ES2588990T3 - Métodos mejorados para la purificación de vectores de AAV recombinantes - Google Patents

Abstract

Un método para aislar una población de partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) de impurezas producidas durante el procedimiento en una corriente de alimentación, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una corriente de alimentación que contiene las partículas de rAAV con un medio cromatográfico de apatito en presencia de polietilenglicol (PEG), en donde las partículas de rAAV se unen al medio cromatográfico de apatito; y (b) eluir las partículas de rAAV unidas al medio cromatográfico de apatito con un tampón de elución que contiene menos de 3% (p/v) de PEG.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

En cualquiera de los casos de la presente divulgación o cualesquiera realizaciones descritas en la presente, las partículas de rAAV tienen un serotipo de la cápside de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV

16. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de la cápside de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1, AAV-4, AAV-5, y AAV-8. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de la cápside de AAV de AAV-1. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de la cápside de AAV de AAV-4. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de la cápside de AAV de AAV-5. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de la cápside de AAV de AAV-8. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside de AAV procedente de un serotipo de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de la cápside de AAV que es un aglutinante aniónico débil. En algunas realizaciones, el serotipo de la cápside de AAV que es una unión aniónica débil se selecciona del grupo que consiste en AAV-1, AAV4, AAV-5 y AAV-8. En algunas realizaciones, la composición que contiene partículas de rAAV comprende además contaminantes de cultivos de producción. En algunas realizaciones, los contaminantes de cultivos de producción comprenden partículas de rAAV dañadas, contaminantes de células hospedadoras, contaminantes virus cooperadores y/o contaminantes de cultivos celulares. En algunas realizaciones, los contaminantes de células hospedadoras comprenden ADN de células hospedadoras, plásmidos, o una proteína de célula hospedadora. En algunas realizaciones, los contaminantes del virus cooperador comprenden partículas del adenovirus, ADN del adenovirus o proteínas del adenovirus. En algunas realizaciones, los contaminantes del cultivo celular comprenden componentes del medio, albúmina sérica u otras proteínas séricas. En algunas realizaciones, los contaminantes del cultivo celular comprenden componentes del medio. En algunas realizaciones, los contaminantes del cultivo celular no comprenden albúmina sérica u otras proteínas séricas.

Se ha de entender que una, alguna o todas las propiedades de las diversas realizaciones descritas en la presente se pueden combinar para formar otras realizaciones de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 presenta los resultados de la digestión con Benzonase® del sobrenadante depurado de la cosecha del cultivo de producción de rAAV. Los resultados demuestran que no estaba presente ADN de alto peso molecular después de la digestión con Benzonase®.

La Figura 2 presenta un rastreo espectrofotométrico típico para una resina típica cribada con respecto a la afinidad de unión a rAAV según se describe en el Ejemplo 4. Se indicaban la absorbancia (AU) y la conductividad (mS/cm).

La Figura 3 presenta un análisis de capacidad de saturación con y sin PEG. Se usaron dos cultivos de producción de rAAV modélicos para juzgar la capacidad de la resina de apatito (CFT tipo I). Panel superior: Saturación durante la carga de corrientes de alimentación que contienen suero o libres de suero en presencia o ausencia de aproximadamente 5% (p/v) de PEG6000 en la carga. Los volúmenes de carga se refieren a la corriente de alimentación de partida, antes de la dilución en línea 1:1, y se normalizaron por ml de volumen de resina. Panel inferior: Volúmenes de carga (ml) en los que se observaba 1% de saturación, y recuperación en la fracción eluida. Las cosechas de TFF utilizadas en el experimento estaban en una concentración de aproximadamente 1016 DRP/ml para los vectores de rAAV. En presencia de aproximadamente 5% (p/v) de PEG6000, 150 ml de la cosecha de TFF se cargaron a los 1,2 ml de resina de CFT sin saturación, lo que se definió como la presencia de >1% de rAAV en el flujo pasante de columna, correspondiente a una carga de 1,8×1014 de DRP de rAAV totales.

La Figura 4 presenta un cromatograma de CHT I típico. Se muestran en línea medidas de la absorbancia UV A280 (AU, unidad de absorbancia) y la conductividad (mS/cm) mediante el Amersham 3 mm Skid. Las llaves indican los principales segmentos del programa descrito en el Ejemplo 7. "NaOH" indica la etapa de descontaminación de la columna.

La Figura 5 muestra la pureza relativa de vectores de rAAV eluidos desde resinas de apatito. El Panel A muestra la distribución del vector entre el flujo pasante/el recorrido (FT), el lavado con alto contenido de fosfato/5% (p/v) de PEG6000 (PO4), los lavados para retirar fosfato y PEG6000 (WII/WIII) y la elución. Ninguna de las diferencias entre los casos son significativas dentro de la precisión de la analítica, y es típica la falta de balance de masas. El Panel B muestra los carriles pertinentes procedentes de una SDS PAGE con tinción con Sypro orange con fracciones de elución desde la columna de apatito. Cada muestra se cargó en 2×1011 DRP/carril; la diferencia de migración aparente entre los carriles es un artefacto salino debido a que tiene que concentrar la elución de CFT mediante la evaporación hasta un volumen que cupiera en el gel. Las únicas bandas predominantes parecen ser proteínas de la cápside de AAV. El Panel C muestra los carriles pertinentes de una trasferencia Western de Ad5 con carriles reordenados por claridad, demostrando una depuración comparable de proteínas Ad5.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

La Figura 6 muestra el examen de la purificación a través del procedimiento mediante SDS-PAGE. Muestras producidas durante el procedimiento a partir de una cosecha de cultivo de producción representativa se probaron en un gel de poliacrilamida al 10% desnaturalizador/reductor y se tiñó con Sypro orange. Todas las muestras después de la cosecha se cargaron en 1×1010 DRP/carril. Las dos muestras aguas arriba antes de la etapa de concentración de TFF (etapa de depuración inicial y flujo pasante de AEX) solo se podían cargar en 1×109 DRP/carril debido a restricciones de volumen en el gel. Se cargó ß-galactosidasa (ß-Gal) en 50 ng/carril para examinar la sensibilidad y la consistencia de la tinción a través del gel. Se indican las tres proteínas de la cápside de AAV1 (VP1, 2, y 3).

La Figura 7 muestra la recuperación por etapas para la purificación de rAAV según se describe en los Ejemplos 1

12. La DRP total presente en el sobrenadante antes de la cosecha se definió como 100%. La recuperación en cada etapa es la DRP total recuperada con relación a DRP total procesada a lo largo de esa etapa. La recuperación global para todo el procedimiento era aproximadamente 28%. D4 sup: cultivo de producción; AEX FT: flujo pasante del intercambio aniónico (Mustang® Q); captura: cromatografía en apatito; calor: inactivación térmica o destrucción térmica; HIC: cromatografía de interacción hidrófoba; SEC: cromatografía de exclusión por tamaño; AEX: intercambio aniónico.

Descripción detallada

Un objetivo de esta divulgación, incluyendo la presente invención, es proporcionar métodos para aislar una población de partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) para cualquier serotipo de la cápside de AAV de contaminantes del cultivo de producción tales como partículas de rAAV dañadas, virus cooperadores, proteínas de virus cooperadores, plásmidos, proteínas y ADN celulares, componentes del medio, proteínas séricas, y similares. Por otra parte, los métodos de la presente divulgación, incluyendo la presente invención, proporcionan procedimientos ortogonales comercialmente ampliables a escala de acuerdo con los requisitos reguladores para el aislamiento de una población de partículas de rAAV de cosechas o corrientes de alimentación de cultivos de producción de rAAV de título alto. Las poblaciones de partículas de rAAV aisladas mediante los métodos de la presente divulgación, incluyendo la presente invención, están sustancialmente libres de contaminantes, incluyendo contaminantes del cultivo de producción y/o contaminantes producidos durante el procedimiento, tales como partículas de rAAV dañadas, virus cooperadores, proteínas de virus cooperadores, plásmidos, proteínas y ADN celulares, componentes del medio, proteínas séricas y glucanos. Los métodos de la presente divulgación, incluyendo la presente invención, son particularmente adecuados para serotipos de vectores de rAAV que son aglutinantes aniónicos débiles tales como, por ejemplo, rAAV-1, rAAV-4, rAAV-5 y rAAV-8. La divulgación, incluyendo la presente invención, contempla además un método para aislar una población de título alto de partículas de rAAV sustancialmente libres de contaminantes, incluyendo contaminantes del cultivo de producción y/o contaminantes producidos durante el procedimiento, adecuado para el uso en aplicaciones de terapia génica sin la necesidad de realizar una centrifugación con gradiente de densidad.

Definiciones

El término "aislado" o "purificado", según se usa en la presente, se refiere a una preparación de partículas de rAAV desprovista de al menos algunos de los otros componentes que también pueden estar presentes cuando las partículas de rAAV son las presentes en la naturaleza o se preparan inicialmente a partir de las mismas. Así, por ejemplo, se pueden preparar partículas de rAAV aisladas usando una técnica de purificación para enriquecerla desde una mezcla fuente, tal como un lisado de cultivo o un sobrenadante del cultivo de producción. El enriquecimiento se puede medir de una variedad de modos, tales como, por ejemplo, por la proporción de partículas resistentes a desoxirribonucleasa (DRPs) presentes en una solución, o por la infectividad, o se puede medir con relación a una segunda sustancia potencialmente interferente presente en la mezcla fuente, tal como contaminantes, incluyendo contaminantes del cultivo de producción o contaminantes producidos durante el procedimiento, incluyendo virus cooperadores, componentes del medio, y similares, según se define posteriormente.

Se dice que una preparación de rAAV está "sustancialmente libre" de virus cooperador si la relación de partículas de AAV infecciosas a partículas de virus cooperador infecciosas es al menos aproximadamente 102:1; preferiblemente al menos aproximadamente 104:1, más preferiblemente al menos aproximadamente 106:1; aún más preferiblemente al menos aproximadamente 108:1. Preferiblemente, las preparaciones también están libres de cantidades equivalentes de proteínas del virus cooperador (es decir, proteínas que estarían presentes como resultado de tal nivel de virus cooperador si las impurezas de las partículas de virus cooperador apuntadas anteriormente estuvieran presentes en forma alterada). La contaminación viral y/o de proteínas celulares se puede observar generalmente como la presencia de bandas de tinción con Coomassie sobre geles de SDS (p. ej., la aparición de bandas distintas a las correspondientes a las proteínas de la cápside de AAV VP1, VP2 y VP3).

El término "aglutinante aniónico débil" o "aglutinante aniónico de baja afinidad", según se usa en la presente intercambiablemente, se refiere a una partícula de rAAV que tiene un serotipo de la cápside que, en presencia de contaminantes (incluyendo contaminantes del cultivo de producción o contaminantes producidos durante el procedimiento), no se une con suficiente afinidad para permitir el aislamiento de las partículas de rAAV de otros

imagen7

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Los términos "resina de apatito”, "medio cromatográfico de apatito”, "matriz de apatito" o "medio de apatito”, según se usan en la presente intercambiablemente, se refieren a un medio cromatográfico comprendido por un mineral de fosfato cálcico, e incluye sin limitación medios cromatográficos de hidroxiapatito cerámico (CHT) y fluoroapatito cerámico (CFT).

Los términos "modo mixto" o "multimodal" se refieren a medios cromatográficos que tienen la capacidad para más de una química de unión. Medios cromatográficos en modo mixto incluyen sin limitación medios cromatográficos de apatito, que son capaces de exhibir unión por afinidad a metales a través de los restos calcio, unión por enlaces de hidrógeno a través de los grupos hidroxilo presentes sobre la cadena principal, repulsión de cargas positivas y atracción de cargas negativas a través de los restos calcio y repulsión de cargas negativas y atracción de cargas positivas a través de los restos fosfato presentes sobre el medio.

Una referencia general a "la composición" o "composiciones" incluye y es aplicable a composiciones de la divulgación, incluyendo la presente invención.

Según se usa en la presente, la forma singular de los artículos "un”, "uno(a)”, y "el(la)" incluye referencias plurales a menos que se indique otra cosa. Por ejemplo, la expresión "una partícula de virus" incluye una o más partículas de virus.

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) realizaciones que se dirigen a ese valor o parámetro de por sí. Por ejemplo, una descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X."

Se entiende que los aspectos y las realizaciones de la invención en la presente incluyen que consisten y/o que consisten esencialmente en aspectos y realizaciones.

Producción de vectores de rAAV

Se conocen en la técnica numerosos métodos para la producción de vectores de rAAV, incluyendo sistemas de transfección, de producción de líneas celulares estables y de producción de virus híbridos infecciosos que incluyen híbridos de adenovirus-AAV, híbridos de herpesvirus-AAV e híbridos de baculovirus-AAV. Los cultivos de producción de rAAV para la producción de partículas de virus rAAV requieren todos; 1) células hospedadoras adecuadas, incluyendo, por ejemplo, líneas celulares derivadas de ser humano tales como células HeLa, A549 o 293, o líneas celulares derivadas de insecto tales como SF-9, en el caso de sistemas de producción de baculovirus; 2) función de virus cooperador adecuada, proporcionada por adenovirus silvestres o mutantes (tales como adenovirus sensibles a la temperatura), herpesvirus, baculovirus, o una construcción plasmídica que proporciona funciones cooperadoras; 3) genes y productos génicos rep y cap de AAV; 4) un transgén (tal como un transgén terapéutico) flanqueado por secuencias de ITR de AAV; y 5) medios y componentes de medios adecuados para soportar la producción de rAAV. Medios adecuados conocidos en la especialidad se pueden usar para la producción de vectores de rAAV. Estos medios incluyen, sin limitación, medios producidos por Hyclone Laboratories y JRH incluyendo medio de Eagle modificado (MEM), medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), formulaciones habituales tales como las descritas en la Patente de EE. UU. Nº 6.566.118, y medio Sf-900 II SFM según se describe en la Patente de EE. UU. Nº 6.723.551, particularmente con respecto a formulaciones de medios habituales para el uso en la producción de vectores de AAV recombinantes.

Medios de cultivo de producción de rAAV adecuados de la presente divulgación, incluyendo la presente invención, se pueden complementar con suero o proteínas recombinantes derivadas de suero en un nivel de 0,5%-20% (v/v o p/v). Alternativamente, como se sabe en la especialidad, se pueden producir vectores de rAAV en condiciones libres de suero que también se pueden denominar medios sin productos derivados de animales. Un experto normal en la especialidad puede apreciar que medios comerciales o habituales diseñados para soportar la producción de vectores de rAAV también se pueden complementar con uno o más componentes de cultivo celular conocidos en la especialidad, incluyendo sin limitación glucosa, vitaminas, aminoácidos y/o factores de crecimiento, a fin de incrementar el título de rAAV en cultivos de producción.

Los cultivos de producción de rAAV se pueden desarrollar bajo una variedad de condiciones (a lo largo de un amplio intervalo de temperatura, durante espacios de tiempo variables, y similares) adecuadas para la célula hospedadora particular que se utilice. Como se sabe en la especialidad, los cultivos de producción de rAAV incluyen cultivos dependientes de la adhesión que se pueden cultivar en recipientes dependientes de la adhesión adecuados tales como, por ejemplo, botellas giratorias, filtros de fibra hueca, microportadores y biorreactores de lecho relleno o de lecho fluidizado. Los cultivos de producción de vectores de rAAV también pueden incluir células hospedadoras adaptadas a suspensiones tales como células HeLa, 293 y SF-9 que se pueden cultivar de una variedad de modos incluyendo, por ejemplo, matraces rotatorios, biorreactores de tanque agitado y sistemas desechables tales como el sistema de bolsa de Wave.

imagen8

imagen9

15

25

35

45

55

65

Los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que la presencia de polietilenglicol (PEG) en el tampón de carga incrementa drásticamente la capacidad y la reproducibilidad (al reducir la saturación variable de partículas de rAAV en el flujo pasante) de la unión de partículas de vectores de rAAV a resinas de apatito. Sin querer limitarse por una teoría, un atributo de los vectores de rAAV que los distingue de la mayoría de las impurezas relacionadas con el procedimiento es el gran tamaño físico de las partículas. Esta diferencia de tamaño se explotó en las etapas de captura y lavado al incluir polietilenglicol (PEG) en los tampones de captura y lavado cromatográficos para incrementar preferentemente los coeficientes de reparto de moléculas mayores al estado unido basándose en la compartición energéticamente favorable de envueltas de hidratación. Aunque se ha descrito en la especialidad el uso de PEG en la purificación de vectores virales y de bacteriófago, a diferencia de la presente invención, se usaba principalmente como un agente precipitante para agregar físicamente y retirar partículas virales de la solución. Puesto que se sabe en la técnica que el PEG facilita la agregación y la precipitación de partículas virales y se ha descrito en la especialidad que rAAV forma agregados a una intensidad iónica por debajo de 200 mM (Wright y cols., Molecular Therapy 12:171-178 (2005)), el efecto del PEG sobre la unión de vectores de rAAV a resinas de apatito era impredecible. Se sabía en la especialidad que el PEG facilitaba la unión de moléculas de inmunoglobulina a resinas de intercambio iónico según se describe, por ejemplo, en Gagnon, J. Chromtogr. 743A:51-55 (1996), y para resinas de modo mixto hidrófobas cargadas, según se describe, por ejemplo, en Gagnon y cols., 22nd International IBC Conference on Antibody Production and Development, 4-6 de marzo de 2009.

Los inventores de la presente solicitud han determinado basándose en la experimentación con PEG6000 a lo largo de un intervalo de concentración entre 3-10% (p/v) en la corriente de alimentación que una concentración relativa de aproximadamente 5% (p/v) de PEG6000 era óptima. Un experto normal en la técnica apreciará que se pueden utilizar otras especies y pesos moleculares de PEG incluyendo sin limitación PEG8000, PEG10000 y PEG15000, y que la concentración relativa de PEG a la concentración final en la solución de vector de rAAV se puede determinar empíricamente de modo que a las concentraciones apropiadas de PEG, las partículas de vector de rAAV en la solución sean impulsadas a unirse a la resina de apatito pero no formen agregados o precipiten físicamente.

En algunos casos, las partículas de vector de rAAV se aíslan de contaminantes del cultivo de producción mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG y elución de la partícula de rAAV unida desde la resina de apatito en un tampón de fosfato. En realizaciones preferidas, las partículas de vector de rAAV se aíslan de contaminantes del cultivo de producción mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG y elución de la partícula de rAAV unida desde la resina de apatito en un tampón en ausencia de PEG. En algunas realizaciones, partículas de rAAV que comprenden cápsides que son aglutinantes aniónicos débiles se aíslan de contaminantes del cultivo de producción mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG y la partícula de rAAV unida se eluye desde la resina de apatito en un tampón en ausencia de PEG. En realizaciones más preferidas, partículas de rAAV que comprenden cápsides de serotipo 1 (serotipo rAAV-1) se aíslan de contaminantes del cultivo de producción mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG y la cápside de serotipo rAAV-1 que contiene partículas unidas a la resina se eluye en tampón en ausencia de PEG. En algunas realizaciones, las partículas de vectores de rAAV se aíslan de contaminantes del cultivo de producción según un método que comprende cargar una corriente de alimentación en un tampón de carga en ausencia de fosfato pero en presencia de PEG y eluir el rAAV unido desde la resina de apatito en un tampón de elución que comprende fosfato y que carece de PEG.

Aunque la cromatografía en apatito en presencia de PEG representa una estrategia de captura o unión eficaz para la purificación de vectores de rAAV, muchas impurezas producidas durante el procedimiento también eran retenidas por la resina de apatito a pH 7,0. Sin querer limitarse por una teoría, sería más probable que las proteínas presentes en la corriente de alimentación a pH básico (pH mayor de 7,0) tuvieran una carga neta negativa y fueran repelidas por los sitios de unión de fosfato negativos presentes sobre la resina de apatito, reduciendo de ese modo la capacidad de unión por intercambio catiónico global de la resina cromatográfica. Sin embargo, dada la naturaleza de modo mixto de las resinas de apatito, todavía se produce la unión a través de atracción a cargas positivas y afinidad a metales.

Los tampones de borato se usan habitualmente en la técnica como sistemas tamponadores básicos debido a sus propiedades de fabricación deseables incluyendo sin limitación facilidad de preparación, solubilidad óptima, excelente capacidad tamponadora y bajo coste. Por lo tanto, tampones de borato como el sistema tamponador básico modélico se evaluaron con respecto a la captura de rAAV sobre resinas de apatito. Un experto normal en la especialidad puede apreciar que se podrían evaluar otros tampones básicos para determinar si reducían el nivel de unión de impurezas producidas durante el procedimiento a resinas de apatito en presencia de PEG. Otros tampones básicos se pueden probar y usar con respecto a la captura de rAAV. En algunos casos de la divulgación, el tampón de carga de apatito en ausencia de PEG comprende un tampón de borato. En casos o realizaciones preferidos, el tampón de borato se formula a un pH entre aproximadamente 8,0 y aproximadamente pH 9,9. En un caso o una realización preferidos, el tampón de borato se formula a un pH de aproximadamente 9,0. En algunos casos o realizaciones, el tampón de borato está en una concentración entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 500 mM. En casos o realizaciones más preferidos, el tampón de borato se formula en aproximadamente 20 mM de borato, pH 9,0. En algunos casos o realizaciones, el tampón de borato 20 mM a pH 9,0 reduce específicamente la captura de impurezas de molécula pequeña producidas durante el procedimiento sobre la resina de apatito.

15

25

35

45

55

65

En algunas realizaciones, la corriente de alimentación se carga sobre la resina de apatito en un tampón que contiene fosfato en presencia de PEG mediante mezcladura en línea de la corriente de alimentación con un tampón de fosfato que comprende PEG en dos veces la concentración final de PEG. En algunas realizaciones, el pH del tampón de fosfato está entre pH 6,5 y pH 7,0. En algunas realizaciones, el PEG es PEG6000. En algunas realizaciones, la concentración de PEG6000 en el tampón de carga está entre aproximadamente 3% (p/v) y aproximadamente 10% (p/v). En realizaciones más preferidas, la concentración de PEG6000 en el tampón de carga es aproximadamente 5% (p/v). En algunas realizaciones, la concentración de fosfato en el tampón de carga para la resina de apatito está entre5mMy 500mM

En algunas realizaciones, la capacidad de unión de la resina de apatito en presencia de PEG se potencia con relación a la capacidad de unión de la resina de apatito en ausencia de PEG. En algunas realizaciones, la capacidad de unión de la resina de apatito para partículas de vector de rAAV en una corriente de alimentación en presencia de PEG se potencia desde aproximadamente medio logaritmo hasta aproximadamente diez logaritmos con relación a la capacidad de unión de la resina de apatito en ausencia de PEG. En realizaciones preferidas, la capacidad de unión de la resina de apatito para partículas de rAAV presentes en una corriente de alimentación en presencia de PEG se potencia ocho logaritmos. En algunas realizaciones, la capacidad de unión de la resina de apatito para partículas de vector de rAAV en una corriente de alimentación en presencia de PEG es de al menos aproximadamente 106 partículas de rAAV por ml de resina a aproximadamente 1016 partículas por ml de resina (tal como aproximadamente cualquiera de 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016 partículas por ml de resina). En algunas realizaciones, la capacidad de unión de la resina de apatito en presencia de PEG es aproximadamente 1014 partículas por ml de resina.

Aunque esta sorprendente capacidad de unión de aproximadamente 1012-1014 DRP de rAAV-1 por ml de resina de apatito en presencia de PEG permite la ampliación a escala rentable altamente eficaz de la purificación de rAAV-1 comercial, un experto normal en la especialidad apreciará que la capacidad de unión representa el número máximo de rAAV-1 que se unirá por ml de resina y no pretende limitar operativamente el alcance de la invención. En efecto, los inventores aprecian que los cultivos cosechados de vectores de rAAV-1 que contienen menos de 1014-1016 DRP de rAAV-1/ml se pueden purificar mediante la presente invención.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV unidas al medio de apatito se lavan antes de eluir las partículas de rAAV desde la resina. En algunas realizaciones, el medio cromatográfico de apatito se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene concentraciones decrecientes de PEG para retirar las impurezas producidas durante el procedimiento. En algunas realizaciones, el medio cromatográfico de apatito se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene entre aproximadamente 3% (p/v) y aproximadamente 10% (p/v) de PEG. En algunas realizaciones, el tampón de lavado contiene aproximadamente cualquiera de 10% (p/v), 9,5% (p/v), 9% (p/v), 8,5% (p/v), 8% (p/v), 7,5% (p/v), 7% (p/v), 6,5% (p/v), 6% (p/v), 5,5% (p/v), 5% (p/v), 4,5% (p/v), 4% (p/v), 3,5% (p/v) y 3% (p/v) de PEG. En algunas realizaciones, el medio de apatito se lava con un tampón de lavado que contiene PEG a una concentración mayor que la concentración de PEG usada para permitir la unión de las partículas de rAAV al medio de apatito. En algunas realizaciones, el medio de apatito se lava adicionalmente con una concentración decreciente de PEG. En algunas realizaciones, el tampón de lavado contiene tampones conocidos en la especialidad. En alguna realización, el tampón de lavado comprende un tampón seleccionado del grupo que consiste en borato, ácido N-2-hidoxietilpiperacino-N’-2-etanosulfónico (HEPES) y Tris-HCl. En algunas realizaciones, el tampón de lavado está a un pH básico. En algunas realizaciones, el tampón de lavado tiene un pH entre pH 7,0 y pH 10,0, entre pH 7,2 y pH 10,0, entre pH 7,4 y pH 10,0, entre pH 7,6 y pH 10,0, entre pH 7,8 y pH 10,0, pH 8,0 y pH 10,0, pH 8,2 y pH 10,0, entre pH 8,4 y pH 10,0, entre pH 8,6 y pH 10,0, entre pH 8,8 y pH 10,0, entre pH 9,0 y pH 10,0, entre pH 9,2 y pH 10,0, entre pH 9,4 y pH 10,0, entre pH 9,6 y pH 10,0, o entre pH 9,8 y pH 10,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado tiene un pH en 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8, 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8 o 10,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende además entre 100 y 500 mM de fosfato. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende además entre 50 y 250 mM de NaCl.

En algunos casos de la divulgación, los vectores de rAAV aislados de una corriente de alimentación mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG se eluyen en un tampón en concentraciones bajas de PEG. En algunos casos, incluyendo algunas realizaciones, las bajas concentraciones de PEG están entre aproximadamente 2,9% (p/v) y aproximadamente 0,1% (p/v) de PEG. En algunos casos, incluyendo algunas realizaciones, los vectores de rAAV aislados de una corriente de alimentación mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG se eluyen en un tampón en ausencia de PEG. En casos o realizaciones preferidos, los vectores de rAAV aislados de una corriente de alimentación mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG se eluyen en un tampón que contiene fosfato en ausencia de PEG.

En algunas realizaciones, los vectores de rAAV aislados de una corriente de alimentación mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG se eluyen en un tampón que contiene fosfato. En algunas realizaciones, los vectores de rAAV aislados de una corriente de alimentación mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG se eluyen en un tampón que contiene fosfato en una concentración entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 500 mM (tal como entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 250 mM, entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 100 mM). En realizaciones preferidas, los vectores de rAAV aislados

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

de una corriente de alimentación mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG se eluyen en un tampón de fosfato 50 mM.

Los inventores de la presente solicitud han descubierto que los vectores de rAAV presentes en una corriente de alimentación se pueden aislar mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG. Sin embargo, si virus cooperadores usados en el cultivo de producción (tales como adenovirus) están presentes en la corriente de alimentación aplicada a la resina de apatito, son capturados por la resina de apatito en presencia de PEG. Las partículas de vector de rAAV capturadas por la resina de apatito en presencia de PEG se pueden aislar fácilmente del adenovirus por su perfil de elución en tampones de fosfato. Las partículas de vector de rAAV unidas a la resina de apatito en presencia de PEG se eluyen, en ausencia de PEG, en tampones que contienen tan poco como 0 mM de fosfato; mientras que las partículas adenovirales de virus cooperador son retenidas sobre las resinas de apatito bajo las concentraciones de fosfato usadas para eluir las partículas de vector de rAAV. Experimentalmente, se encontró que los vectores de rAAV se eluyen en un solo pico agudo en tan poco como 50 mM de fosfato en ausencia de PEG, mientras que un virus cooperador tal como adenovirus si está presente se retiene sobre la resina. En estudios de agregación en los que a las corrientes de alimentación de rAAV se agregaban 89 partículas resistentes a desoxirribonucleasa (DRPs) de adenovirus infeccioso y se sometían a cromatografía sobre resinas de apatito en presencia de PEG, los vectores de rAAV se capturaban sobre la resina de apatito y se eluían en tampón de fosfato 50 mM en ausencia de PEG, mientras que aproximadamente 4 logaritmos de proteínas adenovirales se retenían sobre la resina de apatito. Según esto, en algunas realizaciones, los vectores de rAAV presentes en una corriente de alimentación se aíslan del virus cooperador contaminante mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG y elución en tampones de fosfato en ausencia de PEG. En algunas realizaciones, los tampones de fosfato se formulan en concentraciones que retienen el virus cooperador contaminante unido a la resina de apatito. En algunas realizaciones, de dos a ocho logaritmos de adenovirus son retenidos por ml de resina de apatito. En algunas realizaciones, los vectores de rAAV presentes en una corriente de alimentación se aíslan mediante elución desde una resina de apatito en tampón de fosfato 0-500 mM (tal como 0-400 mM, 0-300 mM, 0200 mM, 0-100 mM, 0-50 mM) bajo condiciones que retienen el virus cooperador unido a la resina de apatito.

Sistemas de producción conocidos en la técnica para producir vectores de rAAV pueden incluir medios de producción que contienen suero en el intervalo de 0,5%-20% (v/v), o pueden estar desprovistos por completo de suero. Por otra parte, esquemas de purificación descritos en la especialidad pueden incluir una o más etapas de concentración que pueden dar como resultado un incremento de proteínas séricas y otros componentes séricos en la corriente de alimentación aplicada a la resina de apatito. Por ejemplo, el sobrenadante del cultivo de producción que se describe en la presente que estaba formulado con 1% (v/v) de suero se concentró aproximadamente veinte veces en la etapa de TFF, de modo que la corriente de alimentación cargada sobre la resina de apatito contuviera tanto como 20% de contaminantes de proteína sérica en comparación con un concentrado de la corriente de alimentación procedente de un cultivo de producción formulado sin suero. Los inventores de la presente solicitud probaron los métodos de captura en apatito proporcionados en la presente con concentrados de corrientes de alimentación procedentes de cultivos de producción formulados en presencia o ausencia de suero. Se encontró que la presencia de proteínas séricas en la corriente de alimentación no tenía efecto sobre el comportamiento de la etapa cromatográfica en apatito.

Inactivación térmica de virus cooperador (destrucción térmica)

Si se usan adenovirus infecciosos como una fuente de virus cooperador en los cultivos de producción para la producción de rAAV, se puede incorporar una etapa de inactivación térmica (destrucción térmica) opcional para inactivar cualesquiera partículas adenovirales residuales que puedan estar presentes en la corriente de alimentación. La etapa de destrucción térmica se beneficia de una de las principales diferencias entre AAV y adenovirus: las partículas de adenovirus se inactivan a temperaturas de aproximadamente 54-56°C, mientras que las partículas virales de AAV y rAAV son estables y no se ven afectadas por esas temperaturas. En la presente divulgación, incluyendo una realización de la presente invención, los inventores han ajustado la etapa de inactivación térmica para ajustarse a una optimización del procedimiento a mayor escala tal como los cultivos de producción a una escala de 250 l realizados en la presente. En particular, el eluido del apatito se inactivó térmicamente en una bolsa de bioprocesamiento de un solo uso estéril de 5 l sobre una plataforma giratoria de temperatura controlada ajustada a 53°C con una velocidad de giro de 40 RPM, con un ángulo de 12° para la mezcladura (recipiente calentador de Wave de 20 l). El eluido del apatito se incubó sobre la plataforma hasta que alcanzaba 52°C, y a continuación se mantuvo a esa temperatura durante 10 minutos adicionales. Se añadió MgCl2 al eluido del apatito en una concentración final de 2 mM para estabilizar el vector de rAAV durante el calentamiento. Un experto normal en la especialidad puede apreciar que la escala, el punto de ajuste final para el calentamiento y el tiempo de calentamiento se pueden probar empíricamente para encontrar condiciones óptimas para inactivar partículas adenovirales mientras se mantiene la infectividad y la integridad de las partículas de rAAV. La etapa de inactivación térmica se puede omitir para la purificación de partículas de rAAV de cultivos de producción que utilizan construcciones plasmídicas para proporcionar una función cooperadora.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Cromatografía de interacción hidrófoba

La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) es una técnica para separar biomoléculas basándose en diferencias en su hidrofobia superficial. Así, la HIC se considera un método ortogonal a las otras etapas de purificación en el procedimiento de AAV. Los medios cromatográficos de HIC contienen ligandos hidrófobos tales como hidrocarburos de cadena lineal (p. ej., propilo (C3), butilo (C4), hexilo (C6) u octilo (C8)) o compuestos aromáticos (p. ej., fenilo). En agua pura, el efecto hidrófobo es demasiado débil para la interacción funcional entre el ligando y proteínas, o entre las propias proteínas. Sin embargo, las sales liotrópicas potencian las interacciones hidrófobas, y la adición de sal impulsa la captura de proteínas en medios de HIC. Por esta razón, las resinas de HIC se cargan habitualmente bajo altas concentraciones de sal y se eluyen a concentraciones de sal inferiores. Como apreciará un experto normal en la especialidad, el sulfato amónico [(NH4)2SO4] es la sal más comúnmente usada para controlar la captura de proteínas a través de cromatografía HIC, debido a la alta clasificación liotrópica de los iones tanto amonio como sulfato en la serie de Hofmeister, y la alta solubilidad de la sal. En la presente divulgación, partículas de rAAV presentes en una corriente de alimentación se cargaron sobre una resina de HIC mediante la mezcladura en línea de una relación 75:25 (volumen:volumen) de tampón de sulfato amónico 2 M + BisTris 50 mM (pH 7,0):corriente de alimentación, respectivamente. La mezcladura en línea de la corriente de alimentación con el tampón de carga evita el riesgo de cualquier precipitación de vectores de rAAV por la alta concentración de sulfato amónico presente en el tampón. Como apreciará un experto normal en la especialidad, la concentración de sal (sulfato amónico) se puede manipular para alcanzar la concentración óptima para la unión a rAAV. Según esto, en algunos casos, la concentración de sulfato amónico está entre 1 M y 3 M. En algunos casos preferidos, la concentración de sulfato amónico en el tampón de carga es 2 mM. Como puede apreciar un experto normal en la especialidad, la mezcladura en línea del sulfato amónico y la corriente de alimentación se realiza por comodidad y fluidez de la operación de la unidad, pero se podría mezclar fácilmente la corriente de alimentación con la concentración apropiada de tampón de carga por cualquier medio conocido en la especialidad y a continuación cargar la corriente de alimentación + la solución de tampón de carga sobre el medio cromatográfico de HIC.

Los codisolventes también pueden afectar a la interacción hidrófoba. Por ejemplo, el etilen-o el propilenglicol puede reducir la interacción entre la proteína y el ligando inmovilizado y así ser útil para mejorar los perfiles de elución. Según esto, la columna de HIC se lavó con una mezcla 75:25 (v:v) de tampón de sulfato amónico 2 M + BisTris 50 mM (pH 7,0):tampón de BisTris 50 mM (pH 7,0) + 10% de propilenglicol (v:v) (EMD BioSciences), y el rAAV se eluyó en un tampón con bajo contenido de sal más propilenglicol (tampón de sulfato amónico 800 mM + BisTris 50 mM (pH 7,0) + 4% de propilenglicol. Bajo esas condiciones de elución, cualesquiera virus cooperadores y proteínas residuales presentes en la corriente de alimentación cargada sobre la columna permanecerían unidos a la columna. El propilenglicol en este ejemplo se añadió a los tampones para agudizar el perfil de elución, en comparación con el perfil de elución amplio del tampón sin propilenglicol, pero es opcional en el procedimiento.

Ejemplos de resinas hidrófobas adecuadas incluyen sin limitación Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyl 650C, Tosoh Phenyl 650C y EMD Fractogel Phenyl (Tosoh Bioscience LLC, PA)

Un residuo procedente de procedimientos de producción de rAAV requiere una descontaminación rigurosa antes de la eliminación al menos por dos razones: (1) el producto comprende un vector viral; y (2) los cultivos de producción comúnmente usan adenovirus tipo 5 (Ad5) vivo como un virus cooperador para la producción de rAAV. Un residuo líquido procedente de operaciones cromatográficas típicamente se descontamina en primer lugar con lejía en el punto de uso y a continuación se somete a una descontaminación adicional manteniendo a pH alto antes de la neutralización y la eliminación.

El sulfato amónico presente en los tampones de HIC reacciona tanto como lejía como con hidróxido sódico para liberar cloro y amoníaco gaseosos nocivos, respectivamente. Por lo tanto, una primera consideración para la optimización de un procedimiento de la etapa de cromatografía HIC era el desarrollo de un sistema tamponador adecuado que se pudiera descontaminar de forma segura mediante métodos conocidos en la especialidad.

Como apreciará un experto normal en la especialidad, los tampones con altas concentraciones de sal usados en la cromatografía de interacción hidrófoba se deben cribar con respecto a cuestiones de viscosidad que pueden dar como resultado altas contrapresiones que bien pueden limitar los caudales o bien provocar problemas de mezcladura, incrementando de ese modo el riesgo de precipitación del producto mediante cristalización de sales en los tampones que se producen a temperaturas usadas para el almacenamiento o el funcionamiento. Basándose en los datos de la Tabla 6 posterior y considerando los factores descritos anteriormente, los inventores seleccionaron el citrato sódico 1 M (pH 7,0) como el tampón óptimo para la unión de vectores de rAAV al medio cromatográfico de HIC, aunque se pueden usar tampones de citrato en la cromatografía de interacción hidrófoba a concentraciones de 0,5 M a2,0M.

imagen10

imagen11

imagen12

10

15

20

25

30

35

40

45

50

apatito y mejorar la capacidad de la resina para discriminar entre partículas de rAAV-1 y otras impurezas producidas durante el procedimiento. Se desarrollaron además dos mejoras clave para la función de las resinas de apatito según se describe en la presente: 1) la adición de PEG; y 2) el desarrollo de las condiciones del tampón de carga.

Basándose en la saturación variable de la columna de apatito debido a cuestiones de capacidad en los tamaños de columna comercialmente razonables, se mezcló PEG con el concentrado de TFF (véase el Ejemplo 3 anterior) antes de la carga sobre la resina de apatito a fin de incrementar la unión del vector de rAAV-1 con relación a otras impurezas producidas durante el procedimiento tales como albúmina sérica, virus cooperador y otras impurezas proteínicas que desplazan al vector de rAAV-1 con respecto a la unión a la columna en el Ejemplo 4.

La cromatografía en apatito en presencia de PEG representa una estrategia de captura o unión eficaz para la purificación de vectores de rAAV-1, aunque muchas impurezas producidas durante el procedimiento también eran retenidas por la resina de apatito a pH 7,0.

Se realizaron experimentos para determinar si modificar las condiciones de tamponación podía mejorar la resolución de rAAV-1 de otras impurezas producidas durante el procedimiento. Se realizaron experimentos a pequeña escala usando un AKTAexplorer FPLC System (GE Healthcare, Piscataway, NJ) equipado con 5 columnas Tricorn de 1,2 ml (GE Healthcare) rellenas a una altura del lecho de 6 cm con resina de CFT, con circulación a un caudal de 150 cm/h. Esas columnas se evaluaron con respecto a la captura del vector de rAAV-1 frente a la unión de albúmina sérica bovina ("BSA"), una impureza producida durante el procedimiento, de molécula pequeña, modélica, en diversos sistemas tamponadores en presencia o ausencia de 5% de PEG6000.

Se inyectó rAAV-1 o BSA en pequeños volúmenes (<5% del volumen total) en la columna de CFT en el sistema tamponador que se va a ensayar, bien en presencia o bien en ausencia de 5% (p/v) de PEG6000. Se usaron pequeños volúmenes a fin de obviar la necesidad de intercambio de tampones entre las muestras. Los productos se eluyeron junto con un gradiente de PO4 500 mM. Se usó ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico ("MES") 50 mM para tamponar el sistema a pH=6,50, y se usó borato 20 mM para tamponar el sistema a pH 9,0.

Los datos presentados en la Tabla 3 demuestran que la unión de vector de rAAV-1 a la resina de apatito era esencialmente la misma a pH 6,5 o pH 9,0 en presencia de 5% (p/v) de PEG6000, mientras que la unión de BSA, la impureza producida durante el procedimiento, de molécula pequeña, modélica, se reducía drásticamente a pH 9,0 en presencia o ausencia de 5% (p/v) de PEG6000, según se indica por los rastreos espectrofotométricos (datos no mostrados). Un análisis adicional de la capacidad reducida de BSA para unirse a la columna de apatito en condiciones de carga de tampón básico (es decir, pH=9,0) mediante un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas ("ELISA") demostraba que la mayoría de la BSA (78%) estaba presente en el flujo pasante a condiciones tamponadoras de pH 9,0, mientras que se podían alcanzar niveles adicionales de depuración o reducción en la unión a BSA durante etapas de lavado posteriores (19%), dejando sólo 0,1% de la BSA cargada en la columna realmente unida a la resina de apatito y coeluyendo con el vector de rAAV-1. Las partículas de rAAV-1 eran estables a pH=9,0, según se indicaba por la falta de pérdida de infectividad o la disminución en el número de partículas resistentes a desoxirribonucleasa ("DRP") eluidas.

Tabla 3: Fuerza relativa de la unión de rAAV-1 y BSA a resina de apatito a pH=6,5 o pH=9,0, con o sin 5% (p/v) de PEG6000

Condiciones de unión

BSA rAAV-1

pH=6,50

++ +

pH=6,50 + 5% (p/v) de PEG6000

++ ++++

pH=9,0

+ +

pH=9,00 + 5% (p/v) de PEG 6000

+ ++++

Clave: + = unión débil; ++ = unión media; ++++ = unión fuerte.

Ejemplo 6: Efecto del suero en el cultivo de cosecha de rAAV-1 sobre la captura de rAAV-1 a través de cromatografía en apatito en presencia de PEG

Los cultivos de producción de rAAV-1 o las corrientes de alimentación que contienen rAAV-1 que se van a purificar mediante los métodos descritos en la presente pueden contener suero y proteínas séricas si los cultivos de producción se sembraban en medio que contiene suero. Aunque se ha descrito la producción de vectores rAAV-1 que usa concentraciones muy bajas de suero (es decir, 1% o menos) (véase, p. ej., la Pat. EE. UU. Nº 6.995.006), la concentración del cultivo de producción o la corriente de alimentación según se describe en el Ejemplo 3 puede producir una corriente de alimentación que contiene efectivamente 20% de suero y proteínas séricas como resultado de la concentración de 20 veces de la cosecha del cultivo de producción. A fin de evaluar el efecto de componentes

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

séricos sobre el comportamiento de la cromatografía en apatito, se efectuaron experimentos sobre cultivos de producción producidos en presencia o ausencia de suero, en presencia o ausencia de PEG6000.

Se usaron dos cultivos de producción de rAVV-1 modélicos para valorar la capacidad de la resina de apatito (CFT tipo I) mediante análisis de saturación tradicional en un total de cuatro experimentos de carga en columna. En un experimento, los cultivos de producción contenían suero; y, en el segundo experimento, el cultivo de producción no contenía suero. Ambas corrientes de alimentación se probaron en presencia de 5% (p/v) de PEG6000 o en ausencia de PEG. Las corrientes de alimentación eran representativas del procedimiento de cosecha, y eran sobrenadantes de cultivo depurados que se habían hecho pasar sobre un filtro de intercambio aniónico y se habían concentrado 20 veces mediante filtración con flujo tangencial según se describe en la presente. Columnas de CFT tipo I se cargaron mediante la mezcladura en línea 1:1 de la corriente de alimentación con un tampón de borato a pH=9,0. El tampón contenía bien 0% o bien 10% (p/v) de PEG6000 (para alcanzar una concentración final de 5% (p/v) de PEG6000). A medida que se cargaban las columnas, el flujo pasante se recogió en una serie de fracciones que se analizaron con respecto al producto mediante DRP-PCR. La capacidad funcional se definió como el punto en el que la concentración de producto en el flujo de salida de la columna alcanzaba justo 1% de la concentración que entraba en la columna, después de tener en cuenta la dilución en línea. Para cargas de columna que contenían PEG, el resto del procedimiento cromatográfico se realizó a continuación para valorar la recuperación de vector en las fracciones eluidas.

Los datos presentados en la Figura 3 demuestran que la adición de PEG6000 incrementa la capacidad de la resina de apatito con respecto a la unión al vector de rAAV-1 independientemente de si estaba presente suero en el cultivo de producción. Sin querer limitarse por una teoría, el sobrenadante posterior a TFF en presencia de PEG se une preferentemente rAAV-1 a la resina de apatito sobre otras impurezas producidas durante el procedimiento a través de una interacción aniónica con los restos fosfato que puede ser desplazada por la presencia de fosfato en el tampón de elución. Además, la unión de rAAV-1 a la resina de apatito se discrimina adicionalmente de impurezas producidas durante el procedimiento a través de la interacción con metales que puede ser desplazada por la presencia de sal. La unión de rAAV-1 a los restos fosfato no es impulsada principalmente por la hidrofobia, ya que los tampones de captura y elución están formulados para ser principalmente de naturaleza iónica (es decir, el tampón de elución contiene fosfato 50 mM, en comparación con tampones de elución que contienen fosfato 150 mM

o superior usados comúnmente para eluir composiciones unidas por interacciones principalmente hidrófobas). Bajo estas condiciones de elución de alto contenido de sal y bajo contenido de fosfato, el virus cooperador, el ADN de células hospedadoras y otras proteínas de bajo peso molecular residuales contenidos en el sobrenadante de los cultivos de producción, si estuvieran presentes, serían retenidos sobre la resina. Sorprendentemente, los datos demuestran que en presencia de PEG6000, los vectores de rAAV-1 producidos en medios bien libres de suero o bien que contienen suero demuestran una capacidad de unión para las resinas de apatito de al menos 1,2×1012 DRP/ml (una carga de 1 ml) a más de 1,5×1014 DRP/ml de resina (150 ml). En ausencia de 5% (p/v) de PEG6000, la capacidad de unión de la resina de apatito para la cosecha por TFF era menos de 2,4×1012 DRP/ml para vectores producidos medios que contienen suero y 7,2×1012 DRP/ml para vectores producidos en medios libres de suero, ya que no se recuperaba vector de rAAV-1 en el eluido de CFT.

Ejemplo 7: Purificación de rAAV-1 a través de cromatografía en apatito

La columna de CHT tipo I se rellenó con NaCl 2 M y se esterilizó con NaOH 1 M. Antes de la carga, la columna se equilibró con 6 volúmenes de columna ("VC") de borato 20 mM (pH = 9) + 5% (p/v) de PEG6000. El concentrado de la corriente de alimentación de TFF se cargó a través de un BioProcess Skid de 3 mm (GE Healthcare) sobre una columna de CHT de 923 ml (14 cm de diámetro × 6 cm de altura del lecho) preparada como se describe previamente a un caudal de 96 cm/h. El concentrado de la corriente de alimentación de TFF se mezcló en línea con un volumen igual de un tampón de borato 40 mM (pH = 9) + 10% (p/v) de PEG6000 para dar una concentración final de 20 mM de borato (pH = 9) + 5% (p/v) de PEG6000.

Se realizó una serie de 4 lavados secuenciales para retirar impurezas producidas durante el procedimiento mientras se retenía el vector de rAAV-1 sobre la columna. El lavado 1 ("el recorrido") se realizó mediante la mezcladura en línea de 5 VC de un borato 20 mM (pH = 9,0) + 5% (p/v) de PEG6000:borato 40 mM (pH = 9,0) + 10% (p/v) de PEG6000 50:50 (volumen:volumen) para seguir todos los conductos de carga con PEG6000. Además, se encontró que esta etapa incrementaba preferentemente la afinidad de unión de los vectores de rAAV-1. El lavado 2 se realizó con 15 VC de fosfato potásico 150 mM + borato 20 mM (pH = 9) + 5% (p/v) de PEG6000 para retirar la mayoría de la albúmina sérica y otras impurezas producidas durante el procedimiento proteínicas de bajo peso molecular mientras se retenía rAAV-1 en la columna. El lavado 3 ("WII" en la Figura 5) se realizó con 15 VC de borato 20 mM (pH = 9) + 5% (p/v) de PEG6000 para retirar cualquier fosfato residual de modo que el rAAV-1 permaneciera unido a la columna una vez que se retiraba el PEG6000. El lavado 4 ("WIII" en la Figura 5) se realizó con 5 VC de tampón de HEPES 20 mM (pH = 7,0) + NaCl 150 mM para retirar el PEG6000 y para ajustar la concentración de sal, permitiendo de ese modo la discriminación entre rAAV-1 y cualquier virus cooperador residual u otras impurezas producidas durante el procedimiento, tales como contaminantes proteínicos, que pueden permanecer unidos a la columna.

El vector de rAAV-1 se eluyó de la columna mediante 6 VC de un tampón de fosfato potásico 50 mM + HEPES 20 mM (pH = 7,0) + NaCl 150 mM. La Figura 4 muestra un rastreo espectrofotométrico típico de absorbancia UV a 280 nm (A280) y conductividad para el procedimiento cromatográfico en CHT I. La Figura 5 muestra la pureza relativa de vectores de rAAV eluidos de la resina de apatito.

5 Depuración de glucanos mediante cromatografía en apatito

Los glucanos son carbohidratos similares a celulosa que se filtran en el procedimiento desde el filtro de profundidad a base de celulosa usado para recolectar partículas de rAAV-1 desde cultivos de producción. Los glucanos en concentraciones por encima de 1 ng/ml pueden interferir con pruebas de lisados de amebocitos de Limulus estándar ("LAL") con respecto a la contaminación con endotoxinas bacterianas. Según se demuestra en la Tabla 4

10 posteriormente, la columna de apatito CHT tipo I se depuraba 2,5 logaritmos de glucanos procedentes del cultivo de producción. Bajo las condiciones tamponadoras descritas en la presente, la gran mayoría de los glucanos estaba presente en el flujo pasante y no se unía a la columna.

Tabla 4: Depuración de glucanos en el procedimiento

Etapa de procesamiento

Concentración de glucanos (ng/ml) Cantidad total por lote (ng) (escala de 250 l)

Depuración

10,4 2.600.000

TFF

136 1.541.016

Elución de CHT

1,9 4.769

Después de HIC y SEC

0,2 662

Eluido Final del Intercambio Aniónico

0,1 71

15 Las muestras se ensayaron con respecto al glucano usando un ensayo cromogénico cinético basado en LAL específico para glucanos (Glucatell®, Cape Cod, MA).

Depuración de virus cooperador Ad5 mediante cromatografía en apatito

Para confirmar que la cromatografía en CHT depuraba Ad5 de la corriente de alimentación, se realizó un estudio de

20 agregación preliminar usando una corriente de alimentación procedente del procedimiento aguas arriba final. Los niveles de agregación de Ad5 se establecieron basándose en datos obtenidos del estudio de depuración viral en fase I con resinas de CFT II, y se usaron tres relaciones de carga diferentes de la corriente de alimentación: 6,6 ml; 13,5 ml y 33 ml de corriente de alimentación posterior a TFF por ml de resina de CHT.

25 Los datos presentados en la Tabla 5, depuración de Ad5 mediante CHT, eran comparables con la depuración de 4 LRV, demostraban aproximadamente 4 logaritmos de depuración viral de Ad5 y parecían ser independientes del volumen de corriente de alimentación cargada, dentro del intervalo de 5 veces valorado. La baja recuperación de Ad5 está de acuerdo con datos previos que indican que bajo las condiciones tamponadoras utilizadas, el Ad5 se une más fuertemente que rAAV-1 a la resina de apatito.

30 Tabla 5: Unidades infecciosas totales de Ad5 en fracciones de la columna de CHT

Fracción de relación de carga

6,6 ml 13,5 ml 33 ml

Carga

9,0x108 1,3x109 9,0x108

Flujo pasante + recorrido

<2,5x105 <3,6x105 <6,9x105

Lavado con PO4

2,9x106 2,7x106 <2,6x106

Lavados II y III

3,6x106 2,2x106 2,8x106

Elución

<6,9x104 <6,9x104 <3,5x105

Valor de reducción logarítmico (LRV)

>4,1 >4,3 >3,4

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2