estas moléculas também foram testados pela ligação a IL-4 humano em um ELISA de ligação direta (como descrito no método 2). Estes dados são mostrados na Figura 14. A Figura 14 mostra que todos destes anti-IL13mAb-anti- IL4dAbs ligam-se ao IL-4, mas alguma variação na atividade de ligação IL-4 foi observada. Nenhuma ligação a IL-4 foi observada quando nenhum anti- IL4 dAb estava presente na construção mAbdAb. O mAb IL13 anti-humano purificado também foi incluído como um controle negativo pela ligação a IL-
4. Nota-se que o anti-IL-4 dAbs sozinho não foi testado neste ensaio como os dAbs não são detectados pelo anticorpo de detecção secundário; em vez de, IL4 mAb anti-humano purificado (Pascolizumab) ser usado como um controle positivo para demonstrar a ligação IL-4 neste ensaio. As amostras purificadas de mAbdAbs, também foram testados pela ligação a IL-13 humano em um ELISA de ligação direta (como descrito no método 1). Estes dados são mostrados na Figura 15. Estes anti-IL13mAb- anti-IL4dAbs purificados ligam-se ao IL-13. A atividade de ligação destes mAbdAbs para IL-13 foi equivalente aquele do mAb IL13 anti-humano 5 purificado sozinho. Um mAb comparado por isótipo (com especificidade por um antígeno irrelevante) também foi incluído como um controle negativo pela ligação a IL-13 neste ensaio. Estes mAbdAbs purificados também foram testados pela ligação a IL-4 humano em um ELISA de ligação direta (como descrito no método 2). Estes dados são mostrados na Figura 16. Todos destes anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs ligam-se ao IL-4. Nota-se que os anti-IL-4 dAbs sozinhos não foram testados neste ensaio como os dAbs não são detectados pelo anticorpo de detecção secundário; em vez de, IL4 mAb anti-humano purificado (Pascolizumab) ser usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-4 neste ensaio. Um mAb comparado por isótipo (com especificidade por um antígeno irrelevante) também foi incluído como um controle negativo pela ligação a IL-4 neste ensaio.
2.2 Ligação de anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs a IL-13 e IL-4 Os sobrenadantes mAbdAb foram testados pela ligação a IL-4 humano em um ELISA de ligação direta (como descrito no método 2). Estes dados são mostrados na Figura 17 (algumas amostras foram preparadas e testadas em cópias e estes foram anotadas como amostra 1 e amostra 2). A Figura 17 mostra que todos destes mAbdAbs ligam-se ao IL-4. IL4 mAb anti-humano purificado sozinho (Pascolizumab) foi incluído neste ensaio mas não gera uma curva de ligação como um erro foi feito quando a diluição deste mAb para o uso no ensaio (Pascolizumab foi usado sucessivamente em todos as outras ELISAs IL-4 de ligação subsequente). O mAb IL13 anti-humano purificado foi incluído como um controle negativo para a ligação IL-4.
Os mesmos sobrenadantes mAbdAb também foram testados pela ligação a IL-13 humano em um ELISA de ligação direta (como descrito no método 1). Estes dados são mostrados na Figura 18 (algumas amostras foram preparadas e testadas em cópias e estes foram anotadas como amostra 1 5 e amostra 2). A Figura 18 mostra que todos destes anti-IL4mAb-anti- IL13dAbs ligam-se ao IL-13. O mAb IL13 anti-humano purificado sozinho foi incluído neste ensaio mas não gera uma curva de ligação como um erro foi feito quando a diluição deste mAb para o uso no ensaio (mAb IL13 anti- humano purificado foi usado sucessivamente em todos as outras ELISAs IL- 13 de ligação subsequente). Anti-IL4 mAb purificado (Pascolizumab) foi incluído como um controle negativo pela ligação a IL-13. Nota-se que o anti- IL-13 dAb sozinho (DOML0-53-474) não foi testado neste ensaio como este dAb não é detectado pelo anticorpo de detecção secundário. O anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs purificado, ‘PascoH-G4S-474’, ‘PascoH-474’, ‘PascoLG4S-474’ e ‘PascoHL-G4S-474’, também foram testados pela ligação a IL-4 humano em um ELISA de ligação direta (como descrito no método 2). Estes dados são mostrados na Figura 19. Estes anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs purificados ligam-se ao IL-
4. A atividade de ligação destes mAbdAbs foi aproximadamente equivalente (dentro de 2 vezes) ao anti-IL4 mAb purificado sozinho (Pascolizumab). Um mAb comparado por isótipo (com especificidade por um antígeno irrelevante) também foi incluído como um controle negativo pela ligação a IL-4 neste ensaio. Os mesmos anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs purificados, PascoH- G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 e PascoHL-G4S-474, também foram testados pela ligação ao IL-13 humano em um ELISA de ligação direta (como descrito no método 1). Estes dados são mostrados na Figura 20A. Estes anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs purificados ligam-se ao IL-
13. Um mAb comparado por isótipo (com especificidade por um antígeno irrelevante) também foi incluído como um controle negativo pela ligação a IL-13 neste ensaio. Nota-se que o anti-IL-13 dAb sozinho (DOML0-53-474) não foi testado neste ensaio como o dAb não é detectado pelo anticorpo de 5 detecção secundário; em vez de, o mAb IL13 anti-humano foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-13 neste ensaio. Os PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 e PascoHELQLE-474 purificados também foram testados pela ligação de um IL-13 cinomolgo em um ELISA de ligação direta, como descrito no método 17 (PascoH-474 GS removido e PascoH-TVAAPS-474 GS removido também foram incluídos neste ensaio, a construção destas moléculas é descrita no Exemplo 18). Um gráfico que mostra um dado representativo é mostrado na Figura 20B. Os PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 e PascoHELQLE-474 purificados todos ligam-se ao IL-13 cinomolgo. O IL4 mAb anti-humano purificado sozinho (Pascolizumab) foi incluído neste ensaio como um controle negativo pela ligação a IL-13. O mAb IL13 anti- humano purificado foi incluído como um controle positivo para um IL-13 de ligação cinomóloga. Nota-se que o anti-IL-13 dAb sozinho (DOML0-53-474) não foi testado neste ensaio como o dAb não é detectado pelo anticorpo de detecção secundário; em vez de, o mAb IL13 anti-humano foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-13 neste ensaio. Exemplo 3 Ligação de mAbdAbs a IL-13 humano e IL-4 humano pela ressonância de plasmon de superfície (BIAcoreTM)
3.1 Ligação de anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs a IL-13 e IL-4 por BIAcoreTM Os mAbdAbs (em sobrenadantes de célula CHO, preparadas como descrito na seção 1.5) foram testados pela ligação a IL-13 humano usando BIAcoreTM a 25 °C (como descrito no método 4). Para este dado apresentado, duas curvas de concentração IL-13 (100 nM e 1 nM) foram avaliadas e níveis de captura de resposta relativa de entre 1000 e 1300 (aproximadamente) foram atingidos para cada construção mAbdAb.
Devido 5 ao número limitado de concentrações de IL-13 usado, os dados gerados são mais adequados para a classificação das construções antes do que as medições cinéticas exatas.
Estes dados são mostrados na Tabela 6. Tabela 6 Anticorpo KD de afinidade de ligação (Nm) 586H-25 0,39 586H-G4S-25 0,41 586H-TVAAPS-25 0,5 586H-ASTKG-25 0,54 586H-EPKSC-25 0,55 586H-ELQLE-25 0,42 586H-147 0,46 586H-G4S-147 0,45 586H-TVAAPS-147 0,56 586H-ASTKG-147 0,44 586H-EPKSC-147 0,46 586H-ELQLE-147 0,51 586H-154 0,46 586H-G4S-154 0,37 586H-TVAAPS-154 0,56 586H-ASTKG-154 0,44 586H-EPKSC-154 0,42 586H-ELQLE-154 0,44 586H-210 0,44 586H-G4S-210 0,42 586H-TVAAPS-210 0,4 586H-ASTKG-210 0,4 586H-EPKSC-210 0,43 586H-ELQLE-210 0,43 586H 0,44 586H-ASTKG 0,32 586H-ELQLE 0,47 586H-EPKSC 0,45 mAb IL-13 anti-humano (purificado) 0,38 Pascolizumab (purificado) nenhuma ligação
Todos destes anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs ligam-se ao IL-13 com afinidades de ligação similares que foram aproximadamente equivalentes a afinidade de ligação de mAb IL13 anti-humano purificado sozinho.
Estes dados sugerem que a adição de ligantes e/ou anti-IL4 dAbs a cadeia pesada do anti-IL13 mAb, não afetam a afinidade de ligação IL-13 do componente mAb dentro desta construção mAbdAbs.
Estes mAbdAbs também foram testados pela ligação a IL-4 humano usando BIAcoreTM a 25 °C (como descrito no método 5). Estes dados são mostrados na Tabela 7. Para este dado apresentado, quarto curvas de concentração IL-4 (512, 128, 32 e 8 nM) foram avaliadas e níveis de captura 5 de resposta relativa aproximados para cada mAbdAb testado são indicados na tabela.
Nota-se que o anti-IL-4 dAbs sozinho não foi testado neste ensaio como os dAbs não podem ser capturados na proteína A ou chip CM5 revestido por IgG anti-humano; em vez de, o mAb IL4 anti-humano (Pascolizumab) foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-4 neste ensaio.
Tabela 7 Anticorpo Nível de Em taxa taxa de corte KD de afinidade de Captura (ka, Ms-1) (kd, s-1) ligação (nM) 586H-25 864 6,13e3 4,11e-4 67 586H-G4S-25 1818 6,3e3 9,54e-4 151 586H-TVAAPS-25 673 1,27e5 1,2e-4 0,95 586H-ASTKG-25 809 5,4e5 1,20e-3 21,8 586H-EPKSC-25 748 4,79e4 1,42e-3 29,6 586H-ELQLE-25 603 1,26e6 1,63e-6 0,001* 586H-147 1095 3,42e3 1,18e-3 344,8 586H-G4S-147 1200 4,21e3 4,57e-4 108,5 586H-TVAAPS-147 433 6,62e4 6,69e-7 0,011** 586H-ASTKG-147 1248 3,67e4 6,9e-4 18,8 586H-EPKSC-147 878 2,54e4 6,71e-4 26,4 586H-ELQLE-147 676 7,01e5 1,52e-5 0,027* 586H-154 436 6,1e3 1,74e-3 285 586H-G4S-154 1437 5,00e3 6,85e-4 137,8 586H-TVAAPS-154 1530 6,44e4 1,15e-7 0,002** 586H-ASTKG-154 1373 3,26e4 2,84e-4 8,7 586H-EPKSC-154 794 3,03e4 5,7e-4 18,8 586H-ELQLE-154 795 1,25e6 3,57e-6 0,003* 586H-210 1520 não determinado não determinado --- 586H-G4S-210 1448 não determinado não determinado --- 586H-TVAAPS-210 1693 não determinado não determinado --- 586H-ASTKG-210 1768 não determinado não determinado --- 586H-EPKSC-210 1729 não determinado não determinado --- 586H-ELQLE-210 1350 não determinado não determinado --- 586H 1500 nenhuma ligação nenhuma ligação --- 586H-ASTKG 1615 nenhuma ligação nenhuma ligação --- 586H-ELQLE 343 nenhuma ligação nenhuma ligação --- 586H-EPKSC 1416 nenhuma ligação nenhuma ligação --- Pascolizumab (purificado) 1092 2,04e6 1,23e-4 0,060
As advertências foram observadas para alguns dos dados apresentados acima.
Os ajustes de curva fracos foram observados por alguns dados observados (*), os valores de afinidade de ligação atual que foi determinado por estes dados deve ser portanto tratado com cuidado.
A dissociação positiva foi vista em algumas curvas (**), os valores de afinidade de ligação atual que foi determinado por estes dados devem ser portanto tratados com cuidado.
Além disso, BIAcoreTM foi incapaz (isto é não bastante 5 não sensível) para determinar as taxas on e off para todas as construções mAbdAbs contendo o DOM9-112-210 dAb, devido a ligação excepcionalmente firme destes mAbdAbs a IL-4. Determinação de cinéticos ligantes para estes mAbdAbs por IL-4 ainda foi impedido pelos efeitos de dissociação positivo observado.
Estes dados são mostrados na Figura 21. O dado similar foi obtido no experimento adicional.
Estes dados são mostrados na Figura 22. Estes dois dados independentes apresentados indicam que todos dos anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs ligam-se ao IL-4, mas as afinidades de ligação variadas dependendo do ligante usado para ligar o anti-IL4 dAb a cadeia pesada anti-IL13 mAb.
Neste experimento, a presença de um ligante foi observado para intensificar a afinidade de ligação por IL-4 do componente anti-IL4 dAb (quando colocado na cadeia pesada) no formato mAbdAb . For exemplo as moléculas tendo ligantes TVAAPS ou ELQLEESCAEAQDGELDG parecem ser mais ligantes potentes.
Nenhuma ligação ao IL-4 foi observada quando nenhum anti-IL4 dAb estava presente na construção mAbdAb.
Este não foi possível para medir a afinidade de ligação de 586-ligante-210 mAbdAbs por IL-4, devido ao fato que o componente DOM9-112-210 destes mAbdAbs ligam-se mais fortemente e visto que a taxa de corte é menor para determinar usando BIAcoreTM Os anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs purificados também foram testados pela ligação a IL-13 humano e IL-4 humano usando BIAcoreTM a 25 °C (como descritos nos métodos 4 e 5). Estes dados são mostrados na Tabela 8. Tabela 8 Construção Afinidade de ligação, KD (nM)
IL-13 humano IL-14 humano 586H-TVAAPS-25 0,38 1,1 586H-TVAAPS-154 0,41 0,49 586H-TVAAPS-210 0,38 ligante muito firme (incapaz de determinar KD devido aos efeitos de dissociação positive e nível de sensibilidade de técnica BIACORETM) mAb IL-13 anti-humano (purificado) 0,43 --- Pascolizumab (purificado) --- 0,03 O 586H-TVAAPS-25, 586H-TVAAPS-154 e 586H-TVAAPS- 210 todos ligam-se ao IL-13 com afinidades de ligação similares e este foi aproximadamente equivalente à afinidade de ligação de mAb IL13 anti- humano purificado sozinho. O 586H-TVAAPS-25, 586H-TVAAPS-154 e 5 586H-TVAAPS-210 todos ligam-se ao IL-4. Este não foi possível para medir a afinidade de ligação de 586-TVAAPS-210 por IL-4, devido ao fato que o componente DOM9-112-210 deste mAbdAb liga-se muito firmemente e visto que a taxa de corte foi muito menor para determinar usando BIAcoreTM. Nota- se que o anti-IL-4 dAbs sozinho (DOM9-155-25, DOM9-155-154 e DOM9- 112-210) não foram testados neste formato de ensaio como os dAbs não podem ser capturados na proteína A ou chip CM5 revestido por IgG anti- humano; em vez de, o mAb IL4 anti-humano (Pascolizumab) foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-4 neste ensaio.
3.2 Ligação de anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs a IL-4 e IL-13 por BIAcoreTM Os mAbdAbs (em sobrenadantes de célula CHO preparadas como descrito na seção 1.5) foram testados pela ligação a IL-4 humano usando BIAcoreTM a 25 °C (como descrito no método 5). Estes dados são mostrados na Tabela 9 (algumas amostras foram preparadas e testadas em cópias - este foi anotada como amostra 1 e amostra 2). Para este dado apresentado, quatro curvas de concentração IL-4 (100 nM, 10 nM, 1 nM e 0,1 nM) foram avaliadas e níveis de captura de resposta relativa aproximados para cada mAbdAb testados são indicados na tabela. Um mAb comparado por isótipo (com especificidade por um antígeno irrelevante) também foi incluído como um controle negativo pela ligação a IL-4 neste ensaio.
Tabela 9 Anticorpo Nível de Em taxa Taxa de corte KD de afinidade de Captura (ka, Ms-1) (kd, s-1) ligação (nM) Experimento 1 PascoH-G4S-474 ~500 5.1e6 8.6e-5 0.02 PascoH-TVAAPS-474 ~500 5.5e6 9.7e-5 0.02 PascoH-474 ~500 4.8e6 9.4e-5 0.02 PascoH-ASTKG-474 ~500 5.3e6 8.6e-5 0.02 PascoH-ELQLE-474 ~500 5.1e6 1.1e-4 0.02 PascoH-EPKSC-474 ~500 4.9e6 9.8e-5 0.02 Pascolizumab (purificado) ~700 5.3e6 1.6e-4 0.03 Experimento 2 PascoL-G4S-474 (amostra 1) 1871 2.14e6 1.35e-4 0.063 PascoL-G4S-474 (amostra 2) 1921 2.13e6 1.11e-4 0.052 PascoL-TVAAPS-474 (amostra 1) 2796 2.48e6 2.12e-4 0.085 PascoL-TVAAPS-474 (amostra 2) 3250 3.04e6 2.79e-4 0.092 PascoL-474 (amostra 1) 3254 2.8e6 1.84e-4 0.065 PascoL-474 (amostra 2) 2756 2.53e6 1.22e-4 0.048 PascoL-ASTKG-474 (amostra 1) 3037 2.95e6 1.21e-4 0.041 PascoL-ASTKG-474 (amostra 2) 3784 2.54e6 1.52e-4 0.060 PascoL-EPKSC-474 (amostra 1) 3238 1.86e6 2.58e-4 0.139 PascoL-EPKSC-474 (amostra 2) 3276 2.51e6 3.18e-4 0.127 Pascolizumab (purificado) 1152 2.04e6 1.23e-4 0.060 mAb de controle negativo 2976 nenhuma ligação nenhuma ligação ---
Todos dos anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs testados ligam-se ao IL-4 com afinidades de ligação similares e este foi aproximadamente equivalente à afinidade de ligação de o mAb IL4 anti-humano sozinho 5 (Pascolizumab). PascoL-EPKSC-474 ligam-se ao IL-4 aproximadamente 2 vezes potencialmente menos do que Pascolizumab.
Estes dados sugerem que a adição de ligantes e o anti-IL13 dAb da cadeia pesada ou a cadeia leve de Pascolizumab, não publicamente afetam a afinidade de ligação IL-4 do componente mAb dentro da construção mAbdAb.
Estes mAbdAbs também foram testados pela ligação a IL-13 humano usando BIAcoreTM a 25 °C (como descrito no método 4). Estes dados são mostrados na Tabela 10 (algumas amostras foram preparadas e testadas em cópias - este foi anotado como amostra 1 e amostra 2). Para este dado apresentado, quarto curves de concentração IL-13 (128 nM, 32 nM, 8 nM e 2 nM) foram avaliadas e níveis de captura de resposta relativa aproximados para cada mAbdAb testado são indicados na tabela.
Tabela 10 Anticorpo Nível de Em taxa Taxa de corte KD de afinidade Captura (ka, Ms-1) (kd, s-1) de ligação (nM) Experimento 1
PascoH-474 ~500 3.6e5 3.1e-4 0.84 PascoH-G4S-474 ~500 3.9e5 2.6e-4 0.67 PascoH-TVAAPS-474 ~500 4.5e5 4.2e-4 0.94 PascoH-ASTKG-474 ~500 3.1e5 4.6e-4 1.5 PascoH-ELQLE-474 ~500 3.4e5 6.2e-4 1.8 PascoH-EPKSC-474 ~500 3.5e5 4.0e-4 1.1 mAb IL-13 Anti-humano (purificado) ~650 8.6e5 4.9e-4 0.57 Experimento 2 PascoL-474 (amostra 1) 3254 2.86e5 3.82e-4 1.34 PascoL-474 (amostra 2) 2756 3.12e5 3.86e-4 1.24 PascoL-G4S-474 (amostra 1) 1871 5.63e5 4.25e-4 0.756 PascoL-G4S-474 (amostra 2) 1921 5.59e5 3.47e-4 0.621 PascoL-TVAAPS-474 (amostra 1) 2796 7.42e5 2.58e-4 0.348 PascoL-TVAAPS-474 (amostra 2) 3250 6.22e5 1.71e-4 0.275 PascoL-ASTKG-474 (amostra 1) 3037 5.26e5 2.38e-4 0.451 PascoL-ASTKG-474 (amostra 2) 3784 5.38e5 3.20e-4 0.595 PascoL-EPKSC-474 (amostra 1) 3238 4.17e5 3.34e-4 0.801 PascoL-EPKSC-474 (amostra 2) 3276 3.51e5 2.86e-4 0.815 Anti-human IL-13 mAb (purificado) 1373 9.12e4 6.11e-4 0.67 Pascolizumab (purificado) 1152 nenhuma ligação nenhuma ligação --- mAb de controle negativo 2976 nenhuma ligação nenhuma ligação ---
O dado de afinidade de ligação pelas construções testadas no experimento 2 também são mostrados na Figura 23. Todos dos anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs ligam-se ao IL-13. Em mais casos a presença de um ligante não parece intensificar uma afinidade de 5 ligação por IL-13 do componente anti-IL13 dAb quando colocado na cadeia pesada do anti-IL4 mAb.
Entretanto, a presença de um ligante parece intensificar a afinidade de ligação por IL-13 do componente anti-IL13 dAb quando colocado na cadeia leve do anti-IL4 mAb.
PascoLTVAAPS-474 parece ter a afinidade de ligação mais potente IL-13 neste experimento.
Nota-se que o anti-IL-13 dAb sozinho (DOML0-53-474) não foi testado neste ensaio como o dAb não pode ser capturado na proteína A ou chip CM5 revestido por IgG anti-humano; em vez de, mAb IL13 anti-humano purificado foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL- 13 neste ensaio.
Um mAb comparado por isótipo (com especificidade por um antígeno irrelevante) também foi incluído como um controle negativo pela ligação a IL-13 neste ensaio.
Os anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs purificados também foram testados pela ligação a IL-4 humano e IL-13 humano usando BIAcoreTM a 25 °C (como descritos nos métodos 4 e 5). Estes dados são mostrados na Tabela 11.
Tabela 11 Construção Afinidade de ligação, KD (nM) IL-4 Humano IL-13 Humano PascoH-G4S-474 0,036 0,58 PascoH-474 0,037 0,71 PascoL-G4S-474 0,028 1,2 PascoHL-G4S-474 0,035 0,87 mAb IL-13 anti-humano --- 0,41 Pascolizumab (purificado) 0,037 --- Todos ligam-se ao IL-4 com afinidades de ligação similares e este foi aproximadamente equivalente à afinidade de ligação do mAb IL4 anti-humano sozinho (Pascolizumab). Todos estes também ligam-se ao IL-13. 5 Nota-se que o anti-IL-13 dAb sozinho (DOML0-53-474) não foi testado neste ensaio como o dAb não pode ser capturado na proteína A ou chip CM5 revestido por IgG anti-humano; em vez de, o mAb IL13 anti- humano foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-13 neste ensaio.
3.3 Estequiometria de ligação de IL-13 e IL-4 ao anti-IL4mAb-anti- IL13dAbs usando BIAcoreTM Os anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs purificados foram avaliados pela estequiometria de ligação por IL-13 e IL-4 usando BIAcoreTM (como descrito no método 7). Estes dados são mostrados na Tabela 12. Tabela 12 Construção Estequiometria IL-4 Humano IL-13 Humano PascoL-G4S-474 1,8 1,8 PascoH-G4S-474 1,8 1,9 Pasco-474 1,8 1,9 PascoHL-G4S-474 1,7 3,5 mAb IL-13 anti-humano (purificado) --- 1,8 Pascolizumab (purificado) 1,8 --- PascoH-G4S-474, PascoH-474 e PascoL-G4S-474 foram capazes de ligar próximo as duas moléculas de IL-13 e duas moléculas de IL-
4. PascoHL-G4S-474 foi capaz de ligar próximo as duas moléculas de IL-4 e próximo as quatro moléculas de IL-13. Estes dados indicam que as construções testadas devem ser totalmente ocupadas pelo número esperado de moléculas IL-13 ou IL-4.
Exemplo 4 Potência de neutralização de mAbdAbs em bioensaios IL-13 e IL-4
4.1 Anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs Os anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs purificados foram testados 5 pela neutralização de IL-13 humano em um ensaio de célula TF-1 (como descrito no método 8). Estes dados são mostrados na Figura 24. Os anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs purificados, 586H-TVAAPS- 25, 586H-TVAAPS-154 e 586H-TVAAPS-210, neutralizaram totalmente a bioatividade de IL-13 em um ensaio de célula TF-1. As potências de neutralização destes mAbdAbs estão dentro de 2 vezes do mAb IL-13 anti- humano purificado sozinho. O anti-IL-4 humano mAb purificado (Pascolizumab) e anti-I L4 dAbs purificado (DOM9-155-25, DOM9-155-154 ou DOM9-112-210) foram incluídos como controle negativo pela neutralização de IL-13 neste ensaio. Os anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs purificados, 586H-TVAAPS- 25, 586H-TVAAPS-154 e 586H-TVAAPS-210, também foram testados pela neutralização de IL-4 humano em um ensaio de célula TF-1 (como descrito no método 9). Estes dados são mostrados na Figura 25. O 586H-TVAAPS-210 neutralizou totalmente a bioatividade de IL-4 neste bioensaio de célula TF-1. A potência de neutralização deste mAbdAb está dentro de 2 vezes do dAb IL-4 anti-humano purificado sozinho (DOM9-112-210). O 586H-TVAAPS-25 e 586H-TVAAPS-154 não neutralizam a bioatividade de IL-4 e este estava em contraste ao dAbs IL-4 anti-humano purificado sozinho (DOM9-155-25 e DOM9-155-154). Como demonstrado por BIAcoreTM 586H-TVAAPS-25 purificado e 586H- TVAAPS-154 tem 1,1 nM e 0,49 nM de afinidades de ligação (respectivamente) por IL-4. O IL-4 liga-se o receptor IL-4 muito firmemente (afinidades de ligação de aproximadamente 50 pM foram relatados nas publicações na literatura) e deste modo a observação que tanto 586H-
TVAAPS-25 quanto 586H-TVAAPS-154 foram incapazes de efetivamente neutralizar uma bioatividade de IL-4 no bioensaio de célula TF-1 pode ser um resultado da afinidade inferior relativa destes mAbdAbs por IL-4 comparados a potência de IL-4 pelo receptor IL-4. 5 O mAb anti-IL-4 purificado (Pascolizumab) foi incluído como um controle positivo para uma neutralização de IL-4 neste bioensaio. O mAb IL-13 anti-humano purificado foi incluído como um controle negativo pela neutralização de IL-4 neste bioensaio.
4.2 Anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs Os anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs purificados, PascoH-G4S- 474, PascoH-474, PascoLG4S-474 e PascoHL-G4S-474, foram testados pela neutralização de IL-4 humano em um ensaio de célula TF-1 (como descrito no método 9). Estes dados são mostrados na Figura 26. Os anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs purificados, PascoH-G4S- 474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 e PascoHL-G4S-474, neutralizaram totalmente a bioatividade de IL-4 em um ensaio de célula TF-1. As potências de neutralização destes mAbdAbs foram aproximadamente equivalentes aquele de mAb IL4 anti-humano purificado sozinho (Pascolizumab), mAb IL- 13 anti-humano purificado, DOML0-53-474 dAb purificado e um dAb com especificidade por um antígeno irrelevante (dAb de controle negativo) também foram incluídos como controle negativo pela neutralização de IL-4 neste bioensaio. Os anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs purificados, PascoH-G4S- 474, PascoH-474, PascoLG4S-474 e PascoHL-G4S-474, foram testados pela neutralização de IL-13 humano em um ensaio de célula TF-1 (como descrito no método 8). Estes dados são mostrados na Figura 27. Os anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs purificados, PascoH-G4S- 474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 e PascoHL-G4S-474, neutralizaram totalmente a bioatividade de IL-13 em um ensaio de célula TF-1. As potências de neutralização destes mAbdAbs estão dentro de 3 vezes de dAb anti-IL-13 purificado sozinho (DOML0-53-474). O mAb IL-13 anti-humano purificado também foi incluído como um controle positivo para uma neutralização IL-13 neste bioensaio.
Um dAb com especificidade por um antígeno irrelevante 5 (dAb de controle negativo) e IL4 mAb anti-humano purificado sozinho (Pascolizumab) também foram incluídos como controle negativo pela neutralização de IL-4 neste bioensaio.
Os anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs purificados, PascoH-G4S- 474, PascoH-474, PascoLG4S-474 e PascoHL-G4S-474, também foram testados pela neutralização simultânea de IL-4 humano e IL-13 humano em um bioensaio de célula TF-1 de neutralização dupla (como descrito no método 10). Estes dados são mostrados na Figura 28. Os anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs purificados, PascoH-G4S- 474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 e PascoHL-G4S-474, neutralizaram totalmente a bioatividade de tanto IL-4 quanto IL-13 em um bioensaio de célula TF-1 de neutralização dupla.
As potências de neutralização destes mAbdAbs foram aproximadamente equivalentes aqueles de uma combinação de IL4 mAb anti-humano purificado (Pascolizumab) e dAb anti-IL-13 purificado (DOML0-53-474). O mAb IL-13 anti-humano purificado sozinho, mAb IL-4 anti-humano purificado sozinho (Pascolizumab) e o anti-IL-13 humano dAb (DOML0-53-474) sozinho (que foram incluídos como controle negativo) não neutraliza totalmente a bioatividade de tanto IL-4 quanto IL-13 neste bioensaio de neutralização IL-4 e IL-13 duplo.
Exemplo 5 Análise SEC-MALLS de dAbs Os dAbs específicos por antígenos foram caracterizados por seu estado de solução por SEC-MALLS (cromatografia de exclusão por tamanho - dispersão de luz de laser de ângulo múltiplo) e os resultados são mostrados na Tabela 13: o DOML0-53-474, dAb existe como um monômero na solução enquanto todos os DOM9 dAbs (DOM9-112-210, DOM9-155-25, DOM9-155-147 e DOM9-155-154) podem formar dímeros estáveis (e em alguns exemplos tetrâmeros).
5.1. Preparação de proteínas 5 As amostras foram purificadas e dialisadas no tampão apropriado por exemplo PBS. As amostras foram filtras após a diálise e a concentração determinada (0,43 mg/ml DOM-155-25), (1,35 mg/ml DOM9- 155-147) e 1,4 mg/ml DOM9-155-159). DOML0-53-474 e DOM9-112-210 foram ajustados a 1mg/ml. O BSA foi adquirido de Sigma e usado sem purificação adicional.
5.2. Cromatografia de exclusão de tamanho e apresentação do detector O sistema Shimadzu LC-20AD Prominence HPLC com uma autoamostragem (SIL-20A) e SPD-20A Prominence UV/detector Vis foi conectado a Wyatt Mini Dawn Treos (MALLS, detector de dispersão de luz de laser de ângulo múltiplo) e detector Wyatt Optilab rEX DRI (índice refrativo diferencial). Os detectores foram conectados na seguinte ordem - LS-UV-RI. Tanto os instrumentos RI quanto os LS operados em uma microonda de 488nm. A coluna TSK2000 (Tosoh corporation)) foi usada (coluna HPLC com base em sílica) com fase móvel de 50 mM de tampão de fosfato (sem sal), ou 1 x PBS, ambos em pH7.4. Uma taxa de fluxo usada é 0,5 ou 1 ml/min, o período de realização foi ajustado as taxas de fluxo diferentes refletidas (45 ou 23 min) e não foi esperado ter impacto significante na separação das moléculas. As proteínas foram preparadas no tampão a uma concentração de 1 mg/ml e volume de injeção de 100 ul.
5.3. Calibração detectora O detector de difusão de luz foi calibrado com tolueno de acordo com as instruções dos fabricantes.
5.4. Calibração detectora com BSA
A saída detectora UV e saída detectora RI foram conectadas ao instrumento de difusão de luz de modo que os sinais a partir de todos os três detectores devem ser simultaneamente coletados com o software Wyatt ASTRA. Diversas injeções de BSA em uma fase móvel de PBS (1 ml/min) 5 são realizados em uma coluna Tosoh TSK2000 com sinais UV, LS e RI coletados pelo software Wyatt. Os traços são então analisados usando software ASTRA, e os sinais normalizados, alinhados e corrigidos para ampliar a faixa seguindo as instruções dos fabricantes. Os constantes da calibração são então medianas e a entrada no modelo que é usado pela realização de amostras futuras.
5.5. Cálculos de massa molar absoluta 100 ul de cada amostra foi injetado na coluna pré-equilibrada apropriada. Após a coluna SEC da amostras passar através de 3 detectores em linha - UV, MALLS (dispersão de luz de laser de ângulo múltiplo) e DRI (índice refrativo diferencial) permitindo a determinação de massa molar absoluta. A diluição que acontece na coluna é cerca de 10 vezes, e a concentração em que no estado de solução foi determinado como apropriado. A base de cálculos em ASTRA bem como da técnica Zimm plot, que é frequentemente implementada em um modo de amostra de batelada é a equação de Zimm [J. Chem. Phys. 16, 1093-1099 (1948)]: (Eq. 1) onde • c é a concentração massa das moléculas de soluto no solvente (g/mL) • M é a massa molar média ponderada (g/mol) • A2 é o segundo coeficiente virial (mol mL / g2) • K* = 4p2 n02 (dn/dc)2 10-4 NA-1 é uma constante óptica onde n0 é o índice refrativo do solvente no comprimento de onda de radiação incidente
(vácuo), l0 é o comprimento de onda de radiação incidente (vácuo), expressado em nanômetros, NA é o número de Avogadro, igual ao 6,022 x 1023 mol-l e do/dc é o aumento do índice refrativo diferencial da solução soluto-solvente com relação a uma mudança na concentração de soluto, expressado em mL/g 5 (este fator deve ser medido independentemente usando um detector dRI). • P(q) é o fator de forma teoricamente derivada, aproximadamente igual a 1- 2µ2(1-2)/3!+…, onde µ=(4π/λ)sen(θ/2) e <r2> é o raio quadrado médio.
P(q) é uma função do tamanho médio das moléculas z, forma e estrutura. • Rq é o excesso da razão Rayleigh (cm-1) Esta equação compreende luz incidente verticalmente polarizada e é válida na ordem c2. Para realizar os cálculos com o método de ajuste Zimm, que é um ajuste a Rq /K*c versos sin2(q/2), necessitamos expandir o recíproco da primeira Eq. 1 na ordem c: Para realizar os cálculos com o método de ajuste Zimm, que é um ajuste a Rq /K*c versos sin2(q/2), necessitamos expandir o recíproco da primeira Eq. 1 na ordem c:
Eq. 2
Os resultados apropriados neste caso são
Eq. 3 e
Eq. 4
Os cálculos são realizados automaticamente por software ASTRA, resultando em uma plotagem com massa molar determinada para cada uma das partes [Astra manual]. A massa molar obtida a partir da plotagem para cada um dos picos observados no cromatograma foi comparado com a massa molecular esperada de uma unidade simples de proteína.
Este fornece uma base para formar as conclusões a cerca do estado na solução da proteína.
O dado representativo é mostrado na Tabela 13. 5 Tabela 13: dAb SEC-MALLS MW Coluna & fase móvel DOML0-53-474 monômero 14kDa TSK2000, PBS, pH7.4, 0.5ml/min DOM9-112-210 dímero 30kDa TSK2000, PBS, pH7.4, 0.5ml/min DOM9-155-25 dímero 28kDa TSK2000, 50mM, fosfato buffer pH7.4, 1ml/min DOM9-155-147 equilíbrio de 26-51kDa TSK2000, 50mM fosfato buffer, pH7.4, tetrâmero-dímero 1ml/min DOM9-155-159 dímero 28kDa TSK2000, 50mM fosfato Buffer, pH7.4, 1ml/min
DO M 10-53-474 O pico simples com a massa molar média definida como - 14kDa que indica um estado monomérico na solução, mostrado na Figura 29 DOM9-112-210 O pico simples com a massa molar definida como 30 kDa que indica um estado dimérico na solução, mostrado na Figura 30. DOM9-155-25 Nove picos simétricos mas funcionando a parte frontal do tampão.
A parte média do pico foi usada para a determinação de massa molar (ver Figura abaixo com todos os três sinais sobrepostos). A massa molar é 28 kDa que representa um dAb dimérico, mostrado na Figura 31. Sobreposição de todos os três sinais (Figura 32) DOM9-155-147 O pico principal é projetado com a massa molar de 26 kDa na parte direita do pico e aumentando abruptamente na parte esquerda do pico até 53kDa.
O pico mais provavelmente representa um dímero e uma fração menor de tetrâmero em um equilíbrio rápido.
Um pico muito menor eluindo- se a 7,6 minutos, representa uma proteína tetramérica com massa molar de 51 kDa (Figura 33). DOM9-155-159
A proteína realizada como um pico simétrico simples, com massa molar média projetada a -28kDa que indica um estado dimérico na solução (Figura 34) Controle para indicação MW por SEC-MALLS: BSA 5 Cada BSA realiza para cada um dos experimentos apresentados acima resultados em MW esperado, por exemplo 2 picos com massa molar de 67 e 145 kDa (monômero e dímero) (Figura 35). Exemplo 6 Geração de mAbdAbs triespecíficos Os mAbdAbs triespecíficos foram construídos pela geração das sequências VH e VL pela reunião de PCR que foi então clonado nos vetores de expressão mAbdAb existentes ou pela subclonagem das regiões VH e VL existentes a partir dos vetores de expressão mAb nos vetores de expressão mAbdAb existentes, tal que quando expressado, o mAbdAb triespecífico tem dAbs ligado a ambos do terminal C das cadeias leves e pesadas.
Uma sequência ligadora foi usada para ligar o domínio de anticorpo a cadeia pesada CH3 ou cadeia leve CK.
Um diagrama esquemático de uma molécula mAbdAb triespecífica é mostrada na Figura 36 (a cadeia pesada mAb é esboçada em cinza; a cadeia leve mAb é esboçada em branco; os dAbs são esboçados em preto). Um diagrama esquemático que ilustra uma construção de um mAbdAb cadeia pesada triespecífico (ilustração da parte superior) e um mAbdAb de cadeia leve triespecífico (ilustração da parte funda) é mostrado abaixo
Para a cadeia pesada o termo 'VH' é a sequência de cadeia pesada variável de anticorpo monoclonal; 'CH1, CH2 e CH3' são sequências de região constante de cadeia pesada IgG1 humano; ‘ligante’ é a sequência da região ligadora específica usada; ‘dAb’ é o domínio da sequência de 5 anticorpo. Para a cadeia leve: ‘VL’ é a sequência de cadeia leve variável de anticorpo monoclonal; 'CK' é a sequência de região constante de cadeia leve humana; ‘ligante’ é a sequência da região ligadora específica usada; ‘dAb’ é o domínio da sequência de anticorpo. A sequência de sinal de aminoácido de mamífero (como mostrado na SEQ ID N°: 64) foi usada na geração de estas construções.
6.1 Anti-IL18mAb-anti-IL4dAb-anti-IL13dAb triespecífico Um anti-IL18mAb-anti-IL4dAb-anti-IL13dAb triespecífico (também conhecido como IL18mAb-210-474) foi construído pelo enxerto de uma sequência codificadora de um domínio de anticorpo IL-4 anti-humano (DOM9-112-210) em uma sequência codificadora da cadeia pesada e uma sequência codificadora de um domínio de anticorpo anti-IL13 (DOML0-53- 474) em uma sequência codificadora da cadeia leve de um anticorpo monoclonal IL-18 anti-humano humanizado. Um ligante G4S foi usado para ligar o domínio de anticorpo anti-IL4 na cadeia pesada do anticorpo monoclonal. Um ligante G4S também foi usado para ligar o domínio de anticorpo anti-IL13 na cadeia leve do anticorpo monoclonal.
O IL18mAb-210-474 foi expressado transitoriamente em sobrenadantes de célula CHOK1 e seguindo a quantificação de IL18mAb- 210-474 no sobrenadante da célula, analisado em um número de IL-18, IL-4 e ensaios de ligação IL-13. Nome Descrição Sequência ID No. IL18mAb-210-474 Cadeia H = cadeia pesada IL-18 mAb anti- 69 (=Cadeia H) humano- ligante G4S -DOM9-112-210 dAb 70 (= Cadeia L) Cadeia L = cadeia leve IL-18 mAb anti-humano – ligante G4S -DOML0-53-474 dAb 5 6.2 Anti-IL5mAb-anti-IL4dAb-anti-IL13dAb triespecífico Um anti-IL5mAb-anti-IL4dAb-anti-IL13dAb triespecífico (também conhecido como Mepo-210-474) foi construído pelo enxerto de uma sequência codificadora de um domínio de anticorpo IL-4 anti-humano DOM9-112-210 (SEQ ID N°: 4) em uma sequência codificadora da cadeia pesada de um anticorpo monoclonal IL-5 anti-humano humanizado (SEQ ID N°: 65) e enxerto de uma sequência codificadora de um domínio de anticorpo anti-IL13 DOML0-53-474 (SEQ ID N°: 5) em uma sequência codificadora da cadeia leve de um anticorpo monoclonal IL-5 anti-humano humanizado (SEQ ID N°: 66). Um ligante G4S foi usado para ligar o domínio de anticorpo anti- IL4 na cadeia pesada do anticorpo monoclonal. Um ligante G4S também foi usado para ligar o domínio de anticorpo anti-IL13 na cadeia leve do anticorpo monoclonal. Este mAbdAb foi expressado transitoriamente em CHOK1 e sobrenadantes de célula HEK293-6E e seguindo pela quantificação no sobrenadante da célula, analisado em um número de IL-4, IL-5 e ensaios de ligação IL-13. Nome Descrição Sequência ID N° Mepo-210-474 Cadeia H = cadeia pesada de mAb de IL-5 anti- 71 (= Cadeia H) humano-G4S ligante-DOM9-112-210 dAb 72 (= Cadeia L) cadeia L = cadeia leve de mAb de IL-5 anti-humano- G4S ligante-DOML0-53-474 dAb
6.3 Sequências de anticorpos monoclonais, anticorpos de domínio e ligantes As sequências para os anticorpos monoclonais, anticorpos de domínio e ligantes usados para gerar os mAbdAbs triespecíficos (ou usada como reagentes de controle nas seguintes exemplificações) são mostrados abaixo na Tabela 14. Tabela 14 Nome Especificidade Sequência ID N° DOM9-112-210 anticorpo de domínio IL-4 humano 4 DOML0-53-474 anticorpo de domínio IL-13 humano 5 GGGGS sequência ligadora 6 Pascolizumab (anticorpo monoclonal de IL-4 anti- IL-4 humano 14 (= cadeia H) humano) 15 (= cadeia L) Mepolizumab (anticorpo monoclonal de IL-5 anti- Human IL-5 65 (= cadeia H) humano) 66 (= cadeia L) Anticorpo monoclonal humano de IL-13 anti-humano IL-13 humano 12 (= cadeia H) (humanizado) 13 (= cadeia L) Anticorpo monoclonal humano de IL-18 anti-humano Human IL-18 67 (= cadeia H) (humanizado) 68 (= cadeia L) 5 Sequência de aminoácido IL-4 humano maduro (sem sequência sinal) é dado na SEQ ID N°: 62. Sequência de aminoácido IL-13 humano maduro (sem sequência sinal) é dado na SEQ ID N°: 63.
6.4 Expressão e purificação de mAbdAbs triespecíficos As sequências de DNA que codificam as moléculas mAbdAb triespecíficas foram clonadas em vetores de expressão de mamíferos (Rln, Rln ou pTT) usando técnicas de biologia molecular padrão. As construções de expressão mAbdAb triespecíficas foram transitoriamente transfectadas em um ou ambos de CHOK1 ou células HEK293-6E, expressadas em pequenas escala (3 ml a 150 ml). Os procedimentos de expressão usados para gerar os mAbdAbs triespecíficos foram os mesmos como aqueles rotineiramente usados para expressar os anticorpos monoclonais. Algumas das construções foram purificadas usando colunas de proteína A imobilizadas e quantificadas pela absorbância de leitura a 280 nm. Exemplo 7 Ligação de mAbdAbs triespecíficos a IL-4 humano, IL-13 humano e IL- 18 humano por ELISA
7.1 Ligação de IL-18mAb-210-474 a IL-4, IL-13 e IL-18 por ELISA
O mAbdAb IL18mAb-210-474 triespecífico (sobrenadantes) preparados como descritos no Exemplo 6 (SEQ ID N°: 69 e 70), foi testado pela ligação de um IL-18 humano, IL-13 humano e IL-4 humano em ELISAs de ligação direta (como descrito nos métodos 1, 2 e 3) e estes dados são 5 mostrados nas Figuras 37, 38 e 39 respectivamente (IL18 mAb-210-474 foi preparado e testado diversas vezes e este foi anotado nas figuras como amostra 1, amostra 2, amostra 3, etc). Estas figuras mostram que IL18mAb-210-474 ligam-se ao IL- 4, IL-13 e IL-18 por ELISA. mAb IL18 anti-humano purificado foi incluído na ligação IL18 de ELISA como um controle positivo para uma ligação IL18. O anti-IL-4 dAb (DOM9-112-210) não foi testado na ligação IL-4 ELISA como este dAb não é detectado pelo anticorpo de detecção secundário; em vez de, IL4 mAb anti-humano purificado (Pascolizumab) foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-4 neste ELISA. O anti-IL-13 dAb (DOML0-53-474) não foi testado na ligação IL-13 ELISA como este dAb não é detectado pelo anticorpo de detecção secundário; em vez de, mAb IL-13 anti-humano purificado foi incluído como um controle positivo para demonstrar ligação IL-13 neste ELISA. Como mostrado nas figuras, os mAbs de controle negativo a um antígeno irrelevante foram incluídos em cada ELISA de ligação. Em cada ELISA a curva de ligação de IL18mAb-210-474 amostra 5 fica a parte de uma curva de ligação para as outras amostras IL18mAb-210-474. A razão para este não é conhecido entretanto, pode ser devido a série de quantificação na quantificação IgG humana ELISA para esta amostra 5 IL18mAb-210-474 particular.
7.2 Ligação de Mepo-210-474 a IL-4 e IL-13 por ELISA Os mAbdAbs triespecíficos Mepo-210-474 (sobrenadante) preparados como descrito na seção 1 (sequência dos números ID 71 e 72), foram testados pela ligação a IL-13 humano e IL-4 humano em ELISAs de ligação direta (como descritos nos métodos 1 e 2 respectivamente) e estes dados são mostrados nas Figuras 40 e 41 respectivamente (Mepo-210-474 foi preparado e testado em quadruplicação e este foi anotado como amostra 1, amostra 2, amostra 3 e amostra 4). 5 Estas figuras ilustram que Mepo-210-474 liga a IL-4 e IL-13 por ELISA. O anti-IL-4 dAb (DOM9-112-210) não foi testado na ligação IL-4 ELISA como este dAb não é detectado pelo anticorpo de detecção secundário; em vez de, IL4 mAb anti-humano purificado (Pascolizumab) foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-4 neste ELISA. O anti-IL-13 dAb (DOML0-53-474) não foi testado na ligação IL-13 ELISA como este dAb não é detectado pelo anticorpo de detecção secundário; em vez de, mAb IL-13 anti-humano purificado foi incluído como um controle positivo para demonstrar ligação IL-13 neste ELISA. Como mostrado nas Figuras 40 e 41, os mAbs de controle negativo a um antígeno irrelevante foram incluídos em cada ELISA de ligação. A amostra 1 e amostra 2 Mepo-210-474 foram preparadas em um experimento de transfecção transitória Mepo-210-474 amostra 3 e amostra 4 foram preparadas em um outro experimento de transfecção transitório separado. Todas as quatro amostras ligam-se ao IL-13 e IL-4 no ELISA de ligação IL-13 e IL-4. Entretanto, a razão para os perfis de ligação diferentes de amostras 1 e 2 versos amostras 3 e 4 não é conhecido, mas pode refletir uma diferença na qualidade do mAbdAb (no sobrenadante) gerado em cada experimento de transfecção. Exemplo 8 Ligação de mAbdAbs triespecíficos a IL-4 humano, IL-5 humano, IL-13 humano e IL-18 humano pela ressonância de plasmon de superfície (BIAcoreTM)
8.1 Ligação de IL-18mAb-210-474 to IL-4, IL-13 e IL-18 by BIAcoreTM O mAbdAb IL18mAb-210-474 triespecífico (sobrenadantes)
preparados como descritos no Exemplo 6.1 (SEQ ID N°: 69 e 70), foi testado pela ligação a IL-4 humano, IL-13 humano e IL-18 humano usando BIAcoreTM a 25 °C (como descritos nos métodos 4, 5 e 6 respectivamente). Os níveis de captura estão dentro da faixa de aproximadamente 400 a 850 5 Unidades de resposta.
Três concentrações de cada analitos foram testados (256, 32 e 4nM). Os dados resultantes são mostrados na Tabela 15 (amostras foram preparadas e testadas na triplicata, este foi anotada como amostra 1, amostra 2 e amostra 3). Tabela 15 Construção Em taxa Fora de taxa Afinidade de ligação, KD (ka) (kd) (nM) Ligação a IL-18 IL18mAb-210-474 (amostra 1) 2.1e6 2.3e-5 0.011 IL18mAb-210-474 (amostra 2) 2.1e6 2.8e-5 0.014 IL18mAb-210-474 (amostra 3) 2.1e6 2.9e-5 0.014 mAb IL-18 anti-humano (purificado) 1.9e6 6.8e-5 0.035 Ligação a IL-13 IL18mAb-210-474 (amostra 1) 5.8e5 5.7e-4 0.99 IL18mAb-210-474 (amostra 2) 6.2e5 6.1e-4 0.99 IL18mAb-210-474 (amostra 3) 7.4e5 7.4e-4 1.0 mAb IL-13 anti-humano (purificado) 1.2e6 5.0e-4 0.41 Ligação a IL-4 IL18mAb-210-474 (amostra 1) --- --- ligante muito firme * IL18mAb-210-474 (amostra 2) --- --- ligante muito firme * IL18mAb-210-474 (amostra 3) --- --- ligante muito firme * Pascolizumab (purificado) 4,6e6 1,7e-4 0,037 * incapaz para determinar KD devido aos efeitos de dissociação positiva e nível de sensibilidade da técnica BIAcoreTM O mAbdab triespecífico liga-se L-4, IL-13 e IL-18 usando BIAcoreTM.
A afinidade de ligação do mAbdAb por IL-18 foi aproximadamente equivalente aquele do mAb IL18 anti-humano purificado sozinho, que foi incluído neste ensaio como um controle positivo para a ligação IL18 e a fim de comparar diretamente à afinidade de ligação do mAbdab.
Não foi possível determinar a afinidade de ligação absoluta de mAbdab por IL-4, devido ao fato que o componente DOM9-112-210 deste mAbdAb triespecífico liga-se muito firmemente a IL-4 e visto que as taxas de corte foi muito menor para determinar usando BIAcoreTM.
O anti-IL-4 dAb sozinho (DOM9-112-210) não foi testado neste ensaio como este dAb não pode ser capturado na proteína A ou chip CM5 revestido por IgG anti-humano; em vez de, o mAb IL4 anti-humano (Pascolizumab) foi incluído como um controle positivo para demonstrar ligação IL-4 neste ensaio. O anti-IL-13 dAb sozinho (DOML0-53-474) não foi testado neste ensaio como este dAb não pode ser capturado na proteína A 5 ou chip CM5 revestido por IgG anti-humano; em vez de, o mAb IL13 anti- humano foi incluído como um controle positivo para demonstrar ligação IL- 13 neste ensaio.
8.2 Ligação de Mepo-210-474 a IL-4, IL-5 e IL-13 por BIAcoreTM O mAbdAb Mepo-210-474 triespecífico (sobrenadantes) preparado como descrito no Exemplo 6.2 (SEQ ID N°: 71 e 72), foi testado pela ligação a IL-4 humano, IL-5 humano e IL-13 humano usando BIAcoreTM a 25 °C (como descritos nos métodos 5, 11 e 4 respectivamente). Os níveis de captura estão dentro da faixa de aproximadamente 550 a 900 Unidades de resposta. Para IL-4 e cinco concentrações de ligação IL-13 de cada analito foram testadas (256, 64, 16, 4 e 1nM). Para quatro concentrações de ligação IL-5 de cada analito foram testadas (64, 16, 4 e 1nM). Os dados resultantes são mostrados na Tabela 16. Tabela 16 Construção Em taxa (ka) Fora de taxa (kd) Afinidade de ligação, KD (nM) Ligação a IL-5 Mepo-210-474 3,34e5 1,50e-4 0,45 Mezolizumab (purificado) 3,78e4 1,30e-4 0,34 Ligação a IL-13 Mepo-210-474 6,38e5 1,03e-3 1,62 mAb IL-13 anti-humano 1,51e6 5,68e-4 0,38 (purificado) Ligação a IL-4 Mepo-210-474 --- --- ligante muito firme (incapaz para determinar KD devido aos efeitos de dissociação positiva e nível de sensibilidade da técnica BIAcoreTM) Pascolizumab (purificado) 6,26e6 1,43e-4 0,02 Mepo-210-474 liga-se a IL-4, IL-5 e IL-13 usando BIAcoreTM. A afinidade de ligação de Mepo-210-474 por IL-5 foi aproximadamente equivalente aquela do mAb IL5 anti-humano purificado (Mepolizumab) sozinho, que foi incluído neste ensaio como um controle positivo para a ligação IL-5 e a fim de comparar diretamente à afinidade de ligação de Mepo- 210-474. Não foi possível determinar a afinidade de ligação absoluta de Mepo-210-474 por IL-4, devido ao fato que o componente DOM9-112-210 deste mAbdAb triespecífico liga-se muito firmemente a IL-4 e visto que a 5 taxa de corte foi muito menor para determinar usando BIAcoreTM. O anti-IL-4 dAb sozinho (DOM9-112-210) não foi testado neste ensaio como este dAb não pode ser capturado na proteína A ou chip CM5 revestido por IgG anti- humano; em vez de, o mAb IL4 anti-humano (Pascolizumab) foi incluído como um controle positivo para demonstrar ligação IL-4 neste ensaio. O anti- IL-13 dAb sozinho (DOML0-53-474) não foi testado neste ensaio como este dAb não pode ser capturado na proteína A ou chip CM5 revestido por IgG anti-humano; em vez de, o mAb IL13 anti-humano foi incluído como um controle positivo para demonstrar ligação IL-13 neste ensaio. Exemplo 9 Estequiometria
9.1 Estequiometria de ligação de IL-4, IL-13 e IL-18 a IL-18mAb-210-474 usando BIAcoreTM O IL18mAb-210-474 (nos sobrenadantes de célula CHO preparados como descrito na seção 1) (SEQ ID N°: 69 e 70), foram avaliados pela estequiometria de ligação por IL-4, IL-13 e IL-18 usando BIAcoreTM (como descrito no método 7). Estes dados são mostrados na Tabela 17 (R- max é a resposta de ligação padrão e este é requerido calcular a estequiometria, como pelo fórmula dada no método 7). A concentração de cada uma das citocinas foi de 500 nM. A posição de injeção refere-se a ordem em que cada uma das citocinas foi adicionada. Tabela 17 Citocina Posição de injeção R-max Estequiometria IL-4 1º 59 0,9 IL-4 2º 56 0,9 IL-4 3º 51 0,8 IL-13 1º 74 1,6 IL-13 2º 77 1,7 IL-13 3º 80 1,8
IL-18 1º 112 1,8 IL-18 2º 113 1,8 IL-18 3º 110 1,7 O dado de estequiometria indica que IL18mAb-210-474 liga- se aproximadamente duas moléculas de IL-18, duas moléculas de IL-13 e apenas uma molécula de IL-4. O anti-IL4 dAb sozinho (DOM9-112-210) é conhecido ser um dímero no estado de solução e é apenas capaz de ligar-se a 5 uma molécula de IL-4. Este não é portanto esperado que o IL18mAb-210-474 ligaria apenas uma molécula de IL-4. Estes dados indicam que as moléculas testadas devem ser totalmente ocupadas pelo número esperado de moléculas IL-18, IL-13 e IL-4. O dado de estequiometria também indicam que a ordem de captura das citocinas parece ser independente da ordem de adição das citocinas. Exemplo 10
10.1 Geração de um anti-TNF de alvejamento duplo/mAbdAb anti-
EGFR Este mAbdAb de alvejamento duplo foi construído pela fusão de um dAb ao terminal C da cadeia pesada mAb. O cassetes de expressão da cadeia pesada e leve anti-TNF mAb foram previamente construídos. Os locais de restrição que foram usados para a clonagem são mostrados abaixo (Figura 42). Para introduzir os locais de restrição para inserção dAb na cadeia pesada, mutagênese direcionada ao local foi usada para criar locais de clonagem Sall e Hindlll usando um vetor de expressão mAb de cadeia pesada como um modelo. DNA que codifica um anti-EGFR dAb (DOML6-39-542) foi então amplificado por PCR (usando iniciadores que codificam os finais Sall e Hindlll) e inseridos na região codificadora da extremidade 3’ modificada, resultando em um ligante de 'STG' (serina, treonina, glicina) entre o mAb e o dAb. Os clones que verificam a sequência (SEQ ID N°: 170 e 169) para as cadeias pesadas e leves respectivamente) foram selecionados e por ampla escala foram feitos usando kit Qiagen Mega Prep seguindo os protocolos dos fabricantes. Os mAbdAbs foram expressados nas células de mamíferos HEK293-6E usando técnicas de transfecção transitórias pela cotransfecção das cadeias pesadas e leves (SEQ ID N°: 73 e 74) 5 10.2 Purificação e análise SEC do anti-TNF de alvejamento duplo/mAbdAb anti-EGFR O anti-TNF/mAbdAb anti-EGFR foi purificado a partir do sobrenadante de expressão clarificado usando cromatografia de afinidade de proteína A de acordo com os protocolos estabelecidos. As concentrações de amostras purificadas foram determinadas pela espectrofotometria a partir de medições da absorbância de luz a 280nm. Análise SDS-PAGE (Figura 43) da amostra purificada mostra nenhuma realização da amostra a -170kDa enquanto a amostra reduzida mostra duas faixas que funcionam em -25 e - 60kDa correspondente a cadeia leve e cadeia pesada dAb fundida respectivamente. Para a análise de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) o anti-TNF/mAbdAb anti-EGFR foi aplicado em uma coluna Superdex-200 10/30 HR (ligado a um sistema Akta Express FPLC) pré- equilibrado e realizado em PBS a 0,5ml/min. O perfil SEC mostra um funcionamento de espécie simples em um pico assimétrico (Figura 44).
10.3 Afinidades de ligação de anti-TNF de alvejamento duplo/mAbdAb As afinidades de ligação anti-EGFR a EGFR e TNF foram determinadas como descritos nos métodos 13 e 14 respectivamente. Os dados do ensaio foram analisados usando Graph Pad Prism. Os valores de potência foram determinados usando uma curva de resposta de dosagem sigmoidal e os dados ajustados usando o melhor modelo de ajuste. A potência anti-EGFR (Figura 45) deste mAbdAb foi calculada ser 39.lnM enquanto o controle, um anti-EGFR mAb dá um valor EC50 de 3,4 nM. Em um bioensaio anti-TNF (Figura 46) a potência do mAbdAb foi de 3 pM (0,0028nM) enquanto um controle anti-TNF mAb produziu um EC50 de 104 pM. Finalmente, os dados do ensaio mostrou que a construção do exemplo 10, um anti-TNF de alvejamento duplo/mAbdAb anti-EGFR é potente contra os ambos antígenos.
10.4 PK de rato de anti-TNF de alvejamento duplo/mAbdAb anti-EGFR 5 Esta molécula foi testada para suas propriedades farmacocinéticas in vivo no rato. O anti-TNF/mAbdAb anti-EGFR foi administrado intravenosamente a três ratos e as amostras do soro coletadas em um período de 7 dias (168 horas). A concentração do medicamento remanescentes em vários pontos de tempo pós-dose foi avaliada por ELISA contra ambos TNF & EGFR. Os resultados são mostrados na Figura 125. Os parâmetros PK confirmam que esta molécula tem uma vida média longa, na mesma região como aquela previamente observada pelo adalimumab não modificado (125 horas). Os detalhes adicionais são mostrados na Tabela 17.1 Tabela 17.1 Antígeno de % de AUC Ensaio Vida Média Cmax AUC (0-inf) Liberação extrapolado (hora) (ug/mL) (h*ug/mL) (mL/h/kg) TNF 157,2 149,8 10301,3 0,5 40,6 EGFR 140,8 123,6 7986,7 0,7 35 Exemplo 11
11.1 Geração de um anti-TNF de alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb Um anti-TNF/anti-VEGF mAbdAb foi produzido utilizando uma estratégia similar descrito por exemplo 10. Para a construção do cassete de expressão de cadeia pesada, o DNA de vetor que codifica a cadeia pesada do exemplo 10 foi retirada como um ponto de partida. O anti-EGFR dAb foi taxado usando as enzimas de restrição Sall e Hindlll. DOML5-26-593, um anti-VEGF dAb foi amplificado por PCR (usando iniciadores que codificam as extremidades Sall e Hindlll) e ligado na cadeia principal do vetor que previamente tem o anti-EGFR dAb taxado usando os mesmos locais de restrição, resultando em um ligante de ‘STG’ (serina, treonina, glicina) entre o mAb e o dAb. Os clones que verificam a sequência (SEQ ID N°: 169 e 168 para as cadeias pesadas e leves respectivamente) foram selecionados e por 5 ampla escala de preparações de DNA foram feitas e o anti-TNF/anti-VEGF mAbdAb foi expressado em células de mamífero HEK293-6E usando técnicas de transfecção transitórias pela cotransfecção das cadeias pesadas e leves (SEQ ID N°: 73 e 75).
11.2 Purificação e análise SEC de anti-TNF de alvejamento duplo/anti- VEGF mAbdAb O anti-TNF/anti-VEGF mAbdAb (nomeado DMS4000) foi purificado a partir do sobrenadante de expressão clarificado usando cromatografia de afinidade de proteína A de acordo com os protocolos estabelecidos. As concentrações de amostras purificadas foram determinada pela espectrofotometria a partir de medições da absorbância de luz a 280nm. Análise SDS-PAGE (Figura 47) da amostra purificada mostra nenhuma realização da amostra a ~170kDa enquanto a amostra reduzida mostra duas faixas que funcionam em ~25 e ~60 kDa correspondente a cadeia leve e cadeia pesada dAb fundida respectivamente. Para a análise de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) o anti-TNF/anti-VEGF mAbdAb foi aplicado em uma coluna Superdex-200 10/30 HR (ligado a um sistema Akta Express FPLC) pré- equilibrado e realizado em PBS a 0,5ml/min. O perfil SEC mostra um funcionamento de espécie simples em um pico assimétrico (Figura 48).
11.3 Afinidades de ligação de anti-TNF de alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb As afinidades de ligação a VEGF e TNF foram determinadas como descritos nos métodos 12 e 14 respectivamente. Os dados do ensaio foram analisados usando GraphPad Prism. Os valores de potência foram determinados usando a curva de resposta de dosagem sigmoidal e os dados ajustados usando o melhor modelo de ajuste. A potência Anti-VEGF (Figura 49) deste mAbdAb foi calculado ser 57 pM enquanto o controle, um anti- VEGF mAb dá um valor EC50 de 366 pM. No bioensaio anti-TNF (Figura 5 50) a potência foi 10 pM enquanto um controle anti-TNF mAb produziu um EC50 de 22pM. Finalmente, os dados do ensaio mostram que a molécula de Exemplo 11, um anti-TNF de alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb é potente contra os ambos antígenos.
11.4 PK de rato de anti-TNF de alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb Esta molécula foi testada por sua propriedade farmacocinética in vivo no rato. O anti-TNF/anti-VEGF mAbdAb foi administrado intravenosamente a três ratos e amostras de soro coletadas em um período de 10 dias (240 horas). A concentração do medicamento remanescente em vários pontos de tempo pós dose foi avaliada por ELISA contra ambos TNF & VEGF. Os resultados são mostrados na Figura 126 Os parâmetros PK confirmam que esta molécula tem propriedades farmacocinéticas in vivo que comparadas com aquele de adalimumab não modificado. O t1/2β mais curto observado pelo componente VEGF não é considerado ser significante e pode ser um artefato de ensaio. Os detalhes adicionais são mostrados na Tabela 17.2 Tabela 17.2 Antígeno de % de AUC Ensaio Vida Média Cmax AUC (0-inf) Liberação extrapolado (hora) (ug/mL) (h*ug/mL) (mL/h/kg) TNF 180,1 89,9 7286,3 0,7 35,8 VEGF 94,2 102,8 4747,1 1,1 14,3
11.5 Geração de um anti-TNF alternativo/anti-VEGF mAbdAb Um anti-TNF alternativo/anti-VEGF mAbdAb foi construído em uma maneira similar aquela descrita acima no Exemplo 11.1, usando o mesmo anti-TNF mAb ligado a um VEGF dAb no terminal C da cadeia pesada usando um ligante STG. O anti-VEGF dAb usado neste caso foi DOML5-10-11. Esta molécula foi expressada em células de mamífero
HEK293-6E usando técnicas de transfecção transitórias pela cotransfecção das cadeias pesadas e leves (SEQ ID N°: 73 e 185). Esta molécula expressada para dar um mAbdAb de níveis de expressão similares aqueles descritos no Exemplo 11.2, entretanto quando testado para a potência no mesmo ensaio 5 VEGF como descrito no Exemplo 11.3 foi observado ter os níveis não detectáveis de inibição de ligação VEGF ao receptor VEGF neste ensaio. Exemplo 12
12.1 Geração de um anti-VEGF de alvejamento duplo/IgG estendido por anti-ILI RI dAb Duas moléculas IgG estendidas por aAb de alvejamento duplo foram construídos usando técnicas de biologia molecular padrão seguindo uma estratégia da inserção de regiões codificadoras de domínio Dummy V entre dAb e regiões constantes de ambas cadeias. Para a cadeia leve, o anti-IL1 R1 dAb DOM4-130-54 foi previamente clonado em um cassete de expressão com locais Sall e BsiWl (Figura 51) para produzir uma cadeia dAb-Ck. para produzir a cadeia leve IgG estendido por dAb, região Dummy Vk foi amplificada por PCR com iniciadores que codificam BsiWl em ambas extremidades. O plasmídeo contendo o cassete de expressão dAb-Ck foi digerido com BsiWl. O domínio Dummy Vk digerido por BsiWl foi ligado neste para produzir a cadeia leve IgG estendido por dAb, com um ligante de ‘TVAAPS’ entre os dois domínios variáveis. Uma estratégia idêntica foi seguida para produzir uma cadeia pesada IgG estendida por dAb onde o domínio Dummy VH amplificado por PCR com extremidades Nhel foi ligado em uma cadeia pesada dAb digerida por Nhel entre o dAb DOML5-26 e CH1 (Figura 51), com um ligante de 'ASTKGPS' entre os dois domínios variáveis. Este é nomeado DMS2090 e tem a sequência apresentada nas SEQ ID N°: 163 (Sequência de DNA SEQ ID N°: 162). Este foi formado par com o cadeia leve apresentado na SEQ ID N°: 77 (Sequência de DNA SEQ ID N°: 171). Uma segunda cadeia pesada foi construída na mesma maneira mas usando o dAb DOML5-26-593. Este é nomeado DMS2091 e tem a 5 sequência apresentada na SEQ ID N°: 76 (Sequência de DNA SEQ ID N°: 172). Este foi formado par com o cadeia leve apresentado na SEQ ID N°: 77 (Sequência de DNA SEQ ID N°: 171). Os clones que verificam a sequência foram selecionados e por ampla escala das preparações de DNA foram feitas usando kits Qiagen Maxi ou Mega Prep seguindo os protocolos dos fabricantes. A construção resultante foi expressada em células de mamíferos usando técnicas de transfecção transitórias pela cotransfecção das cadeias pesadas e leves.
12.2 Purificação e análise SEC de anti-VEGF de alvejamento duplo/anti- ILIRI mAbdAb Ambos os anti-IL1 R1/moléculas IgG estendida por anti- VEGF dAb foram purificadas a partir do sobrenadante de expressão clarificado usando cromatografia de afinidade de proteína A de acordo com os protocolos estabelecidos. As concentrações de amostras purificadas foram determinadas pela espectrofotometria a partir de medições da absorbância de luz a 280nm. Análise SDS-PAGE para DMS2090 é mostrada na Figura 52 e para DMS2091 é mostrada na Figura 53. Ambas as amostras purificadas mostraram amostras não reduzidas realizadas a 190 kDa enquanto as amostras reduzidas mostram duas faixas realizadas a 35 e 60 kDa correspondente a cadeia leve e cadeia pesada estendida por dAb respectivamente. Para a análise de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) o anti-VEGF/IgG estendida por anti-IL1 R1 dAb foi aplicado em uma coluna Superdex-200 10/30 HR (ligado a um sistema Akta Express FPLC) pré-equilibrado e realizado em PBS a 0,5ml/min. Os perfis SEC para DMS2090 (Figura 54) e DMS2091 (Figura 55) ambos mostram uma realização de espécie simples em um pico assimétrico.
12.3 Afinidades de ligação de anti-VEGF de alvejamento duplo/anti-ILI RI mAbdAb As afinidades de ligação a VEGF e IL1 R1 foram 5 determinadas como descritos nos métodos 12 e 15 respectivamente. Os dados do ensaio foram analisados usando GraphPad Prism. Os valores de potência foram determinados usando a curva de resposta de dosagem sigmoidal e os dados ajustados usando o melhor modelo de ajuste. A potência Anti-VEGF (Figura 57) de DMS2090 foi calculada ser 158,4 pM enquanto o controle, um anti-VEGF mAb dá um valor EC50 de 689,2 pM. A potência Anti-VEGF (Figura 56) de DMS2091 foi calculada ser 55 pM enquanto o controle, um anti-VEGF mAb dá um valor EC50 de 766 pM. Em um bioensaio anti-IL1 R1 a potência de DMS2090 (Figura 58) foi 32 pM enquanto um controle anti-IL1 R1 mAb produziu um EC50 de 35p M. A potência de DMS2091 (Figura 59) foi de 17,47 pM enquanto um controle anti-IL1-R1 mAb produziu um EC50 de 35,02 pM. Finalmente, os dados do ensaio mostram que o exemplo 12, de um anti-IL1 R1 de alvejamento duplo/IgG estendido por anti-VEGF dAb é potente contra os ambos antígenos.
12.4 PK de rato de anti-VEGF de alvejamento duplo/anti-ILIRI mAbdAb Esta molécula foi testada por suas propriedades farmacocinéticas in vivo no rato. O anti-IL1 R1/IgG estendido por anti-VEGF dAb A foi administrado intravenosamente a três ratos e as amostras do soro coletadas em um período de 7 dias (168 horas). A concentração do medicamento remanescentes em vários pontos de tempo pós-dose foi avaliada por ELISA contra ambos IL1 R1 & VEGF. Os resultados são mostrados na Figura 127 Os parâmetros PK são mostrados na Tabela 17.3
Tabela 17.3 Antígeno Vida % de AUC Molécula de Ensaio média Cmax AUC (0-inf) Liberação extrapolado (h) (ug/mL) (h*ug/mL) (mL/h/kg) DMS2090 VEGF 72,1 100,4 4811,6 1,1 19 DMS2090 IL-1R1 86,3 87,7 3467,4 1,6 23,7 Exemplo 13
13.1 Geração de um anti-TNF de alvejamento triplo/anti- VEGF/mAbdAb anti-EGFR 5 Um mAb de alvejamento triplo foi construído usando as técnicas de biologia molecular padrão e seguindo uma estratégia da inserção de regiões codificadoras de domínio V mAb entre dAb e regiões constantes de ambas cadeias. Para a cadeia leve, o anti-EGFR dAb DOML6-39-542 foi previamente clonado em um cassete de expressão com locais Sall e BsiWl (Figura 15) para produzir uma cadeia dAb-Ck. Para produzir o cadeia leve mAbdAb, a região mAb VL foi amplificada por PCR com iniciadores que codificam BsiWl em ambas extremidades. O plasmídeo contendo o cassete de expressão dAb-Ck foi digerido com BsiWl. O domínio V mAb digerido por BsiWl foi ligado neste para produzir a cadeia leve mAbdAb, resultando em um ligante de ‘TVAAPS’ entre os dois domínios variáveis. Uma estratégia idêntica foi seguida para produzir a cadeia pesada mAbdAb onde a região VH mAb amplificado por PCR com extremidades Nhel foi ligado em um vetor de cadeia pesada dAb digerido por Nhel entre o dAb (DOML5-26) e CH1 (Figura 60), resultando em um ligante de 'ASTKGPS' entre os dois domínios variáveis. Os clones que verificam a sequência (aminoácido da SEQ ID N°: 78 e 79 para as cadeias pesadas e leves respectivamente) foram selecionados e por ampla escala das preparações de DNA foram feitas usando kits Qiagen Mega Prep seguindo os protocolos dos fabricantes. Os mAbdAbs foram expressados nas células de mamíferos usando técnicas de transfecção transitórias pela cotransfecção das cadeias pesadas e leves.
13.2 Purificação do anti-TNF do alvejamento triplo/anti-VEGF/mAbdAb anti-EGFR O anti-TNF/anti-VEGF/mAbdAb anti-EGFR foi purificado a partir do sobrenadante de expressão clarificado usando cromatografia de 5 afinidade de proteína A de acordo com os protocolos estabelecidos. As concentrações de amostras purificadas foram determinadas pela espectrofotometria a partir de medições da absorbância de luz a 280nm. Análise SDS-PAGE (Figura 61) da amostra purificada mostra nenhuma realização da amostra a 190 kDa enquanto a amostra reduzida mostra duas faixas que funcionam em 35 e 60 kDa correspondente cadeia leve e cadeia pesada estendida por dAb respectivamente.
13.3 Afinidades de ligação do anti-TNF do alvejamento triplo/anti- VEGF/mAbdAb anti-EGFR As afinidades de ligação a VEGF, EGFR e TNF foram determinadas como descritos nos métodos 12, 13 e 14 respectivamente. Os dados do ensaio foram analisados usando GraphPad Prism. Os valores de potência foram determinados usando a curva de resposta de dosagem sigmoidal e os dados ajustados usando o melhor modelo de ajuste. A potência anti-VEGF (Figura 62) deste mAbdAb foi calculada ser 1,885 mM enquanto o controle, um anti-VEGF mAb dá um valor EC50 de 0,145 nM. No bioensaio anti-TNF (Figura 63) a potência foi 87 pM enquanto um controle anti-TNF mAb produziu um EC50 de 104 pM. No ensaio anti-EGFR (Figura 64) o mAbdAb de alvejamento triplo produziu ~20 % de inibição a ~300 nM. Enquanto os valores EC50 foram calculados pela ligação VEGF e TNF, pela ligação EGFR uma curva total não foi produzida para calcular um valor EC50. Exemplo 14: IGF-1 R/VEGF mAbdAb
14.1 Construção de IGF-1 R/VEGF mAbdAb As sequência do gene leve variável e pesado variável Anti
IGF-1 R foram originalmente construídos novamente a partir do PCR dos oligonucleotídeos de sobreposição.
Estas regiões foram fundidas as regiões constantes kapa ou IgG1 humanas em um vetor de expressão de mamífero usando técnicas de biologia molecular padrão.
A sequência do gene para um 5 domínio de anticorpo anti VEGF foi de outra maneira construída por PCR usando os oligonucleotídeos de sobreposição e fundidos a extremidade 3' dos genes de cadeia pesada ou leve dos componentes anti IGF-1 R descritos acima.
A fusão incorporada em um ligante de dois aminoácidos (GS) ou um ligante de 8 aminoácidos (TVAAPSGS) entre o anticorpo e os componentes de domínio de anticorpo.
O anticorpo de cadeia leve e pesada também foi construído sem o domínio de anticorpo e as sequências ligadoras.
Os clones que verificam a sequência foram selecionados por grandes escalas das preparações de DNA usando kit Endofree Qiagen Maxiprep seguindo os protocolos dos fabricantes.
Nas sequências SEQ ID N°: 108, 109, 111 e 112, a posição da sequência ligadora entre o anticorpo e domínio de anticorpo é sublinhado.
As variantes alternativas devem ser construídas pela remoção do ligante totalmente ou pelo uso de ligantes diferentes.
Exemplos de outros ligantes adequados são fornecidos em SEQ ID N°: 6 e 8 a 11. A Tabela 18 fornece uma lista de anticorpos construídos e expressados.
Tabela 18 - Anticorpos construídos e testados Identificador Nomes Alternativos Anticorpo Anticorpo deLigante SEQ SEQ Local de domínio ID N° para ID N° fusão Cadeia Para cadeia pesada leve BPC1603 381H Anticorpo Doml5- TVAAPSGS 108 113 Terminal C TVAAPSGS Anti-IGF-1 R 26-593 de cadeia 593, HOLO anti-VEGF pesada DMS4019 BPC1604 381H GS Anticorpo Doml5- GS 109 113 Terminal C 593, Anti-IGF-1 R 26-593 de cadeia DMS4020 O anti-VEGF pesada BPC1605 381L Anticorpo Doml5- TVAAPSGS 110 111 Terminal C TVAAPSGS anti-IGF-1 R 26-593 de cadeia 593, HOLO anti-VEGF leve DMS4021 BPC1606 381L GS 593, Anticorpo Doml5- GS 110 112 Terminal C DMS4022 Anti-IGF- 26-593 de cadeia 1R anti-VEGF leve
Exemplo 14.2: Expressão, purificação e perfil SEC de IGF-1 R/VEGF mAbdAb As combinações dos vetores da cadeia pesada e leve expressadas em transfecções transitórias de HEK293-6E.
Brevemente, 50 ml 5 das células HEK293-6E a 1,5x106 células/ml foram transfectadas com plasmídeo 25 µg da cadeia leve e 25 µg da cadeia pesada previamente incubados com 293 reagente de fectina (Invitrogen # 51-0031). As células foram colocadas em um incubador de agitação a 37 °C, 5 % de CO2 e 95 % de umidade relativa.
Após 24 horas, o meio de alimentação de triptona foi adicionado e as células desenvolvidas por 72 horas adicionais.
Sobrenadante foi coletado pela centrifugação seguido pela filtração usando um filtro de 0,22 µm.
A proteína expressada foi purificada usando a coluna de sefarose de proteína A e dialisada em PBS.
A proteína purificada foi analisada pela cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e é mostrada na Figura 65. Um anticorpo IGF-1 R (HOLO) foi usado como um comparador nos ensaios seguintes.
Esta molécula tem a sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID N°: 110 e a sequência de cadeia leve apresentada na SEQ ID N°: 113. Um outro mAbdAb com especificidade irrelevante foi usado como um comparador nos ensaios seguintes.
Esta molécula tem a sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID N°: 87 e a sequência de cadeia leve apresentada na SEQ ID N°: 13 e é nomeada BPC1601. Exemplo 14.3: ELISA de ligação IGF-IR Uma ELISA de ligação foi realizada para testar a ligação do anti-IGF-1 R purificado/VEGF mAbdAbs a IGF-1 R.
Brevemente, as placas de ELISA revestidas com anti-poli-histidina (AbCam AB9108) a 1 µg/ml e bloqueada com solução de bloqueamento (4 % de BSA em solução salina tamponada com Tris) foi carregada com 400 ng/ml de IGF-1 R-his rótulo humano recombinante (sistemas R&D 305-GR) em PBS.
A placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem em TBS + 0,05 % de Tween 20 (TBST). Várias concentrações de mAbdAbs purificados foram adicionados bem como um anticorpo monoclonal anti IGF-1 R (HOLO) e um mAbdAb irrelevante (BPC1601), diluído na solução de 5 bloqueamento.
A placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem em TBST.
A ligação foi detectada pela adição de um anticorpo de cadeia leve de capa anti-humano rotulado por peroxidase (Sigma A7164) em uma diluição de 1/1000 na solução de bloqueamento.
A placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem em TBST.
A placa foi desenvolvida pela adição de substrato OPD (Sigma P9187) e de desenvolvimento da cor interrompida pela adição de 3M de H2SO4. a absorbância foi medida a 490 nm com um leitor de placa e o meio de absorbância plotado.
Os resultados de ELISA de ligação são apresentados na Figura 66 e confirmam que todos os variantes IGF1R-VEGF mAbdAb testados (BPC1603-1606) mostram a ligação a IGF-1 R em níveis comparáveis ao anticorpo anti-IGF-1 R HOLO.
Os valores EC50 foram calculados usando software de bioensaio Cambridgesoft e são como seguem: HOLO (0,1797µg/ml)), BPC1603 (0,1602 µg/ml), BPC1604 (0,1160 µg/ml), BPC1605 (0,1975 µg/ml), BPC1606 (0,1403 µg/ml). O anticorpo biespecífico de controle irrelevante BPC1601 mostrou agora a ligação detectável a IGF-1 R.
Exemplo 14.4: Ligação VEGF ELISA Uma ELISA de ligação foi realizada para testar a ligação do anti IGF-1 R purificado/anticorpos específicos VEGF a VEGF.
As placas de ELISA foram revestidas com VEGF humano recombinante (GSK) a 400 ng/ml em PBS e então bloqueado na solução de bloqueamento (4 % de BSA em TBS). Várias concentrações de mAbdAbs purificados diluídos na solução de bloqueamento foram adicionados e mAbdAb BPC1601 foi incluído como um controle negativo.
A placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem em TBST.
A ligação foi detectada pela adição de um anticorpo de cadeia leve de capa anti-humano rotulado por peroxidase (Sigma A7164) em uma diluição de 1/1000 na solução de bloqueamento.
A 5 placa foi incubada por 40 minutos em temperatura ambiente antes da lavagem em TBST.
A placa foi desenvolvida pela adição de substrato OPD (Sigma P9187) e de desenvolvimento da cor interrompida pela adição de 3M H2SO4. A absorbância foi medida a 490 nm com um leitor de placa e o meio de absorbância plotado.
Os resultados de ELISA de ligação são apresentados na Figura 67 e confirma que todos os quatro anti-IGF-1R/VEGF mAbdAbs (BPC1603- 1606) podem ligar-se a VEGF imobilizado.
A atividade de ligação inferior aparente de BPC1605 e BPC1606 pode ser atribuído pela interferência entre o domínio de anticorpo (localizado no terminal C da cadeia leve) e o anticorpo de detecção.
Os valores EC50 foram calculados usando software de bioensaio Cambridgesoft e são como seguem: BPC1603 (0,044 µg/ml), BPC1604 (0,059 µg/ml), BPC1605 (0,571 µg/ml). Não foi possível calcular um valor EC50 exato por BPC1606 devido aos valores de respostas inferiores.
O anticorpo anti-IGF-1R HOLO e o mAbdAb de controle irrelevante BPC1601 mostrou agora a ligação detectável a VEGF.
Exemplo 14.5: Cinéticos de ligação a VEGF Um camundongo monoclonal contra IgG humano (Biacore BR-1008-39) foi imobilizado pela amina primária ligado a um CM5 biosensor chip.
As construções de anticorpos foram capturadas usando esta superfície.
Após o VEGF de captura foi passado na superfície que então foi regenerado usando 3M de MgCl2. As concentrações de VEGF usadas para gerar cinéticos foram 256, 64, 16, 4, 1 e 0,25nM, com um tampão apenas de injeção na superfície capturada usada pela dupla referência.
Os experimentos foram realizados na máquina Biacore T100, usando tampão 1x HBS-EP (BR-1006-
69) a 25 °C.
Os dados foram ajustados ao modelo 1:1 inerente à máquina neste software de análise.
Os dados mostrados na Tabela 19 é a partir de dois experimentos independentes.
Tabela 19 - Cinéticos de ligação a VEGF humano Experimento 1 Experimento 2 Construção ka kd KD (nM) ka kd KD (nM) BPC1603 2,398E+6 2,762E-4 0,115 1,334E+6 3,497E-4 0,262 BPC1604 9,933E+5 3,092E-4 0,311 5,806E+5 3,266E-4 0,563 BPC1605 1,599E+6 2,161E-4 0,135 1,089E+6 2,727E-4 0,251 BPC1606 4,343E+5 1,573E-4 0,362 2,717E+5 1,607E-4 0,591
5 Exemplo 14.6: Inibição de Ligação VEGF ao receptor A atividade dos mAbdAbs foi medido usando um ensaio de ligação do receptor VEGF como descrito no método 12. Os IC50s obtidos neste ensaio para a inibição da ligação de VEGF a VEGFR2 são: BPC1603 (0,037nM) BPC1604 (0,010nM) BPC1605 (0,167nM) BPC1606 (0,431 nM) Estes resultados confirmam que todos as quatro construções de ligação de antígeno inibem a ligação do ligando ao receptor.
Exemplo 14.7: Inibição de fosforilação do receptor IGF-IR As células 3T3/LISN c4 foram colocadas em uma densidade de 10.000 células/reservatório em 96 placas de reservatórios e incubados durante a noite em DMEM completo (modificação DMEM-Hepes +10 % de FCS). Os MAbdAbs purificados foram adicionados as células incubadas por 1 hora.
O rhlGF-1 foi adicionado às células tratadas para atingir uma concentração final de 50 ng/ml e incubados por um 30 minutos adicionais para estimular a fosforilação receptora.
O meio foi aspirado e então as células lisadas pela adição de tampão de lise RIPA (150 mM de NaCl, 50 mM de TrisHCl, 6 mM de Na de Desoxicolato, 1 % de Tween 20) mais coquetel inibidor de protease (Roche 11 697 498 001). A placa foi congelada durante a noite.
Após o descongelamento, o lisado de cada reservatório foi transferido a uma placa de ELISA de 96 reservatórios pré-revestida com um anticorpo de captura anti IGF-1 R 2B9 (GSK) a 2 µg/ml e bloqueado com 4 % de BSAITBS.
A placa foi lavada com TEST (TBS+0.1%Tween 20) e um anticorpo de anti-fosfotirosina rotulada por európio (PerkinElmer DELFIA Eu-N1 PT66) diluído 1/2500 em 4 % de BSA/TBS foi adicionada em cada 5 reservatório.
Após 1 hora de incubação a placa foi lavada e a solução de intensificação DELFIA (PerkinElmer 1244-105) adicionada.
Após 10 minutos de incubação o nível de fosforilação receptora foi determinada usando um leitor de placa apresentado para medir o período de fluorescência determinado por európio (TRF). Os resultados dos experimentos são apresentados na Figuras 68 e 69. Os resultados confirmam que os mAbdAbs BPC1603-1606 podem inibir a fosforilação receptora mediada por IGF-l em níveis comparáveis ao anticorpo monoclonal anti-IGF-1R HOLO.
Um anticorpo irrelevante (rotulado como IgG1, Sigma 15154) não mostrou atividade neste ensaio.
Exemplo 15 Proteína de ligação de antígeno anti-CD20/IL-13 Exemplo 15.1: biologia molecular Os vetores de expressão de mamíferos que codificam uma sequência de cadeia leve e pesada de um anti-CD20 mAb apresentados na SEQ ID N°: 117 e 120 foram construídos novamente usando um PCR com base no método e as técnicas de biologia molecular padrão.
As cadeias pesadas e leves anti-CD20mAb-anti-IL13dAb biespecíficos foram construídos pela clonagem das sequências em que regiões variáveis leves e pesadas codifica anti-CD20 mAb em vetores de expressão de mamíferos contendo regiões constantes de anticorpo humano fundido a um domínio de anticorpo humano anti-IL-13 (DOML0-53-474). As construções de expressão mAbdAb foram transfectadas nas células CHOE1a.
O sobrenadante foi coletado e então o anticorpo purificado usando a proteína A imobilizada e quantificadas pela absorbância de leitura a 280nm.
Os mAbdAbs (e o controle anti-CD20 mAb) construído e testado são listados na Tabela 20. Tabela 20 Identificador Nomes Anticorpo Anticorpos Ligante Seq ID: Seq ID: Local de fusão alternativos alvo de domínio Para cadeiaPara cadeia pesada leve BPC1401 RituxanH- CD20 DOML0- TVAAPSGS 116 117 Terminal C de TVAAPSGS- 53-474 cadeia pesada DOM474 BPC1402 RituxanH- CD20 DOML0- GS 118 117 Terminal C de GS-DOM474 53-474 cadeia pesada BPC1403 RituxanL- CD20 DOML0- TVAAPSGS 120 119 Terminal C de TVAAPSGS- 53-474 cadeia leve DOM474 BPC1404 RituxanL- CD20 DOML0- GS 120 121 Terminal C de GS-DOM474 53-474 cadeia leve mAb anti-CD20 Rituxan CD20 - - 120 117 - Exemplo 15.2: Cinéticos de ligação a IL-13 humano A afinidade de ligação de construção mAbdAbs por IL-13 5 humano foram avaliados pela análise BIAcoreTM. As análises foram realizadas na anti-IgG de captura humano. Brevemente, o anti-IgG humano (Biacore BR-1008-39) foi ligado em um chip CM5 pela ligação de amina primária. As construções MAbdAb foram então capturadas nesta superfície e IL-13 humano (feito e purificado em GSK) passado em concentrações definidas. A superfície foi regenerado novamente à superfície anti-IgG humano usando 3M de MgCl2. Este tratamento não significantemente afeta a capacidade de capturar o anticorpo para um evento da ligação subsequente IL-
13. Esta realização foi desempenhada a 25 °C usando tampão HBS-EP, na máquina BIAcoreTM T100. Os dados foram analisados usando o software de avaliação na máquina e ajustado ao modelo de ligação 1:1. Os resultados da análise são apresentados na Tabela 48, confirmando que para todas as construções mAbdAbs, os cinéticos de ligação a IL-13 são comparáveis. Tabela 48 – Dados de ressonância de plasmon de superfície (BIAcoreTM) Nome do anticorpo Ka (M-1.s-1) Kd (s-1) KD (nM) BPC1401 5,81E+5 1,82E-4 0,313 BPC1402 8,52E+5 3,05E-4 0,358 BPC1403 1,07E+6 2,95E-4 0,277 BPC1404 4,99E+5 5,08E-4 1,02 PascoH-474 GS removido 6,29E+5 2,66E-4 0,423 anti-CD20 mAb Nenhuma ligação detectada Ligação do mAb-dAbs a CD20 foi avaliada pela citometria de fluxo usando uma linha de célula positiva CD20 (Wein133). Todos os mAb-
dAbs (BPC1401-BPC1404) e o anticorpo de controle anti-CD20 mostrou um aumento dependendo da dosagem na intensidade de fluorescência média (MFI) (dados não mostrados). Exemplo 15.3: Ensaio ADCC com anti-CD20/anticorpo biespecífico IL-13 5 O ensaio ADCC foi com base no método publicado de Boyd et al. (1995) J.
Imm.
Meth. 184:29-38. Brevemente, as células Raji (alvos) foram rotulados com európio como seguem.
As células foram coletadas, contadas e preparadas a uma densidade final de 1x107 em um tubo falcon 15 ml, lavado uma vez com tampão de Hepes (50 mM de HEPES, 83 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de MgCl2.H2O, pH7.4). As células foram granuladas e 1 ml de tampão de rotulação com európio gelado (tampão HEPES mais 600 µM de EuCl3, 3 mM de DTPA e 25 mg/ml de sulfato de dextrano) foi adicionado a cada tubo. a suspensão celular foi agitada vigorosamente no início da rotulação e então a cada 10 minutos durante o período de incubação de 30 minutos em gelo. 10 ml de tampão de reparo gelado (tampão de Hepes contendo 294 mg/l de CaCl2.2H2O, 1,8 g/l D- glicose, pH7.4) foi adicionado e as células incubado em gelo por 10 minutos adicionais.
As células foram então centrifugados, o sobrenadante decantando e lavado duas vezes com tampão de reparo e então uma vez com meio completo.
As células rotuladas foram então contadas e recolocadas em suspensão no meio livre do soro a 2x105 células/ml e armazenado em gelo.
As células mononucleares sanguíneas purificadas humanas (PBMCs ou células efetivas) foram preparadas como seguem. 150 ml de sangue total foi centrifugado a 2000 rpm por 10 minutos para remover o soro.
As células foram diluídas duas vezes ao volume original com PBS (Invitrogen/Gibco, #14190). Os tubos gradiente de densidade Accuspin (Sigma, #A2055-10EA) foram preparados pela adição 15ml lymphoprep (Axis shield, #NYC1114547) e centrifugado por 1 minuto a 1500 rpm. 25 ml de suspensão sanguínea foi adicionado aos tubos de gradiente de densidade e centrifugados por 20 minutos a 2500 rpm com a parada da centrífuga. 10 ml da parte superior do sobrenadante foi descartado.
O remanescente (incluindo a camada inflamatória) foi vertido em um tubo limpo, coberto com PBS e centrifugado a 1500 rpm por 5 minutos.
O sobrenadante foi descartado, as 5 células granuladas unidas, lavadas uma vez em meio RPMI, centrifugado novamente e contado.
As células efetivas foram preparadas a 5x106/ml no meio RPMI livre de soro.
As placas de ensaio foram colocadas em placas de fundo redondo de 96 reservatórios (placa Nunc 96 maxisorb, #735-0199) como seguem.
As diluições de anticorpo foram feitas no meio RPMI livre de soro em uma concentração de partida de aproximadamente 12 µg/ml e onze diluições triplas adicionais.
Usando o esquema da placa abaixo, 50 µl da amostra de anticorpo foi adicionado aos reservatórios apropriados (séries B-G apenas), permitindo 6 cópias por diluição). 50 µl de meio RPMI foi adicionado a todos os reservatórios em séries A e H. 50 µl do meio RPMI foi adicionado a todos os reservatórios em meio de placas rotuladas. 50 µl de IL- 13 humano recombinante diluído em meio RPMI a 4µg/ml (1 µg/ml de concentração final, GSK de material in-house) foi adicionado a todos os reservatórios em placas rotulados +IL13. Todas as placas foram incubadas a 4 °C pelo mínimo de 30 minutos. 50 µl das células alvos rotuladas por európio foram adicionados a todas as placas. 20 µl de um 10X triton foi adicionado a todos os reservatórios em série H em todas as placas.
As placas foram incubadas a 4 °C por um mínimo de 30 minutos. 50 µl do meio RPMI foi adicionado a todos os reservatórios em colunas rotulados alvos sozinho. 50 µl de PBMCs foi adicionado a todos os reservatórios em colunas efetivas rotuladas:alvos para dar uma razão 25:1. As placas foram centrifugadas a 1500 rpm por 3 minutos e incubadas a 37 °C por 3 a 4 horas. 200 µl de solução de intensificação (Wallac/Perkin Elmer, Catálogo# 1244-105) foi adicionada em cada reservatório de placas ELISA imunoabsorventes nunc
(uma placa ELISA para cada placa de ensaio). 20 µl do sobrenadante foi transferido a partir da placa de ensaio a placa ELISA.
As placas de ELISA foram incubadas em temperatura ambiente no agitador de placa por um mínimo de 30 minutos ou armazenado durante a noite a 4 °C.
A liberação de 5 európio é medida usando fluorimetria parada no tempo (leitor de placa Wallac Victor). Lise espontânea = medição de európio liberado a partir de células e meio sozinho.
Lise máxima = lise não específica de células alvos pela adição de Triton-X100 (detergente não iônico). Efetivos:Alvos Alvos Efetivos:Alvos Alvos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Liberação Liberação espontânea espontânea B 3µg/ml 0,003µg/ml C 1µg/ml 0,001µg/ml D 0,3µg/ml 0,0003µg/ml E 0,1µg/ml 0,0001µg/ml F 0,03µg/ml 0,00003µg/ml G 0,01µg/ml 0,00001µg/ml H Liberação Liberação Máxima Máxima
O ensaio ADCC foi realizado em duas ocasiões separadas usando dois doadores PBMCs diferentes.
Os resultados de um ensaio representativo são apresentados nas Figuras 70 e 71. Além disso, um ensaio ADCC similar usando uma faixa de dosagem mais curta foi realizado em uma ocasião separada usando doadores PBMCs diferentes.
Os resultados a partir deste ensaio são apresentados nas Figura 72 e 73. Exemplo 15.4: Ensaio CDC com anticorpo biespecífico anti-CD20/IL-13 As células WEIN (alvos) foram rotuladas com európio como seguem.
Brevemente, as células foram coletadas, contadas e preparadas a uma densidade final de 1x107 em um tubo falcon de 15 ml, lavado uma vez com tampão de Hepes (50 mM de HEPES, 83 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de MgCl2.H2O, pH7.4). As células foram granuladas e 1 ml de tampão de rotulação európio gelado (tampão HEPES mais 600 µM EuCl3, 3 mM de DTPA e 25 mg/ml sulfato de dextrano) foi adicionado a cada tubo.
A suspensão celular foi agitada vigorosamente no início da rotulação e então a cada 10 minutos durante o período de incubação de 30 minutos em gelo. 10 ml de tampão de reparo gelado (tampão de Hepes contendo 294 mg/l de CaCl2.2H2O, 1,8g/l de D-glicose, pH7.4) foi adicionado e as células incubadas em gelo por 10 minutos adicionais.
As células foram então 5 centrifugadas, o sobrenadante decantando e lavado duas vezes com tampão de reparo e então uma vez com meio completo.
As células rotuladas foram então contadas e recolocadas em suspensão no meio livre do soro a 2x105 células/ml e armazenado em gelo.
O soro foi removido a partir do sangue total coletados a partir dos doadores alojados pela centrifugação.
Metade da amostra foi inativada pelo tratamento por calor a 56 °C por 30 minutos.
As amostras de anticorpos foram diluídas no meio RPMI livre de soro, partida a 12µg/ml com cinco diluições triplas adicionais. 50 µl de amostra de anticorpo foi adicionado aos reservatórios apropriados em séries B-G apenas (como pelo esquema da placa abaixo). 50 µl meio RPMI foi adicionado a todos os reservatórios em colunas 1 a 6. Onde indica, 50 µl de IL-13 humano recombinante (a 4 µg/ml no meio RPMI) foi adicionado a todos os reservatórios em colunas 7 a 12. As placas foram incubadas a 4 °C por um mínimo de 30 minutos. 50 µl de alvos rotulados por európio das células foram adicionados em todas as placas e as placas incubadas a 4 °C por um mínimo de 30 minutos. 50 µl de soro (ativo ou inativado por calor) foi adicionado aos reservatórios apropriados (ver esquema de placa abaixo). As placas foram incubadas a 37 °C no incubador por 2 a 3 horas, após o período em que as placas foram centrifugadas a 1500 rpm por 3 minutos. 200 µl de solução de intensificação (Wallac/Perkin Elmer, Catálogo# 1244-105) foi adicionada em cada reservatório de placas ELISA imunoabsorventes nunc (uma placa ELISA para cada placa de ensaio). 20 µl de sobrenadante foi transferido a partir da placa de ensaio a placa de ELISA.
As placas de ELISA foram incubadas em temperatura ambiente em um agitador de placa por um mínimo 30 minutos ou armazenadas durante a noite a 4 °C. A liberação de európio é medida usando fluorimetria parado no tempo (leitor de placa Wallac Victor). lise espontânea = medição de liberação de európio a partir de células e meio sozinho. lise máxima = lise não específica de células alvos pela adição de Triton-X100 (detergente não iônico). Meio IL13 Complemento ativo Tratado por calor Complemento ativo Tratado por calor 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Liberação espontânea B 3µg/ml C 1µg/ml D 0,3µg/ml E 0,1µg/ml F 0,03µg/ml G 0,01µg/ml H Liberação Máxima 5 O ensaio CDC foi realizado em três ocasiões separadas usando três soros de doadores diferentes. Os resultados de um ensaio representativo são apresentados nas Figuras 74 e 75 e mostram que a atividade CDC das amostras de anticorpo é comparável na ausência de IL-13. Na presença do excesso IL-13, a atividade CDC das amostras de anticorpo BPC1401 e BPC1402 (domínio de anticorpo fundido a cadeia pesada) é reduzido enquanto uma atividade CDC de BPC1403 e BPC1404 (domínio de anticorpo fundido a cadeia leve) não é amplamente afetado pela presença de IL-13. Exemplo 16
16.1 Projeto e construção de proteína de ligação de antígenos que compreende os domínios de ligação do epítopo compostos da estruturas alternativa Cinco estruturas alternativas, listadas abaixo, foram combinadas com anticorpos monoclonais para fornecer moléculas biespecíficas de estruturas alternativas mAb: • lipocalina de remoção de anti VEGF (TLPC) • aficorpo anti HER2 (AFFI) • anti HER2 DARPin (DRPN) • lisozima branca de ovo anti galinha (NARV)
• camelídeo anti-RNaseA VHH As sequências de proteína de TLPC (para informação adicional ver US2007/0224633), AFFI (para informação adicional ver WO2005003156A1), DRPN (para informação adicional ver Zahnd, C. et al. 5 (2007), J.
Mol.
Biol., 369, 1015-1028) e NARV (para informação adicional ver US20050043519A) foram traduzidos reversos ao DNA e otimizados por códon.
Um local BamHl no terminal N e local EcoRl no terminal C foram incluídos em cada uma destas quatro estruturas alternativas para facilitar a clonagem.
Os fragmentos de DNA que codificam quatros sequências de DNA das estruturas alternativas finais foram construídas novamente usando uma estratégia com base em PCR e oligonucleotídeos de sobreposição.
Os produtos PCR TLPC, AFFI e DRPN foram clonados em vetores de expressão de mamíferos contendo o cadeia pesada de HOLO, um anticorpo anti-hIGF- 1R.
As sequências de DNA resultantes que codificam as estruturas alternativas fundidas ao terminal C da cadeia pesada por intermédio de um ligante TVAAPSGS ou ligante GS.
O produto PCR NAR V foi clonado nos vetores de expressão de mamíferos contendo DNA que codifica a cadeia pesada de Pascolizumab (um anticorpo anti-IL-4). A sequência de DNA resultante que codifica o NAR V fundido ao terminal C da cadeia pesada por intermédio de um ligante GS.
Uma sequência de DNA de camelídeo anti-RNAse A VHH foi modificado por PCR para incluir um local BamHl na extremidade 5’ e o local EcoRl na extremidade 3’ a fim de facilitar a clonagem.
O produto PCR foi clonado nos vetores de expressão de mamíferos contendo a cadeia pesada de Pascolizumab, um anticorpo anti-IL4. A sequência de DNA resultante que codifica um camelídeo VHH fundido ao terminal C da cadeia pesada por intermédio de um ligante GS.
Tabela 21 abaixo é um resumo da proteína de ligação de antígenos que foram construídos. Tabela 21 ID do Anticorpo Descrição SEQ ID N°: sequência de aminoácido BPC1803 antilGF1 R Cadeia pesada-GS-TLPC 123 antilGF1 R Cadeia leve 113 BPC1804 antilGF1 R Cadeia pesada-TVAAPSGS-TLPC 125 antilGF1 R Cadeia leve 113 BPC1805 antilGF1 R Cadeia pesada-GS-AFFI 126 antilGF1 R Cadeia leve 113 BPC1806 antilGF1 R Cadeia pesada-TVAAPSGS-AFFI 127 antilGF1 R Cadeia leve 113 BPC1807 antilGF1 R Cadeia pesada-GS-DRPN 128 antilGF1 R Cadeia leve 113 BPC1808 antilGF1 R Cadeia pesada-TVAAPSGS-DRPN 129 antilGF1 R Cadeia leve 113 BPC1809 Anti IL-4 cadeia pesada-GS-anti RNAse A camelídeo VHH 130 Anti IL-4 Cadeia leve 15 BPC1816 Anti IL-4 cadeia pesada-GS-NARV 131 Anti IL-4 Cadeia leve 15 Os plasmídeos de expressão que codificam uma cadeia pesada e leve da proteína de ligação de antígenos apresentados na tabela 21 foram 5 transitoriamente cotransfectados nas células HEK 293-6E usando 293 fectina (Invitrogen, 12347019). Uma alimentação de triptona foi adicionado a cada uma das culturas celulares ao mesmo dia ou dia seguinte e o material sobrenadante foi coletado após cerca de 2 a 6 dias a partir da transfecção inicial. A proteína de ligação de antígeno foi purificada do sobrenadante usando uma coluna de proteína A antes de ser testado nos ensaios de ligação.
16.2: rhELISA de ligação IGF-IR As placas de ligação altas de 96 reservatórios foram revestidas com 1 µg/ml de anticorpo anti-his-tag (Abcam, ab9108) em PBS e armazenadas a 4 °C. As placas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20. 200 µL de solução de bloqueamento (5 % de BSA em tampão DPBS) foi adicionado em cada reservatório e as placas foram incubadas por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente. Uma outra etapa de lavagem foi então removida. 0,4 µg/mL de rhlGF-1 R (Sistemas R&D) foi adicionada em cada reservatório a 50 µL por reservatório. As placas foram incubadas por uma hora em temperatura ambiente e então lavadas. A proteína purificada de ligação de antígenos/anticorpos foram sucessivamente diluídos através das placas na solução de bloqueamento. Após uma hora de incubação, as placas foram lavadas. Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti-humano de cabra foi diluído na solução de bloqueamento a 1 µg/mL e 50 µL foi adicionado em cada reservatório. As placas foram incubadas por 5 uma hora. Após uma outra etapa de lavagem, 50 µl de solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o-fenilenodiamina) foi adicionado em cada reservatório e a reação foi interrompida 15 minutos após, pela adição de 25 µL de 3M de ácido sulfúrico. A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico. As Figuras 76, 78 e 80 mostram os resultados ELISA e confirmam que a proteína de ligação de antígenos BPC1803 - BPC1808 ligam-se ao IGF-1R humano recombinante. O anti-IGF-1R de anticorpo monoclonal HOLO também mostrou a ligação ao IGF-1 R humano recombinante considerando o anticorpo de controle negativo (sigma 15154) não mostrou ligação a IGF-1 R.
16.3: Ligação VEGF ELISA As placas de ligação altas de 96 reservatórios foram revestidas com 0,4 µg/mL de hVEGF165 (Sistemas R&D) e incubadas a +4 °C durante a noite. As placas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20. 200 µL de solução de bloqueamento (5 % de BSA em tampão DPBS) foi adicionada em cada reservatório e as placas foram incubadas por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente. Uma outra etapa de lavagem foi então removida. A proteína purificada de ligação de antígenos/anticorpos foram sucessivamente diluída através das placas na solução de bloqueamento. Após uma hora de incubação, as placas foram lavadas. Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti-humano de cabra foi diluído na solução de bloqueamento a 1 µg/mL e 50 µL foi adicionado em cada reservatório. As placas foram incubadas por uma hora. Após uma outra etapa de lavagem, 50 µl de solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o-fenilenodiamina) foi adicionado em cada reservatório e a reação foi interrompida 15 minutos após pela adição de 25 µL de 3M de ácido sulfúrico. A absorbância foi lida a 490 nm usando o leito de 5 microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico. A Figura 77 mostra os resultados da ligação VEGF ELISA e confirma que os anticorpos biespecíficos BPC1803 e BPC1804 ligam-se ao VEGF humano. Um anticorpo biespecífico anti VEGF (BPC1603) foi usado como um controle positivo neste ensaio e mostrou a ligação a VEGF. Em contraste o anticorpo monoclonal anti-IGF-1 R HOLO não mostrou ligação a VEGF humano.
16.4: HER2 ELISA de ligação As placas de ligação altas de 96 reservatórios foram revestidas com 1 µg/mL de HER2 (Sistemas R&D) e incubadas a +4 °C durante a noite. As placas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20. 200 µL de solução de bloqueamento (5 % de BSA em tampão DPBS) foi adicionada em cada reservatório e as placas foram incubadas por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente. Uma outra etapa de lavagem foi então removida. A proteína purificada de ligação de antígenos/anticorpos foram sucessivamente diluída através das placas na solução de bloqueamento. Após uma hora de incubação, as placas foram lavadas. Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti-humano de cabra foi diluído na solução de bloqueamento a 1 µg/mL e 50 µL foi adicionada em cada reservatório. As placas foram incubadas por uma hora. Após uma outra etapa de lavagem, 50 µl de Solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o-fenilenodiamina) foi adicionada em cada reservatório e a reação foi interrompida 15 minutos após pela adição de 25 µL de 3 M de ácido sulfúrico. A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico. As Figuras 79 e 81 mostram os resultados da ELISA de ligação HER2 e confirmam que a proteína de ligação de antígenos BPC1805, 5 BPC1806, BPC1807 e BPC1808 ligam-se ao HER2 humano recombinante. Herceptina foi usada como um controle positivo neste ensaio e mostrou a ligação a HER2. Em contraste o anti-IGF-1 R anticorpo monoclonal HOLO não mostrou ligação ao HER2 humano.
16.5: IL-4 ELISA de ligação As placas de ligação altas de 96 reservatórios foram revestidas com 5 µg/ml de IL-4 humano em PBS e armazenadas a 4 °C. As placas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20. 200 µL de solução de bloqueamento (5 % de BSA em tampão DPBS) foi adicionado em cada reservatório e as placas foram incubadas por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente. Uma outra etapa de lavagem foi então removida. A proteína purificada de ligação de antígenos/anticorpos foram sucessivamente diluídos através das placas na solução de bloqueamento. Após uma hora de incubação, as placas foram lavadas. Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti- humano de cabra (Sigma, A7164) foi diluído na solução de bloqueamento a 1 µg/mL e 50 µL foi adicionado em cada reservatório. As placas foram incubadas por uma hora. Após uma outra etapa de lavagem, 50 µl de Solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o-fenilenodiamina) foi adicionado em cada reservatório e a reação foi interrompida por 15 minutos após pela adição de 25 µL de 3 M de ácido sulfúrico. A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico. A Figura 82 mostra os resultados de ELISA e confirmam que a proteína de ligação de antígeno BPC1809 liga-se ao IL-4 humano em níveis comparáveis ao anti IL-4 anticorpo monoclonal, Pascolizumab. O anticorpo de controle negativo (Sigma 15154) não mostrou ligação a IL-4. A Figura 84 mostra os resultados de ELISA e confirmam que proteína de ligação de antígeno BPC1816 liga-se ao IL-4 humano em níveis 5 comparáveis ao anti IL-4 anticorpo monoclonal, Pascolizumab. O anticorpo de controle negativo (Sigma 15154) não mostrou ligação a IL-4.
16.6: Uma ELISA de ligação RNAse 50 uL de 1ug/mL RNAse A (Qiagen, 19101) que foi diluído em PBS foi adicionado em cada reservatório de uma placa Costar de 96 reservatórios. A placa foi incubada por 2 horas em temperatura ambiente então lavada com PBST antes da adição de 200 uL de 4 % de BSA/PBS bloquear em cada reservatório. A placa foi incubada por uma hora e lavada antes da adição das amostras. Anticorpos purificados e proteína de ligação de antígeno BPC1809 foram adicionados em uma concentração adicional de 2 ug/mL em reservatórios de coluna 1 então seriamente diluídos 1 em 2 através da placa no bloco. A placa foi incubada por uma hora então lavada. 50 ul/reservatório do anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti-humano de cabra (Sigma, A7164) foi adicionado em um 1 na diluição 1000. A placa foi incubada por uma hora então lavada. 50 uL de OPD foi adicionada em cada reservatório e a reação foi interrompida com 3 M de ácido sulfúrico após 15 a 30 minutos. A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico. A Figura 83 mostra os resultados de uma ELISA RNAse de ligação e confirma que anticorpo monoclonal humano purificado-anticorpo de camelídeo VHH biespecífico BPC1809 mostra a ligação a RNAse A. Em contraste tanto o anticorpo monoclonal Pascolizumab IL-4 quanto ao controle negativo (sigma 15154) não mostrou ligação a RNAse A.
16.7: ELISA de ligação HEL
Uma placa de ligação alta de 96 reservatórios foi revestido com 5 µg/ml de HEL (Hen Egg Lysozyme, Sigma L6876) em PBS e armazenadas a 4 °C. A placa foi lavada duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20. 200 µL de solução de 5 bloqueamento (5 % de BSA em tampão DPBS) foi adicionado em cada reservatório e a placa foi incubada por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente. Uma outra etapa de lavagem foi então removida. Os anticorpos purificados foram sucessivamente diluídos através da placa na solução de bloqueamento. Após uma hora de incubação, a placa foi lavada. Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti-humano de cabra (Sigma, A7164) foi diluído na solução de bloqueamento a 1 µg/mL e 50 µL foi adicionada em cada reservatório. A placa foi incubada por uma hora. Após uma outra etapa de lavagem, 50 µl de solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o-fenilenodiamina) foi adicionada em cada reservatório e a reação foi interrompida 15 minutos após pela adição de 25 µL de 3 M de ácido sulfúrico. A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico. A Figura 85 mostra os resultados da ELISA de ligação HEL e confirma que anticorpo monoclonal humano purificado - NAR V anticorpo biespecífico BPC1816 liga-se ao HEL. Em contraste o anticorpo monoclonal Pascolizumab IL-4 não mostrou ligação a HEL. Exemplo 17
17.1 Projeto e construção de proteínas de ligação de antígeno que compreende os domínios de ligação do epítopo compostos de adnectina A adnectina CT01 é específica por VEGFR2 (para informação adicional ver WO2005/056764). A sequência de proteína de adnectina CT01 foi traduzida reversa a DNA e otimizada por códon. Um local BamHl no terminal N e local EcoRl no terminal C foram incluídos para facilitar a clonagem.
Os fragmentos de DNA que codificam uma sequência de DNA CT01 final foram construídos novamente usando uma estratégia com base em PCR e oligonucleotídeos de sobreposição.
O produto PCR foi clonado nos 5 vetores de expressão de mamíferos contendo o cadeia pesada de HOLO (um anticorpo anti-hIGF-1 R) permitindo a adesão ser fundidas ao terminal C da cadeia pesada por intermédio de um ligante GS ou um ligante TVAAPSGS.
As sequências de proteínas das cadeias leves e pesadas de IGF-1 R - VEGFR2 biespecíficos são dados na SEQ ID números 124, 113 e 133. Uma outra sequência de proteína de adnectina que codifica por uma adnectina anti-TNF-α (para informação adicional ver US20080139791) foi traduzida reversa ao DNA, otimizado por códon e modificado para incluir terminal BamHl e local EcoRl antes de ser construído usando o método PCR de oligonucleotídeo de sobreposição previamente descrito.
O produto PCR foi clonado nos vetores de expressão de mamíferos contendo DNA que codifica a cadeia pesada de Pascolizumab (um anticorpo anti-IL-4) permitindo que o DNA que codifica adnectina anti-TNF-α seja fundida ao terminal C da cadeia pesada por intermédio de um ligante GS ou um ligante TVAAPSGS.
As sequências de proteínas das cadeias leves e pesadas do IL-4 - TNF-α biespecíficos são dados na SEQ ID N°: 146, 147 e 15. As proteínas de ligação de antígeno usando a adnectina específica por TNF-α fundida no terminal C da cadeia pesada de um anticorpo monoclonal IL-13 também foi projetado.
Exemplo como as sequências de proteínas são dadas na SEQ ID's 134, 13 e 135. Além disso, as moléculas biespecíficas com base na fusão de CT01 no terminal C ou no terminal N de cadeia leve ou pesada de anticorpos anti-EGFR Erbitux e IMC- 11 F8 foram projetados.
Exemplos das sequências de proteínas que foram projetados são dadas na SEQ ID N°: 136-145. Destes exemplos de sequências, um número foi construído.
As sequências de DNA que codificam a SEQ ID N° 136 (CT01 fundidas ao terminal C da cadeia pesada Erbitux), SEQ ID N° 144 (CT01 fundida no terminal N de cadeia pesada Erbitux) e SEQ ID N° 138 (CT01 fundida ao terminal C da cadeia leve Erbitux) foram construídos.
Todas estas sequências 5 foram construídas usando métodos de clonagem com base em PCR e clonados nos vetores de expressão de mamíferos.
Tabela 22 abaixo é um resumo da proteína de ligação de antígenos que foram projetados e/ou construídos.
Tabela 22 ID do anticorpo Descrição SEQ ID NO: Sequência de aminoácido BPC1801 antilGF1 R Cadeia pesada-GS-CT01 adnectina 124 (construído) antilGF1 R Cadeia leve 113 BPC1802 antilGF1 R Cadeia pesada-TVAAPSGS-CT01 adnectina 133 (construído) antilGF1 R Cadeia leve 113 BPC1810 antilL13-Cadeia pesada-GS-antiTNFa 134 (projetado) adnectina antilL13-Cadeia leve 13 BPC1811 antilL13-Cadeia pesada-TVAAPSGS- 135 (projetado) antiTNFa adnectina antilL13-Cadeia leve 13 BPC1812 Erbitux Cadeia pesada-RS-CT01 adnectina 136 (construído) Erbitux Cadeia leve 137 BPC1813 Erbitux Cadeia leve-RS-CT01 adnectina 138 (construído) Erbitux Cadeia pesada 139 BPC1814 11 F8 Cadeia pesada-GS-CT01 adnectina 140 (projetado) 11 F8 Cadeia leve 141 BPC1815 11 F8 Cadeia leve-GS-CT01 adnectina 142 (projetado) 11 F8 Cadeia pesada 143 BPC1818 GS-CT01 adnectina-GSTG-Erbitux cadeia pesada 144 (construído) Erbitux Cadeia leve 137 BPC1819 CT01 adnectina-STG-Erbitux Cadeia leve 145 (projetado) Erbitux Cadeia pesada 139 BPC1823 Anti IL-4 Cadeia pesada-GS-anti TNF-a 146 (construído) adnectina
Anti IL-4 Cadeia leve 15 BPC1822 Anti IL-4 Cadeia pesada-TVAAPSGS- anti TNF-a adnectina 147 (construído) Anti IL-4 Cadeia leve 15
Os plasmídeos de expressão que codificam uma cadeia pesada e leve de BPC1801, BPC1802, BPC1822, BPC1823, BPC1812, BPC1813 e BPC1818 foram transitoriamente cotransfectados em células HEK 293-6E usando 293 fectina (Invitrogen, 12347019). Uma alimentação de triptona foi adicionada a cultura celular no mesmo dia ou dia seguinte e o material sobrenadante foi coletado após cerca de 2 a 6 dias a partir da transfecção inicial.
Em alguns exemplos o material de sobrenadante foi usado como artigo de teste nos ensaios de ligação.
Em outros exemplos, a proteína de ligação de antígeno foi purificada usando uma coluna de proteína A antes de ser testada nos ensaios de ligação. 5 17.2: rhELISA de ligação IGF-IR As placas de ligação altas de 96 reservatórios foram revestidas com 1 µg/ml de anticorpo anti-his-tag (Abcam, ab9108) em PBS e armazenadas a 4 °C.
As placas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20. 200 µL de solução de bloqueamento (5 % de BSA em tampão DPBS) foi adicionado em cada reservatório e as placas foram incubadas por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente.
Uma outra etapa de lavagem foi então removida. 0,4 µg/mL de rhlGF-1 R (Sistemas R&D) foi adicionada em cada reservatório a 50 µL por reservatório.
As placas foram incubadas por uma hora em temperatura ambiente e então lavadas.
A proteína purificada de ligação de antígenos/anticorpos foram sucessivamente diluídas através das placas na solução de bloqueamento.
Após uma hora de incubação, as placas foram lavadas.
Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti-humano de cabra foi diluído na solução de bloqueamento a 1 µg/mL e 50 µL foi adicionada em cada reservatório.
As placas foram incubadas por uma hora.
Após uma outra etapa de lavagem, 50 µl de solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o-fenilenodiamina) foi adicionada em cada reservatório e a reação foi interrompida 15 minutos após pela adição de 25 µL de 3 M de ácido sulfúrico.
A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico.
A Figura 86 mostra os resultados de IGF-1 R ELISA de ligação e confirma que anticorpo monoclonal humano purificado -anticorpos biespecíficos por adnectina (BPC1801 e BPC 1802) ligam-se ao IGF-1 R humano recombinante em níveis comparáveis ao anticorpo monoclonal anti- IGF-1R HOLO. O anticorpo de controle negativo (Sigma 15154) não mostrou ligação a IGF-1R.
17.3: ELISA de ligação VEGFR2 5 As placas de ligação altas de 96 reservatórios foram revestidas com 0,4 µg/mL de VEGFR2 (Sistemas R&D) e incubadas a +4 °C durante a noite. As placas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20. 200 µL de solução de bloqueamento (5 % de BSA em tampão DPBS) foi adicionada em cada reservatório e as placas foram incubadas por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente. Uma outra etapa de lavagem foi então removida. Os sobrenadantes ou anticorpos purificados foram sucessivamente diluídos através das placas na solução de bloqueamento. Após uma hora de incubação, a placa foi lavada. Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti-humano de cabra foi diluído na solução de bloqueamento a 1 µg/mL e 50 µL foi adicionada em cada reservatório. As placas foram incubadas por uma hora. Após uma outra etapa de lavagem, 50 µl de solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o-fenilenodiamina) foi adicionado em cada reservatório e a reação foi interrompida 15 minutos após pela adição de 25 µL de 3 M de ácido sulfúrico. A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico. A Figura 87 mostra os resultados de ELISA de ligação VEGFR2 e confirma que anticorpo monoclonal humano purificado - anticorpos biespecíficos por adnectina (BPC1801 e BPC1802) ligam-se ao VEGFR2 humano recombinante. Em contraste o anticorpo monoclonal anti- IGF-1 R HOLO não mostrou ligação a VEGF R2 humano. A Figura 172 mostra os resultados de ELISA de ligação VEGFR2 e confirma que a proteína de ligação de antígenos BPC1818 e
BPC1813 ligam-se ao VEGFR2 humano recombinante. Em contraste Erbitux não mostrou ligação a VEGF R2 humano. Para a proteína de ligação de antígenos BPC1813 e BPC1818, a quantidade de anticorpo no sobrenadante não foi quantificado deste modo o dado apresentado na Figura 172 é 5 representado como um fator de diluição do material de sobrenadante limpo. Por Erbitux, material purificado foi usado no ensaio aT na concentração de partida de 2µg/ml, que é equivalente ao fator de diluição de 1 na Figura 172. A Figura 175 mostra os resultados da ELISA de ligação VEGFR2 e confirma que a proteína de ligação de antígeno BPC1812 liga-se ao VEGFR2 humano recombinante. Em contraste Erbitux e o controle negativo do anticorpo Sigma IgG 15154 não mostrou ligação a VEGF R2 humano. Para a proteína de ligação de antígeno BPC1812, a quantidade de anticorpo no sobrenadante não foi quantificado deste modo o dado apresentado na Figura 175 é representado como um fator de diluição do material de sobrenadante limpo. Pelo material purificado Erbitux e Sigma IgG 15154 foi usado no ensaio nas concentração de partida de 2µg/ml, que é equivalente ao fator de diluição de 1 na Figura 175.
17.4: IL-4 ELISA de ligação As placas de ligação altas de 96 reservatórios foram revestidas com 5 µg/ml de IL-4 humano em PBS e armazenadas a 4 °C. As placas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20. 200 µL de solução de bloqueamento (5 % de BSA em tampão DPBS) foi adicionado em cada reservatório e as placas foram incubadas por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente. Uma outra etapa de lavagem foi então removida. O sobrenadante ou anticorpos purificados/proteína de ligação de antígenos foram sucessivamente diluídos através da placa na solução de bloqueamento. Após uma hora de incubação, as placas foram lavadas. Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti- humano de cabra (Sigma, A7164) foi diluído na solução de bloqueamento a 1 µg/mL e 50 µL foi adicionado em cada reservatório. As placas foram incubadas por uma hora. Após uma outra etapa de lavagem, 50 µl de solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o-fenilenodiamina) foi adicionada em cada reservatório e a reação foi interrompida 15 minutos após 5 pela adição de 25 µl de 3 M de ácido sulfúrico. A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico. A Figura 88 mostra os resultados da ligação IL-4 ELISA e confirma que anticorpo humano monoclonal-anticorpos biespecíficos por adnectina (BPC1823 e BPC 1822) ligam-se ao IL-4 humano recombinante. O anticorpo monoclonal Pascolizumab anti-IL-4 de controle positivo mostrou a ligação ao IL-4 e o anticorpo de controle negativo (Sigma 15154) não mostrou ligação a IL-4. A transfecção HEK para este experimento foi repetido para obter o sobrenadante material com uma concentração de anticorpo mais alto. A Figura 88b mostra a ligação deste anticorpo monoclonal humano de sobrenadante de concentração mais alta - anticorpo de adnectina biespecífico (BPC1823) ao IL-4 humano como determinada por ELISA Para a proteína de ligação de antígenos BPC1823 e BPC1822, a quantidade de anticorpo no sobrenadante não foi quantificado deste modo o dado apresentado na Figura 88 e 88b é representado como um fator de diluição do material de sobrenadante limpo. Para Pascolizumab e o anticorpo de controle negativo (Sigma 15154), material purificado foi usado no ensaio e a concentração de partida de 1 µg/ml, que é equivalente ao fator de diluição de 1 na Figura 88 e 88b. α
17.5: ELISA de ligação TNF-α Uma placa de ligação alta de 96 reservatórios foi revestido com 0,4 µg/ml de TNFα humano recombinante (sistemas RnD 210-TA- 050/CF) em PBS e armazenadas a 4 °C. A placa foi lavada duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20. 200 µL de solução de bloqueamento (5 % de BSA em tampão DPBS) foi adicionado em cada reservatório e a placa foi incubada por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente.
Uma outra etapa de lavagem foi então removida.
O 5 sobrenadante ou anticorpos purificados foram sucessivamente diluídos através da placa na solução de bloqueamento.
Após uma hora de incubação, a placa foi lavada.
Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti-humano de cabra (Sigma, A7164) foi diluído na solução de bloqueamento a 1 µg/mL e 50 µL foi adicionado em cada reservatório.
A placa foi incubada por uma hora.
Após uma outra etapa de lavagem, 50 µl de solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o-fenilenodiamina) foi adicionado em cada reservatório e a reação foi interrompida 15 minutos após pela adição de 25 µL de 3 M de ácido sulfúrico.
A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico.
A Figura 89 mostra os resultados de ELISA de ligação TNF-α e confirma que anticorpo monoclonal humano - anticorpos biespecíficos por adnectina (BPC1823 e BPC1822) ligam-se ao TNF-α humano recombinante.
Em contraste o anticorpo monoclonal Pascolizumab anti-IL-4 não mostrou ligação ao TNF-α humano recombinante.
A transfecção HEK para este experimento foi repetido para obter o material de sobrenadante com uma concentração de anticorpo mais alto.
A Figura 89b mostra a ligação deste anticorpo monoclonal humano de sobrenadante de concentração mais alta - anticorpo de adnectina biespecífico (BPC1823) ao TNF-α humano recombinante como determinada por ELISA.
O controle IgG não mostrou ligação a TNF-α humano recombinante.
Para a proteína de ligação de antígenos BPC1822 e BPC1823, a quantidade de anticorpo no sobrenadante não foi quantificado deste modo o dado apresentado na Figura 89 e 89b é representado como um fator de diluição do material de sobrenadante limpo. Para Pascolizumab, material purificado foi usada no ensaio na concentração de partida de 1µg/ml, que é equivalente ao fator de diluição de 1 na Figura 89 e 89b.
17.6: ELISA de ligação EGFR 5 Uma placa de ligação alta de 96 reservatórios foi revestido com 0,67 µg/ml de proteína EGFR humano recombinante em PBS e armazenadas a 4 °C. A placa foi lavada duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20. 200 µL de solução de bloqueamento (5 % de BSA em tampão DPBS) foi adicionado em cada reservatório e a placa foi incubada por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente. Uma outra etapa de lavagem foi então removida. A proteína de ligação de antígenos/anticorpos foram sucessivamente diluídos através da placa na solução de bloqueamento. Após uma hora de incubação, a placa foi lavada. Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti-humano de cabra (Sigma, A7164) foi diluído na solução de bloqueamento a 1 µg/mL e 50 µL foi adicionada em cada reservatório. A placa foi incubada por uma hora. Após uma outra etapa de lavagem, 50 µl da solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o-fenilenodiamina) foi adicionada em cada reservatório e a reação foi interrompida 25 minutos após pela adição de 25 µL de 3 M de ácido sulfúrico. A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico. A Figura 171 mostra os resultados de EGFR ELISA de ligação e confirma que os anticorpos biespecíficos BPC1818 e BPC1813 ligam-se ao EGFR humano recombinante. O anticorpo de controle positivo, Erbitux, também mostrou a ligação ao EGFR humano recombinante. Em contraste o Sigma IgG 15154 não mostrou ligação a EGFR humano recombinante. Para os anticorpos biespecíficos BPC1813 e BPC1818, a quantidade de anticorpo no sobrenadante não foi quantificado deste modo o dado apresentado na
Figura 171 é representado como um fator de diluição do material de sobrenadante limpo. Para Erbitux e o anticorpo de controle negativo (Sigma 15154), material purificado foi usado no ensaio e a concentração de partida de 2µg/ml e 1µg/ml respectivamente, que é equivalente ao fator de diluição de 1 5 na Figura 171. A Figura 176 mostra os resultados da EGFR ELISA de ligação e confirma que os anticorpos biespecíficos BPC1812 liga-se ao EGFR humano recombinante. O anticorpo de controle positivo, Erbitux, também mostrou a ligação ao EGFR humano recombinante. Em contraste o Sigma IgG 15154 não mostrou ligação ao EGFR humano recombinante. Para os anticorpos biespecíficos BPC1812, a quantidade de anticorpo no sobrenadante não foi quantificado deste modo o dado apresentado na Figura 176 é representado como um fator de diluição do material de sobrenadante limpo. Para Erbitux e o anticorpo de controle negativo (Sigma 15154), material purificado foi usada no ensaio na concentração de partida de 2µg/ml e 1 µg/ml respectivamente, que é equivalente ao fator de diluição de 1 na Figura
176. Exemplo 18 Dados de atividade de ligação de IL-13/IL-4 mAbdAbs onde os resíduos de aminoácidos ‘G e S’ foram removidos.
18.1 Construção de mAbdAbs Os mAbdAbs foram construídos em que os resíduos de aminoácidos G e S (próximo a sequência ligadora) foram removidos. Os plasmídeos de expressão foram construídos usando técnicas de biologia molecular padrão. Estes mAbdAbs são descritos na tabela 23. Estes foram clonados, então expressados em um ou mais das células HEK293-6E, células CHOK1, ou células CHOE1a, estas foram purificadas (como descrito nos exemplos 1, 1.3 e 1.5 respectivamente) e analisado em um número de IL-13 e IL-4 ensaios de atividades.
Tabela 23 Nome Descrição Sequência ID N° PascoH-474 GS Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-DOML0-53- 91 (= cadeia H) removido 474 15 (= cadeia L) dAb cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab PascoH-TVAAPS- Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-TVAAPS- 92 (= cadeia H) 474 GS removido DOML0- 15 (= cadeia L) 53-474 dAb cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab PascoH-GS- Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-GS- 96 (= cadeia H) ASTKGPT-474 2nd ASTKGPT- 15 (= cadeia L) GS removido DOML0-53-474 dAb cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab 586H-210 GS Cadeia H = cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-humano- 87 (= cadeia H) removido DOM9- 13 (= cadeia L) 112-210 dAb cadeia L = cadeia leve de mAb de IL-3 anti-humano 586H-TVAAPS-210 Cadeia H = cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-humano- 88 (= cadeia H) GS removido TVAAPS- 13 (= cadeia L) DOM9-112-210 dAb cadeia L = cadeia leve de mAb de IL-3 anti-humano
18.2 expressão e purificação Estes mAbdAbs foram purificados e analisados por SEC e SDS PAGE. Diversas preparações purificadas foram feitas e os dados SEC e 5 SDS PAGE mostrados nas Figuras 90 a 98 são representativos destas preparações.
18.3 Ligação a IL-4 humano em um ELISA de ligação direta PascoH-474 GS purificado removido e PascoH-TVAAPS-474 GS removido foram testados pela ligação a IL-4 humano em um ELISA de ligação direta como descrito no método 2 (PascoH-474, PascoH-TVAAPS- 474, PascoH-ASTKG-474 e PascoH-ELQLE-474 também foram testados pela ligação neste ensaio). Diversos ensaios de ELISA foram completados para estas moléculas, os dados mostrados na Figura 99 é representativo destes ensaios. O PascoH-474 GS removido e PascoH-TVAAPS-474 GS removido, ambos ligam-se ao IL-4 humano. O IL4 mAb anti-humano purificado sozinho (Pascolizumab) foi incluído neste ensaio como um controle positivo para a ligação ao IL-4. O mAb IL13 anti-humano purificado foi incluído como um controle negativo para a ligação IL-4. A atividade de ligação de PascoH-474 GS removido e PascoH-TVAAPS-474 GS removido foi similar ao anti-IL4 mAb purificado sozinho (Pascolizumab), PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 e PascoH-ELQLE-474.
18.4 Ligação a IL-13 humano em um ELISA de ligação direta O PascoH-474 GS purificado removido e PascoH-TVAAPS- 5 474 GS removido também foram testados pela ligação a IL-13 humano em um ELISA de ligação direta como descrito no método 1 (PascoH-616 e PascoH-TVAAPS-616 também foram testados pela ligação neste ensaio, a geração destas moléculas é descrito no Exemplo 19). Diversos ensaios ELISA foram completados para estas moléculas, os dados mostrados na Figura 100 é representativo de todos os ensaios. O PascoH-474 GS removido, PascoH-TVAAPS-474 GS removido, PascoH-616 e PascoH-TVAAPS-616 todos ligam-se ao IL-13 humano. IL4 mAb anti-humano purificado sozinho (Pascolizumab) foi incluído neste ensaio como um controle negativo pela ligação a IL-13. O mAb IL13 anti-humano purificado foi incluído como um controle positivo para a ligação IL-13. Nota-se que o anti-IL-13 dAb sozinho (DOML0-53-474) não foi testado neste ensaio como o dAb não é detectado pelo anticorpo de detecção secundário; em vez de, o mAb IL13 anti-humano foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-13 neste ensaio.
18.5 Ligação a IL-13 cinomolgo em um ELISA de ligação direta O PascoH-474 GS purificado removido, PascoH-TVAAPS- 474 GS removido, PascoH-616 e PascoH-TVAAPS-616 mAbdAbs também foram testados pela ligação um IL-13 cinomolgo em um ELISA de ligação direta (como descrito no método 17). Diversos ensaios de ELISA foram completados para estas moléculas, os dados mostrados na Figura 101 é representativo de todos os ensaios. O PascoH-474 GS removido, PascoH-TVAAPS-474 GS removido, PascoH-616 e PascoH-TVAAPS-616 todos ligam-se IL-13 cinomolgo. O IL4 mAb anti-humano purificado sozinho (Pascolizumab) foi incluído neste ensaio como um controle negativo pela ligação a IL-13. O mAb IL13 anti-humano purificado foi incluído como um controle positivo para a IL-13 de ligação cinomóloga. Nota-se que o anti-IL-13 dAbs sozinho (DOML0-53-474 e DOML0-53-616) não foram testados neste ensaio como o 5 dAb não é detectado pelo anticorpo de detecção secundário; em vez de, o mAb IL13 anti-humano foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-13 neste ensaio.
18.6 Análise Biacore para a ligação ao IL-4 humano e IL-13 humano Os MAbdAbs purificados foram testados pela ligação a IL-4 humano e IL-13 humano usando BIAcoreTM T100 a 25 °C (como descritos nos métodos 4 e 5). Estes dados são mostrados na Tabela 24. No experimento 1, um nível de captura mAbdAb de aproximadamente 600 unidades de resposta relativas foi atingido e seis curvas de concentração IL-13 e IL-4 (256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM e 0,25 nM) foram avaliados. Apenas uma curva de concentração IL-13 (256 nM) e IL-4 (256 nM) foi avaliada pelo mAbs no experimento 1. No experimento 2, um mAbdAb de um nível de captura de aproximadamente 400 unidades de resposta relativas foi atingido e seis IL-4 (64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM, 0,25 nM e 0,0625 nM) e seis curvas de concentração IL-13 (256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM e 0,25 nM) foram avaliados. No experimento 2, apenas uma curva de concentração IL-13 (256 nM) foi avaliada pelo anti-IL13 mAb e cinco curvas de concentração IL-4 (64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM e 0,25 nM) foram avaliados por Pascolizumab. No experimento 3, um mAbdAb ou nível de captura mAb de aproximadamente 700 unidades de resposta relativas foi atingido e seis curvas de concentração IL-4 (256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM e 0,25 nM) e seis curvas de concentração IL-13 (256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM, l nM e 0,25 nM) foram avaliados.
Tabela 24 Molécula Afinidade de ligação , KD (nM) (material purificado) IL-4 humano IL-13 humano Experimento Experimento Experimento Experimento Experimento Experimento 1 2 3 1 2 3 PascoH-474 não realizado 0,005 não realizado 0,3307 0,351 não realizado GS removido PascoH- não realizado 0,011 não realizado 0,2677 0,305 não realizado TVAAPS-474 GS removido 586H-210 GS não realizado não realizado Ligante muito não realizado não realizado 0,438 removido firme * 586H- não realizado não realizado Ligante muito não realizado não realizado 0,501 TVAAPS-210 firme GS removido Anti-human Não liga-se Não liga-se Não liga-se 0,2799 0,31 0,547 IL-13 mAb Pascolizumab 0,0137 0,011 0,013 Não liga-se Não liga-se Não liga-se
Nos experimentos 1 e 2, PascoH-474 GS removido e PascoH- TVAAPS-474 GS removido, ambos ligam-se ao IL-4 com afinidades de ligação similares e este foi aproximadamente equivalente à afinidade de 5 ligação do mAb IL4 anti-humano sozinho (Pascolizumab). PascoH-474 GS removido e PascoH-TVAAPS-474 GS removido, também liga-se ao IL-13 com afinidades de ligação similares.
Nota-se que o anti-IL-13 dAb sozinho (DOML0-53-474) não foi testado neste ensaio como o dAb não pode ser capturado na proteína A ou chip CM5 revestido por IgG anti-humano; em vez de, o mAb IL13 anti-humano foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-13 neste ensaio.
No experimento 3, 586H-210 GS removido e 586H-TVAAPS- 210 GS removido, ambos ligam-se ao IL-13 com afinidades de ligação similares e este foi aproximadamente equivalente à afinidade de ligação do mAb IL13 anti-humano. 586H-210 GS removido e 586HTVAAPS-210 GS removido, também ligam-se ao IL-4 muito firmemente, entretanto este método foi incapaz de determinar a afinidade de ligação devido aos efeitos de dissociação positiva e o nível de sensibilidade da técnica BIAcoreTM (*). Nota-se que o anti-IL-4 dAb sozinho (DOM9-112-210) não foi testado neste ensaio como o dAb não foi capturado na proteína A ou chip CM5 revestido por IgG anti-humano; em vez de, o mAb IL4 anti-humano (Pascolizumab) foi usada como um controle positivo para demonstrar ligação
IL-4 neste ensaio.
18.7 Análise Biacore para a ligação ao IL-4 cinomolgo e IL-13 cinomolgo Os mAbdAbs purificados foram testados pela ligação a IL-4 cinomolgo e IL-13 cinomolgo usando BIAcoreTM T100 a 25 °C (como 5 descritos nos métodos 24 e 23). Estes dados são mostrados na Tabela 25. Um nível de captura mAbdAb de aproximadamente 600 unidades de resposta relativas foi atingido e seis curvas de concentração IL-13 (256, 64, 16, 4, 1, 0,25 nM) e cinco curvas de concentração IL-4 (64, 16, 4, 1, 0,25 nM) foram avaliados. Tabela 25 Molécula Afinidade de ligação, KD (material purificado) Cinomolgo IL 13 Cinomolgo IL-4 em taxa Fora de taxa KD (nM) em taxa fora de taxa KD (pM) ka, Ms-1 kd, s-1 ka, Ms-1 kd, s-1 PascoH-474 GS 6,62E+5 1,10E-2 16,6 1,87E+6 6,38E-5 34,2 removido PascoH- 4,83E+5 1,29E-2 26,7 1,83E+6 5,30E-5 29,0 TVAAPS-474 GS removido PascoH- 4,79E+5 1,14E-2 23,8 1,83E+6 5,30E-5 29,0 ASTKGPT-474 2nd GS removido PascoH-474 5,86E+5 1,09E-2 18,6 1,85E+6 8,14E-5 43,9 PascoH- 4,33E+5 1,17E-2 27,1 1,80E+6 8,85E-5 49,1 TVAAPS-474 PascoH-ASTKG- 3,64E+5 1,07E-2 29,5 1,78E+6 7,90E-5 44,5 474 O PascoH-474 GS removido, PascoH-TVAAPS-474 GS removido, PascoH-ASTKGPT-474 2° GS removido, PascoH-474, PascoH- TVAAPS-474 e PascoH-ASTKG-474 todos ligam-se ao IL-4 cinomolgo com afinidades de ligação similares. O PascoH-474 GS removido, PascoH- TVAAPS-474 GS removido, PascoH-ASTKGPT-474 2° GS removido, PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474 e PascoH-ASTKG-474, também todos ligam-se ao IL-13 com afinidades de ligação similares. Os MAbdAbs purificados também foram testados pela ligação a IL-4 cinomolgo e IL-13 cinomolgo usando BIAcoreTM T100 a 25 °C (como descritos nos métodos 24 e 23). Estes dados são mostrados na Tabela 26. Um nível de captura mAbdAb de aproximadamente 600 unidades de resposta relativas foi atingido e seis IL13 e seis curvas de concentração IL-4 (256, 64,
16, 4, 1 e 0,25 nM) foram avaliados. Tabela 26 Molécula Afinidade de ligação, KD (material purificado) Cinomolgo IL 13 Cinomolgo IL-4 em taxa fora de taxa KD (pM) em taxa fora de taxa KD (pM) ka, Ms-1 kd, s-1 ka, Ms-1 kd, s-1 586H-TVAAPS- 4,92E+5 2,86E-5 58 Ligante muito Ligante muito Ligante muito 210 GS removido firme * firme * firme * 586H-210 GS 5,07E+5 2,24E-5 44 Ligante muito Ligante muito Ligante muito removido firme * firme * firme * Anti-IL13 mAb 4,74E+5 1,05E-4 222 Não liga-se Não liga-se Não liga-se Pascolizumab Não liga-se Não liga-se Não liga-se 2,34E+6 1,08E-4 46 O 586H-210 GS removido e 586H-TVAAPS-210 GS removido, ambos ligam-se ao IL-13 cinomolgo com afinidades de ligação 5 similares; estes mAbdAbs parecem ligar-se a IL-13 mais potencialmente do que o mAb IL13 anti-humano, entretanto no caso do mAb apenas uma curva de concentração foi completada que é inerentemente menos exato do que uma avaliação da faixa de concentração total. O 586H-210 GS removido e 586H- TVAAPS-210 GS removido, também ligam-se ao IL-4 muito firmemente, entretanto este método foi incapaz para determinar a afinidade de ligação devido aos efeitos de dissociação positiva e o nível de sensibilidade da técnica BIAcoreTM (*). Nota-se que o anti-IL-4 dAb sozinho (DOM9-112-210) não foi testado neste ensaio como o dAb não pode ser capturado na proteína A ou chip CM5 revestido por IgG anti-humano; em vez de, o mAb IL4 anti- humano (Pascolizumab) foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-4 neste ensaio.
18.8 Análise Biacore do efeito de ligação IL-4 a mAbdAbs nos cinéticos de ligação IL-13 subsequente e vice versa; e o efeito de IL-13 ligação a mAbdAbs nos cinéticos de ligação IL14 subsequentes e vice versa. Os ensaios de ligação IL-13 e IL-4 BIAcoreTM também foram usados para investigar do efeito de ligação IL-4 a PascoH-474 GS removido nos cinéticos IL-13 de ligação subsequente e vice versa; e o efeito de ligação IL-13 a 586H-TVAAPS-210 nos cinéticos IL-4 de ligação subsequente e vice versa. As análises foram realizadas na máquina BIAcoreTM T100 a 25 °C, usando anti-IgG de captura humano do mAbdAb (ou mAb de controle positivo). Brevemente, anti-IgG humano foi ligado em um CM5 chip pela ligação de amina primária de acordo com as recomendações dos fabricantes.
As construções mAbdAbs (ou mAb de controle positivo) foram então capturadas nesta superfície (em aproximadamente 250 a 750RUs) e o 5 primeiro analito (IL-13 humano ou IL-4 humano) foi passado em 256 nM por 4 minutos.
O segundo analito (IL-4 humano ou IL-13 humano respectivamente) foi então passado nas concentrações de 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM e 0,25 nM e pela dupla referência a uma injeção de tampão foi passado pelo anticorpo de captura ou superfície mAbdAb.
Os dados foram analisados (ajustados ao modelo 1:1 de ligação) usando o software de avaliação na máquina.
A superfície foi então regenerada usando 3M de cloreto de magnésio.
Os dados a partir destes experimentos são mostrados na Tabelas 27 e 28. Tabela 27 Molécula Cinéticas de ligação de IL-13 com IL-4 humano não ligado à molécula Sem IL-4 humano ligado à molécula em taxa fora de taxa KD Em taxa fora de taxa KD ka, Ms-1 kd, s-1 pM ka, Ms-1 kd, s-1 pM PascoH-474 5,66E+5 2,31 E-4 407,7 6,09E+5 2,59E-4 425.2 GS removido 5861-1- 9,68E+5 3,15E-4 325,2 9,09E+5 3,47E-4 381.3 TVAAPS-210 Anti-11-13 mAb Não testado 1,01 E+6 3,68E-4 366,1
A afinidade de ligação de PascoH-474 GS removido por IL-13 humano foi similar, independente se o IL-4 humano foi ligado a esta molécula ou não.
Além disso, a afinidade de ligação de 586H-TVAAPS-210 por IL-13 humano foi similar, independente se o IL-4 humano foi ligado a esta molécula ou não e também foi similar à afinidade de ligação do anti-IL13 mAb por IL- 13 humano.
As taxas de corte (kd) para a ligação IL-4 obtidos por PascoH- 474 GS removido e 586HTVAAPS-210, são muito inferiores e fora da faixa de sensibilidade de BIAcoreTM T100 visto que não deve ser usado como uma determinação exata de uma afinidade de ligação (dados não mostrados). Entretanto, os dados indicam que todos as construções testadas ligam-se muito firmemente a IL-4 humano. Deste modo a afinidade de ligação de PascoH-474 GS removido por IL-4 humano foi muito firme, irrespectivo se IL-13 humano foi ligado a esta molécula ou não. Além disso, a afinidade de ligação de 586H-TVAAPS-210 por IL-4 humano foi também firme, 5 independente se IL-13 humano foi ligado a esta molécula ou não.
18.9 Potência de mAbdAbs Os mAbdAbs foram testados para a inibição de ligação IL-4 humano a IL-4Ra humano por ELISA, como descrito no método 19. Todos das moléculas mostradas na Tabela 28 foram testadas em um experimento, entretanto os dados foram plotados em dois gráficos para distinguir entre as curvas de plotagem (586H-TVAAPS-210 foi realizado duas vezes, este é rotulado como amostra 1 e amostra 2 na tabela 25). Estes dados são mostrados nas Figuras 102 e 103. O PascoH-474 GS removido, inibiu a ligação de IL-4 humano a IL4Ra humano similarmente a Pascolizumab. 586H-210 GS removido, 586H-TVAAPS-210 GS removido, 586HTVAAPS-210, 586H-210, 586H- G4S-210 e 586H-ASTKG-210 todos inibem a ligação de IL-4 humano a IL4Ra humano similarmente a DOM9-112-210. Pascolizumab e DOM9-112- 210 foram incluídos como controles positivos para a inibição de ligação IL-4 a IL4Ra. DOML0-53-474 e um mAb comparado por isótipo (com especificidade por um antígeno irrelevante) foram incluídos como controle negativo para a inibição de ligação IL-4 a IL4Ra. Estes dados também foram usada para determinar os valores IC50 para cada molécula. O valor IC50 é uma concentração de mAbdAb ou mAb ou dAb, que é capaz de inibir a ligação de IL-4 humano a IL4Ra humano por 50 %. Os valores IC50 são mostrados na Tabela 28. Tabela 28 Molécula IC50 (nM) PascoH-474 GS removido 5,14 Pascolizumab 3,45 DOM9-112-210 36,77 586H -210 26,79
586H-210 GS removido 36,18 586H-TVAAPS-210 (amostra 1) 23,77 586H-TVAAPS-210 (amostra 2) 21,03 586H-TVAAPS-210 GS removido 19,21 586H-ASTKG-210 27,32 586H-G4S-210 29,85 DOML0-53-474 Nenhuma inibição na faixa de concentração testada mAb de controle negativo Nenhuma inibição na faixa de concentração testada Estes dados confirmam que PascoH-474 GS removido agir similarmente a Pascolizumab e que todos os membros da família 586H-210 mAbdAb agem similarmente ao DOM9-112-210 dAb.
18.10 Neutralização de IL-13 humano e cinomolgo no bioensaio de célula 5 TF-1 pelos mAbdAbs Um número dos mAbdAbs purificados foram testados pela neutralização de IL-13 humano e cinomolgo no bioensaio de célula TF-1 (como descrito no método 8 e método 20 respectivamente). Cada molécula foi testada entre uma e nove vezes nestes ensaios, nem todos os gráficos são mostrados, mas as Figuras 104 e 105 são representativos e gráficos mostram os dados de neutralização por IL-13 humano e IL-13 cinomolgo respectivamente. O DOML0-53-474 foi incluído como um controle positivo para uma neutralização de IL-13 humano ou cinomolgo no bioensaio. Um dAb com especificidade por um antígeno irrelevante (dAb de controle negativo) também foi incluído como um controle negativo pela neutralização de IL-13 humano ou cinomolgo no bioensaio. O PascoH-474 GS removido, PascoH-TVAAPS-474 GS removido e PascoH-ASTKG-474 2° GS removido, bem como PascoH-616, PascoH-TVAAPS-616 e DOML0-53-616 (estes são descritos no Exemplo 19), neutralizaram totalmente a bioatividade tanto de IL-13 humano quanto cinomolgo no bioensaio de célula TF-1.
18.11 Neutralização de IL-4 humano e cinomolgo nos bioensaios de célula TF-1 pelos mAbdAbs Um números dos mAbdAbs purificados também foram testados pela neutralização de IL-4 humanos e cinomólogos no bioensaio de célula TF-1 (como descrito no método 9 e método 21 respectivamente). Cada molécula foi testada duas vezes nestes ensaios, nem todos os gráficos são mostrados, mas as Figuras 106 e 107 são gráficos representativos (a partir dos 5 dados) que mostram os dados de neutralização por IL-4 humano e IL-4 cinomolgo respectivamente.
O anti-IL13 mAb foi incluído como um controle negativo e Pascolizumab foi incluído como um controle positivo para uma neutralização de IL-4 humano ou cinomolgo no bioensaio.
Além disso, o PascoH-474, PascoH- TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 e PascoHG4S-474 também foram testados pela neutralização de IL-4 humanos e cinomólogos nestes bioensaios.
O PascoH-474 GS removido e PascoH-TVAAPS-474 GS removido, neutralizaram totalmente a bioatividade tanto de IL-4 humanos quanto cinomólogos no bioensaio de célula TF-1. Além disso PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 e PascoH-G4S-474 também neutralizaram totalmente a bioatividade de IL-4 humano no bioensaio de célula TF-1. Os valores ND50 foram derivados com base nos dados obtidos de diversos experimentos diferentes.
O valor ND50 é uma de mAbdAb ou mAb ou dAb, que é capaz de neutralizar uma bioatividade de IL-13 ou IL-4 por 50 %. O valor ND50 médio, o desvio padrão (SD) e o número de vezes testados (n) são mostrados na tabela 29. Tabela 29 Valor ND50 médio & desvio padrão (nM) Molécula IL-13 humano cino IL-13 IL-4 humano cino IL-4 média (DP) n média (DP) n média (DP) n média (DP) n PascoH-474 GS 2,269 9 39,834 8 2,855 2 1.89 (0.325) 2 removido (0,763) (14,675) (1,464) PascoH-TVAAPS- 2,114 9 47,882 9 3,015 2 1.36 2 474 GS removido (0,766) (13,181) (2,015) (0.41) PascoH-ASTKGPT- 1,37 1 21,49 1 não realizado não realizado 474 2nd GS removido DOML0-53-474 1,035 4 10,495 4 não neutralizado não neutralizado (0,741) (6,958) dAb Controle não neutralizado não neutralizado não realizado não realizado Negativo Pascolizumab não neutralizado não neutralizado 1,36 (0,198) 2 2,615 2 (2,242)
O PascoH-474 GS removido, PascoH-TVAAPS-474 GS removido, e PascoHASTKGPT-474 2° GS removido, todos neutralizaram totalmente a bioatividade de IL-13 humano e cinomolgo no bioensaio de célula TF-1. Além disso, as potências de neutralização (valores ND50) de 5 PascoH-474 GS removido, PascoH-TVAAPS-474 GS removido, e PascoH- ASTKGPT-474 2° GS removido, por IL-13 humano foram similares e dentro do valor ND50 por dAb anti-IL-13 purificado sozinho (DOML0-53-474). O PascoH-474 GS removido e PascoH-TVAAPS-474 GS removido, ambos neutralizaram totalmente a bioatividade de IL-4 humanos e cinomólogos no bioensaio de célula TF-1. Além disso, as potências de neutralização (valores ND50) de PascoH-474 GS removido e PascoH- TVAAPS-474 GS removido, por IL-13 humano e cino IL-13 foram similar e dentro dos valores ND50 por Pascolizumab.
18.12 Capacidade de mAbdAbs para inibir a ligação de Ligação IL-13 humano a IL-13Ra2 humano As moléculas listadas na Tabela 30 foram testadas para a inibição de ligação IL-13 humano a IL-13Ra2 humano por ELISA, como descrito no método 22. Todas as moléculas foram testadas em um experimento. Os dados são mostrados na Figura 108. Todos os mAbdAbs testados inibiram a ligação de IL-13 humano a IL13Ra2 humano. O nível de inibição foi similar aqueles DOML0- 53-474, DOML0-53-616 e o anti-IL13 mAb. Pascolizumab e um dAb de controle negativo (com especificidade por um antígeno irrelevante), foram incluídos como controle negativo para a inibição de ligação IL-13 a IL13Ra2. Estes dados também foram usados para determinar os valores IC50 para cada molécula. O valor IC50 é uma concentração de mAbdAb ou mAb ou dAb, que é capaz de inibir a ligação de IL-13 humano a IL13Ra2 humano por 50 %. Os valores IC50 são mostrados na Tabela 30.
Tabela 30 Molécula IC50 (nM) PascoH-474 GS removido 9,58 PascoH-TVAAPS-474 GS removido 7,41 DOML0-53-474 7,61 PascoH-616 6,41 PascoH-TVAAPS-616 6,17 DOML0-53-616 5,76 Anti-IL13 mAb 6,43 Pascolizumab Nenhuma inibição na faixa de concentração testada dAb de controle negativo Nenhuma inibição na faixa de concentração testada Estes dados confirmam que PascoH-474 GS removido, PascoH-TVAAPS-474 GS removido, PascoH-616 e PascoH-TVAAPS-616 agem similarmente a DOML0-53-474, DOML0-53-616 e o anti-IL13 mAb. 5 Exemplo 19 mAbdAbs contendo o anti-IL13 DOML0-53-616 dAb
19.1 Construção de mAbdAbs contendo o anti-IL13 DOML0-53-616 dAb Dois anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs como apresentado na tabela 31 foram clonados a partir dos vetores existentes pela mutagênese direcionada ao local como descritos no exemplo 1. Tabela 31 Nome Descrição Sequência ID N° No. PascoH-616 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-DOML0-53-616 149 (= cadeia H) dAb 15 (= cadeia L) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab PascoH-TVAAPS- Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-TVAAPS- 150 (= cadeia H) 616 DOML0-53-616 dAb 15 (= cadeia L) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab
19.2 Expressão e purificação de mAbdAbs contendo o anti-IL13 DOML0-53-616 dAb Estes mAbdAbs foram expressados nas células HEK293-6E e células CHOE1a como descritos no exemplo 1.3. Os mAbdAbs foram purificados e analisados por SEC e SDS PAGE. Diversas preparações purificadas de PascoH-616 e PascoH-TVAAPS- 616 mAbdAbs foram feitas, os dados SEC e SDS PAGE mostrados na Figuras 109 (perfil SEC por PascoH-616), 110 (perfil SEC por PascoH-
TVAAPS_616), 111 (SDS PAGE por PascoH-616) e 112 (SDS PAGE por PascoH-TVAAPS-616), são representativos destas preparações.
19.3 Ligação de mAbdAbs a IL-13 humano em um ELISA de ligação direta 5 O PascoH-616 e PascoH-TVAAPS-616 purificado por mAb dAbs foram testados pela ligação a IL-13 humano em um ELISA de ligação direta (como descrito no método 1). Estes dados são mostrados na Figura 113. O PascoH-616 e PascoH-TVAAPS-616 purificado, ambos ligam-se ao IL-13 humano. O IL4 mAb anti-humano purificado sozinho (Pascolizumab) foi incluído neste ensaio como um controle negativo pela ligação a IL-13. O mAb IL13 anti-humano purificado foi incluído como um controle positivo para a ligação IL-13. Nota-se que o anti-IL-13 dAb sozinho (DOML0-53-616) não foi testado neste ensaio como o dAb não é detectado pelo anticorpo de detecção secundário; em vez de, o mAb IL13 anti-humano foi usado como um controle positivo para demonstrar a ligação IL-13 neste ensaio.
19.4 Análise Biacore para a ligação ao IL-4 humano e IL-13 humano Os mAbdAbs purificados foram testados pela ligação a IL-4 humano e IL-13 humano usando BIAcoreTM T100 a 25 °C (como descritos nos métodos 4 e 5). Estes dados são mostrados na Tabela 32. No experimento 1, um nível de captura mAbdAb de aproximadamente 600 unidades de resposta relativas foi atingido e seis curvas de concentração IL-13 e IL-4 (256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM, l nM e 0,25 nM) foram avaliados. Apenas uma curva de concentração IL-13 (256 nM) e IL-4 (256 nM) foi avaliada pelos mAbs no experimento 1. No experimento 2, um mAbdAb de nível de captura de aproximadamente 400 unidades de resposta relativas foi atingido e seis IL-4 (64 nM, 16 nM, 4 nM, l nM, 0,25 nM e 0,0625 nM) e seis curvas de concentração IL-13 (256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM e 0,25 nM) foram avaliados. No experimento 2, apenas uma da curva de concentração IL-13 (256 nM) foi avaliada por anti-IL13 mAb e cinco curvas de concentração IL-4 (64 nM, 16 nM, 4 nM, l nM e 0,25 nM) foram avaliados por Pascolizumab. Tabela 32 Molécula Afinidade de ligação, KD nM (material purificado) IL-4 humano IL-13 humano Experimento Experimento 2 Experimento 1 Experimento 2 PascoH-616 0,00172 Ligante muito firme 0,1137 0,15 PascoH-TVAAPS-616 0,003 0,005 0,0497 0,056 mAb IL-13 Anti-humano Não liga-se Não liga-se 0,2799 0,31 Pascolizumab 0,0137 0,011 Não liga-se Não liga-se 5 O PascoH-616 e PascoH-TVAAPS-616 que liga-se ao IL-4 com afinidades de ligação similares e este foi similar à afinidade de ligação do mAb IL4 anti-humano sozinho (Pascolizumab). O PascoH-616 e PascoH- TVAAPS-616 ambos ligam-se ao IL-13. Nota-se que o anti-IL-13 dAb sozinho (DOML0-53-616) não foi testado neste ensaio como o dAb não pode ser capturado na proteína A ou chip CM5 revestido por IgG anti-humano; em vez de, o mAb IL13 anti-humano foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-13 neste ensaio.
19.5 Análise Biacore para a ligação ao IL-13 cinomolgo Os mAbdAbs purificados também foram testados pela ligação um IL-13 cinomolgo usando BIAcoreTM T100 a 25 °C (como descrito no método e 30). Estes dados são mostrados na Tabela 33. Um nível de captura mAbdAb de aproximadamente 400 unidades de resposta relativas foi atingido e seis curvas de concentração IL-13 (256, 64, 16, 4, 1 e 0,25 nM) foram avaliados. Existe apenas uma curva de concentração IL-13 (256 nM) pelo anti-IL13 mAb. Tabela 33 Molécula (material Afinidade de ligação ao IL-13 de cinomolgo (KD) purificado) na taxa de (ka, Ms-1) fora de taxa (kd, s-1) KD (nM) PascoH-616 3,411E+5 1,842E-3 5,4 PascoH-TVAAPS-616 4,597E+5 4,514E-3 9,8 Anti-IL13 mAb 5,498E+5 6,549E-5 0,119 Pascolizumab não liga-se não liga-se não liga-se O PascoH-616 e PascoH-TVAAPS-616 ambos ligam-se ao IL- 13 cinomolgo com afinidades de ligação similares. Nota-se que o anti-IL-13 dAb sozinho (DOML0-53-616) não foi testado neste ensaio como o dAb não pode ser capturado na proteína A ou chip CM5 revestido por IgG anti- humano; em vez de, o mAb IL13 anti-humano foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-13 neste ensaio. 5 19.6 Neutralização de IL-13 humano e cinomolgo no bioensaio de célula TF-1 por mAbdAbs Os mAbdAbs purificados foram testados pela neutralização de IL-13 humano e IL-13 cinomolgo no bioensaio de célula TF-1 (como descrito no método 8 e método 20 respectivamente). Estas moléculas foram testados 3 vezes em cada ensaio e Figura 114 é um gráfico representativo que mostra o dado de neutralização por IL-13 humano.
Figura 114a é um gráfico representativo que mostra o dado de neutralização por cino IL-13. DOML0- 53-616 foi incluído como um controle positivo para uma neutralização de IL- 13 neste bioensaio.
Um dAb com especificidade por um antígeno irrelevante (dAb de controle negativo) também foi incluído como um controle negativo pela neutralização de IL-13 neste bioensaio.
O valor ND50 médio, o desvio padrão (SD) e o número de vezes testados (n) são mostrados na tabela 34. Tabela 34 Molécula Valor ND50 médio e desvio padrão (nM) IL-13 humano cino IL-13 Média (DP) n Média (DP) n PascoH-616 0,7956 3 9,23 3 (0,129) (1,422) PascoH-TVAAPS-616 0,722 3 14,477 3 (0,245) (2,847) DOML0-53-616 0,416 3 4,81 3 (0,144) (3,266) dAb de controle negativo não neutralisa não neutralisa
Tanto o PascoH-616 quanto PascoH-TVAAPS-616, bem como em adição o mAbdAbs PascoH-TVAAPS-474 GS removido e PascoH-474 GS removido neutralizaram totalmente a bioatividade de IL-13 humano e cinomolgo no bioensaio de célula TF-1. Além disso, as potências de neutralização (valores ND50) de
PascoH-616 e PascoHTVAAPS-616 por IL-13 humano foram similares e estão dentro de 2 vezes do valor ND50 pelo dAb anti-IL-13 purificado sozinho (DOML0-53-616). O PascoH-616 e PascoH-TVAAPS-616 também foram 5 testados para a inibição de Ligação IL-13 humano a IL-13Ra2 humano por ELISA, como descrito no método 22. Estes dados são apresentados no Exemplo 18.12 Exemplo 20 Capacidade de mAbdAbs para neutralizar IL-13 humano ou IL-4 em um bioensaio STAT6 fosfo sanguíneo total humano A capacidade de mAbdAbs para neutralizar IL-13 humano ou IL-4 em um bioensaio STAT6 fosfo sanguíneo total humano foi realizado como descrito no método 16. As potências de neutralização IL-4 ou IL-13 (isto é inibição de IL-4 ou bioatividade IL-13) de 2 construções mAbdAbs (o anti-IL13mAb- anti-IL4dAb purificado, 586H-TVAAPS-210; e o anti-IL4mAb-anti-IL13dAb purificado, PascoH-474 GS removido) foram determinados.
O anti-IL-4 humano mAb purificado (Pascolizumab) e anti-IL4 dAb purificado (DOM9- 112-210) foram incluídos como controles positivos pela neutralização de rhlL-4 neste ensaio.
O mAb IL-13 anti-humano purificado e dAb anti-IL-13 purificado (DOML0-53-474) foram incluídos como controles positivos pela neutralização de rhlL-13. Um mAb comparado por isótipo misturado com um dAb (ambos com especificidades pelos antígenos irrelevantes), foram incluídos como um controle negativo pela neutralização de rhlL-4 ou rhlL-13. Cada molécula foi testada pelo menos duas vezes, usando sangue de doadores diferentes.
As Figuras 115 a 124 são gráficos que mostram os dados representativos.
Os mAbdAbs purificados neutralizaram totalmente a bioatividade de rhlL-13 e rhlL-4.
Como descrito no método 16, a capacidade das moléculas de teste para neutralizar a bioatividade rhlL-13 ou rhlL-4 foi expressado como uma concentração das moléculas (por exemplo mAbdAbs) requerido para neutralizar 2ng/mL de IL-4 humano ou IL-13 humano por 50 % (IC50). Estes 5 dados são mostrados na Tabela 35. O meio IC50 combinado a partir de todos os doadores para cada molécula está presente, junto com o desvio padrão.
Tabela 35 Molécula Alvo no ensaio IC50 médio Número de doadores (desvio padrão) nM 586-TVAAPS-210 1 L-4 1,23 (0,6) 3 IL-13 2,68 (1,2) 3 PascoH-474 GS I L-4 7,95 (7,8) 3 removido IL-13 2,78 (0,7) 3 Anti-11-13 mAb IL-13 1,47 (0,4) 3 Pascolizumab IL-4 2,44 (1,2) 3 DOML0-53-474 IL-13 6,83 (2,2) 2 DOM9-112-210 I L-4 3,51 (0,8) 2 Controle negativo mAb --- Nenhuma inibição apresentada 4 Controle negativo dAb --- Nenhuma inibição apresentada 4
Em comparação com os valores IC50 que indicam que 586- TVAAPS-210 inibiu IL-13 e IL-4 induzido por pSTAT-6 similarmente o anti- IL13 mAb e DOM9-112-210 (nos ensaios sanguíneos totais IL-13 e IL-4 respectivamente). Em comparação com os dados IC50 também que indicam que PascoH-474 GS removido, inibiram IL-13 e IL-4 induzidos por pSTAT-6 similarmente a DOML0-53-474 e Pascolizumab (nos ensaios sanguíneos totais IL-13 e IL-4 respectivamente). O controle mAb mostrou nenhuma inibição até a concentração máxima testada de 661 nM em todos os doadores e o dAb de controle mostrou nenhuma neutralização até a concentração máxima testado de 2291 nM em todos os doadores.
Exemplo 21 Estudos PK de rato do anti-IL4 de alvejamento duplo/anti-IL13 mAbdAb PascoH-G4S-474, PascoL-G4S-474, 586H-TVAAPS-210 e 586H-TVAAPS-154 foram avaliados nos estudos PK de rato (como resumido na Tabela 35.1). De fato, ratos Sprague-Dawley machos (aproximadamente 200 gramas a 220 gramas em peso) foram dados uma administração intravenosa simples (i/v) de mAbdAb em um nível de dosagem alvo de 2mg/kg.
O período de tempo dividido (0 horas através de 312 horas) 100 µl de amostras sanguíneas foram retiradas e processadas por plasma.
As amostras de plasma de rato foram avaliadas ela presença da molécula de teste 5 em um ensaio de detecção humano IgG, e/ou um ensaio de ligação do ligando IL-13, e/ou um ensaio de ligação de ligando IL-14. Além disso, o perfil PK em plasma por Pascolizumab (em rato) também foi avaliado: neste caso como amostras de plasma de rato foram avaliados pela presença de Pascolizumab em um ensaio de detecção humano IgG e um ensaio de ligação de ligando IL-14. No primeiro estudo, o pascolizumab foi dado a 4 ratos.
Em um segundo estudo, existem quatro grupo de tratamentos (2 mg/kg PascoH-G4S- 474, 2 mg/kg PascoL-G4S-474, 2 mg/kg 586H-TVAAPS-210 e 2 mg/kg 586H-TVAAPS-154), com 4 ratos em cada grupo.
Os parâmetros PK (mostrado na Tabela 35.1) foram derivadas de dados de perfil no período de concentração de plasma (que não são mostrados). Nota-se que, algumas amostras de plasma foram analisadas mais do que uma vez nestes ensaios e os parâmetros PK na Tabela 35.1 foram derivados de apenas um destes dados.
Também nota-se que os parâmetros PK foram normalizados pela dosagem animal individual, em vez de dosagens nominais de 2mg/kg foram adotados.
Nota-se que algumas dificuldades técnicas foram encontradas com o ensaio IgG PK por PascoH-G4S-474 visto que as concentrações podem ser super estimadas.
Além disso, a análise dos perfis do período de concentração de plasma IgG foi realizado duas vezes em alguns casos (na análise 1 e análise 2, como notado na Tabela 35.1). A análise do dado de perfil do período de concentração de plasma gerado a partir de IL- 13 e ensaios PK de ligação de ligando IL-4 foi apenas realizado na análise 2. O dado de perfil do período de concentração de plasma gerado a partir de IL- 13 e ensaios de ligação de ligando IL-4 por PascoL-G4S-474 e 586H-
TVAAPS-154 não foram usados para derivar os parâmetros PK para estas moléculas.
Tabela 35.1 AUC Tempo médio Molécula Ensaio Análise T1/2 Cmax Liberação AUC (último) (extrap) de residência PascoH-G4S-474 IgG 1 129 60950 3430345 18,7 0,49 83 I L-4 2 117 21975 1231243 17,2 1,42 83 IL-13 2 87 22050 1328651 13,2 1,36 85 586H- IgG 1 134 42400 1932615 21,9 0,81 88 TVAAPS-210 IgG 2 92 42400 2215579 16,1 0,76 82 IL-4 2 60 41350 1674740 20,9 1,08 77 IL-13 2 101 31125 1515155 16,0 1,13 83 Pascolizumab IgG 1 188 45150 3528174 31,9 0,39 110 IgG 2 193 45150 3496503 34,9 0,38 109 I L-4 2 136 42825 2590114 30,6 0,54 110 PascoL-G4S-474 IgG 1 69 42550 2539978 6,8 0,75 87 586H-TVAAPS-154 IgG 1 166 43900 3315164 41,7 0,36 93
Os dados de perfil do período de concentração de plasma, 5 gerados nos ensaios IL-13 e IL-4 por PascoH-G4S-474 (e parâmetros PK derivados subsequentes), tende-se a ser comparáveis; este também foi o caso para os dados de perfil do período de concentração de plasma gerados nos ensaios IL-13, IL-4 e IgG PK por 586H-TVAAPS-210 (e parâmetros PK derivados subsequente). Este sugere que este mAbdAbs estavam ‘intactos’ no plasma do rato por toda parte do curso do estudo.
Os parâmetros PK derivados por 586H-TVAAPS-154 parecem ser mais similares aos parâmetros PK derivados por Pascolizumab do que qualquer outros mAbdAbs.
Exemplo 22 Estudos Cino PK Os estudos PK foram realizados em macacos cinomólogos.
Os animais foram dados em uma administração intravenosa simples em um nível de dosagem alvo de 1 mg/kg.
O período de tempo dividido, 500 µl de amostras sanguíneas foram retiradas e processadas por plasma.
As amostras de plasma de cinomolgo foram então avaliados pela presença da molécula testada em um ensaio de ligação do ligando IL-13, um ensaio de ligação de ligando IL-14 e um ensaio de ligação em ponte IL-13/IL-4. Os dados preliminares a partir destes estudos com os mAbdAbs 'PascoH-474 GS removido' e ‘586H-TVAAPS-210’ são consistentes com os dados PK de rato mostrados acima e que indicam que estas moléculas são limpas a partir de circulação sistêmica mais rapidamente do que um mAb mas menos rapidamente do que um dAb. Exemplo 23 5 23.1 Geração de anti-EGFR de alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb Este mAbdAb de alvejamento duplo foi construído pela fusão de um dAb ao terminal C da cadeia pesada mAb. O cassete de expressão da cadeia pesada e leve anti-EGFR mAb foram previamente construídos. Os locais de restrição que foram usados para a clonagem são os mesmos como aqueles apresentados no Exemplo 10 (Sall e Hindlll). O DNA que codifica um anti-VEGF dAb (DOML5-26-593) foi então amplificado por PCR (usando iniciadores que codificam os finais Sall e Hindlll) e inseridos na região codificadora da extremidade 3’ modificada, resultando em um ligante de 'STG' (serina, treonina, glicina) entre o mAb e o dAb. Os clones que verificam a sequência (SEQ ID N°: 164 e 243) para as cadeias pesadas e leves respectivamente) foram selecionados e por ampla escala das preparações de DNA foram feitas usando kit Qiagen Mega Prep seguindo os protocolos dos fabricantes. Os mAbdAbs foram expressados nas células de mamíferos HEK293-6E usando técnicas de transfecção transitórias pela cotransfecção das cadeias pesadas e leves (SEQ ID N°: 165 e 137).
23.2 Purificação e análise SEC do anti-EGFR de alvejamento duplo/anti- VEGF mAbdAb Este mAbdAb de alvejamento duplo foi purificado a partir do sobrenadante de expressão clarificado usando cromatografia de afinidade de proteína A de acordo com os protocolos estabelecidos. As concentrações das amostras purificadas foram determinadas pela espectrofotometria a partir de medições da absorbância de luz a 280nm. Análise SDS-PAGE (Figura 128)
da amostra purificada (nomeado DMS4010) mostra nenhuma realização da amostra a ~170kDa enquanto a amostra reduzida mostra duas faixas que funcionam em ~25 e ~ 60kDa correspondente a cadeia leve e cadeia pesada dAb fundida respectivamente. 5 Para a análise de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) o anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb foi aplicado em uma coluna S-200 10/300 GL (ligado a um sistema HPLC) pré-equilibrado e realizado em PBS a 1 ml/min. O perfil SEC mostra um funcionamento de espécie simples em um pico assimétrico (Figura 129).
23.3 Potência de anti-EGFR alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb A capacidade da molécula para neutralizar VEGF e EGFR foram determinada como descritos nos métodos 12 e 13 respectivamente. Os dados do ensaio foram analisados usando GraphPad Prism. Os valores de potência foram determinados usando a curva de resposta de dosagem sigmoidal e os dados ajustados usando o melhor modelo de ajuste. A potência Anti-EGFR (Figura 130) deste mAbdAb (nomeado DMS4010) foi calculada ser 4,784nM enquanto o controle, um anti-EGFR mAb dá um valor EC50 de 4,214nM. No ensaio de ligação do receptor anti-VEGF (Figura 131) o EC50 do mAbdAb (nomeado DMS4010) foi 58pM (0,058nM) enquanto um mAb de controle anti-VEGF produziu um EC50 de 214.1 pM (0,2141 nM). Finalmente, os dados do ensaio mostrou que a construção do exemplo 23, um anti-EGFRde alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb é potente contra os ambos antígenos.
23.4 PK do anti-EGFR alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb. O perfil farmacocinético do anti-EGFR alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb (nomeado DMS4010) foi determinado após a administração aos macacos cinomolgos. O composto foi administrado em uma dosagem de 5mg/kg i.v. e os níveis de soro do medicamento nos períodos de tempo múltiplos da pós-administração foi determinada pela ligação de tanto EGFR quanto VEGF nos ensaios separados de ELISA. A Figura 132 mostra os resultados para este ensaio em que os dados foram comparados com os dados históricos que foram gerados pelos mAbs cetuximab (anti-EGFR) e bevacizumab (anti-VEGF). Os detalhes adicionais 5 são mostrados na tabela 36. Tabela 36 Vida % de AUC Antígeno Média Cmax AUC (0-inf) Liberação extrapolado (h) (ug/mL) (h*ug/mL) (mL/h/kg) cetuximab EGFR 43,6 151,4 5684,3 0,9 18,4 bevacizumab VEGF 238,7 167,4 24201,9 0,2 13,4 DMS4010 EGFR 7,5 89,7 623,2 8,1 5,2 DMS4010 VEGF 6,7 125,5 733,8 7 7,2
23.5 Geração de um anti-EGFR alternativo/anti-VEGF mAbdAb Um anti-EGFR alternativo/anti-VEGF mAbdAb foi construído em uma maneira similar aquela descrita acima no Exemplo 11.1, usando o mesmo anti-EGFR mAb ligado a um VEGF dAb no terminal C da cadeia pesada usando um ligante STG. O anti-VEGF dAb usada neste caso foi DOML5-10-11. Esta molécula foi expressada em células de mamífero HEK293-6E usando técnicas de transfecção transitórias pela cotransfecção das cadeias pesadas e leves (SEQ ID N°: 165 e 186), entretanto significantemente os níveis reduzidos da expressão foram atingidos em comparação à expressão da molécula descrita no Exemplo 23.2. Quando testado para a potência no mesmo ensaio VEGF como descrito no Exemplo
23.3 foi observado ter níveis não detectáveis de inibição de ligação VEGF ao receptor VEGF neste ensaio. Exemplo 24
24.1 Geração de um anti-EGFR alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb com nenhum ligante Um derivado do mAbdAb descrito acima no Exemplo 23 foi feito com o ligante ‘STG’ entre o dAb e o domínio CH3 do mAb foi removido. O SDM foi usado para anular os resíduos que codificam um ligante STG a partir do plasmídeo que codifica a cadeia pesada. Os clones que verificam a sequência para as cadeias pesadas e leves (SEQ ID N°: 243 e SEQ ID N°: 174) respectivamente foram selecionados e por ampla escala das preparações de DNA foram feitas usando kit Qiagen Mega Prep seguindo os protocolos dos fabricantes. Os mAbdAbs foram expressados nas células de 5 mamíferos HEK293-6E usando técnicas de transfecção transitórias pela cotransfecção das cadeias pesadas e leves (SEQ ID N°: 175 e 137).
24.2 Purificação e análise SEC do anti-EGFR alvejamento duplo/anti- VEGF mAbdAb com nenhum ligante Este mAbdAb de alvejamento duplo foi purificado a partir do sobrenadante de expressão clarificado usando cromatografia de afinidade de proteína A de acordo com os protocolos estabelecidos. As concentrações de amostras purificadas foram determinada pela espectrofotometria a partir de medições da absorbância de luz a 280nm. Análise SDS-PAGE (Figura 133) da amostra purificada (nomeado DMS4011) mostra nenhuma realização da amostra a ~170kDa enquanto a amostra reduzida mostra duas faixas que funcionam em ~25 e ~60kDa correspondente a cadeia leve e cadeia pesada dAb fundida respectivamente. Para a análise de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) o anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb foi aplicado em uma coluna S-200 10/300 GL (ligado a um sistema HPLC) pré-equilibrado e realizado em PBS a 1 ml/min. O perfil SEC mostra um funcionamento de espécie simples em um pico assimétrico (Figura 134).
24.3 Potência de anti-EGFR de alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb com nenhum ligante A capacidade da molécula neutralizar VEGF e EGFR foi determinada como descrito nos métodos 12 e 13 respectivamente. Os dados do ensaio foram analisados usando GraphPad Prism. Os valores de potência foram determinados usando uma curva de resposta de dosagem sigmoidal e os dados ajustados usando o melhor modelo de ajuste. A potência anti-EGFR
(Figura 135) deste mAbdAb (nomeado DMS4011) foi calculada ser 3,529nM enquanto o controle, um mAb anti-EGFR dá um valor EC50 de 3,647nM. No ensaio de ligação do receptor anti-VEGF (Figura 136) o EC50 do mAbdAb (nomeado DMS4011) foi de 342,9 pM (0,3429 nM) enquanto um controle 5 anti-VEGF mAb produziu um EC50 de 214,1pM (0,2141 nM). Finalmente, os dados do ensaio mostraram que a construção do exemplo 24, um anti-EGFR alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb com nenhum ligante é potente contra os ambos antígenos. Exemplo 25
25.1 Geração de um anti-EGFR alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb com ligantes mais longos Os derivados do mAbdAb descritos acima no Exemplo 23 foram feitas onde o ligante entre o dAb e o domínio CH3 do mAb foi alongado pela inserção de uma ou duas repetições de um motivo “GGGGS” flexível no plasmídeo que codifica a cadeia pesada. A primeira molécula com a sequência de cadeia pesada como apresentado nas SEQ ID N°: 175 tem uma repetição deste motivo, visto que tem um ligante de 'STGGGGGS'. A segunda molécula com a sequência de cadeia pesada como apresentado nas SEQ ID N°: 177 tem duas repetições deste motivo, visto ter um ligante de 'STGGGGGSGGGGS'. Estes foram ambos independentemente formados pares com a mesma cadeia leve como usado no Exemplo 23 (SEQ ID N°: 243) Os clones que verificam a sequência para as cadeias pesadas e leves foram selecionados e por ampla escala das preparações de DNA foram feitas usando kit Qiagen Mega Prep seguindo os protocolos dos fabricantes. Os mAbdAbs foram expressados nas células de mamíferos HEK293-6E usando técnicas de transfecção transitórias pela cotransfecção das cadeias pesadas e leves (SEQ ID N°: 176 e 137 que é nomeado DMS4023; e SEQ ID
N°: 178 e 137 que é nomeado DMS4024).
25.2 Purificação e análise SEC do anti-EGFR alvejamento duplo/anti- VEGF mAbdAb com ligantes mais longos Este mAbdAbs de alvejamento duplo foram purificados a 5 partir de sobrenadantes de expressão clarificados usando cromatografia de afinidade de proteína A de acordo com os protocolos estabelecidos. As concentrações de amostras purificadas foram determinada pela espectrofotometria a partir de medições da absorbância de luz a 280nm. Análise SDS-PAGE das amostras purificadas DMS4023 e DMS4024 (Figura 137) mostram as amostras não reduzidas realizadas a ~170kDa enquanto as amostras reduzidas mostram duas faixas realizadas a ~25 e ~60kDa correspondente a cadeia leve e cadeia pesada dAb fundida respectivamente. Para a análise de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) o anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb foi aplicado em uma coluna S-200 10/300 GL (ligado a um sistema HPLC) pré-equilibrado e realizado em PBS a 1 ml/min. O perfil SEC por ambos DMS4023 (Figura 138) e DMS4024 (Figura 139) mostram uma espécie simples com um pico que diminui levemente.
25.3 Potência de anti-EGFR alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb com ligantes mais longos A capacidade da molécula neutraliza VEGF e EGFR e foram determinadas como descritos nos métodos 12 e 13 respectivamente. Os dados do ensaio foram analisados usando GraphPad Prism. Os valores de potência foram determinados usando a curva de resposta de dosagem sigmoidal e os dados ajustados usando o melhor modelo de ajuste. A potência anti-EGFR (Figura 140) do mAbdAb DMS4023 foi calculada ser 7,066 nM e a potência de mAbdAb DMS4024 foi calculada ser 6,420 nM enquanto o controle, um anti-EGFR mAb dá um valor EC50 de 7,291 nM. No ensaio de ligação do receptor anti-VEGF (Figura 141) o EC50 do mAbdAb DMS4023 foi de 91,79 pM (0,091 nM) e o EC50 do mAbdAb DMS4024 foi de 90 pM (0,0906 nM) enquanto um controle anti-VEGF mAb produziu um EC50 de 463,2 pM (0,4632 nM). Finalmente, os dados do ensaio mostraram que as construções do exemplo 25, anti-EGFR alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAbs com 5 ligantes mais longos são potentes contra ambos antígenos. Exemplo 26
26.1 Geração de um anti-VEGF de alvejamento duplo/mAbdAb anti-
EGFR Este mAbdAb de alvejamento duplo foi construído pela fusão de um dAb ao terminal C da cadeia pesada mAb. O cassete de expressão da cadeia pesada e leve anti-VEGF mAb foi previamente construído. Os locais de restrição que foram usados para a clonagem são os mesmos como aqueles apresentados no Exemplo 10 (Sall e Hindlll). O DNA que codifica um anti-EGFR dAb (DOML6-39-542) foi então amplificado por PCR (usando iniciadores que codificam os finais Sall e Hindlll) e inseridos na região codificadora da extremidade 3’ modificada, resultando em um ligante de 'STG' (serina, treonina, glicina) entre o mAb e o dAb. Os clones que verificam a sequência (SEQ ID N°: 179 e 181) para as cadeias pesadas e leves respectivamente) foram selecionados e por ampla escala das preparações de DNA foram feitas usando kit Qiagen Mega Prep seguindo os protocolos dos fabricantes. mAbdAbs foram expressados nas células de mamíferos HEK293-6E usando técnicas de transfecção transitórias pela cotransfecção das cadeias pesadas e leves (SEQ ID N°: 180 e 182).
26.2 Purificação e análise SEC de anti-VEGF de alvejamento duplo/mAbdAb anti-EGFR Este mAbdAbs de alvejamento duplo foram purificadas a partir de sobrenadante de expressão clarificado usando cromatografia de afinidade de proteína A de acordo com os protocolos estabelecidos. As concentrações de amostras purificadas foram determinada pela espectrofotometria a partir de medições da absorbância de luz a 280nm. Análise SDS-PAGE da amostra purificada (nomeado DMS4009) (Figura 142) 5 mostra as amostras não reduzidas realizadas a ~170kDa enquanto as amostras reduzidas mostram duas faixas realizadas a ~25 e ~60 kDa correspondente a cadeia leve e cadeia pesada dAb fundida respectivamente. Para a análise de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) o anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb foi aplicado em uma coluna S-200 10/300 GL (ligado a um sistema HPLC) pré-equilibrado e realizado em PBS a 1 ml/min. O perfil SEC para esta molécula (Figura 143) mostra uma espécie simples com um pico simétrico.
26.3 Potência de anti-VEGF de alvejamento duplo/mAbdAb anti-EGFR A capacidade da molécula para neutralizar VEGF e EGFR foi determinada como descrito nos métodos 12 e 13 respectivamente. Os dados do ensaio foram analisados usando GraphPad Prism. Os valores de potência foram determinados usando a curva de resposta de dosagem sigmoidal e os dados ajustados usando o melhor modelo de ajuste. A potência anti-EGFR (Figura 144) do mAbdAb DMS4009 foi calculada ser 132,4nM enquanto o controle, um mAb anti-EGFR dá um valor EC50 de 6,585nM. No ensaio de ligação do receptor anti-VEGF (Figura 145) o EC50 do mAbdAb foi de 539,7pM (0,5397nM) enquanto um mAb de controle anti-VEGF produziu um EC50 de 380,5pM (0,3805nM). Finalmente, os dados do ensaio mostrou que a construção do exemplo 26, um anti-VEGF de alvejamento duplo/mAbdAb anti-EGFR é potente contra os ambos antígenos. Exemplo 27
27.1 Geração de um anti-EGFR alvejamento duplo/anti-IL-13 mAbdAb Este mAbdAb de alvejamento duplo foi construído pela fusão de um dAb ao terminal C da cadeia pesada mAb. O cassete de expressão da cadeia pesada e leve anti-EGFR mAb foi previamente construído. Os locais de restrição que foram usados para a clonagem são os mesmos como aqueles apresentados no Exemplo 10 (Sall e Hindlll). O DNA que codifica um anti-IL-13 dAb (DOML0-53-474) foi 5 então amplificado por PCR (usando iniciadores que codificam os finais Sall e Hindlll) e inseridos na região codificadora da extremidade 3’ modificada, resultando em um ligante de 'STG' (serina, treonina, glicina) entre o mAb e o dAb. Os clones que verificam a sequência (SEQ ID N°: 243 e 183) para as cadeias pesadas e leves respectivamente) foram selecionados e por ampla escala das preparações de DNA foram feitas usando kit Qiagen Mega Prep seguindo os protocolos dos fabricantes. mAbdAbs foram expressados nas células de mamíferos HEK293-6E usando técnicas de transfecção transitórias pela cotransfecção das cadeias pesadas e leves (SEQ ID N°: 137 e 184).
27.2 Purificação e análise SEC do anti-EGFR alvejamento duplo/anti-IL- 13 mAbdAb Este mAbdAbs de alvejamento duplo foram purificadas a partir do sobrenadante de expressão clarificado usando cromatografia de afinidade de proteína A de acordo com os protocolos estabelecidos. As concentrações de amostras purificadas foram determinada pela espectrofotometria das medições da absorbância de luz a 280nm. Análise SDS-PAGE da amostra purificada (nomeado DMS4029) (Figura 146) mostram as amostras não reduzidas realizadas a ~170kDa enquanto as amostras reduzidas mostram duas faixas realizadas a ~25 e ~60kDa correspondente a cadeia leve e cadeia pesada dAb fundida respectivamente. Para a análise de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) o anti-EGFR/anti-IL-13 mAbdAb foi aplicado em uma coluna S-200 10/300 GL (ligado a um sistema HPLC) pré-equilibrado e realizado em PBS a
0,5ml/min. O perfil SEC para esta molécula (Figura 147) mostra uma espécie simples com um pico simétrico.
27.3 Potência do anti-EGFR alvejamento duplo/anti-IL-13 mAbdAb A capacidade da molécula para neutralizar EGFR e IL-13 foi 5 determinada como descrito nos métodos 13 e 25 respectivamente. Os dados do ensaio foram analisados usando GraphPad Prism. Os valores de potência foram determinados usando a curva de resposta de dosagem sigmoidal e os dados ajustados usando o melhor modelo de ajuste. A potência anti-EGFR (Figura 148) do mAbdAb DMS4029 foi calculada ser 9,033nM enquanto o controle, um mAb anti-EGFR dá um valor EC50 de 8,874nM. No ensaio de neutralização com base celular IL-13 (Figura 149) o EC50 do mAbdAb foi de 1,654nM enquanto um controle anti-IL-13 dAb produziu um EC50 de 0,996nM. Finalmente, os dados do ensaio mostraram que a construção do exemplo 27, um anti-EGFR alvejamento duplo/anti-IL-13 mAbdAb é potente contra os ambos antígenos. Exemplo 28
28.1 Geração de um anti-EGFR alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAbs onde o dAb é localizado na cadeia leve Os anti-EGFR alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAbs foram construídos pela fusão de um dAb ao terminal C da cadeia leve mAb. O cassete de expressão da cadeia pesada e leve anti-EGFR mAb foram previamente construídos. Para introduzir os locais de restrição para inserção dAb na cadeia leve, mutagênese direcionada ao local foi usada para criar os local de clonagem BamHl e Hindlll usando um vetor de expressão de cadeia leve mAb como um modelo. O DNA que codifica um anti-VEGF dAb (DOML5-26- 593) foi então amplificado por PCR (usando iniciadores que codificam as extremidades BamHl e Hindlll) e inseridos na região codificadora da extremidade 3’ modificada, resultando em um ligante de ‘GSTG’ ou
‘GSTVAAPS’ entre o mAb e o dAb. A primeira molécula com uma sequência de cadeia leve como apresentado nas SEQ ID N°: 187 tem um ligante de ‘GSTG’. A segunda molécula com a sequência de cadeia leve como 5 apresentado nas SEQ ID N°: 189 tem um ligante de ‘GSTVAAPS’. Estes ambos foram independentemente formados pares com a cadeia pesada da SEQ ID N°: 245. Os clones que verificam a sequência para as cadeias pesadas e leves foram selecionados e por ampla escala das preparações de DNA foram feitas usando kit Qiagen Mega Prep seguindo os protocolos dos fabricantes. Os mAbdAbs foram expressados nas células de mamíferos HEK293-6E usando técnicas de transfecção transitórias pela cotransfecção das cadeias pesadas e leves (SEQ ID N°: 188 e 139 que é nomeado DMS4013; e SEQ ID N°: 190 e 139 que é nomeado DMS4027).
28.2 Purificação e análise SEC do anti-EGFR alvejamento duplo/anti- VEGF mAbdAbs onde o dAb é localizado na cadeia leve Este mAbdAbs de alvejamento duplo foram purificadas a partir do sobrenadante de expressão clarificado usando cromatografia de afinidade de proteína A de acordo com os protocolos estabelecidos. As concentrações de amostras purificadas foram determinada pela espectrofotometria a partir de medições da absorbância de luz a 280nm. Análise SDS-PAGE das amostras purificadas DMS4013 e DMS4027 (Figura 150) mostram as amostras não reduzidas realizadas a ~170kDa enquanto as amostras reduzidas mostram duas faixas realizadas a ~38 e ~50kDa correspondente uma cadeia leve fundida ao dAb e cadeia pesada respectivamente. Para a análise de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) o anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb foi aplicado em uma coluna S-200 10/300 GL (ligado a um sistema HPLC) pré-equilibrado e realizado em PBS a
1 ml/min. O perfil SEC para ambos DMS4013 (Figura 151) e DMS4027 (Figura 152) mostra uma espécie simples com um pico simétrico.
28.3 Potência do anti-EGFR alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAbs onde o dAb é localizado na cadeia leve 5 A capacidade da molécula para neutralizar VEGF e EGFR foi determinada como descrito nos métodos 12 e 13 respectivamente. Os dados do ensaio foram analisados usando GraphPad Prism. Os valores de potência foram determinados usando a curva de resposta de dosagem sigmoidal e os dados ajustados usando o melhor modelo de ajuste. A potência anti-EGFR (Figura 153) do mAbdAb DMS4013 foi calculada ser 7,384nM e a potência de mAbdAb DMS4027 foi calculada ser 7,554nM enquanto o controle, um mAb anti-EGFR dá um valor EC50 de 7,093nM. No ensaio de ligação do receptor anti-VEGF (Figura 154) o EC50 do mAbdAb DMS4013 foi de 1,179nM e o EC50 do mAbdAb DMS4027 foi 0,1731nM enquanto um mAb de controle anti-VEGF produziu um EC50 de 0,130nM. Finalmente, os dados do ensaio mostram que as construções do exemplo 28, anti-EGFR alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAbs onde o dAb é localizado na cadeia leve são potentes contra ambos antígenos. Exemplo 29 Análise Biacore de anti-EGFR alvejamento duplo/anti-VEGF e anti- TNF/anti-VEGF mAbdAbs Os mAbdAbs descritos no exemplo 11 (anti-TNF/anti-VEGF mAbdAb) e exemplos 23, 24, 25 e 28 (anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAbs) foram submetidos a análise BIAcore para determinar associação cinética e constantes de dissociação pela ligação aos seus antígenos correspondentes. A análise foi realizada em instrumento BIAcoreTM 3000. A temperatura do instrumento foi apresentada a 25 °C. o tampão HBS-EP foi usado como tampão de realização. Os dados experimentais foram coletados na taxa mais alta possível pelo instrumento. Uma célula de fluxo em um chip CM5 de grau de busca foi revestido com a proteína A usando química de ligação de amina padrão de acordo com as instruções do fabricante e uma segunda célula de fluxo foi tratada igualmente mas o tampão foi usado em vez da proteína A para gerar uma superfície de referência.
Uma célula de fluxo revestida com 5 proteína A foi então usada para capturar mAbdAbs.
O antígeno foi injetado como uma série 2x as diluições em séries como detalhadas na tabela 37. Diversas diluições foram realizadas em cópias.
As injeções de tampão sozinho em vez do ligando foram usadas pela subtração do fundamento.
As amostras foram injetadas em aleatório a fim de usar os cinéticos Wizard inerentes ao software de instrumento.
A superfície foi regenerada na extremidade de cada ciclo pela injeção de 10 mM de Glicina, pH 1.5. Tanto o processamento de dados e ajuste cinético foram realizados usando BIAsoftware de avaliação 4.1. Os dados mostraram as médias de resultados duplicados (a partir da mesma realização) é mostrada na Tabela 37. Os valore múltiplos mostraram para DMS4010 que representam dois experimentos que realizam-se em ocasiões separadas.
O valor de 787nM provavelmente superestima a afinidade devido as concentrações do ligando analisado Tabela 37 Exemplo de Número da Antígeno Ka [1/Ms] Kd [1/s] KD Concentração # mAbdAb Molécula [pM] superior (nM) diluições 11 4000 TNF 3,65E+05 4,16E-05 112 10 6 23 4010 EGFR 1,47E+06 1,16E-03 787 1,25 5 23 4010 EGFR 3,14E+05 1,16E-03 3700 10 6 24 4011 EGFR 1,81 E+05 1,11 E-03 6120 5 6 28 4013 EGFR 2,20E+05 1,17E-03 5310 20 5 28 4013 EGFR 3,01 E+05 1,40E-03 4650 10 7 25 4023 EGFR 2,38E+05 1,10E-03 4630 5 7 25 4024 EGFR 2,34E+05 1,10E-03 4700 10 6 28 4027 EGFR 2,80E+05 1,14E-03 4060 20 7 11 4000 VEGF 9,19E+05 4,78E-04 520 2,5 5 23 4010 VEGF 9,85E+05 1,90E-04 193 10 8 24 4011 VEGF 6,17E+05 1,26E-04 204 10 8 28 4013 VEGF 7,62E+05 3,64E-04 478 2 5 25 4023 VEGF 1,60E+06 2,40E-04 150 2 6 25 4024 VEGF 1,01 E+06 2,30E-04 224 2 4 28 4027 VEGF 7,47E+05 2,23E-04 229 2 5
Exemplo 30 Anticorpos triespecíficos que compreendem os anticorpos de domínio simples fundidos nas estruturas biespecíficas de anticorpos
30.1 Construção Os genes que codificam domínios variáveis leves e pesados de uma molécula de anticorpo biespecífico que tem a especificidade por IL-18 e IL-12 antígenos (para informação adicional ver WO 2007/024715) foram 5 construídos de novo com locais de enzima de restrição apropriado e sequência de sinal adicionada. Usando técnicas de biologia molecular padrão, os domínios variáveis pesados foram clonados em um vetor de expressão contendo a região constante de cadeia pesada IgG1 fundida a um domínio de anticorpo anti-IL4 DOM9-112-210 (SEQ ID N°: 4) por intermédio de um ligante TVAAPS no terminal c da região constante. O domínio variável de cadeia leve foi similarmente clonado em um vetor de expressão contendo a sequência de região constante Ck. Os anticorpos construídos e expressados são listados na Tabela 38. Tabela 38 ID do anticorpo Descrição SED ID N°: da sequência de aminoácido BPC1616 IL-12/18 DVDH TVAAPS-210 cadeia pesada 193 IL-12/18 DVD Capa cadeia leve 194
30.2 expressão e purificação Brevemente, 25 ml de células HEK293 a 1,5x106 células/ml foram cotransfectadas com os plasmídeos de expressão de cadeia pesada e leve previamente incubados com 293 reagentes de fectina (Invitrogen # 51- 0031). Estes foram colocados em um incubador de agitação a 37 °C, 5 % de CO2 e 95 % de RH. Após 24 horas o meio de alimentação de triptona foi adicionado e as células desenvolvidas por 48 horas adicionais. O sobrenadante foi coletado pela centrifugação e os níveis IgG quantificados por ELISA. O mAbdAb resultante foi nomeado BPC1616 (SEQ ID N°: 193 e 194)
30.3 IL-12 ELISA de ligação O sobrenadante celular a partir das transfecções foram avaliados pela ligação de um IL-12 humano recombinante. Brevemente, as placas de ELISA revestidas com anti-IL-12 humano (Sistemas R&D
AF219NA) a 2 pg/ml e bloqueada com solução de bloqueamento (4 % de BSA em solução salina tamponada com Tris). As placas foram então carregadas com 25 ng/ml de IL-12 humano recombinante (PeproTech #200- 12) na solução de bloqueamento. A placa foi incubada por 1 hora em 5 temperatura ambiente antes da lavagem em TBS + 0,05 % de Tween 20 (TBST). Várias diluições do sobrenadante celular foram adicionados bem como anticorpos de controle irrelevantes (Pascolizumab e um hIgG de controle comparado ao isótipo) diluído na solução de bloqueamento. A placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem em TBST. A ligação foi detectada pela adição de um anticorpo de cadeia leve de capa anti-humano rotulado por peroxidase (Sigma A7164) em uma diluição de 1/1000 na solução de bloqueamento. A placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem em TBST. A placa foi desenvolvida pela adição de substrato OPD (Sigma P9187) e de desenvolvimento da cor interrompida pela adição de 3M H2SO4. A absorbância foi medida a 490 nm com um leitor de placa e o meio de absorbância plotado. Os resultados são apresentados na Figura 155 e mostram que BPC1616 liga-se ao IL-12 humano recombinante considerando os dois anticorpos de controle não mostrados na ligação.
30.4 ligação IL18 ELISA Os sobrenadantes de célula a partir das transfecções foram avaliados pela ligação a IL-18 humano recombinante. Brevemente, as placas de ELISA foram revestidas com IL-18 humano (fabricadas a GSK) a 1 pg/ml e bloqueada com solução de bloqueamento (4 % de BSA em solução salina tamponada com Tris). Várias diluições do sobrenadante celular foram adicionados bem como anticorpos irrelevantes (Pascolizumab e um IgG humano controle comparado ao isótipo), diluído na solução de bloqueamento. A placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem em TBS + 0,05 % de Tween 20 (TBST). A ligação foi detectada pela adição de um anticorpo de cadeia leve de capa anti-humano rotulado por peroxidase (Sigma A7164) em uma diluição de 1/1000 na solução de bloqueamento. A placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem em TBST. A placa foi desenvolvida pela adição de substrato OPD (Sigma P9187) 5 e de desenvolvimento da cor interrompida pela adição de 3M H2SO4. A absorbância foi medida a 490 nm com um leitor de placa e o meio de absorbância plotado. Os resultados são apresentados na Figura 156 e mostram que BPC1616 liga-se ao IL-18 humano recombinante considerando os dois anticorpos de controle não mostrados na ligação.
30.5 ELISA de ligação IL-4 Os sobrenadantes de célula a partir das transfecções foram avaliados pela ligação a IL-4 humano recombinante. Brevemente, as placas de ELISA foram revestidas com IL-4 humano (fabricado em GSK) a 1 pg/ml e bloqueada com solução de bloqueamento (4 % de BSA em solução salina tamponada com Tris). Várias diluições do sobrenadante celular foram adicionados bem como um anti IL-4 anticorpo monoclonal (Pascolizumab) e anticorpo irrelevante (hIgG de controle comparado ao isótipo,), diluído na solução de bloqueamento. A placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem em TBS + 0,05 % de Tween 20 (TBST). A ligação foi detectada pela adição de um anticorpo de cadeia leve de capa anti-humano rotulado por peroxidase (Sigma A7164) em uma diluição de 1/1000 na solução de bloqueamento. A placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem em TBST. A placa foi desenvolvida pela adição de substrato OPD (Sigma P9187) e de desenvolvimento da cor interrompida pela adição de 3M de H2 SO4 . A absorbância foi medida a 490 nm com um leitor de placa e o meio de absorbância plotado. Os resultados são apresentados na Figura 157 mostram que BPC1616 e Pascolizumab ligam-se ao IL-4 humano recombinante considerando o anticorpo de controle não mostrado na ligação.
Exemplo 31 Os mAbdAbs triespecíficos compreendem dois anticorpos de domínio simples fundidos em linha no terminal C de um anticorpo monoclonal 5 31.1 Construção Três anticorpos triespecíficos (mAbdAb-dAb) foram construídos onde dois anticorpos de domínio simples são fundidos em linha no terminal C da cadeia pesada de um anticorpo monoclonal.
Brevemente, um local de restrição Bglll no terminal N e local de restrição BamHl no terminal C foram introduzidos por PCR para flanquear as sequências de DNA que codificam um anticorpo de domínio no DOML0- 53-474 (SEQ ID N°: 5), DOM9-155-154 (SEQ ID N°: 3) e DOM9-112-210 (SEQ ID N°: 4). O fragmento de DNA que codifica um domínio de anticorpo DOML0-53-474 foi então clonado no um local BamHl do vetor de expressão de mamífero que codifica a cadeia pesada de um anticorpo monoclonal anti IL-5 fundido com um domínio de anticorpo anti IL-4 DOM9-112-210 (SEQ ID N°: 71). Os fragmentos de DNA que codificam os domínios de anticorpos DOM9-155-154 e DOM9-112-210 foram ambos independentemente clonados em um local BamHl de um vetor de expressão de mamífero que codifica a cadeia pesada de um anticorpo monoclonal anti-CD20 fundido com um domínio de anticorpo anti IL-13 DOML0-53-474 (SEQ ID N°: 116). Os vetores de expressão resultantes que codificam uma cadeia pesada com dois anticorpos de domínio simples fundidos ao terminal C.
As sequência de proteína das cadeias pesadas são dadas na SEQ ID N°: 195, 196 e 197 como apresentado na tabela 39. Tabela 39 é um resumo dos mAbdAbs que foram construídos.
Tabela 39 ID do anticorpo Descrição SEQ ID N°: de sequência de aminoácido
BPC1008 Anti IL-5 Cadeia pesada-G4S-dAb474- 195 TVAAPSGS-dAb210 Anti IL-5 Cadeia leve 66 BPC1009 Anti CD-20 Cadeia pesada-TVAAPSGS- 196 dAb 154-TVAAPS GS-dAb474 Anti CD-20 Cadeia leve 117 BPC1010 Anti CD-20 Cadeia pesada-TVAAPSGS- 197 dAb21 0-TVAAPSGS-dAb474 Anti CD-20 Cadeia leve 117
31.2 expressão e purificação Os plasmídeos de expressão que codifica uma cadeia pesada e leve de BPC1008, BPC1009 e BPC1010 foram cotransfectados em células HEK 2936E usando 293 fectina (Invitrogen, 12347019). Uma alimentação de 5 triptona foi adicionada a cultura celular no dia seguinte e o material sobrenadante foi coletado após cerca de 2 a 6 dias a partir da transfecção inicial. Os anticorpos foram purificadas usando uma coluna de proteína A antes de serem testado nos ensaios de ligação.
31.3: ELISA de ligação IL-4 As placas de ligação altas de 96 reservatórios foram revestidas com 5 µg/ml IL-4 humano (GSK) no tampão de revestimento (0,05M de bicarbonato pH9.6, Sigma C-3041)3 e armazenadas a 4 °C. As placas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20 (TBST). 100 µL de solução de bloqueamento (1% de BSA em tampão TBST) foi adicionado em cada reservatório e as placas foram incubadas por pelo menos uma hora em temperatura ambiente. Os anticorpos purificados foram sucessivamente diluídos através das placas na solução de bloqueamento. Após uma hora de incubação, as placas foram lavadas três vezes. Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti-humano de cabra (Sigma A7164) foi diluído 1 em 2000 na solução de bloqueamento e 50 µL foi adicionado em cada reservatório. As placas foram incubadas por uma hora. As placas foram lavadas três vezes, então a solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o-fenilenodiamina) foi adicionada em cada reservatório e a reação foi interrompida 5 minutos após pela adição de 25 µL de 3 M de ácido sulfúrico. A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico. Os resultados de ELISA são mostrados na Figura 158 e 5 confirmam que os anticorpos BPC1008, 1009 e BPC1010 ligam-se ao IL-4 humano recombinante. O Pascolizumab de controle positivo também mostrou a ligação ao IL-4 recombinante considerando o anti IL-13 mAb de controle negativo e Mepolizumab não mostrou ligação a IL-4. Os anticorpos BPC1009 e BPC1010 também foram testados em um experimento separado que dão resultados similares aqueles mostrados na Figura 158.
31.4: ELISA de ligação IL-5 As placas de ligação altas de 96 reservatórios foram revestidas com 5,9 µg/ml IL-5 humano (GSK) no tampão de revestimento (0,05M bicarbonato pH9.6) e armazenado durante a noite a 4 °C. As placas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20 (TBST). 100 µL de solução de bloqueamento (1% de BSA em tampão TBST) foi adicionado em cada reservatório e as placas foram incubadas por pelo menos uma hora em temperatura ambiente. Os anticorpos purificados foram sucessivamente diluídos através das placas na solução de bloqueamento. Após uma hora de incubação, as placas foram lavadas três vezes. Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti-humano de cabra (Sigma A7164) foi diluído 1 em 2000 na solução de bloqueamento e 50 µL foi adicionada em cada reservatório. As placas foram incubadas por uma hora. Esta foi lavada três vezes, então a solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o-fenilenodiamina) foi adicionado em cada reservatório e a reação foi interrompida 5 minutos após pela adição de 25 µL de 3 M de ácido sulfúrico. A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico.
A Figura 159 mostra os resultados de ELISA que confirmam que os anticorpos BPC1008 ligam-se ao IL-5 humano recombinante considerando BPC1009 e BPC1010 não mostrou ligação a IL-5. O Mepolizumab de controle positivo também mostrou a ligação ao IL-5 5 recombinante considerando o anti IL-13 mAb de controle negativo e Pascolizumab não mostrou ligação a IL-5. ELISA de ligação IL-13 As placas de ligação altas de 96 reservatórios foram revestidas com 5 µg/ml IL-13 humano (GSK) no tampão de revestimento (0,05M bicarbonato pH9.6, Sigma C-3041) 3 e armazenadas a 4 °C.
As placas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20 (TBST). 100 µL de solução de bloqueamento (1% de BSA em tampão TBST) foi adicionado em cada reservatório e as placas foram incubadas por pelo menos uma hora em temperatura ambiente.
Os anticorpos purificados foram sucessivamente diluídos através das placas na solução de bloqueamento.
Após uma hora de incubação, as placas foram lavadas três vezes.
Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti-humano de cabra (Sigma A7164) foi diluído 1 em 2000 na solução de bloqueamento e 50 µL foi adicionada em cada reservatório.
As placas foram incubadas por uma hora.
Esta foi lavada três vezes, então a solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o-fenilenodiamina) foi adicionado em cada reservatório e a reação foi interrompida 5 minutos após pela adição de 25 µL de 3 M de ácido sulfúrico.
A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico.
Os resultados de ELISA são mostrados na the Figura 160 e confirmam que anticorpos BPC1008, 1009 e BPC1010 ligam-se ao IL-13 humano recombinante.
O anti IL-13 mAb de controle positivo também mostrou a ligação ao IL-13 recombinante considerando o Pascolizumab e
Mepolizumab de controle negativo não mostrou ligação a IL-13. Anticorpos BPC1009 e BPC1010 também foram testados em um experimento separado que dão resultados similares aqueles mostrados na Figura 160. Exemplo 32 5 mAbdAbs com anticorpos de domínio simples fundidos em estruturas monovalentes
32.1 Construção de mAbdAbs Os anticorpos biespecíficos compreendem uma fusão de um anticorpo monovalente (para informação adicional ver WO2006015371 e WO2007059782) e um domínio de anticorpo DOM-15-26-293 foram construídos como seguem. As sequências de DNA que codificam o anti-c-Met saliência-em-orifício de cadeia pesada (SEQ ID N°: 202 e 203) foi construído usando uma estratégia com base em PCR seguido pela mutagênese direcionada ao local. A sequência de DNA que codificam o anti-c-Met Unibody de cadeia pesada (SEQ ID N°: 204) foi construído usando uma estratégia com base em PCR seguido pela remoção da região de junta por um método com base em PCR. Adicionalmente, para as construções de fusão, locais de restrição BamHl e EcoRl foram incluídos no terminal C do cassete de expressão de cadeia pesada para facilitar a clonagem subsequente da sequência de DNA de domínio de anticorpo anti VEGF-A (DOM-15-26-593) (que codificam aminoácidos 455-570 da SEQ ID N°: 75) como um fragmento BamHl-EcoRl a partir de um vetor existente. Os vetores de expressão resultantes codifica um domínio de anticorpo anti-VEGFA fundidos ao terminal C da cadeia pesada por intermédio de um ligante GS (SEQ ID N°: 198, 199 e 201). A sequência de DNA que codificam a cadeia leve anti-c-Met (SEQ ID N°: 200) foi construído por uma estratégia com base em PCR. A construção de BPC1604 é descrita no Exemplo 14. Tabela 40 abaixo é um resumo da estruturas monovalentes mAbdAbs e anticorpos que foram gerados e expressados.
Tabela 40 ID do anticorpo Descrição SED ID N°: de sequência de aminoácido BPC1017 anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (orifício)-GS-dAb593 198 anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (saliência)-GS-dAb593 199 anti cMET 5D5v2 Cadeia leve 200 BPC1018 anti cMET 5D5v2 IgG4 Cadeia pesada 201 UNIBODY -GS-dAb593 anti cMET 5D5v2 Cadeia leve 200 BPC1019 anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (orifício) 202 anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (saliência) 203 anti cMET 5D5v2 Cadeia leve 200 BPC1020 anti cMET 5D5v2 IgG4 Cadeia pesada 204
UNIBODY anti cMET 5D5v2 Cadeia leve 200
32.2 Expressão e purificação Os plasmídeos de expressão que codifica a cadeia pesada de BPC1017, BPC1018, BPC1019 e BPC1020 foram cotransfectados 5 em células HEK 2936E usando 293 fectina (Invitrogen, 12347019). Uma alimentação de triptona foi adicionada a cultura celular no dia seguinte e o material sobrenadante foi coletado após cerca de 2 a 6 dias a partir da transfecção inicial. Os anticorpos foram purificados usando uma coluna de proteína A antes de ser testado nos ensaios de ligação.
32.3 ELISA de ligação receptora HGF As placas de ligação altas de 96 reservatórios foram revestidas com 5 µg/ml HGF R (c-MET) humano recombinante /Quimera Fc (Sistema R&D, Número do catálogo: 358-MT/CF) no tampão de revestimento (0,05M de bicarbonato pH9.6, Sigma C-3041)3 e armazenadas a 4 °C. As placas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20 (TEST). 100 µL de solução de bloqueamento (1% de BSA em tampão TEST) foi adicionado em cada reservatório e as placas foram incubadas por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes. Então os anticorpos purificados foram sucessivamente diluídos através das placas na solução de bloqueamento. Após uma hora de incubação em temperatura ambiente, as placas foram lavadas três vezes. Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti-humano de cabra (Sigma A7164) foi diluído na solução de bloqueamento a 1 em 2000 e foi adicionado em cada reservatório. As placas foram incubadas por uma hora. Este foi lavado três 5 vezes e então a solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o- fenilenodiamina) foi adicionado em cada reservatório e a reação foi interrompida 5 minutos após pela adição de 25 µL de 3 M de ácido sulfúrico. A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico. Os resultados de ELISA são mostrados na Figura 161 e confirmam que mAbdAbs BPC1017 e BPC1018 ligam-se ao humano recombinante c-MET com a atividade comparável aos anticorpos BPC1019 e BPC1020. O Pascolizumab de controle negativo e BPC1604 (um IGF- 1R/VEGF mAbdAb) não mostrou ligação a c-MET.
32.4 ELISA de ligação VEGF As placas de ligação altas de 96 reservatórios foram revestidas com 0,4 µg/mL de VEGF humano (GSK) em PBS e incubadas a 4 °C durante a noite. As placas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada por Tris com 0,05 % de Tween-20 (TBST). 100 µL de solução de bloqueamento (4 % de BSA em tampão TBST) foi adicionada em cada reservatório e as placas foram incubadas por pelo menos uma hora em temperatura ambiente. Uma outra etapa de lavagem foi então removida. Os anticorpos purificados foram sucessivamente diluídos através das placas na solução de bloqueamento. Após uma hora de incubação em temperatura ambiente, as placas foram lavadas. Anticorpo conjugado de peroxidase específico por cadeia leve de capa anti-humano de cabra foi diluído na solução de bloqueamento a 1 em 2000 e foi adicionada em cada reservatório. As placas foram incubadas por uma hora em temperatura ambiente. Após uma outra etapa de lavagem, a solução de substrato SigmaFast OPD (diidrocloreto de o-fenilenodiamina) foi adicionado em cada reservatório e a reação foi interrompida 5 minutos após pela adição de 25 µL de 3 M de ácido sulfúrico. A absorbância foi lida a 490 nm usando o leitor de microplaca VersaMax 5 Tincapaz (Dispositivos moleculares) usando um protocolo de ponto final básico. A Figura 162 mostra os resultados de ELISA que confirmam que mAbdAbs BPC1017 e BPC1018 ligam-se ao VEGF humano recombinante. O BPC1604 de controle positivo também mostrou a ligação ao VEGF humano recombinante considerando Pascolizumab, BPC1019 e BPC1020 não mostrou ligação a VEGF. Exemplo 33 mAbdAbs contendo o anti-IL13 dAbs DOML0-53-546 dAb e DOML0-53- 567
33.1 Construção, expressão e purificação O anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs mostrado na Tabela 41 foram clonados e expressados transitoriamente em células HEK2936E, purificados (como descritos no exemplos 1, 1.3 e 1.5 respectivamente). Tabela 41 Nome Descrição Sequência ID N° PascoH-TVAAPS-546 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-TVAAPS- 157 (= cadeia H) DOML0-53-546 dAb 15 (= cadeia L) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab PascoH-TVAAPS-567 Cadeia H = Cadeia pesada de Pascolizumab-TVAAPS- 159 (= cadeia H) DOML0-53-567 dAb 15 (= cadeia L) cadeia L = cadeia leve de Pascolizumab Os PascoH-TVAAPS-546 e PascoH-TVAAPS-567 mAbdAbs purificados foram analisados pela cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e eletroforese de acrilamida de poli sulfato de dodecila sódica (SDS PAGE), sob as condições de redução. Os dados SEC e SDS PAGE são mostrados nas Figuras 163, 164, 165 e 166.
33.2 Análise Biacore de ligação a IL-13 e IL-4 Os PascoH-TVAAPS-546 e PascoH-TVAAPS-567 purificados foram testados pela ligação a IL-13 humano e IL-4 humano usando o BIAcoreTM T100 a 25 °C (como descritos nos métodos 4 e 5). Estes dados são mostrados na Tabela 42. Tabela 42 Molécula Afinidade de ligação, KD (nM) IL-4 humano IL-13 humano em taxa fora de taxa KD (nM) em taxa (ka, Fora de taxa KID ka, Ms-1 kd, s-1 Ms-1 kd, s-1 nM PascoH-TVAAPS-546 4.92E+6 2.37E-5 0.00482 2.26E+5 1.69E-4 0.747 PascoH-TVAAPS-567 - - Ligação firme 4.46E+5 1.70E-5 0.038 observada Anti-IL-13 humano mAb - - Não liga-se 1.00E+6 3.78E-4 0.377 Pascolizumab 4.25E+6 2.43E-5 0.00572 - - Não liga-se
5 Os mAbdAbs testado neste ensaio ambos ligam-se ao IL-4 com afinidade muito alta (NB, para PascoH-TVAAPS-567 este vai além da sensibilidade da máquina) e com a afinidade de ligação similar aquele do mAb IL4 anti-humano sozinho (Pascolizumab). O PascoH-TVAAPS-546 e PascoH-TVAAPS-567 ambos ligam-se ao IL-13. Nota-se que o anti-IL-13 dAbs sozinho (DOML0-53-546 e DOML0-53-567) não foram testados neste ensaio como o dAb não pode ser capturado na proteína A ou chip CM5 revestido por IgG anti-humano; em vez de, o mAb IL13 anti-humano foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-13 neste ensaio.
Este mAbdAbs também foram testados pela ligação um IL-13 cinomolgo usando o BIAcoreTM T100 a 25 °C (como descrito no método 23). Estes dados são mostrados na Tabela 43. Um nível de captura mAbdAb entre 500 e 750 unidades de resposta relativas foi atingida, seis curvas de concentração IL-13 (256, 64, 16, 4, 1 e 0,25 nM) foram avaliados por ambas os mAbdAbs e o anti-IL13 mAb.
Tabela 43 Molécula Afinidade de ligação para IL-13 cinomolgo, (KD) (material purificado) em taxa ka, Ms-1 fora de taxa kd, s-1 KD (nM) PascoH-TVAAPS-546 1,67E+6 2,09E-2 12,5 PascoH-TVAAPS-567 5,92E+5 5,22E-3 8,8 Anti-IL13 mAb 4,79E+5 8,22E-5 0,171
O PascoH-TVAAPS-546 e PascoH-TVAAPS-567 ambos que ligam-se IL-13 cinomolgo com afinidades de ligação similares.
Nota-se que o anti-IL-13 dAbs sozinho (DOML0-53-546 e DOML0-53-567) não foram testados neste ensaio como o dAb não pode ser capturado na proteína A ou chip CM5 revestido por IgG anti-humano; em vez de, o mAb IL13 anti- humano foi usado como um controle positivo para demonstrar ligação IL-13 neste ensaio. 5 33.3 Neutralização de IL-13 humano e IL-13 cinomolgo nos bioensaios de célula TF-1 Os PascoH-TVAAPS-546 e PascoH-TVAAPS-567 purificados foram testados pela neutralização de IL-13 humano e IL-13 cinomolgo no bioensaio de célula TF-1 (como descrito no método 8 e método 20 respectivamente). Figuras 167 e 168 mostram os dados de neutralização por IL-13 humano e IL-13 cinomolgo (no bioensaio de célula TF-1) respectivamente.
O DOML0-53-616 foi incluído como um controle positivo para uma neutralização de IL-13 nestes bioensaios.
Um dAb com especificidade por um antígeno irrelevante (dAb de controle negativo) também foi incluído como um controle negativo pela neutralização de IL-13. Além disso, PascoH-616 e PascoH-TVAAPS-616 também foram testados nestes ensaios.
Tanto PascoH-TVAAPS-546 quanto PascoH-TVAAPS-567 neutralizaram totalmente a bioatividade de IL-13 humano e cinomolgo no bioensaio de célula TF-1. Os valores ND50 foram calculados a partir dos dados.
O valor ND50 é uma concentração de mAbdAb ou mAb ou dAb, que é capaz de neutralizar a bioatividade de IL-13 por 50 %. O valor ND50 médio, o desvio padrão (SD) e o número de vezes testados (n) são mostrados na tabela 44. Tabela 44 Molécula Valor ND50 médio de desvio padrão (nM) IL-13 humano IL-13 Cinomolgo Média (SD) n Média (SD) n PascoH-TVAAPS-546 1,522 1 33,88 1 PascoH-TVAAPS-567 2,06 1 38,25 1 DOM 10-53-616 0,536 1 3,57 1 Controle negativo dAb Não neutraliza Não neutralisa
Exemplo 34 mAbdAbs com regiões constantes de cadeia pesada IgG2, IgG4 e IqG4PE
34.1 Construção de mAbdAbs As regiões constantes de cadeia pesada de isótipos de anticorpo humano IgG2, IgG4 e um gene IgG4 (IgG4PE) variante foram 5 amplificados a partir de construções existentes por PCR e clonado usando as técnicas de biologia molecular padrão em um vetor de expressão que codifica a cadeia pesada PascoH-GS-474 (SEQ ID N°: 48). Os anticorpos mAbdAbs projetados e testados são listados na Tabela 45. Tabela 45 ID do anticorpo Descrição SED ID N°: de sequência de aminoácido BPC1617 PascoH IgG2-GS-474 207 Pasco Kappa 15 BPC1618 PascoH IgG4-GS-474 208 Pasco Kappa 15 BPC1619 PascoH I G4PE-GS-474 209 Pasco Kappa 15
34.2 Expressão Os mAbdAbs apresentados na tabela 45 foram expressados, junto com PascoH-GS-474 (SEQ ID N°: 48 e 15) que é nomeado BPC1000. Brevemente, 75011I de células HEK293 a 1,5x106 células/ml foram cotransfectadas com plasmídeos de expressão de cadeia pesada e leve previamente incubados com 293 reagentes de fectina (Invitrogen # 51-0031). Estes foram colocados em um incubador de agitação a 37 °C, 5 % de CO2 e 95 % de RH. Após 1 hora, o meio de alimentação de triptona foi adicionado e as células desenvolvidas por 72 horas adicionais. O sobrenadante foi coletado pela centrifugação.
34.3 ELISA de ligação IL-4 Os sobrenadantes contendo estes mAbdAbs foram avaliados pela ligação a IL-4 humano recombinante. Brevemente, as placas de ELISA foram revestidas com IL-4 humano (fabricado em GSK) a 1 µg/ml e bloqueada com solução de bloqueamento (4 % de BSA em solução salina tamponada com Tris). Várias diluições do sobrenadante celular, um anticorpo monoclonal anti IL-4 (Pascolizumab) e um anticorpo de especificidade irrelevante (586 anti IL-13) foram adicionados. Todas as amostras foram diluídas na solução de bloqueamento. A placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem em TBS + 0,05 % de Tween 20 (TBST). A ligação foi detectada pela adição 5 de um anticorpo de cadeia leve de capa anti-humano rotulado por peroxidase (Sigma A7164) em uma diluição de 1/1000 na solução de bloqueamento. A placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem em TBST. A placa foi desenvolvida pela adição de substrato OPD (Sigma P9187) e de desenvolvimento da cor interrompida pela adição de 3M H2SO4. A absorbância foi medida a 490 nm com um leitor de placa e o meio de absorbância plotado. Os resultados apresentados na Figura 169 mostram que os mAbdAbs contendo o isótipos alternativos todos que ligam-se ao IL-4 humano. Para os mAbdAbs BPC1000, BPC1617, BPC1618 e BPC1619, a quantidade de anticorpo no sobrenadante não foi quantificado deste modo o dado apresentado na Figura 169 é representado como um fator de diluição do material de sobrenadante limpo. Para os anticorpos de controle anti-IL4 e IL- 13, material purificado foi usada no ensaio e a concentração de partida de 1µg/ml e 1µg/ml foi usada respectivamente (que é equivalente ao fator de diluição de 1 na Figura 169).
34.4 IL-13 ELISA de ligação Os sobrenadantes contendo estes mAbdAbs foram avaliados pela ligação a IL-13 humano recombinante. Brevemente, as placas de ELISA foram revestidas com IL-13 humano (fabricado em GSK) a 5 µg/ml e bloqueada com solução de bloqueamento (4 % de BSA em solução salina tamponada com Tris). Várias diluições do sobrenadante celular, um anticorpo monoclonal anti IL-13 (586) e um anticorpo de especificidade irrelevante (Pascolizumab anti IL-4) foram adicionados. Todas as amostras foram diluídas na solução de bloqueamento. A placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente antes da lavagem em TBS + 0,05 % de Tween 20 (TBST). A ligação foi detectada pela adição de um anticorpo de cadeia leve de capa anti-humano rotulado por peroxidase (Sigma A7164) em uma diluição de 1/1000 na solução de bloqueamento. A placa foi incubada por 1 5 hora em temperatura ambiente antes da lavagem em TBST. A placa foi desenvolvida pela adição de substrato OPD (Sigma P9187) e de desenvolvimento da cor interrompida pela adição de 3M H2SO4. A absorbância foi medida a 490 nm com um leitor de placa e o meio de absorbância plotado. Os resultados apresentados na Figura 170 mostram que os anticorpos biespecíficos contendo os isótipos alternativos todos que ligam-se ao IL-13 humano. Para os anticorpos biespecíficos BPC1000, BPC1617, BPC1618 e BPC1619, a quantidade de anticorpo no sobrenadante não foi quantificado deste modo o dado apresentado na Figura 170 é representado como um fator de diluição do material de sobrenadante limpo. Para os anticorpos de controle anti-IL4 e IL-13, material purificado foi usado no ensaio em uma concentração de partida de 1 µg/ml e 1 µg/ml respectivamente (que é equivalente ao fator de diluição de 1 na Figura 170). Exemplo 35 Anti-IL-13 alternativo/IL-4 mAbdAbs
35.1 Construção de anti-IL-13/IL-4 mAbdAbs com sequências de região variável alternativa Usando as técnicas de biologia molecular padrão, as sequências de DNA que codificam a anti-IL-13 mAb de região variável de cadeia pesada alternativa nomeado ‘C1’ e ‘D1’ foram transferidos a partir das construções existentes a um vetor de expressão contendo DNA que codifica uma região constante hIgG1 fundido a um domínio de anticorpo anti IL-4 (DOM9-112-210) por intermédio de um ligante TVAAPSGS no terminal c da região constante. As sequências de DNA que codificam a região variável de cadeia leve alternativa de IL-13mAbs nomeado ‘MO’ e ‘NO’ foram reunidos novamente e clonados nos vetores de expressão contendo a região constante Ck humana. Estas regiões variáveis de anticorpo de cadeia pesada e leve compreendem as mesmas regiões CDR como o anticorpo anti-IL-13 descrito 5 nas SEQ ID N°: 12 e 13 mas com uma região de estrutura variável humanizada alternativa.
35.2 Construção de mAbdAbs usando as regiões variáveis de anti IL-13 mAb ‘656’ Usando as técnicas de biologia molecular padrão, a sequência de DNA que codifica a região variável de cadeia pesada do anti IL-13 mAb ‘656’ humanizado, foram transferidos a partir de uma construção existente e clonados em um vetor de expressão contendo DNA que codifica uma região constante hlgG1 fundido a um domínio de anticorpo anti IL-4 (DOM9-112- 210) por intermédio de um ligante TVAAPS no terminal c da região constante. A sequência de DNA que codifica uma região variável leve foi transferido a partir da uma construção existente e clonados em um vetor de expressão contendo a região constante Ck humana.
35.3 Expressão de mAbdAbs Brevemente, 25 ml de células HEK293 em 1,5x106 células/ml foram cotransfectadas com plasmídeos de expressão de cadeia pesada e leve previamente incubados com 293 reagente de fectina (Invitrogen # 51-0031). Estes foram colocados em um incubador de agitação a 37 °C, 5 % de CO2 e 95 % de RH. Após 24 horas o meio de alimentação de triptona foi adicionado e as células desenvolvidas por 72 horas adicionais. Sobrenadante foi coletado pela centrifugação e os níveis IgG quantificados por ELISA. Os anticorpos construídos e expressados são listados na Tabela 46. Tabela 46 ID do anticorpo /Nome Descrição SED ID NO: da sequência de aminoácido BPC1607 Cadeia H = C1-TVAAPSGS-210 151 cadeia L = MO Capa 154 BPC1608 Cadeia H = C1-TVAAPSGS-210 151 cadeia L = NO Capa 153
ID do anticorpo /Nome Descrição SED ID NO: da sequência de aminoácido BPC1609 Cadeia H = C1-TVAAPSGS-210 151 cadeia L = 586 Capa 13 cadeia leve de mAb de IL-3 anti-humano BPC1610 Cadeia H = D1-TVAAPSGS-210 152 cadeia L = MO Capa 154 BPC1611 Cadeia H = D1-TVAAPSGS-210 152 cadeia L = NO Capa 153 BPC1612 Cadeia H = D1-TVAAPSGS-210 152 cadeia L = 586 Capa 13 cadeia leve de mAb de IL-3 anti-humano BPC1613 Cadeia H = 586H-TVAAPS-210 88 (Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-humano-TVAAPS-DOM9- 154 112-210 dAb) cadeia L = MO Capa BPC1614 Cadeia H = 586H-TVAAPS-210 88 (Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-humano-TVAAPS-DOM9- 153 112-210 dAb cadeia L = NO Capa BPC1615 Cadeia H = 656H-TVAAPS-210 155 (Anti-IL-13 humano mAb 2 cadeia pesada-TVAAPS-DOM9- 156 112-210 dAb cadeia L = 656 Capa Anti-IL-13 humano mAb 2 cadeia leve BPC1602 Cadeia H = 586H-TVAAPS-210 88 (586H-TVAAPS-210 (Cadeia pesada de mAb de IL-3 anti-humano-TVAAPS-DOM9- GS removido 112-210 dAb) cadeia L = 586 Capa 13 cadeia leve de mAb de IL-3 anti-humano
35.4 Ligação dos mAbdAbs a IL-13 A atividade de ligação dos mAbdAbs a IL-13 foi avaliada por ELISA. De fato, 5 µg/ml de IL-13 humano expressado por E.coli recombinante (feito e purificado em GSK) foi revestido a uma placa ELISA 5 de 96 reservatórios. Os reservatórios foram bloqueados por 2 horas em temperatura ambiente, as construções mAbdAbs foram então tituladas abaixo da placa. A ligação foi detectada usando uma diluição 1 em 1000 de anticorpo conjugado de peroxidase de cadeia leve de capa anti-humano (número do catálogo A7164, Sigma-Aldrich). A Figura 177 mostram todos das moléculas testadas foram capazes de ligar-se ao IL-13 humano. Embora BPC1615 mostrou a ligação neste ELISA não foi possível para quantificar exatamente uma concentração desta molécula e portanto os dados de ligação IL-13 ELISA para esta molécula não foi plotado na Figura 177. BPC1615 também foi mostrado ter a ligação de alta afinidade a IL-13 em um ensaio Biacore independente (Tabela 47).
35.5 Ligação de anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs a IL-13 by BIAcoreTM Os sobrenadantes de célula a partir das transfecções de célula 5 HEK também foram testados pela ligação de um IL-13 expressado por E.Coli humano recombinante usando BIAcoreTM a 25 °C (como descrito no método 4). O BPC1601 foi testado como uma proteína purificada. As afinidades de ligação, apresentadas na Tabela 47, confirmam que todos os anticorpos mostram a ligação de alta afinidade ao IL-13 humano. Tabela 47 ka kd KD (nM) C1-TVAAPSGS-210 & MOCapa BPC1607 5,15E+5 8,89E-4 1,73 C1-TVAAPSGS-210 & NOCapa BPC1608 4,90E+5 8,83E-4 1,80 C1-TVAAPSGS-210 & 586capa BPC1609 7,55E+5 7,61 E-4 1,01 D1 -TVAAPSGS-21 0 & MOcapa BPC1610 3,31 E+5 4,66E-4 1,41 D1-TVAAPSGS-210 & NOcapa BPC1611 2,59E+5 3,31E-4 1,28 D1-TVAAPSGS-210 & 586capa BPC1612 4,85E+5 2,74E-4 0,565 586H TVAAPS-210 & MOcapa BPC1613 5,54E+5 4,45E-4 0,804 586H TVAAPS-210 & NOcapa BPC1614 5,49E+5 4,42E-4 0,805 656H TVAAPS-210 & 656capa BPC1615 4,89E+6 4,17E-4 0,085 586H-TVAAPS-210noGS BPC1602 8,21 E+5 4,62E-4 0,562 586H-no ligante-210noGS BPC1601 purificado 8,93E+5 3,93E-4 0,440 Exemplo 36 Geração de mAbdAb com especificidade por IL-5 humano e IL-13 humano
36.1 Construção e expressão do mAbdAb Uma molécula mAbdAb tendo a cadeia pesada apresentada nas SEQ ID N°: 65 e a cadeia leve apresentada nas SEQ ID N°: 72 foi expressada em células HEK2936E. Este foi nomeado MepolizumabL-G4S- 474 ou BPC1021.
36.2 Ligação de anti-IL5mAb-anti-IL13dAb a IL-5 e IL-13 Este mAbdAb (em sobrenadantes de célula) foi testado pela ligação a IL-13 humano em um ELISA de ligação direta (como descrito no método 1). Estes dados são mostrados na Figura 173. A amostra foi transfectadas e testadas em cópias e estes foram anotadas como amostra A e amostra B.
Este mAbdAb liga-se ao IL-13. O mAb IL13 anti-humano purificado sozinho foi incluído neste ensaio como um controle positivo para a ligação IL-13. O anti-IL-4 humano mAb purificado (Pascolizumab) e anti-IL- 5 humano mAb (Mepolizumab) foram incluídos como controle negativo para 5 a ligação IL-13. Este mAbdAb também foi testado pela ligação a IL-5 humano em um ELISA de ligação direta (como descritos no Exemplo 31.4) Estes dados são ilustrados na Figura 174. O mepolizumabL-G4S-474 liga-se ao IL-5. O IL4 mAb anti- humano purificado (Pascolizumab) e anti 13 mAb humano purificado foi incluído como controle negativo pela ligação a IL-5. Um IL5 mAb anti- humano purificado (Mepolizumab) foi usado como um controle positivo para demonstrar a ligação IL-5 neste ensaio.
Sequências Tabela 49: Descrição de proteína ou polinucleotídeo Sequência de DNA Sequência de proteína (SEQ ID N°:) (SEQ ID N°:) DO M9-155-25 - 1 DOM9-155-147 60 2 DO M9-155-154 61 3 DO M9-112-210 - 4 DO M 10-53-474 - 5 G4S Ligante - 6 Ligante - 7 Ligante - 8 Ligante - 9 Ligante - 10 Ligante - 11 Cadeia pesada de mAb de IL13 anti-humano 205 12 & alternativo pol nucleotide sequence 206 Cadeia leve de mAb de IL13 anti-humano 210 13 Cadeia pesada de Pascolizumab 211 14 Pascolizumab Cadeia leve 212 15 Mepolizumab Cadeia pesada 213 65 Mepolizumab Cadeia leve 214 66 Cadeia pesada de mAb de IL18 anti-humano - 67 Cadeia leve de mAb de IL18 anti-humano - 68 586H-25 Cadeia pesada - 16 586H-147 Cadeia pesada - 17 586H-154 Cadeia pesada - 18 586H-210 Cadeia pesada - 19 586H-G4S-25 Cadeia pesada - 20 586H-G4S-147 Cadeia pesada - 21 586H-G4S-154 Cadeia pesada - 22
Descrição de proteína ou polinucleotídeo Sequência de DNA Sequência de proteína (SEQ ID N°:) (SEQ ID N°:) 586H-G4S-210 Cadeia pesada - 23 586H-TVAAPS-25 Cadeia pesada - 24 586H-TVAAPS-147 Cadeia pesada - 25 586H-TVAAPS-154 Cadeia pesada 122 26 586H-TVAAPS-210 Cadeia pesada 167 27 586H-ASTKG-25 Cadeia pesada - 28 586H-ASTKG-147 Cadeia pesada - 29 586H-ASTKG-154 Cadeia pesada - 30 586H-ASTKG-210 Cadeia pesada 192 31 586H-EPKSC-25 Cadeia pesada - 32 586H-EPKSC-147 Cadeia pesada - 33 586H-EPKSC-154 Cadeia pesada - 34 586H-EPKSC-210 Cadeia pesada - 35 586H-ELQLE-25 Cadeia pesada - 36 586H-ELQLE-147 Cadeia pesada - 37 586H-ELQLE-154 Cadeia pesada - 38 586H-ELQLE-210 Cadeia pesada - 39 586H Cadeia pesada-GS - 40 586H-ASTKG Cadeia pesada - 41 586H-EPKSC Cadeia pesada - 42 586H-ELQLE Cadeia pesada - 43 586L-G4S-25 Cadeia leve - 44 586L-G4S-147 Cadeia leve - 45 586L-G4S-154 Cadeia leve - 46 586L-G4S-210 Cadeia leve - 47 PascoH-474 Cadeia pesada 215 48 PascoH-G4S-474 Cadeia pesada - 49 PascoH-TVAAPS-474 Cadeia pesada 216 50 Pasco H-ASTKG-474 Cadeia pesada - 51 Pasco H-EPKSC-474 Cadeia pesada - 52 PascoH-ELQLE-474 Cadeia pesada - 53 PascoL-474 Cadeia leve 217 54 PascoL-G4S-474 Cadeia leve - 55 PascoL-TVAAPS-474 Cadeia leve 218 56 PascoL-ASTKG-474 Cadeia leve - 57 PascoL-EPKSC-474 Cadeia leve - 58 PascoL-ELQLE-474 Cadeia leve - 59 Interleucina-4 - 62 Interleucina-13 - 63 Sequência sinalizadora de mamífero - 64 IGF1 R ligação VH CDR3 - 80 IGF1 R ligação VH CDR2 - 81 IGF1 R ligação VH CDR1 - 82 IGF1 R ligação VL CDR1 - 83 IGF1 R alternativo VL CDR2 - 84 IGF1 R ligação VL CDR3 - 85 IGF1 R ligação VL CDR2 - 86 IL-18mAb-G4S-DOM9-112-210 cadeia pesada - 69 IL-18mAb-G4S-DOML0-53-474 Cadeia leve - 70 IL-5 mAb-G4S-DOM9-112-210 cadeia pesada 219 71 IL-5 mAb-G4S-DOML0-53-474 cadeia leve 220 72 Anti-TNF mAb Cadeia leve 169 73 Anti-TNF mAb-DOML6-39-542 Cadeia pesada 170 74 Anti-TNF mAb-DOML5-26-593 Cadeia pesada 168 75 DOM 15-26-593-VHdUMMY Cadeia pesada 172 76 DOM 4-130-54-VKdUMMY Cadeia leve 171 77 DOM 15-26-anti-TNFmAb Cadeia pesada _ 78
Descrição de proteína ou polinucleotídeo Sequência de DNA Sequência de proteína (SEQ ID N°:) (SEQ ID N°:) DOM 16-39-542-anti-TNFmAb Cadeia leve _ 79 586H-210 Cadeia pesada (GS removido) 221 87 586H-TVAAPS-210 Cadeia pesada (GS removido) 222 88 586H-ASTKGPT-210 Cadeia pesada (ambos GS _ 89 removidos 586H-ASTKGPS-210 Cadeia pesada (ambos GS _ 90 removidos, ligante ASTKGPS PascoH-474 Cadeia pesada (GS removido) 223 91 PascoH-TVAAPS-474 Cadeia pesada (GS 224 92 Removido Pasco H-AST KGPT-474 Cadeia pesada (ambos GS _ 93 Removido Pasco H-ASTKGPS-474 Cadeia pesada (ambos GS _ 94 removido, ligante ASTKGPS Pasco H-ASTKGPS-474 Cadeia pesada (segundo _ 95 GS removido, ligante ASTKGPS Pasco H-AST KGPT-474 Cadeia pesada (segundo 225 96 GS removido EGFR ligação VH CDR1 _ 97 EGFR ligação VH CDR2 _ 98 EGFR ligação VH CDR3 _ 99 EGFR ligação VL CDR1 - 100 EGFR ligação VL CDR2 - 101 EGFR ligação VL CDR3 - 102 EGFR epítopo - 103 EGFR ligação VH alternativo CDR1 - 104 EGFR ligação VH alternativo CDR2 - 105 EGFR ligação VH alternativo CDR3 - 106 EGFR ligação VH alternativo CDR2 - 107 Cadeia pesada de anticorpo anti-IGF-1 R HOLO com DOML5- 226 108 26-593 fundido no terminal C com o ligante TVAAPSGS ligante IGF1 RmAb-GS-DOML5-26-593 Cadeia pesada 227 109 Anticorpo anti-IGF-1 R Cadeia pesada 228 110 Cadeia leve de anticorpo anti-IGF-R HOLO com 229 111 DOML5-26-593 fundido no terminal C com o ligante
TVAAPSGS Cadeia leve de anticorpo anti-IGF-1 R HOLO com 230 112 DOML5-26-593 fundido no terminal C com o ligante GS Anticorpo anti-IGF-1 R Cadeia leve 231 113 Domínio pesado variável de anticorpo 2139 - 114 Domínio leve variável de anticorpo 2139 - 115 Anti-CD20 mAb cadeia pesada com TVAAPSGS - 116 ligante e anticorpo DOML0-53-474 de domínio fundido no terminal C Anti-CD20 mAb Cadeia leve - 117 Anti-CD20 mAb cadeia pesada com ligante GS and DOML0- - 118 53-474 anticorpo de domínio fundido no terminal C Anti-CD20 cadeia leve cp, TVAAPSGS ligante - 119 e DOML0-53-474 anticorpo de domínio fundido no terminal C Anti-CD20 mAb cadeia pesada - 120 Anti-CD20 mAb cadeia leve com ligante GS e - 121 DOML0-53-474 anticorpo de domínio fundido no terminal C antilGF1 R Cadeia pesada-GS-TLPC 232 123 antilGF1 R Cadeia pesada-GS-CT01 adnectina 233 124 antilGF1 R Cadeia pesada-TVAAPSGS-TLPC 234 125 antilGF1 R Cadeia pesada-GS-AFFI 235 126 antilGF1 R Cadeia pesada-TVAAPSGS-AFFI 236 127
Descrição de proteína ou polinucleotídeo Sequência de DNA Sequência de proteína (SEQ ID N°:) (SEQ ID N°:) antilGF1 R Cadeia pesada-GS-DRPN 237 128 antilGF1 R Cadeia pesada-TVAAPSGS-DRPN 238 129 Anti IL-4 cadeia pesada-GS-anti RNAse A 239 130 CamelídeoVHH Anti IL-4 cadeia pesada-GS-NARV 240 131 antilGF1 R Cadeia pesada-TVAAPSGS-CT01 241 133 adnectina antilL13-cadeia pesada-GS-antiTNFa adnectina - 134 antilL13-Cadeia pesada-TVAAPSGS-antiTNFa - 135 adnectina Erbitux Cadeia pesada-RS-CT01 adnectina 242 136 Anti-EGFR mAb Cadeia leve (RS12) 243 137 Erbitux Cadeia leve-RS-CT01 adnectina 244 138 Anti-EGFR mAb Cadeia pesada 245 139 11 F8 Cadeia pesada-GS-CT01 adnectina - 140 11F8 Cadeia leve - 141 11 F8 Cadeia leve-GS-CT01 adnectina - 142 11 F8 Cadeia pesada - 143 CT01 adnectina-GSTG- Erbitux Cadeia pesada 246 144 CT01 adnectina-STG-Erbitux Cadeia leve 247 145 Anti IL-4 Cadeia pesada-GS-anti TNF-a adnectina 270 146 Anti IL -4 Cadeia pesada-TVAAPSGS- anti TNF-a 132 147 Adnectina DOM 10-53-616 - 148 PascoH-616 Cadeia pesada 248 149 PascoH-TVAAPS-616 Cadeia pesada 249 150 C1 -TVAAPSGS-21 0 Cadeia pesada - 151 D1 -TVAAPSGS-21 0 Cadeia pesada - 152 NO Cadeia leve - 153 MO Cadeia leve - 154 656H-TVAAPS-210 Cadeia pesada 250 155 656 Cadeia leve 251 156 Pasco H-TVAAPS-546 Cadeia pesada 252 157 Pasco H-546 Cadeia pesada 253 158 PascoH-TVAAPS-567 Cadeia pesada 254 159 Pasco H-567 Cadeia pesada 255 160 656 Cadeia pesada 256 161 DOML5-26-VHdUMMY Cadeia pesada 162 163 Cetuximab-DOML5-26-593 Cadeia pesada 164 165 Pascolizumab alternativo Cadeia pesada 166 Cetuximab-DOML5-26-593 Cadeia pesada no ligante 173 174 Cetuximab-DOML5-26-593 Cadeia pesada 175 176 STGGGGGS ligante Cetuximab-DOML5-26-593 Cadeia pesada 177 178 STGGGGGSGGGGS ligante Avastin-DOML6-39-542 Cadeia pesada 179 180 Avastin Cadeia leve 181 182 Cetuximab-DOML0-53-474 Cadeia pesada 183 184 Anti-TNF mAb-DOML5-10-11 Cadeia pesada - 185 Anti-EGFR mAb-DOML5-10-11 Cadeia pesada - 186 Anti-EGFR mAb-DOML5-26-593 Cadeia leve 187 188
GSTG Anti-EGFR mAb-DOML5-26-593 Cadeia leve 189 190
GSTVAAPS Mepolizumab alternativo Cadeia pesada 191 IL-12/18 DVDH TVAAPS-210 cadeia pesada - 193 IL-12/18 DVD Capa cadeia leve - 194
Descrição de proteína ou polinucleotídeo Sequência de DNA Sequência de proteína (SEQ ID N°:) (SEQ ID N°:) Anti IL-5 Cadeia pesada-G4S-dAb474- 257 195 TVAAPSGS-dAb210 Anti CD-20 Cadeia pesada-TVAAPSGS-dAb154- 258 196 TVAAPSGS-dAb474 Anti CD-20 Cadeia pesada-TVAAPSGS-dAb210- 259 197 TVAAPSGS-dAb474 anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (orifício)-GS- 260 198 dAb593 anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (saliência)-GS- 261 199 dAb593 anti cMET 5D5v2 Cadeia leve 262 200 anti cMET 5D5v2 IgG4 Cadeia pesada 263 201 U N I BO DY -GS-dAb593 anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (orifício) 264 202 anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (saliência) 265 203 anti cMET 5D5v2 IgG4 Cadeia pesada 266 204
UNIBODY PascoH IgG2-GS-474 cadeia pesada 267 207 PascoH IgG4-GS-474 cadeia pesada 268 208 PascoH IgG4PE-GS-474 cadeia pesada 269 209 Breve Descrição das Figuras Figuras 1 a 7: Exemplos de construções de ligação de antígeno Figura 8: Diagrama esquemático da construção mAbdAbs. Figuras 9: Análise SEC e SDS Page de PascoH-G4S-474 5 Figura 10: Análise SEC e SDS Page de PascoL-G4S-474 Figura 11: Análise SEC e SDS Page de PascoH-474 Figura 12: Análise SEC e SDS Page de PascoHL-G4S-474 Figura 13: ligação de sobrenadantes mAbdAb a IL-13 humano em um ELISA de ligação direta Figura 14: ligação de sobrenadantes mAbdAb a IL-4 humano em um ELISA de ligação direta Figura 15: Ligação de mAbdAbs purificados a IL-13 humano em um ELISA de ligação direta Figura 16: ligação de mAbdAbs purificados a IL-4 humano em um ELISA de ligação direta Figura 17: ligação de sobrenadantes mAbdAb a IL-4 humano em um ELISA de ligação direta Figura 18: ligação de sobrenadantes mAbdAb a IL-13 humano em um ELISA de ligação direta Figura 19: ligação mAbdAb purificado a IL-4 humano em um ELISA de ligação direta Figura 20A: ligação mAbdAb purificado a IL-13 humano em 5 um ELISA de ligação direta Figura 20B: ligação mAbdAb purificado a IL-13 cinomolgo em um ELISA de ligação direta Figura 21: cinéticos de ligação mAbdAb por IL-4 usando BIAcoreTM Figura 22: cinéticos de ligação mAbdAb por IL-4 usando BIAcoreTM Figura 23: cinéticos de ligação mAbdAbs por IL-13 usando BIAcoreTM Figura 24: Capacidade de anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs purificados para neutralizar IL-13 humano em um ensaio de célula TF-1 Figura 25: Capacidade de anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs purificados para neutralizar IL-4 humano em um ensaio de célula TF-1 Figura 26: Capacidade de anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 e PascoHL-G4S-474 purificados para neutralizar IL-4 humano em um ensaio de célula TF-1 Figura 27: Capacidade anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs, PascoH- G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 e PascoHL-G4S-474 purificados para neutralizar IL-13 humano em um ensaio de célula TF-1 Figura 28: Capacidade anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs, PascoH- G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 e PascoHL-G4S-474 purificados para neutralizar simultaneamente IL-4 humano e IL-13 humano em um bioensaio de célula TF-1 de neutralização duplo.
Figura 29: DOML0-53-474 SEC-MALLS Figura 30: DOM9-112-210 SEC-MALLS
Figura 31: DOM9-155-25 SEC-MALLS Figura 32: Sobreposição DOM9-155-25 SEC-MALLS de todos os três sinais Figura 33: DOM9-155-147 SEC-MALLS 5 Figura 34: DOM9-155-159 SEC-MALLS Figura 35: Controle para indicação MW por SEC-MALLS:
BSA Figura 36: diagrama esquemático da molécula mAbdAb triespecífica Figura 37: ligação mAbdAb IL18mAb-210-474 (sobrenadantes) triespecífica a IL-18 humano em ELISA de ligação direta Figura 38: Ligação mAbdAb IL18mAb-210-474 (sobrenadantes) triespecífica a IL-13 humano em ELISA de ligação direta Figura 39: Ligação mAbdAb IL18mAb-210-474 (sobrenadantes) triespecífica a IL-4 humano em ELISA de ligação direta Figura 40: Ligação mAbdAb Mepo-210-474 (sobrenadantes) triespecífica a IL-13 humano em ELISA de ligação direta Figura 41: Ligação mAbdAb Mepo-210-474 (sobrenadantes) triespecífica a IL-4 humano em ELISA de ligação direta Figura 42: Clonagem do anti-TNF/anti-EGFR mAb-dAb Figura 43: Análise SDS-PAGE do anti-TNF/anti-EGFR mAb- dAb Figura 44: Perfil SEC do anti-TNF/anti-EGFR mAb-dAb (Exemplo 10) Figura 45: Atividade anti-EGFR do Exemplo 10 Figura 46: Atividade anti-TNF do Exemplo 10 Figura 47: Análise SDS-PAGE do anti-TNF/anti-VEGF mAb- dAb (Exemplo 11) Figura 48: Perfil SEC do anti-TNF/anti-VEGF mAb-dAb (Exemplo 11) Figura 49: Atividade anti-VEGF do Exemplo 11
Figura 50: Atividade anti-TNF do exemplo 11 Figura 51: Clonagem do anti-VEGF/IgG estendido por dAb anti-lL1R1 (Exemplo 12) Figura 52: Análise SDS-PAGE do anti-TNF/IgGA estendido 5 por dAb anti-VEGF (Exemplo 12) Figura 53: Análise SDS-PAGE do anti-TNF/IgGB estendido dAb por anti-VEGF (Exemplo 12) Figura 54: Perfil SEC do anti-TNF/IgGA estendido por dAb anti-VEGF (Exemplo 12) Figura 55: Perfil SEC de o anti-TNF/IgGB estendido por dAb anti-VEGF (Exemplo 12) Figura 56: Atividade anti-VEGF do Exemplo 12 (DMS2091) Figura 57 Atividade anti-VEGF do Exemplo 12 (DMS2090) Figura 58: Atividade anti-IL1 R1 do Exemplo 12 (DMS2090) Figura 59: Atividade anti-IL1R1 do Exemplo 12 (DMS2091) Figura 60: Clonagem do anti-TNF/anti-VEGF/anti-EGFR mAb-dAb (Exemplo 13) Figura 61: Análise SDS-PAGE do anti-TNF/anti-VEGF/anti- EGFR mAb-dAb (Exemplo 13) Figura 62: Atividade anti-VEGF do Exemplo 13 Figura 63: Atividade anti-TNF do Exemplo 13 Figura 64: Atividade anti-EGFR do Exemplo 13 Figura 65: Análise SEC de anticorpos biespecíficos purificados, BPC1603 (A), BPC1604 (B), BPC1605 (C), BPC1606 (D) Figura 66: Ligação de anticorpos biespecíficos a IGF-1R imobilizado Figura 67: Ligação de Anticorpos biespecíficos a VEGF imobilizado Figura 68: Inibição de fosforilação receptora mediada pelo ligando por vários anticorpos biespecíficos
Figura 69: Inibição de fosforilação receptora mediada pelo ligando por vários anticorpos biespecíficos Figura 70: ensaio ADCC com anticorpo biespecífico anti- CD20/IL-13 5 Figura 71: ensaio ADCC com anticorpo biespecífico anti- CD20/IL-13 Figura 72: ensaio ADCC com anticorpo biespecífico anti- CD20/IL-13 usando uma faixa de dosagem mais curta Figura 73: ensaio ADCC com anticorpo biespecífico anti- CD20/IL-13 usando uma faixa de dosagem mais curta Figura 74: Ensaio CDC com anticorpo biespecífico anti- CD20/IL-13 Figura 75: Ensaio CDC com anticorpo biespecífico anti- CD20/IL-13 Figura 76: Ligação BPC1803 e BPC1804 em IGF-1 R ELISA humano recombinante Figura 77: Ligação BPC1803 e BPC1804 em ELISA de ligação VEGF recombinante Figura 78: Ligação BPC1805 e BPC1806 em IGF-1 R ELISA humano recombinante Figura 79: Ligação BPC1805 e BPC1806 em HER2 humano recombinante ELISA Figura 80: Ligação BPC1807 e BPC1808 em IGF-1 R ELISA humano recombinante Figura 81: Ligação BPC1807 e BPC1808 em HER2 ELISA humano recombinante Figura 82: Ligação BPC1809 em IL-4 ELISA humano recombinante Figura 83: Ligação BPC1809 em RNAse A ELISA.
Figura 84: Ligação BPC1816 em IL-4 ELISA humano recombinante Figura 85: Ligação BPC1816 em HEL ELISA Figura 86: Ligação BPC1801 e BPC 1802 em IGF-1 R ELISA 5 humano recombinante Figura 87: Ligação BPC1801 e BPC1802 em VEGFR2 ELISA humano recombinante Figura 88: Ligação BPC1823 e BPC 1822 em IL-4 ELISA humano recombinante Figura 88b: Ligação BPC1823 (sobrenadante de concentração mais alta) em IL-4 ELISA humano recombinante Figura 89: Ligação BPC1823 e BPC1822 em TNF-α ELISA humano recombinante Figura 89b: Ligação BPC1823 (sobrenadante de concentração mais alta) em TNF-α ELISA humano recombinante Figura 90: Perfil SEC para PascoH-474 GS removido Figura 91:Perfil SEC para PascoH-TVAAPS-474 GS removido Figura 92: Perfil SEC para PascoH-GS-ASTKGPT-474 2° GS removido Figura 93: Perfil SEC para 586H-210 GS removido Figura 94: Perfil SEC para 586H-TVAAPS-210 GS removido Figura 95: SDS PAGE para PascoH-474 GS removido (linha B) e PascoH-TVAAPS-474 GS removido (linha A) Figura 96: SDS PAGE para PascoH-GS-ASTKGPT-474 2° GS removido [A = condições de não redução, B = condições de redução] Figura 97: SDS PAGE para 586H-210 GS removido (linha A) Figura 98: SDS PAGE para 586H-TVAAPS-210 GS removido (linha A) Figura 99: Ligação PascoH-474 GS purificado removido e
PascoH-TVAAPS-474 GS removido em IL-4 ELISA humano Figura 100: Ligação PascoH-474 GS purificado removido e PascoH-TVAAPS-474 GS removido em IL-13 ELISA humano Figura 101: Ligação PascoH-474 GS purificado removido, 5 PascoH-TVAAPS-474 GS removido, PascoH-616 e PascoH-TVAAPS-616 em IL-13 ELISA cinomolgo Figura 102: inibição mAbdAbs de Ligação IL-4 humano a IL- 4Rα humano por ELISA Figura 103: inibição mAbdAbs de Ligação IL-4 humano a IL- 4Rα humano por ELISA Figura 104: Neutralização de IL-13 humano no bioensaio de célula TF-1 por mAbdAbs Figura 105: Neutralização de IL-13 cinomolgo no bioensaio de célula TF-1 por mAbdAbs Figura 106: Neutralização de IL-4 humano no bioensaio de célula TF-1 por mAbdAbs Figura 107: Neutralização de IL-4 cinomolgo no bioensaio de célula TF-1 por mAbdAbs Figura 108: Capacidade de mAbdAbs para inibir a ligação de ligação IL-13 humano a IL-13Rα2 humano Figura 109: Perfil SEC para PascoH-616 Figura 110: Perfil SEC para PascoH-TVAAPS_616 Figura 111: SDS PAGE para PascoH-616 [E1 = condições de não redução, E2 = condições de redução] Figura 112: SDS PAGE para PascoH-TVAAPS-616 [A = condições de não redução, B = condições de redução] Figura 113: ligação PascoH-616 e PascoH-TVAAPS-616 purificado em IL-13 ELISA humano Figura 114: Neutralização de IL-13 humano no bioensaio de célula TF-1 por mAbdAbs Figura 114a: Neutralização de IL-13 cinomolgo no bioensaio de célula TF-1 por mAbdAbs Figura 115: Inibição de atividade IL-4 para PascoH-474 GS 5 removido Figura 116: Inibição de atividade IL-13 para PascoH-474 GS removido Figura 117: Inibição de atividade IL-4 para 586-TVAAPS-210 Figura 118: Inibição de atividade IL-13 para 586-TVAAPS- 210 Figura 119: Inibição de atividade IL-4 para Pascolizumab Figura 120: Inibição de atividade IL-4 para DOM9-112-210 Figura 121: Inibição de atividade IL-13 para anti-IL13 mAb Figura 122: Inibição de atividade IL-13 para DOML0-53-474 Figura 123: Atividade de mAb de controle e dAb no ensaio sanguíneo total IL-4 Figura 124: Atividade de mAb de controle e dAb no ensaio sanguíneo total IL-13 Figura 125: A concentração do medicamento remanescentes em vários pontos de tempo pós-dose avaliados por ELISA contra ambos TNF & EGFR.
Figura 126: A concentração do medicamento remanescentes em vários pontos de tempo pós-dose avaliados por ELISA contra ambos TNF & VEGF.
Figura 127: A concentração do medicamento remanescentes em vários pontos de tempo pós-dose avaliados por ELISA contra ambos IL1 R1 & VEGF.
Figura 128: SDS-PAGE do DMS4010 purificado Figura 129: perfil SEC do DMS4010 purificado
Figura 130: Potência anti-EGFR de DMS4010 Figura 131: Ensaio de ligação do receptor anti-VEGF Figura 132: Perfil farmacocinético do anti-EGFR alvejamento duplo/anti-VEGF mAbdAb 5 Figura 133: Análise SDS-PAGE DMS4011 purificado Figura 134: perfil SEC do DMS4011 purificado Figura 135: Potência anti-EGFR de DMS4011 Figura 136: DMS4011 no ensaio de ligação do receptor anti-
VEGF Figura 137: Análise SDS-PAGE das amostras purificadas DMS4023 e DMS4024 Figura 138: O perfil SEC para DMS4023 Figura 139: O perfil SEC para DMS4024 Figura 140: Potência anti-EGFR do mAbdAb DMS4023 Figura 141: DMS4023 e DMS4024 no ensaio de ligação do receptor anti-VEGF Figura 142: Análise SDS-PAGE do DMS4009 purificado Figura 143: O perfil SEC para DMS4009 Figura 144: Potência anti-EGFR do mAbdAb DMS4009 Figura 145: DMS4009 no ensaio de ligação do receptor anti-
VEGF Figura 146: Análise SDS-PAGE do DMS4029 purificado Figura 147: O perfil SEC para DMS4029 Figura 148: Potência anti-EGFR do mAbdAb DMS4029 Figura 149: DMS4029 no ensaio de neutralização com base na célula IL-13 Figura 150: Análise SDS-PAGE das amostras purificadas DMS4013 e DMS4027 Figura 151: O perfil SEC para DMS4013
Figura 152: O perfil SEC para DMS4027 Figura 153: Potência anti-EGFR do mAbdAb DMS4013 Figura 154: DMS4013 no ensaio de ligação do receptor anti-
VEGF 5 Figura 155: ligação BPC1616 no IL-12 ELISA humano recombinante Figura 156: ligação BPC1616 no IL-18 ELISA humano recombinante Figura 157: ligação BPC1616 no IL-4 ELISA humano recombinante Figura 158: ligação BPC1008, 1009 e BPC1010 no IL-4 ELISA humano recombinante Figura 159: ligação BPC1008 no IL-5 ELISA humano recombinante Figura 160: ligação BPC1008, 1009 e BPC1010 no IL-13 ELISA humano recombinante Figura 161: ligação BPC1017 e BPC1018 no c-MET ELISA humano recombinante Figura 162: ligação BPC1017 e BPC1018 no VEGF ELISA humano recombinante Figura 163: Perfil SEC para PascoH-TVAAPS-546 Figura 164: Perfil SEC para PascoH-TVAAPS-567 Figura 165: SDS PAGE para PascoH-TVAAPS-546 [A = condições de não redução, B = condições de redução] Figura 166: SDS PAGE para PascoH-TVAAPS-567 [A = condições de não redução, B = condições de redução] Figura 167: dados de neutralização por IL-13 humano no bioensaio de célula TF-1 Figura 168: dados de neutralização por IL-13 cinomolgo no bioensaio de célula TF-1 Figura 169: mAbdAbs contendo ligação de isótipos alternativos em IL-4 ELISA humano Figura 170: mAbdAbs contendo ligação de isótipos 5 alternativos em IL-13 ELISA humano Figura 171: ligação BPC1818 e BPC1813 em EGFR ELISA humano recombinante Figura 172: ligação BPC1818 e BPC1813 em VEGFR2 ELISA humano recombinante Figura 173: ligação anti-IL5mAb-anti-IL13dAb em IL-13
ELISA Figura 174: ligação anti-IL5mAb-anti-IL13dAb em IL-5
ELISA Figura 175: ligação BPC1812 em VEGFR2 ELISA humano recombinante Figura 176: ligação BPC1812 em EGFR ELISA humano recombinante Figura 177: ligação mAbdAb em IL-13 ELISA humano
1. Anticorpos de domínio SEQ ID NO: 1 = DOM9-155- 25
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASTLDSGVPSRFSGSG
SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 2 = DOM9-155-147
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLYEGVPSRFSGSG
SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 3 = DOM9-155-154
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLQGGVPSRFSGSG
SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 4 = DOM9-112-210
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKG
RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 5 = DOML0-53-474
GVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 60 = Sequência de DNA de DOM9-155-147 (proteína = SEQ ID NO:2)
GACATCCAGATGACCCAATCACCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACT tGCCGGGCAAGTCGCCCCATtAGCGACTGGTTACATtGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCC AAGCTCCTGATCGCCTGGGCGtCCTCGTTGTACGAGGGGGtCCCATCACGtTTCAGTGGCAGTGGG
TCGGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCCGAAGATTTCGCTACGTACTACTGT
TTGCAGGAGGGGTGGGGTCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG SEQ ID NO: 61 = Sequência de DNA de DOM9-155-154 (proteína = SEQ ID NO:3)
GACATCCAGATGACCCAATCACCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACT TGCCGGGCAAGTCGCCCCATTAGCGACTGGTTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCC AAGCTCCTGATCGCCTGGGCGTCCAGCTTGCAGGGGGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGG TCGGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCCGAAGATTTCGCTACGTACTACTGT TTGCAGGAGGGGTGGGGTCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
2. Ligantes SEQ ID NO: 6 = G4S ligante
GGGGS SEQ ID NO: 7 = ligante
TVAAPS SEQ ID NO: 8 = ligante
ASTKGPT SEQ ID NO: 9 = ligante
ASTKGPS SEQ ID NO: 10 = ligante
EPKSCDKTHTCPPCP SEQ ID NO: 11 = ligante
ELQLEESCAEAQDGELDG
3. Anticorpos monoclonais SEQ ID NO: 12 = MAb IL13 anti-humano (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 13 = MAb IL13 anti-humano (Cadeia L)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKISDRFSGVPDR FSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGIYYCFQGSHVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 14 = Pascolizumab (Cadeia H)
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 15 = Pascolizumab (Cadeia L)
DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC
EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 65 = Mepolizumab (Cadeia H)
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLTSYSVHWVRQPPGKGLEWLGVIWASGGTDYNSALMSR LSISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARDPPSSLLRLDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 66 = Mepolizumab (Cadeia L)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNVHSFPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY
ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 67 = MAb de IL-18 anti-humano (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRQAPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKD RVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP
ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 68 = MAb de IL-18 anti-humano (Cadeia L)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSG SGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
4. mAbdAbs biespecíficos NB, a porção sublinhada da sequência em texto em “negrito” corresponde ao ligante. (resíduos de aminoácido ‘GS’) a sequência codificadora de DNA da qual foi usado o local de clonagem de BamHI) não estão em texto em ‘negrito’, mas são sublinhados. SEQ ID NO: 16 = 586H-25 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSDIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASTLDSGVPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 17 = 586H-147 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSDIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLYEGVPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 18 = 586H-154 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSDIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLQGGVPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 19 = 586H-210 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEVQLL ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFTIS
RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 20 = 586H-G4S-25 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASTLDSGVPSRFSGSGSG
TDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 21 = 586H-G4S-147 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLYEGVPSRFSGSGSG
TDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 22 = 586H-G4S-154 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLQGGVPSRFSGSGSG
TDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 23 = 586H-G4S-210 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEV QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRF
TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 24 = 586H-TVAAPS-25 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSG SDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASTLDSGVPSRFSGS
GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 25 = 586H-TVAAPS-147 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSG SDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLYEGVPSRFSGS
GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 26 = 586H-TVAAPS-154 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSG SDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLQGGVPSRFSGS
GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 27 = 586H-TVAAPS-210 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSG SEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 28 = 586H-ASTKG-25 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSASTKG PTGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASTLDSGVPSRF
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 29 = 586H-ASTKG-147 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSASTKG PTGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLYEGVPSRF
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 30 = 586H-ASTKG-154 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSASTKG PTGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLQGGVPSRF
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 31 = 586H-ASTKG-210 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSASTKG PTGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 32 = 586H-EPKSC-25 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEPKSC DKTHTCPPCPGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASTL
DSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 33 = 586H-EPKSC-147 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEPKSC DKTHTCPPCPGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSL
YEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 34 = 586H-EPKSC-154 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEPKSC DKTHTCPPCPGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSL
QGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 35 = 586H-EPKSC-210 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEPKSC DKTHTCPPCPGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISS
GTETYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 36 = 586H-ELQLE-25 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSELQLE ESCAEAQDGELDGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWA
STLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 37 = 586H-ELQLE-147 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSELQLE ESCAEAQDGELDGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWA
SSLYEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 38 = 586H-ELQLE-154 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSELQLE ESCAEAQDGELDGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWA
SSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 39 = 586H-ELQLE-210 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSELQLE ESCAEAQDGELDGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWI
ISSGTETYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 40 = 586H-GS (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGS SEQ ID NO: 41 = 586H-ASTKG (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSASTKG
PTGS SEQ ID NO: 42 = 586H-EPKSC (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEPKSC
DKTHTCPPCPGS SEQ ID NO: 43 = 586H-ELQLE (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSELQLE
ESCAEAQDGELDGGS SEQ ID NO: 44 = 586L-G4S-25 (Cadeia L)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKISDRFSGVPDR FSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGIYYCFQGSHVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKP GKAPKLLIAWASTLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEI
KR SEQ ID NO: 45 = 586L-G4S-147 (Cadeia L)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKISDRFSGVPDR FSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGIYYCFQGSHVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKP GKAPKLLIAWASSLYEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEI
KR SEQ ID NO: 46 = 586L-G4S-154 (Cadeia L)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKISDRFSGVPDR FSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGIYYCFQGSHVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKP GKAPKLLIAWASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEI
KR SEQ ID NO: 47 = 586L-G4S-210 (Cadeia L)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKISDRFSGVPDR FSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGIYYCFQGSHVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQA PGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYW
GQGTLVTVSS SEQ ID NO: 48 = PascoH-474 (Cadeia H)
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSGVQLLESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 49 = PascoH-G4S-474 (Cadeia H)
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGVQLLE SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISR
DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 50 = PascoH-TVAAPS-474 (Cadeia H)
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSGVQ LLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFT
ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 51 = PascoH-ASTKG-474 (Cadeia H)
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSASTKGPTGS GVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKG
RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 52 = PascoH-EPKSC-474 (Cadeia H)
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEPKSCDKTH TCPPCPGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVT
YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 53 = PascoH-ELQLE-474 (Cadeia H)
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSELQLEESCA EAQDGELDGGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHG
EVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 54 = PascoL-474 (Cadeia L)
DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGECGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKG LEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQ
GTLVTVSS SEQ ID NO: 55 = PascoL-G4S-474 (Cadeia L)
DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAP GKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDY
WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 56 = PascoL-TVAAPS-474 (Cadeia L)
DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVR QAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPG
YDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 57 = PascoL-ASTKG-474 (Cadeia L)
DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGECASTKGPTGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWV RQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEP
GYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 58 = PascoL-EPKSC-474 (Cadeia L)
DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGECEPKSCDKTHTCPPCPGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF AWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY
CATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 59 = PascoL-ELQLE-474 (Cadeia L)
DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGECELQLEESCAEAQDGELDGGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG FTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS
5. Citocinas SEQ ID NO: 62 = IL-4 (Interleucina-4)
HKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKD TRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKY
SKCSS SEQ ID NO: 63 = IL-13 (Interleucina-13)
GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRML SGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN
6. Sequência sinalizadora SEQ ID NO: 64 = sequência sinalizadora de aminoácido de mamífero
MGWSCIILFLVATATGVHS
7. CDRs de ligação a IGF-1R SEQ ID 80 = VH CDR3
WILYYGRSKWYFDV SEQ ID 81 = VH CDR2
NINPNNGGTNYNQKFKD SEQ ID 82 = VH CDR1
DYYMN SEQ ID 83 = VL CDR1
RSSQSIVQSNGDTYLE SEQ ID 84 = VL CDR2 alternativo
RISNRFS SEQ ID 85 = VL CDR3
FQGSHVPYT SEQ ID 86 = VL CDR2
RVSNRFS
8. mAbdAbs Triespecíficos SEQ ID NO: 69 = IL18mAb-G4S-DOM9-112-210 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRQAPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKD RVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSE VQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGR
FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 70 = IL18mAb-G4S-DOML0-53-474 (Cadeia L)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSG SGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGL EWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQG
TLVTVSS SEQ ID NO: 71 = IL-5 mAb-G4S-DOM9-112-210 Cadeia pesada
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLTSYSVHWVRQPPGKGLEWLGVIWASGGTDYNSALMSR LSISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARDPPSSLLRLDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESG GGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFTISRDN
SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 72 = IL-5 mAb-G4S-DOML0-53-474 Cadeia leve
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNVHSFPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQ APGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGY DYWGQGTLVTVSS
9. mAbdAb anti-TNF/anti-EGFR de alvejamento duplo SEQ ID NO: 73 = anti-TNFmAb (Cadeia L)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 74 = anti-TNFmAb-DOML6-39-542 (Cadeia H)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTGDIQMTQSP SSLSASVGDRVTITCRASQWIGNLLDWYQQKPGKAPKLLIYYASFLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQANPAPLTFGQGTKVEIKR
10. mAbdAb de anti-TNF/anti-VEGF alvejamento duplo SEQ ID NO: 75 = anti-TNFmAb-DOML5-26-593 (Cadeia H)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTGEVQLLVSG GGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
11. IgG estendido por dAb anti-IL1 R1/anti-VEGF de alvejamento duplo SEQ ID NO: 76 = DOM 15-26-593-VHdUMMY (Cadeia H)
EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSEVQLLESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 77 = DOM4-130-54-VkdUMMY (Cadeia L)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIYLNLDWYQQKPGKAPKLLINFGSELQSGVPSRFSGSG YGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQPSFYFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQSYSTPNTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
12. mAbdAb anti-TNF/anti-EGFR/anti-VEGF de alvejamento triplo SEQ ID NO: 78 = DOM 15-26-anti-TNFmAb (Cadeia H)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSEVQLVESGG GLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNA KNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 79 = DOM 16-39-542-anti-TNFmAb (Cadeia L)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGNLLDWYQQKPGKAPKLLIYYASFLQSGVPSRFSGSG YGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANPAPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVA TYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV
DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 87 = 586H-210 (Cadeia H) GS removido
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEVQLLES GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFTISRD
NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 88 = 586H-TVAAPS-210 (Cadeia H) GS removido
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSE VQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGR
FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 89 = 586H-ASTKGPT-210 (Cadeia H) ambos os GS removidos
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKASTKGPT EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKG
RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 90 = 586H-ASTKGPS-210 (Cadeia H) ambos os GS removidos
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKASTKGPS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKG
RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 91 = PascoH-474 (Cadeia H) GS removido
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGVQLLESGGGL VQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKN
TLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 92 = PascoH-TVAAPS-474 (Cadeia H) GS removido
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGVQLL ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTIS
RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 93 = PascoH-ASTKGPT-474 (Cadeia H) Ambos os GS removidos
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKASTKGPTGVQL LESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTI
SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 94 = PascoH-ASTKGPS-474 (Cadeia H) Ambos os GS removidos
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKASTKGPSGVQL LESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTI
SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 95 = PascoH-ASTKGPS-474 (Cadeia H) Segundo GS removido
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSASTKGPSGV QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRF
TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 96 = PascoH-ASTKGPT-474 (Cadeia H) Segundo GS removido
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSASTKGPTGV QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRF
TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 97 = CDRH1
GYSITSDFAWN SEQ ID NO: 98 = CDRH2
GYISYSGNYNPSLK SEQ ID NO: 99 = CDRH3
VTAGRGFPY SEQ ID NO: 100 = CDRL1
HSSQDINSNIG SEQ ID NO: 101 = CDRL2
HGINLDD SEQ ID NO: 102 = CDRL3
VQYAQFPWT SEQ ID NO: 103 = epítopo EGFR
CGADSYEMEEDGVRKC SEQ ID NO: 104 = CDRH1
SDFAWN SEQ ID NO: 105 = CDRH2
YISYSGNYNPSLK SEQ ID NO: 106 = CDRH3
AGRGFPY
SEQ ID NO: 107 = CDRH2
YISYSGNYNPSLKS SEQ ID NO: 108 = Cadeia pesada de anticorpo anti-IGF-1R H0L0 com DOML5-26-593 fundido no terminal C com ligante TVAAPSGS
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKD RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSE VQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGR
FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 109 = Cadeia pesada de anticorpo anti-IGF-1R H0L0 com DOML5-26-593 fundido no terminal C com ligante GS
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKD RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEVQLLVS GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRD
NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 110 = Cadeia pesada de anticorpo anti-IGF-1R H0L0
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKD RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN
YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 111 = Cadeia leve de anticorpo anti-IGF-1 R H0L0 com DOML5-26-593 fundido no terminal C com ligante TVAAPSGS
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDR FSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWV RQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKL
DYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 112 = Cadeia leve de anticorpo anti-IGF-1 R H0L0 com DOML5-26-593 fundido no terminal C com ligante GS
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDR FSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGK GLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQG
TLVTVSS SEQ ID NO: 113 = Cadeia leve de anticorpo anti-IGF-1 R H0L0
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDR FSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 114 = Domínio pesado variável de anticorpo 2B9
QVQLKQSGPGLVQSSQSLSITCTISGFSLTSHGIYWLRQSPGKGLEWLGVIWSGGSADYNAAFISR
LSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARSPYYYRSSLYAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 115 = Domínio leve variável de anticorpo 2B9
NIVLTQSPKSMSMSIGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKAEQSPKLLIYGASNRHTGVPDRFTGSG
SSTDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYSDPLTFGAGTKLELKRA SEQ ID NO: 116 = Sequência de proteína de mAb anti-CD20 cadeia pesada com ligante TVAAPSGS e DOML0-53-474 anticorpo de domínio fundido no terminal C
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSGVQ LLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFT
ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 117 = Sequência de proteína mAb anti-CD20 VL-humano CK cadeia leve
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGS GTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ
GLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 118 = Sequência de proteína de mAb anti-CD20 cadeia pesada com ligante GS e DOML0-53-474 anticorpo de domínio fundido no terminal C
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSGVQLLESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNS
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 119 = Sequência de proteína de mAb anti-CD20 cadeia leve com ligante TVAAPSGS e DOML0-53-474 anticorpo de domínio fundido no terminal C
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGS GTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGECTVAAPSGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGK GLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWG QGTLVTVSS
SEQ ID NO: 120 = Sequência de proteína de mAb anti-CD20 VH-humano IgG1 cadeia pesada
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 121 = Sequência de proteína de mAb anti-CD20 cadeia leve com ligante GS e DOML0-53-474 anticorpo de domínio fundido no terminal C
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGS GTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGECGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVS SIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVT
VSS SEQ ID NO: 122: 586H-TVAAPS-154 Cadeia pesada
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGC AAGGCCTCCGGCTTCTACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGC CTGGAGTGGATGGGCACTATCGACCCCGCCAACGGCAACACCAAGTACGTGCCCAAGTTCCAGGGC AGGGTGACCATCACCGCCGATGAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCT GAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCATCTACGACGACTACCACTACGACGACTACTAC GCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGC GTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTG AAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGC AGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTG CTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTAC CGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAG GTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGA GAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAG AACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTG ACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG CACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGA TCCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATT ACCTGCAGGGCCAGCAGGCCCATCAGCGACTGGCTGCACTGGTACCAACAGAAGCCCGGCAAGGCT CCCAAGCTGCTGATCGCCTGGGCCAGCAGCCTGCAGGGAGGCGTGCCCAGCAGGTTTAGCGGCAGC GGCAGCGGCACCGACTTCACCCTCACCATCTCTTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTAC
TGCCTGCAGGAGGGCTGGGGGCCCCCTACTTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGG SEQ ID NO: 123
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKD RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSDGGGIRR SMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKY TADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTES
ILIPRQSETCSPG SEQ ID NO: 124
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKD RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEVVAATP TSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNG
RLLSIPISINYRT SEQ ID NO:125
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKD RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSD GGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRT KERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGAR
GLSTESILIPRQSETCSPG SEQ ID NO: 126
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKD RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSVDNKFNK
ELRQAYWEIQALPNLNWTQSRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK SEQ ID NO: 127
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKD RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSV
DNKFNKELRQAYWEIQALPNLNWTQSRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK SEQ ID NO: 128
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKD RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSDLGKKLL EAARAGQDDEVRILMANGADVNAKDEYGLTPLYLATAHGHLEIVEVLLKNGADVNAVDAIGFTPLH
LAAFIGHLEIAEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIGNGNEDLAEILQKL SEQ ID NO: 129
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKD RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSD LGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNAKDEYGLTPLYLATAHGHLEIVEVLLKNGADVNAVDAI
GFTPLHLAAFIGHLEIAEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIGNGNEDLAEILQKL SEQ ID NO: 130
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSQVQLVESGG GLVQAGGSLRLSCAASGYAYTYIYMGWFRQAPGKEREGVAAMDSGGGGTLYADSVKGRFTISRDKG
KNTVYLQMDSLKPEDTATYYCAAGGYELRDRTYGQWGQGTQVTVSS SEQ ID NO: 131
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSARVDQTPRS VTKETGESLTINCVLRDASYALGSTCWYRKKSGEGNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTV
EDGGTYRCGLGVAGGYCDYALCSSRYAECGDGTAVTVN SEQ ID NO: 132: Anti IL-4 Cadeia pesada-TVAAPSGS-anti-TNF-a adnectina
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGC ACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGC AAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAG AGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGAC CCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTG TGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCC AGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACC TGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCC GTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTG TACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAG GGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG ACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAG AGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGTGAGCGAC GTGCCAAGGGACCTCGAGGTGGTGGCAGCCACTCCCACCTCTCTGCTGATCAGCTGGGACACACAC AACGCCTACAACGGCTACTACAGGATCACCTACGGAGAGACCGGCGGCAATAGCCCCGTGAGGGAG TTCACCGTGCCCCACCCCGAGGTGACCGCCACCATTAGCGGCCTGAAGCCCGGCGTGGACGATACC ATCACCGTCTACGCCGTGACCAACCACCACATGCCCCTGAGGATCTTCGGCCCCATCAGCATCAAC
CATAGGACC SEQ ID NO: 133
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKD RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSE VVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAV
TDGRNGRLLSIPISINYRT SEQ ID NO: 134
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSVSDVP RDLEVVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPGVDDTIT
VYAVTNHHMPLRIFGPISINHRT SEQ ID NO: 135
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSG SVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPG
VDDTITVYAVTNHHMPLRIFGPISINHRT SEQ ID NO: 136
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSR LSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKRSEVVAATPTSLL ISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLS
IPISINYRT SEQ ID NO: 137
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSG SGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 138
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSG SGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGECRSEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPT
ATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT SEQ ID NO: 139
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSR LSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 140
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLK SRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEVVAATPTS LLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRL
LSIPISINYRT SEQ ID NO: 141
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSG SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQYGSTPLTFGGGTKAEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 142
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSG SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQYGSTPLTFGGGTKAEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGECGSEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPT
ATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT SEQ ID NO: 143
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLK SRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 144
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYA VTDGRNGRLLSIPISINYRTGSTGQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPG KGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAY WGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 145
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYA VTDGRNGRLLSIPISINYRTSTGDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGS PRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL
SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 146
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSVSDVPRDLE VVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPGVDDTITVYAV
TNHHMPLRIFGPISINHRT SEQ ID NO: 147
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSVSD VPRDLEVVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPGVDDT
ITVYAVTNHHMPLRIFGPISINHRT SEQ ID NO: 148 = DOML0-53-616 (dAb)
GVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFPWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGKITYYADSVKG
RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 149 = PascoH-616 (Cadeia H)
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGVQLLESGGGL VQPGGSLRLSCAASGFVFPWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGKITYYADSVKGRFTISRDNSKN
TLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 150 = PascoH-TVAAPS-616 (Cadeia H)
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGVQLL ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFPWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGKITYYADSVKGRFTIS
RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 151 = C1-TVAAPSGS-210 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSG SEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 152 = D1-TVAAPSGS-210 (Cadeia H)
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGFYIKDTYMHWVRQMPGKGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQG QVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSG SEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 153 = N0 (Cadeia L)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSQNIVHINGNTYLEWYQQKPGQAPRLLIYKISDRFSGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 154 = M0 (Cadeia L)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSQNIVHINGNTYLEWYQQKPGQAPRLLIYKISDRFSGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 155 = 656H-TVAAPS-210 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFIDYEIHWVRQAPGQGLEWMGAIDPETGGTAYNQKFKG RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRILLYYYPMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSEVQLLES GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFTISRD
NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 156 = 656 (Cadeia L)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNISDYLHWYQQKPGQAPRLLIYYASQSISGIPARFSGSG SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHSFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 157 = PascoH-TVAAPS-546 (Cadeia H)
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGVQLL ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFPWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWKGGKTYYADSVKGRFTIS
RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 158 = PascoH-546 (Cadeia H)
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGVQLLESGGGL VQPGGSLRLSCAASGFVFPWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWKGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN
TLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 159 = PascoH-TVAAPS-567 (Cadeia H)
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGVQLL ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTIS
RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 160 = PascoH-567 (Cadeia H)
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGVQLLESGGGL VQPGGSLRLSCAASGFVFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKN
TLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 161 = 656 (Cadeia H)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFIDYEIHWVRQAPGQGLEWMGAIDPETGGTAYNQKFKG RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRILLYYYPMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 162
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGT GCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGGCTTATCCGATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGT CTAGAGTGGGTCTCAGAGATTTCGCCTTCGGGTTCTTATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGC CGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCC GAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGGAAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACC CTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGA GGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGC TATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGT AGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCC AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCG AAAAGTTATGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACC AAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTG GGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACC TCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTG ACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAAC ACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCT GCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATG ATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTAC AACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAG TACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAG GGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAG GTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAC GGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTG TACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATG
CACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 163
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSEVQLLESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 164
CAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCCTCTCAGAGCCTGAGCATCACCTGTACCGTGAGCGGCTTC AGCCTGACCAATTACGGCGTGCATTGGGTGCGGCAGTCTCCAGGCAAGGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGTCCGGC GGCAACACCGACTACAACACCCCCTTCACCAGCAGACTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAG ATGAACAGCCTGCAGAGCAACGACACCGCCATCTACTATTGTGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTAC TGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAG AGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGC GGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAA GTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCTAGCGTGTTC CTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCAC GAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAG TACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAA GTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTAC ACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGC TTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAG GCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTCGACCGGTGAGGTGCAGCTGTTGGTGTCT GGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGGCTTATCCGATG ATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTTTCAGAGATTTCGCCTTCGGGTTCTTATACATACTACGCA GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCC GAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGGAAGTTAGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCG
AGC SEQ ID NO: 165:
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AEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 166
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TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 167 586H-TVAAPS-210 Cadeia Pesada
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGC AAGGCCTCCGGCTTCTACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGC CTGGAGTGGATGGGCACTATCGACCCCGCCAACGGCAACACCAAGTACGTGCCCAAGTTCCAGGGC AGGGTGACCATCACCGCCGATGAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCT GAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCATCTACGACGACTACCACTACGACGACTACTAC GCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGC GTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTG AAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGC AGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTG CTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTAC CGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAG GTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGA GAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAG AACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTG ACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG CACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGA TCCGAAGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGC TGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGGAACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAG GGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATCATCAGCTCCGGCACCGAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAG GGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGG GCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTGGGCAGGTTCGACTACTGGGGACAGGGG
ACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 168
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCCGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGT GCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGACTACGCCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGC CTGGAGTGGGTGTCCGCCATCACCTGGAATAGCGGCCACATCGACTACGCCGACAGCGTGGAGGGC AGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCC GAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGTGTCCTACCTGAGCACCGCCAGCAGCCTGGACTAC TGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAG CCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCT AGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACC TGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCT GTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTC TACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAG GGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG ACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAG AGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTCGACCGGTGAGGTGCAGCTGTTGGTGTCTGGG GGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAG GCTTATCCGATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTTTCAGAGATTTCG CCTTCGGGTTCTTATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAAT TCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGT
GCGAAAGATCCTCGGAAGTTAGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC SEQ ID NO: 169
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGCCGGGCCAGCCAG GGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCACCCTG CAGAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAG GACGTGGCCACCTACTACTGCCAGCGGTACAACAGAGCCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGT ACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTCAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTG CTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGC GTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCAC
AAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC SEQ ID NO: 170
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCCGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGT GCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGACTACGCCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGC CTGGAGTGGGTGTCCGCCATCACCTGGAATAGCGGCCACATCGACTACGCCGACAGCGTGGAGGGC AGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCC GAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGTGTCCTACCTGAGCACCGCCAGCAGCCTGGACTAC TGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAG CCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCT AGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACC TGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCT GTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTC TACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAG GGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG ACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAG AGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTCGACCGGTGACATCCAGATGACCCAGAGCCCT TCAAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCCGGGCCAGCCAGTGGATCGGC AACCTGCTGGACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGC TTCCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGCTACGGCACCGACTTCACCCTGACC ATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGCCAACCCTGCCCCCCTG
ACCTTCGGCCAGGGTACCAAGGTGGAAATCAAACGG SEQ ID NO: 171
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACT TGCCGGGCAAGTCAGGATATTTACCTGAATTTAGACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCT AAGCTCCTGATCAATTTTGGTTCCGAGTTGCAAAGTGGTGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGA TATGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCTACGTACTACTGT CAACCGTCTTTTTACTTCCCTTATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTG GCCGCCCCCAGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGT GTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTACCAGCAGAAACCA GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTC AGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCT ACGTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTAATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATC AAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTCAAGAGCGGC ACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTG GACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACC TACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGC
GAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC SEQ ID NO: 172
GAGGTGCAGCTGTTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGT GCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGGCTTATCCGATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGT CTAGAGTGGGTTTCAGAGATTTCGCCTTCGGGTTCTTATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGC CGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCC GAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGGAAGTTAGACTACTGGGGTCAGGGAACC CTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGA GGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGC TATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGT AGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCC AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCG AAAAGTTATGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACC AAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTG GGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACC TCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTG ACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAAC ACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCT GCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATG ATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTAC AACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAG TACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAG GGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAG GTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAC GGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTG TACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATG
CACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 173
CAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCCTCTCAGAGCCTGAGCATCACCTGT ACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCAATTACGGCGTGCATTGGGTGCGGCAGTCTCCAGGCAAGGGC CTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGTCCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCCTTCACCAGCAGA CTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACAGCCTGCAGAGCAAC GACACCGCCATCTACTATTGTGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGC CAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCC AGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAG CCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG CAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAG AGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCTAGCGTG TTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTG GTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTG CACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTG ACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTG CCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACC CTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTC TACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACC CCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAG AAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGAGGTGCAGCTGTTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG CCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGGCTTATCCGATGATG TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTTTCAGAGATTTCGCCTTCGGGTTCTTAT ACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTG TATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGG
AAGTTAGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC SEQ ID NO: 174
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQ VFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEVQLLVSGGGLVQ PGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED
TAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 175
CAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCCTCTCAGAGCCTGAGCATCACCTGTACCGTGAGCGGCTTC AGCCTGACCAATTACGGCGTGCATTGGGTGCGGCAGTCTCCAGGCAAGGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGTCCGGC GGCAACACCGACTACAACACCCCCTTCACCAGCAGACTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAG ATGAACAGCCTGCAGAGCAACGACACCGCCATCTACTATTGTGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTAC TGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAG AGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGC GGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAA GTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCTAGCGTGTTC CTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCAC GAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAG TACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAA GTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTAC ACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGC TTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAG GCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTCGACCGGTGGTGGAGGTGGATCAGAGGTG CAGCTGTTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTT AAGGCTTATCCGATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTTTCAGAGATTTCGCCTTCGGGTTCT TATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATG AACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGGAAGTTAGACTACTGGGGTCAGGGAACC
CTGGTCACCGTCTCGAGC SEQ ID NO: 176
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQ VFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTGGGGGSEVQLL VSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ
MNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 177
CAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCCTCTCAGAGCCTGAGCATCACCTGTACCGTGAGCGGCTTC AGCCTGACCAATTACGGCGTGCATTGGGTGCGGCAGTCTCCAGGCAAGGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGTCCGGC GGCAACACCGACTACAACACCCCCTTCACCAGCAGACTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAG ATGAACAGCCTGCAGAGCAACGACACCGCCATCTACTATTGTGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTAC TGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAG AGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGC GGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAA GTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCTAGCGTGTTC CTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCAC GAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAG TACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAA GTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTAC ACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGC TTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAG GCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTCGACCGGTGGTGGAGGTGGATCAGGTGGA GGTGGATCAGAGGTGCAGCTGTTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC TCCGGATTCACCTTTAAGGCTTATCCGATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTTTCAGAGATT TCGCCTTCGGGTTCTTATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACG CTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGGAAGTTAGACTAC
TGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC SEQ ID NO: 178
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQ VFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTGGGGGSGGGGS EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKN
TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 179
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGC GCCGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACGGCATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGC CTGGAATGGGTGGGCTGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGCCGACTTCAAGCGG CGGTTCACCTTCAGCCTGGACACCAGCAAGAGCACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCC GAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGTACCCCCACTACTACGGCAGCAGCCACTGGTACTTC GACTACTGGGGGCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTC CCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGAC TACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTC CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGC CTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAA GTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGC GGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAA GTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTG GTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGC AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCC CAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTG GTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAT CACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTCGACCGGTGACATCCAGATGACCCAG AGCCCTTCAAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCCGGGCCAGCCAGTGG ATCGGCAACCTGCTGGACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTAC GCCAGCTTCCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGCTACGGCACCGACTTCACC CTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGCCAACCCTGCC
CCCCTGACCTTCGGCCAGGGTACCAAGGTGGAAATCAAACGG SEQ ID NO: 180
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR RFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTGDIQMTQ SPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGNLLDWYQQKPGKAPKLLIYYASFLQSGVPSRFSGSGYGTDFT
LTISSLQPEDFATYYCQQANPAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 181
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACC TGCAGCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCC AAGGTGCTGATCTACTTCACCAGCTCCCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGC TCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGC CAGCAGTACAGCACCGTGCCCTGGACCTTCGGCCAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG GCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCTCCGTG GTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTG CAGTCCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCAC
CAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC SEQ ID NO: 182
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL
QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 183
CAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCCTCTCAGAGCCTGAGCATCACCTGT ACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCAATTACGGCGTGCATTGGGTGCGGCAGTCTCCAGGCAAGGGC CTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGTCCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCCTTCACCAGCAGA CTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACAGCCTGCAGAGCAAC GACACCGCCATCTACTATTGTGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGC CAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCC AGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAG CCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG CAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAG AGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCTAGCGTG TTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTG GTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTG CACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTG ACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTG CCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACC CTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTC TACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACC CCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAG AAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTCGACCGGTGGGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGC TTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTCGCTTGGTAT GATATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAGTATTGATTGGCAT GGTGAGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAG AACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGACA
GCGGAGGACGAGCCGGGGTATGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC SEQ ID NO:184
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFK MNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTGGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDM GWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVT
VSS SEQ ID NO: 185
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKN SLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTGDIQMTQSP SSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAT
YYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 186
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQ VFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTGDIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY
CQQYMFQPMTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 187
GACATCCTGCTGACCCAGAGCCCCGTGATCCTGAGCGTGAGCCCTGGCGAGAGAGTGAGCTTCAGCTGCCGGGCCAGCCAG AGCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGACCAACGGCAGCCCCAGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGTCC ATCAGCGGCATCCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAGCATCAACAGCGTGGAGAGCGAG GATATCGCCGACTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGT ACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTCAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTG CTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGC GTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCAC AAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGGATCC ACCGGCGAGGTGCAGCTGTTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCC GGATTCACCTTTAAGGCTTATCCGATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTTTCAGAGATTTCG CCTTCGGGTTCTTATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTG TATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGGAAGTTAGACTACTGG
GGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC SEQ ID NO: 188
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINS VESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGSTGEVQLLVSGGGLVQ PGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED
TAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 189
GACATCCTGCTGACCCAGAGCCCCGTGATCCTGAGCGTGAGCCCTGGCGAGAGAGTGAGCTTCAGCTGCCGGGCCAGCCAG AGCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGACCAACGGCAGCCCCAGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGTCC ATCAGCGGCATCCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAGCATCAACAGCGTGGAGAGCGAG GATATCGCCGACTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGT ACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTCAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTG CTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGC GTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCAC AAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGGATCC ACGGTGGCCGCCCCCAGCGAGGTGCAGCTGTTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGGCTTATCCGATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTT TCAGAGATTTCGCCTTCGGGTTCTTATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCC AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGGAAG
TTAGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC SEQ ID NO: 190
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINS VESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGSTVAAPSEVQLLVSGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
RAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 191
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLTSYSVHWVRQPPGKGLEWLGVIWASGGTDYNSALMSRLSISKDT SRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARDPPSSLLRLDYWGRGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 192: 586H-ASTKG-210 Cadeia Pesada
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGC AAGGCCTCCGGCTTCTACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGC CTGGAGTGGATGGGCACTATCGACCCCGCCAACGGCAACACCAAGTACGTGCCCAAGTTCCAGGGC AGGGTGACCATCACCGCCGATGAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCT GAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCATCTACGACGACTACCACTACGACGACTACTAC GCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGC GTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTG AAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGC AGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTG CTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTAC CGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAG GTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGA GAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAG AACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTG ACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG CACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCAGCCAGCACCAAGGGC CCCACGGGATCCGAAGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTG AGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGGAACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCC CCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATCATCAGCTCCGGCACCGAGACCTACTACGCCGAC AGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAAC AGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTGGGCAGGTTCGACTACTGG
GGACAGGGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 193
EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSKSVMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKYYNPSLK SRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRGIRSAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPEVQLVQS GTEVKKPGESLKISCKGSGYTVTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGFIYPGDSETRYSPTFQGQVTISAD KSFNTAFLQWSSLKASDTAMYYCARVGSGWYPYTFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSEVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 194
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVSNDVAWYQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDYNSPWTFGGGTKVEIKRTVAAPEIVMTQSPATLSVSPGERA TLSCRASESASSNLAWYQQKPGQAPRLFIYTASTRATDIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAV YYCQQYNNWPSITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV
DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 195: Anti IL-5 Cadeia pesada-G4S-dAb474-TVAAPSGS-dAb210
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLTSYSVHWVRQPPGKGLEWLGVIWASGGTDYNSALMSR LSISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARDPPSSLLRLDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGVQLLESG GGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSTVAAPSGSEVQLLESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY
LQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 196: Anti CD-20 Cadeia pesada-TVAAPSGS-dAb154-TVAAPSGS- dAb474
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSDIQ MTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLQGGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSGSGVQLLESGGGLVQPGGSLR LSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNS
LRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 197: Anti CD-20 Cadeia pesada-TVAAPSGS-dAb210-TVAAPSGS- dAb474
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSEVQ LLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSSTVAAPSGSGVQLLESGGGL VQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKN
TLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 198: anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (orifício)-GS-dAb593
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKD RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEVQLLVSGGGL VQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKN
TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 199: anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (saliência)-GS-dAb593
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQA PGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYW
GQGTLVTVSS SEQ ID NO: 200: anti cMET 5D5v2 Cadeia leve
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 201: anti cMET 5D5v2 IgG4 Cadeia pesada (UNIBODY)-GS-dAb593
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKD RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP CSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTK TYTCNVDHKPSNTKVDKRVAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASG FTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA
VYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 202: anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (orifício)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKD RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 203: anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (knob)
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF
SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 204: anti cMET 5D5v2 IgG4 Cadeia pesada (UNIBODY)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKD RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP CSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTK TYTCNVDHKPSNTKVDKRVAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR
LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 205: Cadeia pesada de mAb de IL13 anti-humano
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGC AAGGCCTCCGGCTTCTACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGC CTGGAGTGGATGGGCACTATCGACCCCGCCAACGGCAACACCAAGTACGTGCCCAAGTTCCAGGGC AGGGTGACCATCACCGCCGATGAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCT GAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCATCTACGACGACTACCACTACGACGACTACTAC GCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGC GTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTG AAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGC AGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTG CTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTAC CGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAG GTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGA GAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAG AACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTG ACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG CACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO: 206: Cadeia pesada de mAb de IL13 anti-humano alternativa
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGC AAGGCTTCTGGATTCTACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGG CTTGAGTGGATGGGAACGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGTCCCGAAGTTCCAGGGC AGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCT GAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGCATCTATGATGATTACCACTACGACGATTACTAT GCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCG GTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTC AAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCC AGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTC CTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC TGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAG AACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTC ACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG
CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ ID NO 207: PascoH IgG2-GS-474 pesada
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFG TQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPA PIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP MLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSGVQLLESGGGLVQ PGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTL
YLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO 208: PascoH IgG4-GS-474 Cadeia pesada
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGSGVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO 209: PascoH IgG4PE-GS-474 Cadeia pesada
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGSGVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 210: Cadeia leve de mAb de IL13 anti-humano
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCTCTGAGCCTCCCCGTGACCCCCGGCGAACCAGCCAGCATCTCC TGCAGAAGCAGCCAGAACATCGTGCACATCAACGGCAACACCTACCTGGAGTGGTACCTGCAAAAG CCCGGCCAGAGCCCCAGGCTGCTGATCTACAAGATCAGCGACAGGTTCAGCGGCGTGCCCGATAGG TTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCCGACGACGTG GGCATCTACTACTGCTTCCAGGGCAGCCACGTCCCCTGGACTTTCGGACAGGGCACCAAGCTGGAG ATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGC GGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAG GTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCC ACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCC
TGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC SEQ ID NO: 211: Cadeia pesada de Pascolizumab
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGC ACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGC AAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAG AGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGAC CCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTG TGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCC AGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACC TGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCC GTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTG TACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAG GGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG ACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAG AGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC
ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 212: Cadeia leve de Pascolizumab
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCTCTTCCCTGAGCGCAAGCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACC TGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCC GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTCGAGTCAGGCATTCCCAGCAGGTTT AGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCC ACCTACTACTGCCAGCAGAGCAACGAGGACCCTCCCACCTTCGGACAGGGCACCAAGGTCGAGATC AAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGC ACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG GACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACC TACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGT
GAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC SEQ ID NO: 213: Cadeia pesada de Mepolizumab
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACACAGACCCTCACTCTGACCTGC ACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCTCCTACAGCGTCCACTGGGTGAGGCAGCCCCCCGGCAAGGGC CTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGCAAGCGGCGGCACCGACTACAACAGCGCCCTGATGAGCAGG CTCTCCATCAGCAAGGACACCAGCCGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTG GACACCGCCACCTATTACTGCGCCAGGGACCCTCCCTCTAGCCTGCTGAGGCTGGACTACTGGGGC AGGGGAACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCC AGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTG TTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTG GTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG CACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTG ACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTG CCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACC CTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTC TACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACC CCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAG
AAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 214: Cadeia leve de Mepolizumab
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCCGATTCACTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAAC TGCAAGAGCAGCCAGAGCCTCCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAG AAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTATGGCGCCTCCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCAGAC AGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGAC GTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGTCCACAGCTTCCCCTTCACCTTCGGCGGGGGAACCAAGCTG GAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAG AGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGG AAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGAC TCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTAC
GCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC SEQ ID NO: 215: PascoH-474 Cadeia pesada
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGC ACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGC AAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAG AGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGAC CCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTG TGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCC AGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACC TGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCC GTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTG TACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAG GGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG ACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAG AGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGA GGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGG TATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGG CACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGC AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCC
ACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 216: PascoH-TVAAPS-474 Cadeia pesada
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGC ACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGC AAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAG AGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGAC CCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTG TGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCC AGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACC TGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCC GTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTG TACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAG GGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG ACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAG AGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGGCGTGCAG CTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGC GGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGG GTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACC ATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACC GCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTG
GTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 217: PascoL-474 Cadeia leve
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCTCTTCCCTGAGCGCAAGCGTGGGCGATAGGGTGACC ATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACATGAACTGGTAC CAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTCGAGTCA GGCATTCCCAGCAGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACAATCAGC AGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAACGAGGACCCTCCC ACCTTCGGACAGGGCACCAAGGTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTG AACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGC GGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTG ACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGTGGATCC GGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTG AGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCC CCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTAC GCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAG
GACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 218: PascoL-TVAAPS-474 Cadeia leve
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCTCTTCCCTGAGCGCAAGCGTGGGCGATAGGGTGACC ATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACATGAACTGGTAC CAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTCGAGTCA GGCATTCCCAGCAGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACAATCAGC AGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAACGAGGACCCTCCC ACCTTCGGACAGGGCACCAAGGTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTG AACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGC GGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTG ACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCACCGTG GCCGCCCCCTCGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCC GGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATG GGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCAC GGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC AGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTAC TACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTG
ACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 219: IL-5 mAb-G4S-DOM9-112-210 Cadeia pesada
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACACAGACCCTCACTCTGACCTGC ACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCTCCTACAGCGTCCACTGGGTGAGGCAGCCCCCCGGCAAGGGC CTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGCAAGCGGCGGCACCGACTACAACAGCGCCCTGATGAGCAGG CTCTCCATCAGCAAGGACACCAGCCGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTG GACACCGCCACCTATTACTGCGCCAGGGACCCTCCCTCTAGCCTGCTGAGGCTGGACTACTGGGGC AGGGGAACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCC AGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTG TTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTG GTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG CACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTG ACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTG CCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACC CTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTC TACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACC CCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAG AAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGCGGCGGCGGATCCGAAGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGC GGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGG AACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATCATC AGCTCCGGCACCGAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAAC AGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGC
GCCAAGAGCCTGGGCAGGTTCGACTACTGGGGACAGGGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 220: IL-5 mAb-G4S-DOML0-53-474 Cadeia leve
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCCGATTCACTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACC ATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTCCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCC TGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTATGGCGCCTCCACCAGG GAGAGCGGCGTGCCAGACAGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACA ATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGTCCACAGCTTC CCCTTCACCTTCGGCGGGGGAACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGC GTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGT CTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTG CAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGC CTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGT GAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC GGCGGCGGCGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGC GGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGC TGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGG GAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGC AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTAC TGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACT GTGAGCAGC
SEQ ID NO: 221: 586H-210 Cadeia pesada (GS removido)
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGC AAGGCCTCCGGCTTCTACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGC CTGGAGTGGATGGGCACTATCGACCCCGCCAACGGCAACACCAAGTACGTGCCCAAGTTCCAGGGC AGGGTGACCATCACCGCCGATGAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCT GAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCATCTACGACGACTACCACTACGACGACTACTAC GCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGC GTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTG AAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGC AGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTG CTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTAC CGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAG GTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGA GAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAG AACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTG ACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG CACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGAAGTGCAGCTCCTGGAGAGC GGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTC AGGAACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATC ATCAGCTCCGGCACCGAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGAC AACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTAC
TGCGCCAAGAGCCTGGGCAGGTTCGACTACTGGGGACAGGGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 222: 586H-TVAAPS-210 Cadeia pesada (GS removido)
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGC AAGGCCTCCGGCTTCTACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGC CTGGAGTGGATGGGCACTATCGACCCCGCCAACGGCAACACCAAGTACGTGCCCAAGTTCCAGGGC AGGGTGACCATCACCGCCGATGAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCT GAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCATCTACGACGACTACCACTACGACGACTACTAC GCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTGTCTAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGC GTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTG AAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGC AGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTG CTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTAC CGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAG GTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGA GAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAG AACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTG ACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG CACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGAA GTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCC GCTAGCGGCTTCACCTTCAGGAACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTG GAGTGGGTCAGCTGGATCATCAGCTCCGGCACCGAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGG TTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAG GACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTGGGCAGGTTCGACTACTGGGGACAGGGGACCCTG
GTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 223: PascoH-474 Cadeia pesada (GS removido)
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTG ACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGG CAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGG TACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTG GTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCC AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC GGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGC AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATC AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGA GGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTC GCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCC AGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACC ATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAG GACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGC
CAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 224: PascoH-TVAAPS-474 Cadeia pesada (GS removido)
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTG ACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGG CAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGG TACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTG GTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCC AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC GGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGC AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATC AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGCGTGCAG CTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCC GCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAG GGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGC GTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATG AACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCC
GGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 225: PascoH-ASTKGPT-474 Cadeia pesada (segundo GS removido)
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTG ACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGG CAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGG TACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTG GTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCC AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC GGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGC AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATC AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCAGCCAGCACCAAGGGCCCCACG GGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTG AGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCC CCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTAC GCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAG
GACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 226: Cadeia pesada de anticorpo anti-IGF-1 R H0L0 com DOML5-26-593 fundido no terminal C com ligante TVAAPSGS
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGC AAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGA CTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGAC CGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGC GACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTC GACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTC CCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC
CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGC CTGGGCACCCAGACCTACATCTgTAaCgTgAACcACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAG
GTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAG GTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC CAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTG GTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAT CACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGAG GTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCC GCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTG GAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGG TTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAG GACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTG
GTGACCGTGAGCAGC SEQ ID NO: 227: IGF1RmAb-GS-DOML5-26-593 Cadeia pesada
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGC AAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGA CTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGAC CGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGC GACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTC GACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTC CCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC
CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGC CTGGGCACCCAGACCTACATCTgTAaCgTgAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAG
GTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAG GTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC CAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTG GTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAT CACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGC GGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTC AAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATC AGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGAC AACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTAC
TGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGC SEQ ID NO: 228: anticorpo anti-IGF-1R Cadeia pesada
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGC AAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGA CTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGAC CGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGC GACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTC GACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTC CCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGC CTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAG GTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAG GTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC CAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTG GTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAT
CACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 229: Cadeia leve de anticorpo anti-IGF-1 R H0L0 com DOML5-26-593 fundido no terminal C com ligante TVAAPSGS
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGC TGCAGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAG CCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGA TTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTG GGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAA ATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGC GGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAG GTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCC ACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCC TGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCACC GTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGA GGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTC AGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTAC TACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTG CAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTG
GACTATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGC SEQ ID NO: 230: Cadeia leve de anticorpo anti-IGF-1 R H0L0 com DOML5-26-593 fundido no terminal C com ligante GS
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGC TGCAGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAG CCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGA TTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTG GGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAA ATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGC GGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAG GTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCC ACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCC TGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGTGGA TCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGC TGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAA GGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAG GGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGG GCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGC
ACTCTGGTGACCGTGAGCAGC SEQ ID NO: 231: anticorpo anti-IGF-1R Cadeia leve
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGC TGCAGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAG CCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGA TTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTG GGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAA ATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGC GGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAG GTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCC ACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCC
TGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC SEQ ID NO: 232: anti-IGF1R Cadeia pesada-GS-TLPC
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGC AAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGA CTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGAC CGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGC GACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTC GACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTC CCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGC CTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAG GTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAG GTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC CAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTG GTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAT CACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGACGGCGGCGGCATTAGGAGG AGCATGAGCGGCACCTGGTACCTGAAGGCCATGACCGTGGATAGGGAGTTCCCCGAGATGAACCTG GAGAGCGTGACCCCCATGACACTGACCCTGCTCAAGGGCCACAACCTGGAGGCCAAGGTCACCATG CTGATCTCAGGCAGGTGCCAGGAGGTGAAGGCAGTGCTGGGCAGGACCAAGGAGAGGAAGAAGTAC ACCGCCGACGGGGGCAAGCACGTGGCCTATATCATCCCCAGCGCCGTGAGGGACCACGTGATCTTC TACAGCGAGGGCCAGCTCCACGGAAAGCCCGTGAGAGGCGTGAAGCTGGTGGGCAGGGACCCCAAG AACAACCTGGAGGCCCTGGAGGACTTCGAAAAAGCCGCAGGCGCCAGGGGCCTGTCCACTGAGAGC
ATCCTGATCCCTAGGCAGAGCGAGACCTGCAGCCCCGGC SEQ ID NO: 233: anti-IGF1R Cadeia pesada-GS-CT01 adnectina
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGC AAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGA CTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGAC CGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGC GACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTC GACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTC CCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGC CTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAG GTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAG GTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC CAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTG GTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAT CACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGAGGTGGTGGCCGCCACCCCC ACCAGCCTGCTGATTTCCTGGAGGCACCCCCACTTCCCCACACGCTACTACAGGATCACCTACGGC GAGACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCCTGCAGCCTCCCACTGCCACCATC AGCGGCCTCAAGCCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTCACCGACGGAAGGAACGGC
AGGCTGCTGAGCATCCCCATCAGCATCAACTACAGGACC SEQ ID NO: 234: anti-IGF1R Cadeia pesada-TVAAPSGS-TLPC
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGC AAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGA CTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGAC CGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGC GACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTC GACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTC CCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGC CTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAG GTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAG GTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC CAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTG GTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAT CACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGAC GGCGGCGGCATTAGGAGGAGCATGAGCGGCACCTGGTACCTGAAGGCCATGACCGTGGATAGGGAG TTCCCCGAGATGAACCTGGAGAGCGTGACCCCCATGACACTGACCCTGCTCAAGGGCCACAACCTG GAGGCCAAGGTCACCATGCTGATCTCAGGCAGGTGCCAGGAGGTGAAGGCAGTGCTGGGCAGGACC AAGGAGAGGAAGAAGTACACCGCCGACGGGGGCAAGCACGTGGCCTATATCATCCCCAGCGCCGTG AGGGACCACGTGATCTTCTACAGCGAGGGCCAGCTCCACGGAAAGCCCGTGAGAGGCGTGAAGCTG GTGGGCAGGGACCCCAAGAACAACCTGGAGGCCCTGGAGGACTTCGAAAAAGCCGCAGGCGCCAGG
GGCCTGTCCACTGAGAGCATCCTGATCCCTAGGCAGAGCGAGACCTGCAGCCCCGGC SEQ ID NO: 235: anti-IGF1R Cadeia pesada-GS-AFFI
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGC AAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGA CTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGAC CGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGC GACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTC GACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTC CCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGC CTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAG GTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAG GTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC CAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTG GTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAT CACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGTGGACAACAAGTTCAACAAG GAGCTGAGGCAGGCCTACTGGGAGATCCAGGCCCTGCCCAATCTGAACTGGACCCAGAGCAGGGCC TTCATCAGGAGCCTGTACGACGACCCCAGCCAGAGCGCTAACCTCCTGGCCGAGGCCAAAAAGCTG
AACGACGCCCAGGCCCCCAAG SEQ ID NO: 236 anti-IGF1R Cadeia pesada-TVAAPSGS-AFFI
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGC AAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGA CTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGAC CGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGC GACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTC GACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTC CCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGC CTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAG GTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAG GTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC CAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTG GTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAT CACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGTG GACAACAAGTTCAACAAGGAGCTGAGGCAGGCCTACTGGGAGATCCAGGCCCTGCCCAATCTGAAC TGGACCCAGAGCAGGGCCTTCATCAGGAGCCTGTACGACGACCCCAGCCAGAGCGCTAACCTCCTG
GCCGAGGCCAAAAAGCTGAACGACGCCCAGGCCCCCAAG SEQ ID NO: 237: anti-IGF1R Cadeia pesada-GS-DRPN
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGC AAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGA CTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGAC CGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGC GACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTC GACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTC CCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGC CTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAG GTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAG GTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC CAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTG GTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAT CACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGACCTGGGGAAAAAGCTGCTT GAAGCCGCTAGGGCAGGACAGGATGACGAGGTGAGGATTCTGATGGCAAATGGCGCCGACGTCAAT GCCAAAGACGAGTACGGCCTCACCCCTCTTTATCTGGCCACTGCACACGGACACTTGGAGATCGTG GAGGTGCTGCTCAAGAACGGAGCTGATGTGAACGCTGTGGACGCTATTGGGTTCACACCCCTTCAC CTCGCAGCCTTTATTGGCCACCTGGAGATCGCCGAAGTTCTCCTGAAACACGGCGCAGACGTCAAC GCACAGGATAAGTTCGGGAAGACCGCCTTCGACATCAGCATCGGCAATGGGAACGAGGATCTGGCC
GAGATCCTGCAGAAGCTG SEQ ID NO: 238: anti-IGF1R Cadeia pesada-TVAAPSGS-DRPN
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGC AAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGA CTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGAC CGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGC GACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTC GACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTC CCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGC CTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAG GTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAG GTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC CAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTG GTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAT CACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGAC CTGGGGAAAAAGCTGCTTGAAGCCGCTAGGGCAGGACAGGATGACGAGGTGAGGATTCTGATGGCA AATGGCGCCGACGTCAATGCCAAAGACGAGTACGGCCTCACCCCTCTTTATCTGGCCACTGCACAC GGACACTTGGAGATCGTGGAGGTGCTGCTCAAGAACGGAGCTGATGTGAACGCTGTGGACGCTATT GGGTTCACACCCCTTCACCTCGCAGCCTTTATTGGCCACCTGGAGATCGCCGAAGTTCTCCTGAAA CACGGCGCAGACGTCAACGCACAGGATAAGTTCGGGAAGACCGCCTTCGACATCAGCATCGGCAAT
GGGAACGAGGATCTGGCCGAGATCCTGCAGAAGCTG SEQ ID NO: 239: Anti IL-4 cadeia pesada-GS-anti RNAse A camelídeoVHH
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGC ACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGC AAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAG AGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGAC CCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTG TGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCC AGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACC TGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCC GTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTG TACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAG GGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG ACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAG AGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA GGCTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACGCATACACTTAC ATCTACATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAGAGCGTGAGGGGGTCGCAGCTATGGATAGT GGTGGTGGTGGCACACTCTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGCGACAAAGGC AAGAACACGGTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCACGTATTACTGTGCT GCAGGTGGCTACGAGCTGCGTGACCGGACATATGGGCAGTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTC
TCCTCA SEQ ID NO: 240: Anti IL-4 Cadeia pesada-GS-NARV
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGC ACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGC AAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAG AGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGAC CCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTG TGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCC AGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACC TGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCC GTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTG TACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAG GGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG ACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAG AGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGCGCGCGTCGACCAGACGCCGCGCAGC GTCACGAAGGAAACCGGCGAGTCCCTCACCATCAACTGCGTGCTGCGGGATGCCTCCTACGCCCTG GGCAGCACATGTTGGTACAGAAAGAAGAGCGGGGAAGGCAACGAGGAGTCCATCTCCAAGGGGGGA AGATACGTCGAGACCGTGAACAGCGGAAGCAAGAGCTTCAGCCTGCGGATCAACGACCTCACCGTC GAGGACGGGGGCACCTACCGTTGCGGTCTGGGCGTGGCCGGCGGCTATTGCGATTACGCCCTGTGC
AGTAGCCGGTATGCTGAGTGCGGCGACGGCACCGCTGTGACCGTGAAC SEQ ID NO: 241 anti-IGF1R Cadeia pesada-TVAAPSGS-CT01 adnectina
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGC AAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGA CTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGAC CGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGC GACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTC GACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTC CCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGC CTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAG GTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAG GTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCC CAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTG GTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAT CACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGAG GTGGTGGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATTTCCTGGAGGCACCCCCACTTCCCCACACGCTAC TACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCCTGCAG CCTCCCACTGCCACCATCAGCGGCCTCAAGCCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTC
ACCGACGGAAGGAACGGCAGGCTGCTGAGCATCCCCATCAGCATCAACTACAGGACC SEQ ID NO: 242: Erbitux Cadeia pesada-RS-CT01 adnectina
CAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCCTCTCAGAGCCTGAGCATCACCTGT ACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCAATTACGGCGTGCATTGGGTGCGGCAGTCTCCAGGCAAGGGC CTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGTCCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCCTTCACCAGCAGA CTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACAGCCTGCAGAGCAAC GACACCGCCATCTACTATTGTGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGC CAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCC AGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAG CCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG CAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAG AGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCTAGCGTG TTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTG GTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTG CACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTG ACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTG CCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACC CTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTC TACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACC CCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAG AAGAGTCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAGAGATCCGAGGTGGTGGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATTTCCTGGAGGCACCCCCACTTCCCCACACGCTACTACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGC AACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCCTGCAGCCTCCCACTGCCACCATCAGCGGCCTCAAG CCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTCACCGACGGAAGGAACGGCAGGCTGCTGAGC
ATCCCCATCAGCATCAACTACAGGACC SEQ ID NO: 243: Erbitux Cadeia leve
GACATCCTGCTGACCCAGAGCCCCGTGATCCTGAGCGTGAGCCCTGGCGAGAGAGTGAGCTTCAGC TGCCGGGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGACCAACGGCAGCCCC AGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGTCCATCAGCGGCATCCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGC TCCGGCACCGACTTCACCCTGAGCATCAACAGCGTGGAGAGCGAGGATATCGCCGACTACTACTGC CAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACGGTG GCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTCAAGAGCGGCACCGCCAGCGTG GTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTG CAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCAC
CAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC SEQ ID NO: 244: Erbitux Cadeia leve-RS-CT01 adnectina
GACATCCTGCTGACCCAGAGCCCCGTGATCCTGAGCGTGAGCCCTGGCGAGAGAGTGAGCTTCAGC TGCCGGGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGACCAACGGCAGCCCC AGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGTCCATCAGCGGCATCCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGC TCCGGCACCGACTTCACCCTGAGCATCAACAGCGTGGAGAGCGAGGATATCGCCGACTACTACTGC CAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACGGTG GCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTCAAGAGCGGCACCGCCAGCGTG GTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTG CAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCAC CAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGAGGCGAGTGCAGATCCGAGGTGGTGGCC GCCACCCCCACCAGCCTGCTGATTTCCTGGAGGCACCCCCACTTCCCCACACGCTACTACAGGATC ACCTACGGCGAGACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCCTGCAGCCTCCCACT GCCACCATCAGCGGCCTCAAGCCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTCACCGACGGA
AGGAACGGCAGGCTGCTGAGCATCCCCATCAGCATCAACTACAGGACC SEQ ID NO: 245: Erbitux Cadeia pesada
CAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCCTCTCAGAGCCTGAGCATCACCTGT ACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCAATTACGGCGTGCATTGGGTGCGGCAGTCTCCAGGCAAGGGC CTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGTCCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCCTTCACCAGCAGA CTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACAGCCTGCAGAGCAAC GACACCGCCATCTACTATTGTGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGC CAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCC AGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAG CCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG CAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAG AGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCTAGCGTG TTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTG GTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTG CACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTG ACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTG CCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACC CTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTC TACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACC CCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAG
AAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 246: CT01 adnectina-GSTG- Erbitux Cadeia pesada
GAGGTGGTGGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATTTCCTGGAGGCACCCCCACTTCCCCACACGC TACTACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCCTG CAGCCTCCCACTGCCACCATCAGCGGCCTCAAGCCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCC GTCACCGACGGAAGGAACGGCAGGCTGCTGAGCATCCCCATCAGCATCAACTACAGGACCGGATCC ACCGGCCAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCCTCTCAGAGCCTGAGCATC ACCTGTACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCAATTACGGCGTGCATTGGGTGCGGCAGTCTCCAGGC AAGGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGTCCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCCTTCACC AGCAGACTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACAGCCTGCAG AGCAACGACACCGCCATCTACTATTGTGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTAC TGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAG CCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCT AGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACC TGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCT GTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTC TACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAG GGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG ACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAG AGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC
ACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 247: CT01 adnectina-STG-Erbitux Cadeia leve
GAGGTGGTGGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATTTCCTGGAGGCACCCCCACTTCCCCACACGC TACTACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCCTG CAGCCTCCCACTGCCACCATCAGCGGCCTCAAGCCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCC GTCACCGACGGAAGGAACGGCAGGCTGCTGAGCATCCCCATCAGCATCAACTACAGGACGTCGACC GGTGACATCCTGCTGACCCAGAGCCCCGTGATCCTGAGCGTGAGCCCTGGCGAGAGAGTGAGCTTC AGCTGCCGGGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGACCAACGGCAGC CCCAGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGTCCATCAGCGGCATCCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGC GGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAGCATCAACAGCGTGGAGAGCGAGGATATCGCCGACTACTAC TGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACG GTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTCAAGAGCGGCACCGCCAGC GTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCC CTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTG AGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACC
CACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC SEQ ID NO: 248 (PascoH-616 Cadeia pesada)
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTG ACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGG CAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGG TACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTG GTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCC AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC GGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGC AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATC AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGA GGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGTGTTC CCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCC AGCATCGACTGGCACGGGAAGATCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACC ATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAG GACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGC
CAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 249 (PascoH-TVAAPS-616 Cadeia pesada)
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTG ACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGG CAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGG TACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTG GTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCC AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC GGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGC AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATC AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGCGTGCAG CTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCC GCCAGCGGCTTCGTGTTCCCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAG GGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGAAGATCACCTACTACGCCGACAGC GTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATG AACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCC
GGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 250: 656H-TVAAPS-210 Cadeia pesada
CAGGTGCAGCTCGTCCAGTCTGGGGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGC AAGGCCAGCGGCTATACCTTCATCGACTACGAGATCCATTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGGCAGGGC CTGGAGTGGATGGGCGCCATCGACCCAGAGACCGGAGGCACGGCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGA CGGGTCACCATGACAACCGATACCAGCACCTCCACCGCTTACATGGAGCTGCGCAGCCTGAGAAGC GACGACACCGCGGTGTACTACTGTACGCGCATCCTGCTCTACTACTACCCCATGGATTACTGGGGC CAGGGCACACTAGTGACCGTGTCTAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCC AGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAA
CCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCAcCCAG ACCTACATCTgTAACgTgAACCACAaGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG
AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTG TTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTG GTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG CACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTG ACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTG CCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACC CTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTC TACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACC CCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAG AAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGAAGTGCAGCTCCTGGAGAGC GGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTC AGGAACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATC ATCAGCTCCGGCACCGAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGAC AACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTAC
TGCGCCAAGAGCCTGGGCAGGTTCGACTACTGGGGACAGGGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 251: 656 Cadeia leve
GAGATCGTGCTGACCCAGAGTCCAGCCACCCTCAGCCTGAGCCCTGGGGAACGCGCCACCCTGTCC TGCCGGGCGAGTCAGAACATCTCCGACTACCTGCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCT CGCCTGCTGATCTACTACGCCTCCCAGAGCATCAGCGGAATCCCCGCCCGGTTCTCCGGAAGTGGG TCCGGAACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCTCTCGAGCCAGAGGACTTCGCGGTGTACTACTGC CAGAACGGGCATAGTTTCCCACTGACCTTCGGAGGGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG GCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTG GTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTG CAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCAC
CAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC SEQ ID NO: 252: PascoH-TVAAPS-546 Cadeia pesada
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTG ACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGG CAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGG TACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTG GTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCC AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC GGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGC AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATC AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGCGTGCAG CTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCC GCCAGCGGCTTCGTGTTCCCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAG GGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGAAGGGGGGCAAGACCTACTACGCCGACAGC GTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATG AACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCC
GGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 253: PascoH-546 Cadeia pesada
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGC ACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGC AAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAG AGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGAC CCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTG TGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCC AGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACC TGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCC GTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTG TACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAG GGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG ACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAG AGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTG GTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGTGTTCCCCTGGTATGAT ATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGAAGGGG GGCAAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAAC ACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCC
GAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 254: PascoH-TVAAPS-567 Cadeia pesada
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTG ACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGG CAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGG TACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTG GTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCC AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC GGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGC AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATC AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGCGTGCAG CTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCC GCCAGCGGCTTCGTGTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAG GGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGC GTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATG AACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCC
GGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 255: (PascoH-567 Cadeia pesada)
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTG ACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGG CAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGG TACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTG GTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCC AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC GGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGC AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATC AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGA GGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGTGTTC GCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCC AGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACC ATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAG GACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGC
CAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 256: 656 Cadeia pesada
CAGGTGCAGCTCGTCCAGTCTGGGGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGC AAGGCCAGCGGCTATACCTTCATCGACTACGAGATCCATTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGGCAGGGC CTGGAGTGGATGGGCGCCATCGACCCAGAGACCGGAGGCACGGCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGA CGGGTCACCATGACAACCGATACCAGCACCTCCACCGCTTACATGGAGCTGCGCAGCCTGAGAAGC GACGACACCGCGGTGTACTACTGTACGCGCATCCTGCTCTACTACTACCCCATGGATTACTGGGGC CAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCC TCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAG ACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAA TCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTG GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTC CCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACC CTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAG
AAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ ID NO: 257: Anti IL-5 Cadeia pesada-G4S-dAb474-TVAAPSGS-dAb210
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACACAGACCCTCACTCTG ACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCTCCTACAGCGTCCACTGGGTGAGGCAGCCC CCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGCAAGCGGCGGCACCGACTACAAC AGCGCCCTGATGAGCAGGCTCTCCATCAGCAAGGACACCAGCCGGAACCAGGTGGTGCTG ACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCCACCTATTACTGCGCCAGGGACCCTCCC TCTAGCCTGCTGAGGCTGGACTACTGGGGCAGGGGAACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCC AGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGC ACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGG AACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGC CTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTAC ATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCC AGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAG GTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGC ACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAG TACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAG GCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTG ACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTG GACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAG CAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAG AAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGCGGCGGCGGATCTGGCGTGCAGCTCCTGGAG AGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGC TTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAG TGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGC AGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTG AGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGAC TACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCC GAAGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTG AGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGGAACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCC CCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATCATCAGCTCCGGCACCGAGACCTACTAC GCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTG
GGCAGGTTCGACTACTGGGGACAGGGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 258: Anti CD-20 Cadeia pesada-TVAAPSGS-dAb154-TVAAPSGS- dAb474
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAATG TCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACC CCCGGCAGGGGCCTCGAGTGGATCGGAGCTATCTACCCCGGCAACGGCGACACTAGCTAC AACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTAC ATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGAGCACC TACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTCTGGGGCGCCGGCACACTAGTGACCGTGTCC AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC GGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGC AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATC AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCTGAC ATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATT ACCTGCAGGGCCAGCAGGCCCATCAGCGACTGGCTGCACTGGTACCAACAGAAGCCCGGC AAGGCTCCCAAGCTGCTGATCGCCTGGGCCAGCAGCCTGCAGGGAGGCGTGCCCAGCAGG TTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTCACCATCTCTTCCCTGCAGCCCGAG GACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGAGGGCTGGGGGCCCCCTACTTTCGGCCAGGGC ACCAAGGTGGAGATCAAGAGGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTG GAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGC GGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTG GAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAG GGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGC CTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTAC
GACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 259: Anti CD-20 Cadeia pesada-TVAAPSGS-dAb210-TVAAPSGS- dAb474
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAATG TCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACC CCCGGCAGGGGCCTCGAGTGGATCGGAGCTATCTACCCCGGCAACGGCGACACTAGCTAC AACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTAC ATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGAGCACC TACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTCTGGGGCGCCGGCACACTAGTGACCGTGTCC AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC GGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGC AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATC AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCTGAA GTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGC TGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGGAACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCC GGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATCATCAGCTCCGGCACCGAGACCTACTACGCC GACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTG CAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTGGGC AGGTTCGACTACTGGGGACAGGGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGCACCGTGGCCGCCCCC TCGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGC CTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTG AGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTG ACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAAC ACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCC ACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGC
AGC SEQ ID NO: 260: anti WET 5D5v2 Cadeia pesada (orifício)-GS-dAb593
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGC GCCGCTAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGCTCCACTGGGTCAGGCAGGCCCCAGGCAAGGGA CTGGAGTGGGTGGGCATGATCGACCCCAGCAACAGCGACACCAGGTTCAACCCCAACTTCAAGGAC AGGTTCACCATCAGCGCCGACACTAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCC GAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCACCTACAGGAGCTACGTCACCCCCCTGGATTACTGGGGC CAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCC AGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTG TTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTG GTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG CACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTG ACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTG CCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACC CTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGAGCTGCGCCGTGAAGGGCTTC TACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACC CCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGGTGAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAG AAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTG GTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCC ATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGC AGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAAC ACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGAC
CCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGC SEQ ID NO: 261: anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (knob)-GS-dAb593
TGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCC AAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGAT GTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAC AATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTG CTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAG CCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTG TGGTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGC CAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTC CTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGC TCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCT GGCAAGGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGC TCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGG GTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGC TACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAG AACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGC
GCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGC SEQ ID NO: 262: anti cMET 5D5v2 Cadeia leve
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCTCAGTGGGAGACAGGGTGACC ATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTCCTGTACACCAGCAGCCAGAAGAACTACCTGGCC TGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCTAGCACCAGG GAGTCAGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACTCTGACC ATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACTACGCCTAT CCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGC GTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGT CTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTG CAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGC CTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGT
GAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC SEQ ID NO: 263: anti cMET 5D5v2 IgG4 Cadeia pesada (UNIBODY)-GS-dAb593
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTG AGCTGCGCCGCTAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGCTCCACTGGGTCAGGCAGGCC CCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGGCATGATCGACCCCAGCAACAGCGACACCAGGTTC AACCCCAACTTCAAGGACAGGTTCACCATCAGCGCCGACACTAGCAAGAACACCGCCTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCACCTACAGG AGCTACGTCACCCCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCC AGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCTGCAGCAGAAGCACCAGCGAGAGC ACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGG AACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGC CTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTAC ACCTGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGCCCCCGAG TTCCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATC AGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTC CAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAG GAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGG CTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCTCCATCGAG AAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTAC CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACC ACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGAC AAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCAC AACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGGGATCCGAGGTGCAGCTC CTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCT AGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGC CTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTG AAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAAC TCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGAC
TATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGC SEQ ID NO: 264: anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (orifício)
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTG AGCTGCGCCGCTAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGCTCCACTGGGTCAGGCAGGCC CCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGGCATGATCGACCCCAGCAACAGCGACACCAGGTTC AACCCCAACTTCAAGGACAGGTTCACCATCAGCGCCGACACTAGCAAGAACACCGCCTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCACCTACAGG AGCTACGTCACCCCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCC AGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGC ACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGG AACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGC CTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTAC ATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCC AGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAG GTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGC ACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAG TACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAG GCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTG ACCAAGAACCAGGTGTCCCTGAGCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTG GACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGGTGAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAG CAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAG
AAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 265: anti cMET 5D5v2 Cadeia pesada (knob)
TGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCC AAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGAT GTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAC AATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTG CTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAG CCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTG TGGTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGC CAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTC CTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGC TCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCT
GGCAAG SEQ ID NO: 266: anti cMET 5D5v2 IgG4 Cadeia pesada (UNIBODY)
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTG AGCTGCGCCGCTAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGCTCCACTGGGTCAGGCAGGCC CCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGGCATGATCGACCCCAGCAACAGCGACACCAGGTTC AACCCCAACTTCAAGGACAGGTTCACCATCAGCGCCGACACTAGCAAGAACACCGCCTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCACCTACAGG AGCTACGTCACCCCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCC AGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCTGCAGCAGAAGCACCAGCGAGAGC ACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGG AACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGC CTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTAC ACCTGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGCCCCCGAG TTCCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATC AGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTC CAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAG GAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGG CTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCTCCATCGAG AAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTAC CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACC ACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGAC AAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCAC
AACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAG SEQ ID NO: 267: PascoH IgG2-GS-474 Cadeia pesada
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGC ACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGC AAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAG AGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGAC CCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTG TGGGGAAGGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCTGCAGCAGAAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAACTTCGGC ACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAG CGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTCCTGTGGCCGGACCCTCCGTGTTCCTG TTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTG GACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAAC GCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTTCAACAGCACCTTCCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTG GTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCC CCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCC CCCAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCC ATGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCCGGTGGCAG CAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGC CTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAG CCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGC TGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTG ACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTG TACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGAC
GAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 268: PascoH IgG4-GS-474 Cadeia pesada
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGC ACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGC AAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAG AGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGAC CCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTG TGGGGAAGGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCTGCAGCAGAAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAG AGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCAGCTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCTCCGTGTTC CTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTG GTGGACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAC AACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACC GTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCC AGCTCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTAC CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCC CCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGG CAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAG AGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTC CAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATG GGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAG GTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACC CTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAG
GACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 269: PascoH IgG4PE-GS-474 Cadeia pesada
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGC ACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGC AAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAG AGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGAC CCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTG TGGGGAAGGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCTGCAGCAGAAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAG AGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGTTCGAGGGCGGACCCTCCGTGTTC CTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTG GTGGACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAC AACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACC GTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCC AGCTCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTAC CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCC CCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGG CAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAG AGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTC CAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATG GGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAG GTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACC CTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAG
GACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO: 270: Anti IL-4 Cadeia pesada-GS-anti TNF-a adnectina
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGC ACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGC AAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAG AGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGAC CCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTG TGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCC AGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACC TGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCC GTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTG TACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAG GGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG ACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAG AGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGTGAGCGACGTGCCAAGGGACCTCGAG GTGGTGGCAGCCACTCCCACCTCTCTGCTGATCAGCTGGGACACACACAACGCCTACAACGGCTAC TACAGGATCACCTACGGAGAGACCGGCGGCAATAGCCCCGTGAGGGAGTTCACCGTGCCCCACCCC GAGGTGACCGCCACCATTAGCGGCCTGAAGCCCGGCGTGGACGATACCATCACCGTCTACGCCGTG ACCAACCACCACATGCCCCTGAGGATCTTCGGCCCCATCAGCATCAACCATAGGACC

Claims (49)

REIVINDICAÇÕES
1. Construção de ligação de antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende uma estrutura de proteína que é ligada a um ou mais domínios de ligação de epítopo em que a construção de ligação de antígeno 5 tem pelo menos dois locais de ligação de antígeno pelo menos um dos quais é de um domínio de ligação de epítopo e pelo menos um dos quais é de um domínio VH/VL em pares.
2. Construção de ligação de antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um homodímero que compreende duas ou mais estruturas da fórmula I: em que X representa uma região de anticorpo constante que compreende domínio pesado constante 2 e domínio pesado constante 3; R1, R4, R7 e R8 representa um domínio independentemente selecionado de um domínio de ligação de epítopo; R2 representa um domínio selecionado do grupo que consiste de cadeia pesada constante 1 e um domínio de ligação de epítopo; R3 representa um domínio selecionado do grupo que consiste de um VH em pares e um domínio de ligação de epítopo; R5 representa um domínio selecionado do grupo que consiste de um domínio de cadeia leve constante e um domínio de ligação de epítopo;
R6 representa um domínio selecionado do grupo que consiste de um VL em pares e um domínio de ligação de epítopo; n representa um número inteiro independentemente selecionado de: 0, 1, 2, 3 e 4; 5 m representa um número inteiro independentemente selecionado de: 0 e 1, em que os domínios de Cadeia pesada constante 1 e de Cadeia leve constante são associados; em que pelo menos um domínio de ligação de epítopo está presente; e quando R3 representa um domínio VH em pares, R6 representa um Domínio VL em pares, de modo que os dois domínios são, juntos, capazes de, ligar o antígeno.
3. Construção de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que R6 representa um VL em pares e R3 representa um VH em pares.
4. Construção de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que um ou ambos de R7 e R8 representam um domínio de ligação de epítopo.
5. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 4, caracterizada pelo fato de que um ou ambos de R1 e R4 representam um domínio de ligação de epítopo.
6. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 4, caracterizada pelo fato de que R4 está presente.
7. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 6, caracterizada pelo fato de que R1 R7 e R8 representam um domínio de ligação de epítopo.
8. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 6, caracterizada pelo fato de que R1 R7 e R8, e R4 representam um domínio de ligação de epítopo.
9. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que pelo 5 menos um domínio de ligação de epítopo é um dAb.
10. Construção de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o dAb é um dAb humano.
11. Construção de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o dAb é um dAb de camelídeo.
12. Construção de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o dAb é um dAb de tubarão (NARV).
13. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um domínio de ligação de epítopo é derivado de uma estrutura selecionada de CTLA-4 (Evicorpo); lipocalina; moléculas derivadas de Proteína A, tal como domínio Z de Proteína A (Aficorpo, SpA), domínio A (Avímero/Maxicorpo); Proteínas de choque por calor tais como GroEl e GroES; transferrina (trans- corpo); proteína de repetição de ancirina (DARPin); aptâmero de peptídeo; domínio de lecitina tipo C (Tetranectina); γ-cristalina humana e ubiquitina humana (afilinas); domínios PDZ; domínios tipo toxinkunitz de escorpião de inibidores da protease humana; e fibronectina (adnectina).
14. Construção de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação de epítopo é derivado de uma estrutura selecionada de um Aficorpo, uma proteína de repetição de ancirina (DARPin) e uma adnectina.
15. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação de epítopo é selecionado de um dAb, um Aficorpo, uma proteína de repetição de ancirina (DARPin) e uma adnectina.
16. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a construção de ligação tem especificidade para mais do que um antígeno. 5
17. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o primeiro local de ligação tem especificidade quanto a um primeiro epítopo e o segundo local de ligação tem especificidade quanto a um segundo epítopo no mesmo antígeno.
18. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a construção de ligação de antígeno é capaz de ligar IL-13.
19. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a construção de ligação de antígeno é capaz de ligar dois ou mais antígenos selecionados de IL-13, IL-5 e IL-4.
20. Construção de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a construção de ligação de antígeno é capaz de ligar IL-13 e IL-4 simultaneamente.
21. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a construção de ligação de antígeno é capaz de ligar dois ou mais antígenos selecionados de VEGF, IGF-1 R e EGFR,
22. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a construção de ligação de antígeno é capaz de ligar TNF.
23. Construção de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a construção de ligação de antígeno é capaz de ligar a TNF e IL1-R.
24. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 ou reivindicações de 9 a 23, caracterizada pelo fato de que a estrutura de proteína é uma estrutura de Ig.
25. Construção de ligação de antígeno de acordo com a 5 reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a estrutura de Ig é uma estrutura de IgG.
26. Construção de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a estrutura de IgG é selecionada de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
27. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou reivindicações de 9 a 26, caracterizada pelo fato de que a estrutura de proteína compreende um anticorpo monovalente.
28. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 27, caracterizada pelo fato de que a estrutura de IgG compreende todos os domínios de um anticorpo.
29. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 12 ou 15 a 28, caracterizada pelo fato de que compreende quatro anticorpos de domínio.
30. Construção de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que dois dos anticorpos de domínio têm especificidade quanto ao mesmo antígeno.
31. Construção de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que todos os anticorpos de domínio têm especificidade quanto ao mesmo antígeno.
32. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos domínios variáveis simples é diretamente ligado à estrutura de Ig com um ligante que compreende de 1 a 150 aminoácidos.
33. Construção de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos domínios variáveis simples é diretamente ligado à estrutura de Ig com um ligante que compreende de 1 a 20 aminoácidos.
34. Construção de ligação de antígeno de acordo com a 5 reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos domínios de ligação de epítopo é diretamente ligado à estrutura de Ig com um ligante selecionado de qualquer um daqueles na SEQ ID N°: 6 a 11 ou ‘GS’ ou qualquer combinação.
35. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos domínios de ligação de epítopo liga a albumina de soro humano.
36. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 33, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de ligação de epítopo ligado à estrutura de Ig no terminal N da cadeia leve.
37. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 33, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de ligação de epítopo ligado à estrutura de Ig no terminal N da cadeia pesada.
38. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 33, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de ligação de epítopo ligado à estrutura de Ig no terminal C da cadeia leve.
39. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 33, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de ligação de epítopo ligado à estrutura de Ig no terminal C da cadeia pesada.
40. Construção de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que tem 4 locais de ligação de antígeno e que é capaz de ligar 4 antígenos simultaneamente.
41. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que é para o 5 uso em medicamento.
42. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que é para o uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer ou doenças inflamatórias tais como asma, artrite reumatóide ou osteoartrite.
43. Método para tratar um paciente que sofre de câncer ou uma doença inflamatória, tal como asma, artrite reumatóide ou osteoartrite, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade terapêutica de uma construção de ligação de antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações precedentes.
44. Construção de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que é para o tratamento de câncer ou doenças inflamatórias tais como asma, artrite reumatóide ou osteoartrite.
45. Sequência de polinucleotídeo, caracterizada pelo fato de que codifica a cadeia pesada de uma construção de ligação de antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 40.
46. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica uma cadeia leve de uma construção de ligação de antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 40.
47. Célula hospedeira transformada ou transfectada recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada e uma cadeia leve de uma construção de ligação de antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações precedentes.
48. Método para produzir uma construção de ligação de antígeno como definida nas reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de cultivar uma célula hospedeira como definida na reivindicação 47 e isolar a construção de ligação de antígeno.
49. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma construção de ligação de antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 38 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
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