ES2400235T3

ES2400235T3 - Método de producción escalable de AAV

Info

Publication number: ES2400235T3
Application number: ES07756027T
Authority: ES
Inventors: Luc H. Vandenberghe; James M. Wilson; Martin Lock
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-27
Publication date: 2013-04-08
Anticipated expiration: 2027-04-27
Also published as: US20200385689A1; CN101528916A; US20190055523A1; US20230116968A1; US9198984B2; US20160040137A1; CN101528916B; WO2007127264A3; JP5268890B2; US10155931B2; EP2018421A2; US20090275107A1; EP2018421B1; WO2007127264A2; JP2009535030A; US11377641B2

Abstract

Un método para la producción de AAV, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) cultivar un AAV carente de un sitio de enlace de heparina en un cultivo celular, y (b) aislar el AAV del sobrenadante del cultivo celular sin que se requiera la recogida de un sedimento celular ola disrupción celular.

Description

Método de producción escalable de AAV.

Exposición relativa a la investigación o desarrollo patrocinados federalmente

La presente solicitud describe un trabajo sustentado al menos en parte por una subvención de National Institutes of Health, subvención de NHLBI número P=1-HL-059407. El gobierno de US puede tener determinados derechos sobre la presente invención.

Antecedentes de la invención

La invención describe una forma novedosa de cultivo y producción de AAV.

Un virus adeno asociado (AAV), un miembro de la familia Parvovirus, es un pequeño virus icosaédrico, sin cubierta, con un genoma de ADN lineal de cadena simple de 4,7 kilobases (kb) a 6 kb. El AAV se asigna al género, Dependovirus, puesto que el virus fue descubierto como contaminante en poblaciones de adenovirus purificados. El ciclo de vida del AAV incluye una fase latente en la que genomas de AAV, tras la infección, son integrados en genomas anfitrión, y una fase infecciosa en la que, a continuación de la infección por virus ya sea por adenovirus o ya sea por herpes simplex, los genomas de AAV integrados son rescatados posteriormente, replicados y empaquetados en virus infecciosos. Las propiedades de no patogenicidad, la amplia gama de infectividad del anfitrión, incluyendo células sin división, y la integración, hacen que un AAV sea un vehículo de suministro atractivo.

Se ha descrito una diversidad de secuencias de AAV diferentes y de métodos para aislamiento de las mismas a partir de tejidos. Se ha descrito el AAV 1-6, AAV7, AAV9 y AAV9, entre otras secuencias de AAV obtenidas a partir de fuentes de tejido de simios o de humanos. Véanse, por ejemplo, las solicitudes de Patentes Internacionales núms. WO 02/33269, WO 02/386122 (AAV6), y la solicitud de Patente Internacional núm. WO 2005/033321. Con todo esto, se ha producido un alejamiento en cuanto a definir un AAV estrictamente mediante la actividad serológica cruzada (serotipos). La literatura reciente define la relación entre estos AAV en términos de relatividad filogenética, proponiendo grupos denominados “clados”. Véase, por ejemplo, Gao et al., J. Virol. 78(12): 6381-6388 (Junio de 2004); solicitud de Patente Internacional núm. WO 2005/033321.

La metodología actual para la producción de AAV ha estado fundamentada en gran medida en la observación de que el AAV2 está asociado a la célula y de ese modo, se cree que reside principalmente en las células productoras. Por lo tanto, la mayor parte de las estrategias de producción de AAV del estado actual de la técnica obtienen partículas de vector procedentes del sedimento celular de la línea celular de producción. Cada una de estas estrategias emplea alguna metodología de liberación de vector desde el sedimento celular mediante lisis por sonicación, enzimática, física o química. Esto libera desafortunadamente todas las proteínas intracelulares y los residuos en el cultivo viral. Por lo tanto, el procedimiento subsiguiente de purificación es más exigente. Debido a la eficacia relativamente baja tanto de la producción como de la purificación, es necesario empezar con una gran cantidad de células productoras.

Se necesitan por tanto métodos eficientes de producción y purificación de AAV.

Sumario de la invención

La presente invención permite la producción de AAV sin que se requiera la terminación del cultivo celular de producción de virus. El método incluye cultivar AAV liberado en el sobrenadante sin que se requiera la recogida de un sedimento celular o la disrupción celular. Más en particular, la invención proporciona un método para la producción de AAV, comprendiendo dicho método las etapas de (a) cultivar un AAV carente de un sitio de enlace de heparina en un cultivo celular; y (b) aislar el AAV del sobrenadante del cultivo celular sin que se requiera la recogida de un sedimento celular o la disrupción celular. En una realización, el método incluye modificar los cápsides de AAV, las células y/o las condiciones de cultivo para reducir sustancialmente, o eliminar, el enlace entre el sitio de enlace de Heparina de AAV y las células productoras, permitiendo con ello que el AAV pase al sobrenadante, es decir, al medio. De ese modo, el método de la invención proporciona un sobrenadante que contiene altas producciones de AAV que tienen un grado de pureza más alto a partir de membranas celulares y de materiales intracelulares, en comparación con el AAV producido con la utilización de métodos que hacen uso de una etapa de recogida celular y/o de lisis celular.

Esta tecnología puede ser aplicada a la producción eficiente y escalable de AAV con mejoras significativas en cuanto a coste financiero e inversión de tiempo. Esta tecnología permite la producción de AAV a pequeña escala y su aplicación comercial para un kit de “todo incluido” a efectos de investigación. Puesto que el AAV puede ser cultivado múltiples veces a partir del sobrenadante, un sistema continuo o bio-reactor permite la producción de cantidades partículas necesarias para uso clínico o para una aplicación farmacéutica amplia sin que el substrato celular constituya una limitación para la producción. Opcionalmente, en combinación con el uso de un medio de crecimiento que carezca de, o que sea muy bajo en cuanto a, suero o proteínas, la purificación se simplifica considerablemente. Esta tecnología puede ser aplicada en combinación con métodos más eficientes de purificación y concentración que podrían ser utilizados con los métodos de producción de la técnica anterior y/o en presencia de cantidades significativas de material intracelular.

Otras ventajas adicionales de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra el efecto de una glicoproteína de sulfato de heparano (HSPG) sobre la producción de AAV2 y de AAV2HSPG- en presencia (S) o ausencia (SF) de suero, con producción de AAV2/8 como control positivo.

La Figura 2ª muestra la cuantificación de partículas de AAV resistentes a DNasa (drp) en sobrenadante (I), fracción celular pobremente asociada (II) y fracción celular estrechamente asociada (III) para control positivo de AAV2/8;

Las Figuras 2B-2E muestran fracciones similares para AAV2 y AAV2HSPG- en presencia (Suero o S) o ausencia (Exentas de Suero o SF) de suero;

La Figura 3 ilustra la producción de aislados de AAV a partir de transfección simple por plato de 15 cm. Todos los aislados con un enlace que no fuera de heparina produjeron una GC total mayor de 2 x 1012 comprendida en la gama de hasta 1 x 1013. Se ha mostrado el AAV2 y el hu.51 aislado para enlazar heparina y está limitado en cuanto a producción.

La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra los resultados de inmunización con una diversidad de AAV por activación de células T. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 1 x 1011 de vector de GC AAV2/6, AAV2/6.1, AAV2/6.2, AAV2/6.1.2, AAV2/1 y AAV2. 13 días más tarde se cultivaron esplenocitos a partir de 3 ratones por grupo y se agruparon. Iguales cantidades de esplenocitos fueron simuladas in vitro con epítope IPQYGYLTL [SEQ ID No. 1] de AAV de Balb/c en un ensayo ELISPOT.

La Figura 5 es un gráfico de barras que muestra la fracción de vector liberada en el sobrenadante a continuación de la producción de vector viral de AAV especificada mediante triple transfección transitoria en un sistema de cultivo de células 293.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un método para la producción de AAV, sin que se requiera disrupción celular. El método incluye cultivar AAV a partir del sobrenadante de un cultivo de producción viral.

Para aquellos AAVs que no muestren afinidad con proteoglicanos de sulfato de heparano o heparina, los cuales comprenden la mayor parte de las especies de AAV, una gran fracción de partículas infecciosas, resistentes a DNasa, se localiza en el sobrenadante del cultivo o está asociada a la célula solamente de manera pobre. Esto se observa sin lisis viral, osmolítica o de cualquier otro tipo.

La presente invención permite una tecnología escalable para la producción de AAV para su uso en una diversidad de transferencias de gen y/o aplicaciones de vacuna. La misma reduce también drásticamente la rigurosidad de la purificación cuando se usa en combinación con medios de contaminación baja, o nula, en proteínas, para el cultivo. Este método de producción puede ser aplicado en combinación con métodos adecuados de purificación y concentración que incluyen, por ejemplo, cromatografía, filtración o precipitación a efectos de purificación y concentración.

Puesto que la mayor parte de las estrategias de producción de AAV utilizan el sedimento celular como substrato para aislar partículas, tales métodos son por definición un proceso iterativo que excluye una estrategia de cultivo continuo.

Al contrario que en las metodologías actuales, en una realización, la presente invención proporciona un método en el que el sobrenadante es la principal fuente para muchos AAVs. Esto permite el cultivo repetitivo continuo de las mismas células productoras para la producción de cantidades mayores de AAV para investigación o terapia clínica o pre-clínica. En el cultivo actual de sedimento celular y los subsiguientes métodos de purificación, se necesitan grandes cantidades de partículas para proporcionar eficientemente un título viral utilizable. Por lo tanto, existe un umbral por debajo del cual no es técnicamente factible la recuperación de una cantidad de partículas utilizable. En una realización, un vector AAV secreta al menos alrededor de un 10% de genomas o partículas de vector resistentes a Dnasa (drp vg) a partir de las células en las que se producen. Tales drp vg representan secuencias genómicas (por ejemplo, un minigén, un casete y/o secuencias de ácido nucleico de AAV) empaquetadas en un cápside de AAV. En otras realizaciones, un vector de AAV secreta al menos alrededor de un 20% de drp vg. En otras realizaciones adicionales, un vector de AAV secreta al menos alrededor de un 40% de drp vg. Mediante la estrategia de producción más eficiente que se proporciona en la presente memoria, la escalabilidad es posible para ambas necesidades de partículas pequeñas y de partículas grandes. Por lo tanto, la producción viral puede ser personalizada dependiendo de las cantidades que se espera que se requieran, sin el requisito de lisis celular o la suspensión del cultivo celular.

Por ejemplo, se ha encontrado que los vectores de AAV8 secretan, por término medio, más de un 40% de sus partículas virales al sobrenadante en un método de producción de triple transfección a base de células 293. Se ha encontrado que otros vectores basados en AAV7 y rh8R secretan en esta misma gama. Incluso otros vectores que se ha encontrado que secretan, por término medio, más de un 30% de las partículas virales en el sobrenadante de este sistema, por ejemplo, AAV1 [proteína de cápside proporcionada en SEQ ID No. 2], AAV6 [proteína de cápside de AAV6 proporcionada en SEQ ID No. 3], AAV6.1 [SEQ ID No. 3, con un cambio K531E en la proteína de cápside], AAV6.1.2 [SEQ. ID No. 3, con K531E, F129L], rh32.33 [proteína de cápside proporcionada en SEQ ID No. 4], rh 10 [proteína de cápside proporcionada en SEQ ID No. 5], y rh64R1 [proteína de cápside de rh64 proporcionada en SEQ ID No. 6, con un R697W] y rh8R [proteína de cápside de rh8 proporcionada en SEQ ID No. 7, con D531E]. En otro ejemplo más, se ha encontrado que otros vectores de AAV secretan por término medio más de un 20% de sus partículas virales en el sobrenadante durante la producción que sigue a la triple transfección en este sistema. Incluso otros vectores de AAV, por ejemplo, los basados en AAV9 [proteína de cápside proporcionada en SEQ ID No. 8], se ha encontrado que liberan más de un 10% de sus partículas virales en el sobrenadante de este sistema. Incluso otros ejemplos que incluyen AAVs que secretan más de un 10% de sus partículas virales en el sobrenadante, son utilizados en los métodos de la invención. En una realización, estos vectores producidos con esta materia proceden de AAVs que secretan de manera natural fuera de la célula en la que son producidos.

En otra realización, los AAVs son modificados para permitir su secreción. En una realización, los inventores han encontrado que un AAV que tenga un dominio de enlace de heparina y que esté caracterizado por tener capacidad de transducción (infecciosa) bloqueada por heparina, no secretan en cantidades detectables. Ejemplos de tales AAVs son el AAV2 (proteína de cápside proporcionada en SEQ ID No. 9], que en su mayor parte está asociado a la célula durante la producción, y el AAV3 [proteína de cápside proporcionada en SEQ ID No. 10]. De ese modo, en una realización, el método incluye modificar los cápsides de AAV, las células y/o las condiciones de cultivo para reducir sustancialmente o eliminar el enlace entre el sitio de enlace de heparina de AAV y las células productoras, permitiendo con ello que el AAV pase al sobrenadante, es decir, al medio.

El método de la invención proporciona un sobrenadante que contiene producciones elevadas de AAV que tienen un grado de pureza más alto a partir de membranas celulares, proteínas y materiales intracelulares, en comparación con el AAV recuperado a continuación de una lisis celular. En una realización, la presente invención se inicia, por el contrario, a partir de sobrenadante sin lisis y con ello simplifica cualquier purificación subsiguiente. Una cantidad limitada de residuo celular se encuentra en el sobrenadante en cultivo normal y equivale a una reducción drástica de contaminación de proteína. En una realización, se utiliza un medio exento de suero para evitar el efecto de contaminación del suero o de otras proteínas introducidas por el medio de crecimiento.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método de producción de un AAV en un cultivo de producción viral. Las secuencias de una diversidad de AAVs han sido descritas previamente. Véase, por ejemplo, AAV 1 (Patente US núm. 6.759.237), AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, rh32.33, rh. 10, hu. 11, otros AAVs procedentes de fuentes humanas y no humanas, véase por ejemplo la publicación de las Patentes Internacionales núms. WO 02/33269, WO 02/386122 (AAV8), y GenBank, y cómo han sido alteradas tales secuencias para corregir errores de singletón, por ejemplo, AAV6.2, AAV6.1, AAV6.1.2, rh64R1 y rh8R (véase, por ejemplo, el documento WO 2006/110689, publicado el 19 de Octubre de 2006]. Alternativamente, otras secuencias de AAV incluyendo aquellas identificadas por un experto en la materia con la utilización de técnicas conocidas [véase, por ejemplo, la publicación de Patente Internacional núm. WO 2005/033321 y GenBank] o mediante otros medios, pueden ser modificadas según se describe en la presente memoria.

Determinadas secuencias de AAV están desprovistas de manera natural de dicho sitio de enlace de heparina. Para un AAV que carece de un sitio de enlace de heparina, por ejemplo, el AAV8 [proteína de cápside proporcionada en SEQ ID No. 11], no se requiere ninguna modificación de la secuencia de AAV, de la célula o del medio. La capacidad de un cápside de AAV para enlazar heparina puede ser identificada fácilmente utilizando una diversidad de formatos de ensayo y heparina o porciones de la misma para enlazar un AAV. Además, la capacidad de la heparina para bloquear la capacidad infecciosa/de transducción de un AAV puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia. Se ha descrito un ensayo adecuado para determinar la capacidad de la heparina para bloquear cualquier infección/transducción de transducción de un AAV, por ejemplo, por C. Halbert et al., J. Virol., 75(14): 6615-6624 (Julio 2001) y por C.E. Walsh y H. Chao, Haemophilia, 8 (Supl. 2), p. 60-67 (2002).

Otras secuencias de AAV, por ejemplo, el AAV6, tienen un sitio de enlace de heparina, pero la capacidad del AAV6 para infectar es inhibida parcialmente, no bloqueada, por la presencia de heparina. Se ha descrito la secuencia de cápside vp1 del AAV6 como que tiene un residuo único de aminoácido que media en el enlace de heparina, residiendo la lisina natural en la posición 531 [SEQ ID No. 3]. [La secuencia de AAV6 se proporciona en la solicitud de Patente Internacional núm. PCT/US06/13375 y el número de residuo está basado en el esquema de numeración proporcionada en esa solicitud internacional (véase, por ejemplo, Tabla)]. En ese caso, no se requiere ninguna modificación de esta secuencia de AAV puesto que se ha encontrado que está asociada a la célula solamente de forma pobre.

En una realización, para un AAV que tenga un sitio de enlace de heparina y que tenga su capacidad de infectar/transfectar células bloqueadas por heparina, la invención prevé para la modificación del AAV reducir o eliminar el enlace de heparina con el fin de incrementar la cantidad de partículas virales secretadas al sobrenadante. En una realización, un dominio de enlace de heparina es un motivo Arg-Xaa-Xaa-Ag (RxxR) [SEQ ID No. 12] según se ha descrito en AAV2 (es decir, en torno a los aminoácidos 585 a 588 de la proteína de cápside vp1 de AAV2, SEQ ID No. 9, Kern et al., J. Virol. 77: 11072-81; Opie et al., J. Virol. 77: 6995-7006 (en base a la numeración ilustrada en el documento WO 02/33269)]. Xaa representa cualquier aminoácido. Los inventores han identificado otros cápsides de AAV que tienen motivos RxxR, varios de los cuales son AAVs de Clado B. Ejemplos de tales cápsides de AAV que tienen motivos RxxR incluyen el hu.51 [SEQ ID No. 13], hu.34 [SEQ ID No. 14], hu.35 [SEQ ID No. 15], hu.45 [SEQ ID No. 16], y hu.47 [SEQ ID No. 17]. Otro AAV que tiene un dominio RxxR puede ser identificado fácilmente por un experto en la materia a partir de aquellas secuencias de AAV que han sido descritas.

5 Adicionalmente, otros sitios de enlace de heparina pueden ser identificados fácilmente en un AAV usando técnicas conocidas por los expertos en la materia. En otro ejemplo, el AAV3 se enlaza a heparina; sin embargo, no contiene el dominio RxxR.

Los inventores han encontrado que cambiando uno (o más) residuo(s) de aminoácido de una secuencia de enlace de heparina para que contenga un cambio de aminoácido no conservador, no solo está ablacionado en cuanto a

10 enlace de heparina, sino que también, la activación de células T se reduce significativamente. Éste es el objeto de la solicitud en co-propiedad “Vectores de AAV Modificados que Tienen Inmunogenicidad de Cápside Reducida y Uso de los Mismos”, la cual reivindica prioridad de la solicitud de Patente Provisional US núm. 60/795.965, depositada el 28 de Abril de 2006, que se incorpora en la presente memoria por referencia.

En una realización, la invención proporciona un método para producir un AAV en un cultivo viral, en el que el AAV se 15 modifica para la ablación del dominio de enlace de heparina.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el sitio de enlace de heparina de cápside de AAV se modifica usando técnicas de mutagénesis específicas del sitio, en las que el codón para el (los) residuo(s) de aminoácido responsable de mediar en el enlace de heparina se altera para realizar un cambio no conservador en el aminoácido codificado. Ejemplos de cambios no conservadores de aminoácido incluyen, por ejemplo, la sustitución

20 de un aminoácido por otro aminoácido de estructura (propiedades) química diferente, lo que afecta a la función de la proteína. La tabla que sigue ilustra los aminoácidos más comunes y sus propiedades.

Aminoácido: Abrev. Hidrofóbico Polar Cargado Aromático o alifático Codón

Alanina: Ala, A X - - - GCU, GCC, GCA, GCG

Cisteína: Cys, C X - - - UGU, UGC

Aspartato: Asp, D - X negativo - GAU, GAC

Glutamato: Glu, E - X negativo - GAA, GAC

Fenilanina: Phe, F X - - Aromático UUU,UUC

Glicina: Gly, G X - - - GGU, GGC, GGA, GGG

Histidina: His, H - X positivo Aromático CAU, CAC

Isoleucina: Ile, I X - - Alifático AUU, AUC, AUA

Lisina: Lys, K - X positivo - AAA, AAG

Leucina: Leu, L X - - Alifático UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG

Metionina: Met, M X - - - AUG

Asparagina: Asn, N - X - - AAU, AAC

Prolina: Pro, P X - - - CCU, CCC, CCA, CCG

Glutamina: Gln, Q - X - - CAA, CAG

Arginina: Arg, R - X positivo - CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG

Serina: Ser, S - X - - UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC

Treonina: Thr, T X X - - ACU, ACC, ACA, ACG

Valina: Val, V X - - Alifático GUU, GUC, GUA, GUG

Triptofano: Trp, W X - - Aromático UGG

Tirosina: Tyr, Y X X - Aromático UAU, UAC

Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica el sitio de enlace de heparina se modifica usando técnicas de mutagénesis específicas del sitio. Por ejemplo, en un motivo RxxR [SEQ ID No. 3], el codón para la arginina 25 inicial y/o la última arginina del motivo se altera para cambiar uno (o ambos) de los aminoácidos por un aminoácido no conservador. Se ha encontrado que alterando cualquiera de las argininas de ese motivo, se impide el enlace de heparina. Según se ha ilustrado en la presente memoria, cuando el motivo de enlace de heparina es RxxR, el primer aminoácido del sitio de enlace de glicoproteína de sulfato de heparina modificado puede ser cambiado de Arg a Ser

o Glu. En otra realización, el último aminoácido del sitio de enlace de glicoproteína de sulfato de heparina modificado 30 se cambia de Arg a Thr. En otra realización, la lisina de la posición 531 de la proteína de cápside vpa [SEQ ID No. 3] del AAV6 se cambia a un aminoácido no conservador. Los cambios de aminoácido no conservadores distintos de los que se han ilustrado en la presente memoria, pueden ser seleccionados por un experto en la materia.

De manera similar, se pueden identificar otros dominios de enlace de heparina usando técnicas conocidas por los expertos en la materia, y modificados usando mutagénesis específica del sitio u otra técnica adecuada para alterar la secuencia de codificación para la arginina. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY).

Adicionalmente, se pueden usar otros métodos de alteración de la secuencia de un dominio de enlace de heparina para impedir el enlace de heparina. En otra realización, el enlace de heparina con un AAV que contiene un sitio de enlace de heparina es ablacionado por medio de métodos distintos de los que alteran la secuencia del sitio de enlace de heparina. Por ejemplo, se puede dotar al cápside de AAV con una molécula que enmascare de forma efectiva el sitio de enlace de heparina en la célula productora.

En otra realización más, se puede modificar la célula productora para eliminar o reducir sustancialmente la producción de heparina, por ejemplo, usando ARN objetivado en, o mutando genes importantes para, biogénesis de heparina, ya sea de forma transitoria o ya sea de forma permanente. En otra realización, se podría usar una línea celular productora naturalmente defectuosa en la biogénesis de heparina.

Un cultivo celular viral utiliza células que contienen, ya sea de manera estable o ya sea de manera transitoria, al menos los componentes mínimos requeridos para generar una partícula de AAV, donde la producción de un genoma resistente a DNasa de AAV que contenga partículas, incluye el empaquetamiento de un casete de expresión en un cápside de AAV. Los componentes mínimos requeridos incluyen: un casete de expresión, que ha de ser empaquetado en el cápside de AAV, un cap de AAV, y un rep de AAV o un fragmento funcional de los mismos, y funciones auxiliares.

Una diversidad de células y de líneas celulares adecuadas han sido descritas para su uso en la producción de AAV. La propia célula puede ser seleccionada a partir de cualquier organismo biológico, incluyendo células procarióticas (por ejemplo, bacterianas), y células eucarióticas, incluyendo células de insectos, células de levaduras y células de mamíferos. Las células anfitrión particularmente deseables se eligen a partir de especies de mamífero que incluyen, aunque sin limitación, células tales como A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, una célula 293 de HEK (que expresa E1 adenoviral funcional), Saos, C2C12, células L, Ht1080, HepG2 y fibroblasto primario, células de hepatocito y de mioblasto derivadas de mamíferos incluyendo el ser humano, el mono, el ratón, la rata, el conejo y el hámster. La selección de las especies de mamíferos que proporcionan las células no es una limitación de la presente invención, ni lo es el tipo de célula del mamífero, es decir, fibroblasto, hepatocito, célula tumoral, etc.

La secuencia de AAV puede ser obtenida a partir de una diversidad de fuentes. Por ejemplo, una secuencia de AAV adecuada puede ser obtenida según se describe en el documento WO 2005/033321 o a partir de fuentes conocidas, por ejemplo, la American Type Culture Collection, o de una diversidad de familias académicas de núcleo de vector. Alternativamente, las secuencias adecuadas son generadas sintéticamente usando técnicas conocidas con referencia a secuencias publicadas. Ejemplos de secuencias de AAV adecuadas se proporcionan en la presente memoria.

En general, el casete de expresión está compuesto, como mínimo, de una repetición de terminal invertido (ITR) 5’ de AAV, una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto terapéutico, un inmunógeno o un antígeno deseable, enlazado operativamente a secuencias reguladoras que dirigen la expresión de los mismos, y una ITR 3’ de AAV. En una realización, se utilizan las ITRs 5’ y/o 3’ de serotipo 2 de AAV. Sin embargo, se pueden elegir las ITRs 5’ y 3’ de otras fuentes adecuadas. Este casete de expresión es el que se empaqueta en una proteína de cápside para formar un virión (partícula) de AAV.

Además del casete de expresión, la célula contiene las secuencias que activan la expresión de un cápside de AAV en la célula (secuencias cap), y secuencias rep de la misma fuente como fuente de las ITRs de AAV encontradas en el casete de expresión, o una fuente complementaria cruzada. Las secuencias cap y rep de AAV pueden ser seleccionadas de manera independiente a partir de secuencias parentales diferentes de AAV, y ser introducidas en la célula anfitrión de una manera adecuada conocida por el experto en la materia. Aunque se puede usar el gen rep de longitud completa, se ha encontrado que fragmentos más pequeños del mismo, es decir, el rep76/68 y el rep52/40, son suficientes para permitir la replicación y el empaquetamiento del AAV.

La célula requiere también funciones auxiliares con el fin de empaquetar el AAV de la invención. Opcionalmente, estas funciones auxiliares pueden ser proporcionadas por un herpesvirus. En otra realización, cada una de las funciones auxiliares necesarias es proporcionada a partir de una fuente de adenovirus de un humano o de un primate no humano, tal como las que se encuentran disponibles a partir de una diversidad de fuentes, incluyendo la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA (US). Se han descrito las secuencias de una diversidad de adenovirus adecuados. Véase, por ejemplo, los adenovirus C1 y C68 de chimpancé [Patente US No. 6.083.716]; Pan5, Pan6 y Pan7 [documento WO 02/33645], adenovirus híbridos tales como los que han sido descritos, [por ejemplo, documento WO 05/001103], y GenBank.

En una realización, la célula anfitrión contiene al menos las secuencias mínimas de ADN de adenovirus necesarias para expresar un producto de gen E1a, un producto de gen E1b, un producto de gen E2a, y/o un producto de gen ORF6 E4. La célula anfitrión puede contener otros genes adenovirales tal como VAI ARN, pero estos genes no son necesarios. En una realización, la célula usada no porta ningún gen de adenovirus distinto del E1, E2a y/o E4 ORF6; no contiene ningún otro gen de virus que pudiera dar como resultado una recombinación homóloga de un virus contaminante durante la producción de rAAV, y está capacitada para la infección o transfección mediante ADN y expresa el (los) gen(es) transfectado(s).

Una célula útil en la presente invención es una célula anfitrión transformada de manera estable con la secuencia que codifica rep y cap, y que está transfectada con ADN de los adenovirus E1, E2a y E40RF6, y una construcción portadora del casete de expresión según se ha descrito con anterioridad. Las líneas celulares que expresan rep y/o cap de manera estable, tal como la B-50 (publicación de solicitud de Patente Internacional núm. WO 99/15685), o las descritas en la Patente US núm. 5.658.785, pueden ser empleadas de manera similar. Otra célula anfitrión deseable contiene el ADN adenoviral mínimo que sea suficiente para expresar E4 ORF6. Se pueden construir otras líneas celulares adicionales utilizando las novedosas secuencias cap modificadas de la presente invención.

La preparación de una célula anfitrión conforme a la presente invención incluye técnicas tales como el ensamblaje de secuencias de ADN seleccionadas. Este ensamblaje puede ser realizado usando técnicas convencionales. Tales técnicas convencionales incluyen clonación genómica y de cADN, las cuales son bien conocidas y han sido descritas por Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY., incluyendo reacción de cadena de polimerasa, métodos sintéticos, y cualesquiera otros métodos adecuados que proporcionen la secuencia de nucleótido deseada.

Los componentes requeridos para la producción de AAV (por ejemplo, productos de gen E1a, E1b, E2a, y/o E4ORF6 de adenovirus, o uno (o más) fragmento(s) rep o cap de los mismos, el casete de expresión, así como también otras funciones auxiliares deseadas), pueden ser suministrados a la célula anfitrión de empaquetamiento por separado, o en combinación, en forma de cualquier elemento genético que transfiera las secuencias portadas en el mismo.

Según se utiliza en la presente memoria, un elemento genético (vector) incluye, por ejemplo, ADN desnudo, un plásmido, fago, transposón, cósmido, episoma, una proteína en un vehículo de suministro no viral (por ejemplo, un portador a base de lípido), un virus, etc., que transfiere las secuencias portadas en el mismo. El vector seleccionado puede ser suministrado por medio de cualquier método adecuado, incluyendo transfección, electroporación, suministro de liposoma, técnicas de fusión de membrana, gránulos recubiertos de ADN de alta velocidad, infección viral y fusión de protoplasto. Los métodos usados para construir cualquier realización de la presente invención son conocidos por los expertos en la manipulación de ácido nucleico e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante, y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. Véase, por ejemplo, K. Fisher et al., J. Virol., 70: 520-532 (1993), y la Patente US núm. 5.478.745.

En una realización, uno o más de los genes adenovirales están integrados de manera estable en el genoma de la célula anfitrión o expresados de manera estable como episomas. Los promotores para cada uno de los genes adenovirales pueden ser seleccionados de manera independiente a partir de un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor adenoviral natural. Los promotores, por ejemplo, pueden estar regulados por un estado fisiológico específico del organismo o la célula (es decir, por el estado de diferenciación o en células replicantes o quiescentes) o mediante factores añadidos exógenamente.

En una realización, una célula anfitrión estable podrá contener el (los) componente(s) bajo el control de un promotor regulable. Sin embargo, el (los) componente(s) requerido(s) puede(n) estar bajo el control de un promotor constitutivo.

Los promotores regulables permiten el control de expresión de gen mediante compuestos suministrados exógenamente, factores medioambientales tal como la temperatura, o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo, un estado de fase aguda, de diferenciación particular, o en células replicantes solamente. Los promotores y sistemas regulables están disponibles a partir de una diversidad de fuentes comerciales que incluyen, aunque sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Muchos otros sistemas han sido descritos y pueden ser seleccionados fácilmente por un experto en la materia. Ejemplos de promotores regulados por promotores suministrados exógenamente incluyen el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible por zinc, el promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (DEX), el sistema promotor de polimerasa T7 [documento WO 98/10088]; el promotor de ecdisoma de insecto [No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 33463351 (1996)], el sistema reprimible por tetraciclina [Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)], el sistema inducible por tetraciclina [Gossen et al., Science, 268: 1766- 1769 (1995), véase también Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 512-518 (1998)], el sistema inducible por RU-486 [Wang et al. Nat. Biotech. 15: 239-243 (1997) y Wang et al., Gene Ther., 4: 432-441 (1997)] y el sistema inducible por rapamicina [Magan et al., J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)]. Otros tipos adicionales de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son aquellos que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o en células replicantes solamente.

En otra realización, se utiliza el promotor natural. El promotor natural puede ser usado cuando se desea que la expresión del producto de gen mimetice la expresión natural. El promotor natural puede ser usado cuando la expresión del transgén debe ser regulada temporalmente o durante el desarrollo, o de una manera específica del tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una realización adicional, otros elementos de expresión natural, tal como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias de consenso de Kozak, pueden ser usados también para mimetizar la expresión natural.

Otra realización del transgén incluye un transgén enlazado operativamente a un promotor específico del tejido. Por ejemplo, si se desea expresión en el músculo esquelético, se debe usar un promotor activo en el músculo. Estos incluyen los promotores procedentes de genes que codifican �-actina esquelética, cadena 2a ligera de miosina, distrofina, quinasa de creatina muscular, así como promotores musculares sintéticos con actividades más altas que los promotores que se producen de manera natural (véase Li et al., Nat. Biotech., 17: 241-245 (1999)]. Ejemplos de promotores que son específicos del tejido son conocidos para el hígado (albúmina, Miyatake et al., J. Virol., 71: 5124-32 (1997); promotor de núcleo de virus de hepatitis B, Sandig et al., Gene Ther., 3: 1002-9 (1996); alfafetoproteína (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)) osteocalcina ósea (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997)); sialoproteína ósea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11: 654-64 (1996)), linfocitos (CD2, Hansai et al., J. Immunol., 161: 1063-8 (1998); cadena pesada de inmunoglobulina; cadena de receptor de célula T), neuronal tal como promotor de enolasa específica de neurona (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13: 50315 (1993)), gen de cadena ligera de neurofilamento (Piccioli et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 88: 5611-5 (1991)), y el gen vgf específico de neurona (Piccioli, et al., Neuron., 15: 373-84 (1995)), entre otros.

Los ejemplos de promotores activables y constitutivos adecuados son conocidos por los expertos en la materia. Según otra alternativa más, una célula anfitrión estable seleccionada puede contener un(os) componente(s) seleccionado(s) bajo el control de un promotor constitutivo y otro(s) componente(s) seleccionado(s) bajo el control de uno o más promotores inducibles. Por ejemplo, se puede generar una célula anfitrión estable que sea derivada de células 293 (las cuales contienen funciones auxiliares E1 bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contenga las proteínas rep y/o cap bajo el control de promotores inducibles. Otras células anfitrión estables adicionales pueden ser generadas por los expertos en la materia.

Alternativamente, uno o más de los componentes requeridos para ser cultivados en la célula anfitrión para empaquetar un casete de expresión en un cápside de AAV puede(n) ser proporcionado(s) a la célula anfitrión en trans utilizando un elemento genético adecuado.

Una vez que se ha seleccionado un sistema de cultivo celular adecuado, las células son cultivadas en un medio adecuado bajo condiciones que permiten el empaquetamiento del AAV, el sobrenadante se recoge desde el cultivo, y el AAV se aísla a partir del mismo. En una realización, la invención proporciona un sistema que es escalable, permitiendo que un cultivo celular sea mantenido mediante un proceso de producción continua, es decir, que no requiere disrupción celular y/o lisis celular para la recogida. En una realización, un sistema de ese tipo mantiene un cultivo celular viable. En otra realización, el cultivo celular contiene una población mixta de células viables y no viables. Durante el proceso de cultivo, se puede añadir medio durante el proceso de cultivo y/o junto con la recogida del sobrenadante para proporcionar un proceso de producción continua. Esta adición de medio, células nuevas, y/o elementos nutricionales requeridos o de otro tipo, tal como un agente regulador, puede ser repetida al menos dos veces, desde dos a 100 veces, o más de 100 veces, dependiendo de la vida del cultivo celular.

Mientras que el método de la invención permite la producción continua del virus, tras la terminación del ciclo de producción, puede ser deseable extraer cualquier resto de AAV desde las células de producción con anterioridad a la destrucción de las mismas. Esta extracción puede ser llevada a cabo utilizando métodos usados habitualmente para esta finalidad. Tales métodos incluyen típicamente retirar el sobrenadante, someter las células a lisis mediante técnicas de congelación/descongelación o sonicación, seguido por un tratamiento detergente (por ejemplo, benzonasa). La purificación se realiza tradicionalmente mediante tres rondas de centrifugación de gradiente de CsCl, diálisis y concentración.

En una realización, la invención proporciona un cultivo celular que contiene células cultivadas en un medio de cultivo adecuado. Opcionalmente, cualesquiera componentes que sean necesarios para activar o inducir expresión de un producto de gen deseado o que se requieran para la producción de virión, son suministrados con anterioridad a, o en momentos apropiados durante, la producción. Tales componentes pueden ser añadidos con el medio o suministrados por separado. Por ejemplo, uno o más elementos genéticos adecuados (por ejemplo, un plásmido) que sean portadores del (de los) componente(s) requerido(s), pueden ser transfectados en la línea celular deseada.

En una realización, el medio es un medio exento de suero tal como el Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), el cual contiene sales inorgánicas tales como CaCl2 (anhid.), Fe(NO3) 9H2O, KCl, MgSO4 (anhid.), NaCl, y NaH2PO4H2O, aminoácidos tales como L-arginina HCl, L-cisteína 2HCl, glutamina, glicina, histidina HCl H2O, isoleuquina, lisina HCl, metionina, fenilanina, serina, treonina, triptófano, tirosina 2Na 2H2O, y valina, vitaminas tales como D-Ca pantotenato, cloruro de colina, ácido fólico, i-inositol, niacinamida, riboflavina, y tiamina HCl, y otros pueden seleccionar otros medios adecuados exentos de suero.

Una célula producida en ausencia de suero (es decir, en medio libre de suero) de acuerdo con la invención, tiene con preferencia la ventaja adicional de que puede ser cultivada en ausencia de suero o de componentes de suero. Así, el aislamiento es fácil y de bajo coste, la seguridad se incrementa, y el sistema tiene una buena fiabilidad (los medios sintéticos son los mejores para la reproducibilidad). Las células de la invención y, en particular, las basadas en células primarias, están capacitadas para un ensamblaje y modificaciones normales (para humanos) post- y pretraslacionales. Esto significa que son muy adecuadas para la preparación de proteínas virales y virus para su uso en composiciones terapéuticas y de vacuna.

En otra realización, se pueden seleccionar medios que contienen suero. Adicional o alternativamente, los medios pueden ser mezclados antes del, o durante el, proceso de cultivo con nutrientes deseados, agentes de activación (inducción), o suero (por ejemplo, DMEM + 10% suero de bovino fetal). En otra realización más, se puede utilizar un medio exento de proteína.

Se suministra medio de refresco y cualesquiera agentes necesarios de inducción o de activación (por ejemplo, mediante una bomba peristáltica u otro medio adecuado) y el medio gastado se extrae del recipiente de cultivo a la misma tasa de flujo. El volumen de cultivo se mantiene y la tasa de dilución puede ser alterada cambiando la velocidad de funcionamiento de la bomba. Tras la iniciación, el cultivo se mantiene en una gama de temperatura adecuada para el cultivo celular seleccionado (por ejemplo, desde alrededor de la temperatura ambiente hasta 37 ºC), con agitación. El cultivo puede ser aeróbico o anaeróbico, dependiendo del tipo de célula seleccionada.

Se prevé que se necesite añadir medio aproximadamente 24 horas después de la transfección, o de la iniciación del cultivo de una línea celular de expresión estable. Sin embargo, el cultivo puede ser muestreado periódicamente para determinar las concentraciones de células anfitrión y de AAV en el sobrenadante, para evaluar de manera más precisa el instante de recogida del sobrenadante y de la adición de medio.

De ese modo, en una realización, la invención proporciona un sistema continuo para producción viral de AAV. En una realización, se utiliza un cultivo por lotes. Por ejemplo, el cultivo por lotes puede utilizar células de suspensión y adherentes, un cultivo de alimentación en lotes, relleno y extracción. Los expertos en la materia son conocedores de una diversidad de sistemas de cultivo por lotes, y utilizan, por ejemplo, bio-reactores, fermentadores, sistemas microportadores, frascos estáticos, factorías celulares, botellas con rulo, bolsas desechables (por ejemplo, el sistema Wave™), recipientes de acero inoxidable y de vidrio. Otros sistemas, por ejemplo, los sistemas de perfusión tales como los bio-reactores de fibra hueca, los sistemas de micro-portadores, el sistema de cubo celular (Corning), filtros giratorios, bio-reactores de lecho empaquetado (por ejemplo, célula de fibra), y encapsulación de célula, pueden ser usados para producción viral de AAV.

En un sistema continuo, los expertos en la materia conocen bien el hecho de obtener muestras en varias fases y medir la concentración de los virus mediante infectividad, titulación de genoma, u otros métodos adecuados. Una vez que se ha obtenido la concentración apropiada, el sobrenadante puede ser arrastrado hacia el sistema de purificación deseado. Al mismo tiempo, se suministran al cultivo celular cantidades adecuadas de medio de sustitución y de cualesquiera otros componentes necesarios.

El AAV del sobrenadante puede ser cultivado usando técnicas adecuadas que son conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, se pueden usar columnas monolíticas (por ejemplo, en modo de intercambio iónico, afinidad o IMAC), cromatografía (por ejemplo, cromatografía por captura, cromatografía de método fijo, y cromatografía de lecho expandido), filtración y precipitación, a efectos de purificación y concentración. Estos métodos pueden ser usados por si solos o en combinación. En una realización, los métodos de cromatografía de captura, incluyendo los sistemas basados en columna o basados en membrana, se utilizan en combinación con filtración y precipitación. Los métodos de precipitación adecuados, por ejemplo, utilizando polietileno glicol (PEG) 8000 y NH3SO4, pueden ser seleccionados fácilmente por un experto en la materia. A continuación, el precipitado puede ser tratado con benzonasa y purificado usando técnicas adecuadas.

En una realización, ventajosamente, cuando se produce usando el método de la invención, el sobrenadante del cultivo celular contiene niveles significativamente más altos de AAV que si se compara con el AAV que se mantiene en el interior de las células. En determinadas realizaciones, el sobrenadante comprende AAV con un rendimiento de al menos el 60%.

En la actualidad, los inventores han encontrado que la eficiencia de la producción de AAV ha sido incrementada mediante el cultivo de sobrenadante frente al sedimento celular en más de 30 especies recombinantes de AAV.

De ese modo, la invención proporciona también un virus para su uso en una composición terapéutica o de vacuna obtenible mediante un método o mediante un uso conforme a la invención, estando el virus o la proteína viral exentos de cualquier material proteináceo de mamífero no humano, y una formulación farmacéutica que comprende dicho virus y/o proteína viral. Ejemplos de tales virus incluyen los que se describen en la solicitud de patente en copropiedad, titulada “Vectores de AAV Modificados que Tienen Inmunogenicidad de Cápside Reducida, Y Uso de los Mismos”, presentada en la misma fecha que la presente, y que reivindica el beneficio de la solicitud de Patente Provisional US núm. 60/795.965, depositada el 28 de Abril de 2006.

De ese modo, en una realización, la invención proporciona un kit para producir AAV tal y como se describe en la presente memoria. Dicho kit puede contener uno o más de los componentes que siguen. Se puede suministrar una célula de producción adecuada capacitada para dirigir el empaquetamiento de una partícula viral de AAV. Alternativamente, dicha célula de producción puede haber sido alterada de tal modo que carezca de la capacidad de expresar heparina susceptible de enlazar con un sitio de enlace de heparina. Otros componentes adecuados pueden incluir un reactivo de transfección, un componente plásmido para la construcción de un vector, un componente necesario para la recogida, purificación, concentración o cultivo de la partícula de AAV ensamblada, un reactivo para selección negativa o positiva de partícula viral a efectos de purificación, un reactivo para concentración de la preparación viral, y/o un reactivo para la digestión enzimática de contaminantes en la preparación viral.

Los ejemplos que siguen son ilustrativos de métodos para producir partículas de AAV en el sobrenadante de cultivos celulares de acuerdo con la presente invención.

Ejemplo 1

Experimentales

Células 293 fueron transfectadas con CaPO4 con plásmidos requeridos para la producción de AAV, es decir, AAV2 rep, una construcción auxiliar adenoviral y un casete de transgén flanqueado por ITR. El plásmido de AAV2 rep contiene también la secuencia cap del virus particular que se está estudiando. La secuencia cap es la única variable en todos los experimentos. Se han repetido estos experimentos para diversos casetes de transgén. Veinticuatro horas después de la transfección, lo que ocurrió en DMEM que contenía suero, el medio fue sustituido por medio de refresco con, o sin, suero. Tres (3) días después de la transfección, se tomó una muestra (I) en el medio de cultivo de las células 293 adherentes. Los células fueron posteriormente raspadas y transfectadas en un receptáculo. Tras la centrifugación para extraer el sedimento celular, se tomó una muestra (II) en el sobrenadante después del raspado. A continuación, se obtuvo lisis celular mediante tres ciclos consecutivos de congelación/descongelación (80 ºC a 37 ºC). El residuo celular fue extraído y se tomó una muestra (III) del medio. Las muestras fueron cuantificadas en cuanto a AAV mediante titulación de genoma resistente a DNasa mediante PCR Taqman™. El rendimiento de producción total a partir de tal transfección fue igual a la concentración de partícula de la muestra III. Tres fracciones están contenidas en ésta: en particular, la fracción de sobrenadante de cultivo, la fracción de sedimento celular y la fracción que se libera mediante raspado y posterior centrifugación de las células. Las cantidades absolutas de estas fracciones se obtienen de la manera que sigue.

Cantidad de partícula sobrenadante = cantidad de partícula muestra I

Fracción de cantidad de partícula extraída mediante raspeado y giro (célula pobremente asociada) = cantidad de partícula muestra II menos muestra I

Fracción de cantidad de partícula en sedimento celular = cantidad de partícula muestra III menos muestra II.

Resultados:

La presencia del motivo (dominio) RxxR [SEQ ID No. 12] no sólo restringe considerablemente la localización de las partículas de AAV en el sedimento celular sino que limita su producción a partir del substrato celular posiblemente por saturación. Esta limitación no ha sido observada para homólogos de AAV2 de enlace de no heparina o en AAV8 (Figuras 1 y 2). La presencia (S) o la ausencia (SF) de suero (Figura 2) no parece impactar drásticamente sobre la producción de partículas de AAV para el AAV de enlace de no heparina. El efecto de saturación de AAV2 de enlace de heparina, por otra parte, parece ser mitigado en parte en presencia de suero.

En otro ejemplo, con la utilización de los métodos de la técnica anterior a nivel de laboratorio, se podía prever que alrededor de 40 platos de 15 cm producirían por término medio AAV2/7 en torno a un total de 4 x 1013 partículas. La presente invención permite, con la inclusión del sobrenadante, que se cultiven hasta 4,7 x 1012 partículas por placa.

También, en combinación con el uso de un medio exento de suero, esta tecnología reduce los esfuerzos posteriores de purificación drásticamente. Más en particular, el AAV2/1 y el AAV2/8 producidos con la utilización del método de recogida de sobrenadante de la invención, fueron comparados con el AAV2/1 y el AAV2/8 producidos con la utilización de los métodos anteriormente descritos y purificados mediante gradiente de CsCl. Para ambos virus, se observó una infectividad significativamente más alta para las partículas de AAV2/1 y de AAV2/8 obtenidas de acuerdo con el método de recogida de sobrenadante de la invención a través de una gama de concentraciones.

Reproduciblemente, para un gran número de aislados de AAV, las partículas resistentes a DNasa procedentes de una transfección de un solo plato de 15 cm fueron producidas con plásmido adeno-auxiliar deltaF6, plásmido trans de expresión rep-cap de AAV para empaquetamiento, y plásmido cis de AAV2.CMV.eGFP para el genoma del vector. Los títulos para estas purificaciones a pequeña escala para aislados de enlace de no heparina, añadieron hasta 1012 a 1013 partículas contenedoras de copia de genoma por placa (Figura 3). Estas cantidades son suficientes para la mayor parte de las aplicaciones de laboratorio para experimentación in vitro o in vivo.

Ejemplo 2

Se investigó la liberación de vector en el sobrenadante para los serotipos 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 y 9, así como nuevos vectores rh32.33, rh.10, hu.11, AAV6.2, AAV6.1, AAV6.1.2, rh64R1 y rh8R. Se encontró que el AAV2, el AAV2/3 y el AAV2/5 secretaban mínimamente (menos del 10% de genomas o partículas de vector resistentes a Dnasa total (drp vg)). Se liberó AAV2/9 moderadamente al sobrenadante durante la producción de vector viral (más de un 10%, menos de un 20% del drp vg total). Todos los demás vectores probados secretaron más de un 20% de las partículas virales en el sobrenadante durante la producción sobre células 293 a continuación de la triple transfección.

La infectividad de los vectores cultivados a partir del sobrenadante fue comparada con la de las preparaciones purificadas (CsCl puro con excepción de AAV2 que era heparina purificada), así como con la del vector cultivado a partir de lisados de sedimento celular. Se encontró que el AAV cultivado a partir del sobrenadante era de una infectividad igual o mayor cuando se comparó con las dos últimas fracciones en un ensayo de transducción de células 293 para vector de AAV basado en el aislado 1, 2, 6, 8 ó 9, así como también en el AAV2HSPG-.

La liberación de vector en el sobrenadante parece estar correlacionada con su afinidad a la heparina. La ablación de esta afinidad mediante mutación genética del motivo de enlace de heparina (en SGNT, SEQ ID No. 19) de AAV2 natural (SEQ ID No. 9) RGNR [SEQ ID No. 18], incrementa la fracción de vector que se libera en el sobrenadante en más de un 40%. La introducción de argininas de enlace de heparina en la posición homóloga en el cápside de AAV8 (enlace de no heparina, SEQ ID No. 11) produce el vector AAV8RQNR que está asociado casi por completo con el sedimento celular durante el cultivo de producción de vector viral. Esto contrasta con su vector AAV8 parental que por término medio libera más de un 40% de sus partículas de genoma de vector recuperable hacia el sobrenadante.

Ejemplo 3

Se realizó un estudio de inmunización para evaluar el efecto de una diversidad de vectores de AAV que tienen diferentes cápsides sobre la activación de células T. El estudio comparó un cápside de AAV6 natural, que se sabe que tiene un dominio de enlace de heparina en el residuo de lisina en la posición 531 con tres AAV modificados que tienen cápsides con modificaciones específicas del sitio introducidas. Se utilizaron estos AAV, designados como AAV2/6.2 (modificados en una posición distinta de K531), AAV2/6.1 (que tienen un cápside de AAV6 [SEQ ID No. 3] modificado en posición 531 para contener un ácido glutámico (es decir, un cambio de aminoácido no conservador), y AAV2/6.1.2 que tiene un cápside de AAV6 con ambas modificaciones del cápside de AAV6.2 y de AAV6.1. La secuencias y la generación de estos vectores se han descrito en la solicitud de Patente Internacional núm. PCT/US06/13375. El AAV1 sirvió como control negativo y el AAV2 sirvió como control positivo.

Ratones Balb/c (macho) fueron inmunizados intramuscularmente con 1 x 1011 de vector de GC AAV2/6, AAV2/6.1, AAV2/6.2, AAV2/6.1.2, AAV2/1 o AAV2. Trece (13) días después se cultivaron esplenocitos procedentes de 3 ratones por grupo, y se agruparon. Cantidades iguales de esplenocitos fueron estimulados in vitro con el epítope IPQYGYLTL [SEQ ID No. 1] de AAV de Balb/c en un ensayo ELISPOT. Véase la Figura 4.

Estos resultados muestran que el vector viral contenía niveles de células T inducidas por cápside de AAV6 sin modificar, comparables a las inducidas por el cápside de AAV2. Por el contrario, los vectores de AAV6 modificados que tenían dominios de enlace de heparina ablacionados (AAV2/6.1 y AAV2/6.1.2) tuvieron respuestas de células T que eran virtualmente indistinguibles del control negativo (AAV1).

Esto demuestra que cambiando un residuo de aminoácido responsable de mediar en el enlace de heparina con un cápside de AAV por un residuo de amino ácido no conservador, no solo se ablaciona el enlace de heparina, sino que también, se reduce significativamente la activación de células T.

Ejemplo 4

Varios AAVs de serotipos fueron evaluados en cuanto a su capacidad de enlazar con una membrana de intercambio de iones (Mustang Q, Pall Scientific) en tampones con pHs comprendidos en la gama de 6,0 a 9,0, y se monitorizó la elución utilizando de 0 a 500 mM de gradiente salino. Los tampones de pH alto fueron más adecuados para el enlace y la elución de los serotipos probados (Tabla 1). La elución de tres serotipos (AAV8, AAV7 y Rh8Rc) ocurrió en la gama de 100 a 150 mM del gradiente mientras que dos (AAV9 y Rh64R1) eluyeron directamente a continuación de la aplicación del gradiente. Las recuperaciones de material cargado estuvieron en la gama del 50% (AAV7) al 100% (Rh64R1).

Tabla 1

Características de Enlace y Elución de nuevos serotipos de AAV con Membranas Mustang Q

pH Óptimo para Enlace y Elución: Punto de Inicio de Elución (mM) Producción de Elución Óptima

AAV7: 8 145 50%

AAV8: 9 110 71%

AAV9: 8,5 10 63%

Rh8Rc: 9 110 67%

Rh64R1: 9 10 100%

Los datos muestran que la tecnología de membrana de intercambio de iones es aplicable para la purificación de un número de serotipos de AAV. Debido a las altas tasas de flujo y a las capacidades de enlace que ofrece la estructura microporosa de la membrana, esta tecnología resulta particularmente adecuada para la purificación de AAV procedente de sobrenadantes de cultivo celular. Los datos indican que la dilución de sobrenadante o el intercambio de tampón deberá ser necesario para obtener concentraciones de sal apropiadas para el enlace de AAV con membranas de intercambio de iones.

Listado de secuencias

<110> Los fideicomisarios de la Universidad de Pennsylvania Lock, Martin Vandenberghe, Luc H. Wilson, James M.

<120> PRODUCCIÓN ESCALABLE PARA AAV

<130> UPN-S4197PCT

<150> US 60/796.229

<151>

<160> 19

<170> Patentin versión 3.4

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> epítope de AAV de Balb/c

<400> 1

Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu 1 5

<210> 2

<211> 736

<212> PRT

<213> Adenovirus humano tipo 1

<400> 2

5: <211> 4 < 212> PRT <213> Adenovirus humano

<400> 18

10 15: <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Adenovirus humano <400> 19 Arg Gly Asn Arg 1

20: Ser Gly Asn Thr 1

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un método para la producción de AAV, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a)

cultivar un AAV carente de un sitio de enlace de heparina en un cultivo celular, y

(b)

aislar el AAV del sobrenadante del cultivo celular sin que se requiera la recogida de un sedimento celular o la disrupción celular.
2.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el método comprende además una o ambas de las etapas siguientes:

(c) mantener un cultivo celular viable, y

(d) añadir medio durante, o a continuación de, la recogida del sobrenadante para proporcionar un proceso de producción continuo. y, opcionalmente, repetir las etapas de método al menos dos veces y opcionalmente hasta 100 veces.
3.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el AAV es AAV8. 4.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el AAV ha sido modificado para la ablación de un sitio de enlace natural de heparina.
5.- El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el sitio de enlace de heparina está caracterizado por la

secuencia de aminoácido RxxR (SEQ ID No. 12), donde X es cualquier aminoácido. 6.- El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el AAV se elige en el grupo consistente en AAV2, hu.51, hu.34, hu.35, hu.45 y hu.47.
7.- El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el sitio de enlace de heparina se modifica según una o más de las siguientes maneras:

(a)

se modifica el primer aminoácido de la secuencia RxxR (SEQ ID No. 12);

(b)

se cambia el primer aminoácido de la RxxR (SEQ ID No. 12) desde Arg a Ser o Glu;

(c)

se modifica el sitio de enlace de heparina en el último aminoácido de la secuencia RxxR (SEQ ID No. 12), y/o

(d)

se cambia el último aminoácido de la secuencia RxxR (SEQ ID No. 12) desde Arg a Thr.
8.- El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de cultivo se realiza en un medio carente de suero.
9.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el AAV se cultiva en una célula HEK 293.
10.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de aislamiento comprende además concentrar AAV mediante un método elegido en el grupo consistente en cromatografía, cromatografía basada en columna, cromatografía basada en membrana, filtración y precipitación.
11.- Un método para producir AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las células del cultivo celular (a) comprenden:

funciones auxiliares de adenovirus necesarias para empaquetamiento, una proteína rep de AAV suficiente para empaquetamiento, una proteína cap de AAV suficiente para empaquetamiento, y el genoma de AAV que va a ser empaquetado.
12.- El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que las células son transformadas de manera estable con uno o más de lo siguiente:

(a)

las secuencias que codifican las funciones auxiliares de adenovirus (estando opcionalmente las funciones auxiliares de dicho adenovirus expresadas bajo un promotor activable o inducible);

(b)

las secuencias que codifican la proteína rep de AAV y/o la proteína cap de AAV (estando dichas proteína rep de AAV y/o proteína cap de AAV opcionalmente expresadas bajo la dirección de un promotor activable

o inducible); y/o

(c)

el genoma de AAV que va a ser empaquetado.