KR20120047213A - 재조합 ａａｖ 벡터에 대한 개선된 정제 방법 - Google Patents

재조합 ａａｖ 벡터에 대한 개선된 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본원에서는 유전자 전달 및 구체적으로 유전자 치료 또는 백신 접종에 사용될 수 있는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터의 정제 방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 AAV 벡터는 세포성 핵산, 세포성 단백질, 헬퍼 바이러스, 및 배지 성분과 같은 생성 성분을 비롯한 공정 중 불순물을 실질적으로 함유하지 않는다.

Description

재조합 ＡＡＶ 벡터에 대한 개선된 정제 방법 {IMPROVED METHODS FOR PURIFICATION OF RECOMBINANT AAV VECTORS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2009년 6월 16일 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/187,601호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전문은 참조로 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 유전자 전달 및 구체적으로는 유전자 치료 또는 백신 접종에 사용될 수 있는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터의 정제 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 세포성 핵산, 세포성 단백질, 헬퍼 바이러스, 및 배지 성분과 같은 공정 중 (in-process) 생성 성분을 실질적으로 함유하지 않는 재조합 rAAV 벡터의 정제 방법에 관한 것이다.
아데노-연관 바이러스 (AAV)는 유전자 치료 및 유전자 백신을 위한 벡터로서 흥미를 갖게 하는 독특한 특징을 갖는다. 배양 중의 세포의 AAV 감염은 세포변성을 야기하지 않으며, 인간 및 여타 동물의 자연적 감염도 잠잠하고, 증상이 없으며, 임의의 인간 질병의 병인에도 연루된 것으로 나타나지 않는다. 나아가, AAV는 다수의 포유동물 세포를 비롯한 광범위한 세포 유형을 감염시킴으로써, 생체내에서 다수의 상이한 조직을 표적으로 할 수 있게 할 가능성이 있다. AAV는 느리게 분열하거나 분열하지 않는 세포를 감염시키며, 전사상 활성인 핵 에피솜 (염색체외 요소)으로서의 이들 세포의 생애 동안 본질적으로 지속될 수 있다. 간 또는 근육과 같은 기관에서 rAAV 벡터의 집적된 복제물은 매우 드물다. 눈, CNS, 및 근육을 비롯한 수많은 세포 유형에서 효율적인 장기간 유전자 전달이 보고된 바 있다. 예컨대, 문헌 [X. Xiao et al., J. Virol. 70(11):8098-8108 (1996)]; [R.R. Ali et al., Hum. Mol. Genet. 5(5):591-94 (1996)]을 참고한다. 현재의 임상 연구는 대부분 혈청형 2 rAAV 벡터의 사용에 집중되어 왔지만, 다수의 보고에 따르면 rAAV-1, rAAV-4, rAAV-5 및 rAAV-8을 비롯한 여타의 AAV 혈청형은 임상 시험에서 시험하기에 매력적인 바이러스 혈청형이 되게 하는 독특한 생체내 생체-분포를 갖는 것으로 나타났다.
아데노-연관 바이러스 (AAV)는 복제 불능 파보바이러스로서, 이의 단일가닥 DNA 게놈은 145개 뉴클레오티드의 역위 말단 반복부 (inverted terminal repeat, ITR)를 포함하여 길이가 약 4.7 kb이다. AAV 혈청형 2 (AAV2) 게놈의 뉴클레오티드 서열은 문헌 [Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)]에 제시되어 있으며, 이는 문헌 [Ruffing et al., J. Gen. Virol., 75: 3385-3392 (1994)]에서 정정되어 있다. 바이러스성 DNA 복제(rep), 캡시드 내로의 이입(encapsidation)/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 시스-작용 (cis-acting) 서열은 상기 ITR 내에 함유되어 있다. 3개의 AAV 프로모터, p5, p19, 및 p40 (이들의 상대적인 맵 위치에 따라 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 코딩하는 2개의 AAV 내부 오픈 리딩 프레임의 발현을 이끈다. 뉴클레오티드 2107 및 2227에서의 단일 AAV 인트론의 상이한 스플라이싱으로 커플링된 2개의 rep 프로모터 (p5 및 p19)는 rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질 (rep78, rep68, rep52, 및 rep40)의 생성을 초래한다. rep 단백질은 궁극적으로는 바이러스 게놈의 복제를 담당하는 다중의 효소적 특성을 지닌다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되며, 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 코딩한다. 선택적 스플라이싱 및 비-공통 번역 시작 부위는 상기 3개의 관련된 캡시드 단백질의 생성을 담당한다. 단일 공통 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 맵 위치 95에 위치해 있다. AAV의 생활사 및 유전학은 문헌 [Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)]에 개관되어 있다.
AAV 입자는 약 4.6 kb 선형의 단일가닥 DNA 게놈을 둘러싸고 있는 3개의 캡시드 단백질, VP1, VP2 및 VP3을 갖는 단백질성 캡시드를 포함한다. 개별 입자는 단 하나의 DNA 분자 가닥을 패키징하지만, 이는 + 또는 - 가닥 중 하나일 수 있다. 어느 하나의 가닥을 함유하는 입자는 감염성이며, 복제는 감염성 부모 단일 가닥의 이중체 형태로의 전환 및 후속적인 증폭에 의해 일어나며, 이로부터 자손 단일 가닥이 변위되어 캡시드 내로 패키징된다. AAV 게놈의 이중체 또는 단일가닥 복제물 (간혹 "프로바이러스성 DNA" 또는 "프로바이러스"로 지칭됨)은 박테리아 플라스미드 또는 파지미드 내로 삽입되어, 아데노바이러스-감염된 세포 내로 형질감염될 수 있다. AAV에 대한 일반적인 개관을 위해서는 문헌 [Carter, HANDBOOK OF PARVOVIRUSES, Vol. I, pp. 169-228 (1989)], 및 [Berns, VIROLOGY, pp. 1743-1764, Raven Press, (1990)]을 참고할 수 있다.
rAAV 벡터의 생성에는 일반적으로 4가지의 공통된 요소가 필요하다: 1) 복제에 대해 관용적인 숙주 세포; 2) 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스와 같은 적합한 헬퍼 바이러스, 또는 대안적으로 최소한의 아데노바이러스성 헬퍼 기능을 함유한 플라스미드 구축물에 의해 제공될 수 있는 헬퍼 바이러스 기능; 3) 트랜스-패키징 rep-cap 구축물; 및 4) 적합한 생성 배지.
재조합 AAV 입자는 세포 용해물의 패키징으로부터 생성될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Chirico and Trempe (1998) J. Virol. Methods 76:31-41]을 참고할 수 있다. 그러나, 세포 용해물은 숙주 세포 DNA, 숙주 세포 단백질, 배지 성분 및 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 바이러스 플라스미드 DNA 중 하나 (이는 rAAV 벡터로부터 분리되어야만 그 후 생체내 사용에 적합함)와 같은 다양한 세포성 성분을 함유한다. rAAV 생성에서의 최근의 진보로서는, 교반 탱크 생물반응기 및 생성 조건에서의 비부착성 세포 현탁 방법을 사용하는 것을 들 수 있는데, 여기에서는 rAAV 벡터를 배지 또는 상청액 내로 방출시켜, 생성 물질에 존재하는 숙주 세포성 성분의 농도를 감소시키지만, 여전히 상당한 양의 공정 중 불순물을 함유한다. 미국 특허 제6,566,118호 및 PCT WO 99/11764를 참고할 수 있다. 따라서, rAAV 입자는 배지 및/또는 세포 용해물로부터 수거된 후 추가로 정제될 수 있다.
rAAV 벡터 및 특히 rAAV-2의 정제에 이용되는 밀도 구배 원심분리법을 포함하는 방법들은 대규모화에 호의적이지 않다. rAAV-2 벡터에 대한 최근의 보고에서는 반대되는 이온 교환 크로마토그래피 (양이온 및 음이온 크로마토그래피 포함)를 비롯한 이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 정제 방법이 기재된 바 있다. 예를 들어 배양 상청액 및/또는 세포 용해물로부터 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터를 정제하기 위해 반대되는 이온 교환 크로마토그래피의 조합을 이용하는 방법을 개시하는 미국 특허 제6,566,118호 및 PCT WO 99/11764를 참고할 수 있다. rAAV 스탁 (stock) 조제물에서의 추가적인 개선사항으로는, 세포 용해물에 대한 데옥시콜레이트 처리, 이오딕사놀 구배 분리에 이은 친화성 크로마토그래피의 사용을 들 수 있는데, 이는 고 역가 rAAV2를 산출하였다 (문헌 [Clark et al., Hum. Mol. Genet. 10(6):1031-39 (1999)]; [Zolotukhin et al., Gene Therapy 6(6):973-985 (1999)]). 오'리오르단 등 (문헌 [O'Riordan et al., J. Gene Med. 2:444-454 (2000)]; 미국 특허 제7,015,026호)도 또한 이온 교환 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 셀루파인 술페이트 (cellufine sulfate) 친화성 크로마토그래피, 및 아연 킬레이트 크로마토그래피를 사용하는, 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 및 특히 예시한 것으로서, rAAV-2 벡터를 위한 규모화가능한 크로마토그래피적 정제 방법을 보고하였다.
최근의 자료는 rAAV-1, 4, 5, 및 8과 같은 rAAV 캡시드 혈청형이 정제된 바이러스 스탁으로서 또는 숙주 세포 DNA, 숙주 세포 단백질, 혈청 알부민, 배지 성분, 및 헬퍼 바이러스 성분과 같은 공정 중 생성 불순물의 존재 하에 음이온성 수지에 약하게 결합한다는 것을 나타낸다. 그 결과로서, 상기 캡시드 혈청형의 정제는 전형적으로, 이오딕사놀 밀도-구배 원심분리와 같은 여타의 정제 방법과 조합된 음이온-교환 크로마토그래피를 수반한다. 예컨대, 문헌 [Zolotukhin et al., Methods 28(2): 158-167 (2002)] 및 [Kaludov et al., Hum. Gene Therapy 13:1235-1243 (2002)]; 및 미국 특허 공개공보 제2004/0110266 A1호를 참고할 수 있다. 그러나, 상기 방법들은 상업적 규모의 공정으로 용이하게 규모화가능하지 않다.
따라서, 유전자 치료 및 유전자 백신에서 사용하기 위한 것과 같은 재조합 AAV 벡터의 개발에 있어서, 헬퍼 바이러스, 이뿐 아니라 rAAV 생성 스탁에 존재하는 헬퍼 바이러스 단백질, 세포성 단백질, 숙주 세포 DNA, 및 배지 성분을 비롯한 공정 중 생성 성분으로부터 rAAV 벡터를 정제하는 방법에 대한 필요성이 존재한다. 그러한 방법은 유전자 치료 기법의 실제적 응용에 적합한 규모로 효과적으로 이용되어야 한다. 나아가 rAAV 유전자 치료 및 유전자 백신에 유용한 고 역가의 고도로 정제된 상업용 스탁을 산출하도록 규모화가능한 rAAV 벡터를 위한 정제 방법의 개발에 대한 필요성이 존재한다. 더욱 특히는, 크로마토그래피적 수지 및 특히 음이온성 수지에 약하게 결합하는 rAAV 벡터를 위한 정제 방법의 개발에 대한 필요성이 존재한다.
본 명세서에 인용된 모든 공개물, 특허 출원 및 특허의 개시내용은, 각각의 개별 공개물, 특허 출원, 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 특히, 본원에서 인용된 모든 공개물은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 조성물 및 방법을 기재 및 개시하기 위한 목적으로 참고로 본원에 명백히 포함된다. 본원에 제공된 본 발명이 명료한 이해를 위해 실례 및 예시로써 일부 상세히 기재되었으나, 본 발명의 교시에 비추어 첨부된 특허청구범위의 취지 또는 범주를 벗어나지 않으면서 본 발명에 대한 일부 변경 및 변형이 일어날 수 있다는 것이 당업자에 명백할 것이다.
발명의 개요
본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 존재 하의 아파타이트 (apatite) 크로마토그래피 매질 상에서 rAAV 입자를 포획하여 공정 중 불순물로부터 임의의 캡시드 혈청형의 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 입자 집단을 단리하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 상류 공정 (예를 들어, 원심분리, 벤조나제(Benzonase)®로의 처리, 음이온 교환 여과, 및/또는 접선 흐름 (tangential flow) 여과 등) 및 하류 공정 (예를 들어, 열 불활성화, 여과, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피 등)을 수반한다. 상류 및 하류 방법은 단독으로 또는 다양한 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명은, (a) rAAV 입자를 함유한 공급 스트림을 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉시키되, 여기서 rAAV 입자가 아파타이트 크로마토그래피 매질에 결합하는 것인 단계; 및 (b) 아파타이트 크로마토그래피 매질에 결합된 rAAV 입자를 3％ (w/v) 미만의 PEG를 함유한 용리 완충액으로 용리시키는 단계를 포함하는, 공급 스트림 내의 공정 중 불순물로부터 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 입자 집단을 단리시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 아파타이트 크로마토그래피 매질은 세라믹 히드록시아파타이트 (CHT) 또는 세라믹 플루오로아파타이트 (CFT)이다. 특정 실시양태에서, 아파타이트 크로마토그래피 매질에 결합된 rAAV 입자는 3％ (w/v) 미만의 PEG를 함유한 용리 완충액으로 용리된다. 특정 실시양태에서, 아파타이트 크로마토그래피 매질에 결합된 rAAV 입자는 PEG 부재 하의 용리 완충액으로 용리된다.
일부 실시양태에서, 아파타이트 크로마토그래피 매질의 특이적 결합은 밀리리터당 106 내지 1016개 DNase-저항성 입자 (DNase-resistant particle, DRP)이다. 일부 실시양태에서, 아파타이트 크로마토그래피 매질의 특이적 결합은 밀리리터당 108 내지 1016개 DNase-저항성 입자 (DRP)이다. 일부 실시양태에서, 아파타이트 크로마토그래피 매질의 특이적 결합은 밀리리터당 1010 내지 1016개 DNase-저항성 입자 (DRP)이다. 일부 실시양태에서, 아파타이트 크로마토그래피 매질의 특이적 결합은 밀리리터당 1012 내지 1016개 DNase-저항성 입자 (DRP)이다. 일부 실시양태에서, 아파타이트 크로마토그래피 매질의 특이적 결합은 밀리리터당 1014 내지 1016개 DNase-저항성 입자 (DRP)이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 아파타이트 크로마토그래피 단계 전에 음이온 교환 여과 단계를 추가로 포함하는데, 여기서 rAAV 입자는 음이온 교환 여과의 통과 유동물 (flow-through) 중에 존재한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 아파타이트 크로마토그래피 단계 전에 음이온 교환 여과의 통과 유동물로부터의 rAAV 입자를 접선 흐름 여과로 농축하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 용리된 공급 스트림 내의 rAAV 입자를 음이온성 크로마토그래피 매질에 결합시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 헬퍼 바이러스를 불활성화하는 열 불활성화 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 아파타이트 크로마토그래피 후에 공급 스트림 내의 rAAV 입자를 소수성 상호작용 크로마토그래피에 결합시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 염기성 완충액의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 염기성 완충액은 pH 7.2 내지 10, pH 7.4 내지 10, pH 7.6 내지 10, pH 7.8 내지 10, pH 8.0 내지 10.0, pH 8.2 내지 10.0, pH 8.4 내지 10.0, pH 8.6 내지 10.0, pH 8.8 내지 10, pH 9.0 내지 10.0, pH 9.2 내지 10, pH 9.4 내지 10.0, pH 9.6 내지 10.0, 또는 pH 9.8 내지 10.0이다. 일부 실시양태에서, 염기성 완충액은 대략 7.2, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8, 9.0, 9.2, 9.4, 9.6, 9.8, 및 10.0 중 임의의 pH를 갖는다. 당업계에 공지된 임의의 염기성 완충액이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기성 완충액은 붕산염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기성 완충액은 붕산염이다.
일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 예를 들어, 약 3％ (w/v) 내지 약 10％ (w/v)의 PEG가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 3％ (w/v), 약 3.5％ (w/v), 약 4％ (w/v), 약 4.5％ (w/v), 약 5％ (w/v), 약 5.5％ (w/v), 약 6％ (w/v), 약 6.5％ (w/v), 약 7％ (w/v), 약 7.5％ (w/v), 약 8％ (w/v), 약 8.5％ (w/v), 약 9％ (w/v), 약 9.5％ (w/v), 또는 약 10％ (w/v) PEG의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다.
일부 실시양태에서, PEG의 평균 분자량은 약 5,000 (PEG5000) 그램/몰 내지 약 15,000 (PEG15000) 그램/몰, 예컨대, 약 5,000 그램/몰 (PEG5000), 약 6,000 (PEG6000) 그램/몰, 약 7,000 (PEG7000) 그램/몰, 약 8,000 (PEG8000) 그램/몰, 약 9,000 (PEG9000) 그램/몰, 약 10,000 (PEG10000) 그램/몰, 약 11,000 (PEG11000) 그램/몰, 약 12,000 (PEG12000) 그램/몰, 약 13,000 (PEG13000) 그램/몰, 약 14,000 (PEG14000) 그램/몰, 및 약 15,000 (PEG15000) 그램/몰이다. 특정 실시양태에서, PEG의 평균 분자량은 약 5,000 (PEG5000) 그램/몰이다. 특정 실시양태에서, PEG의 평균 분자량은 약 6,000 (PEG6000) 그램/몰이다. 특정 실시양태에서, PEG의 평균 분자량은 약 8,000 (PEG8000) 그램/몰이다. 특정 실시양태에서, PEG의 평균 분자량은 약 10,000 (PEG10000) 그램/몰이다. 특정 실시양태에서, PEG의 평균 분자량은 약 15,000 (PEG15000) 그램/몰이다.
일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 3％ (w/v) 내지 약 10％ (w/v) PEG6000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 3％ (w/v) PEG6000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 4％ (w/v) PEG6000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 5％ (w/v) PEG6000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 6％ (w/v) PEG6000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 7％ (w/v) PEG6000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 8％ (w/v) PEG6000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 9％ (w/v) PEG6000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 10％ (w/v) PEG6000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다.
일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 3％ (w/v) 내지 약 10％ (w/v) PEG8000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 3％ (w/v) PEG8000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 4％ (w/v) PEG8000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 5％ (w/v) PEG8000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 6％ (w/v) PEG8000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 7％ (w/v) PEG8000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 8％ (w/v) PEG8000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 9％ (w/v) PEG8000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 10％ (w/v) PEG8000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다.
일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 3％ (w/v) 내지 약 10％ (w/v) PEG10000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 3％ (w/v) PEG10000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 4％ (w/v) PEG10000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 5％ (w/v) PEG10000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 6％ (w/v) PEG10000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 7％ (w/v) PEG10000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 8％ (w/v) PEG10000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 9％ (w/v) PEG10000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 10％ (w/v) PEG10000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다.
일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 3％ (w/v) 내지 약 10％ (w/v) PEG15000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 3％ (w/v) PEG15000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 4％ (w/v) PEG 15000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 5％ (w/v) PEG 15000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 6％ (w/v) PEG 15000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 7％ (w/v) PEG 15000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 8％ (w/v) PEG 15000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 9％ (w/v) PEG 15000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 10％ (w/v) PEG15000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다.
일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유한 공급 스트림은 약 20 mM 붕산염 pH 9.0 및 약 5％ PEG (예컨대, PEG6000)를 포함하는 완충액 중에서 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 공급 스트림은 pH 9.0의 약 40 mM 붕산염 및 약 10％ PEG를 포함하는 등부피의 완충액과 인라인(in-line)으로 혼합되어, pH 9.0의 약 20 mM 붕산염 및 약 5％ PEG의 최종 농도를 산출한다.
일부 실시양태에서는, 공정 중 불순물을 제거하기 위하여, rAAV 입자가 매질에 결합되어 있는 아파타이트 크로마토그래피 매질을 rAAV 입자를 용리시키기 전에 세척한다. 일부 실시양태에서는, 공정 중 불순물을 제거하기 위하여, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 감소되는 농도의 PEG를 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서는, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 약 3％ (w/v) 내지 약 10％ (w/v) PEG를 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 대략 10％ (w/v), 9.5％ (w/v), 9％ (w/v), 8.5％ (w/v), 8％ (w/v), 7.5％ (w/v), 7％ (w/v), 6.5％ (w/v), 6％ (w/v), 5.5％ (w/v), 5％ (w/v), 4.5％ (w/v), 4％ (w/v), 3.5％ (w/v), 및 3％ (w/v)의 PEG 중 어느 하나를 함유한다. 일부 실시양태에서는, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 7.5％ (w/v) PEG6000을 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서는, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 7.5％ (w/v) PEG8000을 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서는, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 7.5％ (w/v) PEG10000을 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서는, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 7.5％ (w/v) PEG15000을 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서는, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 약 5％ (w/v) PEG6000을 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서는, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 약 5％ (w/v) PEG8000을 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서는, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 약 5％ (w/v) PEG10000을 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서는, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 약 5％ (w/v) PEG15000을 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서는, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 약 3％ (w/v) 미만의 PEG6000를 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서는, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 약 3％ (w/v) 미만의 PEG8000을 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서는, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 약 3％ (w/v) 미만의 PEG10000을 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서는, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 약 3％ (w/v) 미만의 PEG15000을 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서는, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 PEG를 함유하지 않은 세척 완충액으로 1회 이상 세척한다.
일부 실시양태에서, 세척 완충액은 당업계에 공지된 완충액을 함유한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 붕산염, N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES), 및 트리스-HCl로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 붕산염이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 HEPES이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 트리스-HCl이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 염기성 pH로 존재한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액의 pH는 pH 7.0 내지 pH 10.0, pH 7.2 내지 pH 10.0, pH 7.4 내지 pH 10.0, pH 7.6 내지 pH 10.0, pH 7.8 내지 pH 10.0, pH 8.0 내지 pH 10.0, pH 8.2 내지 pH 10.0, pH 8.4 내지 pH 10.0, pH 8.6 내지 pH 10.0, pH 8.8 내지 pH 10.0, pH 9.0 내지 pH 10.0, pH 9.2 내지 pH 10.0, pH 9.4 내지 pH 10.0, pH 9.6 내지 pH 10.0, 또는 pH 9.8 내지 pH 10.0이다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액의 pH는 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8, 9.0, 9.2, 9.4, 9.6, 9.8, 또는 10.0이다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 8.0 내지 10.0의 붕산염이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 8.0의 붕산염이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 9.0의 붕산염이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 10.0의 붕산염이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 7.0 내지 10.0의 HEPES이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 7.0의 HEPES이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 8.0의 HEPES이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 9.0의 HEPES이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 10.0의 HEPES이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 7.0 내지 10.0의 트리스-HCl이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 7.0의 트리스-HCl이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 8.0의 트리스-HCl이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 9.0의 트리스-HCl이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 10.0의 트리스-HCl이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 100 내지 500 mM의 인산염을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 50 내지 250 mM의 NaCl을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 세척 단계는 pH 약 9.0의 약 30 mM 붕산염 및 약 7.5％ PEG를 포함하는 세척 완충액을 이용한 제1 세척; 약 150 인산칼륨, pH 약 9.0의 약 20 mM 붕산염, 및 약 5％ PEG를 포함하는 세척 완충액을 이용한 제2 세척; pH 약 9.0의 약 20 mM 붕산염 및 약 5％ PEG를 포함하는 세척 완충액을 이용한 제3 세척; 및 pH 약 7.0의 약 20 mM HEPES 및 150 mM NaCl을 포함하는 세척 완충액을 이용한 제4 세척을 포함한다.
일부 실시양태에서, 아파타이트 크로마토그래피 매질에 결합된 rAAV 입자는 저농도의 PEG를 함유하거나 또는 PEG 부재 하의 용리 완충액으로 용리된다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 약 3％ (w/v) 미만의 PEG, 약 2％ (w/v) 미만의 PEG, 또는 약 1％ (w/v) 미만의 PEG를 함유한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 약 2.5％ (w/v), 약 2％ (w/v), 약 1.5％ (w/v), 약 1％ (w/v), 또는 약 0.5％ (w/v) PEG를 함유하거나, 또는 PEG를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 약 3％ (w/v) 미만의 PEG6000을 함유한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 약 3％ (w/v) 미만의 PEG8000을 함유한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 약 3％ (w/v) 미만의 PEG10000을 함유한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 약 3％ (w/v) 미만의 PEG15000을 함유한다. 일부 실시양태에서, 아파타이트 크로마토그래피 매질에 결합된 rAAV 입자는 PEG 부재 하의 용리 완충액으로 용리된다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 붕산염, N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES), 및 트리스-HCl로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 붕산염이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 HEPES이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 트리스-HCl이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 중성 pH로 존재한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 중성 pH의 HEPES이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 중성 pH의 트리스-HCl이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 100 mM 미만의 인산염을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 50 mM 미만의 인산염을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 50 내지 250 mM의 NaCl을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아파타이트 크로마토그래피 매질에 결합된 rAAV 입자는 약 50 mM 인산칼륨, pH 약 7.0의 약 20 mM HEPES, 및 약 150 mM NaCl을 포함하는 용리 완충액으로 용리된다.
일부 실시양태에서, 공급 스트림 중의 공정 중 불순물로부터 rAAV 입자를 단리시키는 방법은 이하의 단계를 포함한다: (a) rAAV 입자를 함유한 공급 스트림을 pH 약 9.0의 염기성 완충액 중의 약 5％ (w/v) PEG의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉시키되, 여기서 rAAV 입자가 아파타이트 크로마토그래피 매질에 결합하는 것인 단계; (b) 아파타이트 크로마토그래피 매질을 pH 약 9.0의 약 30 mM 붕산염 및 약 7.5％ PEG를 포함하는 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계; (c) 약 150 인산칼륨, pH 약 9.0의 약 20 mM 붕산염, 및 약 5％ PEG를 포함하는 제2 세척 완충액으로 아파타이트 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계; (d) pH 약 9.0의 약 20 mM 붕산염 및 약 5％ PEG를 포함하는 제3 세척 완충액으로 아파타이트 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계; (e) pH 약 7.0의 약 20 mM HEPES 및 150 mM NaCl을 포함하는 제4 세척 완충액으로 아파타이트 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계; 및 (f) 아파타이트 크로마토그래피 매질에 결합된 rAAV 입자를 약 50 mM 인산칼륨, pH 약 7.0의 약 20 mM HEPES, 및 약 150 mM NaCl을 포함하는 용리 완충액으로 용리시키는 단계.
본원에서는 또한, (a) rAAV 입자를 함유한 공급 스트림을 고농도 염 완충액 중에서 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 매질에 접촉시키되, 여기서 rAAV 입자 및 공정 중 불순물이 HIC 매질에 결합하는 단계; 및 (b) HIC 매질에 결합된 rAAV 입자를 중간농도 염 완충액으로 용리시키는 단계를 포함하는, 공급 스트림 내의 공정 중 불순물로부터 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 입자 집단을 단리시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, HIC 매질은 토소 부틸 650M, 토소 수퍼부틸 650C, 토소 페닐 650C, EMD 프락토겔 페닐, 및 토소 하스(부틸) 수지로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 고농도 염 완충액은 0.5 M 내지 2.0 M 시트르산염 (예컨대, 시트르산나트륨)이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고농도 염 완충액은 대략 0.5 M, 0.75 M, 1.0 M, 1.25 M, 1.5 M, 1.75 M, 및 2.0 M 중 어느 하나의 시트르산염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간농도 염 완충액은 0.5 M 미만의 시트르산염 (예컨대, 시트르산나트륨)이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간농도 염 완충액은 0.5 M 내지 약 0.3 M의 시트르산염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간농도 염 완충액은 대략 0.45 M, 0.4 M, 0.35 M, 0.3 M, 및 0.25 M 중 어느 하나의 시트르산염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 고농도 염 완충액은 1 내지 100 mM 인산염을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간농도 염 완충액은 1 내지 100 mM 인산염을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간농도 염 완충액은 상기 rAAV 입자를 용리시키되, 중공 캡시드, 부분 변성 캡시드, 보다 약한 감염성의 캡시드, 및/또는 부분적으로 완전한 캡시드를 가진 rAAV 입자는 용리시키지 않는다.
본원에 기재된 실시양태 중 어느 하나에서, rAAV 입자는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 및 AAV-16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 AAV-1, AAV-4, AAV-5, 및 AAV-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 AAV-1의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 AAV-4의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 AAV-5의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 AAV-8의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 및 AAV-16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV 혈청형으로부터의 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 약한 음이온성 결합제인 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 약한 음이온성 결합제인 AAV 캡시드 혈청형은 AAV-1, AAV-4, AAV-5, 및 AAV-8로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자를 함유하는 조성물은 생성 배양 오염물을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 생성 배양 오염물은 손상된 rAAV 입자, 숙주 세포 오염물, 헬퍼 바이러스 오염물, 및/또는 세포 배양 오염물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포 오염물은 숙주 세포 DNA, 플라스미드, 또는 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 헬퍼 바이러스 오염물은 아데노바이러스 입자, 아데노바이러스 DNA, 또는 아데노바이러스 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 오염물은 배지 성분, 혈청 알부민, 또는 여타 혈청 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 오염물은 배지 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 오염물은 혈청 알부민 또는 여타의 혈청 단백질을 포함하지 않는다.
본원에 기재된 다양한 실시양태의 특성 중 하나, 일부 또는 전부가 조합되어 본 발명의 다른 실시양태를 형성할 수 있음을 이해해야 한다.
도 1은 rAAV 생성 배양 수거물로부터의 정화된 상청액에 대한 벤조나제® 소화의 결과를 제시한다. 이 결과는 벤조나제® 소화 후에 고분자량 DNA가 존재하지 않은 것을 나타낸다.
도 2는 실시예 4에 기재된 바와 같은 rAAV 결합 친화도에 대해 스크리닝된 전형적인 수지에 대한 전형적인 분광광도적 추적을 제시한다. 흡광도 (AU) 및 전도도 (mS/cm)를 표시하였다.
도 3은 PEG 존재 및 부재 하의 파과 (breakthrough) 용량 분석을 제시한다. 2가지 모델의 rAAV 생성 배양물을 사용하여 아파타이트 수지 (CFT 유형 I)의 용량을 평가하였다. 상부 패널: 로드 (load) 중의 약 5％ (w/v) PEG6000의 존재 또는 부재 하에서 혈청-함유 또는 혈청-무함유 공급 스트림의 로드 동안의 파과. 로드 부피는 1:1 작업 중 (online) 희석 전의 시작 공급 스트림을 지칭하며, 수지 부피 1 mL당으로 표준화되었다. 하부 패널: 1％ 파과가 관찰된 로드 부피 (ml) 및 용리 분획으로의 회수. 본 실험에 이용된 TFF 수거물은 rAAV 벡터에 있어서 대략 1016 DRP/ml의 농도로 존재하였다. 약 5％ (w/v) PEG6000의 존재 하에서, 150 mL의 TFF 수거물을 파과없이 1.2 mL CFT 수지 상에 로딩하였는데, 이는 컬럼 통과 유동물 중 >1％ rAAV의 존재로 정의되었고, 이는 1.8xlO14의 총 rAAV DRP의 로드에 해당한다.
도 4는 전형적인 CHT I 크로마토그램을 제시한다. 나타낸 것은 아머샴 (Amersham) 3 mm 스키드 (Skid)에 의한 인라인의 UV 흡광도 A280 (AU, 흡광도 단위) 및 전도도 (mS/cm) 측정치이다. 괄호는 실시예 7에 기재된 프로그램의 주요 단편을 표시한다. "NaOH"는 컬럼 오염 제거 단계를 표시한다.
도 5는 아파타이트 수지로부터 용리한 rAAV 벡터의 상대적인 순도를 제시한다. 패널 A는 통과 유동/추적 (FT), 고 인산염/5％ (w/v) PEG6000 세척 (PO4), 인산염 및 PEG6000를 제거하기 위한 세척 (WII/WIII), 및 용리 간의 벡터의 분포를 제시한다. 상기 사건들 간의 차이 중 어느 것도 분석론의 정확도 내에서 유의미하지 않으며, 질량 균형의 결여는 전형적인 것이다. 패널 B는 아파타이트 컬럼으로부터의 용리 분획을 이용한 사이프로 오렌지(Sypro orange)-염색된 SDS PAGE로부터의 관련 레인들을 제시한다. 각각의 샘플은 2x1011 DRP/레인으로 로딩되었으며; 레인 간의 외관상의 이동 차이는 CFT 용리물을 증발에 의해 겔 상에 적합한 부피로 농축시켜야 했던 것으로 인한 염 인공 산물이다. 유일하게 우세한 밴드는 AAV 캡시드 단백질인 것으로 보인다. 패널 C는 Ad5 웨스턴 블롯의 관련 레인들을 제시하는데, 여기서 명료성을 위해 레인들을 재배치하였으며, 이는 Ad5 단백질의 필적할만한 제거를 입증한다.
도 6은 SDS-PAGE에 의한 공정 전체에 걸친 정제에 대한 평가를 제시한다. 대표적인 생성 배양 수거물로부터의 공정 중 샘플을 변성/환원성 10％ 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전개시키고, 사이프로 오렌지로 염색하였다. 모든 수거 후 샘플을 1x1010 DRP/레인으로 로딩하였다. TFF 농도 단계 전의 2개의 상류 샘플 (초기 정화 단계 및 AEX 통과 유동)은 겔 상에서의 부피 제약으로 인해 1x109 DRP/레인으로만 로딩될 수 있었다. 겔의 전체적인 감도 및 염색의 일관성을 평가하기 위해 베타-갈락토시다제 (B-Gal)를 50 ng/레인으로 로딩하였다. 3개의 AAV1 캡시드 단백질 (VP1, 2, 및 3)이 표시되어 있다.
도 7은 실시예 1 내지 12에 기재된 바와 같은 rAAV 정제에 대한 단계적 회수율을 제시한다. 수거 전에 상청액 중에 존재한 총 DRP는 100％으로 정의되었다. 각 단계에서의 회수율은 해당 단계 동안 처리된 총 DRP와 비교한 회수된 총 DRP이다. 전체 공정에 대한 종합적 회수율은 대략 28％였다. D4 sup: 생성 배양물; AEX FT: 음이온 교환 (무스탕(Mustang)® Q) 통과 유동; 포획: 아파타이트 크로마토그래피; 열: 열 불활성화 또는 히트 킬; HIC: 소수성 상호작용 크로마토그래피; SEC: 크기 배제 크로마토그래피; AEX: 음이온 교환.
본 발명의 목적은 손상된 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 입자, 헬퍼 바이러스, 헬퍼 바이러스 단백질, 플라스미드, 세포성 단백질 및 DNA, 배지 성분, 혈청 단백질 등과 같은 생성 배양 오염물로부터 임의의 AAV 캡시드 혈청형의 rAAV 입자 집단을 단리시키는 방법을 제공하는 것이다. 나아가, 본 발명의 방법은 고 역가 rAAV 생성 배양 수거물 또는 공급 스트림로부터의 rAAV 입자 집단의 단리에 대한 규제 요건에 부합하는, 상업적으로 규모화가능한 직교 (orthogonal) 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 단리되는 rAAV 입자 집단은 실질적으로 손상된 rAAV 입자, 헬퍼 바이러스, 헬퍼 바이러스 단백질, 플라스미드, 세포성 단백질 및 DNA, 배지 성분, 혈청 단백질 및 글루칸과 같은 생성 배양 오염물 및/또는 공정 중 오염물을 비롯한 오염물을 함유하지 않는다. 본 발명의 방법은 약한 음이온성 결합제인 rAAV 벡터 혈청형, 예를 들어, rAAV-1, rAAV-4, rAAV-5, 및 rAAV-8에 특히 적합하다. 본 발명은, 밀도 구배 원심분리법을 수행할 필요없이 유전자 치료 용도에서 사용하기에 적합한, 생성 배양 오염물 및/또는 공정 중 오염물을 비롯한 오염물을 실질적으로 함유하지 않는 고 역가 rAAV 입자 집단을 단리하는 방법을 추가로 고려한다.
정의
본원에서 사용된 용어 "단리된" 또는 "정제된"이란 rAAV 입자가 천연적으로 발생하는 곳 또는 처음 생성된 곳에서 또한 존재할 수 있는 여타 성분 중 적어도 일부를 결여하는 rAAV 입자의 조제물을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 단리된 rAAV 입자는, 배양 용해물 또는 생성 배양 상청액과 같은 공급 혼합물로부터 이를 농축하기 위한 정제 기법을 사용하여 생성할 수 있다. 농축 정도는, 예를 들어, 용액 중에 존재하는 DNase-저항성 입자 (DRP)의 비율, 또는 감염력과 같은 다양한 방법으로 측정가능하거나, 또는 이는, 공급 혼합물 중에 존재하는 제2의 잠재적 방해 물질, 예컨대 이하에 정의되는 헬퍼 바이러스, 배지 성분 등을 비롯한 생성 배양 오염물 또는 공정 중 오염물을 비롯한 오염물에 대하여 측정될 수도 있다.
rAAV 조제물은, 감염성 헬퍼 바이러스 입자에 대한 감염성 AAV 입자의 비가 적어도 약 102:1; 바람직하게는 적어도 약 104:1, 더욱 바람직하게는 적어도 약 106:1; 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 108:1인 경우 헬퍼 바이러스가 "실질적으로 존재하지 않는" 것으로 불린다. 조제물은 또한 바람직하게는 등가량의 헬퍼 바이러스 단백질 (즉, 상기 언급된 헬퍼 바이러스 입자 불순물이 파괴된 형태로 존재하는 경우 그러한 수준의 헬퍼 바이러스의 결과로 존재하는 것과 같은 단백질)을 함유하지 않는다. 바이러스성 및/또는 세포성 단백질 오염은 일반적으로 SDS 겔 상에서의 쿠마시 (Coomassie) 염색 밴드의 존재로 관찰가능하다 (예컨대, AAV 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3에 해당하는 밴드 이외의 밴드의 출현).
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "약한 음이온성 결합제" 또는 "저 친화도 음이온성 결합제"는, 오염물 (생성 배양 오염물 또는 공정 중 오염물 포함)의 존재 하에, 다른 rAAV 생성 배양 오염물로부터 rAAV 입자를 단리시키기에 충분한 친화도로 결합하지 않는 캡시드 혈청형을 갖는 rAAV 입자를 지칭한다. 그러한 캡시드 혈청형은 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적으로, AAV-1, AAV-5, AAV-8 및 AAV-4를 들 수 있다. 당업계에 기재된 바와 같이, 그러한 약한 음이온성 결합제는 일반적으로 이오딕사놀 (상표명 옵티프렙(Optiprep)®으로 판매) 또는 염화세슘 구배 원심분리를 비롯한 적어도 하나의 밀도 원심분리 단계를 포함하는 방법으로 정제된다.
본원에 사용된 바, 용어 "헬퍼 바이러스" 또는 "오염성 헬퍼 바이러스"는 단독으로는 복제할 능력이 없는 헬퍼 바이러스-의존 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스의 복제물을 생성할 때 사용되는 바이러스를 지칭한다. 헬퍼 바이러스는 바이러스 벡터와 함께 세포를 공동-감염시키는데 사용되며, 상기 바이러스 벡터의 게놈의 복제에 필요한 단백질을 제공한다. 상기 용어는 무손상 바이러스 입자, 중공 캡시드, 바이러스성 DNA 등을 포괄한다. rAAV 입자를 생성하기 위해 흔히 사용되는 헬퍼 바이러스로는, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스, 및 백시니아 바이러스가 있다.
본원에서 사용된 용어 "생성 배양물"은 rAAV 벡터 입자 생성에 필요한 성분을 함유한 용기를 지칭한다. 생성 배양물은, 비제한적으로, 이하의 성분을 포함한다: 1) 적합한 숙주 세포; 2) 헬퍼 바이러스 기능; 3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 산물; 4) AAV ITR 서열의 측면에 위치한 치료적 트랜스진; 및 5) 적합한 배지, 배지 성분, 및 비제한적으로, rAAV 생성을 원조하는 것으로 알려진 혈청, 혈청-유래 단백질, 비타민, 필수 및 비필수 아미노산, 및 글루코스를 비롯한 배지 보충물.
본원에 사용된 바, 본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "오염물," "생성 배양 오염물," "공정 중 오염물," "공정 중 불순물," "불순물," 또는 "오염물"은, 비제한적으로, rAAV 벡터의 생성을 원조하는 것으로 당업계에 공지된 배지 제형물; 배지 보충물, 예컨대 염분, 소 혈청, 아미노산 보충물, 비타민 보충물, 성장 인자, 혈청 알부민 및 당업계에 공지된 배지 제형물 중에 존재하는 여타의 저분자량 단백질; 관용적 숙주 세포, 숙주 세포 단백질 또는 숙주 세포 DNA; 헬퍼 바이러스, 헬퍼 바이러스 단백질, 또는 헬퍼 바이러스 DNA, 예컨대 야생형 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스 단백질; 및 여타의 비(非) rAAV 벡터 또는 공급 스트림으로부터 rAAV 벡터의 정제에 이용되는 글루칸 또는 크로마토그래피 완충액과 같은, 정제 과정 동안 도입된 rAAV 벡터 생성 배양 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "생성 배양 수거물"은, 비제한적으로 형질감염 방법, 안정한 세포주 생성, Ad-혼성체 생성 시스템, 또는 바큘로바이러스 생성 시스템을 비롯한, 당업계에 공지된 수단에 의해 rAAV 벡터 생성 배양물로부터 생성한 rAAV 벡터 입자를 포함하는 용액으로 정의된다. 나아가, 본원에서 사용된 용어 "생성 배양 수거물"은 생성 배양 용기로부터 단리한 물질을 지칭하며, 당업계에 공지된 수단에 의한 rAAV 생성 세포의 용해에 의해 단리된 물질 및 무손상 세포로부터 배지 내로 방출된 rAAV 입자를 산출하는 것으로 당업계에 공지된 배양 조건 하에서 유지된 rAAV 생성 배양물로부터 단리된 물질을 모두 포함한다. 생성 배양 수거물은, 비제한적으로, 이하 중 일부 또는 전부를 함유할 수 있다: rAAV 벡터 입자, 생성 배양 성분, 예컨대, 배지 성분, 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 숙주 세포, 헬퍼 바이러스, 헬퍼 바이러스 단백질, 헬퍼 바이러스 DNA, 플라스미드 DNA, 운반 (carrier) 바이러스 DNA, 혈청, 혈청-유래 단백질 및 배지 보충물.
본원에서 사용된 용어 "공급 스트림"은 크로마토그래피적 매트릭스 상에 로딩되거나, 이를 통과하게 되거나 또는 이에 적용되는 rAAV 벡터 입자의 공급원을 지칭한다. 본 발명의 공급 스트림으로는, 생성 배양 수거물, 및 본 발명의 이전의 크로마토그래피 단계로부터 단리한 물질이 포함되며, 이전 단계로부터의 통과 유동물로서 존재하였는지, 이전 단계에서 결합 및 용리되었는지, 이전 단계의 기공 용적 중에 존재하였는지 또는 rAAV 입자의 정제 동안 수득된 임의의 분획 중에 존재하였는지 관계없다. 그러한 공급 스트림은 본원에 정의된 하나 이상의 "오염물," "생성 배양 오염물," "공정 중 오염물," "공정 중 불순물," 또는 "불순물," 또는 "오염물"을 포함할 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "포획," "결합된," "결합한다," 또는 "결합하는"은 공급 스트림의 성분의 크로마토그래피적 매질에의 결합, 부착 또는 점착을 지칭한다. 성분은, 비제한적으로 소수성, 이온성 (음이온성 및 양이온성 포함), 친화성, 금속 킬레이트화, 및 킬레이트화를 비롯한 당업계에 공지된 임의의 물리력 또는 화학작용에 의해 크로마토그래피적 매질에 결합될 수 있다. 성분은 아파타이트 크로마토그래피적 매질에서와 같은 2 이상의 유형의 화학작용에 의해 크로마토그래피적 매질에 결합될 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "아파타이트 수지," "아파타이트 크로마토그래피적 매질," "아파타이트 매트릭스" 또는 "아파타이트 매질"은 인산칼슘의 무기물로 구성된 크로마토그래피적 매질을 지칭하며, 여기에는 비제한적으로 세라믹 히드록시아파타이트 (CHT) 및 세라믹 플루오로아파타이트 (CFT) 크로마토그래피적 매질이 포함된다.
용어 "혼합 모드" 또는 "다중 모드"는 2 이상의 결합 화학작용의 역량을 갖는 크로마토그래피적 매질을 지칭한다. 혼합 모드 크로마토그래피적 매질로는, 비제한적으로, 칼슘 모이어티를 통한 금속 친화성 결합, 백본 상에 존재하는 히드록실기를 통한 수소 결합, 칼슘 모이어티를 통한 양전하 반발 및 음전하 인력 및 배지 상에 존재하는 인산염 모이어티를 통한 음전하 반발 및 양전하 인력을 나타낼 수 있는 아파타이트 크로마토그래피적 매질이 있다.
"조성물" 또는 "조성물들"이라는 일반적인 언급은 본 발명의 조성물을 포함하며, 이에 적용가능하다.
본원에서 사용된, 단수 형태의 관사 ("a," "an," 및 "the")는 다르게 지시되지 않는 한 복수의 대상물을 포함한다. 예를 들어, "바이러스 입자"라는 구절은 하나 이상의 바이러스 입자를 포함한다.
본원에서 "약" 수치 또는 매개변수의 언급은 상기 수치 또는 파라미터 자체를 지향하는 실시양태를 포함(하고 이를 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태가 측면 및 실시양태로 본질적으로 이루어지고/이루어지거나 이들로 이루어지는 것을 포함함은 물론이다.
rAAV 벡터의 생성
rAAV 벡터의 생성 방법은 당업계에 무수히 공지되어 있으며, 여기에는 형질감염, 안정한 세포주 생성, 및 아데노바이러스-AAV 혼성체, 헤르페스바이러스-AAV 혼성체 및 바큘로바이러스-AAV 혼성체를 비롯한 감염성 혼성체 바이러스 제조 시스템이 포함된다. rAAV 바이러스 입자의 생성을 위한 rAAV 생성 배양물은 모두 이하를 필요로 한다: 1) 적합한 숙주 세포, 예를 들어, 인간-유래 세포주, 예컨대 HeLa, A549, 또는 293 세포, 또는 곤충-유래 세포주, 예컨대 SF-9 (바큘로바이러스 생성 시스템의 경우) 포함; 2) 야생형 또는 변이체 아데노바이러스 (예컨대, 온도 민감성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스, 바큘로바이러스, 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 구축물에 의해 제공된 적합한 헬퍼 바이러스 기능; 3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 산물; 4) AAV ITR 서열의 측면에 위치한 트랜스진 (예컨대, 치료적 트랜스진); 및 5) rAAV 생성을 원조하기에 적합한 배지 및 배지 성분. 당업계에 공지된 적합한 배지를 rAAV 벡터의 생성에 사용할 수 있다. 이들 배지로는, 비제한적으로, 변형 이글 배지 (MEM), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)를 비롯한 하이클론 라보라토리즈 (Hyclone Laboratories) 및 JRH에 의해 생성된 배지, 맞춤식 제형물, 예컨대, 특히 재조합 AAV 벡터의 생성에 사용하기 위한 맞춤식 배지 제형물과 관련하여 미국 특허 제6,566,118호에 기재된 것, 및 미국 특허 제6,723,551호에 기재된 Sf-900 II SFM 배지 (상기 특허 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)가 있다.
본 발명의 적합한 rAAV 생성 배양 배지는 혈청 또는 혈청-유래 재조합 단백질이 0.5％-20％ (v/v 또는 w/v)의 수준으로 보충될 수 있다. 대안적으로, 당업계에 공지된 바, rAAV 벡터는 혈청-무함유 조건에서 생성될 수 있는데, 이는 또한 동물-유래 생성물을 함유하지 않은 배지로 지칭될 수 있다. 당업자는 rAAV 벡터의 생성을 원조하도록 고안된 상업적 또는 맞춤식 배지가 또한 생성 배양물에서 rAAV의 역가를 증가시키기 위해 당업계에 공지된 하나 이상의 세포 배양 성분 (비제한적으로 글루코스, 비타민, 아미노산, 및 또는 성장 인자를 포함함)으로 보충될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
rAAV 생성 배양물은 이용되는 특정 숙주 세포에 적합한 다양한 조건 하에서 성장될 수 있다(넓은 온도 범위에 걸쳐, 다양한 길이의 시간 동안 등). 당업계에 공지된 바와 같이, rAAV 생성 배양물은 적합한 부착-의존성 용기, 예를 들어, 회전 병, 중공 사막 필터, 마이크로캐리어, 및 충전층 또는 유동층 생물반응기에서 배양될 수 있는 부착-의존성 배양물을 포함한다. rAAV 벡터 생성 배양물은 또한, 예를 들어, 스피너 플라스크, 교반 탱크 생물반응기, 및 일회용 시스템, 예컨대 웨이브 백 시스템을 비롯한 다양한 방법으로 배양될 수 있는 현탁배양-적합형 숙주 세포, 예컨대 HeLa, 293, 및 SF-9 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 rAAV 벡터 입자는 생성 배양물의 숙주 세포의 용해 또는 생성 배양물로부터 소비된 배지의 수거물에 의해 rAAV 생성 배양물로부터 수거할 수 있는데, 단, 세포는 무손상 세포로부터 배지 내로 rAAV 입자의 방출을 야기하는 것으로 당업계에 공지된 조건 하에서 배양되며, 이에 대해서는 미국 특허 제6,566,118호에서 보다 상세히 기재되어 있다. 적합한 세포 용해 방법도 또한 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 다수의 동결/해동 사이클, 음파처리, 미세유동법, 및 디터전트 (detergent) 및/또는 프로테아제와 같은 화학약품으로의 처리가 있다.
rAAV 벡터의 정제
수거시, 본 발명의 rAAV 생성 배양물은 이하 중 하나 이상을 함유할 수 있다: (1) 숙주 세포 단백질; (2) 숙주 세포 DNA; (3) 플라스미드 DNA; (4) 헬퍼 바이러스; (5) 헬퍼 바이러스 단백질; (6) 헬퍼 바이러스 DNA; 및 (7) 배지 성분, 예를 들어, 혈청 단백질, 아미노산, 트랜스페린 및 여타의 저분자량 단백질 포함. 부가적으로, rAAV 생성 배양물은 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 및 AAV-16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV 캡시드 혈청형을 갖는 rAAV 입자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 AAV-1, AAV-4, AAV-5, 및 AAV-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다.
일부 실시양태에서는, 숙주 세포 잔해물을 제거하기 위해 rAAV 생성 배양 수거물을 정화시킨다. 일부 실시양태에서, 생성 배양 수거물을, 예를 들어, D0HC 등급 밀리포어 밀리스택+ HC 포드 필터 (Millipore Millistak+ HC Pod Filter), A1HC 등급 밀리포어 밀리스택+ HC 포드 필터, 및 0.2 μm 필터 옵티캡 (Filter Opticap) XL10 밀리포어 익스프레스 SHC 하이드로필릭 멤브레인 필터 (Express SHC Hydrophilic Membrane filter)를 비롯한 일련의 심층여과 필터를 통한 여과에 의해 정화시킨다. 정화는 또한 당업계에 공지된 여타의 다양한 표준 기법, 예컨대, 당업계에 공지된 공극 크기가 0.2 μm 이상인 셀룰로스 아세테이트 필터를 통한 여과 또는 원심분리에 의해 이루어질 수도 있다.
일부 실시양태에서는, 생성 배양물 중에 존재하는 임의의 고분자량 DNA를 소화하기 위해 rAAV 생성 배양 수거물을 벤조나제®로 추가로 처리한다. 일부 실시양태에서, 벤조나제® 소화는 당업계에 공지된 표준 조건 하에서 실시되는데, 여기에는, 예를 들어, 30분 내지 수 시간의 기간 동안 주위 내지 37℃ 범위의 온도에서 1-2.5 유닛/ml의 최종 농도의 벤조나제®가 포함된다.
rAAV 입자는 이하의 정제 단계 중 하나 이상을 이용하여 단리 또는 정제될 수 있다: 통과 유동물 음이온 교환 여과, rAAV 입자를 농축시키기 위한 접선 흐름 여과 (TFF), 아파타이트 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획, 헬퍼 바이러스의 열 불활성화, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의한 완충액 교환, 나노여과, 및 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획. 이들 단계는 단독으로, 다양한 조합으로, 또는 상이한 순서로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 이하에 기재된 순서로의 모든 단계를 포함한다.
음이온 교환 여과
임의로 일부 실시양태에서, 정화되고 벤조나제®-처리된 생성 배양 수거물은 rAAV 벡터가 통과 유동물 중에 존재하고 오염성 헬퍼 바이러스가 하전된 필터 상에 보유된 조건 하에서 음이온 교환 여과에 적용된다. rAAV 생성 배양 수거물의 이온 강도에서, rAAV 입자는 음이온성 필터, 예컨대 무스탕® Q 필터 (폴 코포레이션 (Pall Corp.; 미국 뉴욕주 이스트 힐)에 통과시킴에 의해 헬퍼 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스로부터 구별될 수 있다. 당업자는 정화되고, 벤조나제®-처리되고, 음이온성 여과된 생성 배양물 중에 존재하는 아데노바이러스 (LRV) 및 아데노바이러스성 단백질의 최적의 로그 감소를 달성하는데 필요한 필터의 크기 및 수를 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, LRV는 적어도 1 로그이며, 10 로그를 초과한다. 바람직한 실시양태에서, LRV는 적어도 2 로그이며 8 로그를 초과한다. 더욱 바람직한 실시양태에서 LRV는 적어도 6 로그이다.
접선 흐름 여과 (TFF) 농도
일부 실시양태에서는, 정화되고, 벤조나제®-처리된 공급 스트림의 음이온성 여과로부터의 통과 유동물을 아파타이트 크로마토그래피적 매질에 적용하기 전에 접선 흐름 여과 ("TFF")를 통해 농축시킨다. TFF 한외여과를 이용한 바이러스의 대규모 농축은 문헌 [R. Paul et al., HUMAN GENE THERAPY, 4:609-615 (1993)]에 기재된 바 있다. 공급 스트림에 대한 TFF 농축은 기술적으로 관리가능한 부피의 공급 스트림을 본 발명의 크로마토그래피 단계에 적용될 수 있게 하며, 긴 재순환 시간을 필요로 하지 않으면서 더욱 합리적인 컬럼 규모화를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서는, rAAV 공급 스트림을 적어도 2배 내지 적어도 10배 농축시킨다. 일부 실시양태에서는, 공급 스트림을 적어도 10배 내지 적어도 20배 농축시킨다. 일부 실시양태에서는, 공급 스트림을 적어도 20배 내지 적어도 50배 농축시킨다. 당업자는, TFF가 또한 정제 공정 중의 다음 단계를 수행하기 전에 완충액을 교환하는 것이 바람직한 정제 공정 중의 임의의 단계에서 사용될 수 있다는 것을 또한 인식할 것이다.
폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 존재 하에서의 아파타이트 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획
인간 임상 시험 및 제약 제품에 사용하기에 적합한 FDA-승인된 단백질 정제 방법 및 여타의 생물학적 제품은 상업적 규모의 직교 공정에 의존한다. 다-단계 정제 계획은, 각 단계가 직교 공간 (Cartesian space)에서 한 축을 나타내는 서로 명백히 구분되는 분리 메커니즘을 이용하는 경우 직교 공정을 포함하는 것으로 간주된다. 예를 들어, 음이온 교환 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 이용하는 2-단계 공정은 직교 공정으로 간주될 것이다. 본원에 기재된 생성 배양 수거물 또는 공급 스트림으로부터 생성 배양 오염물 또는 공정 중 오염물과 같은 오염물을 제거하는 공정은 최종 생성물 (즉, rAAV 벡터)을 위해 다양한 크로마토그래피적 매질 상에서의 포획 및 통과 유동 단계를 포함하는 직교 공정이다. rAAV 벡터 (구체적으로는 rAAV-2)는 음이온성 수지에 결합하는 것으로 당업계에서 증명되었다. rAAV-1, rAAV-5, 및 rAAV-8과 같은 rAAV 벡터는 혈청 알부민, 헬퍼 바이러스 성분, 생성 배지 성분 및 숙주 세포 DNA와 같은 생성 성분의 존재 하에서 rAAV-2보다 훨씬 덜 강하게 음이온 교환 배지에 결합하여, 보다 더 낮은 효율 및 더 낮은 품질의 정제 계획을 야기하는 것으로 입증되었다.
AAV-1과 같은 더 낮은 친화도의 음이온성 결합제에 대해 당업계에 기재된 이전의 정제 전략에서는, rAAV 벡터의 음이온 교환체에 대한 더 강한 결합을 달성하기 위해, 생성 배양 오염물 및 공정 중 불순물과 같은 오염물의 상대적인 농도를 감소시키는 이오딕사놀 단계 구배를 포함하였다. 이오딕사놀 단계 구배는 본원에 기재된 상업적 규모의 공정으로 용이하게 규모화가능하지 않다.
본 출원의 발명자들은 rAAV 벡터 입자가 아파타이트 수지로부터의 포획 및 용리에 의해 생성 배양 오염물 또는 공정 중 오염물과 같은 오염물로부터 단리될 수 있음을 발견하였다. 따라서, 미정제 공급 스트림으로부터 생성물을 포획하는 것에 더하여, 아파타이트 컬럼은 숙주 세포 및 아데노바이러스 단백질, 글루칸, 및 혈청 단백질을 비롯한 다양한 공정-관련 불순물을 제거할 뿐 아니라, 헬퍼 바이러스 (예컨대, Ad5 헬퍼 바이러스)에 대한 추가적인 제거 인자를 제공한다.
아파타이트 수지는 세라믹 히드록시아파타이트 (CHT) 및 세라믹 플루오로아파타이트 (CFT)를 비롯한 (이에 제한되지 않음) 인산칼슘 무기물을 포함하는 크로마토그래피 매질이다. 아파타이트 크로마토그래피 매질은 또한, 아파타이트가 1개 초과의 결합 화학을 제공하는 관능기를 갖기 때문에 혼합 모드 또는 다중-모드 매질로서 지칭된다. 이론에 얽매이기를 바라지 않지만, 아파타이트 매질은 골격 상에 존재하는 히드록실 잔기, 수지 상에 존재하는 양전하를 띄는 칼슘 모이어티 및 음전하를 띠는 인산염 모이어티를 비롯한 다수의 상이한 화학 기를 통해 칼슘 금속 친화성 결합, 수소 결합, 양전하 척력, 양전하 인력, 음전하 척력, 및 음전하 인력에 대한 기회를 제공한다. 각각의 화학 결합은 단일 모드 크로마토그래피에 대해서 적용된 것과 마찬가지로 혼합 모드에 적용된다. 그러나, 단일 모드 크로마토그래피에서와 달리, 다양한 결합 및 용리 화학은 독립적이지 않으며 상반되는 방식으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 이온 농도를 증가시키는 것은 소수성 결합을 촉진할 수 있다 (문헌 [T. Kawasaki, M. Niikura, and Y. Kobayashi, J. Chrom. 515:125-148 (1990)] 및 [P.S. Gagnon, P. Ng, J. Zhen, C. Aberin, and J. He, BioProcess Int'l 4:50-60 (2006)]). 구체적으로, CHT 및 CFT는 무기물을 결정에서 세라믹 형태로 전환시키기 위해 고온에서 소결된 히드록시아파타이트 (Ca5(PO4)3OH)2의 구형 대기공성 형태이다. 이는 큰 표면적, 제한된 매스(mass)-전달 저항성, 높은 기계적 강도, 및 염기 저항성을 제공하는 대기공성 구조를 갖는 크로마토그래피 매질을 생성한다. 상이한 온도 및 시간에서의 소결은 상이한 물리적 구조-유형 I 및 II를 생성하며, 이들은 화학적으로 동일하지만 상이한 부류의 분자에 대한 상이한 용량을 제공한다. CFT는, 산성 조건에 대한 안정성을 증가시키기 위해 히드록실 기를 불소 기로 화학적으로 대체하여 제조된, 플루오로아파타이트 및 히드록시아파타이트의 복합물이라는 점에서 CHT와 상이하다. CFT 및 CHT 수지는 시판된다 (예를 들어, 바이오-라드 래보러토리즈, 인크.(Bio-Rad Laboratories, Inc.)).
본 발명의 발명자들은 놀랍게도, 로딩 완충액 중 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 존재가 아파타이트 수지에 대한 rAAV 벡터 입자 결합의 용량 및 재생력을 (통과 유동 중에 rAAV 입자의 가변성 파과를 감소시킴으로써) 극적으로 증가시킨다는 것을 발견하였다. 이론에 얽매이기를 바라지 않지만, 대다수의 공정-관련 불순물과 구별되는 rAAV 벡터의 한가지 특성은 입자의 큰 물리적 크기이다. 이러한 크기 차이는 크로마토그래피 결합 및 세척 완충액에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함시킴으로써 포획 및 세척 단계에서 이용되어, 수화 쉘(shell)의 에너지적으로 바람직한 공유를 기준으로 보다 큰 분자의 분배 계수를 결합 상태로 우선적으로 증가시켰다. 본 발명과 달리, 당업계에서는 바이러스 및 박테리오파지 벡터를 정제하는데 있어서 PEG의 사용을 기재하고 있지만, PEG는 주로 용액으로부터 바이러스 입자를 물리적으로 응집시키고 제거하기 위한 침전제로서 사용되었다. 당업계에서는 PEG가 바이러스 입자의 응집 및 침전을 용이하게 한다고 공지되어 있고, rAAV가 200 mM 미만의 이온 농도에서 응집물을 형성한다고 기재되어 있기 때문에 (문헌 [Wright et al., Molecular Therapy 12:171-178 (2005)]), 아파타이트 수지에의 rAAV 벡터 결합에 대한 PEG의 효과는 예측불가능하였다. PEG는 예를 들어 문헌 [Gagnon, J. Chromtogr. 743A:51-55 (1996)]에 기재된 바와 같이 이온 교환 수지에 대한 면역글로불린 분자의 결합, 및 예를 들어 문헌 [Gagnon et al., 22nd International IBC Conference on Antibody Production and Development, March 4-6, 2009]에 기재된 바와 같이 하전된 소수성 혼합 모드 수지에 대한 면역글로불린 분자의 결합을 용이하게 한다고 당업계에 공지되었다.
본원의 발명자들은 공급 스트림 중 3-10％ (w/v) 농도 범위에 걸쳐 PEG6000을 이용한 실험을 기준으로, 상대 농도 약 5％ (w/v)의 PEG6000이 최적이었음을 결정하였다. 당업자는, PEG8000, PEG10000, 및 PEG15000을 비롯한 (이에 제한되지 않음) 다른 종 및 분자량의 PEG가 이용될 수 있고, rAAV 벡터 용액 중 최종 농도에서 PEG의 상대 농도는, 적절한 PEG 농도에서 용액 중 rAAV 벡터 입자가 아파타이트 수지에 결합하도록 조종되지만 응집물을 형성하거나 물리적으로 침전되지 않도록 실험적으로 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, rAAV 벡터 입자는 PEG 존재 하의 아파타이트 수지 상에서의 포획에 의해, 그리고 인산염 완충액에서 아파타이트 수지로부터 결합 rAAV 입자의 용리에 의해 생성 배양 오염물로부터 단리된다. 바람직한 실시양태에서, rAAV 벡터 입자는 PEG 존재 하의 아파타이트 수지 상에서의 포획에 의해, 그리고 PEG 부재 하의 완충액에서 아파타이트 수지로부터 결합 rAAV 입자의 용리에 의해 생성 배양 오염물로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 약한 음이온 결합제인 캡시드를 포함하는 rAAV 입자는 PEG 존재 하의 아파타이트 수지 상에서의 포획에 의해, 그리고 PEG 부재 하의 완충액에서 아파타이트 수지로부터 결합 rAAV 입자의 용리에 의해 생성 배양 오염물로부터 단리된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 혈청형 1 (rAAV-1 혈청형)의 캡시드를 포함하는 rAAV 입자는 PEG 존재 하의 아파타이트 수지 상에서의 포획에 의해 생성 배양 오염물로부터 단리되고, rAAV-1 혈청형 캡시드를 함유하는, 수지에 결합된 입자는 PEG 부재 하의 완충액에서 용리된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터 입자는 인산염 부재 하, 그러나 PEG 존재 하의 로딩 완충액에 공급 스트림을 로딩하는 단계, 및 인산염을 포함하며 PEG를 포함하지 않는 용리 완충액에서 아파타이트 수지로부터 결합 rAAV를 용리시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 생성 배양 오염물로부터 단리된다.
PEG 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피는 rAAV 벡터의 정제에 대한 효율적인 포획 또는 결합 전략을 나타내지만, 다수의 공정 중 불순물이 또한 pH 7.0의 아파타이트 수지에 보유되었다. 이론에 얽매이기를 바라지 않지만, 염기성 pH (7.0 초과 pH)의 공급 스트림에 존재하는 단백질은 최종 음전하를 가질 것이며, 아파타이트 수지 상에 존재하는 음성 인산염 결합 부위에 의해 반발되어, 크로마토그래피 수지의 전체 양이온 교환 결합 용량을 감소시킬 것이다. 그러나, 아파타이트 수지의 혼합 모드 성질 하에서도 양전하 인력 및 금속 친화성을 통한 결합은 여전히 일어날 수 있다.
붕산염 완충액은, 제조의 용이성, 최적의 용해도, 탁월한 완충 용량, 및 저 비용을 비롯한 (이에 제한되지 않음) 그의 바람직한 제조 특성 때문에 당업계에서 염기성 완충 시스템으로서 통상적으로 사용된다. 따라서, 붕산염 완충액은 염기성 완충 시스템 모델로서 아파타이트 수지 상에서의 rAAV 포획에 대해 평가되었다. 당업자는, 다른 염기성 완충액이 PEG 존재 하의 아파타아트 수지에 대한 공정 중 불순물 결합의 수준을 감소시키는지 여부를 결정하도록 평가될 수 있음을 이해할 수 있다. 다른 염기성 완충액이 rAAV 포획에 대해 시험 및 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG 부재 하의 아파타이트 로딩 완충액은 붕산염 완충액을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 붕산염 완충액은 pH 약 8.0 내지 약 pH 9.9로 제제화된다. 바람직한 실시양태에서, 붕산염 완충액은 pH 약 9.0으로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 붕산염 완충액의 농도는 약 5 mM 내지 약 500 mM이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 붕산염 완충액은 pH 9.0의 약 20 mM 붕산염으로 제제화된다. 일부 실시양태에서, pH 9.0의 20 mM 붕산염 완충액은 아파타이트 수지 상에서 소분자 공정 중 불순물의 포획을 특이적으로 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 공급 스트림은, PEG 최종 농도의 2배로 PEG를 포함하는 인산염 완충액과 공급 스트림을 온라인 혼합함으로써 PEG 존재 하의 인산염 함유 완충액 중 아파타이트 수지 상으로 로딩된다. 일부 실시양태에서, 인산염 완충액의 pH는 pH 6.5 내지 pH 7.0이다. 일부 실시양태에서, PEG는 PEG6000이다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충액 중 PEG6000의 농도는 약 3％ (w/v) 내지 약 10％ (w/v)이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 로딩 완충액 중 PEG6000의 농도는 약 5％ (w/v)이다. 일부 실시양태에서, 아파타이트 수지에 대한 로딩 완충액 중 인산염의 농도는 5 mM 내지 500 mM이다.
일부 실시양태에서, PEG 존재 하의 아파타이트 수지의 결합 용량은 PEG 부재 하의 아파타이트 수지의 결합 용량에 비해 증진된다. 일부 실시양태에서, PEG 존재 하의 공급 스트림 중 rAAV 벡터 입자에 대한 아파타이트 수지의 결합 용량은 PEG 부재 하의 아파타이트 수지의 결합 용량에 비해 약 1/2 로그 내지 약 10 로그 증진된다. 바람직한 실시양태에서, PEG 존재 하의 공급 스트림에 존재하는 rAAV 입자에 대한 아파타이트 수지의 결합 용량은 8 로그 증진된다. 일부 실시양태에서, PEG 존재 하의 공급 스트림 중 rAAV 벡터 입자에 대한 아파타이트 수지의 결합 용량은 적어도 수지 1 ml 당 rAAV 입자 약 106개 내지 수지 1 ml 당 입자 약 1016개 (예컨대 수지 1 ml 당 입자 약 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016개)이다. 일부 실시양태에서, PEG 존재 하의 아파타이트 수지의 결합 용량은 수지 1 ml 당 입자 약 1014개이다.
PEG 존재 하의 아파타이트 수지 1 ml 당 rAAV-1의 대략 1012 내지 1014개의 DRP라는 놀라운 결합 용량은 상업적 rAAV-1 정제를 매우 효율적이면서도 비용-효과적으로 축소시키지만, 당업자는 결합 용량이 수지 1 ml 당 결합하는 rAAV-1의 최대 수를 나타내며 본 발명의 범위를 운영상 제한하고자 하지 않음을 이해할 것이다. 실제로, 본 발명자들은 ml 당 1014-1016개 미만의 rAAV-1의 DRP를 함유하는 rAAV-1 벡터 수득 배양물이 본 발명에 의해 정제될 수 있음을 이해한다.
일부 실시양태에서, 아파타이트 매질에 결합된 rAAV 입자는 수지로부터 rAAV 입자의 용리 전 세척된다. 일부 실시양태에서, 아파타이트 크로마토그래피 매질은 공정 중 불순물을 제거하기 위해 감소하는 농도의 PEG를 함유하는 세척 완충액으로 1회 이상 세척된다. 일부 실시양태에서, 아파타이트 크로마토그래피 매질은 약 3％ (w/v) 내지 약 10％ (w/v) PEG를 함유하는 세척 완충액으로 1회 이상 세척된다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 약 10％ (w/v), 9.5％ (w/v), 9％ (w/v), 8.5％ (w/v), 8％ (w/v), 7.5％ (w/v), 7％ (w/v), 6.5％ (w/v), 6％ (w/v), 5.5％ (w/v), 5％ (w/v), 4.5％ (w/v), 4％ (w/v), 3.5％ (w/v), 및 3％ (w/v) 중 임의의 PEG를 함유한다. 일부 실시양태에서, 아파타이트 매질은 아파타이트 매질에 대한 rAAV 입자의 결합을 허용하는데 사용되는 PEG 농도보다 높은 농도의 PEG를 함유하는 세척 완충액으로 세척된다. 일부 실시양태에서, 아파타이트 매질은 감소하는 농도의 PEG로 추가로 세척된다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 당업계에 공지된 완충액을 함유한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 붕산염, N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES), 및 트리스-HCl로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 염기성 pH이다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액의 pH는 pH 7.0 내지 pH 10.0, pH 7.2 내지 pH 10.0, pH 7.4 내지 pH 10.0, pH 7.6 내지 pH 10.0, pH 7.8 내지 pH 10.0, pH 8.0 내지 pH 10.0, pH 8.2 내지 pH 10.0, pH 8.4 내지 pH 10.0, pH 8.6 내지 pH 10.0, pH 8.8 내지 pH 10.0, pH 9.0 내지 pH 10.0, pH 9.2 내지 pH 10.0, pH 9.4 내지 pH 10.0, pH 9.6 내지 pH 10.0, 또는 pH 9.8 내지 pH 10.0이다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액의 pH는 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8, 9.0, 9.2, 9.4, 9.6, 9.8, 또는 10.0이다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 100 내지 500 mM 인산염을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 50 내지 250 mM NaCl을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, PEG 존재 하의 아파타이트 수지 상에서의 포획에 의해 공급 스트림으로부터 단리된 rAAV 벡터는 저 농도의 PEG 하의 완충액에서 용리된다. 일부 실시양태에서, 저 농도의 PEG는 약 2.9％ (w/v) 내지 약 0.1％ (w/v) PEG이다. 일부 실시양태에서, PEG 존재 하의 아파타이트 수지 상에서의 포획에 의해 공급 스트림으로부터 단리된 rAAV 벡터는 PEG 부재 하의 완충액에서 용리된다. 바람직한 실시양태에서, PEG 존재 하의 아파타이트 수지 상에서의 포획에 의해 공급 스트림으로부터 단리된 rAAV 벡터는 PEG 부재 하의 인산염 함유 완충액에서 용리된다.
일부 실시양태에서, PEG 존재 하의 아파타이트 수지 상에서의 포획에 의해 공급 스트림으로부터 단리된 rAAV 벡터는 인산염 함유 완충액에서 용리된다. 일부 실시양태에서, PEG 존재 하의 아파타이트 수지 상에서의 포획에 의해 공급 스트림으로부터 단리된 rAAV 벡터는 농도 약 0.1 mM 내지 약 500 mM (예컨대, 약 1 mM 내지 약 250 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM)의 인산염 함유 완충액에서 용리된다. 바람직한 실시양태에서, PEG 존재 하의 아파타이트 수지 상에서의 포획에 의해 공급 스트림으로부터 단리된 rAAV 벡터는 50 mM 인산염 완충액에서 용리된다.
본원의 발명자들은 공급 스트림에 존재하는 rAAV 벡터가 PEG 존재 하의 아파타이트 수지 상에서의 포획에 의해 단리될 수 있음을 발견하였다. 그러나, 생성 배양에 사용된 헬퍼 바이러스 (예컨대 아데노바이러스)가 아파타이트 수지에 적용된 공급 스트림에 존재하는 경우, 그들은 PEG 존재 하의 아파타이트 수지에 의해 포획된다. PEG 존재 하의 아파타이트 수지에 의해 포획된 rAAV 벡터 입자는 인산염 완충액에서 그들의 용리 프로파일에 의해 아데노바이러스로부터 용이하게 단리될 수 있다. PEG 존재 하의 아파타이트 수지에 결합된 rAAV 벡터 입자는 PEG 부재 하에 0 mM 만큼 적은 인산염을 함유하는 완충액에서 용리되는 반면, 헬퍼 바이러스 아데노바이러스 입자는 rAAV 벡터 입자를 용리시키는데 사용된 인산염의 농도 하에서 아파타이트 수지 상에 보유된다. 실험적으로, rAAV 벡터는 PEG 부재 하의 50 mM 만큼 적은 인산염에서 단일의 뚜렷한 피크로 용리된다고 밝혀진 반면, 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스는 존재한다면 수지 상에 보유되었다. rAAV 공급 스트림에 감염성 아데노바이러스의 DNase-저항성 입자 (DRP) 89개가 가해지고 PEG 존재 하의 아파타이트 수지 상에서 크로마토그래피되는 스파이크-인(spike-in) 연구에서, rAAV 벡터는 아파타이트 수지 상에서 포획되고 PEG 부재 하의 50 mM 인산염 완충액에서 용리되었으며, 이때 대략 4 로그의 아데노바이러스 단백질이 아파타이트 수지 상에 보유되었다. 따라서, 일부 실시양태에서, 공급 스트림에 존재하는 rAAV 벡터는 PEG 존재 하의 아파타이트 수지 상에서의 포획 및 PEG 부재 하의 인산염 완충액에서의 용리에 의해 오염성 헬퍼 바이러스로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 인산염 완충액은 아파타이트 수지에 결합된 오염성 헬퍼 바이러스를 보유하는 농도로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 아파타이트 수지 1 ml 당 2 내지 8 로그의 아데노바이러스가 보유된다. 일부 실시양태에서, 공급 스트림에 존재하는 rAAV 벡터는 아파타이트 수지에 결합된 헬퍼 바이러스를 보유하는 조건 하에 0-500 mM (예컨대 0-400 mM, 0-300 mM, 0-200 mM, 0-100 mM, 0-50 mM) 인산염 완충액에서 아파타이트 수지로부터의 용리에 의해 단리된다.
rAAV 벡터를 생성하는 것으로 당업계에 공지된 생성 시스템은 0.5％-20％ (v/v) 범위의 혈청을 함유하는 생성 배지를 포함할 수 있거나, 혈청이 전혀 없을 수 있다. 또한, 당업계에서 설명된 정제 계획은 아파타이트 수지에 적용된 공급 스트림 중 혈청 단백질 및 다른 혈청 성분의 증가를 초래할 수 있는 하나 이상의 농축 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 1％ (v/v) 혈청으로 제제화된 본원에 기재된 바와 같은 생성 배양 상청액은 TFF 단계에서 대략 20배로 농축되어, 아파타이트 수지 상에 로딩된 공급 스트림이 혈청 없이 제제화된 생성 배양물으로부터의 공급 스트림 농축액에 비해 20％ 정도의 혈청 단백질 오염물을 함유하도록 하였다. 본원의 발명자들은 혈청의 존재 또는 부재 하에 제제화된 생성 배양물으로부터의 공급 스트림 농축액을 이용하여 본원에 제공된 아파타이트 포획 방법을 시험하였다. 공급 스트림 중 혈청 단백질의 존재는 아파타이트 크로마토그래피 단계의 수행에 전혀 효과를 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다.
헬퍼 바이러스의 열 불활성화 (히트 킬(Heat Kill))
감염성 아데노바이러스가 rAAV 생성을 위한 생성 배양물 중 헬퍼 바이러스의 공급원으로서 사용되는 경우, 임의적 열 불활성화 (히트 킬) 단계가 포함되어 공급 스트림에 존재할 수 있는 임의의 잔류 아데노바이러스 입자를 불활성화시킬 수 있다. 히트 킬 단계는 AAV와 아데노바이러스의 주요 차이점 중 하나를 이용한다: 아데노바이러스 입자는 대략 54-56℃의 온도에서 불활성화되는 반면, AAV 및 rAAV 바이러스 입자는 상기 온도에서 안정하고 그에 의해 영향받지 않는다. 본 발명에서, 발명자들은 본원에서 수행된 250L 규모의 생성 배양과 같은 보다 큰 규모의 공정 최적화에 적응하도록 열 불활성화 단계를 조정하였다. 특히, 아파타이트 용리액은 40 RPM의 진동 속도에서 53℃로 설정된 온도-제어 진동 플랫폼 (혼합을 위해 12°각을 이룸 (20L 웨이브 히터 팬)) 상에서 멸균된 단일 용도의 5 L 생물처리 백 내에서 열-불활성화되었다. 아파타이트 용리액이 52℃에 도달할 때까지 이를 플랫폼 상에서 인큐베이터한 다음, 추가의 10분 동안 상기 온도에서 유지시켰다. MgCl2를 최종 농도 2 mM의 아파타이트 용리액에 첨가하여 가열 동안 rAAV 벡터를 안정화시켰다. 당업자는, rAAV 입자의 감염성 및 완전성을 유지하면서 아데노바이러스 입자를 불활성화시키기 위한 최적의 조건을 발견하기 위해 가열을 위한 규모, 최종 설정점, 및 가열 시간을 실험적으로 시험할 수 있음을 이해할 수 있다. 열 불활성화 단계는 rAAV 입자의 정제를 위해, 플라스미드 구조물을 이용하여 헬퍼 기능을 제공하는 생성 배양으로부터 생략될 수 있다.
소수성 상호작용 크로마토그래피
소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)는 생물분자를 그들의 표면 소수성 차이에 기초하여 분리하는 기술이다. 따라서, HIC는 AAV 공정에서 다른 정제 단계에 대한 직교 방법으로 간주된다. HIC 크로마토그래피 매질은 소수성 리간드, 예컨대 선형 쇄 탄화수소 (예를 들어, 프로필 (C3), 부틸 (C4), 헥실 (C6), 또는 옥틸 (C8)) 또는 방향족 (예를 들어, 페닐)을 함유한다. 순수 물에서, 소수성 효과는 리간드와 단백질, 또는 단백질 자체 사이의 기능적 상호작용에 대해 매우 약하다. 그러나, 액방성(lyotropic) 염은 소수성 상호작용을 증진시키고, 염의 부가는 HIC 매질에 대한 단백질의 포획을 촉진한다. 이러한 이유로, HIC 수지는 통상 높은 염 농도 하에 로딩되고, 보다 낮은 염 농도에서 용리된다. 당업자가 이해하듯이, 암모늄 술페이트 [(NH4)2SO4]는, 호프마이스터(Hofmeister) 시리즈에서 암모늄 및 술페이트 이온 둘 다의 높은 액방성 순위 및 염의 높은 용해도 때문에, HIC 크로마토그래피를 통해 단백질의 포획을 제어하는데 가장 통상적으로 사용되는 염이다. 본 발명에서, 공급 스트림에 존재하는 rAAV 입자는, 각각 75:25 (부피:부피) 비의 2 M 암모늄 술페이트 + 50 mM 비스트리스(BisTris) 완충액 (pH 7.0):공급 스트림의 인-라인 혼합에 의해 HIC 수지 상에 로딩되었다. 공급 스트림과 로딩 완충액의 인-라인 혼합은 완충액에 존재하는 고 농도의 암모늄 술페이트에 의해 임의의 rAAV 벡터 침전의 위험을 방지한다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 염 (암모늄 술페이트)의 농도는 rAAV 결합을 위한 최적의 농도를 달성하기 위해 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 암모늄 술페이트 농도는 1 M 내지 3 M이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 로딩 완충액 중 암모늄 술페이트 농도는 2 mM이다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 암모늄 술페이트 및 공급 스트림의 인-라인 혼합은 단위 작업의 편의 및 흐름을 위해 수행되지만, 당업자는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 공급 스트림을 적절한 농도의 로딩 완충액과 용이하게 혼합한 다음, 공급 스트림 + 로딩 완충액 용액을 HIC 크로마토그래피 매질 상에 로딩할 수 있다.
공-용매가 또한 소수성 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜은 단백질과 고정된 리간드 사이의 상호작용을 감소시킬 수 있으므로, 용리 프로파일을 개선하는데 유용할 수 있다. 따라서, HIC 컬럼을 2 M 암모늄 술페이트 + 50 mM 비스트리스 완충액 (pH 7.0):50 mM 비스트리스 (pH 7.0) + 10％ 프로필렌 글리콜 (v:v) 완충액의 75:25 (v:v) 혼합물 (EMD 바이오사이언시즈(EMD BioSciences))로 세척하고, rAAV를 저 염 완충액 + 프로필렌 글리콜 (800 mM 암모늄 술페이트 + 50 mM 비스트리스 완충액 (pH 7.0) + 4％ 프로필렌 글리콜)에서 용리시켰다. 상기 용리 조건 하에서, 컬럼 상에 로딩된 공급 스트림에 존재하는 임의의 잔류 헬퍼 바이러스 및 단백질은 컬럼에 결합된 채로 남아있을 것이다. 이러한 실시예에서 프로필렌 글리콜을 완충액에 첨가하여, 프로필렌 글리콜이 없는 (공정 중에서 임의적임) 완충액의 광범위한 용리 프로파일에 비해 용리 프로파일을 뚜렷하게 하였다.
적합한 소수성 수지의 예로는 토소 부틸 650M, 토소 수퍼부틸 650C, 토소 페닐 650C, 및 EMD 프락토겔 페닐 (토소 바이오사이언스 엘엘씨(Tosoh Bioscience LLC), 펜실베니아주 소재)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
rAAV 생성 공정으로부터의 폐기물은 적어도 2가지의 하기 이유로 처분 전에 엄격하게 정화하는 것이 필요하다: (1) 생성물은 바이러스 벡터를 포함하고; (2) 생성 배양은 rAAV 생성을 위한 헬퍼 바이러스로서 살아있는 아데노바이러스 유형 5 (Ad5)를 통상적으로 사용한다. 크로마토그래피 작업으로부터의 액체 폐기물은 전형적으로는, 사용 시점에 표백제로 먼저 정화된 다음, 중화 및 처분 전 고 pH에서 유지시켜 추가로 정화된다.
HIC 완충액에 존재하는 암모늄 술페이트는 표백제 및 수산화나트륨 둘 다와 반응하여 각각 유해한 염소 및 암모니아 가스를 방출시킨다. 따라서, HIC 크로마토그래피 단계의 공정 최적화를 위한 주요 고려사항은 당업계에 공지된 방법에 의해 안전하게 정화될 수 있는 적합한 완충 시스템을 개발하는 것이었다.
당업자가 이해할 수 있듯이, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 사용된 높은 염 농도의 완충액은 점도 문제에 대해 추가로 스크리닝되어야 하는데, 점도 문제는 높은 배압을 초래하여, 유속을 제한하거나 혼합 문제를 유발시킴으로써, 저장 또는 작업 동안 사용된 온도에서 발생하는 완충액 중의 염 결정화에 의해 생성물의 침전 위험을 증가시킬 수 있다. 하기 표 6의 데이타 및 상기 기재된 인자의 고려사항을 기준으로, 본 발명자들은 비록 시트르산염 완충액이 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 0.5 M 내지 2.0 M 범위의 농도로 사용될 수 있지만, HIC 크로마토그래피 매질에의 rAAV 벡터 결합을 위한 최적의 완충액으로서 1 M 시트르산나트륨 (pH 7.0)을 선택하였다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의한 완충액 교환
TFF 및 투석을 비롯한, 본원에 기재된 완충액 교환을 수행하기 위한 수많은 방법이 당업계에 공지되어 있다. 크기 배제 크로마토그래피의 사용은, 수지 내 기공을 통과하도록 크기조정된 단백질의 추가 단백질 제거(clearance)를 제공하며 완충액을 교환하는데 필요한 시간의 관점에서 비교적 신속하다는 추가의 이점을 갖는다. 완충액 교환을 이 단계에서 수행하여, 이전 단계의 HIC 용리액이 공정 중 최종 음이온 교환 크로마토그래피 단계에의 rAAV 결합을 위한 적절한 완충액으로 교환되도록 보장하였다.
외래 물질 (바이러스 제거)
임의로, 공급 스트림에 존재할 수 있는 외래 바이러스와 같은 미량의 오염물을 제거하기 위한 추가 단계가 공정에 포함되어, 상업적으로 적당한 직교 공정을 생성할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 공정은 바이러스 제거 필터를 추가로 포함한다. 이러한 필터의 예는 당업계에 공지되어 있으며, 밀리포어 바이어솔브(Millipore Viresolve) NFR (50 nm), 폴 얼티포어(Pall Ultipore) VF (50 nm), 및 아사히(Asahi) 70 nm를 포함한다.
음이온 교환 크로마토그래피
아파타이트 크로마토그래피에 제공된 rAAV 벡터를 위한 음이온 교환 포획 단계는 최종 농축 및 연마(polish) 단계로서 수행되었다. 적합한 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 당업계에 공지되어 있으며, 우노스피어 큐(Unosphere Q) (바이오라드(Biorad), 캘리포니아주 허큘러스 소재), 및 N-하전 아미노 또는 이미노 수지, 예컨대 POROS 50 PI, 또는 임의의 DEAE, TMAE, 3급 또는 4급 아민, 또는 당업계에 공지된 PEI-기재 수지 (미국 특허 제6,989,264호; 문헌 [N. Brument et al, Mol. Therapy 6(5):678-686 (2002)]; [G. Gao et al., Hum. Gene Therapy 11:2079-2091 (2000)])를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는, 정제 단계에 이용된 다양한 필터로부터 걸러져 도입될 수 있는 다른 공정 중 불순물 (글루칸을 포함하나 이에 제한되지 않음)이 제거되는 동안 rAAV가 수지에 결합된 채로 남아있도록 하는 적합한 이온 농도의 세척 완충액이 확인될 수 있음을 이해할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 60 mM NaCl이고, rAAV 벡터는 130 mM NaCl을 갖는 컬럼으로부터 용리되어, 존재하는 임의의 잔류 미량 공정 중 불순물, 예컨대 혈청 알부민 또는 헬퍼 바이러스가 컬럼에 보유되도록 한다.
<실시예>
실시예 1: 배양 배지-정화 및 벤조나제 ® 소화로부터 rAAV-1 수거
rAAV-1 벡터를 함유하는, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성된 250 L rAAV-1 바이러스 생성 배양물으로부터 소비된 rAAV-1 생성 배지 (상청액)을 정화하여 상청액에 함유된 임의의 세포를 제거하였다. (1) 밀리포어 밀리스택+® HC 포드 필터, D0HC 등급 (밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.), 매사추세츠주 베드포드 소재) (4회); (2) 밀리포어 밀리스택+® HC 포드 필터, A1HC 등급; 및 (3) 옵티캡(Opticap)® XL10 밀리포어 익스프레스 SHC 하이드로필릭 멤브레인 0.2 μm 필터를 포함하는, 연속적으로 연결된 일련의 필터에 5 리터/분 (LPM)의 속도 (4 LPM으로 단계적으로 감소함)로 상청액을 통과시켰다.
제조자의 설명서에 따라 모든 필터를 역삼투/탈이온화 ("RO/DI") 물로 예비세척하였다. 벤조나제® 소화를 위해 생물처리 백에 통과 유동물을 수집하였다. 최종 농도 2 단위/ml의 벤조나제® (EM 인더스트리즈 카탈로그 번호 1.01695.0002)를 rAAV-1 생성 배지 중에 용해시키고, 이를 정화된 바이러스 상청액에 첨가하여 최종 농도 2.5 단위/ml를 달성하였다. 상청액 + 벤조나제®를 주변 온도에서 4 LPM의 일정한 재순환으로 인큐베이션하여 DNA 소화를 가능케 하였다. 벤조나제® 소화로부터의 데이타는 도 1에 도시되어 있으며, 이는 벤조나제® 소화 후 고분자량 DNA가 존재하지 않았음을 입증한다.
실시예 2: 음이온 교환을 통한 생성 오염물의 제거
실시예 1로부터 rAAV-1 정화되고 벤조나제® 소화된 상청액을 연속적으로 연결된 일련의 2인치씩 22인치의 폴 무스탕(Pall Mustang)® Q ("MQ") 필터 (폴 코포레이션, 카탈로그 번호 NP6MSTGQP1)에 통과시켰다. rAAV-1 바이러스성 상청액의 로딩 전에, 필터를 0.5 M NaOH 15 L를 이용하여 0.5 LPM으로 15분 유지 시간을 가지면서 소독하고, 6 LPM의 속도로 15 L TMEG + 2 M NaCl (TMEG: 0.05 M 트리스-HCl, pH 7.5, 1 mM 2-머캅토에탄올, 1 mM Na2EDTA, 10％ (v/v) 글리세롤)에 의해 헹구어 하전시키고, 6 LPM으로 벡터 생성 배지 15 L에 의해 평형화시켰다. 이어서, 상청액을 일련의 필터를 통해 대략 6 LPM의 속도로 펌핑시키고, 생물처리 백에 수집하였다. 생성 배지의 이온 농도에서, 음이온 교환 MQ 필터는 하전된 멤브레인에 오염물을 결합시킴으로써 rAAV-1 상청액으로부터 다른 불순물 중 헬퍼 바이러스 및 잔류 DNA를 제거하는 것으로 입증되었다. 그러나, 생성 배양의 이온 농도에서, 상청액에 존재하는 rAAV-1 벡터는 음이온 교환 멤브레인을 통과 유동시켰다. 공정 최적화 동안, 단일 MQ 필터의 사용은 공정 중 Ad5 헬퍼 바이러스를 비롯한 오염물의 파과를 초래하는 것으로 실험적으로 결정되었다. 그 결과, 공정 중 제2 필터를 연속적으로 또는 일렬로 첨가하였다.
실시예 3: rAAV-1 벡터 상청액의 농축
실시예 1 및 2에서 처리된 완전한 rAAV-1 벡터 생성 상청액을 접선 유동 여과 ("TFF")를 통해 대략 250 L의 초기 부피에서 대략 12.5 L의 부피로 대략 20배 농축시켰다. 100 kD 분자량 컷 오프(cut off), C 스크린 및 5 m2의 전체 표면적을 갖는 접선 유동 폴리에테르술폰 필터 카트리지 (밀리포어 펠리콘(Pellicon)® 2 바이오맥스, 카탈로그 번호 P2B100C05)를 RO/DI 물 50 L로 플러슁하고, 0.5 M NaOH 15 L로 15분 유지 단계를 가지면서 소독하고, 다시 WIFI (하이퓨어(HyPure)™ WFI 정제수; 하이클론(HyClone), 유타주 로간 소재) 100 L로 플러슁하고, 15 L TMEG + 2 M NaCl로 플러슁하고, 마지막으로 rAAV-1 생성 배지 15 L로 평형화시켰다. 상청액을 대략 3 LPM의 유속 및 16 LPM의 재순환 속도로 TFF 카트리지를 통과시켰다. 필터에 보유된 TFF 물질 ("보유물")을 대략 10.5 L로 농축시키고, 저장소로 옮겼다. 필터를 대략 2 L의 생성 배지로 플러슁하였다. 이어서, 세척 및 농축액을 모아 대략 12.5 L의 최종 부피를 수득하였다.
rAAV-1을 TFF에 의해 12.5 L의 부피로 농축시키는 것은 또한 용액 중 남아있는 rAAV-1 생성 오염물을 대략 20배로 농축시켰다. 따라서, TFF 농축액을 4-인치 옵티캡 0.22 μM 필터 멤브레인 (밀리포어 옵티캡® 카탈로그 번호 KVSC04HB3)을 통해 여과시키는 TFF 단계 후에 생성 유지 단계를 도입하였다. 상기 추가의 여과 단계는 rAAV-1 함유 TFF 농축액이 정용여과 및 완충액 교환을 필요로 하지 않으면서 공정 중 다음 단계로 진행하도록 한다. TFF-후 물질은 2-8℃에서 임의의 시간 동안, 예를 들어 적으면 24시간 내지 많으면 3개월 이상 동안 저장된 후, 벡터 수율에 의해 측정된 안정성 또는 당업계에 공지된 검정에 의해 평가된 감염성의 손실 없이 추가로 처리될 수 있다. 별법으로, 본원에 기재된 바와 같이 수행된 TFF는 정제 공정 중 임의의 단계에서 사용되어 rAAV-1 벡터를 농축시키거나 완충액 교환시킬 수 있다.
실시예 4: rAAV-1 벡터 대 공정 불순물 결합에 대한 수지 스크리닝
단백질 및 다른 생물학적 생성물의 정제를 위한 상업적 FDA-승인 방법은 직교 공정을 포함하는 상업적-규모에 의존한다. 직교 공정은, 예를 들어 rAAV-1 벡터와 같은 최종 생성물에 대한 포획 및 통과 유동 단계를 비롯한, 공정 중 불순물의 제거를 위한 1개 초과의 단계 또는 공정을 갖는 공정이다. rAAV 벡터 (구체적으로 rAAV-2)는 음이온성 수지에 결합하는 것으로 당업계에서 입증되었다. rAAV-1, -5, 및 -8과 같은 rAAV 벡터는 생성 성분, 예컨대 혈청 알부민, 헬퍼 바이러스 성분, 생성 배지 성분 및 숙주 세포 DNA의 존재 하에서 음이온 교환체에 대해 rAAV-2보다 훨씬 덜 단단하게 결합하여, 보다 덜 효율적이며 보다 낮은 품질의 정제 계획을 초래하는 것으로 입증되었다.
AAV-1과 같은 보다 낮은 친화성의 음이온 결합제에 대해 당업계에서 기재된 이전의 정제 전략은, 음이온 교환체에 대한 rAAV 벡터의 보다 단단한 결합을 달성하기 위해 생성 성분의 상대적 농축을 감소시키는 이오딕시놀 단계 구배를 포함한다. 이오딕시놀 단계 구배는 본원에 기재된 것과 같은 상업적 규모 공정으로 용이하게 조정될 수 없다. 따라서, 초원심분리 및 단계 구배를 수행할 필요 없이 rAAV-1과 같은 낮은 친화성의 음이온 결합제에 대한 rAAV 벡터 정제를 최적화하기 위해, 수많은 수지를 숙주 세포 DNA, 헬퍼 바이러스, 혈청 알부민, 혈청 단백질 (혈청이 생성 배지에 포함된 경우), 및 생성 배양물에서 발견된 다른 저분자량 단백질을 비롯한 통상적으로 관찰되는 공정 불순물에 결합하거나 이를 통과 유동시키는 그의 능력과 비교하여 rAAV 벡터에 결합하거나 통과 유동 중에 rAAV 벡터를 배제시키는 그의 능력에 대해 스크리닝하여, 상업적으로 조정가능하고 효율적인 직교 rAAV 정제 공정을 개발하였다.
수지 스크리닝을, 제조자의 권고에 비해 심각하게 낮은 로딩 용량으로, 각 수지에 대해 판매자에 의해 권고된 선형 유속으로, 1 ml (5 cm 베드 높이) 컬럼을 사용하여 수행하였다. 280 나노미터에서의 자외선 흡광도 (A280)의 분광광도계 기록을 각각의 수지에 대한 결합 및 각각의 수지로부터의 용리에 대해 수집하였다. 적절한 검정에 의해 rAAV-1 벡터 및 대표적인 공정 불순물 둘 다에 대한 피크를 분석하였다. 도 2에 제시된 데이타는 목록에서 전형적인 수지에 대한 전형적인 분광광도계 기록을 나타낸다. 하기 표 2는 스크리닝된 일부 수지를 나열할 뿐만 아니라 rAAV-1 벡터 및 다양한 공정 불순물에 대한 수지의 상대적 결합 친화성을 나열한다.
Figure pct00001
실시예 5: rAAV-1의 포획을 위한 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG") 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피의 개발
실시예 4에서 수행된 수지 스크리닝의 결과를 기준으로, 아파타이트 수지 또는 세라믹 아파타이트 수지를 rAAV-1에 대한 포획 수지 중 하나로서 선택하였다. CFT II 수지를 사용하여 초기 실험을 수행하였지만, 이후의 정제를 위해 수지를 하기에서 상세하게 논의된 바와 같이 CHT I으로 변화시켰다. 데이타는 두 크로마토그래피 수지가 동등하게 수행되었음을 나타냈다. 실험을 수행하여 아파타이트 수지의 rAAV-1 결합 용량을 더 증가시키고, rAAV-1 입자와 다른 공정 중 불순물을 구별하는 수지의 능력을 개선시켰다. 아파타이트 수지의 기능에 대한 두 가지 중요한 개선은 본원에 기재된 바와 같이 더 개발되었다: 1) PEG의 첨가; 및 2) 로딩 완충액 조건의 개발.
상업적으로 적당한 컬럼 크기에서 용량 문제로 인한 아파타이트 컬럼의 가변성 파과를 기준으로, PEG를 아파타이트 수지 상에 로딩하기 전 TFF 농축액 (상기 실시예 3 참조)과 혼합하여, 실시예 4에서 컬럼에의 결합에 대해 rAAV-1 벡터를 능가하는 다른 공정 중 불순물 (예컨대 혈청 알부민, 헬퍼 바이러스 및 다른 단백질 불순물)에 비해 rAAV-1 벡터의 결합을 증가시켰다.
PEG 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피는, 비록 다수의 공정 중 불순물이 pH 7.0에서 아파타이트 수지에 의해 또한 보유되었지만, rAAV-1 벡터의 정제에 대한 효율적인 포획 또는 결합 전략을 나타낸다.
완충 조건의 변형이 다른 공정 중 불순물로부터 rAAV-1의 분석을 개선시킬 수 있는지 결정하기 위해 실험을 수행하였다. CFT 수지와 함께 6 cm 베드 높이로 팩킹된 1.2 mL 트리콘(Tricorn) 5 컬럼 (지이 헬쓰케어(GE Healthcare))이 장착되어 있으며 150 cm/hr의 유속으로 전개되는 AKTA익스플로러 FPLC 시스템 (지이 헬쓰케어, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하여 소규모 실험을 수행하였다. 상기 컬럼을, 5％ PEG6000의 존재 또는 부재 하의 다양한 완충 시스템에서 rAAV-1 벡터 포획 대 소분자 공정 중 불순물 모델인 소 혈청 알부민 ("BSA")의 결합에 대하여 평가하였다.
rAAV-1 또는 BSA를 5％ (w/v) PEG6000의 존재 또는 부재 하에 시험될 완충 시스템 내 CFT 컬럼 상에 소 부피 (전체 부피의 5％ 미만)로 주사하였다. 샘플의 완충액 교환에 대한 필요성을 방지하기 위하여 소 부피를 사용하였다. 생성물을 500 mM PO4 구배에 따라 용리시켰다. 50 mM 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 ("MES")을 사용하여 시스템을 pH 6.50으로 완충시키고, 20 mM 붕산염을 사용하여 시스템을 pH 9.0으로 완충시켰다.
하기 표 3에 제시된 데이타는, 분광광도계 기록 (데이타는 도시되지 않음)에 의해 나타내어진 바와 같이, 아파타이트 수지에 대한 rAAV-1 벡터 결합은 5％ (w/v) PEG6000의 존재 하에 pH 6.5 또는 pH 9.0에서 본질적으로 동일한 반면, 소분자 공정 중 불순물 모델인 BSA의 결합은 5％ (w/v) PEG6000의 존재 또는 부재 하에 pH 9.0에서 극적으로 감소하였음을 입증한다. 효소-연계 면역흡착 검정 ("ELISA")에 의한 염기성 완충액 로딩 조건 (즉, pH 9.0)에서 아파타이트 컬럼에 결합하는 BSA의 용량 감소의 추가 분석은, 대부분의 BSA (약 78％)가 pH 9.0 완충액 조건에서 통과 유동 중에 존재한 반면, BSA 결합의 제거 또는 감소의 추가적인 수준은 이후 세척 단계 동안 달성될 수 있으며 (약 19％), 컬럼 상에 로딩된 BSA의 약 0.1％만이 아파타이트 수지에 실제로 결합된 채로 남고, rAAV-1 벡터와 함께 공동-용리됨을 입증하였다. rAAV-1 입자는 pH 9.0에서 안정하였으며, 이는 용리된 DNase-저항성 입자 ("DRP") 수의 감소 또는 그의 감염성 손실이 없다는 것으로 나타난다.
Figure pct00002
실시예 6: PEG 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피를 통한 rAAV-1 포획에 대한 rAAV-1 수거 배양물 중 혈청의 효과
본원에 기재된 방법에 의해 정제될 rAAV-1 벡터 생성 배양물 또는 rAAV-1-함유 공급 스트림은, 생성 배양물이 혈청 함유 배지에서 성장하는 경우 혈청 및 혈청 단백질을 함유할 수 있다. 매우 저 농도 (즉, 1％ 이하)의 혈청을 사용하는 rAAV-1 벡터 생성이 기재되었지만 (예를 들어, 미국 특허 제6,995,006호 참조), 실시예 3에 기재된 바와 같은 생성 배양물 또는 공급 스트림의 농축은 생성 배양 수거물의 20배 농축의 결과로서 20％ 혈청 및 혈청 단백질을 효과적으로 함유하는 공급 스트림을 생성할 수 있다. 아파타이트 크로마토그래피의 성능에 대한 혈청 성분의 효과를 평가하기 위해, PEG6000의 존재 또는 부재 하에, 혈청의 존재 또는 부재 하에 생성된 생성 배양물에 대해 실험을 수행하였다.
2개의 rAAV-1 생성 배양물 모델을 사용하여, 전체 4 컬럼 로딩 실험으로 전형적인 파과 분석에 의해 아파타이트 수지 (CFT 유형 I)의 용량을 평가하였다. 제1 실험에서, 생성 배양물은 혈청을 함유하였고; 제2 실험에서, 생성 배양물은 혈청을 함유하지 않았다. 공급 스트림 모두를 5％ (w/v) PEG6000의 존재 하에 또는 PEG의 부재 하에 시험하였다. 공급 스트림은 수득 공정을 나타냈으며, 음이온-교환 필터를 통과하고 본원에 기재된 바와 같은 접선 유동 여과에 의해 20배 농축된 정화된 배양 상청액이었다. CFT 유형 I 컬럼을 공급 스트림과 pH=9.0의 붕산염 완충액의 1:1 온라인 혼합에 의해 로딩하였다. 완충액은 (최종 농도 5％ (w/v) PEG6000을 달성하기 위해) 0％ 또는 10％ (w/v) PEG6000을 함유하였다. 컬럼이 로딩됨에 따라, 통과 유동물을 일련의 분획물로 수집하고, 생성물에 대해 DRP-PCR로 분석하였다. 기능적 용량은, 온라인 희석을 설명한 후, 컬럼 유출시의 생성물 농도가 컬럼에 도입되는 농도의 1％에 막 도달한 지점으로서 정의하였다. 이어서, PEG를 함유하는 컬럼 로드에 대해, 크로마토그래피 공정의 나머지를 실행하여 용리 분획물 중 벡터 회수를 평가하였다.
도 3에 제시된 데이타는, PEG6000의 첨가는 혈청이 생성 배양물 중에 존재하는지 여부에 상관없이 rAAV-1 벡터 결합에 대한 아파타이트 수지의 용량을 증가시킴을 입증한다. 이론에 얽매이기를 바라지 않지만, PEG 존재 하의 TFF-후 상청액은, 용리 완충액 중 인산염의 존재에 의해 능가될 수 있는 인산염 모이어티에 대한 음이온성 상호작용을 통해, 다른 공정 중 불순물보다 아파타이트 수지에 우선적으로 rAAV-1를 결합시킨다. 또한, 아파타이트 수지에 대한 rAAV-1의 결합은, 염의 존재에 의해 능가될 수 있는 금속 상호작용을 통해 공정 중 불순물과 더 구별된다. 인산염 모이어티에 대한 rAAV-1의 결합은 주로 소수성에 의해 촉진되지 않는데, 이는 포획 및 용리 완충액이 성질상 주로 이온성으로 제제화되기 때문이다 (즉, 용리 완충액은, 주로 소수성 상호작용에 의해 결합된 조성물을 용리시키는데 통상적으로 사용되는 150 mM 이상의 인산염을 함유하는 용리 완충액과 비교하여, 50 mM 인산염을 함유한다). 저 인산염 용리 조건인 상기 고 염 하에서, 생성 배양물의 상청액에 함유된 잔류 헬퍼 바이러스, 숙주 세포 DNA, 및 다른 저분자량 단백질은 존재한다면 수지 상에 보유될 것이다. 놀랍게도, 데이타는, PEG6000의 존재 하에 혈청-함유 또는 혈청-무함유 매질에서 생성된 rAAV-1 벡터가 1.2x1012 DRP/mL 이상 (1 mL 로드) 내지 1.5x1014 DRP/mL(수지) 초과 (150 mL)의 아파타이트 수지에 대한 결합 용량을 나타냄을 입증한다. 5％ (w/v) PEG6000의 부재 하에, TFF 수득물에 대한 아파타이트 수지의 결합 용량은 혈청 함유 매질에서 생성된 벡터의 경우 2.4x1012 DRP/mL 미만이고, 혈청-무함유 매질에서 생성된 벡터의 경우 7.2x1012 DRP/mL 미만이었으며, CFT 용리물에서는 rAAV-1 벡터가 회수되지 않았다.
실시예 7: 아파타이트 크로마토그래피를 통한 rAAV-1의 정제
CHT 유형 I 컬럼을 2 M NaCl로 팩킹하고, 1 M NaOH로 소독하였다. 로딩 전에, 컬럼을 6 컬럼 부피 ("CV")의 20 mM 붕산염 (pH = 9) + 5％ (w/v) PEG6000으로 평형화시켰다. TFF 공급 스트림 농축액을 3 mm 바이오프로세스 스키드(BioProcess Skid) (지이 헬쓰케어)를 통해, 상기 기재된 바와 같이 제조된 923 ml (14 cm 직경 x 6 cm 베드 높이) CHT 컬럼 상에 96 cm/hr의 유속으로 로딩하였다. TFF 공급 스트림 농축액을 동일한 부피의 40 mM 붕산염 (pH = 9) + 10％ (w/v) PEG6000 완충액과 인-라인 혼합하여 최종 농도 20 mM 붕산염 (pH = 9) + 5％ (w/v) PEG6000을 수득하였다.
일련의 4회 순차적 세척을 수행하여, 컬럼 상에 rAAV-1 벡터는 보유하면서 공정 중 불순물을 제거하였다. 5 CV의 50:50 (부피:부피) 20 mM 붕산염 (pH = 9.0) + 5％ (w/v) PEG6000:40 mM 붕산염 (pH = 9.0) + 10％ (w/v) PEG6000의 인-라인 혼합에 의해 세척 1 ("추적")을 수행하여 PEG6000을 갖는 모든 로딩 라인을 추적하였다. 또한, 이 단계는 rAAV-1 벡터의 결합 친화성을 우선적으로 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 15 CV의 150 mM 인산칼륨 + 20 mM 붕산염 (pH = 9) + 5％ (w/v) PEG6000으로 세척 2를 수행하여, 컬럼 상에 rAAV-1 벡터를 보유하면서 대다수의 혈청 알부민 및 다른 저분자량 단백질 공정 중 불순물을 제거하였다. 15 CV의 20 mM 붕산염 (pH = 9) + 5％ (w/v) PEG6000으로 세척 3 (도 5에서의 "WII")을 수행하여 임의의 잔류 인산염을 제거함으로써, PEG6000이 제거되었을 때 rAAV-1은 컬럼에 결합된 채로 남아있게 하였다. 5 CV의 20 mM HEPES (pH = 7.0) + 150 mM NaCl 완충액으로 세척 4 (도 5에서의 "WIII")를 수행하여 PEG6000을 제거하고 염 농도를 조정함으로써, rAAV-1과 컬럼에 결합된 채로 남아있을 수 있는 임의의 잔류 헬퍼 바이러스 또는 다른 공정 중 불순물, 예컨대 단백질 오염물을 구별하였다.
6 CV의 50 mM 인산칼륨 + 20 mM HEPES (pH = 7.0) + 150 mM NaCl 완충액에 의해 컬럼으로부터 rAAV-1 벡터를 용리시켰다. 도 4는 280 nm에서의 UV 흡광도 (A280)의 전형적인 분광광도계 기록 및 CHT I 크로마토그래피 절차에 대한 전도율을 도시한다. 도 5는 아파타이트 수지로부터 용리된 rAAV 벡터의 상대적 순도를 도시한다.
아파타이트 크로마토그래피에 의한 글루칸 제거
글루칸은, 생성 배양물으로부터 rAAV-1 입자를 수득하는데 사용된 셀룰로스-기재 심부 필터로부터 공정 내로 걸러지는, 셀루로스와 유사한 탄수화물이다. 약 1 ng/mL 초과 농도의 글루칸은 박테리아 엔도톡신 오염에 대한 표준 리물러스 아모에보사이트 용해물(Limulus amoebocyte lysate, "LAL") 시험을 방해할 수 있다. 하기 표 4에서 입증된 바와 같이, 아파타이트 CHT 유형 I 컬럼은 생성 배양물으로부터 약 2.5 로그의 글루칸을 제거하였다. 본원에 기재된 완충액 조건 하에서, 대다수의 글루칸은 통과 유동 중에 존재하며 컬럼에 결합하지 않았다.
Figure pct00003
글루칸에 특이적인 LAL-기재 역학 발색성 검정 (글루카텔(Glucatell)®, 매사추세츠주 케이프 코드 소재)을 사용하여 샘플을 글루칸에 대해 검정하였다.
아파타이트 크로마토그래피에 의한 Ad5 헬퍼 바이러스 제거
CHT 크로마토그래피가 공급 스트림으로부터 Ad5를 제거한다는 것을 확인하기 위해, 최종 상류 공정으로부터의 공급 스트림을 사용하여 예비 스파이크-인 연구를 수행하였다. Ad5 스파이크 수준은 CFT II 수지를 이용한 단계 I 바이러스 제거 연구로부터 수득한 데이타를 기준으로 하였으며, 3개의 상이한 공급 스트림 로드 비를 사용하였다: CHT 수지 1 mL 당 TFF-후 공급 스트림 6.6 mL; 13.5 mL; 및 33 mL.
하기 표 5에 제시된 데이타, CHT에 의한 Ad5 제거는 4 LRV 제거와 필적하였으며, 대략 4 로그의 Ad5 바이러스 제거를 입증하였고, 평가된 5배 범위 이내에서는 로딩된 공급 스트림의 부피에 관계없는 것으로 나타났다. 낮은 Ad5 회수는 이전의 데이타와 일치하며, 이는 이용된 완충액 조건 하에서 Ad5가 아파타이트 수지에 대해 rAAV-1 보다 단단하게 결합함을 나타낸다.
Figure pct00004
전체 8x109개의 감염성 Ad5 입자 (즉, P:I 약 10인 전체 입자)를 여러 부피의 TFF-후 공급 스트림에 가하여 1.2 mL CHT 컬럼 상에서 전개시켰다. 컬럼을 100 cm/hr로 전개시키고, 분획물을 수집하여 DRP에 의해 벡터를 검정하고 감염성 적정 검정에 의해 Ad5를 검정하였다. 로드 및 CHT 용리 샘플 모두의 고 농도는 세포-기재 검정을 방해하는 것으로 알려져 있기 때문에 스파이크-제어된 버젼의 Ad5 감염성 검정을 사용하였다. Ad5 제거는, 로딩된 Ad5의 전체 양을 용리 분획물 중에 회수된 Ad5의 전체 양으로 나눈 로그 (로그 감소 값)로서 계산된 로그 감소 값 ("LRV")으로서 결정하였다.
실시예 8: 잔류 헬퍼 바이러스의 열 불활성화
열 불활성화 단계를 수행하여 CHT I 용리물에 존재하는 임의의 잔류 헬퍼 바이러스를 불활성화 및 제거시켰다. 보다 작은 규모의 실험을 위해, CHT I 용리물을 2개의 1 L PETG (날젠(Nalgene)®) 병에 나누고, MgCl2를 최종 농도 2 mM로 첨가하여 rAAV-1 벡터의 안정성을 증가시켰다. 병을 53.5℃ 수조에서 혼합하면서 병 내의 온도가 대략 52℃에 도달할 때까지 인큐베이션하였다. 이어서, 병을 주변 온도의 수조에 옮겨 냉각시키고, 병 내의 온도가 주변 온도보다 5℃ 이하로 높을 때까지 혼합하였다. 히트-킬 혼합물을 4-인치 옵티캡® 0.22 μM 필터 멤브레인 (밀리포어 옵티캡® 카탈로그 번호 KVSC04HB3)을 통해 여과시켰다. 별법으로, 보다 큰 규모의 실험을 위해, CHT I 용리물을 40 RPM의 진동 속도 및 12°의 혼합 각 (20 L 웨이브 히터 팬)에서 53℃의 온도 설정점을 갖는 온도 제어된 진동 플랫폼 상에서 멸균된 단일 용도의 생물처리 백 (커스텀 하이클론(Custom Hyclone) 5 L 백, CX5-14 필름) 내에서 열 불활성화시켰다. CHT I 용리물을 온도가 52℃에 도달할 때까지 플랫폼 상에서 인큐베이션시킨 다음, 추가의 10분 동안 유지시켰다. 가열 동안 rAAV-1을 안정화시키기 위해, MgCl2를 최종 농도 2 mM로 첨가하였다. 가열 후, 생성물을 0.2 μm 필터를 통해 여과시키고, 주변 온도에서 밤새 유지시켜 이후의 소수성 상호작용 컬럼에 대한 가능한 온도 효과를 최소화하였다.
실시예 9: 소수성 상호작용 크로마토그래피 ("HIC")를 통한 rAAV-1 포획
HIC는 생물분자를 그들의 표면 소수성 차이에 기초하여 분리하는 기술이다. 따라서, HIC는 rAAV-1 공정에서 다른 정제 단계에 대한 직교 방법으로 간주된다. HIC 매질은 소수성 리간드, 예컨대 선형 쇄 탄화수소 (예를 들어, 프로필 (C3), 부틸 (C4), 헥실 (C6), 또는 옥틸 (C8)) 또는 방향족 탄화수소 (예를 들어, 페닐)를 함유한다. 순수 물에서, 소수성 효과는 리간드와 단백질, 또는 단백질 자체 사이의 기능적 상호작용에 대해 매우 약하다. 그러나, 액방성 염은 소수성 상호작용을 증진시키고, 그러한 염의 부가는 HIC 매질에 대한 단백질의 흡착을 촉진한다. 이러한 이유로, HIC 수지는 통상 높은 염 농도 하에 로딩되고, 보다 낮은 염 농도에서 용리된다.
암모늄 술페이트 완충액을 이용한 HIC 크로마토그래피
요컨대, 170 ml (6 cm 직경 x 6 cm 베드 높이) HIC 부틸 컬럼 (토요펄(Toyopearl)® 부틸 650M; 토소 바이오사이언시즈(Tosoh Biosciences), 펜실베니아주 몽고메리빌 소재; 카탈로그 번호 14702)을 여러 컬럼 부피의 0.5 M NaOH로 소독하고, 2 M 암모늄 술페이트 + 50 mM 비스 트리스 (pH = 7.0):50 mM 비스 트리스 (pH = 7.0)의 75:25 (부피:부피) 혼합물로 평형화시켰다. 히트 킬 rAAV-1 벡터 아파타이트 용리물을 75:25 (부피:부피) 비의 2 M 암모늄 술페이트 + 50 mM 비스 트리스 (pH = 7.0):rAAV-1 아파타이트 용리물로 인-라인 혼합하면서 3.3 L/hr의 속도로 로딩하였다. 인-라인 혼합은 완충액에 존재하는 암모늄 술페이트에 의한 임의의 rAAV-1 벡터 침전의 위험을 방지한다. 컬럼을 1 이상의 컬럼 부피의 75:25 (부피:부피)의 2 M 암모늄 술페이트 + 50 mM 비스 트리스 (pH = 7.0) 완충액:50 mM 비스 트리스 (pH = 7.0) + 10％ 프로필렌 글리콜 (부피:부피) (EMD 바이오사이언시즈) 완충액으로 세척하였다. 이 샘플 중 프로필렌 글리콜을 완충액에 첨가하여 (공정 중 임의적이지만), 프로필렌 글리콜이 없는 완충액의 광범위한 용리 프로파일에 비해 용리 프로파일을 뚜렷하게 하였다. rAAV-1 벡터를 800 mM 암모늄 술페이트 + 50 mM 비스 트리스 (pH = 7.0) 완충액 + 4％ 프로필렌 글리콜을 갖는 컬럼으로부터 용리시켰다. 이용된 용리 조건에서, 로드에 존재하는 임의의 잔류 헬퍼 바이러스 및 단백질은 컬럼에 결합한 채로 남아있을 것이다.
rAAV-1 생성 공정으로부터의 폐기물은, 생성물이 바이러스 벡터인 점 및 생성을 위한 헬퍼 바이러스로서 살아있는 아데노바이러스 유형 5 (Ad5)를 사용한다는 점 둘 다로 인해, 처분 전에 엄격한 정화를 필요로 한다. 크로마토그래피 작업으로부터의 액체 폐기물은 전형적으로는, 사용 시점에 표백제로 먼저 정화된 다음, 중화 및 처분 전 고 pH에서 유지시켜 추가로 정화된다. HIC 완충액에 존재하는 암모늄 술페이트는 표백제 및 수산화나트륨 둘 다와 반응하여 각각 유해한 염소 및 암모니아 가스를 방출시킨다. 따라서, HIC 크로마토그래피 단계의 공정 최적화를 위한 주요 고려사항은 당업계에 공지된 방법에 의해 안전하게 정화될 수 있는 적합한 완충 시스템을 개발하는 것이었다.
HIC 컬럼에 대한 rAAV-1 결합에 적합한 완충액의 스크리닝
rAAV-1 벡터를 여러 상이한 완충액 조건 하의 컬럼 상에 로딩하고, 통과 유동 분획물에 존재하는 rAAV-1 벡터의 양을 측정함으로써 상대적 결합 효율을 결정하였다 (표 6). 평가된 완충액은 HIC 크로마토그래피 공정에 통상적으로 이용되는 고 농도 액방성 염 및 여러 저 pH 완충액 둘 다를 포함하였으며, 이때 혼합-모드 상호작용 (HIC/양이온 교환)이 잠재적으로 일어날 수 있다. 토소 부틸 650M 및 EMD 페닐 수지 둘 다 여러 다른 완충액에서 벡터에 결합하였다.
소수성 상호작용 크로마토그래피에 사용된 고 염 농도를 갖는 완충액은 점도 문제에 대해 추가로 스크리닝되어야 하며, 점도 문제는 높은 배압을 생성하여 유속을 제한할 수 있거나 또는 완충액의 저장 또는 작업 온도에서의 염 결정화로 인한 생성물 침전 위험 및 혼합 문제를 야기할 수 있다. 하기 표 6에서의 데이타를 기준으로, 그리고 상기 기재된 인자를 고려한 후, HIC 크로마토그래피 매질에 대한 rAAV-1 벡터의 결합을 위한 최적의 완충액으로서 1 M 시트르산나트륨 (pH = 7.0)을 선택하였다.
Figure pct00005
주변 온도에서 정제된 rAAV-1 벡터를 사용하여 트리콘 5/50 컬럼 (6 cm 베드 높이, 1.2 mL 컬럼 부피) 상에서 실험을 수행하였다. 컬럼을 나열된 완충액으로 평형화시키고, 약 2x1011 DRP 또는 rAAV-1을 컬럼 상에 로딩하였다. rAAV-1을 145 mM 비스 트리스 (pH = 7.0), 10％ (v/v) 프로필렌 글리콜로부터 20 CV 선형 구배에 걸쳐 용리시켰다. 통과 유동물을 수집하고, 통과 유동하거나 결합하지 않은, 컬럼에 적용된 rAAV-1의 분획물에 대해 DRP 분석으로 검정하였다.
이전의 실험에서 rAAV-1의 양호한 결합을 입증한 다양한 완충액 하에 HIC 컬럼 상에서의 공정 중 불순물의 제거에 대한 추가의 특성화를 수행하였다. 오염물 결합 모델에 대한 하기 표 7에서의 데이타는 공급 스트림 중의 아데노바이러스 및 DNA (존재하는 경우) 모두가 HIC 크로마토그래피 단계에 의해 효과적으로 구별됨을 입증한다.
Figure pct00006
주변 온도에서 트리콘 5/50 컬럼 (6 cm 베드 높이, 1.2 mL 컬럼 부피) 상에서 실험을 수행하였다. 컬럼을 나열된 완충액으로 평형화시키고, 나타낸 샘플을 컬럼 상에 로딩하였다. 각각의 샘플을 20 CV 선형 구배에 걸쳐 용리시켰다. 샘플을 수집하고, 관련 로드 물질에 대해 검정하였다.
시트르산나트륨 완충액을 이용한 HIC 크로마토그래피
히트-킬 rAAV-1 벡터 아파타이트 용리물을 이후 HIC 부틸 컬럼 상에 로딩하여 농축 및 탈염 단계로서 임의의 잔류 공정 불순물을 추가로 감소시켰다. 373 ml (6 cm 직경 x 8.9 cm 베드 높이) HIC 부틸 컬럼 (토소 바이오사이언시즈 토요펄® 부틸 650M 카탈로그 번호 14702)을 여러 컬럼 부피의 0.5 M NaOH로 소독하고, 5 CV의 1 M 시트르산염 + 20 mM 인산나트륨:20 mM 인산나트륨의 75:25 (부피:부피) 혼합물로 평형화시켰다. 히트-킬 rAAV-1 벡터 CHT I 용리물을 75:25 (부피:부피) 비의 1 M 시트르산염 + 20 mM 인산나트륨:CHT I 용리물으로 인-라인 혼합하면서 106 cm/hr의 속도로 로딩하였다. 인-라인 혼합은 임의의 rAAV-1 벡터 침전의 위험을 방지한다. 컬럼을 5 CV의 1 M 시트르산염 + 20 mM 인산나트륨:20 mM 인산나트륨 완충액의 75:25 (부피:부피) 혼합물로 세척하였다. rAAV-1 벡터를 6 CV의 0.35 M 시트르산염 + 20 mM 인산나트륨을 갖는 컬럼으로부터 용리시켰다. 이어서, 컬럼을 3.5 CV의 20 mM 인산나트륨 완충액으로 세척하였다. 이러한 저 염 세척 (20 mM 나트륨)은, 보다 높은 염 용리 완충액에서 용리된 rAAV-1 벡터 입자로부터의 용리 프로파일과 소수성 측면에서 구별되는 rAAV-1 벡터 입자의 분획물을 용리시킨다. 실제로, 저 염 용리된 분획물을 단리하고, 기재된 조건 하에서 HIC 컬럼에 재적용하는 경우, 상기 벡터 집단은 여전히 저 염 분획물로만 용리되는데, 이는 분획물이 컬럼의 용량을 파과하지 않았음을 나타낸다. 감염성 분석은, 이러한 rAAV-1 분획물이 마치 중공 캡시드, 부분 변성 캡시드, 보다 약한 감염성의 캡시드 물질, 및 부분 완전 캡시드를 포함하는 집단을 나타냄을 시사한다. 따라서, 이러한 관찰은 보다 약한 감염성이므로 생성 물질로서 덜 바람직한 rAAV-1 입자의 분리를 개선시킬 수 있다. 이용된 용리 조건에서, 로드에 존재하는 임의의 잔류 헬퍼 바이러스 및 단백질은 컬럼에 결합된 채로 남아있으므로 저 염 스트립에 존재할 것이다.
실시예 10: 크기 배제 크로마토그래피 ("SEC")에 의한 완충액 교환
크기 배제 크로마토그래피에 의한 완충액 교환은 수지 내 기공을 통과하도록 크기조정된 단백질의 추가 단백질 제거를 제공하며, 완충액을 교환하는데 필요한 시간의 관점에서 비교적 신속하다. 이 단계에서 수행된 완충액 교환은, 이전 단계의 HIC 용리물이 공정 중 최종 음이온 교환 크로마토그래피 단계에의 rAAV-1 결합을 위한 적절한 완충액으로 교환되도록 보장하였다. 3.2 L (14 cm 직경 x 21 cm 베드 높이) 아머샴 수퍼덱스® 200 제조 등급 수지 (아머샴/지이 헬쓰케어, 뉴저지주 피스카타웨이 소재; 카탈로그 번호 17-1043-04)를 팩킹하였으며, 2 M NaCl + 1 M NaOH로 소독하고 2.8 CV의 20 mM NaCl + 20 mM 트리스 (pH = 8.0)로 평형화시켜 제조하였다. HIC 용리를 SEC 상에서 각각 대략 400 ml의 3개의 순차적 사이클로 처리하도록 세분하고, 각 사이클에 대해 12.5％ 이하의 SEC 컬럼 부피를 로딩하였다. 3개의 SEC 사이클로부터의 생성물 피크 (틈새 부피에 함유됨)를 단일 생물처리 백에 수집하였다. HIC 용리물을 49 cm/hr의 유속으로 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 추적하고, 1.4 CV의 20 mM NaCl + 20 mM 트리스 (pH = 8.0)로 플러슁하였으며, HIC 용리물에 존재하는 rAAV-1 벡터는 컬럼의 틈새 부피에 존재하였다. 기재된 바와 같은 틈새 부피의 수집 후, 제2 및 제3 분획물을 제1 분획물에 대해 상기 기재된 바와 같이 순차적으로 동일한 컬럼 상에서 로딩 및 수집하였다.
실시예 11: 외래 물질 (바이러스 제거)
미량의 오염물로서 존재할 수 있는 외래 바이러스를 제거하여 상업적으로 적당한 직교 공정을 생성하기 위한 임의적 공정으로서, 바이러스 제거 필터를 공정 중에 도입하였다. 이러한 필터의 예는 당업계에 공지되어 있으며, 밀리포어 바이어솔브® NFR (50 nm), 폴 얼티포어® VF (50 nm), 및 아사히 70 nm를 포함한다. 밀리포어 바이어솔브® NFR (밀리포어 4" 바이어솔브 NFR 필터 카탈로그 번호 KZRV 04T C3) 바이러스 제거 필터를 제조자 설명서에 따라 제조하고, 20 mM NaCl + 20 mM 트리스 (pH = 8.0)로 플러슁하고, SEC 용리물을 멤브레인을 통해 여과하였다. 필터를 여러 부피의 20 mM NaCl + 20 mM 트리스-HCl (pH 8.0)로 플러슁하고, 여과된 SEC 용리물을 모았다.
실시예 12: 음이온 교환 크로마토그래피
rAAV-1 벡터에 대한 제2 음이온 교환 포획 단계를 최종 농축 및 연마 단계로서 우노스피어® 큐 수지 (바이오라드, 캘리포니아주 허큘러스 소재) 상에서 수행하였다. 373 ml (8.9 cm 직경 x 6 cm 베드 높이) 컬럼을 여러 컬럼 부피의 0.5 M NaOH로 소독하고, 7 CV의 20 mM NaCl + 20 mM 트리스 (pH = 8.0) 완충액으로 평형화시켰다. SEC 틈새 부피 분획물 또는 임의로 바이러스 여과된 용리물을 309 cm/hr의 속도로 로딩하였다. 컬럼을 10 CV의 60 mM NaCl로 세척하였다. 세척 용액의 이온 농도는, 정제 단계 동안 이용된 다양한 필터로부터 걸러져 도입될 수 있는 글루칸과 같은 임의의 다른 공정 중 불순물을 제거하면서 수지에 결합된 rAAV-1을 보유하도록 선택되었다. rAAV-1 벡터를 6 CV의 130 mM NaCl을 갖는 컬럼으로부터 용리시켰다. 130 mM NaCl 염 용리의 이온 농도는, 혈청 알부민 또는 헬퍼 바이러스와 같은 임의의 잔류 미량 공정 중 불순물을 결합시킨 채로 유지하면서 컬럼으로부터 rAAV-1을 제거할 것이다.
도 6은 SDS-PAGE에 의해 다양한 공정 단계를 통한 정제의 정도를 비교한다. 대표적인 생성 배양 수득물로부터의 공정 중 샘플을 변성/환원 10％ 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전개시키고, 시프로 오렌지(Sypro Orange)로 염색하였다. 모든 수득-후 샘플을 1x1010 DRP/레인으로 로딩하였다. TFF 농축 단계 전 2개의 상류 샘플 (초기 정화 단계 및 음이온 교환 ("AEX") 통과 유동)은 겔 상의 부피 제한으로 인해 1x109 DRP/레인으로만 로딩할 수 있었다. 베타-갈락토시다제 (B-Gal)를 50 ng/레인으로 로딩하여 겔을 통한 염색의 민감성 및 일관성을 평가하였다. 3개의 AAV1 캡시드 단백질 (VP1, 2, 및 3)이 나타내어진다.
실시예 13: 정제 동안 rAAV의 회수율(％)
도 7에 제시된 데이타는, rAAV-1 벡터의 대표적인 생성 배양으로부터의 정제 계획의 각 공정 단계 후 감염성 rAAV 입자의 회수율(％)을 도시한다. 회수율(％)은 각 공정 단계로부터 회수된 rAAV-1 벡터의 전체 DRP를 상기 정제 단계에 로딩 또는 제공된 DRP의 전체 수로 나눈 것을 기준으로 계산하였다. 데이타는 정제 공정 중 각 단계에서 대략 60％ 이상의 회수율이 달성되었음을 입증한다. 수많은 실험에서, 각 공정 단계로부터의 회수 범위는 적어도 60％ 내지 90％이었다. 특히 주목할만한 것은, 개별 실험에서 포획 단계 (즉, 아파타이트 크로마토그래피 단계)의 회수 범위가 57％ 내지 90％ 초과였다. 또한, HIC 단계의 회수 범위는 60％ 내지 80％였다.
상기 발명은 이해의 명확화를 위해 예시 및 실시예를 통해서 일부 상세하게 기재되었지만, 특정 소수의 변화 및 변형이 실시될 것임은 당업자에게 자명하다. 따라서, 상세한 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

Claims (42)

  1. (a) 재조합 아데노-연관 바이러스 (adeno-associated virus) (rAAV) 입자를 함유한 공급 스트림 (feedstream)을 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 존재 하의 아파타이트 (apatite) 크로마토그래피 매질과 접촉시키되, 여기서 rAAV 입자가 아파타이트 크로마토그래피 매질에 결합하는 것인 단계; 및
    (b) 아파타이트 크로마토그래피 매질에 결합된 rAAV 입자를 3％ (w/v) 미만의 PEG를 함유한 용리 완충액으로 용출시키는 단계
    를 포함하는, 공급 스트림 내의 공정 중 (in-process) 불순물로부터 rAAV 입자 집단을 단리시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 아파타이트 크로마토그래피 매질이 세라믹 히드록시아파타이트 (ceramic hydroxyapatite; CHT)인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 아파타이트 크로마토그래피 매질이 세라믹 플루오로아파타이트 (ceramic fluoroapatite; CFT)인 방법.
  4. 제1항에 있어서, rAAV 입자에 대한 아파타이트 크로마토그래피 매질의 특이적 결합이 밀리리터당 1014 내지 1016개 DNase-저항성 입자 (DRP/mL)인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 용출시킨 공급 스트림 내 rAAV 입자를 음이온성 크로마토그래피 매질에 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서의 rAAV 입자를 함유한 공급 스트림이 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 염기성 완충액의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 염기성 완충액의 pH가 7.6 내지 10인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 염기성 완충액의 pH가 8.0 내지 10.0인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 염기성 완충액의 pH가 9.0 내지 10.0인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 염기성 완충액이 붕산염을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, PEG의 평균 분자량이 약 5,000 (PEG5000) 그램/몰 내지 약 15,000 (PEG15000) 그램/몰인 방법.
  12. 제11항에 있어서, PEG의 평균 분자량이 약 6,000 (PEG6000) 그램/몰인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서의 rAAV 입자를 함유한 공급 스트림이 약 3％ (w/v) 내지 약 10％ (w/v) PEG의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 공급 스트림이 약 5％ (w/v) PEG6000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉되는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 공급 스트림이 약 10％ (w/v) PEG6000의 존재 하의 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 공급 스트림을 아파타이트 크로마토그래피 매질과 접촉시킨 후, 아파타이트 크로마토그래피 매질로부터 rAAV 입자를 용출시키기 전에, 아파타이트 크로마토그래피 매질을 세척 완충액으로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 아파타이트 크로마토그래피 매질이 약 7.5％ (w/v) PEG를 함유한 세척 완충액 및/또는 약 5％ (w/v) PEG를 함유한 세척 완충액으로 1회 이상 세척되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 아파타이트 크로마토그래피 매질이 약 3％ (w/v) 미만의 PEG를 함유한 세척 완충액 및/또는 PEG를 함유하지 않은 세척 완충액으로 추가로 세척되는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 세척 완충액이 붕산염, N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES), 및 트리스(Tris)-HCl로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액을 포함하는 것인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 세척 완충액이 염기성 pH를 갖는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 세척 완충액이 약 8.0 내지 약 10.0의 pH의 붕산염을 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 세척 완충액이 약 8.0의 pH의 붕산염을 포함하는 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 세척 완충액이 약 9.0의 pH의 붕산염을 포함하는 것인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 세척 완충액이 약 10.0의 pH의 붕산염을 포함하는 것인 방법.
  25. 제20항에 있어서, 세척 완충액이 100 내지 500 mM의 인산염을 추가로 포함하는 것인 방법.
  26. 제20항에 있어서, 세척 완충액이 50 내지 250 mM의 NaCl을 추가로 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항에 있어서, 아파타이트 크로마토그래피 매질에 결합된 rAAV 입자가 저농도의 PEG를 함유하거나 또는 PEG 부재 하의 용리 완충액으로 용출되는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 용리 완충액이 중성 pH의 붕산염, N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES), 및 트리스-HCl로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액을 포함하는 것인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 용리 완충액이 약 3％ (w/v) 미만의 PEG6000을 함유하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 용리 완충액이 100 mM 미만의 인산염을 추가로 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 용리 완충액이 50 mM의 인산염을 추가로 포함하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 용리 완충액이 50 내지 250 mM의 NaCl을 추가로 포함하는 것인 방법.
  33. (a) 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 입자를 함유한 공급 스트림을 고농도 염 완충액 중의 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 매질과 접촉시키되, 여기서 rAAV 입자 및 공정 중 불순물이 HIC 매질에 결합하는 것인 단계; 및
    (b) HIC 매질에 결합된 rAAV 입자를 중간농도 염 완충액으로 용출시키는 단계
    를 포함하는, 공급 스트림 내 공정 중 불순물로부터 rAAV 입자 집단을 단리시키는 방법.
  34. 제33항에 있어서, HIC 매질이 토소 부틸 (Tosoh Butyl) 650M, 토소 수퍼부틸 (Tosoh SuperButyl) 650C, 토소 페닐 (Tosoh Phenyl) 650C, EMD 프락토겔 페닐 (Fractogel Phenyl), 및 토소 하스(부틸) (Tosoh Has(butyl)) 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 고농도 염 완충액이 약 0.5 M 내지 약 2.0 M의 시트르산염을 포함하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 고농도 염 완충액이 약 1 내지 약 100 mM의 인산염을 추가로 포함하는 것인 방법.
  37. 제33항에 있어서, 중간농도 염 완충액이 0.5 M 미만의 시트르산염을 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 중간농도 염 완충액이 약 1 내지 약 100 mM의 인산염을 추가로 포함하는 것인 방법.
  39. 제37항에 있어서, 중간농도 염 완충액이 0.2 M 내지 0.5 M의 시트르산염을 포함하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 중간농도 염 완충액으로의 용출 후에 HIC 매질에 중공 캡시드 (empty capsid), 부분 변성 캡시드, 보다 약한 감염성의 캡시드 물질, 및/또는 부분적으로 완전한 (partially full) 캡시드를 가진 rAAV 입자 집단이 결합되는 것인 방법.
  41. 제1항 또는 제33항에 있어서, rAAV 입자가 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 및 AAV-16으로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, rAAV 입자가 AAV-1, AAV-4, AAV-5, 및 AAV-8로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 것인 방법.
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