JP7385603B2 - 組換えaav生成のためのアニオン交換クロマトグラフィー - Google Patents
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Description
本出願は、2018年6月14日出願の米国仮出願第62/684,835号の優先権を主張し、当該出願の全体は本明細書に援用される。
組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベースベクターは、現在最も広く使用されている開発中の遺伝子療法製品である。rAAVベクター系の使用が好まれる理由は、部分的には、野生型ウイルスに関連する疾患がないこと、AAVの形質導入が非***細胞にも***細胞にも可能であること、及び臨床試験で結果的に長期のロバストな導入遺伝子発現が観察されていることによるものであり、このことは、遺伝子療法の適応症における送達の大きな可能性を示している。加えて、種々の天然及び組換えrAAVベクター血清型は、種々の組織、器官、及び細胞を特異的に標的とし、ベクターに対する任意の既存の免疫を回避するのに役立ち、そのためAAVベース遺伝子療法の治療応用を拡大する。
1つの態様において、本開示は、組換えAAV(rAAV)粒子及び不純物(例えば、空の/充填不完全なウイルスカプシドまたはウイルス凝集体)を含むフィード組成物(例えば、rAAVアフィニティークロマトグラフィーカラムの溶出液)からrAAV粒子を単離するための方法を提供し、これは、当該組成物をアニオン交換クロマトグラフィー樹脂(例えば、4級アミンリガンドを含むモノリスアニオン交換クロマトグラフィー樹脂またはAEX樹脂)に接触させ、単離されたrAAV粒子を含む生成物組成物を回収することによって行われる。
[1.]組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を、rAAV粒子及び不純物を含むフィード組成物から単離するための方法であって、
(a)前記フィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、rAAV粒子が前記クロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、
(b)直線勾配を用いて前記クロマトグラフィー媒体から前記rAAV粒子を溶出すること、及び
(c)溶出された前記rAAV粒子を含む溶出液を回収すること
を含み、
(i)前記不純物が、空のウイルスカプシド、充填不完全なウイルスカプシド、及び/またはウイルス凝集体を含み、
(ii)前記方法が、以下:
a.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のMg2+濃度を有すること、
b.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のK+濃度を有すること、
c.前記フィード組成物が、約6.5から約10.5の間のpHを有すること、
d.前記溶出することが、0.1CV/分から5CV/分の間の流量で行われること、及び
e.前記直線塩勾配が、約5から約100CVの間の体積を含むこと
のうちの1つ以上によって特徴づけられる、方法。
[2.]以下:
a.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のMg2+濃度を有すること、
b.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のK+濃度を有すること、
c.前記フィード組成物が、約6.5から約10.5の間のpHを有すること、
d.前記溶出することが、0.1CV/分から5CV/分の間の流量で行われること、及び
e.前記直線塩勾配が、約5から約100CVの間の体積を含むこと
のうちの2つ以上によって特徴づけられる、[1]に記載の方法。
[3.]以下:
a.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のMg2+濃度を有すること、
b.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のK+濃度を有すること、及び
c.前記フィード組成物が、約6.5から約10.5の間のpHを有すること
によって特徴づけられる、[1]に記載の方法。
[4.]以下:
a.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のMg2+濃度を有すること、
b.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のK+濃度を有すること、
c.前記フィード組成物が、約6.5から約10.5の間のpHを有すること、
d.前記溶出することが、0.1CV/分から5CV/分の間の流量で行われること、及び
e.前記直線塩勾配が、約5から約100CVの間の体積を含むこと
によって特徴づけられる、[1]に記載の方法。
[5.]
a.前記フィード組成物が、約0.5mMから約10mMの間のMg2+濃度を有し、
b.前記フィード組成物が、約0.5mMから約10mMの間のK+濃度を有し、
c.前記フィード組成物が、約7.0から約10.2の間のpHを有し、
d.前記溶出することが、0.2CV/分から5CV/分の間の流量で行われる、
[1]~[4]のいずれか1つに記載の方法。
[6.]アニオン交換クロマトグラフィー中における、空のまたは充填不完全な組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子と完全rAAV粒子との分離を改善するための方法であって、
(a)空のrAAV粒子、充填不完全なrAAV粒子、及び完全rAAV粒子を含むフィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、前記rAAV粒子が前記クロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、
(b)直線勾配を用いて前記クロマトグラフィー媒体から前記rAAV粒子を溶出すること、ならびに
(c)溶出された前記rAAV粒子を含む溶出液を回収すること
を含み、
以下:
a.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のMg2+濃度を有すること、
b.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のK+濃度を有すること、
c.前記フィード組成物が、約6.5から約10.5の間のpHを有すること、
d.前記溶出することが、0.1CV/分から5CV/分の間の流量で行われること、及び
e.前記直線塩勾配が、約5から約100CVの間の体積を含むこと
のうちの1つ以上によって特徴づけられる、前記方法。
[7.]アニオン交換クロマトグラフィー中における、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子とウイルス凝集体との分離を改善するための方法であって、
(a)rAAV粒子及びウイルス凝集体を含むフィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、前記rAAV粒子が前記クロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、
(b)直線勾配を用いて前記クロマトグラフィー媒体から前記rAAV粒子を溶出すること、ならびに
(c)溶出された前記rAAV粒子を含む溶出液を回収すること
を含み、
以下:
a.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のMg2+濃度を有すること、
b.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のK+濃度を有すること、
c.前記フィード組成物が、約6.5から約10.5の間のpHを有すること、
d.前記溶出することが、0.1CV/分から5CV/分の間の流量で行われること、及び
e.前記直線塩勾配が、約5から約100CVの間の体積を含むこと
のうちの1つ以上によって特徴づけられる、前記方法。
[8.]以下:
a.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のMg2+濃度を有すること、
b.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のK+濃度を有すること、
c.前記フィード組成物が、約6.5から約10.5の間のpHを有すること、
d.前記溶出することが、0.1CV/分から5CV/分の間の流量で行われること、及び
e.前記直線塩勾配が、約5から約100CVの間の体積を含むこと
のうちの2つ以上によって特徴づけられる、[6]または[7]に記載の方法。
[9.]以下:
a.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のMg2+濃度を有すること、
b.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のK+濃度を有すること、
c.前記フィード組成物が、約6.5から約10.5の間のpHを有すること、
d.前記溶出することが、0.2CV/分から5CV/分の間の流量で行われること、及び
e.前記直線塩勾配が、約5から約100CVの間の体積を含むこと
によって特徴づけられる、[6]または[7]に記載の方法。
[10.]以下:
a.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のMg2+濃度を有すること、
b.前記フィード組成物が、約0.1mMから約20mMの間のK+濃度を有すること、及び
c.前記フィード組成物が、約6.5から約10.5の間のpHを有すること
によって特徴づけられる、[6]または[7]に記載の方法。
[11.]以下:
a.前記フィード組成物が、約0.5mMから約10mMの間のMg2+濃度を有すること、
b.前記フィード組成物が、約0.5mMから約10mMの間のK+濃度を有すること、及び
c.前記フィード組成物が、約6.5から約10.5の間のpHを有すること
によって特徴づけられる、[6]または[7]に記載の方法。
[12.]前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、4級アミン官能基を含む、[1]~[11]のいずれか1つに記載の方法。
[13.]前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、モノリスアニオン交換クロマトグラフィーである、[1]~[11]のいずれか1つに記載の方法。
[14.]前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、4級アミン官能基を含むモノリスアニオン交換クロマトグラフィーである、[1]~[11]のいずれか1つに記載の方法。
[15.]前記直線塩勾配が、約0から500mMの間のNaClを含む、[1]~[14]のいずれか1つに記載の方法。
[16.]前記直線塩勾配が、約0から200mMの間のNaClを含む、[1]~[14]のいずれか1つに記載の方法。
[17.]溶出することの前に、結合した前記rAAV粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含む、[1]~[16]のいずれか1つに記載の方法。
[18.]溶出することの前に、結合した前記rAAV粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、約0.1mMから約20mMの間のMg2+を含む、[1]~[16]のいずれか1つに記載の方法。
[19.]溶出することの前に、結合した前記rAAV粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、約0.1mMから約20mMの間のK+を含む、[1]~[16]のいずれか1つに記載の方法。
[20.]溶出することの前に、結合した前記rAAV粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、約0.1mMから約20mMの間のMg2+及び約0.1mMから約20mMの間のK+を含む、[1]~[16]のいずれか1つに記載の方法。
[21.]溶出することの前に、結合した前記rAAV粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、8mMのMgCl2及び2.5mMのKClを含む、[1]~[16]のいずれか1つに記載の方法。
[22.]前記フィード組成物を前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体に接触させる前に、前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、8mMのMgCl2及び2.5mMのKClを含む緩衝液で平衡化されている、[1]~[21]のいずれか1つに記載の方法。
[23.]前記rAAV粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15、及びAAV-16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、及びAAV.HSC16から選択されるAAVからのカプシドタンパク質を含む、[1]~[22]のいずれか1つに記載の方法。
[24.]前記rAAV粒子が、AAV-8またはAAV-9血清型のカプシドタンパク質を含む、[1]~[22]のいずれか1つに記載の方法。
[25.]前記フィード組成物が、約8.2から約9.5の間のpHを有する、[1]~[24]のいずれか1つに記載の方法。
[26.]前記rAAV粒子がAAV-8血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が8.2から8.6の間のpHを有する、または前記rAAV粒子がAAV-9血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が9.1から9.5の間のpHを有する、[1]~[22]のいずれか1つに記載の方法。
[27.]前記溶出することが、0.5CV/分から1.25CV/分の間の流量で行われる、[1]~[26]のいずれか1つに記載の方法。
[28.]前記直線塩勾配が、約30から約70CVの間の体積中0~200mMのNaClを含む、[1]~[27]のいずれか1つに記載の方法。
[29.]前記rAAV粒子が、AAV-8またはAAV-9血清型のカプシドタンパク質を含み、前記方法が、以下:
a.前記フィード組成物が、約0.5mMから約10mMの間のMg2+濃度を有すること、
b.前記フィード組成物が、約0.5mMから約10mMの間のK+濃度を有すること、
c.前記rAAV粒子がAAV-8血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が8.2から8.6の間のpHを有すること、または前記rAAV粒子がAAV-9血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が9.1から9.5の間のpHを有すること、
d.前記溶出することが、1.25CV/分から0.5CV/分の間の流量で行われること、及び
e.前記直線塩勾配が、約30から約70CVの間の体積を含むこと
のうちの2つ以上によって特徴づけられる、[1]~[22]のいずれか1つに記載の方法。
[30.]前記rAAV粒子が、AAV-8またはAAV-9血清型のカプシドタンパク質を含み、
a.前記フィード組成物が、約0.5mMから約10mMの間のMg2+濃度を有し、
b.前記フィード組成物が、約0.5mMから約10mMの間のK+濃度を有し、
c.前記rAAV粒子がAAV-8血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が8.2から8.6の間のpHを有するか、または前記rAAV粒子がAAV-9血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が9.1から9.5の間のpHを有し、
d.前記溶出することが、1.25CV/分から0.5CV/分の間の流量で行われ、及び
e.前記直線塩勾配が、約30CVから約70CVの間の体積を含む、
[1]~[22]のいずれか1つに記載の方法。
[31.]前記塩勾配が、0~200mMのNaClを含む、[29]または[30]に記載の方法。
[32.]前記フィード組成物が、2.5mMのMg2+濃度を有する、[1]~[31]のいずれか1つに記載の方法。
[33.]前記フィード組成物が、1mMのMg2+濃度を有する、[1]~[31]のいずれか1つに記載の方法。
[34.]前記フィード組成物が、1mMのK+濃度を有する、[1]~[33]のいずれか1つに記載の方法。
[35.]前記rAAV粒子が、AAV-8血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が、約8.4のpHを有する、[1]~[34]のいずれか1つに記載の方法。
[36.]前記rAAV粒子が、AAV-9血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が、約9.3のpHを有する、[1]~[34]のいずれか1つに記載の方法。
[37.]前記溶出することが、約0.5CV/分の流量で行われる、[1]~[36]のいずれか1つに記載の方法。
[38.]前記直線塩勾配が、約50CVの体積中0~200mMのNaClを含む、[1]~[37]のいずれか1つに記載の方法。
[39.]前記直線塩勾配が、約60CVの体積中0~200mMのNaClを含む、[1]~[37]のいずれか1つに記載の方法。
[40.]前記Mg2+がMgCl2である、[1]~[39]のいずれか1つに記載の方法。
[41.]前記K+がKClである、[1]~[40]のいずれか1つに記載の方法。
[42.]前記モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体が、メタクリレート、アガロースベース材料、セルロース、アクリルアミド、ポリスチレンジビニルベンゼン、またはシリカベース材料を含む、[1]~[41]のいずれか1つに記載の方法。
[43.]前記モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体が、グリシジルメタクリレート-エチレンジメタクリレートまたはスチレン-ジビニルベンゼンポリマーを含む、[1]~[41]のいずれか1つに記載の方法。
[44.]前記モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体が、グリシジルメタクリレート-エチレンジメタクリレートポリマーを含む、[43]に記載の方法。
[45.]前記モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体が、950nm~1150nmの平均細孔半径を有する、[1]~[44]のいずれか1つに記載の方法。
[46.]前記モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体が、600nm~750nmの平均細孔半径を有する、[1]~[44]のいずれか1つに記載の方法。
[47.]rAAV粒子の収率が少なくとも約40%である、[1]~[46]のいずれか1つに記載の方法。
[48.]rAAV粒子の収率が少なくとも約50%である、[1]~[46]のいずれか1つに記載の方法。
[49.]rAAV粒子の収率が少なくとも約60%である、[1]~[46]のいずれか1つに記載の方法。
[50.]rAAV粒子の収率が少なくとも約70%である、[1]~[46]のいずれか1つに記載の方法。
[51.]rAAV粒子の収率が少なくとも約75%である、[1]~[46]のいずれか1つに記載の方法。
[52.]rAAV粒子の収率が少なくとも約80%である、[1]~[46]のいずれか1つに記載の方法。
[53.]rAAV粒子の収率が少なくとも約85%である、[1]~[46]のいずれか1つに記載の方法。
[54.]rAAV粒子の収率が少なくとも約90%である、[1]~[46]のいずれか1つに記載の方法。
[55.]rAAV粒子の収率が少なくとも約95%である、[1]~[46]のいずれか1つに記載の方法。
[56.]前記不純物が、空のまたは充填不完全なウイルスカプシドを含み、前記方法が、前記空のまたは充填不完全なウイルスカプシドから前記rAAV粒子を分離する、[1]~[55]のいずれか1つに記載の方法。
[57.]前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約10%、少なくとも約20%、または少なくとも約30%がrAAV粒子である、[1]~[56]のいずれか1つに記載の方法。
[58.]前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約40%がrAAV粒子である、[1]~[56]のいずれか1つに記載の方法。
[59.]前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約50%がrAAV粒子である、[1]~[56]のいずれか1つに記載の方法。
[60.]前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約60%がrAAV粒子である、[1]~[56]のいずれか1つに記載の方法。
[61.]前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約70%がrAAV粒子である、[1]~[56]のいずれか1つに記載の方法。
[62.]前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約80%がrAAV粒子である、[1]~[56]のいずれか1つに記載の方法。
[63.]前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約90%がrAAV粒子である、[1]~[56]のいずれか1つに記載の方法。
[64.]前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約95%がrAAV粒子である、[1]~[56]のいずれか1つに記載の方法。
[65.]前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約97%がrAAV粒子である、[1]~[56]のいずれか1つに記載の方法。
[66.]前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約98%がrAAV粒子である、[1]~[56]のいずれか1つに記載の方法。
[67.]前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約99%がrAAV粒子である、[1]~[56]のいずれか1つに記載の方法。
[68.]前記フィード組成物が、以下:
(a)前記rAAV粒子を含む細胞培養物、細胞溶解物、細胞上清、またはこれらの組み合わせを含む出発組成物を準備すること、
(b)前記出発組成物を深層濾過によって清澄化して、清澄化された出発組成物を生成すること、
(c)前記清澄化された出発組成物をタンジェンシャルフロー濾過によって濃縮して、濃縮された濾液を生成すること、
(d)前記濃縮された濾液をアフィニティークロマトグラフィー媒体に接触させること、及び
(e)前記アフィニティークロマトグラフィー媒体から前記rAAV粒子を回収して、前記フィード組成物を生成すること
によって生成される、[1]~[67]のいずれか1つに記載の方法。
[69.]前記フィード組成物が、以下:
(a)前記rAAV粒子を含む細胞培養物、細胞溶解物、細胞上清、またはこれらの組み合わせを含む出発組成物を準備すること、
(b)前記清澄化された出発組成物をタンジェンシャルフロー濾過によって濃縮して、濃縮された濾液を生成すること、
(c)前記濃縮された濾液をアフィニティークロマトグラフィー媒体に接触させること、及び
(d)前記アフィニティークロマトグラフィー媒体から前記rAAV粒子を回収して、前記フィード組成物を生成すること
によって生成される、[1]~[67]のいずれか1つに記載の方法。
[70.]前記出発組成物が細胞培養物を含み、前記細胞培養物が浮遊培養物または接着細胞培養物である、[68]または[69]に記載の方法。
[71.]前記浮遊培養物が、HeLa細胞、HEK293細胞、HEK293由来細胞、Vero細胞、CHO細胞、EB66細胞、またはSF-9細胞の培養物を含む、[70]に記載の方法。
[72.]前記浮遊培養物が、HEK293細胞の培養物を含む、[71]に記載の方法。
[73.]前記出発組成物が、哺乳類細胞または昆虫細胞の培養物を含む、[68]~[70]のいずれか1つに記載の方法。
[74.]前記出発組成物が、HeLa細胞、HEK293細胞、HEK293由来細胞、Vero細胞、CHO細胞、EB66細胞、またはSF-9細胞の培養物を含む、[68]~[70]のいずれか1つに記載の方法。
[75.]前記出発組成物が、約20リットルから約20,000リットルの間の体積を有する、[68]~[74]のいずれか1つに記載の方法。
[76.]前記出発組成物が、約20リットルから約5,000リットルの間の体積を有する、[68]~[74]のいずれか1つに記載の方法。
[77.]前記出発組成物が、約50リットルから約20,000リットルの間の体積を有する、[68]~[74]のいずれか1つに記載の方法。
[78.]前記出発組成物が、約50リットルから約5,000リットルの間の体積を有する、[68]~[74]のいずれか1つに記載の方法。
[79.]前記出発組成物が、約100リットルから約3,000リットルの間の体積を有する、[68]~[74]のいずれか1つに記載の方法。
[80.]前記出発組成物が、約500リットルから約3,000リットルの間の体積を有する、[68]~[74]のいずれか1つに記載の方法。
[81.]前記出発組成物が、約1,500リットルから約2,500リットルの間の体積を有する、[68]~[74]のいずれか1つに記載の方法。
[82.]前記出発組成物が、約2,000リットルの体積を有する、[81]に記載の方法。
[83.]前記出発組成物が、約1000リットルの体積を有する、[81]に記載の方法。
[84.][1]~[83]のいずれか1つに記載の方法によって生成される、単離された組換えアデノ随伴ウイルス粒子を含む、組成物。
いくつかの実施形態において、本開示は、AEXクロマトグラフィーを用いて不純物(例えば、空のウイルスカプシドまたはウイルス凝集体)を含むフィード組成物からrAAV粒子を単離するための方法と、AEXクロマトグラフィー中における空の/充填不完全な粒子からの完全rAAVウイルス粒子の分離を改善するための方法と、AEXクロマトグラフィー中におけるウイルス凝集体からの完全rAAVウイルス粒子の分離を改善するための方法とを提供する。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、4級アミンリガンドを含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、アニオン交換クロマトグラフィー媒体を使用する。いくつかの実施形態において、当該方法の生成物は、例えば、タンジェンシャルフロー濾過及び無菌濾過による、単離されたrAAV粒子を生成するためのさらなる下流処理に適している。説明される方法は、遺伝子療法用途で使用するためのrAAV粒子集団の単離に関するGMP規制要件と一致する、柔軟で費用効果が高く商業的にスケーラブルなプロセスを提供する。本明細書で説明される方法は、限定されるものではないが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15、及びAAV-16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、及びAAV.HSC16を含めた任意のrAAV血清型、ならびにこれらの派生物、修飾物、またはシュードタイプに適している。いくつかの実施形態において、当該方法は、rAAV-8粒子を単離するために使用される。いくつかの実施形態において、当該方法は、rAAV-8派生物粒子、rAAV-8修飾物粒子、またはrAAV-8シュードタイプ粒子を単離するために使用される。いくつかの実施形態において、当該方法は、rAAV-9粒子を単離するために使用される。いくつかの実施形態において、当該方法は、rAAV-9派生物粒子、rAAV-9修飾物粒子、またはrAAV-9シュードタイプ粒子を単離するために使用される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法の理解を容易にするため、以下に複数の用語及び表現を定義する。
いくつかの実施形態において、本開示は、不純物を含むフィード組成物からrAAV粒子を単離するための方法であって、フィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、rAAV粒子がクロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、クロマトグラフィー媒体からrAAV粒子を溶出すること、ならびに単離されたrAAV粒子を含む溶出液を回収することを含み、不純物が、空のまたは充填不完全なウイルスカプシドまたはウイルス凝集体を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、rAAV粒子は、AAV-8もしくはAAV-9血清型、またはこれらの派生物もしくは修飾物のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、モノリスクロマトグラフィー媒体である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、4級アミン官能基を含む。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー材料は、4級アミンを含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約0.1mMから約20mMの間のMg2+、Ca2+、またはZn2+を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約0.5mMから約10mMの間のMg2+、Ca2+、またはZn2+を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約0.1mMから約20mMの間のMg2+を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約0.5mMから約10mMの間のMg2+を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約1mMから約2.5mMの間のMg2+を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約0.1mMから約20mMの間のK+、Rb+、またはCs+を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約0.5mMから約10mMの間のK+、Rb+、またはCs+を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約0.1mMから約20mMの間のK+を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約0.5mMから約10mMの間のK+を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、1mMのK+を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約7.0から約10.2の間、約8.2から約8.6の間、または約9.1から約9.5の間のpHを有する。いくつかの実施形態において、rAAV粒子は、AAV-8血清型、またはその派生物もしくは修飾物のカプシドタンパク質を含み、フィード組成物は、約8.2から約8.6の間のpHを有する。いくつかの実施形態において、rAAV粒子は、AAV-9血清型、またはその派生物もしくは修飾物のカプシドタンパク質を含み、フィード組成物は、約9.1から約9.5の間のpHを有する。いくつかの実施形態において、溶出は、約0.2CV/分から約5CV/分の間の流量で行われる。いくつかの実施形態において、溶出は、約0.5CV/分から約1.25CV/分の間の流量で行われる。いくつかの実施形態において、溶出は、直線塩勾配によって行われる。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約30から約70CVの間の体積中に0から500mMのNaClを含む。
提供される方法は、任意の単離された組換えAAV粒子の生成で使用するのに適している。そのため、本開示の方法によるフィード組成物中のrAAVは、当技術分野で知られている任意の血清型、修飾、もしくは派生物、またはこれらの任意の組合せ(例えば、2つ以上の血清型を含む(例えば、rAAV2、rAAV8、及びrAAV9粒子のうちの2つ以上を含む)rAAV粒子集団)とすることができる。いくつかの実施形態において、rAAV粒子は、AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7,AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15、及びAAV-16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、もしくはAAV.HSC16、または他のrAAV粒子、あるいはこれらのうちの2つ以上の組合せである。
本明細書で開示されるアニオン交換クロマトグラフィー樹脂(例えば、4級アミン配位子を含むモノリスアニオン交換クロマトグラフィー樹脂またはAEXクロマトグラフィー樹脂)を用いた精製方法(例えば、[1]~[55]のいずれか1つの方法)は、rAAV粒子を単離するための上流処理、下流処理、または上流及び下流処理と組み合わせて使用することができる。
凝集体、ミスフォールドした粒子、空のカプシド、充填不完全なカプシドを含めた処理関連不純物からrAAV粒子を分離することが可能な大規模で高収率の精製ステップを開発するために、複数のAEX樹脂を試験した。空の/充填不完全なカプシド及びウイルス凝集体から機能的rAAV粒子を分離することは、溶媒アクセス可能なこれらの実体の外部の構造的類似性が高レベルであることを考慮すれば、とりわけ困難である。それと同時に、機能的rAAV粒子から空のカプシド及び充填不完全なカプシドを分離することは、より安全でより効果的な治療用AAV組成物を製造するために不可欠である。試験した樹脂は、CIMmultus(登録商標)QA、Q Sepharose、Fractogel(登録商標)TMAE(M)、Toyopearl(登録商標)Gigacap Q-650M、及びPOROS(商標)50 HQであった。
さらなる実験は、緩衝液構成成分、pH、及び勾配プロファイルが生成物関連不純物からのAAV8-A分離に及ぼす影響を試験するため、1mLのCIMmultus(登録商標)QAモノリスカラムで、アフィニティークロマトグラフィーで精製したAAV8-A調製物を用いて実施した。AAV8-Aを精製する間のクロマトグラフィー緩衝液にはpH8.4±0.2の25mMトリスが最適であり、AAV8-AのAEX培地への緊密な結合と、AAVの安定性を損なうことなく生成物関連不純物から完全AAVを良好に分離することとを確実にした(図2)。
4級アミンリガンドを含む複数のAEXクロマトグラフィー樹脂について、Mg2+及びK+を含む緩衝液系を使用した際の空の/充填不完全なカプシド及び凝集体から完全AAV粒子を分離する能力を試験した。図4。CIMmultus(商標)QA(BIA Separations)、Poros XQ(Thermo Fisher)、及びSartobind(登録商標)Q(Sartorius)AEX媒体を使用して、AAV8-Bウイルス(例えば、導入遺伝子Bを運搬するAAV8)を精製した。AAV8-Bウイルスを細胞培養物上清から収集し、実施例1での説明とほぼ同様にPoros AAVXアフィニティーカラムで精製した。アフィニティー精製したAAV8-Bウイルスを20mMのトリスHCl緩衝液(任意選択で2mMのMgCl2、2.5mMのKCl、及び「粘着」を防止するための0.001%プルロニックを含む)で希釈し、平衡/洗浄緩衝液(25mMのトリスHCl、2mMのMgCl2、2.5mMのKCl pH8.4)で予め平衡化したAEXカラムにロードした。カラムを平衡化/洗浄緩衝液で洗浄し、続いて漸増NaCl濃度の直線勾配によって溶出した。試験した3つの樹脂は全て、完全AAV8-B粒子を含むメインピークと、空の/充填不完全なカプシドを含むフロントピークと、凝集したウイルスを含むテールとの間を良好に分離した。Mg2+及びK+を含む緩衝系を用いたAAV8-Bで観察された分離(図4)は、Mg2+及びK+を含まない緩衝系を用いたAAV8-Aの4級アミンAEXカラムで観察された分離(図1A、B、D、及びE)と比較して顕著に優れていた。
AAV8-Aを、実施例1で説明されているように50Lの細胞培養物上清から単離し、実施例2で説明されているようにトリスpH8.4、2.5mMのMgCl2、及び1mMのKCl、低速の流量、ならびに浅い直線NaCl濃度勾配を含む緩衝系を用いた80mLのCIMmultus(登録商標)QAモノリスカラムを用いてさらに精製した。80mLのCIMmultus(登録商標)QAカラムまでスケールアップしたAEXクロマトグラフィー法により、アフィニティー精製したAAV8-Aは、3つの画分またはピーク:空のウイルスカプシドを含む第1またはフロントピーク(280nmの吸光度>260nmの吸光度);完全AAV8-A粒子及び最小限の生成物関連不純物を含む第2またはメジャーピーク(260nmの吸光度>280nmの吸光度);様々な生成物関連不純物(例えば、凝集、ミスフォールド、または分解したAAV粒子)の混合物を含む第3またはテールピークに分離された(図5)。6回の実行からのCIMmultus(登録商標)QAクロマトグラフィー処理における平均AAV8-Aゲノムコピー(GC)収率は92%であった。
実施例1で説明されている処理を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたAAV9ウイルスを、CIMmultus(登録商標)QAカラムを使用するアニオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。試料を、1mMのMgCl2及び1mMのKClを伴うまたは伴わないAEXロード希釈緩衝液(25mMのトリス、0.001%のPF-68、pH10.0)で希釈した。平衡化緩衝液は、1mMのMgCl2及び1mMのKClを伴うまたは伴わない25mMトリス、3mMのNaCl、pH9.3であり、溶出緩衝液は、1mMのMgCl2及び1mMのKClを伴うまたは伴わない25mMのトリス、200mMのNaCl、pH9.3であった。9mMのNaClから121mMのNaClまでの直線NaCl濃度勾配を50CVにわたり送達させてAAV9粒子を溶出した。クロマトグラフィー緩衝液に1mMのMgCl2及び1mMのKClを含めることで、AAV9生成物のピーク面積が12%増加し、GCステップ収率が76%から79%に増加した(図8)。
Claims (19)
- アニオン交換クロマトグラフィー中における、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子とウイルス凝集体との分離を改善するための方法であって、
(a)rAAV粒子及びウイルス凝集体を含むフィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、前記rAAV粒子が前記クロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、
(b)直線勾配を用いて前記クロマトグラフィー媒体から前記rAAV粒子を溶出すること、ならびに
(c)溶出された前記rAAV粒子を含む溶出液を回収すること
を含み、
以下:
a.前記フィード組成物が、約0.5mMから約5mMの間のMg2+濃度を有すること、
b.前記フィード組成物が、約0.5mMから約5mMの間のK+濃度を有すること、及び
c.前記フィード組成物が、約6.5から約10.5の間のpHを有すること、
によって特徴づけられる、前記方法。 - 以下:
d.前記溶出することが、0.1CV/分から5CV/分の間の流量で行われること、及び
e.前記直線塩勾配が、約5から約100CVの間の体積を含むこと
によって特徴づけられる、請求項1に記載の方法。 - 前記フィード組成物が、約8.2から約9.5の間のpHを有することによって特徴づけられる、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、4級アミン官能基を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、モノリスアニオン交換クロマトグラフィーである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記直線塩勾配が、約0から500mMの間のNaClを含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出することの前に、結合した前記rAAV粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、約0.1mMから約20mMの間のMg2+を含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出することの前に、結合した前記rAAV粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、約0.1mMから約20mMの間のK+を含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出することの前に、結合した前記rAAV粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、約0.1mMから約20mMの間のMg2+及び約0.1mMから約20mMの間のK+を含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出することの前に、結合した前記rAAV粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、8mMのMgCl2及び2.5mMのKClを含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記フィード組成物を前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体に接触させる前に、前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、8mMのMgCl2及び2.5mMのKClを含む緩衝液で平衡化されている、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記rAAV粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15、及びAAV-16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、及びAAV.HSC16から選択されるAAVからのカプシドタンパク質を含む、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記rAAV粒子が、AAV-8またはAAV-9血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Mg2+がMgCl2である、および/または前記K+がKClである、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子の収率が少なくとも約80%である、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約50%がrAAV粒子である、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を、rAAV粒子及び不純物を含むフィード組成物から単離するための方法であって、
(a)前記フィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、前記rAAV粒子が前記クロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、
(b)直線勾配を用いて前記クロマトグラフィー媒体から前記rAAV粒子を溶出すること、及び
(c)溶出された前記rAAV粒子を含む溶出液を回収すること
を含み、
(i)前記不純物が、空のウイルスカプシド、充填不完全なウイルスカプシド、及び/またはウイルス凝集体を含み、
(ii)前記方法が、以下:
a.前記フィード組成物が、約0.5mMから約5mMの間のMg2+濃度を有すること、
b.前記フィード組成物が、約0.5mMから約5mMの間のK+濃度を有すること、及び
c.前記フィード組成物が、約6.5から約10.5の間のpHを有すること
によって特徴づけられ、
任意で前記方法が、以下:
d.前記溶出することが、0.1CV/分から5CV/分の間の流量で行われること、及び
e.前記直線塩勾配が、約5から約100CVの間の体積を含むこと
のうちの1つ以上によってさらに特徴づけられる、前記方法。 - アニオン交換クロマトグラフィー中における、空のまたは充填不完全な組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子と完全rAAV粒子との分離を改善するための方法であって、
(a)空のrAAV粒子、充填不完全なrAAV粒子、及び完全rAAV粒子を含むフィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、前記rAAV粒子が前記クロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、
(b)直線勾配を用いて前記クロマトグラフィー媒体から前記rAAV粒子を溶出すること、ならびに
(c)溶出された前記rAAV粒子を含む溶出液を回収すること
を含み、
前記方法が、以下:
a.前記フィード組成物が、約0.5mMから約5mMの間のMg2+濃度を有すること、
b.前記フィード組成物が、約0.5mMから約5mMの間のK+濃度を有すること、及び
c.前記フィード組成物が、約6.5から約10.5の間のpHを有すること
によって特徴づけられ、
任意で前記方法が、以下:
d.前記溶出することが、0.1CV/分から5CV/分の間の流量で行われること、及び
e.前記直線塩勾配が、約5から約100CVの間の体積を含むこと
のうちの1つ以上によってさらに特徴づけられる、前記方法。 - 前記フィード組成物が、約8.2から約9.5の間のpHを有することによって特徴づけられる、請求項17または請求項18に記載の方法。
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