CN102803478B - 用于纯化重组aav载体的改进方法 - Google Patents

用于纯化重组aav载体的改进方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于纯化重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法，该方法能被用于基因转移且特别用于基因治疗或免疫。本发明的重组AAV载体实质上不含工序内杂质，包括生产组分如细胞核酸、细胞蛋白质、辅助病毒和培养基组分。

Description

用于纯化重组AAV载体的改进方法
相关申请的交叉引用
此申请要求2009年6月16日提交的美国临时申请序列号61/187,601的优先权，在此以其整体引入作为参考。
技术领域
本发明一般涉及重组腺相关病毒(rAAV)载体纯化的领域，该载体能够被用于基因转移且特别用于基因治疗或免疫。更特别的是，本发明涉及用于纯化重组rAAV载体的方法，该载体实质上不含生产工序内生产组分(如细胞核酸、细胞蛋白质、辅助病毒和培养基组分)。
背景技术
腺相关病毒(AAV)具有使其成为有效的基因治疗载体和遗传疫苗的独特性质。培养中细胞的AAV感染不引起细胞病变，而人类和其他动物的自然感染是隐性的、无症状的，并且和任何人类疾病的病因无关。而且，AAV感染包括很多哺乳动物细胞的广泛的细胞类型，使其可能针对体内许多不同组织。AAV感染缓慢***和不***细胞，而且基本上能作为转录活性的核附加体(染色体外因子)持续那些细胞的寿命。整合拷贝的rAAV载体在如肝或肌肉的器官内非常稀少。有效的长期基因转移已在多种细胞类型(包括眼睛、CNS和肌肉)中有报道，见例如X.Xiao等，J.Virol.70(11)：8098-8108(1996)；R.R.Ali等，Hum.MoI.Genet.5(5)：591-94(1996)。现在的临床研究大部分集中在血清型2rAAV载体的使用，但许多报道证实了其他AAV血清型(包括rAAV-1、rAAV-4、rAAV-5和rAAV-8)具有独特的体内生物分布，这使得它们成为在临床试验中试验的有效病毒血清型。
腺相关病毒(AAV)是复制缺陷性细小病毒，其单链DNA基因组长为大约4.7kb，包括145个核苷酸的反向末端重复(ITRs)。AAV血清型2(AAV2)基因组的核苷酸序列呈现在Srivastava等，J.Virol.，45：555-564(1983)中，由Ruffing等，J.Gen.Virol.，75：3385-3392(1994)修正。在ITRs内包含指导病毒DNA复制(rep)、壳体化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列。三个AAV启动子(p5、p19、和p40，以它们的相对图谱位置命名)指挥编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p19)，连同在2107和2227位核苷酸的单个AAV内含子的差异拼接，导致自rep基因生产四个rep蛋白质(rep78、rep68、rep52和rep40)。Rep蛋白具有最终负责复制病毒基因组的多重酶性质。cap基因自p40启动子表达并且它编码三个衣壳蛋白质VP1、VP2和VP3。可变剪接和非共有翻译起始位点负责生产三个相关的衣壳蛋白质。一个单一共有多聚腺苷酸位点坐落在AAV基因组图谱95位。在Muzyczka，CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology，158：97-129(1992)中综述了AAV的生活周期和遗传学。
AAV颗粒包括具有三个衣壳蛋白质VP1、VP2和VP3的蛋白质化衣壳，该蛋白质化衣壳由～4.6kb的线性单链DNA基因组包围。单独颗粒只包装一个DNA分子链，但此分子可能是正链或负链。含有任一链的颗粒是具感染性的，并以转换亲本感染单链为双链形式发生复制及随后的扩增，由此置换掉后代单链并包装进衣壳。AAV基因组的双链或单链拷贝(有时被称为“前病毒DNA”或“前病毒”)能被***至细菌质粒或噬菌粒，并转染入腺病毒感染的细胞。关于AAV的一般综述见Carter，HANDBOOKOFPARVOVIRUSES，第一卷，169-228页(1989)和Berns，VIROLOGY，1743-1764页，RavenPress，(1990)。
rAAV载体生产通常需要四个普遍元素：1)用于复制的可感染宿主细胞；2)能由合适的辅助病毒(如腺病毒或单纯疱疹病毒)、或由包含最小腺病毒辅助功能的质粒构建体提供的辅助病毒功能；3)反式包装rep-cap构建体；和4)合适的生产培养基。
重组AAV颗粒能够自包装细胞裂解物生产。见例如Chirico和Trempe(1998)J.Virol.Methods76：31-41。然而，细胞裂解物包含不同细胞组分如宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白质、培养基成分和辅助病毒或辅助病毒质粒DNA，在其适于体内使用之前必须将这些组分从rAAV载体中分开。rAAV生产中的近期进展包括使用在搅拌罐生物反应器中的非粘附细胞悬浮工艺及在其中rAAV载体被释放至培养基或上清、降低生产材料中含有的宿主细胞组分浓度但仍含有数目可观的工序内杂质的生产条件。见美国专利号6,566,118和PCTWO99/11764。因此，可以从培养基和/或细胞裂解物中收集和进一步纯化rAAV颗粒。
纯化rAAV载体及特别是rAAV-2所用的包括密度梯度离心的方法不适合规模放大。最近关于rAAV-2载体的报道已描述了使用离子交换层析包括反向离子交换层析(包括阳离子和阴离子层析)的纯化方法。见例如美国专利号6,566,118和PCTWO99/11764，其公布了使用反向离子交换层析的组合用于自培养上清和/或细胞裂解物纯化重组腺相关病毒载体的方法。rAAV储备物制备的另外的进展包括使用脱氧胆酸盐处理细胞裂解物、亲和层析之前的碘克沙醇梯度分离(其产生了高滴度rAAV2，Clark等，Hum.MoI.Genet.10(6)：1031-39(1999)；Zolotukhin等，GeneTherapy6(6)：973-985(1999))。O′Riordan等(O′Riordan等，J.GeneMed.2：444-454(2000)；美国专利号7,015,026)也报道了使用离子交换层析、羟磷灰石层析、硫酸cellufine(cellufine)亲和层析和锌螯合层析用于重组腺相关病毒载体及如特别例证的rAAV-2载体的可放大的层析纯化方法。
最近数据表明，rAAV衣壳血清型如rAAV-1、4、5和8(或作为纯化病毒储存物或在有工序内生产杂质如宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白质、血清白蛋白、培养基组分及辅助病毒组分的存在下)微弱结合于阴离子树脂。因此，那些衣壳血清型的纯化通常包括结合其他纯化方法(如碘克沙醇密度梯度离心)的阴离子交换层析。见例如Zolotukhin等，Methods28(2)：158-167(2002)和Kaludov等，Hum.GeneTherapy13：1235-1243(2002)；及美国专利文献号2004/0110266A1。然而，那些方法不容易放大到商业规模的过程。
因此，在发展(如那些用于基因治疗和基因疫苗的)重组AAV载体方面，存在从工序内生产组分(包括辅助病毒，以及辅助病毒蛋白质、细胞蛋白质、宿主细胞DNA、和rAAV生产储存物中含有的培养基组分)中纯化rAAV载体的方法的需要。此类方法应该能在适于基因治疗技术实际应用的规模上有效使用。而且，存在发展可放大生产以用于rAAV基因治疗和基因疫苗的高滴度、高度纯化商品储存物的rAAV载体的纯化方法的需要。更特别的是，存在发展微弱结合于层析树脂及特别是阴离子树脂的rAAV载体纯化方法的需要。
在此说明中引用的所有文献、专利申请及专利的公开在此引入作为参考，如同特定、个别指明每一单独文献、专利申请或专利被引入作为参考。特别是，在此引用的所有文献是在此明确引入作为参考，用于描述和公开可能与本发明相关使用的组合物和方法的目的。尽管为清晰理解的目的，在此提供的本发明以说明和实施例的方式已有详细描述，对于本领域普通技术人员显而易见的是，根据本发明的教导、在不背离附加权利要求的精神或范围的情况下可以对其做出某些改变和修改。
发明内容
本发明提供了在聚乙二醇(PEG)存在下，通过在磷灰石层析介质上捕获rAAV颗粒，自工序内杂质中分离任意衣壳血清型的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒群落的方法。本发明的方法涉及上游加工(如，例如离心、以处理、阴离子交换过滤、和/或切向流过滤)及下游加工(如，例如热灭活、过滤、疏水相互作用层析、体积排阻层析、和/或阴离子交换层析)。上游和下游方法可以单独使用或以不同组合使用。
本发明提供了用于自原料流中工序内杂质分离重组腺相关病毒(rAAV)颗粒群落的方法，包括以下步骤：(a)在聚乙二醇(PEG)存在下、以磷灰石层析介质接触含rAAV颗粒的原料流，其中rAAV颗粒结合于磷灰石层析介质；及(b)以包含小于3％(w/v)PEG的洗脱缓冲液洗脱结合于磷灰石层析介质的rAAV颗粒。在某些实施方案中，该磷灰石层析介质是陶瓷羟基磷灰石(CHT)或陶瓷氟磷灰石(CFT)。在某些实施方案中，以包含小于3％(w/v)PEG的洗脱缓冲液洗脱结合于磷灰石层析介质的rAAV颗粒。在某些实施方案中，以不含PEG的洗脱缓冲液洗脱结合于磷灰石层析介质的rAAV颗粒。
在某些实施方案中，磷灰石层析介质的特异结合在每毫升106到1016DNA酶抗性颗粒(DRP)之间。在某些实施方案中，磷灰石层析介质的特异结合在每毫升108到1016DNA酶抗性颗粒(DRP)之间。在某些实施方案中，磷灰石层析介质的特异结合在每毫升1010到1016DNA酶抗性颗粒(DRP)之间。在某些实施方案中，磷灰石层析介质的特异结合在每毫升1012到1016DNA酶抗性颗粒(DRP)之间。在某些实施方案中，磷灰石层析介质的特异结合在每毫升1014到1016DNA酶抗性颗粒(DRP)之间。
在某些实施方案中，该方法还包括磷灰石层析步骤前的阴离子交换过滤步骤，其中rAAV颗粒在阴离子交换过滤的流过液中。在某些实施方案中，该方法还包括磷灰石层析步骤前通过切向流过滤自阴离子交换过滤的流过液中浓缩rAAV颗粒。在某些实施方案中，该方法还包括将洗脱自磷灰石层析介质的原料流中rAAV颗粒结合于阴离子层析介质的步骤。在某些实施方案中，该方法还包括热灭活步骤以灭活辅助病毒。在某些实施方案中，该方法还包括在磷灰石层析后将原料流中rAAV颗粒结合于疏水相互作用层析的步骤。
在某些实施方案中，在聚乙二醇(PEG)和碱性缓冲液存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，碱性缓冲液为pH7.2到10、pH7.4到10、pH7.6到10、pH7.8到10、pH8.0到10.0、pH8.2到10.0、pH8.4到10.0、pH8.6到10.0、pH8.8到10、pH9.0到10.0、pH9.2到10、pH9.4到10.0、pH9.6到10.0、或pH9.8到10.0。在某些实施方案中，碱性缓冲液具有pH为大约7.2、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、和10.0的任一个。可以使用本领域已知的任意碱性缓冲液。在某些实施方案中，碱性缓冲液包括硼酸盐。在某些实施方案中，碱性缓冲液为硼酸盐。
在某些实施方案中，在聚乙二醇(PEG)存在下，用磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。例如，可以使用约3％(w/v)到约10％(w/v)的PEG。在某些实施方案中，在约3％(w/v)、约3.5％(w/v)、约4％(w/v)、约4.5％(w/v)、约5％(w/v)、约5.5％(w/v)、约6％(w/v)、约6.5％(w/v)、约7％(w/v)、约7.5％(w/v)、约8％(w/v)、约8.5％(w/v)、约9％(w/v)、约9.5％(w/v)、或约10％(w/v)PEG存在下，用磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。
在某些实施方案中，PEG平均分子量为约5,000克/摩尔(PEG5000)到约15,000克/摩尔(PEG15000)，如约5,000克/摩尔(PEG5000)、约6,000克/摩尔(PEG6000)、约7,000克/摩尔(PEG7000)、约8,000克/摩尔(PEG8000)、约9,000克/摩尔(PEG9000)、约10,000克/摩尔(PEG10000)、约11,000克/摩尔(PEG11000)、约12,000克/摩尔(PEG12000)、约13,000克/摩尔(PEG13000)、约14,000克/摩尔(PEG14000)、和约15,000克/摩尔(PEG15000)。在某些实施方案中，PEG平均分子量为约5,000克/摩尔(PEG5000)。在某些实施方案中，PEG平均分子量为约6,000克/摩尔(PEG6000)。在某些实施方案中，PEG平均分子量为约8,000克/摩尔(PEG8000)。在某些实施方案中，PEG平均分子量为约10,000克/摩尔(PEG10000)。在某些实施方案中，PEG平均分子量为约15,000克/摩尔(PEG15000)。
在某些实施方案中，在约3％(w/v)到约10％(w/v)的PEG6000存在下，用磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约3％(w/v)PEG6000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约4％(w/v)PEG6000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约5％(w/v)PEG6000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约6％(w/v)PEG6000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约7％(w/v)PEG6000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约8％(w/v)PEG6000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约9％(w/v)PEG6000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约10％(w/v)PEG6000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。
在某些实施方案中，在约3％(w/v)到约10％(w/v)的PEG8000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约3％(w/v)PEG8000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约4％(w/v)PEG8000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约5％(w/v)PEG8000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约6％(w/v)PEG8000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约7％(w/v)PEG8000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约8％(w/v)PEG8000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约9％(w/v)PEG8000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约10％(w/v)PEG8000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。
在某些实施方案中，在约3％(w/v)到约10％(w/v)的PEG10000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约3％(w/v)PEG10000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约4％(w/v)PEG10000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约5％(w/v)PEG10000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约6％(w/v)PEG10000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约7％(w/v)PEG10000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约8％(w/v)PEG10000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约9％(w/v)PEG10000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约10％(w/v)PEG10000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。
在某些实施方案中，在约3％(w/v)到约10％(w/v)的PEG15000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约3％(w/v)PEG15000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约4％(w/v)PEG15000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约5％(w/v)PEG15000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约6％(w/v)PEG15000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约7％(w/v)PEG15000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约8％(w/v)PEG15000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约9％(w/v)PEG15000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，在约10％(w/v)PEG15000存在下，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。
在某些实施方案中，在包括约20mM硼酸盐(pH9.0)和约5％PEG(如PEG6000)的缓冲液中，以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流。在某些实施方案中，原料流在线混合于等体积的包括约40mM、pH9.0的硼酸盐和约10％PEG的缓冲液，以产生终浓度为约20mM、pH9.0的硼酸盐和约5％的PEG。
在某些实施方案中，洗涤带有结合于介质的rAAV颗粒的磷灰石层析介质以在洗脱rAAV颗粒之前去除工序内杂质。在某些实施方案中，以包含降低浓度PEG的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次以去除工序内杂质。在某些实施方案中，以包含约3％(w/v)到约10％(w/v)PEG的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包含约10％(w/v)、9.5％(w/v)、9％(w/v)、8.5％(w/v)、8％(w/v)、7.5％(w/v)、7％(w/v)、6.5％(w/v)、6％(w/v)、5.5％(w/v)、5％(w/v)、4.5％(w/v)、4％(w/v)、3.5％(w/v)、和3％(w/v)PEG的任意一个。在某些实施方案中，以包含7.5％(w/v)PEG6000的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。在某些实施方案中，以包含7.5％(w/v)PEG8000的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。在某些实施方案中，以包含7.5％(w/v)PEG10000的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。在某些实施方案中，以包含7.5％(w/v)PEG15000的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。在某些实施方案中，以包含5％(w/v)PEG6000的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。在某些实施方案中，以包含5％(w/v)PEG8000的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。在某些实施方案中，以包含5％(w/v)PEG10000的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。在某些实施方案中，以包含5％(w/v)PEG15000的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。在某些实施方案中，以包含小于3％(w/v)PEG6000的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。在某些实施方案中，以包含小于3％(w/v)PEG8000的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。在某些实施方案中，以包含小于3％(w/v)PEG10000的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。在某些实施方案中，以包含小于3％(w/v)PEG15000的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。在某些实施方案中，以不含PEG的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。
在某些实施方案中，洗涤缓冲液包含本领域已知的缓冲液。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括选自硼酸盐、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙二酸(HEPES)和Tris-HCl的缓冲液。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为硼酸盐。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为HEPES。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为Tris-HCl。在某些实施方案中，洗涤缓冲液是碱性pH。在某些实施方案中，洗涤缓冲液pH为pH7.0到pH10.0、pH7.2到pH10.0、pH7.4到pH10.0、pH7.6到pH10.0、pH7.8到pH10.0、pH8.0到pH10.0、pH8.2到pH10.0、pH8.4到pH10.0、pH8.6到pH10.0、pH8.8到pH10.0、pH9.0到pH10.0、pH9.2到pH10.0、pH9.4到pH10.0、pH9.6到pH10.0、或pH9.8到pH10.0。在某些实施方案中，洗涤缓冲液pH为7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、或10.0。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为pH8.0到10.0的硼酸盐。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为pH8.0的硼酸盐。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为pH9.0的硼酸盐。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为pH10.0的硼酸盐。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为pH7.0到10.0的HEPES。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为pH7.0的HEPES。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为pH8.0的HEPES。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为pH9.0的HEPES。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为pH10.0的HEPES。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为pH7.0到10.0的Tris-HCl。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为pH7.0的Tris-HCl。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为pH8.0的Tris-HCl。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为pH9.0的Tris-HCl。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括或为pH10.0的Tris-HCl。在某些实施方案中，洗涤缓冲液还包括100到500mM的磷酸盐。在某些实施方案中，洗涤缓冲液还包括50到250mM的NaCl。
在某些实施方案中，洗涤步骤包括用包括约30mM、pH约为9.0的硼酸盐和约7.5％PEG的洗涤缓冲液的第一次洗涤；用包括约150磷酸钾、约20mM、pH约为9.0的硼酸盐和约5％PEG的洗涤缓冲液的第二次洗涤；用包括约20mM、pH约为9.0的硼酸盐和约5％PEG的洗涤缓冲液的第三次洗涤；和用包括约20mM、pH约为7.0的HEPES和150mMNaCl的洗涤缓冲液的第四次洗涤。
在某些实施方案中，以包含低浓度PEG或不含PEG的洗脱缓冲液洗脱结合于磷灰石层析介质的rAAV颗粒。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包含小于约3％(w/v)PEG、小于约2％(w/v)PEG、或小于约1％(w/v)PEG。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包含约2.5％(w/v)、约2％(w/v)、约1.5％(w/v)、约1％(w/v)、或约0.5％(w/v)PEG、或无PEG。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包含小于约3％(w/v)PEG6000。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包含小于约3％(w/v)PEG8000。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包含小于约3％(w/v)PEG10000。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包含小于约3％(w/v)PEG15000。在某些实施方案中，以不含PEG的洗脱缓冲液洗脱结合于磷灰石层析介质的rAAV颗粒。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括选自硼酸盐、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙二酸(HEPES)和Tris-HCl的缓冲液。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括或为硼酸盐。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括或为HEPES。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括或为Tris-HCl。在某些实施方案中，洗脱缓冲液是中性pH。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括或为中性pH的HEPES。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括或为中性pH的Tris-HCl。在某些实施方案中，洗脱缓冲液还包括小于100mM的磷酸盐。在某些实施方案中，洗脱缓冲液还包括小于50mM的磷酸盐。在某些实施方案中，洗脱缓冲液还包括50到250mM的NaCl。在某些实施方案中，以包括约50mM磷酸钾、约20mM、pH约7.0的HEPES和约150mMNaCl的洗脱缓冲液洗脱结合于磷灰石层析介质的rAAV颗粒。
在某些实施方案中，自原料流的工序内杂质中分离rAAV颗粒的方法包括以下步骤：(a)在约5％(w/v)PEG存在下、在pH约9.0的碱性缓冲液中以磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流，其中rAAV颗粒结合于磷灰石层析介质；(b)用包括约30mM、pH约为9.0的硼酸盐和约7.5％PEG的第一次洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质；(c)用包括约150磷酸钾、约20mM、pH约为9.0的硼酸盐和约5％PEG的第二次洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质；(d)用包括约20mM、pH约为9.0的硼酸盐和约5％PEG的第三次洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质；(e)用包括约20mM、pH约为7.0的HEPES和150mMNaCl的第四次洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质；及(f)以包括约50mM磷酸钾、约20mM、pH约7.0的HEPES和约150mMNaCl的洗脱缓冲液洗脱结合于磷灰石层析介质的rAAV颗粒。
在此还提供用于自原料流的工序内杂质中分离重组腺相关病毒(rAAV)颗粒群落的方法，包括以下步骤：(a)在高盐缓冲液中以疏水相互作用层析(HIC)介质接触含rAAV颗粒的原料流，其中rAAV颗粒和工序内杂质结合HIC介质；及(b)以中等盐缓冲液洗脱结合于HIC介质的rAAV颗粒。在某些实施方案中，HIC介质选自TosohButyl650M、TosohSuperButyl650C、TosohPhenyl650C、EMDFractogelPhenyl、和TosohHas(丁基)树脂(TosohHas(butyl)resin)。在某些实施方案中，高盐缓冲液包括或为0.5M到2.0M的柠檬酸盐(如柠檬酸钠)。在某些实施方案中，高盐缓冲液包括约0.5M、0.75M、1.0M、1.25M、1.5M、1.75M、和2.0M柠檬酸盐的任意一个。在某些实施方案中，中等盐缓冲液包括或为小于0.5M柠檬酸盐(如柠檬酸钠)。在某些实施方案中，中等盐缓冲液包括0.5M到约0.3M柠檬酸盐。在某些实施方案中，中等盐缓冲液包括约0.45M、0.4M、0.35M、0.3M、和0.25M柠檬酸盐的任意一个。在某些实施方案中，高盐缓冲液还包括1到100mM磷酸盐。在某些实施方案中，中等盐缓冲液还包括1到100mM磷酸盐。在某些实施方案中，中等盐缓冲液洗脱rAAV颗粒而不洗脱带空衣壳、部分变性衣壳、较弱感染性衣壳、和/或部分完整衣壳的rAAV颗粒。
在此所述的任意实施方案中，rAAV颗粒具有选自AAV-I、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15和AAV-16的AAV衣壳血清型。在某些实施方案中，rAAV颗粒具有选自AAV-I、AAV-4、AAV-5、和AAV-8的AAV衣壳血清型。在某些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV-1的AAV衣壳血清型。在某些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV-4的AAV衣壳血清型。在某些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV-5的AAV衣壳血清型。在某些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV-8的AAV衣壳血清型。在某些实施方案中，rAAV颗粒包括来自选自AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15和AAV-16的AAV血清型的AAV衣壳蛋白质。在某些实施方案中，rAAV颗粒具有是弱阴离子结合物的AAV衣壳血清型。在某些实施方案中，是弱阴离子结合的AAV衣壳血清型选自AAV-1、AAV-4、AAV-5、和AAV-8。在某些实施方案中，包含rAAV颗粒的组合物还包括生产培养污染物。在某些实施方案中，生产培养污染物包括损伤的rAAV颗粒、宿主细胞污染物、辅助病毒污染物、和/或细胞培养污染物。在某些实施方案中，宿主细胞污染物包括宿主细胞DNA、或宿主细胞蛋白质。在某些实施方案中，辅助病毒污染物包括腺病毒颗粒、腺病毒DNA、或腺病毒蛋白质。在某些实施方案中，细胞培养污染物包括培养基组分、血清白蛋白、或其它血清蛋白质。在某些实施方案中，细胞培养污染物包括培养基组分。在某些实施方案中，细胞培养污染物不包括血清白蛋白或其它血清蛋白质。
应理解在此所述不同实施方案的一个、几个、或全部性质可以组合形成本发明的其它实施方案。
附图说明
图1显示了自rAAV生产培养收获物的净化上清的消化结果。结果证实，在消化后没有高分子量DNA存在。
图2显示如实施例4所述筛选rAAV结合亲和性的典型树脂的典型分光光度示踪。标示了吸收(AU)和电导(mS/cm)。
图3显示有和无PEG时的突破能力分析。使用两种模型rAAV生产培养以评估磷灰石树脂(CFTI型)的性能。顶部面板：在上样物(load)中有或无约5％(w/v)PEG6000时上样含血清或无血清原料流期间的突破。上样体积指1∶1在线稀释前的起始原料流，并以每mL树脂体积标准化。底部面板：观察到1％突破和洗脱部分中回收时的上样体积(ml)。对于rAAV载体，在试验中使用的TFF收获物浓度约为1016DRP/ml。在约5％(w/v)PEG6000存在下，150mL的TFF收获物被上样至1.2mLCFT树脂而无突破，被限定为在柱流过液中有＞1％rAAV，对应于上样量为1.8x1014总rAAVDRP。
图4显示典型CHTI层析图。以线条显示Amersham3mmSkid所做的UV吸收A280(AU，吸收单位)和电导(mS/cm)测定。括号标记了实施例7中所述程序的主要节段。“NaOH”标记柱去污步骤。
图5显示自磷灰石树脂洗脱的rAAV载体的相对纯度。组A显示在流过液/驱赶(FT)、高磷酸盐/5％(w/v)PEG6000洗涤(P04)、用以去除磷酸盐和PEG6000的洗涤(WII/WIII)和洗脱之间的载体分布。分析精确度范围内的案例间的差异并不显著，而质量平衡的缺乏是典型的。组B显示与磷灰石柱洗脱组分相应的Sypro橙-染色的SDS-PAGE条带。每个样品以2x1011DRP/孔道上样；孔道间明显的迁移差异是由于不得不以蒸发浓缩CFT洗脱物至适合于凝胶的体积导致的盐假象。仅主要条带看起来是AAV衣壳蛋白质。组C显示与为清晰起见重新排列的条带相关的Ad5免疫印迹条带，证明Ad5蛋白质的可比的清除。
图6显示以SDS-PAGE评估整个过程中的纯化。来自代表性生产培养收获物的工序内样品在变性/还原10％聚丙烯酰胺凝胶上跑样并以Sypro橙染色。所有收获后样品以1x1010DRP/孔道上样。因为凝胶的体积限制，在TFF浓缩步骤前的两个上游样品(起始净化步骤和AEX流过液)只能以1x109DRP/孔道上样。以50ng/孔道上样β-半乳糖苷酶(B-Gal)以评估整个凝胶内染色的灵敏度和一致性。标示了三个AAV1衣壳蛋白质(VP1、2和3)。
图7显示如实施例1-12所述的rAAV纯化的逐步回收。在收获前上清中含的总DRP被定义为100％。每一步的回收率是回收的总DRP相对于那一步上加工的总DRP。整个过程的总回收率是大约28％。D4sup：生产培养；AEXFT：阴离子交换(Q)流过液；捕获：磷灰石层析；加热：热灭活或热杀死；HIC：疏水相互作用层析；SEC：体积排阻层析：AEX：阴离子交换。
具体实施方式
本发明的目的为，提供用于自生产培养污染物(如损伤rAAV颗粒、辅助病毒、辅助病毒蛋白质、质粒、细胞内蛋白质和DNA、培养基组分、血清蛋白质等等)中分离任意AAV衣壳血清型的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒群落的方法。另外，本发明方法提供与自高滴度rAAV生产培养收获物或原料流分离rAAV颗粒群落的调控需求相一致的、商业可放大的正交方法。以本发明方法分离的rAAV颗粒群落实质上无污染物，包括生产培养污染物和/或工序内污染物，如损伤rAAV颗粒、辅助病毒、辅助病毒蛋白质、质粒、细胞内蛋白质和DNA、培养基组分、血清蛋白质和葡聚糖。本发明方法特别适合于是弱阴离子结合物的rAAV载体血清型(例如rAAV-1、rAAV-4、rAAV-5和rAAV-8)。本发明还涵盖一种用于分离实质上无污染物(包括生产培养污染物和/或工序内污染物)的高滴度rAAV颗粒群落的方法，适用于基因治疗应用而无需进行密度梯度离心。
定义
在此使用的术语“分离”或“纯化”意指制备没有至少某些(可能存在于rAAV颗粒天然产生或最初制备来源的)其他组分的rAAV颗粒。因此，例如，分离的rAAV颗粒可能用纯化技术来制备以从来源混合物(如培养裂解物或生产培养上清)中富集它。能够以多种方式(如，例如，以溶液中存在的DNA酶抗性颗粒(DRP)的比例或以感染性)测定富集，或者，能够用与来源混合物中存在的第二个潜在干扰物质(如污染物，包括生产培养污染物或工序内污染物，包括如下所述的辅助病毒、培养基组分等等)相关的方法来测定富集。
如果感染性AAV颗粒与感染性辅助病毒颗粒的比例为至少约102∶1；优选至少约104∶1，更优选至少约106∶l；还更优选至少约108∶l，rAAV制备物被称为“实质上无”辅助病毒。制备物还优选无等量辅助病毒蛋白质(即，如果上述辅助病毒颗粒杂质以破坏方式存在时，作为由于此类水平辅助病毒出现的蛋白质)。病毒和/或细胞内蛋白质污染物通常能观察为SDS凝胶上出现的考马斯染色条带的存在(例如，那些相应于AAV衣壳蛋白质VPl、VP2和VP3之外的条带的出现)。
在此可互换使用的术语“弱阴离子结合物”或“低亲和性阴离子结合物”意指一rAAV颗粒，具有衣壳血清型，其在有污染物(包括生产培养污染物或工序内污染物)存在下不以保证从其它rAAV生产培养污染物中分离rAAV颗粒的足够亲和性结合。此种衣壳血清型为本领域已知，包括(不限于)AAV-1、AAV-5、AAV-8和AAV-4。如本领域所述，此类弱阴离子结合物通常以包括碘克沙醇(以商标名出售)或氯化铯梯度离心的至少一种密度离心步骤的方法纯化。
如在此使用的术语“辅助病毒”或“污染辅助病毒”意指当生产辅助病毒依赖性病毒载体(如腺相关病毒，其没有复制自身的能力)拷贝时使用的病毒。该辅助病毒用于与病毒载体一起共感染细胞并提供用来复制病毒载体基因组的必需蛋白质。术语涵盖完整病毒颗粒、空衣壳、病毒DNA等等。普遍用于生产rAAV颗粒的辅助病毒包括腺病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和牛痘病毒。
在此使用的术语“生产培养”意指含有rAAV载体颗粒生产所必需组分的容器。生产培养包括(不限于)下列组分：1)合适宿主细胞；2)辅助病毒功能；3)AAVrep和cap基因和基因产物；4)两侧为AAVITR序列的治疗性转基因；及5)合适培养基、培养基组分和培养基添加物，包括而不限于血清、血清衍生蛋白质、维生素、必需和非必需氨基酸、及已知支持rAAV生产的葡萄糖。
如在此所用，在此可互换使用的术语“污染物”、“生产培养污染物”、“工序内污染物”、“工序内杂质”、“杂质”或“污染物”意指(不限于)本领域已知用于支持生产rAAV载体的培养基配方；在本领域已知培养基配方中存在的培养基添加物如盐、小牛血清、氨基酸补充物、维生素补充物、生长因子、血清白蛋白和其他低分子量蛋白质；宽松宿主细胞、宿主细胞蛋白质或宿主细胞DNA；辅助病毒、辅助病毒蛋白质或辅助病毒DNA，如野生型腺病毒或疱疹病毒蛋白质；及其他在纯化过程中引入的非rAAV载体或rAAV载体生产培养材料(如葡聚糖)或自原料流纯化rAAV载体中所使用的层析缓冲液。
在此所用的术语“生产培养收获物”意思是包括以本领域已知方法(包括(不限于)转染方法、稳定细胞株生产、Ad-杂交生产***或杆状病毒生产***)，自rAAV载体生产培养生产的rAAV载体颗粒的溶液。另外，在此所用的术语“生产培养收获物”意指分离自生产培养容器的材料，并且既包括以本领域已知方法通过裂解rAAV生产者细胞分离的材料、又包括分离自在本领域已知用以生产自完整细胞释放至培养基中的rAAV颗粒的培养条件下维持的rAAV生产培养的材料。生产培养收获物可以包含下列的一些或全部(不限于)：rAAV载体颗粒、生产培养组分，如培养基组分、宿主细胞蛋白质、宿主细胞DNA、宿主细胞、辅助病毒、辅助病毒蛋白质、辅助病毒DNA、质粒DNA、载体病毒DNA、血清、血清衍生蛋白质和培养基添加物。
在此所用的术语“原料流”意指rAAV载体颗粒的来源，其上样至、流经或应用于层析介质。本发明的原料流包括生产培养收获物及分离自本发明以前层析步骤的材料(不管材料呈现为前一步的流过液、前一步中结合和洗脱部分，还是存在于前一步空隙体积或存在于纯化rAAV颗粒期间获得的任一部分)。此原料流可以包括在此所限定的“污染物”、“生产培养污染物”、“工序内污染物”、“工序内杂质”、“杂质”或“污染物”的一个或多个。
在此可互换使用的术语“捕获”、“结合(bound)”、“结合(binds)”或“结合(binding)”意指结合、粘附或粘住原料流的组分于层析介质。组分可以以本领域已知任意力或化学方式(包括(不限于)疏水、离子(包括阴离子和阳离子)、亲和、金属螯合和螯合)结合于层析介质。组分可以以一种以上类型的化学方式(如在磷灰石层析介质中)结合于层析介质。
在此可互换使用的“磷灰石树脂”、“磷灰石层析介质”、“磷灰石基质”或“磷灰石介质”意指包括磷酸钙矿物质的层析介质，并包括(不限于)陶瓷羟基磷灰石(CHT)和陶瓷氟磷灰石(CFT)层析介质。
术语“混合模式”或“多模式”意指具有一种以上结合化学能力的层析介质。混合模式层析介质包括(不限于)磷灰石层析介质(其能够通过钙基团实现金属亲和结合、通过骨架上含有的羟基形成氢键、通过介质上含有的钙基团实现正电荷排斥和负电荷吸引及通过磷酸基团实现负电荷排斥和正电荷吸引)。
一般涉及的“组合物(thecomposition)”或“组合物(compositions)”包括并适用于本发明组合物。
如在此所用的，除非另外说明，单数形式冠词“a”、“an”和“the”包括复数参考。例如，短语“病毒颗粒”包括一个或多个病毒颗粒。
在此涉及“约”一个值或参数包括(和描述)指向该值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
应理解在此所述的本发明方面和实施方案包括由和/或基本由多个方面和实施方案组成。
生产rAAV载体
用于生产rAAV载体的许多方法是本领域已知的，包括转染、稳定细胞株生产和感染性杂交病毒生产***(其包括腺病毒-AAV杂交、疱疹病毒-AAV杂交和杆状病毒-AAV杂交)。用于生产rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养均需要：1)合适宿主细胞，包括(例如)人源细胞系如HeLa、A549或293细胞、或在杆状病毒生产***情况下的昆虫源细胞系如SF-9；2)合适辅助病毒功能，通过野生型或突变腺病毒(如温度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；3)AAVrep和cap基因和基因产物；4)两侧为AAVITR序列的转基因(如治疗性转基因)；及5)支持rAAV生产的合适培养基和培养基组分。本领域已知合适培养基可以用来生产rAAV载体。这些培养基包括(不限于)Hyclone实验室和JRH生产的培养基，包括改良Eagle培养基(ModifiedEagleMedium，MEM)、Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco′sModifiedEagleMedium，DMEM)，如在美国专利号6,566,118中所述那些定制配方及如在美国专利号6,723,551中所述的Sf-900IISFM培养基，其中每一个以其整体在此引入作为参考，特别是关于用于生产重组AAV载体的定制培养基配方。
本发明的合适rAAV生产培养基可以用血清或血清衍生重组蛋白质以0.5％-20％(v/v或w/v)的水平补充。或者，如本领域已知，rAAV载体可以在无血清条件(可能也被称为无动物来源产物的培养基)下生产。本领域技术人员可以理解，设计用于支持生产rAAV载体的商业或定制培养基也可以用一个或多个本领域已知的细胞培养组分(包括不限于葡萄糖、维生素、氨基酸和或生长因子)补充，以提高生产培养中的rAAV滴度。
rAAV生产培养能够在多种适于所用特定宿主细胞的条件(在较宽的温度范围内、不同的时间长度，等等)下生长。如本领域已知，rAAV生产培养包括粘附依赖性培养(其能够培养于合适的粘附依赖性容器，如例如滚瓶、中空纤维过滤器、微载体、和填充床或流化床生物反应器)。rAAV载体生产培养可能还包括悬浮适应宿主细胞如HeLa、293和SF-9细胞，其能以多种方式培养(包括(例如)旋床烧瓶、搅拌罐生物反应器及一次性***如波气囊***)。
本发明的rAAV载体颗粒可以通过裂解生产培养的宿主细胞、或通过自生产培养收获所费培养基(如美国专利号6,566,118中更充分描述的，只要细胞是在本领域已知能导致rAAV颗粒从完整细胞释放到培养基的条件下培养的)自rAAV生产培养中收获。裂解细胞的合适方法也在本领域内已知，并且包括例如多次冻/融循环、超声、微射流和以化学品(如去污剂和/或蛋白酶)处理。
纯化rAAV载体
在收获时，本发明rAAV生产培养可能包含下列的一个或多个：1)宿主细胞蛋白质；2)宿主细胞DNA；3)质粒DNA；4)辅助病毒；5)辅助病毒蛋白质；6)辅助病毒DNA；及7)培养基组分，包括(例如)血清蛋白质、氨基酸、转铁蛋白与其他低分子量的蛋白质。此外，rAAV生产培养还包括具有选自AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15和AAV-16的AAV衣壳血清型的rAAV颗粒。在某些实施方案中，该rAAV颗粒具有选自AAV-1、AAV-4、AAV-5和AAV-8的AAV衣壳血清型。
在某些实施方案中，净化rAAV生产培养收获物以去除宿主细胞碎片。在某些实施方案中，通过过滤经过系列深度过滤器(包括，例如分级D0HCMilliporeMillistak+HCPod过滤器、分级AlHCMilliporeMillistak+HCPod过滤器和0.2m过滤器OpticapXL10MilliporeExpressSHC亲水膜过滤器(agradeDOHCMilliporeMillistak+HCPodFilter，agradeAlHCMilliporeMillistak+HCPodFilter，anda0.2mFilterOpticapXLl0MilliporeExpressSHCHydrophilicMembranefilter))净化生产培养收获物。也能够用本领域已知的多种其他标准技术(如离心或过滤经过本领域已知的0.2m或更大孔径的任意醋酸纤维素滤膜)实现净化。
在某些实施方案中，rAAV生产培养收获物还被用进一步处理以消化生产培养中含有的任意高分子量DNA。在某些实施方案中，在本领域已知的标准条件(包括，例如终浓度为1-2.5单位/ml的在从室温至37℃的温度下作用30分钟到数小时的时间)下完成消化。
可以使用下列纯化步骤的一个或多个分离或纯化rAAV颗粒：流过阴离子交换过滤、切向流过滤(TFF)以浓缩rAAV颗粒、以磷灰石层析捕获rAAV、热灭活辅助病毒，以疏水相互作用层析捕获rAAV、以体积排阻层析(SEC)做缓冲液交换、纳米过滤和以阴离子交换层析捕获rAAV。这些步骤可单独、以不同组合或以不同顺序使用。在某些实施方案中，方法包括按如下所述顺序的所有步骤。
阴离子交换过滤
可选地在某些实施方案中，净化并以处理的生产培养收获物在流过液中含rAAV载体而污染辅助病毒保留在带电过滤器上的条件下进行阴离子交换过滤。在rAAV生产培养收获物的离子强度下，以经过阴离子滤器如Q过滤器(Qfilter，PallCorp.，东山，纽约州)能够将rAAV颗粒与辅助病毒(例如腺病毒)区分开。本领域技术人员能够确定实现在净化、处理和阴离子过滤的生产培养中所含腺病毒和腺病毒蛋白质的最佳对数降低(LRV)所需过滤器的尺寸和数目。在某些实施方案中，LRV为至少一个对数且大于10个对数。在优选实施方案中，LRV是至少两个并大于八个对数。在更优选实施方案中，LRV是至少六个对数。
切向流过滤(TFF)浓缩
在某些实施方案中，净化、处理的原料流的阴离子过滤流过液在被用于磷灰石层析介质之前，经由切向流过滤(“TFF”)浓缩。R.Paul等HUMANGENETHERAPY，4：609-615(1993)曾描述了使用TFF超滤的病毒的大规模浓缩。原料流的TFF浓缩能使技术上易控制体积的原料流进行本发明层析步骤，而且保证更合理地调整柱大小而无需冗长的再循环时间。在某些实施方案中，rAAV原料流被浓缩了至少两倍到至少十倍。在某些实施方案中，原料流被浓缩了至少十倍到至少二十倍。在某些实施方案中，原料流被浓缩了至少二十倍到至少五十倍。本领域技术人员也能认识到，在进行纯化过程下一步前TFF还能够用在纯化过程的任意(如果需要交换缓冲液的)步骤。
在聚乙二醇(PEG)存在下以磷灰石层析进行的rAAV捕获
FDA批准用于纯化适用于人体临床试验及医药产品中的蛋白质和其他生物产品的方法依赖于商业规模的正交过程。一个多步骤纯化方案被认为是包括正交法，如果它采用彼此不同的分离机制，其中每一步骤代表笛卡尔空间的一个轴。例如，使用阴离子交换和疏水相互作用层析(HIC)的两步法被认为是正交的。用于自在此所述的生产培养收获物或原料流中去除污染物(如生产培养污染物或工序内污染物)的过程对于终产物(即rAAV载体)来讲是包括多种层析介质上的捕获和流过步骤的正交过程。rAAV载体(特别是rAAV-2)已经本领域证实能结合阴离子树脂。已经证实在生产组分(如血清白蛋白、辅助病毒组分、生产培养基组分和宿主细胞DNA)存在下，rAAV载体如rAAV-1、-5和-8能比rAAV-2更不紧密地结合于阴离子交换介质，导致较低效和较低质量的纯化方案。
本领域所述用于低亲和性阴离子结合物如AAV-1的之前纯化策略包括碘克沙醇阶式梯度，其降低了污染物(如生产培养污染物和工序内杂质)的相对浓度，以实现rAAV载体更紧密地结合于阴离子交换剂。碘克沙醇阶式梯度不容易放大到在此所述的商业规模过程。
本申请的发明者已发现，能通过从磷灰石树脂捕获和洗脱自污染物(如生产培养污染物或工序内污染物)分离rAAV载体颗粒。因此，除从粗原料流捕获产物之外，磷灰石柱清除了多种过程相关杂质，包括宿主细胞和腺病毒蛋白质、葡聚糖、和血清蛋白质，还提供了另外的对于辅助病毒(如Ad5辅助病毒)的清除因素。
磷灰石树脂是包括磷酸钙矿物质的层析介质，包括不限于陶瓷羟基磷灰石(CHT)和陶瓷氟磷灰石(CFT)。磷灰石层析介质也被称作混合模式或多模式介质，因为磷灰石具有提供一个以上结合化学的功能团。不希望被理论所约束，磷灰石介质通过许多不同化学基团(包括骨架上含有的羟基残基、树脂上含有的带正电的钙基团和带负电的磷酸基团)提供钙金属亲和结合、氢键、正电荷斥力、正电荷引力、负电荷斥力、及负电荷引力的机会。每种结合化学用于混合模式结合，正如其用于单一模式层析。然而，不像在单一模式层析中，不同结合和洗脱化学并非独立，而且能以相反方式工作。例如，增加离子强度能推动疏水结合(T.Kawasaki，M.Niikura，和Y.Kobayashi，J.Chrom.515：125-148(1990)和P.S.Gagnon，P.Ng，J.Zhen，C.Aberin，和J.He，BioProcessInt′l4：50-60(2006))。特别是，CHT和CFT是球形、大孔式羟基磷灰石(Ca5(PO4)3OH)2，在高温下烧结以将矿物质从结晶转换成陶瓷的形式。这产生了具有大孔结构的层析介质，提供大表面面积、有限传质阻力、高机械强度和基极电阻。在不同温度和时间烧结导致不同物理结构-类型I和II，两者在化学上等同但对于不同类分子提供不同能力。CFT与CHT不同，在于它是氟磷灰石和羟磷灰石的合成物，通过化学上以氟基取代羟基制得以增加酸性条件下的稳定性。CFT和CHT树脂在市场上(如，从Bio-RadLaboratories，Inc.)可买到。
本发明发明者已令人吃惊地发现，在上样缓冲液中含有聚乙二醇(PEG)(通过降低流过液中rAAV颗粒的可变突破)大大增加了rAAV载体颗粒结合于磷灰石树脂的能力和重复性。不希望被理论所约束，有别于大部分过程相关杂质的rAAV载体的一个属性是颗粒的大物理尺寸。通过在层析结合和洗涤缓冲液中包括聚乙二醇(PEG)，以优先增加基于能量有利共享水化壳的结合态的较大分子的分配系数，在捕获和洗涤步骤中利用这个大小差异。在本领域内已描述了在纯化病毒和噬菌体载体时使用PEG，与本发明不同，最初PEG被用作沉淀剂以物理聚集并从溶液中去除病毒颗粒。由于本领域已知PEG有利于聚集和沉淀病毒颗粒，并且本领域已描述rAAV在低于200mM离子强度下形成聚集体(Wright等，MolecularTherapy12：171-178(2005))，PEG对于rAAV载体结合于磷灰石树脂的影响是不可预期的。本领域已知PEG有利于免疫球蛋白分子结合于离子交换树脂(例如，Gagnon，J.Chromtogr.743A：51-55(1996)所述)、及带电疏水混合模式树脂(例如Gagnon等，22ndInternationalIBCConferenceonAntibodyProductionandDevelopment，March4-6，2009所述)。
基于使用原料流中浓度范围为3-10％(w/v)的PEG6000的实验，本申请发明者已确定相对浓度约5％(w/v)的PEG6000是最佳的。本领域技术人员应理解，能使用其他种类和分子量的PEG，包括不限于PEG8000、PEG10000和PEG15000，并且可经验确定在rAAV载体溶液终浓度中PEG的相对浓度，以便于在适当浓度PEG的情况下、能促进溶液中rAAV载体颗粒结合于磷灰石树脂但不形成聚集物或物理沉淀。
在某些实施方案中，通过在PEG存在下捕获于磷灰石树脂和在磷酸盐缓冲液中自磷灰石树脂洗脱结合的rAAV颗粒来从生产培养污染物中分离rAAV载体颗粒。在优选实施方案中，通过在PEG存在下捕获于磷灰石树脂和在无PEG的缓冲液中自磷灰石树脂洗脱结合的rAAV颗粒来从生产培养污染物中分离rAAV载体颗粒。在某些实施方案中，通过在PEG存在下捕获于磷灰石树脂和在无PEG的缓冲液中自磷灰石树脂洗脱结合的rAAV颗粒来从生产培养污染物中分离包括是弱阴离子结合物的衣壳的rAAV颗粒。在更优选实施方案中，通过在PEG存在下捕获于磷灰石树脂和在无PEG的缓冲液中洗脱结合于树脂的含rAAV-1血清型衣壳颗粒来从生产培养污染物中分离包括血清型1(rAAV-1血清型)衣壳的rAAV颗粒。在某些实施方案中，根据包括在无磷酸盐但存在PEG的上样缓冲液中上样原料流和在包括磷酸盐和无PEG的洗脱缓冲液中自磷灰石树脂洗脱结合rAAV的方法，自生产培养污染物中分离rAAV载体颗粒。
在PEG存在的磷灰石层析代表用于纯化rAAV载体的有效捕获或结合策略，许多工序内杂质在pH7.0时也由磷灰石树脂所保留。不希望为理论所约束，在碱性pH(pH大于7.0)的原料流中含有的蛋白质更有可能具有净负电荷并被磷灰石树脂上含有的负电磷酸结合位点所排斥，因而降低层析树脂的总体阳离子交换结合能力。但是，鉴于磷灰石树脂混合模式的性质，通过正电荷吸引和金属亲和的结合仍能发生。
由于其理想的生产性能(包括但不限于制备容易、溶解度最佳、缓冲能力优良且成本低)，硼酸盐缓冲液是本领域内常规使用的碱性缓冲***。因此，评估硼酸缓冲液作为模式碱性缓冲***的磷灰石树脂上的rAAV捕获。本领域技术人员能理解，能够评估其他碱性缓冲液以确定是否其降低PEG存在下工序内杂质结合于磷灰石树脂的水平。可以检验其他基本缓冲液并用之于rAAV捕获。在某些实施方案中，无PEG的磷灰石上样缓冲液包括硼酸盐缓冲液。在优选实施方案中，配制在约pH8.0到pH9.9的硼酸盐缓冲液。在优选实施方案中，配制pH在约9.0的硼酸盐缓冲液。在某些实施方案中，硼酸盐缓冲液浓度为约5mM到500mM。在更优选实施方案中，配制约20mM硼酸盐、pH9.0的硼酸盐缓冲液。在某些实施方案中，pH9.0的20mM硼酸盐缓冲液特别降低了小分子工序内杂质捕获于磷灰石树脂。
在某些实施方案中，通过在线混合原料流和含终浓度PEG两倍的PEG的磷酸盐缓冲液，在含有磷酸盐、有PEG的缓冲液中上样原料流于磷灰石树脂。在某些实施方案中，磷酸盐缓冲液的pH在pH6.5到pH7.0之间。在某些实施方案中，PEG是PEG6000。在某些实施方案中，上样缓冲液中的PEG6000浓度为约3％(w/v)到约10％(w/v)。在更优选实施方案中，上样缓冲液中的PEG6000浓度为约5％(w/v)。在某些实施方案中，用于磷灰石树脂的上样缓冲液中的磷酸盐浓度为5mM到500mM。
在某些实施方案中，在PEG存在下磷灰石树脂的结合能力相对于无PEG情况下磷灰石树脂的结合能力有所增强。在某些实施方案中，在PEG存在下磷灰石树脂对于原料流中rAAV载体颗粒的结合能力相对于无PEG情况下磷灰石树脂的结合能力增强了约二分之一对数到约十个对数。在优选实施方案中，在PEG存在下磷灰石树脂对于原料流中rAAV载体颗粒的结合能力增强了八个对数。在某些实施方案中，在PEG存在下磷灰石树脂对于原料流中rAAV载体颗粒的结合能力为至少约106rAAV颗粒/ml树脂到约1016颗粒/ml树脂(如大约106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016颗粒/ml树脂的任一个)。在某些实施方案中，在PEG存在下磷灰石树脂的结合能力为约1014颗粒/ml树脂。
尽管在PEG存在下、大约1012-1014DRP的rAAV-1/ml磷灰石树脂的此令人吃惊的结合能力保证高效、有效成本的商业rAAV-1纯化放大，但本领域技术人员应理解，结合能力代表将结合每ml树脂的rAAV-1的最大数量，并不意味着可用于限制本发明范围。事实上，发明人理解含有低于1014-1016DRP的rAAV-1/毫升的rAAV-1载体收获培养物可以用本发明纯化。
在某些实施方案中，在自树脂上洗脱rAAV颗粒之前，洗涤结合于磷灰石介质的rAAV颗粒。在某些实施方案中，以含有降低浓度的PEG的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次以去除工序内杂质。在某些实施方案中，以含有约3％(w/v)到约10％(w/v)的PEG的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。在某些实施方案中，洗涤缓冲液含有任意的约10％(w/v)、9.5％(w/v)、9％(w/v)、8.5％(w/v)、8％(w/v)、7.5％(w/v)、7％(w/v)、6.5％(w/v)、6％(w/v)、5.5％(w/v)、5％(w/v)、4.5％(w/v)、4％(w/v)、3.5％(w/v)、和3％(w/v)的PEG。在某些实施方案中，以含有比结合rAAV颗粒于磷灰石介质所用PEG浓度高的浓度的PEG的洗涤缓冲液洗涤磷灰石介质。在某些实施方案中，进一步以降低浓度的PEG洗涤磷灰石介质。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包含本领域已知的缓冲液。在某些实施方案中，洗涤缓冲液包括选自硼酸盐、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙二酸(HEPES)和Tris-HCl的缓冲液。在某些实施方案中，洗涤缓冲液为碱性pH。在某些实施方案中，洗涤缓冲液具有pH在pH7.0到pH10.0、pH7.2到pH10.0、pH7.4到pH10.0、pH7.6到pH10.0、pH7.8到pH10.0、pH8.0到pH10.0、pH8.2到pH10.0、pH8.4到pH10.0、pH8.6到pH10.0、pH8.8到pH10.0、pH9.0到pH10.0、pH9.2到pH10.0、pH9.4到pH10.0、pH9.6到pH10.0或pH9.8到pH10.0。在某些实施方案中，洗涤缓冲液的pH为7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、或10.0。在某些实施方案中，洗涤缓冲液还包括100到500mM磷酸盐。在某些实施方案中，洗涤缓冲液还包括50到250mMNaCl。
在某些实施方案中，在低浓度PEG的缓冲液中洗脱通过在PEG存在下捕获于磷灰石树脂自原料流中分离的rAAV载体。在某些实施方案中，低浓度PEG为约2.9％(w/v)到约0.1％(w/v)的PEG。在某些实施方案中，在无PEG的缓冲液中洗脱通过在PEG存在下捕获于磷灰石树脂自原料流中分离的rAAV载体。在优选实施方案中，在无PEG的含磷酸盐缓冲液中洗脱通过在PEG存在下捕获于磷灰石树脂自原料流中分离的rAAV载体。
在某些实施方案中，在含磷酸盐缓冲液中洗脱通过在PEG存在下捕获于磷灰石树脂自原料流中分离的rAAV载体。在某些实施方案中，在含有浓度为约0.1mM到约500mM(如约1mM到约250mM，约10mM到约100mM)磷酸盐缓冲液中洗脱通过在PEG存在下捕获于磷灰石树脂自原料流中分离的rAAV载体。在优选实施方案中，在50mM磷酸盐缓冲液中洗脱通过在PEG存在下捕获于磷灰石树脂自原料流中分离的rAAV载体。
本申请发明者已发现，原料流中含有的rAAV载体能够通过在PEG存在下捕获于磷灰石树脂而分离。然而，如果生产培养中所用的辅助病毒(如腺病毒)存在于用于磷灰石树脂的原料流中，在PEG存在下它们能被磷灰石树脂捕获。通过其在磷酸盐缓冲液中的洗脱情况，在PEG存在下被磷灰石树脂捕获的rAAV载体颗粒能够容易地从腺病毒中分离。在PEG存在下结合于磷灰石树脂的rAAV载体颗粒在不含PEG的情况下能在含低至0mM磷酸盐的缓冲液中洗脱；同时辅助病毒腺病毒颗粒在用于洗脱rAAV载体颗粒的磷酸盐浓度下保留在磷灰石树脂上。试验中，发现rAAV载体在无PEG情况下在低至50mM磷酸盐中洗脱在一个单一尖峰中，而(如存在)辅助病毒如腺病毒保留于树脂上。在掺入(spike-in)研究中，rAAV原料流被89DNA酶抗性颗粒(DRPs)的感染性腺病毒掺入(spike)并且在PEG存在下进行磷灰石树脂上的层析，rAAV载体被捕获于磷灰石树脂并在无PEG情况下在50mM磷酸盐缓冲液中被洗脱，而约4个对数的腺病毒蛋白质被保留在磷灰石树脂上。因此，在某些实施方案中，通过在PEG存在下捕获于磷灰石树脂和在无PEG的磷酸盐缓冲液中洗脱来将原料流中存在的rAAV载体从污染辅助病毒中分离。在某些实施方案中，磷酸盐缓冲液配制成保留污染辅助病毒结合于磷灰石树脂的浓度。在某些实施方案中，两个到八个对数的腺病毒被保留在每ml磷灰石树脂上。在某些实施方案中，原料流中含有的rAAV载体通过在保留辅助病毒结合于磷灰石树脂的条件下、在0-500mM磷酸盐缓冲液(如0-400mM、0-300mM、0-200mM、0-100mM、0-50mM)中自磷灰石树脂洗脱来分离。
本领域已知用于生产rAAV载体的生产***可包括含有0.5％-20％(v/v)范围内的血清、或可以是完全无血清的生产培养基。另外，本领域所述纯化策略可能包括一个或多个浓缩步骤，该步骤可能导致用于磷灰石树脂的原料流中血清蛋白质和其他血清组分的增加。例如，在此所述的用1％(v/v)血清配制的生产培养上清在TFF步骤中被浓缩大约二十倍，因此上样于磷灰石树脂的原料流与浓缩自无血清配制的生产培养的原料流相比，包含多达20％血清蛋白质污染物。本申请发明者用浓缩自有或无血清配制的生产培养的原料流试验了在此提供的磷灰石捕获方法。发现原料流中含有血清蛋白质对于磷灰石层析步骤的性能没有影响。
辅助病毒的热灭活(热杀死)
如果感染性腺病毒被用作rAAV纯化的生产培养的辅助病毒来源，能加入可选的热灭活(热杀死)步骤以灭活可能存在于原料流中的任意残留腺病毒颗粒。热杀死步骤利用AAV和腺病毒之间的主要区别之一：在约54-56℃温度下腺病毒颗粒被灭活，而AAV和rAAV病毒颗粒是稳定的且不受那些温度影响。在本发明中，发明者已调节热灭活步骤至适应较大规模的过程优化(如在此实现的250L规模生产培养)。特别是，在设为53℃、摇动速度40RPM、以12°角混合(20L波加热器锅)的温控摇床上，在灭菌、单次使用的5L生物加工袋中热灭活磷灰石洗脱物。在平台上孵育磷灰石洗脱物至其到达52℃，并随后在那个温度下再保持10分钟。加入终浓度2mM的MgCl2到磷灰石洗脱物中以稳定加热期间的rAAV载体。本领域技术人员能够理解，能够经验性地测试加热的规模、最终设定点及加热时间以找到维持rAAV颗粒感染性和完整性的同时灭活腺病毒颗粒的最适条件。对于自使用质粒构建物来提供辅助功能的生产培养中纯化rAAV颗粒，能够省略热灭活步骤。
疏水相互作用层析
疏水相互作用层析(HIC)是基于生物分子表面疏水性不同来分开生物分子的技术。因此，HIC被认为是AAV方法的其他纯化步骤的正交法。HIC层析介质包含疏水配体如线性链烃(例如丙基(C3)、丁基(C4)、己基(C6)、或辛基(C8))或芳香烃(例如苯基)。在纯水中，疏水效应对于配体和蛋白质、或蛋白质自身之间的功能性相互作用是很弱的。然而，易溶盐增强了疏水相互作用，而且加入盐促进捕获蛋白质于HIC介质。因为此原因，通常在高盐浓度下上样和在低盐浓度下洗脱HIC树脂。如本领域技术人员所理解的，硫酸铵[(NH4)SO4]是控制通过HIC层析捕获蛋白质的最普遍使用的盐，因为霍夫迈斯特(Hofmeister)系列中铵和硫酸根离子的高易溶性等级、及该盐的高溶解度。在本发明中，分别通过在线混合75∶25(体积∶体积)比例的2M硫酸铵+50mMBisTris缓冲液(pH7.0)：原料流，将原料流中含有的rAAV颗粒上样于HIC树脂。在线混合原料流和上样缓冲液避免了因缓冲液中含有的高浓度硫酸铵导致任何rAAV载体沉淀的风险。如本领域技术人员所能理解的，能够进行盐(硫酸铵)浓缩以获得用于rAAV结合的最佳浓度。因此，在某些实施方案中，硫酸铵浓度在1M到3M。在某些优选实施方案中，上样缓冲液中的硫酸铵浓度为2mM。如本领域技术人员所能理解的，在线混合硫酸铵和原料流为方便和持续单元操作而进行，但是人们能够方便地以本领域已知的任意方法混合原料流和适当浓度的上样缓冲液，并随后上样原料流+上样缓冲液溶液至HIC层析介质。
共溶剂也可以影响疏水相互作用。例如，乙烯或丙烯乙二醇能降低蛋白质和固定配体之间的相互作用，并从而有助于改善洗脱情况。因此，以2M硫酸铵+50mMBisTris缓冲液(pH7.0)：50mMBisTris(pH7.0)+10％丙烯乙二醇(v∶v)缓冲液(EMDBioSciences)的75∶25(v∶v)混合物洗涤HIC柱，并在低盐缓冲液加丙烯乙二醇(800mM硫酸铵+50mMBisTris缓冲液(pH7.0)+4％丙烯乙二醇中洗脱rAAV。在那些洗脱条件下，在上样于柱子的原料流中含有的任意残留辅助病毒和蛋白质将保留结合于柱。加入此样品中的丙烯乙二醇至缓冲液中使洗脱谱与无丙烯乙二醇缓冲液的宽洗脱谱相比更加锐利，但在方法中是可选的。
合适的疏水树脂的例子包括并不限于Tosoh丁基650M、TosohSuperButyl650C、Tosoh苯基650C、和EMDFractogel苯基(TosohBioscienceLLC，宾夕法尼亚州)。
在丢弃之前，自rAAV生产过程产生的废物需要严格去污，至少因为两个原因：(1)产物包括病毒载体；和(2)生产培养通常使用活的5型病腺毒(Ad5)作为rAAV生产的辅助病毒。来自层析操作的液体废物在中和和丢弃之前，通常先以漂白剂在使用点去污、并随后通过保持在高pH进行进一步去污。
HIC缓冲液中含有的硫酸铵与漂白剂和氢氧化钠反应能分别释放有害的氯气和氨气。因此，HIC层析步骤的优化过程中的首要考虑是发展能够以本领域已知方法安全去污的合适的缓冲***。
如本领域技术人员能理解的，疏水相互作用层析所用的高盐浓度缓冲液必须进一步筛选粘度问题，这个问题能够导致高背压，其能限制流速或导致混合问题，因而增加了在储存或操作所用温度下发生的缓冲液中盐结晶所导致的产物沉淀的风险。基于下面表6的数据并考虑上述因素，发明者选择了1M柠檬酸钠(pH7.0)作为用于结合rAAV载体至HIC层析介质的最适缓冲液，尽管柠檬酸盐缓冲液能够以0.5M到2.0M的浓度范围被用于疏水作用层析。
以体积排阻层析(SEC)做缓冲液交换
本领域已知多种方法可进行在此描述的缓冲液交换，包括TFF和透析。使用体积排阻层析具有额外的优势，在于其提供大小能流过树脂孔隙的蛋白质的进一步蛋白质清除，而且从交换缓冲液所需时间来讲是相对快速的。在此步骤进行缓冲液交换以保证前一步的HIC洗脱物被交换为适于过程中rAAV结合最终阴离子交换层析步骤的缓冲液。
外源因子(病毒清除)
可选地，能够向过程中加入清除痕量污染物(如原料流中可能含有的外源病毒)的另一步骤，从而产生商业上合理的正交过程。因此，在某些实施方案中，方法还包括病毒清除过滤。此类过滤的例子在本领域已知，并包括MilliporeViresolveNFR(50nm)、PallUltiporeVF(50nm)和Asahi70nm。
阴离子交换层析
作为最终浓缩和完善步骤，进行做过磷灰石层析的rAAV载体的阴离子交换捕获步骤。合适的阴离子交换层析为本领域已知，并包括而不限于本领域已知的UnosphereQ(Biorad，海克力斯，加利福尼亚州)、和N-带电氨基或亚氨基树脂如例如POROS50PI、或任意DEAE、TMAE、叔胺或季胺、或基于PEI的树脂(美国专利号6,989,264；N.Brument等，MoI.Therapy6(5)：678-686(2002)；G.Gao等，Hum.GeneTherapy11：2079-2091(2000))。本领域技术人员能理解，能够找到合适离子强度的洗涤缓冲液，以便于rAAV保持结合于树脂，而去掉其他从纯化步骤中所用各种过滤器滤出而引入的工序内杂质(包括但不限于葡聚糖)。在某些实施方案中，洗涤缓冲液是60mMNaCl并且rAAV载体是用130mMNaCl从柱上洗脱，以便于将存在的任意残留痕量工序内杂质(如血清白蛋白或辅助病毒)保留在柱上。
实施例
实施例1：自培养基中收获rAAV-1-净化&消化
净化包含rAAV-1载体的来自以本领域已知的任何方法生产的250L的rAAV-1病毒生产培养的所费rAAV-1生产培养基(上清)以去除上清中包含的任何细胞。以5升每分钟(LPM)被逐步降低至4LPM的速率，将上清流经串联的系列过滤器，包括：(1)MilliporeHCPod过滤器，D0HC级(MilliporeCorp.，贝德福德，马萨诸塞州)(4次)；(2)MilliporeHCPod过滤器，AlHC级；及(3)XL10MilliporeExpressSHC疏水膜0.2m过滤器。
在反渗透/去离子(“RO/DI”)水中根据制造商的说明书预洗所有过滤器。收集流过液到生物加工袋中以进行消化。在rAAV-1生产培养基中溶解终浓度为2单位/ml的(EMIndustries目录号1.01695.0002)并将其加入至净化病毒上清以得到终浓度2.5单位/ml。在室温下、以4LPM的持续再循环孵育上清和以保证DNA消化。图1显示消化得到的数据，其证实在消化后不存在高分子量DNA。
实施例2：通过阴离子交换去除生产污染物
来自实施例1的rAAV-1净化和消化上清流过串联的一组2英寸乘22英寸PallQ(“MQ”)过滤器(PallCorp.，目录号NP6MSTGQP1)。在上样rAAV-1病毒上清之前，以15L的0.5MNaOH以0.5LPM保持15分钟时间消毒过滤器，以15LTMEG+2MNaCl(TMEG：0.05MTris-HCl，pH7.5，1mM2-巯基乙醇，1mMNa2EDTA，10％(v/v)甘油)以速度6LPM润洗使其带电，并且以15L的载体生产培养基以6LPM平衡。然后以约6LPM的速率将上清抽过过滤器组并收集至生物加工袋中。在生产培养基的离子强度下，已证明阴离子交换MQ过滤器能通过结合污染物于带电膜、从rAAV-1上清中清除其他杂质中的辅助病毒和残留DNA。然而，在生产培养基的离子强度下，上清中含有的rAAV-1载体流过阴离子交换膜。在过程优化期间，实验上确定了使用单个MQ过滤器导致过程中污染物(包括Ad5辅助病毒)的突破。因此在方法中在串联或级联中加入第二个过滤器。
实施例3：浓缩rAAV-1载体上清
实施例1和2中加工的全部rAAV-1载体生产上清经由切向流过滤(“TFF”)被浓缩了大约20倍，从最初约250L的体积到约12.5L的体积。以50L的RO/DI水冲洗具有100kD分子量隔断、C屏和5m2总表面积的切向流聚酯砜滤芯(Millipore2Biomax，目录号P2B100C05)，以15L的0.5MNaOH保持15分钟步骤消毒，并以100L的WIFI(HyPureTMWFI纯化水；HyClone，洛根，犹他州)再次冲洗，以15LTMEG+2MNaCl冲洗，并在最后以15L的rAAV-1生产培养基平衡。上清以流速大约3LPM及再循环速率16LPM流经TFF芯。浓缩保留在过滤器上的TFF材料(“保留物”)至约10.5L并将其转移至储藏物。以大约2L的生产培养基冲洗过滤器。然后集合洗涤和浓缩物以产生终体积约12.5L。
以TFF浓缩rAAV-1至12.5L的体积也浓缩了溶液中保留的rAAV-1生产污染物大约20倍。因此，在TFF步骤后引入一生产保持步骤，在此期间过滤TFF浓缩物经过4英寸Opticap0.22m过滤膜(Millipore目录号KVSC04HB3)。此额外的过滤步骤使得含rAAV-1的TFF浓缩物进行至方法中的下一步而无需渗滤和缓冲液交换。在进一步加工前，可以将TFF后材料储藏在2-8℃任意时期(包括少至24小时至多达3月或更长)，而不丧失(以载体产量测定的)稳定性或(以本领域已知分析评估的)感染性。或者，在此所述进行的TFF能够被用于纯化过程中的任意步骤以浓缩或缓冲液交换rAAV-1载体。
实施例4：筛选用于rAAV-1载体相对过程杂质结合的树脂
用于纯化蛋白质和其他生物产品的商业化FDA批准方法依赖于商业规模结合正交过程。用于工序内杂质去除的正交进程是有一个以上步骤或方法的进程，包括对于终产物(如例如rAAV-1载体)的捕获和流过步骤。rAAV载体(特别是rAAV-2)已被本领域证实结合阴离子树脂。已证实，在导致较低效和低质量纯化策略的生产组分(如血清白蛋白、辅助病毒组分、生产培养基组分和宿主细胞DNA)存在下，rAAV载体如rAAV-1、-5和-8比rAAV-2结合于阴离子交换剂的紧密度少得多。
本领域所述用于低亲和性阴离子结合物如AAV-1的之前纯化策略包括碘克沙醇阶式梯度，其为实现rAAV载体更紧密结合于阴离子交换剂，降低了生产组分的相对浓度。碘克沙醇阶式梯度不容易放大到如那些在此所述的商业规模过程。因此，为了优化用于低亲和性阴离子结合物如rAAV-1的rAAV纯化而不需进行超离心和阶式梯度，筛选了多种树脂结合rAAV载体或排除rAAV载体于流过液中的能力，与通常观察到的过程杂质(包括生产培养中发现的宿主细胞DNA、辅助病毒、血清白蛋白、血清蛋白质(如果生产培养基中包括血清)及其他低分子量蛋白质)的结合或流过的能力相比较，以发展商业规模的正交和有效的rAAV纯化方法。
对于每种树脂，用1ml(5cm床高)柱以供应商建议的线性流率、以相对于制造商建议的严重欠载容量进行树脂筛选。对于结合于和洗脱自每种树脂，收集分光光度计扫描的280纳米(A280)处紫外吸收。以合适分析法分析峰的rAAV-1载体和代表性过程杂质。图2显示的数据代表名单中典型树脂的典型分光光度计示踪。表2列出筛选的某些树脂及树脂对于rAAV-1载体和不同过程杂质的相对结合亲和性。
表2：对于结合rAAV-1相比于结合过程污染物的树脂的筛选
关键词：(-)＝存在于流过液中(无结合)；+＝弱结合(梯度中很早被洗脱)；++到++++＝更强结合(进一步沿梯度洗脱)
实施例5：聚乙二醇(“PEG”)存在下用于捕获rAAV-1的磷灰石层析的发展
基于实施例4中进行的树脂筛选结果，选择磷灰石树脂或陶瓷磷灰石树脂作为捕获rAAV-1的树脂。如下面所详细讨论，最初的实验用CFTII树脂进行，但为后期纯化将树脂换做CHTI。数据显示两种层析树脂效果相同。进行实验以进一步增加磷灰石树脂的rAAV-1结合能力、并改善树脂区分rAAV-1颗粒和其他工序内杂质的能力。如在此所述进一步发展对于磷灰石树脂功能的两个关键改进：1)加入PEG；和2)发展上样缓冲液条件。
由于商业上合理柱尺寸的容量问题，基于磷灰石柱的可变突破，在上样于磷灰石树脂前、混合PEG和TFF浓缩物(见上面实施例3)以增加rAAV-1载体相对于其他工序内杂质(如血清白蛋白、辅助病毒和其他蛋白质杂质，其与rAAV-1载体争夺结合实施例4中的柱子)的结合。
PEG存在下的磷灰石层析代表用于纯化rAAV-1载体的有效捕获或结合策略，尽管在pH7.0时通过磷灰石树脂也保留许多工序内杂质。
进行实验以确定是否改变缓冲条件能改进rAAV-1与其他工序内杂质的分辨率。用配有以CFT树脂装填了6cm床高的1.2mLTricorn5柱(GEHealthcare)的AKTAexplorerFPLC***(GEHealthcare，皮斯卡塔韦，新泽西州)进行小规模实验，以150cm/hr流速跑样。在不同缓冲***、有或无5％PEG6000存在下，评价那些柱相对牛血清白蛋白(“BSA”，模型小分子工序内杂质)结合的对于rAAV-1载体捕获。
在有或无5％(w/v)PEG6000情况下，在待检验的缓冲***中注射小体积(＜总体积的5％)的rAAV-1或BSA于CFT柱。使用小体积以省却样品缓冲液交换的需要。沿500mMPO4梯度洗脱产物。在pH＝6.50时使用50mM的2-(N-吗啉)乙磺酸(“MES”)缓冲***，而在pH9.0时使用20mM硼酸盐缓冲***。
表3显示的数据证实，在5％(w/v)PEG6000存在下，rAAV-1载体结合于磷灰石树脂在pH6.5或pH9.0时基本相同，而有或无5％(w/v)PEG6000的情况下，BSA(模型小分子工序内杂质)结合在pH9.0时显著降低，如分光光度计图形所显示(数据未显示)。进一步以酶联免疫吸收法(“ELISA”)分析在碱性缓冲液上样条件(即pH＝9.0)下BSA结合于磷灰石柱的能力降低，证实在pH9.0缓冲条件下多数BSA(～78％)存在于流过液中，而在随后洗涤步骤中能实现额外水平的BSA结合的清除或降低(～19％)，留下仅～0.1％的上样于柱子的BSA实际结合于磷灰石树脂、并和rAAV-1共洗脱。如洗脱的DNA酶抗性颗粒(“DRP”)无感染性损失或数量降低所显示，在pH＝9.0时rAAV-1颗粒是稳定的。
表3：在pH＝6.5或pH＝9.0，有或无5％(w/v)PEG6000的情况下rAAV-1和BSA结合于磷灰石树脂的相对强度
结合条件 BSA 5％(w/v)PEG6000
pH＝6.50 ++ +
pH＝6.50+5％(w/v)PEG6000 ++ ++++
pH＝9.0 + +
pH＝9.0+5％(w/v)PEG6000 + ++++
关键词：+＝弱结合；++＝中等结合；++++＝强结合
实施例6：rAAV-1收获培养中的血清对于PEG存在下通过磷灰石层析捕获rAAV-1的影响
如果生产培养生长在含血清培养基中，待以在此所述方法纯化的rAAV-1载体生产培养或含rAAV-1原料流可以包含血清和血清蛋白质。尽管使用很低浓度血清(即1％或更少，见例如美国专利号6,995,006)的rAAV-1载体生产已有描述，作为生产培养收获物20倍浓缩的结果，浓缩实施例3所述的生产培养或原料流能生产有效包含20％血清和血清蛋白质的原料流。为了评价血清组分对于磷灰石层析性能的影响，对于有或无PEG6000的情况下、有或无血清生产的生产培养进行了实验。
在总共四个柱子上样实验中，以传统突破分析、使用两个模型rAAV-1生产培养来评估磷灰石树脂(I型CFT)的能力。在一个实验中，生产培养包含血清；而在第二个实验中，生产培养不包含血清。在有5％(w/v)PEG6000或无PEG的情况下检验两种原料流。原料流是收获过程的代表、和净化的培养上清，其流经阴离子交换过滤器并以在此所述的切向流过滤浓缩了20倍。以1∶1在线混合的原料流和pH＝9.0的硼酸盐缓冲液上样I型CFT柱。缓冲液包含0％或10％(w/v)的PEG6000(以实现终浓度为5％(w/v)的PEG6000)。当上样柱子时，收集流过液的一系列部分，以DRP-PCR分析其产物。在考虑在线稀释后，功能性容量被定义为流出柱的产物浓度刚刚达到进入柱浓度的1％时的点。对于含PEG的柱上样，随后跑样色谱过程的余下部分以评估洗脱部分中的载体回收。
图3中显示的数据证实，加入PEG6000增加了磷灰石树脂对于rAAV-1载体结合的能力，无论在生产培养中是否存在血清。不希望为理论所约束，PEG存在下，通过(其能够被洗脱缓冲液中含有的磷酸盐所竞争的)与磷酸基团间的阴离子相互作用，TFF后上清优先结合rAAV-1于磷灰石树脂(胜于其他工序内杂质)。此外，通过能够为含有盐所竞争的金属相互作用，能进一步将结合于磷灰石树脂的rAAV-1与工序内杂质区分开。因为在性质上捕获和洗脱缓冲液被配制成主要是离子的(即，相比于主要疏水相互作用所结合的洗脱组合物通常所用的包含150mM磷酸盐或更高的洗脱缓冲液，该洗脱缓冲液包含50mM磷酸盐)，rAAV-1结合磷酸基团不是主要由疏水性驱动。在这些高盐、低磷酸盐洗脱条件下，在生产培养上清中包含的残留辅助病毒、宿主细胞DNA及其他低分子量蛋白质(如果有的话)将保留在树脂上。令人吃惊的是，数据证实，PEG6000存在下，在含血清或无血清培养基中生产的rAAV-1载体证明了与磷灰石树脂的结合能力为至少1.2x1012DRP/mL(1mL上样)至大于1.5x1014DRP/mL树脂(150mL)。在无5％(w/v)PEG6000存在下，磷灰石树脂对于TFF收获物的结合能力是，对于含血清培养基中生产的载体为小于2.4x1012DRP/mL，而对于无血清培养基中生产的载体为7.2x1012DRP/ml，因为在CFT洗脱物中没有回收到rAAV-1载体。
实施例7：通过磷灰石层析纯化rAAV-1
以2MNaCl装填I型CHT柱并以1MNaOH消毒。在上样前，以6个柱体积(“CV”)的20mM硼酸盐(pH＝9)+5％(w/v)PEG6000平衡柱子。以96cm/hr流速、用3mmBioProcessSkid(GEHealthcare)将TFF原料流浓缩物上样至如前所述制备的923ml(14cm直径x6cm床高)CHT柱上。TFF原料流浓缩物和等体积的40mM硼酸盐(pH＝9)+10％(w/v)PEG6000缓冲液在线混合以产生终浓度为20mM硼酸盐(pH＝9)+5％(w/v)PEG6000。
进行一组4次连续洗涤以去除工序内杂质而保留rAAV-1载体于柱上。通过在线混合5CV的50∶50(体积∶体积)20mM硼酸盐(pH＝9.0)+5％(w/v)PEG6000：40mM硼酸盐(pH＝9.0)+10％(w/v)PEG6000以驱赶所有含PEG6000的上样线来进行洗涤1(“驱赶”)。另外，发现此步骤优先增加了rAAV-1载体的结合能力。以15CV的150mM磷酸钾+20mM硼酸盐(pH＝9)+5％(w/v)PEG6000进行洗涤2以去除大多数血清白蛋白和其他低分子量蛋白质工序内杂质而保留rAAV-1于柱上。以15CV的20mM硼酸盐(pH＝9)+5％(w/v)PEG6000进行洗涤3(图5中的“WII”)以去除任意残留磷酸盐，以便于一旦去除PEG6000，rAAV-1保持结合于柱上。以5CV的20mMHERES(pH＝7.0)+150mMNaCl缓冲液进行洗涤4(图5中的“WIII”)以去除PEG6000并调节盐浓度，从而保证rAAV-1和任意残留辅助病毒或其他工序内杂质(如蛋白质污染物，其可能保持结合于柱上)间的区分。
以6CV的50mM磷酸钾+20mMHERES(pH＝7.0)+150mMNaCl缓冲液自柱上洗脱rAAV-1载体。图4显示在280nm处的UV吸收(A280)的典型分光光度图形及CHTI层析步骤的电导。图5显示自磷灰石树脂洗脱的rAAV载体的相对纯度。
通过磷灰石层析清除葡聚糖
葡聚糖是类似于纤维素的碳水化合物，其从自生产培养收获rAAV-1颗粒所用的基于纤维素的深度过滤器浸出至过程中。
浓度为～1ng/mL以上的葡聚糖能干扰用于检测细菌内毒素污染的标准鲎(Limulus)变形细胞裂解物(“LAL”)试验。如下面表4所证实，磷灰石I型CHT柱自生产培养中清除了～2.5个对数的葡聚糖。在此所述的缓冲条件下，绝大多数的葡聚糖存在于流过液中，并且不结合于柱子。
表4：过程中葡聚糖清除
加工步骤 葡聚糖浓度(ng/mL) 每批总量(ng)(250L规模)
净化 10.4 2,600,000
TFF 136 1,541,016
CHT洗脱 1.9 4,769
HIC和SEC后 0.2 662
最终阴离子交换洗脱物 0.1 71
用特异于葡聚糖的基于LAL的动力学色谱分析(科德角，马萨诸塞州)分析样本的葡聚糖。
通过磷灰石层析清除Ad5辅助病毒
为证实CHT层析自原料流中清除了Ad5，用来自最终上游过程的原料流进行了初步掺入研究。基于得自用CFTII树脂所作的I期病毒清除研究的数据，设置了Ad5掺加水平，并使用了三个不同原料流上样比例：6.6mL；13.5mL；和33mL的TFF后原料流/mLCHT树脂。
表5中显示的数据，CHT的Ad5清除可以与证实大约是4个对数的Ad5病毒清除的4个LRV清除相比，并且看起来与上样的原料流体积(在所评估的5倍范围内)无关。Ad5低回收率与以前数据一致，表明在所用的缓冲条件下Ad5比rAAV-1更紧密地结合于磷灰石树脂。
表5：在CHT柱分部中的Ad5总感染单位
上样比例分部 6.6mL 13.5mL 33mL
上样 9.0×108 1.3×109 9.0×108
流过+驱赶 ＜2.5×105 ＜3.6×105 ＜6.9×105
PO4洗涤 2.9×106 2.7×106 ＜2.6×106
洗涤II&III 3.6×106 2.2×106 2.8×106
洗脱 ＜6.9×104 ＜6.9×104 ＜3.5×105
对数降低值(LRV) ＞4.1 ＞4.3 ＞3.4
总共8xl09的Ad5感染颗粒(即，具有P∶I为～10的总颗粒)被分成不同体积的TFF后原料流，在1.2mLCHT柱上跑样。以100cm/hr操作柱子并收集部分以DRP分析载体及以感染滴度分析Ad5。因为已知高浓度上样和CHT洗脱样品会干扰基于细胞的分析，使用掺加控制式的Ad5感染性分析。Ad5清除被确定作为对数降低值(“LRV”)，计算为上样的Ad5总量除以洗脱部分中回收的Ad5总量的对数(对数降低值)。
实施例8：热灭活残留辅助病毒
为了灭活和去除CHTI洗脱物中含有的任意残留辅助病毒，进行热灭活步骤。对于较小规模实验，在两个1LPETG()瓶中分开CHTI洗脱液，并加入MgCl2至终浓度2mM以增加rAAV-1载体的稳定性。在53.5℃水浴中以混合孵育瓶子至瓶中温度达到约52℃。然后以转移至室温水浴和混合冷却瓶子，至瓶中温度不高于室温之上5℃。将热杀死混合物过滤经过4英寸0.22m过滤膜(Millipore目录号KVSC04HB3)。或者，对于较大规模实验，在53℃的温度设定点、振荡速度为40RPM及混合角为12°(20L波加热锅)的温控摇床上，在灭菌、单次使用的生物加工袋(CustomHyclone5L袋，CX5-14薄膜)中热灭活CHTI洗脱物。在摇床上孵育CHTI洗脱物至温度达到52℃并随后再保持10分钟。为在加热期间稳定rAAV-1，加入MgCl2到2mM终浓度。加热后，过滤产物经过0.2m过滤器并在室温下保持过夜以最小化可能的对随后疏水相互作用柱影响的温度。
实施例9：通过疏水相互作用层析(“HIC”)捕获rAAV-1
HIC是基于生物分子表面疏水性不同的用于分离生物分子的技术。就这点而论，HIC被认为是rAAV-1过程中其他纯化步骤的正交法。HIC介质包含疏水配基如线性链烃(例如，丙基(C3)、丁基(C4)、己基(C6)、或辛基(C8))或芳香烃(例如，苯基)。在纯水中，对于配基和蛋白质或蛋白质自身之间的功能性相互作用，疏水效应太弱。然而，易溶盐增强了疏水相互作用，而加入此类盐促进了蛋白质被吸收到HIC介质。为此原因，通常在高盐浓度下上样HIC树脂而在低盐浓度下洗脱。
用硫酸铵缓冲液的HIC层析
简单讲，以几个柱体积的0.5MNaOH消毒170ml(6cm直径x6cm床高)的HIC丁基柱(Butyl650M；TosohBiosciences；蒙哥马利，宾夕法尼亚州；目录号14702)，并以75∶25(体积∶体积)的2M硫酸铵+50mMBisTris(pH＝7.0)∶50mMBisTris(pH＝7.0)混合物平衡。以3.3L/hr的速率、以在线混合75∶25(体积∶体积)比例的2M硫酸铵+50mMBisTris(pH＝7.0)：rAAV-l磷灰石洗脱物上样热杀死的rAAV-1载体磷灰石洗脱物。在线混合避免了因缓冲液中含有的硫酸铵导致的任何rAAV-1载体沉淀的风险。以一个或多个柱体积的75∶25(体积∶体积)的2M硫酸铵+50mMBisTrispH＝7.0缓冲液：50mMBisTrispH＝7.0+10％丙二醇(体积∶体积)(EMDBiosciences)缓冲液洗涤柱子。此样品中的丙二醇被加入到缓冲液中以使洗脱谱与无丙二醇缓冲液的宽洗脱谱相比更为锐利，尽管它在过程中是可选的。以800mM硫酸铵+50mMBisTris(pH＝7.0)缓冲液+4％丙二醇自柱上洗脱rAAV-1载体。在所用的洗脱条件下，上样中含有的任意残留辅助病毒和蛋白质将保持结合于柱子。
在丢弃前来自rAAV-1生产过程的废物需要严格去污，因为产物是病毒载体并且使用活的5型腺病毒(Ad5)作为生产中的辅助病毒。来自层析操作的液体废物通常先用漂白剂在使用点处去污，并随后在中和和丢弃前以保持在高pH进一步去污。HIC缓冲液中含有的硫酸铵与漂白剂和氢氧化钠相互反应，能分别释放有害氯气和氨气。因此，对于HIC层析步骤的过程优化的一个首要的考虑是发展能以本领域已知方法安全去污的、合适的缓冲***。
筛选用于rAAV-1结合于HIC柱的合适缓冲液
在多种不同缓冲条件下上样rAAV-1载体于柱上，并以测定流过液部分中含有的rAAV-1载体量来确定相对结合效率(表6)。评估的缓冲液包括通常使用于HIC层析过程的高浓度易溶盐和几个在其中可能发生混合模式相互作用(HIC/阳离子交换)的低pH缓冲液。在几个可选的缓冲液中，Tosoh丁基650M和EMD苯基树脂均结合载体。
必须进一步筛选在疏水相互作用层析中所用的含高盐浓度缓冲液的粘度问题，该问题能导致会限制流速或导致混合问题的高背压、及因储存或缓冲液操作温度下的盐结晶导致的产物沉淀的风险。基于下面表6中的数据，并考虑到上述因素之后，选择1M柠檬酸钠，pH＝7.0作为结合rAAV-1载体于HIC层析介质的最适缓冲液。
表6：在可选缓冲液中筛选AAV1结合
在室温下，在Tricorn5/50柱(6cm床高，1.2mL柱体积)上使用纯化rAAV-1载体进行实验。以所列缓冲液平衡柱子，并上样～2x1011DRP的rAAV-1于柱上。在从145mMBisTris(pH＝7.0)、10％(v/v)丙二醇开始的20CV的线性梯度上洗脱rAAV-1。收集流过液并以DRP分析分析施加于柱上的rAAV-1流过或不结合的部分。
在之前实验证实rAAV-1结合很好的多种缓冲液中，进行对于清除HIC柱上工序内杂质的进一步鉴定。下面表7中关于模型污染物结合的数据证实，腺病毒和DNA(如果在原料流中存在)被HIC层析步骤有效区分。
表7：在不同HIC缓冲液中rAAV-1相对模型工序内杂质的相对结合
缓冲*** rAAV-1 Ad5 DNA
0.1M硫酸钠+bis tris缓冲液，pH＝7.0 + ++ -
0.8M硫酸钠+bis tris缓冲液，pH＝7.0 + ++ 0
1M柠檬酸钠，pH＝7.0 + ++ 0
2.9M NaCl(50mM柠檬酸钠缓冲液，pH＝4.0) - - 0
关键词：“0”＝流过液中不含结合材料；“-”＝很弱结合物；“+”＝强结合物；“++”＝更强结合物。
在室温下，在Tricorn5/50柱(6cm床高，1.2mL柱体积)上进行实验。以所列缓冲液平衡柱子，并上样所示样品于柱上。在20CV的线性梯度上洗脱每个样品。收集样品并分析其相关上样材料。
用柠檬酸钠缓冲液的HIC层析
随后上样热杀死rAAV-1载体磷灰石洗脱物于HIC丁基柱上，以进一步降低任意残留过程杂质，并作为浓缩和脱盐步骤。以几个柱体积的0.5MNaOH消毒373ml(6cm直径x8.9cm床高)的HIC丁基柱(TosohBiosciencesButyl650M目录号14702)，并以5CV的75∶25(体积∶体积)的1M柠檬酸盐+20mM磷酸钠：20mM磷酸钠混合物平衡。以106cm/hr的速率、以在线混合75∶25(体积∶体积)比例的1M柠檬酸盐+20mM磷酸钠：CHTI洗脱物，上样热杀死rAAV-1载体CHTI洗脱物。在线混合避免了任意rAAV-1载体沉淀的风险。以5CV的75∶25(体积∶体积)的1M柠檬酸盐+20mM磷酸钠：20mM磷酸钠缓冲液混合物洗涤柱子。以6CV的0.35M柠檬酸盐+20mM磷酸钠自柱上洗脱rAAV-1载体。然后以3.5CV的20mM磷酸钠缓冲液洗涤柱子。此低盐洗涤(20mM钠)洗脱了部分rAAV-1载体颗粒，它们在其洗脱谱上和在高盐洗脱缓冲液中洗脱的rAAV-1载体颗粒在疏水性上截然不同。事实上，如果在所述条件下、将低盐洗脱部分分离并再施加于HIC柱，载体的那一群仍仅洗脱在低盐部分中，表明该部分不是柱子容量突破的结果。感染性分析显示这部分rAAV-1可能代表包括空衣壳、部分变性衣壳、较低感染性衣壳材料和部分完全衣壳的群落。因此，此观察可以导致感染性小并因而作为生产材料不太理想的rAAV-1颗粒的分离上的改进。在所用洗脱条件下，上样中含有的任意残留辅助病毒和蛋白质将保持结合于柱子，并因而应该存在于低盐去除物中。
实施例10：通过体积排阻层析(“SEC”)的缓冲液交换
通过体积排阻层析的缓冲液交换提供了大小可通过树脂中孔隙的蛋白质的额外蛋白质清除，并就交换缓冲液所需时间而言是相对快速的。在此步进行的缓冲液交换是保证前一步的HIC洗脱物被交换成用于rAAV-1结合于过程中最后阴离子交换层析步骤的适当缓冲液。装填了3.2L(14cm直径x21cm床高)的200制备级树脂(Amersham/GEHealthcare，皮斯卡塔韦，新泽西州；目录号17-1043-04)，并以2MNaCl+1MNaOH消毒制备和以2.8CV的20mMNaCl+20mMTris(pH＝8.0)平衡。HIC洗脱物被再分，以每次约400ml的三次连续循环在SEC上加工，每个循环中上样不超过SEC柱体积的12.5％。在一个生物加工袋中收集来自三次SEC循环的(在无效体积中包含的)产物峰。以49cm/hr的流速将HIC洗脱物上样于柱上。以1.4CV的20mMNaCl+20mMTris(pH＝8.0)驱赶和冲洗柱子，而HIC洗脱物中含有的rAAV-1载体存在于柱子的无效体积中。在收集所述无效体积之后，如之前关于第一部分所述，在同一柱子上顺序上样和收集第二和第三部分。
实施例11：外源因子(病毒清除)
作为清除可能作为痕量污染物存在的外来病毒并因此得到商业上合理的正交法的可选的方法，向过程中引入病毒清除过滤器。此类过滤器的例子为本领域已知，且包括MilliporeNFR(50nm)、PallVF(50nm)和Asahi70nm。根据生产商指示制备MilliporeNFR(Millipore4″VirosolveNFR过滤器目录号KZRV04TC3)病毒清除过滤器，以20mMNaCl+20mMTris(pH＝8.0)冲洗，并将SEC洗脱物过滤过膜。以几个体积的20mMNaCl+20mMTris-HCl(pH8.0)冲洗过滤器，并与过滤的SEC洗脱物集合。
实施例12：阴离子交换层析
进行对于rAAV-1的第二个阴离子交换捕获步骤作为在Q树脂(Biorad，海格立斯，加利福尼亚州)上的最终浓缩和完善步骤。以几个柱体积的0.5MNaOH消毒373ml(8.9cm直径x6cm床高)柱子并以7CV的20mMNaCl+20mMTris(pH＝8.0)缓冲液平衡。以309cm/hr的速率上样SEC无效体积部分或可选的病毒过滤洗脱物。以10CV的60mMNaCl洗涤柱子。选择洗涤溶液的离子强度以保持rAAV-1结合于树脂，同时去掉任意其他工序内杂质(如葡聚糖，其可能由纯化步骤中所用的不同过滤器渗出)。以6CV的130mMNaCl自柱上洗脱rAAV-1载体。130mMNaCl盐洗脱物的离子强度会自柱上去掉rAAV-1，同时任意残留痕量工序内杂质(如血清白蛋白或辅助病毒)将保持结合。
图6以SDS-PAGE比较了经过不同方法步骤纯化的程度。来自代表性生产培养收获物的工序内样品跑样于变性/还原10％聚丙烯酰胺凝胶上并以Sypro橙染色。以1x1010DRP/孔道上样所有收获后样品。因为凝胶上的体积限制，在TFF浓缩步骤前的两个上游样品(起初净化步骤和阴离子交换(“AEX”)流过)只能以1x109DRP/孔道上样。以50ng/孔道上样β-半乳糖苷酶(B-GaI)以评估胶内染色的灵敏度和一致性。标示了三个AAVI衣壳蛋白质(VP1、2、和3)。
实施例13：纯化期间的rAAV回收百分率
图7显示的数据显示自rAAV-1载体的代表性生产培养的纯化策略的每个方法步骤后感染性rAAV颗粒的回收百分率。基于从每个方法步骤回收的rAAV-1载体的总DRPs除以上样或进行那个纯化步骤的总DRPs数，计算回收百分率。数据证实，在纯化方法的每个步骤实现了约60％或更大的回收。在许多实验中，每个方法步骤的回收范围为至少60％至90％。特别值得一提的是，在单独实验中的捕获步骤(即磷灰石层析步骤)的回收范围为57％至大于90％。而且，在HIC步骤的回收范围是60％到80％。
虽然，为清晰理解的目的，上述发明已通过说明和实施例的方式详细描述，对于本领域技术人员显而易见的是，可以实践某些微小改变和修改。因此，描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。

Claims (28)

1.一种用于自原料流中的工序内杂质分离重组腺相关病毒(rAAV)颗粒群落的方法，包括如下步骤：
(a)在聚乙二醇(PEG)存在下，用磷灰石层析介质接触包含rAAV颗粒的原料流，其中rAAV颗粒结合于磷灰石层析介质；及
(b)以包含小于3％(w/v)PEG的洗脱缓冲液洗脱结合于磷灰石层析介质的rAAV颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中磷灰石层析介质是陶瓷羟基磷灰石(CHT)或陶瓷氟磷灰石(CFT)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中磷灰石层析介质对于rAAV颗粒的特异结合在1014到1016DNA酶抗性颗粒每毫升(DRP/mL)。
4.根据权利要求1所述的方法，还包括结合自磷灰石层析介质洗脱的原料流中rAAV颗粒于阴离子层析介质的步骤。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在聚乙二醇(PEG)和碱性缓冲液的存在下，以磷灰石层析介质接触步骤(a)中的包含rAAV颗粒的原料流。
6.根据权利要求5所述的方法，其中碱性缓冲液为pH7.6到10。
7.根据权利要求5所述的方法，其中碱性缓冲液为pH8.0到10.0。
8.根据权利要求5所述的方法，其中碱性缓冲液为pH9.0到10.0。
9.根据权利要求5所述的方法，其中碱性缓冲液包括硼酸盐。
10.根据权利要求1所述的方法，其中PEG具有5,000克每摩尔(PEG5000)到15,000克每摩尔(PEG15000)的平均分子量。
11.根据权利要求1所述的方法，其中PEG具有6,000克每摩尔(PEG6000)的平均分子量。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在3％(w/v)到10％(w/v)PEG存在下，以磷灰石层析介质接触步骤(a)中的包含rAAV颗粒的原料流。
13.根据权利要求1所述的方法，还包括在以磷灰石层析介质接触原料流以后、但在自磷灰石层析介质洗脱rAAV颗粒之前以洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中以包含7.5％(w/v)PEG的洗涤缓冲液和/或包含5％(w/v)PEG的洗涤缓冲液洗涤磷灰石层析介质一次或多次。
15.根据权利要求14所述的方法，其中以包含小于3％(w/v)PEG的洗涤缓冲液和/或不包含PEG的洗涤缓冲液进一步洗涤磷灰石层析介质。
16.根据权利要求13所述的方法，其中洗涤缓冲液包括选自硼酸盐、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙二酸(HEPES)和Tris-HCl的缓冲液。
17.根据权利要求13所述的方法，其中洗涤缓冲液具有碱性pH。
18.根据权利要求17所述的方法，其中洗涤缓冲液包括pH为8.0到10.0的硼酸盐。
19.根据权利要求17所述的方法，其中洗涤缓冲液还包括100到500mM的磷酸盐。
20.根据权利要求17所述的方法，其中洗涤缓冲液还包括50到250mM的NaCl。
21.根据权利要求1所述的方法，其中以包含低浓度PEG或不含PEG的洗脱缓冲液洗脱结合于磷灰石层析介质的rAAV颗粒。
22.根据权利要求21所述的方法，其中洗脱缓冲液包括中性pH的、选自硼酸盐、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙二酸(HEPES)和Tris-HCl的缓冲液。
23.根据权利要求21所述的方法，其中洗脱缓冲液包含小于3％(w/v)的PEG6000。
24.根据权利要求23所述的方法，其中洗脱缓冲液还包含小于100mM的磷酸盐。
25.根据权利要求23所述的方法，其中洗脱缓冲液还包含50mM的磷酸盐。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中洗脱缓冲液还包含50到250mM的NaCl。
27.根据权利要求1所述的方法，其中rAAV颗粒包含来自选自AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15和AAV-16的AAV衣壳血清型的AAV衣壳蛋白质。
28.根据权利要求1所述的方法，其中rAAV颗粒包含来自选自AAV-1、AAV-4、AAV-5和AAV-8的AAV衣壳血清型的AAV衣壳蛋白质。
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